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ES2546743B1 - Marcadores mitocondriales de enfermedades neurodegenerativas - Google Patents

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ES2546743B1
ES2546743B1 ES201430444A ES201430444A ES2546743B1 ES 2546743 B1 ES2546743 B1 ES 2546743B1 ES 201430444 A ES201430444 A ES 201430444A ES 201430444 A ES201430444 A ES 201430444A ES 2546743 B1 ES2546743 B1 ES 2546743B1
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Marta Barrachina Castillo
Isidre FERRER ABIZANDA
Marta BLANCH LOZANO
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Universitat de Barcelona UB
Fundacio Privada Institut dInvestigacio Biomedica de Bellvitge IDIBELL
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Abstract

Marcadores mitocondriales de enfermedades neurodegenerativas.#La presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto basado en la determinación del patrón de metilación en ciertas regiones del ADN mitocondrial de dicho sujeto o en la determinación del nucleótido en la posición polimórfica 16519 del ADN mitocondrial de dicho sujeto. Finalmente, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos adecuados para poner en práctica la invención.

Description

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MARCADORES MITOCONDRIALES DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS DESCRIPCION CAMPO DE LA INVENCION
La presente invention se encuadra dentro de los metodos de diagnostico de enfermedades neurologicas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Existe un numero considerable de enfermedades neurodegenerativas que estan causadas o estan asociadas con alteraciones en la funcion mitocondrial. La enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) se encuentran dentro de este grupo. Las caracteristicas fisiopatologicas de la EA y de la EP estan relacionadas con depositos de protemas agregadas. En concreto, la EA esta asociada con la formation de agregados intracelulares de tau fosforilado en los ovillos neurofibrilares y agregados extracelulares del peptido p-amiloide en las placas seniles y la EP esta asociada con la formacion de agregados anormales de a-sinucleina que constituyen el componente principal de los llamadas cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy.
Es conocido que enfermos de Alzheimer muestran niveles reducidos de la subunidad ND4 en tejido cerebral y que enfermos de Parkinson muestran niveles reducidos de ND6 en la sustancia negra. Ademas, estudios geneticos han permitido identificar mutaciones en varios genes COX y en la region D-Loop asi como deleciones en el ADNmt de cerebros de sujetos con EA y en la sustancia negra en sujetos con EP.
En la tecnica se han desarrollado diferentes metodos y estrategias para el diagnostico, la prediction del inicio y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas y, en particular de EA y EP. Asi, se han descrito metodos de diagnostico de enfermedades neurodegenerativas basados en la identification de mutaciones en el ADN mitocondrial mediante la el empleo de la tecnica RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restriction) o de otras tecnicas relacionadas. El documento WO98038334 describe un metodo de diagnostico de EA basado en la identificacion de mutaciones en genes COX. Tambien se ha propuesto un metodo de diagnostico de la EP en un sujeto mediante la identificacion de polimorfismos de nucleotido simple en muestras de ADN mitocondrial de un sujeto (WO 2000063441). Otros documentos del estado de la tecnica describen metodos para el diagnostico de Alzheimer o Parkinson basados en la identificacion de polimorfismos
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en genes nucleares que codifican protemas que controlan el proceso de transcripcion mitocondrial.
A pesar de los esfuerzos hechos hasta la fecha, todav^a existe la necesidad de disponer de metodos fiables para diagnosticar enfermedades neurodegenerativas tales como EA y EP, asi como para diagnosticar del estadio de dichas enfermedades y pronosticar la evolucion de las mismas.
COMPENDIO DE LA INVENCION
En un primer aspecto, la invention se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en la region D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patron de metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2,
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5,
en donde una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una
hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una
hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una
hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en
al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Alzheimer o de que el sujeto tiene un riego elevado de desarrollar la enfermedad de Alzheimer o
en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Parkinson o de que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad de Parkinson.
En un segundo aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN
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mitocondrial, el patron de metilacion en la region D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patron de metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
en donde una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una
hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una
hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una
hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en
al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer o en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Parkinson.
En un tercer aspecto, la invention se relaciona con un metodo in vitro para monitorizar la progresion de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende:
a) determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patron de metilacion en la region D-loop, y/o en el gen ND1, en donde el patron de metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
b) comparar el patron de metilacion determinado en la etapa a) con dicho patron de metilacion obtenido en un estadio anterior de la enfermedad,
en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en
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al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 con respecto dicho patron de metilacion determinado en un estadio anterior de la enfermedad, es indicativo del avance de la enfermedad de Alzheimer; y
en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop con respecto a dicho patron de metilacion determinado en un estadio anterior de la enfermedad es indicativo del avance de la enfermedad de Parkinson.
En un cuarto aspecto, la invention se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que comprende determinar en una muestra que comprende ADN mitocondrial de dicho sujeto el nucleotido en la position polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en la base de datos NCBI, en donde la detection del nucleotido C en dicha posicion polimorfica o la presencia del nucleotido C en dicha posicion polimorfica en al menos un 60% de las moleculas de ADN mitocondrial de dicho sujeto es indicativo de que el sujeto sufre dicha enfermedad o de que el sujeto tiene un riego elevado de desarrollar dicha enfermedad.
En un quinto aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer que comprende determinar en una muestra que comprende ADN mitocondrial de dicho sujeto el nucleotido en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en la base de datos NCBI, en donde la deteccion del nucleotido C en dicha posicion polimorfica o la presencia del nucleotido C en dicha posicion polimorfica en al menos un 60% de las moleculas de ADN mitocondrial de dicho sujeto es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer.
En un sexto aspecto, la invencion se relaciona con un acido nucleico seleccionado del grupo formado por:
(i) un acido nucleico que comprende al menos 9 nucleotidos contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado del grupo formado por:
a) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
b) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
c) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
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d) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y
e) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5,
(ii) un acido nucleico que comprende al menos 9 nucleotidos contiguos de una region de ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado del grupo formado por:
a) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
b) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
c) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
d) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y
e) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
en donde la posicion correspondiente a la citosina en el sitio CpG, CHG o CHH es uracilo; y
(iii) un polinucleotido que hibrida de forma espedfica con los acidos nucleicos de (i) o (ii).
En un septimo aspecto, la invencion se relaciona con un kit que comprende al menos un oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente y de forma dependiente de metilacion con una secuencia en el ADN mitocondrial que comprende un sitio de metilacion seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
En un octavo aspecto, la invencion se relaciona con un kit que comprende al menos un oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente con una zona en posicion 5'o en posicion 3'con respecto a un sitio de metilacion en el ADN mitocondrial seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5,
en donde la citosina metilada en dicha posicion se ha convertido a uracilo o en otra base que es distinguible de citosina en sus propiedades de hibridacion.
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Finalmente, en un noveno aspecto, la invention se relaciona con el uso los kits definidos en el septimo y octavo aspecto inventivo para determinar el patron de metilacion del ADN mitocondrial o para determinar el diagnostico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto seleccionada de la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1: Graficos Log2(OR) para los sitios CpG (A) CHG (B) y CHH (C) en el amplicon D- Loop en la corteza entorrinal de los casos relacionados con patologia EA. En el eje de las x se encuentran representados los sitios de metilacion ordenados de 5’ a 3’. Los sitios marcados con un diamante son los sitios diferencialmente metilados (FDR < 0.05). Los puntos son los valores de estimation OR, uno para cada sitio, y la banda es la banda de union de todos los intervalos de confianza del 95%. C: muestras control, AD: Enfermedad Alzheimer.
Figura 2: Graficos Log2(OR) para los sitios CpG (A) CHG (B) y CHH (C) en el amplicon ND1 en la corteza entorrinal de los casos relacionados con patologia EA. En el eje de las x se encuentran representados los sitios de metilacion ordenados de 5’ a 3’. Los sitios marcados con un diamante son los sitios diferencialmente metilados (FDR < 0.05). Los puntos son los valores de estimacion OR, uno para cada sitio, y la banda es la banda de union de todos los intervalos de confianza del 95%. C: muestras control, AD: Enfermedad de Alzheimer.
Figura 3: Graficos Log2(OR) para sitios CpG y no CpG (CHG y CHH) en el amplicon D-loop en la sustancia negra de pacientes con EP. En el eje de las x se encuentran representados los sitios de metilacion ordenados de 5’ a 3’. Los sitios marcados con un diamante son los sitios diferencialmente metilados (FDR < 0.05). Los puntos son los valores de estimacion OR, uno para cada sitio, y la banda es la banda de union de todos los intervalos de confianza del 95%. C: muestras control, PD: Enfermedad de Parkinson.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Los autores de la presente invencion han desarrollado un metodo para diagnosticar enfermedades neurodegenerativas basado en la determination del patron de metilacion en una muestra de ADN mitocondrial de un sujeto. Los autores de la invencion han observado que, sorprendentemente, existen variaciones en el patron de metilacion en la region D-loop y en el gen ND1 en sujetos que padecen EA o EP cuando se compara con sujetos sanos tal y
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como se demuestra en los ejemplos. Ademas, los autores de la invention han descubierto patrones de metilacion diferenciales asociados con la evolution de dichas enfermedades.
Primer metodo de la invencion
En un primer aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson en un sujeto (de aqu en adelante, primer metodo de la invencion) que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patron de metilacion en la region D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patron de metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
en donde una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Alzheimer o de que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad de Alzheimer o
en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Parkinson o de que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad de Parkinson.
El termino “diagnostico” como se usa en el presente documento, se refiere tanto al proceso de intentar determinar y/o identificar una posible enfermedad en un sujeto, es decir el procedimiento de diagnostico, como a la opinion alcanzada por este proceso, es decir, la opinion diagnostica. Como tal, tambien se puede considerar como un intento de clasificacion del estado de un individuo en categorias separadas y distintas que permitan que se tomen decisiones medicas sobre el tratamiento y pronostico. Como entendera el experto en la
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materia, tal diagnostico puede no ser correcto para el 100% de los sujetos a diagnosticar, aunque se prefiere que lo sea. Sin embargo, el termino requiere que una parte estadisticamente significativa de los sujetos se puedan identificar como que padecen una enfermedad, particularmente una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y de la enfermedad de Parkinson en el contexto de la invention, o que tiene una predisposition a la misma. El experto en la materia puede determinar si una parte es estadisticamente significativa usando diferentes herramientas de evaluation estadistica bien conocidas, por ejemplo, mediante la determination de intervalos de confianza, la determinacion del valor de p, la prueba de la t de Student, la de Mann-Whitney, etc. (vease, Dowdy y Wearden, 1983). Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%, al menos del 60%, al menos del 70%, al menos del 80%, al menos del 90% o al menos del 95%. Los valores de p son preferiblemente, 0,05, 0,025, 0,001 o menores.
La expresion “riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa”, tal y como se utiliza en la presente invencion, se refiere a la predisposicion, la susceptibilidad o la propension de un sujeto de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa. El riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa generalmente implica que existe un alto o bajo riesgo o un mayor o menor riesgo. Asi, un sujeto con riesgo alto de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa, particularmente la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson, tiene una probabilidad de desarrollar dicha enfermedad de al menos un 50%, o al menos un 60%, o al menos un 70%, o al menos un 80%, o al menos un 90, o al menos un 95%, o al menos un 97%, o al menos un 98%, o al menos un 99%, o al menos un 100%. Del mismo modo, un sujeto con bajo riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa, particularmente la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson, es un sujeto que tiene al menos una probabilidad de desarrollar dicha enfermedad de al menos un 0%, o al menos un 1%, o al menos un 2%, o al menos un 3%, o al menos un 5%, o al menos un 10%, o al menos un 20%, o al menos un 30%, o al menos un 40%, o al menos un 49%.
En general, la expresion "predecir el riesgo", "prediction del riesgo", o similares, se refiere al riesgo de que un paciente desarrolle una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson, ya sea alto o bajo. Como se entendera por los expertos en la materia, la prediccion (o el riesgo), aunque sea preferible, no tiene que ser correcta para el 100% de los sujetos a ser evaluados, aunque es preferible que lo sea. El termino, sin embargo, requiere que una parte estadisticamente significativa de los sujetos pueda ser identificada con una mayor probabilidad de tener un determinado
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resultado. La persona experta en la materia puede determinar sin mayor problema si una parte es estadisticamente significativa utilizando varias herramientas estad^sticas bien conocidas de evaluation, por ejemplo, la determination de intervalos de confianza, determination de valor de p, validation cruzada con indices de clasificacion, etc (mas detalles en “Estadistica para la investigation” Dowdy y Wearden, John Wiley & Sons, New York, 1983). Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01 o inferiores.
El termino “enfermedad neurodegenerativa” tal y como se usa en la presente invention, incluye los procesos cronicos y progresivos que estan caracterizados por perdidas selectivas y simetricas de neuronas en los sistemas motor sensorial y cognitivo.
El termino “enfermedad de Alzheimer” o “demencia senil” o EA se refiere a un deterioro mental asociado con una enfermedad cerebral degenerativa espedfica que se caracteriza por la aparicion de placas seniles, maranas neuriticas y perdida neuronal progresiva que se manifiesta clmicamente en deficiencias progresivas de memoria, confusion, problemas de comportamiento, incapacidad de cuidarse por si mismo, deterioro fisico gradual y, por ultimo, la muerte. En formas preferidas de realization, la enfermedad de Alzheimer es enfermedad en cualquiera de los estadios de acuerdo a la escala Braak:
- Estadios I-II: el area cerebral afectada por la presencia de ovillos neurofibrilares se corresponde a la region transentorrinal del cerebro
- Estadios III-IV: el area cerebral afectada se extiende tambien a zonas de la region limbica como el hipocampo
- Estadios V-VI: el area cerebral afectada implica tambien la region neocortical
Esta clasificacion por estadios neuropatologicos se correlaciona con la evolution clmica de la enfermedad existiendo un paralelismo entre la disminucion de la memoria con los cambios neurofibrilares y la formation de placas neuriticas en la corteza entorrinal y el hipocampo (estadios I a IV). Asimismo, la presencia isocortical de estos cambios (estadios V y VI) se correlaciona con alteraciones clmicamente severas. El estado transentorrinal (I-II) corresponde a periodos clmicamente silenciosos de la enfermedad. El estado limbico (III-IV) corresponde a una EA clmicamente incipiente. El estado necortical corresponde a una EA completamente desarrollada.
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El termino “enfermedad de Parkinson” o “parkinsonismo idiopatico” o “paralisis agitante” o EP tal y como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad cronica y degenerativa que lleva consigo problemas de control del movimiento, tremor, rigidez, bradiquinesia en todo tipo de movimientos como el andar, estar sentado, comer hablar, etc., asi como inestabilidad postural. Los smtomas de la enfermedad estan claramente asociados a la degeneration selectiva de las neuronas dopaminergicas en la sustancia negra. El deficit dopaminergico induce una consiguiente perdida de neuronas estriatales ocasionando una variedad de cambios citologicos que incluyen la agregacion de a-sinucleina en los denominados cuerpos de Lewy. La “sustancia negra” es un nucleo de los ganglios basales cerebrales localizada en las porciones superiores del cerebro medio, bajo el talamo y toma su color de la neuromelanina. En formas preferidas de realization, la EP se encuentra en alguno de los estadios de acuerdo a la escala Braak:
- Estadio I: el area afectada es el nucleo dorsal motor y/o la zona intermedia reticular.
- Estadio II: el area afectada se extiende al locus coreuleus y al nucleo del rafe
- Estadio III: el area afectada se extiende al mesencefalo, en particular a la sustancia negra pars compacta.
- Estadio IV: el area afectada se extiende a la region transentorrinal del mesocortex temporal y al alocortex.
- Estadio V: el area afectada se extiende a la corteza insular, a la circunvolucion cingulada y a la circunvolucion temporal.
- Estadio VI: el area afectada se extiende al area frontal y parietal de la corteza cerebral.
El termino “sujeto” tal como aqu se utiliza, se refiere a una persona, tal como un ser humano, un primate no humano (p. ej., chimpances y otros simios y especies de monos), animales de granja, tales como aves, peces, ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamiferos domesticos, tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores, tales como ratones, ratas y cobayas. El termino no denota una determinada edad o sexo. En una realizacion particular de la invention, el sujeto es un mamifero. En una realizacion preferida de la invencion, el sujeto es un humano.
La expresion “muestra que comprende ADN mitocondrial” tal y como se usa aqui, se refiere a cualquier muestra que se puede obtener de un sujeto en la que exista material genetico procedente de la mitocondria adecuado para detectar el patron de metilacion.
El termino “ADN mitocondrial” o “ADNmt” tal y como se usa aqui, se refiere al material genetico localizado en las mitocondrias de los organismos vivos. Es una molecula
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bicatenaria, circular, cerrada sin extremos. En los seres humanos tiene un tamano de 16569 pares de bases, conteniendo un pequeno numero de genes, distribuidos entre la cadena H y la cadena L. El ADN mitocondrial codifica 37 genes: dos ARN ribosomicos, 22 ARN de transferencia y 13 protemas que participan en la fosforilacion oxidativa.
En una realization particular de la invention, la muestra que comprende ADN mitocondrial se selecciona de una biopsia de un tejido solido o de un biofluido. Las muestras pueden ser obtenidas por metodos convencionales conocidos por el experto en la materia.
En una realizacion todavia mas particular, el biofluido se selecciona de sangre periferica o liquido cefalorraquideo.
En una realizacion todavia mas particular, dicho tejido solido es tejido cerebral. En una realizacion preferida de la invencion, si se desea diagnosticar a un sujeto o si se desea determinar el riego de desarrollar la EP, dicha muestra de tejido cerebral es una muestra obtenida de la sustancia negra.
Si el material en donde se desea determinar el patron de metilacion segun el presente metodo, es decir ADNmt, se encuentra en un tejido solido o un biofluido preferiblemente, se procede a una extraction previa del acido nucleico de la muestra empleando cualquier tecnica apropiada para ello. En una realizacion preferida de la invencion, la fraction de ADN adecuada para la puesta en practica de la invencion es el ADN total. La extraccion del ADN puede ser llevado a cabo usando cualquier metodo conocido por los expertos en la materia (Sambrock et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3) que incluyen sin limitation, centrifugaciones en gradientes de densidad, extraccion en dos fases usando fenol acuoso o cloroformo con etanol, cromatografia en columna, metodos basados en la capacidad del ADN para unirse en superficies de cristal y/o silicatos, como preparaciones de tierra diatomeas o lechos de cristal, empleando kits comerciales, por ejemplo, los kits "Q-Biogene fast DNA® kit” o el "QIAamp®(R) DNA Blood Mini Kit” (Qiagen, Hilden, Alemania) el "G-Spin Ilp” (Intron Biotechnology, Corea) o el "Fast Prep System Bio 101” (Qbiogene®, Madrid, Espana) o los metodos descritos en US5.057.426, US4.923.978 y la solicitud de patente europea EP0512767A1.
Si se desea, el presente metodo puede llevarse a cabo en muestras en donde previamente se ha aislado la fraccion mitocondrial y posteriormente se ha aislado el ADN de las mismas.
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El aislamiento de la fraccion mitocondrial puede ser llevado a cabo usando cualquier metodo conocido de fraccionamiento celular. Dichos metodos comprenden la ruptura celular previa mediante tecnicas que incluyen disruption fisica de las membranas, aplicacion de ultrasonidos, aplicacion de presion o tecnicas enzimaticas, seguida de una centrifugation diferencial mediante la aplicacion de gradientes de densidad (como gradientes de Ficoll o Percoll). Tambien pueden emplearse kits comerciales, por ejemplo, Qproteome “Mitochondrial isolation kit” (Qiagen, Hilden, Alemania) o “Mitochondrial isolation kit for culterd cells” (Thermo Scientific; Estados Unidos). Estos kits se basan en el mismo principio basico, es decir la lisis celular y la centrifugacion diferencial para aislar o enriquecer la fraccion mitocondrial.
El primer metodo de la invention comprende determinar en una muestra de un sujeto el patron de metilacion en una muestra que comprende ADN mitocondrial. El termino "metilacion del ADN", como se usa aqti, se refiere a un proceso bioqtimico que implica la adicion de un grupo metilo (-CH3) a los nucleotidos de ADN citosina (C) o adenina (A). La metilacion del ADN en la position 5 de la citosina tiene el efecto espedfico de represion de la expresion de genes y se ha encontrado en todos los vertebrados examinados.
El termino "patron de metilacion", como se usa aqti, se refiere pero no se limita, a la presencia o ausencia de metilacion de uno o mas nucleotidos. De esta manera, dichos uno o mas nucleotidos estan comprendidos en una unica molecula de acido nucleico. Dichos uno o mas nucleotidos tienen la capacidad de estar metilados o no. El termino "estado de metilacion" tambien se puede utilizar, cuando solo se considera un unico nucleotido. Un patron de metilacion se puede cuantificar, en el cual se considera mas de una molecula de acido nucleico.
El termino “D-loop” o “region control” tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una region de ADN mitocondrial no codificante que contiene aproximadamente, 1100 pares de bases, visible bajo microscopia electronica, que se genera durante la replication de la cadena H por la smtesis de un corto segmento de la hebra pesada, ADN 7S.
El termino “ND1” o “NAHD deshidrogenasa 1” o “ND1mt”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen localizado en el genoma mitocondrial que codifica la protema NADH deshidrogenasa 1 o ND1. La secuencia del gen ND1 humano se encuentra depositada en la base de datos GenBank (version del 2 de enero de 2014) bajo el numero
de acceso NC_012920. (SEQ ID NO: 1). La protema ND1 forma parte del complejo
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enzimatico denominado complejo I que es activo en las mitocondrias e interviene en el proceso de fosforilacion oxidativa.
El termino "sitio CpG", como se usa aqw, se refiere a las regiones de ADN, particularmente regiones de ADN mitocondrial, donde un nucleotido citosina se encuentra al lado de un nucleotido guanina en la secuencia lineal de bases a lo largo de su longitud. "CpG" es la abreviatura de "C-fosfato-G", es decir, citosina y guanina separadas por solo un fosfato; el fosfato enlaza dos nucleosidos cualesquiera juntos en el ADN. El termino "CpG" se utiliza para distinguir esta secuencia lineal del apareamiento de bases CG de citosina y guanina. Citosinas en los dinucleotidos CpG pueden estar metiladas para formar 5-metilcitosina.
El termino “sitio CHG”, como se usa aqui, se refiere a las regiones de ADN, particularmente regiones de ADN mitocondrial, en donde un nucleotido citosina y un nucleotido guanina estan separados por un nucleotido variable (H) que puede ser adenina, citosina o timina. La citosina del sitio CHG puede estar metilada para formar 5-metilcitosina.
El termino “sitio CHH”, como se usa aqui, se refiere a las regiones de ADN, particularmente regiones de ADN mitocondrial, en donde un nucleotido citosina es seguido de un primer y un segundo nucleotido variable (H) que puede ser adenina, citosina o timina. La citosina del sitio CHH puede estar metilada para formar 5-metilcitosina.
En una realization particular, el primer metodo de la invention comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CpG de la region D-loop, seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 1.
Sitio CpG
Position (bp)
CpG 2
16427
CpG 3
16449
CpG 4
16454
CpG 5
16495
CpG 6
16542
CpG 7
16565
CpG 8
33
CpG 9
61
CpG 10
78
CpG 11
80
CpG 12
91
CpG 13
96
CpG 14
105
CpG 15
120
CpG 16
162
CpG 17
170
CpG 18
186
Tabla 1: Lista de los sitios CpG entre las posiciones 16386 y 256 de la region D-loop.
El termino "determination del patron de metilacion en un sitio CpG", como se usa aqui, se 5 refiere a la determinacion del estado de metilacion de un sitio CpG particular. La determinacion del patron de metilacion en un sitio CpG se puede realizar por multiples procesos conocidos por la persona experta en la materia.
En una realization particular, el primer metodo de la invention comprende determinar el 10 patron de metilacion en al menos un sitio CpG de la region D-loop seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 1. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 sitios CpG seleccionados 15 de la Tabla 1.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1.
En otra realization particular, el primer metodo de la invention comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CpG del gen ND1 seleccionado de los sitios 5 mostrados en la Tabla 2.
Sitio CpG
Position (bp)
CpG 1
3351
CpG 2
3375
CpG 3
3379
CpG 4
3406
CpG 7
3453
CpG 12
3549
CpG 13
3642
Tabla 2: Lista de los sitios CpG en el gen ND1 en
re las
posiciones 3313 y 3686.
10 En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en un sitio CpG del gen ND1 seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 2. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 sitios CpG seleccionados de la Tabla 2.
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En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2.
20 En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3.
Sitio CHG
Position (bp)
CHG 2
16426
CHG 3
16453
CHG 4
16459
CHG 5
16466
CHG 6
16479
CHG 7
16514
CHG 8
6
CHG 9
33
CHG 10
64
CHG 11
104
CHG 12
122
CHG 13
128
CHG 14
141
CHG 16
253
Tabla 3: Lista de los sitios CHG entre las posiciones 16386 y 256 de la region D-loop.
El termino "determination del patron de metilacion en un sitio CHG", como se usa aqui, se 5 refiere a la determinacion del estado de metilacion de un sitio CHG particular. La determinacion del patron de metilacion en un sitio CHG se puede realizar por multiples procesos conocidos por la persona experta en la materia.
En una realization particular, el primer metodo de la invention comprende determinar el 10 patron de metilacion en al menos un sitio CHG de la region D-loop seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 3. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13 o al menos 14 o al menos 15 sitios CHG seleccionados de la Tabla 15 3.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3.
En otra realization particular, el primer metodo de la invention comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHG del gen ND1 seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 4.
5
Sitio CHG
Position (bp)
CHG 1
3374
CHG 2
3435
CHG 4
3524
CHG 5
3529
CHG 6
3589
CHG 7
3641
CHG 8
3657
Tabla 4: Lista de los sitios CHG en el gen ND1 entre las posiciones 3313 y 3686.
En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el 10 patron de metilacion en al menos un sitio CHG del gen ND1 seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 4. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 sitios CHG seleccionados de la Tabla 4.
15 En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4.
En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar en 20 una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHH de la region D-loop, seleccionado de los sitios CHH mostrados en la Tabla 5.
Sitio CHH
Posicion (bp)
CHH 5
16419
CHH 6
16425
CHH 7
16429
CHH 8
16439
CHH 9
16442
CHH 10
16446
CHH 11
16451
CHH 12
16458
CHH 13
16465
CHH 14
16478
CHH 15
16498
CHH 16
16507
CHH 17
16511
CHH 18
16520
CHH 19
16527
CHH 20
16536
CHH 21
16540
CHH 22
16546
CHH 23
16549
CHH 24
16560
CHH 25
16563
CHH 26
4
CHH 27
11
CHH 28
15
CHH 29
18
CHH 30
26
CHH 31
29
CHH 32
39
CHH 33
43
CHH 34
48
CHH 35
76
CHH 36
86
CHH 37
110
CHH 38
113
CHH 39
132
CHH 40
140
CHH 41
144
CHH 42
147
CHH 43
150
5
10
15
20
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30
CHH 44
164
CHH 45
167
CHH 46
190
CHH 47
194
CHH 49
198
Tabla 5: Lista de los sitios CHH entre las posiciones 16386 y 256 de la region D-loop.
El termino "determination del patron de metilacion en un sitio CHH", como se usa aqui, se refiere a la determinacion del estado de metilacion de un sitio CHH particular. La determinacion del patron de metilacion en un sitio CHH se puede realizar por multiples procesos conocidos por la persona experta en la materia.
En otra realization particular, el primer metodo de la invention comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CHH de la region D-loop seleccionado de los mostrados en la Tabla 5. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos al menos 17, al
menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos al menos 22, al menos 23, al
menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30,
al menos 31, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos
37, al menos 38, al menos 39, al menos 40, al menos 41, al menos 42, o al menos 43 sitios CHH seleccionados de la Tabla 5.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
En formas preferidas de realizacion, el primer metodo de la invencion comprende:
(i) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2
(ii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3
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(iii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4
(iv) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
(v) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 1 y en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3
(vi) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4
(vii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
(viii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4
(ix) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3 y/o
(x) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
En algunas realizaciones, la determination del patron de metilacion en al menos un sitio CpG, al menos un sitio CHG y/o al menos un sitio CHH de acuerdo al primer metodo de la invention se lleva a cabo en una muestra de sangre entera, en cuyo caso la determinacion se puede realizar directamente. En otras realizaciones, la muestra que comprende ADN mitocondrial, preferiblemente una muestra de ADN total, se extrae de celulas que estan presentes en un fluido biologico (p. ej., sangre entera, liquido cefalorraquideo) como etapa inicial y en tales casos, el acido nucleico total extraido a partir de dichas muestras representa el material de trabajo adecuado para el analisis posterior. El aislamiento del ADN total o del ADN mitocondrial puede realizarse por metodos convencionales conocidos por la persona experta en la materia (citado at supra). Despues de aislar y amplificar (si es necesario) el acido nucleico que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion de uno o mas sitio(s) CpG, uno o mas sitio(s) CHG y/o uno o mas sitio(s) CHH es determinado.
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Los expertos en la materia reconoceran facilmente que el analisis del patron de metilacion presente en uno o varios de los sitios CpG, CHG y/o CHH descritos aqu presentes en el ADN mitocondrial de un sujeto, se puede realizar mediante cualquier metodo o tecnica capaz de medir el patron de metilacion presente en dichos sitios.
En una realization particular, el primer metodo de la invention comprende determinar el patron de metilacion en dichos sitios CpG, CHG y/o CHH mediante una tecnica seleccionada del grupo que consiste en PCR espedfica de metilacion (MSP), un metodo basado en enriquecimiento (p. ej. MeDIP, MBD-seq y MethylCap), secuenciacion por bisulfito y por un metodo basado en bisulfito (p. ej. RRBS, Infinium, GoldenGate, Cobra, MSP, MethyLight) y un metodo por digestion de restriction (p. ej., MRE-seq, o ensayo HELP), pirosecuenciacion, ensayo de ChIP-on-chip, o conversion diferencial, restriccion diferencial, peso diferencial de los sitio(s) CpG, CHG y/o CHH metilados del ADN.
En una realizacion particular y preferida de la invencion, el patron de metilacion de uno o mas sitios CpG, CHG y/o CHH en la region D-loop y/o uno o mas sitios CpG y/o CHG en el gen ND1 se determina mediante pirosecuenciacion. Brevemente, dicha tecnica esta basada en el principio de la secuenciacion por smtesis y en la detection del pirofosfato liberado (PPi) durante la smtesis del ADN. Dicha tecnica emplea una serie de cuatro enzimas para detectar secuencias de acidos nucleicos durante el proceso de smtesis; ADN polimerasa, ATP sufurilasa, luciferasa y apirasa y emplea como sustratos adenosina 5' fosofosulfato (APS) y luciferina.
Para determinar el patron de metilacion en el ADN mitocondrial, es necesario tratar qtimicamente dicha muestra de tal manera que todas las bases de citosina no metiladas se modifican a bases de uracilo, u otra base que es diferente a la citosina en terminos de comportamiento de emparejamiento de bases, mientras las bases de 5-metilcitosina permanecen sin cambios. El termino "modificar", como se usa aqui, significa la conversion de una citosina no metilada a otro nucleotido que distinguira la citosina no metilada de la citosina metilada. La conversion de las bases de citosina no metiladas, pero no las metiladas, en la muestra que comprende ADN mitocondrial se lleva a cabo con un agente de conversion. El termino "agente de conversion" o "reactivo de conversion", como se usa aqti, se refiere a un reactivo capaz de convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que es detectable diferencialmente a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion. El agente de conversion es preferiblemente un bisulfito tal como bisulfito o sulfito de hidrogeno. Sin embargo, otros agentes que modifican de manera similar la citosina no
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metilada, pero no la citosina metilada tambien pueden ser utilizados en el metodo de la invencion, tal como hidrogeno sulfito. La reaccion se realiza de acuerdo con procedimientos estandar (Frommer et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:1827-31; Olek, 1996, Nucleic Acids Res. 24:5064-6; EP 1394172). Tambien es posible llevar a cabo la conversion enzimaticamente, p. ej. mediante el uso de citidina deaminasas de metilacion espedficas.
En una realizacion preferida del primer metodo de la invencion, la muestra que comprende ADN mitocondrial ha sido tratada con un reactivo capaz de convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que es detectablemente diferente a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion. En una realizacion mas preferida, la muestra que comprende ADN mitocondrial se trata con bisulfito usando un kit comercial apropiado para ello, por ejemplo "EZ Methylation Kit” (Zymo Research, Ecogen; Barcelona, Espana).
Una vez que la muestra que comprende ADN mitocondrial ha sido tratada con un bisulfito, la region D-loop y/o el gen ND1 que contiene uno o mas sitio(s) CpG, CHG y/o CHH mostrados en las Tablas 1 a 5 se puede amplificar usando cebadores que permiten distinguir la secuencia no metilada (en el que la citosina del sitio CpG se convierte en uracilo) de la secuencia metilada (en la que la citosina del sitio CpG sigue siendo citosina). Muchos metodos de amplificacion se basan en una reaccion en cadena enzimatica tal como, por ejemplo, una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), reaccion en cadena de la ligasa (LCR), reaccion en cadena de la ligasa polimerasa, Gap-LCR, reaccion en cadena de reparacion, 3SR y NASBA. Ademas, hay amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion mediada por transcripcion (TMA), y Qp-amplificacion, etc, siendo esta lista meramente ilustrativa. Metodos de amplificacion de acidos nucleicos se describen en Sambrook et al., 2001 (citado at supra). Otros metodos de amplificacion incluyen el metodo de PCR espedfica de metilacion (MSP), descrito en el documento US 5.786.146 que combina el tratamiento con bisulfito y PCR espedfica de alelo- (ver p. ej., los documentos US 5.137.806, US 5.595.890, US 5.639.611). El uracilo es reconocido como una timina por la Taq polimerasa y por consiguiente, tras la PCR, el producto resultante contiene citosina solo en la posicion donde existe 5-metilcitosina en el ADN molde de partida.
En una realizacion preferida de la invencion, una vez que la muestra que comprende ADN mitocondrial, preferiblemente una muestra de ADN total, ha sido tratada con un bisulfito, la region que contiene uno o mas sitio(s) CpG, CHG y/o CHH se puede amplificar usando cebadores que no son espedficos de la secuencia metilada. Por ejemplo, la secuencia
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preferida de los cebadores no corresponde a una secuencia nucleotidica que comprende un dinucleotido CpG.
Los productos de amplificacion se detectan de acuerdo con procedimientos estandar en el estado de la tecnica. El acido nucleico amplificado se puede determinar mediante metodos analrticos estandar conocidos por la persona experta en la materia y se describen p. ej., en Sambrook et al., 2001 (citado et supra). Puede haber tambien etapas de purificacion adicionales antes de que el acido nucleico diana se detecte, por ejemplo una etapa de precipitacion. Los metodos de deteccion pueden incluir pero no se limitan a la union o intercalado de colorantes espedficos como el bromuro de etidio que se intercala en el ADN de doble cadena y cambia su fluorescencia despues de eso. Los acidos nucleicos purificados pueden tambien separarse mediante metodos electroforeticos opcionalmente despues de una digestion de restriccion y ser visualizados despues. Hay tambien ensayos basados en sonda que aprovechan la hibridacion de oligonucleotidos a secuencias espedficas y la posterior deteccion del hibrido. Tambien es posible secuenciar el acido nucleico diana despues de mas pasos conocidos por el experto en la materia. Otros metodos utilizan diversas secuencias de acido nucleico a un chip de silicio al que estan unidas sondas espedficas y producen una senal cuando se unen a secuencias complementarias.
En una realizacion preferida de la invencion, tras la amplificacion de la region de interes en donde se desea determinar el patron de metilacion (por ejemplo, en la region D-loop o en el gen ND1) se emplea la pirosecuenciacion para determinar en dicha secuencia los sitios CpG, CHG y/o CHH modificados tras el tratamiento con bisulfito. La razon de citosinas/timinas en cada uno de los sitios puede ser determinada cuantitativamente en base a la cantidad de citosinas y timinas incorporadas durante la etapa de extension de la secuencia.
Alternativamente, el patron de metilacion del en al menos un sitio CpG, CHG y/o CHH de la region D-loop o en al menos un sitio CpG y/o CHG del gen ND1 se puede confirmar mediante digestion con enzimas de restriccion y analisis de transferencia Southern. Ejemplos de endonucleasas de restriccion sensibles a la metilacion que pueden ser utilizadas incluyen Smal, SacII, EagI, MspI, Hpall, BstUI y BssHII, por ejemplo.
El termino “hipermetilacion” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un patron de metilacion alterado en donde uno o mas nucleotidos, preferiblemente citosinas de
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los sitios CpG, CHG y/o CHH, estan metilados comparados con una muestra de referencia. Dicha muestra de referencia preferiblemente es una muestra que comprende ADN mitocondrial obtenida de un sujeto que no padece una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de EA o EP. En particular, dicho termino se refiere a un numero elevado de 5- metilcitosinas en uno o mas sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1, en uno o mas sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2, en uno o mas sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, en uno o mas sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4 y/o en uno o mas sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5, en una secuencia de ADN mitocondrial cuando se compara con la cantidad relativa de 5- metilcitosinas presentes en dichos uno o mas sitios en una muestra de referencia.
El termino “hipometilacion” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un patron de metilacion alterado en donde uno o mas nucleotidos, preferiblemente citosinas de los sitios CpG, CHG y/o CHH, no estan metilados comparados con una muestra de referencia. El termino “muestra de referencia” se refiere a una muestra que comprende ADN mitocondrial obtenida de un sujeto que no padece una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de EA o EP. En particular, dicho termino se refiere a un numero reducido de 5- metilcitosinas en uno o mas sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1, en uno o mas sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2, en uno o mas sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, en uno o mas sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4 y/o en uno o mas sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5 en una secuencia de ADN mitocondrial cuando se compara con la cantidad relativa de 5- metilcitosinas presentes en dichos uno o mas sitios CpG, uno o mas sitios CHG y/o uno o mas sitios CHH en una muestra de referencia.
En una realization preferida de la invention, dicha muestra de referencia que comprende ADN mitocondrial se selecciona de muestras de tejido, o biofluidos, preferiblemente muestras de sangre o de liquido cefalorraqtideo de sujetos. En una realizacion preferida, dicha muestra de referencia es ADN total. Metodos para obtener dichas muestras asi como metodos para aislar el ADN total o el ADN mitocondrial de una muestra han sido detallados anteriormente. En una realizacion todavia mas preferida, la muestra de referencia es una muestra que comprende ADN mitocondrial de sujetos emparejados por edad.
En este primer metodo, la invencion proporciona algunos sitio(s) espedficos CpG, CHG y CHH que estan relacionados con el diagnostico o con el riesgo de desarrollar una
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enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto:
- una hipermetilacion en al menos uno de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
- una hipermetilacion en al menos uno de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
- una hipermetilacion en al menos uno de los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5,
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CpG en el gen ND1 mostrados en la Tabla 2, y/o
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CHG en el gen ND1 mostrados en la Tabla 4,
es indicativo de que el sujeto sufre de Alzheimer o de que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad de Alzheimer; o
- una hipometilacion en al menos, uno de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
- una hipometilacion en al menos, uno de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, y/o
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
es indicativo de que el sujeto sufre de Parkinson o de que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad de Parkinson.
En una realization particular, el primer metodo de la invention comprende determinar el patron de metilacion de todos los sitios CpG, de todos los sitios CHG y de todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en las Tablas 1, 3 y 5, y el patron de metilacion de todos los sitios CpG y de todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en las Tablas 2 y 4.
Los autores de la presente invencion, han descubierto que el grado de metilacion de los sitios CpG, CHG y CHH en la region D-loop es mayor en sujetos que padecen Alzheimer en estadios I-II que en sujetos que padecen dicha enfermedad en estadios tempranos de la enfermedad (estadios III-IV).
En una realizacion particular, si el patron de metilacion se observa con respecto al patron de referencia en una muestra que comprende ADN mitocondrial de un sujeto diagnosticado con la enfermedad de Alzheimer en estadio I-II, entonces una hipometilacion en al menos
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uno de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 o una hipometilacion en uno de dichos sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Alzheimer en estadio III-IV.
Segundo metodo de la invention
En un segundo aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson en un sujeto (de aqu en adelante, segundo metodo de la invencion) que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patron de metilacion en la region D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patron de metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
en donde una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una
hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una
hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una
hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en
al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer o en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Parkinson.
El termino “tratamiento preventivo”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la prevention o conjunto de medidas profilacticas para evitar una enfermedad para prevenir o retrasar la aparicion de la sintomatologia de la misma asi como para reducir o aliviar la sintomatologia clmica de la misma. Particularmente, dicho termino se refiere a la prevencion o el conjunto de medidas para evitar la aparicion, para retrasar o para aliviar la sintomatologia clmica asociada con una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la
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enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Resultados clmicos deseados asociados con la administration de dicho tratamiento a un sujeto incluyen pero no se limitan a, la estabilizacion del estado patologico de la enfermedad, retraso en la progresion de la enfermedad o mejoria en el estado fisiologico del sujeto.
Tratamientos preventivos adecuados dirigidos a la prevention o al retraso de la aparicion de los smtomas de la enfermedad de Alzheimer incluyen pero no se limitan, a inhibidores de colina-esterasa como por ejemplo, clorohidrato de donezepil (Arecept), rivastigmina (Exelon) y galantemina (Reminyl) o antagonistas del receptor N-metil D-aspartato (NMDA). Tratamientos dirigidos a la prevencion o al retraso de la aparicion de los smtomas de la enfermedad de Parkinson incluyen pero no se limitan, a L-dopa, inhibidores de catecol-o- metil transferasa (COMT) como por ejemplo, tolcapone (Tasmar) y entacapone (Comtan), inhibidores de monoamina oxidasa B (MAOB) como por ejemplo, selegilina (Eldepryl) y rasagalina (Azilect) y agonistas de dopamina como por ejemplo, pramipexol, rotigotina y ropinirola.
El termino “seleccionar” tal y como se usa aqui, se refiere a la action de escoger a un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
Los terminos “sujeto”, “enfermedad neurodegenerativa”, “enfermedad de Alzheimer”, “enfermedad de Parkinson”, “muestra”, “ADN mitocondrial”, “region D-loop”, “gen ND1”, “sitio CpG”, “sitio CHG”, sitio CHH”, “patron de metilacion”, “hipermetilacion” e “hipometilacion” se han descrito en detalle en el contexto del primer metodo de la invention y se utilizan con el mismo significado en el segundo metodo de la invencion.
En una realizacion particular del segundo metodo de la invencion, la muestra que comprende ADN mitocondrial se selecciona de una biopsia de un tejido solido o de un biofluido. Las muestras pueden ser obtenidas por metodos convencionales conocidos por el experto en la materia.
En una realization todavia mas particular, el biofluido se selecciona de sangre periferica o liquido cefalorraquideo.
En una realizacion todavia mas particular, dicho tejido solido es tejido cerebral. En una realizacion preferida de la invencion, si se desea seleccionar un sujeto para someterlo a un
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tratamiento preventivo de la enfermedad de Parkinson, dicha muestra de tejido cerebral es una muestra obtenida de la sustancia negra.
En una realization particular, el segundo metodo de la invention comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CpG de la region D-loop, mostrados en la Tabla 1.
En una realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CpG de la region D-loop seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 1. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 sitios CpG seleccionados de la Tabla 1.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CpG del gen ND1, mostrados en la Tabla 2.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en un sitio CpG del gen ND1 seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 2. En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6sitios CpG seleccionados de la Tabla 2.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHG de la region D-loop, mostrados en la Tabla 3.
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En una realization particular, el segundo metodo de la invention comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CHG de la region D-loop seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 3. En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13 o al menos 14 o al menos 15 sitios CHG seleccionados de la Tabla 3.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHG del gen ND1, mostrados en la Tabla 4.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CHG del gen ND1 seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 4. En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 sitios CpG seleccionados de la Tabla 4.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHH de la region D-loop, mostrados en la Tabla 5.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CHH de la region D-loop seleccionado de los mostrados en la Tabla 5. En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al
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En una realization todavia mas particular y preferida de la invention, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
En formas preferidas de realizacion, el segundo metodo de la invencion comprende:
(i) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2
(ii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3
(iii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4
(iv) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
(v) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 1 y en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3
(vi) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4
(vii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
(viii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4
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(ix) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3 y/o
(x) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
Metodos adecuados para determinar el patron de metilacion en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial se han descrito en detalle en el contexto del primer metodo de la invention.
En una realization particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en dichos sitios CpG, CHG y/o CHH mediante una tecnica s seleccionada del grupo que consiste en PCR espedfica de metilacion (MSP), un metodo basado en enriquecimiento (p. ej. MeDIP, MBD-seq y MethylCap), secuenciacion por bisulfito y por un metodo basado en bisulfito (p. ej. RRBS, Infinium, GoldenGate, Cobra, MSP, MethyLight) y un metodo por digestion de restriction (p. ej., MRE-seq, o ensayo HELP), pirosecuenciacion, ensayo de ChIP-on-chip, o conversion diferencial, restriccion diferencial, peso diferencial de los sitio(s) CpG, CHG y/o CHH metilados del ADN.
En una realizacion particular y preferida de la invencion, el patron de metilacion de uno o mas sitios CpG, CHG y/o CHH en la region D-loop y/o uno o mas sitios CpG y/o CHH en el gen ND1, de acuerdo al segundo metodo de la invencion, se determina mediante pirosecuenciacion.
De acuerdo al segundo metodo de la invencion:
- una hipermetilacion en al menos uno de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
- una hipermetilacion en al menos uno de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
- una hipermetilacion en al menos uno de los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5,
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CpG en el gen ND1 mostrados en la Tabla 2, y/o
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CHG en el gen ND1 mostrados en la Tabla 4,
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es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer; o
- una hipometilacion en al menos, uno de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
- una hipometilacion en al menos, uno de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, y/o
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Parkinson.
En una realization particular, el segundo metodo de la invention comprende determinar el patron de metilacion de todos los sitios CpG, de todos los sitios CHG y de todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en las Tablas 1, 3 y 5, y el patron de metilacion de todos los sitios CpG y de todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en las Tablas 2 y 4.
Tercer metodo de la invencion
En un tercer aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para monitorizar la progresion de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson en un sujeto (de aqu en adelante, tercer metodo de la invencion) que comprende:
a) determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patron de metilacion en la region D-loop, y/o en el gen ND1, en donde el patron de metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5y
b) comparar el patron de metilacion determinado en la etapa a) con dicho patron de metilacion obtenido en un estadio anterior de la enfermedad, en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en
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al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 con respecto dicho patron de metilacion determinado en un estadio anterior de la enfermedad, es indicativo del avance de la enfermedad de Alzheimer; y
en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop con respecto a dicho patron de metilacion determinado en un estadio anterior de la enfermedad es indicativo del avance de la enfermedad de Parkinson.
El termino “monitorizar la progresion”, que es equivalente a “determinar la prognosis”, se refiere a la determination de la evolution de una enfermedad en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad. Particularmente, dicho termino se refiere a la determinacion de la progresion de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y de la enfermedad de Parkinson en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad. Como el experto en la materia sabe, existen varios parametros adecuados para determinar la evolucion de una enfermedad en un sujeto, por ejemplo, la evolucion de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de EA y EP, puede determinarse por ejemplo, mediante, la determinacion de la supervivencia global.
El termino “supervivencia global”, tal y como se utiliza en el presente documento, hace referencia al porcentaje de sujetos que sobreviven, desde el momento de diagnostico o tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, al cabo de un periodo de tiempo definido.
Los terminos “sujeto”, “enfermedad neurodegenerativa”, “enfermedad de Alzheimer”, “enfermedad de Parkinson”, “muestra”, “ADN mitocondrial”, “region D-loop”, “gen ND1”, “sitio CpG”, “sitio CHG”, sitio CHH”, “patron de metilacion”, “hipermetilacion” e “hipometilacion” se han descrito en detalle en el contexto del primer metodo de la invention y se utilizan con el mismo significado en el tercer metodo de la invencion”.
De acuerdo con el tercer metodo de la invencion, la primera etapa de determinacion del pronostico de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de EA y EP comprende determinar en una muestra que comprende ADN mitocondrial de un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad neurodegenerativa, el patron de metilacion en la region D-loop y/o en el gen ND1 en al menos un sitio seleccionado de los sitios mostrados en las Tablas 1 a 5.
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En una segunda etapa, el tercer metodo de la invention comprende comparar el patron de metilacion obtenido en dicha primera etapa con dicho patron de metilacion obtenido en un estadio anterior de la enfermedad. Por lo tanto, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en una muestra que comprende ADN mitocondrial (primera muestra) de un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad neurodegenerativa, el patron de metilacion en la region D-loop y/o en el gen ND1 en al menos un sitio seleccionado de los sitios CpG, CHG y/o CHH mostrados en las Tablas 1 a 5 y, transcurrido un periodo de tiempo adecuado, determinar en una muestra que comprende ADN mitocondrial (segunda muestra) de dicho sujeto diagnosticado con dicha enfermedad neurodegenerativa, el patron de metilacion en dichos sitios. Dicha segunda muestra puede ser obtenida transcurrido un periodo de un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, un ano, dos anos, tres anos, cuatro anos, cinco anos, diez anos o mas tras la obtencion de la primera muestra.
En una realization particular, dicha primera muestra es obtenida de un sujeto que no esta recibiendo ningun tratamiento adecuado para dicha enfermedad neurodegenerativa seleccionada de AE y EP y dicha segunda muestra es obtenida transcurrido un periodo de tiempo tras el tratamiento de dicha enfermedad. En otra realizacion particular, dicha primera muestra es obtenida al comienzo de un tratamiento adecuado para dicha enfermedad neurodegenerativa y la segunda muestra es obtenida durante uno o varios puntos durante el transcurso de dicho tratamiento.
De acuerdo al tercer metodo de la invencion:
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5,
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CpG en el gen ND1 mostrados en la Tabla 2, y/o
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CHG en el gen ND1 mostrados en la Tabla 4,
con respecto a dicho patron de metilacion determinado en un estadio anterior de la enfermedad es indicativo del avance de la enfermedad de Alzheimer; o
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- una hipometilacion en al menos, uno de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
- una hipometilacion en al menos, uno de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, y/o
- una hipometilacion en al menos uno de los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
con respecto a dicho patron de metilacion determinado en un estadio anterior de la enfermedad es indicativo del avance de la enfermedad de Parkinson.
La expresion “avance de la enfermedad de Alzheimer” tal y como se usa en el presente documento, hace referencia que el sujeto se encuentra en un estadio mas evolucionado de la enfermedad con respecto al estadio en el que fue diagnosticado. Es decir, si el sujeto fue clasificado en un estadio I-II de la EA (de acuerdo con la afectacion cerebral y/o la
sintomatologia o manifestaciones clmicas de la enfermedad presentes en dicho sujeto) se
considera que el sujeto se encuentra en un estadio mas avanzado de la enfermedad si dicho sujeto pasa a estar clasificado en un estadio III-IV o en un estadio V-VI o si el sujeto pasa de estar clasificado en un estadio III-IV a estar clasificado en un estadio V-VI de la EA.
La expresion “avance de la enfermedad de Parkinson” tal y como se usa en el presente documento, hace referencia que el sujeto se encuentra en un estadio mas evolucionado de la enfermedad con respecto al estadio en el que fue diagnosticado. Es decir, si el sujeto fue clasificado en un estadio I-II de la EP (de acuerdo con la afectacion cerebral y/o la
sintomatologia o manifestaciones clmicas de la enfermedad presentes en dicho sujeto) se
considera que el sujeto se encuentra en un estadio mas avanzado de la enfermedad si dicho sujeto pasa a estar clasificado en un estadio III-IV o en un estadio V-VI o si el sujeto pasa de estar clasificado en un estadio III-IV a estar clasificado en un estadio V-VI de la EP.
En una realization particular del tercer metodo de la invention, la muestra que comprende ADN mitocondrial se selecciona de una biopsia de un tejido solido o de un biofluido. Las muestras pueden ser obtenidas por metodos convencionales conocidos por el experto en la materia.
En una realizacion todavia mas particular, el biofluido se selecciona de sangre periferica o liquido cefalorraquideo.
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En una realization todavia mas particular, dicho tejido solido es tejido cerebral. En una realization preferida de la invention, si se monitorizar la progresion de la enfermedad de Parkinson, dicha muestra de tejido cerebral es una muestra obtenida de la sustancia negra.
En una realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CpG de la region D-loop, mostrados en la Tabla 1.
En una realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CpG de la region D-loop seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 1. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 sitios CpG seleccionados de la Tabla 1.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en un sitio CpG del gen ND1 seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 2. En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 sitios CpG seleccionados de la Tabla 2.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2.
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En otra realization particular, el tercer metodo de la invention comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHG de la region D-loop, mostrados en la Tabla 3.
En una realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CHG de la region D-loop seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 3. En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13 o al menos 14 o 15 sitios CHG seleccionados de la Tabla 3.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CHG del gen ND1 seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 4. En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 6 sitios CpG seleccionados de la Tabla 4.
En una realizacion todavia mas particular y preferida de la invencion, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patron de metilacion en al menos un sitio seleccionado de los sitios CHH de la region D-loop, mostrados en la Tabla 5.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en al menos un sitio CHH de la region D-loop seleccionado de los sitios mostrados en la Tabla 5. En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion
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comprende determinar el patron de metilacion en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39, al menos 40, al menos 41, al menos 42 o al menos 43 sitios CHH seleccionados de la Tabla 5.
En una realization todavia mas particular y preferida de la invention, el tercer metodo de la invention comprende determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
En formas preferidas de realizacion, el tercer metodo de la invencion comprende:
(i) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2,
(ii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4,
(iv) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5,
(v) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 1 y en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(vi) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4,
(vii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
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(viii) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3 y en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4 y/o
(ix) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3
(x) determinar el patron de metilacion en todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4 y en todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
Metodos adecuados para determinar el patron de metilacion en una muestra de un sujeto que comprende ADN mitocondrial se han descrito en detalle en el contexto del primer metodo de la invention.
En una realization particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion en dichos sitios CpG, CHG y/o CHH mediante una tecnica seleccionada del grupo que consiste en PCR espedfica de metilacion (MSP), un metodo basado en enriquecimiento (p. ej. MeDIP, MBD-seq y MethylCap), secuenciacion por bisulfito y por un metodo basado en bisulfito (p. ej. RRBS, Infinium, GoldenGate, Cobra, MSP, MethyLight) y un metodo por digestion de restriction (p. ej., MRE-seq, o ensayo HELP), pirosecuenciacion, ensayo de ChIP-on-chip, o conversion diferencial, restriccion diferencial, peso diferencial de los sitio(s) CpG, CHG y/o CHH metilados del ADN.
En una realizacion particular y preferida de la invencion, el patron de metilacion de uno o mas sitios CpG, CHG y/o CHH en la region D-loop y/o uno o mas sitios CpG y/o CHH en el gen ND1, de acuerdo al tercer metodo de la invencion, se determina mediante pirosecuenciacion.
En una realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el patron de metilacion de todos los sitios CpG, de todos los sitios CHG y de todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en las Tablas 1, 3 y 5, y el patron de metilacion de todos los sitios CpG y de todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en las Tablas 2 y 4.
Cuarto metodo de la invencion
Los autores de la presente invencion han descubierto un polimorfismo de nucleotido simple (SNP) en la region D-loop del ADN mitocondrial que esta estadisticamente asociado al
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desarrollo de la enfermedad de Alzheimer si dicho SNP se encuentra en al menos el 60% de las moleculas de ADNmt de un sujeto.
Por lo tanto, en un cuarto aspecto, la invention se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto (de aqu en adelante, el cuarto metodo de la invencion) que comprende determinar en una muestra que comprende ADN mitocondrial de dicho sujeto el nucleotido en la position polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 (SEQ ID NO: 1) en la base de datos NCBI, en donde la detection del nucleotido C en dicha posicion polimorfica o la presencia del nucleotido C en dicha posicion polimorfica en al menos un 60% de las moleculas de ADN mitocondrial de dicho sujeto es indicativo de que el sujeto sufre dicha enfermedad o de que el sujeto tiene un riego elevado de desarrollar dicha enfermedad.
Los terminos “diagnostico”, “determinar el riesgo”, "muestra” y “ADN mitocondrial” han sido definidos en el contexto del primer, segundo y tercer metodo de la invencion y se utilizan con el mismo significado en el cuarto metodo de la invencion.
La presencia de un nucleotido concreto en una posicion polimorfica puede definirse como el porcentaje de moleculas de ADN que presentan dicho nucleotido en dicha posicion polimorfica con respecto al total de moleculas de ADN presentes en la muestra. De acuerdo con el cuarto metodo de la invencion se considera que el sujeto padece la enfermedad de Alzheimer o que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar dicha enfermedad si el ADNmt de dicho sujeto presenta el nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 cuando al menos el porcentaje de moleculas que presentan dicho nucleotido en dicha posicion es de al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o mas. En una realization particular, se considera que el sujeto padece la enfermedad de Alzheimer o que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar dicha enfermedad si el ADNmt de dicho sujeto presenta el nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en el 60% de las moleculas de ADNmt. En una realizacion preferida de la invencion se considera que el sujeto padece la enfermedad de Alzheimer o que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar dicha enfermedad si el ADNmt de dicho sujeto presenta el nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en el 71% de las moleculas de ADNmt. En otra realizacion preferida de la
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invention, se considera que el sujeto padece la enfermedad de Alzheimer o que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar dicha enfermedad si el ADNmt de dicho sujeto presenta el nucleotido C en la position polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en el 74% de las moleculas de ADNmt. En otra realization preferida de la invencion, se considera que el sujeto padece la enfermedad de Alzheimer o que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar dicha enfermedad si el ADNmt de dicho sujeto presenta el nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en el 78% de las moleculas de ADNmt.
Como el experto en la materia sabe, una muestra que comprende ADN mitocondrial puede ser homoplasmica o heteroplasmica. El termino "heteroplasmia” o "ADN mitocondrial heteroplasmico” tal y como se utiliza en el presente documento, hace referencia a que el ADN mitocondrial de un sujeto esta formado por una mezcla de ADN de al menos dos poblaciones diferentes de mitocondrias. El termino "homoplasmia” o "ADN mitocondrial homoplasmico” tal y como se utiliza en el presente documento, hace referencia a que el ADN mitocondrial de un sujeto esta formado por una unica poblacion de ADN de una unica poblacion mitocondrial.
En una realizacion particular, en el contexto de la presente invencion la muestra de ADN mitocondrial es homoplasmica, en cuyo caso todas las mitocondrias presentes en el sujeto contienen material genetico identico por lo que todas las mitocondrias de un sujeto presentan en su genoma el nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920. En aquellas realizaciones en donde la muestra de ADN mitocondrial es homoplasmica, el cuarto metodo de la invencion permite diagnosticar o determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto mediante la detection del nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en dicha muestra de ADN mitocondrial; es decir, la deteccion del nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en una muestra de ADN mitocondrial homoplasmica de un sujeto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Alzheimer o de que el sujeto tiene un riego elevado de desarrollar dicha enfermedad. Por el contrario, la deteccion del nucleotido T en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en una muestra de ADN mitocondrial homoplasmica de un sujeto es indicativo de que el sujeto no padece la enfermedad de Alzheimer o de que el sujeto tiene un riego bajo de desarrollar dicha enfermedad.
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En otra realization particular y preferida de la invention, la muestra de ADN mitocondrial es heteroplasmica, es decir el ADNmt del sujeto es de dos poblaciones mitocondriales cuyo material genetico no es identico entre sl De acuerdo a la presente invencion, la heteroplasmia se refiere a que un porcentaje de las mitocondrias de dicho sujeto presentan en su genoma el oligonucleotido C en la position polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 y el porcentaje restante de mitocondrias de dicho sujeto presentan en su genoma el oligonucleotido T en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920.
El experto en la materia entendera que la identification de la presencia del polimorfismo en al menos un 60% de las moleculas de ADNmt es igualmente util para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer en casos en los que el ADNmt del sujeto presente heteroplasmia como en los casos en los presente homoplasmia. Asi, en el caso de sujetos cuyo ADNmt es homoplasmico, la totalidad de las moleculas presentara el nucleotido T o el nucleotido C en la posicion 16519, en cuyo caso el porcentaje de moleculas de ADNmt con el polimorfismos indicativo de que el paciente es candidato a recibir un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer es del 100% o del 0%. Asi, en el caso de sujetos cuyo ADNmt es heteroplasmico, existira una poblacion de moleculas de ADNmt que presentara el nucleotido T en la posicion 16519 y una segunda poblacion de moleculas que presentara el nucleotido C en la posicion 16519. En ese caso, se considera que el paciente es candidato a recibir un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer cuando el porcentaje de moleculas de ANDmt que presentan el nucleotido C en la posicion 16519 es igual o superior al 60%.
La determination de la homoplasmia y heteroplasmia asi como el porcentaje de heteroplasmia o el "grado de heteroplasmia” puede determinarse mediante cualquier tecnica conocida por el experto en la materia. Ejemplos ilustrativos no limitativos de tecnicas que permiten determinar si una muestra de ADN mitocondrial es heteroplasmica incluyen pero no se limitan a southern-blot, PCR-RFLP o secuenciacion del ADNmt. Brevemente, la tecnica PCR-RFLP esta basada en el hecho de que, normalmente, la presencia de un SNP en una muestra esta asociada a la creation o destruction de secuencias concretas o dianas de una o varias enzimas de restriction. La detection de heteroplasmia mediante la tecnica PCR-RFLP consiste en una primera etapa, en la amplification de la region del material genetico que contiene el polimorfismo que se desea detectar, mediante el empleo oligonucleotidos espedficos, seguida de una segunda etapa en donde los fragmentos
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amplificados se someten a una reaccion de digestion enzimatica en presencia de una enzima de restriccion apropiada. Puesto que la presencia o ausencia del polimorfismo en la muestra esta asociada con la presencia o ausencia de la diana de restriccion espedfica, el patron de tamanos de los fragmentos obtenidos determinara si la muestra esta formada por un unico patron de bandas, en cuyo caso la muestra es homoplasmica. Si por el contrario, el analisis determina la presencia de dos patrones de bandas, correspondientes al ADN de dos poblaciones mitocondriales distintas, entonces la muestra de ADN mitocondrial es heteroplasmica.
El termino “polimorfismo de nucleotido simple” o “polimorfismo de un solo nucleotido” o “SNP”, tal y como se usa aqd, se refiere a una variacion en la secuencia de nucleotidos de un acido nucleico que se produce en un solo nucleotido (A, C, T o G), donde cada posible secuencia esta presente en un una proporcion igual o mayor al 1% de la poblacion. Estos polimorfismos aparecen cuando un solo nucleotido en el genoma se altera (por ejemplo, por medio de sustitucion, adicion o delecion). Cada version de la secuencia con respecto al sitio polimorfico se refiere como un alelo del sitio polimorfico. Los SNPs tienden a ser estables evolutivamente de generacion en generacion y, como tal, pueden ser usados para estudiar anomalias geneticas espedficas en una poblacion.
La variante polimorfica de la invencion es la posicion 16519 en base a la numeracion definida por el numero NC_012920 en la base de datos NCBI. La variante polimorfica contiene una C en dicha posicion.
Los terminos "determinacion de la secuencia de un SNP" o "detectar un SNP" se utilizan indistintamente en la presente invencion, y se refieren a la determinacion de la secuencia de un SNP particular en la materia objeto de estudio. La determinacion de la secuencia de los SNP se puede realizar por medio de varios procesos conocidos por la persona experta en la materia.
En algunas realizaciones particulares de la invencion, la muestra que comprende ADN mitocondrial se selecciona de una biopsia de un tejido solido o de un biofluido. Las muestras pueden ser obtenidas por metodos convencionales conocidos por el experto en la materia.
En una realizacion todavia mas particular, el biofluido se selecciona de sangre periferica o liquido cefalorraqddeo.
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En una realization todavia mas particular, dicho tejido solido es tejido cerebral.
Si el material en donde se desea determinar dicho SNP segun el presente metodo es un tejido solido o un biofluido, preferiblemente se procede a una extraction previa del acido nucleico de la muestra empleando cualquier tecnica apropiada para ello. En una realizacion preferida de la invention, la fraction de ADN adecuada para la puesta en practica de la invention es el ADN total. La extraccion del ADN puede ser llevado a cabo usando cualquier metodo conocido por los expertos en la materia tal y como se ha detallado para el primer metodo de la invencion.
Si se desea, la detection de dicho SNP de acuerdo al presente metodo puede llevarse a cabo en muestras en donde previamente se ha aislado la fraccion mitocondrial y posteriormente se ha aislado el ADN de las mismas. El aislamiento de la fraccion mitocondrial puede ser llevada a cabo usando cualquier metodo conocido de fraccionamiento celular y que han sido detallados en primer metodo de la presente invencion.
Despues de aislar y amplificar (si es necesario) el acido nucleico, se detecta la secuencia del SNP de la invencion por cualquier metodo o tecnica capaz de determinar nucleotidos presentes en un SNP o polimorfismo. Por ejemplo, se puede detectar un SNP mediante la realizacion de secuenciacion, mini-secuenciacion, hibridacion, analisis de fragmentos de restriction, ensayo de ligacion de oligonucleotidos, PCR espedfica de alelo, o una combination de los mismos. Como tal, los sistemas y metodos para la deteccion de SNPs, en general incluyen, pero no se limitan a, secuenciacion de acidos nucleicos, metodos de hibridacion y la tecnologia de matriz (por ejemplo, la tecnologia disponible de Aclara BioSciences, Affymetrix, Agilent Technologies, Illumina Inc., etc); tambien se pueden utilizar tecnicas basadas en el cambio de movilidad de los fragmentos de acido nucleico amplificados, como por ejemplo Single Stranded Conformational Polymorphism (SSCP), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), Chemical Mismatch Cleavage (CMC), Restriction Fragment Polymorphisms (RFLPs), PCR-RFLP, WAVE analysis y similares (Methods Mol. Med. 2004; 108: 173-88). Por supuesto, esta lista es meramente ilustrativa y en modo alguno limitativa. Los expertos en la materia pueden usar cualquier metodo apropiado para lograr dicha deteccion.
En otra realizacion particular, la determination de la secuencia de dicho SNP se lleva a cabo mediante PCR-RFLP.
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En una realization particular, el cuarto metodo de la invention se refiere a un metodo in vitro para diagnosticar estadios tempranos de la EA. El termino “estadios tempranos de la enfermedad de Alzheimer” segun se utiliza en la presente invencion, se refiere a la enfermedad de Alzheimer en estadios I-II segun la escala Braak definida en el contexto del primer metodo de la invencion.
Quinto metodo de la invencion
En un quinto aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer que comprende determinar en una muestra que comprende ADN mitocondrial de dicho sujeto el nucleotido en la position polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en la base de datos NCBI, en donde la detection del nucleotido C en dicha posicion polimorfica o la presencia del nucleotido C en dicha posicion polimorfica en al menos un 60% de las moleculas de ADN mitocondrial de dicho sujeto es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer.
Los terminos “Alzheimer”, “tratamiento”, “muestra”, ADN mitocondrial”, y “polimorfismo” asi como metodos para obtener dicha muestra y detectar un polimorfismo han sido detallados en el contexto del primer, segundo, tercer y cuarto metodo de la invencion y se utilizan aqu con el mismo significado.
De acuerdo con el quinto metodo de la invencion se considera que el sujeto es candidato a ser sometido a un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer si el ADNmt de dicho sujeto presenta el nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 cuando al menos el porcentaje de moleculas de ADNmt que presentan dicho nucleotido en dicha posicion es de al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o mas. En una realizacion particular, se considera que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer si el ADNmt de dicho sujeto presenta el nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en el 60% de las moleculas de ADNmt.
El experto en la materia entendera que la identification de la presencia del polimorfismo en al menos un 60% de las moleculas de ADNmt es igualmente util para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer en casos en los
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que el ADNmt del sujeto presente heteroplasmia como en los casos en los presente homoplasmia. Asi, en el caso de sujetos cuyo ADNmt es homoplasmico, la totalidad de las moleculas presentara el nucleotido T o el nucleotido C en la posicion 16519, en cuyo caso el porcentaje de moleculas de ADNmt con el polimorfismos indicativo de que el paciente es candidato a recibir un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer es del 100% o del 0%. Asi, en el caso de sujetos cuyo ADNmt es heteroplasmico, existira una poblacion de moleculas de ADNmt que presentara el nucleotido T en la posicion 16519 y una segunda poblacion de moleculas que presentara el nucleotido C en la posicion 16519. En ese caso, se considera que el paciente es candidato a recibir un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer cuando el porcentaje de moleculas de ANDmt que presentan el nucleotido C en la posicion 16519 es igual o superior al 60%.
En algunas realizaciones particulares de la invention, la muestra que comprende ADN mitocondrial se selecciona de una biopsia de un tejido solido o de un biofluido. Las muestras pueden ser obtenidas por metodos convencionales conocidos por el experto en la materia.
En una realization particular, en el contexto de la presente invencion la muestra de ADN mitocondrial es homoplasmica, en cuyo caso todas las mitocondrias presentes en el sujeto contienen material genetico identico por lo que todas las mitocondrias de un sujeto presentan en su genoma el nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920. En aquellas realizaciones en donde la muestra de ADN mitocondrial es homoplasmica, el quinto metodo de la invencion permite seleccionar un paciente para someterlo a un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer mediante la detection del nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en dicha muestra de ADN mitocondrial; es decir, la deteccion del nucleotido C en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en una muestra de ADN mitocondrial homoplasmica de un paciente es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzhemier. Por el contrario, la deteccion del nucleotido T en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 en una muestra de ADN mitocondrial homoplasmica de un paciente es indicativo de que dicho paciente no es candidato a recibir un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer.
En otra realizacion particular y preferida de la invencion, la muestra de ADN mitocondrial es heteroplasmica, es decir el ADNmt del sujeto es de dos poblaciones mitocondriales cuyo
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material genetico no es identico entre si. De acuerdo a la presente invention la heteroplasmia se refiere a que un porcentaje de las mitocondrias de dicho sujeto presentan en su genoma el oligonucleotido C en la position polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920 y el porcentaje restante de mitocondrias de dicho sujeto presentan en su genoma el oligonucleotido T en la posicion polimorfica 16519 segun la secuencia definida con el numero de acceso NC_012920.
Metodos para determinar si una muestra es homoplasmica o heteroplasmica asi como para determinar el grado de heteroplasmia de una muestra han sido detallados en el contexto del cuarto metodo de la invencion y se incorporan aqu por referencia.
En una realization todavia mas particular, el biofluido se selecciona de sangre periferica o liquido cefalorraquideo.
En una realizacion todavia mas particular, dicho tejido solido es tejido cerebral.
Si el material en donde se desea determinar dicho SNP segun el presente metodo es un tejido solido o un biofluido, preferiblemente se procede a una extraction previa del acido nucleico de la muestra empleando cualquier tecnica apropiada para ello. En una realizacion preferida de la invencion, la fraction de ADN adecuada para la puesta en practica de la invencion es el ADN total. La extraccion del ADN puede ser llevado a cabo usando cualquier metodo conocido por los expertos en la materia tal y como se ha detallado para el primer metodo de la invencion.
En otra realizacion particular, la determination de la secuencia de dicho SNP se lleva a cabo mediante PCR-RFLP.
Polinucleotidos de la invencion
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “primer polinucleotido de la invencion”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1.
El termino "polinucleotido", como se usa aqui, se refiere a moleculas de ADN o ARN de cadena simple, de mas de 13 bases de longitud. Los polinucleotidos de la invencion son preferiblemente moleculas de ADN de al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 18,
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al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100 o mas bases de longitud.
En una realization particular, el primer polinucleotido de la invention comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CpG seleccionado de la Tabla 1.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “segundo polinucleotido de la invencion”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2.
En una realizacion particular, el segundo polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CpG seleccionado de la Tabla 2.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “tercer polinucleotido de la invencion”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3.
En una realizacion particular, el tercer polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CHG seleccionado de la Tabla 3.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “cuarto polinucleotido de la invencion”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4.
En una realizacion particular, el cuarto polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos
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En otro aspecto, la presente invention se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “quinto polinucleotido de la invention”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
En una realization particular, el quinto polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CHH seleccionado de la Tabla 5.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “sexto polinucleotido de la invencion”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1, en donde la position correspondiente a la citosina en dicho sitio CpG es uracilo.
En una realizacion particular, el sexto polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CpG seleccionado de la Tabla 1 en donde la posicion correspondiente a la citosina en dicho sitio CpG es uracilo.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “septimo polinucleotido de la invencion”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2, en donde la posicion correspondiente a la citosina en dicho sitio CpG es uracilo.
En una realizacion particular, el septimo polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CpG seleccionado de la Tabla 2, en donde la posicion correspondiente a la citosina en dicho sitio CpG es uracilo.
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En otro aspecto, la presente invention se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “octavo polinucleotido de la invention’”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, en donde la position correspondiente a la citosina en dicho sitio CHG es uracilo.
En una realization particular, el octavo polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CHG seleccionado de la Tabla 3, en donde la posicion correspondiente a la citosina en dicho sitio CHG es uracilo.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “noveno polinucleotido de la invencion”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, en donde la posicion correspondiente a la citosina en dicho sitio CHG es uracilo.
En una realizacion particular, el noveno polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CHG seleccionado de la Tabla 4, en donde la posicion correspondiente a la citosina en dicho sitio CHG es uracilo.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico (de aqu en adelante “decimo polinucleotido de la invencion”) que comprende al menos 9 polinucleotido contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado de los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5, en donde la posicion correspondiente a la citosina en dicho sitio CHH es uracilo.
En una realizacion particular, el decimo polinucleotido de la invencion comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o mas nucleotidos contiguos a dicho al menos un sitio CHH seleccionado de la Tabla 5, en donde la posicion correspondiente a la citosina en dicho sitio CHH es uracilo.
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En otro aspecto, la invencion se relaciona con un polinucleotido que hibrida de forma espedfica con dichos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, septimo, octavo, noveno y decimo polinucleotidos de la invencion.
La expresion “que hibrida de forma espedfica” o “capaz de hibridar de forma espedfica”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un oligonucleotido o de un polinucleotido de reconocer espedficamente la secuencia de un sitio CpG, CHG y CHH. Tal y como se usa aqu el termino “hibridacion” es el proceso de combinar dos moleculas de acido nucleico de cadena simple o moleculas con un alto grado de similitud que da lugar a una molecula simple de cadena doble mediante el apareamiento espedfico entre bases complementarias. Normalmente la hibridacion ocurre bajo condiciones muy rigurosas o condiciones moderadamente rigurosas.
Como se conoce en la tecnica, la "similitud" entre dos moleculas de acido nucleico se determina comparando la secuencia de nucleotidos de una molecula a la secuencia de nucleotidos de una segunda molecula. Las variantes de acuerdo con la presente invencion incluyen secuencias de nucleotidos que son al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% similares o identicas a la secuencia de dichos al menos un sitio CpG, CGH y CHH seleccionado de los sitios mostrados en las Tablas 1 a 5. El grado de identidad entre dos moleculas de acido nucleico se determina utilizando algoritmos informaticos y metodos que son ampliamente conocidos por las personas expertas en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoacidos se determina preferiblemente mediante el algoritmo BLASTN (BLAST Manual, Altschul et al, 1990, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J. Mol Biol. 215: 403-10).
La "rigurosidad" de las reacciones de hibridacion se determina facilmente por un experto ordinario en la materia, y generalmente es un calculo empmco dependiente de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentracion de sal. En general, las sondas mas largas requieren temperaturas mas altas para una correcta hibridacion, mientras que sondas mas cortas necesitan temperaturas mas bajas. La hibridacion generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias estan presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusion. Cuanto mayor sea el grado de homologia deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderian a hacer las condiciones de reaccion mas rigurosas, mientras
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que temperaturas mas bajas no tanto. Para detalles adicionales y una explication de la astringencia de las reacciones de hibridacion, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
El termino "condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se usa en la presente memoria, tipicamente: (1) utilizan una fuerza ionica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo 0,015 M de cloruro de sodio/0,0015M de citrato sodico /0.1% dodecil sulfato de sodio a 50 ° C; (2) emplean durante la hibridacion un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v / v) formamida con 0,1% de albumina de suero bovino/0.1% Ficoll/0.1% polivinilpirrolidona/50 mM de tampon de fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM de cloruro sodico, 75 mM citrato sodico a 42 ° C; o (3) emplean 50% de formamida, 5xSSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato sodico), 50 mM fosfato sodico (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, solution de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmon sonicado (50 mg / ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42 ° C, con lavados a 42 ° C en 0,2 x SSC (cloruro sodico / citrato sodico) y formamida al 50%, seguido por un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 xSSC que contiene EDTA a 55 ° C.
"Condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solucion de lavado y condiciones de hibridacion (p. ej., temperatura, fuerza ionica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubation durante la noche a 37 ° C en una solucion que comprende: 20% de formamida, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato trisodico), 50 mM fosfato sodico (pH 7,6), solucion de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado fragmentado, seguido por lavado de los filtros en 1xSSC a aproximadamente 37-50° C. El experto en la materia reconocera como ajustar la temperatura, fuerza ionica, etc. en caso necesario para adaptar factores tales como longitud de la sonda y similares.
Kits de la invention
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un kit (de aqu en adelante “primer kit de la invencion”), que comprende al menos un oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente y de forma dependiente de metilacion con una secuencia en el ADN mitocondrial que comprende un sitio de metilacion seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
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(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2,
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
Los terminos "sitio CpG”, sitio CHG”, "sitio CHH”, "region D-loop” y "gen ND1” se han descrito en detalle en el contexto del primer metodo de la invencion y el termino "capaz de hibridar de forma espedfica” se ha definido en el contexto de los polinucleotidos de la invencion. Dichos terminos se utilizan con el mismo significado en el contexto de los kits de la invencion
En una forma de realizacion preferida, los oligonucleotidos que forman parte del kit de la invencion y que son capaces de hibridar espedficamente y de forma dependiente de metilacion con una secuencia en el ADN mitocondrial que comprende un sitio de metilacion seleccionado del grupo formado por
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2,
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
constituyen al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 100% de la cantidad total de los oligonucleotidos que forman el kit. En formas de realizacion adicionales, dichos oligonucleotidos constituyen al menos el 55% al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la cantidad total de oligonucleotidos que forman el kit.
Kits adecuados incluyen diversos reactivos para uso de acuerdo con la presente invencion, en contenedores adecuados y materiales de embalaje, incluidos tubos, viales, y paquetes retractilados y moldeados por soplado. Ademas, los kits de la invencion pueden contener instrucciones para el uso simultaneo, secuencial o separado de los distintos componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden estar en la forma de material impreso o en la forma de un soporte electronico capaz de almacenar instrucciones de manera que puedan ser leidos por un sujeto, tales como medios de almacenamiento electronico (discos magneticos, cintas y similares), medios opticos (CD-ROM, DVD) y
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similares. Adicionalmente o alternativamente, los medios pueden contener las direcciones de Internet que proporcionan dichas instrucciones.
Materiales adecuados para su inclusion en un ejemplar de kit de acuerdo con la presente invencion comprenden uno o mas de los siguientes: reactivos capaces de amplificar una secuencia espedfica de un dominio ya sea ADN total o ADNmt sin la necesidad de realizar la PCR; reactivos requeridos para discriminar entre los diversos alelos posibles en los dominios de secuencia amplificados por PCR o amplificacion no-PCR (p. ej., endonucleasas de restriccion, oligonucleotidos que hibridan preferentemente sitios CpG, CHG y/o CHH metilados o no metilados, incluyendo aquellos modificados para contener enzimas o grupos qdmicos fluorescentes que amplifican la senal del oligonucleotido y hacen que la discriminacion entre sitios CpG, CHG y/o CHH metilados o no metilados sea mas robusto); o reactivos requeridos para separar fisicamente productos derivados de las diversas regiones amplificadas (por ejemplo, agarosa o poliacrilamida y un tampon para ser utilizado en electroforesis, columnas de HPLC, geles SSCP, geles de formamida o un soporte de matriz para MALDI-TOF ).
El termino "oligonucleotido", como se usa aqd, se refiere a una molecula de ADN o ARN corta de cadena simple, con hasta 50 bases de longitud. Los oligonucleotidos de la invencion son preferiblemente moleculas de ADN de al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 45 o 50 bases de longitud.
Tal como se usa en el kit de la invencion, al menos un oligonucleotido capaz de hibridar con al menos una secuencia de un sitio CpG de la region D-loop seleccionado de los sitios CpG mostrados en la Tabla 1, al menos un oligonucleotido capaz de hibridar con al menos una secuencia de un sitio CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2, al menos un oligonucleotido capaz de hibridar con al menos una secuencia de un sitio CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, al menos un oligonucleotido capaz de hibridar con al menos una secuencia de un sitio CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4 y/o al menos un oligonucleotido capaz de hibridar con al menos una secuencia de un sitio CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5, de manera espedfica de metilacion, se usa como un cebador para amplificar la region que contiene dichos sitio(s) CpG, CHG y/o CHH. Alternativamente, dicho al menos un oligonucleotido tambien se puede utilizar como una sonda para detectar dichos sitio(s) CpG, CHG y/o CHH metilados o no metilados.
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En una realizacion preferida el primer kit de la invencion comprende oligonucleotidos capaces de hibridar espedficamente con todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1, con todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2, con todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3, con todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4 y/o con todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
Si se desea, el primer kit de la invencion puede comprender un primer oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente con un oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CpG de la region D-loop mostrado en la Tabla 1 cuando dicho sitio CpG esta metilado, y al menos un oligonucleotido o polinucleotido capaz de hibridar espedficamente con el mismo oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CpG de la region D-loop cuando dicho sitio CpG no esta metilado; y/o el kit puede comprender un primer oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente con un oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CpG del gen ND1 mostrado en la Tabla 2 cuando dicho sitio CpG esta metilado, y al menos un oligonucleotido o polinucleotido capaz de hibridar espedficamente con el mismo oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CpG de la region D-loop cuando dicho sitio CpG no esta metilado; y/o el kit puede comprender un primer oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente con un
oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CHG de la region D-loop mostrado en la Tabla 3 cuando dicho sitio CHG esta metilado, y al menos un oligonucleotido o polinucleotido capaz de hibridar espedficamente con el mismo oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CHG de la region D-loop cuando dicho sitio CHG no esta metilado; y/o el kit puede
comprender un primer oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente con un
oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CHG del gen ND1 mostrado en la Tabla 4 cuando dicho sitio CHG esta metilado, y al menos un oligonucleotido o polinucleotido capaz de hibridar espedficamente con el mismo oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CHG de la region D-loop cuando dicho sitio CHG no esta metilado; y/o el kit puede comprender un primer oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente con un
oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CHH de la region D-loop mostrado en la Tabla 5 cuando dicho sitio CHH esta metilado y al menos un oligonucleotido o polinucleotido capaz de hibridar espedficamente con el mismo
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oligonucleotido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CHH de la region D-loop cuando dicho sitio CHH no esta metilado.
Para la hibridacion a un sitio CpG no metilado, los cebadores espedficos que hibridan con el ADN no metilado tienen, preferiblemente, una T en el par CG en 3’ para distinguirla de la C retenida en el ADN metilado. Es preferible que los cebadores contengan relativamente pocas Cs o Gs en la secuencia ya que las Cs estaran ausentes en el cebador sentido y las Gs ausentes en el cebador antisentido (citosina se convierte en uracilo, que se amplifica como timidina en el producto de amplificacion). En consecuencia, para la hibridacion a un sitio CpG metilado, los cebadores que hibridan espedficamente con el ADN metilado tienen preferiblemente una C en el extremo 3' del par CG.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un kit (de aqu en adelante “segundo kit de la invencion”), que comprende al menos un oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente con una zona en posicion 5' o en posicion 3' con respecto a un sitio de metilacion en el ADN mitocondrial seleccionado del grupo formado por:
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2,
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
en donde la citosina metilada en dicha posicion se ha convertido a uracilo o a otra base que es distinguible de citosina en sus propiedades de hibridacion.
En una forma de realizacion preferida, los oligonucleotidos que forman parte del kit de la invencion y que son capaces de hibridar espedficamente con una zona en posicion 5' o en posicion 3' con respecto a un sitio de metilacion en el ADN mitocondrial seleccionado del grupo formado por
(i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2,
(iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
(v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
constituyen al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 100% de la cantidad total de los oligonucleotidos que forman el kit. En formas de realizacion
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adicionales, dichos oligonucleotidos constituyen al menos el 55% al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la cantidad total de oligonucleotidos que forman el kit.
En una realization particular, el segundo kit de la invention comprende ademas, uno o mas reactivos para convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que es detectable diferencialmente a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion. En una realizacion preferida, el uno o mas reactivos para convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que es detectablemente diferente a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion es un bisulfito, preferiblemente bisulfito sodico. En otra realizacion, el reactivo capaz de convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que es detectable diferencialmente a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion es metabisulfito, preferiblemente metabisulfito sodico.
El termino "conversion de reactivo" y sus detalles se han descrito en detalle en el contexto del metodo de diagnostico de la invencion y se utilizan con el mismo significado en el contexto del kit de acuerdo con la invencion.
En una realizacion particular, el segundo kit de la invencion comprende al menos un oligonucleotido que comprende una secuencia seleccionada de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5.
En otro aspecto, la invencion se refiere al uso del primer y/o segundo kit de la invencion para determinar el patron de ADN mitocondrial en un sujeto o para determinar el diagnostico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
***
La invencion se describe por medio de los siguientes ejemplos que se han de interpretarse como meramente ilustrativas y no limitativas del alcance de la invencion
EJEMPLOS
MATERIALES Y METODOS
Diseno del estudio y sujetos incluidos
5
10
15
20
25
El estudio se llevo a cabo en 44 muestras, incluyendo patologia relacionada con enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP) y casos control. Las muestras fueron procesadas en una placa dividida en dos carriles. En el carril 1 se analizaron los amplicones D-Loop y ND1 en muestras de corteza entorrinal de casos de patologia relacionada con EA y sus controles correspondientes (Tabla 7). En el carril 2 se analizaron los amplicones D- Loop en muestras de sustancia negra de EP y sus controles correspondientes (Tabla 7). Cada paciente fue identificado en los cebadores utilizados con un MID (Multiplex Identifier) (Tablas 7 y 8). La metilacion en sitios CpG y no CpG (CHG y CHH, donde H = A, T, o C) se analizo utilizando un pirosecuenciador 454 GS FLX Titanium de Roche que genero 569,684 secuencias en el carril 1, cuyas longitudes variaban desde 40 hasta 1098 pares de bases (pb) con una longitud media de unos 417 pb. En el carril 2 el numero de secuencias obtenidas fue de 513,579, cuya longitud variaba desde 40 hasta 933 pb (longitud media de 466 pb). Los alineamientos de las secuencias obtenidas para cada MID, amplicon y carril frente a sus respectivas secuencias de referencia fueron anotados y los porcentajes de identidad entre estas estaban cerca del 100 %. La media y mediana de las tasas de conversion de bisulfito para cada locus y MID fueron analizadas.
El numero de secuencias no metiladas fue superior al numero de secuencias metiladas en cada sitio identificado y unos pocos sitios de metilacion no estaban presentes. Aquellas secuencias que despues del alineamiento se observo que teman, como mmimo, un sitio del patron de metilacion no presente, fueron eliminadas del analisis para evitar cualquier sesgo en el momento de la cuantificacion. Esta aproximacion elude el analisis de los pseudogenes mitocondriales putativos cuyos amplicones presentan casi un 100% de identidad con el ADN mitocondrial cuando se analizan en NCBI BLAST. La mayoria de sitios CpG, CHG, y CHH analizados estaban no metilados. Sin embargo, se pudieron identificar distintos sitios con metilacion diferencial (Tabla 6).
Carril
Amplicon Sitio Criterio N° de sitios C vs EAI-II C vs EAIII-IV EA I-II vs EA III-IV C vs EP
L1
Dloop CG FDR<0.01 18 17 14 12 -
L1
Dloop CG FDR<0.05 18 17 15 16 -
L1
ND1 CG FDR<0.01 13 7 7 0 -
L1
ND1 CG FDR<0.05 13 7 7 0 -
L1
Dloop CHG FDR<0.01 16 13 10 1 -
L1
Dloop CHG FDR<0.05 16 14 12 7 -
L1
ND1 CHG FDR<0.01 9 6 5 0 -
L1
ND1 CHG FDR<0.05 9 7 5 0 -
L1
Dloop CHH FDR<0.01 52 0 0 34 -
L1
Dloop CHH FDR<0.05 52 23 0 43 -
L1
ND1 CHH FDR<0.01 72 0 0 0 -
L1
ND1 CHH FDR<0.05 72 0 0 0 -
L2
Dloop CG FDR<0.01 18 - - - 17
L2
Dloop CG FDR<0.05 18 - - - 17
L2
Dloop CHG FDR<0.01 16 - - - 14
L2
Dloop CHG FDR<0.05 16 - - - 14
L2
Dloop CHH FDR<0.01 52 - - - 44
L2
Dloop CHH FDR<0.05 52 - - - 44
Tabla 6: Numero de sitios diferencialmente metilados. FRD: p-valor ajustado con el metodo de Benjamini y Hocheberg (1995), C: control, EA: enfermedad de Alzheimer, EP: enfermedad de Parkinson.
MID
Carril Region cerebral Diagnostico Estadio de Braak para EA Estadio de Braak para EP Genero Edad Tiempo postmortem (h)
1
L1 entorrinal CONTROL 0/0 0 H 56 5
2
L1 entorrinal CONTROL 0/0 0 H 56 3.45
3
L1 entorrinal CONTROL 0/0 0 M 55 8.3
4
L1 entorrinal CONTROL 0/0 0 M 66 4.15
5
L1 entorrinal CONTROL 0/0 0 M 64
5
6
L1 entorrinal CONTROL 0/0 0 M 52 5.45
7
L1 entorrinal CONTROL 0/0 0 H 57 5.20
8
L1 entorrinal CONTROL 0/0 0 H 64 3.3
9
L1 entorrinal EA asociada I /A 0 M 57 5
10
L1 entorrinal EA asociada I /A 0 M 64 2.15
11
L1 entorrinal EA asociada I 0 H 59 16.3
12
L1 entorrinal EA asociada II /A 0 M 86 4.15
13
L1 entorrinal EA asociada I /A 0 H 67 14.4
14
L1 entorrinal EA asociada II /A 0 H 66 4.55
15
L1 entorrinal EA asociada I /A 0 M 63 8.05
16
L1 entorrinal EA asociada II /A 0 M 76 5.45
17
L1 entorrinal EA asociada III /A 0 M 71 6.45
18
L1 entorrinal EA asociada lll/A 0 M 77 11.5
19
L1 entorrinal EA asociada lll/B 0 H 86 3.1
20
L1 entorrinal EA asociada IV/C 0 M 69 8.1
9
L1 entorrinal EA asociada I /A 0 M 57 5
10
L1 entorrinal EA asociada I /A 0 M 64 2.15
11
L1 entorrinal EA asociada I 0 H 59 16.3
12
L1 entorrinal EA asociada II /A 0 M 86 4.15
21
L1 entorrinal EA asociada III 0 M 79 3.4
22
L1 entorrinal EA asociada IV/C 0 H 75 6.1
23
L1 entorrinal EA asociada lll/A 0 M 74 4
24
L1 entorrinal EA asociada III /O 0 H 87 3.3
1
L2 SN CONTROL 0/0 0 M 78 3.4
2
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 66 3
3
L2 SN CONTROL 0/0 0 M 71 8.3
ES 2 546 743 A1
MID
Carril Region cerebral Diagnostico Estadio de Braak para EA Estadio de Braak para EP Genero Edad Tiempo postmortem (h)
4
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 30 4.1
5
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 47
5
6
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 67 5
7
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 39 9.15
8
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 85 5.45
9
L2 SN CONTROL 0/0 0 M 46 9.35
10
L2 SN CONTROL 0/0 0 M 77 3.15
11
L2 SN EP 0/0 3,4 H 68 9.2
12
L2 SN EP 0/0 3,4 M 81 6.3
13
L2 SN EP 0/0 3,4 H 76 12.3
14
L2 SN EP 0/0 3,4 M 77 3.3
15
L2 SN EP 0/0 3,4 M 78 27.3
16
L2 SN EP 0/0 3,4 M 69 4.3
5
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 47
5
6
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 67 5
7
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 39 9.15
8
L2 SN CONTROL 0/0 0 H 85 5.45
9
L2 SN CONTROL 0/0 0 M 46 9.35
10
L2 SN CONTROL 0/0 0 M 77 3.15
11
L2 SN EP 0/0 3,4 H 68 9.2
12
L2 SN EP 0/0 3,4 M 81 6.3
13
L2 SN EP 0/0 3,4 H 76 12.3
14
L2 SN EP 0/0 3,4 M 77 3.3
15
L2 SN EP 0/0 3,4 M 78 27.3
16
L2 SN EP 0/0 3,4 M 69 4.3
17
L2 SN EP I/O 4 H 69 6
18
L2 SN EP 0/0 4 M 84 4.3
19
L2 SN EP 0/0 5 H 76 12
20
L2 SN EP 0/0 5 H 80 7.3
Tabla 7: Resumen de las principales caracteristicas clinicas y neuropatologicas de los casos humanos analizados. Los estadios de Braak para la enfermedad de Alzheimer (EA) indican el grado de presencia de neuronas con neurodegeneracion fibrilar (numeros romanos) y placas seniles (letras) siguiendo la clasificacion de Braak. Los estadios de Braak para la enfermedad de Parkinson (EP) hacen referenda al grado de presencia de la proteina a-sinucleina (Lewy bodies).
ES 2 546 743 Al
Numero MID
Secuencia MID SEQ ID NO
1
ACGAGTGCGT 6
2
ACGCTCGACA 7
3
AGACGCACTC 8
4
AGCACTGTAG 9
5
ATCAGACACG 10
6
ATATCGCGAG 11
7
CGTGTCTCTA 12
8
CTCGCGTGTC 13
9
TAGTATCAGC 14
10
TCTCTATGCG 15
11
TGATACGTCT 16
12
TACTGAGCTA 17
13
CATAGTAGTG 18
14
CGAGAGATAC 19
15
ATACGACGTA 20
16
TCACGTACTA 21
17
CGTCTAGTAC 22
18
TCTACGTAGC 23
19
TGTACTACTC 24
20
ACGACTACAG 25
21
CGTAGACTAG 26
22
TACGAGTATG 27
23
TACTCTCGTG 28
24
TAGAGACGAG 29
Tabla 8: secuencia MID asociados a cada caso analizado
Muestras de cerebro humano
Las muestras de tejido fueron cedidas por el Banco de Tejido Neurologico, Universidad de 5 Barcelona - Hospital Clmico de Barcelona y el Banco del Instituto de Neuropatologfa, HUB- ICO-IDIBELL. La donacion y obtencion de las muestras fue regulada por el comite etico de ambas instituciones. La mitad de cada cerebro fue mantenida en solucion tamponada en 4% formalina para el estudio morfologico e histologico, mientras que la otra mitad fue procesada en secciones coronales para congelar a -80C para estar disponible para estudios 10 bioquimicos. El examen neuropatologico en todos los casos controles y patologicos se llevo a cabo en treinta secciones estandarizadas del cerebro, cerebelo y tronco encefalico, los
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cuales fueron tenidos con hematoxilina y eosina, y Kluver Barrera, o procesadas para inmunohistoqwmica para la protema acida glial fibrilar, marcadores microgliales, B-amiloide, tau fosforilada (anticuerpo AT8), a-sinuclema, aB-cristalina, ubiquitina y TDP- 43. Los casos con patologia relacionada con EA y EP fueron clasificados de acuerdo con los criterios neuropatologicos actuales (Braak y Braak 1991, 1999; Braak et al, 2003, 2006). Los casos con patologia mixta (incluyendo lesiones vasculares) fueron excluidos de este estudio. Los cerebros usados como control pertenecieron a individuos sin manifestaciones neurologicas y sin lesiones en el estudio neuropatologico. Las historias clmicas fueron reexaminadas para cada caso, y los casos con patologia relacionada con la EA (estadios I-IV) fueron reevaluados mediante llamadas telefonicas o entrevistas con familiares, preguntando si teman constancia de algun impedimento neurologico o cognitivo. Solo los casos que cumplian estos criterios fueron considerados en el presente trabajo. Todos los casos analizados se resumen en la Tabla 7.
El intervalo promedio post-mortem de las muestras de corteza entorrinal fue de 4,98 ± 1,57 horas en los controles, 7,51 ± 5,13 horas en estadios I-II, y 5,70 ± 2,85 horas en estadios III- IV; para las muestras de la sustancia negra los intervalos fueron 5,59 ± 2,46 horas en los controles y 9,23 ± 7,07 horas en los casos de EP.
Extraccion de ADN total
El ADN total fue aislado de la corteza entorrinal y la sustancia negra (Tabla 7) utilizando el kit DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Madrid, Espana) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Tratamiento con bisulfito
Trescientos nanogramos de ADN fueron tratados con bisulfito usando el kit EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, Ecogen, Barcelona, Espana) siguiendo las instrucciones del proveedor. El ADN tratado con bisulfito se resuspendio en 30^l para llegar a una concentration final de 10ng/^l. Todas las muestras fueron tratadas con bisulfito en paralelo, utilizando el mismo lote de reactivo para evitar diferencias en la tasa de conversion de bisulfito entre diferentes lotes comerciales.
Diseno de los cebadores para FLX de los amplicones D-Loop, y ND1
Los cebadores para el experimento FLX fueron disenados siguiendo las instrucciones tecnicas para el secuenciador FLX de Roche “Amplicon Fusion Primer Design Guidelines for GS FLX Titanium Series Lib-A Chemistry". Los cebadores de fusion para los amplicones
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conteman un cebador direccional GS FLX Titanium cebador A o cebador B (incluyendo una secuencia clave (Key) de cuatro bases) en la porcion 5 -prima del oligonucleotido , ademas una secuencia espedfica para el molde en el 3 - final primera. Por otra parte, se anadio una secuencia MID (Multiplex Identifier) entre el cebador A (o cebador B) y la secuencia espedfica para la posterior identificacion automatizada de las muestras con el software despues de los pasos de agrupacion/multiplexado y secuenciacion. Los cebadores utilizados conteman los siguientes componentes: Cebador forward (Primer A -Key -MID - secuencia espedfica del molde), 5'- CGTATCGCCTCCCTCGCGCCA (SEQ ID NO: 33) - TCAG -MID - secuencia espedfica del molde -3 '; Cebador reverse (Cebador B- Key-MID - secuencia espedfica del molde): 5'- CTATGCGCCTTGCCAGCCCGC (SEQ ID NO: 34)- TCAG -MID - secuencia espedfica molde -3 '. Las secuencias espedficas de molde para cada uno de los amplicones : D- Loop- directo, 5' - TAGGGGTTTTTTGATTATTATTTTT -3 ' (SEQ ID NO: 2) y D- Loop -reverso , 5'- ACAAACATTCAATTATTATTATTATATCCT -3' (SEQ ID NO: 3); ND1 - directo, 5' - ATGGTTAATTTTTTATTTTTTATTGTATTT -3 ' (SEQ ID NO: 4) y ND1 -reverso , 5'- TAATTTAAATTTAATACTCACCCTAATCAA -3 ' (SEQ ID NO: 5). Los cebadores utilizados en este estudio fueron disenados evitando sitios CpG. La secuencia espedfica de los MID para cada paciente se indica en la Tabla 8. Regiones amplificadas (D-Loop: 16386-256; ND1: 3313-3686) se basan en la posicion de nucleotidos del mapa del ADN mitocondrial humano (
www.mitomap.org ).
Preparacion de la librerla de Amplicones
Las PCR para los amplicones D-Loop y ND1 se realizaron siguiendo el manual Amplicon Library Preparation Method Manual (GS FLX Titanium Series) de Roche. Para las PCRs se utilizaron veinte nanogramos de ADN total tratado con bisulfito. La amplificacion del ADN tratado bisulfito se llevo a cabo en un volumen de reaccion de 25^l . Cada reaccion de PCR consistio en: 1x de FastStart 10x Buffer #2, 0,05U/^l de polimerasa FastStart HiFi Polymerase (Roche), 200 nM de cada dNTP, y 200 nM de cada cebador concreto forward y reverse. Los cebadores se sintetizaron con una calidad de purificacion HPLC (Sigma - Aldrich , Madrid, Espana ). Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador Applied Biosystems Verity ® (Applied Biosystems, Madrid, Espana) usando las siguientes condiciones: 94°C durante 3 min y luego 36 ciclos de 94 ° C durante 15s, temperatura anillamiento (61°C ND1 , y 62°C D-Loop) durante 45s y 72°C durante 1 min, seguido por un paso de extension final a 72°C durante 8 min y una temperatura final de mantenimiento a 4°C. Dos microlitros de cada producto de PCR se comprobaron en un gel de agarosa del 1,5 % tenido con SYBR ® Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Madrid, Espana).
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Purificacion de las PCR
La purificacion de los productos de PCR se llevo a cabo utilizando el kit
Agencourt®AMPure®XP PCR Purification (Beckman Coulter, Madrid, Espana) siguiendo las indicaciones del manual de Roche Amplicon Library Preparation Method Manual (GS FLX Titanium Series).
Cuantificacion de las Librerlas de amplicones y secuenciacion FLX
La cuantificacion y los controles de calidad de las bibliotecas de amplicones y el resto del protocolo de secuenciacion FLX fue realizado por el equipo de la Plataforma de Genomica del Instituto de Recerca de Vall d'Hebron (VHIR, Barcelona, Espana).
Seleccion de los sitios diferencialmente metilados
El alineamiento y la identification de los sitios CpG, CHG, y CHH y las tasas de conversion de bisulfito se realizaron con el software BIQ Analyzer HT (Lutsik et al, 2011). El control de calidad de los datos crudos y todos los analisis estadisticos se realizaron utilizando el lenguaje estadistico R y el software bioconductor,
http:///www bioconductor.org .
La seleccion de los sitios diferencialmente metilados se baso en el calculo del test estadistico Fisher’s Exact Test, considerando diferencialmente metilados esos sitios con un p-valor ajustado con el metodo de Benjamini y Hochberg (1995) por debajo de 0,05. El p- value representado en los graficos Heatmaps es la relation las secuencias metiladas respecto a la suma global de secuencias metiladas y no metiladas por sitio (Du et al., 2010, BMC Bioinformatics, 30;11:587), es decir p,j = M / (M+U) donde M es el numero de secuencias metiladas en el sitio (i) y MID (j), y U es el numero de secuencias no-metiladas en el sitio (i) y MID (j).
Ejemplo 1: La metilacion del ADN esta incrementada en la region D-Loop y reducida en el gen ND1 en casos con estadios tempranos de patologia relacionada con EA
Se observo un incremento de metilacion en sitios CpG y no CpG (CHG y CHH) en la region D-Loop en los casos con patologia relacionada con EA de estadios I/II y III/IV de Braak (Fig. 1). El grado de metilacion fue superior en los casos de patologia relacionada con EA con respecto a las muestras control, y superior en estadios I/II frente a estadios III/IV, tal y como se representa en los graficos log2(OR) (Fig. 2). Sin embargo, no se encontraron diferencias en la metilacion de sitios CHH entre los controles y los casos con patologia relacionada con EA en las etapas III/IV.
El analisis de ND1 revelo la presencia de algunos sitios CpG y CHG menos metilados en los casos con patologia relacionada con EA en estadios I/II y III/IV respecto a las muestras control (log2 [O]> 0, Fig. 3). No se encontraron diferencias para los sitios CHH.
Ejemplo 2: La metilacion del ADN esta reducida en la region D-Loop en la sustancia 5 negra de casos con EP.
En contraste con lo observado en la corteza entorrinal en EA, la region D-Loop mostro una perdida de metilacion en casi todos los sitios CpG y no CpG en la sustancia negra de los casos con EP con respecto a las muestras control (Fig. 3). Sin embargo, como en la EA, el porcentaje de metilacion del ADN representa una pequena parte del total del ADN 10 mitocondrial.
Ejemplo 3: La presencia de la posicion polimorfica 16519 en el ADN mitocondrial esta asociada con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.
Los resultados mostrados en la Tabla 9 ponen de manifiesto que la presencia del polimortfismo T16519C esta associada a la enfermedad de Alzheimer. Dichos resultados se 15 obtuvieron mediante secuenciacion convencional y aplicando un test de Chi cuadrado.
Tipo de muestra (numero de muestras analizadas)
Presencia del polimorfismo T16519C (%) p-value
Controles (n=46)
56,5 -
EA I/II (n=47)
76,6 0,02
EA III/IV (n=47)
74,4 0,03
EA V/VI (n=46)
76,1 0,02
Tabla 9: Presencia del polimorfismo en muestras obtenidas de individuos controles y de individuos que padecen la enfermedad de Alzheimer (EA) en distintos estadios (numeros romanos).
Se observo la presencia de heteroplasmia en algunos casos y se realizo de nuevo el 20 genotipado de las muestras mediante el empleo de la tecnica PCR-RFLP. La presencia del alelo C genera una diana de restriction para el enzima de restriction HaeIII. Se llevo a cabo la amplification de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 30 empleando oligonucleotidos con secuencias SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32.
Se obtuvieron los siguientes patrones de bandas en funcion del genotipo:
Genotipo T: 183 pb, 318 pb Genotipo C: 61 pb, 183 pb, 257 pb Heteroplasmia: 61 pb, 183 pb, 257 pb, 319 pb.
TRADUCCION DE TERMINOS AL INGLES 5 El termino “DNA” significa “ADN”.
El termino “Artificial Sequence” significa “Secuencia Artificial”. El termino “misc_feature” significa “caracteristica miscelanea”.
10

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
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    REIVINDICACIONES
    1. Metodo in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patron de metilacion en la region D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patron de metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
    (i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
    (ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
    (iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
    (iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
    (v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
    en donde una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Alzheimer o de que el sujeto tiene un riego elevado de desarrollar la enfermedad de Alzheimer o
    en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Parkinson o de que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad de Parkinson.
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop con respecto al patron de metilacion en un sujeto en estadio I-II de la enfermedad de Alzheimer es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Alzheimer en estadio III-IV.
  3. 3. Metodo in vitro para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la
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    enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patron de metilacion en la region D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patron de metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
    (i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
    (ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
    (iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
    (iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
    (v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
    en donde una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una hipermetilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer o en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Parkinson.
  4. 4. Metodo para monitorizar la progresion de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende:
    a) determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el
    patron de metilacion en la region D-loop, y/o en el gen ND1, en donde el patron de
    metilacion se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:
    (i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
    (ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
    (iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
    (iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
    (v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
    b) comparar el patron de metilacion determinado en la etapa a) con dicho patron de
    metilacion obtenido en un estadio anterior de la enfermedad,
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 con respecto dicho patron de metilacion determinado en un estadio anterior de la enfermedad, es indicativo del avance de la enfermedad de Alzheimer; y
    en donde una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CpG de la region D-loop, una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHG de la region D-loop y/o una hipometilacion en al menos uno de dichos sitios CHH de la region D-loop con respecto a dicho patron de metilacion determinado en un estadio anterior de la enfermedad es indicativo del avance de la enfermedad de Parkinson.
  5. 5. El metodo segun las reivindicaciones 1 a 4 en donde la determination del patron de metilacion comprende la determinacion de la metilacion de todos los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1.
  6. 6. El metodo segun las reivindicaciones 1 a 5, en donde la determinacion del patron de metilacion comprende la determinacion de la metilacion todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2.
  7. 7. El metodo segun las reivindicaciones 1 a 6 en donde la determinacion del patron de metilacion comprende la determinacion de la metilacion de todos los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3.
  8. 8. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde la determinacion del patron de metilacion comprende la determinacion del patron de metilacion de todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4.
  9. 9. El metodo segun las reivindicaciones 1 a 8 en donde en donde la determinacion del patron de metilacion comprende la determinacion de la metilacion de todos los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
  10. 10. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el patron de metilacion se determina por una tecnica seleccionada del grupo que consiste en PCR espetifica de
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    metilacion, secuenciacion por bisulfito, tecnicas basadas en restriction-digestion, pirosecuenciacion, ensayo de ChIP-on chip, conversion diferencial, restriction diferencial y peso diferencial de los sitio(s) metilados.
  11. 11. Metodo segun la reivindicacion 10, en donde el patron de metilacion se determina mediante pirosecuenciacion.
  12. 12. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde la muestra que comprende ADN mitocondrial se selecciona de un biofluido o una biopsia de un tejido solido.
  13. 13. Metodo segun la reivindicacion 12, en donde dicho biofluido se selecciona de sangre periferica o liquido cefalorraquideo.
  14. 14. Metodo segun la reivindicacion 13, en donde dicho tejido solido es tejido cerebral.
  15. 15. Un acido nucleico seleccionado del grupo formado por:
    (i) un acido nucleico que comprende al menos 9 nucleotidos contiguos de una region del ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado del grupo formado por:
    a) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
    b) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
    c) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
    d) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y
    e) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5,
    (ii) un acido nucleico que comprende al menos 9 nucleotidos contiguos de una region de ADN mitocondrial en donde dicha region comprende al menos un sitio de metilacion seleccionado del grupo formado por:
    a) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
    b) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
    c) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
    d) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y
    e) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    en donde la posicion correspondiente a la citosina en el sitio CpG, CHG o CHH es uracilo; y
    (iii) un polinucleotido que hibrida de forma espedfica con los acidos nucleicos de (i) o
    (ii).
  16. 16. Un kit que comprende al menos un oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente y de forma dependiente de metilacion con una secuencia en el ADN mitocondrial que comprende un sitio de metilacion seleccionado del grupo formado por:
    (i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
    (ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
    (iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
    (iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
    (v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5.
  17. 17. Un kit que comprende al menos un oligonucleotido capaz de hibridar espedficamente con una zona en posicion 5’ o en posicion 3’ con respecto a un sitio de metilacion en el ADN mitocondrial seleccionado del grupo formado por:
    (i) los sitios CpG de la region D-loop mostrados en la Tabla 1,
    (ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;
    (iii) los sitios CHG de la region D-loop mostrados en la Tabla 3,
    (iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o
    (v) los sitios CHH de la region D-loop mostrados en la Tabla 5
    en donde la citosina metilada en dicha posicion se ha convertido a uracilo o a otra base que es distinguible de citosina en sus propiedades de hibridacion.
  18. 18. Un kit segun la reivindicacion 17, en donde dicho al menos un oligonucleotido comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5.
  19. 19. Uso de un kit de acuerdo a las reivindicaciones 16 a 18 para determinar el patron de metilacion del ADN mitocondrial o para determinar el diagnostico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
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