ES2425167T3 - Inmunoensayos para everolimús - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de determinación de la concentración de everolimús en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) proporcionar un competidor marcado que comprende everolimús acoplado con un marcador detectable a través de un ligamiento oxima y que tiene la fórmula: **Fórmula** en la que X1 es una cadena ligadora que comprende uno o más átomos, cada uno de los cuales puede estar no sustituido o sustituido y puede ser ramificado o no ramificado; Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y Z es dicho marcador detectable; b) proporcionar un anticuerpo anti-everolimús producido usando un compuesto antigénico que comprende everolimús acoplado con un portador antigénico a través de un ligador y que tiene la fórmula: **Fórmula** en la que n es 0 o 1; X es una cadena ligadora que comprende 3-10 átomos de carbono o heteroátomos, en la que dicha cadena ligadora puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada; Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y Z es dicho portador antigénico; c) combinar dicha muestra, dicho anticuerpo anti-everolimús y dicho competidor marcado, compitiendo el everolimús en dicha muestra con dicho competidor marcado por la unión a dicho anticuerpo anti-everolimús; y d) determinar la concentración de everolimús en dicha muestra midiendo la cantidad de dicho competidor marcado no unido a dicho anticuerpo mediante la detección de dicho marcador.

Description

Inmunoensayos para everolimus

CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se refiere en general a reactivos y a procedimientos para la determinacion de everolimus en fluidos biologicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El everolimus [40-O-(2-hidroxietil)rapamicina] es un inmunosupresor macrolido novedoso. El everolimus (tambien conocido como SDZ-RAD, RAD o Certican®) se ha desarrollado por Novartis (Nashan B. "The role of Certican in the many pathways of chronic rejection". Transplantation Proceedings, 2001, 33: 3215-3230) en un esfuerzo por mejorar la rapamicina (sirolimus), un inhibidor de la senal de proliferacion que bloquea las senales de transduccion activadas por factor de crecimiento en las respuestas celulares ante aloantigeno (Cottens S, et al. "O-Alkylated rapamycin derivatives and their use, particularly as immunosupressants", documento WO-009409010 28 de abril de 1994). El everolimus tiene una mayor estabilidad y una solubilidad potenciada en disolventes organicos, asi como una farmacocinetica mas favorable con menos efectos secundarios que la rapamicina (sirolimus). El everolimus se ha usado junto con una microemulsion de ciclosporina (Neoral®, Novartis) para aumentar la eficacia del regimen inmunosupresor (Kovarik JM, et al. "Exposure-response relationship for Certican in de novo kidney transplantation: define a therapeutic range". Transplantation 2002; 73(6): 920-925).

La complejidad del estado clinico y las diferencias individuales en sensibilidad a los efectos inmunosupresores y nefrotoxicos han sido bastante problematicos para que los medicos equilibraran entre eficacia terapeutica y aparicion de efectos secundarios (Wallemacq, Pierre E. "Therapeutic monitoring of immunosuppressant drugs. Where are we?" Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (2004), 42 (11), 1204-1211). La monitorizacion terapeutica de farmacos (MTF), definida como la medida e interpretacion de la concentracion de estos farmacos en fluidos biologicos, con el objetivo final de la prediccion de respuestas organicas, se ha convertido en una parte integral de los protocolos de transplante.

Se ha resenado la concentracion terapeutica de everolimus (Kovarik et al.) como de 3-15 ng/ml, que era coherente con eficacia con minimizacion de efectos adversos en transplante de rinon. Los datos recientes han mostrado tambien que la monitorizacion terapeutica de farmacos (MTF) de everolimus beneficiaria a pacientes de transplante de corazon (Starling, Randall C; et al. "Therapeutic drug monitoring for everolimus in heart transplant recipients based on exposure-effect modeling". American Journal of Transplantation (2004), 4(12), 2126-2131). Las concentraciones minimas de everolimus eran estables en el primer ano despues del transplante y promediaban 5,2 ± 3,8 y 9,4 ± 6,3 ng/ml en pacientes tratados con 1,5 y 3 mg/dia, respectivamente.

Se ha resenado la MTF de everolimus (McMahon LM, et al. "High-throughput analysis of everolimus (RAD001) and cyclosporin A (CsA) in whole blood by liquid chromatography/ mass spectrometry using a semi-automated 96-well solid-phase extraction system". Rapid Comm. Mass Spectrometry 2000; 14: 1965-1971; Brignol N, et al. "Highthroughput semi-automated 96-well liquid/liquid extraction and liquid chromatography/mass spectrometric analysis of Certican (RAD001) and cyclosporin A (CsA) in whole blood". Rapid Communications in Mass Spectrometry 2001; 15: 898-907; Streit F. et al. "Rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry routine method for simultaneous determination of sirolimus, everolimus, tacrolimus, and cyclosporin A in whole blood". Clinical Chemistry. 2002; 48(6): 955-958). Sin embargo, los procedimientos que usan HPLC y CL/EM pueden ser impracticables para uso comercial debido, por ejemplo, al largo tiempo de preparacion de la muestra, al largo tiempo de ensayo, al alto coste y a procedimientos trabajosos. Para MTF rutinaria de everolimus, es deseable la disponibilidad de pruebas automatizadas sencillas y analizadores clinicos de alto rendimiento.

El documento US6328970 (B1) da a conocer conjugados de rapamicina que pueden usarse como moleculas inmunogenicas para la generacion de anticuerpos especificos de rapamicina o un derivado de la misma, para medir los niveles de rapamicina o derivados de la misma, para aislar proteinas de union a rapamicina y para detectar anticuerpos especificos de rapamicina o derivados de la misma. El documento US6328970 da a conocer tambien anticuerpos monoclonales especificos de rapamicina o un derivado de anillo abierto de rapamicina.

El documento US2002022717 (A1) da a conocer anticuerpos monoclonales de rapamicina y se dan a conocer derivados 40-O-alquilados de rapamicina, junto con haptenos novedosos, conjugados inmunogenicos y procesos para prepararlos y kits de ensayo para usarlos.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencion esta dirigida a derivados novedosos de everolimus y a inmunogenos novedosos de everolimus. La presente invencion esta tambien dirigida a anticuerpos policlonales y monoclonales generados usando inmunogenos de everolimus, asi como a competidores y trazadores marcados. Estos anticuerpos, conjugados y trazadores son utiles en inmunoensayos para la deteccion de everolimus en fluidos biologicos.

En un aspecto de la invencion, que se describe pero no se reivindica, se proporcionan inmunoensayos competitivos para determinar la presencia de everolimus en una muestra. Los inmunoensayos competitivos ilustrativos comprenden un anticuerpo capaz de unirse especificamente a everolimus, y un compuesto de everolimus conjugado con un marcador detectable, en los que el compuesto de everolimus conjugado se configura para competir con el 5 everolimus en la muestra para union al anticuerpo, y en los que el marcador proporciona una senal indicativa de la concentracion de everolimus en la muestra cuando el everolimus en la muestra esta presente a concentraciones de monitorizacion terapeutica de farmacos. En una realizacion, el inmunoensayo es adecuado para monitorizar everolimus en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 ng/ml. En otra realizacion, el inmunoensayo competitivo proporciona una senal indicativa de la concentracion de everolimus en un intervalo mas

10 amplio, ilustrativamente de aproximadamente 0 a aproximadamente 40 ng/ml.

En otro aspecto de la invencion, se proporcionan procedimientos para determinar la concentracion de everolimus en una muestra. Los procedimientos son como se definen en la reivindicacion 1.

En aun otro aspecto de la invencion, que se describe pero no se reivindica, se proporcionan compuestos que tienen la siguiente estructura

Formula II en la que n es 0 o 1; X es una cadena ligadora que comprende 3-10 atomos de carbono o heteroatomos, en la que la cadena ligadora

20 puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada;

Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

Z es un portador antigenico o un marcador.

En una realizacion ilustrativa particular, X es -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, Y es -C(O)- y Z es el portador antigenico.

Los anticuerpos producidos usando dichos compuestos se describen tambien pero no se reivindican. Se

25 proporcionan tambien kits de inmunoensayo que usan los anticuerpos, estos kits para determinar la concentracion

de everolimus en una muestra son como se definen en la reivindicacion 5. Resultaran evidentes rasgos adicionales de la presente invencion para los expertos en la materia tras la consideracion de la siguiente descripcion detallada de las realizaciones preferidas, que ejemplifican el mejor modo de llevar a cabo la invencion como se entiende actualmente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 muestra la estructura de un derivado de everolimus ilustrativo de la presente invencion, La Fig. 2 muestra la sintesis de formiato de RAD anclado, La Fig. 3 muestra la sintesis de RAD-acido (desproteccion),

5 La Fig. 4 muestra la sintesis de RAD-822 (activacion de NHS), La Fig. 5 muestra la sintesis de RAD 822: trazador FAMCO-E FP, La Fig. 6 muestra la sintesis de RAD 822: inmunogeno de BSA, La Fig. 7 muestra la estructura de un derivado 32-oxima de everolimus, La Fig. 8 muestra un ester activado del derivado 32-oxima de la Fig. 8,

10 La Fig. 9 muestra una curva de calibracion de (FPIA): eje X-valores del patron, eje Y- indice (mP) de anticuerpos

(policlonales), trazador FP (RAD822:FAMCO-E), La Fig. 10 muestra la comparacion de un ensayo de FPIA de everolimus segun la presente invencion frente a CL/EM en pacientes de transplante de rinon,

La Fig. 11 muestra la comparacion de un ensayo de FPIA de everolimus segun la presente invencion frente a CL/EM

15 en pacientes de transplante de corazon, y La Fig. 12 es una curva de calibracion QMS de everolimus (anticuerpo: anticuerpo policlonal del inmunogeno RAD 822; antigeno: RAD 822: trazador FAMCO-E), derivado acoplado a las particulas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

El "everolimus" es un farmaco inmunosupresor comercializado por Novartis AG con la marca comercial CERTICAN®. 20 El everolimus tiene la estructura de formula I:

Formula I

Los "haptenos" son antigenos parciales o incompletos. Son habitualmente sustancias exentas de proteinas, mayoritariamente de bajo peso molecular, que no son generalmente capaces de estimular la formacion de

25 anticuerpos, pero que reaccionan con anticuerpos. Los anticuerpos pueden formarse acoplando un hapteno con un portador antigenico de alto peso molecular e inyectando entonces este producto acoplado, concretamente inmunogeno, en un sujeto humano o animal. El everolimus es un hapteno.

La frase "anticuerpo capaz de unirse especificamente a everolimus" como se usa en la presente memoria hace referencia a un anticuerpo con la capacidad de reaccionar con al menos un epitopo en el farmaco en una verdadera reaccion de anticuerpo-antigeno, en contraposicion a una interaccion no especifica.

El termino "analogo" o "derivado" hace referencia a un compuesto quimico o molecula preparados a partir de un compuesto o molecula original mediante una o mas reacciones quimicas.

Un "hapteno activado" hace referencia a un derivado de hapteno que se ha proporcionado con un sitio de reaccion disponible, tal como por la union de un grupo ligador, para sintetizar un conjugado derivado de hapteno.

Como se usa en la presente memoria, un "grupo ligador" o "ligador" hace referencia a una porcion de la estructura quimica que conecta dos o mas subestructuras tales como haptenos, portadores, inmunogenos, marcadores, trazadores u otros ligadores. Un grupo ligador tiene al menos una cadena ininterrumpida de atomos distintos de hidrogeno (u otros atomos monovalentes) que se extiende entre las subestructuras. Los atomos de un grupo ligador y los atomos de una cadena en un grupo ligador estan conectados entre si por enlaces quimicos. Los ligadores pueden ser cadenas carbonadas lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas. Pueden incluir tambien uno o mas heteroatomos en la cadena o en los extremos de las cadenas. Se entiende por "heteroatomos" atomos distintos de atomos de carbono, ilustrativamente oxigeno, nitrogeno, azufre y fosforo. El grupo ligador puede incluir tambien grupos ciclicos o aromaticos como parte de la cadena o como sustitucion en uno de los atomos de la cadena. El numero de atomos en un grupo ligador o ligador se determina contando los atomos distintos de hidrogeno. El numero de atomos en una cadena de un grupo ligador se determina contando el numero de atomos distintos de hidrogeno a lo largo de la ruta mas corta entre las subestructuras que se estan conectando. Los grupos ligadores pueden usarse tambien para activar un hapteno, por ejemplo, proporcionar un sitio disponible en un hapteno para sintetizar un conjugado de un hapteno con un marcador o portador.

Los terminos "inmunogeno" e "inmunogenico" como se usan en la presente memoria hacen referencia a sustancias capaces de producir o generar una respuesta inmunitaria en un organismo.

Un "ester activo" hace referencia a un grupo ester que puede reaccionar con un grupo amino libre de un compuesto tal como, por ejemplo, peptidos y proteinas. Los ejemplos de esteres activos incluyen N-hidroxisuccinimida, pnitrofenilo, pentafluorofenilo y N-hidroxibenzotriazolilo.

Un "portador" o "portador inmunogenico", como se usan los terminos en la presente memoria, es una sustancia inmunogenica, comunmente una proteina, que puede unirse a un hapteno, posibilitando asi que el hapteno induzca una respuesta inmunitaria y desencadene la produccion de anticuerpos que pueden unirse especificamente con el antigeno (hapteno). Las sustancias portadoras incluyen proteinas, glucoproteinas, polisacaridos complejos, particulas y acidos nucleicos que se reconocen como extranos y desencadenan asi una respuesta inmunologica por el hospedador. Pueden emplearse diversas proteinas como portador inmunogenico poli(aminoacidico). Estas proteinas incluyen albuminas y seroproteinas, por ejemplo, globulinas, proteinas del cristalino, lipoproteinas, etc. Las proteinas ilustrativas incluyen seroalbumina bovina (BSA), hemocianina de lapa bocallave (KLH), ovoalbumina de huevo, gamma-globulina bovina (BGG), etc. Como alternativa, pueden usarse poli(aminoacidos) sinteticos. El portador inmunogenico puede ser tambien un polisacarido, que es un polimero de alto peso molecular constituido por condensaciones repetidas de monosacaridos. Son ejemplos de polisacaridos almidones, glucogeno, celulosa, gomas de carbohidratos tales como goma arabiga, agar y demas. El polisacarido puede contener tambien residuos de poli(aminoacidos) y/o residuos de lipidos. El portador inmunogenico puede ser tambien un poli(acido nucleico) solo o conjugado con uno de los poli(aminoacidos) o polisacaridos mencionados anteriormente. El portador inmunogenico puede ser tambien una particula. Las particulas son ilustrativamente de al menos aproximadamente 0,02 micrometros (!m) e ilustrativamente de no mas de aproximadamente 100 !m, y habitualmente de aproximadamente 0,05 !m a 10 !m de diametro. La particula puede ser organica o inorganica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, opcionalmente de una densidad similar a la del agua, generalmente de aproximadamente 0,5 a 1,5 g/ml, y compuesta por material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las particulas pueden ser materiales biologicos tales como celulas y microorganismos, incluyendo ejemplos no limitantes tales como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli y virus. Las particulas pueden constar tambien de polimeros organicos e inorganicos, liposomas, latex, vesiculas fosfolipidicas o lipoproteinas.

"Poli(aminoacido)" o "polipeptido" es una poliamida formada a partir de aminoacidos. Los poli(aminoacidos) estaran ilustrativamente en el intervalo de peso molecular de aproximadamente 2.000, sin limite superior de peso molecular, siendo normalmente de menos de 10.000.000 y opcionalmente de no mas de aproximadamente 600.000 Da. Habra habitualmente diferentes intervalos, dependiendo de si esta implicado o no un portador inmunogenico o una enzima.

Un "peptido" es cualquier compuesto formado mediante el ligamiento de dos o mas aminoacidos por enlaces amida (peptidicos), habitualmente un polimero de a-aminoacidos en que el grupo a-amino de cada residuo aminoacidico (excepto el extremo NH2) esta ligado al grupo a-carboxilo del siguiente residuo de una cadena lineal. Los terminos "peptido", "polipeptido" y "poli(aminoacido)" se usan como sinonimos en la presente memoria para hacer referencia a esta clase de compuestos sin restriccion en cuanto a tamano. Se hace referencia tambien a los miembros mayores de esta clase como proteinas.

Un "marcador", "molecula detectora" o "trazador" es cualquier molecula que produce, o puede inducirse a producir, una senal detectable. El marcador puede conjugarse con un analito, un inmunogeno o un anticuerpo, ilustrativamente el anticuerpo producido en respuesta al compuesto antigenico o un anticuerpo secundario que tiene especificidad por el mismo, o con otra molecula tal como un receptor o una molecula que puede unirse a un receptor tal como un ligando, particularmente un hapteno. Los ejemplos no limitantes de marcadores incluyen isotopos radiactivos, enzimas, fragmentos de enzimas, sustratos enzimaticos, inhibidores enzimaticos, coenzimas, catalizadores, fluoroforos, tintes, productos quimioluminiscentes, luminiscentes, sensibilizadores, particulas no magneticas o magneticas, soportes solidos, liposomas, ligandos, receptores e isotopos radiactivos de hapteno.

El termino "compuesto antigenico" como se usa en la presente memoria es un compuesto usado para producir una respuesta inmunitaria. Ilustrativamente, el compuesto antigenico es un hapteno, por ejemplo everolimus, ligado con un portador inmunogenico. El compuesto antigenico se usa para generar los anticuerpos deseados.

El termino "competidor marcado" como se usa en la presente memoria es una molecula capaz de unirse especificamente a anticuerpos que tienen especificidad por everolimus, en los que la molecula esta ligada con un marcador detectable o trazador. Ilustrativamente, la molecula es everolimus o un derivado o analito del mismo.

El termino "muestra biologica" incluye, pero sin limitacion, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o anteriormente ser vivo. Dichos seres vivos incluyen, pero sin limitacion, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos, caballos y otros animales. Dicha sustancia incluye, pero sin limitacion, sangre, suero, orina, lagrimas, celulas, organos, tejidos, hueso, medula osea, linfa, nodulos linfaticos, tejido sinovial, condrocitos, macrofagos sinoviales, celulas endoteliales y piel.

El termino "concentraciones de monitorizacion terapeutica de farmacos" hace referencia a las concentraciones del farmaco desde que no proporcionan efecto hasta las de efecto toxico. Para everolimus, como se entiende actualmente, el intervalo terapeutico es generalmente de 3-15 ng/ml. Sin embargo, se entiende que puede ser util proporcionar informacion sobre un intervalo mas amplio, y el intervalo de ensayo es generalmente mas amplio que el intervalo terapeutico. Por consiguiente, los ensayos que monitorizan las concentraciones de monitorizacion terapeutica de farmacos pueden proporcionar sensibilidad a lo largo de un intervalo mas amplio de concentraciones de everolimus.

El termino "paciente" incluye sujetos humanos y animales.

Son conocidos numerosos formatos de inmunoensayo cuantitativo para detectar un hapteno tal como un farmaco u otra molecula pequena en un fluido corporal. Un procedimiento de ensayo para everolimus incluye ilustrativamente la muestra con un anticuerpo anti-everolimus y detectar la cantidad de complejo de anticuerpo antieverolimus/everolimus, como indicativa de la cantidad de everolimus en la muestra.

Los inmunoensayos ilustrativos emplean anticuerpos policlonales y/o anticuerpos monoclonales con una sensibilidad y especificidad apropiadas por everolimus que proporcionan informacion sobre las concentraciones de everolimus estadisticamente comparable con la obtenida mediante procedimientos analiticos tales como CL/EM. Dichos inmunoensayos son ilustrativamente utiles en la monitorizacion de los niveles de farmaco en las muestras de paciente.

Disenar un inmunoensayo para la deteccion de una molecula pequena tal como un farmaco puede ser un reto. Dichas moleculas pequenas a menudo carecen de antigenicidad, haciendo dificil generar anticuerpos. Esto es particularmente problematico con farmacos tales como everolimus, que suprime la respuesta inmunitaria. Para aumentar la inmunogenicidad, se conjugan con el farmaco compuestos antigenicos mayores, ilustrativamente proteinas o polipeptidos incluyendo, pero sin limitacion, seroalbumina bovina, ovoalbumina, hemocianina de lapa bocallave y similares. Ademas, la deteccion del farmaco en un inmunoensayo requiere generalmente el uso de un marcador detectable conjugado con un anticuerpo, un analito o analogo de analito.

Los inmunogenos pueden prepararse acoplando everolimus con una proteina portadora antigenica a traves de un ligador reaccionado con uno de los grupos hidroxilo, ilustrativamente el hidroxilo en posicion 28. Dichos procedimientos se describen en la patente de EE.UU. n° 6.635.745 y la patente europea n° EP 0.693.132. Sin embargo, se ha encontrado que un ligador extendido entre el portador antigenico conduce a la produccion de anticuerpos mas sensibles. Sin ligarse a teoria particular alguna, presuntamente el ligador mas largo proporciona un epitopo mas accesible, dando como resultado una especificidad aumentada del anticuerpo por everolimus.

El conjugado inmunogenico es un compuesto mostrado en la Fig. 1 y en la formula II siguiente:

Formula II

en la que

n es 0 o 1;

X es una cadena ligadora que comprende 3-10 atomos de carbono o heteroatomos, en la que la cadena ligadora puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada;

Y se selecciona del grupo consistente en carbonilo, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

Z es un portador antigenico.

En esta realizacion, el ligador (X) comprende una cadena de 3 o mas atomos, en la que al menos un atomo es de carbono (C). La molecula ligadora puede ser una cadena lineal o ramificada y, ademas de al menos un atomo de C, puede contener heteroatomos tales como N, O, S y P, que pueden estar sustituidos independientemente entre si. El ligador puede contener tambien enlaces multiples. Si el ligador esta ramificado, las ramas pueden formar anillos. Cuando el ligador esta ramificado, la longitud del ligador se determina por el numero de atomos en la ruta mas corta entre everolimus y conjugado. Ilustrativamente, el ligador (X) comprende una cadena de entre 3 y 10 atomos, mas ilustrativamente de entre 4 y 7 atomos, y aun mas ilustrativamente de 4 a 5 atomos. En un ejemplo particularmente bien adecuado, el ligador comprende una cadena de 5 atomos. Aunque no sea de la invencion, se entiende que pueden prepararse compuestos antigenicos u otros conjugados de everolimus acoplando a traves de otras posiciones en la molecula de everolimus, ilustrativamente en uno de los grupos cetona en posiciones 26, 32 o 9, mediante un ligamiento adecuado (por ejemplo, oxima, hidrazona), en los que el ligador tiene suficiente longitud para proporcionar acceso a un epitopo de everolimus adecuado, aunque sin proporcionar demasiada separacion entre el everolimus y el portador antigenico. El ligador puede adjuntarse a un grupo funcional adecuado que permita acoplar a una proteina u otra biomolecula, o a una superficie de soporte solido.

En un ejemplo particular, n= 1, X es una cadena de 5 atomos e Y es -C(O)-. Es un ejemplo de dicho compuesto inmunogenico RAD 822:BSA, como se muestra en la Fig. 6, en la que Z es BSA. Los anticuerpos preparados usando RAD 822:BSA han probado demostradamente una fuerte union (> 100 mP) y una fuerte inhibicion (> 50% a 50 ng/ml), como se muestra en la curva de calibracion de la Fig. 9. Es otro de dichos ejemplos en el que se espera una fuerte union y fuerte inhibicion los anticuerpos producidos usando un compuesto inmunogenico de formula II en la que n= 1, X es una cadena de 7 atomos (por ejemplo -(CH2)7-), e Y es -C(O)-. Se espera que los anticuerpos producidos usando otros compuestos de formula II demuestren tambien una fuerte union y fuerte inhibicion. Se entiende, sin embargo, que puede ser aceptable una union media (50-100 mP) y/o una inhibicion media (50% a 50500 ng/ml) para algunas realizaciones. Los anticuerpos generados a partir de los compuestos de formula II son bien adecuados para ensayos competitivos y no competitivos.

El conjugado inmunogenico es util para la generacion de anticuerpos policlonales asi como monoclonales. Dependiendo del fin del sistema de deteccion, los anticuerpos pueden seleccionarse para orientarse a everolimus con poca o ninguna reactividad cruzada por metabolitos, o como alternativa, pueden seleccionarse anticuerpos con la capacidad de reconocer uno o mas de los metabolitos y/o farmacos relacionados asi como everolimus. Un estudio integral de la biotransformacion de everolimus por microsomas hepaticos humanos ha identificado al menos 11

metabolitos resultantes de la hidroxilacion y desmetilacion de everolimus (Bornsen KO, et al. "Electrospray ionization and collisionally induced dissociation of RADOO1 and related compounds and structural characterization of RAD001 metabolites by nano-spray and micro liquid chromatography mass spectrometry", Jacobson W, et al. "Comparison of the in vitro metabolism of the macrolide immunosuppressants sirolimus and RAD". Transplantation Proceedings 5 2001; 33: 614-615), siendo los metabolitos principales hidroxil-(24/25 OH RAD, 46 OH RAD), compuestos de anillo abierto (RAD SA, RAD PSA) y 40-fosfatidilcolina-RAD (RAD PC). La generacion de metabolitos de everolimus se atribuye al citocromo P450 3A4, el mas abundante de las enzimas CYP en higado e intestino, tambien implicado en el metabolismo de ciclosporina (CsA) y rapamicina. Ilustrativamente, si se desean anticuerpos capaces de distinguir everolimus de sus metabolitos, pueden inducirse opcionalmente anticuerpos mediante inmunogenos preparados a

10 partir de derivados de 28-O.

Ademas de inmunogenos, pueden prepararse otros conjugados de everolimus. Cuando se usa el ligamiento a traves de la posicion 28-O para producir una molecula competidora marcada, la Z de la formula II puede ser biotina, peroxidasa de rabano picante u otras enzimas, marcadores fluorescentes y tintes, o particulas tales como soles metalicos, particulas de latex, particulas de poliestireno y similares, o cualquier otro marcador, molecula detectora o 15 trazador, como se discute anteriormente. Dichos conjugados se forman mediante cualquier serie de procedimientos rutinarios bien conocidos por los expertos en la materia. Es posible preparar conjugados de everolimus que sean utiles para una variedad de inmunoensayos incluyendo, pero sin limitacion, inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia, inmunoensayo de donante de enzima clonada, inmunoensayo de flujo lateral, ensayos de microparticulas quimioluminiscentes y ensayos inmunoturbidimetricos. Se describen varias realizaciones en la

20 presente memoria.

Aunque no de la invencion, los anticuerpos pueden producirse usando un compuesto antigenico de formula II, por ejemplo RAD 822:BSA, como se muestra en la Fig. 6. En un ensayo competitivo no de la invencion, el competidor marcado puede derivar de everolimus usando un ligamiento que es el mismo o similar al del compuesto antigenico, por ejemplo, RAD 822:FAMCO-E, como se muestra en la Fig. 5. Sin embargo, se entiende que cuando el competidor 25 marcado sea un derivado de 28-O de everolimus, la cadena ligadora, como se representa por X en la formula II, no esta limitada a una cadena que comprende 3-10 atomos. En algunos ensayos competitivos, es deseable tener un competidor marcado que se una al anticuerpo con menos especificidad que el everolimus se une al anticuerpo, permitiendo desplazar el competidor marcado mas facilmente en presencia de everolimus. Por consiguiente, pueden ser deseables ligadores mas cortos para limitar el acceso a los sitios de union a anticuerpo y para debilitar la union

30 especifica con el anticuerpo. Los ligadores mas largos de 10 atomos pueden ser tambien utiles, ya que la distancia entre el marcador y el everolimus no es critica en muchas realizaciones. Por tanto, se entiende que el ligador del competidor marcado no esta limitado a la definicion de X en la formula II.

El competidor marcado de la invencion deriva de everolimus usando el ligamiento mostrado en la formula III:

Formula III

en la que X1 es una cadena ligadora que comprende uno o mas atomos, cada uno de los cuales puede estar sustituido o no sustituido y puede ser ramificado o no ramificado;

Y es como se define anteriormente y

Z es un marcador como se define anteriormente.

Para un competidor marcado, la estructura del ligador X1 puede elegirse basandose en el ensayo particular. Como se discute anteriormente, puede ser deseable proporcionar un ligador corto que tenga solo uno o dos atomos en la cadena (ilustrativamente -O-CH2-), para reducir la union especifica al anticuerpo. Por otro lado, puede ser deseable proporcionar un ligador largo, ilustrativamente cuando el everolimus del competidor marcado se esta anclando a un soporte solido, y se desea una flexibilidad adicional en la cadena ligadora. El ligador mas largo puede comprender una cadena de cualquier longitud, ilustrativamente de 10 a 100 atomos.

Un ensayo competitivo ilustrativo usa anticuerpos producidos usando un compuesto antigenico de formula II, ilustrativamente RAD 822:BSA, como se muestra en la Fig. 6, y un competidor marcado de formula III, ilustrativamente el compuesto de 32-oxima mostrado en la Fig. 7, en la que la succinimida se reemplaza por un marcador adecuado para un inmunoensayo competitivo. Para FPIA, el marcador puede ser FAMCO-E, aunque pueden usarse otros marcadores o trazadores adecuados. Puesto que el farmaco no unido everolimus tiene mayor afinidad por el anticuerpo (producido a partir del inmunogeno RAD 822:BSA) que el derivado de 32-oxima marcado, una cantidad muy pequena de everolimus no unido en una muestra deberia tener un efecto detectable sobre la velocidad de aglutinacion regida por el derivado de oxima unido. Por tanto, si el derivado de 32-oxima marcado se inmoviliza, por ejemplo, sobre latex, puede conseguirse una alta sensibilidad (necesaria para la deteccion de everolimus debido al intervalo terapeutico extremadamente bajo y estrecho de 3-15 ng/ml).

Los ligamientos de oxima son mas estables a la escision hidrolitica que los enlaces ester. Ademas, se ha encontrado que el derivado de oxima (en posicion 32) no experimentara una reaccion de eliminacion en las condiciones mas utiles. El derivado de oxima (ester activado) seria un candidato deseable en diversos ensayos, incluyendo ensayos inmunoturbidimetricos potenciados con latex. Las microparticulas acopladas con derivado de oxima han mostrado una estabilidad mejorada.

Se entiende que puede usarse cualquier combinacion de anticuerpos producidos usando los compuestos antigenicos anteriormente descritos y los competidores marcados anteriormente descritos en los ensayos competitivos, dependiendo la eleccion de cada uno del ensayo especifico y la sensibilidad deseada.

Inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia de everolimus

La tecnologia de inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia (FPIA) esta basada en la union competitiva entre un antigeno/farmaco en una muestra y una concentracion conocida de antigeno/farmaco marcado. El FPIA se describe en la patente de EE.UU. n° 4.593.089. En el sistema de ensayo, el antigeno de muestra tal como everolimus compite con el antigeno marcado con fluoresceina o analogo de antigeno por un numero fijo de sitios de anticuerpo. Los componentes principales del sistema de FPIA son: i) anticuerpo capaz de unirse especificamente al antigeno/farmaco, ii) muestra sospechosa de contener el antigeno/farmaco y iii) el antigeno/farmaco o analogo marcado con fluoresceina. Debido a las propiedades rotacionales de las moleculas en solucion, el grado de polarizacion es directamente proporcional al tamano de la molecula. La polarizacion aumenta a medida que aumenta el tamano molecular. Cuando se usa luz polarizada linealmente para excitar el antigeno/farmaco marcado con fluoresceina, que es pequeno y rota rapidamente en solucion, se despolariza significativamente la luz emitida. Cuando se une el antigeno/farmaco marcado con fluoresceina al anticuerpo, se retarda la rotacion y la luz emitida se polariza en gran medida. Las cantidades aumentadas de antigeno/farmaco no marcado en la muestra daran como resultado una union reducida de antigeno-farmaco marcado con fluoresceina al anticuerpo, y una polarizacion reducida de la luz emitida por la muestra. En los presentes ejemplos, se establece la relacion precisa entre la polarizacion y la concentracion de everolimus no marcado en la muestra midiendo los valores de polarizacion de los patrones de concentracion conocida de everolimus.

Inmunoensayo de microparticulas homogeneas (inmunoturbidimetrico) para everolimus

Formato A:

En una realizacion, se proporciona un kit con un conjunto de reactivos liquidos usados para efectuar ensayos inmunoturbidimetricos para la medida de las concentraciones de everolimus en sangre completa, sangre hemolizada, suero o plasma. En esta tecnologia, se carga un conjugado de everolimus, ilustrativamente un conjugado de everolimus activado en 28-O, sobre una microparticula, por ejemplo cualquiera de las microparticulas fabricadas y/o comercializadas por Seradyn, Inc. (Indianapolis, Indiana) incluyendo, pero sin limitacion, de poliestireno o poliestireno modificado con carboxilato y particulas magneticas recubiertas con estreptavidina. Se formula un anticuerpo capaz de unirse especificamente a everolimus en un sistema tamponador estandar. Tiene lugar una reaccion competitiva entre el everolimus inmovilizado sobre las microparticulas y el everolimus en la muestra del paciente por la union a una cantidad limitada de anticuerpo anti-everolimus en la solucion de reaccion. La aglutinacion de particulas se inhibe por la presencia de farmaco en la muestra del paciente.

Formato B:

Esta realizacion es similar a la descrita anteriormente como formato A, excepto porque se carga sobre la microparticula un anticuerpo capaz de unirse especificamente a everolimus. Se liga un derivado de everolimus, ilustrativamente everolimus activado en 28-O, con la macromolecula de eleccion, por ejemplo seroalbumina bovina, ovoalbumina, dextrano y similares, formando un conjugado de farmaco. Tiene lugar una reaccion competitiva entre el conjugado de farmaco en la solucion tamponada y el everolimus en la sangre del paciente por la union a anticuerpo anti-everolimus inmovilizado sobre las microparticulas. La aglutinacion de particulas esta inhibida por la presencia de farmaco en la muestra del paciente.

Tecnologia de inmunoensayo de donante de enzima clonada CEDIA® para everolimus

La CEDIA® (marca comercial de Roche) ha probado ser un procedimiento altamente exacto para la cuantificacion de farmacos terapeuticos. La CEDIA® es el objeto de varias patentes, incluyendo la patente de EE.UU. n° 4.708.929, que reivindica procedimientos de ensayo homogeneo competitivos, la patente de EE.UU. n° 5.120.653, que reivindica una secuencia de ADN recombinante que codifica el fragmento donante de enzima y un hospedador para dicho vector, la patente de EE.UU. n° 5.604.091, que reivindica secuencias aminoacidicas del fragmento donante de enzima, y la patente de EE.UU. n° 5.643.734, que ensena kits para ensayos de CEDIA®.

La CEDIA esta basada en la competicion de un farmaco en la muestra biologica con farmaco conjugado con el fragmento donante de enzima (ED) genomanipulado inactivo de �-D-galactosido galactohidrolasa (E.G. 3.2.1.23) o �-galactosidasa (� gal) de E. coli por la union a un anticuerpo capaz de unirse especificamente al farmaco diana. Si el farmaco diana esta presente en la muestra, se une al anticuerpo, dejando la porcion de ED del conjugado de EDfarmaco libre para recuperar la actividad enzimatica tras asociacion con fragmentos aceptores de enzima (EA), tambien de �-D-galactosido galactohidrolasa (E.C. 3.2.1.23) o �-galactosidasa (�-gal) de E. coli, en la mezcla de reaccion de ensayo. La enzima activa es entonces capaz de producir un producto de reaccion cuantificable cuando se expone a un sustrato apropiado. Es un sustrato ilustrativo rojo de clorofenol-�-D-galactopiranosido (CPRG), escindido por la enzima activa en galactosa y CPR. El CPR se mide mediante la absorbancia a 570 nm de longitud de onda. Si no esta presente farmaco en la muestra, el anticuerpo se une al conjugado de ED-farmaco, inhibiendo la asociacion de los fragmentos de ED con los fragmentos de EA, e inhibiendo por tanto la recuperacion de la actividad enzimatica. La cantidad de producto de reaccion y el cambio de absorbancia resultante son proporcionales a la cantidad de farmaco en la muestra.

Inmunoensayo heterogeneo quimiolumiscente

En una realizacion, un ensayo competitivo que usa la tecnologia de inmunoensayo de microparticulas quimioluminiscentes (CMIA) consta del uso de anticuerpos capaces de unirse especificamente a everolimus acoplado con particulas, en particular particulas magneticas o particulas adecuadas para separacion por filtracion, sedimentacion u otros medios. Un marcador que comprende everolimus ligado con una molecula quimioluminiscente adecuada, por ejemplo un ester de acridinio, compite con el everolimus libre en la muestra del paciente por la cantidad limitada de anticuerpo anti-everolimus sobre la particula magnetica. Despues de la etapa de lavado rutinaria para retirar el marcador no unido, se mide la cantidad de quimioluminiscencia, expresada en unidades luminicas relativas (ULR). La cantidad de quimioluminiscencia esta inversamente relacionada con la cantidad de farmaco libre en la muestra del paciente y la concentracion se determina construyendo una curva estandar usando valores conocidos del farmaco.

Otros formatos de inmunoensayo

Los derivados, anticuerpos, inmunogenos y/u otros conjugados descritos en la presente memoria son tambien adecuados para uso con cualquiera de una serie de otros inmunoensayos homogeneos y heterogeneos con una serie de sistemas de deteccion. Los ejemplos presentados en la presente memoria no se pretende que sean limitantes.

Por tanto, la presente invencion proporciona derivados de everolimus que son utiles para la preparacion de inmunogenos y conjugados para uso en inmunoensayos para la deteccion de everolimus. Al acoplar un analogo de everolimus segun la presente invencion con un material portador inmunogenico, pueden producirse y aislarse anticuerpos policlonales o monoclonales que son reactivos utiles para inmunoensayos para la deteccion de everolimus.

Puede lograrse el acoplamiento mediante cualquier reaccion quimica que una el marcador o portador. Este ligamiento puede lograrse mediante una variedad de mecanismos quimicos, por ejemplo, union covalente, union por afinidad, intercalado, union coordinada y complejacion. Lo mas a menudo, el ligamiento se realiza mediante enlace covalente. El enlace covalente puede conseguirse por condensacion directa de cadenas laterales existentes o por la incorporacion de moleculas de puente externas. Muchos agentes ligantes divalentes o polivalentes son utiles para acoplar moleculas de proteina, tales como un portador, a otras moleculas. Los agentes de acoplamiento representativos incluyen compuestos organicos tales como tioesteres, carbodiimidas, esteres de Nhidroxisuccinimida, diisocianatos, glutaraldehido, diazobencenos y hexametilendiaminas. Se entiende que este listado no es una recopilacion exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la materia sino que, en lugar de ello, es representativo de los agentes de acoplamiento mas comunes.

Los inmunoensayos de everolimus ilustrativos emplean anticuerpos anti-everolimus que pueden ser policlonales o monoclonales. En inmunoensayos competitivos ilustrativos, la preparacion del anticuerpo usado se induce por un inmunogeno descrito en la presente memoria formulado en una solucion acuosa tal como un tampon y similar, o proporcionado en un coadyuvante o composicion similar. Los anticuerpos inducidos pueden ensayarse para determinar la especificidad por everolimus.

EJEMPLO 1- Sintesis de compuestos inmunogenicos y competidores marcados.

Sintesis de monoformiato de RAD

Se disolvieron 0,6 g de RAD en 2 ml de cloruro de metileno seco en un matraz de fondo redondo de 100 ml en atmosfera de argon (Ar). Se separo una alicuota (-10 !l) para ensayos de HPLC y TLC. Se dispuso el matraz de fondo redondo que contenia la solucion de reaccion en un bano de hielo/NaCl aproximadamente a -20°C. Se dejo enfriar el matraz de reaccion durante 3-5 min. Se anadio piridina seca (0,25 ml) usando una jeringuilla de vidrio seca con una aguja metalica (de 15 cm) de una vez. Se anadieron 0,35 ml de cloroformiato de alilo seco usando una jeringuilla de vidrio seca con una aguja de metal (de 15 cm) en aproximadamente 0,5-1 min. Poco despues de la adicion, aparecio precipitacion. Se dejo agitar durante 1 hora. Se inactivo la reaccion anadiendo 5 ml de NaHCO3 saturado. Se extrajo la reaccion inactivada con cloruro de metileno. Se combinaron las fases organicas, se secaron (Na2SO4) y se filtraron. Se transfirio el filtrado a un matraz de fondo redondo de 250 ml (100-250 ml) y se evaporaron los productos volatiles a presion reducida (bano de agua a menos de +30°C). Se purifico el producto bruto por cromatografia de silice en 40% de acetato de etilo en cloruro de metileno. El rendimiento del producto final era de 0,53 g.

Sintesis de formiato de RAD anclado (Fig. 2)

Se dispusieron 0,4 g de monoformiato de RAD, 9 mg de DMAP y 0,2 g de ester alilico del acido pimelico en un matraz de fondo redondo de 50 ml seco equipado con una barra de agitacion. Se anadieron 5 ml de CH2Cl2 seco al matraz anterior, que se dispone en un bano de hielo/agua a 0°C en atmosfera de argon. Se dejo enfriar la solucion durante 5-10 min. Se anadieron rapidamente 0,2 g de DCC. Se dejo agitar la reaccion durante 5 horas a 0°C. Se recogio el DCU precipitado en un filtro Whatman n° 1. Se aclararon matraz y precipitado con aproximadamente 10 ml de CH2Cl2 enfriado con hielo, se combinaron y se lavo la fase organica con HCl 1 M enfriado con hielo y bicarbonato de sodio acuoso saturado, se seco sobre Na2SO4, se decanto (o filtro), se aclaro el solido con 2 x 5 ml de CH2Cl2 y se concentro el producto bruto a vacio, proporcionando 0,45 g. Puede conseguirse una purificacion adicional por cromatografia ultrarrapida en columna de gel de silice con acetato de etilo/cloruro de metileno (1:1).

Sintesis de RAD-acido (desproteccion) (Fig. 3)

Se dispusieron 0,362 g de RAD protegido en atmosfera de argon en un matraz de fondo redondo ambar seco equipado con una barra de agitacion y un sello de caucho a temperatura ambiente. Se dejaron calentar los reactivos durante al menos 30 min a temperatura ambiente para proteger de la condensacion de humedad. Se anadieron 5,75 ml de cloruro de metileno seco al matraz de reaccion usando una jeringuilla seca (de plastico o vidrio) con aguja seca y se anadieron 73 !l (4 equivalentes) de acido acetico glacial usando una pipeta automatica. Se pesaron 7,4 mg (0,02 equivalentes o 2%) de tetraquis(trifenilfosfino)paladio (0) (Pd(PPh3)4) en un papel de pesada y se anadieron a la solucion de reaccion. Se anadieron gota a gota 260 !l de hidruro de tributilestano a las mezclas de reaccion anteriores a temperatura ambiente. Se dejo agitar la reaccion durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente. Se dispuso el matraz en un rotavapor y se condenso el contenido a aproximadamente 2-3 ml de solucion. Se cargo la solucion en una columna de cromatografia de vidrio corta de 5-6 cm (volumen de SiO2 seca= 50 cm3, diametro de aproximadamente 4 cm). Elucion: 1°-200 ml de acetato de etilo, 2°- 200 ml de 10% de acetona en acetato de etilo, 3° 200 ml de 50% de acetona en acetato de etilo, acetona pura aproximadamente 1,5 l. Se recogieron las fracciones de producto y se concentraron a vacio, proporcionando 273 mg de RAD-acido.

Sintesis de RAD-822 (activacion de NHS) (Fig. 4)

Se dejaron calentar a temperatura ambiente 0,281 g de RAD-acido obtenidos en la etapa anterior y se relleno con argon. Se anadieron rapidamente al matraz de reaccion 3,1 mg (0,1 equivalentes) de DMAP, 88 mg (3 equivalentes) de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 79 mg (1,5 equivalentes) de DCC. Se inicio la reaccion anadiendo 3,0 ml de cloruro de metileno seco mediante jeringuilla. Se dejo proceder la reaccion a temperatura ambiente durante 1 h agitando en atmosfera de argon. Se dispuso la reaccion en un bano de hielo/agua y se dejo agitar durante 2 h adicionales. Al final de este tiempo, se anadieron 1,5 ml de hexano y se detuvo la agitacion. Se filtro la urea precipitada (DCU) a traves de un tapon de algodon usando una pipeta Pasteur. Se extrajo la fase organica secuencialmente con volumenes iguales de HCl 1,0 M enfriado con hielo, NaCl sat., NaHCO3 sat. y agua destilada. Se seco la fase organica con Na2SO4 y se concentro a presion reducida. Se disolvio el RAD-822 bruto en aproximadamente 1 ml de CH2Cl2 y se cargo en la columna de gel de silice. Se eluyo la muestra con hexano/acetona (1:1). Se recogio el producto y se concentro a vacio, proporcionando 46 mg.

El RAD-822 puede usarse en diversas realizaciones de la presente invencion. Este compuesto se usa en la presente memoria en una realizacion de FPIA ilustrativa con un ligador modificado con ester en la posicion 28. Sin embargo, el RAD 822 puede experimentar degradacion quimica mediante escision hidrolitica debido a una reaccion de eliminacion. Por tanto, el RAD 822 no es optimo para otras realizaciones que requieran condiciones termicamente estresantes vigorosas, tales como la tecnologia QMS® (Seradyn, Indianapolis, IN).

Sintesis de RAD 822: trazador FAMCO-E FP (Fig. 5)

Se peso un matraz de fondo redondo de 100 ml y se pipeteo 1 ml de solucion de FAMCO-E a un matraz de fondo redondo de tamano adecuado. Se sometio a rotavapor el disolvente a presion reducida. Se enrollo el matraz con tapa de plastico con lamina de aluminio y se anadio un agitador magnetico al matraz anterior. Se pipeteo 1 ml de solucion de DMF al matraz anterior y se agito a temperatura ambiente durante 40-50minutos. Se retiro una cantidad suficiente de RAD de un almacenamiento en congelador a -78°C y se dispuso a temperatura ambiente para descongelar. Se pesaron 4 mg de RAD 822 sobre un trozo de papel de pesada y se transfirio el polvo al matraz que contenia la solucion de FAMCO-E. Se dejo agitar la reaccion bajo presion de argon sobre una placa de agitacion magnetica durante 1 h en un bano de hielo/agua y entonces durante 30-40 minutos a temperatura ambiente (no mas de 2 horas en total). Se evaporo el disolvente a presion reducida (bomba de alto vacio). Se disolvio el producto bruto (0,5-2 ml para un tamano de lote de 1 mg) en la cantidad minima de metanol. Se preparo el disolvente de TLC anadiendo 85 ml de CH2Cl2 y 15 ml de MeOH. Se dejaron secar al aire las placas durante al menos 60 minutos en una campana de humos operativa, y se despego la banda trazadora de la placa. Se transfirio el polvo a un embudo de filtro Buchner de 30 ml (porosidad M) y se lavo con 100% de metanol. Se recogio el filtrado y se transfirio a un matraz de fondo redondo de tamano adecuado. Se concentro el filtrado hasta sequedad y se redisolvio en metanol. Se filtro la solucion a traves de un filtro de 0,45 �m y se recogio el filtrado en un recipiente ambar.

Sintesis de RAD 822: inmunogeno BSA (Fig. 6)

Se anadio lentamente una solucion en DMSO (6,8 ml) de RAD 822 (27,2 mg) en un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con una barra de agitacion magnetica recubierta con teflon a una solucion de BSA: PBS (10 ml, PBS 20 mM, pH 7,2) en condiciones de agitacion vigorosa a temperatura ambiente. La solucion empezo a volverse turbia gradualmente. Se cubrio el matraz de fondo redondo con lamina de aluminio y se dejo agitar durante otras 2 horas a temperatura ambiente, se dializo entonces en un tubo de dialisis SnakeSkin (Pierce) frente a tampon PBS 50 mM a pH 7,5 en sala fria cinco veces. El volumen final era de 45 ml. Se concentro la solucion a 9 ml (-8 mg/ml) usando un concentrador Amicon Centriprep (Lote 874710, 10 kDa de MWCO). Se mezclo bien la solucion para asegurar la homogeneidad.

Sintesis de everolimus-O-carboximetil-32-oxima (Fig. 7)

Se anadieron 160 mg de hemiclorhidrato de carboximetoxilamina a una solucion de 290 mg de everolimus en 3,0 ml de piridina fria a +23°C. Se realizo la reaccion en atmosfera inerte en un matraz de fondo redondo equipado con una barra de agitacion. Despues de agitar la solucion de reaccion durante 5-6 horas, se diluyo el contenido con -25 ml de cloruro de metileno y se extrajo sucesivamente con volumenes iguales de HCl 1,2 M frio, bicarbonato de sodio saturado y cloruro de sodio saturado. Se seco la fase organica resultante con sulfato de sodio anhidro, se concentro a vacio y se uso en la siguiente etapa de activacion como tal.

El analisis de HPLC en la fase estacionaria "Silica" (de Regis Technologies) usando 4% de metanol y 40% de acetato de etileno en hexano como fase movil a 2 ml/min (deteccion U� a 280 nm) indica que la reaccion conduce a la formacion de isomeros (E y Z) y que la relacion es 3:1 (suponiendo coeficientes de extincion similares). Masa molecular exacta: 1030,6. EM-IEP (M+Na+): 1052,8.

Sintesis de un ester activado (succinimida) de everolimus-O-carboximetil-32-oxima (Fig. 8)

Se mezclaron conjuntamente 7 mg de N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) seca, 124 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC), 173 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 309 mg de everolimus-O-carboximetil-27-oxima (de la etapa anterior), se disolvieron en cloruro de metileno seco y se enfrio a 0°C. Despues de agitar durante aproximadamente 6 horas bajo atmosfera inerte, se filtro la suspension resultante y se extrajo consecutivamente con HCl 1,2 M, bicarbonato de sodio saturado y cloruro de sodio saturado. Se seco la fase organica resultante con sulfato de sodio anhidro y se sometio a cromatografia en gel de silice usando sucesivamente las siguientes mezclas de disolventes: hexano/acetona (3/2), hexano/acetona (1/1), hexano/acetona (2/3), todas v/v. Se combinaron las fracciones que contienen producto mayoritarias y se concentraron a vacio, proporcionando 116 mg del ester activado.

El analisis de HPLC en la fase estacionaria "Silica" (de Regis Technologies) usando 4% de metanol y 40% de acetato de etilo en hexano como fase movil a 2 ml/min (deteccion U� a 280 nm) indica que la reaccion conduce a la formacion de isomeros E y Z (sin resolucion del valor de referencia). Cromatografia de capa fina en mezcla de acetona/hexano (3/2, v/v): Rf= 0,48. Masa molecular exacta: 1127,6. EM-IEP (M+Na+): 1150,6.

Se muestra el compuesto resultante en la Fig. 8. Se entiende que el grupo succinimida puede reemplazarse por un inmunogeno de forma similar al proceso descrito anteriormente con RAD 822 para obtener RAD 822:BSA, o el grupo succinimida puede reemplazarse por un marcador, de forma similar al proceso descrito anteriormente con RAD 822, para obtener RAD 822:FAMCO- E. Se entiende que pueden usarse otros inmunogenos, marcadores y trazadores.

EJEMPLO II (comparativo) -Preparacion de anticuerpo

Pueden prepararse anticuerpos policlonales anti-everolimus mediante procedimientos convencionales. Se inmunizaron animales con el inmunogeno everolimus (RAD 822/BSA), como se produce en el Ejemplo 1. El programa de inmunizacion empezaba con una inyeccion inicial de 0,5 ml de mezcla de inmunogeno con 0,5 de coadyuvante completo de Freund. Se efectuaron inyecciones posteriores con 0,5 ml de mezcla de inmunogeno con 0,5 de coadyuvante incompleto de Freund. Se inyectaron tipicamente los animales cada dos semanas. Se cribaron los sueros por FPIA usando RAD 822:trazador FAMCO-E. Se agruparon conjuntamente varias extracciones de sangre de produccion bimensual (-20 ml por extraccion) de tres conejos. Antes del filtrado y dilucion, el volumen agrupado total es de aproximadamente 500 ml. Se filtraron los antisueros de conejo por filtro de acetato de celulosa de 0,2 !m a vacio y se diluyeron con tampon fosfato con azida de sodio y cloruro de sodio a pH 7,5. El volumen final es de aproximadamente 1000 ml.

Los anticuerpos monoclonales anti-everolimus pueden prepararse mediante la inmunizacion de ratones. Puede inyectarse a un raton una composicion que contiene un inmunogeno de esta invencion y coadyuvante de Freund. Despues de la ultima inmunizacion, se sacrifico el raton y se proceso el bazo. Se fusionaron las celulas de bazo con celulas de mieloma. Se dejaron crecer las celulas fusionadas y se cribo el sobrenadante por ELISA.

EJEMPLO III (comparativo): Inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia que usa RAD 822: trazador FAMCO-E

Inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia automatizado (FPIA)

Este ejemplo describe un inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia (FPIA) ejemplar para everolimus.

Se efectuo el inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia usando un analizador de polarizacion TDx automatizado (Abbott Laboratories, Irving, TX) que usa un ensayo competitivo que incluia un anticuerpo anti-analito (el anticuerpo anti-everolimus del ejemplo II) o "A", un conjugado de fluoresceina-analogo de everolimus (trazador o "T") y un tampon de pretratamiento o "B". Se consiguio la calibracion del ensayo automatizado descrito en los ejemplos con una serie de seis patrones que incluyen suero humano enriquecido con concentraciones especificas de everolimus. Se disponen las muestras de pacientes (plasma) en recipientes de plastico de muestra en un carrusel circular disenado para el instrumento TDx. Se describe el ensayo automatizado con detalle en la bibliografia disponible de Abbott Laboratories, Irving, TX. Se entiende que, aunque se usa el analizador de polarizacion TDx en este ejemplo, pueden usarse otros dispositivos para detectar la polarizacion en un FPIA.

Recogida de especimenes y preparacion para analisis

Este ensayo se ha caracterizado solo para muestras de concentracion minima.

Se usa sangre completa tratada con EDTA para cada ensayo. Cada ensayo usa 600 !l de sangre completa, recogida usando la tecnica de venopuncion aseptica normal en tubos de vidrio o plastico con EDTA. Ilustrativamente, las muestras de pacientes pueden almacenarse a 2-8°C durante hasta 24 horas. Si se requiere un almacenamiento mas largo, la sangre completa puede congelarse a -20°C o mas frio y puede ensayarse hasta 28 dias despues. Ilustrativamente, se descongelan completamente las muestras congeladas y se mezclan concienzudamente antes del uso. Se mezclan concienzudamente todas las muestras (congeladas y frescas) invirtiendo suavemente multiples veces antes de efectuar la extraccion de muestra.

Reactivos

Reactivo anticuerpo (5 ml)- <5% de antisueros de conejo en tampon que contiene proteina como estabilizante y <0,1% de azida de sodio como conservante. Se produjo el reactivo anticuerpo policlonal en procedimientos coherentes con el ejemplo II, usando el inmunogeno mostrado en la Fig. 6 (RAD 822:BSA).

Reactivo trazador (5 ml)-<1% de trazador de fluoresceina (RAD 822: FAMCO-E FP, como se muestra en la Fig. 5) en tampon que contiene PBS 0,01 M, pH 7,5, 0,1% de azida de sodio y gamma-globulina bovina 0,01 mg/ml. Tapa de vial marcada con "T".

Tampon de pretratamiento (5 ml)- tampon tris, detergente y <0,1% de azida de sodio como conservante. Tapa de vial marcada con "B".

Reactivo de precipitacion (7,5 ml)- contiene reactivo precipitante y <0,1% de azida de sodio.

Procedimiento de ensayo

A. Procedimiento de extraccion de muestra: Se extraen muestras (patrones, muestras de pacientes y controles) justo antes del analisis por el instrumento. Se pipetean 600 !l de cada patron, control o muestra para ensayar en el tubo de centrifuga apropiado. Se dispensan 700 �l de metanol a la muestra y se anaden 100 !l de reactivo de precipitacion a cada tubo de centrifuga que contiene muestra y metanol. Se tapa inmediatamente cada tubo de centrifuga para evitar la evaporacion, se

5 mezcla/somete a vortex entonces vigorosamente a la velocidad maxima durante al menos 10 segundos y se centrifuga durante al menos 8 minutos a 13.400 x g. Despues de centrifugar, se pipetean al menos 300 !l de cada sobrenadante a cartuchos de muestra cargados en el carrusel y se activa inmediatamente el instrumento para minimizar la evaporacion de muestra.

B. Sumario del procedimiento:

10 Se disponen en un carrusel de ensayo dos cartuchos y dos cubetas por cada muestra de paciente y control. Se pipetean al menos 300 !l de sobrenadante del procedimiento de extraccion de muestra en cada pocillo de muestra, evitando las burbujas. Se mezclan los reactivos por inversion suave. Se retiran los tapones del vial, se disponen el conjunto de reactivos y carrusel de ensayo en el analizador y se activa el proceso de ensayo sin demora.

El material de referencia usado se preparo mediante adicion gravimetrica a sangre humana hemolizada. A cada lote

15 de patron se le asigna un valor en el TDx® usando un material de referencia que sea trazable con un procedimiento de CL/EM validado. Como se configura actualmente, se imprime el valor asignado de concentracion de cada nivel de patron en la etiqueta de carton del patron y la tarjeta de valor de patron adjunta. Estos valores se programan en los parametros de TDx® con cada nuevo lote de patron. El intervalo de ensayo es de 2,00 ng/ml al valor asignado al patron F (-40 ng/ml).

20 Resultados

El sistema de ensayo ilustrativo es un procedimiento cuantitativo. Se registran las concentraciones de everolimus en la impresion del analizador TDx®/TDxFlx® en ng/ml. Los resultados de muestra de paciente menores que la sensibilidad del ensayo deberian resenarse como "<2,00 ng/ml". La concentracion de everolimus en la mayoria de muestras entrara dentro del intervalo de ensayo. Si el valor de una muestra de paciente es mayor que el patron F, se

25 imprimira "HI". Ilustrativamente, dichas muestras pueden diluirse manualmente (1:1 o 1:4) con sangre completa negativa de everolimus, volverse a ensayar efectuando el procedimiento de extraccion de muestra y multiplicarse el valor impreso final por el factor de dilucion para obtener la concentracion verdadera.

Se prefiere que los patrones, controles y muestras se procesen duplicadamente dos o mas veces y se resene el valor medio. Se prefiere repetir los resultados con un coeficiente de variacion (C�) de las duplicaciones mayor del

30 20%.

La mayoria del extracto de muestra es metanol. Debido a la volatilidad del metanol, el tiempo entre la extraccion y el analisis de muestra se ha limitado para evitar la evaporacion. La evaporacion de las muestras puede conducir a resultados falsamente elevados. Por consiguiente, si las muestras se cargan en el instrumento y se anula el proceso, estas muestras deben volverse a extraer y procesar.

35 C. Caracteristicas de rendimiento de FPIA que usa reactivo anticuerpo policlonal (RAD 822:BSA) y reactivo trazador (RAD 822:FAMCO-E)

1. Recuperacion de muestras enriquecidas

Se enriquecieron especimenes de sangre completa negativos de everolimus con everolimus en el intervalo de ensayo y se ensayaron entonces n=3 en tres analizadores diferentes. Se comparo el valor medio con el valor de

40 CL/EM y se calculo el porcentaje de recuperacion. Se muestran los resultados en la Tabla 1.

Tabla 1: Porcentaje de recuperacion = media del resultado de TDx / resultado de CL/EM x 100%

TDx Resultado medio de TDx (ng/ml)

CL/EM Resultado medio de CL/EM (ng/ml) Porcentaje de recuperacion

32,07 22,32 14,52 7,27 3,63

39,53 28,46 17,39 9,49 4,74 81% 78% 83% 77% 77%

2. Correlacion de la muestra de paciente con el procedimiento de referencia 5

Se compararon las concentraciones medidas mediante el sistema de ensayo ilustrativo TDx® con las medidas por CL/EM en muestras de sangre completa de pacientes que recibieron terapia de everolimus. Se muestran en la Fig. 10 los resultados de los ensayos de dos laboratorios de referencia para pacientes de transplante de rinon (datos analizados usando el analisis de regresion lineal Passing Bablock), comparando el sistema de ensayo ilustrativo frente a CL/EM. Las muestras de TDx estaban en el intervalo de 2,40 ng/ml a 33,17 ng/ml y son de 110 pacientes individuales. De forma similar, se muestran en la Fig. 11 los resultados del ensayo de dos laboratorios de referencia para pacientes de transplante de corazon (datos analizados usando el analisis de regresion lineal Passing Bablock), comparando el sistema de ensayo ilustrativo frente a CL/EM. Las muestras en TDx estaban en el intervalo de 2,06 ng/ml a 20,60 ng/ml y son de 62 pacientes individuales diferentes. El sistema de ensayo ilustrativo muestra una relacion lineal entre el porcentaje de dilucion y la recuperacion en el intervalo de ensayo.

Se evaluo la precision del sistema de ensayo ilustrativo segun las directrices del NCCLS. Se efectuaron estudios ensayando cada muestra por duplicado, dos veces al dia durante 20 dias no consecutivos en un solo analizador, y calibrando segun fuera necesario. Se muestran los resultados a continuacion en la Tabla 2.

Tabla 2: Estudio de precision

Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Media (ng/ml) 3,28 12,38 36,55 DE en la pasada (ng/ml) 0,35 0,73 3,13 C� en la pasada (%) 11% 6% 9% DE de dia a dia (ng/ml) 0,39 0,63 1,85 C� de diaa dia (%) 12% 5% 5% DE de pasada a pasada (ng/ml) 0,35 0,66 1,74 C� de pasada a pasada (%) 11% 5% 5% DE total (ng/ml) 0,63 1,17 4,03 C� total (%) 19% 9% 11%

3. Especificidad. Reactividad cruzada.

Se realizaron estudios para examinar la reactividad cruzada del reactivo anticuerpo "A" con los principales metabolitos de everolimus. Se anadieron los compuestos (en la Tabla 3 siguiente) a 5 ng/ml a sangre completa humana agrupada normal (que contiene enriquecimiento con everolimus en el extremo inferior del intervalo terapeutico, aproximadamente a 4 ng/ml) y se ensayaron en el sistema de ensayo ilustrativo. Se ensayo sangre completa humana normal con enriquecimiento con everolimus como control.

Aunque se ensayaron a 5 ng/ml, se esperarian concentraciones de metabolito menores en los pacientes reales con terapia de everolimus. Se han encontrado RAD SA, RAD y PSA en cantidades <20% del farmaco original en estudios del metabolismo farmacologico de sujetos humanos. La reactividad cruzada de los metabolitos hidroxil(24/25 OH RAD, 46 OH RAD) no se ensayo por adicion por enriquecimiento.

Tabla 3. Reactividad cruzada: % de reactividad cruzada = ([everolimus medido con metabolito enriquecido] -[control medido] / [metabolito anadido]) x 100

Compuesto

Concentracion Concentracion % de reactividad

ensayado

ensayada (ng/ml) aparente (ng/ml) cruzada

RAD SA

5 0,26 5

RAD PSA

5 0,62 12

4. Especificidad. Interferencia de farmaco

Se ensayo el sistema de ensayo ilustrativo frente a compuestos potencialmente interferentes. Las sustancias mostradas en la Tabla 4, cuando se anaden a sangre completa humana (que contiene everolimus 12 ng/ml), tenian una reactividad cruzada menor del 5% cuando se ensayaban a concentraciones superiores a los niveles clinicamente relevantes.

Tabla 4: Interferencia de farmacos

Farmaco Nivel de ensayo (!g/ml) Acetaminofeno 200 N-acetilprocainamida 120 Aciclovir 1000 Albuterol 0,18 Alopurinol 60 Amikacina 150 Anfotericina B 100

�cido

ascorbico 30 Atenolol 40 Azatioprina 10 Cafeina 100 Captoprilo 50 Carbamezapina 120 Cefaclor 230 Cloranfenicol 250 Cimetidina 100 Ciprofloxacina 2500 Ciclosporina A 1 Digoxina 10 Diisopiramida 30 Eritromicina 200 Etanol 3500

�cido

folico 0,01 Furosemida 100 Ganciclovir 1000 Gentamicina 20 Glipizida 60 Gliburida 40 Heparina 8000 U/l Hidralazina 32 Hidroclorotiazida 40 Ibuprofeno 400 Insulina 400 !U/ml Intralipido 15000 Isoniazida 70 Clorhidrato de isoproterenol 0,06 Kanamicina 100 Cetoconazol 10 Labetalol 200

Lidocaina 100 Lovastatina 4 HCl de metformina 5100 Metoclopramida 4 Misoprostol 0,015 Sulfato de morfina 6

�cido

micofenolico 250 Nadolol 333 Naproxeno 1000 Niacina 800 Nifedipina 120 Omeprazol 14 Penicilina G 100 Fenobarbital 150 Fenitoina 100 Piperacilina 8 Prazosina 25 Prednisona 12 Prednisolona 12 Primidona 100 Procainamida 25 Propanolol 0,5 Quinidina 100 Ranitidina 200 Rifampina 50

�cido

salicilico 500 Espectinomicina 100 Sulfametoxazol 400 Tacrolimus 0,5 Teofilina 250 Tobramicina 20 Triamtereno 600 Trimetoprim 20

�cido

valproico 1000

�ancomicina 630

�erapamilo 10

Especificidad. Sustancias interferentes

Se anadieron los siguientes compuestos, como se muestra en la Tabla 5, a sangre completa humana normal que contiene everolimus en o por debajo del extremo inferior del intervalo terapeutico, dando como resultado <10% de error en la cuantificacion de everolimus por el sistema de ensayo ilustrativo.

Tabla 5: Sustancias interferentes

Compuesto ensayado Concentracion ensayada Albumina 12 g/dl Bilirrubina 20 mg/dl Colesterol 500 mg/dl Gamma-globulina humana 12 g/dl Factor reumatoide 500 UI/ml Trigliceridos 1.500 mg /dl

Los hematocritos al 20% y 60% dieron como resultado :10% de error en la cuantificacion de everolimus mediante el sistema de ensayo ilustrativo.

5 5. Sensibilidad

El limite de cuantificacion (LOQ) del sistema de ensayo ilustrativo, definido como la menor concentracion en sangre humana completa en la que la C� interensayos entre duplicados multiples es :20%, es de 2,00 ng/ml.

El limite inferior de deteccion (LDD) para el sistema de ensayo ilustrativo, definido como la menor concentracion que puede distinguirse de cero, es 0,80 ng/ml.

10 Se entiende que los resultados anteriores son ilustrativos de FPIA que usa reactivo anticuerpo policlonal (RAD 822:BSA) y reactivo trazador (RAD 822:FAMCO-E). Otros ensayos competitivos dentro del alcance de esta invencion pueden proporcionar caracteristicas de rendimiento diferentes.

Aunque la invencion se ha descrito con detalle con referencia a realizaciones preferidas, existen variaciones y modificaciones dentro del alcance de la invencion como se describe y define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de determinacion de la concentracion de everolimus en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

   a) proporcionar un competidor marcado que comprende everolimus acoplado con un marcador detectable a traves de un ligamiento oxima y que tiene la formula:

   en la que X1 es una cadena ligadora que comprende uno o mas atomos, cada uno de los cuales puede estar no sustituido o sustituido y puede ser ramificado o no ramificado; 10 Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y Z es dicho marcador detectable; b) proporcionar un anticuerpo anti-everolimus producido usando un compuesto antigenico que comprende everolimus acoplado con un portador antigenico a traves de un ligador y que tiene la formula:

   en la que

   n es 0 o 1;

   X es una cadena ligadora que comprende 3-10 atomos de carbono o heteroatomos, en la que dicha cadena ligadora 5 puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada;

   Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

   Z es dicho portador antigenico;

   c) combinar dicha muestra, dicho anticuerpo anti-everolimus y dicho competidor marcado, compitiendo el everolimus en dicha muestra con dicho competidor marcado por la union a dicho anticuerpo anti10 everolimus; y

   d) determinar la concentracion de everolimus en dicha muestra midiendo la cantidad de dicho competidor marcado no unido a dicho anticuerpo mediante la deteccion de dicho marcador.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que X es -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- e Y es -C(O)-.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho anticuerpo anti-everolimus tiene mayor afinidad por 15 dicho everolimus en dicha muestra que por dicho competidor marcado.
4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la etapa (d) de determinacion de la cantidad de dicho competidor marcado no unido a dicho anticuerpo anti-everolimus se efectua mediante un ensayo automatizado seleccionado del grupo consistente en: FPAI, inmunoensayo de microparticulas homogeneas (inmunoturbidimetrico), inmunoensayo de donante de enzima clonada (CEDIA), inmunoensayo heterogeneo quimioluminiscente e

   20 inmunoensayo de flujo lateral.
5. 5. Un kit para determinar la concentracion de everolimus en una muestra, comprendiendo dicho kit: un competidor marcado que comprende everolimus acoplado con un marcador detectable a traves de un ligamiento oxima y que tiene la formula:

   en la que

   X1 es una cadena ligadora que comprende uno o mas atomos, cada uno de los cuales puede estar no sustituido o

   sustituido y puede ser ramificado o no ramificado;

   Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

   Z es dicho marcador detectable; y

   un anticuerpo anti-everolimus;

   en el que dicho anticuerpo anti-everolimus se produce usando un compuesto antigenico que comprende everolimus

   acoplado con un portador antigenico a traves de un ligador y que tiene la formula:

   en la que n es 0 o 1;

   X es una cadena ligadora que comprende 3-10 atomos de carbono o heteroatomos, en la que dicha cadena ligadora puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada; Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

   5 Z es dicho portador antigenico; y en el que dicho competidor marcado compite con dicho everolimus en dicha muestra por la union a dicho anticuerpo anti-everolimus.
6. 6. El kit de la reivindicacion 5, en el que X es -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- e Y es -C(O)-.
7. 7. El kit de la reivindicacion 5, en el que dicho anticuerpo anti-everolimus tiene mayor afinidad por dicho 10 everolimus en dicha muestra que por dicho competidor marcado.

8. 8.

   El kit de la reivindicacion 5, en el que dicho anticuerpo anti-everolimus es un anticuerpo monoclonal.

9. 9.

   El kit de la reivindicacion 5, en el que dicho anticuerpo anti-everolimus es un anticuerpo policlonal.

   Fii ra 1 Fii ra 2 Fii ra 3 Fii ra 4 Fii ra 5 Fii ra 6 Fii ra �

   Fii ra � Fii ra �

   Fii ra 1� Fii ra 11

   Fii ra 12