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ES2331388T3 - Marcador especifico para el cancer de prostata. - Google Patents

Marcador especifico para el cancer de prostata. Download PDF

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Patrick A. Schneider
Karen K. Yamamoto
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Abstract

Un polinucleótido no presente en la naturaleza que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:

Description

Marcador específico para el cáncer de próstata.
Referencia a una solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el privilegio de la fecha de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 60/041.246, presentada el 7 de marzo de 1997, y la solicitud de patente provisional 60/047.811, presentada el 15 de mayo de 1997.
Campo de esta invención
La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican un cDNA específico del cáncer de próstata, proteínas codificadas por los polinucleótidos y métodos para usar estos materiales.
Antecedentes de la invención
La próstata es casi invariablemente una zona de cambios proliferativos benignos y malignos en los varones ancianos. La hipertrofia prostática benigna (BPH) es la anormalidad proliferativa no maligna más común de los órganos internos. Un alto porcentaje de estos trastornos del crecimiento relacionados con la edad se desarrolla en enfermedades malignas. Como resultado de esto, el adenocarcinoma de próstata representa la enfermedad maligna más común en varones americanos y es la segunda causa más importante de muerte por cáncer en hombres.
Un método útil en la diagnosis del cáncer de próstata es determinar el nivel de antígeno específico de la próstata (PSA) en la sangre. El PSA es una glicoproteína secretada por la glándula prostática. Sin embargo, la prueba del PSA tiene limitaciones de sensibilidad y selectividad:
En general, niveles de 4 ng/ml son sugestivos de cáncer y niveles por encima de 10 ng/ml son altamente sugestivos. Sin embargo, muchos individuos con niveles elevados no tienen cáncer de próstata, sino que exhiben hipertrofia prostática benigna. A la inversa, muchas personas con cáncer de próstata tienen niveles de PSA normales en el momento de la diagnosis. Por lo tanto, marcadores para el cáncer de próstata con mayor sensibilidad y selectividad para el cáncer de próstata serían útiles, entre otras cosas, para la diagnosis del cáncer de próstata.
Sumario de la invención
Se ha clonado un cDNA que codifica un marcador específico del cáncer de próstata, llamado Repro-PC-1.0, y se ha determinado su secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del cDNA y la secuencia de aminoácidos deducida de Repro-PC-1.0 se presentan como Nº ID SEC:1 y Nº ID SEC:2, respectivamente. Repro-PC-1.0 se expresa en células de cáncer de próstata y es útil como un marcador en la detección del cáncer de próstata. La inhibición de la expresión de Repro-PC-1.0 es útil en el tratamiento profiláctico y terapéutico del cáncer de próstata.
También se ha encontrado que la expresión de Repro-PC-1.0 depende del ambiente - las células procedentes de la línea celular de adenocarcinoma de próstata, LNCaP, sobreexpresan Repro-PC-1.0 cuando se propagan en ratones desnudos macho, pero no cuando se propagan en ratones desnudos hembra. Repro-PC-1.0 tiene un nivel significativo de identidad de la secuencia de aminoácidos con las sinaptotagminas. Por lo tanto, se cree que Repro-PC-1.0 funciona en reacciones de fusión de membranas y gemación de membranas.
De acuerdo con esto, la invención proporciona moléculas polinucleotídicas no presentes en la naturaleza (recombinantes) que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Repro-PC-1.0 o Repro-PC-1.0. Péptidos de Repro-PC-1.0 incluyen Repro-PC-1.0 natural (Nº ID SEC:2) y variantes alélicas de él. Análogos de Repro-PC-1.0 incluyen análogos activos, que tienen la actividad biológica de Repro-PC-1.0, análogos inactivos, útiles como señuelos, y análogos inmunogénicos, que, cuando se usan como un inmunógeno, provocan una respuesta inmunitaria contra Repro-PC-1.0 o células que lo expresan. En una realización, el polinucleótido no presente en la naturaleza comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad con polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2. En otra realización, la molécula polinucleotídica no presente en la naturaleza (recombinante) comprende una secuencia de nucleótidos que encierra al menos 100 aminoácidos consecutivos de polipéptido de Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2). En otra realización, la secuencia de nucleótidos es sustancialmente idéntica o idéntica a la secuencia de nucleótidos de Repro-PC-1.0 (Nº ID
SEC:1).
En un aspecto, esta invención proporciona vectores de expresión que comprenden secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de Repro-PC-1.0.
En otro aspecto, esta invención proporciona sondas y cebadores polinucleotídicos de al menos 15 nucleótidos que se hibridan específicamente a una secuencia seleccionada de cDNA de Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC: 1) o su complemento, en donde la sonda o el cebador no es la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5.
En otro aspecto, esta invención proporciona vectores de expresión que comprenden secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptido de Repro-PC-1.0, una sonda, un cebador o un polinucleótido inhibidor de Repro-PC-1.0 de esta invención.
En otro aspecto, esta invención proporciona células recombinantes en las que se ha introducido un vector de expresión que comprende secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de Repro-PC-1.0.
También se describe en la presente memoria un método para la expresión de mRNA de Repro-PC-1.0 en una célula que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica Repro-PC- 1.0, que comprende conectar operativamente una secuencia de control de la expresión a la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser, por ejemplo, una secuencia dentro del DNA genómico de un animal.
También se describen en la presente memoria métodos para producir un polipéptido de Repro-PC-1.0 o un análogo de Repro-PC-1.0, que comprenden cultivar una célula recombinante que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Repro-PC-1.0 o análogo de Repro-PC-1.0.
En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para detectar un cDNA de Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:1) o su complemento en una muestra, que comprende las etapas de (a) poner en contacto la muestra con una sonda o cebador polinucleotídico que comprende una secuencia de al menos 15 nucleótidos que se hibrida específicamente a la secuencia de nucleótidos, en donde la sonda no es la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5, y (b) detectar si el polinucleótido se ha hibridado específicamente al polinucleótido. La hibridación específica proporciona una detección del polinucleótido en la muestra.
En otro aspecto, esta invención proporciona proteína de Repro-PC-1.0 recombinante purificada, por ej. una proteína cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de Nº ID SEC:2 o cuya secuencia de aminoácidos es al menos 95% idéntica al Nº ID SEC:2. La invención también proporciona polipéptido de Repro-PC-1.0 cuya secuencia de aminoácidos no está presente en la naturaleza y que comprende una secuencia de al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos de Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2) y tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el Nº ID SEC:2. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos que tienen la actividad biológica de Repro-PC-1.0, así como polipéptidos capaces de provocar la producción de anticuerpos que reconocen Repro-PC-1.0.
En otro aspecto, esta invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a polipéptido de Repro-PCT-1.0.
En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para detectar un polipéptido de Repro-PC-1.0 o una variante del mismo que tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2 en una muestra, que comprende las etapas de (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de Repro-PC-1.0 o la variante del mismo y (b) detectar la unión específica entre el anticuerpo y el polipéptido de Repro-PC-1.0 o la variante del mismo. La unión específica proporciona una detección de Repro-PC-1.0 en la muestra.
En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para el uso en la diagnosis, la verificación o la realización de una prognosis para el cáncer de próstata en un sujeto. Los métodos implican detectar mRNA o polipéptido de Repro-PC-1.0 o una variante que tiene al menos 95% de identidad con mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en una muestra procedente del sujeto. En el método diagnóstico, se determina una cantidad diagnóstica de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en una muestra procedente del sujeto y la cantidad diagnóstica se compara con un intervalo normal de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en una muestra de control no cancerosa. Una cantidad diagnóstica por encima del intervalo normal proporciona una indicación positiva en la diagnosis del cáncer de próstata. La detección de una cantidad de mRNA o polipéptido de Repro-PC-1.0 a un nivel de pronóstico particular proporciona una prognosis para el sujeto. Métodos para verificar el avance del cáncer de próstata implican detectar la cantidad de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en el sujeto en un primer y un segundo momento, y comparar las cantidades. Un cambio en la cantidad indica un cambio en el curso de la enfermedad, indicando una cantidad decreciente la remisión del cáncer de próstata e indicando un incremento el avance del cáncer de próstata. Una realización de estos métodos implica la obtención diagnóstica de imágenes de Repro-PC-1.0 en el cuerpo usando sondas, cebadores o anticuerpos etiquetados detectablemente. Métodos para realizar una prognosis para el cáncer de próstata en un sujeto implican determinar la cantidad de polinucleótido o polipéptido de Repro-PC-1.0 en una muestra de un sujeto y comparar esa cantidad con una cantidad de pronóstico. Una cantidad determinada en una cantidad de pronóstico particular proporciona una prognosis para el sujeto.
En otro aspecto, esta invención proporciona un método in vitro para detectar una traslocación cromosómica de un gen de Repro-PC-1.0, que comprende las etapas de hibridar una sonda etiquetada de la invención a una extensión cromosómica procedente de una muestra celular para determinar el patrón de hibridación y determinar si el patrón de hibridación difiere de un patrón normal.
En otro aspecto, esta invención proporciona una inmunotoxina que se une específicamente a polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 o una variante del mismo que tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2, para el uso en un método para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer de próstata en un sujeto. También se describe en la presente memoria otro método que implica alterar el ambiente hormonal de las células cancerosas para suprimir la expresión de Repro-PC-1.0.
También se describen en la presente memoria composiciones farmacéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacológicamente eficaz de un polinucleótido inhibidor de la invención o un anticuerpo de la invención conjugado a toxina.
En otro aspecto, esta invención proporciona métodos de rastreo in vitro para determinar si un compuesto modula (inhibe o promueve) la expresión de Repro-PC-1.0 o una variante alélica del mismo en una célula. Los métodos implican poner en contacto la célula con el compuesto y la respuesta inmunitaria mediada por células dependiente implica proporcionar al sujeto células transfectadas con un vector de expresión que codifica polipéptido de Repro-PC-1.0, o polipéptidos de Repro-PC-1.0 de al menos 100 aminoácidos consecutivos de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2, que comprende motivos de aminoácido reconocidos por moléculas de Clase I del MHC.
En otro aspecto, esta invención proporciona métodos de rastreo in vitro para determinar se un compuesto modula (inhibe o promueve) la expresión de Repro-PC-1.0 o una variante alélica del mismo en una célula. Los métodos implican poner en contacto la célula con el compuesto y determinar si la producción de mRNA o polipéptido de Repro-PC-1.0 se altera (se incrementa, se disminuye o permanece sin cambio) de un modo estadísticamente significativa (p < 0,05).
En otro aspecto, esta invención proporciona métodos in vitro para detectar formas polimorfas de Repro-PC-1.0, que comprenden comparar la identidad de un nucleótido o aminoácido en una posición seleccionada a partir de la secuencia de un gen o polipéptido de Repro-PC-1.0 de prueba con la identidad del nucleótido o aminoácido en la posición correspondiente de Repro-PC-1.0 natural (Nº ID SEC:1 ó 2). Una diferencia en la identidad indica que el polinucleótido de prueba es una forma polimorfa de Repro-PC-1.0.
También se describe en la presente invención un animal no humano transgénico, preferiblemente un mamífero, cuyas células germinales comprenden un polinucleótido recombinante de esta invención.
Breve descripción de los dibujos
Las Figs. 1A-1B son fotografías de células LNCaP en ratones macho (1A) y hembra (1B).
Las Figs. 2A-2B son fotografías de un análisis Northern. La Fig. 2A muestra RNA procedente de células LNCaP y se hibrida con una sonda específica para Repro-PC-1.0. La Fig. 2B muestra la rehibridación de la misma transferencia con sondas para tubulina y actina. Macho = tumores desarrollados en machos. Hembra = tumores desarrollados en hembras. C = células LNCaP. P = células PC3.
La Fig. 3 muestra el alineamiento de clones solapados que, juntos, producen el cDNA de Repro-PC-1.0 de Nº ID SEC:1.
La Fig. 4 presenta una comparación de la organización de polipéptidos de PKC, Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina.
La Fig. 5 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina 4 de rata ("SYT4").
La Fig. 6 muestra el alineamiento de las repeticiones internas de PKC-C2, la repetición "B" de Repro-PC-1.0, la repetición "B" de sinaptotagmina, la repetición "A" de sinaptotagmina y la repetición "A" de Repro-PC-1.0.
Descripción detallada I. Definiciones
A no ser que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la especialidad a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos usados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2ª ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Aunque pueden usarse cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o las pruebas de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Según se usa en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados asignados a ellos a no ser que se especifique otra cosa.
"Polinucleótido" se refiere a un polímero compuesto por unidades nucleotídicas (ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, variantes estructurales presentes en la naturaleza relacionadas y análogos no presentes en la naturaleza sintéticos de los mismos) conectadas a través de enlaces fosfodiéster, variantes estructurales presentes en la naturaleza relacionadas y análogos no presentes en la naturaleza sintéticos de los mismos. Así, el término incluye polímeros nucleotídicos en los que los nucleótidos y los enlaces entre ellos incluyen análogos sintéticos no presentes en la naturaleza, tales como, por ejemplo y sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metilrribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), y similares. Tales polinucleótidos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de DNA automatizado. El término "ácido nucleico" se refiere típicamente a polinucleótidos grandes. El término "oligonucleótido" se refiere típicamente a polinucleótidos cortos, generalmente no mayores de aproximadamente 50 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de DNA (es decir, A, T, G, C), esta también incluye una secuencia de RNA (es decir, A, U, G, C) en la que "U" reemplaza a "T."
En la presente memoria se usa la notación convencional para describir secuencias polinucleotídicas: el extremo izquierdo de una secuencia polinucleotídica de una sola hebra es el extremo 5'; la dirección a izquierdas de una secuencia polinucleotídica de doble hebra se denomina la dirección 5'. La dirección de adición 5' a 3' de nucleótidos a transcritos de RNA nacientes se denomina la dirección de transcripción. La hebra de DNA que tiene la misma secuencia que un mRNA se denomina la "hebra codificante"; las secuencias en la hebra de DNA que tienen la misma secuencia que un mRNA transcrito a partir de ese DNA y que están situadas 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de RNA se denominan "secuencias aguas arriba"; las secuencias en la hebra de DNA que tienen la misma secuencia que el RNA y que son 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de RNA codificante se denominan "secuencias aguas abajo".
"Polipéptido" se refiere a un polímero compuestos por residuos de aminoácido, variantes estructurales presentes en la naturaleza relacionadas y análogos no presentes en la naturaleza sintéticos de los mismos conectados a través de enlaces peptídicos, variantes estructurales presentes en la naturaleza relacionadas y análogos no presentes en la naturaleza sintéticos de los mismos. Los polipéptidos sintéticos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de polipéptidos automatizado. El término "proteína" se refiere típicamente a polipéptidos grandes. El término "péptido" se refiere típicamente a polipéptidos cortos.
"Presente en la naturaleza", cuando se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio está presente en la naturaleza.
En la presente memoria se usa la notación convencional para representar secuencias polipeptídicas: el extremo izquierdo de una secuencia polipeptídica es el extremo amino; el extremo derecho de una secuencia polipeptídica es el extremo carboxilo.
Términos usados para describir relaciones de secuencias entre dos o más secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos incluyen "secuencia de referencia", "seleccionada de", "intervalo de comparación", "idéntica", "porcentaje de identidad de secuencia", "sustancialmente idéntica", "complementaria" y "sustancialmente complementaria."
Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como una base para una comparación de secuencias y puede ser un subgrupo de una secuencia mayor, por ej. una secuencia de cDNA, proteínica o génica completa.
Debido a que dos polinucleótidos o polipéptidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, o (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos a lo largo de un "intervalo de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia.
Un "intervalo de comparación" se refiere a un segmento conceptual típicamente de al menos 12 residuos de nucleótido consecutivos o 4 de aminoácidos consecutivos que se compara con una secuencia de referencia. El intervalo de comparación tiene frecuentemente una longitud de al menos 15 o al menos 25 nucleótidos o al menos 5 o al menos 8 aminoácidos. El intervalo de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de aproximadamente 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear un intervalo de comparación puede efectuarse mediante ejecuciones computarizadas de algoritmos (AAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el porcentaje más alto de homología a lo largo del intervalo de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos.
Una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos en cuestión es "idéntica" a una secuencia de referencia si las dos secuencias son iguales cuando están alineadas para una correspondencia máxima a lo largo de la longitud de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos.
El "porcentaje de identidad de secuencia" entre dos secuencias se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de un intervalo de comparación, determinando el número de posiciones en las que el nucleótido o aminoácido idéntico está presente en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones del intervalo de comparación (es decir, el tamaño del intervalo) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. A no ser que se especifique otra cosa, el intervalo de comparación usado para comparar dos secuencias es la longitud de la secuencia más corta.
Alternativamente, cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a polipéptidos, se sabe que las posiciones de residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, en las que los residuos de aminoácido se sustituyen por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ej., carga o hidrofobia) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la especialidad. Típicamente, esto implica puntuar una sustitución conservativa como una falta de coincidencia parcial en vez de total, incrementando de ese modo el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución no conservativa se le da una puntuación de cero, a una sustitución conservativa se le da una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservativas se calcula, por ej., de acuerdo con un algoritmo conocido. Véanse, por ej., Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988); Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988); Higgins & Sharp Gene, 73: 237-244 (1988); Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992); y Pearson et al., Methods in Molecular Biology 24: 307-31 (1994). El alineamiento también se realiza a menudo mediante inspección y alineamiento manual.
Una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos en cuestión es "sustancialmente idéntica" a una secuencia de referencia si la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos en cuestión tiene al menos 90% de identidad de secuencia a lo largo de un intervalo de comparación. Así, las secuencias que tienen al menos 95% de identidad de secuencia, al menos 98% de identidad de secuencia o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia también son "sustancialmente idénticas". Dos secuencias que son idénticas entre sí, por supuesto, también son "sustancialmente idénticas".
"Complementario" se refiere a la compatibilidad o coincidencia topológica entre sí de superficies interactivas de dos polinucleótidos. Así, las dos moléculas pueden describirse como complementarias y, por otra parte, las características de la superficie de contacto son complementarias entre sí. Un primer polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es idéntica a la secuencia de nucleótidos del socio de unión polinucleotídico del segundo polinucleótido. Así, el polinucleótido cuya secuencia es 5'-TATAC-3' es complementario a un polinucleótido cuya secuencia es 5'-GTATA-3'.
Una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente complementaria" a una secuencia de nucleótidos de referencia si la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos en cuestión es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia.
"Codificar" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un cDNA o un mRNA, para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen bien una secuencia definida de nucleótidos (es decir, rRNA, tRNA y mRNA) o bien una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de los mismos. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción de mRNA producido por ese gen producen la proteína en una célula u otro sistema biológico. Puede hacerse referencia a que tanto la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de mRNA y es proporcionada habitualmente en listados se secuencia, como la hebra no codificante, usada como la plantilla para la transcripción, de un gen o cDNA codifican la proteína u otro producto de ese gen o cDNA. A no ser que se especifique otra cosa, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y RNA pueden incluir
intrones.
"Secuencia de control de la expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos en un polinucleótido que regula la expresión (transcripción y/o traducción) de una secuencia de nucleótidos conectada operativamente a la misma. "Conectada operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos partes en la que la actividad de una parte (por ej., la capacidad para regular la transcripción) da como resultado una acción sobre la otra parte (por ej., transcripción de la secuencia). Secuencias de control de la expresión pueden incluir, por ejemplo y sin limitación, secuencias de promotores (por ej., inducibles o constitutivas), potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de iniciación (es decir, ATG), señales de corte y empalme para intrones, y codones de parada.
"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que ha de expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o el sistema de expresión in vitro. Vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la especialidad, tales como cósmidos, plásmidos (por ej., desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan el polinucleótido recombinante.
"Sustitución conservativa" se refiere a la sustitución en un polipéptido de un aminoácido por un aminoácido funcionalmente similar. Los seis grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
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"Variante alélica" se refiere a cualesquiera de dos o más formas polimorfas de un gen que ocupa el mismo locus genético. Las variaciones alélicas surgen naturalmente a través de mutación y pueden dar como resultado polimorfismo genotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. "Variantes alélicas" también se refiere a cDNAs derivados de transcritos de mRNA de variantes alélicas genéticas, así como a las proteínas codificadas por ellos.
"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene secuencias que naturalmente no están empalmadas entre sí. Un polinucleótido recombinante amplificado o ensamblado puede incluirse en un vector adecuado, y el vector puede usarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula huésped que comprende el polinucleótido recombinante se denomina una "célula huésped recombinante". El gen se expresa entonces en la célula huésped recombinante para producir, por ej., un "polipéptido recombinante". Un polinucleótido recombinante puede servir asimismo para una función no codificante (por ej., promotor, origen de replicación, sitio de unión al ribosoma, etc.).
"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, que específicamente se unen a y reconocen un analito (antígeno). Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de regiones variables de inmunoglobulina. Los anticuerpos existen, por ej., como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas peptidasas. Esto incluye, por ej., fragmentos Fab' y F(ab)'_{2}. El término "anticuerpo", según se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de anticuerpo bien producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros o bien los sintetizados de novo usando metodologías de DNA recombinante.
"Inmunoensayo" se refiere a un ensayo que utiliza un anticuerpo que se une específicamente a un analito. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de las propiedades de unión específica de un anticuerpo particular para aislar, elegir como diana y/o cuantificar el analito.
"Vacuna" se refiere a un agente o una composición que contiene un agente eficaz para conferir un grado terapéutico de inmunidad en un organismo mientras que solamente provoca niveles muy bajos de morbidez o mortalidad. Por supuesto, los métodos para elaborar vacunas son útiles en el estudio del sistema inmunitario y para prevenir y tratar una enfermedad en animales o seres humanos.
Una "cantidad inmunogénica" es una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto.
"Hibridarse específicamente a" o "hibridación específica" o "hibridarse selectivamente a" se refiere a la unión, la formación de un dúplex o la hibridación de una molécula de ácido nucleico preferentemente a una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones restrictivas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja de DNA o RNA (por ej., celular total).
El término "condiciones restrictivas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará preferentemente a su subsecuencia diana, y en una extensión menor a, o en absoluto a, otras secuencias. La "hibridación restrictiva" y las "condiciones de lavado con hibridación restrictiva" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como hibridaciones Southern y Northern son dependientes de la secuencia, y son diferentes bajo parámetros ambientales diferentes. Una guía extensiva de la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nueva York. Generalmente, se selecciona que las condiciones de hibridación y lavado altamente restrictivas son aproximadamente 5ºC inferiores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una intensidad iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica y pH definidos) a la que 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente coincidente. Se selecciona que las condiciones muy restrictivas son iguales a la Tm para una sonda particular.
Un ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42º C, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente restrictivas es NaCl 0,15 M a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0,2 X SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase Sambrook et al. para una descripción del tampón de SSC). A menudo, un lavado de alta restricción está precedido de un lavado de baja restricción para retirar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de restricción media para un dúplex de, por ej., más de 100 nucleótidos, es 1 x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja restricción para un dúplex de, por ej., más de 100 nucleótidos, es 4-6 x SSC a 40ºC durante 15 minutos. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o más) la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.
Un anticuerpo "se une específicamente a" o "es específicamente inmunorreactivo con" una proteína cuando el anticuerpo funciona en una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en presencia de una población heteróloga de proteínas y otros materiales biológicos. Así, bajo condiciones de inmunoensayo señaladas, los anticuerpos especificados se unen preferentemente a una proteína particular y no se unen en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a una proteína bajo tales condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se usan habitualmente inmunoensayos de ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlot y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica.
Una primera secuencia es una "secuencia antisentido" con respecto a una segunda secuencia si un polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia se hibrida específicamente con un polinucleótido cuya secuencia es la segunda secuencia.
"Sustancialmente pura" significa que una especie elegida como objetivo es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar, más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie elegida como objetivo comprende al menos aproximadamente 50% (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura significa que de aproximadamente 80% a 90% o más de la especie macromolecular presente en la composición es la especie purificada de interés. La especie elegida como objetivo se purifica hasta homogeneidad esencial (la especie contaminante no puede detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) si la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular. Especies de disolventes, moléculas pequeñas (< 500 daltons), estabilizantes (por ej., BSA) y especies iónicas elementales no se consideran especies macromoleculares para los propósitos de esta definición.
"Cebador" se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridarse específicamente a una plantilla polinucleotídica señalada y proporcionar un punto de iniciación para la síntesis de un polinucleótido complementario. Tal síntesis se produce cuando el cebador polinucleotídico se sitúa bajo condiciones en las que se induce la síntesis, es decir, en presencia de nucleótidos, una plantilla polinucleotídica complementaria y un agente para la polimerización tal como DNA polimerasa. Un cebador es típicamente de una sola hebra, pero puede ser de doble hebra. Los cebadores son típicamente ácidos desoxirribonucleicos, pero una amplia variedad de cebadores sintéticos y presentes en la naturaleza son útiles para muchas aplicaciones. Un cebador es complementario a la plantilla a la que está señalado que se hibride para servir como un sitio para la iniciación de la síntesis, pero no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. En tal caso, la hibridación específica del cebador a la plantilla depende de la restricción de las condiciones de hibridación. Los cebadores pueden etiquetarse con, por ej., restos cromogénicos, radiactivos o fluorescentes y usarse como restos detectables.
"Sonda" se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridarse específicamente a una secuencia señalada de otro polinucleótido. Una sonda se hibrida específicamente a un polinucleótido complementario diana, pero no necesita reflejar la secuencia complementaria exacta de la plantilla. En tal caso, la hibridación específica de la sonda a la diana depende de la restricción de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden etiquetarse con, por ej., restos cromogénicos, radiactivos o fluorescentes y usarse como restos detectables.
"Detectar" se refiere a determinar la presencia, la ausencia o la cantidad de un analito en una muestra, y puede incluir cuantificar la cantidad del analito en una muestra o por célula en una muestra.
Un "resto detectable" o una "etiqueta" se refieren a una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, etiquetas útiles incluyen ^{32}P, ^{35}S, colorantes fluorescentes, reactivos electrónicamente densos, enzimas (por ej., como las usadas comúnmente en un ELISA), biotina-estreptavidina, dioxigenina, haptenos y proteínas para los que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales, o moléculas de ácido nucleico con una secuencia complementaria a una diana. El resto detectable genera a menudo una señal medible, tal como una señal radiactiva, cromogénica o fluorescente, que puede usarse para cuantificar la cantidad de resto detectable unido en una muestra. El resto detectable puede estar incorporado en o ligado a un cebador o una sonda bien covalentemente o bien a través de enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ej., incorporación de nucleótidos radiactivos, o nucleótidos biotinilados que son reconocidos por estreptavadina. El resto detectable puede ser detectable directamente o indirectamente. La detección indirecta puede implicar la unión de un segundo resto detectable directamente o indirectamente al resto detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser el ligando de un socio de unión, tal como biotina, que es un socio de unión para estreptavadina, o una secuencia de nucleótidos, que es el socio de unión para una secuencia complementaria, a la que puede hibridarse específicamente. El socio de unión puede ser por sí mismo directamente detectable, por ejemplo, un anticuerpo puede etiquetarse con una molécula fluorescente. El socio de unión también puede ser detectable indirectamente, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria puede ser parte de una molécula de DNA ramificada que es detectable a su vez a través de hibridación con otras moléculas de ácido nucleico etiquetadas. (Véase, por ej., PD. Fahrlander y A. Klausner, Bio/Technology (1988) 6:1165.) La cuantificación de la señal se alcanza, por ej., mediante conteo por centelleo, densitometría o citometría de flujo.
"Conector" se refiere a una molécula que empalma dos moléculas distintas, bien covalentemente o bien a través de enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ej., una molécula de ácido nucleico que se hibrida a una secuencia complementaria en el extremo 5' y a otra secuencia complementaria en el extremo 3', empalmando así dos secuencias no complementarias.
"Amplificación" se refiere a cualquier medio por el que una secuencia polinucleotídica se copia y así se expande en un número mayor de moléculas de polinucleótido, por ej., mediante transcripción inversa, reacción en cadena de la polimerasa y reacción en cadena de la ligasa.
"Valor de pronóstico" se refiere a una cantidad de un analito en una muestra en cuestión que está de acuerdo con una prognosis particular para una enfermedad señalada. La cantidad (incluyendo una cantidad cero) del analito detectado en una muestra se compara con el valor de pronóstico para la muestra de modo que la comparación relativa de los valores indica el resultado probable del avance de la enfermedad.
"Valor diagnóstico" se refiere a un valor que se determina para un analito en una muestra en cuestión, que se compara a continuación con una escala normal del analito (por ej., procedente de un individuo sano) de modo que la comparación relativa de los valores proporcione un valor de referencia para diagnosticar una enfermedad señalada. Dependiendo del método de detección, el valor diagnóstico puede ser una determinación de la cantidad del analito, pero no es necesariamente una cantidad. El valor diagnóstico también puede ser un valor relativo, tal como una puntuación positiva o negativa, y también incluye un valor que indica la presencia o ausencia del analito en una muestra.
"Composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico en un mamífero. Una composición farmacéutica comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un agente activo y un portador farmacéuticamente aceptable. "Cantidad farmacológicamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente eficaz par producir el resultado farmacológico pretendido. "Portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los portadores, tampones y excipientes farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, solución acuosa al 5% de dextrosa y emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes. Portadores farmacéuticos y formulaciones adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Los portadores farmacéuticos preferidos dependen del modo de administración pretendido del agente activo. Modos de administración típicos incluyen enteral (por ej., oral) o parenteral (por ej., inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa; o administración tópica, transdérmica o transmucosal).
Un "sujeto" de diagnóstico o tratamiento es un animal, tal como un mamífero, incluyendo un ser humano. Animales no humanos sujetos del tratamiento incluyen, por ejemplo, peces, aves y mamíferos tales como primates, vacas, ovejas, cerdos, caballos, perros y gatos.
Un tratamiento "profiláctico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no exhibe signos de una enfermedad o sólo exhibe signos iniciales con el propósito de rebajar el riesgo de desarrollar patología.
Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que exhibe signos de patología con el propósito de disminuir o eliminar esos signos.
II. cDNA que codifica Repro-PC-1.0
Se ha aislado una molécula de cDNA que codifica un marcador específico del cáncer de próstata, llamada Repro-PC-1.0. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de la molécula de ácido nucleico se presentan en Nº ID SEC:1 y Nº ID SEC:2, respectivamente. Esta secuencia de nucleótidos de 3891 bases contiene un marco de lectura abierto de 1275 bases que codifica Repro-PC-1.0 desde el nucleótido 151 hasta el nucleótido 1425. La secuencia de aminoácidos deducida de Repro-PC-1.0 tiene 425 aminoácidos.
El análisis de la secuencia de aminoácidos deducida de Repro-PC-1.0 muestra 90% de identidad con sinaptotagmina IV de rata. Los residuos de aminoácido 15-37 tienen suficiente longitud e hidrofobia para constituir un dominio de transmembrana que presenta los límites de transmembrana inusuales de otras sinaptotagminas. Repro-PC-1.0 también tiene dos copias de una repetición directa de 116 aminoácidos (aminoácidos 150-252 y 276-396) que tienen 34% de identidad entre sí. Estas repeticiones son homólogas al dominio regulador C2 de isoformas dependientes del calcio de proteína quinasa C (PKC) y otras isoformas de las sinaptotagminas.
Las sinaptotagminas son proteínas vesiculares sinápticas que se propone que representan un papel para regular la traslocación vesicular sináptica hacia el sitio de liberación presináptica de la membrana plasmática (atraque) y/o la fusión de estas dos membranas. Por lo tanto, sin querer limitarse por una teoría, se cree que Repro-PC-1.0 funciona en rutas de exocitosis y endocitosis.
III. Ácidos nucleicos de Repro-PC-1.0
De acuerdo con esto, esta invención proporciona polinucleótidos recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de Repro-PC-1.0, polipéptidos que tienen menos de 95% de identidad con Repro-PC-1.0 o fragmentos de ellos, según se describe en la presente memoria. Análogos incluyen "análogos activos" que tienen la actividad biológica de Repro-PC-1.0, "análogos inactivos" útiles, por ej., como señuelos, y "análogos inmunogénicos", que, cuando se presentan como un inmunógeno, provocan la producción de un anticuerpo que se une específicamente a Repro-PC-1.0. Los polinucleótidos son útiles para expresar el mRNA o polipéptidos que codifican y en la preparación de sondas o cebadores, entre otras cosas.
En una realización, la molécula de polinucleótido recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de al menos 100 aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos de Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2). La secuencia de nucleótidos puede codificar una secuencia de al menos 100 aminoácidos o al menos 200 aminoácidos del Nº ID SEC: 2. En una realización, la secuencia de nucleótidos codifica polipéptido de Repro-PC-1.0 natural de longitud total.
La secuencia de nucleótidos puede ser idéntica a una secuencia procedente de cDNA de Repro-PC-1.0 o su complemento, o puede incluir codones degenerados. En una realización de una secuencia de nucleótidos que codifica Repro-PC-1.0 de longitud completa, la secuencia es idéntica a la secuencia codificante de Repro-PC-1.0 de Nº ID SEC:1. En otra realización, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido de Repro-PC-1.0 cuya secuencia de aminoácidos es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de polipéptido de Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2).
En otra realización, el polinucleótido codifica una proteína de fusión entre polipéptido de Repro-PC-1.0 o polipéptido que tiene al menos 95% de identidad con secuencias de aminoácidos de Repro-PC-1.0 y una segunda secuencia de aminoácidos.
Los polinucleótidos de la presente invención se clonan o amplifican mediante métodos in vitro, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencias autosostenido (3SR) y el sistema de amplificación de Q\beta \betareplicasa (QB). Por ejemplo, un polinucleótido que codifica la proteína puede aislarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa de cDNA de células de cáncer de próstata usando cebadores basados en la secuencia de DNA de Repro-PC-1.0 de Nº ID SEC:1. Un par de cebadores útiles para amplificar DNA de Repro-PC-1.0, incluyendo variantes alélicas, es:
5' oligo (109):
Cebador Superior, 21-mero, posición 109:
5' CAG TTT TCC CTT CAG CAC CTC 3'
(Nº ID SEC:3)
\vskip1.000000\baselineskip
3' oligo (3489):
Cebador Inferior, 30-mero, posición 3489:
5' TTC CTT TGT TGT TTC TTT TCT CTT TTC TGA 3'
(Nº ID SEC:4)
Una amplia variedad de metodologías de clonación y amplificación in vitro es bien conocida para los expertos. Métodos de PCR se describen, por ejemplo, en la Pat. de EE. UU. Nº 4.683.195; Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; y Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Los polinucleótidos también pueden aislarse rastreando bibliotecas genómicas o de cDNA con sondas seleccionadas de las secuencias de Nº ID SEC: 1 bajo condiciones de hibridación restrictivas.
Versiones mutantes de las proteínas pueden elaborarse mediante mutagénesis específica para el sitio de otros polinucleótidos que codifican las proteínas, o mediante mutagénesis aleatoria provocada al incrementar el grado de error de la PCR del polinucleótido original con MnCl_{2} 0,1 mM y concentraciones de nucleótido desequilibradas.
Esta invención también proporciona vectores de expresión, por ej., moléculas de polinucleótido recombinante que comprenden secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido diana. Los vectores de expresión pueden adaptarse para funcionar en procariotas o eucariotas mediante la inclusión de promotores, secuencias de replicación, marcadores, etc. apropiados, para la transcripción y traducción de mRNA. La construcción de vectores de expresión y la expresión de genes en células transfectadas implica el uso de técnicas de clonación molecular también muy conocidas en la especialidad. Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., (Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc.). Promotores útiles para tales propósitos incluyen un promotor de metalotioneína, un promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor de polIII de MRP, un promotor de MPSV constitutivo, un promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor de CMV inmediato-temprano de ser humano) y un promotor de CMV constitutivo. Un plásmido útil para la terapia génica puede comprender otros elementos funcionales, tales como marcadores seleccionables, regiones de identificación y otros genes. Plásmidos de expresión de DNA recombinante también pueden usarse para preparar los polinucleótidos de la invención para el aporte por otros medios distintos a la terapia génica, aunque puede ser más económico elaborar oligonucleótidos cortos mediante síntesis química in vitro.
Métodos para transfectar genes en células de mamífero y obtener su expresión para el uso in vitro o para terapia génica son bien conocidos en la especialidad. Véanse, por ej., Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., San Diego, CA (D.V. Goeddel, ed.) (1990) o M. Krieger, Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York, NY, (1990).
Vectores de expresión útiles en esta invención dependen de su uso pretendido. Por supuesto, tales vectores de expresión deben contener señales de expresión y replicación compatibles con la célula huésped. Vectores de expresión útiles para expresar la proteína de esta invención incluyen vectores virales tales como virus alfa, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados, vectores plasmídicos, cósmidos, liposomas y similares. Se prefieren vectores virales y plasmídicos para transfectar células de mamífero. El vector de expresión pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), en el que la secuencia de control de la expresión comprende el promotor de CMV, proporciona buenos grados de transfección y expresión. Los vectores virales adenoasociados son útiles en los métodos de terapia génica de esta invención.
El constructo también puede contener un rótulo para simplificar el aislamiento de la proteína. Por ejemplo, un rótulo de polihistidina de, por ej., seis residuos de histidina, puede incorporarse en el extremo aminoterminal de la proteína. El rótulo de polihistidina permite el aislamiento conveniente de la proteína en una sola etapa mediante cromatografía con quelato de níquel.
En otra realización, genes endógenos se transcriben conectándolos operativamente a secuencias de control de la expresión suministradas endógenamente que se recombinan con DNA genómico. En un método, se provee a la célula de un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia de elección como diana, que permite la recombinación homóloga en el genoma aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen diana; las secuencias de control de la expresión; un exón del gen diana y un sitio donante de corte y empalme desapareado que se aparea con un aceptor de corte y empalme en el gen diana. Tales métodos se analizan en Treco et al., WO 94/12650; Treco et al., WO 95/31560 y Treco et al., WO 96/29411.
La invención también proporciona células recombinantes que comprenden un vector de expresión para la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de esta invención. Las células huésped pueden seleccionarse con respecto a altos niveles de expresión para purificar la proteína. Se prefieren células de mamífero para este propósito, pero también son útiles células procarióticas, tales como E. coli. La célula puede ser, por ej., una célula recombinante en cultivo o una célula in vivo.
IV. Sondas y cebadores polinucleotídicos
Esta invención proporciona sondas y cebadores polinucleotídicos que se hibridan específicamente a una subsecuencia de cDNA de Repro-PC-1.0 o su complemento bajo condiciones de hibridación restrictivas pero no son la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5. Las sondas y los cebadores de esta invención son polinucleótidos de al menos 15 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos o al menos 25 nucleótidos. En una realización, la secuencia polinucleotídica es una secuencia contigua del Nº ID SEC:1 o su complemento. Cualquier región adecuada del gen de Repro-PC-1.0 puede elegirse como una diana para la hibridación de polinucleótidos. Sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos pueden incorporarse en los polinucleótidos con tal de que se retenga la capacidad característica para hibridarse específicamente a la secuencia diana o su complemento. La variación en la secuencia de nucleótidos puede resultar de polimorfismos de secuencia de diversos alelos, errores de secuenciación menores y similares.
Las sondas y los cebadores de la invención son útiles como sodas en ensayos de hibridación, tales como transferencias Southern y Northern, para identificar polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de Repro-PC-1.0, y como cebadores para procedimientos de amplificación. Las sondas y los cebadores de la invención también son útiles para detectar la presencia, la ausencia o la cantidad de Repro-PC-1.0 en biopsias tisulares y secciones histológicas en las que el método de detección se lleva a cabo in situ, típicamente después de la amplificación de secuencias de Repro-PC-1.0 usando un grupo de cebadores.
Las sondas y los cebadores de esta invención son útiles para identificar formas alélicas de Repro-PC-1.0 y genes cognados animales. Las sondas y los cebadores pueden usarse para rastrear bibliotecas de DNA genómico o cDNA de seres humanos o animales bajo, por ej., condiciones restrictivas. Las moléculas de DNA que se hibridan específicamente a la sonda se examinan a continuación adicionalmente para determinar si son variantes alélicas o cognados animales de Repro-PC-1.0.
Las sondas también son útiles en series oligonucleotídicas. Tales series se usan en ensayos de hibridación para comprobar la identidad de bases en un polinucleótido diana. En esencia, cuando una diana se hibrida perfectamente a una sonda en la serie, la diana contiene la secuencia de nucleótidos de la sonda. Cuando la diana se hibrida peor, o no se hibrida en absoluto, entonces la diana y la sonda difieren en la secuencia en uno o más nucleótidos. Mediante la selección apropiada de sondas, pueden comprobarse bases en una molécula diana. Véase, por ej., Chee et al., WO 95/11995. El uso de la secuencia de Repro-PC-1.0 en la genómica se describe más adelante.
En una realización, el polinucleótido comprende además una etiqueta. Se usa subsiguientemente un resto detectable unido bien a un cebador oligonucleotídico o bien a una sonda para detectar la hibridación de un cebador oligonucleotídico al componente de RNA. La detección de material etiquetado unido a un polinucleótido de Repro-PC-1.0 en una muestra proporciona un medio para determinar un valor diagnóstico o de pronóstico.
Aunque los cebadores y las sondas pueden diferir en secuencia y longitud, el principal factor diferenciador es uno de función: los cebadores sirven como un punto de iniciación de la síntesis de DNA de un polinucleótido diana, como en reacciones de RT y PCR, mientras que las sondas se usan típicamente para la hibridación a y la detección de un polinucleótido diana. Longitudes típicas de los cebadores y las sondas pueden variar de 7-50 nucleótidos, preferiblemente de 10-40 nucleótidos y lo más preferiblemente de 15-35 nucleótidos. Un cebador o una sonda también puede etiquetarse con un resto detectable para la detección de la hibridación del cebador o la sonda al polinucleótido diana.
En general, los expertos en la especialidad saben que los polinucleótidos usados en la invención incluyen moléculas tanto de DNA como de RNA y modificaciones presentes en la naturaleza de las mismas, así como análogos sintéticos no presentes en la naturaleza de los mismos, y heteropolímeros, de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o análogos de cualquiera. La composición particular de un polinucleótido o análogo de polinucleótido dependerá del propósito para el que se use el material y el ambiente en el que esté situado el material. Se han diseñado nucleótidos sintéticos no presentes en la naturaleza para servir a una variedad de propósitos y para permanecer estables en una variedad de ambientes, tales como aquellos en los que están presentes las nucleasas.
Los oligonucleótidos se sintetizan preferiblemente, por ej., en un Applied BioSystems u otro sintetizador de oligonucleótidos disponible comercialmente de acuerdo con las especificaciones proporcionadas por el fabricante. Los oligonucleótidos pueden prepararse usando cualquier método adecuado, tal como los métodos del fosfotriéster y el fosfodiéster, o realizaciones automatizadas de los mismos. En una de tales realizaciones automatizadas, se usan dietilfosforamidatos como materiales de partida y pueden sintetizarse como se describe por Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22: 1859 (1981), y la Patente de EE. UU. Nº 4.458.066.
Los polinucleótidos, por ej., las sondas, también pueden producirse recombinantemente a través del uso de plásmidos u otros vectores.
V. Métodos para detectar polinucleótidos de Repro-PC-1.0
Las sondas y los cebadores de esta invención son útiles, entre otras cosas, para detectar polinucleótidos de Repro-PC-1.0 en una muestra. Un método para detectar la presencia, la ausencia o la cantidad de un polinucleótido de Repro-PC-1.0 en una muestra implica dos etapas: (1) hibridar específicamente una sonda o cebador polinucleotídico a un polinucleótido de Repro-PC-1.0, y (2) detectar la hibridación específica.
Para la primera etapa del método, el polinucleótido usado para la hibridación específica se elige para hibridarse a cualquier región adecuada de Repro-PC-1.0.
Sin embargo, la sonda o el cebador no se hibrida a la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5. El polinucleótido puede ser una molécula de DNA o RNA, así como un análogo sintético no presente en la naturaleza del mismo. Los polinucleótidos en esta etapa son cebadores polinucleotídicos y sondas polinucleotídicas descritos en la presente memoria.
Para la segunda etapa de la reacción, puede usarse cualquier método adecuado para detectar la hibridación específica de un polinucleótido a Repro-PC-1.0. Tales métodos incluyen, por ej., amplificación mediante extensión de un cebador hibridado usando transcriptasa inversa (RT); extensión de un cebador hibridado usando RT-PCR u otros métodos de amplificación; y en la detección in situ de un cebador hibridado. En la hibridación in situ, una muestra de tejido o células se fija sobre un portaobjetos de vidrio y se permeabiliza suficientemente para el uso con técnicas de hibridación in situ. Restos detectables usados en estos métodos incluyen, por ej., sondas polinucleotídicas etiquetadas; la incorporación directa de una etiqueta en reacciones de amplificación o RT, y cebadores polinucleotídicos
etiquetados.
A menudo, los extractos celulares o las muestras tisulares usados en los métodos para determinar la cantidad de un polinucleótido en una muestra contendrán cantidades variables de células o materiales extraños de la matriz extracelular. Así, un método para determinar el número de células en una muestra es importante para determinar la cantidad relativa por célula de un polinucleótido de prueba tal como Repro-PC-1.0. Un control para el número de células y la eficacia de amplificación es útil para determinar valores diagnósticos para una muestra de un cáncer potencial, y un control es particularmente útil para comparar la cantidad de polinucleótido de prueba, tal como Repro-PC-1.0, en una muestra con un valor de pronóstico para el cáncer de próstata. Una realización preferida del RNA de control es rRNA de 28S expresado endógenamente. (Véase, por ej., Khan et al., Neurosci. Lett. 147: 114-117 (1992) que usaba rRNA de 28S como un control, diluyendo rRNA de 28S transcrito inversamente y añadiéndolo a la reacción de amplificación).
VI. Polinucleótidos inhibidores para inhibir la expresión de Repro-PC-1.0 A. General
Se describen en la presente memoria polinucleótidos inhibidores dirigidos contra polinucleótidos de Repro-PC-1.0 que inhiben la expresión de Repro-pc-1.0 y, por lo tanto, inhiben su actividad en una célula. Los polinucleótidos inhibidores pueden inhibir la actividad de Repro-PC-1.0 de un número de modos. De acuerdo con un mecanismo, el polinucleótido evita la transcripción del gen de Repro-PC-1.0 (por ejemplo, mediante la formación de una triple hélice). En otro mecanismo, el polinucleótido desestabiliza el Repro-PC-1.0 y reduce su semivida. En otro mecanismo, el polinucleótido inhibe el ensamblaje del componente de RNA en el Repro-PC-1.0 mediante unión a Repro-PC-1.0.
Un polinucleótido inhibidor es un polinucleótido que es capaz de hibridarse específicamente con un polinucleótido diana y que interfiere con la transcripción, el procesamiento, la traducción u otra actividad del polinucleótido diana. Los polinucleótidos inhibidores son generalmente de una sola hebra y tienen una secuencia de al menos 7, 8, 9, 10 u 11 nucleótidos capaces de hibridarse específicamente a la secuencia diana. Las secuencias de RNA requieren generalmente una secuencia de al menos 10 nucleótidos para la hibridación específica. Polinucleótidos inhibidores incluyen, sin limitación, moléculas antisentido, ribozimas, moléculas de sentido y moléculas que forman tríplex. En una realización, el polinucleótido inhibidor tiene una longitud de no más de aproximadamente 50 nucleótidos.
Aunque sin querer limitarse por una teoría, se cree que los polinucleótidos inhibidores inhiben la función de una diana, en parte, uniéndose a la secuencia diana apropiada. Un polinucleótido inhibidor puede inhibir la replicación de DNA o la transcripción de DNA, por ejemplo, interfiriendo con la ligazón de DNA o RNA polimerasa al promotor uniéndose a un sitio de iniciación de la transcripción o una plantilla. Puede interferir con el procesamiento de mRNA, la adición de poli(A) a mRNA o la traducción de mRNA, por ejemplo, uniéndose a regiones del transcrito de RNA tales como el sitio de unión al ribosoma. Puede promover mecanismos inhibidores de las células, tales como promover la degradación de RNA a través de la acción de RNasa. El polinucleótido inhibidor puede unirse a la ranura principal del DNA dúplex para formar una estructura de triple hélice o "tríplex". Métodos de inhibición que usan polinucleótidos inhibidores abarcan por lo tanto un número de diferentes sistemas para alterar la expresión de genes específicos que operan mediante diferentes mecanismos. Estos tipos diferentes de tecnología de polinucleótidos inhibidores se describen en C. Helene y J. Toulme, (1990) Biochim. Biophys. Acta., 1049:99-125.
Polinucleótidos antisentido pueden incluir desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Pueden modificarse químicamente a fin de mejorar la estabilidad en el cuerpo. Las propiedades del polinucleótido pueden manipularse para impartir estabilidad (por ej., resistencia a nucleasas), una unión más estrecha o la Tm deseada. Véase, por ej., la publicación de patente internacional Nº 94/12633.
El sistema general para construir diversos polinucleótidos útiles en la terapia con polinucleótidos inhibidores ha sido revisado por A.R. Vander Krol et al. (1988), Biotechniques 6:958-976, y por C. A. Stein et al., (1988) Cancer Res. (1988) 48:2659-2668. Véanse además Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expresión, Cohen, J.S., editor, MacMillan Press, London, páginas 79-196 (1989), y Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos inhibidores comprenden un sustituyente derivado que sustancialmente no es interferente con respecto a la hibridación del polinucleótido inhibidor al polinucleótido diana.
B. Antisentido
Se describen en la presente memoria polinucleótidos antisentido capaces de hibridarse específicamente a una secuencia diana de Repro-PC-1.0. Los polinucleótidos antisentido son útiles in vitro o in vivo para inhibir la actividad de Repro-PC-1.0.
Los polinucleótidos antisentido comprenden una secuencia antisentido de al menos 7 nucleótidos que se hibrida específicamente a una secuencia procedente de Repro-PC-1.0 y, más particularmente, Repro-PC-1.0 de mamífero y Repro-PC-1.0 de ser humano.
La secuencia antisentido puede estar entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos. En otras realizaciones, los polinucleótidos antisentido son polinucleótidos de menos de aproximadamente 100 nucleótidos o menos de aproximadamente 200 nucleótidos. De acuerdo con esto, una secuencia del polinucleótido antisentido puede hibridarse específicamente a la totalidad o parte del Repro-PC-1.0, tal como polinucleótidos antisentido para el gen de Repro-PC-1.0 o su RNA transcrito. En una realización, la secuencia del polinucleótido contiene dentro de ella la secuencia antisentido. En este caso, la secuencia antisentido está contenida dentro de un polinucleótido de secuencia más larga. En otra realización, la secuencia del polinucleótido consiste esencialmente en, o es, la secuencia antisentido. Así, por ejemplo, el polinucleótido antisentido puede ser un polinucleótido de menos de aproximadamente 50 nucleótidos en una secuencia que se hibrida específicamente a la secuencia diana.
Generalmente, para asegurar la hibridación específica, la secuencia antisentido es sustancialmente complementaria a la secuencia diana en Repro-PC-1.0. En ciertas realizaciones, la secuencia antisentido es exactamente complementaria a la secuencia diana. Los polinucleótidos antisentido pueden incluir sustituciones, adiciones, deleciones o transposiciones de nucleótidos, con tal de que la unión específica a la secuencia diana pertinente correspondiente a mRNA de Repro-PC-1.0 o su gen se retenga como una propiedad funcional del polinucleótido.
El polinucleótido antisentido debe ser suficientemente largo para formar un dúplex estable pero suficientemente corto, dependiendo del modo de aporte, para administrarse in vivo, si se desea. La longitud mínima de un polinucleótido requerido para la hibridación específica a una secuencia diana depende de varios factores, tales como el contenido de G/C, el posicionamiento de las bases no coincidentes (si las hay), el grado de univocidad de la secuencia en comparación con la población de polinucleótidos diana, y la naturaleza química del polinucleótido (por ej., cadena principal de metilfosfonato, poliamida-ácido nucleico, fosforotioato, etc.), entre otros.
Para métodos generales relativos a polinucleótidos antisentido, véase Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Para una revisión de la terapia antisentido, véase, por ej., Uhlmann et al., Chem. Reviews, 90:543-584 (1990).
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C. Ribozimas
La segmentación de Repro-PC-1.0 puede inducirse mediante el uso de ribozimas o RNA catalítico. En este sistema, la ribozima debe contener bien RNA presente en la naturaleza (ribozimas) o bien ácidos nucleicos sintéticos con actividad catalítica. Bratty et al., (1992) Biochim. Biophys. Acta., 1216:345-59 (1993) y Denhardt, (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci., 660:70-76 describen métodos para elaborar ribozimas.
A diferencia de los polinucleótidos antisentido y otros descritos anteriormente, que se unen a un RNA o un DNA, una ribozima no solo se une a sino que también disocia específicamente y de ese modo inactiva potencialmente un RNA diana. Tal ribozima puede comprender secuencias terminales 5' y 3' complementarias al RNA de Repro-PC-1.0.
Sitios diana óptimos para la inhibición mediada por ribozimas de la actividad pueden determinarse como se describe por Sullivan et al., publicación de patente PCT Nº 94/02595 y Draper et al., publicación de patente PCT Nº 93/23569. Según se describe por Hu et al., publicación de patente PCT Nº 94/03596, las funciones antisentido y de ribozima pueden combinarse en un solo polinucleótido. Al revisar la secuencia de RNA de Repro-PC-1.0, los expertos en la especialidad apreciarán que varios sitios diana de ribozima útiles están presentes y son susceptibles de segmentación por, por ejemplo, una ribozima con motivo de cabeza de martillo.
Tales ribozimas manipuladas pueden expresarse en células o pueden transferirse mediante una variedad de medios (por ej., liposomas, inmunoliposomas, biolística, captación directa en células, etc.). Otras formas de ribozimas (ribozimas intrónicas del grupo I (Cech (1995) Biotechnology 13; 323); ribozimas de cabeza de martillo (Edgington (1992) Biotechnology 10: 256) pueden manipularse sobre la base de la información de secuencia de Repro-PC-1.0 descrita, para catalizar la segmentación de RNA de Repro-PC-1.0. Por otra parte, las ribozimas pueden comprender uno o más nucleótidos modificados o conexiones modificadas entre nucleótidos, según se describe anteriormente.
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D. Otros Polinucleótidos Inhibidores
Además de los polinucleótidos inhibidores antisentido y de ribozima, pueden construirse polinucleótidos que se unirán a ácido nucleico dúplex bien en el componente de RNA plegado o bien en el gen para el componente de RNA, formando un ácido nucleico que contiene una triple hélice o tríplex para inhibir la actividad de Repro-PC-1.0. Tales polinucleótidos de la invención se construyen usando las reglas de apareamiento de bases de la formación de la triple hélice y la secuencia de nucleótidos del componente de RNA (Cheng et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15110; Ferrin y Camerini-Otero (1991) Science 354: 1494; Ramdas et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17395; Strobel et al. (1991) Science 254: 1639; Hsieh et al. (1990) op.cit.; Rigas et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 9591. Tales polinucleótidos pueden bloquear la actividad de Repro-PC-1.0 de un número de modos, incluyendo evitando la transcripción del gen de Repro-PC-1.0.
Típicamente, y dependiendo del modo de acción, los polinucleótidos que forman tríplex de la invención comprenden una secuencia suficientemente larga para formar una triple hélice estable pero suficientemente pequeña, dependiendo del modo de aporte, para administrar in vivo.
E. Métodos para Elaborar Polinucleótidos Inhibidores
Los polinucleótidos inhibidores pueden elaborarse químicamente o recombinantemente.
1. Síntesis química
Polinucleótidos inhibidores pequeños para el aporte directo pueden elaborarse mediante síntesis química. Los polinucleótidos químicamente sintetizados pueden ser DNA o RNA, o pueden incluir análogos nucleotídicos o cadenas principales que no se limitan a conexiones fosfodiéster.
2. Producción recombinante
Para el aporte dentro de células o para métodos de terapia génica, es particularmente útil la producción recombinante de polinucleótidos inhibidores a través del uso de vectores de expresión. De acuerdo con esto, esta invención también proporciona vectores de expresión, por ej., moléculas de polinucleótido recombinante que comprenden secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el polinucleótido inhibidor.
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VII. Polipéptidos de Repro-PC-1.0
Esta invención también proporciona polipéptido de Repro-PC-1.0 recombinante purificado y polipéptido de Repro-PC-1.0 que comprende una secuencia de al menos 100 aminoácidos consecutivos procedente de la secuencia de aminoácidos de Repro-PC-1.0 y tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el Nº ID SEC:2. El polipéptido de Repro-PC-1.0 recombinante incluye el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se presenta en el Nº ID SEC:2, así como polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos es al menos 95% idéntica al Nº ID SEC:2. Análogos de Repro-PC-1.0 incluyen análogos de Repro-PC-1.0 activos, análogos inactivos y análogos de Repro-PC-1.0 inmunogénicos.
Polipéptido de Repro-PC-1.0 se refiere a Repro-PC-1.0 natural, el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia de aminoácidos de Nº ID SEC:2, y a polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos es al menos 95% idéntica al Nº ID SEC:2. Moléculas polinucleotídicas que codifican variantes alélicas de Repro-PC-1.0 pueden aislare de DNA o DNA genómico de células de cáncer de próstata y típicamente se hibridan bajo condiciones restrictivas a la secuencia de nucleótidos que codifica Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:1). Pueden obtenerse mediante amplificación usando, por ej., cebadores de PCR tomados de la secuencia de Repro-PC-1.0 descrita en la presente memoria.
Los polipéptidos de Repro-PC-1.0 son útiles como inmunógenos para provocar la producción de anticuerpos anti-Repro-PC-1.0, como moléculas de captura por afinidad para aislar tales anticuerpos de una mezcla, como controles en métodos diagnósticos destinados a detectar Repro-PC-1.0 en una muestra.
Un análogo de Repro-PC-1.0 es un polipéptido cuya secuencia no está presente en la naturaleza pero es sustancialmente idéntica a lo largo de su secuencia a una secuencia de Repro-PC-1.0 natural. Análogos de Repro-PC-1.0 incluyen análogos de Repro-PC-1.0 activos, análogos de Repro-PC-1.0 inactivos y análogos de Repro-PC-1.0 inmunogénicos. Análogos de Repro-PC-1.0 incluyen proteínas de fusión, es decir, polipéptidos que tienen un resto Repro-PC-1.0/análogo de Repro-PC-1.0 fusionado con otro resto polipeptídico como su extremo amino- o carboxi-terminal.
Los análogos de Repro-PC-1.0 activos tienen la actividad biológica de Repro-PC-1.0. Se cree que Repro-PC-1.0 funciona en las rutas de exocitosis y endocitosis. Generalmente, los análogos de Repro-PC-1.0 activos tienen al menos 95% de identidad de secuencia con Repro-PC-1.0 natural. Los análogos de Repro-PC-1.0 activos pueden producirse, por ejemplo, introduciendo sustituciones de aminoácidos conservativas en la secuencia de Repro-PC-1.0 natural. Los más propensos a ser tolerados son los cambios en la secuencia de aminoácidos fuera de las secuencias de repetición directa o fuera de los aminoácidos 40-140. Los aminoácidos alrededor de 1-15, 268-275 y 397-425 probablemente son altamente mutables. Los aminoácidos en la región de transmembrana, por ej., los aminoácidos 15-37 (Nº ID SEC:2), no deben sustituirse con aminoácidos hidrófilos. Fragmentos activos de Repro-PC-1.0 pueden identificarse empíricamente truncando la proteína bien desde el extremo amino o bien desde el extremo carboxi para generar fragmentos, y probando los fragmentos resultantes con respecto a la actividad de Repro-PC-1.0. Más específicamente, se espera que las siguientes sustituciones en Repro-PC-1.0 den análogos que tengan actividad de Repro-PC-1.0: N79S (es decir sustituir N en la posición 79 por S); V87L; S133A; E268D y V421M). Estas sustituciones se producen en áreas que no son parte de los siguientes motivos principales que comparten identidad con sinaptotagmina IV de rata: sitios de fosforilación de PKA, sitios de fosforilación de CK2, sitios de fosforilación de PKC, sitios de N-miristoilación, dominio C2 de PKC y el dominio de transmembrana.
Polipéptidos de análogos de Repro-PC-1.0 inactivos de al menos 5 aminoácidos de Repro-PC-1.0 natural se describen en la presente memoria. Análogos de Repro-PC-1.0 inactivos incluyen, por ejemplo, polipéptidos que codifican fragmentos de Repro-PC-1.0. Fragmentos útiles de Repro-PC-1.0 incluyen polipéptidos que comprenden la secuencia de una o ambas de las repeticiones directas de 116 aminoácidos de Repro-PC-1.0. Otro fragmento útil de Repro-PC-1.0 es uno que carece de las regiones de transmembrana y, por lo tanto, no se ancla a la membrana celular. Estos análogos inactivos son útiles como mímicos o señuelos de polipéptidos inhibidores. Cuando se expresan en una célula, compiten con polipéptidos de Repro-PC-1.0 con respecto a la interacción con moléculas que interactúan naturalmente con Repro-PC-1.0. En algunas realizaciones, los polipéptidos de Repro-PC-1.0 comprenden al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de Repro-PC-1.0.
Análogos de Repro-PC-1.0 inmunogénicos son polipéptidos que tienen una secuencia de al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de Repro-PC-1.0 natural y que, cuando se presentan a un animal como un inmunógeno, provocan una respuesta humoral o mediada por células. Esto incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es un epítopo procedente de Repro-PC-1.0, tales como fragmentos inmunogénicos de Repro-PC-1.0. Los análogos proteínicos de Repro-PC-1.0 están opcionalmente en forma aislada.
Repro-PC-1.0 y análogos se producen lo más fácilmente recombinantemente, según se describe en la presente memoria. Repro-PC-1.0 recombinante puede purificarse mediante purificación por afinidad. En un método, análogos de Repro-PC-1.0 recombinantes comprenden un rótulo de polihistidina. La proteína se purifica sobre una matriz de afinidad de quelato de níquel. En otro método, Repro-PC-1.0 se purifica usando una matriz de afinidad que soporta anticuerpos anti-Repro PC-1.0.
VIII. Anticuerpos e hibridomas
En un aspecto, esta invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a polipéptidos de Repro-PC-1.0. Los anticuerpos tienen preferiblemente una afinidad de al menos 10^{6} M^{-1}, 10^{7} M^{-1}, 10^{8} M^{-1} o 10^{9} M^{-1}. Esta invención contempla composiciones de anticuerpos tanto policlonales como monoclonales.
En una realización, esta invención proporciona inmunotoxinas contra células que expresan Repro-PC-1.0. Las inmunotoxinas son anticuerpos y similares como los descritos en la presente memoria acoplados a un compuesto, por ej., una toxina, que es tóxico para una célula diana. Las toxinas pueden incluir, por ejemplo, isótopos radiactivos, ricina, cisplatino, moléculas antisentido, toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas o antígeno protector de Bacillus anthracis. Las inmunotoxinas se unen a células cancerosas que expresan Repro-PC-1.0 y las destruyen. Son útiles en los métodos terapéuticos de esta invención. Los anticuerpos de la invención tienen muchos usos. Por ejemplo, tales anticuerpos son útiles para detectar polipéptidos de Repro-PC-1.0 en inmunoensayos. Los anticuerpos también pueden usarse para rastrear bibliotecas de expresión para productos de expresión particulares tales como Repro-PC-1.0 de mamífero. Estos son útiles para detectar o diagnosticar estados patológicos relacionados con la presencia de los antígenos respectivos. Habitualmente, los anticuerpos en tal procedimiento se etiquetan con un resto que permite la detección fácil de la presencia de antígeno mediante unión a anticuerpo. Los anticuerpos producidos contra Repro-PC-1.0 también pueden usarse para generar anticuerpos antiidiotípicos.
A. Producción de Anticuerpos
Se usa un número de inmunógenos para producir anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de Repro-PC-1.0. Repro-PC-1.0 de longitud completa es un inmunógeno adecuado. Típicamente, el inmunógeno de interés es un péptido de al menos aproximadamente 3 aminoácidos, más típicamente el péptido tiene una longitud de 5 aminoácidos, preferiblemente el fragmento tiene una longitud de 10 aminoácidos y más preferiblemente el fragmento tiene una longitud de 15 aminoácidos o más. Los péptidos pueden acoplarse a una proteína portadora (por ej., como una proteína de fusión), o se expresan recombinantemente en un vector de inmunización. Los determinantes antigénicos sobre péptidos a los que se unen anticuerpos tienen típicamente una longitud de 3 a 10. Polipéptidos presentes en la naturaleza también se usan en forma bien pura o bien impura.
Los polipéptidos recombinantes se expresan en células eucarióticas y procarióticas y se purifican usando técnicas estándar. El polipéptido, o una versión sintética del mismo, se inyecta a continuación en un animal capaz de producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos bien monoclonales o bien policlonales para el uso subsiguiente en inmunoensayos para medir la presencia y la cantidad del polipéptido.
Métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la especialidad. En resumen, un inmunógeno, preferiblemente un polipéptido purificado, un polipéptido acoplado a un portador apropiado (por ej., GST, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, etc.), o un polipéptido incorporado en un vector de inmunización tal como un virus vacunal recombinante (véase la Patente de EE. UU. Nº 4.722.848), se mezcla con un adyuvante y los animales se inmunizan con la mezcla. La respuesta inmunitaria del animal a la preparación de inmunógeno se verifica tomando sangrados de prueba y determinando la valoración de la reactividad con el polipéptido de interés. Cuando se obtienen valoraciones apropiadamente altas de anticuerpo para el inmunógeno, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Cuando se desea, se realiza fraccionación adicional del antisuero para enriquecer con respecto a anticuerpos reactivos hacia el polipéptido. Véanse, por ej., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene. NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY.
Anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y versiones recombinantes monocatenarias de los mismos, contra fragmentos predeterminados de proteína de Repro-PC-1.0 son generados inmunizando a los animales, por ej., con conjugados de los fragmentos con proteínas portadoras según se describe anteriormente.
Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se rastrean con respecto a la unión a polipéptidos normales o modificados, o se rastrean con respecto a la actividad agonista o antagonista, por ej., actividad mediada a través de Repro-PC-1.0. En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos huéspedes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Descripciones de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se encuentran, por ej., en Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citad allí; Harlow y Lane, Supra; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497.
Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fágicos o similares. Véanse Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; y Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546.
Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se etiquetarán empalmándose, bien covalentemente o bien no covalentemente, a una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación y se presentan extensamente en la bibliografía tanto científica como de patentes. Además. pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes. Véase Cabilly, Patente de EE. UU. Nº 4.816.567; y Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033.
Los anticuerpos de esta invención también se usan para cromatografía de afinidad al aislar proteínas de Repro-PC-1.0. Las columnas se preparan, por ej., con los anticuerpos conectados a un soporte sólido, por ej. partículas, tales como agarosa, Sephadex o similares, donde un lisado celular se hace pasar a través de la columna, se lava y se trata con concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, con lo que se liberan polipéptidos de Repro-PC-1.0 purificados.
Un sistema alternativo es la generación de inmunoglobulinas humanizadas conectando las regiones CDR de anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas mediante técnicas de DNA recombinante. Véase Queen et al., patente de Estados Unidos 5.585.089.
Un sistema adicional para aislar secuencias de DNA que codifican un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento de unión del mismo es rastreando una biblioteca de DNA procedente de células B humanas de acuerdo con el protocolo general esbozado por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) y a continuación clonando y amplificando las secuencias que codifican el anticuerpo (o el fragmento de unión) de la especificidad deseada. El protocolo descrito por Huse se hace más eficaz en combinación con la tecnología de presentación en fagos. Véase, por ej., Dower et al., WO 91/17271 y McCafferty et al., WO 92/01047. La tecnología de presentación en fagos también puede usarse para mutagenizar regiones CDR de anticuerpos que previamente se mostraba que tenían afinidad para receptores de proteína de Repro-PC-1.0 o sus ligandos. Se seleccionan anticuerpos que tienen afinidad de unión mejorada.
En otra realización de la invención, se proporcionan fragmentos de anticuerpos contra proteína de Repro-PC-1.0. Típicamente, estos fragmentos exhiben unión específica al receptor de proteína de Repro-PC-1.0 similar a la de una inmunoglobulina completa. Los fragmentos de anticuerpo incluyen cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab', F(ab')_{2} and Fv. Los fragmentos se producen mediante técnicas de DNA recombinante, o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
IX. Métodos para detectar polipéptidos de Repro-PC-1.0
Los polipéptidos de Repro-PC-1.0 pueden identificarse mediante cualesquiera métodos conocidos en la especialidad. En una realización, los métodos implican detectar el polipéptido con un ligando que reconoce específicamente el polipéptido. Los anticuerpos de la invención son particularmente útiles para la detección específica de polipéptidos de Repro-PC-1.0. Se conoce en la especialidad una variedad de métodos de detección basados en anticuerpos. Estos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayos tipo sándwich (incluyendo ELISA), transferencia Western, aislamiento sobre anticuerpos unidos a una fase sólida y detección in situ con anticuerpos etiquetados. Otro método para detectar polipéptidos de Repro-PC-1.0 implica identificar el polipéptido de acuerdo con su masa a través de, por ejemplo, electroforesis en gel, espectrometría de masas o HPLC. Las muestras en cuestión pueden tomarse de cualquier número de fuentes apropiadas, tales como sangre, orina, biopsia tisular (por ej., tejido de nódulos linfáticos), etc.
X. Métodos diagnósticos, de verificación y pronóstico
Repro-PC-1.0 se ha encontrado en todo el tejido de adenocarcinoma de próstata probado. Además, es virtualmente indetectable en células distintas a las células de cáncer de próstata. Por lo tanto, Repro-PC-1.0 es un marcador tanto altamente selectivo como altamente específico para el cáncer de próstata. De acuerdo con esto, los métodos descritos en la presente memoria para detectar polinucleótidos de Repro-PC-1.0 o polipéptidos de Repro-PC-1.0 en una muestra son útiles en métodos para diagnosticar el cáncer de próstata, verificar su avance o tratamiento y determinar el pronóstico del paciente. Los métodos de la presente invención permiten detectar estados cancerosos con una confianza incrementada y en una fase temprana, antes de que las células se detecten como cancerosas basándose en las características patológicas. Por supuesto, se entiende por los expertos en diagnóstico que las pruebas diagnósticas se miden por su grado de especificidad y sensibilidad. Sin embargo, las pruebas que no son perfectamente específicas o sensibles son útiles en la diagnosis debido a que proporcionan información útil que, en combinación con otra evidencia, puede proporcionar una diagnosis definitiva o indicar el curso del tratamiento.
Métodos para la diagnosis implican determinar una cantidad diagnóstica de Repro-PC-1.0 (por ej., mRNA, cDNA o polipéptido) en una muestra de un paciente y comparar esa cantidad con un intervalo normal que se espera encontrar en la muestra. No se ha detectado mRNA o polipéptido de Repro-PC-1.0 en tejido prostático normal, y el intervalo normal no es superior que la detección de fondo. Por lo tanto, cualquier cantidad diagnóstica positiva detectada por encima del fondo es un signo positivo de cáncer de próstata. Las muestras usadas para determinar el intervalo normal de Repro-PC-1.0 pueden ser muestras normales procedentes del individuo que va a probarse o muestras normales procedentes de otros individuos que no sufren el estado de enfermedad.
En una realización, los métodos para diagnosticar el cáncer de próstata implican detectar Repro-PC-1.0 sobre la superficie de células de cáncer de próstata. Las células que expresan la proteína presentan la sección aminoterminal de Repro-PC-1.0 sobre sus superficies. Por lo tanto, los anticuerpos que reconocen el extremo amino de Repro-PC-1.0 son particularmente útiles para este propósito. Tales anticuerpos pueden elaborarse, por ejemplo, inmunizando a un animal con un fragmento de Repro-PC-1.0 que contiene los aminoácidos de 1 a aproximadamente 15 del Nº ID SEC:2. En este caso, las células de prueba se exponen a un anticuerpo etiquetado. La unión específica del anticuerpo a la célula indica que la célula expresa Repro-PC-1.0 y es una indicación positiva de que la célula es una célula de cáncer de próstata.
Las células de cáncer de próstata pueden metastasizarse incluso antes de que el cáncer sea detectable a través de histopatología. Las pruebas diagnósticas de esta invención permiten detectar células metastáticas en, por ejemplo, los nódulos linfáticos o la sangre, detectando Repro-PC-1.0.
Puede usarse una variedad de muestras de pacientes en los métodos de la invención. Por ejemplo, extractos celulares, células cultivadas o muestras de tejidos proporcionan muestras convenientes para el uso con los métodos de la invención. Los métodos de la invención pueden usar muestras bien en solución o bien extractos, por ejemplo, con RT-PCR, o muestras tales como secciones tisulares para métodos de detección in situ. También pueden obtenerse muestras de fuentes tales como células recogidas de fluidos y residuos corporales, por ej., orina, esputo y sangre; lavados, por ej., vejiga y pulmón; y biopsias con agujas finas, por ej., de próstata; materiales celulares; células enteras; extractos tisulares y celulares; RNA extraído de tejido y células; y secciones histológicas de tejido.
Métodos para verificar el curso del cáncer de próstata implican determinar la cantidad de Repro-PC-1.0 en una muestra en un primer y un segundo momento. Los momentos pueden ser durante exámenes físicos habituales o durante el transcurso del tratamiento para el cáncer de próstata. Cuando el cáncer de próstata aparece y/o avanza, se espera que la cantidad de Repro-PC-1.0 en una muestra se incremente. La regresión o la cura del cáncer de próstata están acompañadas por una disminución o eliminación de Repro-PC-1.0 en una muestra.
El estadio de un tumor es una indicación del pronóstico del paciente. Se ha encontrado que los tumores de cáncer de próstata, según se determina por tinción de Gleason, expresan niveles superiores de Repro-PC-1.0. Por lo tanto, comparando una cantidad medida de Repro-PC-1.0 en una muestra de un sujeto con cantidades de Repro-PC-1.0 asociadas con diversos estadios del tumor, puede proporcionarse una prognosis para el sujeto. Tal valor de pronóstico es útil para planificar el curso del tratamiento para el sujeto.
Los métodos diagnósticos y de pronóstico también pueden llevarse a cabo junto con otras pruebas diagnósticas o de pronóstico. En algunos casos, tales pruebas de combinación pueden proporcionar información relativa al avance de una enfermedad, aunque los presentes métodos para probar Repro-PC-1.0 proporcionan mucha información útil a este respecto.
Otro método diagnóstico de la invención implica la administración a un sujeto de una composición etiquetada que se une específicamente a células que tienen Repro-PC-1.0, tales como anticuerpos etiquetados. A continuación, la localización de la etiqueta se determina mediante cualquiera de los métodos radiológicos conocidos. Puede usarse cualquier método convencional para visualizar la obtención diagnóstica de imágenes. Habitualmente, se usan radioisótopos que emiten partículas gamma y positrones para obtención de imágenes con cámara y se usan isótopos paramagnéticos para MRI.
El gen de Repro-PC-1.0 está situado sobre el cromosoma 18. Una traslocación en este sitio puede dar como resultado una alteración de la actividad de Repro-PC-1.0, tal como una transcripción activada o una función cambiada. Las traslocaciones cromosómicas en la vecindad del gen de Repro-PC-1.0 pueden detectarse hibridando una sonda etiquetada de esta invención a una extensión cromosómica. Una traslocación, duplicación o deleción puede identificarse mediante patrones de hibridación aberrantes en comparación con los normales. Tales pruebas son útiles para detectar anormalidades genéticas tales como una disposición familiar al cáncer de próstata, o el comienzo temprano de la enfermedad. Un método para la hibridación in situ fluorescente de cromosomas se proporciona en los
Ejemplos.
La presente invención también proporciona estuches para realizar el método diagnóstico y de pronóstico de la invención. Tales estuches incluyen una sonda o cebador polinucleotídico o un anticuerpo específico para Repro-PC-1.0 e instrucciones para usar los reactivos para detectar Repro-PC-1.0 en una muestra de un paciente.
XI. Métodos para inhibir la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0 y para tratar el cáncer de próstata
Inhibir la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0 cambia un cáncer de próstata de metastático a no metastático. Inhibir la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0 es útil in vivo en el tratamiento terapéutico y profiláctico del cáncer de próstata u otros estados que implican expresión de Repro-PC-1.0. De acuerdo con esto, los productos de esta invención pueden usarse en métodos para inhibir la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0. Los métodos implican poner en contacto una célula de cáncer de próstata, in vitro o in vivo, con un polinucleótido inhibidor, una inmunotoxina u otro compuesto que inhiba la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0.
A. Aporte de Polinucleótidos Inhibidores
Se contempla una variedad de medios para aportar un polinucleótido inhibidor a un sujeto incluyendo, por ejemplo, captación directa de la molécula por una células desde una solución, captación facilitada a través de lipofección (por ej., liposomas o inmunoliposomas), transfección mediada por partículas y expresión intracelular a partir de un casete de expresión que tiene una secuencia de control de la expresión conectada operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica el polinucleótido inhibidor. Métodos útiles para el aporte de polinucleótidos con propósitos terapéuticos se describen en Inouye et al., Patente de EE. UU. 5.272.065.
B. Composiciones Farmacéuticas y Tratamiento
Los agentes, tales como polinucleótidos inhibidores, inmunotoxinas u otros compuestos que inhiben la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0, se aportan preferiblemente en composiciones farmacéuticas que comprenden el agente y un portador farmacéuticamente eficaz. El agente puede administrarse mediante cualquier ruta que le dé acceso a células que expresan Repro-PC-1.0, por ejemplo, células de tumor de próstata. Esto incluye, por ejemplo, soluciones acuosas para administración enteral, parenteral o transmucosal, por ej., para administración intravenosa, como tónicos, y administración a membranas mucosas y otras como, por ejemplo, gotas nasales u oculares; composiciones sólidas y otras no acuosas para aporte enteral o transdérmico, por ej., como píldoras, comprimidos, polvos o cápsulas; sistemas de aporte transdérmico o transmucosal para administración tópica, y aerosoles o nebulizaciones para el aporte mediante inhalación. Una ventaja del aporte por un modo que sea fácil de administrar, por ej., enteral o mediante inyección intravenosa o intramuscular, es que tañes modos imitan posibles modos de aporte cuando el agente se formula como un producto farmacéutico.
En un caso, la formulación farmacéutica está en la forma de una dosis unitaria que contiene una cantidad farmacológicamente eficaz del compuesto inhibidor de Repro-PC-1.0. La dosis unitaria, tomada como parte de un régimen terapéutico, da como resultado la inhibición del crecimiento de células de cáncer de próstata. Así, las composiciones farmacéuticas, cualquiera que sea su forma, se administran al sujeto en una cantidad farmacológicamente eficaz.
La cantidad de la formulación farmacéutica aportada, el modo de administración y el curso temporal del tratamiento están a discreción del médico asistente. Los tratamientos profilácticos están indicados para personas con un riesgo mayor que el promedio de contraer cáncer de próstata, por ejemplo, personas con niveles elevados de PSA, PAP (fosfatasa ácida prostática) o PSP (proteína específica de la próstata). Los tratamientos terapéuticos están indicados para personas diagnosticadas de cáncer de próstata.
XII. Terapia hormonal
Los presentes inventores han mostrado que los tumores de próstata desarrollados en machos se vuelven malignos, mientras que los desarrollados en hembras siguen siendo benignos. Aunque sin querer limitarse por una teoría, se cree que esta diferencia se debe al ambiente hormonal. Se cree que la regulación al alza de la expresión de Repro-PC-1.0 está directamente o indirectamente controlada por un elemento de respuesta hormonal que es sensible a andrógenos, tales como testosterona, pero no a estrógenos. Sin embargo, independientemente del papel exacto que represente la expresión de Repro-PC-1.0 en el cáncer de próstata, los experimentos presentados en la presente memoria muestran que alterar el ambiente hormonal cambia el carácter de las células prostáticas.
Por lo tanto, un método para tratar el cáncer de próstata implica inhibir el contacto entre la célula de cáncer de próstata y una hormona que active elementos de respuesta hormonal que regulan el estado maligno. En una realización, el cáncer de próstata se trata mediante una disminución de la cantidad de testosterona en el sistema del sujeto, o incrementando la cantidad de estrógeno. Métodos para alterar el perfil hormonal de los sujetos son bien conocidos en la especialidad. Por ejemplo, pueden administrarse estrógenos para incrementar su cantidad en la sangre, y se sabe que compuestos tales como flutamida, antagonistas de hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) y acetato de ciproterona disminuyen la cantidad de andrógenos en el sistema.
XIII. Vacunas polipeptídicas y polinucleotídicas contra Repro-PC-1.0
También se describen en la presente memoria vacunas contra células que expresan Repro-PC-1.0 y métodos para usarlas.
Se describen en la presente memoria métodos para provocar una respuesta inmunitaria humoral contra Repro-PC-1.0. El método implica inmunizar a un sujeto con una vacuna que comprende una cantidad inmunogénica de polipéptido de Repro-PC-1.0 o un análogo de Repro-PC-1.0 inmunogénico. Tales vacunas provocan anticuerpos contra Repro-PC-1.0.
También se describen en la presente memoria métodos para provocar una respuesta inmunitaria dependiente de MHC Clase II contra células que expresan Repro-PC-1.0. Las moléculas del MHC Clase II se unen a péptidos que tienen motivos de aminoácido particulares bien conocidas en la especialidad. La respuesta dependiente del MHC Clase II implica la captación de un antígeno por células que presentan antígeno (APC's), su procesamiento y la presentación sobre la superficie celular como parte de un complejo de MHC Clase II/péptido antigénico. Alternativamente, las moléculas del MHC Clase II sobre la superficie celular pueden unirse a péptidos que tienen el motivo
apropiado.
Las células que presentan antígeno interactúan con células auxiliares T positivas a CD4, activando de ese modo las células auxiliares T. Las células auxiliares T activadas estimulan linfocitos B para producir anticuerpos contra el antígeno. Los anticuerpos marcan células que tienen el antígeno sobre su superficie. Las células marcadas se someten a citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, en la que células NK o macrófagos, que tienen receptores de Fc, atacan a las células marcadas.
Métodos para provocan una respuesta inmunitaria dependiente del MHC Clase II implican administrar a un sujeto una vacuna que incluye una cantidad inmunogénica de polipéptido de Repro-PC-1.0 o un análogo de Repro-PC-1.0 inmunogénico que incluye un motivo de aminoácido reconocidos por moléculas del MHC Clase II del sujeto. Alternativamente, células que presentan antígeno pueden cultivarse con tales péptidos para permitir la unión, y las células pueden administrarse al sujeto. Preferiblemente, las células son singeneicas con el sujeto.
También se describen en la presente memoria métodos para provocar una respuesta inmunitaria mediada por células dependiente de MHC Clase II contra células que expresan Repro-PC-1.0 en un sujeto. Moléculas del MHC Clase I también se unen a péptidos que tienen motivos de aminoácido particulares bien conocidos en la especialidad. Las proteínas expresadas en una célula se digieren hasta péptidos, se asocian con moléculas del MHC Clase I y se presentan sobre la superficie celular. Allí, son reconocidas por linfocitos positivos a CD8, generando una respuesta de linfocitos T citotóxicos contra células que expresan los epítopos en asociación con moléculas del MHC Clase I. Debido a que las células de cáncer de próstata expresan Repro-PC-1.0, la generación de linfocitos T citotóxicos que atacan a tales células es útil en el tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer de próstata.
Un motivo de unión a HLA-A 1 incluye un primer residuo conservado de T, S o M, un segundo residuo conservado de D o E y un tercer residuo conservado de Y. Otros segundos residuos conservados son A, S o T. Los residuos conservados primero y segundo son adyacentes y preferiblemente están separados del tercer residuo conservado por de 6 a 7 residuos. Un segundo motivo consiste en un primer residuo conservado de E o D y un segundo residuo conservado de Y donde los residuos conservados primero y segundo están separados por de 5 a 6 residuos. El motivo de unión a HLA-A3.2 incluye un primer residuo conservado de L, M, I, V, S, A, T y F en la posición 2 y un segundo residuo conservado de K, R o Y en el extremo C-terminal. Otros primeros residuos conservados son C, G o D y alternativamente E. Otros segundos residuos conservados son H o F. Los residuos conservados primero y segundo están separados preferiblemente por de 6 a 7 residuos. El motivo de unión a HLA-A 11 incluye un primer residuo conservado de T o V en la posición 2 y un residuo conservado C-terminal de K. Los residuos conservados primero y segundo están separados preferiblemente por 6 ó 7 residuos. El motivo de unión a HLA-A24.1 incluye un primer residuo conservado de Y, F o W en la posición 2 y un residuo conservado C-terminal de F, I, W, M o L. Los residuos conservados primero y segundo están separados preferiblemente por de 6 a 7
residuos.
Un modo metódico de identificar péptidos que pueden activar una respuesta de células T citotóxicas es preparar un grupo de fragmentos solapados del polipéptido de aproximadamente 9 a 15 aminoácidos, y probarlos con respecto a la capacidad para estimular células T. Por ejemplo, el grupo podría incluir fragmentos que abarcan los aminoácidos 1-15, 2-16, 3-17, etc. Tales fragmentos pueden prepararse habitualmente mediante un sintetizador de péptidos y pueden probarse en lotes para disminuir la cantidad de experimentación necesaria. Por ejemplo, el grupo de 25 fragmentos solapados que incluye del fragmento 1-15 al fragmento 25-39 puede probarse en comparación con un grupo que incluye del fragmento 26-40 al 51-65. Si sólo un grupo muestra actividad, ese grupo puede dividirse en dos grupos más pequeños y probarse de nuevo, hasta que se identifiquen péptidos inmunogénicos individuales.
Otro método implica transfectar células ex vivo con tales vectores de expresión, y administrar las células al sujeto. Preferiblemente, las células son singeneicas para el sujeto.
Los métodos para provocar una respuesta inmunitaria contra Repro-PC-1.0 en un sujeto son útiles en métodos profilácticos para prevenir el cáncer de próstata cuando la vacuna se administra a un sujeto que ya no sufre cáncer de próstata.
Se describe en la presente memoria un método para activar linfocitos T citotóxicos contra células que expresan un Repro-PC-1.0, que comprende poner en contacto linfocitos T ex vivo con un péptido inmunogénico que comprende un epítopo lineal derivado del Repro-PC-1.0, el péptido capaz de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringida al MHC Clase I contra células que expresan el Repro-PC-1.0.
Se describe en la presente memoria un método para determinar si una célula expresa polipéptido de Repro-PC-1.0, que implica las etapas de poner en contacto la célula con un linfocito T citotóxico activado contra células que expresan un Repro-PC-1.0 y determinar si el linfocito T citotóxico ataca a la célula.
Se describe en la presente memoria un péptido inmunogénico que comprende un epítopo lineal derivado del Repro-PC-1.0, el péptido capaz de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringida al MHC Clase I contra células que expresan Repro-PC-1.0. En ciertos casos, el péptido inmunogénico tiene entre 8 y 12 aminoácidos y el epítopo lineal tiene un motivo de unión a moléculas del MHC Clase I. En otro caso, el péptido inmunogénico comprende además un epítopo de células auxiliares T.
El siguiente diagrama proporciona porciones de la secuencia de aminoácidos de Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2). Se indican los números de aminoácidos. Las barras entre corchetes sobre la secuencia de aminoácidos indican motivos de unión a MHC Clase I o MHC Clase II. Se indican los números de aminoácidos. Péptidos de aproximadamente 8-15 aminoácidos de longitud que incluyen estos motivos, incluyendo péptidos cuya secuencia de aminoácidos total se selecciona de la secuencia de Repro-PC-1.0, se unen a moléculas del MHC y pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células o humoral contra Repro-PC-1.0.
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Se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra Repro-PC-1.0 (por ej., una vacuna) y comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad inmunogénica de un compuesto seleccionado de Repro-PC-1.0, un fragmento de Repro-PC-1.0, un péptido inmunogénico que comprende un epítopo lineal derivado de Repro-PC-1.0, el péptido capaz de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringida al MHC Clase I o una respuesta inmunitaria restringida al MHC Clase II contra células que expresan Repro-PC-1.0.
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V. Animales no humanos transgénicos
También se describen en la presente memoria mamíferos no humanos transgénicos para Repro-PC-1.0. Según se usa en la presente memoria, "animal transgénico para Repro-PC-1.0" se refiere a un animal, en particular un mamífero, cuyas células germinales (es decir, oocitos o esperma) al menos, comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica Repro-PC-1.0. Tales animales son útiles, por ejemplo, como modelos en el estudio del cáncer de próstata.
En un caso, las secuencias de control de la expresión no se encuentran naturalmente operativamente conectadas a Repro-PC-1.0. En un caso, el ácido nucleico recombinante comprende una secuencia codificante de Repro-PC-1.0 no natural, es decir, una secuencia de Repro-PC-1.0 que la especie no produce en la naturaleza. En un caso, el Repro-PC-1.0 es un Repro-PC-1.0 humano. En otro caso, las secuencias de control de la expresión son secuencias de control de la expresión no naturales introducidas en las células germinales a fin de que se recombinen con el gen presente en la naturaleza y controlen su expresión. Mamíferos transgénicos particularmente útiles incluyen conejos y roedores tales como ratones.
Los animales transgénicos se producen, por ejemplo, introduciendo la molécula de ácido nucleico recombinante en un huevo fertilizado o una célula pluripotencial embrionaria (ES), típicamente mediante microinyección, electroporación, lipofección o transferencia génica mediada por partículas. Los animales transgénicos expresan la secuencia de nucleótidos heteróloga en tejidos dependiendo de si el promotor es inducible por una señal para la célula o es constitutivo. Los animales transgénicos pueden cruzarse con animales no transgénicos para producir animales transgénicos con características mixtas.
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XV. Métodos para rastrear compuestos que regulan la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0
Los compuestos que regulan la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0 son candidatos como agentes terapéuticos en el tratamiento del cáncer de próstata. Esta invención proporciona métodos para determinar si un compuesto regula (por ej., activa o inhibe) la expresión o la actividad de Repro-PC-1.0.
Métodos para determinar si un compuesto regula la expresión de Repro-PC-1.0 implican administrar el compuesto a una célula o un animal de prueba que tiene un gen de Repro-PC-1.0 expresable, y determinar si se altera la expresión de Repro-PC-1.0. En una realización, los métodos implican administrar el compuesto a un cultivo que comprende la célula o a un animal de prueba que tiene células que expresan Repro-PC-1.0, medir la cantidad del polinucleótido o los polipéptidos de Repro-PC-1.0 en una muestra procedente del cultivo o el animal, y determinar si la cantidad medida es diferente de la cantidad en una muestra procedente del cultivo o el animal bajo condiciones de control (por ej., a los que no se ha administrado compuesto). Las diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre la cantidad medida a partir de la muestra de prueba y a partir de la muestra de control se registran e indican que el compuesto altera la cantidad de Repro-pc-1.0 producida por la célula.
Métodos para determinar si un compuesto regula la actividad biológica de Repro-PC-1.0 implican poner en contacto una célula que expresa Repro-PC-1.0 con el compuesto y determinar si se altera la actividad de Repro-PC-1.0. Repro-PC-1.0 tiene un nivel significativo de identidad de secuencia de aminoácidos con las sinaptotagminas; por lo tanto, se cree que Repro-PC-1.0 funciona en las reacciones de fusión de membranas y gemación de membranas en la exocitosis. La exocitosis es el proceso por el cual una vesícula intracelular se fusiona con el plasmalema. Como resultado, el contenido de la vesícula se libera en el medio extracelular (secreción) y los componentes de la membrana vesicular pasan a formar parte del plasmalema. Algunas vesículas se fusionan con el plasmalema constitutivamente, mientras que otras se acumulan bajo el plasmalema y se fusionan solo después de un estímulo apropiado. La exocitosis constitutiva es usada por las células para la secreción de proteínas no regulada y para la inserción en el plasmalema de componentes proteínicos recientemente sintetizados. La exocitosis regulada es característica de gránulos secretores derivados del complejo de Golgi, que almacenan productos secretores concentrados, y de vesículas especializadas tales como vesículas sinápticas, que almacenan neurotransmisores.
Los ensayos de actividad incluyen detectar cambios en los niveles de las secreciones al medio o cambios en la capacitancia de la membrana después de la introducción de inhibidores potenciales de Repro-PC-1.0 tales como nucleótidos antisentido, anticuerpos anti-Repro-PC-1.0., fragmentos peptídicos de Repro-PC-1.0 u otras moléculas en bibliotecas combinatorias. Se usan métodos inmunológicos para detectar cambios en los niveles de moléculas liberadas, tales como, pero no limitadas a, PSA, PAP, PSP, al medio, con, por ej., estuches de ensayo disponibles comercialmente (J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 37:849 (1990)). La liberación de neurotransmisor o ATP puede detectarse mediante HPLC o mediante ensayos de luciferina-luciferasa, respectivamente (Science, 256:1820 (1992)). Alternativamente, las células pueden radioetiquetarse y la liberación del contenido de los gránulos secretores podría medirse mediante escintigrafía (Cell, 70:765 (1992)). La exocitosis incrementada también puede detectarse verificando incrementos en la capacitancia de la membrana. En este caso, la corriente de transmembrana se mide usando métodos convencionales de pinzamiento zonal ("patch-clamp") en células enteras (Neuron, 10:21 (1993); Nature, 364:540 (1993)).
El compuesto que ha de probarse puede seleccionarse de un número de fuentes. Por ejemplo, bibliotecas combinatorias de moléculas están disponibles para experimentos de rastreo. Usando tales bibliotecas, pueden rastrearse miles de moléculas con respecto a la actividad reguladora. En una realización preferida, métodos de rastreo de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos "candidatos"). Tales "bibliotecas químicas combinatorias" se rastrean a continuación en uno o más ensayos, según se describe en la presente memoria, para identifican aquellos miembros de la biblioteca (especies químicas particulares o subclases) que presentan una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos de partida" o pueden usarse por sí mismos como agentes terapéuticos potenciales o
reales.
La preparación y el rastreo de bibliotecas químicas combinatorias son bien conocidos para los expertos en la especialidad. Tales bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero no se limitan a, bibliotecas de péptidos (véanse, por ej., la Patente de EE. UU. 5.010.175, Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493, Houghton et al. (1991) Nature, 354: 84-88): La síntesis de péptidos no es en absoluto en único sistema ideado y pretendido para el uso con la presente invención. También pueden usarse otras sustancias químicas para generar bibliotecas con diversidad química. Tales sustancias químicas incluyen, pero no se limitan a: peptoides (Publicación PCT Nº WO 91/19735, 26 dic. 1991), péptidos codificados (Publicación PCT WO 93/20242, 14 oct. 1993), biooligómeros aleatorios (Publicación PCT WO 92/00091, 9 en. 1992), benzodiazepinas (Pat. EE. UU. Nº 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-691.3), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568), peptidomiméticos no peptídicos con un andamiaje de beta-D-glucosa (Hirschmann et al., (1992) J. Amer. Chew. Soc, 114: 9217-9218), síntesis orgánica análoga de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661), oligocarbamatos (Cho, et al., (1993) Science 261:1303), y/o peptidilfosfonatos (Campbell et al., (1994) J. Org. Chem. 59: 658). Véase, generalmente, Gordon et al., (1994) J. Med. Chem. 37:1385, bibliotecas de ácidos nucleicos, bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase, por ej., la Patente de EE. UU. 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véanse, por ej., Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314), y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (véanse, por ej., Liang et al. (1996) Science, 274: 1520-1522, y la Patente de EE. UU. 5.593.853) y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas, (véanse, por ej., benzodiazepinas, Baum (1993) C&EN, 18 enero, página 33, isoprenoides, Patente de EE. UU. 5.569.588, tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de EE. UU. 5.549.974, pirrolidinas, Patente de EE. UU. 5.525.735 y 5.519.134, morfolinocompuestos, Patente de EE. UU. 5.506.337, benzodiazepinas, 5.288.514, y
similares).
Dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias están disponibles comercialmente (véanse, por ej., 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA).
Compuestos inhibidores que inhiben la expresión de Repro-PC-1.0 se identifican o son identificables mediante los métodos de rastreo de esta invención.
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XVI. Genómica
La identificación de formas cognadas o polimorfas del gen de Repro-PC-1.0 y el seguimiento de esos polimorfismos en individuos y familias son importantes en el rastreo genético. De acuerdo con esto, esta invención proporciona métodos útiles para detectar formas polimorfas del gen de Repro-PC-1.0. Los métodos implican comparar la identidad de un nucleótido o aminoácido en una posición seleccionada de la secuencia de un gen de Repro-PC-1.0 de prueba con el nucleótido o aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia de Repro-PC-1.0 natural (Nº ID SEC:1). La comparación puede llevarse a cabo mediante cualesquiera métodos conocidos en la especialidad, incluyendo la comparación directa de secuencias mediante secuenciación de nucleótidos, comparación de secuencias o determinación mediante hibridación o identificación de RFLPs.
En una realización, el método implica secuenciación de nucleótidos o aminoácidos de todo el polinucleótido o polipéptido de prueba, o una subsecuencia de él, y comparar esa secuencia con la secuencia de Repro-PC-1.0 natural. En otra realización, el método implica identificar fragmentos de restricción producidos durante la digestión con enzimas de restricción del polinucleótido de prueba y comparar esos fragmentos con fragmentos producidos mediante digestión con enzimas de restricción de gen de Repro-PC-1.0 natural. Los fragmentos de restricción procedentes del gen natural pueden identificarse mediante análisis de la secuencia para identificar sitios de restricción. Otra realización implica el uso de series oligonucleotídicas. (Véase, por ej., Fodor et al., patente de Estados Unidos 5.445.934.). El método implica proporcionar una serie oligonucleotídica que comprende un grupo de sondas oligonucleotídicas que definen secuencias seleccionadas de la secuencia de Repro-PC-1.0 natural, generar datos de hibridación realizando una reacción de hibridación entre las moléculas polinucleotídicas diana y las sondas del grupo y detectar la hibridación entre las moléculas diana y cada una de las sondas del grupo y procesar los datos de hibridación para determinar las posiciones de nucleótidos en las que la identidad de la molécula diana difiere de la de Repro-PC-1.0 natural. La comparación puede realizarse manualmente, pero se realiza más convenientemente mediante un ordenador digital
programable.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, no a modo de limitación.
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Ejemplos I. Los xenoinjertos tumorales de LNCaP presentan características morfológicas y metastáticas que dependen del ambiente en el que se generan
Usando un sistema modélico de células tumorales de próstata humanas LNCaP, se originaron tumores en ratones atímicos tanto macho como hembra. Los tumores, que típicamente tardaban al menos 2-3 meses en desarrollarse en masas palpables, mostraban rasgos notablemente diferentes dependiendo de si se propagaban en un ambiente femenino o masculino. Los tumores que se desarrollaban en ratones macho (LNCaP-macho) mostraban una vascularización y una destrucción morfológica intensivas en comparación con la composición altamente regular y homogénea de los tumores originados en hembras (LNCaP-hembra) (Figura 1). Adicionalmente, los tumores originados en huéspedes macho habían ganado potencial metastático, mientras que nunca de detectaban metástasis en ratones hembra. Las diferencias morfológicas de estos tumores sugerían la posibilidad de que secuencias específicas implicadas en la progresión metastática y/o la angiogénesis se hayan inducido en el ambiente masculino.
La expresión aberrante de un número de oncogenes y factores de crecimiento (regulación al alza) así como los genes supresores de tumores (regulación a la baja) se han relacionado con un número de tumores humanos y con el avance del cáncer en general. Por lo tanto, los presentes inventores examinaron la expresión de un conjunto representativo de secuencias para investigar si la apariencia diferente de los tumores LNCaP derivados de macho era el resultado de una regulación al alza o a la baja conducida por andrógenos de un factor previamente caracterizado. RNA aislado de LNCaPs-macho, LNCaPs-hembra, células LNCaP, células PC-3 (una línea celular prostática humana no sensible a andrógenos), tejido de bazo humano normal y tejido de hígado humano normal se sometió a hibridación Northern usando una variedad de sondas de oncogenes, factores de crecimiento y supresores de tumores previamente caracterizados. Como puede observarse en la Tabla 1, no existía diferencia en el patrón de expresión detectado en tumores LNCaP-macho en comparación con tumores LNCaP-hembra o con células LNCaP desarrolladas in vitro, indicando que el estado diferenciado de los tumores LNCaP-macho no se debía a la diferente expresión de cualquiera de estos factores más comunes.
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TABLA 1 Expresión de oncogenes para tumores LNCaP
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TABLA 1 (continuación)
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II. Aislamiento de secuencias específicas de LNCaP-macho
Para aislar secuencias que se sobreexpresan en tumores LNCaP-macho y que podrían elucidar el mecanismo o los mecanismos responsables de las diferencias morfológicas drásticas, los presentes inventores generaron una sonda específica de LNCaP-macho mediante tres rondas de hibridación sustractiva con cDNA de tumor de LNCaP-hembra. Esta sonda específica de LNCaP-macho se usó a continuación para realizar un rastreo primario de una biblioteca de cDNA de tumor lambda-ZAP-LNCaP-macho. Las calvas positivas se sometieron a un rastreo secundario doble, usando la sonda específica de LNCaP-macho y cDNA de tumor LNCaP-hembra total. Los clones se consideraban positivos si se hibridaban fuertemente a la sonda "específica para macho" y débilmente a la sonda de hembra.
Los positivos resultantes se sometieron a un rastreo terciario en el que los clones se "rescataban" y su DNA plasmídico se sometía a hibridaciones Southern duplicadas usando cDNA de LNCaP-macho total o LNCaP-hembra total. El DNA procedente de los clones que se hibridan más fuertemente a secuencias de LNCaP-macho se sometió a continuación a análisis Northern. El DNA procedente de un clon, Repro-PC-1.0, cuando se hibridaba a cantidades equivalentes de RNA procedente de tumores LNCaP-macho, tumores de LNCaP-hembra o células LNCaP, mostraba una amplificación de ~10X de un solo mRNA de 4,4 kb en tumores LNCaP-macho (Figura 2a). La rehibridación de la misma transferencia con sondas para actina y tubulina mostraba que la señal amplificada detectada por Repro-PC-1.0 en tumores LNCaP-macho no se debía a un nivel incrementado de RNA en ese carril (Figura 2b).
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III. Análisis de secuencias de Repro-PC-1.0
El análisis de secuencias inicial del clon Repro-PC-1.0 no revelaba marcos de lectura abiertos (ORFs) significativos en ninguna dirección. Subsiguientemente, un clon solapado (PS5-1) se aisló de la biblioteca de tumores LNCaP-macho mediante hibridación con una sonda oligonucleotídica que codifica secuencias 5' contenidas dentro del inserto de Repro-PC-1.0. La direccionalidad del clon Repro-PC-1.0 se infería de la presencia de una cola de poli-A putativa. La región codificante completa se determinó sometiendo a secuenciación PSS-1 y un clon de cDNA del extremo 5' derivado por RACE-PCR. El alineamiento de estos clones se muestra en la Figura 3. Los análisis Northern de los 2 clones solapados a conjuntos de RNA aislado de tumores LNCaP-macho, tumores LNCaP-hembra, células LNCaP y células PC-3 revelaban el mismo patrón de hibridación que se observaba originalmente con Repro-PC-1.0.
El análisis de secuencia de los clones solapados revelaba un solo ORF de 1275 pb que codifica 425 aminoácidos, seguido por una región no traducida 3' de 2466 pb a la que se añadía una cola de poliadenilato (Nº ID SEC: 1). La secuencia obtenida para la región no traducida 5' de Repro-PC-1.0 era mucho más corta que los aproximadamente 750 pb de la secuencia predicha, basándose en el tamaño del mensaje de 4,4 kb que se observaba mediante hibridaciones por transferencia de RNA, y por lo tanto probablemente esté incompleta. Se calculó que el Mr y el pI eran 48.070 y 8,83, respectivamente.
La identidad y la similitud de secuencia se determinaron usando el programa FASTDB, Bionet suite, Oxford Molecular Group, Campbell, CA o BLASTX, NCBI.
La secuencia de aminoácidos predicha de la región C-terminal de Repro-PC- 1.0 contenía dos copias de una repetición directa de 116 aminoácidos que tenían 34% de identidad (41% de similitud) entre sí. Estas repeticiones se situaban desde el aminoácido 150 hasta el 252 y desde el aminoácido 276 hasta el 396. Se encontró que las repeticiones eran homólogas al dominio regulador C2 de isoformas dependientes de calcio de proteína quinasa C (PKC) y a isoformas de sinaptotagmina (Figura 4).
La sinaptotagmina es realmente una familia de proteínas vesiculares sinápticas abundantes altamente conservadas que se ha propuesto que representan un papel en la traslocación de vesículas sinápticas al sitio de liberación presináptico de la membrana plasmática (atraque) y/o la fusión de estas dos membranas. Estructuralmente, las isoformas de sinaptotagmina pueden dividirse en varios dominios que incluyen: un dominio aminoterminal intravesicular; un solo dominio de transmembrana; y un dominio carboxiloterminal citoplásmico que consiste en dos repeticiones homólogas al dominio regulador C2 de PKC denominadas A y B (Figura 4). Los homólogos de sinaptotagmina han mostrado mayor conservación de identidad y similitud de secuencia en el dominio citoplásmico que contiene las dos repeticiones homólogas a C2 de PKC que en los dominios intravesiculares N-terminal o de transmembrana.
La Figura 5 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos para Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina IV de rata. Repro-PC-1.0 muestra 90% de identidad global con sinaptotagmina IV de rata. Como las otras isoformas de sinaptotagmina, Repro-PC-1.0 era el más similar a estas secuencias en la región C-terminal de la repetición C2 de PKC (91% de identidad). Las dos repeticiones internas de Repro-PC-1.0 son aproximadamente tan homólogas entre sí (34% de identidad) como la región correspondiente de PKC (identidad entre 35% y 43% dependiendo de la isoforma). Como en las otras formas de sinaptotagmina, los residuos de aminoácido que son idénticos entre las dos repeticiones internas de Repro-PC-1.0 también se conservan entre Repro-PC-1.0 y PKC, revelando una secuencia de consenso central de SDPYV/IK seguida por un tramo de residuos básicos (Figura 6).
Las representaciones de la hidrofobia de la secuencia de aminoácidos de Repro-PC-1.0 revelaba un solo segmento, desde los residuos 15-37, de longitud e hidrofobia suficientes para constituir un dominio de transmembrana. Aunque este dominio no se alinea colinealmente con el dominio correspondiente de las otras sinaptotagminas, también presenta los límites de transmembrana inusuales encontrados para otras sinaptotagminas. El límite N-terminal del dominio de transmembrana putativo está flanqueado por una prolina, el extremo C del dominio está flanqueado por residuos de cisteína seguidos por una región altamente cargada positivamente.
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IV. Localización cromosómica
Los análisis por transferencia Southern de la hibridación de Repro-PC-1.0 a DNA genómico humano revelaban un patrón no complejo que indicaba una secuencia de una sola copia. El análisis de la hibridación de Repro-PC-1.0 a DNAs genómicos procedentes de un conjunto de especies filogenéticamente distintas mostraba que las secuencias que codifican Repro-PC-1.0 estaban altamente conservadas, hibridándose a DNA de levadura incluso bajo condiciones de alta restricción. Un solo gen de Repro-PC-1.0 evolutivamente conservado se localiza en el cromosoma 18.
V. Expresión de Repro-PC-1.0 en carcinoma de próstata y otros tejidos
Para comparar la expresión de Repro-PC-1.0 en próstata normal con adenocarcinomas prostáticos e hiperplasias benignas, secuencias de Repro-PC-1.0 se amplificaron específicamente a partir de RNA aislado de un número de fuentes tisulares bien caracterizadas mediante RT-PCR. Estos productos se fraccionaron, se transfirieron y se hibridaron con una sonda de Repro-PC-1.0 y el nivel de expresión se graduó mediante la intensidad de señal relativa de las bandas específicas de Repro-PC-1.0 (Tabla 2).
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TABLA 2 Expresión de Repro-PC-1.0 en carcinoma prostático
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Las secuencias de Repro-PC-1.0 solo estaban presentes en los RNAs aislados de muestras de adenocarcinoma de próstata y no eran detectables en muestras que representan hiperplasias benignas. La señal marginal detectada en tejido prostático normal puede reflejar el principio de un cáncer de próstata no diagnosticado, ya que la fuente del tejido era un hombre mayor. Para asegurar que las secuencias amplificadas no se debían a contaminantes de DNA genómico, se realizaron reacciones de control, añadiendo RNasa o DNasa antes de la etapa de síntesis de la 1ª hebra. Según se muestra en la Tabla 2, la adición de DNasa no tenía el efecto del nivel de señal detectado en muestras de adenocarcinoma de próstata, mientras que el tratamiento con RNasa erradicaba la señal, indicando que la señal de hibridación a Repro-PC-1.0 detectada en las muestras de adenocarcinoma se debía a secuencias de RNA de Repro-PC-1.0 y no se debía a secuencias genómicas contaminantes.
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TABLA 3 mRNA de Repro-PC-1.0 en líneas celulares humanas y tejidos de mamífero
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TABLA 3 (continuación)
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La expresión de Repro-PC-1.0 en carcinomas y tejidos adicionales se investigó mediante análisis por transferencia de RNA. La Tabla 3 lista las líneas celulares de carcinoma y los tejidos humanos diferentes que se rastreaban con respecto a la expresión de Repro-PC-1.0. No se detectaba expresión de Repro-PC-1.0 en ninguna otra línea celular de carcinoma prostático o no prostático además de la línea LNCaP, ni se detectó en ningún otro tejido normal excepto para el cerebro. De forma interesante, este es precisamente el tejido en el que se expresa la familia de las sinaptotagminas, sugiriendo que las células LNCaP están expresando aberrantemente un gen que codifica una proteína implicada en la ruta secretora regulada.
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VI. Expresión diferencial de Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina humana
Para analizar si Repro-PC-1.0 podría representar o no una isoforma de sinaptotagmina humana que se expresaba diferencialmente en células tumorales LNCaP, los presentes inventores compararon la expresión de Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina humana en células LNCaP, tejido cerebral, células PC12 (línea celular medular adrenal de rata) y en una línea celular de carcinoma humano que expresa Repro-PC-1.0 o sinaptotagmina, RL95-2. RNA aislado de cada una de estas fuentes se hibridó a sondas bien específicas para Repro-PC-1.0 o bien específicas para sinaptotagmina humana. Ambas formas son detectables en RNA aislado de cerebro humano normal, pero sólo Repro-PC-1.0, y no sinaptotagmina humana, se expresa en células LNCaP. De forma interesante, solo las secuencias de Repro-PC- 1.0 son detectables en células PC12 que normalmente expresan sinaptotagmina I cerebral de raya. La sinaptotagmina I cerebral de rata no habría sido detectable con las sondas bien específicas para sinaptotagmina humana o bien específicas para Repro-PC-1.0. La hibridación cruzada de Repro-PC-1.0 a RNA de PC12 sugiere que un homólogo de rata de Repro-PC-1.0 también podría expresarse en células PC12 y puede participar en la secreción regulada. Así, la expresión de Repro-PC-1.0 está regulada al alza específicamente y diferencialmente en células tumorales LNCaP, representando una nueva isoforma de sinaptotagmina cerebral humana que se hibrida cruzadamente con un homólogo de rata, distinta de la sinaptotagmina I cerebral de rata, normalmente expresada en células PC 12.
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VII. Análisis
Las proteínas específicas para tumores permiten adquirir una nueva percepción de los mecanismos que contribuyen al avance hasta una enfermedad maligna. La línea celular LNCaP proporciona un modelo útil de cáncer de próstata que ha resultado valioso para comprender el cáncer de próstata. Estas células se usaron para originar xenoinjertos de tumor de próstata humano en ratones atímicos tanto macho como hembra. Las observaciones iniciales de los presentes inventores de diferencias histológicas y morfológicas dependientes del sexo del huésped en la producción de tumores les movieron a investigar estas dos formas de tumor como una fuente potencial de RNA para desarrollar un rastreo sustractivo para identificar proteínas expresadas unívocamente en un tumor que ha avanzado a través de vascularización (angiogénesis) y ha ganado carácter metastático.
La tumorigénesis a menudo se asocia bien con una activación de un oncogén o bien con la desactivación de un gen supresor de tumor (antioncogén). Los presentes inventores compararon el nivel de expresión de un número de oncogenes, genes supresores de tumores, factores de crecimiento y el receptor de andrógeno entre los tumores LNCaP irregulares en un ambiente masculino, con tumores LNCaP desarrollados en un ambiente femenino, con células LNCaP desarrolladas in vitro, con otra línea celular de cáncer de próstata humano no sensible a andrógenos y con tejido humano normal. Debido a que los tumores desarrollados en huéspedes macho mostraban un perfil que era similar a tumores desarrollados en hembras y a células LNCaP desarrolladas in vitro, los presentes inventores consideraron los dos tumores morfológicamente distintos como una fuente adecuada de mensaje potencial.
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VIII. Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) de Cromosomas
Células linfoblásticas cultivadas se incuban con BrdU y nacadozol durante de 3 a 5 horas antes de recoger con tripsina y reunir mediante centrifugación. Las células se resuspenden en KCl y se fijan en suspensión con metanol/ácido acético sobre hielo durante 30 min. La suspensión celular se pone sobre portaobjetos de microscopio y se seca lentamente a 70ºC, 80% de humedad. Una sonda de cDNA biotinilada, complementaria a Repro-PC-1.0, se genera usando protocolos estándar (Labeling and colorimetric detection of non-isotopic probes. En "Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel, et al., Eds., pp. 3, 18, 1-3,18.7, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). La sonda biotinilada se diluye hasta 3 ng/\mul en un tampón de hibridación que contiene formamida al 50%, dextrano al 10%, 2 X SSC, 50 \mug/ml de DNA de Cot-1 y se incuba durante la noche a 37ºC con la extensión de células fijada que se ha preincubado con tampón de hibridación. Los portaobjetos se lavan dos veces con 0,5 X SSC a 70ºC, una vez con 4X SSC a temperatura ambiente, una vez con diluyente para anticuerpos (BSA al 1%, 4X SSC) a temperatura ambiente durante 5 min. y se incuban durante 20 min. a 37ºC con avidina conjugada a FITC diluida (10 \mug/ml) en diluyente para anticuerpos. Los portaobjetos se lavan tres veces con un tampón que contiene 4X SSC, a continuación con un tampón que contiene 4X SSC, Tween 20 al 0,05%, a continuación con un tampón que contiene 4X SSC seguido por tinción por contraste durante 2 min con DAPI (200 ng/ml en 4X SSC) y lavado con 4X SSC. El fluido en exceso se seca con papel y los portaobjetos se montan con un reactivo estabilizante de FITC que contiene dihidrocloruro de p-fenilendiamina en glicerol al 90%. El perfil de hibridación se determina usando un microscopio
fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
IX. Protocolo de cuantificación por imitación de PCR
El siguiente protocolo es útil para amplificar Repro-PC-1.0 a partir de una muestra de células.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Extracción de RNA
1.
Se extirpa la próstata del paciente
2.
Menos de 15-30 minutos después de que se haya extirpado la próstata del paciente, identifíquense áreas normales y cancerosas y retírense aproximadamente 100-300 mg de tejido (aproximadamente 1 cm X 0,5 cm X 0,4 cm) de cada área.
3.
Si el RNA va a extraerse en un momento posterior, entonces colóquese cada bloque de tejido en un trozo etiquetado previamente de papel de aluminio de gran resistencia e introdúzcase inmediatamente en nitrógeno líquido.
4.
Almacénense los tejidos en el congelador a -70ºC.
5.
Las porciones embebidas se seccionan y se le dan al patólogo para la determinación.
6.
El resto de la próstata se fija en formaldehído.
7.
Cuando esté listo para usar, extráigase el RNA como sigue:
8.
Déjese caer el tejido congelado en 3 ml de Trizol (GIBCOBRL, número de catálogo 15596-018) y homogenéicese usando un homogeneizador de tejidos Politron, Tissumizer u otro adecuado.
9.
Incúbese la muestra homogeneizada durante 5 minutos a temperatura ambiente.
10.
Añádanse 600 \mul de cloroformo (200 \mul de cloroformo por ml de Trizol).
11.
Mézclense durante 15 segundos y déjense asentar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
12.
Centrifúguese a 12000 X g durante 15 minutos a 4ºC.
13.
Retírese cuidadosamente la capa acuosa incolora superior.
14.
Precipítese el RNA usando un volumen igual de isopropanol.
15.
Déjese que las muestras se asienten a temperatura ambiente durante 10 minutos.
16.
Centrifúguese a 12000 X g durante 15 minutos a 4ºC.
17.
Retírese el sobrenadante y lávese la pella, rompiendo la pella y pipeteando hacia arriba y hacia abajo, con etanol al 75% enfriado con hielo en agua libre de RNasa.
18.
Centrifúguese a 12000 X g durante 15 minutos a 4ºC.
19.
Retírese el sobrenadante y séquese la pella en Speed-Vac durante 2-3 minutos.
20.
Resuspéndase el RNA en agua libre de RNasa e incúbese a 65ºC durante 10 minutos.
21.
Tómense lecturas de DO a 260 y 280 nm (para muestras concentradas, debe usarse una dilución 1:125 de la muestra para leer los valores de DO. El factor de conversión sería así la A_{260} de la muestra multiplicada por el factor de dilución de 125 multiplicado por 40 \mug/ml (Muestra A_{260} X 125 X 40 \mug/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
B. Tratamiento con DNasa
Las muestras de RNA deben tratarse con DNAsa I (GIBCOBRL, número de catálogo 18068-015) antes de usar en la síntesis de cDNA y la PCR para suprimir cualquier DNA genómico contaminante. Trátense las muestras con DNasa como sigue:
1.
Añádanse a un tubo de microcentrífuga:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
2.
Incúbense los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3.
Inactívese la DNasa I añadiendo 1 \mul de EDTA 25 mM.
4.
Caliéntese durante 10 minutos a 65ºC.
C. Síntesis de cDNA
Transcríbase inversamente el RNA como sigue:
1.
En un tubo de microcentrífuga, mézclese lo siguiente:
9 
\vskip1.000000\baselineskip
2.
Incúbese a 70ºC durante 10 minutos y enfríese bruscamente con hielo durante 2 minutos.
3.
En un tubo de microcentrífuga, prepárese la siguiente mezcla de reacción en el orden indicado:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
4.
Añádanse 7 \mul de la mezcla anterior a cada una de las mezclas de RNA/hexámeros aleatorios.
5.
Mézclese y centrifúguese brevemente.
6.
Incúbese a temperatura ambiente durante 5 minutos
7.
Añádase 1 \mul (200 unidades) de SUPERSCRIPT II RT (GIBCOBRL, número de catalogo 18064-014), mézclense e incúbense a temperatura ambiente durante 10 minutos (no añadir RT al tubo de control Sin RT).
8.
Transfiéranse los tubos hasta 42ºC e incúbense durante 50 minutos.
9.
Termínense las reacciones incubando a 70ºC durante 15 minutos.
10.
Enfríese sobre hielo durante 2 minutos y centrifúguese brevemente.
11.
Añádase 1 \mul de RNasa H (GIBCOBRL, número de catálogo 18021-022) e incúbese durante 20 minutos a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
D. Construcción de "Mímico"
Realícese la serie de dilución de mímico como sigue:
1.
Etiquétense ocho tubos de microcentrífuga de 0,5 ml 1-8.
2.
Prepárese una reserva de 100 attomol/\mul para cada uno de los mímicos. Todas las diluciones deben realizarse en solución de dilución de mímico (es decir TE que contiene 10 \mug/ml de glicógeno de calidad para ácidos nucleicos):
Prepárense 20 \mul de una dilución 1:10 de la reserva de 100 attomol/\mul y etiquétese este tubo como 10 attomol/\mul.
Añádanse 18 \mul se solución de dilución de mímico al tubo 1 y añádanse 2 \mul desde el tubo de 10 attomol/\mul. Para elaborar la serie duplicada, prepárense 20 \mul de una dilución 1:10 de la reserva de 10 attomol/\mul y etiquétese este tubo como "1".
\vskip1.000000\baselineskip
3.
Prepárense el resto de las soluciones de reserva de mímico como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\newpage
En la tabla posterior se resumen las concentraciones molares y másicas para la serie de dilución de G3PDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) y PC1:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\newpage
III PCR
Establézcase la PCR como sigue:
15
1.
Numérense los pocillos de una placa de PCR o los tubos de PCR 1-8.
2.
Añádase 1 \mul del mímico correspondiente al número del tubo (por ej., el tubo Nº 1 da 1 \mul de mímico Nº 1, etc.). Manténgase la placa o el tubo sobre hielo.
3.
Fórmese la siguiente mezcla (elabórese suficiente mezcla para n+1 reacciones, es decir 9 reacciones). Manténgase el tubo de mezcla sobre hielo:
16
4.
Añádanse 24 \mul a cada uno de los pocillos o al tubo a los que ya se ha añadido el mímico en la etapa 2 anterior. Manténgase la placa o el tubo sobre hielo mientras se añade la mezcla.
5.
Realícese PCR usando el siguiente ciclo:
18
6.
Háganse pasar 10 \mul del producto sobre un gel de agarosa en TAE al 2% con una escalera de 1 kb como marcador.
La presente invención proporciona nuevos polinucleótidos que codifican un marcador específico para tumores de próstata, Repro-PC- 1.0, la proteína codificada por él y métodos para usar estos materiales. Aunque se han proporcionado ejemplos específicos, la descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones de la invención se harán evidentes para los expertos en la especialidad al revisar esta memoria descriptiva. Por lo tanto, el alcance de la invención debe determinarse sin referencia a la descripción anterior, pero en cambio debe determinarse con referencia a las reivindicaciones adjuntas en conjunto con su alcance completo de equivalentes.
Todas las publicaciones y los documentos de patente citados en esta solicitud se incorporan mediante referencia en su totalidad para todos los propósitos en la misma extensión que si cada publicación o documento de patente individual se apuntara así individualmente.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: French, Cynthia K.
\hskip1.5cm
Schneider, Patrick A. 
\hskip1.5cm
Yamamoto, Karen K. 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Marcador Específico para el Cáncer de Próstata
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: TOWNSEND and TOWNSEND and CREW LLP
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Two Embarcadero Center, 8th Floor
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE. UU. de A.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 94111
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: (pendiente de asignar)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: (junto con la presente)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Dow, Karen B.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 29.684
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 018002-000210US
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 415-576-0200
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFÁX: 415-576-0300
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CONFIGURACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 151..1425
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:1:
19
20
21 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 425 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:2:
23
24

Claims (27)

1. Un polinucleótido no presente en la naturaleza que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2.
2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos codifica polipéptido de Repro-PC-1.0 natural que se muestra en el Nº ID SEC:2.
3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad con polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2.
4. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes del polipéptido de Repro-PC-1.0 es idéntica a una secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC:1.
5. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica a los nucleótidos 151-1425 del Nº ID SEC:1.
6. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido de Repro-PC-1.0 inmunogénico de al menos 100 aminoácidos consecutivos de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2.
7. Una sonda o un cebador polinucleotídico de al menos 15 nucleótidos que se hibrida específicamente a una secuencia de nucleótidos seleccionada de cDNA de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:1 y su complemento, en donde la sonda o el cebador no es la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5.
8. La sonda o el cebador polinucleotídico de acuerdo con la reivindicación 7, cuya secuencia es idéntica o complementaria a una secuencia de nucleótidos seleccionada de cDNA de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:1.
9. La sonda polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, que comprende además una etiqueta.
10. Un polinucleótido no presente en la naturaleza que comprende una secuencia de control de la expresión conectada operativamente a un polinucleótido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Una célula no presente en la naturaleza que comprende un polinucleótido recombinante de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un método para detectar un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de cDNA de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC: 1 o su complemento en una muestra, que comprende las etapas de:
(a)
poner en contacto la muestra con una sonda o cebador polinucleotídico que comprende una secuencia de al menos 15 nucleótidos que se hibrida específicamente a la secuencia de nucleótidos, en donde la sonda o el cebador no es la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5; y
(b)
detectar si el polinucleótido se ha hibridado específicamente al polinucleótido,
con lo que la hibridación específica proporciona una detección del polinucleótido en la muestra.
13. Un polipéptido de Repro-PC-1.0 recombinante purificado cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la del Nº ID SEC: 2, o cuya secuencia de aminoácidos es al menos 95% idéntica al Nº ID SEC:2.
14. Un polipéptido de Repro-PC-1.0 que no está presente en la naturaleza, que comprende una secuencia de al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 y tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el Nº ID SEC:2.
15. Una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2.
16. La composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
17. La composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que los anticuerpos son anticuerpos policlonales.
18. Un método para detectar un polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 o una variante del mismo que tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2 en una muestra, que comprende las etapas de
(a)
poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 o la variante del mismo; y
(b)
detectar la unión específica entre el anticuerpo y el polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 o la variante del mismo,
con lo que la unión específica proporciona una detección del polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 o la variante del mismo en la muestra.
19. Un método in vitro para el uso en la diagnosis del cáncer de próstata en un sujeto, que comprende las etapas de:
(a)
detectar una cantidad diagnóstica de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en una muestra procedente del sujeto; y
(b)
comparar la cantidad diagnóstica con un intervalo normal de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en una muestra de control no cancerosa,
con lo que una cantidad diagnóstica por encima del intervalo normal proporciona una indicación positiva de la diagnosis del cáncer de próstata; en donde el mRNA de Repro-PC-1.0 tiene la secuencia del Nº ID SEC:1 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:1 y en donde el polipéptido de Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de Nº ID SEC:2 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la muestra es sangre, orina, tejido de nódulo linfático o tejido de próstata.
21. Un compuesto que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 15, 16 ó 17 acoplado a una etiqueta, para el uso en un método para detectar células de cáncer de próstata en un sujeto, que comprende las etapas de:
(a)
administrar el compuesto al sujeto, y
(b)
detectar la localización del compuesto en el sujeto.
22. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la etiqueta es (1) una etiqueta radiactiva y la etapa de detección comprende detectar la etiqueta mediante obtención de imágenes con cámara, o (2) una etiqueta isotópica y la etapa de detección comprende detectar la etiqueta mediante obtención de imágenes por resonancia
magnética.
23. Un método in vitro para seguir el avance del cáncer de próstata en un sujeto, que comprende las etapas
de:
(a)
detectar cantidades primera y segunda de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en muestras procedentes del sujeto en un primer y un segundo momento; y
(b)
comparar las cantidades primera y segunda,
con lo que un incremento entre las cantidades primera y segunda indica avance del cáncer de próstata y una disminución entre las cantidades primera y segunda indica remisión del cáncer de próstata; en donde el mRNA de Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de Nº ID SEC:1 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:1 y en donde el polipéptido de Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de Nº ID SEC:2 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2.
24. Una inmunotoxina que se une específicamente al polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 o una variante del mismo que tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2, para el uso en un método para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer de próstata en un sujeto.
25. Un método de rastreo in vitro para determinar si un compuesto modula la expresión de Repro-PC-1.0 en una célula, que comprende poner en contacto la célula con el compuesto y determinar si la producción de mRNA o polipéptido de Repro-PC-1.0 se incrementa o se disminuye; en donde el mRNA de Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de Nº ID SEC: 1 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:1 y en donde el polipéptido de Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de Nº ID SEC:2 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2.
26. Un método de rastreo in vitro para detectar una traslocación cromosómica de un gen de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:1, que comprende las etapas de:
(a)
hibridar una sonda etiquetada de acuerdo con la reivindicación 9 a una extensión cromosómica procedente de una muestra celular para determinar el patrón de hibridación, y
(b)
determinar si el patrón de hibridación difiere de un patrón normal.
\newpage
27. Un método in vitro para detectar formas polimorfas de Repro-PC-1.0 que comprende comparar la identidad de un nucleótido o aminoácido en una posición seleccionada de la secuencia de un gen o polipéptido de Repro-PC-1.0 de prueba con la identidad del nucleótido o aminoácido en la posición correspondiente de Repro-PC-1.0 natural que se muestra en el Nº ID SEC:1 ó 2, con lo que una diferencia en la identidad indica que el polinucleótido de prueba es una forma polimorfa de de Repro-PC-1.0.
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