ES2328011T3

ES2328011T3 - Selecion de alto rendimiento de bibliotecas de adn expresadas en hongos filamentosos.

Info

Publication number: ES2328011T3
Application number: ES01927056T
Authority: ES
Inventors: Peter Jan Punt; Cornelia Van Zeijl; Cornelius Van Den Hondel; Mark Aaron Emalfarb
Original assignee: Dyadic International USA Inc
Current assignee: Dyadic International USA Inc
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2001-04-13
Publication date: 2009-11-06
Anticipated expiration: 2021-04-13
Also published as: DE60138947D1; MXPA01012905A; EP1272669A1; BR0105795A; CN102174551A; WO2001079558A8; EP1272669A4; WO2001079558A1; EA200200035A1; DK1272669T3; IL146935A0; CN1380905A; AU5354401A; ATE433486T1; JP5138855B2; JP2003530843A; CA2376552A1; EP1272669B1; EA006873B1

Abstract

Método para expresar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN, donde la biblioteca de vectores comprende una pluralidad de vectores diferentes, cada vector diferente comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas diferentes, dicha secuencia de ácidos nucleicos siendo operativamente enlazada a una región reguladora de la expresión y opcionalmente una secuencia que codifica una señal de secreción, el método incluyendo las etapas de: (a) suministar una pluralidad de hongos filamentosos individuales, dichos hongos teniendo un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión y caracterizado por la producción de elementos transferibles reproductivos que son monoclonales y fácilmente separados los unos de los otros en suspensión; (b) transfomar de forma estable dichos hongos filamentosos con dicha biblioteca de vectores de ADN para introducir en cada uno de una pluralidad de los hongos individuales al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas heterólogas u homólogas; (c) cultivar los hongos filamentosos transformados en suspensión bajo condiciones propicias para la formación de elementos reproductivos transferibles; (d) separar entre sí una pluralidad de elementos reproductivos transferibles; y (e) cultivar en cultivos monoclonales o colonias monoclonales los elementos reproductivos transferibles individuales, bajo las condiciones propicias para la expresión de las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas heterólogas u homólogas.

Description

Selección de alto rendimiento de bibliotecas de ADN expresadas en hongos filamentosos.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método para la expresión y selección posterior de bibliotecas de ADN, particularmente bibliotecas sintéticas genómicas, y de ADNc, en huéspedes filamentosos fúngicos. El sistema emplea cepas fúngicas filamentosas transformadas o modificadas que generan elementos reproductivos transferibles, por ejemplo por esporulación eficaz, en cultivo sumergido. Los hongos preferiblemente muestran una morfología que minimiza o elimina la formación de micelios enredados. Cepas fúngicas particularmente preferidas son también capaces de expresar cantidades aislables de proteínas exógenas para su evaluación. Las cepas mutantes fúngicas de la invención son particularmente bien adecuadas para técnicas de selección de alto rendimiento, debido a su producción de elementos reproductivos transferibles, niveles altos de expresión, y viscosidad de cultivo muy baja.

Antecedentes de la invención

Las poblaciones naturales de microorganismos muestran un conjunto amplio de diversidad bioquímica y metabólica. En parte debido a dificultades en aislar y cultivar muchos microorganismos, un gran número de proteínas valiosas de forma potencial y polipéptidos presentes en estas poblaciones han escapado de la identificación. De hecho, ha sido estimado que menos del uno por ciento de los microorganismos del mundo han sido cultivados hasta la fecha. Continua habiendo una necesidad de presión para nuevos enfoques para la caracterización de proteínas, polipéptidos y metabolitos de microorganismos todavía no cultivados, no identificados, y también de microorganismos conocidos. (El término "proteína" como se usa de ahora en adelante debería ser entendido como incluyendo péptidos así como polipéptidos). Continua habiendo también una necesidad de enfoques nuevos para la identificación y aislamiento de los genes que codifican estas proteínas, para permitir la modificación y/o producción de las proteínas.

Un enfoque para este problema ha sido descrito por Short en las patentes estadounidenses 5,958,672, 6,001,574, 6,030,779, y 6,057,103. En este enfoque, una biblioteca de ADN genómico es preparada directamente de una muestra medioambiental (p. ej. una muestra de tierra), haciendo o no un intento para aislar o cultivar cualquier organismo que pueda estar presente. La biblioteca de ADN es expresada en E. coli, y las proteínas expresadas son seleccionadas para una propiedad o actividad de interés. Short alude a, pero no describe o permite, el uso de células huéspedes fúngicas en este método.

El enfoque según está descrito padece de diferentes desventajas serias, una de ellas es que E. Coli no expresa eficazmente genes que tienen intrones. Aproximadamente el 90% de las especies de microorganismos en la tierra son eucariotas (principalmente hongos), que generalmente tienen intrones en su ADN genómico. Suponiendo que hay ya aproximadamente 100.000 especies de hongos eumicotas conocidos, estimándose que 1.000.000 todavía deben ser descubiertos (B.Kendrick, The Fifth Kingdom, Mycologue Publications 1999), el potencial para diversidad de proteínas y de metabolitos es mucho más alto entre los genomas fúngicos, pero la presencia de intrones pone la mayor parte de las proteínas fúngicas y repertorio de metabolitos fuera del alcance de los sistemas de expresión bacteriana. No sólo son muchas clases de enzimas (p. ej., lignina peroxidasas fúngicas secretoras y peroxidasas dependientes de manganeso) únicas para hongos, sino que hay muchas proteínas fúngicas, incluso enzimas (p. ej. lignina peroxidasas, invertasa de A. niger), que son glicosiladas, y estas proteínas no serían glicosiladas si fueran expresadas por E. coli. El número mucho mayor y el tamaño y complejidad superiores de genomas fúngicos, la singularidad de muchas proteínas fúngicas, y la glicosilación de muchas proteínas fúngicas, todo ello indica que la fracción de proteína microbiana y la diversidad de metabolitos en una muestra medioambiental que podría ser detectada en realidad por la expresión bacteriana del ADN genómico es considerablemente inferior al 10%.

En parte debido a la extensión del SIDA y al aumento de población de receptores de transplante de órganos, hay una población en crecimiento de individuos inmuno-comprometidos o inmuno-suprimidos, y el número y variedad de infecciones fúngicas ha crecido rápidamente (Infect. Med. 16:380-382, 385-386 (1999)). Hay una necesidad de identificar y caracterizar proteínas de hongos patógenos en la actual búsqueda de nuevas metas para fármacos anti-fúngicos, lo que requiere la capacidad de seleccionar bibliotecas de ADN derivadas de genomas fúngicos. Nuevamente, la presencia de intrones en genomas fúngicos hace la expresión de bibliotecas de ADN genómico difícil en la mayoría de huéspedes bacterianos habitualmente disponibles. Ha habido también un aumento en la prevalencia de infecciones bacterianas resistentes a los antibióticos, creando una necesidad de selección de alto rendimiento para metabolitos fúngicos nuevos con actividad antibiótica.

Los genomas eucarióticos de organismos superiores son también demasiado complejos para la expresión comprensiva de bibliotecas de ADN en bacterias. Cuando todas las especies eucarióticas son consideradas, las bacterias representan sólo aproximadamente un 0,3% de todas las especies conocidas (E.O. Wilson, "The Current State of Biological Diversity", en Biodiversity, National Academy Press, Washington DC, 1988, capítulo 1); así la fracción de la diversidad del mundo genético accesible para los sistemas de expresión bacteriana es extremadamente limitada.

Para evitar problemas con intrones, es posible preparar una biblioteca de ADNc y expresarla en bacterias. No obstante, este enfoque se refiere a la presencia de transcripciones de ARN, y cualquier gen no estando transcrito activamente no será representado en la biblioteca. Muchas proteínas deseables son expresadas sólo bajo condiciones específicas (p. ej., factores de virulencia en hongos patógenos) y estas condiciones no pueden existir al mismo tiempo que el ARNm es recolectado. Además, para obtener suficiente ARN para preparar una biblioteca de ADNc, es preciso cultivar una cantidad razonable del organismo. Para organismos en muestras medioambientales que no crecen bien en cultivo, o microorganismos nuevos para los cuales las condiciones de cultivo apropiadas son desconocidas, no se obtendrá suficiente ARN de una forma fácil o fiable. Por el contrario, se puede obtener suficiente ADN genómico de un número muy pequeño de células individuales por amplificación por PCR, usando bien cebadores aleatorios o bien cebadores diseñados para favorecer clases determinadas de genes. Finalmente, los genes que son altamente expresados en un organismo tenderán a ser sobre-representados en el ARNm, y por lo tanto sobre-representados a costa de genes mínimamente expresados en una biblioteca de ADNc. Para tener un nivel alto de cobertura de las especies ARNm presentes, un número mucho mayor de clones debe ser seleccionado si se emplea una biblioteca de ADNc en vez de una biblioteca genómica, puesto que ésta tendrá una representación más prácticamente igual de la variedad de genes presentes. Claramente es más deseable seleccionar una biblioteca de ADN genómica en la medida de lo posible.

También, E. coli es incapaz de segregar muchas proteínas, y por tanto es indeseable como una célula huésped para fines de selección cuando la selección se refiere a la secreción del producto genético. Una desventaja adicional para E. coli, y para los huéspedes bacterianos en general, es que los procariotas no pueden proporcionar muchas de las modificaciones postraduccionales requeridas para la actividad de numerosas proteínas eucarióticas. Además de la glicosilación, la ruptura de subunidades, la formación de enlaces de disulfuro, y el pliegue apropiado de proteínas son ejemplos del procesamiento postraduccional frecuentemente requeridos para producir una proteína activa.

Para asegurar tal procesamiento se puede a veces usar células mamíferas, pero las células mamíferas son difíciles de mantener, requieren medios caros, y no son generalmente transformadas con alta eficiencia. Estos sistemas de transformación no son en consecuencia convenientes para selección de proteínas de alto rendimiento, a pesar de que se han hecho esfuerzos para emplear células mamíferas como huéspedes para la selección de bibliotecas de ADNc (Schouten et al., WO 99/64582). Un enfoque que implica fusión de protoplastos transformados con células mamíferas antes de la selección de bibliotecas ha sido descrita (patente U.S. 5,989,814), pero la expresión de la biblioteca de proteínas ocurre en bacterias o levadura antes de la fusión celular. Se han hecho esfuerzos para modificar modelos de glicosilación enzimáticamente después de la expresión en células huéspedes (Meynial-Salles y Combes, J. Biotechnol., 46:1-14 (1996), pero este tipo de métodos deben ser confeccionados para productos específicos y no son adecuados para la expresión de proteínas a partir de una biblioteca de ADN. Más recientemente, Maras et al., Eur. J. Biochem., 249:701-707 (1997) (véase también patente estadounidense 5,834,251) han descrito una cepa de Tichoderma reesei creada genéticamente para expresar GIcNAc transferasa 1 humana. La enzima transfiere N-acetilglucosamina a los residuos de manosa en otras proteínas exógenas expresadas, un primer paso dirigido a una aproximación más cercana a productos de mamíferos naturales.

El uso de levadura como células huéspedes resuelve algunos de los problemas de arriba, pero introduce otros. La levadura tiende a hiperglicosilar proteínas exógenas (Bretthauer y Castellino, 1999, Biotechnol. Appl.. Biochem. 30:193-200), y los modelos de glicosilación alterados frecuentemente convierten las proteínas mamíferas expresadas en altamente antigénicas (C. Ballou, en Molecular Biology of the Yeast Sacccharomyces, J. Strathern et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1982, 335-360). Aunque las levaduras son capaces de afrontar un número limitado de intrones, éstas no son generalmente capaces de manipular genes complejos de especies superiores tales como los vertebrados. Incluso los genes de hongos filamentosos son normalmente demasiado complejos para que la levadura transcriba eficazmente, y este problema está compuesto por diferencias en expresión y secuencias de empalme entre levadura y hongos filamentosos (véase p. ej., M. Innis et al., Science 1985 228:21-26). A pesar de estos inconvenientes, los sistemas de transformación y de expresión para levadura han sido desarrollados extensamente, generalmente para el uso con bibliotecas de ADNc. Los sistemas de expresión de levadura han sido desarrollados que son usados para seleccionar proteínas segregadas naturalmente y de membrana de origen mamífero (Klein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93:7108-7113; Treco, patente U.S. 5,783,385), y para proteínas heterólogas fúngicas (Dalboge y Heldt-Hansen, Mol. Gen. Genet. 243:253-260. 243:253-260 (1994)) y proteínas mamíferas (Tekamp-Olson y Meryweather, patente U.S. 6,017,731).

El término "levadura" como se usa en el contexto de sistemas de expresión en levadura generalmente se refiere a organismos del orden de Saccharomycetales, tales como S. cerevisiae y Pichia pastoris. Para los objetivos de esta descripción, los términos "hongos" y "fúngico" deberían ser entendidos como refiriéndose a Basidiomycetes, Zygomycetes, Oomycetes, y Chythridiomycetes, y Ascomycetes de la clase Euascomycetes, que no son del orden de Saccharomycetales. Los hongos filamentosos pueden ser distinguidos de levadura por su alargamiento hifal durante el crecimiento vegetativo, y el catabolismo de carbono estrictamente aeróbico (el crecimiento vegetativo en levadura es realizado por injerto de un talo unicelular, y la levadura puede emplear catabolismo fermentativo).

La eliminación de intrones apropiada, y glicosilación, pliegue, y otras modificaciones postraduccionales de productos genéticos fúngicos serían manipuladas más eficazmente por unas especies de huéspedes fúngicos, haciendo hongos filamentosos huéspedes superiores para seleccionar ADN genómico de muestras de tierra. También los convierte en huéspedes excelentes para la producción de enzimas fúngicas de interés comercial, tales como proteasas, celulasas, y amilasas. Se ha encontrado también que los hongos filamentosos son capaces de transcribir, traducir, tratar, y segregar los productos de otros genes eucarióticos, incluso de genes mamíferos. Ésta propiedad convierte a los hongos filamentosos en huéspedes atractivos para la producción de proteínas de interés biomédico. Los modelos de glicosilación introducidos por los hongos filamentosos se asemejan más a estos de proteínas mamíferas de lo que lo hacen los modelos introducidos por la levadura. Por estas razones, se han gastado muchos esfuerzos en el desarrollo de sistemas de huéspedes fúngicos para la expresión de proteínas heterólogas, y varios sistemas de expresión fúngica han sido desarrollados. Para revisiones de trabajos en este área, véase Maras et al., Glycoconjugate J.,16:99-107 (1999); Peberdy, Acta Microbiol. Immunol. Hung. 46:165-174 (1999); Kruszewsa, Acta Biochim. Pol. 46:181-195 (1999); Archer et al., Crit. Rev. Biotechnol.17:273-306 (1997); y Jeenes et al., Biotech. Genet. Eng. Rev. 9:327-367 (1991).

La expresión de alto rendimiento y evaluación de bibliotecas de ADN derivadas de genomas fúngicos también serán útiles para asignar funciones a los muchos genes mamíferos que son habitualmente de función desconocida. Por ejemplo, una vez identificada una proteína fúngica con una propiedad de actividad de interés, la secuencia del gen codificante puede ser comparada con la secuencia del genoma humano para buscar genes homólogos.

Yelton et al., Pat. U.S. Nº. 4,816,405, expone la modificación de Ascomycetes filamentosos para producir y segregar proteínas heterólogas. Buxton et al., en Pat. U.S. Nº. 4,885,249, y en Buxton y Radford, Mol. Gen. Genet.196: 339-344 (1984), expone la transformación de Aspergillus niger por un vector de ADN que contiene un marcador seleccionable capaz de ser incorporado en las células huéspedes. McKnight et al., patente U.S. 4,935,349, y Boel, en patente U.S. 5,536,661, revelan métodos para la expresión de genes eucarióticos en Aspergillus que implican promotores capaces de dirigir la expresión de genes heterólogos en Aspergillus y otros hongos filamentosos. Royer et al., en patente estadounidense 5,837,847, y Berka et al., en WO 00/56900, revelan sistemas de expresión para el uso en Fusarium venenatum utilizando promotores naturales y mutantes de Fusarium spp.. Conneely et al., en patente U.S. 5,955,316, revelan constructos plásmidos adecuados para la expresión y producción de lactoferrina en Aspergillus. Glucosa-oxidasa de Cladosporium ha sido expresada en Aspergillus (patente U.S. 5,879,921).

Técnicas similares han sido usadas en Neurospora. Lambowitz, en la patente U.S. 4,486,533, expone un vector de ADN que se replica de manera autónoma para hongos filamentosos y su uso para la introducción y expresión de genes heterólogos en Neurospora. Stuart et al. describen la cotransformación de esferoplastos de Neurospora crassa con genes mamíferos y elementos endógenos transcripcionales reguladores en la patente U.S. 5,695,965, y una cepa mejorada de Neurospora que tiene niveles reducidos de proteasa extracelular en la patente U.S. 5,776,730. Vectores para transformación de Neurospora están descritos en la patente U.S. 5,834,191. Takagi et al. describen un sistema de transformación para Rhizopus en la patente U.S. 5,436,158. Sisniega-Barroso et al. describen un sistema de transformación para hongos filamentosos en WO 99/51756, que emplea promotores de los genes de glutamato-deshidrogenasa de Aspergillus awamori. Dantas-Barbosa et al., FEMS Microbiol. Left. 1998 169:185-190, describen la transformación de Humicola grisea var. thermoidea para resistencia a la higromicina B, usando bien el método de acetato de litio o bien electroporación.

Entre los sistemas de expresión fúngica más exitosos están estos de Aspergillus y Trichoderma, por ejemplo como se describe por Berka et al. en la patente U.S. 5,578,463; véase también Devchand y Gwynne, J. Biotechnol. 17:3-9 (1991) y Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:1-11 (1997). Ejemplos de cepas transformadas de Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris y Sporotrichum cellulophilum están presentados en WO 96/02563 y las patentes U.S. 5,602,004, 5,604,129 y 5,695,985, que describen inconvenientes determinados de los sistemas de Aspergillus y de Trichoderma y sugieren que otros hongos pueden ser más adecuados en la producción de proteínas a gran escala.

Los métodos para la transformación de filos distintos de los Ascomycetes son conocidos en la técnica; véase por ejemplo Munoz-Rivas et al., Mol. Gen. Genet. 1986 205:103-106 (Schizophyllum commune); van de Rhee et al., Moll. Gen. Genet. 1996 250:252-258 (Agaricus bisporus); Aenau et al., Mol. Gen. Genet. 1991 225:193-198 (Mucor circinelloides); Liou et Al., BioSci. Biotechnol. Biochem. 1992 56:1503-1504 (Rhizopus niveus); Judelson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 1991 4:602-607 (Phytophthora infestans); y de Groot et al., Nature Biotechnol. 1998 16:839-842 (Agaricus bisporus).

Además de los métodos usuales de transformación de hongos filamentosos, tal como por ejemplo la fusión de protoplastos, Chakraborty y Kapoor, Nucleic Acids Res. 18:6737 (1990) describen la transformación de hongos filamentosos por electroporación. De Groot et al., en Nature Biotechnol. 16: 839-842 (1998), describen la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de diferentes hongos filamentosos. La introducción biolística de ADN en hongos ha sido realizada; véase por ejemplo Christiansen et al., Curr. Genet. 29:100-102 (1995); Durand et al., Curr. Genet. 31:158-161 (1997); y Barcellos et al., Can. J. Microbiol. 44:1137-1141 (1998). El uso de partículas magnéticas para la transfección "magneto-biolistica" de células está descrito en las patentes U.S. 5,516,670 y 5,753,477, y está previsto que sea aplicable para hongos filamentosos.

Es evidente que se ha hecho mucho trabajo para desarrollar sistemas de expresión usando hongos como huéspedes. No obstante, los huéspedes fúngicos comunes son todos hongos filamentosos, que tienden a formar esteras enredadas de micelios en cultivos no agitados, y cultivos en suspensión altamente viscosos (sumergidos) en biorreactores de tanque agitado. Estas propiedades de hongos filamentosos también causan algunos problemas en la producción industrial de enzimas en células huéspedes fúngicas. Por ejemplo, la alta viscosidad y/o la formación local de agregados densos de micelios, conduce a dificultades en agitación, ventilación, y difusión de nutrientes. En general, los hongos filamentosos no son capaces de microinyectar cultivos de suspensión en placas de microtitulación, debido a la viscosidad de los cultivos. Además, debido a los micelios enredados, un cultivo de un hongo filamentoso típico que expresa un banco de ADN no es fácilmente separado en clones separados a gran escala, lo que previene la evaluación de los genotipos individuales como sería requerido en un sistema de ensayos de alto rendimiento.

Los hongos filamentosos típicos, en ausencia de agitación constante, tienden a crecer en forma de esteras en la superficie de un medio de cultivo líquido, dónde éstos producen esporas aéreas. Ellos generalmente no esporulan cuando están en cultivo sumergido. Ambas propiedades presentan obstáculos sustanciales al cultivo de clones filamentosos fúngicos en placas de mircotitulación, y a la manipulación eficaz y uso de tales cultivos para la selección de alto rendimiento. Las esporas suspendidas u otros elementos competentes serán reproductivamente adecuados para la separación y distribución en pocillos de microtitulación individuales, mientras que la producción de esporas aéreas llevarán a la contaminación cruzada de pocillos de microtritulación si se permite que se formen las esteras de superficie. La agitación del medio en los pocillos de microtritulación, hasta la extensión necesaria para prevenir la formación de esteras, no es realizable. Además del problema de las esporas aéreas difíciles de controlar, las esteras de superficie interfieren con ligera transmisión, haciendo muchos ensayos (en particular ensayos de absorbencia espectrofotométrica) difíciles o imposibles. Las esteras de superficie también interferen con procesos tales como oxigenación, adición de reactivos y nutrientes, e inyección por pipeta.

La influencia de morfología fúngica en las propiedades físicas del cultivo ha sido reconocida, y las cepas naturales que tienen morfología más favorable han sido identificadas, como se describe por ejemplo por Jensen y Boominathan en la patente U.S. 5,695,985. La distribución homogénea de micelios sueltos, con ramificación pronunciada, fue descrita como una morfología particularmente deseable. Schuster y Royer, en la solicitud de patente internacional WO 97/26330 y la patente estadounidense 6,184,026, sugieren un método similar de células micóticas de identificación que tienen una morfología más adecuada para la producción industrial de proteínas heterólogas. El método comprende la selección de mutantes de una línea celular fúngica parental, mejor que cepas de tipo salvaje, para encontrar una morfología específica alterada, transformando el mutante, y evaluando si un cultivo del mutante transformado produce más proteína heteróloga que la línea celular parental. Mutantes con al menos un 10% de ramificación hifal superior son particularmente reivindicados. El método está ilustrado para cepas de Trichoderma, Fusarium y Aspergillus, y está sugerido para ser aplicable para otros numerosos géneros.

El efecto de frecuencia de ramificación en viscosidad de cultivo de mutantes de Aspergillus oryzae fue examinado por Bocking et al., Biotechnol. Bioeng. 65:638-648 (1999); cepas más altamente ramificadas presentaron viscosidad inferior en este estudio. Van Wezel et al., en la solicitud de PCT WO 00/00613, describen métodos para reducir la ramificación y/o aumentar la fragmentación de microorganismos filamentosos, por los cuales la viscosidad del cultivo es reducida. El método implica transfomar los microorganismos con el gen de SsgA de Streptomyces griseus. El método está demostrado en bacterias filamentosas del orden de los Actinomycetales, pero está establecido que sean aplicables para hongos filamentosos. Dunn-Coleman et al., en WO 00/56893, describen un mutante HbrA2 de A. nidulans, que muestra un fenotipo hiperramificado cuando crece por encima de 42ºC, y observaron una relación lineal entre el grado de ramificación hifal y la viscosidad del cultivo.

Muchos esfuerzos previos en el campo de sistemas de expresión fúngica filamentosa han sido dirigidos a la identificación de cepas adecuadas para la producción industrial de enzimas, y en consecuencia la atención ha estado focalizada en la viscosidad del cultivo, estabilidad de la transformación, rendimiento de la proteína heteróloga por unidad de volumen, y rendimiento como un porcentaje de biomasa. Las bibliotecas de ADN han sido expresadas en hongos; veéase por ejemplo Gems y Clutterbuck, Curr. Genet. 1993 24:520-524, donde una biblioteca de Aspergillus nidulans fue expresada en A. nidulans y Gems et al., Mol. Gen. Genet. 1994 242:467-471 donde una biblioteca genómica de Penicillium fue expresada en Aspergillus. Ninguno de estos informes describió o sugirió la selección de las proteínas expresadas; fue a través de complementación de alelos mutantes en el huésped que la expresión de genes de la biblioteca de ADN fue demostrada. El método de complementación requiere un huésped mutante específico para cada actividad de proteína exógena que se desea detectar, y no proporciona una herramienta para la selección general de bibliotecas.

La clonación de un gen de invertasa de Aspergillus niger por expresión en Trichoderma reesei fue descrita por Berges et al., Curr. Genet. 1993 24:53-59. Usando una biblioteca genómica de A. niger construida en un vector de cósmido conteniendo un marcador seleccionable, y usando como huésped T. reesei (que es incapaz de utilizar sacarosa), un gen de invertasa de A. niger fue clonado por un procedimiento de selección familiar. Aquí, nuevamente, una característica muy específica del huésped fue requerida para detectar la presencia de una única proteína exógena expresada, y la selección de la biblioteca genómica no fue descrita o permitida.

WO93/11249 describe un método para clonar proteínas en huéspedes de levadura de modo que las proteínas son segregadas desde la célula huésped.

WO99/32617 se refiere a la expresión de ADN en huéspedes filamentosos fúngicos para identificar proteínas de interés. El método implica propagación en medios sólidos y no es corregible para selección de alto rendimiento.

Las características de una célula huésped fúngica adecuada para la expresión de una biblioteca de ADN son diferentes en muchos aspectos a partir de las características de huéspedes adecuados para la producción de proteínas industriales. En términos generales, un huésped adecuado fúngico para selección de alto rendimiento debería reunir numerosos criterios; entre éstos se encuentran los siguientes:

-: el huésped debe ser transformado con alta eficiencia.

-: el huésped debe procesar genes conteniendo intrones y efectuar cualquier empalme necesario.

-: el huésped debe procesar postraduccionalmente la proteína expresada de modo que sea producido en una forma activa.

-: cuando la biblioteca debe ser evaluada para una proteína, el huésped debe producir la proteína en rendimiento alto suficiente para la detección por el ensayo.

-: el huésped debería aceptar una variedad de elementos reguladores de la expresión, para facilidad de uso y versatilidad.

-: el huésped debería permitir el uso de marcadores seleccionables fácilmente.

-: los cultivos de célula huésped deberían ser de viscosidad baja.

-: el huésped debería ser deficitario de proteasas y/o ser asequible para la supresión de expresión de proteasa.

-: el huésped debe permitir selecciones para una amplia variedad de actividades o propiedades de proteínas exógenas.

-: las hifas en un cultivo del hongo huésped no deberían estar tan enredadas para prevenir el aislamiento de clones individuales, y no deberían estar tan enredadas para aumentar la viscosidad hasta el punto de prevenir una transferencia y replicación eficaces en un formato de selección miniaturizado de alto rendimiento (p. ej. por micropipetado).

-: el huésped no debería formar esteras de superficie, sino que debería preferentemente crecer como un cultivo sumergido.

-: el huésped debería permitir la producción eficaz de esporas sumergidas u otros propágulos bajo las condiciones de crecimiento proporcionadas en la selección de alto rendimiento.

En los casos donde los metabolitos están siendo seleccionados, sería ventajoso si las células huéspedes segregan los metabolitos en el medio, donde estos podrían ser fácilmente detectados y/o evaluados. Idealmente, el huésped debería segregar sólo la proteína exógena.

En los casos donde una proteína está siendo evaluada, sería particularmente ventajoso si el huésped también expresa suficiente proteína heteróloga para permitir el aislamiento y purificación de la proteína. Una célula huésped con esta característica permitirá además caracterizar todas las proteínas heterólogas de interés simplemente cultivando las células huéspedes, sin las manipulaciones biológicas moleculares tediosas necesarias para transferir el gen a otro organismo. Preferiblemente, el huésped debería ser capaz de segregar la proteína, puesto que esto permitiría ensayos más fiables y más variados.

También sería ventajoso que la célula huésped fuera asequible para preparar el aislamiento del ADN heterólogo, de modo que estudios posteriores y modificaciones del gen mismo puedan ser realizados.

Además de estas cualidades del huésped, el sistema de transformación debería también presentar ciertas características. La frecuencia de transformación debería ser suficientemente alta para generar los números de transformantes requeridos para selecciones significativas. Idealmente, la expresión de la proteína exógena estará inducida por un único inductor, por una única vía, que actúa en un único promotor.

Hasta el momento, ninguna combinación de células huéspedes y sistema de transformación ha sido desarrollado que reúna todos, o incluso más, de estos criterios. En consecuencia, permanece una necesidad de célula huésped fúngica y sistemas de transformación que sean capaces de expresar eficazmente los productos genéticos de una biblioteca de ADN, especialmente bibliotecas de ADN genómico y/o genómico eucariótico.

Breve descripción de la invención

La presente invención emplea hongos filamentosos que producen "elementos reproductivos transferibles" cuando crecen en cultivo sumergido. Por "elemento reproductivo transferibile" se entiende una espora, propágulo, fragmento hifal, protoplasto, microgránulo, u otro elemento fúngico es decir (1) fácilmente separado de otros elementos de este tipo en el medio de cultivo, y (2) capaz de reproducirse él mismo en un cultivo monoclonal. Los hongos preferiblemente también muestran un fenotipo filamentoso menos pronunciado y/o una morfología de crecimiento compacto, y producen cultivos de viscosidad baja que son adecuados para las manipulaciones físicas implicadas en la selección de bibliotecas de ADN de alto rendimiento. Particularmente preferidos son los hongos filamentosos que, incluso en la ausencia de agitación, tienden a crecer como cultivos sumergidos mejor que como esteras de superficie.

La presente invención toma ventaja de las propiedades del sistema de transformación descrito en solicitudes de patente internacionales PCT/NL99/00618 y PCT/EP99/202516. Estas aplicaciones describen un sistema de transformación eficaz para huéspedes filamentosos fúngicos tales como Cluysosporium lucknowense y Aspergillus sojae. Estas aplicaciones también revelan que cepas mutantes son fácilmente preparadas que retienen todas las ventajas de las células huéspedes tipo salvaje, pero que han perdido parcialmente su fenotipo filamentoso y por lo tanto proporcionan cultivos de baja viscosidad.

Los hongos preferidos para el uso en la invención expresan y segregan cantidades grandes de proteína exógena, que producen una alta proporción de proteína/biomasa respecto a los huéspedes fúngicos filamentosos previamente conocidos. La invención proporciona un sistema de transformación que muestra rendimientos altos de transformantes. La invención también proporciona bibliotecas de hongos transformantes que expresan eficazmente los productos de proteínas de insertos de ADNc heterólogo, y especialmente insertos de ADN genómico. En otro aspecto de la invención, las bibliotecas de hongos transformados pueden ser usados para la selección de actividades o propiedades de las proteínas heterólogas, o para la selección de metabolitos producidos por los hongos transformados como una consecuencia de actividades de la proteína exógena, o para la selección del ADN heterólogo o para transcripciones de ARN derivadas del mismo. Será apreciado que la presente invención también permite la selección de alto rendimiento de metabolitos de cepas no transformadas que tienen las características fenotípicas anteriormente descritas.

El término "hongo filamentoso mutante" como se utiliza en este caso se refiere simplemente a hongos no encontrados en la naturaleza. Las "mutaciones" que llevan a características fenotípicas deseables, tales como una forma de crecimiento compacta, viscosidad baja, niveles de proteasa reducidos, crecimiento sumergido, etc., pueden ser introducidas de forma aleatoria por medios bien tradicionales, tales como irradiación UV y mutagénesis química, o por métodos moleculares biológicos tales como mutagénesis de "cassette", o pueden ser deliberadamente introducidas por métodos de ingeniería genética. Si se encontrara que un hongo natural posee las propiedades necesarias, por supuesto será utilizable en los métodos de la invención.

En otro aspecto adicional de la invención, las bibliotecas de hongos transformados pueden ser seleccionadas para propiedades útiles de los hongos ellos mismos, tales como por ejemplo niveles altos de producción de una proteína o metabolito expresado particular. Este aspecto de la invención está ilustrado por un ensayo cuantitativo para la proteína expresada de interés, donde el transformante particular que tiene la combinación más favorable de producción de proteína, procesamiento de proteína, y secreción de proteína sería detectado.

En otro aspecto de la invención, las bibliotecas de hongos transformados pueden ser seleccionadas por la presencia de secuencias de ADN capaces de hibridarse con una sonda de ácidos nucleicos de interés.

Descripción de las figuras

Figura 1 es una prueba de Western blot como se describe en los ejemplos.

Figura 2 es un mapa pUT720.

Figura 3 es un mapa pUT970G.

Figura 4 es un mapa pUT1064.

Figura 5 es un mapa pUT1 065.

Figura 6 es un mapa pF6g.

Figura 7 es un mapa pUT1150.

Figura 8 es un mapa pUT1152.

Figura 9 es un mapa pUT1155.

Figura 10 es un mapa pUT1160.

Figura 11 es un mapa pUT1162.

Figura 12 es la estructura esquemática de la proteína pclA.

Figura 13A es una microfotografía de Aspergillus niger de tipo salvaje.

Figura 13B es una microfotografía de un mutante pclA de Aspergillus niger.

Figura 14A es una microfotografía de Aspergillus sojae tipo salvaje.

Figura 14B es un microfotografía de un mutante pclA de Aspergillus sojae.

Figuras 15A-E presentan los resultados de secuenciación del gen pyrE. El subrayado indica que la secuencia de aminoácidos no es continua debido a algunas incertidumbres de secuencia. Los aminoácidos indicados son los más probables. La letra negrita indica intrones putativos/probables.

Descripción detallada de la invención

En su aspecto más amplio, la invención se refiere a hongos filamentosos transformados que generan elementos reproductivos transferibles en suspensión, a bibliotecas de hongos de este tipo, y a métodos de selección de bibliotecas de este tipo por las propiedades biológicas de interés, tal como actividad bioquímica o biológica asociada a proteínas expresadas exógenas o asociadas a metabolitos, es decir, productos de molécula pequeña producidos por enzimas endógenas y/o exógenas. La biblioteca de hongos filamentosos de baja viscosidad comprende hongos que contienen secuencias de ácidos nucleicos, cada secuencia de ácidos nucleicos codificando una proteína heteróloga, cada una de dichas secuencias de ácidos nucleicos estando operativamente enlazadas a una región reguladora de la expresión y opcionalmente una secuencia de codificación de señal de secreción y/o una secuencia codificadora de proteína transportadora. Preferiblemente una cepa transformada según la invención segregará la proteína
heteróloga.

Los métodos de expresión y de selección de la invención, y los hongos empleados en los mismos, son útiles para producir hongos, proteínas, metabolitos, y moléculas de ADN que tienen utilidad en una variedad de aplicaciones. Los métodos de la invención son también útiles para producir información sobre la secuencia de ácidos nucleicos y de proteínas, y esta información misma está considerada como un producto valioso de los métodos reivindicados.

Hongos preferidos filamentosos de la invención están caracterizados por la viscosidad baja del medio de cultivo. Mientras que un hongo filamentoso típico de grado industrial producirá cultivos con viscosidades bien sobre 200 centipoise (cP) y normalmente sobre 1.000 cP, y pueden alcanzar 10.000 cP, los hongos de esta invención muestran una viscosidad de cultivo inferior a 200 cP, preferiblemente inferior a 100 cP, más preferiblemente inferior a 60 cP, y de la forma más preferible inferior a 10 cP después de 48 o más horas de cultivo en presencia de nutrientes adecuados bajo condiciones de crecimiento óptimas o casi óptimas. Los hongos filamentosos de la invención normalmente muestran una morfología caracterizada por hifas, o microgránulos, cortas, específicas, no enredadas. Los microgránulos son colecciones ligeramente o no enredadas de hifas que surgen de un único clon, tan diferentes de los granulados que son mucho más grandes y son derivados de clones múltiples enredados. Por ejemplo, la cepa mutante UV 18-25 Chrysosporium lucknowense (viscosidad < 10 cP) y la cepa mutante X-252 de Trichoderma longibrachiatum morfológicamente similar (viscosidad < 60 cP) están caracterizadas por la presencia de hifas cortas, diferentes, no enredadas entre 100 y 200 micras en longitud, y la pclA mutante de Aspergillus sojae de viscosidad baja creada genéticamente está caracterizada por una forma compacta con ramificaciones considerables e hifas cortas (véase Fig. 14). Mientras que los hongos de viscosidad baja descritos en WO97/26330 están descritos como que tienen "ramificaciones hifales más extensas", algunos hongos de la presente invención tienen ramificaciones hifales equivalentes o incluso ligeramente reducidas cuando se compara con las cepas no mutantes. Se obtiene como resultado que la longitud hifal juega el papel dominante en el control de la viscosidad del cultivo.

Las cepas particularmente preferidas fúngicas están caracterizadas por el hecho de que tienen una alta proporción exógena de proteína segregada/biomasa. Esta proporción es preferiblemente mayor que 1:1, más preferiblemente mayor que 2:1, e incluso más preferiblemente 6:1 o superior. De la forma más preferible, la proporción es 8:1 o mayor. Estas proporciones altas son ventajosas en un medio ambiente de selección de alto rendimiento, porque éstas suponen una concentración más alta de proteína exógena, permitiendo ensayos de selección más sensibles y/o más rápidos. Esto es de beneficio particular puesto que el volumen de la solución de ensayo se reduce, por ejemplo de placas de 96 pocillos a placas de 384 pocillos, y por consiguiente a placas de 1536 pocillos. Los métodos de la presente invención son adecuados para cualquiera de estos formatos de placa de microtitulación, y para otros muchos formatos HTS que utilizan muestras líquidas.

Está contemplado que cualquier hongo filamentoso puede ser convertido, por los procesos de mutación descritos aquí, en cepas mutantes adecuadas para el uso en la presente invención. Entre los géneros preferidos de hongos filamentosos están el Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Cryplococcus, Acremonium, Tolypocladium, Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola, y Trichoderma, y anamorfos y teleomorfos de los mismos. Más preferidos son Chrysosporium, Trichoderma, Aspergillus, y Fusarium. Muy preferido es Chrysosporium. El género y especies de hongos pueden ser definidos por morfología consistente con aquella descrita en Barnett y Hunter, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3rd Edition, 1972, Burgess Publishing Company. Una fuente que proporciona detalles en lo que se refiere a la clasificación de hongos del género Chrysosporium es Van Oorschot, C.A.N. (1980) "A revision of Chrysosporium and allied genera" en Studies in Mycology No. 20, Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baam, The Netherlands, págs. 1-36. Según estas instrucciones el género de Chrysosporium cae dentro de la familia Moniliaceae que pertenece al orden Hyphomycetales.

Otra fuente preparada de suministro de información en la nomenclatura fúngica son los depositarios del Tratado de Budapest, especialmente aquellos que suministran bases de datos online (las siguientes direcciones de internet emplean el protocolo http). La ATCC (US) proporciona información a www.atcc.org, el CBS (NE) a www.cbs.knaw.nl, y el VKM (RU) a www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/general. Otra fuente es NT.ars-grin.gov/fungaldatabases. Todas estas instituciones pueden proporcionar teorias sobre las características distintivas de especies fúngicas. Una taxonomía alterna del Ascomycota puede ser encontrada en www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Undef&id=
4890. Según esta taxonomía alterna, el género Chrysosporium pertenece a la familia Onygenaceae, orden Onygenales, filo Ascomycota.

La definición de Chrysosporium incluye pero no está limitada a estas cepas: C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. farinicola, C. fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. globiferum, C. globiferum var. articulatum, C. globiferum var. niveum, C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. pseudomerdarium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undulatum, C. vallenarense, C. vespertilium, C. zonatum.

C. lucknowense es una especie de Chrysosporium es decir de interés particular puesto que ha proporcionado un productor natural elevado de proteínas de celulasa (solicitudes internacionales WO 98/15633, PCT/NL99/00618, y patentes U.S. 5,811,381 y 6,015,707). Las cepas con números de registro de depositario internacional ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77, CBS 272.77, y VKM F-3500D son ejemplos de cepas de Chrysosporium lucknowense. También incluidas dentro de la definición de Chrysoporium se encuentran las cepas derivadas de predecesores de Chrysoporium incluso de aquellas que han mutado bien naturalmente o por mutagénesis inducida. Los métodos de la invención, en una forma de realización, emplean mutantes de Chrysosporium, obtenidos por una combinación de mutagénesis inducida por irradiación y químicamente, que tienden a producir elementos reproductivos transferibles en suspensión, y que muestran una morfología caracterizada por hifas cortas, específicas, no enredadas ("crecimiento compacto"), y un fenotipo caracterizado por un crecimiento sumergido y viscosidad reducida del medio de fermentación cultivado en suspensión. En otra forma de realización, la invención emplea mutantes fenotípicamente similares de Trichoderma. En otras formas de realización la invención emplea mutantes fenotípicamente similares de Aspergillus sojae o Aspergillus niger.

Por ejemplo, VKM F-3500D (cepa "C1") fue mutagenizada sometiéndola a luz ultravioleta para generar la cepa UV13-6. Esta cepa fue posteriormente mutada adicionalmente con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina para generar la cepa NG7C-19. Esta última cepa sucesivamente fue sometida a mutación por luz ultravioleta dando como resultado la cepa UV18-25 (VKM F-3631 D). Durante este proceso de mutación las características morfológicas variaron un tanto en cultivo en líquido o en placas al igual que bajo el microscopio. Con cada mutagénesis sucesiva los cultivos mostraron menos apariencia esponjosa y afieltrada en placas que están descritas como siendo características de Chrysosporium, hasta que las colonias lograron una apariencia plana y esterada. Un pigmento marrón observado con la cepa de tipo salvaje en algunos medios fue menos predominante en cepas mutantes. En cultivo líquido el mutante UV18-25 fue evidentemente menos viscoso que la cepa de tipo salvaje C1 y los mutantes UV13-6 y NG7C-19. Mientras que todas las cepas mantuvieron las características microscópicas gruesas de Chrysosporium, los micelios se volvieron más estrechos con cada mutación sucesiva y con UV 18-25 se pudo observar una fragmentación diferente de los micelios. Esta fragmentación micelial es posible que sea una causa de la viscosidad inferior asociada a los cultivos de UV18-25. La capacidad de las cepas para esporulación aérea disminuyó con cada fase mutagénica. Estos resultados demuestran que una cepa puede pertenecer genéticamente al género Chrysosporium mientras que presenta desviaciones de las definiciones taxonómicas tradicionales (morfológicas).

En particular la forma anamorfa de Chrysosporium ha sido encontrada como adecuada para la aplicación de la selección según la invención. El metabolismo del anamorfo lo vuelve particularmente adecuado para un alto grado de expresión. Un teleomorfo debería también servir como el carácter genético de los anamorfos y el de los teleomorfos es idéntico. La diferencia entre anamorfo y teleomorfo es que uno es el estado asexual y el otro es el estado sexual; los dos estados exhiben morfología diferente bajo ciertas condiciones.

Otro ejemplo plasma las cepas mutantes creadas genéticamente a partir de Aspergillus sojae. En uno de estos mutantes un gen codificante de endoproteasa específico fue interrumpido. Esto resultó en un fenotipo de crecimiento compacto que exhibe una ramificación mejorada e hifas cortas, y la formación de microgránulos en cultivo sumergido. Además, la Aspergillus sojae a la que se hace referencia en esta aplicación puede ser inducida a exhibir esporulación eficaz bajo condiciones de cultivo sumergido específicas, que la vuelven especialmente adecuada para el uso en un sistema de selección de alto rendimiento. En este caso, las condiciones propicias para la formación de los elementos reproductivos transferibles simplemente consistieron en un medio sintético que contiene 0,6 g/ml de EDTA. Las condiciones propicias variarán de un huésped a otro, pero es evidente que las condiciones ya serán conocidas si se encuentra que un huésped es adecuado.

Es preferible usar cepas fúngicas no toxigénicas y no patógenas, de las cuales un número es conocido en la técnica, puesto que esto reducirá riesgos al profesional y simplificará el proceso de selección global. En una forma de realización preferida los hongos también serán deficitarios de proteasa, para minimizar la degradación de las proteínas exógenas, y/o susceptible de supresión de producción de proteasa. El uso de cepas deficitarias de proteasa como huéspedes de expresión es bien conocido; véase por ejemplo solicitud PCT WO 96/29391. Las cepas deficitarias de proteasa pueden ser producidas mediante selección de mutantes, o el(los) gen(es) de proteasa puede(n) ser "bloqueados" o por lo contrario inactivado por métodos conocidos en la técnica, como se describe por ejemplo por Christensen y Hynes en la patente US 6,025,185 (Aspergillus oryzae con gen areA no funcional).

Se ha descubierto que los mutantes de Chrysosporium pueden ser hechos de manera que tengan una expresión reducida de proteasa, así haciéndolos incluso más adecuados para la producción de productos proteínicos, especialmente si el producto proteínico es sensible a la actividad proteasa. Por lo tanto, la invención puede también emplear una cepa mutante de Chrysosporium que produce menos proteasa que la cepa de Chrysosporium no mutante, por ejemplo menos que la cepa C1 de C. lucknowense (VKM F-3500 D). En particular la actividad proteasa (más que cualquier proteasa selectiva destinada a disociar una proteína de fusión segregada) de tales cepas es inferior a la mitad de la cantidad, más preferiblemente menos del 30% de la cantidad, y de la forma más preferible menos de aproximadamente el 10% de la cantidad producida por la cepa C1. La actividad proteasa disminuida puede ser medida por métodos conocidos, tal como midiendo el halo formado en placas de leche desnatada o por degradación de la albúmina de suero bovino (BSA).

Puede ser deseable inactivar otros genes en el hongo filamentoso huésped, tales como por ejemplo aquellos que codifican celulasas y otras proteínas segregadas en gran medida, para minimizar la interferencia en el ensayo por proteínas huésped. Los genes que codifican proteínas segregadas pueden ser delecionados o mutados, o de forma alternativa los genes que controlan el sistema de inducción u otras rutas implicadas en la expesión de proteínas indeseadas pueden ser modificados de tal manera que se reduzca tal expresión. Cuando un promotor endógeno es empleado en los vectores de la invención (véase abajo), puede ser especialmente deseable inactivar genes para otras proteínas bajo el control del mismo inductor. Los hongos susceptibles de supresión de secreción de proteasa son aquellos donde la expresión de proteasa está bajo el control de un elemento regulador que responde a las condiciones medioambientales, de manera que estas condiciones (p. ej., concentración de aminoácidos) puede ser manipulada para minimizar la producción de proteasa.

Preferiblemente una región reguladora de la expresión homóloga que permite la expresión elevada en el huésped seleccionado es empleada en el vector de transformación. Las regiones que regulan la expresión elevada derivadas de un huésped heterólogo, tal como de Trichoderma o Aspergillus, son bien conocidas en la técnica y pueden también ser usadas. A modo de ejemplo, y no de limitación, ejemplos de proteínas conocidas para ser expresadas en cantidades grandes y por lo tanto que proporcionan secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para el uso en la presente invención son hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa, pectinasa, esterasa, beta-galactosidasa, celulasa (p. ej. endoglucanasa, celobiohidrolasa) y poligalacturonasa.

Una región reguladora de la expresión comprende una secuencia del promotor operativamente enlazada a una secuencia de ácidos nucleicos que codifican la proteína que debe ser expresada. El promotor es enlazado de manera que la posición enfrente del codón iniciador de la secuencia que debe ser expresada permite la expresión. La secuencia del promotor puede ser constitutiva pero preferiblemente es inducible. El uso de un promotor inducible y los medios de inducción apropiados favorecen la expresión de genes operativamente enlazados al promotor. Cualquier secuencia reguladora de la expresión procedente de una especie homóloga, o de una cepa heteróloga capaz de permitir la expresión de una proteína, está prevista. La secuencia reguladora de la expresión es de manera adecuada una región reguladora de la expresión fúngica, p. ej. una región reguladora de ascomycete. De manera adecuada la región reguladora de la expresión de ascomycete es una región reguladora de cualquiera de los géneros siguientes: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Humicola, Neurospora, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Talaromyces, o formas sexuales alternativas de las mismas tales como Emericela e Hypocrea. El promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma; promotores de alcohol-deshidrogenasa A, alcohol-deshidrogenasa R, glutamato-deshidrogenasa, TAKA amilasa, glucoamilasa, y gliceraldehído fosfato deshidrogenasa de Aspergillus; promotores de fosfoglicerato y de control de ruta cruzada de Neurospora; promotor de lipasa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei; promotor de beta-galactosidasa de Penicillium canescens; y promotores de celobiohidrolasa, endoglucanasa, xilanasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa A, y proteasa de Chrysosporium son ejemplos representativos. Una secuencia reguladora de la expresión del mismo género que la cepa huésped es preferible, puesto que es más posible que sea adaptada específicamente al huésped.

Secuencias reguladoras de la expresión naturales de cepas de Chrysosporium que expresan proteínas en cantidades extremadamente grandes, son particularmente preferidas. Ejemplos de tales cepas han sido depositados conforme al tratado de Budapest con el instituto depositario All Russian Collection (VKM) en Moscú. La cepa C1 tipo salvaje tiene el número VKM F-3500 D, fecha de depósito 29-08-1996, el mutante de C1 UV13-6 fue depositado con el número VKM F-3632 D, y la fecha de depósito 02-09-1998, el mutante de C1 NG7C-19 fue depositado con el número VKM F-3633 D y fecha de depósito 02-09-1998 y el mutante de C1 UV18-25 fue depositado con el número VKM F-3631 D y fecha de depósito 02-09-1998. Estas cepas son también preferidas como fuentes para la generación de mutantes de viscosidad baja; de hecho la cepa VKM F-3631 D ya muestra el fenotipo de viscosidad baja necesario. Una cepa mutante de Trichoderma de viscosidad baja, designada X-252, se obtuvo después de dos ciclos de irradiación de Trichoderma longibrachiatum 18.2KK, que a su vez fue derivado por mutación de la cepa QM 9414 de T. longibrachiatum (ATCC 26921). En otras formas de realización la invención emplea mutantes fenotípicamente similares de Aspergillus sojae y Aspergillus niger.

Preferiblemente, allí donde el huésped es una Chrysosporium, una secuencia del promotor de Chrysosporium es empleada para asegurar un buen reconocimiento de la misma por el huésped. Ciertas secuencias heterólogas reguladoras de la expresión también funcionan tan eficazmente en Chrysosporium como en secuencias de Chrysosporium nativas. Esto permite el uso de constructos y vectores bien conocidos para la transformación de Chrysosporium, y ofrece muchas otras posibilidades para construir vectores que permiten buenos índices de transformación y de expresión en este huésped. Por ejemplo, las técnicas de transformación de Aspergillus estándar pueden ser usadas como se describe por ejemplo por Christiansen et al. en BiolTechnology 1988 6:1419-1422. Otros documentos que proporcionan detalles de vectores de transformación de Aspergillus, p. ej. patentes US 4,816,405, 5,198,345, 5,503,991, 5,364,770, 5,705,358, 5,728,547, y 5,578,463, EP-B-215,594 (también para Trichoderma).

Como se han observado índices de expresión extremadamente altos para celulasa en cepas de Chrysosporium, las regiones que regulan la expresión de genes de celulasa son particularmente preferidos.

Los vectores de la invención pueden comprender una secuencia del promotor derivada de un gen que codifica una enzima, preferiblemente una enzima segregada. Ejemplos de enzimas adecuadas de las cuales pueden tomarse las secuencias del promotor son las enzimas degradadoras de carbohidratos (p. ej., celulasas, xilanasas, mananasas, manosidasas, pectinasas, amilasas, p. ej. glucoamilasas, \alpha-amilasas, \alpha- y \beta-galactosidasas, \alpha- y \beta-glucosidasas, \beta-glucanasas, quitinasas, quitanasas), proteasas (endoproteasas, amino-proteasas, amino- y carboxipeptidasas), otras hidrolasas (lipasas, esterasas, fitasas), oxidorreductasas (catalasas, glucosa-oxidasas) y transferasas (transglicosilasas, transglutaminasas, isomerasas e invertasas). Diferentes ejemplos de Chrysosporium lucknowense están presentados en la tabla A.

Un constructo de ácidos nucleicos preferiblemente comprenderá una región reguladora de la expresión de ácidos nucleicos de Chrysosporium, más preferiblemente de Chrysosporium lucknowense o un derivado, operativamente enlazada a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que debe ser expresada. Constructos de ácidos nucleicos particularmente preferidos comprenderán una región reguladora de la expresión de Chrysosporium asociada a la expresión de celulasa o xilanasa, preferiblemente a la expresión de celobiohidrolasa, de la forma más preferible a la expresión de la celobiohidrolasa de 55 kDa (CBH1) descrita en la tabla A. Como ejemplos adicionales, las secuencias del promotor de Chrysosporium de hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa, esterasa, pectinasa, beta-galactosidasa, celulasa (p. ej. endoglucanasa, celobiohidrolasa) y poligalacturonasa están también consideradas dentro del campo de la invención.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA A Características de enzimas seleccionadas de Chrysosporim lucknowense

1

2

Cualquiera de los promotores o regiones reguladoras de la expresión de enzimas descritas en la tabla A, por ejemplo, pueden ser empleados de manera adecuada. Las secuencias de ácidos nucleicos de estos promotores y regiones reguladoras pueden rápidamente ser obtenidas de una cepa de Chrysosporium. Los métodos por los que las secuencias del promotor pueden ser determinadas son numerosos y bien conocidos en la técnica. Las secuencias del promotor son generalmente encontradas inmediatamente delante del codón de iniciación ATG al principio del gen pertinente. Por ejemplo, las secuencias del promotor pueden ser identificadas delecionando secuencias corriente arriba del gen pertinente, usando técnicas de ADN recombinante, y examinando los efectos de estas deleciones en la expresión del gen. También, por ejemplo, las secuencias del promotor pueden frecuentemente ser inferidas comparando la secuencia de regiones corriente arriba del gen pertinente con secuencias del promotor de consenso.

Por ejemplo, las secuencias del promotor de endoglucanasas de C1 fueron identificadas de esta manera (véase PCT/NL99/00618) por clonación de los genes correspondientes. Los promotores preferidos según la invención son los promotores de celobiohidrolasa (CBH1) de 55 kDa, de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa A, y de xilanasa (XyIF) de 30 kDa de Chrysosporium, puesto que estas enzimas son expresadas en un nivel alto por sus propios promotores. Los promotores de las enzimas degradadoras de carbohidratos de Chrysosporium lucknowense en particular, especialmente C. lucknowense GARG 27K, pueden ser usadas ventajosamente para expresar bibliotecas de proteínas en otros organismos huéspedes fúngicos.

Formas de realización particulares de las secuencias de ácidos nucleicos según la invención son conocidas para Chrysosporium, Aspergillus y Trichoderma. Los promotores para Chrysosporium están descritos en PCT/NL99/00618. La técnica anterior proporciona varias regiones de regulación de la expresión para el uso en Aspergillus, p. ej. patentes U.S. 4,935,349, 5,198,345, 5,252,726, 5,705,358; y 5,965,384; y solicitud PCT WO 93107277. La expresión en Trichoderma se describe en la patente U.S. 6, 022,725.

El gen de hidrofobina es un gen fúngico que es altamente expresado. Se sugiere por lo tanto que la secuencia del promotor de un gen de hidrofobina, preferiblemente de Chrysosporium, puede ser de manera adecuada aplicada como secuencia reguladora de la expresión en una forma de realización adecuada de la invención. Las secuencias de genes de Trichoderma reesei y de Trichoderma harzianum para hidrofobina han sido descritas por ejemplo en la técnica anterior al igual que una secuencia de genes para Aspergillus fumigatus y Aspergillus nidulans y la información de la secuencia pertinente está incorporada por la presente como referencia (Nakari-Setala et al., Eur. J. Biochem. 1996, 235:248-255; Parta et al., Infect. Immun. 1994 62:4389-4395; Munoz et al., Curr. Genet. 1997, 32:225-230; y Stringer et al., Mol. Microbiol. 1995 16:33-44). Usando esta información de secuencia un experto en la técnica puede obtener las secuencias reguladoras de la expresión de genes de hidrofobina de Chrysosporium sin la experimentación indebida después de técnicas estándar tales como aquellas sugeridas arriba. Una cepa de Chrysosporium recombinante según la invención puede comprender una región reguladora de hidrofobina operativamente enlazada a la secuencia que codifica la proteína heteróloga.

Una secuencia reguladora de la expresión puede también adicionalmente comprender un intensificador o silenciador. Estos son también bien conocidos en la técnica anterior y están normalmente localizados a cierta distancia del promotor. Las secuencias reguladoras de la expresión pueden también comprender promotores con sitios de enlace activadores y sitios de enlace represores. En algunos casos tales sitios pueden también ser modificados para eliminar este tipo de regulación. Por ejemplo, promotores filamentosos fúngicos donde los sitios de creA están presentes han sido descritos. Los sitios de creA pueden ser mutados para asegurar que la represión de glucosa que normalmente resulta de la presencia de creA es eliminada. El uso de tal promotor habilita la producción de la biblioteca de proteínas codificada por las secuencias de ácidos nucleicos reguladas por el promotor en presencia de glucosa. El método es ejemplificado en WO 94/13820 y WO 97/09438. Estos promotores pueden ser usados bien con o sin sus sitios de creA. Los mutantes donde los sitios de creA han sido mutados pueden ser usados como secuencias reguladoras de la expresión en una cepa recombinante según la invención y la biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos regulada por ésta puede después ser expresada en presencia de glucosa. Tales promotores de Chrysosporium aseguran la desrepresión en una manera análoga a aquella ilustrada en WO 97/09438. La identidad de sitios de creA es conocida a partir de la técnica anterior. De forma alternativa, es posible aplicar un promotor con sitios de enlace de creA que no han sido mutados en una cepa huésped con una mutación en otro lugar en el sistema de represión p. ej. en el gen creA mismo, de modo que la cepa puede, sin importar la presencia de sitios de enlace de creA, producir la biblioteca de proteínas en presencia de glucosa.

Las secuencias del terminador son también secuencias reguladoras de la expresión y éstas están operativamente enlazadas a los terminales 3' de las secuencias que deben ser expresadas. Una variedad de terminadores fúngicos conocidos son posibles para ser funcionales en las cepas huéspedes de la invención. Ejemplos son el terminador trpC de A. nidulans, el terminador de alfa-glucosidasa de A. niger, el terminador de glucoamilasa de A. niger, el terminador de carboxil proteasa de Mucor miehei (véase US 5,578,463), y el terminador de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei. Las secuencias del terminador de Chrysosporium, p. ej. el terminador EG6, funcionará por supuesto bien en Chrysosporium.

Un vector de transformación adecuado para el uso según la invención puede opcionalmente tener las secuencias de ácidos nucleicos exógenas para ser expresadas operativamente enlazadas a una secuencia que codifica una secuencia señal. Una secuencia señal es una secuencia de aminoácidos que, cuando está operativamente enlazada a la secuencia de aminoácidos de una proteína expresada, habilita la secreción de la proteína del organismo huésped. Tal secuencia señal puede ser una asociada a una proteína heteróloga o puede ser una nativa al huésped. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia señal debe ser situada en marco para permitir la traducción de la secuencia señal y las proteínas heterólogas. Las secuencias señal serán particularmente preferidas cuando la invención está siendo usada en conjunción con la evolución molecular dirigida, y una única proteína exógena segregada está siendo desarrollada.

Será entendido que es menos ventajoso incorporar una secuencia señal en un vector que debe ser usado para expresar una biblioteca, puesto que esto reducirá la probabilidad de expresión de la proteína de interés. En una biblioteca genómica preparada por corte aleatorio del ADN y clonación en un vector, la probabilidad de que se obtenga una fusión en marco de un gen en la biblioteca con la secuencia señal es baja. También, incluso cuando una fusión dentro del marco de lectura ha sido obtenida, la secuencia señal elegida puede no funcionar con todos los genes. Por estas razones puede ser preferible no emplear una secuencia señal cuando se selecciona una biblioteca de ADN genómico, sino que mejor seleccionar la actividad o la presencia de una proteína exógena intracelular. El análisis de la actividad o presencia de proteínas intracelulares puede ser realizado pretratando la biblioteca transformante con enzimas que convierten las células micóticas en protoplastos, seguido de lisis. El procedimiento ha sido descrito por van Zeyl et al., J. Biotechnol. 59:221-224 (1997). Este procedimiento ha sido aplicado a Chrysosporium para permitir que la PCR de la colonia de transformantes de Chrysosporium crezca en placas de microtitulación.

Cualquier secuencia señal capaz de permitir la secreción de una proteína de una cepa de Chrysosporium está prevista. Tal secuencia señal es preferiblemente una secuencia señal fúngica, más preferiblemente una secuencia señal de Ascomycete. Las secuencias señal adecuadas pueden ser derivadas de eucariotas generalmente, preferiblemente de levaduras o de cualquiera de los géneros de hongos siguientes: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces o formas sexuales alternativas de las mismas tales como Emericella e Hypocrea. Secuencias señal que son particularmente útiles son aquellas originalmente asociadas a celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-galactosidasa, xilanasa, pectinasa, esterasa, hidrofobina, proteasa o amilasa. Ejemplos incluyen amilasa o glucoamilasa de Aspergillus o Humicola, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, \alpha-amilasa de Aspergillus niger, carboxil peptidasa de Mucor (US 5,578,463), una lipasa o proteinasa de Rhizomucor miehei, celobiohidrolasa de Trichoderma, beta-galactosidasa de CBH1 de Penicillium canescens de Chrysosporium, y el factor alfa de acoplamiento de
Saccharomyces.

De forma alternativa la secuencia señal puede ser de un gen de amilasa o de subtilisina de una cepa de Bacillus. Una secuencia señal del mismo género que la cepa huésped es extremadamente adecuada puesto que es muy probable que se una específicamente al huésped específico; así cuando Chrysosporium lucknowense es el huésped, la secuencia señal es preferiblemente una secuencia señal de Chrysosporium. Las cepas C1 de Chrysosporium, UV13-6; NG7C-19 y UV18-25 segregan proteínas en cantidades extremadamente grandes, y las secuencias señal de estas cepas son de interés particular. Las secuencias señal de hongos filamentosos y levadura pueden ser útiles, al igual que las secuencias señal de origen no fúngico.

Un hongo huésped recombinante transformado según cualquiera de las formas de realización de la invención puede adicionalmente comprender un marcador seleccionable. Tal marcador seleccionable permite la selección de células transformadas o modificadas. Un marcador seleccionable frecuentemente codifica un producto genético que proporciona un tipo específico de resistencia ajena a la cepa no transformada. Ésta puede ser resistencia a metales pesados, antibióticos o biocidas en general. La prototrofía es también un marcador seleccionable útil de la variedad no antibiótica. Los marcadores auxotróficos generan deficiencias nutritivas en las células huéspedes, y los genes que corrigen estas deficiencias pueden ser usados para la selección. Ejemplos de resistencia y marcadores de selección auxotróficos usados comúnmente son amdS (acetamidasa), hph (higromicina fosfotransferasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), y pyrE (orotato P-ribosil transferasa, trpC (antranilato sintasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), sC (sulfato adeniltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), niaD (nitrato-reductasa), Sh-ble (resistencia a la bleomicina-fleomicina), acetolactato sintasa mutante (resistencia a la sulfonilurea), y neomicina fosfotransferasa (resistencia a aminoglicósidos). Un marcador de la selección preferido en Chrysosporium es orotato P-ribosil transferasa. La selección puede llevarse a cabo por cotransformación donde el marcador de la selección está sobre un vector separado o donde el marcador de la selección está sobre el mismo fragmento de ácido nucleico que la secuencia codificadora de proteínas para la proteína heteróloga.

Otra mejora de la frecuencia de transformación puede ser obtenida por el uso de la secuencia del replicador AMA1, que es útil por ejemplo en Aspergillus niger (Verdoes et al., Gene 146:159-165 (1994)). Esta secuencia resulta en un aumento de 10 a 100 veces en la frecuencia de transformación en varios hongos filamentosos diferentes. Además, el ADN introducido es retenido de manera autónoma en las células micóticas, en una forma multicopia, sin integración en el genoma fúngico. Se prevé que esto sea provechoso para el método de selección de alto rendimiento de la presente invención, puesto que el estado no integrativo reduce variaciones en el nivel de expresión genética entre transformantes diferentes. Además, como el ADN introducido no es recombinado en el ADN huésped, no ocurrirán mutaciones no deseadas en genoma huésped. Niveles uniformes de expresión genética exógena pueden ser obtenidos usando vectores de replicación autónoma tales como AMA1, o de forma alternativa, la replicación autónoma en hongos puede ser promovida por secuencias teloméricas (véase p. ej. A. Aleksenko y L. Ivanova, Mol. Gen. Genet. 1998
260:159-164).

Como se utiliza en este caso el término "proteína heteróloga" es una proteína o polipéptido normalmente no expresado o segregado por la cepa huésped usada para la expresión según la invención. Una proteína heteróloga puede ser de origen procariótico, o puede ser derivada de un hongo, planta, insecto, o animal superior tal como un mamífero. Para fines de selección farmacéutica existirá con bastante frecuencia una preferencia para proteínas humanas, por lo tanto una forma de realización preferida será un huésped donde la biblioteca de ADN sea de origen humano. Tales formas de realización también son consideradas en consecuencia ejemplos adecuados de la invención.

La expresión de una biblioteca de genes humanos, derivada de una biblioteca de ADN humano genómico, en los hongos filamentosos de la invención está previsto que sea eficaz por diferentes razones. Es ahora conocido que el tamaño promedio de genes humanos es 3,000-5,000 pares de bases, y que el promedio de intrones humanos aproximadamente 75 a aproximadamente 150 pares de bases (rango total 40 - >50,000). Los hongos filamentosos tienen intrones de 40-75 pares de bases, pero ellos pueden tratar intrones hasta 500 pares de bases de longitud. De media, los genes humanos llevan 3-5 intrones por gen (M. Deutsch, M. Long, Nucl. Acids Res. 1999 27:3219-3228; Tabla B). Las secuencias señal humanas son también conocidas por funcionar en hongos filamentosos. Por estas razones, es posible que un gran número de genes humanos puedan ser expresados y segregados a niveles altos por los métodos de esta invención.

TABLA B

3

Los métodos de la invención están por lo tanto previstos que sean útiles para la expresión de bibliotecas de ADN derivadas de ambos genomas procariótico y eucariótico. Como se ha descrito anteriormente, los métodos son capaces de expresión y descubrimiento de ambas proteínas segregadas e intracelulares, dando acceso inmediato a un número extremadamente grande de genes y proteínas.

Otro aspecto de la invención incluye la construcción y selección de bibliotecas fúngicas mutantes, y bibliotecas fúngicas mutantes preparadas por los métodos descritos aquí. Las bibliotecas pueden ser obtenidas por transformación de los huéspedes fúngicos según esta invención con cualquier medio de transformación integrativa o no integrativa, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Esta biblioteca de hongos basada en las cepas huéspedes preferidas puede ser manejada y seleccionada por sus propiedades deseadas o actividades de proteínas exógenas en métodos de selección de formato miniturizado y/o de alto rendimiento. Por propiedad o actividad de interés se entiende, cualquier propiedad física, fisicoquímica, química, biológica, o catalítica, o cualquier mejora, aumento, o reducción en tal propiedad, asociada a una proteína exógena de un miembro de la biblioteca. La biblioteca puede también ser seleccionada por sus metabolitos, o por una propiedad o actividad asociada a un metabolito, producida como resultado de la presencia de proteínas exógenas y/o endógenas. La biblioteca puede también ser seleccionada por los hongos que producen cantidades aumentadas o disminuidas de tal proteína o metabolitos.

En otro aspecto de esta invención, la biblioteca de hongos transformados puede ser seleccionada por la presencia de metabolitos fúngicos con propiedades deseables. Ejemplos de tales metabolitos incluyen productos naturales poliquétidos, alcaloides, y terpenoides. Se anticipa que genes múltiples o agrupaciones de genes (operones) pueden ser transferidos a las células huéspedes de la invención, y que productos no proteínicos generados por la acción de las enzimas codificadas luego serán generados en las células huéspedes. Por ejemplo, ha sido mostrado que el ADN que codifica las proteínas necesarias para la producción de lovastatina pueden ser transferidas a Aspergillus oryzae (Patente U.S. 5,362,638; véase también la patente U.S. 5,849,541).

En otra forma de realización de la invención, la biblioteca de hongos transformados puede ser seleccionada por la presencia de ADN que se hibrida con una sonda de ácidos nucleicos de interés. En esta forma de realización, la expresión y/o secreción de proteínas exógenas no es esencial, aunque frecuentemente además será deseable. Cuando la expresión de la proteína no es necesitada, será apreciado que las secuencias reguladoras no son necesitadas en el vector.

En otra forma de realización adicional de la invención, la biblioteca de hongos transformados puede ser seleccionada por alguna propiedad deseable de los hongos ellos mismos, tal como por ejemplo tolerancia a un medio ambiente físicamente o químicamente extremo, o la capacidad para producir, modificar, degradar o metabolizar una sustancia de interés. Tales propiedades deseables pueden o no pueden ser atribuibles a la presencia de una única proteína exógena. Esta forma de realización será de utilidad particular cuando se emplea como parte de un proceso de evolución dirigida.

El ADN heterólogo puede ser ADN genómico o ADNc, obtenido a partir de muestras biológicas por métodos bien conocidos en la técnica. La muestra biológica puede ser una muestra medioambiental (por ejemplo, tierra, compost, lecho forestal, agua de mar, o agua dulce), o una muestra de ello extraída, filtrada, o centrifugada o por el contrario concentrada. Los cultivos mezclados de microorganismos derivados de muestras medioambientales pueden ser también empleados. La muestra biológica puede también derivar de cualquier especie única de organismo, tal como un microorganismo cultivado, o planta, insecto, u otro animal tal como un mamífero. Además, el ADN heterólogo puede ser sintético o semi-sintético, por ejemplo secuencias de ADN aleatorias o de ADN comprendiendo segmentos naturales que han sido redistribuidos, mutados, o por el contrario alterados. Un ejemplo de una biblioteca nucleica semi-sintética se encuentra en Wagner et al., WO 00/0632. El ADN de muestras medioambientales (o cultivos mezclados derivados de las mismas) será ventajoso para el descubrimiento de proteínas nuevas, mientras que el uso de ADN de una especie individual será ventajoso (1) un vector apropiado puede ser elegido más juiciosamente, y (2) el profesional se dirigirá a especies relacionadas o similares para una selección posterior si una proteína de interés es
identificada.

En comparación con los huéspedes fúngicos tradicionales, los índices de transformación, de expresión y de secreción son exageradamente altos cuando se usa una cepa de Chrysosporium que presenta la morfología micelial compacta de la cepa UV 18-25. Por lo tanto, una cepa recombinante según la invención presenta preferiblemente tal morfología. La invención no obstante también cubre cepas no recombinantes o por el contrario cepas creadas genéticamente de hongos que presentan esta característica. Una forma de realización atractiva de la invención emplearía una cepa de Chrysosporium recombinante que expone una viscosidad por debajo de aquella de la cepa NG7C-19, preferiblemente por debajo de aquella de UV18-25 bajo condiciones de cultivos correspondientes o idénticas. Hemos determinado que la viscosidad de un cultivo de UV18-25 está por debajo de 10 cP a diferencia de aquella de Trichoderma reesei previamente conocida siendo del orden 200-600 cP, y con aquella de Aspergillus niger tradicional siendo del orden de 1500-2000 cP bajo condiciones de cultivo óptimas durante los estadios de fermentación de medio a tardío. Por consiguiente, la invención puede emplear cualquier hongo filamentoso creado genéticamente o mutante que presenta esta viscosidad baja característica, tal como la cepa UV 18-25 de Chrysosporium (VKM F 3631 D), la cepa X-252 de Trichoderma, o pclA de A. sojae (derivada de ATCC 11906) o de A. niger pclA.

La fluidez de los cultivos fúngicos filamentosos puede variar en un rango amplio, desde casi sólido hasta un líquido que fluye libremente. La viscosidad puede ser cuantificada rápidamente por viscometría rotacional de Brookfield, uso de tubos de viscosidad cinemática, viscosímetro de caída de bola o viscosimetro tipo taza. Caldos de fermentación son fluidos no newtonianos, y la viscosidad aparente será dependiente hasta cierto punto de la velocidad de cizalla (Goudar et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999 51:310-315). Este efecto es sin embargo mucho menos pronunciado para los cultivos de viscosidad baja empleados en la presente invención.

El uso de tales cultivos de viscosidad baja en la selección de una biblioteca de expresión según el método de la invención es altamente ventajoso. La selección de bibliotecas de ADN expresadas en hongos filamentosos ha estado hasta el momento limitada a métodos relativamente lentos y laboriosos. En general, una vez que los hongos han sido transformados (y los transformantes opcionalmente seleccionados), ha sido necesario preparar esporas o conidias, o disgregar mecánicamente los micelios, para dispersar la biblioteca de hongos transformados en organismos individuales o elementos reproductivos. Esta dispersión es necesaria de modo que los organismos separados pueden ser cultivados en colonias o cultivos clonales. Las esporas, conidias, o fragmentos miceliales son luego diluidos y dispuestos en platos de cultivo estándar, y las colonias individuales son inspeccionadas en cuanto a color, alteraciones del sustrato, u otra indicación detectable de la presencia de la actividad o propiedad de la proteína. En otro enfoque, las proteínas segregadas son transferidas de las colonias sobre una membrana, y la membrana es evaluada o examinada para una indicación de la presencia de la actividad o propiedad de la proteína de interés. El uso de membranas ha demostrado ser útil cuando la degradación proteolítica de la proteína exógena es un problema (Asgeirsdottir et al., Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65:2250-2252). Tales procedimientos son laboriosos y no han demostrado ser susceptibles de automatización, y como resultado la selección de alto rendimiento de las proteínas expresadas fúngicamente no ha sido conseguido hasta el momento con hongos filamentosos convencionales. Para los fines de esta descripción, la selección de alto rendimiento se refiere a cualquier método de selección parcialmente o completamente automatizado que sea capaz de evaluar las proteínas expresadas de aproximadamente 1.000 o más transformantes al día, y particularmente a aquellos métodos capaces de evaluar 5.000 o más transformantes al día, y más particularmente a métodos capaces de evaluar 10,000 o más transformantes al día.

La selección automatizada de alto rendimiento de una biblioteca de hongos transformados según la presente invención, por consiguiente, puede ser realizada según varios modos conocidos. Los métodos que son conocidos para ser aplicables a bacterias o levadura pueden en general ser aplicados a los hongos de viscosidad baja de la presente invención. Esto es permitido por la presencia de elementos reproductivos transferibles en combinación con el fenotipo de viscosidad baja, una consecuencia de la morfología relativamente no enredada de las hifas de los hongos mutantes empleados. En esencia, los hongos mutantes, y/o sus elementos reproductivos transferibles, se comportan de forma muy parecida a las bacterias individuales o levadura durante las manipulaciones mecánicas implicadas en la selección automatizada de alto rendimiento. Esto contrasta con hongos de tipo salvaje, y otros hongos también adaptados industrialmente, que producen micelios altamente enredados que no permiten la separación inmediata de los organismos individuales entre sí.

Por ejemplo, una suspensión diluida de hongos transformados según la presente invención puede ser alicuotada a través de una micropipeta mecánica en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. Se anticipa que el aparato de manipulación de líquidos capaz de inyectar microplacas de 384 o 1536 pocillos puede también ser adaptado a la tarea de dispersión automatizada de los organismos en microplacas. La concentración de los organismos suspendidos puede ser ajustada según se desee para controlar el número medio de organismos (u otros elementos reproductivos transferibles) por pocillo. Se apreciará que cuando los múltiples organismos individuales son alicuotados en pocillos, la identificación de la actividad o propiedad de la proteína deseada en este pocillo vendrá seguida de la dilución del contenido del pocillo y cultivo de los organismos presentes en colonias o cultivos clonales individuales. De este modo, el rendimiento del sistema puede ser aumentado, según el coste de la necesidad para la resolución posterior del contenido de cada pocillo que presenta un "éxito".

En una forma de realización alternativa, una clasificadora de células puede ser interpuesta en el recorrido del fluido, siendo capaz de dirigir el flujo del cultivo a los pocillos de la microplaca tras la detección de un organismo u otro elemento reproductivo transferible en la célula detectora. Esta forma de realización permite la dispensación precisa razonable de un organismo por pocillo. El uso de un marcador detectable ópticamente, tal como la proteína verde fluorescente, para identificar transformantes es particularmente útil en esta forma de realización, puesto que permite la selección automatizada de transformantes por una clasificadora de células activada por
fluorescencia.

En otra forma de realización adicional, las colonias que crecen en medios sólidos pueden ser escogidos por un recolector robótico de colonias, y los organismos transferidos por el robot a los pocillos por una placa de microtitulación. Las colonias bien separadas darán lugar a clones individuales en cada pocillo.

Los organismos dispersados son luego dejados crecer en cultivos clonales en los pocillos de microplacas. Los inductores, nutrientes, etc. pueden ser añadidos según se desee por el sistema de distribución de fluido automatizado. El sistema puede también ser usado para añadir cualquier reactivo requerido para permitir la detección de la actividad de proteína o propiedad de interés. Por ejemplo, los sustratos colorogénicos o fluorogénicos pueden ser añadidos para permitir la detección espectroscópica o fluorométrica de una actividad enzimática. La viscosidad baja y hábito de crecimiento sumergido de los cultivos en los pocillos de una placa de microtitulación permiten la difusión rápida de estos reactivos en el cultivo, aumentando inmensamente la sensibilidad y fiabilidad del ensayo. La difusión de oxígeno y nutrientes es también inmensamente mejorada, facilitando el crecimiento rápido y la expresión y secreción máximas de péptidos exógenos. Ciertos ensayos, tales como el ensayo de centelleo por proximidad, dependen de la difusión de componentes solubles para llegar a un estado de equilibrio; nuevamente la viscosidad baja de los cultivos fúngicos de la presente invención hace posible este ensayo de alto rendimiento. Finalmente, en un sistema altamente automatizado será deseable recolectar, aspirar, o pipetar automáticamente cultivos clonales de interés desde sus pocillos en la placa de microtitulación, y la viscosidad baja y el hábito de crecimiento sumergido de los cultivos lo harán posible. Todas las operaciones anteriores serían difíciles o imposibles dada la viscosidad de los cultivos fúngicos filamentosos tradicionales, especialmente los cultivos que crecen como esteras de superficie en las condiciones sin agitación, sin cizalla de un pocillo de placa de microtitulación.

En otra forma de realización, las únicas células son pasadas a través de un aparato microfluídico, y la propiedad o actividad de interés es detectada ópticamente (Wada et al., WO 99/67639). La viscosidad baja es esencial para la operación de un dispositivo microfluídico, y se prevé que los cultivos de viscosidad baja de hongos mutantes de la presente invención sean susceptibles de manipulación microfluídica. Short et al., en la patente estadounidense 6,174,673, han descrito cómo los sustratos fluorogénicos pueden ser empleados para detectar una actividad enzimática de interés, y cómo las células huéspedes que expresan tal actividad pueden ser aisladas con una clasificadora de células activada por fluorescencia. Los métodos de la presente invención son compatibles con este método de identificación de proteínas expresadas.

En una forma de realización, si los transformantes llevan una proteína fluorescente como un marcador, la fluorescencia puede ser cuantificada y empleada como una medida de la cantidad de expresión genética y/o de proteína expresada presente en un cultivo dado. En esta forma de realización, es posible no sólo detectar una proteína exógena de interés, sino estimar la actividad específica de la proteína, como se describe por Blyna et al. en WO 00/78997. Esta forma de realización será particularmente preferida cuando el método de selección de la invención es empleado como parte de un proceso de evolución dirigida.

En estos casos donde una viscosidad superior es aceptable, una matriz formadora de gel puede proporcionar ventajas determinadas cuando se cultivan los hongos, y se conducen ensayos bioquímicos, en un formato de microplaca, como se describe por Bochner en la patente estadounidense 6,046,021.

Otra clase de selecciones de alto rendimiento es por análisis fotométrico, por espectroscopia de formación de imágenes digitales, de grandes números de colonias individuales que crecen en un sustrato sólido. Véase por ejemplo Youvan et al., 1994, Meth. Enzymol. 246:732-748. En este método, cambios en la absorción global o espectros de emisión de reactivos especializados son indicativos de la presencia de una actividad o propiedad de la proteína heteróloga de interés. La dispersión inmediata de organismos individuales que sirven para el uso de mutantes de viscosidad baja también habilita el uso de hongos filamentosos en este método. La tendencia para las colonias de hongos mutantes de la invención a mostrar menor crecimiento lateral, y a producir colonias homogéneas, compactas, y bien definidas en medios sólidos, es también ventajosa en tal sistema de selección. Además, las características de expresión y secreción superiores de hongos en comparación con bacterias proporcionan cantidades superiores de proteína para el análisis espectral.

Una herramienta de manipulación automatizada de microorganismos está descrita en la publicación de solicitud de patente japonesa número 11-304666. Este dispositivo es capaz de transferir microgotas que contienen células individuales, y se anticipa que las cepas fúngicas de la presente invención, en virtud de su morfología, serán susceptibles de micromanipulación de clones individuales con este dispositivo.

Un sistema de selección microbiológica automatizado de alto rendimiento está descrito en Beydon et al., J. Biomol. Screening 5:13-21 (2000). El sistema robótico es capaz de transferir gotitas con un volumen de 400 nl a placas de agar, y tratar 10.000 puntos de selección por hora, y ha sido usado para conducir selecciones de levadura de dos híbridos. Es anticipado que los huéspedes fúngicos de la presente invención serán tan susceptibles como la levadura para la selección de alto rendimiento con tales sistemas.

Como una alternativa para placas de microtitulación, los transformantes pueden ser dejados crecer en placas y, en forma de microcolonias, evaluados ópticamente como se describe en WO 00/78997.

El desarrollo de selecciones de alto rendimiento en general es discutido por Jayawickreme y Kost, Curr. Opin. Biotechnol. 8:629-634 (19977). Una selección de alto rendimiento para genes raramente transcritos diferencialmente expresados está descrita en von Stein et al., Nucleic Acids Res. 35: 2598-2602 (1997).

La cepa LTV1 8-25 de Chrysosporium y la cepa X-252 de Trichoderma ilustran varios aspectos de la invención extremadamente bien. La invención no obstante puede emplear otro mutante o por el contrario cepas creadas genéticamente de hongos filamentosos que producen elementos reproductivos transferibles en suspensión y presentan baja viscosidad en cultivo. La morfología específica de los hongos no puede ser crítica; los inventores presentes han observado micelios cortos no enredados en estas dos cepas pero otras morfologías, tal como la ramificación hifal cercana y extensiva, pueden también llevar a una viscosidad reducida. Las cepas fúngicas según la invención son preferidas si éstas muestran condiciones de crecimiento óptimo a pH neutro y temperaturas de 25-43ºC. Tales condiciones de selección son ventajosas para mantener la actividad de proteínas exógenas, en particular aquellas susceptibles de degradación o inactivación a pH ácido. Muchas proteínas mamíferas, y proteínas humanas en particular, han evolucionado para funcionar a pH y temperatura fisiológicos, y la selección de la actividad normal de una enzima humana es mejor realizada bajo estas condiciones. Las proteínas destinadas para el uso terapéutico tendrán que funcionar bajo estas condiciones, lo que también hace que éstas sean las condiciones de selección preferidas. Las cepas de Chrysosporium presentan precisamente esta característica, creciendo bien a pH neutro y 35-40ºC, mientras que otras especies huéspedes fúngicas empleadas de forma común (p. ej. Aspergillus y Trichoderma) crecen mejor a pH ácido y pueden ser menos adecuadas por esta razón.

Otra aplicación del método de la presente invención es en el proceso de "evolución dirigida", en la que nuevas secuencias de ADN que codifican proteínas son generadas, las proteínas codificadas son expresadas en una célula huésped, y estas secuencias que codifican proteínas que presentan una característica deseada, son seleccionadas, mutadas, y expresadas nuevamente. El proceso es repetido en varios ciclos hasta que una proteína con las características deseadas es obtenida. La transposición de genes, ingeniería de proteínas, PCR con tendencia al error, mutagénesis dirigida, y mutagénesis combinatoria y aleatoria son ejemplos de procesos a través de los cuales nuevas secuencias de ADN que codifican proteínas exógenas pueden ser generadas. Las patentes U.S. 5,223,409, 5,780,279 y 5,770,356 proporcionan teorías de evolución dirigida. Véase también Kuchner y Arnold, Trends in Biotechnology, 15:523-530 (1997); Schmidt-Dannert y Arnold, Trends in Biotech., 17:135-136 (1999); Arnold y Volkov, Curr. Opin. Chem. Biol., 3:54-59 (1999); Zhao et al., Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd Ed., (Demain and Davies, eds.) págs. 597-604, ASM Press, Washington DC, 1999; Arnold y Wintrode, Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, (Flickinger and Drew, eds.) pp. 971-987, John Wiley & Sons, New York, 1999; y Minshull and Stemmer, Curr. Open. Chem. Biol. 3:284-290.

Una aplicación de mutagénesis combinatoria se describe en Hu et al., Biochemistry. 1998 37:10006-10015. US 5,763,192 describe un proceso para obtener nuevas secuencias de ADN codificadoras de proteínas generando estocásticamente secuencias sintéticas, introduciéndolas en un huésped, y seleccionando las células huéspedes con la característica deseada. Los métodos para efectuar la recombinación de genes artificial (redistribución de ADN) incluyen la recombinación aleatoria (Z. Shao, et al., Nucleic Acids Res., 26:681-683 (1998), el proceso de extensión empalmada (H. Zhao et al., Nature Biotech., 16:258-262 (1998), y recombinación de heterodúplex (A. Volkov et al., Nucleic Acids Res., 27:e18 (1999)). PCR con tendencia al error es otro enfoque adicional (Song y Rhee, Appl. Environ. Microbiol. 66:890-894 (2000)).

Hay dos métodos muy practicados de realización de la fase de selección en un proceso de evolución dirigida. En un método, la actividad de proteína de interés de alguna manera se vuelve esencial para la supervivencia de las células huéspedes. Por ejemplo, si la actividad deseada es una celulasa activa a pH 8, un gen de celulasa podría ser mutado e introducido en las células huéspedes. Los transformantes son dejados crecer con celulosa como la única fuente de carbono, y el pH aumentado gradualmente hasta que sólo queden unos pocos residuos. El gen de celulasa mutado de los supervivientes, que supuestamente codifican una celulasa activa a pH relativamente alto, es sometido a otra ronda de mutación, y el proceso es repetido hasta que los transformantes que pueden crecer bien son obtenidos en celulosa a pH 8. Variantes termoestables de enzimas pueden asimismo ser desarrolladas, por ciclos de mutación de genes y cultivo a alta temperatura de células huéspedes (Liao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986 83:576-580; Giver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1998 95:12809-12813. Para los fines de esta aplicación, la mutación de secuencias de ADN que codifican proteínas exógenas pueden ser realizadas por cualquiera de los diferentes métodos empleados para la evolución dirigida, por ejemplo por transposición de genes, recombinación in vivo, o mutagénesis de "cassette".

La ventaja mayor de este método es la naturaleza masivamente paralela de "supervivencia de la fase de selección más adecuada". Millones, o billiones, de mutaciones fallidas son simultáneamente eliminadas de consideración sin la necesidad de evaluarlas individualmente. No obstante, no es siempre posible enlazar una actividad enzimática de interés a la supervivencia del huésped. Por ejemplo cuando la propiedad de proteína deseada es la unión selectiva a un objetivo de interés, haciendo que la propiedad de unión sea esencial para la supervivencia, es posible que sea difícil. También, la supervivencia bajo condiciones forzadas tales como alta temperatura o pH extremo es posible que sea dependiente de factores múltiples, y una mutación deseable no será seleccionada y se perderá si la célula huésped es incapaz de sobrevivir por cuestiones no relacionadas con las propiedades de la proteína mutante.

Una alternativa al enfoque masivamente paralelo de "supervivencia del más adecuado" es la selección en serie. En este enfoque, los transformantes individuales son seleccionados por métodos tradicionales, tales como observación de zonas esclarecidas o coloreadas alrededor de colonias que crecen en medios indicadores, ensayos enzimáticos colorimétricos o fluorométricos, inmunoensayos, ensayos de unión, etc. Véase por ejemplo Joo et al., Nature 399:670-673 (1999), donde una citocromo P450 monooxigenasa que no requiere NADH como un cofactor fue desarrollada por ciclos de mutación y selección; May et al., Nature Biotech. 18:317-320 (2000), donde una hidantoinasa de estereoselectividad inversa fue desarrollada de una forma similar; y Miyazaki et al., J. Mol. Biol. 297:1015-1026 (2000), donde fue desarrollada una subtilisina termoestable.

El enfoque de selección tiene ventajas claras sobre una simple "selección de supervivencia" especialmente si puede ser realizada en una manera de alto rendimiento que se acerca al rendimiento de la técnica de "selección de supervivencia" masivamente paralela. Por ejemplo, algo de paralelismo ha sido introducido utilzando medidas tales como formación de imágenes digitales de los organismos transformados (Joo et al., Chemistry & Biology, 6:699-706 (1999)) o evaluación digital espectroscópica de colonias (Youvan et al., 1994, Meth. Enzymol. 246:732-748). Ensayos en serie pueden ser automatizados por el uso de clasificación de células (Fu et al., Nature Biotech., 17:1109-1111 (1999)). Un enfoque bien establecido para la selección de alto rendimiento implica la evaluación automatizada de proteínas expresadas en placas de microtitulación, usando lectores de placa comercialmente disponibles, y el método de la presente invención es adecuado para la aplicación de este modo de selección de alto rendimiento para una evolución dirigida.

En esta forma de realización de la invención, un gen que codifica una proteína de interés es mutado por cualquier método conocido de generación de una pluralidad de mutantes, el ADN mutante que codifica la proteína es introducido mediante un vector de expresión adecuado en un huésped fúngico filamentoso de viscosidad baja según la presente invención, y los transformantes son opcionalmente seleccionados y cultivados. Las células huéspedes son luego dispersadas como se describe previamente en los pocillos de una placa de microtitulación, o por el contrario espacialmente separados en lugares resolubles, para proporcionar cultivos monoclonales individuales (o cultivos policlonales que tienen menos de aproximadamente 100 clones diferentes). Las células son preferiblemente dispersadas en los pocillos de una placa de microtitulación. La proteína codificada por el ADN mutante es preferiblemente segregada en el medio en los pocillos de las placas de microtitulación. Cada uno de los cultivos dispersos es seleccionado para la actividad de la proteína de interés, y aquellos que presentan más fuertemente la propiedad deseada son seleccionadas. El gen que codifica la proteína de interés en los cultivos seleccionados es mutado otra vez, el ADN mutante es otra vez introducido en el huésped fúngico de baja viscosidad, y los transformantes son reseleccionados. El mutante y proceso de reselección es repetido hasta que el valor de la propiedad de interés alcanza un nivel deseado.

En una forma de realización alternativa, la evolución dirigida se realiza por mutación y reproducción del gen de interés en otro organismo, tal como E. coli, seguido de transferencia de los genes mutantes a un hongo filamentoso según la presente invención para selección.

Será inmediatamente apreciado por los expertos en la técnica que una proteína que resulta ser de interés basándose en el ensayo de selección no tendrá necesariamente todas las demás propiedades requeridas para utilidad comercial. Por ejemplo, la posesión de actividad enzimática, aunque sea alta la actividad específica, no indicará que la enzima mutante tiene el requisito de estabilidad térmica o del pH, o resistencia al detergente o a la proteasa, o no inmunogenicidad, u otra propiedad que puede ser deseable o necesaria en un producto comercialmente viable. Hay una necesidad de métodos que determinen fácilmente si una proteína identificada tiene propiedades comercialmente útiles.

Los enfoques de la técnica anterior para la selección no han proporcionado una solución para esta necesidad, porque los organismos huéspedes (bacterias y levadura) no fueron adaptados a la producción de cantidades aislables de proteína. Hasta el momento ha sido necesario transferir genes útiles de forma potencial de un organismo a otro, como uno que procede de la preparación de la biblioteca de ADN, expresión génica, selección, expresión de cantidades de investigación de productos genéticos, y sobre-expresión en cepas de producción industrialmente adecuadas. Los hongos mutantes filamentosos de la presente invención, en cambio, son excelentes superproductores y secretores de proteínas exógenas, especialmente cuando se emplean con los vectores descritos aquí. Proteína suficiente puede ser aislada no sólo para los fines de caracterización, sino para la evaluación en ensayos de aplicación. De hecho, las cepas usadas en el método de selección de la invención son adecuadas para la producción industrial también, puesto que éstas poseen propiedades de producción deseables tales como viscosidad baja, índices de expresión altos, y proporciones de proteína/biomasa muy altas.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida de la presente invención, el método además comprende el cultivo de una colonia clonal o cultivo identificado según el método de la invención, bajo condiciones que permiten la expresión y secreción de la proteína de la biblioteca exógena (o un precursor de la misma), y recuperación de la proteína posteriormente producida para obtener la proteína de interés. La expresión y secreción de una proteína de la biblioteca puede ser facilitada creando una fusión dentro del marco de lectura del gen clonado con el gen para una proteína heteróloga (o un fragmento de la misma) con su secuencia señal correspondiente, o con la secuencia señal de una tercera proteína, todas operativamente enlazadas a una secuencia reguladora de la expresión. Por este enfoque una proteína de fusión es creada que contiene secuencias de aminoácidos heterólogas corriente arriba de la proteína de la biblioteca. Posteriormente, esta proteína precursora de fusión puede ser aislada y recuperada usando técnicas de purificación conocidas en la técnica. El método puede opcionalmente comprender el sometimiento del precursor de la proteína de fusión segregada a una fase de ruptura para generar la proteína de la biblioteca de interés. La fase de seccionamiento puede llevarse a cabo con Kex-2, una proteasa tipo Kex-2, u otra proteasa selectiva, cuando el vector es creado genéticamente de modo que un sitio de seccionamiento de proteasa enlaza un portador de proteína bien segregada y la proteína de interés.

La disponibilidad inmedianta de la proteína mutante, directamente del organismo huésped de selección, no ha sido previamente posible con huéspedes de selección de la técnica anterior. La presente invención así proporciona una ventaja, en la que las proteínas mutantes creídas de interés basándose en la selección de alto rendimiento pueden ser aisladas en de cantidades suficientes (miligramos) para una caracterización adicional y cantidades incluso más grandes (gramos a kilogramos) para ensayos de aplicación. Esta forma de realización particular de la invención permite por lo tanto que el profesional seleccione proteínas mutantes para la siguiente ronda de evolución dirigida basándose en un número cualquiera de propiedades deseables, y no solamente en la única propiedad detectada en la selección de alto rendimiento. Los criterios más rigurosos de selección posibilitados por la presente invención deberían conducir a un proceso de evolución dirigida más eficaz y rentable.

El método de producción de una cepa fúngica recombinante mutante filamentosa según la invención comprende introducir una biblioteca de secuencias de ADN comprendiendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas en un hongo filamentoso mutante de baja viscosidad según la invención, las secuencias de ácidos nucleicos estando operativamente enlazadas a una región reguladora de la expresión. La introducción de las secuencias de ADN puede ser realizada en cualquier manera conocida per se para transformar hongos filamentosos. Los expertos en la técnica apreciarán que hay diferentes métodos bien establecidos, tal como la absorción del ADN estimulada por CaCl_{2}-polietilenglicol por protoplastos fúngicos (Johnstone et al., EMBO J., 1985, 4:1307-1311). Un método de transformación de protoplastos está descrito en los ejemplos. Los métodos de transformación de protoplastos o de esferoplastos alternativos son conocidos y pueden ser usados puesto que han sido descritos en la técnica anterior para otros hongos filamentosos. Los vectores adecuados para la integración multicopia del ADN heterólogo en el genoma fúngico son bien conocidos; véase por ejemplo Giuseppin et al., WO 91/00920. El uso de plásmidos que se replican de manera autónoma ha sido muy conocido como una herramienta de transformación eficaz para hongos (Gems et al., Gene 1991 98:61-67; Verdoes et al., Gene 1994 146:159-165; Aleksenko and Clutterbuck, Fungal Genetics Biol. 1997 21:373-387; Aleksenko et al., Mol. Gen. Genet. 1996 253:242- 246). Detalles de tales métodos pueden ser encontrados en muchas de las referencias citadas, y están por tanto incorporados por referencia.

Métodos ejemplares según la invención, comprendiendo el uso de una cepa mutante de baja viscosidad de Chrysosporium o A. sojae como materia prima para la introducción de vectores que llevan ADN heterólogo, están presentados abajo.

Ejemplos A. Desarrollo de mutantes de morfología de crecimiento compacto

Varias solicitudes de patente enseñan que los mutantes morfológicos pueden ser aislados mediante varias maneras de selección. WO 96/02653 y WO 97/26330 describen mutantes no definidos que presentan morfología compacta. Se descubrió que una proproteina que procesó el mutante de A. sojae tuvo un fenotipo de crecimiento aberrante inesperado (hiperramificación) mientras que no se observó ningún efecto perjudicial en la producción de proteínas. Los experimentos de cultivo con esta cepa revelaron un fenotipo de crecimiento muy compacto con microgránulos. Las características observadas no sólo estuvieron presentes en A. sojae sino que también en otros hongos mutados, p. ej. A. niger.

(1) Construcción de un mutante de procesamiento de proproteínas de A. niger

Para clonar el gen que codifica la proproteína convertasa de A. niger, se usó la PCR. Basándose en la comparación de varios genes de la proproteína convertasa de varias especies de levadura y eucariotas superiores, cebadores de la PCR diferentes fueron diseñados que son degenerados, respectivamente, 4, 2, 2, 512, 1152, 4608, 2048 y 49152 veces. A partir de la amplificación usando cebadores PE4 y PE6, dos clones individuales fueron obtenidos de los cuales la secuencia de la proteína codificada mostró homología significante a la secuencia KEX2 de S. cerevisiae. Estos clones fueron usados para experimentos sucesivos.

Con base en la homología observada para otros genes de la proproteína convertasa del fragmento de PCR clonado, el correspondiente gen de A. niger fue designado pclA (de tipo proproteína convertasa). Análisis de Southern de digeridos genómicos de A. niger revelaron que el gen pclA fue un gen de copia individual sin genes cercanamente relacionados en el genoma de A. niger, puesto que incluso a condiciones de hibridación heterólogas (50ºC; lavados a 6xSSC) no se constataron señales de hibridación adicionales. Una primera selección de una biblioteca genómica EMBL3 de N401 de A. niger (van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 1987 206:71-75) no resultó en placas de hibridación positiva aunque aproximadamente 10-20 equivalentes de genoma fueron seleccionados. En una segunda selección una copia genómica de longitud total del gen pclA fue aislada de una biblioteca genómica N400 de A. niger en EMBL4 (Goosen et al., Curr. Genet. 11:499-503 (1987)).

De las 8 placas de hibridación que fueron obtenidas después de seleccionar 5-10 equivalentes del genoma, 6 siguieron siendo positivas después de una primera reselección. Todos estos 6 clones muy probablemente llevaron una copia completa del gen pclA, como en todos los clones (como fue observado para el ADN genómico) con el fragmento de PCR dos fragmentos EcoRV hibridantes de 3 y 4 kb estuvieron presentes (el fragmento de PCR contenía un sitio de restricción de EcoRV). Con base en la comparación del tamaño de otras proproteínas convertasas, junto con estos fragmentos contendrán el gen completo pclA con 5' y 3' secuencias flanqueantes. Los dos fragmentos EcoRV y un fragmento EcoRI de 5 kb superpuestos fueron subclonados para caraterización adicional.

Con base en el mapa de restricción la secuencia de ADN completa del gen pclA fue determinada de los subclones EcoRI y EcoRV. El análisis de la secuencia obtenida reveló un marco de lectura abierto con similitud considerable a aquella del gen KEX2 de S. cerevisiae y otras proproteínas convertasas. Con base en una comparación adicional dos secuencias de intrones putativos fueron identificadas en la región codificante. Un análisis de PCR posterior con cebadores que flanquean a los intrones putativos, en una biblioteca de ADNc de A. niger basada en pEMBLyex reveló que sólo la mayoría 5' de estas dos secuencias representaron un intrón real. La estructura general de la proteína de pclA codificada fue claramente similar a aquella de otras proproteínas convertasas. La similitud global de la proteína de pclA con las otras proproteínas convertasas fue aproximadamente del 50%.

Para demostrar que el gen pclA clonado es un gen funcional que codifica una proteína funcional, la construcción de cepas desprovistas del gen pclA fue intentada. En consecuencia, pPCL1A, un vector de deleción de pclA, donde una gran parte de la región codificante de pclA fue sustituida por el marcador de selección pyG de A. oryzae, fue generado. Posteriormente, a partir de este vector el fragmento del inserto EcoRI de 5 kb fue usado para transformación de varias cepas de A. niger.

A partir de estas transformaciones (basadas en selección de pyrG) numerosos transformantes fueron obtenidos. De manera interesante, una fracción de los transformantes (variando del 1-50%) mostraron un fenotipo aberrante muy diferente (figura 13). El análisis de Southern de diferentes transformantes de tipo salvaje y aberrantes revelaron que estos transformantes aberrantes que mostraron un fenotipo de crecimiento seriamente restringido (compacto), habían perdido el gen pclA. Todas las cepas que muestran crecimiento tipo salvaje demostraron llevar una copia del fragmento de sustitución integrado contiguo al gen pclA de tipo salvaje o en una posición no homóloga.

(2) Construcción de un mutante de procesamiento de proproteínas de A. sojae

Para construir el correspondiente mutante en A. sojae, la complementación funcional del mutante de viscosidad baja de A. niger se efectuó por transformación de un mutante de pclA de A. niger con la biblioteca de cósmidos ATCC 11906 de A. sojae. A partir de los transformantes de A. niger complementados resultantes, los clones de cósmidos genómicos fueron aislados, que comprendieron la proteína de A. sojae de procesamiento de la proteasa de pclA. El análisis de secuencias parcial de las secuencias aisladas confirmó la clonación del gen pclA de A. sojae. Con base en las secuencias de pclA de A. sojae clonadas un vector de sustitución de genes fue generado siguiendo un enfoque similar al que se describe en otro lugar en nuestros ejemplos, usando el marcador de selección pyrG reutilizable descrito en WO 01/09352.

Además, un vector de interrupción génica fue construido llevando el marcador de selección pyrG y el fragmento truncado en 5' y 3' del gen pclA de A. sojae. El vector de sustitución génica y de interrupción génica fueron usados para generar mutantes de pclA en derivados de ATCC 11906 y ATCC 11906. Experimentos de cultivos con algunos transformantes resultantes revelaron características morfológicas mejoradas, en particular morfología de crecimiento compacto y microgránulos.. (figs. 14A y 14B).

(3) Aislamiento de mutantes de crecimiento compacto de A. sojae alternativos

La transformación de A. sojae ATCC 11906 y derivados puede ser realizada con fragmentos de ADN lineales que llevan un marcador de selección fúngica. Si no se proveen secuencias de replicación no específicas los transformantes obtenidos usando este procedimiento llevan el ADN introducido integrado en el genoma de la cepa huésped. Como el marcador de selección introducido es de origen heterólogo (A. niger) sólo ocurrirá la recombinación heteróloga, conduciendo a una recogida de transformantes que llevan el ADN marcador a varias posiciones en el genoma. Esta integración es propensa a resultar en la ruptura de secuencias endógenas de A. sojae, así dando como resultado una recogida de cepas mutantes de A. sojae. Esto está ejemplificado por el análisis de una recogida grande de transformantes obtenidos de A. sojae ATCC 11906alpApyrG usando un fragmento de ADN con el marcador de selección pyrG de A. niger. En total mil transformantes diferentes fueron analizados y de estos 5-10 mostraron un fenotipo morfológicamente aberrante. Entre estos varios tuvieron un fenotipo comparable a los mutantes de pclA. Similar a como se describe para la clonación del gen pclA de A. sojae, el gen correspondiente a la mutación podría ser aislado de la genoteca de A. sojae por complementación del fenotipo morfológico. Con base en el gen clonado los mutantes de ruptura/deleción del gen correspondiente pueden ser generados.

(4) Aislamiento de mutantes de crecimiento compacto de Chrysosporium

Usando un enfoque de clonación basado en PCR similar al que se describe para el gen pclA de A. niger, un fragmento del gen de procesamiento de la proproteína de Chrysosporium, denominado pcl1, fue clonado de una genoteca de Chrysosporium BLUESTAR (TM). Un fragmento de gen que lleva la copia del gen genómico completo fue subclonado del clon pBLUESTAR. Con base en el subclón obtenido un vector de interrupción génica fue generado como se describe para A. sojae. En vez del marcador pyrG, para Chrysosporium la versión flanqueada de repetición del gen pyrE de A. niger fue usada. La transformación/interrupción génica de Chrysosporium resultó en cepas con un fenotipo de crecimiento compacto.

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B. Determinaciones de viscosidad

Los rangos de datos paramétricos de operación siguientes han sido determinados para fermentaciones fúngicas usando cinco organismos fúngicos diferentes. Los cinco organismos fúngicos comparados fueron cepas de Aspergillus niger, Trichoderma longibrachiatum de 18.2KK (precedentemente T. reesei), X-252 de Trichoderma de longibrachiatum, cepa UV18-25 de Chrysosporium lucknowense, y pclA de Aspergillus sojae. La viscosidad de un cultivo fúngico varía durante el curso de una fermentación y varía con la concentración de nutrientes. Para las mediciones proporcionadas, el medio que contiene entre 20 y 100 g/l de una fuente de carbono de carbohidrato (p. ej., celulosa, lactosa, sacarosa, xilosa, glucosa, y similares) es inoculada con el hongo, y el cultivo permitió proceder a través de una "fase de crecimiento" durante la cual la fuente de carbono es consumida. Los cultivos del frasco de agitación son agitados a 200 r.p.m., mientras que los vasos de fermentación de un litro son agitados con un propulsor a 500-1000 r.p.m. La viscosidad máxima normalmente ocurre a o cerca del fin de la fase de crecimiento. En ese momento el cultivo es accionado a un modo de flujo continuo, donde una fuente de carbono es alimentada al cultivo a una velocidad tal que la concentración de la fuente de carbono no asciende por encima de aproximadamente 0,5 g/l. Es típica una velocidad de alimentación de entre 1 y 3 g/l/hr.

La viscosidad fue determinada en un viscosímetro LVF de Brookfield usando el pequeño adaptador de muestra y el husillo número 31, accionado a 30ºC. Una muestra fresca de caldo de fermentación (10 ml) fue colocada en el pequeño husillo de muestra. La velocidad del husillo fue ajustada para dar una lectura en la gama 10-80. Después de cuatro minutos una lectura fue tomada de la escala del viscosímetro. La lectura fue multiplicada por el factor dado abajo para obtener la viscosidad en centipoise (cP).

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La viscosidad final fue medida al final de la fermentación:

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C. Transformación de Chrysosporium, Trichoderma y Tolypocladium

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Los medios de transformación usados fueron los siguientes:

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Medios para selección y cultivo:

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Los medios de regeneración (MnR) suplementados con 50 \mug/ml de fleomicina o 100-150 \mug/ml de higromicina se utilizan para seleccionar transformantes. El medio GS, suplementado con 5 \mug/ml de fleomicina se utiliza para confirmar resistencia antibiótica.

PDA es un medio completo para crecimiento rápido y buena esporulación. Medios líquidos son inoculados con 1/20º de suspensión de esporas (todas las esporas de una placa PDA de 90 mm en 0,1% Tween de 5 ml). Tales cultivos son cultivados a 27ºC en frascos de agitación (200 r.p.m.).

Dos cepas no transformadas de Chrysosporium C1 y una cepa de referencia de Trichoderma reesei fueron evaluadas en dos medios (GS pH 6.8, y Pridham agar, PA, pH 6.8). Para evaluar el nivel de resistencia antibiótica, las esporas fueron recogidas de placas de PDA de 7 días. Placas selectivas fueron incubadas a 32ºC y marcadas después de 2, 4 y 5 días. Las cepas C-1 NG7C-19 y UV18-25 claramente tienen un nivel de resistencia basal baja tanto a la fleomicina como a la higromicina, comparable a aquella para una cepa de laboratorio de T. reesei de referencia. Ésta es una indicación clara de que estos marcadores fúngicos estándar seleccionables pueden ser usados en cepas de Chrysosporium. Problemas con otros marcadores fúngicos estándar seleccionables no están previstos.

Selección de cepas de Chrysosporium transformadas con Sh-ble (resistencia a la fleomicina) fue exitosamente realizada a 50 \mug/ml. Éste fue también el nivel de selección usado para T. reesei así mostrando que la selección diferencial puede ser fácilmente conseguida en Chrysosporium. Las mismas observaciones son válidas para cepas transformadas para resistencia a la higromicina a un nivel de 150 \mug/ml.

La técnica de transformación de protoplastos fue usada en Chrysosporium con base en la tecnología de transformación fúngica generalmente aplicada. Todas las esporas de una placa PDA de 90 mm fueron recuperadas en IC1 de 8 ml y transferidas a un matraz vibrante de medio IC1 de 50 ml para incubación durante 15 horas a 35ºC y 200 r.p.m. Después de esto el cultivo fue centrifugado, el granulado fue lavado en MnP, devuelto en solución en 10 ml de MnP y 10 mg/ml de Caylase C_{3} e incubado durante 30 minutos a 35ºC con agitación (150 r.p.m.).

La solución fue filtrada y el filtrado fue sometido a centrifugado durante 10 minutos a 3500 r.p.m. El granulado fue lavado con 10 ml de MnP Ca^{2+}. Este fue centrifugado durante 10 minutos a 25ºC. Luego 50 microlitros de MPC frío fueron añadidos. La mezcla fue mantenida en hielo durante 30 minutos a partir de lo cual 2,5 ml de PMC fueron añadidos. Después de 15 minutos a la temperatura ambiente 500 microlitros de los protoplastos tratados fueron mezclados con 3 ml de MnR Soft e inmediatamente dispuesto en una placa de MnR conteniendo fleomicina o higromicina como agente de selección. Tras la incubación durante cinco días a 30ºC los transformantes fueron analizados (los clones se hacen visibles después de 48 horas). La eficiencia de la transformación fue determinada usando 10 \mug de plásmido de referencia pAN8-1. Los resultados están presentados en la siguiente tabla C.

TABLA C Eficiencia de transformación

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Los resultados muestran que la viabilidad de transformante de Chrysosporium es superior a aquella de Trichoderma. La transformabilidad de las cepas es comparable y por lo tanto, el número de transformantes obtenidos en un experimento se extiende 4 veces más para Chrysosporium que para T. reesei. Así el sistema de transformación de Chrysosporium no sólo iguala el comúnmente usado sistema de T. reesei, sino que incluso lo supera. Esta mejora puede demostrarse especialmente útil para vectores que tienen una transformación menos eficaz que pAN8-1.

Varios otros plásmidos de transformación y de expresión fueron construidos con secuencias codificantes de proteínas homólogas de Chrysosporium y también con secuencias codificantes de proteínas heterólogas para el uso en experimentos de transformación con Chrysosporium. Los mapas de vector se proveen en las Figuras 6-11.

La proteína homóloga para ser expresada fue seleccionada del grupo de celulasas producido por Chrysosporium y consistió en endoglucanasa 6 que pertenece a la familia 6 (PM 43 kDa) y la proteína heteróloga fue endoglucanasa 3 que pertenece a la familia 12 (PM 25 kDa) de Penicillium.

pF6g comprende el fragmento promotor de endoglucanasa 6 de Chrysosporium enlazado a la secuencia señal de endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura abierto de endoglucanasa 6 seguido de la secuencia del terminador de endoglucanasa 6. La selección de transformantes se realiza usando cotransformación con un vector seleccionable.

pUT1150 comprende el promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei enlazado a la secuencia señal de endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura abierto de endoglucanasa 6 seguido de la secuencia del terminador de celobiohidrolasa de T. reesei. Además este vector lleva un segundo cassette de expresión con un marcador de selección, es decir el gen de resistencia a la fleomicina (gen Sh-ble).

pUT1152 comprende el promotor de Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa A de Aspergillus nidulans enlazado a la secuencia señal de endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura abierto de endoglucanasa 6 seguido de la secuencia del terminador de antranilato sintasa (trpC) de A. nidulans. Además este vector lleva un segundo cassette de expresión con un marcador de selección, es decir el gen de resistencia a la fleomicina (gen Sh-ble).

pUT1155 comprende un promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa A de A. nidulans enlazado a la secuencia señal de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en marco con la proteína transportadora Sh-ble que a su vez es enlazada en marco con el marco de lectura abierto de endoglucanasa 6 seguido de la secuencia del terminador trpC de A. nidulans. Este vector usa la tecnología de la proteína transportadora fusionada a la proteína de interés que es conocida por mejorar mucho la secreción de la proteína de interés.

pUT1160 comprende el promotor de Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa A de Aspergillus nidulans enlazado a la secuencia señal de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en marco con la proteína transportadora Sh-ble que a su vez es enlazada en marco con el marco de lectura abierto de endoglucanasa 3 de Penicillium seguido de la secuencia del terminador trpC de A. nidulans.

pUT1162 comprende el promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei enlazado a la secuencia señal de endoglucanasa 3 en marco con el marco de lectura abierto de la endoglucanasa 3 de Penicillium seguido de la secuencia del terminador de celobiohidrolasa de T. reesei. Además este vector lleva un segundo cassette de expresión con el gen de resistencia a la fleomicina (Sh-ble gen) como marcador de la selección.

Será aparente para los expertos en la técnica que una muestra de ADN genómico o ADNc puede ser fácilmente cortada o digerida en fragmentos codificantes de proteínas, y los fragmentos ligados en vectores tales como los ilustrados aquí para producir una biblioteca de vectores de expresión. Será adicionalmente aparente que los métodos que emplean la cotransfección sean aplicables, y que los vectores que se replican de manera autónoma o vectores de integración puedan ser empleados para transfectar hongos filamentosos con tal biblioteca de vectores.

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TABLA D Transformaciones comparativas

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La Tabla D muestra los resultados de transformación de ambos Chrysosporium UV18-25 y Tolypocladium geodes. El protocolo de transformación usado está descrito abajo en la sección para transformación heteróloga.

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D. Expresión heteróloga y homóloga en transformantes de Chrysosporium

Las cepas C1 (NG7C-19 y/o UV18-25) fueron evaluadas por su capacidad para segregar varias proteínas heterólogas: una proteína bacteriana (proteína de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus, Sh-ble), una proteína fúngica (xilanasa II de Trichoderma reesei, XYN2) y una proteína humana (la lisozima humana, HLZ). Los detalles del proceso son los siguientes:

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(1) Secreción de C1 de la proteína de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus (Sh-ble)

Las cepas C1 NG7C-19 y UV18-25 fueron transformadas por el plásmido pUT720 (Ref. 1). Este vector presenta el cassette de expresión fúngica siguiente:

-: promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Aspergillus nidulans (gpdA) (Ref 2)

-: una secuencia señal de celobiohidrolasa I sintética de Trichoderma reesei (cbhl) (refs 1, 3)

-: gen Sh-ble de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus (Ref. 4)

-: terminador de triptófano-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC) (Ref. 5)

El vector también lleva el gen de beta-lactamasa (bla) y el origen de replicación de E. Coli del plásmido pUC18 (Ref 6). El mapa del plásmido detallado está provisto en la figura 2.

Los protoplastos de C1 fueron transformados según Durand et al. (Ref. 7) adaptados a C1: todas las esporas de una placa PDA de 90 mm de la cepa C1 no transformada fueron recuperadas en 8 ml de IC1 y transferidas en un matraz vibrante con 50 ml de medio IC1 para incubación 15 horas a 35ºC y 150 r.p.m. Por lo tanto, el cultivo fue centrifugado, el granulado lavado en MnP, redisuelto en 10 ml de MnP + 10 mg/ml Caylase C_{3}, e incubado 30 min a 35ºC con agitación (150 r.p.m.). La solución fue filtrada y el filtrado fue centrifugado 10 min a 3500 r.p.m. El granulado fue lavado con 10 ml de MnPCa^{2+}. Este fue centrifugado 10 min a 3500 r.p.m. y el granulado fue retomado en 1 ml de MnPCa^{2+}. 10 \mug de ADN de pUT720 fueron añadidos a 200 \mul de solución de protoplastos e incubados 10 min a la temperatura ambiente (aprox. 20ºC). Luego, 50 \mul de MPC frío fue añadido. La mezcla fue mantenida en hielo durante 30 min a partir de lo cual 2,5 ml de PMC fueron añadidos. Después de 15 min a la temperatura ambiente 500 \mul de los protoplastos tratados fueron mezclados a 3 ml de MnR Soft e inmediatamente dispuestos en una placa de MnR que contenía fleomicina (50 \mu/ml a f6.5) como agente de selección. Después de 5 días de incubación a 30ºC, los transformantes fueron analizados (los clones empiezan a ser visibles después de 48 horas). La producción de Sh-ble de transformantes de C1 (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada como sigue: transformantes primarios fueron pinchados con palillos en placas de GS+fleomicina (5 \mug/ml) y dejados crecer durante 5 días a 32ºC para verificación de resistencia. Cada clon resistente validado fue subclonado sobre placas GS. Dos subclones por transformante fueron usados para inocular placas de PDA para obtener esporas para la iniciación del cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC1 fueron dejados crecer 5 días a 27ºC (agitación 200 r.p.m.). Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10 min.) y 500 \mul de sobrenadante fueron recogidos. De estas muestras, las proteínas fueron precipitadas con ATC y resuspendidas en un tampón de muestra de Western hasta 4 mg/ml de proteínas totales (método Lowry, Ref. 8). 10 \mul (aproximadamente 40 \mug de proteínas totales) fueron cargadas en un 12% de gel de acrilamida/SDS y hechas fluir (Sistema de Mini Trans-Blot^{TM}, BioRad Laboratories). La transferencia de Western fue conducida según las instrucciones de BioRad (Schleicher & Schull 0.2 \mum de membrana) usando antisuero anti-Sh-ble de conejo (Societe Cayla, Tolouse FR, Catalog #ANTI-0010) como anticuerpo primario. Los resultados están mostrados en la figura 1 y tabla E.

TABLA E Niveles de producción de Sh-ble estimados en C1

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Estos datos muestran que:

1): las señales de transcripción/traducción heterólogas de pUT720 son funcionales en Chrysosporium.

2): la secuencia señal heteróloga de pUT720 es funcional en Chrysosporium.

3): Chrysosporium puede ser usada como huésped para la secreción de proteínas heterólogas bacterianas.

(2) Secreción de C1 de lisozima humana (HLZ)

Cepas C1 NG7C-19 y UV18-25 fueron transformadas por el plásmido pUT97OG (Ref. 9). Este vector presenta el cassette de expresión fúngica siguiente:

-: promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (gpdA) de Aspergillus nidulans (Ref. 2)

-: una secuencia señal sintética de celobiohidrolasa I (cbh1) de Trichoderma reesei (refs. 1, 3)

-: gen Sh-ble 4 de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus usado como proteína transportadora (Ref 10)

-: dominio articulado (glaA2) de glucoamilasa de Aspergillus niger clonado del plásmido pAN56-2 (refs. 11, 12)

-: un péptido de enlace (LGERK) representando un sitio de seccionamiento de proteasa tipo KEX2 (Ref. 1)

-: un gen de lisozima humana sintético (h/z) (Ref. 10)

-: un terminador de triptófano-sintasa (trpC) de Aspergillus nidulans (Ref. 5)

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El vector también lleva el gen de beta-lactamasa (bla) y el origen de replicación de E. coli del plásmido pUC18 6. El mapa del plásmido detallado está provisto en la Figura 3.

Los protoplastos de C1 fueron transformados con el plásmido pUT970G siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en el ejemplo 1. La proteína de fusión (Sh-ble:: articulación GAM:: HLZ) es funcional con respecto a la resistencia a la fleomicina permitiendo así la selección fácil de los transformantes de C1. Además, el nivel de resistencia a la fleomicina se correlaciona ligeramente con el nivel de expresión de hlz.

La producción de HLZ de los transformantes de C1 (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada por ensayo de actividad de lisozima como sigue: transformantes primarios fueron pinchados con palillos en placas de GS+fleomicina (5 \mug/ml) (verificación de resistencia) y también en placas LYSO (detección de actividad de HLZ aclarando la zona de visualización (refs. 1, 10). Las placas fueron crecidas durante 5 días a 32ºC. Cada clon validado fue subclonado en placas LYSO. Dos subclones por transformante fueron usados para inocular placas de PDA para obtener esporas para la iniciación del cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC1 fueron cultivados 5 días a 27ºC (agitación 180 r.p.m.). Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10 min.). de estas muestras, la actividad de lisozima fue medida según Mörsky et al. (Ref 13)

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TABLA F Niveles de producción de HLZ activa en C1

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Estos datos muestran que:

1): los puntos 1 & 2 del Ejemplo 1 están confirmados.

2): Sh-ble es funcional en Chrysosporim como marcador de resistencia.

3): Sh-ble es funcional en Chrysosporim como proteína transportadora.

4): el sitio de seccionamiento de proteasa tipo KEX2 es funcional en Chrysosporium (de lo contrario HLZno sería activa).

5): Chrysosporium puede ser usada como huésped para la secreción de proteínas heterólogas mamíferas.

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(3) Secreción de C1 de xilanasa II (XYN2) de Trichoderma reesei

La cepa C1 UV18-25 fue transformada por los plásmidos pUT1064 y pUT1065. pUT1064 presenta los dos cassettes de expresión fúngica siguientes:

El primer cassette permite la selección de transformantes resistentes a la fleomicina:

-: promotor del gen 1 de control de ruta cruzada de Neurospora crassa 1 (cpc-1) (Ref. 14)

-: gen Sh-ble de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus (Ref. 4)

-: terminador de triptófano-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC) (Ref. 5)

El segundo cassette es el cassette de producción de xilanasa:

-: promotor cbh1 de la cepa TR2 de T. reesei (Ref. 15)

-: gen xyn2 de la cepa TR2 de T. reesei (incluida su secuencia señal) (Ref. 16)

-: terminador cbh1 de la cepa TR2 de T. reesei (Ref. 15)

El vector también lleva un origen de replicación de E. coli del plásmido pUC19 (Ref. 6). El mapa detallado del plásmido está provisto en la figura 4. pUT1065 presenta el cassette de expresión fúngica siguiente:

-: promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (gpdA) de A. nidulans (Ref. 2)

-: una secuencia señal de celobiohidrolasa I sintética (cbhl) de T. reesei (refs. 1, 3) - gen Sh-ble 4 de resistencia a la fleomicina de S. hindustanus usado como proteína portadora (Ref. 10)

-: un péptido de enlace (SGERK) representando un sitio de seccionamiento de proteasa tipo KEX2 (Ref. 1)

-: gen xyn2 de la cepa TR2 de T. reesei (sin secuencia señal) (Ref. 16)

-: terminador triptófano-sintasa de A. nidulans (trpC) (Ref. 5)

El vector también lleva el gen de beta-lactamasa (bla) y un origen de replicación de E. coli del plásmido pUC18 (Ref. 6). El mapa detallado del plásmido está provisto en la Figura 5.

Los protoplastos C1 fueron transformados con el plásmido pUT1064 o pUT1065 siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en el ejemplo 1. La proteína de fusión en el plásmido pUT1065 (Sh-ble:: XYN2) es funcional con respecto a la resistencia a la fleomicina permitiendo así una selección fácil de los transformantes de C1. Además, el nivel de resistencia a la fleomicina se correlaciona ligeramente con el nivel de expresión de xyn2. En pUT1064, xyn2 fue clonado con su secuencia señal.

La producción de xilanasa de transformantes de C1 (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada por el ensayo de actividad xilanasa como sigue: los transformantes primarios fueron pinchados con palillos a placas de GS+fleomicina (5 \mug/ml) (verificación de resistencia) y también en placas de xilano (Ref. 17), donde la actividad xilanasa es detectada por observación de una zona de compensación. Las placas fueron crecidas durante 5 días a 32ºC. Cada clon validado fue subclonado sobre placas de xilano. Dos subclones por transformante fueron usados para inocular placas de PDA para obtener esporas para inoculación de cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC1 + 5 g/l de Ftalato K^{+} fueron dejados crecer 5 días a 27ºC (agitación 180 r.p.m.). Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10 min.). De estas muestras, la actividad xilanasa fue medida por la técnica DNS según Miller et al. (ref 18)

TABLA G Niveles de producción de XYN2 activa en C1 (mejores productores)

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Estos datos muestra que:

1): los puntos 1 a 4 del ejemplo 2 están confirmados.

2): C1 puede ser usado como huésped para la secreción de proteínas heterólogas fúngicas.

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(4) Resumen

La Tabla H muestra los resultados para los plásmidos con los cuales se efectuó la transformación de UV18-25. La tabla muestra niveles de expresión para endoglucanasa y celobiohidrolasa usando secuencias reguladoras de la expresión heterólogas y secuencias señal y también con secuencias reguladoras de la expresión homólogas y secuencias señal. Los detalles de los distintos plásmidos pueden ser derivados en otro lugar en la descripción y a partir de las figuras. La producción ocurre a pH alcalino a una temperatura de 35ºC.

TABLA H Datos de expresión de la cepa UV18-25 transformada

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E. Construcción de una genoteca de Aspergillus sojae (1) Biblioteca de vectores

ADN genómico de A. sojae fue aislado de protoplastos obtenidos de ATCC 11906 usando un protocolo previamente descrito (Punt, van den Hondel, Methods Enzymol. 1992 216:447-457). Después del aislamiento el ADN fue extraído de los protoplastos usando el protocolo descrito por Kolar et al., Gene 1988 62:127-34. Posteriormente el ADN fue parcialmente digerido con MboI para resultar en fragmentos de ADN de un tamaño promedio de 30-50 kb.

El vector pAOpyrGcosarp1, que fue usado para la construcción de la genoteca fue construido por unión de un fragmento BamHI-HindII de 3 kb de pANsCos1 (Osiewacz, Curr Genet. 1994 26:87-90) y un fragmento Acc651-HindIII de 3.2 kb de pAO4.2 (De Ruiter-Jacobs et al., Curr. Genet. 1989 16:159-63) en pHELP1 digerido con Acc65I-BamHI (Gems et al., Gene 1991 98:61-67). Este vector cósmido lleva el marcador de selección pyrG de A. oryzae y es autorreplicativo en hongos filamentosos.

El ADN genómico digerido con MboI fue unido a pAOpyrGcosarp1 digerido con BamHI, y la mezcla de unión fue envuelta en partículas de fago usando el kit de vectores Stratagene Supercos1 (Stratagene Inc., La Jolla CA). Esto resultó en un total de aprox. 30.000 clones individuales, que representan una representación de 30 veces aproximadamente del genoma de A. sojae. Reservas (en 15% de glicerol) de depósitos de los clones resultantes fueron almacenadas a -80ºC para uso posterior.

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(2) Transformación de alta frecuencia

Un mutante pyrG de ATCC 11906 de A. sojae fue seleccionado como un derivado resistente al ácido fluoroorótico de ATCC 11906, como se describe en WO 01/09352. Esta cepa, ATCC 11906pyrG de A. sojae, fue transformada con dos vectores llevando el gen pyrG de A. niger. Un vector pAB4-1 (van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206:71-75 (1987)) lleva sólo el gen pyrG, mientras que pAB4-arp1 (Verdoes et al., Gene 146:159-165 (1994)) lleva el gen pyrG y la secuencia AMA1 de A. nidulans. La transformación de ATCC 11906pyrG resulta en 5-10 transformantes por microgramo de ADN de pAB4-1, mientras que con la frecuencia pAB4-arp1 fueron al menos 10-100 veces mayores. El análisis fenotípico de los transformantes reveló que el fenotipo pyrG de los transformantes pAB4-arp1 fue mantenido sólo bajo selección continua, mientras que los transformantes pAB4-1 fueron estables con y sin selección para el fenotipo pyrG. Estos resultados confirman la replicación autónoma del ADN plásmido introducido en transformantes pAB4-arp1. Resultados similares fueron obtenidos con vectores de transformación fúngica alternativos llevando la secuencia AMA1 o derivados de la misma., p. ej. pAOpyrGcosarp1.

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(3) Construcción de una biblioteca de transformantes fúngicos

ATCC 11906pyrG de A. sojae o los mutantes pertinentes, en particular mutantes de morfología compacta de los mismos, fueron transformados con una genoteca de A. sojae basada en el vector de transformación pAOpyrGcosarp1. Este vector resulta en una alta frecuencia de transformantes con copias de vector que se replican libremente. Los protoplastos fúngicos fueron tratados como se describe en Punt y van den Hondel, Methods Enzymol. 1992 216:447-457 con ADN de una biblioteca de cósmidos que lleva clones genómicos de ADN fúngico de A. sojae o Chrysosporium y diluciones en serie de los protoplastos transformados fueron puestos en placas de agar selectivas para determinar la frecuencia de transformación obtenida. Los protoplastos restantes fueron regenerados en medio selectivo durante unas horas y almacenados a 4ºC. Con base en los resultados obtenidos para la frecuencia de transformación (que dependiendo del experimento alcanzará valores de hasta varios miles de transformantes por microgramo de ADN de la biblioteca de cósmidos), las diluciones limitadoras de los protoplastos regenerados fueron puestas en placas de microtitulación de 96, 248, o un formato de pocillos alternativo, dando como resultado un protoplasto transformado por pocillo. Las placas fueron incubadas a 35ºC para formar biomasa fúngica. La biblioteca de transformantes resultante se usa para experimentos sucesivos.

Una estrategia similar fue usada para la construcción de una recogida de transformantes fúngicos que llevan alelos mutantes de Chrysosporium CBH1. Esta estrategia puede también ser usada con una biblioteca de mutantes derivados de cualquier otro gen de interés, si se genera por mutagénesis, la transposición de genes o enfoques de evolución de genes.

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F. Inducción de esporulación en fermentación sumergida

Muchos hongos, tales como Aspergillus sojae, no muestran esporulación bajo fermentación sumergida. Aquí describimos un enfoque previamente desconocido para obtener esporulación bajo estas condiciones. ATCC 11906 de A. sojae y en particular mutantes de morfología de crecimiento compacto del mismo fueron dejados crecer en un medio de crecimiento sintético suplementado con extracto de levadura. Bajo estas condiciones la acumulación rápida de biomasa ocurre en cultivos tanto estáticos como agitados. No obstante, no ocurre ninguna esporulación en el fluido de cultivo. Un medio de crecimiento similar con la adición de 0,6 g/kg de EDTA resulta en rendimientos considerables de alcance de esporas hasta 10^{9} esporas por ml de fluido de cultivo tras la incubación de 2-4 días a 35ºC.

Medio sintético (+/- EDTA):

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G. Sistemas de transformación para Chrysosporium y Aspergillus (1) Clonación del gen pyrE de orotato p-ribosil transferasa de A. niger

Numerosos sistemas de transformación versátiles para hongos filamentosos se basan en el uso de cepas mutantes que requieren uridina. Estas cepas mutantes son bien deficitarias en orotidina 5 fosfato descarboxilasa (OMPD) u orotato p-ribosil transferasa (OPRT). (T. Goosen et al., Curr Genet. 1987,11:499-503; J. Begueret et al., Gene. 1984 32:487-92). Previamente hemos aislado el gen pyrG OMPD de A. niger (W. van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 1987 206:71-5). La clonación del gen OPRT (pyrE) de A. niger se efectuó por complementación de un mutante distinto de pyrG que requiere uridina resistente a FOA de A. niger. Para la complementación se usó una biblioteca de cósmidos de A. niger en el vector pAOpyrGcosarp1. De los transformantes de complementación, los clones de cósmidos genómicos fueron aislados, llevando el gen de A. niger de complementación, denominado ahora pyrE. Un fragmento Sstll de 5.5 kb que lleva el gen pyrE fue clonado en el vector pBLUESCRIPT (TM) (Stratagene) dando como resultado el vector pBLUEpyrE. Un fragmento de 1.6 kb de este vector que abarca la región codificante de pyrE fue secuenciado para confirmar la ubicación del gen OPRT (véase Fig. 15).

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(2) Sistema de transformación auxotrófica para Chrysosporium lucknowense

Las cepas de Chrysosporiun luknowense que requerían uridina fueron seleccionadas como derivados resistentes al ácido fluoroorótico de C1 y UV18-25 por los métodos descritos en la publicación PCT WO 01/09352. La selección de derivados resistentes al ácido fluoroorótico pueden suponer el aislamiento de dos tipos de mutantes que requieren uridina, es decir, bien mutantes de orotidina 5 fosfato descarboxilasa (OMPD) o bien mutantes de orotato P-ribosil transferasa (OPRT) (T. Goosen et al., Curr Genet. 1987, 11: 499-503). Para determinar la naturaleza de los mutantes de Chrysosporium obtenidos, se realizaron experimentos de transformación con los genes pyrG de A. niger disponibles (OMPD; vector pAB4-1, W. van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 1987 206:71-5) y pyrE (pBLUE-pyrE; OPRT). Como se muestra en la Tabla 1, sólo la transformación de las cepas mutantes con el gen pyrE resultó en transformantes prototróficos, implicando que las cepas de Chrysosporium son mutantes de OPRT. Después de la nomenclatura génica de Chrysosporium que hemos adoptado, los mutantes fueron designados pyr5.

TABLA 1

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(3) Construcción y uso de vectores de fúngicos transformación que se replican de manera autónoma

Con base en el vector pBLUEpyrE dos derivados fueron generados que llevaban secuencias que suministraban características de replicación autónoma a los vectores al introducirse en hongos filamentosos. Un fragmento HindIII de 5.5 kb llevando las secuencias AMA1 de Aspergillus nidulans (J: Verdoes et al., Gene 1994 146:159-65) fue introducido en el único sitio HindIII de pBLUEpyrE dando como resultado pBLUEpyrE-AMA. Un fragmento de HindIII (parcial) de 2.1 kb que lleva secuencias teloméricas humanas (A. Aleksenko, L. Ivanova, Mol. Gen. Genet. 1998 260:159-64) fue introducido en el único sitio HindIII de pBLUEpyrE dando como resultado pBLUEpyrE-TEL. Estos vectores fueron introducidos en cepas mutantes OPRT de Aspergillus y Chrysosporium dando como resultado transformantes prototróficos. Varios de los transformantes obtenidos mostraron la característica de fenotipo rasgado de transformantes que llevan plásmidos que se replican libremente (J. Verdoes et al., Gene 1994 146:159-65).

(4) Transformación de Chrysosporium lucknowense

El protocolo se basa en un procedimiento originalmente usado para transformación de Aspergillus (P. Punt, C. van den Hondel, Methods in Enzymology 1992 216:447-457). Medio rico (250 ml) fue inoculado con 10^{6} esporas/ml del mutante Chrysosporium pyr5 (supra) en un matraz de Erlenmeyer de 1L. El cultivo fue dejado crecer durante 24-48 horas a 35ºC en una incubadora de aire (300 r.p.m.). El micelio fue filtrado a través de un filtro Miracloth(TM) estéril (Calbiochem) y lavado con aprox. 100 ml 1700 mosmol NaCl/CaCl_{2} (0.27 M CaCl_{2}/0.6 M NaCl). El micelio fue pesado y luego mantenido en hielo. Caylase(TM) (Cayla) fue añadido (20 mg por gramo de micelio) y 1700 mosmol NaCl/CaCl_{2} (3.3 ml/g micelio) y la suspensión fue incubada en una incubadora de aire a 33ºC (100 r.p.m.). La protoplastización fue vigilada bajo el microscopio. Después de 1-3 horas de incubación, la mayor parte del micelio fue digerida, dejando principalmente protoplastos en la vista microscópica de la preparación. Los protoplastos fueron filtrados a través de un filtro Miracloth estéril y el filtro fue lavado con 1 volumen de STC1700 frío (1.2 M sorbitol/10 mM Tris.HCl pH 7.5/50 mM CaCl_{2}/35 mM NaCl). Los protoplastos fueron centrifugados a 2500 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC. El granulado fue resuspendido en STC1700 y centrifugado otra vez. Después de resuspender el granulado en STC1700, los protoplastos fueron contados. STC1700 fue añadido a una concentración final de 2 x 10^{8} protoplastos por ml.

El ADN del vector (pAB4-1 o pBLUE-pyrE, 1-10 \mug) fue pipetado en el fondo de un tubo estéril y 1 \mul de ATA 1M (ácido aurintricarbónico) y 100 \mul de protoplastos (aprox. 2 x 10^{7}) fueron añadidos al ADN. Un control negativo de ADN negativo fue incluido en el experimento. Después de la mezcla, los protoplastos fueron incubados a la temperatura ambiente durante 25 minutos. PEG6000 (60% PEG/50 mM CaCl_{2}/10 mM tris pH 7.5) fue añadida a porciones como sigue: 250 \mul, mezcla, 250 \mul, mezcla, 850 \mul y mezcla. La solución fue mantenida a la temperatura ambiente durante 20 minutos. Los tubos fueron luego llenados con 8 ml de STC1700, mezclados y centrifugados a 2500 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC, y el granulado fue suspendido en 250 \mul de STC1700. Alícuotas de la muestra fueron usadas para colocar en placas en un medio selectivo. Para la selección de pyr^{+}, se prepararon placas conteniendo 1.5% de Daishin agar, 1.2 M de sorbitol, 1x AspA con nitrato, 2 mM de MgSO_{4}.7 H_{2}O, 1x elementos traza, 0.1% casaminoácidos y 1% glucosa. Si se selecciona para amdS (y pyr^{+}), las placas contenían 1.5% de agar Oxoid, 1.2 M de sorbitol, 2 mM MgSO_{4}.7 H_{2}O, 1x elementos traza, 1% glucosa, 1x AspA sin nitrato, 15 mM CsCl y 10 mM de acetamida o acrilamida. Las placas fueron incubadas a 30 o 35ºC.

Las esporas y protoplastos viables antes y después del procesamiento de PEG6000 fueron contados colocando en placas diluciones en STC1700 en placas de medio mínimo con nitrato y con o sin sorbitol. 100 \mul de 10^{-1}, 10^{-2} y 10^{-3} diluciones fueron colocadas en placas sin sorbitol para contar esporas y 100 \mul de 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4} y 10^{-5} diluciones fueron colocadas en placas con sorbitol para contar los protoplastos viables.

Los resultados de las transformaciones están mostrados en la tabla I.

H. Proporciones de proteína/biomasa

Para cepas de Chrysosporium, Trichoderma, y Aspergillus productoras de celulasas o amilasas, sólidos secos totales fueron determinados pasando una alícuota medida del caldo entero a través de un filtro prepesado, lavando con agua desionizada, y secando el pastel y filtro durante toda la noche a 60ºC y durante una hora a 100ºC. Tras el enfriamiento en un desecante, la biomasa fue determinada substrayendo el peso del filtro del peso del filtro seco más la torta de filtración y dividiendo por el volumen de caldo eliminado.

Para cepas de Trichoderma y Aspergillus, se presumió que la biomasa era igual a los sólidos totales secos puesto que allí hubo poco material insoluble a parte de la biomasa en el momento en que se tomaron las mediciones. Para cepas de Chrysosporium productoras de celulasa, hubo una cantidad significante de celulosa en el medio, así la biomasa fue determinada como la diferencia entre sólidos totales secos y celulosa. La celulosa fue evaluada como sigue.

Partes alícuotas medidas del caldo entero fueron centrifugadas para eliminar sólidos y el sobrenadante fue descartado. El granulado fue resuspendido en un volumen de 0.1 N de NaOH igual al volumen de caldo original y fue añadido un décimo volumen de 0.5 N de NaOH. La mezcla fue incubada durante cuatro horas a 65ºC. Este procesamiento disolvió todo excepto la celulosa. La mezcla alcalina fue enfriada y centrifugada, y el sobrenadante fue descartado. El resultante granulado fue lavado dos veces por resuspensión en agua desionizada y centrifugado. El granulado lavado fue resuspendido en agua desionizada, transferido a un recipiente prepesado y secado como se ha descrito anteriormente. La concentración de celulosa fue determinada dividiendo el peso en seco por el volumen de la alícuota evaluada.

La proteína fue determinada por el procedimiento de unión de colorante de Bradford (M. Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248) usando un estándar de inmunoglobulina. Las proporciones de proteína/biomasa para proteínas seleccionadas expresadas en varias cepas filamentosas fúngicas están presentadas en la Tabla J.

TABLA J

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I. Expresión y secreción de proteína verde fluorescente en A. sojae y C. lucknowense

Como un ejemplo de una proteína indicadora versátil y fácilmente seleccionablle, proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequoria victoria fue expresada en A. sojae y C. lucknowense. Vectores que llevan GFP (A. Santerre Henriksen et al., Microbiology. 1999, 145:729-734) y genes de fusión de glucoamilasa-GFP (pGPDGFP, C. Gordon et al., Microbiology. 2000 146:415-26) fueron modificados por sustitución del promotor glaA con el promotor gpdA de A. nidulans expresado constitutivamente. Los vectores fueron introducidos en A. sojae por cotransformación, usando bien el marcador de selección pyrG o amdS. El vector pGPDGFP y sus derivados fueron introducidos en Chrysosporium por cotransformación usando bien el marcador de selección pyrE o amdS. La expresión resultó en transformantes fluorescentes luminosamente de A. sojae y Chrysosporium, confirmando la expresión de GFP por ambos vectores. La fluorescencia de sobrenadantes de cultivo de los transformantes que expresan la glucoamilasa-proteína de fusión GFP indica la secreción de la proteína de fusión fluorescentemente activa. La expresión de la proteína fluorescente fue también observada en esporas (o propágulos tipo esporas) obtenidas de los distintos transformantes que expresan la versión citoplásmica no segregada de las proteínas fluorescentes.

J. Transferencia de unidades de crecimiento fúngico

Los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos son cargados con un medio apropiado, bien manualmente con una pipeta multicanal o mediante un sistema de manipulación de placa automatizada. Un volumen grande aumenta la posibildad de infección cruzada, mientras que para evitar problemas con la evaporación del volumen éste no debería ser demasiado pequeño. Si se usa la placa de fondo redondo COSTAR(TM) 3799, por ejemplo, 150 \mul es un volumen apropiado para trabajar. Las placas son inoculadas con esporas de colonias crecidas en placas usando palillos para la transferencia. De forma alternativa, las placas pueden ser inoculadas pipetando partes alícuotas pequeñas de suspensiones de esporas, protoplastos o elementos hifales. Estas suspensiones pueden ser derivadas de soluciones de esporas/protoplastos aislados o de cultivos esporulantes crecidos en microplacas. La inoculación puede también efectuarse a partir de placas de microtitulación usando una herramienta de una punta o una de 96 puntas.

Posteriormente las placas son incubadas a 35ºC. Para minimizar la evaporación, placas tapadas pueden ser empleadas, o las placas pueden ser selladas con una membrana que permite el intercambio de O_{2}, H_{2}O y CO_{2} y bastones a la superficie de la placa. Para limitar adicionalmente la evaporación, una incubadora de atmósfera controlada puede ser usada.

Después de tres a cuatro días de incubación, la cantidad de biomasa es apropiada para una transferencia eficaz a placas de microtitulación nuevas que contienen medio fresco. Para la preparación de placas de réplica, se usa una herramienta de 96 puntas. Las placas hijas que tienen dispositivos diferentes de los cultivos pueden ser preparadas por pipetado manual o robótico o transferencia con puntas. Para asegurar la presencia de elementos de reproducción transferibles en las puntas de transferencia, la herramienta de punta es sumergida en el cultivo de placa de microtitulación y agitada durante 20 segundos. La herramienta de puntas es luego cuidadosamente eliminada de la placa inicial y se hace una impresión en una placa de microtitulación nueva. Un procedimiento de transferencia eficaz de forma similar puede también ser conseguido usando una pipeta de canales múltiples, transfiriendo aproximadamente 1 \mul del cultivo de la placa de microtitulación parental. En ambos casos una transferencia eficaz es conseguida debido a la presencia de elementos reproductivos transferibles, tales como esporas, propágulos tipo espora, protoplastos, o fragmentos hifales o miceliales. Los protoplastos pueden ser generados en los pocillos de microplaca por procesamiento con enzimas degradadoras de la pared celular y luego transferir estos protoplastos. La formación de protoplastos en microplacas ha sido descrita por C. van Zeijl et al., J Biotechnol. 1997 59:221-224.

Otra mejora de la transferencia es obtenida incubando los cultivos de la placa de microtitulación en un agitador de placa de microtitulación a 35ºC. Esto aumenta el número de elementos reproductivos transferibles en los cultivos. Para almacenar los cultivos de la placa de microtitulación, se añade glicerol hasta una concentración final del 15%, y las placas son almacenadas a -80ºC. Para experimentos de transferencia posteriores, las placas son descongeladas y se realiza la transferencia como se ha descrito antes. Transferencia eficaz con cepas tipo salvaje o comerciales de A. niger y A. sojae no fue realizable según las condiciones usadas aqui, puesto que estas cepas mostraron un crecimiento de superficie vigoroso y esporulación aérea después de un día. La esporulación aérea causa contaminación cruzada masiva durante la transferencia, y el crecimiento de la superficie que cubre los pocillos posteriormente excluye una proporción grande de métodos de ensayo conocidos.

K. Construcción de una biblioteca de expresión fúngica para descubrimiento de genes

Con base en el vector de expresión fúngica pAN52-1 NOT (registro de EMBL Z32524) o uno de sus derivados, un vector fue construido en el que está presente un único sitio de clonación de BamHI directamente corriente abajo del promotor de rango huésped fúngico amplio expresado constitutivamente para el gen gpdA de A. nidulans (P. Punt et al., J. Biotechnol. 1991 17:19-33). Este vector fue construido de manera que los fragmentos de ADN genómico que llevan el codón de iniciación de la traducción (ATG) puedan ser expresados. Para proporcionar un marcador de selección para este vector, un fragmento NotI-BamHI de pBLUEpyrE fue clonado en el vector de expresión digerido con NotI BglII denominado pAN52-BamHI, dando como resultado el vector pAN52-pyrE. Los fragmentos de ADN genómico de Chrysosporium en un rango de tamaño de 3-6 kb fueron obtenidos con digestión parcial de Sau3A. Después de la unión de estos fragmentos en el vector de expresión pAN52-pyrE digerido con BamHI, se obtuvieron varios clones recombinantes suficientes para cubrir el genoma de Chrysosporium entero varias veces. Varios de estos clones fueron agrupados para cubrir al menos 5-10 equivalentes del genoma fúngico. El ADN plásmido de estas agrupaciones fue preparado y usado para la transformación de mutantes pyr5 de Chrysosporium o pyrE de Aspergillus. Las colecciones de transformantes fueron generadas en un formato de microplaca como se ha descrito anteriormente, y usadas para selección adicional funcional/actividad. De forma alternativa, una biblioteca de expresión puede ser construida usando promotores de Chrysosporium específicamente regulados, como se describe en PCT/NL99/00618.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Documentos de patente citados en la descripción

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\bulletDrocourt D.; Calmels T.; Reynes J.P.; Baron M.; Tiraby G. Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance. Nucleic Acids Res., 1990, vol. 18, no. 13. 4009- [0187]

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\bullet Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains. Durand H.; Baron M.; Calmels T.; Tiraby G. Biochemistry and genetics of cellulose degradation. Academic Press. 1988. 135-151 [0187]

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\bulletNakari T.; Onnela M.L.; Ilmen M.; Nevalainen K.; Penttilä M. Fungal promoters active in the presence of glucose, 1994, [0187]

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Claims

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1. Método para expresar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN, donde la biblioteca de vectores comprende una pluralidad de vectores diferentes, cada vector diferente comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas diferentes, dicha secuencia de ácidos nucleicos siendo operativamente enlazada a una región reguladora de la expresión y opcionalmente una secuencia que codifica una señal de secreción, el método incluyendo las etapas de:

(a)

suministar una pluralidad de hongos filamentosos individuales, dichos hongos teniendo un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión y caracterizado por la producción de elementos transferibles reproductivos que son monoclonales y fácilmente separados los unos de los otros en suspensión;

(b)

transfomar de forma estable dichos hongos filamentosos con dicha biblioteca de vectores de ADN para introducir en cada uno de una pluralidad de los hongos individuales al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas heterólogas u homólogas;

(c)

cultivar los hongos filamentosos transformados en suspensión bajo condiciones propicias para la formación de elementos reproductivos transferibles;

(d)

separar entre sí una pluralidad de elementos reproductivos transferibles; y

(e)

cultivar en cultivos monoclonales o colonias monoclonales los elementos reproductivos transferibles individuales, bajo las condiciones propicias para la expresión de las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas heterólogas u homólogas.
```
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```
2. Método para seleccionar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN para una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:

(a)

expresar la pluralidad de proteínas en cultivos fúngicos monoclonales filamentosos o colonias fúngicas monoclonales filamentosas, por el método según la reivindicación 1; y

(b)

seleccionar los cultivos clonales individuales o colonias clonales para la actividad o propiedad de interés.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
3. Método para producir una molécula de ADN que codifica una proteína con una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:

(a)

expresar una pluralidad de proteínas en cultivos fúngicos monoclonales filamentosos o colonias fúngicas monoclonales filamentosas, por el método según la reivindicación 1;

(b)

seleccionar cultivos clonales individuales o colonias clonales para la actividad o propiedad de interés; y

(c)

aislar ADN de un cultivo clonal o colonia clonal que presenta la actividad o propiedad de interés.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
4. Método para producir la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN que codifica una proteína con una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:

(a)

aislar ADN de un cultivo clonal o colonia clonal que presenta la actividad o propiedad de interés, por el método según la reivindicación 3; y

(b)

secuenciar dicho ADN.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
5. Método para producir la secuencia de aminoácidos de una proteína con una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:

(a)

producir la secuencia de ADN de la proteína con una actividad o propiedad de interés, por el método según la reivindicación 4; y

(b)

convertir dicha secuencia de ADN en una secuencia de aminoácidos.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
6. Método para optimizar una actividad o propiedad de proteína de interés, que incluye las etapas de:

(a)

suministrar una biblioteca de vectores que comprenden secuencias de ADN que codifican formas mutantes de la proteína;
```
\global\parskip1.000000\baselineskip
```
(b)

suministrar una pluralidad de hongos filamentosos individuales, dichos hongos teniendo un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión y por la producción de elementos reproductivos transferibles que son monoclonales y fácilmente separados el uno del otro en suspensión;

(c)

transformar de forma estable dichos hongos filamentosos con dicha biblioteca de vectores de ADN para introducir en cada uno de una pluralidad de hongos individuales al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas u homólogas;

(d)

cultivar los hongos transformados filamentosos en suspensión bajo condiciones propicias para la formación de elementos reproductivos transferibles en suspensión;

(e)

separar entre sí una pluralidad de elementos reproductivos transferibles;

(f)

cultivar en cultivos clonales o colonias clonales los elementos reproductivos individuales transferibles, bajo condiciones propicias para la expresión de las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas u homólogas;

(g)

seleccionar cada organismo individual, cultivo clonal, o colonia clonal para una proteína expresada que tenga la actividad o propiedad de interés;

(h)

aislar uno o más organismos individuales, cultivos clonales, o colonias clonales que expresan una proteína que presenta la actividad o propiedad de interés;

(i)

mutar el ADN de los organismos individuales aislados, cultivos clonales, o colonias clonales que codifican la proteína que presenta la actividad o propiedad de interés;

(j)

suministrar una biblioteca de vectores que comprenden las secuencias de ADN mutado obtenidas en la fase (i); y

(k)

repetir las fases (b) a (g), hasta que la propiedad o actividad de interés bien alcanza un nivel deseable o bien ya no mejora más.
```
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```
7. Método según la reivindicación 6, comprendiendo además entre fases (h) y (i) las fases de:

cultivar uno o más de los organismos individuales, cultivos clonales, o colonias clonales aisladas en la fase (h);

aislar la proteína expresada que presenta la actividad o propiedad de interés; y

evaluar la proteína aislada para la propiedad de interés.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, donde la fase de selección se realiza por selección de alto rendimiento.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la viscosidad de la suspensión es inferior a 200 cP.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la viscosidad de la suspensión es inferior a 100 cP.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la viscosidad de la suspensión es inferior a 60 cP.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la viscosidad de la suspensión es inferior a 10 cP.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde los vectores comprenden una secuencia señal fúngica.
14. Método según la reivindicación 13, donde la secuencia señal fúngica es la secuencia señal de un gen fúngico que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en celulasa, \beta-galactosidasa, xilanasa, pectinasa, esterasa, proteasa, amilasa, poligalacturonasa e hidrofobina.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde los vectores comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican un marcador seleccionable.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde los vectores comprenden una región reguladora de la expresión operativamente enlazada a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína.
17. Método según la reivindicación 16, donde la región reguladora de la expresión comprende un promotor inducible.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el hongo es de la clase Euascomycetes.
19. Método según la reivindicación 18 donde el hongo es del orden Onygenales o Eurotiales.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el hongo es de la división Ascomycota, con la condición de que no sea del orden Saccharomycetales.
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el hongo es de un género seleccionado del grupo que consiste en: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Talaromyces, Emericella e Hypocrea.
22. Método según la reivindicación 21 donde el hongo es de un género seleccionado del grupo que consiste en Aspergillus, Fusarium, Chrysosporium, y Trichoderma.
23. Método según la reivindicación 22, donde el hongo es la cepa UV18-25 de Chrysosporium que tiene número de registro VKM F 3631 D, la cepa X-252 de Trichoderma longibrachiatum, la cepa pclA de Aspergillus sojae o la cepa pclA de Aspergillus niger.
24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la proteína expresada homóloga o heteróloga es segregada en el medio de cultivo.
25. Método según cualquiera de reivindicaciones 1-8, donde los elementos reproductivos transferibles son células micóticas individuales.
26. Método según cualquiera de reivindicaciones 1-8, donde los elementos reproductivos transferibles son esporas, fragmentos hifales o microgránulos.
27. Método según cualquiera de reivindicaciones 1-8, donde los elementos reproductivos transferibles son protoplastos.
28. Método según la reivindicación 2 comprendiendo además (c) el aislamiento de la proteína expresada.
29. Método para obtener un huésped fúngico transformado filamentoso que expresa una proteína con una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:

(a)

seleccionar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN para una actividad o propiedad de interés, por el método según la reivindicación 2; y

(b)

aislar el cultivo monoclonal o colonia monoclonal que expresa la actividad o propiedad de interés.