ES2318163T3 - Citoquinas aviares, tales como il-12, que comprenden una (s) subunidad (es) p40 y/o p35. - Google Patents
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Abstract
Proteína IL12 aviar que comprende las subunidades polipeptídicas: - una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud de al menos el 80% con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº 1, - una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud de al menos el 80% con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº
Description
Citoquinas aviares, tales como
IL-12, que comprenden una(s)
subunidad(es) p40 y/o p35.
La presente invención se refiere a citoquinas
aviares novedosas, a secuencias de ADN que codifican estas
citoquinas novedosas y a su uso en adyuvantes con propósitos
vacunales.
El grupo de moléculas secretadas solubles,
denominadas de forma colectiva citoquinas, representa señales de
comunicación críticas entre las células del sistema inmune y entre
células del sistema inmune y no inmune. Algunas de estas citoquinas
tienen que formar homodímeros, tales como interferón gamma
(IFN-\gamma), u homotrímeros, tales como
moléculas de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) para
ejercer actividad biológica. Las formas monoméricas muestran mínima
o ninguna bioactividad.
Las citoquinas se usan actualmente en fármacos
en terapia de cáncer y en la lucha contra infecciones microbianas
crónicas. Las citoquinas también se evalúan para su uso como
inmunoestimulantes en adyuvantes para mejorar vacunas.
En mamíferos se ha identificado un grupo de
citoquinas heterodiméricas compuestas basadas en complejos de una
subunidad de proteína p40. El elemento p40 de mamífero comprende una
proteína de 40 kD que se une covalentemente, por unión por
di-sulfuro, con una subunidad p35 para formar
interleuquina 12 (IL-12) p70 (Gubler U, et
al., PNAS USA 1991, 88: 4143-4147; Wolf S F,
et al., J. Immunol. 1991, 146: 3047-3081;
Trinchieri G., Blood 1994, 12: 4008-4027). Además,
p40 puede formar la citoquina compuesta IL-23,
después de combinarse con p19 (Wiekowski M T, et al., J.
Immunol. 2001 166: 7563-7570), una molécula
relacionada estructuralmente con IL-6, p35 y factor
estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF)
(Oppmann B, et al., Immunity 2000, 13:
715-725). Además, p40 puede formar homodímeros que
se ha demostrado que compiten por la unión con IL-12
p70 con el receptor de alta afinidad de IL-12 e
inhiben la bioactividad de IL-12 (Heinzel Fig. P,
et al., J. Immunol., 1997, 158: 4381-4388) o
que aumentan, mas que disminuyen, la producción de
IFN-\gamma por células T CD8+ y el desarrollo de
Th1 (Piccotti J R, et al., J. Immunol. 1997. 158:
643-648).
El significado de p40 in vivo en diversas
especies de mamíferos se ha demostrado usando p40 recombinante. Las
características antagonísticas de IL-12 de
(p40)_{2} homodimérica de 80 KDa se han demostrado
claramente en modelos de choque letal dependientes de
IFN-\gamma inducido por lipopolisacáridos (LPS)
(Mattner, F, et al. Infect. Immun. 1997, 11:
4734-4737). La producción de p40 humana, en ausencia
de IL-12 p70 bioactiva, se ha demostrado para
células de microglía de cerebro (De Goer-de Herve M
G, et al. Cytokyne 2001, 14: 88-96). Además,
el papel fisiológico de citoquinas compuestas por p40 de mamífero se
ha definido de forma detallada usando estrategias de dirección de
genes in vivo. Se ha demostrado que después de la infección
por Salmonella enteritidis, ratones genéticamente
defectuosos en la proteína p40 (p40 -/-) mostraron una mayor tasa de
mortalidad y mayor carga orgánica bacteriana que ratones capaces de
producir p40, pero que carecen del gen de p35
(IL-12 p35 -/-) (Lehmann J, et al., J.
Immunol. 2001, 167: 5304-5315). Ratones normales (de
tipo silvestre) e IL-12 p35 -/- resolvieron una
infección por cepa Calmette-Guerin (BCG) de
Mycobacterium bovis o infección por tuberculosis pulmonar,
mientras que ratones doblemente deficientes en IL-12
(p35 -/- + p40 -/-) mostraron susceptibilidad alta a BCG de M.
bovis e infección por tuberculosis (Holscher C, et al.,
J. Immunol. 2001, 167: 6957-6566). La
susceptibilidad se asoció a respuestas reducidas de células Th1
específicas de antígenos y de células T citotóxicas. De forma
interesante, la terapia in vivo con homodímeros de p40
recombinantes invirtió los ratones infectados por BCG de M.
bovis con deficiencia doble (p35 -/- + p40 -/-) en un fenotipo
resistente. Esto demuestra un papel protector y agonístico de p40
endógena y exógena en infección micobacteriana, que es
independiente de IL-12 p70 (Holscher et al.,
2001 anteriormente). De forma similar, ratones p40 -/- infectados
por Cryptococcus neoformans murieron antes y desarrollaron
cargas orgánicas mayores que ratones p35 -/-, lo que sugiere de
nuevo un papel protector para la subunidad p40 independiente del
heterodímero de IL-12 (Decken K., et al.
Infect. Immunity 1998, 66: 4994-5000). Además,
ratones p40 -/- sobrevivieron a grandes dosis de la bacteria
intracelular Franscisella tularensis (LVS), pero no aclararon
nunca bacterias y desarrollaron infección crónica. Por el
contrario, ratones p35 -/- sobrevivieron fácilmente a grandes dosis
de infección sub letal por LVS. Este estudio sugiere que el
aclaramiento de LVS depende de p40, pero no de IL-12
p70 (Elkins K L, et al. Infect. Immun. 2002, 70:
1936-1946). Además, durante la infección por
citomegalovirus murino (MCMV), ratones p35 -/- mostraron un
fenotipo alterado en comparación con ratones p40 -/-, indicando que
p40 puede tener una actividad independiente de y adicional a
antagonismo de IL-12 in vivo (Carr J A, et
al., J. Interferon Cytokine Res. 1999, 19:
1145-1152).
Tomados de forma conjunta, estos estudios
experimentales ilustran el papel crucial en mamíferos de citoquinas
basadas en p40 tales como IL-12,
IL-23 y (p40)_{2} en la regulación de
respuestas inmunes de tipo T auxiliar 1 características de
IFN-\gamma esenciales para el control de la
mayoría de las infecciones intracelulares de naturaleza bacteriana,
parasitaria, fúngica o vírica.
La presente invención se refiere a equivalentes
aviares de las citoquinas basadas en p40 de mamífero.
La clonación y secuenciación de citoquinas
aviares se sitúa por detrás de trabajo similar realizado en
mamíferos. Hasta la fecha solamente se han identificado unas pocas
citoquinas aviares. Se han clonado IFN-\gamma e
IL-18 así como varias citoquinas proinflamatorias,
demostrando la existencia de una red de citoquinas similar a Th1 en
pollos. Debido a la baja homología de secuencia con citoquinas de
mamífero, habitualmente aproximadamente del 30 al 50%, las
estrategias clásicas para identificar homólogos aviares de
citoquinas de mamífero habitualmente no son exitosas. La
identificación mediante amplificación por PCR usando cebadores
basados en secuencias de mamífero es muy difícil e impredecible.
(Hilton L. S. et al. Vet. Immunol. and Immunopathol. 2002,
85: 119-128; Staehli P. et al., J.
Interferon Cytokine Res. 2001, 21: 993-1010). Cuando
se dispuso de algunas citoquinas aviares, se inició un trabajo para
investigar su uso potencial como inmunomoduladores o como
inmunoadyuvantes para mejorar la eficacia de vacunas.
La mayoría de los pollos producidos en países
desarrollados, tanto para consumo como para puesta de huevos, están
vacunados. Se vacunan contra enfermedad de Marek y contra Virus de
Enfermedad de Newcastle, Virus de Enfermedad Infecciosa de la
Bursa, Virus de Bronquitis Infecciosa, Virus de la Viruela Aviar y
con vacunas contra Coccidios. La vacunación se puede realizar antes
o después de la eclosión. Los sistemas inmunes de embriones y aves
recién eclosionadas todavía no están completamente desarrollados y
no pueden generar una respuesta inmune que sea eficaz
2-3 semanas después de la eclosión. Para el
desarrollo de vacunas usadas pre-eclosión o en la
eclosión existe, por lo tanto, una necesidad de agentes que mejoren
la respuesta inmune en aves después de la vacunación.
Los presentes inventores han tenido éxito al
identificar y determinar tanto la secuencia de aminoácidos como de
genes codificantes para citoquinas aviares novedosas. Estas
proteínas son útiles para los propósitos que se han mencionado
anteriormente conocidos para los equivalentes de mamífero,
especialmente para mejorar la eficacia de vacunas aviares.
La presente invención proporciona una proteína
de IL-12 aviar que comprende las siguientes
subunidades polipeptídicas:
- -
- una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº 1,
- -
- una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº 2.
La secuencia ilustrada en la SEC ID Nº 1
representa un polipéptido que tiene un peso molecular de
aproximadamente 40 kD. La secuencia ilustrada en la SEC ID Nº 2
representa un polipéptido que tiene un peso molecular de
aproximadamente 35 kD.
La subunidad polipeptídica que tiene un peso
molecular de 40 kD se denominará "p40", mientras que la
subunidad de 35 kD se denominará "p35". Ambas secuencias
ilustradas en las SEC ID Nº 1 y 2 se obtienen de ADN de pollo (p40
de pollo y p35 de pollo).
Como se ha explicado anteriormente para las
citoquinas de mamífero, pueden existir diversos complejos que
contienen p40. p40 puede presentarse como molécula monomérica, como
homodímeros o como moléculas heterodiméricas. La subunidad p40 se
puede unir covalentemente, mediante unión por
di-sulfuro, con la subunidad p35 para formar
interleuquina-12 (IL-12). Además,
p40 puede formar la citoquina compuesta IL-23,
después de combinación con p19. La unión promiscua de p40 con otras
cadenas peptídicas de citoquinas sugiere la existencia de otras
citoquinas que forman complejos con p40 no identificadas hasta
ahora.
Las proteínas de acuerdo con la invención
comprenden ambas subunidades (p40 y p35). La invención también
incluye proteínas quiméricas que comprenden, por ejemplo, una
subunidad p40 o p35 de pollo en combinación con una subunidad p35 o
p40 obtenida de otra especie. Las quimeras pueden ser, por ejemplo,
proteínas en las que la p35 de pollo se combina con una p40
obtenida de otra especie aviar. La p40 y la p35 de forma conjunta,
cuando se unen mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro, formarán
una interleuquina-12 (IL-12) aviar
que es así mismo parte de la presente invención.
Las proteínas de la invención en principio son
citoquinas aviares que se pueden usar para diferentes propósitos,
de forma análoga a los equivalentes de mamífero. Las citoquinas de
acuerdo con la invención, especialmente la IL-12
aviar, más en particular la IL-12 de pollo, se
pueden usar como un adyuvante en vacunas aviares para mejorar la
respuesta inmune.
Ya que es obvio que son igualmente útiles
modificaciones menores en la secuencia de la proteína, la invención
también proporciona una proteína que comprende una subunidad
polipeptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una
similitud de secuencia de al menos el 80%, o preferiblemente al
menos el 90%, más preferiblemente el 95%,
más preferiblemente al menos el 99%, incluso más preferiblemente el 100% con la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2.
más preferiblemente al menos el 99%, incluso más preferiblemente el 100% con la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2.
El término "similitud" se refiere a un
grado de similitud entre proteínas en vista de diferencias de
aminoácidos, pero cuyos diferentes aminoácidos son funcionalmente
similares en vista a tamaño prácticamente igual, lipofilia, acidez,
etc. Se puede calcular un porcentaje de similitud por alineamiento
óptimo de las secuencias usando una matriz de puntuación de
similitud tal como la matriz Blosum62 descrita en Henikoff S. y
Henikoff J G., P. N. A. S. USA. 1992, 89:
10915-10919. El cálculo del porcentaje de similitud
y alineamiento óptimo de las dos secuencias usando la matriz de
similitud Blosum62 y el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol.
Biol. 1970, 48: 443-453) se puede realizar usando
el programa GAP del Genetics Computer Group (GCG, Madison, WI,
EE.UU.) usando los parámetros por defecto del programa.
Es un aspecto adicional de la invención
proporcionar una proteína que comprenda una variante de origen
natural de una o ambas sub-unidades que tienen la
secuencia como en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2. Tales proteínas,
que comprenden una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos
que tiene al menos el 80% de similitud, preferiblemente al menos el
90%, más preferiblemente al menos el 95%, incluso más
preferiblemente al menos el 99% y mucho mas preferiblemente el 100%
de similitud con los polipéptidos definidos en la SEC ID Nº 1 o la
SEC ID Nº 2 se obtienen de especies de aves tales como pollo, pato,
ganso, pavo y paloma.
Tales secuencias se presentan en las SEC ID Nº 5
y 7, que representan el equivalente de pato y pavo respectivamente,
de la secuencia de aminoácidos de p40 de pollo ilustrada en la SEC
ID Nº 1.
Tales formas polimórficas y homólogos de especie
de aves se incluyen en la clase de proteínas puestas a disposición
mediante esta invención. Las variantes de las proteínas que también
son parte de la presente invención pueden ser variantes naturales
que pueden contener variaciones en la secuencia de aminoácidos
debido a deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o
adiciones de un aminoácido o aminoácidos en dicha secuencia. Se han
descrito sustituciones de aminoácidos que se espera que no alteren
esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas. Las
sustituciones de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o
sustituciones que han tenido lugar frecuentemente en la evolución
son, entre otros, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase
Dayhof, M. D., Atlas of protein secuence and structure, Nat.
Biomed. Res. Found., Washington, D. C., 1978, 5: supl. 3).
Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un
método para comparación de proteínas rápida y sensible y
determinación de la similitud funcional entre polipéptidos homólogos
(Science 1985, 227: 1435-1441).
Otras variantes pueden ser, por ejemplo,
variantes funcionales como sales, amidas, ésteres y específicamente
ésteres C-terminales y derivados de
N-acilo. También están incluidos péptidos que se
modifican in vivo o in vitro, por ejemplo, por
glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación.
Las proteínas que comprenden solamente un
fragmento funcional de la subunidad p40 y p35 se consideran asimismo
parte de la presente invención. Un fragmento funcional del
polipéptido es un fragmento que al menos representa la parte o las
partes de la subunidad o las subunidades polipeptídicas, que es/son
esenciales para la proteína para que sea capaz de servir como una
citoquina y pueden cumplir esta función, por ejemplo, cuando se usan
solos o se fusionan con secuencias heterólogas. Por tanto, tales
fragmentos funcionales pueden ser polipéptidos que son funcionales
por sí mismos o los fragmentos pueden ser funcionales cuando se unen
a otros polipéptidos para obtener proteínas quiméricas. Se entiende
que estos fragmentos funcionales entran dentro de la definición de
las
subunidades.
subunidades.
Los fragmentos se pueden producir entre otras
cosas mediante escisión enzimática de moléculas precursoras,
mediante el uso de endonucleasas de restricción para el ADN y
proteasas para los polipéptidos. Otros métodos incluyen síntesis
química de los fragmentos o la expresión de fragmentos peptídicos
por fragmentos de ADN.
Las subunidades polipeptídicas tienen un peso
molecular aparente de 40 o 35 kD, respectivamente, basándose en la
longitud de la secuencia de aminoácidos (aa). El peso molecular
exacto se puede determinar en SDS-PAGE usando
condiciones reductoras.
Las proteínas preferidas de acuerdo con la
invención son las proteínas que comprenden una subunidad
polipeptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al
menos el 80% de similitud, preferiblemente al menos el 90%, más
preferiblemente al menos el 95%, incluso más preferiblemente al
menos el 99% y mucho más preferiblemente el 100 % de similitud con
la proteína definida en la SEC ID Nº 1. Tales proteínas preferidas
de acuerdo con la invención pueden comprender una o dos subunidades
de p40 (es decir, un monómero o dímero de p40). Dentro de esta
realización preferida se prefieren más las proteínas que comprenden
una subunidad p40 obtenida de pollo. Los ejemplos de subunidades
que tienen más del 99% de similitud con la secuencia de pollo de la
SEC ID Nº 1 son las secuencias de p40 de pato y pavo que se
ilustran en las SEC ID Nº 5 y 7, respectivamente.
Son especialmente útiles las proteínas en las
que la subunidad p40 está unida a una subunidad p35 (mediante un
enlace disulfuro) de tal forma que se obtiene una
IL-12 aviar.
En una realización especialmente preferida, la
invención proporciona la IL-12 de pollo, que
consiste en una subunidad p40 que tiene la secuencia de aminoácidos
de la SEC ID Nº 1 y una subunidad p35 que tiene la secuencia de
aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº 2, unidas entre sí, por
ejemplo, mediante un enlace disulfuro.
El enlace de las subunidades p35 y p40 se puede
establecer de diversos modos. La IL-12 de pollo se
puede generar mediante vectores de expresión que contienen los ADNc
tanto de p35 como de p40 separados mediante, por ejemplo, un IRES
(segmento de entrada de ribosoma interno) o unidos directamente
mediante una región codificante rica en Glicina/Serina
("bisagra") para formar una única fase de lectura abierta.
Además, los vectores de expresión que contienen la secuencia de
ADNc de p35 o p40 bajo el control de promotores separados se pueden
usar para generar IL-12 de pollo.
La preparación de las proteínas, subunidades o
fragmentos funcionales de las mismas de acuerdo con la invención se
realiza mediante uno de los métodos de química orgánica conocidos
para síntesis de péptidos o con la ayuda de técnicas de ADN
recombinante. Este último método implica la preparación del péptido
deseado mediante la expresión usando un polinucleótido recombinante
con una secuencia de nucleótidos, que codifica uno o más de los
péptidos en cuestión en un microorganismo adecuado como
hospedador.
Estos polinucleótidos son asimismo parte de la
presente invención.
Por tanto, la presente invención proporciona
además un polinucleótido de IL-12 aviar aislado que
codifica al menos una de las siguientes subunidades
polipeptídicas:
- -
- una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de similitud con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº 1 y
- -
- una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de similitud con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº 2.
Un polinucleótido que codifica una
IL-12 aviar puede comprender ambas secuencias, por
ejemplo, unidas por una secuencia que codifica una bisagra.
Los fragmentos de la secuencia de ácido nucleico
(an) proporcionada que codifican un fragmento funcional del
polipéptido también son parte de la presente invención.
Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un
fragmento funcional de este tipo del polipéptido se puede fusionar
con polinucleótidos que codifican regiones transmembrana y/o
secuencias señal.
Los polinucleótidos como se definen en la
presente invención también incluyen polinucleótidos que tienen
variaciones en la secuencia de ácido nucleico cuando se comparan
con la secuencia de ácido nucleico identificada o que tienen sitios
polimórficos. Con polinucleótidos "variantes" se quiere decir
que difieren de la secuencia de ácido nucleico identificada pero
que todavía codifican un polipéptido que tiene una actividad
biológica, por ejemplo, de citoquina, similar a la actividad de un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos ilustrada en la
SEC ID Nº 1 y/o 2.
Las variantes pueden ser variantes naturales o
no naturales. Las variantes naturales incluirán homólogos en
diversas especies de aves. La variante de origen no natural puede
introducirse mediante mutagénesis. Las variantes naturales también
pueden ser variantes alélicas. Una variante alélica es una de varias
formas alternativas de un gen que ocupa un locus en un cromosoma de
un organismo. A veces se expresa un gen en un determinado tejido
como una variante de corte y empalme, dando como resultado un ARNm
5' o 3' alterado o la inclusión o exclusión de una o más secuencias
de exón. Se espera que estas secuencias, así como las proteínas
codificadas por estas secuencias, realicen funciones iguales o
similares y también forman parte de la invención.
Una secuencia de ADNc aislada puede ser
incompleta debido a transcripción incompleta del ARNm
correspondiente o se pueden obtener clones que contienen fragmentos
del ADN completo. En la técnica se conocen diversas técnicas para
completar dichas secuencias de ADNc, tales como RACE (Amplificación
Rápida de extremos
de ADNc).
de ADNc).
Los polinucleótidos que tienen una secuencia de
ácido nucleico que es una variante de la secuencia de ácido
nucleico identificada se pueden aislar mediante un método que
comprende las etapas de: a) hibridar un ADN que comprende todo o
parte de la secuencia identificada como se refleja en la SEC ID Nº 3
ó 4, en condiciones rigurosas con ácidos nucleicos que son ADN
(genómico) o ADNc aislado de células aviares que expresan en gran
medida el polinucleótido de interés; y b) aislar dichos ácidos
nucleicos mediante métodos conocidos por un especialista en la
técnica.
Las condiciones de hibridación son
preferiblemente de alta rigurosidad.
De acuerdo con la presente invención, el término
"riguroso" se refiere a condiciones de lavado de SSC 1 x, SDS
al 0,1% a una temperatura de 65ºC; condiciones altamente rigurosas
se refieren a una reducción en SSC con respecto a SSC 0,3 x, más
preferiblemente a SSC 0,1 x. Preferiblemente, los primeros dos
lavados se realizan de forma sucesiva dos veces cada uno durando
15-30 minutos. Si existe una necesidad de lavar en
condiciones altamente rigurosas, se realiza un lavado adicional con
SSC 0,1 x una vez durante 15 minutos. La hibridación se puede
realizar, por ejemplo, durante una noche en tampón fosfato 0,5 M pH
7,5 con SDS al 7% a 65ºC. Tales métodos de hibridación se describen
en cualquier libro de texto convencional de clonación molecular, por
ejemplo: Molecular Cloning: a laboratory manual, 3^{a} ed.; eds:
Sambrook et al. CSHL press, 2001.
Como una alternativa, el método de aislamiento
puede comprender metodología de amplificación de ácido nucleico que
usa cebadores y/o sondas obtenidos de la secuencia de ácido nucleico
proporcionada con la presente invención. Tales cebadores y/o sondas
son oligonucleótidos que tienen al menos 15 nucleótidos de longitud;
los oligonucleótidos preferidos tienen aproximadamente
25-50 nucleótidos.
También se pueden identificar variantes u otros
homólogos aviares de las secuencias ilustradas en las SEC ID Nº 3 y
4 comparando la secuencia in silicio con otras secuencias
aviares que pueden estar comprendidas en una base de datos
informática. Las secuencias se pueden comparar con secuencias en
bases de datos usando un programa BLAST (BLASTF 2.1.2
[oct-19-2000]) (Altschul, S F,
Madden T L, Schaffer A A, Zhang J, Zhang Z, W Miller y D J.
Lipman, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs", Nucleic Acids
Res. 1997, 25: 3389-3402).
La bioactividad de proteínas de acuerdo con la
invención se puede medir in vitro usando un ensayo de
proliferación, del siguiente modo:
- \quad
- Se pueden sembrar células COS-7 o células de pollo, por ejemplo, CEF, HD-11, DT40 etc., en placas de 35 mm de diámetro a 5 x 10^{5} células/pocillo. Después de un periodo de cultivo de 16 horas, las células se pueden transfectar con 1 \mug de ADN plasmídico que codifica IL-12 de pollo usando Lipofectamin Plus^{TM} (Gibco BRL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El medio de cultivo que contiene IL-12 de pollo se puede recoger 72 horas después de la transfección. Para comprobar la bioactividad de IL-12 de pollo se tiene que desarrollar un bioensayo basado en la proliferación de linfocitos de sangre periférica (PBL). Para esto, se puede analizar la actividad de citoquina, codificada por el plásmido o los plásmidos introducidos por transfección, que se libera al medio de cultivo usando un protocolo adaptado de un bioensayo descrito previamente (Gately, M. K., Chizzonite, R. & Presky, D. H., "Measurement of human and mouse interleukin-12", en: Current Protocols in Immunology, 1997, págs. 6.16.1-6.16.15, editado por J. E. Coligan et al., ed: John Wiley & Sons.)
En este bioensayo que se desarrolló
específicamente para IL-12 de ratón y humana se
cultivan PBL humanos aislados usando Lymphoprep^{TM} (Nycomed),
durante 2 días en medio Iscoves que contiene 5 \mug/ml de
Concanavalina A (ConA). Para estimular la formación de blastos se
añade interleuquina-2 humana recombinante (50
unidades/ml) y las células se cultivan durante 3 días adicionales.
Las células se lavan, se siembran en placas de 96 pocillos (2 x
10^{4} células/pocillo) y se cultivan en presencia del medio de
cultivo de células transfectadas. Después de 48 horas se añade
^{3}H-timidina (Amersham) y la incubación
continuará durante 4 horas, después de lo cual se recogen las
células mediante un dispositivo de recogida de células automático.
La radiactividad incorporada, que es una medida de proliferación
celular y, por tanto, de bioactividad de IL-12, se
cuantificará mediante recuento de centelleo líquido.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona polinucleótidos de IL-12 aviar aislados
que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una
subunidad polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos
que tiene al menos el 80% de similitud con la secuencia de
aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº 1 ó 2, respectivamente. Se
prefieren polinucleótidos que codifican polipéptidos que tengan al
menos el 95% de identidad con la SEC ID Nº 1 ó 2 y se prefieren más
los polinucleótidos que codifican poliproteínas que tienen al menos
el 97% de identidad con la SEC ID Nº 1 ó 2, donde se prefieren más
los que codifican polipéptidos que tienen al menos el 98 o el 99%.
Lo más preferido son polinucleótidos que codifican el polipéptido de
la SEC ID Nº 1 ó 2. Debido a la degeneración del código genético,
los polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos
idéntica o sustancialmente idéntica pueden utilizar diferentes
codones específicos. Se considera que son parte de la invención
todos los polinucleótidos que codifican los polipéptidos como se ha
definido anteriormente.
En particular, los polinucleótidos preferidos de
acuerdo con la invención son polinucleótidos aislados que tienen al
menos el 80% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la
SEC ID Nº 3 ó 4. Se prefieren más los polinucleótidos que tienen al
menos el 90% de identidad y se prefieren aún más los que tienen al
menos el 95%, preferiblemente el 99% de identidad, mucho más
preferiblemente el 100% de identidad con toda la secuencia de la SEC
ID Nº 3 ó 4.
Tales polinucleótidos incluyen polinucleótidos
que comprenden la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEC
ID Nº 3 y/o 4. Un polinucleótido que codifica un polipéptido con una
secuencia como se ilustra en la SEC ID Nº 1 y/o 2 puede comprender
la secuencia de ácido nucleico como se ilustra en la SEC ID Nº 3 y/o
4. En una realización preferida adicional de la invención, el
polinucleótido consiste en la secuencia de ácido nucleico como se
ilustra en la SEC ID Nº 3 y/o 4.
Los ejemplos de polinucleótidos que muestran más
del 99% de homología con la secuencia de nucleótidos ilustrada en la
SEC ID Nº 3 son las secuencias ilustradas en las SEC ID Nº 6 y 8,
que son las secuencias codificantes para la p40 de pato y pavo,
respectivamente.
Los polinucleótidos de acuerdo con la invención
pueden ser ADN o ARN, preferiblemente ADN. El ADN de acuerdo con la
invención se puede obtener a partir de ADNc. Alternativamente, la
secuencia codificante puede ser ADN genómico o se puede preparar
usando técnicas de síntesis de ADN. Si el polinucleótido es ADN,
puede estar en forma monocatenaria o bicatenaria. La cadena única
puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante
(antisentido).
Dentro de la definición de polinucleótidos
también se incluyen ARN o ADN modificados. Se pueden realizar
modificaciones en las bases del ácido nucleico y se pueden
incorporar bases tales como Inosina. Otras modificaciones pueden
incluir, por ejemplo, modificaciones de la cadena principal.
Con "aislado" se quiere decir que el
polinucleótido se aísla del estado natural, es decir, se ha sido
cambiado o movido de su entorno natural o ambos. La molécula está
separada y es discreta del organismo completo con el que se observa
la molécula en la naturaleza.
El "%" de "identidad" define la
relación entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos basándose en
una comparación entre sus secuencias alineadas.
La identidad se puede calcular mediante métodos
conocidos. Los porcentajes de identidad u homología como se
mencionan en este documento son los que se pueden calcular con el
programa GAP, gestionado por el GCG (Genetics Computer Group Inc.,
Madison, WI, EE.UU.).
Los parámetros para la comparación de secuencia
polipeptídica incluyeron lo siguiente: algoritmo: Needleman y
Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453.
Como una matriz de comparación para los
alineamientos de aminoácidos se usa la matriz Blosum62 (Henikoff y
Henikoff, anteriormente), usando los siguientes parámetros:
- Penalización por hueco: 8
- Penalización por longitud de hueco: 2
- Ninguna penalización para huecos de extremo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros para la comparación de
nucleótidos que se pueden usar:
- Algoritmo: Needleman y Wunsch (anteriormente).
- Matriz de comparación: emparejamientos = +10, desemparejamientos = 0.
- Penalización por hueco: 50.
- Penalización por longitud de hueco: 3
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN de acuerdo con la invención será muy útil
para expresión in vivo o in vitro del polipéptido
codificado en cantidades suficientes y en forma sustancialmente
pura. Cuando se usan los polinucleótidos de acuerdo con la
invención para expresión del polipéptido codificado, los
polipéptidos pueden incluir, además de la secuencia codificante
para el polipéptido o el fragmento funcional del mismo, otras
secuencias codificantes, por ejemplo, secuencias líder o proteínas
de fusión, tales como secuencias de marcador y similares.
La aplicación de citoquinas compuestas basadas
en p40, tales como IL-12, IL-23 y
(p40)_{2}, puede aumentar las respuestas inmunes que se
desarrollan inducidas por microorganismos o las respuestas inmunes
inducidas por vacunación, basándose tanto en la inmunidad celular
como en la humoral. Además, la intervención en la cascada
inmunológica desencadenada por estas citoquinas usando, por ejemplo,
dosis antagonísticas de (p40)_{2}, puede evitar reacciones
inmunes patológicas indeseadas después de la hiperproducción no
regulada de las moléculas basadas en p40.
Los polinucleótidos de acuerdo con la invención
se pueden usar en la producción de proteínas recombinantes de
acuerdo con la invención. Los polinucleótidos también se pueden usar
en vacunas de ADN o vector, junto con otras secuencias de ácido
nucleico que codifican, por ejemplo, proteínas con capacidad
inmunógena obtenidas de patógenos aviares.
Los polinucleótidos de acuerdo con la invención
serán muy útiles para expresión in vivo o in vitro
del polipéptido codificado en cantidades suficientes y en forma
sustancialmente pura. Cuando se usan los polinucleótidos de acuerdo
con la invención para la expresión del polipéptido codificado, los
polinucleótidos pueden incluir, además de la secuencia codificante
para el polipéptido o el fragmento funcional del mismo, otras
secuencias codificantes, por ejemplo, secuencias líder o proteínas
de fusión, tales como secuencias de marcador y similares.
Se puede emplear de forma útil una amplia
diversidad de combinaciones de célula hospedadora y vehículo de
clonación para la clonación de la secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la invención. Un polinucleótido de acuerdo con la
invención se puede clonar en un sistema de expresión apropiado, tal
como un sistema de expresión bacteriano (por ejemplo,
Escherichia coli DH5\alpha), un sistema de expresión vírico
(por ejemplo, Baculovirus), un sistema de levadura (por ejemplo:
Saccharomyces cerevisiae, Pichia) o células eucariotas (por
ejemplo, Cos, BHK, HeLa, HD-11, DT40 o células
CEF). En todos los sistemas, el polinucleótido se clona en primer
lugar en un vector apropiado bajo el control de un promotor
constitutivo o inducible adecuado.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente
invención se refiere a un vector recombinante que comprende un
polinucleótido de acuerdo con la invención. Son vectores adecuados,
por ejemplo, cósmidos, plásmidos bacterianos o de levadura,
plásmidos de amplio espectro de hospedador y vectores obtenidos de
combinaciones de ADN de plásmido y fago o vírico. También están
incluidos vectores obtenidos de ADN cromosómico. Además, puede estar
presente un origen de replicación y/o un marcador de selección
dominante en el vector de acuerdo con la invención. Los vectores de
acuerdo con la invención son adecuados para transformar una célula
hospedadora. Son ejemplos de vectores de clonación adecuados los
vectores plasmídicos tales como pBR322, los diversos pUC, plásmidos
pEMBL y Bluescript o vectores víricos tales como HVT (Herpes virus
de Pavos), MDV (virus de la enfermedad de Marek), ILT (virus de la
laringotraqueítis infecciosa), FAV (adenovirus de aves), FPV (virus
de la Viruela aviar) o NDV (virus de la enfermedad de
Newcastle).
Cuando se usa en la expresión del polipéptido o
fragmentos funcionales del mismo, un vector recombinante de acuerdo
con la presente invención puede comprender además una secuencia de
control de expresión ligada de forma funcional a la secuencia de
ácido nucleico que codifica la proteína.
"Ligado de forma funcional" se refiere a
una disposición en la que las secuencias de control están
configuradas para realizar su función habitual, para llevar a cabo
la expresión del polinucleótido.
Tales secuencias de control de la expresión
comprenden generalmente una secuencia promotora y secuencias que
regulan la transcripción y traducción y/o mejoran los niveles de
expresión. No tienen que estar presentes todas estas secuencias de
control en un vector recombinante siempre que el polinucleótido
deseado sea capaz de ser transcrito y traducido. Por supuesto, las
secuencias de control de la expresión y otras secuencias pueden
variar dependiendo de la célula hospedadora seleccionada o se puede
hacer que sean inducibles. Tales secuencias de control de la
expresión se conocen bien en la técnica y se extienden a cualquier
promotor eucariota, procariótica o vírico o señal
poli-A capaz de dirigir la transcripción génica. Los
ejemplos de promotores útiles son el promotor de
SV-40 (Science 1983, 222: 524-527),
el promotor de metalotioneína (Nature 1982, 296:
39-42), el promotor de choque térmico (Voellmy et
al. P.N.A.S. USA. 1985, 82: 4949-4953), el
promotor de gX de PRV (Mettenleiter y Rauh, J. Virol. Methods 1990,
30: 55-66), el promotor de IE de CMV humano
(documento US 5.168.062), el promotor de LTR del virus de Sarcoma
de Rous (Gorman et al., P. N. A. S. USA 1982, 79:
6777-6781) o el promotor de factor de elongación 1
alfa humano o de ubiquitina, etc.
Después de que se haya clonado el polinucleótido
en un vector apropiado, la construcción se puede transferir a la
célula, bacteria o levadura sola mediante un método apropiado, tal
como electroporación, transfección con CaCl_{2} o lipofectinas.
Cuando se usa un sistema de expresión en baculovirus, el vector de
transferencia que contiene el polinucleótido se puede introducir
por transfección junto con un genoma de baculovirus completo.
Todas estas técnicas se conocen bien en la
técnica y se describen ampliamente en protocolos proporcionados por
fabricantes de materiales de biología molecular (tales como Promega,
Stratagene, Clontech y/o Invitrogen) y en bibliografía o libros de
texto de referencia, por ejemplo, en Rodríguez, R. L. y D. T.
Denhardt, ed., "Vectors: A survey of molecular cloning vectors
and their uses", Butterworths, 1988; Current protocols in
Molecular Biology, eds.: F. M. Ausubel et al., Wiley N. Y.,
1995; Molecular Cloning: a laboratory manual, anteriormente; y DNA
Cloning, Vol. 1-4, 2da edición 1995, eds.: Glover
and Hames, Oxford University Press).
Las células transformadas con un polinucleótido
o un vector de acuerdo con la invención también son parte de la
presente invención. Por tanto, en otro aspecto, la presente
invención proporciona una célula capaz de expresar un polipéptido
recombinante, caracterizada por que la célula comprende un
polinucleótido de acuerdo con la invención que codifica el
polipéptido recombinante expresado.
El término "recombinante" en este contexto
se refiere a un polipéptido que no se expresa en la célula en la
naturaleza. Por tanto, una célula hospedadora que comprende el ADN o
el vector de expresión de acuerdo con la invención también está
dentro del alcance de la invención. Las células hospedadoras
modificadas por ingeniería genética se pueden cultivar en medios
nutrientes convencionales que se pueden modificar, por ejemplo, para
selección, amplificación o inducción de la transcripción apropiada.
Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH, nutrientes,
etc. se conocen bien por los especialistas en la técnica.
Las células que se transforman con un vector de
acuerdo con la invención pueden ser de origen procariota o
eucariota, preferiblemente, las células son de origen eucariota. Las
células eucariotas de acuerdo con la invención pueden ser de origen
aviar o no aviar. Las células que son de origen no aviar pueden ser,
por ejemplo, células BHK, células de insecto, células HeLa o COS.
Preferiblemente, las células son células aviares tales como células
CEF, HD-11 o DT-40.
Una célula transformada de acuerdo con la
invención puede comprender un polinucleótido de acuerdo con la
invención integrado de forma estable en el material genómico o como
parte de un vector que se replica de forma autónoma.
Un cultivo celular que comprende una multitud de
células de acuerdo con la invención también es parte de la presente
invención. Las células de acuerdo con la invención se pueden usar
para expresar las subunidades polipeptídicas o la proteína completa
y se pueden aislar del cultivo celular.
La clonación de las secuencias de nucleótidos
que codifican la subunidades p40 y p35, respectivamente, permite la
producción de proteínas puras, sin otras citoquinas. Esto es
especialmente útil en el caso de la producción de anticuerpos
específicos para las proteínas de la invención. Estos anticuerpos
específicos se pueden generar mediante técnicas generalmente
disponibles. Preferiblemente, los anticuerpos específicos son
anticuerpos monoclonales. Por tanto, la presente invención
proporciona además anticuerpos específicos para las subunidades p40
y/o p35 o para la IL-12 de pollo. Los anticuerpos
de acuerdo con la invención son adecuados para el uso en diagnóstico
o para el aislamiento y la purificación de proteínas, tales como
IL-12 de pollo aviar de preparaciones sin procesar.
Además, los anticuerpos se pueden usar para desarrollar ensayos para
análisis cuantitativo de producción de proteína in vitro o
para mediciones cuantitativas de niveles de proteína in
vivo.
Como ya se ha indicado anteriormente, las
proteínas y los polinucleótidos de acuerdo con la invención son
especialmente útiles para mejorar la respuesta inmune a vacunas
aviares (es decir, se pueden usar como o en adyuvantes).
La vacunación contra una enfermedad infecciosa
pretende suscitar una respuesta inmune que limite los síntomas
clínicos asociados a infección por un patógeno. Es importante que se
desencadene el tipo correcto de reacción inmune, ya que muchos
tipos de mecanismos inmunes que se pueden activar son inadecuados
para controlar el patógeno particular. La baja capacidad de
respuesta a antígenos vacunales se puede superar administrando los
antígenos en combinación con adyuvantes. Los adyuvantes se definen
como los componentes de una formulación de vacuna diferentes del
antígeno que contribuyen a capacidad de respuesta inmune mejorada al
antígeno, por ejemplo, sales de aluminio, emulsiones oleosas,
derivados del péptido muramilo, monofosforil lípido A, liposomas,
QS21^{TM}, MF-59^{TM}, Iscoms^{TM} y
similares.
Los mecanismos celulares y moleculares que se
activan después de la vacunación están fuertemente influidos por la
selección de adyuvante que se administra junto con el antígeno
vacunal. Por tanto, la selección de adyuvantes puede ser tan
crítica como la selección de los propios antígenos vacunales para
proporcionar eficacia óptima.
Las proteínas de acuerdo con la invención, en
particular la IL-12 de pollo, pueden tener un efecto
adyuvante potente sobre la respuesta inmune de un sujeto a una
vacuna. Por tanto, en otra realización, la invención proporciona
una composición de adyuvante que comprende una cantidad de adyuvante
eficaz de una proteína de acuerdo con la invención, en particular
IL-12 de pollo. La composición de adyuvante se puede
administrar de forma concomitante o de forma secuencial con una
formulación de vacuna.
La proteína o las proteínas de acuerdo con la
invención se pueden incluir en la formulación de vacuna. Por tanto,
en otra realización, la presente invención proporciona una vacuna
que comprende al menos un agente activo, una cantidad de adyuvante
eficaz de una proteína de acuerdo con la invención, preferiblemente
IL-12 de pollo y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Una proteína de acuerdo con la presente
invención puede ser una molécula que comprende la totalidad de la
subunidad o las subunidades p40 y p35 o fragmentos de las mismas,
suponiendo que dichos fragmentos hayan conservado su capacidad de
actuar como una citoquina (por ejemplo, cuando se usan en una
vacuna, para conservar su capacidad adyuvante).
Una composición de adyuvante de acuerdo con la
presente invención comprende una proteína de acuerdo con la
invención, preferiblemente IL-12 de pollo, y un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos
farmacéuticamente adecuados son agua, solución salina y similares.
Adicionalmente, la composición de adyuvante puede comprender uno o
más adyuvantes diferentes tales como emulsiones oleosas, sales de
aluminio, derivados de dipéptido muramilo, monofosforil lípido A,
liposomas, QS21^{TM}, MF-59^{TM}, Iscoms^{TM}
y similares. Las proteínas de acuerdo con la invención también se
pueden usar junto con otras citoquinas.
La composición de adyuvante de acuerdo con la
invención puede comprender, en la alternativa, un plásmido de ADN
capaz de expresar una proteína de acuerdo con la invención. Dicho
plásmido de ADN comprende secuencias de ADN que codifican una
proteína de acuerdo con la invención, preferiblemente
IL-12 de pollo, ligada de forma funcional a
secuencias reguladoras de la transcripción. Las secuencias de
nucleótidos que codifican otras citoquinas que se usan junto con
una proteína de acuerdo con la invención pueden estar presentes en
el mismo plásmido de ADN o en un plásmido separado. Después de la
administración de una composición de adyuvante de ADN de este tipo
a un sujeto, las células hospedadoras captan y expresan genes
codificados en el ADN inoculado, dando como resultado la expresión
in vivo de las proteínas de acuerdo con la invención, por
ejemplo, IL-12 de pollo.
Una vacuna de acuerdo con la invención comprende
al menos un agente activo y una cantidad de adyuvante eficaz de una
proteína de acuerdo con la invención, es decir, en una cantidad que
provocará que el sujeto vacunado produzca una respuesta
inmunológica mejorada en comparación con la vacuna sin dicha
proteína.
La cantidad eficaz requerida en una composición
de adyuvante o vacuna de acuerdo con la invención depende del tipo
de agente activo usado, del tipo de patógeno frente al que se
inmuniza, así como del tipo de sujeto vacunado. La determinación de
la cantidad eficaz está dentro de los conocimientos rutinarios del
investigador y generalmente estará en la cantidad de 0,001 a 500
\mug/dosis. Preferiblemente, la cantidad estará entre 0,01 y 50
\mug/dosis, más preferiblemente de 0,1 a 5 \mug/dosis.
El agente activo para el uso en una vacuna de
acuerdo con la invención puede ser de origen vírico, bacteriano o
parasitario. El agente activo puede ser el patógeno entero que
provoca la enfermedad o puede consistir en componentes obtenidos de
dicho patógeno. En el caso de que el agente activo sea un patógeno
entero, dicho patógeno puede ser un patógeno vivo o un patógeno
inactivado. Se considera que los patógenos vivos son cepas
atenuadas o débiles de origen natural de dicho patógeno. Los
patógenos inactivados son patógenos destruidos por medios químicos
o físicos, es decir, el patógeno inactivado o "destruido" ya no
tiene capacidad de replicación. Son medios adecuados para
inactivación química formaldehído, glutaraldehído,
\beta-propiolactona, etilenoimina y derivados y
similares. Los medios adecuados para inactivación física son
radiación con UV, radiación \gamma, "choque térmico",
radiación X y similares. Alternativamente, el agente activo puede
constituir uno o más componentes obtenidos de dicho patógeno que
provoca enfermedad, por ejemplo, proteína purificada, proteína
-polisacárido, proteína- lipopolisacáridos, lipopolisacáridos y
similares.
El agente activo puede ser un plásmido de ADN
capaz de expresión in vivo de un patógeno o componentes
seleccionados obtenidos de dicho patógeno. Además, la vacuna puede
comprender un plásmido de ADN capaz de expresar in vivo una
proteína de acuerdo con la invención. El ADN que codifica dicho
adyuvante de proteína y el ADN que codifica dicho patógeno o
componentes seleccionados pueden estar presentes en el mismo
plásmido o pueden estar presentes en plásmidos separados. Después
de la administración de la vacuna de ADN a un sujeto, las células
hospedadoras captarán y expresarán in vivo dicho agente
activo así como dicha proteína de acuerdo con la invención. Se
describen vacunas de ADN, por ejemplo, en el documento US
5.580.859.
Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente
aceptables que se pueden usar para formular una composición de
adyuvante o una composición de vacuna de acuerdo con la invención
son estériles y fisiológicamente compatibles tales como, por
ejemplo, un tampón acuoso, una solución salina y similares. Además
se pueden añadir estabilizantes, conservantes y similares a estas
composiciones.
Las composiciones de la presente invención
pueden adoptar cualquier forma que sea adecuada para administración
oral o parenteral. Para uso oral, las composiciones de adyuvante o
de vacuna de acuerdo con la invención se pueden formular como
soluciones, jarabes, suspensiones, comprimidos, cápsulas y
similares. Para uso parenteral, las composiciones de acuerdo con la
presente invención se pueden formular en una forma adecuada para
inyección, tales como suspensiones, soluciones, dispersiones,
emulsiones y similares. La preparación de las composiciones de
acuerdo con la presente invención se realiza por medios
convencionales para el especialista. Son vías de administración
preferidas las vías parenterales, por ejemplo, inyección
intramuscular, inyección intravenosa, inyección intradérmica,
inyección subcutánea y vías por la mucosa, por ejemplo, gotas
nasales, gotas oculares, pulverizadores (aerosol) y similares.
Los siguientes ejemplos ilustrarán la invención
sin limitar la invención a los mismos.
Figura 1: secuencia de ADN y proteína del clon
pat.pk0055.c11 (= ChIL-12 p35)
Figura 2: Homología de ADN de p35 de pollo con
secuencias de p35 de ser humano, oveja, caballo, gato, bovino, ratón
y marmota.
Figura 3: Homología de proteína de p35 de pollo
con secuencias de p35 de ser humano, oveja, caballo, gato, bovino,
ratón y marmota.
Figura 4: Homología de proteína de un fragmento
de p35 de pollo (aa 65-205) con secuencias de p35 de
ser humano, oveja, caballo, gato, bovino, ratón y marmota.
Figura 5: Secuencia de clon ChEST582p2;
cebadores 5' y 3' (SEC ID Nº 18 y 17, respectivamente) están
subrayados.
Figura 6: Homología de proteína ChEST582p2 de
pollo con secuencias de p40 de ser humano, oveja, caballo, gato,
bovino, ratón y marmota.
Figura 7: Cebadores de PCR de p40 de
IL-12 5' degenerados; SEC ID Nº
13-16.
Figura 8: Secuencia de ADN y proteína de clon
pND89 (= ChIL-12 p40).
Figura 9: Homología de ADN de p40 de pollo con
secuencias de p40 de ser humano, oveja, caballo, gato, bovino, ratón
y marmota.
Figura 10: Homología de proteína p40 de pollo
con secuencias de p40 de ser humano, oveja, caballo, gato, bovino,
ratón y marmota.
Figura 11: Secuencia de ADN y proteína de clon
pND115 (= IL-12 p40 de pato).
Figura 12: Secuencia de ADN y proteína de clon
pND117 (= IL-12 p40 de pavo).
Figura 13: Homología de ADN de p40 de pollo con
secuencias de p40 de pato y pavo.
Figura 14: Homología de proteína de p40 de pollo
con secuencias de p40 de pato y pavo.
Figura 15: Análisis de transferencia de Western
de sobrenadantes de cultivo de células COS-7 después
de transfección con IL-12 de pollo y otras moléculas
de ADNc (simulado = control de vector vacío).
Figura 16: Inducción dependiente de
IL-12 heterodimérica de pollo de
IFN-\gamma (Fe = felino; simulado = control de
vector vacío).
Figura 17: Proliferación dependiente de
IL-12 heterodimérica de pollo de esplenocitos de
pollo (Fe = felino; simulado = control de vector vacío).
Figura 18: Inducción dependiente de
Flexi-IL-12 de pollo de
IFN-\gamma (Fe = felino; simulado = control de
vector vacío).
Figura 19: Proliferación dependiente de
Flexi-IL-12 de pollo de esplenocitos
de pollo (Fe = felino; simulado = control de vector vacío).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron las líneas celulares de pollo
HD-11 (origen en macrófagos) y DT-40
(origen en células B) como suspensiones celulares en RPMI
(suplementado con suero de fetal de ternero al 10%, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina, glutamina 2 mM y
piruvato 1 mM) y DMEM (suplementado con suero fetal de ternero al
8%, suero de pollo al 2%, glutamina 2 mM, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y piruvato 1 mM)
respectivamente. El tratamiento con lipopolisacáridos (LPS) incluía
la incubación de células con 5 \mug/ml de LPS durante 5 h.
Después del tratamiento, las células se lavaron 2 veces con solución
salina tamponada con fosfato y se usaron posteriormente para el
aislamiento de ARN o se almacenaron a -70ºC. Las células se
mantuvieron en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% a
37ºC.
La línea celular de mamífero
COS-7 (células de riñón de mono verde africano) se
cultivó en DMEM (suplementado con FCS al 10%, glutamina 2 mM, 100
\mug/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina y piruvato 1
mM).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron pollos de tres semanas de edad
Normal White Leghorn libres de patógenos específicos (SPF) del
animalario de Intervet y se alojaron en condiciones SPF. Los
animales recibieron agua y alimentos ad libitum.
Se tamizaron órganos recién aislados de pollo,
pato o pavo, es decir, bazo y riñón, usando un tamiz y tampón de
Hanks. Las células se sedimentaron a 1500 rpm durante 3 minutos a
temperatura ambiente y se lavaron 2 veces usando el mismo
procedimiento. Posteriormente se usaron células de pato y pavo para
el aislamiento de ARN. Las células de pollo se resuspendieron en
RPMI suplementado con suero de pollo al 10%, 100 \mug/ml de
estreptomicina y 100 unidades/ml de penicilina y se cultivaron
durante 16 h. Algunas células se incubaron con 5 \mug/ml de LPS
durante 5 h. Después del tratamiento, las células se lavaron 2 veces
con solución salina tamponada con fosfato y se usaron
posteriormente para aislamiento de ARN o se almacenaron a -70ºC. Las
células se mantuvieron en una atmósfera humidificada de CO_{2} al
5% a 41ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN total usando Trizol reagent^{TM}
(Gibco-Invitrogen), como se describe por el
fabricante. Se comprobó la calidad del ARN en un gel de agarosa al
1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos \mug de ARN total se transcribieron de
forma inversa hasta ADNc usando el protocolo Superscript II
RT^{TM} (Gibco-Invitrogen). Este ADNc preparado
recientemente se usó posteriormente como molde para amplificación
por PCR. Para esto se mezcló 1 \mul de reacción de ADNc de RT
(10-20 ng de molde de ADNc plasmídico) con 0,5
\mul de 1 unidad/\mul de Supertaq^{TM} (HT Biotechnology
Ltd.), 1 \mul de 10 ng/\muI de cada cebador, 1,6 \mul de dNTP
2 mM y 2 \mul de tampón de PCR ST 10x (HT Biotechnology Ltd.) en
un volumen final de 20 \mul. Las condiciones de ciclado de la
reacción eran 94ºC durante 2 min, después 30 ciclos de 94ºC durante
30 s, 55º C durante 1 min, 72ºC durante 1 min 30 s, después 72ºC
durante 2 min para una extensión final. Los productos PCR se
purificaron en gel usando el Qiaquick Gel Extraction kit^{TM}
(Qiagen), se clonaron en el vector pDrive^{TM} (Qiagen PCR
Cloning kit, Qiagen) o en el vector
pCR2.1-TOPO^{TM} (TA Cloning Kit, Invitrogen).
Se purificó el ADN plasmídico usando el Qiagen
Plasmid Midi kit^{TM} (Qiagen). Para reacciones de PCR generales,
en las que se usan 10 ng de un molde plasmídico, se usan las mismas
condiciones de ciclado que las que se han descrito
anteriormente.
Todos los clones se secuenciaron de forma
extensa tanto en las direcciones 5' como 3' usando un kit de
secuenciación de ADN (BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready
Reaction^{TM}, Applied Biosystems). Las secuencias se analizaron
con el software Sequencher^{TM} 4.0 (Gene Codes Corporation).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de secuencia incluyó el uso de
búsquedas Blast (por un servidor interno, InterBLAST, de Intervet
Innovation, Schwabenheim, Alemania), la versión 10.2 de Wisconsin
Package^{TM} (Genetics Computer Group, GCG), Sequencher^{TM} 4.0
(Gene Codes Corporation), OMIGA^{TM} 2.0 (Oxford Molecular Ltd.) y
de GeneDoc^{TM} 2,6
(www.psc.edu/biomed/genedoc).
(www.psc.edu/biomed/genedoc).
\vskip1.000000\baselineskip
ChIL-12 p35. Se escindió
ChIL-12 p35 de longitud completa (clon
pat.pk0055.c11), clonado originalmente en pcDNA3^{TM}
(Invitrogen) (Tirunagaru, VG et al. Genomics 2000, 66: 144)
de pcDNA3 usando EcoRI y NotI y se clonó en los sitios de
restricción correspondientes del vector de expresión eucariota
pcDNA3. (+)^{TM} (Invitrogen). También se clonó el fragmento
ChlL-12 p35 de EcoRI/NotI en los sitios de
restricción correspondientes de pcDNA3.(-)^{TM} (Invitrogen) para
obtener una construcción de control antisentido.
ChIL-12 p40.
ChIL-12 p40 de longitud completa, presente en una
genoteca de ADNc construida a partir de células T y B agrupadas
aisladas de pollos vacunados y reclonadas en pDrive^{TM} (Qiagen),
se escindió de pDrive usando NotI y HindIII y se clonó en los
sitios de restricción correspondientes del vector de expresión
eucariota pcDNA3.1 (-) (Invitrogen).
ChFlexi-IL-12.
Se generó una molécula de IL-12 de pollo de cadena
única mediante una estrategia descrita por McMonagle et al.
(Equina Vet. J. 2001, 33: 693).
Se usaron los siguientes cebadores para
amplificar ChIL-12 p35 sin la supuesta secuencia de
péptido señal de 35 aminoácidos (como se determina por el programa
SPScan del Wisconsin Package (anteriormente) y que introdujeron un
sitio de restricción BamHI 5' y Hindlll 3':
| 5'-TTGGATCCGGTGGCGGCGGATCTCTGCCACCTCCTGCCCA-3' | (SEC ID Nº 9) y | |
| 5'-CCAAGCTTTTACATCTCTGCAGTGAGGGCACTCAGGTAGC-3' | (SEC ID Nº 10). |
\vskip1.000000\baselineskip
Para ChIL-12 p40 se usaron los
siguientes cebadores que introdujeron un sitio de restricción NotI
5' y BamHI 3':
| 5'-TTGCGGCCGCCATGTCTCACCTGCTATTTGCCTTACTTTC-3' | (SEC ID Nº 11) y | |
| 5'-TGGATCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTCTGCAAAGCGTGG3' | (SEC ID Nº 12). |
\vskip1.000000\baselineskip
Ambos fragmentos de PCR se clonaron de forma
separada en pCR2.1-TOPO^{TM} (Invitrogen) y se
secuenciaron de forma amplia. Se escindió ChIL-12
p40 de pCR2.1-TOPO como un fragmento NotI/BamHI y se
clonó en los sitios de restricción correspondientes del vector
pcDNA3.1 (-) (Invitrogen). Se escindió ChIL-12 p35
de pCR2.1-TOPO como un fragmento BamHI/Hindlll y se
clonó en los sitios de restricción correspondientes de la
construcción [ChIL-12 p40]-[pcDNA3.1 (-)] cadena
abajo del fragmento p40. Esto dio como resultado una construcción
heterodimérica p40-p35 de cadena única en la que la
cadena de p40 se une con la cadena de p35 por un enlazador en fase
(Gly_{4}Ser)_{3};
esta molécula se denominó ChFlexi-IL-12. FeFlexi-IL-12. Se clonó IL-12 felina en el vector eucariota pCI-neo^{TM} (Promega) (Dr. L. Nicolson, Univ. of Glasgow Veterinary School, RU) produciendo una construcción similar a la ChFlexi-IL-12.
esta molécula se denominó ChFlexi-IL-12. FeFlexi-IL-12. Se clonó IL-12 felina en el vector eucariota pCI-neo^{TM} (Promega) (Dr. L. Nicolson, Univ. of Glasgow Veterinary School, RU) produciendo una construcción similar a la ChFlexi-IL-12.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron células COS-7
con 1,5 \mug de cada construcción de ADNc usando el reactivo de
Invitrogen Life Technologies Lipofectamine^{TM} (como se describe
por el fabricante) y se cultivaron en placas de 3 cm con DMEM (sin
FCS ni penicilina/estreptomicina). Después de 8 horas, las células
transfectadas se lavaron y cultivaron en DMEM con
penicilina/estreptomicina y FCS al 10%. Después de 72 h de
incubación a 37ºC/CO_{2} al 5% se recogieron los sobrenadantes
del cultivo celular y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min a
4ºC para eliminar restos celulares. Los sobrenadantes se analizaron
por transferencia de Western y se usaron inmediatamente o se
almacenaron a -70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sobrenadantes de cultivo celular de células
COS-7 transfectadas se fraccionaron por tamaño
usando Nu-PAGE^{TM} al 4-12%
(Invitrogen) y se transfirieron sobre filtros de nitrocelulosa
(Schleicher & Schuell). Las transferencias de Western se
bloquearon en leche desnatada al 3% (MPBS) en PBS y se incubaron
posteriormente con un anticuerpo policlonal que se generó contra un
péptido p40 de FeIL-12 diluido 1: 300 en MPBS. El
bloqueo y la incubación de los anticuerpos se realizaron cada uno
durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado extenso (3
veces 5 min) se incubaron las transferencias con anticuerpos de
cabra anti-IgG de conejo conjugados con peroxidasa
alcalina (AP) (Sanbio) diluidos 1: 1000 en MPBS durante 1 h a
temperatura ambiente. Después del lavado (3 veces 5 min) se
visualizaron por tinción los anticuerpos secundarios marcados con
AP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo con NO para la inducción de
ChIFN-\gamma esplénico por
CHIL-12. Se aislaron de forma reciente
esplenocitos de pollo y se sembraron por triplicado en una placa de
96 pocillos con una densidad de 0,5 x 10^{6} células/pocillo en
100 \mul y se incubaron con 50 \mul de diluciones seriadas de
sobrenadantes de cultivo celular de células COS-7
transfectadas con clones de ADNc que codificaban
ChIL-12 p40, ChIL-12 p40 mezclada
con ChIL-12 p35,
ChFlexi-IL-12,
FeFlexi-IL-12 o con un plásmido
pcDNA3.1 vacío (simulado). Cuarenta y ocho horas después de la
adición de las proteínas se recogieron los sobrenadantes (75 \mul)
y se analizaron para la presencia de ChIFN-\gamma
biológicamente activo. Para esto se incubaron 100 \mul de 1,5 x
10^{6}/ml de células HD-11 con 75 \mul de los
sobrenadantes recogidos durante 24 h a 37ºC/CO_{2} al 5% en placas
de 96 pocillos. La activación de células HD-11 por
ChIFN-\gamma se midió como una función de
acumulación de nitrito en los sobrenadantes de cultivo usando el
ensayo de Griess (Ding, A H et al., J. Immunol. 1988, 141:
2407; Stuehr, D J y C F Nathan, J. Exp. Med. 1989, 169: 1543).
Ensayo para proliferación de esplenocitos por
ChIL-12. Después de retirar 75 \mul de los
sobrenadantes (véase la sección Ensayo con NO para la inducción
de ChIFN-\gamma esplénico por
CHIL-12.) se añadieron 50 \muI de medio y 18,5
kBq de metil-^{3}H-timidina (25
\muI por pocillo) a los restantes 75 \mul en la placa de 96
pocillos y se incubaron durante 18-20 h a
41ºC/CO_{2} al 5%. Después de la incubación se contó la
radiactividad incorporada usando un contador \beta LKB
Betaplate^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
La significación de las diferencias entre las
medias de producción de NO o entre las medias de proliferación
celular se analizó usando el ensayo t de Student. Las diferencias se
consideraron significativas con un nivel de confianza del 95% (P
< 0,05).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la fase de lectura abierta
(nucleótidos 1-618) del clon de ADNc pat.pk0055.c11
(véase la Figura 1), que se aisló de un proyecto de secuenciación
de alto rendimiento de la genoteca de ADNc de células T estimuladas
con Con A de pollo (Tirunagaru et al., anteriormente) mostró
que es homólogo a las secuencias de ADNc de p35 de
IL-12 de ser humano (43% de homología global, M65271
en EMBL/Genbank), oveja (45% de homología global, AF173557 en
EMBL/Genbank), caballo (48% de homología global, Y11130 en
EMBL/Genbank), gato (43% de homología global, Y07761 en
EMBL/Genbank), bovino (45% de homología global, U14416 en
EMBL/Genbank), ratón (42% de homología global; M86672 en
EMBL/Genbank) y marmota (45% de homología global, X970189 en
EMBL/Genbank) (véase la Figura 2). Un alineamiento múltiple de la
proteína ChIL-12 p35 codificada por pat.pk0055.c11
con proteínas p35 de IL-12 de ser humano, oveja,
caballo, gato, bovino, ratón y marmota produce una homología de
aminoácidos global del 27%, 25%, 30%, 24%, 25%, 29% y 21%,
respectivamente (véase la Figura 3). Cuando se eliminan los primeros
64 aa (restos 1-64) de pat.pk0055.c11, las
homologías con las proteínas p35 de IL-12 de ser
humano, oveja, caballo, gato, bovino, ratón y marmota aumenta hasta
el 33%, 32%, 37%, 25%, 32%, 34% y 28%, respectivamente (véase la
Figura 4), indicando que el fragmento N-terminal de
pat.pk0055.c11 no está tan altamente conservado como el resto de la
proteína. Basándose en estas homologías de secuencia, se concluye
que el clon pat.pk0055.c11 codifica la subunidad p35 de
IL-12 de pollo.
\global\parskip0.870000\baselineskip
La secuencia codificante, es decir, los
nucleótidos 35-1042 de la subunidad p40 de
interleuquina 12 de ratón (MuIL-12 p40; número de
Acceso a EMBL/Genbank M86671) se usó para explorar la Base de Datos
de Depósito de EST de Pollo de UMIST/Nottingham/Dundee
(\underbar{http://www.chick.umist.ac.uk/cgi-bin/chicken\_database.cgi})
usando el programa tBlastX. Se recuperó una secuencia de EST de
pollo (ID de clon: ChEST582p2; nombre EST 603603708F1; obtenido de
riñón adulto) que mostró el 51% de identidad con los aa
251-279 y el 66% de identidad con los aa
310-327 de la secuencia de MulL-12
p40. No se ha asignado ningún número de Acceso a Genbank a este clon
ChEST582p2 y no se realizaron anotaciones que apuntaban en la
dirección de IL-12 por los propietarios de esta
base de datos de EST de Pollo. Una búsqueda en base de datos en la
misma base de datos de EST de pollo con este clon ChEST582p2 no dio
como resultado un clon más largo o de longitud completa. Una
búsqueda en base de datos similar en la base de datos de EST de
pollo de U. D. (\underbar{http://www.chickest.udel.edu/}) con la
secuencia codificante, es decir, los nucleótidos
35-1042, de MulL-12 p40 (número de
Acceso a EMBL/Genbank M86671) no dio como resultado una
coincidencia válida usando el programa BlastN ni una búsqueda con el
clon ChEST582p2 dio como resultado un clon más largo o de longitud
completa.
El clon ChEST582p2 identificado tiene 848
nucleótidos de longitud, de los cuales los nucleótidos
3-233 (que incluyen un codón de terminación)
codifican un polipéptido de 76 aa de longitud (véase la Figura 5).
Un alineamiento múltiple de la secuencia de proteína de ChEST582p2
predicha mostró que se alinea con la parte más
C-terminal de MuIL-12 p40 (35% de
homología global; M86671 en EMBL/Genbank) y con la parte
C-terminal de IL-12 p40 de varias
otras especies incluyendo ser humano (43% de homología global,
M65272 en EMBL/Genbank), oveja (43% de homología global, AF004024
en EMBL/Genbank), caballo (43% de homología global, Y11129 en
EMBL/Genbank), gato (43 % de homología global, Y07762 en
EMBL/Genbank), bovino (42% de homología global, U11815 en
EMBL/Genbank) y marmota (51% de homología global, X97019 en
EMBL/Genbank) (véase la Figura 6).
Estas altas homologías prueban que el clon
ChEST582p2 codifica la parte C-terminal de la
subunidad p40 de IL-12 de pollo.
Para clonar la subunidad de proteína
IL-12 p40 de pollo de longitud completa
(ChIL-12 p40) se han usado tres estrategias.
En la primera estrategia se diseñaron 3
cebadores degenerados:
| 5'-ATGTGTCACCAGYRGTTGGTCMTCTCYTG-3' | (SEC ID Nº 13), | |
| 5'-ATGTGTCYTCAGMAGYTRRYCATCTCCTG-3' | (SEC ID Nº 14) y | |
| 5'-ATGTGTCWYCAGYRGTTGGTCMTCTCCTG-3') | (SEC ID Nº 15), |
\vskip1.000000\baselineskip
y 1 cebador de extremo 5' específico
| 5'-ATGCACCCTCAGCAGTTGGTCGTTTCCTG-3' | (SEC ID Nº 16), |
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- basándose en el extremo 5' de ser humano (M65272 en EMBL/Genbank), reno (U57752 en EMBL/Genbank), caballo (Y11129 en EMBL/Genbank), oveja (AF004024 en EMBL/Genbank), ratón (M86671 en EMBL/Genbank) y marmota (X97019 en EMBL/Genbank) (véase la Figura 7). En combinación con un cebador de ChESTp582p2 3'
| 5'-TTATCTGCAAAGCGTGGACCACTCACTCCAGGAT-3' | (SEC ID Nº 17) |
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- (complementario a las posiciones de nucleótidos 233-200 en la Figura 5) se realizó una reacción de RT-PCR en ARN total aislado de células HD-11 (macrófago) de pollo, células DT-40 (B) de pollo, células de riñón de pollo y células de bazo de pollo tratadas con o sin 5 \mug/ml de lipopolisacárido (LPS). Sorprendentemente, ninguna de las combinaciones de cebadores dio como resultado un producto de PCR. Como un control se realizó una reacción de RT-PCR simultáneamente usando un cebador de ChESTp582p2 de extremo 5'
| 5'-ACCTGGACATATCCCAAGACCTGGAGCACA-3' | (SEC ID Nº 18) |
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- (posiciones de nucleótidos 12-41 en la Figura 5) y el cebador de ChESTp582p2 de extremo 3' (SEC ID Nº 17, anteriormente). Esta combinación de cebador dio como resultado un fragmento de PCR de -200 nucleótidos. Estos resultados indican que no es posible obtener una molécula de IL-12 p40 de pollo de longitud completa usando una estrategia de RT-PCR basada en las secuencias de IL-12 p40 de extremo 5' de ser humano, reno, caballo, ratón o marmota con cebadores degenerados en combinación con un cebador de extremo 3' específico.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En la segunda estrategia se usaron grupos de
plásmidos aislados de una genoteca de ADNc de HD-11
que se construyó a partir células HD-11
(macrófagos) de pollo estimuladas durante 5 h con 5 \mug/ml de LPS
(Sick C, Schneider K, Staeheli P, Weining K C. Novel chicken CXC
and CC chemokines. Cytokine 2000, 12: 181-186) En
esta genoteca, las moléculas de ADNc se clonan unidireccionalmente
entre los sitios EcoRI y XhoI del vector de expresión eucariota
pcDNA1. En una reacción de PCR con un cebador de vector pcDNA1 de
extremo 5' 116 nucleótidos cadena arriba del sitio de restricción
EcoRI
| 5'-CTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTT-3' | (SEC ID Nº 19) |
(posiciones de nucleótidos
2918-2951 del vector pcDNA1) y el cebador de
ChEST582p2 3' (SEC ID Nº 17, anteriormente) se obtuvo un fragmento
de PCR de \sim1000 nucleótidos que se clonó en pDrive^{TM}
(Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
En la tercera estrategia se usaron grupos de
plásmidos aislados a partir de una genoteca de ADNc que se construyó
a partir de células T y B agrupadas aisladas de pollos vacunados.
En esta genoteca, las moléculas de ADNc se clonan
unidireccionalmente entre los sitios NotI y EcoRI del vector de
expresión eucariota pBlueScript^{TM} (Stratagene). En una
reacción de PCR con un cebador de vector pBlueScript de extremo 5'
aproximadamente 120 nucleótidos cadena arriba del sitio de
restricción NotI y el cebador ChEST582p2 3' (SEC ID Nº 17,
anteriormente), se obtuvo un fragmento de PCR de \sim 1000
nucleótidos que se clonó en pDrive.
Para investigar si este clon, denominado pND89,
contiene el fragmento de IL-12 p40 de \sim 200
nucleótidos en el extremo 3', se realizó una reacción de PCR usando
pND89 como molde en combinación con el cebador de ChESTp582p2 5'
(SEC ID Nº 18, anteriormente) y ChESTp582p2 3' (SEC ID Nº 17,
anteriormente). Los resultados muestran un fragmento de PCR
\sim200 nucleótidos que indica que el clon de ADNc pND89 de
\sim1000 nucleótidos de longitud contiene el fragmento de
IL-12 p40 de 222 nucleótidos de longitud.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon pND89 se secuenció de forma amplia, lo
que mostró que el clon de ADNc (del inicio al final) tiene 948
nucleótidos de longitud y codifica una proteína de 315 aa (véase la
Figura 8). El análisis de la secuencia de ADNc de pND89 que
contiene la fase de lectura abierta (nucleótidos
1-948) mostró que es homóloga a las secuencias de
ADNc de IL-12 p40 de ser humano (57% de homología
global, M65272 en EMBL/Genbank), oveja (56% de homología global,
AF004024 en EMBL/Genbank), caballo (57% de homología global, Y11129
en EMBL/Genbank), gato (55% de homología global, Y07762 en
EMBL/Genbank), bovino (56% de homología global, U11815 en
EMBL/Genbank), ratón (55% de homología global; M86671 en
EMBL/Genbank) y marmota (57% de homología global, X97019 en
EMBL/Genbank) (véase la Figura 9). Un alineamiento múltiple de la
proteína Ch IL-12 p40 codificada por pND89 con las
proteínas IL-12 p40 de ser humano, oveja, caballo,
gato, bovino, ratón y marmota produce una homología de aminoácidos
del 41%, 40%, 40%, 42%, 39%, 36% y 41%, respectivamente (véase la
Figura 10). El análisis de secuencia mostró además la presencia de
un péptido señal dando como resultado el sitio de escisión entre los
aa 20-21 un péptido señal de 20 aa y una proteína
madura de 295 aa. La presencia de una caja WSXWS (aa
305-311), un dominio de tipo C2 similar a Ig
(restos aa 41-94) y un dominio de fibronectina de
tipo III (restos aa 228-308), que son ambos
característicos para IL-12 p40, se confirmaron por
similitud. Estas homologías de secuencia prueban que el clon pND89
codifica la subunidad p40 de IL-12 de pollo.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la secuencia de IL-12 p40
de pollo y la alta homología existente entre pollo y pato/pavo, se
intentó clonar las subunidades de IL-12 p40 de pato
y pavo. En combinación con un cebador de IL-12 p40
de pollo de extremo 5'
| 5'-ATGTCTCACCTGCTATTTGC-3' | (SEC ID Nº 20) |
\vskip1.000000\baselineskip
(posiciones de nucleótidos 1-20
en la Figura 8) y un cebador de IL-12 p40 de pollo
de extremo 3'
| 5'-TTATCTGCAAAGCGTGGACCACT-3' | (SEC ID Nº 21) |
(complementario a las posiciones de nucleótidos
948-926 en la Figura 8) se realizó una reacción de
RT-PCR en ARN total aislado de células de bazo y
riñón de pato o pavo. De las reacciones de RT-PCR se
obtuvieron fragmentos de PCR de \sim1000 nucleótidos que se
clonaron posteriormente en el vector pCR2.1^{TM} (Invitrogen). El
clon de pato se denominó pND115 y el clon de pavo pND117. Los clones
pND115 y pND117 se secuenciaron de forma amplia, lo que mostró que
ambos clones de ADNc (del inicio al final) tienen 948 nucleótidos de
longitud y codifican proteínas de 315 aa (véase las Figuras 11 y
12). El análisis de las secuencias de ADNc de pND115 y pND117 que
contienen la fase de lectura abierta (nucleótidos
1-948) mostró que ambas tienen > 99% de
identidad con la secuencia de ADNc de IL-12 p40 de
pollo (véase la Figura 13). Un alineamiento múltiple de las
proteínas pND115 y pND117 predichas mostró que pND115 es idéntica a
IL-12 p40 de pollo y que pND117 tiene > 99% de
identidad con la proteína IL-12 p40 de pollo (véase
la Figura 14). Las pequeñas diferencias en homología entre pND115,
pND117 e IL-12 p40 de pollo son el resultado de
pequeñas sustituciones en la secuencia de ADNc que dan como
resultado mutaciones de restos aminoacídicos silenciosas tanto para
pND115 como para pND117 y 1 cambio de resto aminoacídico por pND117
(véase la Figura 14). Basándose en estas altas homologías de
secuencia se concluye que el clon pND115 codifica la subunidad p40
de IL-12 de pato y que el clon pND117 codifica la
subunidad p40 de IL-12 de pavo.
\vskip1.000000\baselineskip
Para detectar las subunidades secretadas p40 de
ChIL-12 y p35 de ChIL-12 después de
la (co-)transfección de células COS-7 se aplicó
análisis de transferencia de Western no desnaturalizante. Para esto
se usó un anticuerpo policlonal que se generó contra un péptido de
la subunidad p40 de IL-12 Felina (Fe). Con este
anticuerpo anti-péptido FeIl-12 p40
se podrían detectar ChIL-12 p40 y el homodímero de
ChIL-12 p40: ChIL-12 p80 (Ch
(p40)_{2}) en los sobrenadantes de células
COS-7 transfectadas (Figura 15, carril 1). En los
sobrenadantes de células COS-7 transfectadas tanto
con ChIL-12 p35 como con ChIL-12 p40
se podría detectar la proteína ChIL-12 p70
heterodimérica (ChIL-12) (Figura 15, carril 4)
indicando que la cadena de p40 y p35 interaccionan entre sí en la
molécula IL-12 p70 heterodimérica. La formación de
ChIL-12 p70 era más eficaz que la formación de
ChIL-12 p80 homodimérica ya que no se pudieron
detectar o solamente cantidades muy pequeñas de
ChIL-12 p80. Además, la formación de
ChIL-12 p70 es específica ya que la
co-transfección de ADNc de ChIL-12
p40 con ADNc de ChIL-12 p35 antisentido o con una
construcción de ADNc que codifica una proteína vírica irrelevante
(IBV-N) no dio como resultado heterodimerización
(Figura 15, carriles 5-6).
\vskip1.000000\baselineskip
Una característica de actividad de
IL-12 en mamíferos es su inducción de
IFN-\gamma por linfocitos T. Por lo tanto, los
niveles de IFN-\gamma se evaluaron en el medio de
cultivo de esplenocitos de pollo aislados recientemente incubados
con diluciones de diversas proteínas aisladas después de la
(co-)expresión transitoria en células COS-7. Se
midió ChIFN-\gamma como una función de acumulación
de nitrito usando células HD-11 y el ensayo de
Griess. Como se muestra en la Figura 16, solamente
ChIL-12 p7C heterodimérica (una
co-transfección de ChIL-12 p40 con
ChIL-12 p35) es capaz de inducir producción de
IFN-\gamma en esplenocitos de pollo de un modo
que depende de la concentración. La introducción por transfección
del vector simulado o de ChIL-12 p40 sola no pudo
inducir la secreción de ChIFN-\gamma hasta un
nivel en alguna manera comparable con la ChIL-12
p70 heterodimérica. A continuación es evidente que solamente la
IL-12 con especificidad de especie induce
IFN-\gamma en esplenocitos de pollo ya que la
FeFlexi-IL-12 no indujo cantidades
significativas de ChIFN-\gamma. Las diferencias
en la producción de NO entre ChIL-12 p40 y
ChIL-12 p70 (una co-transfección de
ChIL-12 p40 con ChIL-12 p35) y entre
ChIL-12 p70 y
FeFlexi-IL-12 eran significativas (P
< 0,05). Tomados de forma conjunta, estos resultados indican que
ChIL-12 es bioactiva y que la inducción de
IFN-\gamma mediante esplenocitos de pollo depende
de ChIL-12.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra característica de IL-12,
compartida con varias otras citoquinas, es su inducción de
proliferación de células T. La respuesta de crecimiento de
esplenocitos de pollo recién aislados a diversas proteínas, aisladas
después de
(co-)expresión transitoria en células COS-7, se midió por un ensayo de proliferación celular. Solamente la ChIL-12 p70 heterodimérica (una co-transfección de ChIL-12 p40 con ChIL-12 p35) fue capaz de inducir la proliferación de esplenocitos de pollo (Figura 17). Los datos de proliferación relativamente bajos observados para las primeras diluciones se explican posiblemente por efectos de sobredosis para estos parámetros. Ni la ChIL-12 p40 sola ni FeFlexi-IL-12 fueron capaces de inducir respuestas proliferativas similares. De la dilución 1/6, las diferencias de proliferación entre ChlL-12 p40 y ChIL-12 p70 (una co-transfección de ChIL-12 p40 con ChIL-12 p35) y entre ChIL-12 p70 y FeFlexi-IL-12 fueron significativas (P <0,05). Tomados de forma conjunta, estos resultados prueban que ChIL-12 es bioactiva y que la molécula es capaz de inducir proliferación de esplenocitos de pollo.
(co-)expresión transitoria en células COS-7, se midió por un ensayo de proliferación celular. Solamente la ChIL-12 p70 heterodimérica (una co-transfección de ChIL-12 p40 con ChIL-12 p35) fue capaz de inducir la proliferación de esplenocitos de pollo (Figura 17). Los datos de proliferación relativamente bajos observados para las primeras diluciones se explican posiblemente por efectos de sobredosis para estos parámetros. Ni la ChIL-12 p40 sola ni FeFlexi-IL-12 fueron capaces de inducir respuestas proliferativas similares. De la dilución 1/6, las diferencias de proliferación entre ChlL-12 p40 y ChIL-12 p70 (una co-transfección de ChIL-12 p40 con ChIL-12 p35) y entre ChIL-12 p70 y FeFlexi-IL-12 fueron significativas (P <0,05). Tomados de forma conjunta, estos resultados prueban que ChIL-12 es bioactiva y que la molécula es capaz de inducir proliferación de esplenocitos de pollo.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de mostrar que la
co-transfección de ChIL-12 p40 de
cadena única con ChIL-12 p35 de cadena única dio
como resultado la formación de un heterodímero bioactivo de
ChIL-12 (Figuras 16 y 17) se construyó una molécula
de IL-12 de cadena única
(ChFlexi-IL-12).
ChFlexi-IL-12 es una construcción
heterodimérica de p40-p35 de cadena única en la que
la cadena de ChIL-12 p40 está enlazada a la cadena
de ChIL-12 p35 por un enlazador en fase
(Gly_{4}Ser)_{3}, también denominado una región
"bisagra". Se pudo demostrar por análisis de transferencia de
Western que el perfil de expresión de la
ChFlexi-IL-12 después de la
introducción por transfección en células COS-7 es
comparable al de FeFlexi-IL-12.
Después de la incubación de esplenocitos de
pollo recién aislados con
ChFlexi-IL-12 se observó tanto la
liberación de IFN-\gamma como proliferación
celular (Figura 18 y Figura 19). Los resultados de estos
experimentos prueban que la construcción flexi de
IL-12 de pollo también es bioactiva.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Akzo Nobel N. V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Citoquinas aviares, tales como
IL-12, que comprenden una(s)
subunidad(es) p40 y/o p35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
2002-099-FF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pollo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pollo
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 948
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pollo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 618
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pollo
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 948
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pavo
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 948
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pavo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR y/o secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (13)
1. Proteína IL12 aviar que comprende las
subunidades polipeptídicas:
- -
- una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud de al menos el 80% con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº 1,
- -
- una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud de al menos el 80% con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº 2.
2. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende una subunidad que tiene un peso molecular aparente de
aproximadamente 40 kD y que tiene una secuencia de aminoácidos como
se ilustra en la SEC ID Nº 1, la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 7.
3. Proteína de acuerdo con la reivindicación 2,
compuesta por:
- -
- una subunidad que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 40 kD y que tiene una secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº 1 y
- -
- una subunidad que tiene un peso molecular aparente de 35 kD y que tiene la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº 2, estando dichas subunidades enlazadas.
4. Polinucleótido de IL12 aviar aislado que
codifica al menos una de las siguientes subunidades
polipeptídicas:
- -
- una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud de al menos el 80% con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº 1 y
- -
- una subunidad que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud de al menos el 80% con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº 2.
5. Polinucleótido de IL12 aviar aislado que
comprende al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada del
grupo que consiste en:
- -
- una secuencia polinucleotídica que muestra una identidad de al menos el 80% con la longitud completa de la secuencia ilustrada en la SEC ID Nº 3,
- -
- una secuencia polinucleotídica que muestra una identidad de al menos el 80% con la longitud completa de la secuencia ilustrada en la SEC ID Nº 4.
6. Vector recombinante que comprende un
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
7. Célula que comprende un polinucleótido de
acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 o un vector de acuerdo con la
reivindicación 6.
8. Composición de adyuvante que comprende una
proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-3 o uno o más polinucleótidos de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 4-5 o un vector
de acuerdo con la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
9. Composición de vacuna que comprende un agente
activo obtenido de un patógeno aviar y una proteína de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, junto con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Composición de vacuna que comprende un
agente activo obtenido de un patógeno aviar y uno o más
polinucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
4-5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 6,
junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Uso de una proteína de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 como un
inmunoestimulante.
12. Uso de una proteína de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un
adyuvante de vacuna.
13. Composición farmacéutica que comprende una
proteína de acuerdo con la reivindicación 1 junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39166202P | 2002-06-26 | 2002-06-26 | |
| US391662P | 2002-06-26 | ||
| US464630 | 2003-06-17 | ||
| US10/464,630 US7347996B1 (en) | 2002-06-26 | 2003-06-17 | Avian cytokines, such as IL-12, comprising a p40 and/or p35 subunit and vaccines |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2318163T3 true ES2318163T3 (es) | 2009-05-01 |
Family
ID=30003199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03761543T Expired - Lifetime ES2318163T3 (es) | 2002-06-26 | 2003-06-25 | Citoquinas aviares, tales como il-12, que comprenden una (s) subunidad (es) p40 y/o p35. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7347996B1 (es) |
| EP (1) | EP1519953B1 (es) |
| JP (1) | JP4376783B2 (es) |
| AT (1) | ATE418564T1 (es) |
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