ES2386991T3 - Nuevas composiciones de laccasas y sus procedimientos de utilización - Google Patents
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Abstract
Una laccasa aislada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, oque tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % a la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.
Description
Nuevas composiciones de laccasas y sus procedimientos de utilización
[0001] La presente invención está relacionada con las laccasas y con secuencias de ácidos nucleicos que codifican las laccasas, y con procedimientos enzimáticos para el blanqueo de materiales.
[0002] Las laccasas son enzimas que contienen cobre conocidas por ser buenos agentes oxidantes en presencia de oxígeno. Las laccasas se encuentran en microbios, hongos, y organismos superiores. Las enzimas laccasas se utilizan para numerosos aplicaciones, incluyendo el blanqueo de pulpa de celulosa y de materiales textiles, el tratamiento de aguas residuales de la pulpa de celulosa, desteñido, eliminación industrial del color, detergentes blanqueantes de lavandería, blanqueantes dentarios para el cuidado bucal, y como catalizadores o ayudantes para las reacciones de polimerización y oxidación.
[0003] Las laccasas se pueden utilizar para una gran variedad de aplicaciones en una serie de industrias, incluyendo la industria de los detergentes, la industria del papel y pulpa de celulosa, la industria textil y la industria alimentaria. En una aplicación, se utilizan enzimas que oxidan el fenol como ayudante para la eliminación de manchas de la ropa, tales como manchas de comida, durante el lavado con detergente.
[0004] La mayoría de laccasas presentan un pH óptimo en el intervalo de pH ácido mientras que permanecen inactivas a pH neutros o alcalinos.
[0005] Se sabe que las laccasas son producidas por una amplia variedad de hongos, incluyendo las especies del género Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytis, Pleurotus, Fornes, Phlebia, Trametes, Polyporus, Stachybotrys, Rhizoctonia, Bipolaris, Curvularia, Amerosporium, y Lentinus.
Zhang y col. (Enz. Microb. Tech. 39 (2006) 92 – 97) describen la caracterización y capacidad de decoloración de una laccasa procedente de Panus rudis.
Michniewicz y col. (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 69: 682-688) describen la caracterización de dos isoformas de una laccasa procedente de la cepa 137 de Cerrena unicolor.
No obstante, aún existe la necesidad de laccasas que tengan diferentes perfiles de comportamiento en diversas aplicaciones.
[0006] Para muchas aplicaciones, la eficacia oxidante de una laccasa se puede mejorar con la utilización de un mediador, también conocido como agente potenciador. Los sistemas que incluyen una laccasa y un mediador son conocidos en la materia como sistemas laccasa-mediador (LMS). Los mismos compuestos también se pueden utilizar para activar o iniciar la acción de la laccasa.
[0007] Existen varios mediadores conocidos para su utilización en un sistema laccasa-mediador. Éstos incluyen HBT (1-hidroxibenzotriazol), ABTS [ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfínico)], NHA (N-hidroxiacetanilida), NEIAA (N-acetil-N-fenilhidroxilamina), HBTO (3-hidroxi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona), y VIO (ácido violúrico). Además, se ha encontrado que existen varios compuestos que contienen NH-OH o N-O que son útiles como mediadores.
[0008] Los grupos funcionales y los sustituyentes tienen grandes efectos sobre la eficacia del mediador. Incluso dentro de la misma clase de compuestos, un sustituyente puede cambiar la especificidad de la laccasa hacia un sustrato, de esta forma incrementando o reduciendo enormemente la eficacia del mediador. Además, un mediador puede ser eficaz para una aplicación particular, pero no apto para otra aplicación. Otro inconveniente de los mediadores actuales es su tendencia a polimerizar durante su utilización. Así, existe la necesidad de descubrir mediadores eficientes para aplicaciones específicas. Una de dichas aplicaciones es el blanqueo de materiales textiles, en donde también es importante que los mediadores no sean indebidamente costosos o peligrosos. A continuación se proporcionan otras aplicaciones del sistema laccasa-mediador.
[0009] Así, existe la necesidad de identificar mediadores adicionales que activen la laccasa, y/o potencien la actividad de enzimas que presenten actividad laccasa.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0010] En el presente documento se describen nuevas laccasas, secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichas laccasas, y vectores y células hospedadoras para la expresión de las laccasas.
[0011] La Figura 1 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Trichoderma, pTrex3glaccaseA, utilizado en el Ejemplo 7. El gen A de la laccasa se puede sustituir con otros genes de la laccasa descritos en el presente documento.
[0012] La Figura 2 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Aspergillus, pKB401, utilizado en el Ejemplo 8a. El gen B de la laccasa se puede sustituir con otros genes de la laccasa descritos en el presente documento.
[0013] La Figura 3 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Aspergillus, pKB403, utilizado en el Ejemplo 8b. El gen B de la laccasa se puede sustituir con otros genes de la laccasa descritos en el presente documento.
[0014] La Figura 4 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Trichoderma, pTrex4laccaseB, utilizado en el Ejemplo 8d. El gen B de la laccasa está fusionado al gen que codifica el dominio catalítico de CBH1. El gen B de la laccasa se puede sustituir con otros genes de la laccasa descritos en el presente documento.
[0015] La Figura 5 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Streptomyces (pKB251) para el gen B de la laccasa optimizado codónicamente, utilizado en el Ejemplo 9.
[0016] La Figura 6 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Bacillus (p2JMagk1031nk2Elaccase) para el gen D de la laccasa optimizado codónicamente fusionado al gen que codifica BCE103, utilizado en el Ejemplo 13.
[0017] La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra los resultados del blanqueo de índigo soluble utilizando una laccasa de la especie Thielavia y una variedad de mediadores a unas concentraciones de 50 y 500 µM.
[0018] La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra los resultados del blanqueo de índigo soluble utilizando una laccasa de las especies Thielavia, Myceliophthora y Cerrena y una variedad de mediadores a pH 5.
[0019] La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra los resultados del blanqueo de índigo soluble utilizando una laccasa de las especies Thielavia, Myceliophthora y Cerrena y una variedad de mediadores a pH 7.
[0020] La Figura 10 es una gráfica con la diferencia total de color para la laccasa D recombinante y el mediador siringamida en función de la concentración de mediador y la concentración de enzima a 60 °C y pH 6.
[0021] La Figura 11 es una gráfica con la diferencia total de color para la laccasa D recombinante y el mediador siringonitrilo en función de la concentración de mediador y la concentración de enzima a 60 °C y pH 6.
[0022] A menos que se defina otra cosa en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen los mismos significados entendidos habitualmente por alguien con conocimientos ordinarios en la materia a la que pertenece esta invención. Singleton, y col., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan a alguien con conocimientos un diccionario general con muchos de los términos utilizados en esta invención. A pesar de que se puede utilizar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o puesta a prueba de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Se debe entender que esta invención no está limitada por la metodología, protocolos, y reactivos particulares descritos, puesto que pueden cambiar.
1. Laccasa y enzimas relacionadas con las laccasas
[0023] En el contexto de esta invención, las laccasas se encuentran en la clasificación de enzimas (EC 1.10.3.2). Se conocen enzimas laccasas de origen microbiano y vegetal.
La invención proporciona una laccasa que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, o que presenta una identidad de secuencia de al menos el 90 % a la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16. Las laccasas que tienen las secuencias de la SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 proceden de Cerrena unicolor. La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica una laccasa de la invención. En formas de realización específicas, el ácido nucleico puede tener la secuencia de la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.
[0024] Además, las laccasas se pueden producir mediante un procedimiento que comprende el cultivo de una célula hospedadora transformada con un vector de ADN recombinante que lleva una secuencia de ADN que codifica dicha laccasa, así como secuencias de ADN que permiten la expresión de la secuencia de ADN que codifica la laccasa, en un medio de cultivo en condiciones que permitan la expresión de la enzima laccasa, y la recuperación de la laccasa a partir del cultivo.
[0025] El vector de expresión se puede transformar en una célula hospedadora adecuada, tal como una célula fúngica, de los que son ejemplos preferidos las especies de Aspergillus, lo más preferentemente Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, y especies de Fusarium, lo más preferentemente Fusarium venenatum. Las células fúngicas se pueden transformar mediante un procedimiento que supone la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos, seguido por la regeneración de la pared celular de una forma ya conocida. La utilización de Aspergillus como microorganismo hospedador se describe en el documento EP 238.023. La utilización de Fusarium como microorganismo hospedador se describe en los documentos WO 96/00787 y WO 97/08325.
[0026] Alternativamente, el organismo hospedador puede ser una bacteria, en particular las cepas de Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, o E. coli. La transformación de células bacterianas se puede llevar a cabo según los procedimientos convencionales, por ejemplo, como se describe en T. Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982. La selección de secuencias de ADN apropiadas y la construcción de los vectores también se pueden llevar a cabo mediante procedimientos habituales, cf. T. Maniatis y col., op. cit.
[0027] El medio utilizado para cultivar las células hospedadoras transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células hospedadoras en cuestión. La enzima expresada puede ser secretada de manera conveniente al medio de cultivo y se puede recuperar de él mediante procedimientos muy conocidos que incluyen la separación de las células del medio mediante centrifugación o filtración, la precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante una sal como sulfato de amonio, seguido de procedimientos cromatográficos como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.
[0028] En una forma de realización, el hospedador de expresión puede ser Trichoderma reesei con la región codificante de la laccasa bajo el control de un promotor de CBH1 y un terminador. (Véase, por ejemplo, patente de EE.UU. Nº 5.861.271). El vector de expresión puede ser pTrex3g, como se describe en la Solicitud de patente de EE.UU. Nº 11/245.628 presentada el 7 de octubre de 2005 (N° de Expediente del Apoderado GC886).
[0029] De esta forma se prepararon los siguientes nuevos genes y laccasas:
A. Gen A1 de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa CBS115.075 (SEQ ID No. 1) que tiene la secuencia
que codifica la enzima laccasa A1, con la secuencia de la proteína traducida (SEQ ID No. 2) B. Gen A2 de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa CBS 154.29 (SEQ ID No. 3) que codifica la enzima laccasa A2, con la secuencia de la proteína traducida (SEQ ID No. 4)
C. Gen B1 de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa CBS1115.075 (SEQ ID No. 5) que codifica la enzima laccasa B1, con la secuencia de la proteína traducida (SEQ ID No. 6)
D. Gen B2 de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa CBS 154.29 (SEQ ID No. 7)
que codifica la enzima laccasa B2, con la secuencia de la proteína traducida (SEQ ID No. 8) E. Gen B3 (parcial) de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa ATCC20013 (SEQ ID No. 9)
que codifica la enzima laccasa B3, con la secuencia parcial de la proteína traducida (SEQ ID No. 10) F. Gen C (parcial) de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa CBS 154.29 (SEQ ID No. 11)
que codifica la enzima laccasa C, con la secuencia parcial de la proteína traducida (SEQ ID No. 12)
10 G. Gen D1 de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa CBS154.29 (SEQ ID No. 13)
que codifica la enzima laccasa D1, con la secuencia de la proteína traducida (SEQ ID No. 14)
H. Gen D2 de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa CBS115.075 (SEQ ID No. 15) que codifica la enzima laccasa D2, con la secuencia de la proteína traducida (SEQ ID No. 16) I. Gen E (parcial) de la laccasa de Cerrena procedente de la cepa CBS 154.29 (SEQ ID No. 17)
que codifica la enzima laccasa E, con la secuencia parcial de la proteína traducida (SEQ ID No. 18)
[0030] El término "% de identidad" en el presente documento se refiere al nivel de identidad de secuencia de los ácidos nucleicos o aminoácidos entre la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una laccasa descrita en el presente documento o la secuencia de aminoácidos de la laccasa, cuando se alinean utilizando un programa de alineamiento de secuencias.
[0031] Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, una identidad de secuencia del 80 % se determina
5 mediante un algoritmo, y por consiguiente un homólogo de una secuencia dada tiene una identidad de secuencia superior al 80 % a lo largo de un tramo de la secuencia dada. Niveles ejemplares de identidad de secuencia incluyen, pero no están limitados a, una identidad de secuencia del 80, 85, 90, 95, 98 % o superior a una secuencia dada, por ejemplo, la secuencia codificante para una laccasa, como se describe en el presente documento.
10 [0032] Ejemplos de programas de ordenador que se pueden utilizar para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el paquete de programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, disponible públicamente en Internet en www.ncbi.nlm.nih.govBLAST. Véase también, Altschul, y col., 1990 y Altschul, y col., 1997.
15 [0033] Las búsquedas de secuencia normalmente se llevan a cabo utilizando el programa BLASTN cuando se evalúa una secuencia dada de ácidos nucleicos en relación a secuencias de ácidos nucleicos en las Secuencias de ADN del GenBank y otras bases de datos públicas. El programa BLASTX se prefiere para la búsqueda de secuencias de ácidos nucleicos que hayan sido traducidas en todos los marcos de lectura contra secuencias de aminoácidos en las Secuencias de proteínas del GenBank y otras bases de datos públicas. Tanto BLASTN como
20 BLASTX se ejecutan utilizando los parámetros por defecto y una penalización de espacio abierto de 11,0, y una penalización de espacio extendido de 1,0, y utilizan la matriz BLOSUM-62. (Véase, por ejemplo, Altschul, y col., 1997).
[0034] Se puede llevar a cabo un alineamiento de secuencias seleccionadas con el fin de determinar el " % de
25 identidad" entre dos o más secuencias utilizando, por ejemplo, el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, funcionando con los parámetros por defecto, que incluyen una penalización de espacio abierto de 10,0, una penalización de espacio extendido de 0,1, y una matriz de similitud BLOSUM 30.
II. Mediadores
30 [0035] En una forma de realización, el sistema de oxidación enzimático comprende adicionalmente uno o más agentes mediadores químicos que potencian la actividad de la enzima laccasa. El término "mediador químico" (o "mediador" que se pueden utilizar aquí indistintamente) se define en el presente documento como un compuesto químico que actúa como mediador redox para transferir electrones eficazmente entre la enzima que presenta
35 actividad oxidasa y el colorante. Los mediadores químicos también se conocen en la materia como potenciadores y aceleradores.
[0036] El mediador químico puede ser un compuesto fenólico, por ejemplo, siringato de metilo, y compuestos relacionados, como se describe en los documentos WO 95/01426 y 96/12845. El mediador químico también puede 40 ser un compuesto N-hidroxi, un compuesto N-oxima, o un compuesto N-óxido, por ejemplo, N-hidroxibenzotriazol, ácido violúrico, o N-hidroxiacetanilida. El mediador químico también puede ser un compuesto de fenoxacina/fenotiacina, por ejemplo, fenotiacina-10-propionato. El mediador químico adicionalmente puede ser ácido 2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS). Existen otros mediadores químicos muy conocidos en la materia. Por ejemplo, los compuestos descritos en el documento WO 95/01426 son conocidos por potenciar la
45 actividad de una laccasa. En formas de realización particulares, el mediador puede ser acetosiringona, siringato de metilo, siringato de etilo, siringato de propilo, siringato de butilo, siringato de hexilo, o siringato de octilo.
[0037] Preferentemente, el mediador es 4-ciano-2,6-dimetoxifenol, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol o uno de sus derivados N-sustituidos tales como, por ejemplo, 4-(N-metil-carboxamido)-2,6-dimetoxifenol, 4-[N-(2-hidroxietil)
50 carboxamido]-2,6-dimetoxifenol, o 4-(N,N-dimetil-carboxamido)-2,6-dimetoxifenol.
[0038] El mediador utilizado en la presente invención se puede describir mediante la fórmula siguiente: en la que A es un grupo tal como -R, -D, -CH = CH-D, -CH = CH-CH = CH-D, -CH = N-D, -N = N-D, o -N = CH-D, en la que D se selecciona del grupo constituido por -CO-E, -SO2-E, -CN, -NXY, y -N + XYZ, en la que E puede ser -H, -OH, -R, -OR, o -NXY, y X e Y y Z pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan entre -H, -OH, -OR y -R; siendo R un alquilo C1-C16, preferentemente un alquilo C1-C8, dicho alquilo que puede estar saturado o insaturado, ramificado o no ramificado y opcionalmente sustituido con un grupo carboxi, sulfo o amino; y B y C pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan entre CmH2m + 1; 1 � m � 5.
[0039] En una forma de realización, A en la fórmula anteriormente mencionada es -CN o -CO-E, en la que E puede ser -H, -OH, -R, -OR, o -NXY, en donde X e Y pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan entre -H, -OH, -OR y -R, siendo R un alquilo C1-C16, preferentemente un alquilo C1-C8, dicho alquilo que puede estar saturado o insaturado, ramificado o no ramificado y opcionalmente sustituido con un grupo carboxi, sulfo o amino; y B y C pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan entre CmH2m + 1; 1 � m � 5.
[0040] En la fórmula anteriormente mencionada A puede estar en posición meta al grupo hidroxi en lugar de estar en posición para, tal y como está representado.
[0041] En formas de realización particulares, el mediador puede ser acetosiringona, siringato de metilo, siringato de etilo, siringato de propilo, siringato de butilo, siringato de hexilo, o siringato de octilo. Preferentemente, el mediador es 4-ciano-2,6-dimetoxifenol, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol o uno de sus derivados N-sustituidos tales como, por ejemplo, 4-(N-metil-carboxamido)-2,6-dimetoxifenol, 4-[N-(2-hidroxietil)-carboxamido]-2,6-dimetoxifenol, o 4-(N,N-dimetil-carboxamido)-2,6-dimetoxifenol.
[0042] El mediador de la invención puede estar presente a concentraciones comprendidas entre 0,005 – 1000 µmol por g de tejido vaquero, preferentemente entre 0,05 – 500 µmol por g de tejido vaquero, más preferentemente entre 0,5 – 100 µmol por g de tejido vaquero.
[0043] Los mediadores se pueden preparar mediante procedimientos conocidos por el facultativo experto, tales como los descritos en los documentos WO 97/11217, WO 96/12845 y US 5752980.
III. Utilidad
[0044] Las aplicaciones industriales de las laccasas incluyen el blanqueo de pulpa de celulosa y papel y el blanqueo de materiales textiles, por ejemplo, de tejidos vaqueros teñidos de índigo. También se ha encontrado utilidad para las laccasas en la tinción del pelo (véanse, por ejemplo, los documentos WO 95/33836 y WO 95/33837). La Patente europea Nº 0504005 describe que las laccasas se pueden utilizar para teñir la lana.
[0045] Las laccasas descritas en el presente documento son útiles en la tinción y blanqueo de materiales textiles, fibras, hilos y similares. Las laccasas también son útiles en el tratamiento de aguas residuales, la deslinificación de la pulpa de celulosa, la despolimerización de agregados de elevado peso molecular, la decoloración de papel residual, la polimerización de compuestos aromáticos, la polimerización mediada por radicales y reacciones de entrecruzamiento (por ejemplo, pinturas, recubrimientos, biomateriales), y la activación de colorantes y el acoplamiento de compuestos orgánicos. Las laccasas se pueden utilizar en una composición de limpieza o en uno de sus componentes, o en un detergente.
[0046] Como se describe en el presente documento, las laccasas son capaces de oxidar una amplia variedad de compuestos coloreados que presentan estructuras químicas diferentes utilizando el oxígeno como aceptor de electrones. Por consiguiente, las laccasas presentadas en este documento se pueden utilizar en aplicaciones en las que se desea modificar el color asociado a los compuestos coloreados, tales como en la limpieza, por ejemplo, para la eliminación de manchas de comida sobre el tejido. En ciertas situaciones, para obtener efectos deseables, se puede utilizar un mediador o potenciador.
[0047] Las laccasas presentadas en este documento se pueden utilizar en el campo de los materiales textiles. Por ejemplo, las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el tratamiento, procesamiento, acabado, pulido, o producción de fibras, u otros tejidos o artículos de manufactura. Las enzimas del presente documento pueden ser útiles, por ejemplo, en el tratamiento de tejido vaquero (procesos de tratamiento de blanqueado final); en la decoloración de residuos de índigo; en la tinción de tejidos; en procesos de blanqueo de materiales textiles; en la modificación de fibras; en la consecución de unas propiedades mejoradas de la fibra o el tejido; etc.
[0048] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en la industria del cuero. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar en el procesamiento de pieles animales incluyendo, pero no limitado a, pelado, encalado, rendido y/o curtido de pieles.
[0049] En el presente documento también se describe un procedimiento para la eliminación de la lignina de un material que contiene lignocelulosa, el blanqueo de material que contiene lignocelulosa (es decir, la decoloración enzimática de papel reciclado) y/o el tratamiento de aguas residuales procedentes de la fabricación de papel o celulosa. El proceso utiliza enzimas laccasas obtenidas de especies de Cerrena, al mismo tiempo que añade o dosifica agentes redox no aromáticos, más compuestos redox aromáticos fenólicos y/o no fenólicos, en las que las unidades fenólicas y no fenólicas de la lignina se pueden oxidar directamente por la acción de estos compuestos aromáticos fenólicos y/o no fenólicos, o la lignina se puede oxidar mediante otros compuestos fenólicos y/o no fenólicos producidos por la acción oxidante de estos compuestos.
[0050] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el campo del tratamiento de la pulpa de celulosa y el papel. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar en la fabricación de pulpa de papel y pulpas de celulosa fluff a partir de materias primas tales como madera, bambú, y paja de cereal de arroz; la fabricación de papel y tableros para impresión y escritura, empaquetamiento, usos sanitarios y otros usos técnicos; el reciclado de la fibra de celulosa con el fin de elaborar papel y tableros; y el tratamiento de productos residuales generados y tratados en fábricas de celulosa o papel y otras instalaciones dedicadas específicamente a la fabricación de papel, pulpa de celulosa, o pulpa de celulosa fluff. Las enzimas presentadas en este documento pueden ser útiles, por ejemplo, en el procesamiento de la madera; en el blanqueo de la pulpa de celulosa; en la modificación de las fibras de la madera; en pegamentos biológicos (activación de la lignina) para la fabricación de MDF; para mejorar las propiedades del papel; en la eliminación de colorantes; en la tinción de papel; en adhesivos (por ejemplo, pegamentos basados en lignina para tableros de partículas o fibras); etc.
[0051] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito de los piensos. Por ejemplo, las laccasas presentadas en este documento se pueden utilizar como aditivo alimentario solo o como parte de un aditivo alimentario con el objetivo de incrementar el valor nutricional de piensos para cualquier tipo de animales tales como pollos, vacas, cerdos, peces y mascotas; y/o como ayudante de procesamiento para procesar materiales vegetales y subproductos de la industria alimentaria con el objetivo de producir materiales/productos adecuados como materias primas para piensos.
[0052] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito de la limpieza de lentes de contacto. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar en la limpieza, almacenamiento, desinfección, y/o preservación de lentes de contacto.
[0053] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito de las féculas. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar en el procesamiento de un sustrato que incluye fécula y/o grano para jarabe de glucosa (dextrosa), jarabe de fructosa o cualquier otro jarabe, alcohol (potable o combustible) o azúcar. Dicho procesamiento de las féculas puede incluir etapas de procesamiento tales como la licuefacción, sacarificación, isomerización, y desramificación de un sustrato.
[0054] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito alimentario. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar en la preparación, procesamiento, o como principio activo en alimentos tales como grasa amarilla, bebidas a base de té, productos culinarios, de panadería, y alimentos congelados para consumo humano. Las laccasas se pueden utilizar, por ejemplo, como mejorador para el pan, en la conservación de los alimentos, como secuestrador de oxígeno, etc.
[0055] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito del cuidado personal. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar en la preparación de productos personales para seres humanos tales como fragancias, y productos para el cuidado de la piel, el cuidado del cabello, higiene oral, lavado personal y desodorantes y/o antitranspirantes, para seres humanos. Las enzimas presentadas en este documento pueden ser útiles, por ejemplo, en la tinción y/o decoloración del cabello, coloración y/o decoloración de las uñas; coloración y/o decoloración de la piel; modificación de la superficie (por ejemplo, como agente acoplante); como agente antimicrobiano; en la eliminación de olores; blanqueado de los dientes; etc.
[0056] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito de la limpieza. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar en la limpieza, tratamiento o cuidado de artículos de lavandería tales como prendas o tejidos; en la limpieza de superficies duras en el hogar; en el que cuidado de la vajilla, incluyendo aplicaciones para lavavajillas; y en pastillas de jabón y jabones líquidos y/o pastillas y líquidos de tensioactivos sintéticos. Las enzimas presentadas en este documento pueden ser útiles por ejemplo, en la eliminación/decoloración de manchas, y/o en la eliminación de olores, y/o en desinfección, etc.
[0057] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito del tratamiento de aguas residuales. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar en la decoloración de compuestos coloreados; en la detoxificación de componentes fenólicos; para actividad antimicrobiana (por ejemplo, en el reciclado del agua); en bio-remediación; etc.
[0058] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito de los bio-materiales. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar como bio-catalizadores para diversas reacciones orgánicas; y/o en relación con biopolímeros; en relación con el envase; en relación con adhesivos; en modificación superficial (agente de activación y acoplamiento); en la producción de alcoholes primarios; en relación con biosensores y/o síntesis orgánicas; etc.
[0059] Las laccasas descritas en el presente documento se pueden utilizar en el ámbito de los agentes antimicrobianos. Por ejemplo, las laccasas se pueden utilizar como agente antimicrobiano en composiciones de limpieza, o para reducir o eliminar la carga microbiana de diversos alimentos (por ejemplo, carnes) o piensos.
[0060] Los mediadores laccasa se pueden utilizar como agentes de desinfección y antimicrobianos (por ejemplo, protección de maderas, detergentes). Los mediadores se pueden utilizar independientemente de las enzimas o junto con las enzimas.
[0061] Como se utiliza en el presente documento, "composiciones de limpieza" y "formulaciones de limpieza" se refieren a composiciones que tienen utilidad en la eliminación de compuestos no deseados de los artículos a limpiar, tales como tejidos, etc. El término engloba cualquier material/compuesto seleccionado para el tipo de composición de limpieza particular deseada y la forma del producto (por ejemplo, composición líquida, gel, en gránulos, o para pulverización), siempre que la composición sea compatible con la laccasa y otra(s) enzima(s) utilizada(s) en la composición. La selección específica de los materiales para la composición de limpieza se realiza fácilmente considerando la superficie, el artículo o tejido a limpiar, y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante su utilización.
[0062] Los términos además se refieren a cualquier composición que sea adecuada para la limpieza y/o blanqueo de cualquier objeto y/o superficie. Está previsto que los términos incluyan, pero no está limitado a, composiciones detergentes (por ejemplo, detergentes de lavandería líquidos y/o sólidos y detergentes para tejidos delicados; formulaciones para la limpieza de superficies duras, tales como cristal, madera, cerámica y mostradores metálicos y ventanas; productos de limpieza para alfombras; productos de limpieza para horno; y pre-tratamientos textiles y de lavandería, así como a detergentes para la vajilla).
[0063] De hecho, el término "composición de limpieza" como se utiliza en el presente documento incluye, a menos que se indique otra cosa, agentes de lavado multiusos o de trabajo pesado en forma de gránulos o en polvo, especialmente detergentes de limpieza; agentes de lavado multiusos en forma de líquido, gel o pasta, especialmente los del tipo denominados líquidos para trabajo pesado (HDL); detergentes líquidos para tejidos delicados; agentes para el lavado de la vajilla a mano o agentes para lavavajillas de trabajo ligero, especialmente aquellos que forman mucha espuma; agentes para máquinas lavavajillas, incluyendo los diversos tipos de ayudantes en forma de pastillas, gránulos, líquidos y enjuagues para uso doméstico e institucional; agentes líquidos para limpieza y desinfección, champús para coches o alfombras, productos para la limpieza del baño; champús para el pelo y enjuagues para el pelo; geles de ducha y baños de espuma y productos para la limpieza de metales; así como aditivos auxiliares tales como aditivos blanqueantes y los del tipo "aplicadores quitamanchas" o de pretratamiento.
[0064] Como se utilizan en el presente documento, los términos "composición detergente" y "formulación detergente" se usan en relación con mezclas que están destinadas para su utilización en un medio de lavado para la limpieza de objetos manchados. En algunas formas de realización, el término se utiliza en referencia al lavado de tejidos y/o prendas (por ejemplo, "detergentes de lavandería"). En formas de realización alternativas, el término se refiere a otros detergentes, tales como aquellos utilizados para limpiar platos, cubertería, etc. (por ejemplo, "detergentes para el lavado de la vajilla"). No se pretende que las composiciones contempladas en el presente documento estén limitadas a ninguna formulación o composición detergente particular. De hecho, se pretende que además de la laccasa, el término englobe detergentes que contienen tensioactivos, transferasa(s), enzimas hidrolíticas, quelantes, agentes blanqueantes, activadores para el blanqueo, agentes azulantes y colorantes fluorescentes, inhibidores del apelmazamiento, agentes enmascarantes, activadores enzimáticos, antioxidantes, y solubilizantes.
[0065] Como se utiliza en el presente documento, el término "composición de limpieza para superficies duras" se refiere a composiciones detergentes para la limpieza de superficies duras tales como suelos, paredes, azulejos, contenedores de acero inoxidable (por ejemplo, tanques de fermentación), accesorios del baño y cocina, y similares. Dichas composiciones se proporcionan en cualquier forma, incluyendo pero no limitado a, sólidos, líquidos, emulsiones, etc. Algunos de los siguientes ejemplos están relacionados con las enzimas laccasa de la invención. Otros proporcionan antecedentes útiles.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Análisis de la secuencia de aminoácidos de la laccasa de Cerrena unicolor
[0066] Se obtuvieron cuatro secuencias de péptidos utilizando una laccasa disponible comercialmente: AIGPVADLHI (SEQ ID No. 19), MLTPTSI (SEQ ID No. 20), TVGGPA (SEQ ID No. 21) y YSFVLNANQP (SEQ ID No. 22). La laccasa disponible comercialmente se purificó. La secuenciación N-terminal dio como resultado la SEQ ID No. 19. Se llevó a cabo la digestión proteolítica con tripsina de la muestra purificada. Los fragmentos se separaron mediante electroforesis en gel con 3 bandas seleccionadas y recogidas de forma manual. Se llevó a cabo la secuenciación del péptido para cada banda y dio como resultado las SEQ ID Nos. 20, 21 y 22.
a. Clonación del gen A de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa ATCC20013
[0067] Para clonar el gen A de la laccasa procedente de la cepa ATCC20013, se diseñaron dos cebadores y se obtuvieron en Invitrogen: TTCGCAGGTCAACGATATTC (SEQ ID No. 35) basado en la secuencia de ADN del gen B de la laccasa obtenido de la cepa ATCC20013 (véase Ejemplo 3a) y GTTAGGTGGTTGAAGGATTG (SEQ ID No. 36) basado en el gen A de la laccasa obtenido de la cepa CBS115.075 (véase Ejemplo 2c). Los cebadores se utilizaron en una reacción de PCR con una T elevada que contiene ADN genómico obtenido de la cepa ATCC 20013 como molde (véase Ejemplo 3). El fragmento de la PCR se purificó utilizando una columna QIAquick spin de Qiagen y se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO (Invitrogen). 22 clones se amplificaron utilizando cuentas de PCR Ready-To-Go (GE Healthcare) y se secuenciaron tres fragmentos de la PCR (2 – 1, 2 – 3 y 2 – 6). La secuencia de ADN de 1316 pb del gen A de la laccasa procedente de la cepa ATCC20013 se lista como SEQ ID No 37.
b. Clonación del gen A de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa CBS154.29
[0068] Para clonar el gen A de la laccasa procedente de la cepa CBS154.29, se diseñaron dos cebadores y se obtuvieron en Invitrogen: CACCAGCATGAGCTCAAAGCTAC (SEQ ID No. 45) basado en el gen A de la laccasa obtenido de la cepa CBS115.075 (véase Ejemplo 2c) y el cebador de la SEQ ID No. 36. Los cebadores se utilizaron en una reacción de PCR Herculase que contiene un molde de ADN genómico obtenido de la cepa CBS 154.29, dNTPs, cebador y el 4 % de DMSO en tampón 1x. La mezcla de PCR se calentó a 98 °C durante 4 minutos para desnaturalizar el molde de ADN. Se añadió la enzima Herculase® II (Stratagene) al tubo y la reacción de PCR se llevó a cabo en 30 ciclos de 98 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 2 minutos. La extensión final a 72 °C se realizó durante 5 minutos y la reacción se enfrió a 4 °C. El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se clonó en el vector pENTR/D-TOPO (Invitrogen). Se amplificaron 15 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y los plásmidos se aislaron a partir de dos clones (pENTR15-24 y pENTR15-30) y se secuenciaron los moldes de ADN. Se obtuvo la secuencia de ADN de 2374 pb del gen A de la laccasa procedente de la cepa CBS 154.29. La secuencia de ADN se lista como SEQ ID No. 3 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 4.
c. Clonación del gen A de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa CBS 115.075
[0069] El cebador CAATCTATGACCGTAGATTC (SEQ ID No. 39) basado en el gen B de la laccasa procedente de la cepa ATCC20013 (véase Ejemplo 3a) y el cebador NNNNNNNNNNCGATCG (SEQ ID No. 38) en el que N representa una mezcla de los cuatro nucleótidos (A, T, C y G) se utilizaron en una reacción de PCR con una T baja (véase Ejemplo 3a). Se extrajo el ADN genómico de la cepa de Cerrena unicolor (CBS 115.075) y se utilizó como molde para la primera ronda de la reacción de PCR con una T baja. Los fragmentos de PCR se purificaron con una columna QIAquick spin y se utilizaron como molde en la segunda ronda de reacción de PCR con una T baja con cebadores de la SEQ ID No. 35 basados en el gen B de la laccasa procedente de la cepa ATCC20013 (véase Ejemplo 3a) y el cebador de la SEQ ID No. 38. Los fragmentos de PCR se clonaron en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se amplificaron 16 clones utilizando cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron tres fragmentos clonados de la PCR (B2#1, B2#4 and B2#11).
[0070] Para clonar el extremo 3' del gen A de la laccasa, se utilizó el cebador ACCGTGGTTCCTCCATTGCC (SEQ ID No. 40) y el cebador de la SEQ ID No. 31 en la reacción de PCR con una T baja con el ADN genómico extraído de la cepa de Cerrena unicolor (CBS 115.075) como molde en la primera ronda de la reacción de PCR con una T baja. Los fragmentos de la PCR se purificaron con una columna QIAquick spin y se utilizaron como molde en la segunda ronda de la reacción de PCR con una T baja con los cebadores GACTGGCACTTGGAAGCGGG (SEQ ID No. 41) y el cebador de la SEQ ID No. 31. Los fragmentos de la PCR se clonaron en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se amplificaron 22 clones utilizando cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenció un fragmento clonado de la PCR (D2#2).
[0071] Para clonar el extremo 5' del gen A de la laccasa, se diseñó un cebador GGACCAAGCTGGTACTTTC (SEQ ID No. 42) basado en la secuencia del gen B de la laccasa. Se utilizó para amplificar un fragmento de ADN con el cebador de la SEQ ID No. 36. El ADN genómico extraído de la cepa de Cerrena unicolor (CBS 115.075) se utilizó como molde de la PCR. Se obtuvo el fragmento de la PCR de 1,7 kb, se purificó con una columna QIAquick spin y se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se analizaron 22 clones utilizando cuentas de PCR Ready-To-Go. Se secuenció el ADN plasmídico procedente del clon (C5#20). Para la clonación posterior del extremo 5' del gen A de la laccasa, se utilizó el cebador CGTGGTACCAGTCTGCCAGGG (SEQ ID No. 43) y el cebador de la SEQ ID No. 31 en la reacción de PCR con una T baja con el ADN genómico extraído de la cepa CBS115.075 de Cerrena unicolor como molde. A partir de la primera ronda de la reacción de PCR con una T baja, el fragmento de la PCR se purificó con una columna QIAquick spin y se utilizó como molde en la segunda ronda de la reacción de PCR con una T baja con los cebadores GGCAGCATCAGTCACGGTCAG (SEQ ID No. 44) y el cebador de la SEQ ID No. 31. El fragmento de la PCR (a3) se amplificó de nuevo y se utilizó como molde en una tercera ronda de reacción de PCR con una T baja con los cebadores GGCAGCATCAGTCACGGTCAG (SEQ ID No. 44) y el cebador de la SEQ ID No. 31. El fragmento de la PCR (a3-2) se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se amplificaron 11 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron dos fragmentos clonados de la PCR (a3-2#10 y a3-2#11). La secuencia de ADN del gen A de la laccasa procedente de la cepa CBS 115.075 que incluye la secuencia de 5' y 3' de la región codificante se lista como SEQ ID No. 1 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 2.
Ejemplo 3
a. Clonación y secuenciación del gen B de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa ATCC20013
[0072] Para clonar el fragmento de ADN que codifica el gen de la laccasa de Cerrena, se diseñaron cuatro cebadores degenerados basados en la secuencia del péptido AIGPVADLHI (SEQ ID No. 19) y se obtuvieron en Invitrogen. Se denominan
cebador A GCAATCGGACCNGTNGCAGA (SEQ ID No. 23); cebador B GCAATCGGACCNGTNGCTGA (SEQ ID No. 24); cebador C GCAATCGGACCNGTNGCGGA (SEQ ID No. 25); y cebador D GCAATCGGACCNGTNGCCGA (SEQ ID No. 26).
[0073] Se diseñaron dos cebadores degenerados basados en la secuencia del péptido YSFVLNANQP (SEQ ID No. 22) y se obtuvieron en Invitrogen. Se denominan
cebador E GGTTGATTTGCATTNAGNAC (SEQ ID No. 27); y cebador F GGTTGATTTGCGTTNAGNAC (SEQ ID No. 28).
en donde N representa una mezcla de los cuatro nucleótidos (A, T, C y G). Se extrajo el ADN genómico de la cepa ATCC20013 y se utilizó como molde en la reacción de PCR con una T baja que contiene la siguiente combinación de cebadores: reacción de PCR 1 no contiene ADN ni cebador; reacción de PCR 2 contiene el cebador A y el cebador E; reacción de PCR 3 contiene el cebador B y el cebador E; reacción de PCR 4 contiene el cebador C y el cebador E; reacción de PCR 5 contiene el cebador D y el cebador E; reacción de PCR 6 contiene el cebador A y el cebador F; reacción de PCR 7 contiene el cebador B y el cebador F; reacción de PCR 8 contiene el cebador C y el cebador F y reacción de PCR 9 contiene el cebador D y el cebador F. La mezcla de la reacción de PCR contenía el molde de ADN, cebadores, tampón 1x, dNTP 0,2 mM y 1 unidad de ADN Taq polimerasa. La reacción de PCR se llevó a cabo en 30 ciclos del 95 °C durante 1 minuto, 45 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 1 minuto. La extensión final a 72 °C se realizó durante 7 minutos y la reacción se enfrió a 4 °C. Los fragmentos de la PCR procedentes de la reacción 4, 5 y 8 se recortaron de un gel de agarosa al 1,2 % y se reunieron. Los fragmentos de la PCR se extrajeron del gel con una columna Qiagen spin y se clonaron en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se seleccionaron 32 fragmentos clonados de la PCR y se secuenciaron utilizando cuentas de PCR Ready-To-Go y la secuencia de ADN del clon #A30 se identificó como el gen B de la laccasa.
[0074] Para clonar el extremo 5' del gen de la laccasa, se diseñó un cebador y se obtuvo en Invitrogen: GGACGTGGCCTTGAGCATAC (SEQ ID No. 29). Se utilizó en una primera ronda de reacción de PCR con una T baja con un oligo degenerado GGATCC (SEQ ID No. 31) en el que N representa una mezcla de los cuatro nucleótidos (A, T, C y G). El producto de la PCR se purificó utilizando una columna QIAquick spin y se usó como molde en una segunda reacción de PCR con una T baja que contiene un cebador TCTGTCAAGTCGTCAATCAC (SEQ ID No. 30) y el cebador de la SEQ ID No. 31. El fragmento de la PCR se purificó utilizando una columna QIAquick spin y se diluyó a 1: 10 y 1: 100 y se usó como molde en la primera ronda de la reacción de PCR con una T elevada realizada en 30 ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 50 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto con dos cebadores (SEQ ID No. 30 y SEQ ID No. 31). La extensión final a 72 °C se realizó durante 7 minutos y la reacción se enfrió a 4 °C. El fragmento de la PCR se purificó con una columna QIAquick spin y se utilizó en la segunda ronda de reacción de PCR con una T elevada con los cebadores de TTACCACGAATCAGAGGACC (SEQ ID No. 32) y la SEQ ID No. 31. El fragmento de la PCR (D13) se secuenció.
[0075] Para clonar el extremo 3' del gen B de la laccasa, se diseñó un cebador y se obtuvo en Invitrogen: CCTCACCTGTATTGGCACAG (SEQ ID No. 33) y se utilizó con el cebador de la SEQ ID No. 31 en una primera ronda de reacción de PCR con una T baja. El fragmento de la PCR se purificó en una columna QIAquick spin y se utilizó como molde en una segunda ronda de reacción de PCR con una T baja con el cebador TTGGTATCATGCCCTTGCTC (SEQ ID No. 34) y el cebador de la SEQ ID No. 31. El fragmento de la PCR se clonó en un plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se amplificaron 16 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go PCR y se secuenciaron cuatro fragmentos clonados de la PCR (C3, C4, C5 y C7).
[0076] Se obtuvo un fragmento de ADN de 1337 pb. La secuencia de ADN se lista como SEQ ID No. 9 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 10.
b. Clonación del gen B de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa CBS 154.29
[0077] Se diseñaron dos cebadores y se obtuvieron en Invitrogen:
CACCGCGATGTCTCTTCTTCGTAG (SEQ ID No. 46); y TGRAGRTGGAASGGATGWGGTCC (SEQ ID No. 47).
en donde R representa una mezcla de los nucleótidos A y G, S representa una mezcla de los nucleótidos C y G, y W representa una mezcla de los nucleótidos A y T. Los dos cebadores se utilizaron en la reacción de PCR con una T elevada. El fragmento de la PCR (A3) se purificó utilizando una columna QIAquick spin. El fragmento de la PCR se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se amplificaron 16 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron dos fragmentos de PCR (A3#1 y A3#5).
[0078] Para clonar el extremo 3' del gen B de la laccasa procedente de la cepa CBS154.29, se diseñó un cebador y se obtuvo en Invitrogen: GTCCCTGTACTACTCCAGATCC (SEQ ID No. 48) y se utilizó con un cebador que tiene la SEQ ID No. 31 en una primera ronda de la reacción de PCR con una T baja. El fragmento de la PCR se purificó en una columna QIAquick spin y se utilizó como molde en una segunda ronda de la reacción de PCR con una T baja con el cebador CCAGCAGGAAGCGTGATCGAAC (SEQ ID No. 49) y el cebador de la SEQ ID No. 31. El fragmento de la PCR se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se amplificaron 16 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron tres fragmentos de la PCR (7#6, 7#7 y 7#8). Las 2663 pb de la secuencia de ADN de la laccasa B de la cepa CBS 154.29 se listan como SEQ ID No. 7 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 8.
c. Clonación del gen B de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa CBS115.075
[0079] Se diseñó un cebador y se obtuvo en Invitrogen:
GTAATCATGTATCACCTGGGCTCAAGG (SEQ ID No. 50). El cebador se utilizó en la reacción de PCR Herculase (véase Ejemplo 2b) con el cebador de la SEQ ID No. 46. El fragmento de la PCR se purificó utilizando una columna QIAquick spin. El fragmento de la PCR se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se analizaron 17 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron los fragmentos de la PCR procedentes de cuatro clones (#1, #2, #4 y #5). El ADN plasmídico se preparó a partir de dos clones (pENTRlaccaseB CBS115075#1 y pENTR-laccaseB CBS115075#3) y ambos plásmidos se secuenciaron. Las 2173 pb de la secuencia de ADN de la laccasa B de la cepa CBS 115.075 se listan como SEQ ID No. 5 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 6.
Ejemplo 4. Clonación del gen C de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa CBS154.29
[0080] Se diseñó un cebador ACGAACGAGTANCGTTGNCC (SEQ ID No. 51), en el que N representa una mezcla de los cuatro nucleótidos (es decir, A, T, C y G), en base a la secuencia del péptido traducido GQRYSFV (SEQ ID No. 52). Este péptido está conservado entre el gen A de la laccasa y el gen B de la laccasa (véanse Ejemplos 2 y 3). El cebador se obtuvo en Invitrogen y se utilizó en la reacción de T baja con el cebador de la SEQ ID No. 24. El fragmento de la PCR se purificó utilizando una columna QIAquick spin. El fragmento de la PCR se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se analizaron 33 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron los fragmentos de la PCR procedentes de cuatro clones (#12, #5a, #19a y #21a). Las 1080 pb de la secuencia del gen C de la laccasa procedente de la cepa CBS 154.29 se listan como SEQ ID No. 11 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 12.
Ejemplo 5
a. Clonación del gen D de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa CBS115.075
[0081] Para clonar el extremo 5' del gen D de la laccasa procedente de la cepa CBS115.075, se diseñó un cebador en base al gen D de la laccasa procedente de la cepa CBS 154.29 (véase Ejemplo 5b) (AACACGGAGACAGTCCAAAC, SEQ ID No. 62). Se utilizó en la reacción de PCR con una T elevada con el cebador de la SEQ ID No. 56. El fragmento de la PCR se purificó utilizando una columna QIAquick spin y se secuenció.
[0082] Para clonar el gen D de la laccasa procedente de la cepa CBS 115.075, se diseñaron dos cebadores (CACCTCTCGAGATGGGATTGAAC, SEQ ID No. 63 y CGTTTAAATAGCAGTTCCTTTC, SEQ ID No. 64) en base al gen D de la laccasa procedente de la cepa CBS 154.29 (véase Ejemplo 5b). Los cebadores se utilizaron en una reacción de PCR Herculase (véase Ejemplo 2b) con un molde del ADN genómico procedente de la cepa CBS 115.075. El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se clonó en el vector pENTR/D-TOPO. Se amplificaron 16 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron los fragmentos de la PCR generados a partir de cuatro clones. Los plásmidos se aislaron a partir del clon #2 (pENTRE-laccaseD#2) y se secuenció. Se obtuvo la secuencia de ADN de 2809 pb del gen D de la laccasa procedente de la cepa CBS
115.075. La secuencia de ADN se lista como SEQ ID No. 15 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 16.
b. Clonación del gen D de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa CBS 154.29
[0083] Se diseñó un cebador, CTGGTTGGTTNGCATTNAG (SEQ ID No. 53), en base a la secuencia peptídica LNANQP (SEQ ID No. 54). El cebador se obtuvo en Invitrogen y se utilizó en la reacción de PCR con una T baja con el cebador de la SEQ ID No. 26. El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se analizaron 18 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenció el fragmento de la PCR procedente de un clon.
[0084] Para clonar el extremo 3' del gen D de la laccasa, se diseñó un cebador (CACACGACCCCTGACCGTTG, SEQ ID No. 55). El cebador se utilizó en la reacción de PCR con una T baja con el cebador de la SEQ ID No. 31. El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se analizaron 24 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenció el fragmento(s) de la PCR procedente de un clon.
[0085] Para clonar más de los extremos 3' y 5' del gen D de la laccasa, se utilizó PCR inversa. 0,4 µg del ADN genómico procedente de la cepa CBS 154.29 de Cerrena se digirieron con la enzima de restricción EcoRV a 37 °C durante 1,5 horas. Los fragmentos de ADN genómico digerido se precipitaron con etanol. Los fragmentos de ADN lineal se ligaron con la ADN ligasa de T4 en un volumen de 100 µl durante más de 5 horas. Los fragmentos de ADN ligados se calentaron a 100 °C durante 3 minutos y se utilizaron como molde de ADN en una primera ronda de la reacción de PCR con una T elevada utilizando dos cebadores (TGACCGGTGATCAACGTCCC, SEQ ID No. 56, y GGCGCAGACATCAATCACAG, SEQ ID No. 57). Los fragmentos de la PCR se purificaron utilizando una columna QIAquick spin y se usaron como molde de ADN en la segunda ronda de la reacción de PCR con una T elevada utilizando dos cebadores (TCTTCAGCATCAACAACGCC, SEQ ID No. 58 y TCCGGCAAGCACGGTTGG, SEQ ID No. 59). Los fragmentos de la PCR procedentes de la segunda ronda de la reacción de PCR se purificaron utilizando una columna QIAquick spin y se secuenciaron.
[0086] Para clonar más del extremo 3' del gen D de la laccasa procedente de la cepa CBS 154.29, se utilizó PCR inversa. 0,4 µg del ADN genómico procedente de la cepa CBS 154.29 de Cerrena se digirieron con la enzima de restricción Smal a 37 °C durante 1,5 horas. Los fragmentos de ADN genómico digerido se precipitaron con etanol. Los fragmentos de ADN lineal se ligaron con la ADN ligasa de T4 en un volumen de 100 µl durante más de 5 horas. Los fragmentos de ADN ligados se calentaron a 100 °C durante 3 minutos y se utilizaron como molde de ADN en una primera ronda de la reacción de PCR con una T elevada con el cebador TCGTCTTCGCTGAGGGCATC, SEQ ID No. 60, y el cebador de la SEQ ID No. 56. Los fragmentos de la PCR se purificaron utilizando una columna QIAquick spin y se usaron como molde de ADN en la segunda ronda de la reacción de PCR con una T elevada utilizando el cebador (CAGACCGCTGCAGCCAACCC, SEQ ID No. 61) y el cebador de la SEQ ID No. 59. Los fragmentos de la PCR procedentes de la segunda ronda de la reacción de PCR se purificaron utilizando una columna QIAquick spin y se clonaron en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se analizaron 21 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron los fragmentos de la PCR procedentes de los clones #Ce11 y #Ce14. Las 2809 pb de la secuencia del gen D de la laccasa procedente de la cepa CBS 154.29.49 se lista como SEQ ID No. 13 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 14.
Ejemplo 6. Clonación del gen E de la laccasa de Cerrena unicolor procedente de la cepa CBS154.29
[0087] Se utilizó el cebador de la SEQ ID No. 53 en la reacción de PCR con una T baja con el cebador de la SEQ ID No. 26 (véase Ejemplo 5b). El fragmento de la PCR se purificó utilizando una columna QIAquick spin y se clonó en el plásmido pTOPO utilizando el kit de clonación TOPO. Se analizaron 18 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenció el fragmento de la PCR procedente del clon #Ae17. Las 1163 pb de la secuencia del gen E de la laccasa procedente de la cepa CBS 154.29.49 se lista como SEQ ID No. 17 y la secuencia de la proteína traducida se lista como SEQ ID No. 18.
Ejemplo 7. Expresión del gen A en Trichoderma
[0088] Para construir el plásmido de expresión para el gen A de la laccasa de la cepa CBS 115.075, se utilizaron dos cebadores (SEQ ID No. 45 y SEQ ID No. 36) en la reacción de PCR Herculase que contiene el molde de ADN genómico obtenido de la cepa 115.075, dNTPs, y el 4 % de DMSO en tampón 1x. La mezcla de PCR se calentó a 98 °C durante 4 minutos para desnaturalizar el molde de ADN. Se añadió la enzima Herculase® II (Stratagene) al tubo y la reacción de PCR se llevó a cabo en 30 ciclos de 98 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 2 minutos. La extensión final a 72 °C se realizó durante 5 minutos y la reacción se enfrió a 4 °C. El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se clonó en el vector pENTR/D-TOPO. Se amplificaron 15 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y el ADN plasmídico se aisló a partir del clon pENTR-laccaseA-CBS 115.075#11. Se secuenció la porción del gen A de la laccasa para confirmar la fidelidad de la amplificación de la PCR del gen A de la laccasa. El plásmido de pENTR-laccaseA-CBS115.075#11 (50 ng) se convirtió en el plásmido de expresión pTrex3g-laccaseA (Figura 1) en una reacción de 10 µl de LB clonasa II (Invitrogen) que contiene 6,5 µl de TE, 1 µl del vector pTrex3g (0,1 mg/ml) y 2 µl de ClonaseII. El plásmido de expresión se confirmó mediante la secuenciación del ADN y se transformó de manera biolística en una cepa de Trichoderma. La transformación de la cepa de Trichoderma mediante el procedimiento de transformación biolística se consiguió utilizando el sistema Biolistic® PDS-1000/he Particle Delivery System de Bio-Rad (Hercules, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante (véanse los documentos WO 05/001036 y US 2006/0003408). Se seleccionaron 66 transformantes y se transfirieron a nuevas placas. Se dejaron crecer un total de 15 transformantes estables en 30 ml de medio Proflo durante 2 días a 30 °C. Se transfirieron 5 ml del cultivo del medio Proflo de 2 días de edad a 50 ml de medio definido que contiene cobre 1 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 5 días a 28 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
Ejemplo 8
a. Expresión del gen B de la laccasa en Aspergillus
[0089] Para construir el plásmido de expresión para el gen B de la laccasa de la cepa CBS 115.075, se utilizaron dos cebadores GCAGATCTGCGATGTCTCTTCTTCGTAGCTTGAC (SEQ ID No. 72) y GAGGTCACCTCTAGATCATGTATCACCTGGGCTCAAGGCATC (SEQ ID No. 73) en la reacción de PCR Herculase que contiene el molde de ADN genómico procedente de la cepa 115.075 (véase Ejemplo 2b). El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se digirió con las enzimas de restricción BglII y Xbal. El fragmento de ADN se purificó de nuevo con la columna QIAquick spin y se clonó en el vector pGAPT digerido con BglII y XbaI. La fidelidad del plásmido se confirmó mediante la secuenciación del ADN. El plásmido pKB401 (Figura 2) resultante se transformó en A. niger 2445 para comprobar la expresión del gen B de la laccasa. Se seleccionaron 34 transformantes y se transfirieron sobre placas MM y se dejaron crecer durante 4 días a 30 °C. Se inocularon en un pequeño tapón con una sola colonia que incluye esporas y micelio sobre una placa CMA y se creció durante 4 días a 30 °C. Un tapón de la placa CMA que contiene esporas y micelio confluentes se transfirieron a 30 ml de caldo especial Promosoy (pH 6,2) que contiene cobre 1 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 5 días a 30 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
b. Expresión del gen B de la laccasa en Aspergillus como fusión al dominio catalítico de la glucoamilasa.
[0090] Para construir el plásmido de expresión de fusión para el gen B de la laccasa de la cepa CBS 115.075, se utilizaron dos cebadores TTGCTAGCAACGTGATCTCCAAGCGTGCAATCGGTCCAGTCACTGACCTAC (51-mero, SEQ ID No. 74) y el cebador de la SEQ ID No. 73 en la reacción de PCR Herculase que contiene el molde del ADN genómico obtenido de la cepa CBS 115.075 (véase Ejemplo 2b). El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se digirió con NheI y BstEII y se volvió a purificar con la columna QIAquick spin. Este fragmento purificado se clonó en el vector pGAMpR2-GV digerido con NheI y BstEI (véase solicitud de patente de EE.UU. US20050153399). El plásmido resultante pKB403 (Figura 3) se confirmó mediante análisis de secuenciación y se transformó en A. niger 2445. Se seleccionaron 28 transformantes y se transfirieron sobre placas MM y se dejaron crecer durante 4 días a 30 °C. Se inocularon en un pequeño tapón con una sola colonia que incluye esporas y micelio sobre una placa CMA y se creció durante 4 días a 30 °C. Un tapón de la placa CMA que contiene esporas y micelio confluentes se transfirieron a 30 ml de caldo especial Promosoy (pH 6,2) (véase solicitud de patente de EE.UU. US20050153399) que contiene cobre 1 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 5 días a 30 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
c. Expresión del gen B de la laccasa en Trichoderma
[0091] Para construir el plásmido de expresión para el gen B de la laccasa de la cepa CBS 115.075 (véase Ejemplo 2b), se diseñó un cebador y se obtuvo en Invitrogen: GTAATCATGTATCACCTGGGCTCAAGG (SEQ ID No. 50). El cebador se utilizó en la reacción de PCR Herculase (véase Ejemplo 2b) con el cebador de la SEQ ID No.
46. El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se clonó en el vector pENTR/D-TOPO (Invitrogen). Se amplificaron 17 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se aisló el ADN plasmídico del clon pENTR-CBS 115.075# 1 (véase Ejemplo 3c). Se secuenció la porción del gen B de la laccasa para confirmar la fidelidad de la amplificación por PCR. El plásmido de pENTR-IaccaseB-CBS 115.075# 1 (50 ng) se convirtió en el plásmido de expresión pTrex3g-laccaseB (véase Figura 1 con el gen A de la laccasa sustituido por el gen B de la laccasa) en una reacción de 10 µl de LB clonasa II (Invitrogen) que contiene 6,5 µl de TE, 1 µl del vector pTrex3g (0,1 mg/ml) y 2 µl de ClonaseII. El plásmido de expresión se confirmó mediante la secuenciación del ADN y se transformó de manera biolística en una cepa de Trichoderma. Se seleccionaron 60 transformantes y se transfirieron a nuevas placas. Se dejaron crecer un total de 20 transformantes estables en 30 ml de medio Proflo durante 2 días a 30 °C. Se transfirieron 3 ml del cultivo del medio Proflo de 2 días de edad a 30 ml de medio definido (véase solicitud de patente de EE.UU. US20050153399) que contiene cobre 1 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 4 días a 28 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
d. Expresión del gen B de la laccasa en Trichoderma como fusión CBH1
5 [0092] Para construir el plásmido de expresión para el gen B de la laccasa de la cepa CBS 115.075, se diseñó un cebador y se obtuvo en Invitrogen: GGACTAGTGTCGCCGTTTACAAACGCGCAATCGGTCCAGTCACTGACC, SEQ ID No. 65). El cebador se utilizó junto con el cebador inverso (obtenido en New England Biolab) en la reacción de PCR Herculase que contiene pENTR-laccaseB CBS115075# 1 (véase Ejemplo 3c) como molde de ADN. El fragmento de la PCR (SEQ ID No. 66)
10 se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se digirió con las enzimas de restricción SpeI y AscI. A continuación este fragmento (SEQ ID No. 66) se clonó en el vector pTrex4 que también se había digerido con SpeI y AscI para crear el plásmido de expresión (pTrex4-laccaseB, Figura 4). La fidelidad del plásmido de expresión se confirmó mediante secuenciación del ADN y se transformó de manera biolística en una cepa de Trichoderma. Se generaron más de 100 transformantes y 60 transformantes se transfirieron a nuevas placas. Se dejaron crecer un total de 20 transformantes estables en 30 ml de medio Proflo durante 2 días a 30 °C. Se transfirieron 5 ml del cultivo del medio Proflo de 2 días de edad a 50 ml de medio definido que contiene cobre 1 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 4 días a 28 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
Ejemplo 9
a. Expresión del gen B de la laccasa de la cepa CBS 115.075 en Streptomyces
[0093] La secuencia de la proteína B de la laccasa se utilizó para la optimización codónica según el uso codónico en Streptomyces lividans. Para construir el plásmido de expresión para el gen B de la laccasa sintetizado de la cepa CBS 115.075 en Streptomyces, se utilizaron dos cebadores ACGCAGCCTGAACTAGTTGCGATCCTCTAGAG (SEQ ID No. 75) y CTCTGATCAAGGTCATCAGGTGTCGCCCGGGGACAGG (SEQ ID No. 76) en la reacción de PCR Herculase que contiene el molde de ADN optimizado (véase Ejemplo 2b). El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se digirió con XbaI y BclI. El fragmento digerido se purificó con la columna QIAquick spin y se clonó en el vector pKB105 digerido con Xbal y BamHI (véase documento US 20060154843). La corrección del plásmido pKB251 resultante (Figura 5) se confirmó mediante la secuenciación del ADN. El ADN del plásmido pKB251 se transformó en la cepa g3s3 de Streptomyces lividans (véase documento US 20060154843). Se seleccionaron 12 transformantes resistentes a tioestreptona y se transfirieron a un matraz de siembra agitado (20 ml de medio TSG que contiene 50 µg/ml de tioestreptona en DMSO), y se creció durante 2 días a 30 °C. Se transfirieron 3 ml del cultivo de 2 días de edad del matraz de siembra agitado a 30 ml de medio de producción II modificado en Streptomyces que contiene cobre 1 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 4 días a 30 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
Ejemplo 10
Expresión del gen B de la laccasa en Trichoderma como fusión CBH1 utilizando un gen sintético optimizado codónicamente
[0094] El gen B sintético optimizado de la laccasa (SEQ ID NO: 67): que codifica el gen B de la laccasa fue sintetizado por McLab Inc. (Molecular Cloning Laboratories, 384 Oyster Point Blvd, Suite15, South San Francisco, CA94080). El ADN plasmídico sintético se digirió con las enzimas de restricción SpeI y AscI y el fragmento de ADN de 1,5 kb se aisló del gel y se clonó en el vector pTrex4 que también se digirió con SpeI y AscI para crear el plásmido de expresión (pTrex4-laccaseBopt), que es similar al plásmido de expresión mostrado en la Figura 4 excepto porque el gen B de la laccasa optimizado codónicamente sustituye al gen B de la laccasa (no optimizado). El plásmido se transformó de manera biolística en una cepa de Trichoderma. Se generaron más de 30 transformantes y se transfirieron a nuevas placas. Se seleccionaron un total de 20 transformantes estables y los micelios se transfirieron a 30 ml de medio definido que contiene cobre 1 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 4 días a 28 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
Ejemplo 11
a. Expresión del gen D de la laccasa en Trichoderma
[0095] Para construir el plásmido de expresión para el gen D de la laccasa de la cepa CBS 115.075, se utilizaron dos cebadores (SEQ ID No. 63 y SEQ ID No. 64) en la reacción de PCR Herculase que contiene el molde de ADN genómico obtenido de la cepa CBS 115.075 (véase Ejemplo 2b). El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se clonó en el vector pENTR/D-TOPO. Se amplificaron 16 clones utilizando las cuentas de PCR Ready-To-Go y se secuenciaron cuatro ADN plasmídicos. Se seleccionó el clon pENTR-laccaseD CBS115.075#2. El plásmido pENTR-laccaseD CBS115.075#2 (50 ng) se convirtió en el plásmido de expresión pTrex3g-laccaseD, que es similar al plásmido de expresión mostrado en la Figura 1 excepto porque el gen D de la laccasa optimizado codónicamente sustituye al gen A de la laccasa, en una reacción de 10 µl de LB clonasa II que contiene 6,5 µl de TE, 1 µl del vector pTrex3g (0,1 mg/ml) y 2 µl de ClonaseII. El plásmido de expresión se confirmó de nuevo mediante la secuenciación del ADN y se transformó de manera biolística en una cepa de Trichoderma. Se seleccionaron 45 transformantes y se transfirieron a nuevas placas. Los micelios procedentes de 28 transformantes estables se transfirieron a 30 ml de medio definido que contiene cobre 0,5 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 4 días a 28 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
b. Expresión del gen D de la laccasa en Trichoderma como fusión CBH1
[0096] Para construir el plásmido de expresión para el gen D de la laccasa de la cepa CBS 115.075, se diseñaron dos cebadores (GGACTAGTGTCGCCGTTTACAAACGCGCAATTGGGCCCGTGGCCGAC, SEQ ID No. 68) y (AAGGCGCGCCTTAAATAGCAGTTCCTTTCTTAG, SEQ ID No. 69) y se obtuvieron en Invitrogen. Los cebadores se utilizaron en la reacción de PCR Herculase que contiene ADN genómico de la cepa CBS115.075 como molde de ADN. El fragmento de la PCR se purificó utilizando la columna QIAquick spin y se digirió con las enzimas de restricción SpeI y AscI y se clonó en el vector pTrex4 (véase solicitud de patente 10/590.956; WO 05/093050) que también se había digerido con SpeI y AscI para crear el plásmido de expresión (pTrex4-laccaseD). La fidelidad del plásmido de expresión se confirmó mediante secuenciación del ADN y se transformó de manera biolística en una
5 cepa de Trichoderma. Se generaron más de 300 transformantes y 60 transformantes se transfirieron a nuevas placas. Los micelios procedentes de 25 transformantes estables se transfirieron a 30 ml de medio definido que contiene cobre 0,5 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 4 días a 28 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
[0097] Expresión del gen D de la laccasa en Trichoderma como fusión CBS1 utilizando un gen sintético optimizado codónicamente
15 [0098] El ADN (SEQ ID NO: 70):
que codifica el gen D de la laccasa (basado en el gen procedente de CBS 115.075) fue sintetizado por DNA2.0 Inc.
20 (1455 Adams Drive, Menlo Park, CA94025). El ADN plasmídico sintético se digirió con las enzimas de restricción SpeI y AscI y el fragmento de ADN de 1,5 kb se aisló del gel y se clonó en el vector pTrex4 que también se digirió con SpeI y AscI para crear el plásmido de expresión (pTrex4-laccaseDopt). El plásmido se transformó de manera biolística en una cepa de Trichoderma. Se transfirieron 40 transformantes a nuevas placas. Se seleccionaron un total de 24 transformantes estables y los micelios se transfirieron a 30 ml de medio definido que contiene cobre 0,5 mM.
25 Los cultivos se dejaron crecer durante 4 días a 28 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
Ejemplo 13
Expresión del gen D de la laccasa en Bacillus como fusión BCE103 utilizando un gen sintético optimizado codónicamente
[0099] El ADN (SEQ ID NO: 71):
10 que codifica el gen D de la laccasa (basado en el gen procedente de CBS 115.075) fue sintetizado por DNA2.0 Inc. (1455 Adams Drive, Menlo Park, CA94025). El ADN plasmídico sintético se digirió con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y el fragmento de ADN de 1,5 kb se aisló del gel y se clonó en el vector p2JMagk1031nk2 (véase documento US20050202535A1) digerido con las dos mismas enzimas de restricción para crear el plásmido de
15 expresión p2JMagk1031nk2E-laccase (Figura 6). El plásmido se transformó en una cepa de B. subtilis (degUHy32, oppA, DspoIIE, DaprE, DnprE, Depr, DispA, Dbpr, Dvpr, DwprA, Dmpr-ybfJ, DnprB, amyE: : xilRPxilAcomK-ermC) (véase documento US20050202535A1). Se seleccionaron dos transformantes en placas de agar Luria Broth con 5 mg/ml de cloranfenicol, y a continuación para seleccionar los clones con el mayor número de copias de los genes, las colonias se sembraron en serie con un asa bacteriológica en placas de agar Luria Broth con 25 mg/ml de
20 cloranfenicol hasta que se obtuvo un crecimiento rápido de las colonias. Los transformantes amplificados se inocularon en 30 ml de medio MBD (véase documento US20050202535A1) que contiene cobre 0,5 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 60 h a 37 °C. Los caldos de cultivo se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo ABTS.
Ejemplo 14
Blanqueo de índigo solubilizado con diferentes laccasas
5 [0100] Se llevó a cabo un ensayo para el blanqueo del sustrato índigo solubilizado mediante combinaciones de laccasa/mediador en placas de microtitulación de 96 pocillos de la manera siguiente.
[0101] Se preparó una disolución saturada de índigo en N-metilpirrolidona (NMP) agitando índigo (30 mg) en NMP (10 ml) a temperatura ambiente durante 5 horas. La disolución de NMP se diluyó 10 veces en una disolución acuosa
10 tampón que produjo una disolución azul. Por ejemplo, la dilución en tampón acetato sódico 50 mM a pH 5, o tampón fosfato sódico 50 mM a pH 7. Las disoluciones se agitaron bien inmediatamente antes de su uso.
[0102] El ensayo para el blanqueo del sustrato índigo solubilizado se llevó a cabo en una placa de microtitulación de 96 pocillos en el que cada pocillo contenía la disolución de índigo soluble en tampón acetato sódico 50 mM a pH 15 5 (180 µl), laccasa (10 ppm de enzima) y disolución mediadora (de una disolución madre 20 mM en metanol). El volumen total de cada pocillo se ajustó a 200 µl con agua desionizada. Se corrió un control por duplicado que contenía sólo laccasa. La placa se selló y se incubó a 50 °C durante 2 horas a 800 rpm en un agitador calefactado (Thermomixer, Eppendorf). Después de este periodo, las placas se abrieron y se añadió una disolución de ácido ascórbico (20 µl de una disolución acuosa al 10 %) a cada pocillo con el fin de reducir las formas oxidadas de los
20 mediadores. A continuación se valoró el grado de blanqueo del índigo determinando la absorbancia de cada pocillo a 600 nm utilizando un lector de placas de microtitulación. Cuanto menor es la lectura de la absorbancia, mayor es el grado de blanqueo del índigo.
[0103] La Figura 7 muestra los resultados para una laccasa de la especie Thielavia (Ecostone LCC10, AB
25 enzymes, Darmstadt, Alemania). Los mediadores utilizados fueron ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico (ABTS), ácido siríngico, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA), siringato de metilo (MS), 4-(N-metil-carboxamido)2,6-dimetoxifenol (MSA), 10-(carboxipropil)-fenotiazina (PTP) y siringaldehído. Los cambios en la absorbancia a 600 nm en relación al control se listan en la Tabla 1 en la que el cambio más grande en la absorbancia corresponde al mayor grado de blanqueo del índigo.
30 [0104] A una concentración de mediador de 500 µM, el mediador más eficaz para el blanqueo del índigo fue el ABTS, seguido por la N-metilamida (MSA) y la amida no sustituida, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA). A la concentración de mediador más baja de 50 µM, el ABTS aún era el mediador más eficaz, siendo el resto de mediadores más o menos equivalentes. La excepción fue el ácido siríngico, que blanqueó el índigo soluble no más
35 eficazmente que las condiciones de control.
Tabla 1. Cambio en la absorbancia a 600 nm después del blanqueo de índigo soluble utilizando una laccasa de la especie Thielavia y una variedad de mediadores a unas concentraciones de 500 y 50 µM (n = 2)
Control 0 0,008 0 0,010 ABTS 0,235 0,019 0,174 0,032 Ácido siríngico 0,024 0,017 0,005 0,009 SA 0,170 0,018 0,088 0,014 Siringato de metilo 0,062 0,035 0,090 0,012 MSA 0,181 0,013 0,103 0,018 PTP 0,044 0,009 0,132 0,020 Siringaldehído 0,132 0,012 0,092 0,017
Ejemplo 15. Ensayo de blanqueo de índigo soluble con diferentes laccasas a dos valores de pH
[0105] Laccasas derivadas de las especies Myceliophthora (Denilite® II, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca), Thielavia (Ecostone LCC 10, AB enzymes, Darmstadt, Alemania) y Cerrena se valoraron para su capacidad de
45 blanquear índigo solubilizado junto con mediadores de bajo peso molecular a dos valores de pH.
[0106] El blanqueo de índigo solubilizado en placas de microtitulación de 96 pocillos se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 14, utilizando 3 laccasas diferentes a valores de pH 5 y 7. Los mediadores utilizados fueron ácido sinapínico, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA), siringato de metil-4-acetilo (AMS), siringato de metilo (MS) y
50 ácido 2,2'-azino bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico (ABTS). Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados del blanqueo de índigo soluble a valores de pH de 5 y 7 utilizando 3 laccasas derivadas de las especies Myceliophthora, Thielavia y Cerrena, respectivamente. Estos datos están representados en las Tablas 2 y 3.
Tabla 2. Cambio en la absorbancia a 600 nm en relación a un control después del blanqueo de índigo soluble utilizando laccasas procedentes de las especies Myceliophthora, Thielavia y Cerrena a pH 5, a una concentración de mediador de 250 µM.
Thielavia Myceliophthora Cerrena
M 600 Desv. Están. M 600 Desv. Están. M 600 Desv. Están.
Control 1 0 0,016 0 0,010 0 0,005 Ácido sinapínico 0,068 0,019 0,157 0,020 0,240 0,007 SA 0,170 0,011 0,254 0,013 0,142 0,005 AMS 0,100 0,012 0,117 0,007 0,028 0,003 MS (AB) 0,048 0,011 0,057 0,007 0,005 0,011 MS (Denilite) 0,050 0,013 0,061 0,007 0,043 0,013 ABTS 0,234 0,012 0,267 0,008 0,329 0,031 Control 2 -0,007 0,017 -0,011 0,007 -0,006 0,005
5 Tabla 3. Cambio en la absorbancia a 600 nm en relación a un control después del blanqueo de índigo soluble utilizando laccasas procedentes de las especies Myceliophthora, Thielavia y Cerrena a pH 7, a una concentración de mediador de 250 µM.
Thielavia Myceliophthora Cerrena
M 600 Desv. Están. M 600 Desv. Están. M 600 Desv. Están.
Control 1 0 0,008 0 0,001 0 0,006
Ácido sinapínico 0,112 0,015 0,204 0,020 0,257 0,005
SA 0,162 0,006 0,220 0,009 0,128 0,010
AMS 0,087 0,006 0,078 0,005 0,077 0,007
MS (AB) 0,053 0,010 0,076 0,006 0,000 0,006
MS (Denilite) 0,069 0,017 0,086 0,001 0,008 0,018
ABTS 0,145 0,006 0,155 0,014 0,215 0,056
Control 2 0,007 0,006 -0,004 0,001 0 0,005
Ejemplo 16. Purificación y determinación de actividad específica
[0107] El gen D optimizado de la laccasa (SEQ ID NO: 70) se expresó mediante el sistema de expresión descrito en la solicitud copendiente WO 2009/058956 titulada "Signal Sequences and co-expressed chaperones for improved 15 heterologous protein production in a host cell", presentada el 1 de noviembre de 2007 en fermentadores de 14 litros. El caldo de fermentación se recogió a las 184 horas y se concentró mediante ultrafiltración (UFC 20070245). El concentrado se sometió a diafiltración en tampón acetato sódico 25 mM, a pH 4,0. A continuación se cargaron 500 ml de la muestra UFC diafiltrada en una columna de intercambio iónico que contiene resina Poros HS-20 (Applied Biosystems, columna de 20 X 275 mm) equilibrada con tampón acetato sódico 25 mM, a pH 4,0. La columna se lavó 20 con 10 volúmenes de columna de tampón acetato sódico 25 mM, a pH 4,0. La proteína D de la laccasa se eluyó de la columna utilizando un gradiente salino (12 volúmenes de columna) de cloruro sódico entre 40 mM y 80 mM en tampón acetato sódico 25 mM, a pH 4,0. Las fracciones que contienen la actividad laccasa se reunieron y se concentraron adicionalmente utilizando una celda de agitación Amicon de 400 ml con una membrana 10K. La proteína total se midió con un gel de proteínas SDS utilizando BSA como patrón a 4 mg/ml (> 90 % puro). La 25 muestra laccasa se diluyó 10.000 veces con agua y se almacenó a temperatura ambiente durante 18 horas y a 4 °C durante más de 24 horas. La actividad del ABTS se midió en 8570 U/ml. La actividad específica de la laccasa D recombinante se calculó a continuación dividiendo las 8570 U/ml por 4 mg/ml dando como resultado 2140 U/mg de proteína, que es más de 100 veces superior a la actividad de la laccasa de Stachybotrys (16 U/mg), (véase Mander y col, Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72: 5020 – 5026). Así, esta enzima produce una menor liberación de cobre al
30 medio ambiente que otras laccasas, por ejemplo, la laccasa de Stachybotrys, en virtud de su alta actividad específica.
Ejemplo 17. Procedimiento para el blanqueo de tejido vaquero
Mediadores
[0108] La 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzamida (siringamida, SA) se obtuvo en Punjab Chemicals & Crop Protection Limited (Mumbai, India). El 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzonitrilo (siringonitrilo, SN) se obtuvo en StereoChemical, Inc., (Newark, DE) o Punjab Chemicals & Crop Protection Limited (Mumbai, India).
Enzima
[0109] En los experimentos se utilizó la enzima laccasa, derivada de Cerrena unicolor (Ejemplo 16, 8570 U/ml, 4 mg de proteína/ml).
Procedimiento
[0110] Las incubaciones de la enzima se realizaron en un ATLAS LP 2 Launder-O-meter a diferentes condiciones en relación con el pH, la temperatura, la concentración de enzima y la concentración del mediador.
[0111] Las reacciones se llevaron a cabo en matraces de reacción de acero inoxidable de 500 ml que contienen 100 ml de líquido. A cada matraz se le añadió cinco (7 x 7 cm) retazos de tejido vaquero lavados a la piedra (estilo vaquero ACG 80270) y 6 bolas de acero de 6 mm de diámetro. Los matraces de reacción se cerraron y se introdujeron en el laurider-O-meter que se había calentado previamente hasta la temperatura deseada. La incubación se llevó a cabo durante 30 minutos, tras los cuales los retazos se lavaron con un chorro de agua del grifo, se secaron por centrifugación en una centrífuga AEG IPX4 y se secaron con una plancha Elna Press Electronic en programa de algodón y se evaluó.
Lavado a la piedra del tejido vaquero
[0112] El tejido vaquero, 12 perneras con un peso de 3 kg aproximadamente, se desaprestó en una lavadora Unimac UF 50 en las siguientes condiciones:
- •
- Desaprestado durante 15 minutos a una relación de líquidos de 10: 1 a 50 °C con 0,5 g/l (15 g) de amilasa Optisize 160 (Genencor) y 0,5 g/l (15 g) de un tensioactivo no iónico (por ejemplo, Rucogen BFA, (Rudolf Chemie) o Ultravon GPN, (Huntsman)).
- •
- 2 aclarados en frío durante 5 minutos a una relación de líquidos de 30: 1.
[0113] Después del desaprestado el tejido vaquero se lavó a la piedra en una lavadora Unimac UF 50 en las siguientes condiciones:
- •
- Aclarado en frío durante 5 minutos a una relación de líquidos de 10: 1.
- •
- Lavado a la piedra durante 60 minutos a una relación de líquidos de 10: 1 a 55 °C con 1 kg de piedra pómez, tampón citrato (30 g de citrato de tri-sodio dihidratado y 30 g de monohidrato de ácido cítrico) y 35 g de celulasa IndiAge 2XL (Genencor).
- •
- 2 aclarados en frío durante 5 minutos a una relación de líquidos de 30: 1.
[0114] El tejido vaquero se secó en una secadora doméstica Miele Novotronic T494C. A partir de las perneras de tela vaquera se cortaron retazos de 7 x 7 cm.
Evaluación de retazos de tejido vaquero
[0115] Se midió el color de los cinco retazos de tejido vaquero con un Minolta Chromameter CR 310 en el espacio de color del CIE Lab con una fuente de luz D 65. Las mediciones se realizaron antes y después del tratamiento con la laccasa y los resultados de los cinco retazos se promediaron. Se calculó la diferencia total de color (TCD). La diferencia total de color se puede calcular con la fórmula: TCD = - (ML)2 + (Ma)2 + (Mb)2.
Evaluación de las perneras de tejido vaquero
[0116] Las perneras de tejido vaquero se evaluaron con un Minolta Chromameter CR 310 en el espacio de color del CIE Lab con una fuente de luz D 65. Las mediciones se realizaron sólo después del tratamiento con la laccasa. Para cada pernera de tejido vaquero se tomaron ocho mediciones y los resultados de las 12 perneras (96 mediciones) se promediaron. La diferencia total de color (ME) se calcula a partir de la diferencia entre los valores inicial y final de CIE L*a*b*, según la fórmula:
ME � (ML2 + Ma2 + Mb2)1/2
Ejemplo 18. Efecto de la temperatura sobre el comportamiento blanqueante de la laccasa D recombinante (Unimac)
5 [0117] Blanqueo con la laccasa del tejido vaquero lavado a la piedra: El tejido vaquero, 12 perneras de 3 kg aproximadamente, se desaprestó y se lavó a la piedra como se ha descrito en el Ejemplo 17. Después del lavado a la piedra, se realizó un tratamiento con la laccasa en una lavadora Unimac UF 50 según el siguiente procedimiento:
10 • 30 minutos a una relación de líquidos de 10: 1.
• pH 6 (21 g de fosfato monosódico y 5 g de ácido adípico, laccasa D) o pH 4,8 (8,6 g de fosfato monosódico y 16,8 g de ácido adípico, laccasa Novoprime Base 268).
15 • Laccasa (laccasa D o Novoprime Base 268).
• Mediador (siringamida (SA) y siringonitrilo (SN)).
• Después del tratamiento con la laccasa el tejido vaquero se aclaró dos veces con agua fría durante 5 minutos a 20 una relación de líquido de 30: 1.
[0118] Se llevaron a cabo los experimentos con la laccasa y los resultados se presentan en las Tablas 4 y 5.
Tabla 4 Concentración Laccasa D Mediador Concentración Mediador Temperatura ( °C) Nivel de blanqueo (CIE L)
0,05 g/l/0,4 U/ml SA 0,33 mM 60 35,6 0,05 g/l/0,4 U/ml SN 0,47 mM 60 35,9 0,05 g/l/0,4 U/ml SA 0,33 mM 40 35,6 0,05 g/l/0,4 U/ml SN 0,47 mM 40 35,7
Tabla 5 Concentración Novoprime base 268 Concentración Mediador Temperatura ( °C) Nivel de blanqueo (CIE L)
0,05 g/l 0,023 g/l 60 35,9 0,05 g/l 0,023 g/l 40 33,7 25 [0119] La laccasa D recombinante presenta un mejor comportamiento a bajas temperaturas que las laccasas comerciales disponibles actualmente. La laccasa D (en presencia del mediador) proporciona un efecto blanqueante a temperaturas por debajo de los 60 °C, preferentemente entre 40 °C y 60 °C. Así, la laccasa puede proporcionar un beneficio energético al procesador textil. 30
Ejemplo 19. Efecto de la concentración de la enzima laccasa recombinante y el mediador sobre el comportamiento blanqueante (Launder-O-meter)
[0120] Se evaluó el efecto de la concentración de la laccasa y el mediador corriendo los experimentos de la tabla 35 siguiente a pH 6 (tampón fosfato monosódico 50 mM con el pH ajustado mediante una disolución de hidróxido sódico 4 N) y una temperatura de 60 °C.
[0121] Los experimentos se realizaron con el mediador siringamida (SA) -y siringonitrilo (SN).
40 [0122] Se añadieron 100 ml de tampón a un vaso de precipitados con cinco retazos de 7 x 7 cm. Peso total 12 g, (relación de tejido vaquero: líquido = 1: 8). Las concentraciones de laccasa y mediador se utilizaron como se indica en las tablas siguientes.
Tabla 6 Concentración de la enzima Laccasa Correspondencia de la Actividad (Unidades Laccasa/g tejido (µl/l) vaquero)
10 0,67 33 2,17 55 3,67 78 5,17 100 6,67
Tabla 7 Concentración Mediador (mM)
0,10 0,33 0,55 0,78 1,00
[0123] A cada vaso de precipitados se le añadieron cantidades de mediador siringamida o siringonitrilo tal y como se indica en las tablas siguientes como dilución de una disolución madre de SA o SN 275 mM en metanol al 98 %. La laccasa se añadió a cada vaso de precipitados como se indica en las tablas siguientes, como dilución de una disolución madre de laccasa de 400 U/ml. Los vasos de precipitados se cerraron y se procesaron a 60 °C como se describe en el Ejemplo 17. Los retazos se evaluaron como se describe en el Ejemplo 17.
Tabla 8
LACCASA + SA a 60 °C ypH 6
Laccasa (µl/l) Mediador siringamida (mM) TCD
100 1,00 5,6 100 1,00 6,0 100 0,10 2,9 78 0,33 4,4 55 1,00 6,2 55 0,55 5,3 33 0,78 5,5 33 0,33 4,6 10 1,00 3,2 10 0,10 2,5 55 0,55 3,1 100 0,55 5,8 78 0,78 5,9 100 0,10 3,2 55 0,10 3,1 10 0,55 3,6 TCD = diferencia total de color
Tabla 9
LACCASA+ SN a 60 °C y pH 6
Laccasa (µl/l) Mediador siringonitrilo (mM) TCD
100 1,00 7,6 100 1,00 8,1 100 0,10 4,1 78 0,33 5,6 55 1,00 7,0 55 0,55 6,0 33 0,78 5,5 33 0,33 4,4 10 1,00 3,8 10 0,10 2,7 55 0,55 6,3 100 0,55 7,1 78 0,78 7,1 100 0,10 4,0 55 0,10 3,5 10 0,55 3,4 TCD = diferencia total de color
[0124] Las Tablas anteriores y las Figuras 10 y 11 muestran que se necesita tanto la enzima como el mediador para conseguir el blanqueo. También muestra que hay flexibilidad en la relación de enzima/mediador en la consecución de cierto nivel de blanqueo.
Ejemplo 20. Efecto de dosis-respuesta de la laccasa D recombinante sobre el comportamiento de blanqueo (Unimac)
[0125] Blanqueo con la laccasa del tejido vaquero lavado a la piedra: El tejido vaquero, 12 perneras de 3 kg
10 aproximadamente, se desaprestó y se lavó a la piedra como se ha descrito en el Ejemplo 17. Después del lavado a la piedra, se realizó un tratamiento con la laccasa según el siguiente procedimiento: 30 minutos a una relación de líquidos de 10: 1 y pH 6 (21 g de fosfato monosódico y 5 g de ácido adípico) y 60 °C con la laccasa y mediador. Después del tratamiento con la laccasa el tejido vaquero se aclaró dos veces con agua fría durante 5 minutos a una relación de líquido de 30: 1.
15 [0126] Se llevaron a cabo los siguientes experimentos.
• Siringamida 0,33 mM:
0,010 34,6 0,05 36,2 0,25 36,2
• Siringonitrilo 0,39 mM:
0,25 37,7 0,4 39,5 0,53 38,8
[0127] Los resultados se muestran en las tablas anteriores. Esto demuestra que con la laccasa D recombinante y
25 el mediador amida el nivel de blanqueo se estabiliza rápidamente. Con una concentración de enzima de 0,05 y 0,25 se obtiene el mismo nivel de blanqueo. Para la laccasa D recombinante y el mediador nitrilo el nivel de blanqueo se incrementa hasta 0,4 g/l, que parece ser el óptimo.
[0128] Se debe entender que los ejemplos y formas de realización descritos en el presente documento tienen sólo
30 fines ilustrativos y que en vista de ellos son posibles diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una laccasa aislada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, o que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % a la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.
-
- 2.
- Un ácido nucleico aislado que codifica una laccasa según la reivindicación 1.
-
- 3.
- Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2 en el que dicho ácido nucleico tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.
-
- 4.
- Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 2 o la reivindicación
- 3.
-
- 5.
- Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión según la reivindicación 4.
-
- 6.
- Un procedimiento de blanqueo de colorantes en una disolución, procedimiento que comprende el tratamiento de los colorantes en la disolución con una laccasa de la reivindicación 1 y un mediador eficaz.
-
- 7.
- Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el mediador se selecciona del grupo constituido por acetosiringona, siringaldehído, siringamida, metilsiringamida, 2-hidroxietil siringamida, siringato de metilo, siringonitrilo, dimetilsiringamida, y ácido siríngico.
-
- 8.
- El uso de una laccasa según la reivindicación 1 en un procedimiento para el blanqueo de tejidos.
-
- 9.
- El uso según la reivindicación 8 en el que el procedimiento comprende además la utilización de un mediador seleccionado del grupo constituido por acetosiringona, siringaldehído, siringamida, metilsiringamida, 2hidroxietil siringamida, siringato de metilo, siringonitrilo, dimetilsiringamida, y ácido siríngico.
-
- 10.
- Un procedimiento según la reivindicación 8, en donde el tejido se tiñe con un colorante de tina.
-
- 11.
- Un procedimiento según la reivindicación 8, en donde el tejido es un tejido celulósico, una mezcla de fibras celulósicas, o una mezcla de fibras celulósicas y sintéticas.
-
- 12.
- Un procedimiento según la reivindicación 8, en donde el tejido es tejido vaquero.
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