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ES2376010T3 - Prote�?na de fusión de transcriptasa inversa de la telomerasa, nucleótidos que la codifican y usos de la misma. - Google Patents

Prote�?na de fusión de transcriptasa inversa de la telomerasa, nucleótidos que la codifican y usos de la misma. Download PDF

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ES2376010T3
ES2376010T3 ES07821082T ES07821082T ES2376010T3 ES 2376010 T3 ES2376010 T3 ES 2376010T3 ES 07821082 T ES07821082 T ES 07821082T ES 07821082 T ES07821082 T ES 07821082T ES 2376010 T3 ES2376010 T3 ES 2376010T3
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Nicola La Monica
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de una proteína de fusión de hTERT-LTB como se expone en la SEC ID Nº: 6.

Description

Proteína de fusión de transcriptasa inversa de la telomerasa, nucleótidos que la codifican y usos de la misma
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a la terapia del cáncer. Más específicamente, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican proteínas de fusión, en la que las proteínas de fusión comprenden al menos una porción del polipéptido asociado a tumores transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT). La presente invención también proporciona vectores recombinantes y huéspedes que comprenden dichos polinucleótidos, proteínas de fusión purificadas y procedimientos para generar o aumentar una respuesta inmune contra el producto proteico del gen de TERT, usando las composiciones y moléculas desveladas en el presente documento.
Antecedentes de la invención
La vacunación se ha convertido en un procedimiento convencional para la prevención de numerosas enfermedades infecciosas. La aplicación de vacunas a otras enfermedades, tales como cáncer, es ahora una posibilidad atractiva debido a los avances en la ingeniería molecular y a una mejor comprensión de la inmunología tumoral.
El cáncer es una de las causas principales de mortalidad en todo el mundo. A pesar de la abundancia de investigaciones relacionadas con el cáncer, las terapias convencionales que combinan cirugía, radiación y quimioterapia con frecuencia fracasan en el tratamiento eficaz de cánceres establecidos. Continúan sin estar disponibles también procedimientos fiables de prevención.
El cáncer implica normalmente el mal funcionamiento de genes que contribuyen a la regulación del ciclo celular o a la proliferación celular, tales como factores de crecimiento y sus receptores, oncogenes y genes supresores de tumores. Los productos de muchos de estos genes se expresan en la superficie de una amplia diversidad de células tumorales y, por lo tanto, se denominan antígenos asociados o tumores (TAA). Se ha demostrado que la introducción de genes que codifican TAA directamente en un sujeto genera una respuesta inmune protectora frente a los TAA en muchos modelos experimentales, haciendo de estas moléculas una diana para la terapia vacunal. Sin embargo, debido a que muchos de estos productos génicos también se expresan en células normales, aunque a menores niveles, muchas terapias inmunológicas que se dirigen a TAA han demostrado ser ineficaces debido a la autotolerancia.
Los genes que codifican varios antígenos asociados a tumores (TAA) se han aislado, caracterizado e insertado en vectores genéticos tales como ADN plasmídico y vectores víricos. Un antígeno asociado a tumor que se ha implicado en la patogénesis del cáncer es la telomerasa (TERT).
La telomerasa es una ADN polimerasa que funciona normalmente en el mantenimiento de la longitud del telómero en los extremos de los cromosomas. Durante el crecimiento celular normal, un cebador de ARN se une al extremo 5’ del ADN e inicia la replicación. Tras la eliminación del cebador de ARN, se introduce un hueco de longitud en la cadena de ADN hija resultante. Por lo tanto, la replicación de una cadena lineal de ADN con polimerasas convencionales conduce a un acortamiento de la longitud del telómero en cada ronda progresiva de replicación. Dicho acortamiento de la longitud del telómero es responsable de la senescencia celular o del envejecimiento de las células somáticas humanas normales.
La telomerasa es una ribonucleoproteína que comprende un componente de ARN y un componente proteico catalítico (transcriptasa inversa de la telomerasa). El componente catalítico de la telomerasa humana lo describieron Meyerson y col. (Cell 1197: 785-95 (1990) y Nakamura y col. (Science 277: 955-59 (1997)). La enzima TERT usa su componente de ARN como molde para la síntesis de ADN de telómero, permitiendo de este modo que los telómeros mantengan su longitud a lo largo de generaciones sucesivas de crecimiento celular. Dicho mantenimiento de la longitud del telómero a lo largo de numerosos ciclos proliferativos permite que una célula escape a la senescencia normal y se vuelva inmortal, permitiendo que un tumor crezca y metastatice a lo largo de grandes periodos de tiempo. Debido a que la telomerasa confiere inmortalidad replicativa a las células, se ha detectado actividad telomerasa en líneas de células cancerosas y en una variedad diversa de tipos tumorales (Kim y col. Science 266: 2011-15 (1994)). Por el contrario, la telomerasa es inactiva o solamente se expresa de forma transitoria a bajos niveles en tejidos humanos normales y cultivos de células somáticas normales. La combinación de la sobreexpresión de telomerasa en la mayoría de tipos de cáncer, así como la baja expresión o la ausencia de expresión en células normales, hace de TERT una diana para la terapia y/o profilaxis de enfermedades asociadas con una proliferación celular aberrante tales como cáncer.
El desarrollo de una vacuna específica de telomerasa es ahora posible debido a que los componentes catalíticos y de ARN de la telomerasa se han clonado y caracterizado (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.166.178). Sin embargo, el desarrollo y la comercialización de muchas vacunas se han visto obstaculizados por las dificultades asociadas con la obtención de altos niveles de expresión del inmunógeno deseado en organismos huésped transformados con éxito. El desarrollo de vacunas basadas en ADN eficaces también se ha visto obstaculizado por la incapacidad para generar una respuesta inmune de una magnitud suficiente en individuos tratados para conducir a la regresión tumoral en un entorno clínico. Por lo tanto, a pesar de la identificación de las
secuencias de nucleótidos de tipo silvestre que codifican las proteínas telomerasa descritas anteriormente, sería altamente deseable desarrollar una vacuna que sea capaz de generar una respuesta inmune específica de TERT aumentada respecto a un ADNc de TERT de longitud completa de tipo silvestre, cuando se administre a un mamífero. También sería deseable desarrollar procedimientos para tratar o prevenir cánceres asociados a TERT que utilicen moléculas de ácido nucleico o proteínas que potencien eficazmente y con seguridad una respuesta inmune específica de TERT.
Sumario de la invención
Como se ha indicado anteriormente, la expresión del gen del antígeno asociado a tumor transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) está comúnmente asociada con el desarrollo o la presencia de adenocarcinomas, incluyendo carcinomas colorrectales. Con este fin, la presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para generar o aumentar la inmunidad contra los productos proteicos expresados por el gen de TERT humano (hTERT). En concreto, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican la variante de proteínas de fusión, en la que las proteínas de fusión comprenden la proteína hTERT fusionada a una porción sustancial de la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli (LTB) expuesta en la SEC ID Nº: 6. La presente invención también proporciona vectores recombinantes, incluyendo, pero sin limitación, vectores plasmídicos y adenovirus, que comprenden dichos polinucleótidos, y células huésped que comprenden dichos vectores recombinantes. También se proporcionan en el presente documento proteínas de fusión purificadas codificadas por polinucleótidos de la invención. Las proteínas de fusión de hTERT-LTB y polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión son útiles como vacunas para la prevención y/o tratamiento del cáncer asociado a la telomerasa. Dichas vacunas son útiles como monoterapia o como parte de un régimen terapéutico, comprendiendo dicho régimen la administración de una segunda vacuna, tal como una vacuna de polinucleótido, basada en células, de proteína o basada en péptido, o comprendiendo radioterapia o quimioterapia.
En realizaciones preferidas de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica hTERT y/o la secuencia de nucleótidos que codifica LTB comprende codones que se han optimizado para altos niveles de expresión en una célula huésped humana. En otras palabras, en ciertas realizaciones de la invención, el patrón de uso de codones de la secuencia polinucleotídica se parece al de genes mamíferos y/o seres humanos altamente expresados.
Otro aspecto de la presente invención es una construcción de expresión que comprende nucleótidos que codifican la proteína hTERT-LTB variante expuesta en la SEC ID Nº: 6. En realizaciones preferidas de esta parte de la invención, la construcción comprende una secuencia líder TPA antes de la secuencia codificante para el gen de TERT para asegurar que la proteína de fusión de TERT-LTB se secreta.
En la presente invención, la actividad catalítica de la telomerasa del antígeno de telomerasa está inactivada, de modo que la proteína de fusión de TERT codificada es más segura que la TERT de tipo silvestre para fines vacunales. La actividad enzimática de la proteína de fusión de TERT puede inactivarse por adición de mutaciones/deleciones a la secuencia de nucleótidos codificante de TERT. En la invención, se han mutado nucleótidos para cambiar aminoácidos específicos D712A y V713I en la secuencia proteica de TERT humana.
La presente invención proporciona además vectores plasmídicos y adenovíricos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de hTERT-LTB variante expuesta en la SEC ID Nº: 6. La presente invención también describe el uso de los vectores plasmídicos y de adenovirus en composiciones inmunogénicas y vacunas para la prevención y/o tratamiento del cáncer asociado a hTERT. En realizaciones preferidas de esta parte de la invención, el vector de adenovirus es un vector Ad6. En otras realizaciones preferidas, el vector Ad es un vector Ad5.
También se describen procedimientos para prevenir el desarrollo de un cáncer en un paciente o tratar a un paciente con un tumor asociado a telomerasa generando una respuesta inmune contra la proteína TERT por administración de una vacuna o composición farmacéutica que comprende las fusiones de TERT o proteínas de fusión de TERT proporcionadas por la invención. Preferentemente, la respuesta inmune se aumenta respecto a la respuesta generada por una TERT de tipo silvestre.
Como se usan a lo largo de toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una" y "el", "la" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto imponga claramente otra cosa.
Como se usan a lo largo de toda la memoria descriptiva y de las reivindicaciones adjuntas, son aplicables las siguientes definiciones y abreviaturas:
El término "promotor" se refiere a un sitio de reconocimiento en una cadena de ADN al que se une la ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de inicio con la ARN polimerasa para iniciar y dirigir la actividad transcripcional. El complejo puede modificarse por secuencias activantes denominadas "potenciadores" o secuencias inhibidoras denominadas "silenciadores".
El término "casete" se refiere a una secuencia génica o de nucleótidos que se va a expresar a partir de un vector, por ejemplo, la secuencia génica o de nucleótidos que codifica la fusión de hTERT(AI)-LTB. En general, un casete
comprende una secuencia génica que puede insertarse en un vector, que en algunas realizaciones proporciona secuencias reguladoras para expresar la secuencia génica o de nucleótidos. En otras realizaciones, la secuencia génica o de nucleótidos proporciona las secuencias reguladoras para su expresión. En realizaciones adicionales, el vector proporciona algunas secuencias reguladoras y la secuencia génica o de nucleótidos proporciona otras secuencias reguladoras. Por ejemplo, el vector puede proporcionar un promotor para transcribir la secuencia génica
o de nucleótidos, y la secuencia génica o de nucleótidos proporciona una secuencia de terminación de la transcripción. Las secuencias reguladoras que pueden proporcionarse por el vector incluyen, pero sin limitación, potenciadores, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias aceptoras y donadoras de corte y empalme, intrones, secuencias de unión al ribosoma y secuencias de adición de poli(A).
El término "vector" se refiere a algunos medios por los que pueden introducirse fragmentos de ADN en un organismo huésped o tejido huésped. Existen diversos tipos de vectores incluyendo plásmidos, virus (incluyendo adenovirus), bacteriófagos y cósmidos.
La expresión "primera generación", como se usa en referencia a vectores adenovíricos, describe vectores adenovíricos que presentan una replicación defectuosa. Los vectores adenovíricos de primera generación tienen normalmente una región génica E1 delecionada o inactivada y, preferentemente, tienen una región génica E3 delecionada o inactivada.
La denominación "pV1JnsA/TPA-mTERT(AI)-LTBopt" se refiere a una construcción plasmídica desvelada en el presente documento, que comprende el promotor inmediato temprano (IE) de CMV con el intrón A, un gen de TERT murina de longitud completa y codones optimizados fusionado a un gen de LTB de codones optimizados, y secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación derivadas de la hormona de crecimiento bovina (véase el EJEMPLO 2). Además, una secuencia líder que codifica la secuencia señal del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano está presente 5’ a la secuencia de nucleótidos que codifica mTERT-LTB. La denominación "AI" indica que se añadieron mutaciones a la secuencia de TERT para eliminar funcionalmente la actividad catalítica de la telomerasa. La denominación "pV1JnsA/ mTERT(AI)opt" se refiere a una construcción esencialmente como se ha descrito anteriormente, excepto por que la construcción comprende una secuencia de nucleótidos de TERT optimizada murina que no se fusionó a LTB o TPA.
La denominación "pV1JnsA/TPA-hTERT(AI)-LTBopt" se refiere a una construcción plasmídica desvelada en el presente documento, que comprende el promotor inmediato temprano (IE) de CMV con el intrón A, un gen de TERT humana de longitud completa y codones optimizados fusionado a un gen de LTB de codones optimizados, y secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación derivadas de la hormona de crecimiento bovina (véase el EJEMPLO 2). Además, una secuencia líder que codifica la secuencia señal del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano está presente 5’ a la secuencia de nucleótidos que codifica hTERT-LTB. La secuencia de hTERT en esta construcción comprende mutaciones para eliminar funcionalmente la actividad catalítica de la telomerasa.
Las denominaciones "Ad6/TPAmTERT(AI)-LTBopt" y "Ad6/hTERT(AI)" se refieren a dos construcciones desveladas en el presente documento, que comprenden un genoma adenovírico Ad6 con deleción de las regiones E1 y E3. En la construcción "Ad6/TPAmTERT(AI)-LTBopt", la región E1 se sustituye por un gen de TERT murina-LTB de codones optimizados en una orientación paralela a E1 bajo el control de un promotor de CMV humano sin el intrón A, seguido por una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. La secuencia codificante de TERT comprende mutaciones para eliminar la actividad catalítica de la telomerasa. La construcción comprende además secuencias que codifican la secuencia señal del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano 5’ a la secuencia de nucleótidos codificante de TERT(AI)-LTB. La construcción "Ad6/hTERT(AI)" es esencialmente como se ha descrito anteriormente, excepto por que la región E1 del genoma de Ad6 se sustituye con una secuencia de ADNc de TERT, comprendiendo dicha secuencia mutaciones para suprimir la actividad enzimática.
La abreviatura "LTB" se refiere en general a la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli, o a una porción substancial de la misma, incluyendo subunidades que están truncadas en el extremo C-terminal o N-terminal pero que mantienen actividad adyuvante, así como subunidades que contienen inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos internos pero que mantienen actividad adyuvante (Fingerut y col. Vaccine 23: 4685-4696 (2005)).
Como se usa en el presente documento, una "proteína de fusión" se refiere a una proteína que tiene al menos dos polipéptidos heterólogos unidos covalentemente, en la que un polipéptido viene de una secuencia proteica o dominio y el otro polipéptido viene de una segunda secuencia proteica o dominio. Las proteínas de fusión de la presente invención comprenden una variante polipeptídica de TERT de las mismas y un segundo polipéptido, que comprende una porción sustancial de LTB. El extremo C-terminal del polipéptido de TERT se fusiona al extremo N-terminal de LTB como se ejemplifica en las FIGURAS 1 y 2.
Las expresiones "proteína de fusión de TERT" o "proteína de fusión de TERT-LTB" se usan indistintamente en el presente documento como una expresión general que se refiere a una fusión como se ha descrito anteriormente, que comprende una variante polipeptídica de TERT de la misma fusionada a un polipéptido LTB. Las fusiones de TERT-LTB de la presente invención, tras su administración a un mamífero tal como un ser humano, pueden estimular una respuesta inmune mediante linfocitos T auxiliares o linfocitos T citotóxicos, al menos tan bien como
una secuencia de hTERT de "tipo silvestre". En realizaciones preferidas de la invención, la fusión de TERT-LTB puede aumentar la respuesta inmune en comparación con una hTERT de tipo silvestre.
El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas preventivas o profilácticas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen los que ya presentan el trastorno, así como los propensos a presentar el trastorno o aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" también incluye la reducción de la probabilidad de obtener el trastorno, así como la reducción de la gravedad del trastorno en los ya afectados.
Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con las moléculas de la presente invención, incluyendo las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento y las proteínas de fusión que están codificadas por dichas moléculas de ácido nucleico. Se incluyen en el término "trastorno" trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Las moléculas de la presente invención pretenden usarse como tratamientos para trastornos o afecciones caracterizadas por una proliferación celular aberrante, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer colorrectal y cáncer pulmonar.
La expresión "cantidad eficaz" significa que se introduce una composición de vacuna suficiente para producir los niveles adecuados del polipéptido, de modo que se obtiene como resultado una respuesta inmune. Un experto en la materia reconoce que este nivel puede variar.
Una "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido químicamente similar. Son ejemplos de dichas sustituciones conservativas: la sustitución de un resto hidrófobo (isoleucina, leucina, valina o metionina) por otro, la sustitución de un resto polar por otro resto polar de la misma carga (por ejemplo, arginina en lugar de lisina: ácido glutámico en lugar de ácido aspártico).
El término "hTERT" se refiere a un antígeno de transcriptasa inversa de la telomerasa humana o a nucleótidos que codifican el antígeno de transcriptasa inversa de la telomerasa humana. El término "hTERTopt" se refiere a una secuencia de nucleótidos de codones optimizados que codifica el antígeno de transcriptasa inversa de la telomerasa humana.
Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de TERT humana de tipo silvestre se exponen en las SEC ID Nº:11 y 12, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de LTB se exponen en las SEC ID Nº:13 (secuencia opt) y 14.
Un "gen" se refiere a una molécula de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos codifica una molécula polipeptídica. Los genes pueden ser secuencias ininterrumpidas de nucleótidos o pueden incluir segmentos intermedios tales como intrones, regiones promotoras, sitios de corte y empalme y secuencias repetitivas. Un gen puede ser ARN o ADN.
La expresión "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" está destinada a ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), sondas, oligonucleótidos, fragmentos o porciones de los mismos, y cebadores.
Las expresiones "TERT de tipo silvestre" o "proteína de tipo silvestre" o "proteína wt" se refieren a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de origen natural o una variante de la misma. La secuencia de aminoácidos de TERT humana de tipo silvestre se expone en la SEC ID Nº: 12. La secuencia de aminoácidos de la TERT humana de tipo silvestre se ha descrito previamente (Patente de Estados Unidos Nº 6.166.178; Patente de Estados Unidos 6.261.836; Patente de Estados Unidos Nº 6.927.285; Solicitud de Patente de Estados Unidos 20030096344; Meyerson y col., Cell 90: 785-95 (1997); Nakamura y col., Science 277: 955-59 (1997)).
La expresión "gen de TERT de tipo silvestre" se refiere a un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TERT de origen natural, incluyendo proteínas de origen humano o proteínas obtenidas de otro organismo, incluyendo, pero sin limitación, otros mamíferos tales como ratas, ratón y mono rhesus. La secuencia de nucleótidos del gen de TERT humana esta disponible en la técnica (anteriormente).
La denominación "TERT(AI)" se refiere a una secuencia de transcriptasa inversa de la telomerasa que comprende mutaciones para eliminar o reducir la actividad catalítica de la telomerasa.
El término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ser humano.
La abreviatura "Ag" se refiere a un antígeno.
La abreviatura "ORF" se refiere a la fase de lectura abierta de un gen.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 1) y de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) de una fusión de TPA-hTERT(AI)-LTBopt ejemplar. La FIGURA 2 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 3) y de aminoácidos (SEC ID Nº: 4) de una
fusión de TPA-mTERT(AI)-LTBopt ejemplar. La FIGURA 3 muestra los resultados de un ensayo ELIspot de IFNγ en ratones BALB/c vacunados con inyecciones repetidas de plásmido pVIJ/TPA-mTERT(AI)-LTBopt. Se usaron 5 ratones de cada grupo para controlar la repuesta inmune dirigida contra mTERT o LTB usando combinaciones de péptidos. Los datos representados son de 6 ratones individuales (círculos en blanco). Se indican los valores medios geométricos (círculos oscuros). No se detectó respuesta de linfocitos T contra mTERT en ratones con tratamiento simulado (no se muestra). Véase el EJEMPLO 7. La FIGURA 4 muestra los resultados de la tinción intracelular de IFNγ en esplenocitos de ratones BALB/c vacunados. Se midieron las respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ contra TERT de ratón usando combinaciones de péptidos solapantes que abarcan la proteína completa. También se controló la respuesta inmune contra LTB. Los datos representados son de 6 ratones individuales (triángulos oscuros). Se indican los valores medios geométricos (línea recta). No se detectaron respuestas de linfocitos T contra TERT en ratones con tratamiento simulado (no se muestra). Véase el EJEMPLO 7. La FIGURA 5 muestra los resultados de destrucción de CTL por liberación de 51 Cr mediante linfocitos T efectores de células diana 4T1 estimuladas con péptido específico de linfocitos T CD8+ mTERTaa167 (AYQVCGSPL; SEC ID Nº: 20). Se prepararon células efectoras a partir de esplenocitos de dos ratones BALB/c inmunizados y se reestimularon in vitro con el péptido específico. Los resultados se expresan como porcentaje de destrucción específica a diferentes proporciones de Efectores/Diana. Véase el EJEMPLO 8. La FIGURA 6 muestra la inducción de una respuesta inmune contra TERT de ratón. Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 5 inyecciones semanales de plásmido pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt. La respuesta inmune se evaluó en esplenocitos de ratón por ensayo ELIspot de IFNγ usando combinaciones de péptidos de TERT de ratón. Las respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de antígeno se muestran como valores medios geométricos obtenidos de 6 ratones inmunizados, también se indica la desviación típica. Véase el EJEMPLO 7. La FIGURA 7 muestra la inducción de una respuesta inmune específica de mTERT en ratones BALB/c. Los ratones se inmunizaron con 5 inyecciones semanales de las construcciones pV1J-mTERT(AI)opt o pV1JTPAmTERT(AI)-LTBopt. Se determinaron las respuestas inmunes por tinción intracelular de IFNγ en PBMC usando el epítopo CD8+ correspondiente a la secuencia peptídica mTERTaa167 (AYQVCGSPL; SEC ID Nº: 20). Los datos representados son de 8 ratones individuales (triángulos oscuros). Se indican los valores medios geométricos (líneas rectas). La FIGURA 8 muestra que la respuesta inmune específica de TERT se aumenta tras la inyección de vectores de adenovirus que expresan mTERT(AI)-LTBopt. Se sometieron grupos de 10 ratones BALB/c a 5 inyecciones semanales de pVIJ/TPA-mTERT(AI)-LT-Bopt (50 μg/iny.). Dos semanas después de la última inyección de ADN plasmídico, los ratones se reforzaron con una inyección adicional de ADN plasmídico (ADN-EP) o con 1010 pv de Ad6/TPA-mTERT(AI)-LTBopt (Ad). Se controlaron las respuestas inmunes contra TERT por ICS de IFNγ en PBMC. Los datos representados son de 10 ratones individuales (rombos oscuros). También se muestran los valores medios geométricos de cada grupo (líneas rectas). Véase el EJEMPLO 10. La FIGURA 9 representa el protocolo usado para analizar la carcinogénesis inducida por DMH y la vacunación en ratones BALB/c. Se administró DMH i.p. semanalmente. La vacunación con pV1J/TPA-mTERT(A1)-LTBopt se llevó a cabo a los puntos temporales indicados. El análisis de las lesiones intestinales se llevó a cabo la semana 12. Véase el EJEMPLO 11. La FIGURA 10 muestra el efecto antitumoral de pVIJ/TPA-mTERT(AI)-LTBopt sobre la carcinogénesis inducida por DMH. Se trataron ratones BALB/c con DMH y ADN-EP como se indica en la FIGURA 9. El análisis de ACF y de la formación de adenoma en el colon se llevó a cabo la semana 12 desde el comienzo del tratamiento. El número de ACF y de adenomas en ratones vacunados se comparó con el detectado en controles no vacunados. Véase el EJEMPLO 11. La FIGURA 11 representa el protocolo usado para analizar la carcinogénesis inducida por DMH y la vacunación en ratones BALB/c. Se administró DMH i.p. semanalmente. La vacunación con ADN de pV1J/TPA-mTERT-LTB y Ad se llevó a cabo a los puntos temporales indicados. El análisis de las lesiones intestinales se llevó a cabo la semana 30. Véase el EJEMPLO 11. La FIGURA 12 demuestra el efecto antitumoral de la sensibilización con ADN de pV1J/TPA-mTERT(AI)LTBopt/refuerzo con Ad son el número de lesiones tumorales. Se trataron ratones BALB/c con DMH y ADN-EP según se indica en la FIGURA 9. El análisis de ACF y de la formación de adenomas en el colon se llevó a cabo la semana 30 desde el comienzo del tratamiento. El número de ACF y adenomas en ratones vacunados se comparó con el detectado en controles no vacunados. Véase el EJEMPLO 11. La FIGURA 13 demuestra el efecto antitumoral de la sensibilización con ADN de pV1J/TPA-mTERTLTB(AI)opt/refuerzo con Ad sobre el volumen y la fase de diferenciación de las lesiones tumorales. Se trataron ratones BALB/c con DMH y ADN-EP según se indica. El volumen (Panel A) y la fase de diferenciación histológica (Panel B) de los adenomas de colon presentes en ratones vacunados y de control se analizaron a las 30 semanas desde el comienzo del tratamiento. Los tumores se clasificaron de la forma siguiente: G1: adenocarcinoma bien diferenciado; G2: adenocarcinoma moderadamente diferenciado; G3: adenocarcinoma escasamente diferenciado). Véase el EJEMPLO 11. La FIGURA 14 muestra la inducción de una respuesta inmune contra TERT humana. Se inmunizaron ratones transgénicos HHD con dos inyecciones bisemanales (ADN-ADN) de plásmido pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt o mediante una inyección de plásmido pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt seguida, después de dos semanas, por una inyección de Ad6hTERT(AI) 1010 pp (ADN/Ad). La respuesta inmune se evaluó en PBMC de ratón mediante
ensayo de ICS de IFNγ. Se incubaron PBMC de ratón con el péptido inmunodominante CD8 para el alelo HLA-A2 hTERT865 (SEC ID Nº: 22). Los datos representados son de 10 ratones individuales (triángulos oscuros). Se indican los valores medios geométricos (línea recta). Véanse los EJEMPLOS 12 y 13. La FIGURA 15 muestra los resultados de un ensayo de CTL sobre células HeLa-HHD diana marcadas con Cr51. Se ensayaron linfocitos T CD8+ obtenidos de un ratón inmunizado en un ensayo de CTL frente a células HeLa-HHD, cargadas exógenamente con el péptido hTERT865 o sin péptido pero en presencia del DMSO usado para la dilución de péptido. Las células HeLa-HHD se infectaron también con un vector Ad que codifica hTERT o un Ad que codifica GFP como control. Véase el EJEMPLO 14. La FIGURA 16 muestra la inducción de una respuesta inmune mediada por células contra hTERT en monos rhesus inmunizados mediante ADN-EP. Se realizó un análisis ELIspot sobre PBMC de monos rhesus inmunizados con hTERT (pVIJ/TPA-hTERT-LTB; ADN-EP/ADN-EP). El ensayo se realizó por duplicado y se muestra el valor promedio de las repeticiones. Se muestra el análisis realizado después del segundo ADN-EP (Panel A). También se muestra el análisis realizado después del quinto ADN-EP (Panel B). Véase el EJEMPLO
15. La FIGURA 17 muestra que la respuesta inmune mediada por células contra hTERT se amplificaba en monos rhesus que estaban vacunados con ADN-EP y reforzados con adenovirus que expresaba hTERT, en comparación con la CMI generada en monos vacunados mediante ADN-EP solamente. Se realizó un ELIspot sobre PBMC de monos rhesus inmunizados con hTERT al final del programa de inmunización, que incluía cinco inyecciones de ADN-EP (pV1J/TPA-hTERT-LTB) seguidas de dos inyecciones de Ad (Ad6-hTERT). El ensayo se realizó por duplicado y se muestra el valor promedio de las repeticiones. Véase el EJEMPLO 15.
Descripción detallada de la invención
La expresión del componente catalítico de la telomerasa, conocido como transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT), se detecta comúnmente en una variedad diversa de tipos tumorales. La combinación de la sobreexpresión de la telomerasa en la mayoría de tipos de cáncer, así como la baja expresión o la ausencia de expresión en células normales hace de TERT una diana para la terapia y/o profilaxis de enfermedades asociadas con una proliferación celular aberrante tal como cáncer. Con este fin, la presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para generar o aumentar inmunidad contra el producto proteico expresado por el antígeno asociado a tumor TERT, en la que la expresión aberrante de TERT está asociada con el carcinoma o su desarrollo. La asociación de la expresión aberrante de TERT con un carcinoma no requiere que se exprese la proteína TERT en tejido tumoral en todos los puntos temporales de su desarrollo, ya que la expresión anormal de TERT puede estar presente al inicio del tumor y no ser detectable posteriormente en la progresión del tumor o viceversa.
Por consiguiente, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican una variante de proteína TERT fusionada a una secuencia de nucleótidos que codifica la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli (LTB), como se expone en la SEC ID Nº: 6, que es capaz de servir eficazmente como adyuvante de una respuesta inmune contra el antígeno de TERT asociado.
En algunas realizaciones de la invención, la secuencias de nucleótidos desveladas en el presente documento comprenden además una secuencia líder TPA antes de la secuencia codificante para el gen de TERT para asegurar que la proteína de fusión de TERT-LTB se secreta. En realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la fusión de TPA-hTERT(AI)-LTB codifica una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº: 2. Se expone una secuencia de nucleótidos preferida en la SEC ID Nº: 1.
La secuencia de nucleótidos de TERT humana de tipo silvestre se expone en la SEC ID Nº: 12 y se ha descrito previamente (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.166.178; Patente de Estados Unidos 6.261.836; Patente de Estados Unidos Nº 6.927.285; Solicitud de Patente de Estados Unidos 2003-0096344; Meyerson y col., Cell 90: 785-95 (1997); Nakamura y col., Science 277: 955-59 (1997)). La variante de TERT de la presente invención comprende mutaciones que eliminan funcionalmente actividad catalítica de la telomerasa. Las proteínas de fusión de TERT codificadas de la presente invención son capaces de inducir una respuesta inmune mediada por células cuando se introducen en un destinatario de vacuna o paciente que lo necesite.
Como se ha indicado anteriormente, en realizaciones preferidas de la presente invención, la actividad catalítica de la telomerasa del antígeno de telomerasa se inactiva (en lo sucesivo denominado “TERT(AI)”), de modo que la proteína de fusión de TERT codificada es más segura que la TERT de tipo silvestre para fines vacunales. La actividad enzimática de la proteína de fusión de TERT puede inactivarse por adición de mutaciones/deleciones a la secuencia de nucleótidos codificante de TERT. Por lo tanto, la presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de TERT-LTB, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una proteína hTERT variante, en la que dicha variante comprende una o más mutaciones respecto a la secuencia de aminoácidos de hTERT de tipo silvestre, como se expone en la SEC ID Nº: 12, y en la que dichas mutaciones funcionan eliminando la actividad catalítica de la telomerasa de la proteína hTERT codificada. En realizaciones ejemplares específicas de la invención, se han mutado nucleótidos para cambiar los aminoácidos específicos D712A y V713I en la secuencia proteica de TERT humana (como se expone en la SEC ID Nº: 10). Se desvela una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de TERT humana mutada expuesta en la SEC ID Nº: 10 en la SEC ID Nº: 9.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a polinucleótidos sintéticos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de TERT-LTB, comprendiendo dicha proteína de fusión una forma mutante de una proteína TERT fusionada a una proteína LTB que puede aumentar eficazmente la respuesta inmune contra la proteína TERT. Dichas formas mutantes de la proteína TERT incluyen, pero sin limitación: sustituciones de aminoácidos conservativas, truncamientos amino-terminales, truncamientos carboxi-terminales, deleciones o adiciones. Cualquiera de dichas variantes de TERT codificará una proteína que imite al menos sustancialmente las propiedades inmunológicas de la proteína TERT como se expone en la SEC ID Nº: 12. Las variantes de TERT preferidas son catalíticamente inactivas, por ejemplo, la variante de TERT expuesta en la SEC ID Nº: 10.
Los polinucleótidos sintéticos de la presente invención codifican moléculas de ARNm que expresan una proteína de fusión de TERT(AI)-LTB que es capaz de estimular o aumentar la respuesta inmune contra la proteína TERT asociada, de modo que sean útiles en el desarrollo de una vacuna terapéutica o profiláctica contra el cáncer. Se ha demostrado que la porción LTB de las fusiones de TERT-LTB de la presente invención potencian fuertemente la inmunogenicidad de los antígenos coadministrados (véase, por ejemplo, Simmons y col. Scand. J. Immunol. 53: 21826 (2001)).
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico sintética (polinucleótido) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARNm que expresa una nueva proteína de fusión de TERT-LTB; es decir, secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión como se exponen en la SEC ID Nº: 6. Una fusión de TERT particularmente preferida de la presente invención es la secuencia de fusión de hTERT(AI)-LTB expuesta en la SEC ID Nº: 5. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención están sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos.
La presente invención también se refiere a vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las moléculas de ADN sintéticas, vectores asociados y huéspedes de la presente invención son útiles para el desarrollo de una vacuna contra el cáncer.
Moléculas de ácido nucleico ejemplares de la presente invención comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 5, como se muestra en la FIGURA 1, que codifica proteínas de fusión de hTERT-LTB y mTERT-LTB ejemplares de la presente invención.
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refiere además a vectores recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención. Estos vectores pueden estar compuestos por ADN o ARN. Para la mayoría de fines de clonación, se prefieren vectores de ADN. Los vectores típicos incluyen plásmidos, virus modificados, baculovirus, bacteriófagos, cósmidos, cromosomas artificiales de levaduras y otras formas de ADN episomal o integrado que pueden codificar una proteína de fusión de TERT-LTB. Está bien dentro del ámbito del experto en la materia determinar un vector apropiado para una transferencia de genes particular u otro uso.
También se proporcionan por la presente invención proteínas de fusión de TERT-LTB purificadas codificadas por los ácidos nucleicos desvelados a lo largo de la presente memoria descriptiva, especialmente proteínas de fusión de TERT(AI)-LTB. La proteína de fusión de TERT-LTB comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.
Un vector de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico codificante de proteína de fusión de TERT-LTB puede usarse para una expresión de alto nivel de proteína de fusión de TERT-LTB en una célula huésped recombinante. Los vectores de expresión pueden incluir, pero sin limitación, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos diseñados específicamente o virus. Además, si se desea pueden usarse una diversidad de vectores de expresión bacterianos para expresar secuencias de fusión de TERT-LTB recombinantes en células bacterianas. Además, pueden usarse una diversidad de vectores de expresión de células fúngicas para expresar secuencias de fusión de TERT-LBT recombinantes en células fúngicas. Además, pueden usarse una diversidad de vectores de expresión de células de insecto para expresar proteína recombinante en células de insecto.
La presente invención también se refiere a células huésped transformadas o transfectadas con vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Las células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo, pero sin limitación, bacterias tales como E. coli, células fúngicas tales como levaduras, células de mamífero incluyendo, pero sin limitación, líneas celulares de origen bovino, porcino, mono y roedor; y células de insecto incluyendo, pero sin limitación, líneas celulares derivadas de Drosophilla y gusano de seda. Dichas células huésped recombinantes pueden cultivarse en condiciones adecuadas para producir una proteína de fusión de TERT-LTB o una forma biológicamente equivalente. En una realización preferida de la presente invención, la célula huésped es humana. Como se define en el presente documento, la expresión “célula huésped” no pretende incluir una célula huésped en el cuerpo de un ser humano transgénico, feto humano o embrión humano.
Como se ha señalado anteriormente, un vector de expresión que contiene ADN que codifica una proteína de fusión de TERT-LTB puede usarse para la expresión de una proteína de fusión de TERT en una célula huésped recombinante. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para expresar una proteína de
fusión de TERT-LTB en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de TERT-LTB en una célula huésped humana adecuada, en el que la proteína de fusión de TERT-LTB comprende una proteína TERT o variante inactiva de la misma fusionada a una porción sustancial de la proteína LTB, y en el que la proteína de fusión es capaz de producir una respuesta inmune en un mamífero; y (b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de fusión de TERT-LTB.
En realizaciones preferidas del procedimiento para expresar una proteína de fusión de TERT-LTB descrito anteriormente, se deleciona la secuencia señal de la secuencia de LTB.
Después de la expresión de una fusión de TERT-LTB en una célula huésped, la proteína de fusión de TERT-LTB puede recuperarse para proporcionar una proteína de fusión de TERT-LTB purificada. Están disponibles varios procedimientos de purificación de proteínas y son adecuados para su uso. La proteína recombinante puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares por diversas combinaciones de, o la aplicación individual de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de adsorción de hidroxilapatita y cromatografía de interacción hidrófoba. Además, la proteína de fusión de TERT-LTB recombinante puede separarse de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad generada con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para una proteína TERT, o fragmentos polipeptídicos de una proteína TERT.
Las moléculas de ácido nucleico que comprenden fusiones de TERT-LTB y las proteínas de fusión codificadas de la presente invención estaban diseñadas para aumentar la respuesta inmune específica de TERT respecto al ADNc de tipo silvestre de longitud completa que codifica TERT, para su uso en el desarrollo de vacunas. Para aumentar adicionalmente las propiedades inmunogénicas de las secuencias de fusión de TERT-LTB de la presente invención, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de TERT-LTB comprenden codones optimizados para una expresión de más alto nivel en una célula huésped, como se describe a continuación. En estas realizaciones, al menos una porción de los codones de las fusiones de TERT-LTB se diseñan de modo que se usen los codones preferidos por la célula huésped prevista, que en realizaciones preferidas es una célula humana. Las fusiones de TERT-LTB optimizadas pueden usarse para el desarrollo de vacunas de ADN basadas en plásmidos o adenovirus recombinantes, que proporcionan una inmunoprofilaxis eficaz frente al cáncer asociado a TERT a través de una inmunidad mediada por células. Las moléculas sintéticas pueden usarse como una composición inmunogénica. La presente invención proporciona polinucleótidos de fusión de TERT-LTB de codones optimizados que, cuando se introducen directamente en un vertebrado in vivo, incluyendo mamíferos tales como primates y seres humanos, inducen la expresión de proteínas codificadas dentro del animal.
Como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones de la presente invención, las moléculas sintéticas comprenden una secuencia de nucleótidos, en las que algunos de los nucleótidos se han alterado de modo que se usen los codones preferidos por una célula humana, permitiendo de este modo un alto nivel de expresión de proteína de fusión en una célula huésped humana. Las moléculas sintéticas pueden usarse como una fuente de una proteína de fusión de TERT-LTB, que puede usarse en una vacuna contra el cáncer para proporcionar una inmunoprofilaxis eficaz frente a carcinomas asociados a TERT a través de una inmunidad mediada por células. Las moléculas de ácido nucleico desveladas en el presente documento también puede servir como base para una vacuna contra el cáncer basada en ADN.
Un codón de “triplete” de cuatro bases de nucleótidos posibles puede existir en más de 60 formas variantes. Debido a que estos codones proporcionan el mensaje para sólo 20 aminoácidos diferentes (así como el inicio y la terminación de la transcripción), algunos aminoácidos pueden estar codificados por más de un codón, un fenómeno conocido como redundancia de codones. Por razones que no se entienden completamente, los codones alternativos no están uniformemente presentes en el ADN endógeno de diferentes tipos de células. De hecho, parece existir una jerarquía natural variable o “preferencia” por ciertos codones en ciertos tipos de células. Como ejemplo, el aminoácido leucina está especificado por cualquiera de seis codones de ADN incluyendo CTA, CTC, CTG, CTT, TTA y TTG. El análisis exhaustivo de frecuencias de codones del genoma para microorganismos ha puesto de manifiesto que el ADN endógeno de E. coli contiene más comúnmente el codón de especificación de leucina CTG, mientras que el ADN de levaduras y mohos del fango incluye más comúnmente un codón de especificación de leucina TTA. En vista de esta jerarquía, generalmente se cree que la probabilidad de obtener altos niveles de expresión de un polipéptido rico en leucina por un huésped de E. coli dependerá en cierta medida de la frecuencia de uso de codones. Por ejemplo, es probable que un gen rico en codones TTA apenas se exprese en E. coli, mientras que un gen rico en CTG probablemente se expresará mucho en este huésped. De forma similar, un codón preferido para la expresión de un polipéptido rico en leucina en células huésped de levadura sería TTA.
Las implicaciones de los fenómenos de preferencia de codones sobre técnicas de ADN recombinante son evidentes, y el fenómeno puede servir para explicar muchos fracasos previos a la hora de conseguir altos niveles de expresión de genes exógenos en organismos huésped transformados con éxito —un codón menos “preferido” puede estar presente de forma repetida en el gen insertado y la maquinaria de la célula huésped para la expresión puede no funcionar tan eficazmente. Este fenómeno sugiere que los genes sintéticos que se han diseñado para incluir los codones preferidos de la célula huésped prevista proporcionan una forma óptima de material genético extraño para la práctica de técnicas de ADN recombinante. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un gen de fusión
de TERT-LTB que presenta codones optimizados para la expresión en una célula humana. En una realización preferida de la presente invención, se ha descubierto que el uso de codones alternativos que codifican la misma secuencia proteica puede eliminar las limitaciones de la expresión de proteína de fusión de TERT-LTB exógena en células humanas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteína de fusión de TERT-LTB se convierten en una secuencia polinucleotídica que tiene una secuencia traducida idéntica pero con un uso de codones alternativo, como se describe por Lathe, “Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations” J. Molec. Biol. 183: 1-12 (1985). La metodología consiste generalmente en identificar codones en la secuencia de tipo silvestre que no estén comúnmente asociados con genes humanos altamente expresados, y sustituirlos con codones óptimos para una alta expresión en células humanas. La nueva secuencia génica se inspecciona después para determinar secuencias no deseadas generadas por estas sustituciones de codones (por ejemplo, secuencias “ATTTA”, creación involuntaria de sitios de reconocimiento de corte y empalme de intrones, sitios de enzimas de restricción no deseados, etc.). Las secuencias no deseables se eliminan por sustitución de los codones existentes con diferentes codones que codifiquen el mismo aminoácido. Los segmentos génicos sintéticos se ensayan después para una expresión mejorada.
Se entiende que este procedimiento no dará como resultado necesariamente una secuencia polinucleotídica en la que todos los codones sean codones óptimos de acuerdo con el uso de codones de células de mamífero y/o humanas de alto nivel de expresión. Sin embargo, se prefiere que, en realizaciones de la invención en las que se contemplen variantes de polinucleótidos de codones optimizados de TERT y/o LTB, una porción sustancial de los codones resultantes se parezca al uso de codones de genes de mamífero y/o humanos altamente expresados.
Los procedimientos descritos anteriormente se usaron para crear secuencias de genes sintéticos que codifican proteínas de fusión de TERT-LTB, dando como resultado un gen que comprende codones optimizados para un alto nivel de expresión en células humanas. Aunque el procedimiento anterior proporciona un resumen de una metodología representativa para diseñar genes de codones optimizados para su uso en vacunas contra el cáncer, un experto en la materia entiende que puede conseguirse una eficacia vacunal o una expresión de genes aumentada similar mediante variaciones minoritarias en el procedimiento o mediante variaciones minoritarias en la secuencia.
Un experto en la materia también reconocerá que pueden construirse moléculas de ácido nucleico adicionales que proporcionen altos niveles de expresión de fusión de TERT-LTB en células humanas, en las que sólo una porción de los codones de las moléculas de ADN sean codones optimizados. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente invención, los codones que comprenden la porción TERT de la fusión de TERT-LTB están optimizados para un alto nivel de expresión en células humanas, y los codones que comprenden la porción LTB de la fusión de TERT-LTB son sustancialmente similares a la LTB de tipo silvestre. En otras realizaciones de la presente invención, los codones que comprenden la porción LTB de la fusión de TERT-LTB están optimizados para un alto nivel de expresión en células humanas, y los codones que comprenden la porción TERT de la fusión de TERT-LTB son sustancialmente similares a un gen de TERT de tipo silvestre. En otras realizaciones más de la presente invención, las porciones tanto TERT como LTB de la fusión de TERT-LTB son de codones optimizados para un alto nivel de expresión en células humanas, por ejemplo, la secuencia de hTERT-LTBopt como se expone en la SEC ID Nº: 5. También se contemplan por la presente invención fusiones de TERT-LTB en las que sólo un subconjunto de los codones están optimizados dentro de la porción de TERT y/o LTB de la fusión de TERT-LTB.
Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ensamblarse en un casete de expresión que comprende secuencias diseñadas para proporcionar una expresión eficaz de la proteína en una célula humana. El casete contiene preferentemente un gen codificante de proteína de fusión de TERT-LTB, con secuencias de control de la transcripción y de la traducción relacionadas unidas operativamente al mismo, tales como un promotor y secuencias de terminación. En una realización preferida, el promotor es el promotor de citomegalovirus con la secuencia del intrón A (CMV), aunque los expertos en la materia reconocerán que puede usarse cualquiera de varios otros promotores conocidos, tales como un promotor de inmunoglobulina fuerte u otro promotor de gen eucariota. Un terminador de la transcripción preferido es el terminador de la hormona de crecimiento bovina, aunque también pueden usarse otros terminadores de la transcripción conocidos. La combinación de terminador de CMV-BGH se prefiere particularmente.
De acuerdo con la presente invención, el casete de expresión de la fusión de TERT-LTB se inserta en un vector. El vector es preferentemente un vector adenovírico o plasmídico, aunque también puede usarse ADN lineal unido a un promotor, u otros vectores tales como virus adenoasociados o un virus vaccinia modificado, vector retrovírico o lentivírico.
En una realización preferida de la invención, el vector es un vector de adenovirus (usado indistintamente en el presente documento con el término “adenovector”). Los adenovectores pueden basarse en diferentes serotipos de adenovirus, tales como los encontrados en seres humanos o animales. Los ejemplos de adenovirus de animales incluyen bovinos, porcinos, de chimpancés, murinos, caninos y aviares (CELO). Los adenovectores preferidos están basados en serotipos humanos, más preferentemente serotipos de Grupo B, C o D. Los ejemplos de serotipos de
Grupo B, C, D o E de adenovirus humanos incluyen los tipos 2 (“Ad2”), 4 (“Ad4”), 5 (“Ad5”), 6 (“Ad6”), 24 (“Ad24”), 26 (“Ad26”), 34 (“Ad34”) y 35 (“Ad35”). En realizaciones particularmente preferidas de la presente invención, el vector de expresión es un vector de adenovirus de tipo 6 (Ad6).
Si el vector seleccionado es un adenovirus, se prefiere que el vector sea un denominado vector adenovírico de primera generación. Estos vectores adenovíricos se caracterizan por tener una región de gen E1 no funcional y, preferentemente, una región de gen E1 adenovírico delecionada. Además, los vectores de primera generación pueden tener una región de gen E3 no funcional o delecionada (Danthinne y col. Gene Therapy 7: 1707-1714 (2000); F. L. Graham, Immunology Today 21(9): 426-428 (2000)). Los adenovectores no tienen que tener sus regiones E1 y E3 completamente eliminadas. En su lugar, se elimina una cantidad suficiente de la región E1 para hacer que el vector sea incompetente para la replicación en ausencia de que las proteínas E1 se suministren en trans; y la deleción de E1 o la combinación de las deleciones de E1 y E3 son suficientemente grandes para alojar un casete de expresión génica.
En algunas realizaciones, el casete de expresión se inserta en la posición en la que se localiza normalmente el gen E1 adenovírico. Además, estos vectores tienen opcionalmente una región E3 no funcional o delecionada. Se prefiere que el genoma de adenovirus usado tenga delecionadas las regiones tanto E1 como E3 (ΔE1ΔE3). Los adenovirus pueden multiplicarse en líneas celulares conocidas que expresan el gen E1 vírico, tales como células 293 o células PERC.6, o en líneas celulares derivadas de células 293 o PERC.6 que se transformen de forma transitoria o de forma estable para expresar una proteína extra. Por ejemplo, cuando se usan construcciones que tienen una expresión de gen controlador, tal como un sistema de promotor regulable por tetraciclina, la línea celular puede expresar los componentes implicados en el sistema regulador. Un ejemplo de dicha línea celular es T-Rex-293; se conocen otras en la técnica.
Por comodidad en la manipulación del vector adenovírico, el adenovirus puede estar en forma de un plásmido lanzadera. La presente invención también se refiere a un vector plasmídico lanzadera que comprende una porción plasmídica y una porción de adenovirus, comprendiendo la porción de adenovirus un genoma adenovírico que tiene E1 delecionado y una deleción de E3 opcional, y que tiene un casete de expresión insertado que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de proteína de fusión de TERT-LTB. En realizaciones preferidas, existe un sitio de restricción flanqueando la porción adenovírica del plásmido, de modo que el vector adenovírico puede eliminarse fácilmente. El plásmido lanzadera puede replicarse en células procariotas o células eucariotas.
En una realización preferida de la invención, el casete de expresión se inserta en un plásmido de adenovirus Ad6 (ΔE1ΔE3) (véase Emini y col., documento US20040247615). Este vector comprende un genoma adenovírico Ad6 con las regiones E1 y E3 delecionadas. En otras realizaciones preferidas de la invención, el casete de expresión se inserta en el plásmido adenovírico pMRKAd5-HV0 (véase Emini y col., documento US20030044421). Este plásmido comprende un genoma adenovírico Ad5 con las regiones E1 y E3 delecionadas. El diseño del plásmido pMRKAd5-HV0 se mejoró sobre los adenovectores previos por extensión de la región de empaquetamiento que actúa en cis 5’ más hacia el gen E1 para incorporar elementos que se descubrió que eran importantes en la optimización del empaquetamiento vírico, dando como resultado una amplificación de virus aumentada. Ventajosamente, estos vectores adenovíricos mejorados son capaces de mantener una estabilidad genética después de una propagación de alto número de pases.
Las técnicas convencionales de biología molecular para preparar y purificar construcciones de ADN permiten la preparación de los adenovirus, plásmidos lanzadera e inmunógenos de ADN de la presente invención.
Se ha determinado de acuerdo con la presente invención que la vacunación genética con ADN plasmídico que codifica TPA mTERT(AI)-LTBopt puede romper la inmunotolerancia en ratones BALB/c y B6 (véase el EJEMPLO 7). También se ha demostrado en el presente documento que la inmunización con el plásmido TPA-mTERT(AI)-LTBopt puede generar una respuesta inmune citotóxica en ratones BALB/c (véase el EJEMPLO 8). Se ha demostrado además que está construcción es capaz de inducir una respuesta inmune CD8+ más potente que mTERT(AI) solamente (véase el EJEMPLO 9) y es capaz de controlar el crecimiento tumoral (EJEMPLO 11). Por lo tanto, los datos descritos en la presente memoria demuestran que la fusión de la secuencia codificante de TERT con el ADNc de LTB da como resultado un aumento en la respuesta inmune específica de TERT.
También se ha demostrado de acuerdo con la presente invención que el hTERT(AI)-LTBopt puede inducir una respuesta inmune CD8+ restringida por HLA-A2 (véase el EJEMPLO 12), y que esta respuesta inmune puede amplificarse por refuerzo con Ad6-hTERT(AI).
Por lo tanto, los vectores descritos anteriormente pueden usarse en composiciones inmunogénicas y vacunas para prevenir el desarrollo de tumores asociados con una expresión aberrante de TERT y/o para tratar cánceres existentes. Los vectores de la presente invención permiten el desarrollo y la comercialización de vacunas eliminando las dificultades con la obtención de altos niveles de expresión de TERT exógena en organismos huésped transformados con éxito y proporcionando una proteína de fusión de TERT-LTB que pueda generar una respuesta inmune aumentada cuando se administra a un mamífero tal como un ser humano.
Con este fin, también se describe un procedimiento de prevención o tratamiento del cáncer asociado a TERT, que
comprende administrar a un mamífero un vector vacunal, que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención.
El vector vacunal puede administrarse para el tratamiento o la prevención de un cáncer en cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitación: cáncer pulmonar, cáncer de mama y cáncer colorrectal. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un ser humano.
Además, un experto en la materia puede seleccionar cualquier tipo de vector para su uso en el procedimiento de tratamiento y prevención descrito. Preferentemente, el vector es un vector de adenovirus o un vector plasmídico. En una realización preferida de la invención, el vector es un vector adenovírico que comprende un genoma adenovírico con una deleción en la región E1 de adenovirus y un inserto en la región E1 de adenovirus, en el que el inserto comprende un casete de expresión que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos de la invención; y (b) un promotor unido operativamente al polinucleótido.
La presente invención se refiere además a un vector vacunal de adenovirus que comprende un genoma adenovírico con una deleción en la región E1 y un inserto en la región E1, en el que el inserto comprende un casete de expresión que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos de la invención; y (b) un promotor unido operativamente al polinucleótido.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el vector adenovírico es un vector Ad 6.
En otra realización preferida de la invención, el vector adenovírico es un vector Ad 5.
En otra realización preferida más, el vector adenovírico es un vector Ad 24. También se contempla para su uso en la presente invención un vector vacunal de adenovirus que comprende un genoma de adenovirus que infecta de forma natural a una especie distinta del ser humano, incluyendo, pero sin limitación, vectores adenovíricos de chimpancés. Una realización preferida de este aspecto de la invención es un vector vacunal Ad 3 de chimpancé.
En otro aspecto, la invención se refiere a un plásmido vacunal que comprende una porción plasmídica y una porción de casete de expresión, comprendiendo la porción de casete de expresión: (a) una secuencia de nucleótidos de la invención; y (b) un promotor unido operativamente al polinucleótido. Un ejemplo de un plásmido adecuado sería el plásmido de expresión de mamífero VlJns como se describe (J. Shiver y col. en DNA Vaccines, M. Liu y col. eds., N.
Y. Acad. Sci., N. Y., 772: 198-208 (1996).
En algunas realizaciones de la presente invención, las vacunas de polinucleótidos basadas en plásmidos y adenovirus recombinantes desveladas en el presente documento se usan en diversas combinaciones de sensibilización/refuerzo para inducir una respuesta inmune aumentada. En este caso, los dos vectores se administran en un régimen de “sensibilización y refuerzo”. Por ejemplo, el primer tipo de vector se administra una o más veces y entonces, después de una cantidad de tiempo predeterminada, por ejemplo, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, seis meses u otro intervalo apropiado, se administra un segundo tipo de vector una o más veces. Preferentemente, los vectores llevan casetes de expresión que codifican el mismo polinucleótido o una combinación de polinucleótidos.
En la realización en la que también se usa ADN plasmídico, se prefiere que el vector contenga uno o más promotores reconocidos por células de mamífero o de insecto. En una realización preferida, el plásmido contendría un promotor fuerte tal como, pero sin limitación, el promotor de CMV. Un experto en la materia reconocerá que puede seleccionarse cualquiera de varios otros promotores conocidos con los fines de dirigir la expresión de las secuencias de nucleótidos de TERT-LTB de la presente invención. Los ejemplos de promotores adicionales incluyen promotores de origen natural tales como el promotor alfa EF 1, el promotor del virus del sarcoma de Rous y los promotores temprano/tardío de SV40 y el promotor de p-actina; y promotores artificiales tales como un promotor específico de músculo sintético y un promotor de CMV/específico de músculo quimérico (Li y col., Nat. Biotechnol.
17: 241-245 (1999); Hagstrom y col., Blood 95: 2536-2542 (2000)). El gen de fusión de TERT-LTB sintético u otro gen a expresar estaría unido a dicho promotor.
Como se ha indicado anteriormente, una vacuna de vector adenovírico y una vacuna plasmídica pueden administrarse a un vertebrado como parte de un solo régimen terapéutico para inducir una respuesta inmune. Por lo tanto, se desvela un procedimiento de protección de un mamífero de un cáncer asociado a TERT que comprende:
(a)
introducir en el mamífero un primer vector que comprende: i) una secuencia de nucleótidos de la invención y ii) un promotor unido operativamente al polinucleótido; (b) permitir que pase una cantidad de tiempo predeterminada; y
(c)
introducir en el mamífero un segundo vector que comprende: i) una secuencia de nucleótidos de la invención; y ii) un promotor unido operativamente al polinucleótido.
En una realización del procedimiento de protección descrito anteriormente, el primer vector es un plásmido y el segundo vector es un vector de adenovirus. En una realización alternativa, el primer vector es un vector de adenovirus y el segundo vector es un plásmido. En algunas realizaciones de la presente invención, el primer vector se administra al paciente más de una vez antes de que se administre el segundo vector.
En el procedimiento descrito anteriormente, el primer tipo de vector puede administrarse más de una vez, con cada
administración del vector separada por una cantidad de tiempo predeterminada. Dicha serie de administración del primer tipo de vector puede estar seguida de la administración de un segundo tipo de vector una o más veces, después de que haya pasado una cantidad de tiempo predeterminada. De forma similar al tratamiento con el primer tipo de vector, el segundo tipo de vector también puede administrarse una vez o más de una vez, después de intervalos de tiempo predeterminados.
Se desvela un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece un cáncer asociado a TERT que comprende: (a) introducir en el mamífero un primer vector que comprende: i) una secuencia de nucleótidos de la invención; y ii) un promotor unido operativamente al polinucleótido; (b) permitir que pase una cantidad de tiempo predeterminada; y (c) introducir en el paciente un segundo vector que comprende: i) una secuencia de nucleótidos de la invención; y ii) un promotor unido operativamente al polinucleótido.
El primer vector puede ser un plásmido y el segundo vector puede ser un vector de adenovirus. Como alternativa, el primer vector puede ser un vector de adenovirus y el segundo vector puede ser un plásmido. El primer vector puede administrarse al paciente más de una vez antes de que se administre el segundo vector al paciente.
La cantidad de ADN expresable o de ARN transcrito a introducir en un destinatario de vacuna dependerá parcialmente de la potencia de los promotores usados y de la inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, una dosis inmunológicamente o profilácticamente eficaz de aproximadamente 1 ng a 100 mg y, preferentemente, de aproximadamente 10 μg a 300 μg de un vector vacunal plasmídico se administra directamente en tejido muscular. Una dosis eficaz para adenovirus recombinante es de aproximadamente 106-1012 partículas y, preferentemente, de aproximadamente 107-1011 partículas. La inyección subcutánea, la introducción intradérmica, la impresión a través de la piel y otros modos de administración tales como la administración intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o por inhalación también se contemplan.
Los vectores vacunales pueden introducirse en el destinatario a través de inyección intramuscular.
Los vectores vacunales de la presente invención pueden estar desnudos, es decir, no asociados con ninguna proteína u otros agentes que afecten al sistema inmune del destinatario. En este caso, es deseable para los vectores vacunales que estén en una solución fisiológicamente aceptable, tal como, pero sin limitación, solución salina estéril
o solución salina tamponada estéril. Como alternativa, puede ser ventajoso administrar un agente que contribuya a la captación celular de ADN, tal como, pero sin limitación, ión calcio. Estos agentes se denominan generalmente reactivos facilitadores de la transfección y cámaras farmacéuticamente aceptables. Los expertos en la materia serán capaces de determinar el reactivo o vehículo farmacéuticamente aceptable particular, así como el tiempo y modo de administración apropiados.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención.
Ejemplo 1
Construcción de proteínas de fusión de TERT
Para determinar si la fusión del antígeno de transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) con la subunidad LTB de enterotoxina termolábil de E. coli (Fingerut y col. Vaccine 23(38): 4685-96 (2005); Rigano y col. Plant Cell Rep. 22(7): 502-8 (2004)) podía aumentar la inmunogenicidad de TERT en solitario, se construyeron vectores que codifican la transcriptasa inversa de la telomerasa de longitud completa con modificaciones. En primer lugar, se optimizaron los codones de la secuencia de ADN para incorporar los codones preferidos por células huésped humanas. Además, para asegurarse de que el antígeno codificado era seguro para uso vacunal, se introdujeron mutaciones en la secuencia de nucleótidos de TERT para inactivar la actividad catalítica de la telomerasa de la proteína codificada. En concreto, se añadieron las mutaciones D712A y V713I a la secuencia de TERT humana y se añadieron las mutaciones D702A y V703I a la secuencia de TERT de ratón (Arai y col. Two independent regions of human telomerase reverse transcriptase are important for its oligomerization and telomerase activity. J. Biol. Chem. 277 (10): 8538-44 (2002)).
Las fusiones de TERT se obtuvieron por ingeniería genética uniendo el extremo C-terminal de las secuencias de nucleótidos de TERT modificadas descritas anteriormente a una secuencia de nucleótidos que codifica una LTB modificada (nt 64 a 375), en la que se había eliminado la secuencia codificante de péptido señal. Además, se añadió una secuencia líder que codifica la secuencia señal del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano 5’ a la secuencia de nucleótidos codificante de TERT para asegurar la secreción de la proteína TERT (Haddad y col. Comparative study of DNA-based immunization vectors: effect of secretion signals on the antibody responses in mice. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 18(3): 193-202 (1997)). Se optimizaron los codones de la secuencia completa para incorporar codones preferidos por células huésped humanas usando algoritmos informáticos. El gen de codones optimizados sintético se ensambló mediante oligonucleótidos sintéticos. En la construcción final, se añadieron dos aminoácidos (S y R) entre la secuencia de TERT y la secuencia de LTB debido a la estrategia de clonación.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las fusiones de TERT se clonaron en el vector pV1JnsA bajo el control del promotor de citomegalovirus humano (CMV)/intrón A más la señal de poliadenilación de la hormona de
crecimiento bovina (BGH). El plásmido pV1J/TPA-hTERT-LTBopt lleva el ADNc inactivado de codones optimizados de TERT humana fusionado a las secuencias codificantes de la secuencia señal de TPA en el extremo N-terminal, y LTB en el extremo C-terminal. De forma similar, el plásmido pV1J/TPA-mTERT-LTBopt lleva el ADNc inactivado de codones optimizados de TERT de ratón fusionado a TPA y LTB.
Ejemplo 2
Construcciones de plásmido y adenovirus
pV1JnsA/TPA-mTERT(Al)-LTBopt: El plásmido 041046pucKana que contenía la secuencia de TPA-mTERT(Al)-LTB se obtuvo en GENEART (Geneart GmbH, Regensburg, Alemania). El plásmido se digirió con BglII y SalI y el fragmento resultante se clonó en el sitio BglII/SalI en el plásmido pV1JnsA (Montgomery y col., DNA Cell Biol., 12 (9): 777-83(1993)).
pV1JnsA/mTERT(Al)opt: El pV1JnsA/TPA-mTERT(Al)-LTB se digirió con XbaI para eliminar la secuencia codificante de LTB (presente entre dos sitios XbaI), la construcción resultante pV1JnsA/TPA-mTERT(AI) tenía 3 aminoácidos (S;R;N) después del último aminoácido de mTERT y antes del codón de terminación. La eliminación de la secuencia codificante de TPA se realizó en el pV1JnsA/TPA-mTERT(AI) por digestión con BamHI y EcoRV. La secuencia codificante de TPA se sustituyó por un producto de PCR obtenido amplificando la secuencia de mTERT con el cebador con sentido (5’-GATCTGATGATATCGCCA CCATGACCAGAGCCCCCAGATG-3; SEC ID Nº: 15) y el cebador antisentido (5’-AGGGGGGATCCGCACACCTGGTAGGCGCAGCTGGGG-3’; SEC ID Nº: 16) y se clonó de nuevo en el vector digerido con BamHI y EcoRV.
pV1JnsA/TPA-hTERT(AI)-LTBopt: El fragmento sintético correspondiente a TPA-hTERT(AI)-LTB obtenido por GENEART se clonó en el pV1JnsA usando los sitios de restricción BglII/SalI.
Ad6-TPAmTERT(AI)-LTBopt: El plásmido 041046pucKana que contenía la secuencia de TPA-mTERT(AI)-LTBopt se obtuvo en GENEART. El plásmido se digirió con BglII y SalI y el fragmento se clonó con BglII/SalI en el vector lanzadera plasmídico pNEBAd6-CMVpA. El plásmido pNEBAd6-CMVpA-TPA-mTERT(AI)-LTB digerido con EcoRI/HindII se recombinó con el plásmido linealizado con ClaI pMRK Ad6 ΔE1 ΔE3. El plásmido se cortó con Pac I para liberar las ITR de Ad y se transfectó en células Perc-6. La amplificación del vector Ad6 se llevó a cabo por pases en serie y se purificó a través de purificación en gradiente de CsCl convencional.
Ad6-hTERT(AI): El plásmido pCRsript que contenía la secuencia de tipo silvestre de hTERT (la secuencia de tipo silvestre de hTERT se rescató por transcripción inversa de ARNm de células tumorales humanas) se digirió con BglII/XbaI, se rellenó con la enzima Klenow y se clonó en pV1JnsA digerido con EcoRV y BglII. El pV1JnsA-hTERT se mutó usando un oligonucleótido (5’-CTGTACTT TGTCAAGGTGGCTATCACGGGCGCGTACG-3’; SEC ID Nº: 17) y el kit de mutagénesis dirigida Quikchange de Stratagene (Stratagene, LA Jolla, CA; Cat: 200513) para obtener el pV1JnsA-hTERT(AI). El plásmido se digirió con BglII y SalI y el fragmento se clonó con BglII/SalI en el vector lanzadera plasmídico pNEBAd6-CMVpA. El plásmido pNEBAd6-CMVpA-hTERT(AI) se digirió con PacI/PmeI y se recombinó con plásmido linealizado con ClaI pMRK Ad6 ΔE1 ΔE3. El plásmido se cortó con PacI para liberar las ITR de Ad y se transfectó en células Perc-6. La amplificación del vector Ad6 se llevó a cabo por pases en serie y se purificó a través de una purificación en gradiente de CsCl convencional.
Ejemplo 3
Ensayo ELISPOT de IFN-γ
Se detectaron esplenocitos de ratón que secretaban IFN-γ de una forma específica de antígeno usando un ensayo Inmunospot (ELISPOT) unido a enzimas (Miyahira y col. J Immunol Methods 181(1): 45-54 (1995)). Se revistieron placas MAIP de noventa y seis pocillos (Millipore Corp., Billerica, MA) con 100 μl/pocillo de anti-IFN-γ de ratón de rata purificado (IgG1, clon R4-6A2, Pharmingen) diluido hasta 2,5 μg/ml en PBS estéril. Después de lavar con PBS, el bloqueo de las placas se llevó a cabo con 200 μl/pocillo de medio R10 durante 2 h a 37 ºC.
Se obtuvieron esplenocitos por extirpación del bazo de los ratones eutanasiados de una forma estéril, seguido de disgregación del bazo por rallado sobre una rejilla de metal. Se eliminaron los eritrocitos por lisis osmótica por adición de 1 ml de PBS 0,1X al sedimento celular y agitación vorticial durante aproximadamente 15 s. Después, se añadió un ml de PBS 2x y el volumen se llevó a 4 ml con PBS 1x. Las células se sedimentaron por centrifugación a 1200 rpm durante 10 min a temperatura ambiente, y el sedimento se resuspendió en 1 ml de medio R10. Las células viables se contaron usando tinción de Türks.
Los esplenocitos se sembraron en placas a 5 x 105 y 2,5 x 105 células/pocillo por duplicado y se incubaron durante 20 h a 37 ºC con una suspensión de 1 μg/ml de cada péptido. Se usó concanavalina (ConA) como control interno positivo para cada ratón a 5 μg/ml. Después de lavar con PBS, Tween 20 al 0,05 %, las placas se incubaron durante una noche a 4 ºC con 50 μl/pocillo de anti-IFNγ de ratón de rata conjugado con biotina (IgG1 de rata, clon XMG 1.2, PharMingen) diluido a 1:2500 en tampón de ensayo. Después de un lavado exhaustivo, las placas se revelaron por adición de NBTB-CIP 50 μl/pocillo (Pierce) hasta que era claramente visible el desarrollo de manchas. La reacción
se interrumpió por lavado de las placas minuciosamente con agua destilada. Las placas se secaron al aire y después se contaron las manchas usando un lector ELISPOT automático.
Ejemplo 4
Tinción de citocina intracelular
De uno a dos millones de esplenocitos de ratón o PBMC obtenidas por extracción de sangre retroorbitaria en EDTA se resuspendieron en 1 ml de RPMI FCS al 10 % y se incubaron con una combinación de péptidos (5-6 μg/ml de concentración final de cada péptido) y brefeldina A (1 μg/ml; BD Pharmingen nº cat 555028/2300kk) a 37 ºC y CO2 al 5 % durante 12-16 horas. Después, las células se lavaron con tampón FACS (PBS FBS al 1 %, NaN3 al 0,01 %) y se incubaron con bloque de Fc anti-CD16/CD32 de ratón purificado (BD Pharmingen nº cat 553142) durante 15 min a 4 ºC. Después, las células se lavaron y se tiñeron con anticuerpos de superficie: anti-ratón conjugado con CD4-PE (BD Pharmingen, nº cat. 553049), anti-ratón conjugado con PercP CD8 (BD Pharmingen nº cat 553036) y anti-CD3e de ratón conjugado con APC (BD Pharmingen nº cat 553066) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después del lavado las células se fijaron y se permeabilizaron con Solución Cytofix-Cytoperm (BD Pharmingen nº cat 555028/2300kk) durante 20 min a 4 ºC en la oscuridad. Después de lavar con Solución PermWash (BD Pharmingen nº cat 555028/2300kk) las células se incubaron con los anticuerpos de IFNγ-FITC (BD Pharmingen). Después, las células se lavaron, se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS y se analizaron en un citómetro de flujo FACS-Calibur usando el programa informático CellQuest (Becton Dickinson, San José, CA).
Ejemplo 5
Ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL)
Se obtuvieron esplenocitos extirpando el bazo de los ratones eutanasiados de forma estéril, seguido de disgregación del bazo por rallado sobre una rejilla de metal. Se eliminaron los eritrocitos por lisis osmótica por adición de 1 ml de PBS 0,1X al sedimento celular y agitación vorticial durante aproximadamente 15 s. Se sembraron en placas esplenocitos a 2 x 106 células/ml en R10 en una placa de cultivo celular de 24 pocillos (2 ml de células/pocillo) en presencia del péptido inmunogénico a la concentración final de 10 μg/ml. Las placas se incubaron a 37 ºC, humedad del 95 %, CO2 al 5 % durante 6 días. El día 3 de cultivo, se añadió IL-2 humana recombinante a una concentración final de 10 U/ml.
Las células diana que crecían en fase exponencial se recogieron y se llevaron a 1 x 106 células/ml/tubo en presencia de péptido inmunogénico a 10 μg/ml de concentración final. Las células se marcaron con 50-100 μCi de 51Cr/tubo a 37 ºC durante 2 horas. Las células diana se lavaron tres veces con 10 ml de medio por centrifugación a 250 g, a temperatura ambiente durante 5 min y se llevaron 1 x 105 células/ml.
El ensayo de CTL se realizó por siembra en placa de células Efectoras/Diana con una proporción de E/T a 100:1, 50:1, 25:1 y 12,5:1. Después de 4 horas de incubación, las placas se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min y se recogió el sobrenadante (30 μl/pocillo). Las placas se secaron durante una noche y se contaron usando un contador BetaPlate.
Ejemplo 6
Inmunización de ratones
Se adquirieron ratones C57BL/6 hembra (H-2b) en Charles River (Lecco, Italia). Los ratones HLA-A2.1 (HHD) se proporcionaron por cortesía de F. Lemmonier (Instituto Pasteur, París, Francia). Se adquirieron ratones BALB/c (H2d) en Charles River (Lecco, Italia). Los ratones se inmunizaron a las 8 semanas de edad. Se electroinyectaron cincuenta microgramos de ADN plasmídico en un volumen de 50 μl en el cuádriceps de los ratones como se ha descrito previamente (Rizzuto y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(11): 6417-22 (1999)). La electroporación (EP) se realizó como se ha descrito previamente (Zucchelli y col. J. Virol. 74(24): 11598-607 (2000); Rizzuto y col., anteriormente). En resumen, el choque eléctrico consistía en 10 series con 1000 pulsos cuadrados bipolares (90V/cm, 75mA, 200 μs/fase). Las inyecciones de Ad se llevaron a cabo en los cuádriceps de ratones en un volumen de 50 μl. Se analizó la respuesta inmune mediada por células en el momento indicado.
Ejemplo 7
La vacunación genética con ADN plasmídico que codifica TPA-mTERT(AI)-LTB rompe la inmunotolerancia
Para determinar si la vacunación de ratones con TPA-mTERT(AI)-LTB podía romper la inmunotolerancia, se inmunizaron grupos de 20 ratones BALB/c con 5 inyecciones semanales de plásmido pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTB seguido de electroporación, como se describe en el EJEMPLO 6. Once días después de la última inyección, se obtuvieron esplenocitos de ratones individuales, que se usaron para analizar la respuesta inmune mediada por células mediante un ensayo ELISPOT de IFN-γ y mediante tinción de citocina intracelular (ICS).
La secreción de IFNγ específica de antígeno a partir de esplenocitos estimulados se midió usando tres
combinaciones de péptidos de mTERT de 15 monómeros que solapaban en 11 aminoácidos y que abarcaban la proteína mTERT completa. La combinación de mTERT-1 estaba compuesta por 94 péptidos individuales que abarcaban la región de mTERT del aminoácido 1 al 388. La combinación de mTERT-2 estaba compuesta por 106 péptidos individuales que abarcaban la región de mTERT del aminoácido 377 al 811. La combinación de mTERT-3 estaba compuesta por 78 péptidos individuales que abarcaban la región de mTERT del aminoácido 801 al 1122. Como control negativo, también se midió la producción de citocina tras la estimulación de los esplenocitos con DMSO a la misma concentración usada para solubilizar los péptidos de TERT. La respuesta inmune inducida frente al adyuvante LTB se detectó también usando una combinación de 24 péptidos de 15 monómeros individuales que solapaban en 11 aminoácidos y que abarcaban la secuencia completa de LTB. Los resultados de ELIspot indican que la vacunación de ratones con TPA-mTERT (AI)-LTBopt generaba una respuesta inmune mediada por células (CMI) contra las regiones N-terminal y central de la proteína TERT, contenidas dentro de las combinaciones de péptidos TERT-1 y TERT-2 (FIGURA 3). También se detectó la CMI contra LTB mediante ELIspot (FIGURA 3).
Para caracterizar mejor la respuesta de linfocitos T generada por el plásmido pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt, y para identificar el subconjunto de linfocitos T CD8+ y CD4+ responsables de la producción de IFN-γ, se llevó a cabo la tinción intracelular de IFN-γ en esplenocitos de ratones vacunados y se analizó por FACS. Los datos obtenidos por ICS demuestran que la inmunización genética de ratones BALB/c vacunados con TPA-mTERT(AI)-LTBopt generaba una respuesta de linfocitos T CD8+ significativa contra la región N-terminal de la proteína TERT (contenida dentro de la combinación de péptidos mTERT-1, véase la FIGURA 4). La respuesta de linfocitos T CD4+ se mapeó en la región central de TERT (combinación de péptidos mTERT-2). Por el contrario, no pudo detectarse CMI en estos ratones contra la región C-terminal de la proteína (combinación de péptidos mTERT-3). También se detectó una respuesta de linfocitos T CD4+ contra LTB (FIGURA 4).
Para mapear adicionalmente la respuesta de linfocitos T CD8+, se usó una combinación de tamaño medio de péptidos de 15 monómeros de mTERT. Cada combinación de tamaño medio contenía diez péptidos de 15 monómeros, que estaban cada uno contenido individualmente en una combinación de tamaño medio separada. Por lo tanto, una reacción positiva de 2 combinaciones de tamaño medio identificaría inequívocamente un péptido de 15 monómeros individual como inmunogénico. Debido a que los epítopos CD8+ son siempre de 9 aminoácidos de longitud, cualquier péptido CD8+ está contenido en dos péptidos de 11 monómeros adyacentes. Los resultados demostraron que la respuesta inmune de linfocitos T CD8+ estaba localizada en la región de TERT incluida en los péptidos de mTERT de 15 monómeros siguientes: mTERT-41 (TERTaa161; LVPPSCAYQVCGSPL (SEC ID Nº: 18) y mTERT-42 (TERTaa165; SCAYQVCGSPLYQIC; SEC ID Nº: 19). Por solapamiento de los dos péptidos de 15 monómeros (mTERT41 y mTERT-42), se sintetizaron tres nonámeros reactivos posibles y se ensayaron en ICS. Por último, el epítopo CD8+ inmunodominante en ratones BALB/c se identificó en la secuencia siguiente (mTERTaa167; AYQVCGSPL; SEC ID Nº: 20). Estos resultados demuestran que la vacunación de ratones BALB/c con pV1J/TPA-mTERT-LTB podría romper la inmunotolerancia al antígeno de mTERT.
Para confirmar los datos obtenidos en ratones BALB/c, se inmunizaron también ratones C57BL/6 (B6) con 5 inyecciones semanales de plásmido pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt. Se llevó a cabo la tinción intracelular de IFN-γ en esplenocitos de ratones vacunados y se analizaron por FACS. De forma similar a los resultados obtenidos con ratones BALB/c, la tolerancia frente a mTERT se rompió en todos los ratones B6. Además, se detectaron linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ que producían IFNγ por ICS tras la estimulación con péptidos de TERT (véase la FIGURA 6).
La respuesta inmune CD8+ generada por vacunación con ADN en ratones C57BL/6 estaba principalmente sesgada hacia la región central de la proteína TERT (combinación de péptidos mTERT-2). También era detectable una respuesta inmune a CD8+ más débil en la combinación de péptidos de mTERT-1. La respuesta inmune CD8+ se mapeó en ratones B6 usando combinaciones de tamaño medio como se han descrito anteriormente. Se identificaron dos epítopos CD8+ en B6, La primera secuencia inmunogénica se mapeó en la secuencia de aminoácidos mTERT198 (VGRNFTNL; SEC ID Nº: 21) y el segundo epítopo CD8+ se mapeó en la secuencia mTERT486 (SLGKYGKL; SEC ID Nº: 22). Además, la respuesta inmune CD4+ estaba localizada en la región N-terminal de TERT (combinación de péptidos mTERT-1). No se detectó respuesta inmune contra la región C-terminal de mTERT.
De forma similar a los resultados obtenidos con ratones BALB/c descritos anteriormente, la inmunización y el análisis de la respuesta inmune posterior de ratones B6 confirma que la inmunización con TPA-mTERT(AI)-LTBopt puede romper la inmunotolerancia al antígeno mTERT. Por lo tanto, en su conjunto, los resultados obtenidos con ratones BALB/c y B6 indican que la fusión de TPA-mTERT(AI)-LTBopt es un inmunógeno potente en el contexto propio independientemente de la cepa de ratones usada.
Ejemplo 8
Actividad citolítica de linfocitos T CD8+ específicos de TERT
Se usó un ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL) para detectar la actividad citolítica de linfocitos T CD8+ específicos de TERT generada por inmunización de ratones BALB/c con pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt. Los ratones se inmunizaron con 5 inyecciones semanales de plásmido pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt, seguido de electroporación. Los esplenocitos de ratones obtenidos de 2 ratones individuales se recogieron 10 días después de la última inmunización. Estos esplenocitos se estimularon durante una semana con el péptido inmunogénico
mTERTaa167 (AYQVCGSPL; SEC ID Nº: 20) para obtener linfocitos T activados in vitro. La línea celular tumoral singénica de BALB/c 4T1 (Aslakson y col. Cancer Res. 52(6): 1399-405 (1992)) se usó como diana. Las células 4T1 se cargaron con el péptido inmunorreactivo y se marcaron con Cr51 para usarse como diana para el ensayo de CTL. Los linfocitos T activados se coincubaron con las células 4T1 diana a diferentes proporciones de efectores/diana. Los linfocitos T activados obtenidos tanto del ratón nº 1 como del ratón nº 2 mostraban actividad citolítica sobre células diana cuando estaban cargados con el péptido inmunogénico mTERTaa167 (AYQVCGSPL; SEC ID Nº: 20). Los dos ratones mostraban grados diferentes de actividad citotóxica que variaba del 80 % (ratón nº 1) al 25 % (ratón nº 2) a una proporción de efectores/diana de 50/1.
Los resultados indican que se indujo una respuesta inmune citotóxica tras la inmunización con ADN con TPA-mTERT(AI)-LTBopt como autoantígeno en ratones BALB/c (FIGURA 5).
Ejemplo 9
Inmunogenicidad comparativa de la construcción TPA-mTERT(AI)-LTBopt.
Para comparar la inmunogenicidad de la proteína mTERT(AI) secretada fusionada a LTB codificada por pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt con una versión no secretada de mTERT(AI) sin fusión a LTB, se construyó un derivado del plásmido pV1J que llevaba el mTERT(AI), como se describe en el EJEMPLO 2.
Se inmunizaron grupos de 6 ratones BALB/c con 5 inyecciones semanales de plásmidos pV1J/TPA-mTERT(Al)-LTBopt o pV1J/mTERT(AI)opt. La respuesta inmune se controló mediante tinción intracelular de IFNγ usando la secuencia de epítopo inmunodominante CD8+ mTERTaa167 previamente identificada para ratones BALB/c (AYQVCGSPL (SEC ID Nº: 20).
Los resultados indican que TPA-mTERT(AI)-LTBopt es una construcción mejor para la inducción de una respuesta inmune CD8+ contra la telomerasa murina que mTERT(AI) (FIGURA 7). La diferencia observada en la respuesta de linfocitos T CD8+ inducida en el grupo inmunizado por TPA-mTERT-LTB(AI)opt es estadísticamente diferente de la obtenida usando el mTERT(AI)opt en el contexto de la inmunización con ADN (prueba t de Student p = 0,04).
Ejemplo 10
Comparación de regímenes de inmunización
La respuesta inmune mediada por células anti-mTERT generada por inmunización de ratones BALB/c con ADN TPA-mTERT(AI)-LTBopt más estimulación eléctrica en solitario se comparó con la respuesta inmune inducida por un régimen de inmunización de sensibilización/refuerzo diversificado usando ADN TPA-mTERT(AI)-LTBopt más estimulación eléctrica como sensibilización y Ad6 TPA-mTERT(AI)-LTBopt como reforzador final de la respuesta inmune.
Se inmunizaron grupos de 10 ratones con 5 inyecciones semanales de plásmido pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt. Una semana después, se administró una inyección de refuerzo que consistía en una inyección adicional de 50 μg de ADN más electroporación (EP) con 1010 pv del Ad6/TPA-mTERT(AI)-LTBopt. Se realizó tinción intracelular de IFNγ en PBMC de ratón para evaluar la respuesta inmune mediada por células resultante. Un péptido que incluía un epítopo específico de linfocitos T CD8+ mTERT 167 (AYQVCGSPL; SEC ID Nº: 20) que se había mapeado previamente en la región N-terminal de TERT se usó como antígeno. Los resultados indican que la amplitud de la respuesta inmune generada por la combinación de ADN-EP/Ad era 4,6 veces superior a la que se observó en ratones que habían recibido solamente un régimen de ADN-EP (véase la FIGURA 8).
Ejemplo 11
La vacunación con TPA-mTERT-LTB controla el crecimiento tumoral
Para determinar si la respuesta inmune específica de mTERT podía generar un efecto antitumoral, se trataron ratones BALB/c con el carcinógeno químico dimetil hidrazina por inyección intraperitoneal (i.p.) antes de la vacunación. El tratamiento de ratones con este carcinógeno conduce a un desarrollo progresivo de tumores en el colon caracterizado por formación de criptas aberrantes, adenomas y, por último, carcinomas. El tratamiento químico de estos ratones no hizo que estuvieran inmunocomprometidos, ya que la inmunización con TPA-mTERT(AI)-LTBopt generaba una respuesta inmune comparable a la encontrada previamente en ratones no tratados (no se muestran los datos).
Para evaluar el impacto de la inmunización genética en fases tempranas de la carcinogénesis inducida por DMH, se trataron ratones BALB/c con DMH y se inmunizaron mediante ADN seguido de electroporación (ADN-EP) con pV1J/TPA-mTERT(Al)-LTBopt de acuerdo con el programa descrito en la FIGURA 9.
Se eutanasiaron veinte ratones 12 semanas después del comienzo de tratamiento con DMH para contar el número de ACF (focos de criptas aberrantes) y el número de adenomas que se habían formado. Se observó una reducción significativa tanto del número de ACF como del número de adenomas presentes en ratones vacunados en
comparación con ratones no vacunados (FIGURA 10).
También se controló la eficacia de la vacunación con mTERT en una fase posterior de desarrollo tumoral. Para aumentar y mantener la respuesta inmune contra mTERT, los ratones se sometieron a ADN-EP repetido TPA-mTERT(AI)-LTBopt y Ad6TPA-mTERT(AI)-LTBopt (FIGURA 11). La respuesta inmune generada en estos ratones era comparable a la detectada en ratones BALB/c vacunados con el mismo régimen de ADN/Ad y no tratados con DMH.
Se eutanasiaron veinte ratones 30 semanas después del comienzo del tratamiento con DMH para contar el número de ACF (focos de criptas aberrantes) y de adenomas formados. Como los resultados observados con el desarrollo de tumores en fase temprana, se observó una reducción significativa en el número de ACF y adenomas en ratones vacunados en comparación con ratones no vacunados (FIGURA 12).
Por último, los tumores encontrados en ratones vacunados eran de menor volumen en comparación con los encontrados en ratones no vacunados (FIGURA 13A). Además, el análisis histológico mostró que los tumores presentes en ratones vacunados estaban en una fase menos avanzada en comparación con los tumores en animales no vacunados (FIGURA 13B).
Ejemplo 12
Caracterización de pV1JTPA-hTERT(AI)-LTBopt.
El potencial inmunogénico de pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt se evaluó en un contexto no propio ya que no estaban disponibles ratones transgénicos para hTERT. Se usaron ratones C57BL/6 transgénicos para el HLA-A2 humano (ratones transgénicos HHD) de modo que los péptidos inmunogénicos de TERT se presentarían en el contexto de HLA humano clase 1. Se vacunaron ratones transgénicos HHD mediante ADN-EP con 2 inyecciones bisemanales de 50 μg de plásmido pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt. La respuesta inmune inducida se evaluó por ICS en PBMC de ratones. El péptido inmunogénico de hTERT correspondiente al epítopo de hTERT 865 RLVDDFLLV (SEC ID Nº: 23) se usó como antígeno. Esta secuencia de epítopo se describió previamente como un agente de unión fuerte para HLA-A2 e inductor de actividad CTL en experimentos de sensibilización in vitro de linfocitos T (Dupont y col. Cancer Research 65(12): 5417-27 (2005)).
Los resultados obtenidos a partir de 10 ratones mostraron que, de promedio, el 12 % de las células CD8+ producían IFN-γ cuando se estimulaban con el péptido de hTERT 865 inmunogénico (FIGURA 14). Los resultados indican que el candidato a vacuna pV1JTPA-hTERT(AI)-LTBopt es inmunogénico e inducía una respuesta inmune CD8 restringida por HLA-A2.
Ejemplo 13
Caracterización de la respuesta inmune en ratones vacunados después del refuerzo con Ad6-hTERT(AI).
Se ensambló una construcción de Ad6 hTERT(AI) como se ha descrito en el EJEMPLO 2. Esta construcción comprende codones de tipo silvestre, con la excepción de dos mutaciones que se añadieron para suprimir la actividad catalítica de la telomerasa. También se generó una construcción de fusión de Ad6 hTERT-LTB, pero no pudo rescatarse, de modo que el ensayo posterior se realizó solamente con Ad6hTERT(AI).
La construcción Ad6 hTERT(AI) se ensayó para determinar su capacidad de refuerzo sobre la respuesta inmune inducida por ADN-EP en ratones transgénicos HHD. Se vacunaron grupos de 10 ratones mediante ADN-EP con 1 inyección de 50 μg de plásmido pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt y se reforzaron con una segunda inyección de ADN o con Ad6 hTERT 1010 pp dos semanas después de la primera inyección de ADN. La respuesta inmune inducida se midió usando el péptido inmunodominante para alelo HLA-A2 hTERT865 identificado previamente. Se detectaron linfocitos T CD8+ reactivos que producían IFN-γ con altas frecuencias. Como se muestra en la FIGURA 14, la amplitud de la respuesta inmune generada por la combinación de ADN-EP/Ad era 3 veces superior a la observada en ratones que habían recibido solamente un régimen de ADN-EP.
Los resultados demostraron que la respuesta inmune específica de hTERT sensibilizada por inyección de ADN de pVIJ/TPA-hTERT(AI)-LTBopt se amplificaba por refuerzo de la misma con Ad6-hTERT(AI).
Ejemplo 14
Caracterización de la actividad CTL inducida por inmunización con hTERT.
La respuesta de linfocitos T CD8+ contra hTERT generada en ratones vacunados se caracterizó adicionalmente por ensayo de la actividad citotóxica (CTL) de linfocitos T activados contra células diana tumorales. Se estimularon esplenocitos de ratones inmunizados en cultivo durante 6 días en presencia del péptido hTERT865 (SEC ID Nº: 23; véase el EJEMPLO 12) e IL-2. Después de eso, se ensayaron linfocitos T CD8+ activados frente a células diana para determinar su actividad lítica en un ensayo de liberación de Cr51. Se usaron como células diana células HeLa transfectadas de forma estable para expresar la molécula de MHC de clase I quimérica presente en ratones HHD (HeLa-HHD). Las células diana HeLa-HHD se cargaron exógenamente con el péptido inmunogénico hTERT865 o se infectaron 24 horas antes con un vector Ad6 que codifica hTERT, para sobreexpresar de forma endógena el antígeno TERT. Como control, las células diana se infectaron con un vector Ad6 que codifica GFP. Los resultados indican que los linfocitos T CD8+ inducidos por la vacunación descrita eran capaces de destruir células diana que
5 sobreexpresan el antígeno hTERT (FIGURA 15).
Ejemplo 15
Caracterización de la inmunogenicidad de la vacuna de TERT humana en monos Rhesus.
La inmunogenicidad de la plataforma de vacunación genética basada en sensibilización con ADN, refuerzo con Ad, con hTERT se evaluó en monos rhesus. Debido a que la homología de secuencia de la TERT humana y la TERT de 10 rhesus es del 96 %, se esperaba que la tolerancia desempeñara un papel fundamental en la determinación de la eficacia de la vacunación.
El protocolo de vacunación consistía en cinco inyecciones de ADN-EP (pV1J/TPA-hTERT-LTB, 5 mg/inyección), administradas cada dos semanas. Cuatro semanas después del último tratamiento con ADN-EP, los monos se reforzaron con un vector Ad que expresaba hTERT (Ad6-hTERT, 1011 pv) 2 veces con un intervalo de dos semanas.
15 Los datos sobre peso corporal y signos clínicos se recogieron cada semana. No se observaron efectos negativos sobre el peso corporal del animal o la aparición de signos clínicos.
La respuesta inmune inducida se controló mediante ensayo ELISPOT de IFN-γ de PBMC usando combinaciones de péptidos de hTERT similares a las descritas en el EJEMPLO 7, y una combinación de péptidos que abarcaba la secuencia de LTB. Las respuestas inmunes se puntuaron positivas si la señal obtenida era al menos cuatro veces 20 superior a la reactividad de fondo (DMSO). El análisis ELIspot de la CMI inducida indicaba que había una respuesta inmune detectable después de los primeros 2 tratamientos con ADN-EP en cuatro de los cuatro monos vacunados (FIGURA 16A). Se observó un ligero aumento a la respuesta después del quinto ADN-EP (FIGURA 16B). La respuesta inmune también se midió al final del protocolo completo de inmunización, después de los dos refuerzos con Ad. Los resultados indican que los refuerzos con Ad inducían un aumento uniforme en la amplitud de la CMI
25 (FIGURA 17). Por lo tanto, la potencia de una modalidad de sensibilización/refuerzo heteróloga se confirmó adicionalmente mediante este experimento.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A.
5 <120> PROTE�?NA DE FUSIÓN DE TRANSCRIPTASA INVERSA DE LA TELOMERASA, NUCLEÓTIDOS QUE LA CODIFICAN Y USOS DE LA MISMA
<130> ITR0119Y PCT 10 <150> 60/851.183
<151>
<160> 23 15 <170> FastSEQ para windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 3783
<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> TPA-hTERT(AI)-LTBopt 25 <400> 1
<210> 2
<211> 1267 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> -hTERT(AI)-LTBopt 10
<400> 2
<210> 3
<211> 3753 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> TPA-mTERT(AI)-LTBopt 10
<400> 3
<210> 4
<211> 1251
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> TPA-mTERT(AI)-LTBopt
<400> 4
<210> 5
<211> 3711 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hTERT(AI)-LTBopt 10
<400> 5
<210> 6
<211> 1236
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hTERT(AI)-LTBopt
<400> 6
<210> 7
<211> 3681 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> mTERT(AI)-LTBopt 10
<400> 7
<210> 8
<211> 1232
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> mTERT(AI)-LTBopt
<400> 8
<210> 9
<211> 3393 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hTERT(AI) 10
<400> 9
<210> 10
<211> 1137
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hTERT(AI) 39
<400> 10
<210> 11
<211> 3399
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<400> 11 <210> 12
<211> 1132
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 309
<212> ADN
<400> 13
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> E. coli
<400> 14
5
<210> 15 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> Cebador de PCR <400> 15 gatctgatga tatcgccacc atgaccagag cccccagatg 40
15
<210> 16 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 16 aggggggatc cgcacacctg gtaggcgcag ctgggg
36
25
<210> 17 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> Cebador de PCR
35 40
<400> 17 ctgtactttg tcaaggtggc tatcacgggc gcgtacg <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Péptido 37
45
<400> 18
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 19
<210> 20 15 <211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 20
25
<210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Péptido
35
<400> 21
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 22
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
55 <220>
<223> Péptido <400> 23 5

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de una proteína de fusión de hTERT-LTB como se expone en la SEC ID Nº: 6.
  2. 2.
    La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia como se expone en la SEC ID Nº: 5.
  3. 3.
    La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos comprende además una secuencia líder que codifica la secuencia señal del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano.
  4. 4.
    La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, en la que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia como se expone en la SEC ID Nº: 1.
  5. 5.
    Una proteína de fusión de hTERT-LTB purificada, que comprende mutaciones que funcionan eliminando la actividad catalítica de la telomerasa, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº: 6.
  6. 6.
    Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  7. 7.
    El vector de la reivindicación 6, en el que el vector es un vector plasmídico o un vector de adenovirus.
  8. 8.
    Un vector de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende un casete de expresión que comprende la proteína de fusión de hTERT y un promotor unido operativamente al polinucleótido.
  9. 9.
    El vector de la reivindicación 7 u 8, en el que el vector es el plásmido pV1J.
  10. 10.
    Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6, 7, 8 ó 9.
  11. 11.
    Un vector de adenovirus de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que es un vector Ad5 o Ad6.
  12. 12.
    Un procedimiento para expresar una proteína de fusión de hTERT-LTB en una célula huésped recombinante, que comprende:
    (a)
    introducir un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en una célula huésped adecuada; y
    (b)
    cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de fusión de hTERT-LTB.
  13. 13.
    Una composición farmacéutica que comprende un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 u 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  14. 14.
    Una combinación de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y un vector adenovírico de acuerdo con la reivindicación 11, en la que los vectores no son los mismos.
  15. 15.
    Una molécula de ácido nucleico, un vector o una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11, para su uso en el tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.
  16. 16.
    Una molécula de ácido nucleico, un vector o una proteína para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el uso es el tratamiento del cáncer.
  17. 17.
    Uso de una molécula de ácido nucleico, o un vector o una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
ES07821082T 2006-10-12 2007-10-09 Prote�?na de fusión de transcriptasa inversa de la telomerasa, nucleótidos que la codifican y usos de la misma. Active ES2376010T3 (es)

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