ES2367035T3 - Bmp-12, bmp-13 y composiciones de las mismas para inducir tendones. - Google Patents

Abstract

Polipéptido que tiene la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón o similar a ligamento, en el que dicho polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) los nucleótidos nº 196, nº 199, nº 208, nº 217, nº 361, nº 388, nº 493, nº 496, nº 571 o nº 577 a nº 879 o nº 882 de la SEC ID Nº: 1; (b) nucleótidos que codifican los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 de la SEC ID Nº: 2; (c) los nucleótidos nº 845, nº 893 o nº 899 a nº 1201 o nº 1204 de la SEC ID Nº: 3; (d) nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 4; (e) los nucleótidos nº 410, nº 458, nº 602, nº 605 o nº 659 a nº 961 o nº 964 de la SEC ID Nº: 25; (f) nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 26; o (g) secuencias alélicas humanas naturales y secuencias de codones degenerados equivalentes de uno cualquiera de (a) a (f), o (h) secuencias que hibridan con cualquiera de (a) a (f) anteriores en condiciones de hibridación rigurosas, para uso en un procedimiento para inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento en un paciente que lo necesita.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva familia de proteínas purificadas, y a composiciones que contienen dichas proteínas, siendo dichas composiciones útiles para la inducción de la formación de tejido similar a tendón/ligamento, para la curación de heridas y para la reparación de ligamentos y otros tejidos. Estas proteínas también pueden usarse en composiciones para aumentar la actividad de proteínas morfogenéticas óseas.

Antecedentes de la invención

La búsqueda de la molécula o moléculas responsables de la formación de hueso, cartílago, tendón y otros tejidos presentes en el hueso y otros extractos de tejidos ha llevado al descubrimiento de una nueva serie de moléculas denominadas las Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMP). Previamente se han esclarecido las estructuras de varias proteínas, denominadas BMP-1 a BMP-11. Las actividades de inducción excepcionales de estas proteínas, junto con su presencia en el hueso, sugieren que son reguladores importantes de procesos de reparación ósea, y pueden estar implicadas en el mantenimiento normal del tejido óseo. Existe la necesidad de identificar proteínas adicionales que jueguen un papel en la formación de otros tejidos vitales. La presente invención se refiere a la identificación de una familia de proteínas que tienen actividad inductora de tejido similar a tendón/ligamento, y que son útiles en composiciones para la inducción de la formación y reparación de tejido similar a tendón/ligamento.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene la capacidad de inducir la formación de un tejido similar a tendón o similar a ligamentos, en el que dicho polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en

(a)

los nucleótidos nº 196, nº 199, nº 208, nº 217, nº 361, nº 388, nº 493, nº 496, nº 571 o nº 577 a nº 879 o nº 882 de la SEC ID Nº: 1;

(b)

nucleótidos que codifican los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 de la SEC ID Nº: 2;

(c)

los nucleótidos nº 845, nº 893 o nº 899 a nº 1201 o nº 1204 de la SEC ID Nº: 3;

(d)

nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 4;

(e)

los nucleótidos nº 410, nº 458, nº 602, nº 605 o nº 659 a nº 961 o nº 964 de la SEC ID Nº: 25;

(f)

nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 26; o

(g)

secuencias alélicas humanas naturales y secuencias de codones degenerados equivalentes de uno cualquiera de (a) a (f), o

(h)

secuencias que hibridan con cualquiera de (a) a (f) anteriores en condiciones de hibridación rigurosas.

Y donde dicho polipéptido es para uso en un procedimiento para inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento en un paciente que lo necesita.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que tiene la capacidad de inducir la formación de un tejido similar a tendón o similar a ligamento, en la que dicho polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en

(a)

los nucleótidos nº 196, nº 199, nº 208, nº 217, nº 361, nº 388, nº 493, nº 496, nº 571 o nº 577 a nº 879 o nº 882 de la SEC ID Nº: 1;

(b)

nucleótidos que codifican los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 de la SEC ID Nº: 2;

(c)

los nucleótidos nº 845, nº 893 o nº 899 a nº 1201 o nº 1204 de la SEC ID Nº: 3;

(d)

nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 4;

(e)

los nucleótidos nº 410, nº 458, nº 602, nº 605 o nº 659 a nº 961 o nº 964 de la SEC ID Nº: 25;

(f)

nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 26; o

(g)

secuencias alélicas humanas naturales o secuencias de codones degenerados equivalentes de uno cualquiera de (a) a (f), o

(h)

secuencias que hibridan con cualquiera de (a) a (f) anteriores en condiciones de hibridación rigurosas

en la que la composición es para inducir la formación de tejido semejante a tendón/ligamento en un paciente que lo necesita.

De esta manera, la presente invención se refiere a moléculas de ADN que codifican una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento que los inventores han denominado V1-1. Esta nueva proteína se denomina ahora BMP

12. La presente invención también incluye moléculas de ADN que codifican proteínas relacionadas con BMP-12.

Las proteínas relacionadas con BMP-12 son una subserie de la familia de proteínas BMP/TGF-β/Vg-1, que incluyen BMP-12 y VL-1, que se definen como proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento codificadas por secuencias de ADN que se clonan e identifican, por ejemplo, usando PCR, usando cebadores específicos de BMP12, tales como cebadores nº 6 y nº 7 descritos más adelante, con condiciones de rigurosidad reducidas. Se prefiere que las secuencias de ADN que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 compartan al menos aproximadamente un 80% de homología a nivel de los aminoácidos con los aminoácidos nº 3 a nº 103 de la SEC ID Nº: 1.

Las moléculas de ADN preferentemente tienen una secuencia de ADN que codifica la proteína BMP-12, proporcionándose dicha secuencia en la SEC ID Nº: 1, o una proteína relacionada con BMP-12 como se describe adicionalmente en el presente documento. Tanto la proteína BMP-12 como las proteínas relacionadas con BMP-12 se caracterizan por la capacidad de inducir la formación de un tejido similar a tendón/ligamento en el ensayo descrito en los ejemplos.

Las moléculas de ADN usadas por la invención preferentemente comprenden una secuencia de ADN, como se describe en la SECUENCIA ID Nº: 1, más preferentemente los nucleótidos nº 496 a nº 882, nº 571 a nº 882 o nº 577 a nº 882 de la SEC ID Nº: 1; o secuencias de ADN que hibridan con las anteriores en condiciones de hibridación rigurosas y codifican una proteína que presenta la capacidad de formar tejido similar a tendón/ligamento. El uso de moléculas de ADN por la invención también puede comprender una secuencia de ADN como se describe en la SEC ID Nº: 25; más preferentemente los nucleótidos nº 604 o nº 658 a nº 964 de la SEC ID Nº: 25.

Las moléculas de ADN usadas por la invención también incluyen moléculas de ADN que comprenden una secuencia de ADN que codifica una proteína relacionada con BMP-12 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 26, así como secuencias alélicas naturales y secuencias de codones degenerativos equivalentes de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 26. Preferentemente, la secuencia de ADN usada por la presente invención codifica los aminoácidos nº -25 a nº 104, nº 1 a nº 104 o nº 3 a nº 103 de la SEC ID Nº: 2; o los aminoácidos nº 1 a nº 120 o nº 19 a nº 120 de la SEC ID Nº: 26. La secuencia de ADN puede comprender, en una dirección 5’ a 3’, nucleótidos que codifican un propéptido y nucleótidos que codifican los aminoácidos nº -25 a nº 104, nº 1 a nº 104 o nº 3 a nº 103 de la SEC ID Nº: 2; o los aminoácidos nº 1 a nº 120 o nº 19 a nº 120 de la SEC ID Nº: 26. El propéptido útil en la realización anterior preferentemente se selecciona del grupo que consiste en el propéptido de BMP-12 nativo y un propéptido de proteína de un miembro diferente de la superfamilia de TGF-B o la familia de BMP. La invención además se refiere a secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ADN anteriores en condiciones de hibridación rigurosas y codifican una proteína relacionada con BMP-12 que presenta la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento.

La presente invención se refiere además a una proteína relacionada con BMP-12 purificada caracterizada por la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento. Los polipéptidos relacionados con BMP-12 preferentemente comprenden una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº: 2. Más preferentemente, el polipéptido comprende los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 como se expone en la SEC ID Nº: 2; o los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 120 como se expone en la SEC ID Nº: 26. En una realización preferida, el polipéptido purificado puede estar en forma de un dímero compuesto por dos subunidades, cada una con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

En otra realización, la presente invención comprende composiciones que comprenden una cantidad eficaz de las proteínas relacionadas con BMP-12 descritas anteriormente. En las composiciones, la proteína puede mezclarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otras realizaciones incluyen moléculas de ADN quiméricas que comprenden una secuencia de ADN que codifica un propéptido de un miembro de la superfamilia de proteínas TGP-β, unida en el marco de lectura correcto a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido relacionado con BMP-12. Un propéptido adecuado es el propéptido de BMP-2. La invención también incluye moléculas de proteína heterodiméricas que comprenden un monómero que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2, y un monómero que tiene la secuencia de aminoácidos de otra proteína de la subfamilia de TGF-β.

Descripción de las secuencias

La SEC ID Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos que codifica la BMP-12 humana.

La SEC ID Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido de BMP-12 humano maduro.

La SEC ID Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína MP52.

La SEC ID Nº: 4 es la secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido de MP52 maduro.

La SEC ID Nº: 5 es la secuencia de nucleótidos de una parte amplificada específicamente de la secuencia que codifica BMP-12 humana.

La SEC ID Nº: 6 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 5.

La SEC ID Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos de una parte amplificada específicamente de la secuencia que codifica VL-1 humana.

La SEC ID Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7.

La SEC ID Nº: 9 es la secuencia de nucleótidos del plásmido pALV1-781, usado para la expresión del BMP-12 en E. coli.

La SEC ID Nº: 10 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento del clon murino, mV1.

La SEC ID Nº: 11 es la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la proteína murina codificada por mV1.

La SEC ID Nº: 12 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento del clon murino, mV2.

La SEC ID Nº: 13 es la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la proteína murina codificada por mV2.

La SEC ID Nº: 14 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento del clon murino, mV9.

La SEC ID Nº: 15 es la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la proteína murina codificada por mV9.

La SEC ID Nº: 16 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de la proteína BMP/TGF-β/Vg-1. El

primer Xaa representa Gln o Asn; el segundo Xaa representa Val o Ile. La SEC ID Nº: 17 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 1. La SEC ID Nº: 18 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de proteína BMP/TGF-β/Vg-1. Xaa

representa Val o Leu. La SEC ID Nº: 19 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 2. La SEC ID Nº: 20 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 3. La SEC ID Nº: 21 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 4. La SEC ID Nº: 22 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 5. La SEC ID Nº: 23 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 6. La SEC ID Nº: 24 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 7. La SEC ID Nº: 25 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante de VL-1 humana (BMP-13). La SEC ID Nº: 26 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 25. La SEC ID Nº: 27 es la secuencia de nucleótidos que codifica una fusión del propéptido de BMP-2 y la secuencia

codificante madura de BMP-12. La SEC ID Nº: 28 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 27. La SEC ID Nº: 29 es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína mV1 murina. X01 es Val, Ala, Glu o Gly;

X02 es Ser, Pro Thr o Ala; X03 es Ser o Arg; X04 es Leu, Pro, Gln o Arg; X05 es Cys o Trp; X06 es Val, Ala, Asp o

Gly; X07 es Val, Ala, Glu o Gly; X08 es Gln, Lys o Glu. La SEC ID Nº: 30 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 29. X01 a X08 son los mismos que en la SEC ID Nº: 29.

La SEC ID Nº: 31 es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína mV2 murina. X01 es Pro o Thr; X02 es Val.

La SEC ID Nº: 32 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 31. X01 y X02 son los mismos que en la SEC ID Nº: 31. La SEC ID Nº: 33 es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína BMP-12 humana. La SEC ID Nº: 34 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 33. La SEC ID Nº: 35 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 8.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una comparación de las secuencias de BMP-12 humana y MP52 un humana.

Descripción detallada de la invención

Las secuencias de ADN de la presente invención son útiles para producir proteínas que inducen la formación de tejido similar a tendón/ligamento, como se describe adicionalmente más adelante. Las secuencias de ADN de la presente invención son útiles además para aislar y clonar secuencias de ADN adicionales que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 con actividad similar. Estas proteínas relacionadas con BMP-12 pueden ser homólogas de otras especies, o pueden ser proteínas relacionadas dentro de la misma especie.

Además, otro aspecto de la invención son secuencias de ADN que codifican la expresión de una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento. Estas secuencias incluyen la secuencia de nucleótidos en la dirección 5’ a 3’ ilustrada en la SEC ID Nº: 1 o en la SEC ID Nº: 25, secuencias de ADN que, excepto por la degeneración del código genético, son idénticas a las secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 ó 25, y codifican la proteína de la SEC ID Nº: 2 ó

26. También se incluyen en la presente invención secuencias de ADN que hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 ó 25 y codifican una proteína que tiene la capacidad de inducir la formación de un tendón o ligamento. Las secuencias de ADN preferidas incluyen las que hibridan en condiciones rigurosas como se describe en Maniatis y col, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389. Finalmente, también se incluyen en la presente invención variaciones alélicas u otras variaciones de las secuencias de la SEC ID Nº: 1 ó 25, tanto si dichos cambios de nucleótidos dan como resultado cambios en la secuencia peptídica como si no, pero en las que la secuencia peptídica sigue teniendo actividad inductora de tejido similar a tendón/ligamento.

La secuencia de ADN del BMP-12 humana (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 2) se exponen en el Listado de Secuencias. Otra proteína que es útil para las composiciones y procedimientos de la presente invención es VL-1. VL-1 es una proteína relacionada con BMP-12 que se clonó usando secuencias de BMP-12. Los inventores han denominado ahora a VL-1 con el nombre BMP-13. Una secuencia de ADN parcial de VL-1 (SEC ID Nº: 7) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEC ID Nº: 8); así como una secuencia de ADN que codifica la VL1 madura (SEC ID Nº: 25) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEC ID Nº: 26) se exponen en el Listado de Secuencias. Aunque se realizan descripciones adicionales haciendo referencia a la secuencia de BMP-12 de las SEC ID Nº: 1 y 2, se reconocerá que la invención incluye modificaciones y mejoras similares que pueden realizarse en otras secuencias relacionadas con BMP-12, tales como la secuencia de VL-1 mostrada en la SEC ID Nº: 25 y 26.

La secuencia de BMP-12 mostrada en la SEC ID Nº: 1 incluye la secuencia madura entera y aproximadamente 190 aminoácidos del propéptido. La secuencia codificante de la proteína BMP-12 humana madura parece empezar en el nucleótido nº 496 o nº 571 y continúa hasta el nucleótido nº 882 de la SEC ID Nº: 1. La primera cisteína en la estructura de siete cisteínas característica de las proteínas TGF-β empieza en el nucleótido nº 577. La última cisteína termina en el nº 879. De esta manera, es de esperar que las secuencias de ADN que codifican especies de BMP-12 activas comprendan los nucleótidos nº 577 a nº 879 de la SEC ID Nº: 1.

Es de esperar que BMP-12, expresada por células de mamífero tales como células CHO, exista como una población heterogénea de especies activas de proteína BMP-12 con extremos N variables. Es de esperar que todas las especies activas contengan la secuencia de aminoácidos que empieza con el resto de cisteína en el aminoácido nº 3 de la SEC ID Nº: 2 y continúa hasta al menos el resto de cisteína en el aminoácido 103 o hasta el codón de terminación después del aminoácido 104. Otras especies activas contienen otra secuencia de aminoácidos en la dirección N-terminal. Como se describe adicionalmente en el presente documento, es de esperar que el extremo N de las especies activas producidas por las células de mamífero comience después de la aparición de un sitio de escisión consenso, que codifica una secuencia peptídica Arg-X-X-Arg. De esta manera, es de esperar que las secuencias de ADN que codifican proteínas BMP-12 activas tengan una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos que empieza en cualquiera de los nucleótidos nº 106, 199, 208, 217, 361, 388, 493, 496 ó 571 hasta el nucleótido nº 879 u 882 de la SEC ID Nº: 1.

Se ha determinado experimentalmente por expresión en E. coli que el extremo N de una especie activa de BMP-12 humana es el siguiente: [M]SRXSRKPLHVDF, en el que X designa un resto de aminoácido sin señal evidente, que es coherente con un resto de cisteína en esa localización. De esta manera, parece ser que el extremo N de esta especie de BMP-12 está en el aminoácido nº 1 de la SEC ID Nº: 1, y una secuencia de ADN que codifica dicha especie de BMP-12 empezaría en el nucleótido nº 571 de la SEC ID Nº: 1. El peso molecular aparente de esta especie de dímero de BMP-12 humana, según se determinó por SDS-PAGE, es de aproximadamente 20-22 kd en un gel de tricina al 16% Novex. La proteína BMP-12 humana existe como una solución transparente incolora en ácido trifluoroacético al 0,1%.

Como se ha descrito anteriormente, las proteínas relacionadas con BMP-12 son una subserie de la familia de proteínas BMP/TGF-β/Vg-1, incluyendo BMP-12 y VL-1, que pueden definirse como proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento codificadas por secuencias de ADN que pueden clonarse e identificarse, por ejemplo, usando PCR, usando cebadores específicos de BMP-12, tales como los cebadores nº 6 y nº 7 descritos más adelante, con condiciones de rigurosidad reducida. Se prefiere que las secuencias de ADN de la presente invención compartan al menos aproximadamente un 80% de homología a nivel de aminoácidos con el ADN que codifica los aminoácidos nº 3 a nº 103 de la SEC ID Nº: 1. Para los fines de la presente invención, la expresión proteínas relacionadas con BMP-12 no incluye la proteína MP52 humana. Usando la información de secuencia de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 3, y la comparación proporcionada en la Figura 1, está dentro de la experiencia en la técnica diseñar cebadores para la secuencia de BMP-12 que permitan la clonación de genes que codifican proteínas relacionadas con BMP-12.

Un ejemplo de las proteínas relacionadas con BMP-12 de la presente invención es VL-1, denominada actualmente BMP-13. La secuencia de la proteína BMP-13 madura completa y al menos una parte del propéptido de BMP-13 se proporcionan en la SEC ID Nº: 25. Al igual que BMP-12, es de esperar que BMP-13, expresada por células de mamífero tales como células CHO, exista como una población heterogénea de especies activas de proteína BMP-13 con extremos N variables. Es de esperar que todas las especies activas contengan la secuencia de aminoácidos que empieza con el resto de cisteína en el aminoácido nº 19 de la SEC ID Nº: 26 y continúa hasta al menos el resto de cisteína en el aminoácido 119 o hasta el codón de terminación después del aminoácido 120. Otras especies activas contienen una secuencia de aminoácidos adicional en la dirección N terminal. Como se describe adicionalmente en el presente documento, es de esperar que el extremo N de la especie activa producida por células de mamífero comience después de la aparición de un sitio de escisión consenso, que codifica una secuencia peptídica Arg-X-X-Arg. De esta manera, es de esperar que las secuencias de ADN que codifican proteínas BMP-13 activas tengan una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos que empieza en cualquiera de los nucleótidos nº 410, 458, 602, 605 ó 659, hasta el nucleótido nº 961 ó 964 de la SEC ID Nº: 25.

Para producir las proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento purificadas útiles para la presente invención, se emplea un procedimiento que comprende cultivar una célula huésped transformada con una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante adecuada, particularmente la secuencia codificante de ADN desde el nucleótido nº 496, nº 571 o nº 577 a nº 879 o nº 882 de la SEC ID Nº: 1; y recuperar y purificar a partir del medio de cultivo una proteína que contenga la secuencia de aminoácidos o una secuencia sustancialmente homóloga representada por los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 de la SEC ID Nº: 2. En otra realización, el procedimiento empleado comprende cultivar una célula huésped transformada con una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante adecuada, particularmente la secuencia codificante de ADN desde el nucleótido nº 605 o nº 659 a nº 961 o nº 964 de la SEC ID Nº: 25; y recuperar y purificar del medio de cultivo una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos o una secuencia sustancialmente homóloga a la representada por los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 26

El ADN de MP52 humana se describe en el documento WO93/16099. Sin embargo, este documento no desvela la capacidad de la proteína de formar tejido similar a tendón/ligamento, o su uso en composiciones para la inducción de tejido similar a tendón/ligamento. La MP52 humana se aisló originalmente usando ARN de tejido embrionario humano. La secuencia de nucleótidos de MP52 humana (SEC ID Nº: 3) y las secuencias de aminoácidos codificadas (SEC ID Nº: 4) se exponen en el Listado de Secuencias del presente documento. La proteína MP52 parece empezar en el nucleótido nº 845 de la SEC ID Nº: 3 y continúa hasta el nucleótido nº 1204 de la SEC Nº: 3. La primera cisteína de la estructura de siete cisteínas característica de las proteínas TGF-β empieza en el nucleótido nº 899. La última cisteína termina en el nº 1201. Otras especies activas de proteína MP52 pueden tener nucleótidos adicionales en la dirección N-terminal desde el nucleótido nº 845 de la SEC ID Nº: 3.

Pueden producirse proteínas MP52 humanas purificadas de la presente invención cultivando una célula huésped transformada con una secuencia de ADN que comprende la secuencia codificante de ADN de la SEC ID Nº: 3 desde el nucleótido nº 845 a nº 1204, y recuperando y purificando a partir del medio de cultivo una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos o una secuencia sustancialmente homóloga a la representada por los aminoácidos nº 1 a nº 120 de la SEC ID Nº: 4. También es de esperar que la secuencia de aminoácidos desde los aminoácidos nº 17 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 4 retenga actividad. De esta manera, es de esperar que la secuencia de ADN de los nucleótidos nº 845, nº 893 o nº 899 a nº 1201 o nº 1204 codifique proteínas activas.

Para la expresión de la proteína en células huésped de mamífero, la célula huésped se transforma con una secuencia codificante que codifica un propéptido adecuado para la secreción de proteínas por la célula huésped, unida en un marco de lectura apropiado a la secuencia codificante para la proteína madura. Por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos 5.168.050, en la que un ADN que codifica una parte precursora de una proteína de mamífero distinta de BMP-2 se fusiona al ADN que codifica una proteína BMP-2 madura. De esta manera, la presente invención incluye moléculas de ADN quiméricas que comprenden una secuencia de ADN que codifica un propéptido de un miembro de la superfamilia de proteínas TGF-β, que está unida en el marco de lectura correcto a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de inducción de tejido similar a tendón/ligamento. El término “quimérico” se usa para hacer referencia a que el propéptido procede de un polipéptido diferente que el polipéptido maduro codificado. Por supuesto, la célula huésped puede transformarse con una secuencia de ADN codificante que codifica el propéptido nativo unido en el marco de lectura correcto a una secuencia codificante que codifica la proteína madura mostrada en la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 26. La secuencia completa del propéptido nativo puede determinarse por procedimientos conocidos en la técnica usando las secuencias desveladas en las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 25 para diseñar una sonda adecuada para identificar y aislar el clon entero.

La presente invención también incluye las nuevas secuencias de ADN, sin asociación con secuencias de ADN que codifican otros materiales proteicos, y que codifican la expresión de proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento. Estas secuencias de ADN incluyen las representadas en las SEC ID Nº: 1 en una dirección 5’ a 3’ y las secuencias que hibridan con las mismas en condiciones de hibridación rigurosas [por ejemplo, SSC 0,1X, SDS al 19% a 65 ºC; véase, T. Maniatis y col, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389] y codifican una proteína que tiene actividad inductora de tejido similar a tendón/ligamento.

De forma similar, las secuencias de ADN que codifican proteínas codificadas por las secuencias de la SEC ID Nº: 1

o SEC ID Nº: 25, o proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 26, pero que difieren en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético o variaciones alélicas (cambios de bases naturales en la población de especies que pueden dar como resultado o no un cambio de aminoácidos) también codifican las proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento descritas en el presente documento. También se incluyen en la invención variaciones en las secuencias de ADN de las SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 25 que se producen por mutaciones puntuales o por modificaciones inducidas (incluyendo inserción, deleción y sustitución) para aumentar la actividad, semivida o producción de los polipéptidos codificados.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un nuevo procedimiento para producir proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento. El procedimiento de la presente invención implica cultivar una línea celular adecuada, que se ha transformado con una secuencia de ADN que codifica una proteína de la invención, bajo el control de secuencias reguladoras conocidas. Las células huésped transformadas se cultivan y las proteínas se recuperan y purifican a partir del medio de cultivo. Las proteínas purificadas carecen sustancialmente de otras proteínas con las que se co-producen así como de otros contaminantes.

Las células o líneas celulares adecuadas pueden ser células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO). Como se ha descrito anteriormente, la expresión de proteínas en células de mamífero requiere un propéptido apropiado para asegurar la secreción de la proteína. En la técnica se conoce la selección de células huésped de mamífero adecuadas y procedimientos para la transformación, cultivo, amplificación, exploración, producción de producto y purificación. Véase, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981) o, como alternativa, Kaufman y col, Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750-1759 (1985) o Howley y col, Patente de Estados Unidos

4.419.446. Otra línea celular de mamífero adecuada, que se describe en los ejemplos adjuntos, es la línea celular COS-1 de mono. También puede ser adecuada la célula CV-1 de mamífero.

También pueden ser huéspedes adecuados células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, MC1061) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. También pueden emplearse en este procedimiento diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas, otros bacilos y similares. Para la expresión de la proteína en células bacterianas, no es necesario ADN que codifique un propéptido.

Se sabe que la expresión en bacterias de proteínas de mamífero, incluyendo miembros de la familia de TGF-β, produce las proteínas en una forma no glicosilada, y en forma de gránulos insolubles, conocidos como cuerpos de inclusión. Se han descrito técnicas en este campo para solubilizar estos cuerpos de inclusión, desnaturalizar la proteína usando un agente caotrópico y replegar la proteína de una forma suficientemente correcta para permitir su producción en una forma soluble. Por ejemplo, véase el documento EP 0433225.

Como alternativa, se han ideado procedimientos que evitan la formación de cuerpos de inclusión, tales como la expresión de proteínas de fusión de genes, en los que la proteína deseada se expresa como una proteína de fusión con un compañero de fusión. La proteína de fusión posteriormente se somete a escisión para producir la proteína deseada. Un ejemplo de dicho sistema de expresión de fusión génica para E. coli se basa en el uso del gen de la tiorredoxina de E. coli como compañero de fusión, La Vallie y col., Bio/Technology, 11: 187-193 (1993).

Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la materia también pueden estar disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Además, cuando se desee, pueden utilizarse células de insecto como células huésped en el procedimiento de la presente invención. Véase, por ejemplo, Miller y col, Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986) y las referencias citadas en dicho documento.

Otro aspecto de la presente invención proporciona vectores para uso en el procedimiento de expresión de estas proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento. Preferentemente, los vectores contienen las secuencias de ADN nuevas completas descritas anteriormente que codifican los nuevos factores de la invención. Además, los vectores contienen secuencias de control de la expresión apropiadas que permiten la expresión de las secuencias de proteínas. Como alternativa, también son realizaciones de la presente invención vectores que incorporan secuencias modificadas como se han descrito anteriormente. Además, la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 3 o la SEC ID Nº: 25 podría manipularse para expresar una proteína madura mediante la deleción de secuencias de propéptido y el reemplazo de las mismas con secuencias que codifican los propéptidos completos de proteínas BMP o miembros de la superfamilia de TGF-β. De esta manera, la presente invención incluye moléculas de ADN quiméricas que codifican un propéptido de un miembro de la superfamilia de TGF-β unido en el marco de lectura correcto a una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 26. Los vectores pueden emplearse en el procedimiento de transformación de líneas celulares y contener secuencias reguladoras seleccionadas en la asociación operativa con las secuencias codificantes de ADN de la invención que son capaces de dirigir la replicación y expresión de las mismas en células huésped seleccionadas. Los expertos en la materia conocen secuencias reguladoras para dichos vectores y pueden seleccionarse dependiendo de las células huésped. Dicha selección es rutinaria y no forma parte de la presente invención.

Una proteína de la presente invención que induce tejido similar a tendón/ligamento u otra formación de tejido en circunstancias en las que normalmente no se forma dicho tejido, tiene aplicación en la curación de desgarros de tendones o ligamentos, deformidades y otros defectos de tendones o ligamentos en seres humanos y otros animales. Dicha preparación que emplea una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento puede tener uso profiláctico en la prevención de lesiones en tejido de tendón o ligamento, así como uso en la mejora de la fijación del tendón o ligamento al hueso u otros tejidos, y en la reparación de defectos de tejido de tendón o ligamento. La formación de tejido similar a tendón/ligamiento de novo inducida por una composición de la presente invención contribuye a la reparación de defectos congénitos, inducidos por traumatismo u otros defectos en tendón o ligamento de otro origen, y también es útil en la cirugía plástica cosmética para la unión o reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento de tendinitis, síndrome del túnel del carpo y otros defectos de tendones o ligamentos. Las composiciones de la presente invención también pueden usarse en otras indicaciones en las que es deseable curar o regenerar tejido del tendón y/o ligamento. Estas indicaciones incluyen, sin limitación, la regeneración o reparación de lesiones en el ligamento periodontal, tales como las que se producen en las tendinitis, y la regeneración o reparación de la unión del tendón al hueso. Las composiciones de la presente invención pueden proporcionar un medio para unir células formadoras de tendón o ligamento, estimular el crecimiento de células formadoras de tendón o ligamento o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de tendón o ligamento.

Las proteínas relacionadas con BMP-12 pueden recuperarse del medio de cultivo y purificarse por aislamiento de otros materiales proteicos con los que se co-producen y de otros contaminantes presentes. Las proteínas de la presente invención pueden inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento. Estas proteínas pueden caracterizarse adicionalmente por la capacidad de demostrar actividad de formación de tejido similar a tendón/ligamento en el ensayo de implante ectópico de rata descrito más adelante. Se contempla que estas proteínas también pueden tener capacidad de inducir la formación de otros tipos de tejido, tales como ligamentos.

Las proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento proporcionadas en el presente documento también incluyen factores codificados por secuencias similares a las de las SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 25, pero en las que se proporcionan naturalmente modificaciones (por ejemplo, variaciones alélicas en la secuencia de nucleótidos que pueden dar como resultado cambios de aminoácidos en el polipéptido) o modificadas deliberadamente por ingeniería genética. Por ejemplo, los polipéptidos sintéticos pueden duplicar total o parcialmente secuencias continuas de los restos de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2. Esta secuencias, gracias a que comparten características conformacionales y de estructura primaria, secundaria o terciaria con polipéptidos de factor de crecimiento de tejido similar a tendón/ligamento de la SEC ID Nº: 2, pueden poseer propiedades biológicas de factor de crecimiento de tejido similar a tendón/ligamento u otro tejido en común con los mismos. De esta manera, pueden emplearse como sustitutos biológicamente activos de polipéptidos inductores de tejido similar a tendón/ligamento naturales en las composiciones y procedimientos terapéuticos.

Otras mutaciones específicas de las secuencias de proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento descritas en el presente documento implican modificaciones de sitios de glicosilación. Estas modificaciones pueden implicar sitios de glicosilación unidos a O o unidos a N. Por ejemplo, la ausencia de glicosilación o sólo una glicosilación parcial resulta de la sustitución o deleción de aminoácidos en sitios de reconocimiento de glicosilación unidos a asparagina. Los sitios de reconocimiento de glicosilación unidos a asparagina comprenden secuencias tripeptídicas que se reconocen específicamente por enzimas de glicosilación celular apropiadas. Estas secuencias tripeptídicas pueden ser asparagina-X-treonina, asparagina-X-serina o asparagina-X-cisteína, donde X es normalmente cualquier aminoácido excepto prolina. Una diversidad de sustituciones o deleciones de aminoácidos en uno o los dos de la primera o tercera posiciones de aminoácidos de un sitio de reconocimiento de glicosilación (y/o deleción de aminoácidos en la segunda posición) da como resultado una ausencia de glicosilación en la secuencia tripeptídica modificada. Además, la expresión bacteriana de proteínas también dará como resultado la producción de una proteína no glicosilada, aunque se dejen sin modificar los sitios de glicosilación.

Las composiciones de la presente invención comprenden una proteína relacionada con BMP-12 purificada que puede producirse por cultivo de una célula transformada con la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 25 y recuperación y purificación de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 26 a partir del medio de cultivo. La proteína expresada purificada carece sustancialmente de otros materiales proteicos con los que se produce conjuntamente, así como de otros contaminantes. Se contempla que la proteína purificada recuperada presenta actividad de formación de tejido similar a tendón/ligamento y otra actividad de crecimiento de tejidos, tal como regeneración de ligamentos. Las proteínas de la invención pueden caracterizarse adicionalmente por la capacidad de demostrar actividad de formación de tejido similar a tendón/ligamento en el ensayo de rata descrito más adelante.

Las composiciones para inducir formación de tejido similar a tendón/ligamento de la presente invención pueden comprender una cantidad eficaz de una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento, en las que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:2, preferentemente los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 de la SEC ID Nº: 2; o los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 120 de la SEC ID Nº: 26; así como mutantes y/o variantes de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 26, que presenta la capacidad de formar tejido similar a tendón y/o ligamento.

Las composiciones de la presente invención pueden comprender además proteínas adicionales, tales como miembros adicionales de la superfamilia de proteínas TGF-β, tales como activinas. Otro aspecto de la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína inductora de tendón/ligamento, tal como BMP-12 o VL-1, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden usarse para inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento u otro tejido. Se contempla que dichas composiciones también pueden usarse para la reparación de tendón y ligamento, curación de heridas y reparación de otros tejidos, tales como la reparación de la piel. También se contempla que las proteínas de la invención pueden aumentar la supervivencia neuronal y, por lo tanto, ser útiles en el trasplante y tratamiento de afecciones que presentan una reducción de la supervivencia neuronal. Las composiciones de la invención pueden incluir además al menos otro agente terapéuticamente útil, tal como las proteínas BMP BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7, desveladas, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.108.922; 5.013.649; 5.116.738; 5.106.748; 5.187.076; y 5.141.905; BMP-8, desvelada en la publicación PCT WO91/18098; BMP-9, desvelada en la publicación PCT WO93/00432; y BMP-10 o BMP-11, desveladas en las solicitudes de patente en trámite junto con la presente con el número de serie 08/061.695 y 08/061.464, presentada el 12 de mayo de 1993.

Las composiciones de la invención pueden comprender, además de proteína inductora de tendón/ligamento tal como BMP-12 o VL-1 (BMP-13), otros agentes terapéuticamente útiles que incluyen MP52, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de transformación (TGF-α y TGF-β) y factor de crecimiento de fibroblastos-4 (FGF-4), hormona paratiroidea (PTH), factor inhibidor de leucemia (LIF/HILDA/DIA), factores de crecimiento similares a insulina (IGF-1 e IGF-II). En las composiciones de la presente invención también pueden usarse partes de estos agentes. Por ejemplo, una composición que comprende tanto BMP-2 como BMP-12 implantados conjuntamente da lugar a tejido similar tanto a hueso como a tendón/ligamento. Dicha composición puede ser útil para tratar defectos de la articulación embrionaria donde se forman simultáneamente tendón, ligamentos y hueso en localizaciones anatómicas contiguas, y puede ser útil para regenerar tejido en el sitio de la unión del tendón al hueso. Se contempla que las composiciones de la invención también pueden usarse en la curación de heridas, tal como en la curación de la piel y la reparación de tejidos relacionada. Los tipos de heridas incluyen, pero sin limitación, quemaduras, incisiones y úlceras. (Véase, por ejemplo, en la Publicación PCT WO84/0110, el análisis de la curación de heridas y la reparación de tejido relacionada).

Es de esperar que las proteínas de la invención puedan actuar conjuntamente con, o quizás de forma sinérgica, con otras proteínas y factores de crecimiento relacionados. Por lo tanto, otros procedimientos terapéuticos y composiciones de la invención comprenden una cantidad terapéutica de al menos una proteína de la invención con una cantidad terapéutica de al menos una de las proteínas BMP descritas anteriormente. Dichas composiciones pueden comprender moléculas separadas de las proteínas BMP o heteromoléculas compuestas por diferentes restos de BMP. Por ejemplo, un procedimiento y composición de la invención pueden comprender un dímero unido por enlaces disulfuro que comprende una subunidad de proteína relacionada con BMP-12 y una subunidad de una de las proteínas “BMP” descritas anteriormente. De esta manera, la presente invención incluye composiciones que comprenden un polipéptido relacionado con BMP-12 purificado es un heterodímero en el que una subunidad comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido nº 1 al aminoácido nº 104 de la SEC ID Nº: 2, y otra subunidad comprende una secuencia de aminoácidos para una proteína morfogenética ósea seleccionada del grupo que consiste en BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, 2. BMP-9, BMP-10 y BMP-11. Otra realización puede comprender un heterodímero de restos inductores de tejido similar a tendón/ligamento unidos por enlaces disulfuro tales como BMP-12, VL-1 (BMP-13) o MP52. Por ejemplo, el heterodímero puede comprender una subunidad que comprende una secuencia de aminoácidos desde el nº 1 al nº 104 de la SEC ID Nº: 2 y la otra subunidad puede comprender una secuencia de aminoácidos desde el nº 1 al nº 120 de la SEC ID Nº: 4 o desde el nº 1 al nº 120 de la SEC ID Nº: 26. Además, pueden combinarse composiciones de la presente invención con otros agentes beneficiosos para el tratamiento del defecto, herida o tejido en cuestión.

La preparación y formulación de dichas composiciones de proteínas fisiológicamente aceptables, considerando debidamente el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro de la experiencia de la técnica. Las composiciones terapéuticas también son valiosas actualmente para aplicaciones veterinarias debido a la ausencia de especificidad de especie en proteínas TGF-β. Particularmente, los animales domésticos y los caballos pura sangre además de los seres humanos son pacientes deseados para dicho tratamiento con las composiciones de la presente invención.

El procedimiento terapéutico incluye administrar la composición tópicamente, sistémicamente o localmente como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para uso en la presente invención, por supuesto, está en una forma fisiológicamente aceptable sin pirógenos. Además, la composición puede encapsularse deseablemente o inyectarse en una forma viscosa para suministrarse en el sitio de lesión del tejido. La administración tópica puede ser adecuada para la curación de heridas y la reparación de tejidos. Ciertos agentes terapéuticamente útiles distintos de las proteínas que también pueden incluirse opcionalmente en la composición como se ha descrito anteriormente, pueden administrarse, como alternativa o adicionalmente, de forma simultánea o secuencial con la composición en los procedimientos de la invención.

Las composiciones también pueden incluir una matriz y/o agente secuestrante apropiado como excipiente. Por ejemplo, la matriz puede soportar la composición o proporcionar una superficie para la formación de tejido similar a tendón/ligamento y/u otra formación de tejido. La matriz puede proporcionar la liberación lenta de la proteína y/o el entorno apropiado para su presentación. El agente secuestrante puede ser una sustancia que ayuda a facilitar la administración por inyección u otro medio, o puede ralentizar la migración de la proteína desde el sitio de aplicación.

La elección de un material excipiente se basa en las propiedades de biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, aspecto cosmético y propiedades de interfaz. La aplicación particular de las composiciones definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser biodegradables y químicamente definidas. Otras matrices se componen de proteínas puras o componentes de matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y definidas químicamente. Las matrices preferidas incluyen materiales basados en colágeno tales como esponja Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, N.J.), o colágeno en una forma inyectable, así como agentes secuestrantes, que también pueden ser biodegradables y que pueden incluir materiales de alquilcelulosa.

Otra clase preferida de vehículos son matrices poliméricas porosas en forma de partículas, que incluyen polímeros de poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico. Estas matrices también pueden incluir un agente secuestrante. Se describen matrices poliméricas adecuadas, por ejemplo, en el documento WO 93/00050.

Una familia preferida de agentes secuestrantes es la de materiales celulósicos tales como alquilcelulosas (incluyendo hidroxialquilcelulosas), incluyendo metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa, siendo las más preferidas sales catiónicas de carboximetilcelulosa (CMC). Otros agentes secuestrantes preferidos incluyen ácido hialurónico, alginato sódico, poli(etilenglicol), poli(óxido de oxietileno), polímero de carboxivinilo y poli(alcohol vinílico). La cantidad de agente secuestrante útil en el presente documento es del 0,5-20% en peso, preferentemente del 1-10% en peso con respecto al peso total de la formulación, que representa la cantidad necesaria para prevenir la desorción de la proteína de la matriz polimérica y permitir una manipulación apropiada de la composición, pero no tan grande como para impedir que las células progenitoras se infiltren en la matriz, proporcionando de esta manera a la proteína la oportunidad de ayudar a la actividad de las células progenitoras.

Otros componentes opcionales útiles en la práctica de la presente solicitud incluyen, por ejemplo, protectores criogénicos tales como manitol, sacarosa, lactosa, glucosa o glicina (para proteger a la proteína de la degradación durante la liofilización), conservantes antimicrobianos tales como metil y propil parabenos y alcohol bencílico; antioxidantes tales como EDTA, citrato y BHT (hidroxitolueno butilado); y tensioactivos tales como poli(sorbatos) y poli(oxietilenos), etc.

Como se ha descrito anteriormente, las composiciones de la invención pueden emplearse en procedimientos para tratar varios defectos de tendones, tales como para la regeneración de tejido similar a tendón/ligamento en áreas de lesiones de tendones o ligamentos, para ayudar a reparar desgarros de tejido de tendón, ligamentos y otros diversos tipos de defectos o heridas en tejidos. Estos procedimientos, de acuerdo con la invención, implican la administración a un paciente que necesita dicha reparación de tejido similar a tendón/ligamento u otro tejido, de una composición que comprende una cantidad eficaz de una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento, tal como la descrita en la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 y/o SEC ID Nº: 26. Estos procedimientos también pueden implicar la administración de una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento junto con al menos una de las proteínas BMP descritas anteriormente.

En otra realización, los procedimientos pueden implicar la administración de una proteína heterodimérica en la que uno de los monómeros es un polipéptido de inducción de tejido similar a tendón/ligamento, tal como BMP-12, VL-1 (BMP-13) o MP52, y el segundo monómero es un miembro de la superfamilia de factores de crecimiento TGF-β. Además, estos procedimientos también pueden incluir la administración de una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento con otros factores de crecimiento que incluyen EGF, FGF, TGF-α, TGF-β e IGF.

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45

De esta manera, otro aspecto de la invención es un procedimiento terapéutico y composición para reparar tejido similar a tendón/ligamento, para reparar tendones o ligamentos, así como para tratar tendinitis y otras afecciones relacionadas con defectos de tendones o ligamentos. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento, tales como BMP-12, una proteína relacionada con BMP-12, o MP52, mezclada con un vehículo, excipiente o matriz farmacéuticamente aceptable.

El régimen de dosificación se determinará por el médico a cargo del caso considerando diversos factores que modifican la acción de la composición, por ejemplo, la cantidad de tejido de tendón o ligamento que se desea formar, el sitio de la lesión de tendón o ligamento, el estado del tendón o ligamento dañado, el tamaño de la herida, el tipo de tejido dañado, la edad, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el momento de administración y otros factores clínicos. La dosificación puede variar con el tipo de matriz usada en la reconstitución y los tipos de proteínas adicionales en la composición. También puede afectar a la dosificación la adición de otros factores de crecimiento conocidos, tales como IGF-I (factor de crecimiento similar a insulina I), a la composición final.

El progreso puede monitorizarse mediante la evaluación periódica de la formación de tejido similar a tendón/ligamento, o del crecimiento y/o reparación de tendón o ligamento. El progreso puede monitorizarse por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, rayos X, artroscopia, determinaciones histomorfométricas y marcaje con tetraciclina.

Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la presente invención en la recuperación y caracterización de proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento humano y su empleo para recuperar las otras proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento, obtener las proteínas humanas, expresar las proteínas mediante técnicas recombinantes y demostrar la capacidad de las composiciones de la presente invención para formar tejido similar a tendón/ligamento en un modelo in vivo. Aunque los ejemplos demuestran la invención con respecto a BMP12, con modificaciones minoritarias dentro de la experiencia en la técnica, se cree que se pueden obtener los mismos resultados con MP52 y VL-1

Ejemplo 1

Aislamiento de ADN

Pueden aislarse secuencias de ADN que codifican BMP-12 y proteínas relacionadas con BMP-12 por diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Como se describe más adelante, pueden diseñarse cebadores oligonucleotídicos basándose en secuencias de aminoácidos presentes en otras proteínas BMP, proteínas relacionadas con Vg-1 y otras proteínas de la superfamilia de TGF-β. Pueden identificarse regiones que contienen secuencias de aminoácidos que están muy conservadas dentro de la familia de proteínas BMP y dentro de otros miembros de la superfamilia de TGF-β’ y pueden construirse secuencias de aminoácidos consenso de estas regiones altamente conservadas basándose en la similitud de las regiones correspondientes de proteínas BMP/TGFβ/Vg-1 individuales. A continuación se indica un ejemplo de dicha secuencia de aminoácidos consenso.

Secuencia de aminoácidos consenso (1):

Trp-Gln/Asn-Asp-Trp-Ile-Val/Ile-Ala (SEC ID Nº: 16)

En la que X/Y indica que cualquier resto de aminoácido puede aparecer en esa posición.

El siguiente oligonucleótido se diseña basándose en la secuencia de aminoácidos consenso identificada anterior (1):

nº 1: CGGATCCTGGVANGAYTGGATHRTNGC (SEC ID Nº: 17)

Esta secuencia oligonucleotídica se sintetiza en un sintetizador de ADN automático. Los símbolos de nucleótidos convencionales en el cebador oligonucleotídico identificado anterior son los siguientes: A, adenosina; C, citosina; G, guanina; T, timina; N, adenosina o citosina o guanina o timina; R, adenosina o citosina; Y, citosina o timina; H, adenosina o citosina o timina; V, adenosina o citosina o guanina; D, adenosina o guanina o timina.

Los siete primeros nucleótidos del oligonucleótido nº 1 (subrayado) contienen la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente que codifica la proteína BMP-12 y, por lo tanto, no proceden de la secuencia de aminoácidos consenso (1) presentada anteriormente.

Una segunda secuencia de aminoácidos consenso procede de otra región altamente conservada de las proteínas BMP/TGF-β/Vg-1 como se describe a continuación:

His-Ala-Ile-Val/Leu-Gln-Thr (SEC ID Nº: 18)

El siguiente oligonucleótido se diseña basándose en la secuencia de aminoácidos consenso identificada anterior (2): nº 2: TTTCTAGAARNGTYTGNACDATNGCRTG (SEC ID Nº: 19)

Esta secuencia oligonucleotídica se sintetiza en un sintetizador de ADN automático. Se usan los mismos símbolos de nucleótidos que se han descrito anteriormente.

Los siete primeros nucleótidos del oligonucleótido nº 1 (subrayado) contienen la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Xbal para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente que codifica la proteína BMP-12 y, por lo tanto, no proceden de la secuencia de aminoácidos consenso (2) presentada anteriormente.

Se contempla que la proteína BMP-12 de la invención y otras proteínas relacionadas con BMP/TGF-β/Vg-1 pueden contener secuencias de aminoácidos similares a las secuencias de aminoácidos consenso descritas anteriormente y que la localización de esta secuencia dentro de una proteína BMP-12 u otras proteínas relacionadas nuevas correspondería a las localizaciones relativas en las proteínas a partir de las cuales se obtuvieron. Además se contempla que esta información posicional derivada de la estructura de otras proteínas BMP/TGF-β/Vg-1 y las secuencias oligonucleotídicas nº 1 y nº 2 que se han obtenido a partir de las secuencias de aminoácidos consenso

(1) y (2) respectivamente, podrían utilizarse para amplificar específicamente secuencias de ADN que codifican los aminoácidos correspondientes de una proteína BMP-12 u otras proteínas relacionadas con BMP/TGF-β/Vg-1.

Basándose en el conocimiento de las estructuras génicas de proteínas BMP/TGF-β/Vg-1, se contempla además que puede usarse ADN genómico humano como molde para realizar reacciones de amplificación específicas que darían como resultado la identificación de secuencias codificantes de BMP-12 HMB/TGF-β/Vg-1 (proteína relacionada con BMP-12). Dichas reacciones de amplificación específicas de un molde de ADN genómico humano podrían iniciarse con el uso de cebadores oligonucleotídicos nº 1 y nº 2 descritos anteriormente. Los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 identificados anteriormente se utilizan como cebadores para permitir la amplificación específica de una secuencia de nucleótidos especifica de ADN genómico humano. La reacción de amplificación se realiza como se indica continuación:

Se corta ADN genómico humano (fuente: linfocitos de sangre periférica), proporcionado por Ken Jacobs de Genetics Institute, mediante el pase repetido a través de una aguja de calibre 25, se desnaturaliza a 100 ºC durante 5 minutos y después se enfría en hielo antes de añadirlo a una mezcla de reacción que contiene una concentración 200 µM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gelatina al 0,001%, 1,25 unidades de ADN polimerasa Taq, una concentración 100 pM de oligonucleótido nº 1 y una concentración 100 pM de oligonucleótido nº 2. Esta mezcla de reacción se incuba a 94 ºC durante dos minutos y después se somete a ciclos térmicos de la siguiente manera: 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 40 ºC, 1 minuto a 72 ºC durante tres ciclos; después 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto at 55 ºC, 1 minuto a 72 ºC durante treinta y siete ciclos, seguido de una incubación de 10 minutos a 72 ºC.

El ADN que se amplifica específicamente por esta reacción se precipita con etanol, se digiere con las endonucleasas de restricción BamHI y XbaI y se somete a electroforesis en gel de agarosa. Se escinde una región del gel, que corresponde al tamaño previsto de la BMP-12 u otro fragmento de ADN que codifica BMP/TGF-β/Vg-1, y los fragmentos de ADN amplificados específicamente contenidos se electroeluyen y se subclonan en el vector plasmídico pGEM-3 entre los sitios XbaI y BamHI del poliengarce. El análisis de la secuencia de ADN de uno de los subclones relacionados con BMP-12 resultantes indica que la secuencia de ADN amplificada específicamente del producto contenido codifica una parte de la proteína BMP-12 de la invención.

La secuencia de ADN (SEC ID Nº: 5) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº: 6) de este fragmento de ADN amplificado específicamente de BMP-12 se muestran en el Listado de SECUENCIAS.

Los nucleótidos nº 1-nº 26 de la SEC ID Nº: 5 comprenden una parte del oligonucleótido nº 1 y los nucleótidos nº 103

– nº 128 comprenden una parte del complemento inverso del oligonucleótido nº 2 utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 para iniciar la reacción de amplificación, es posible que no correspondan exactamente a la secuencia real que codifica una proteína BMP-12 y, por lo tanto, no se traducen en la derivación de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 6).

El análisis de la secuencia de ADN de otro subclón indica que el producto de ADN amplificado específicamente contenido en la misma codifica una parte de otra proteína BMP/TGF-β/Vg1 (relacionada con BMP-12) de la invención denominada VL-1.

La secuencia de ADN (SEC ID Nº: 7) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº: 8) de este fragmento de ADN amplificado específicamente se muestran en el Listado de Secuencias.

Los nucleótidos nº 1 – nº 26 de la SEC ID Nº: 7 comprenden una parte del oligonucleótido nº 1 y los nucleótidos nº 103 – nº 128 comprenden una parte del complemento inverso del oligonucleótido nº 2 utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 en la iniciación de la reacción de amplificación, es posible que no correspondan exactamente a la secuencia real que codifica una proteína VL-1 de la invención y, por lo tanto, no se traducen en la derivación de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 8).

La siguiente sonda oligonucleotídica se diseña basándose en la secuencia de ADN humana de BMP-12 amplificada específicamente expuesta anteriormente (SEC ID Nº: 5) y sintetizada en un sintetizador de ADN automático:

nº 3: CCACTGCGAGGGCCTTTGCGACTTCCCTTTGCGTTCGCAC (SEC ID Nº: 20)

Esta sonda oligonucleotídica se marca radiactivamente con 32P y se emplea para explorar una biblioteca genómica humana construida en el vector λFIX (Stratagene, nº de catálogo 944201). Se cultivan 500.000 recombinantes de la biblioteca genómica humana a una densidad de aproximadamente 10.000 recombinantes por placa en 50 placas. Réplicas en nitrocelulosa duplicadas de las placas de bacteriófagos recombinantes e hibridadas con la sonda oligonucleotídica nº 3 en tampón de hibridación convencional (SHB = SSC 5X, SDS al 0,1%, Denhardt 5X, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón) se dejan a 65 ºC durante una noche. Al día siguiente, se retira la solución de hibridación que contiene oligonucleótido marcado radiactivamente y los filtros se lavan con SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 65 ºC. Se identifica un solo recombinante de hibridación positiva y se purifica en placas. Este clon de bacteriófago recombinante purificado en placa que hibrida con la sonda oligonucleotídica de BMP-12 nº 3 se denomina λHuG-48. Se prepara una solución madre en placa de bacteriófago y se aísla ADN del bacteriófago a partir del con genómico humano λHuG-48. El bacteriófago λHuG-48 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD “ATCC” con el nº de acceso 75625 el 7 de diciembre de 1993. Este depósito cumple los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes y Regulaciones expuestas en el mismo. La región de hibridación oligonucleotídica de este recombinante, λHuG-48, se localiza en un fragmento BamHI de 3,2 kb. Este fragmento se subclona en un vector plasmídico (pGEM-3) y se realiza el análisis de la secuencia de ADN. Este subclón plasmídico se denomina PCR1-1#2 y se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD “ATCC” con el nº de acceso 69517 el 7 de diciembre de 1993. Este depósito cumple los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes y las Regulaciones expuestas en el mismo. La secuencia de ADN parcial (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº: 2) del inserto de ADN de 3,2 kb del subclón plasmídico PCR1-1#2, derivada del clon λHuG-48, se muestran en la Lista de Secuencias.

Debe indicarse que los nucléotidos nº 639 – nº 714 de la SEC ID Nº: 1 corresponden a los nucleótidos nº 27 – nº 102 del fragmento de ADN que codifica BMP-12 amplificado específicamente expuesto en la SEC ID Nº: 5, confirmando de esta manera que el clon del bacteriófago genómico humano λHuG-48 y el subclón derivado PCR1-1#2 codifican al menos una parte de la proteína BMP-12 de la invención. La secuencia de nucleótidos de una parte del inserto BamHI de 3,2 kb del plásmido PCR1-1#2 contiene un marco de lectura abierto de al menos 882 pares de bases, como se define por los nucleótidos nº 1-nº 882 de la SEC ID Nº: 1. Este marco de lectura de abierto codifica al menos 294 aminoácidos de la proteína BMP-12 humana de la invención. La proteína BMP-12 humana de 294 aminoácidos codificada incluye la proteína BMP-12 humana madura completa (aminoácidos nº 1-nº 104 de la SEC ID Nº: 2) así como la parte C-terminal de la región del propéptido del producto de traducción primario (aminoácido nº -190 anº -1 de laSEC ID Nº: 2).

Otra secuencia de ADN del inserto BamHI de 3,2 kb del plásmido PCR1-1#2 expuesto en la SEC ID Nº: 33 demuestra la presencia de un marco de lectura abierto de 1164 pb, como se define por los nucleótidos nº 138 a nº 1301 de la SEC ID Nº 33. [OBSÉRVESE que toda la secuencia desvelada en la SEC ID Nº: 1 está contenida dentro la SEC ID Nº: 33]. Como esta secuencia procede de un clon genómico, es difícil determinar el límite entre el extremo 5’ de la secuencia codificante y el límite 3’ de la secuencia intermedia (secuencia de intrón/no codificante).

Basándose en el conocimiento de otras proteínas BMP y otras proteínas dentro de la familia de TGF-β, se prevé que el polipéptido precursor se escindiría en la secuencia mutibásica Arg-Arg-Gly-Arg de acuerdo con una secuencia de procesamiento proteolítico consenso propuesta de Arg-X-X-Arg. Es de esperar que la escisión del polipéptido precurso de BMP-12 genere un péptido maduro de 104 aminoácidos que empieza con el aminoácido Ser en la posición nº 1 de la SEC ID Nº: 2. Se espera que el procesamiento de BMP-12 en la forma madura implique la dimerización y eliminación de la región N terminal de una manera análoga al procesamiento de la proteína relacionada TGF-β [Gentry y col., Molec & Cell. Biol., 8: 4162 (1988); Derynck y col. Nature, 316: 701 (1985)].

Por lo tanto, se contempla que la especie activa madura de BMP-12 comprende un homodímero de dos subunidades polipeptídicas, comprendiendo cada subunidad los aminoácidos nº 1 a nº 104 de la SEC ID Nº: 2 con un peso molecular previsto de aproximadamente 12.000 daltons. Se contemplan otras especies activas que comprenden al menos los aminoácidos nº 3 a nº 103 de la SEC ID Nº: 2, incluyendo de esta manera el primer y el último resto de cisteína conservado. Como ocurre con otros miembros de la familia de proteínas TGF-β/BMP, la parte carboxi-terminal de la proteína BMP-12 presenta una mayor conservación de secuencia que la parte más próxima al extremo amino. El porcentaje de identidad de aminoácidos de la proteína BMP-12 humana en el dominio C-terminal rico en cisteína (aminoácidos nº 3 – nº 104) con la región correspondiente de las proteínas BMP humanas y otras proteínas dentro de la familia de TGF-β es la siguiente: BMP-2, 55%; BMP-3, 43%; BMP-4, 53%; BMP-5, 49%; BMP-6, 49%; BMP-7, 50%; BMP-8, 57%; BMP-9, 48%; BMP-10, 57%; activina WC (BMP-11), 38%; Vgl, 46%; GDF-1, 47%; TGF-β1, 36%; TGF-β2, 36%; TGF-β3, 39%; inhibina β(B), 36%; inhibina β(A), 41%.

La secuencia de ADN de BMP-12 humana (SEC ID Nº: 1), o una parte de la misma, puede usarse como sonda para identificar una línea celular humana o tejido que sintetiza ARNm de BMP-12. En resumen, se extrae ARN de una fuente celular o tisular seleccionada y se somete a electroforesis en un gel de agarosa-formaldehído y se transfiere a nitrocelulosa, o se hace reaccionar con formaldehído y se aplica puntualmente sobre nitrocelulosa directamente. Después, la nitrocelulosa se hibrida con una sonda derivada de la secuencia codificante de BMP-12 humana.

Como alternativa, la secuencia de BMP-12 humana se usa para diseñar cebadores oligonucleotídicos que amplificarán específicamente una parte de la secuencia codificante de BMP-12 localizada en la región entre los cebadores utilizados para realizar la reacción de amplificación específica. Se contempla que estos cebadores derivados de BMP-12 humana permitirían amplificar específicamente secuencias codificantes de BMP-12 correspondientes a partir de moldes de ARNm, ADNc o ADN genómico. Una vez que se ha identificado una fuente positiva por uno de los procedimientos descritos anteriormente, se selecciona ARNm por cromatografía de oligo (dT) celulosa y se sintetiza ADNc y se clona en λgt10 u otros vectores del bacteriófago λ conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, λZAP por técnicas establecidas (Toole y col., mencionado anteriormente). También es posible realizar la reacción de amplificación dirigida a cebador oligonucleotídico, descrita anteriormente, directamente en una biblioteca de ADNc o genómica humana preestablecida que se ha clonado en un vector del bacteriófago λ. En estos casos, podría explorarse directamente una biblioteca que produce un producto de ADN amplificado específicamente que codifica una parte de la proteína BMP-12 humana, utilizando el fragmento de ADN que codifica BMP-12 amplificada como sonda.

Se predice que los cebadores oligonucleotídicos diseñados basándose en la secuencia de ADN del clon genómico de BMP-12 humana λHuG-48 permiten la amplificación específica de secuencias de ADN que codifican BMP-12 humana a partir de bibliotecas de ADNc humano preestablecidas que están disponibles en el mercado (es decir, Stratagene, La Jolla, CA o Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). El siguiente cebador oligonucleotídico se diseña basándose en los nucleótidos nº 571 a nº 590 de la secuencia de ADN expuesta en la SEC ID Nº: 1 y se sintetiza en un sintetizador de ADN automático:

nº 4: TGCGGATCCAGCCGCTGCAGCCGCAAGCC (SEC ID Nº: 21)

Los nueve primeros nucleótidos del cebador nº 4 (subrayados) comprenden la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI que puede usarse para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente que codifica la proteína BMP-12 humana de la invención y, por lo tanto, no derivan de la secuencia de ADN presentada en la SEC ID Nº: 1. El siguiente cebador oligonucleotídico se diseña basándose en los nucleótidos nº 866 – nº 885 de la secuencia de ADN expuesta en la SEC ID N: 1 y se sintetiza en un sintetizador de ADN automático.

nº 5 GACTCTAGACTACCTGCAGCCGCAGGCCT (SEC ID Nº: 22)

Los nueve primeros nucleótidos del cebador nº 5 (subrayados) comprenden la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción XbaI que puede usarse para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente que codifica la proteína BMP-12 humana de la invención y, por lo tanto, no proceden de la secuencia de ADN presentada en la SEC ID Nº: 1.

Los símbolos de nucleótidos convencionales en los cebadores identificados anteriormente son los siguientes: A, adenina; C, citosina; G, guanina; T, timina.

Los cebadores nº 4 y nº 5 identificados anteriormente se utilizan como cebadores para permitir la amplificación de una secuencia de nucleótidos que codifica BMP-12 específica a partir de bibliotecas de ADNc preestablecidas que pueden incluir las siguientes: ADNc de cerebro fetal humano/λZAPII (Stratagene, nº de catálogo 936206), hígado humano/λUNI-ZAP XR (Stratagene, nº de catálogo 937200), pulmón humano/λUNI-ZAP XR (Stratagene, nº de catálogo 937206) y bazo fetal humano/UNI-ZAP XR (Stratagene, nº de catálogo 937205).

Aproximadamente 1 x 108 ufp (unidades formadoras de placas) de bibliotecas de bacteriófago λ que contienen insertos de ADNc humanos tales como los detallados anteriormente se desnaturalizan a 95 ºC durante cinco minutos antes de la adición a una mezcla de reacción que contiene 200 µM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gelatina al 0,001%, 1,25 unidades de ADN polimerasa Taq, una concentración 100 pM de cebador oligonucleotídico nº 4 y una concentración 100 pM de cebador oligonucleotídico nº 5. La mezcla de reacción después se somete a ciclos términos de la siguiente manera: 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 50 ºC, 1 minuto a 72 ºC durante treinta y nueve ciclos, seguido de 10 minutos a 72 ºC.

Sería de esperar que el ADN que se amplifica específicamente por esta reacción generara un producto codificante de BMP-12 de aproximadamente 333 pares de bases, cuyas 315 pb internas corresponden a los nucleótidos nº 571 a nº 885 de la SEC ID Nº: 1 y que también incluyen 9 pb en cada extremo del fragmento específico de BMP-12 que corresponden a los sitios de restricción definidos por los nucleótidos nº 1 – nº 9 de los cebadores nº 4 y nº 5. El producto de ADN de 333 pb resultante se digiere con las endonucleasas de restricción BamHI y Xbal, se extrae con fenol, se extrae con cloroformo y se precipita con etanol.

Como alternativa a la precipitación con etanol, se realiza intercambio de tampón y extracción de fragmentos pequeños de ADN resultante de la digestión de restricción con BamHI/XbaI por dilución del producto de ADN digerido en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM seguido de centrifugación a través de un microconcentrador Centricon™ 30 (W.R. Grace & Co., Beverly, MA; nº de producto 4209). El producto de ADN amplificado digerido con BamHI/Xbal resultante se subclona en un vector plasmídico (es decir, pBluescript, pGEM-3 etc.) entre los sitios BamHI y XbaI de la región de poliengarce. Se necesitaría el análisis de la secuencia de ADN de los subclones resultantes para confirmar la integridad del inserto codificante de BMP-12. Una vez que se ha identificado una fuente de ADNc positiva de esta manera, podría explorarse directamente la biblioteca de ADNc correspondiente a partir de la cual se amplificó una secuencia específica de BMP-12 de 333 pb con el inserto de 333 pb u otras sondas específicas de BMP-12 para identificar y aislar clones de ADNc que codifiquen la proteína de BMP-12 de longitud completa de la invención.

Pueden usarse otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia para aislar otros ADNc de longitud completa que codifiquen proteínas relacionadas con BMP-12 humanas, o clones de ADNc de longitud completa que codifiquen proteínas relacionadas con BMP-12 de la invención de especies distintas de seres humanos, particularmente otras especies de mamífero.

Los siguientes ejemplos demuestran el uso de la secuencia de BMP-12 humana para aislar homólogos de proteínas relacionadas con BMP-12 en una biblioteca de ADN genómico murino.

Se predice que la secuencia de ADN que codifica la proteína BMP-12 humana de la invención es significativamente homóloga a BMP-12 y secuencias relacionadas con BMP-12 de especies distintas de seres humanos, de tal forma que podría utilizarse para amplificar específicamente secuencias de ADN de esas otras especies que codifiquen las proteínas relacionadas con BMP-12 correspondientes. Específicamente, los siguientes oligonucleótidos se diseñan basándose en la secuencia de BMP-12 humana (SEC ID Nº: 1) y se sintetizan en un sintetizador de ADN automático:

nº 6: GCGGATCCAAGGAGCTCGGCTGGGACGA (SEC ID Nº: 23)

nº 7: GGAATTCCCCACCACCATGTCCTCGTAT (SEC ID Nº: 24)

Los ocho primeros nucleótidos de los cebadores oligonucleotídicos nº 6 y nº 7 (subrayados) comprenden la secuencia de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHI y EcoRI, respectivamente. Estas secuencias se utilizan para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente que codifica BMP-12 o una proteína relacionada con BMP-12 de una especie distinta del ser humano y, por lo tanto, no derivada de la secuencia de ADN presentada en la SEC ID Nº: 1. El cebador oligonucleotídico nº 6 se diseña basándose en los nucleótidos nº 607-nº 626 de la SEC ID Nº: 1. El cebador oligonucleotídico nº 7 se diseña basándose en el complemento inverso de los nucleótidos nº 846-nº 865 de la secuencia de ADN expuesta en la SEC ID Nº: 1.

Los cebadores oligonucleotídicos nº 6 y nº 7 identificados anteriormente se utilizan como cebadores para permitir la amplificación de secuencias relacionadas con BMP-12 específicas a partir de ADN genómico derivado de especies distintas de seres humanos. La reacción de amplificación se realiza como se indica a continuación:

Se corta ADN genómico (fuente: cepa Balb c) por pase repetido a través de una aguja de calibre 25, se desnaturaliza a 100 ºC durante cinco minutos y después se enfría en hielo antes de la adición a una mezcla de reacción que contiene una concentración 200 µM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gelatina al 0,001%, 1,25 unidades de ADN polimerasa Taq, una concentración 100 pM de cebador oligonucleotídico nº 6 y una concentración 100 pM de cebador oligonucleotídico nº 7. Después, la mezcla de reacción se somete a ciclos térmicos de la siguiente manera: 1 minuto a 95 ºC, 1 minuto a 55 ºC, 1 minuto a 72 ºC durante cuarenta ciclos, seguido de 10 minutos a 72 ºC.

El ADN que se amplifica específicamente por esta reacción se precipita con etanol, se digiere con las endonucleasas de restricción BamHI y EcoRI y se somete a electroforesis en gel de agarosa. Una región del gel, que corresponde al tamaño previsto del fragmento de ADN que codifica BMP-12 murina o una proteína relacionada con BMP-12, se escinde y los fragmentos de ADN amplificados específicamente contenidos en el gel se extraen (por electroelución o por otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia) y se subclona en un vector plasmídico, tal como pGEM-3 o pBluescript entre los sitios BamHI y EcoRI del poliengarce. El análisis de la secuencia de ADN de uno de los subclones resultantes, denominado mV1, indica que la secuencia de ADN amplificada específicamente contenida en su interior codifica una parte de una proteína que parece ser el homólogo murino de la secuencia de BMP-12 o VL-1 de la invención. La secuencia de ADN (SEC ID Nº: 10) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº: 11) de este fragmento de ADN murino amplificado específicamente se muestran en el listado de secuencias.

Los nucleótidos nº 1-nº 26 de la SEC ID Nº: 10 comprenden una parte de oligonucleótido. El nucleótido nº 6 y los nucleótidos nº 246-nº 272 comprenden una parte del complemento inverso del oligonucleótido nº 7 utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. El nucleótido nº 27 de la SEC ID Nº: 10 parece ser el último nucleótido de un triplete de codón, y los nucleótidos nº 244-nº 245 de la SEC ID Nº: 10 parecen ser los dos primeros nucleótidos de un triplete de codón. Por lo tanto, los nucleótidos nº 28 a nº 243 de la SEC ID Nº: 10 corresponden a una secuencia codificante parcial de mV1. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 6 y nº 7 en la iniciación de la reacción de amplificación, pueden no corresponder exactamente a la secuencia real que codifica el homólogo murino a la proteína BMP-12 humana o VIL-1 de la invención y, por lo tanto, pueden no traducirse en la derivación de secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 11).

Los expertos en la materia pueden utilizar sondas oligonucleotídicas diseñadas basándose en la secuencia de ADN de BMP-12 o VL-1 murina amplificada específicamente expuesta en la SEC ID Nº: 10 para identificar clones codificantes de BMP-12 o VL-1 murinas de longitud completa (ADNc o genómico).

El análisis de la secuencia de ADN de otro de los subclones resultantes, denominado mV2, indica que la secuencia de ADN amplificada específicamente contenida en su interior codifica una parte de una secuencia relacionada con *BMP-12 murina de la invención. La secuencia de ADN (SEC ID Nº: 12) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº: 13) de este fragmento de ADN murino amplificado específicamente se muestran en el listado de secuencias.

Los nucleótidos nº 1-nº 26 de la SEC ID Nº: 12 comprenden una parte del oligonucléotido nº 6 y los nucleótidos nº 246-nº 272 comprenden una parte del complemento inverso del 31 oligonucleótido nº 7 utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. El nucleótido 27 de la SEC ID Nº: 12 parece ser el último nucleótido de un triplete de codón, y los nucleótidos nº 244-nº 245 de la SEC ID Nº: 12 parecen ser los dos primeros nucleótidos de un triplete de codón. Por lo tanto, los nucleótidos nº 28 a nº 243 de la SEC ID Nº: 12 corresponden a una secuencia codificante parcial de mV2. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 6 y nº 7 en la iniciación de la reacción de amplificación, pueden no corresponder exactamente a la secuencia real que codifica la proteína relacionada con BMP-12 murina de la invención y, por lo tanto, no se traducen en la derivación de secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 13).

Las sondas oligonucleotídicas diseñadas basándose en la secuencia de ADN relacionada con BMP-12 murina amplificada específicamente expuesta en la SEC ID Nº: 12 pueden utilizarse por los expertos en la materia para identificar clones que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 murina de longitud completa (ADNc o genómico).

El análisis de la secuencia de ADN de otro de los subclones resultantes denominado mV9 indica que la secuencia de ADN amplificada específicamente contenida en su interior codifica una parte de una secuencia relacionada con BMP-12 murina de la invención. Esta secuencia parece ser el homólogo murino de la secuencia de ADN de BMP52 descrita en la SEC ID Nº: 3. La secuencia de ADN (SEC ID Nº. 14) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº: 15) de este fragmento de ADN murino amplificado específicamente se muestran en el listado de secuencias.

Los nucleótidos nº 1-nº 26 de la SEC ID Nº: 14 comprenden una parte del oligonucleótido nº 6 y los nucleótidos nº 246-nº 272 comprenden una parte del complemento inverso del oligonucleótido nº 7 utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. El nucleótido nº 27 de la SEC ID Nº: 14 parece ser el último nucleótido de un triplete de codón, y los nucleótidos nº 244-nº 245 de la SEC ID Nº. 14 parecen ser los dos primeros nucleótidos de un triplete de codón. Por lo tanto, los nucleótidos nº 28 a nº 243 de la SEC ID Nº: 14 corresponden a una secuencia codificante parcial de mV9. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 6 y nº 7 en la iniciación de la reacción de amplificación, pueden no corresponder exactamente a la secuencia real que codifica la proteína relacionada con BMP-12 murina de la invención y, por lo tanto, no traducirse en la derivación de secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 15).

Los expertos en la materia pueden utilizar sondas oligonucleotídicas diseñadas basándose en la secuencia de ADN relacionada con BMP-12 murina amplificada específicamente expuesta en la SEC ID Nº: 14 para identificar clones que codifican proteína relacionada con BMP-12 murina de longitud completa (ADNc o genómico).

Como alternativa, se utilizan cebadores oligonucleotídicos nº 6 y nº 7 identificados anteriormente como cebadores para permitir la amplificación específica de una sonda de ADN de 275 pares de bases, de la que 259 pb internos corresponden a los nucleótidos nº 607 a nº 865 de la SEC ID Nº: 1 del subclón del plásmido codificante de BMP-12 PCR1-1#2. Esta sonda de ADN de 275 pb se marcó radiactivamente con 32P y se empleó para explorar una biblioteca genómica murina construida en el vector X FI XX (Stratagene, nº de catálogo 946306). 1 millón de recombinantes de la biblioteca genómica murina se cultivan a una densidad de aproximadamente 20.000 recombinantes por placa en 50 placas. Se hibridan réplicas en nitrocelulosa duplicadas de las placas de bacteriófago recombinante en condiciones de rigurosidad reducida, con sonda de 333 pb amplificada específicamente en tampón de hibridación convencional (SHB = SSC 5X, SDS al 0,1%, Denhardt 5X, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón) a 60 ºC durante una noche. Al día siguiente se retira la solución de hibridación que contiene oligonucleótido marcado radiactivamente y los filtros se lavan, en condiciones de rigurosidad reducida, con SSC 2X, SDS al 0,1% a 60 ºC. Se identifican múltiples recombinantes de hibridación positiva y se purifican en placa. Los fragmentos de los clones recombinantes genómicos murinos de hibridación positiva se subclonan en vectores plasmídicos convencionales (es decir, pGEM-3) y se someten a análisis de la secuencia de ADN.

El análisis de la secuencia de ADN de uno de estos subclones denominado MvR3 indica que codifica una parte del gen de ratón correspondiente al producto de PCR mV1 (homólogo murino de la secuencia de BMP-12 humana expuesta en la SEC ID Nº: 1) descrita anteriormente. La secuencia de ADN parcial de este subclón y la traducción en aminoácidos correspondiente se exponen en la SEC ID Nº: 29 y SEC ID Nº: 30, respectivamente.

El análisis de la secuencia de ADN de otro de estos subclones denominado MVR32 indica que codifica una parte del gen de ratón correspondiente al producto de PCR mV2 (homólogo murino de la secuencia de VL-1 humana expuesta en la SEC ID Nº: 7) descrito anteriormente. La secuencia de ADN parcial de este subclón y 33 la traducción de aminoácidos correspondiente se exponen en las SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32 respectivamente.

El análisis de la secuencia de ADN de otro de estos subclones denominado MVR23 indica que codifica una parte del gen de ratón correspondiente al producto de PCR mV9 (homólogo murino de la secuencia de MP-52 expuesta en la SEC ID Nº: 3) descrita anteriormente.

De una manera similar a lo que se ha descrito anteriormente para identificar y aislar clones genómicos humanos que codifican la proteína BMP-12 de la invención, pueden diseñarse sondas oligonucleotídicas correspondientes a la secuencia codificante de VL-1 expuesta en la SEC ID Nº: 7 y utilizarse para identificar secuencias genómicas o de ADNc humanas que codifican la proteína VL-1 (BMP-13). Estos oligonucleótidos se diseñarían para regiones específicas para secuencias codificantes de VL-1 y, por lo tanto, probablemente procederían de regiones del menor grado de identidad de secuencia de nucleótidos entre la secuencia que codifica VL-1 amplificada específicamente (SEC ID Nº: 7) y la secuencia codificante de BMP-12 amplificada específicamente (SEC ID Nº: 5).

Como alternativa, los cebadores oligonucleotídicos nº 4 y nº 5 identificados anteriormente se utilizan como cebadores para permitir la amplificación específica de una sonda de ADN de 333 pares de bases, de la que 315 pb internos corresponden a los nucleótidos nº 571 a nº 885 de la SEC ID Nº: 1, a partir del subclón de plásmido codificante de BMP-12 PCRI-1#2. Esta sonda de ADN de 333 pb se marcó radiactivamente con 32P y se empleó para explorar una biblioteca genómica humana construida en el vector XDASH II (Stratagene, nº de catálogo 945203). 1 millón de recombinantes de la biblioteca genómica humana se cultivan a una densidad de aproximadamente 20.000 recombinantes por placa en 50 placas. Se hibridan réplicas de nitrocelulosa duplicadas de las placas de bacteriófago recombinante en condiciones de rigurosidad reducida, con la sonda de 333 pb amplificada específicamente en tampón de hibridación convencional (SHB = SSC 5X, SDS al 0,1%, Denhardt 5X, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón) a 60 ºC durante una noche. Al día siguiente, se retira la solución de hibridación que contiene oligonucleótido marcada radiactivamente y los filtros se lavan, en condiciones de rigurosidad reducida, con SSC 2X, SDS al 0,1% a 60 ºC. Se identifican múltiples (aproximadamente 15) recombinantes de hibridación positiva y se purifican en placa.

Para distinguir recombinantes de hibridación positiva que codifican la proteína VL-1 de la invención de BMP-12 y otros recombinantes que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 que, según podría predecirse, hibridarían positivamente con la sonda de ADN de 333 pb generada a partir del plásmido codificante de BMP-12 PCRI-1#2 utilizado este procedimiento de exploración, se diseña la siguiente sonda oligonucleotídica basándose en la secuencia de VL-1 expuesta en la SEC ID Nº: 7, y se sintetiza en un sintetizador de ADN automático:

nº 8: TGTATGCGACTTCCCGC [SECUENCIA ID Nº: 35]

Un oligonucleótido correspondiente a los nucleótidos nº 60 a nº 76 de la SEC ID Nº: 7 que contiene 5 diferencias de nucleótidos con la región correspondiente de la secuencia codificante de BMP-12 expuesta en la SEC ID Nº: 1 (nucleótidos nº 672 a nº 689). Uno de los clones de bacteriófago recombinante que hibrida con la sonda oligonucleotídicos de VL-1 nº 8 se denomina λJLDc31. Este clon de bacteriófago recombinante se purifica en placa, se realiza una reserva de placa de bacteriófago y se aísla ADN del bacteriófago a partir del clon genómico humano λJLDc31. El bacteriófago λJLDc31 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD “ATCC” con el número de acceso nº 75922 el 20 de octubre de 1994. Este depósito satisface los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes y Regulaciones expuestas en el mismo. La región de hibridación de oligonucleótidos de este recombinante, λJLDc31, está localizada en un fragmento Eco RI de 2,5 kb. Este fragmento se subclona en un vector plasmídico (pGEM-3) y se realiza el análisis de la secuencia de ADN. Este subclón de plásmido se denomina pGEMJLDc31/2.5 y se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD “ATCC” con el número de acceso nº 69710 el 20 de octubre de 1994. Este depósito satisface los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes y Regulaciones expuestas en el mismo.

La secuencia de ADN parcial (SEC ID Nº: 25) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº: 26) de una parte del inserto de ADN de 2,5 kb del subclón plasmídico pGEMJLDc31/2.5, derivado del clon λJLDc31, se muestran en el Listado de Secuencias.

La secuencia de ADN de una parte del inserto EcoRI de 2,5 kb del plásmido pGEMJLDc31/2.5 se expone en la SEC ID Nº: 25.

Contiene un marco de lectura abierto de 912 pb, como se define por los nucleótidos nº 52 a nº 963 de la SEC ID Nº:

25. Como esta secuencia deriva de un clon genómico, es difícil determinar el límite entre el extremo 5’ de la secuencia codificante y el límite 3’ de la secuencia intermedia (secuencia de intrón/no codificante). La fase de lectura abierta entera (nucleótidos nº 52 a nº 963 de la SEC ID Nº: 25) codifica una parte de la proteína VL-1 de la invención de hasta 304 aminoácidos.

Basándose en el conocimiento de otras proteínas BMP y otras proteínas dentro de la familia de TGF-β, se predice que el polipéptido precursor se escindiría en la secuencia multibásica Arg-Arg-Arg-Arg de acuerdo con una secuencia de procesamiento proteolítico consenso Arg-X-X-Arg. Es de esperar que la escisión del polipéptido precursor de VL-1 genere un péptido maduro de 120 aminoácidos que empieza con el aminoácido Thr en la posición nº 1 de la SEC ID Nº: 26. Es de esperar que el procesamiento de VL-1 en la forma madura implique la dimerización y eliminación de la región N-terminal de una manera análoga al procesamiento de la proteína relacionada con TGF-β [Gentry y col., Molec & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck y col. Nature, 316:701 (1985)].

Por lo tanto, se contempla que la especie activa madura de VL-1 comprende un homodímero de dos subunidades polipeptídicas, comprendiendo cada subunidad los aminoácidos nº 1 a nº 120 de la SEC ID Nº: 26 con un peso molecular previsto de aproximadamente 12.000 daltons. Se contemplan otras especies activas que comprenden al menos los aminoácidos nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 26, incluyendo de esta manera el primer y el último restos de cisteína conservados.

Usando dicho procedimiento, se obtuvo un clon que codificaba la VL-1 humana madura (BMP-13). La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondientes codificadas por este clon se presentan en el Listado de Secuencias en las SEC ID Nº: 25 y 26, respectivamente.

Ejemplo 2

Expresión de BMP-12

Para producir proteínas BMP-12 humanas, el ADN que las codifica se transfiere a un vector de expresión apropiado y se introduce en células de mamífero u otros huéspedes eucariotas o procariotas preferidos por técnicas de ingeniería genética convencionales.

Para producir a producir la proteína BMP-12 humana en células bacterianas, se emplea el siguiente procedimiento.

Expresión de BMP-12 en E. coli

Se construyó un plásmido de expresión pALV1-781, para la producción de BMP-12 en E. coli, que contiene las siguientes características principales. Los nucleótidos 1-2060 contienen secuencias de ADN procedentes del plásmido pUC-18 [Norrander y col., Gene 26: 101-106 (1983)] incluyendo secuencias que contienen el gen para la βlactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina en cepas de E. coli huésped, y un origen de replicación derivado de colel. Los nucleótidos 2061-2221 contienen secuencias de ADN para el promotor a la izquierda principal (pL) del bacteriófago λ [Sanger y col., J. Mol. Biol. 162: 729-773 (1982)], incluyendo, tres secuencias operadoras OL1, OL2 y OL3. Los operadores son los sitios de unión para la proteína represora λcI, cuyos niveles intracelulares controlan la cantidad de iniciación de la transcripción a partir de pL. Los nucleótidos 2222-2723 contienen una secuencia de unión a ribosomas fuerte incluida en una secuencia procedente de los nucleótidos 35566 a 35472 y 38137 a 38361 del bacteriófago lambda como se describe en Sanger y col., J. Mol. Biol. 162: 729-773 (1982). Los nucleótidos 2724-3041 contienen una secuencia de ADN que codifica la proteína BMP-12 madura con toda la secuencia 3’ no traducida retirada. Las secuencias de ADN de BMP-12 introducidas en el vector de expresión pALV1-781 se modificaron en el extremo 5’ para elevar el contenido de A+T sin alterar la capacidad codificante. Estos cambios se realizaron para aumentar la eficacia de la traducción iniciada en el ARNm del BMP-12 en E. coli. Los nucleótidos 3042-3058 proporcionan una secuencia de ADN de “engarce” que contiene sitios de endonucleasas de restricción. Los nucleótidos 3059-3127 proporcionan una secuencia de terminación de la transcripción basada en la del gen de asp A de E. coli [Takagi y col., Nucl. Acids Res. 13:2063-2074 (1985)]. Los nucleótidos 3128-3532 son secuencias de ADN derivadas de pUC-18.

El plásmido pALV1-781 se utilizó para transformar la cepa huésped E. coli G1724 (F, lacIq, lacpL8, ampC:: λcI+) por el procedimiento de Dagert y Ehrlich, Gene 6:23 (1979). GI724 (ATCC, nº de acceso 55151) contiene una copia del gen represor de λcI de tipo silvestre integrado de forma estable en el cromosoma en el locus ampC, donde se ha colocado bajo control transcripcional de las secuencias de promotor/operador de trp de Salmonella typhimurium. En GI724, la proteína λCI se obtiene únicamente durante el crecimiento en medio sin triptófano, tal como medio mínimo

o un medio mínimo suplementado con casaminoácidos tales como IMC, descrito anteriormente. La adición de triptófano a un cultivo de GI724 reprimirá el promotor de trp e inactivará la síntesis de λcI, causando gradualmente la inducción de la transcripción a partir de promotores de pL si están presentes en la célula.

Se seleccionaron transformantes en placas de agar al 1,5% p/v que contenían medio IMC, que está compuesto de medio M9 [Miller, “Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] que contiene MgSO4 1 mM y suplementado con glucosa al 0,5% p/v, casaminoácidos al 0,2% p/v y 100 µg/ml de ampicilina. Se cultivó GI724 transformado con pALV1-781 a 37 ºC a una A550 de 0,5 en medio IMC que contenía 100 µg/ml de ampicilina. Después se añadió triptófano a una concentración final de 100 µg/ml y el cultivo se incubó durante 4 horas más. Durante este tiempo, la proteína BMP-12 se acumula dentro de la fracción de “cuerpos de inclusión”.

Preparación de monómero de proteína

Se pesaron 18 g de células congeladas y se resuspendieron en 60 ml de Tris 100 mM, EDTA 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF], 1 mM, pH 8,3. Las células se lisaron por 3 pases a través de un Microfluidizer™ [modelo nº MCF 100 T]. El sedimento de cuerpos de inclusión se obtuvo por centrifugación a 15.000 g a 4 ºC durante 20 minutos. El sobrenadante se decantó y el sedimento se lavó con 100 ml de Tris 100 mM, NaCl 1,0 M, EDTA 10 mM, PMSF 1 mM, pH 8,3. La suspensión se centrifugó de nuevo a 15.000 g a 4 ºC durante 10 minutos y el sobrenadante se decantó. Después, el sedimento se lavó con 100 ml de Tris 100 mM, EDTA 10 mM, Triton X-100 al 1%, PMSF 1 mM, pH 8,3. La suspensión se centrifugó de nuevo a 15.000 g a 4 ºC durante 10 minutos y el sobrenadante se decantó. El sedimento se resuspendió con 50 ml de Tris 20 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pH 8,3, que contenía DTT al 1% en un homogeneizador de tejidos de vidrio. Después, la BMP-12 monomérica se solubilizó por acidificación a pH 2,5 con ácido acético glacial. La fracción soluble se aisló por centrifugación a 15.000 g durante 20 minutos a 4 ºC.

El sobrenadante de esta centrifugación se recogió y se cromatografió en una columna de exclusión molecular Sephacryl S-100™ (83 cm x 2,6 cm; lecho ≈440 ml) en incrementos de 20 ml. La columna de Sephacryl S-100™ se procesó con una fase móvil de ácido acético al 1% a un caudal de 1,4 ml/min. Las fracciones correspondientes al monómero de BMP-12 se detectaron por absorbancia a 280 nm y usando un ordenador se calculó un coeficiente de extinción de 18200 M-1 m-1 y un peso molecular (11667 daltons). El material reunido en la columna de exclusión molecular se usó como material de partida para reacciones de replegamiento.

Como alternativa a lo anterior, se miden 1,0 g de células almacenadas a -80 ºC. Se añade solución (3,4 ml de TRIS 100 mM, EDTA 10 mM, pH 8,5). La solución se somete a agitación vorticial hasta que las células se suspenden bien. Se añaden 40 µl de PMSF 100 mM en isopropanol. Las células se lisan a 6,89 MPa (1000 psi) en una celda de presión French. Los cuerpos de inclusión se centrifugan a 4 ºC durante 20 minutos en una microcentrífuga Eppendorf para formar sedimentos. Los sobrenadantes se decantan. A un sedimento (de 4 en total) se le añaden 1,0 ml de clorhidrato de guanidina 8,0 M desgasificado, TRIS 0,5 M, EDTA 5 mM, pH 8,5, que contiene DTT 250 mM. El sedimento se disuelve y se insufla argón sobre el líquido durante 30 segundos. A continuación, la solución se incuba a 37 ºC durante una hora. El material insoluble se sedimenta durante 2-3 minutos en una microcentrífuga Eppendorf a 23 ºC. Se inyectan 0,5-1,0 ml de sobrenadante en un cartucho auxiliar Supelco 2 cm (LC-304) y se eluye con un gradiente de acetonitrilo en TFA al 0,1% del 1-70% durante 35 minutos. La BMP-12 eluye entre 29 y 31 minutos. Las fracciones se reúnen y la concentración de proteína se determina por absorbancia a 280 nanómetros frente a TFA al 0,1%, usando el coeficiente de extinción teórico basado en el contenido de aminoácidos.

Como segundo procedimiento alternativo al anterior, se descongelan sedimentos de células congelados obtenidos a partir de los transformantes de E. coli como se ha descrito anteriormente en 30 ml de tampón TE8.3 (100:10) (Tris-HCl 100 mM pH 8,3, Na2EDTA 10 mM, PMSF 1 mM). Las células se lisan por tres pases a través de un Microfluidizer™ [modelo nº MCF 100 T]. El sedimento de material de cuerpos de inclusión inicial se disuelve en HClguanidina 8 M, tampón TE8.5 (100:10) (Tris-HCl 100 mM, pH 8,5, Na2EDTA 10 mM que contenía DTT 100 mM) y se incuba a 37 ºC durante 1 hora. Este material se centrifuga a 12.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Replegamiento de la proteína BMP-12 usando el sistema CHAPS

Se liofiliza un volumen suficiente de reserva de BMP-12 para dar 10 µg de proteína. Se añaden 5 µl de agua destilada en alambique de vidrio para redisolver el residuo, y después se añaden 100 µl de mezcla de replegamiento

– (Tris 50 mM, NaCl 1,0 M, 1-propano-sulfonato de 3-(3-cloramidopropil)dimetilamonio (CHAPS) al 2%, EDTA 5 mM, glutatión 2 mM (reducido), glutatión 1 mM (oxidado); a pH de aproximadamente 8,5). La solución se mezcla suavemente y se almacena a 23 ºC durante 1-4 días. La formación de dímeros se evalúa por procesamiento de una alícuota en un gel de tricina Novex al 16% a 125 voltios durante 2,5 horas, seguido de tinción con Azul de Coomassie y destinción.

El dímero de BMP-12 se purificó usando una columna C4 de RP-HPLC analítica (cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa) (Vydac 214TP54) que se equilibrió hasta Tampón B al 1% (diluido en tampón A) y se procesó durante 35 minutos, tiempo durante el cual la proteína eluye, usando el siguiente gradiente (tampón A = ácido trifluoroacético al 0,1%, tampón B = acetonitrilo a 95%, ácido trifluoroacético [TFA] al 0,1% con un caudal de 1 ml/min:

1-5 minutos de tampón B al 20% 5-10 minutos de tampón B al 20-30% 10-30 minutos de tampón B al 30-50% 30-35 minutos de tampón B al 50-100%

La proteína se monitorizó por absorbancia a 280 nm. Se reunieron fracciones pico de BMP-12 (que eluían entre 29 y 31 minutos). La pureza se evaluó por SDS-PAGE. La concentración se determinó por absorbancia a 280 nm, y usando el coeficiente de extinción calculado por ordenador y peso molecular indicados anteriormente.

Expresión de BMP-12 en células de mamífero

Otro sistema de expresión preferido contemplado para BMP-12 humana recombinante biológicamente activa es células de mamífero transformadas de forma estable.

Un experto en la materia puede construir vectores de expresión de mamífero empleando la secuencia de la SEC ID Nº 1 u otras secuencias de ADN que codifican proteínas BMP-12 u otras secuencias modificadas y vectores conocidos, tales como pCD [Okayama y col., Mol. Cell Biol., 2: 161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough y col., EMBO J.,

4: 645-653 (1985)] y pMT2 CXM.

El vector de expresión de mamífero pMT2 CXM es un derivado de p91023(b) (Wong y col., Science 228: 810-815, 1985) que difiere de este último en que contiene el gen de resistencia a ampicilina en lugar del gen de resistencia a tetraciclina y contiene además un sitio XhoI para la inserción de clones de ADNc. Se han descrito los elementos funcionales de pMT2 CXM (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689-693) e incluyen los genes VA de adenovirus, el origen de replicación de SV40 que incluye el potenciador de 72 pb, el promotor tardío principal de adenovirus que incluye un sitio de corte y empalme 5’ y la mayor parte de la secuencia líder tripartita de adenovirus presente en ARNm tardíos de adenovirus, un sitio aceptor de corte y empalme 3’, un inserto de DHFR, el sitio de poliadenilación temprano de SV40 (SV40) y secuencias de pBR322 necesarias para la propagación en E. coli.

El plásmido pMT2 CXM se obtiene por digestión con EcoRI de pMT2-VWF, que se ha depositado con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD (USA) con el número de acceso ATCC 67122. La digestión con EcoRI escinde el inserto de ADNc presente en pMT2-VWF, produciendo pMT2 en forma lineal que puede ligarse y usarse para transformar E. coli HB 101 o DH-5 en bacterias con resistencia a ampicilina. El ADN del plásmido pMT2 puede prepararse por procedimientos convencionales. Después se construye pMT2 CXM usando mutagénesis loopout/in [Morinaga, y col., Biotechnology 84: 636 (1984). Esto elimina las bases 1075 a 1145 con respecto al sitio Hind III cerca del origen de replicación de SV40 y las secuencias potenciadoras de pMT2. Además, inserta una secuencia que contiene el sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Xho I. Un derivado de pMT2CXM, denominado pMT23, contiene sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción PstI, Eco RI, SalI y XhoI. El ADN del plásmido pMT2 CXM y pMT23 puede prepararse por procedimientos convencionales.

pEMC2β1 derivado de pMT21 también puede ser adecuado en la puesta en práctica de la invención. pMT21 procede de pMT2 que procede de pMT2-VWF. Como se ha descrito anteriormente, la digestión con EcoRI escinde el inserto de ADNc presente en pMT-VWF, produciendo pMT2 en forma lineal que puede ligarse y usarse para transformar E. coli HB 101 o DH-5 en bacterias con resistencia a ampicilina. El ADN del plásmido pMT2 puede prepararse por procedimientos convencionales.

pMT21 procede de pMT2 mediante las dos siguientes modificaciones. En primer lugar, se delecionan 76 pb de la región 5’ no traducida del ADNc de DHFR incluyendo un tramo de 19 restos de G de la cola G/C para la clonación del ADNc. En este procedimiento, se inserta un sitio Xhol para obtener la siguiente secuencia inmediatamente cadena arriba de DHFR. En segundo lugar, se introduce un único sitio ClaI por digestión con EcoRV y Xbal, tratamiento con fragmento de Klenow de ADN polimerasa I y ligamiento a un engarce ClaI (CATCGATG). Esto deleciona un segmento de 250 pb de la región de ARN asociada a adenovirus (VAI) pero no interfiere con la expresión o función del gen de ARN VAI. pMT21 se digiere con EcoRI y XhoI y se usa para obtener el vector pEMC2B1.

Se obtiene una parte del líder de EMCV a partir de pMT2-ECAT1 [S.K. Jung, y col., J. Virol 63:1651-1660 (1989)] por digestión con Eco RI y PstI, dando como resultado un fragmento de 2752 pb. Este fragmento se digiere con TaqI produciendo un fragmento Eco RI-TaqI de 508 pb que se purifica por electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión. Se sintetiza un adaptador de 68 pb y su cadena complementaria con un extremo saliente 5’ TaqI y un extremo saliente 3' XhoI que tiene una secuencia que corresponde a la secuencia líder del virus EMC desde el nucleótido 763 al 827. También cambia ATG en la posición 10 dentro del líder del virus EMC a ATT y se continúa por un sitio Xhol. Un ligamiento de tres vías del fragmento Eco RI-XhoI de pMT21; el fragmento EcoRI-TaqI del virus EMC y el adaptador oligonucleotídico de 68 pb TaqI-XhoI da como resultado el vector pEMC2β1.

Este vector contiene el origen de replicación y potenciador de SV40, el promotor tardío principal de adenovirus, una copia de ADNc de la mayor parte de la secuencia líder tripartita de adenovirus, una pequeña secuencia intermedia híbrida, una señal de poliadenilación de SV40 y el gen del adenovirus VA I, marcadores de DHFR y β-lactamasa y una secuencia de EMC, en relaciones apropiadas para dirigir el alto nivel expresión del ADNc deseado en células de mamífero.

La construcción de vectores puede implicar la modificación de las secuencias de ADN de BMP-12. Por ejemplo, el ADNc de BMP-12 puede modificarse retirando los nucleótidos no codificantes de los extremos 5’ y 3’ de la región codificante. Los nucleótidos no codificantes delecionados pueden reemplazarse o no por otras secuencias consideradas beneficiosas para la expresión. Estos vectores se utilizan para transformar células huésped apropiadas para la expresión de proteínas BMP-12. Además, la secuencia de la SEC ID Nº: 1 u otras secuencias que codifican proteínas BMP-12 pueden manipularse para expresar la proteína BMP-12 por aislamiento de la secuencia codificante madura de los nucleótidos 571 a 882 de la SEC ID Nº: 1 y adición a las secuencias del extremo 5’ que codifican los propéptidos completos de otras proteínas BMP.

Por ejemplo, un experto en la materia puede fabricar una proteína de fusión en la que el propéptido de BMP-2 está unido de forma operativa al péptido de BMP-12 madura mediante la preparación de un vector de ADN en el que la secuencia de ADN que codifica el propéptido de BMP-2 está unida en el marco de lectura apropiado a la secuencia de ADN que codifica el péptido de BMP-12 madura. La secuencia de ADN de dicha proteína de fusión se muestra en la SECUENCIA ID Nº: 27.

Un experto en la materia puede manipular las secuencias de la SEC ID Nº: 1 eliminando o reemplazando las secuencias reguladoras de mamífero que flanquean la secuencia codificante con secuencias bacterianas para crear vectores bacterianos para la expresión intracelular o extracelular por células bacterianas, como se ha descrito anteriormente. Como otro ejemplo, las secuencias codificantes podrían manipularse adicionalmente (por ejemplo, ligarse a otros engarces conocidos o modificarse por deleción de secuencias no codificantes de las mismas o alteración de nucleótidos por otras técnicas conocidas). La secuencia codificante de BMP-12 modificada después podría insertarse en un vector bacteriano conocido usando procedimientos tales como los descritos en T. Taniguchi y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 5230-5233 (1980). Este vector bacteriano ejemplar después se podría utilizar para transformar células huésped bacterianas y expresar de esta manera una proteína BMP-12. Como estrategia para producir la expresión extracelular de proteínas BMP-12 en células bacterianas, véase, por ejemplo, la solicitud de patente europea EPA 177.343.

Pueden realizarse manipulaciones similares para la construcción de un vector de insecto [Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en la publicación de la solicitud de patente europea 155.476] para la expresión en células de insecto. También podría construirse un vector de levadura empleando secuencias reguladoras de levadura para la expresión intracelular o extracelular de los factores de la presente invención por células de levadura [Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en la publicación de la solicitud PTC WO 86/00639 y en la solicitud de patente europea EPA 123.289).

Un procedimiento para producir altos niveles de una proteína BMP-12 de la invención en células de mamífero puede implicar la construcción de células que contienen múltiples copias del gen de BMP-12 heterólogo. El gen heterólogo está unido a un marcador amplificable, por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) para el que pueden seleccionarse células que contienen más copias de genes para la propagación en concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) de acuerdo con los procedimientos de Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159:601-629 (1982). Esta estrategia puede emplearse con varios tipos celulares diferentes.

Por ejemplo, puede co-introducirse un plásmido que contiene una secuencia de ADN para una BMP-12 de la invención en asociación operativa con otras secuencias de plásmido que permiten la expresión de la misma y el plásmido de expresión de DHFR pAdA26SV(A)3 [Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol., 2: 1304 (1982)] en células CHO deficientes de DHFR, DUKX-BII, por diversos procedimientos incluyendo co-precipitación con fosfato cálcico y transfección, electroporación o fusión de protoplastos. Se seleccionan transformantes que expresan DHFR con respecto al crecimiento en medio alfa con suero bovino fetal dializado y posteriormente se seleccionan para la amplificación por crecimiento en concentraciones crecientes de MTX (por ejemplo, etapas secuenciales en MTX 0,02, 0,2, 1,0 y 5 µM) como se describe en Kaufman y col., Mol Cell Biol., 5: 1750 (1983). Los transformantes se clonan y se monitoriza la expresión de BMP-12 biológicamente activa por el ensayo en rata de Sampath-Reddi modificado por Rosen descrito más adelante en el Ejemplo 5. La expresión de BMP-12 aumentaría al aumentar los niveles de resistencia a MTX. Los polipéptidos de BMP-12 se caracterizan usando técnicas convencionales conocidas en este campo tales como el marcaje pulsátil con [35S] metionina o cisteína y electroforesis en gel de poliacrilamida. Pueden seguirse procedimientos similares para producir otras proteínas relacionadas con BMP-12.

Ejemplo 3

Preparación de fusión de propéptido de BMP-2/péptido maduro de BMP-12

Para construir un vector que codificara la fusión de propéptido de BMP-2/péptido maduro de BMP-12, se usó el siguiente procedimiento de clonación para fusionar las dos secuencias entre sí.

En primer lugar, se cortó un fragmento de enzimas de restricción de ADN que comprendía el propéptido de la proteína BMP-12 humana, que comprendía los nucleótidos 1 a 843 de la SEC ID Nº: 27, a partir de pBMP2nEMC. pBMP2nEMC es un plásmido derivado de lamba U20S-39 (ATCC nº 40345) que comprende la secuencia codificante entera de la proteína BMP-2 humana con las secuencias 5’ y 3’ no traducidas de BMP-2 delecionadas del vector. La enzima de restricción 5’ usada fue Bgl II y corta a pBMP2nEMC en el vector en el nucleótido 979. La enzima de restricción 3’ usada era Mae II y corta pBMP2n EMC en el propéptido de BMP-2 en el nucleótido 1925, cerca del extremo carboxi. El producto de 954 pares de bases resultante después se aisló en gel y se sometió a Geneclean. En segundo lugar, se cortó un fragmento de ADN de enzimas de restricción que comprendía la parte 5’ de la secuencia de ADN del péptido maduro de BMP-12 humana, a partir de pPCR1-1#2 V1-1 (ATCC nº 69517). La enzima de restricción 5’ usada fue Eae I y corta pPCRI-#12 V1-1 en posición 3’ con respecto al extremo N de la secuencia del péptido maduro de BMP-12 humana. El producto de 259 pares de bases resultante se aisló en gel y se sometió a Geneclean. En tercer lugar, se diseñaron dos oligos de ADN y se sintetizaron, de forma que cuando se hibridaran formaran un fragmento de ADN pequeño que comprendiera la secuencia de fusión del extremo 3’ del propéptido de BMP-2 humana y el extremo 5’ del péptido maduro de BMP-12. El fragmento de ADN tiene un extremo adherente complementario 5' Mae II que hibrida con el fragmento de enzimas de restricción 3’ que comprende el propéptido de BMP-12 humana. El fragmento de ADN oligo hibridado tiene un extremo adherente complementario Eae I 3’ que hibrida con el extremo 5’ del fragmento de enzimas de restricción que comprende el péptido maduro de BMP-12 humana. El oligo de la cadena codificante se denomina B2/12 y tiene 13 pares de bases de longitud. A continuación, se obtuvo un fragmento de ADN que codifica los 123 pares de bases en el extremo 3’ del fragmento del péptido maduro de BMP-12 como se indica a continuación. En primer lugar, se amplificó por PCR un fragmento de ADN que comprendía el propéptido de la proteína BMP-2 humana, que comprende los nucleótidos 1 a 846, a partir de pBMP2ΔEMC. El cebador 5’ (oligo 655a) hibrida en la posición 5’ del poliengarce. El cebador 3’ (BMPpro3) hibrida con el propéptido de BMP-2 en el extremo 3’ e introduce un sitio de enzima de restricción Bgl II por mutaciones de secuencia silenciosas. El producto de PCR resultante se cortó con Sal I, que escinde en el poliengarce, y Bgl II. El fragmento de enzimas de restricción de 850 pares de bases (que terminaba en la secuencia de aminoácidos REKR) se aisló en gel y se sometió a Geneclean. El péptido maduro de BMP-12 se amplificó por PCR usando un cebador 5’ (oligo 5-1) que codificaba el sitio de enzimas de restricción Bgl II por mutaciones de secuencia silenciosas, e hibridación con el extremo 5’ de un posible producto de escisión maduro, empezando con la secuencia de aminoácidos SCRS. El cebador 3’ (V1-1 3) hibrida con el extremo 3' del péptido maduro de BMP-12 e introduce un sitio de enzima de restricción Xba I después del codón de terminación. El producto de PCR resultante se cortó con Bgl II y Xba I. El fragmento de enzimas de restricción de 321 pares bases se aisló en gel y se sometió a Geneclean.

Los dos fragmentos de restricción se ligaron por tres vías en un vector cortado previamente con SalI y XbaI. La construcción resultante se secuenció para comprobar los errores inducidos por la PCR y se observó una mutación silenciosa de C a T en el par de bases 185 en el propéptido. Este plásmido se denominó pREKRSRC. Después, pREKRSRC se cortó con BgIII y Ngo MI, y el fragmento de vector que incluía los últimos 123 pares de bases de la secuencia madura de BMP12 se aisló de esta manera. Los tres fragmentos de restricción y el oligoengarce hibridado se ligaron por cuatro vías para producir pREKR-TAL con el propéptido de BMP-2 con el sitio de escisión maduro en el extremo 3’ fusionado al extremo 5’ (TAL) del péptido maduro de BMP-12. La secuencia codificante del vector ligado resultante se muestra en la SEC ID Nº: 27.

Ejemplo 4

Actividad biológica de BMP-12 expresada

Para medir la actividad biológica de las proteínas BMP-12 expresadas obtenidas en el Ejemplo 2 anterior, las proteínas se recuperan del cultivo celular y se purifican aislando las proteínas BMP-12 de otros materiales proteicos con los que se co-producen, así como de otros contaminantes. La proteína purificada puede ensayarse de acuerdo con el ensayo de rata descrito más adelante en el Ejemplo 5.

La purificación se realiza usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

El análisis de proteínas se realiza usando técnicas convencionales tales como SDS-PAGE acrilamida [Laemmli, Nature 227: 680 (1970)] teñida con Azul de Coomassie o plata [Oakley, y col. Anal: Biochem. 105: 361 (1980)] y por inmunotransferencia [Towbin, y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 (1979)]

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplo 5

Ensayo de SAMPATH-REDDI modificado por ROSEN

Se usa una versión modificada del ensayo de implante ectópico de rata descrito en Sampath y Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6591-6595 (1983) para evaluar la actividad de las proteínas BMP-12. Este ensayo modificado se denomina en el presente documento el ensayo de Sampath-Reddi modificado por Rosen. El ensayo se ha usado ampliamente para evaluar la actividad de inducción de cartílago y hueso de las BMP. La etapa de precipitación con etanol del procedimiento de Sampath-Reddi se reemplaza por diálisis (si la composición es una solución) o diafiltración (si la composición es una suspensión) de la fracción a ensayar frente a agua. La solución o suspensión después se equilibra a TFA al 0,1%. La solución resultante se añade a 20 mg de matriz de rata. Como control se utiliza una muestra de matriz de rata simulada no tratada con la proteína. Este material se congela y se liofiliza y el polvo resultante se encierra en cápsulas de gelatina nº 5. Las cápsulas se implantan por vía subcutánea en el área torácica abdominal de ratas Long Evans macho de 21-49 días de edad. Los implantes se retiran después de 10 días. Una sección de cada implante se fija y se procesa para el análisis histológico. Se tiñen secciones de metacrilato de glicol de 1 µm con Von Kossa y fucsina ácida para evaluar la cantidad de formación de tejido similar a tendón/ligamento inducido presente en cada implante.

BMP-12 se implantó en las ratas en dosis de 1, 5, 25 y 50 µm por implante durante 10 días. BMP-2 a una dosis de 5 µg se incluyó como control positivo. Para todas las dosis de BMP-12 ensayadas, no se observó formación de hueso

o cartílago en los implantes después de diez días. En su lugar, los implantes se rellenaron con tejido parecido a tendón embrionario, que se reconoce fácilmente por la presencia de haces densos de fibroblastos orientados en el mismo plano y apretados entre sí. [Se describe tejido similar a tendón/ligamento, por ejemplo, en Ham y Cormack, Histology (JB Lippincott Co. (1979), págs. 367-369. Estos descubrimientos se reprodujeron en una segunda serie de ensayos en los que estaban presentes tejidos similares a tendón/ligamento en todos los implantes que contenían BMP-12. Por el contrario, los implantes de BMP-2, como era de esperar, mostraron formación de cartílago y hueso pero no contenían tejido similar a tendón/ligamento.

Las proteínas BMP-12 y proteínas relacionadas de la presente invención pueden ensayarse con respecto a la actividad en este ensayo.

Ejemplo 6

Usando procedimientos de acuerdo con los ejemplos anteriores, con modificaciones minoritarias dentro de la experiencia de la técnica, se expresaron proteína MP52 humana y el homólogo murino de la proteína BMP-13 y se ensayaron con respecto a la actividad inductora de tejido similar a tendón/ligamento. Todas las proteínas mostraron resultados comparables, similares a los descritos anteriormente para BMP-12 humana.

Las descripciones anteriores detallan realizaciones preferidas actualmente de la presente invención. Es de esperar que a los expertos en la materia se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de la presente invención tras la consideración de estas descripciones. Se considera que estas modificaciones y variaciones se incluyen dentro de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACIÓN GENERAL

(i)

SOLICITANTE: GENETICS INSTITUTE, INC. PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES PARA INDUCIR TENDONES

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 35

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

(A)

DESTINATARIO: GENETICS INSTITUTE, INC.

(B)

CALLE: 87 CambridgePark Drive

(C)

CIUDAD: Cambridge

(D)ESTADO: Massachusetts

(D)

PAÍS: EEUU

(E)

CÓDIGO POSTAL: 02140

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR: 23

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC IBM

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.25

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: Junto con la presente

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/164.103

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-DIC-1993

(C)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/217.780

(D)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 25-MAR-1994

(E)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/333.576

(F)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 02-NOV-1994

(viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

(A)

NOMBRE: Lazar, Steven R.

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.618

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5202D-PCT

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

(A)

TELÉFONO: 617 498-8260

(B)

TELEFAX: 617 876-5851

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 926 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Homo sapiens

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: v1-1

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

(B)

LOCALIZACIÓN: 571..882

24

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..882

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 294 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

imagen1

imagen2

imagen2

imagen2

(A)

LONGITUD: 1207 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Homo sapiens

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: MP52

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS 15 (B) LOCALIZACIÓN: 845..1204

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 120 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

imagen2

28

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

imagen2

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 128 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 10 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Homo sapiens

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: fragmentos V1-1

(ix)

CARACTERÍSTICA: 15 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 28..102

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 128 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 15 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Homo sapiens

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: VL-1 20 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 28..102

imagen2

imagen2

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7

imagen2

25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8

imagen2

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 3585 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: pALV1-781

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 272 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: ratón

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: mV1

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 28..243

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 72 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 272 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: ratón

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: mV2

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 28..243

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 72 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 272 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 5 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: ratón

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: mV9

(ix)

CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 28..243

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 72 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: secuencia consenso de BMP/TGF-beta

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: oligonucleótido nº 1

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: secuencia consenso de BMP/TGF-beta

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: oligonucleótido nº 2

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: oligonucleótido nº 3

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: oligonucleótido nº 4

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: oligonucleótido nº 5

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: oligonucleótido nº 6

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: oligonucleótido nº 7

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 1171 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 10 (vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: proteína VL-1 humana

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..964 15 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

(B)

LOCALIZACIÓN: 605..964

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 321 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1233 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 5 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: ADN que codifica propéptido de BMP2/péptido maduro de BMP-12

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS 10 (B) LOCALIZACIÓN: 1..1233

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

(B)

LOCALIZACIÓN: 847..1233

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 411 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1203 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vii) FUENTE INMEDIATA: 10 (B) CLON: MV1 murino

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..721

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 240 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30

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imagen2

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1046 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: MV2 murino

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..790

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 263 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1345 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO 10 (iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: V1-1 HUMANO

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS 15 (B) LOCALIZACIÓN: 138..1301

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

(B)

LOCALIZACIÓN: 990..1301

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 388 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO 10 (iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE ORIGINAL:

(C) AISLADO INDIVIDUAL: cebador número 8

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35

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Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polipéptido que tiene la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón o similar a ligamento, en el que dicho polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

   (a)

   los nucleótidos nº 196, nº 199, nº 208, nº 217, nº 361, nº 388, nº 493, nº 496, nº 571 o nº 577 a nº 879 o nº 882 de la SEC ID Nº: 1;

   (b)

   nucleótidos que codifican los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 de la SEC ID Nº: 2;

   (c)

   los nucleótidos nº 845, nº 893 o nº 899 a nº 1201 o nº 1204 de la SEC ID Nº: 3;

   (d)

   nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 4;

   (e)

   los nucleótidos nº 410, nº 458, nº 602, nº 605 o nº 659 a nº 961 o nº 964 de la SEC ID Nº: 25;

   (f)

   nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 26; o

   (g)

   secuencias alélicas humanas naturales y secuencias de codones degenerados equivalentes de uno cualquiera de (a) a (f), o

   (h)

   secuencias que hibridan con cualquiera de (a) a (f) anteriores en condiciones de hibridación rigurosas,

   para uso en un procedimiento para inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento en un paciente que lo necesita.

2. 2.

   Polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1.

3. 3.

   Polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

4. 4.

   Polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 25.

5. 5.

   Polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 26.

6. 6.

   Polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dicho polipéptido es para uso en un procedimiento para tratar tendinitis, desgarros de tendones o ligamentos, deformidades y otros defectos de tendones

   o ligamentos.

7. 7.

   Polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el dicho polipéptido está presente como un monómero dentro de una molécula de proteína heterodimérica, y en el que el segundo monómero es un miembro de la superfamilia de factores de crecimiento TGF-β.

8. 8.

   Composición farmacéutica que comprende un polipéptido que tiene la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón o similar a ligamento, en la que dicho polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en

   (a)

   los nucleótidos nº 196, nº 199, nº 208, nº 217, nº 361, nº 388, nº 493, nº 496, nº 571 o nº 577 a nº 879 o nº 882 de la SEC ID Nº: 1;

   (b)

   nucleótidos que codifican los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 de la SEC ID Nº: 2;

   (c)

   los nucleótidos nº 845, nº 893 o nº 899 a nº 1201 o nº 1204 de la SEC ID Nº: 3;

   (d)

   nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 4;

   (e)

   los nucleótidos nº 410, nº 458, nº 602, nº 605 o nº 659 a nº 961 o nº 964 de la SEC ID Nº: 25;

   (f)

   nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 a nº 119 o nº 120 de la SEC ID Nº: 26; o

   (g)

   secuencias alélicas humanas naturales y secuencias de codones degenerados equivalentes de uno cualquiera de (a) a (f), o

   (h)

   secuencias que hibridan con cualquiera de (a) a (f) anteriores en condiciones de hibridación rigurosas,

   en la que la composición es para inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento en un paciente que lo necesita.

9. 9.

   Composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que el polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1.

10. 10.

    Composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

11. 11.

    Composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que el polipéptido se codifica por una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 25.

12. 12.

    Composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 26.

13. 13.

    Composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en la que la composición farmacéutica

    es para tratar tendinitis, desgarros de tendones o ligamentos, deformidades y otros defectos de tendones o 5 ligamentos.
14. 14. Composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en la que el dicho polipéptido está presente como un monómero dentro de una molécula de proteína heterodimérica, y en la que el segundo monómero es un miembro de la superfamilia de factores de crecimiento TGF-β.
15. 15. Composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en la que la composición farmacéutica 10 comprende además al menos otro agente terapéuticamente útil seleccionado de proteínas BMP, BMP-1 a BMP-11.
16. 16. Composición farmacéutica de la reivindicación 15, en la que la composición farmacéutica comprende además BMP-2.