ES2366793T3 - Preparaciones del receptor de tirotropina, sus regiones de unión, interactuaciones de anticuerpos y hormonas con dichas preparaciones y sus usos. - Google Patents
Preparaciones del receptor de tirotropina, sus regiones de unión, interactuaciones de anticuerpos y hormonas con dichas preparaciones y sus usos. Download PDFInfo
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Abstract
Una preparación del receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSHR) mutado, que incluye al menos una mutación puntual, caracterizada porque al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido mutado a un residuo de aminoácido cargado negativamente en dicha preparación del TSHR mutado, con lo cual dicha preparación de TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, porque (i) el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado se reduce o suprime, cuando se compara con el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación del TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de dicha preparación del TSHR mutado con la excepción de que dicha mutación de Arg situada en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa no está presente en dicha preparación del TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación de TSHR mutado no es afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con dicha preparación del TSHR de referencia, y (iii) el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado no es afectado o es aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con dicha preparación del TSHR de referencia, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado es eficaz en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.
Description
La presente invención se refiere a preparaciones del receptor de la hormona estimulante del tiroides (también llamada tirotropina). [Dicho receptor se abrevia en lo sucesivo con las siglas TSHR por la expresión inglesa Thyroid Stimulating Hormone Receptor]. En particular la invención se refiere a preparaciones del TSHR mutado, a interacciones de anticuerpos y hormonas con dichas preparaciones, a sus usos, a métodos de proporcionar dichas preparaciones, a regiones epitópicas y a los sitios de unión así identificados por los anticuerpos del TSHR y sus complejos.
La tirotropina u hormona estimulante del tiroides (abreviadamente en inglés TSH) es una hormona de la hipófisis (también llamada glándula pituitaria) que desempeña un papel clave en regular la función del tiroides. Su liberación es estimulada por la hormona liberadora de tirotropina (abreviadamente TRH por sus iniciales en inglés) formada en el hipotálamo y controla la formación y liberación de las importantes hormones tiroideas tiroxina (T4) y triyodotironina (T3). Sobre la base de un mecanismo de retroalimentación, el contenido de hormonas tiroideas del suero controla la liberación de la TSH. La formación de T3 y T4 por las células del tiroides es estimulada por la TSH mediante un proceso en el cual la TSH liberada por la hipófisis se une al TSHR de la membrana celular del tiroides.
Los autores de la presente invención han descrito recientemente en la solicitud de patente WO 2004/050708A2 un anticuerpo monoclonal humano para el TSHR, que actúa como un potente estimulante del TSHR. El sitio de unión en el TSHR para este anticuerpo monoclonal (hMAb TSHR1) no está descrito en el documento WO 2004/050708A2, pero se ha creído probable que el sitio o cavidad de unión es conformacional e implica regiones discontinuas del receptor que se pliegan conjuntamente. La identificación del sitio de unión, o región epitópica, del TSHR o sus residuos o secuencias de aminoácidos de unión esenciales para un anticuerpo monoclonal o recombinante para el TSHR, tal como hMAb TSHR1, sería de crucial importancia en la comprensión de la estructura del TSHR y la interactuación de anticuerpos humanos con dicho sitio de unión, y como tal debe facilitar una determinación mejorada de las poblaciones de auto-anticuerpos y el manejo subsiguiente de la enfermedad tiroidea asociada con una respuesta autoinmune al TSHR.
En la técnica está bien documentado que se pueden formar diversos tipos de auto-anticuerpos contra el TSHR en el curso de la enfermedad asociada con autoinmunidad para el TSHR. Dependiendo del tipo de estos auto-anticuerpos, puede ocurrir la inhibición de la formación y liberación de T3 y T4 debido a la protección del TSHR frente a las moléculas de la TSH, o bien, por otro lado, estas hormonas tiroideas pueden ser liberadas de un modo no controlado debido a que los auto-anticuerpos anti-TSHR mimetizan las acciones de la TSH y estimulan la síntesis y liberación de las hormonas tiroideas.
La enfermedad tiroidea autoinmune (abreviadamente en lo sucesivo AITD por la expresión inglesa Autoimmune Thyroid Disease) es la enfermedad autoinmune más común que afecta a diferentes poblaciones en todo el mundo. Una proporción de pacientes con AITD, principalmente los que padecen la enfermedad de Graves, tienen autoanticuerpos para el TSHR sustancialmente como los descritos antes. Los auto-anticuerpos se unen al TSHR y usualmente mimetizan las acciones de la TSH, estimulando la glándula tiroides para producir altos niveles de hormonas tiroideas. De estos auto-anticuerpos se ha descrito que tienen actividad estimulante. Los auto-anticuerpos estimulantes también interactúan con los TSHR en los tejidos oculares y causan al menos algunos de los signos de la enfermedad de Graves. En algunos pacientes, los auto-anticuerpos se unen al TSHR pero no estimulan la producción hormonas tiroideas y se describen como poseedores de actividad bloqueante [J. Sanders, Y, Oda, S-A. Roberts, M. Maruyama, J. Furmaniak, B. Rees Smith "Understanding the thyrotropin receptor function-structure relationship" Bailliere’s Clinical Endocrinology and Metabolism. Ed. T. F. Davies 1997 11(3): 451-479. Pub. Bailliére Tindall, London].
Las medidas de los auto-anticuerpos del TSHR son importantes en el diagnóstico y manejo de la AITD, particularmente la enfermedad de Graves. Se usan tres tipos usuales de ensayos para medir los auto-anticuerpos del TSHR.
- (a)
- ensayos de unión competitivos que miden la capacidad de los auto-anticuerpos del TSHR para inhibir la unión de la TSH a preparaciones del TSHR;
- (b)
- bioensayos que miden la capacidad de los auto-anticuerpos del THSR para estimular las células que expresan el TSHR en cultivo; y
- (c)
- inmunoprecipitación de las preparaciones del TSHR con auto-anticuerpos del THSR.
Las medidas de los auto-anticuerpos para el THSR usando dichos ensayos están descritas en las referencias siguientes: J. Sanders, Y. Oda, S-A. Roberts, M. Maruyama, J. Furmaniak, B. Rees Smith "Understanding the thyrotropin receptor function-structure relationship"; Bailliere’s Clinical Endocrinology and Metabolism. Ed; T F Davies 1997 11(3): 451-479. Pub. Bailliére Tindall, London; y J. Sanders, Y. Oda, S. Roberts, A. Kiddie, T. Richards, J. Bol-ton, V. McGrath, S. Walters, D. Jaskólski, J. Furmaniak, B. Rees Smith "The interaction of THSR auto-antibodies with 125I-labelled TSHR", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999, 84(10):3797-3802.
Sin embargo existen cierto número de limitaciones asociadas con el uso de los ensayos actualmente disponibles antes descritos para medir los auto-anticuerpos del THSR. Los ensayos competitivos de tipo (a) que están disponibles en diferentes formatos son generalmente sensibles, fáciles de realizar y adaptables para un uso rutinario. Sin embargo, los ensayos con radio-receptores competitivos conocidos hasta la fecha para detectar auto-anticuerpos del THSR tienen unos inconvenientes importantes de naturaleza práctica (que pueden ser atribuidos al hecho de que la capacidad de unión de las preparaciones del TSHR generalmente reaccionan muy sensiblemente a cambios en el receptor o en una biomolécula unida por él) y además no permiten se lleven a cabo diagnósticos diferenciales de poblaciones de auto-anticuerpos (por ejemplo la diferenciación de auto-anticuerpos estimulantes o bloqueantes como se ha indicado antes).
En lo que respecta a los bioensayos del tipo mencionado en (b) estos tienden a ser costosos, consumen mucho tiempo en su realización y requieren un personal muy cualificado.
Con respecto a los ensayos de inmunoprecipitación directa del tipo (c), en la práctica hay frecuentemente episodios de sensibilidad asociados a los mismos y de nuevo no ha sido posible hasta la fecha diagnósticos diferenciales de poblaciones de auto-anticuerpos.
Como se apreciará del análisis anterior, sigue existiendo la necesidad en la técnica de proporcionar ensayos mejorados para la detección de auto-anticuerpos del TSHR, y por ejemplo sería ventajoso poder distinguir entre los autoanticuerpos estimulantes y los bloqueantes asociados con la autoinmunidad para el TSHR. Para este fin, el documento de patente WO 01/27634 describe un método de ensayo para llevar a cabo la determinación del diagnóstico diferencial de auto-anticuerpos del THSR, con lo cual en teoría pueden ser selectivamente determinados en una muestra los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y auto-anticuerpos del THSR no patógenos (ni estimulantes ni bloqueantes). Se emplea un TSHR-quimera en donde las secuencias del TSHR requeridas para la unión de los auto-anticuerpos estimulantes y/o los bloqueantes del THSR están reemplazadas por secuencias de un receptor diferente de la clase de receptores acoplados a la proteína G. También se describe en el documento el uso de TSHR recombinante de tipo natural solubilizado en la mezcla de reacción, cuando esto se requiera. Puede verse que la quimera A representa el TSHR-quimera en donde los aminoácidos 8-165 del TSHR están reemplazados por los aminoácidos 10-166 del receptor de la lutropina/coriogonadotropina; la quimera B representa el TSHR-quimera en donde los aminoácidos 261-370 del TSHR están reemplazados por los aminoácidos 261-329 del receptor de la lutropina/coriogonadotropina; y la quimera C representa el TSHR-quimera en donde los aminoácidos 8-165 y 261-370 del TSHR están remplazados por los aminoácidos 10-166 y 261-370 respectivamente del receptor de la lutropina/coriogonadotropina.
El documento de patente WO 01/63296 describe similarmente un método de ensayo para llevar a cabo la determinación del diagnóstico diferencial de los auto-anticuerpos del THSR, mediante el cual pueden ser de nuevo determinados selectivamente, en teoría, en una muestra los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y los auto-anticuerpos no patógenos del THSR. Un agente de unión opcional (tal como un TSHR recombinante de tipo natural) que se une a al menos los auto-anticuerpos que se someten a detección se hace reaccionar con una muestra en presencia de un TSHR-quimera seleccionado, en donde las secuencias de unión al TSHR esenciales para los auto-anticuerpos bloqueantes o estimulantes están reemplazadas por secuencias que no se unen al tipo respectivo de auto-anticuerpo que se somete a detección. Los TSHR-quimeras descritos en el documento WO 01/63296 corresponden a los del documento WO 01/27634 antes comentados.
Las técnicas anteriores descritas en WO 01/27634 y WO 01/63296 están descritas también por Minich et al., en Journal of Endocrinology & Metabolism, 89 (1): 352-356.
La base racional para estos estudios descritos por Minich y colegas fue una serie de informes en los que los autoanticuerpos del THSR con actividad estimulante del tiroides (es decir, agonistas de la TSH) interactúan con epítopos en el extremo N del TSHR (entre los aminoácidos 25 y 165), mientras que los auto-anticuerpos para el THSR con actividad antagonista de la TSH interactúan con epítopos que son más C terminales (aminoácidos 261-370). Los estudios con la quimera A en particular indicaron que se unió bien a la TSH macada con 125I y las células transfectadas con esta quimera respondieron bien a la TSH.
La unión de la TSH marcada tanto a la quimera A como al TSHR de tipo natural fue inhibida por sueros que contienen auto-anticuerpos del THSR. Sin embargo los efectos inhibidores de los sueros fueron más fuertes usando un receptor de tipo natural y este fue el caso de los auto-anticuerpos con actividades agonistas del TSH y/o antagonista de la TSH. Este ensayo basado en la inhibición de la unión de la TSH a la quimera parecía mostrar una diferenciación mejorada (comparada con el TSHR de tipo natural) entre auto-anticuerpos del THSR con actividades agonistas de la TSH y antagonistas de la TSH, pero había un solapamiento considerable. Este solapamiento limita la aplicación clínica. Además, en estudios mucho más tempranos, los ensayos para auto-anticuerpos del THSR basados en la inhibición de la unión de la TSH marcada al TSHR nativo (es decir, el de tipo natural) han sido modificados para seleccionar los auto-anticuerpos del THSR con actividad antagonista de la TSH reduciendo la sensibilidad del ensayo (es decir, usando muestras de ensayo diluidas). Esto es eficaz porque los auto-anticuerpos antagonistas de la TSH están generalmente presentes en suero en concentraciones mucho mayores que los auto-anticuerpos agonistas de la TSH.
El documento WO03/018632 describe diversas regiones epitópicas de un receptor de tirotropina (TSH), sus usos y anticuerpos para el mismo. El documento WO00/05345 describe varias composiciones del receptor de la tirotropina Con el fin de proporcionar ensayos mejorados para la detección y análisis de auto-anticuerpos del THSR producidos en respuesta al TSHR, y para aliviar los problemas experimentados usando los métodos de la técnica anterior, la presente invención proporciona ahora un enfoque diferente del de la técnica anterior de Minich y colegas. En particular, los autores de la presente invención hemos mutado un solo aminoácido en el TSHR e investigado los efectos de las mutaciones sobre la unión del TSHR y la estimulación por diversos nuevos ligandos. Estos nuevos ligandos incluyen un auto-anticuerpo monoclonal estimulante del tiroides (hMAb TSHR1), un anticuerpo monoclonal de ratón (9D33) que es un antagonista potente del hMAb TSHR1 (y la TSH) y anticuerpos monoclonales de ratón que son fuertes agonistas de la TSH.
En contraste con la técnica anterior, nuestros estudios han conducido sorprendentemente a un sistema que proporciona una distinción mucho más clara entre diversos ligandos del TSHR. En particular, hemos identificado una mutación puntual específica del TSHR que esencialmente suprime la acción de los anticuerpos del TSHR (autoanticuerpos y anticuerpos monoclonales) con actividades agonistas de la TSH, mientras que los efectos de los anticuerpos del receptor de la TSH (auto-anticuerpos y anticuerpos monoclonales) con actividad antagonista de la TSH son no afectados o aumentados por la misma mutación.
La presente invención proporciona por tanto medios nuevos y mejorados de distinguir entre poblaciones de los autoanticuerpos del TSHR estimulantes y bloqueantes y se proporciona ahora mediante la presente invención una preparación del TSHR mutado que incluye al menos una mutación puntual caracterizada porque al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido mutado para obtener un residuo de aminoácido cargado negativamente en dicha preparación del TSHR mutado, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, porque (i) el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado está reducido sustancialmente o está suprimido esencialmente, cuando se compara con el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación de TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de dicha preparación del TSHR mutado, con la excepción de que dicha mutación de Arg situada en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa no está presente en dicha preparación del TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación del TSHR mutado está esencialmente no afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con dicha preparación del TSHR de referencia, y (iii) el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado está esencialmente no afectado o aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con dicha preparación de TSHR de referencia, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado es eficaz en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes de THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.
En una realización preferida de la presente invención al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa está mutado puntualmente a un residuo de aminoácido cargado negativamente, preferiblemente Asp. Preferiblemente, por tanto se proporciona una preparación del TSHR mutado que incluye al menos una mutación puntual caracterizada porque al menos el aminoácido Arg en un posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido mutado a Asp en dicha preparación del TSHR mutado, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, porque (i) el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado está reducido sustancialmente o suprimido esencialmente, cuando se compara con el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación de TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de dicha preparación del TSHR mutado con la excepción de que dicha mutación de Arg en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa no está presente en dicha preparación de TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación de TSHR mutado está esencialmente no afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con dicha preparación del TSHR de referencia; y (iii) el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado está esencialmente no afectado o aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con dicha preparación del TSHR de referencia, con lo cual dicha preparación de TSHR mutado es eficaz en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del TSHR de suero de pacientes y la TSH en una muestra del suero del de fluido corporal que se somete a detección.
Adecuadamente una preparación de TSHR mutado como es proporcionada por la presente invención puede incluir un TSHR humano de tipo natural de longitud completa, que ha sido mutado como se ha descrito antes. Alternativamente, la preparación del TSHR mutado puede incluir fragmentos de un TSHR humano de tipo natural de longitud completa mutado como se ha descrito antes y cuyos fragmentos interactúan diferencialmente con los autoanticuerpos estimulantes del TSHR de suero del paciente, los auto-anticuerpos bloqueantes del TSHR de suero de pacientes y la TSH de nuevo como se ha descrito antes. Otras mutaciones de aminoácidos pueden estar presentes en una preparación del TSHR mutado como se ha descrito en la presente memoria, y dichas otras mutaciones pueden ser mutaciones puntuales para aumentar más la interactuación diferencial de la preparación de TSHR mutado con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, o pueden representar sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas que no alteran o alteran sustancialmente la actividad o función biológica de la preparación del TSHR mutado como es proporcionada por la presente invención.
En el caso en el que otras mutaciones representen sustituciones conservadoras de aminoácidos, dichas substituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en la preparación del TSHR mutado por otro aminoácido de características similares. Se consideran sustituciones típicamente conservadoras los reemplazamientos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos; entre los de residuos con hidroxilo; entre los residuos con grupos ácidos; entre los residuos con grupos amida; entre los residuos básicos; y entre los residuos aromáticos.
El término "fragmento" como se usa en la presente memoria denota, en relación con una preparación del TSHR mutado de acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos que corresponde a parte, pero no a la totalidad, de la secuencia de aminoácidos del TSHR humano de tipo natural y que incluye la mutación de al menos el aminoácido Arg en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa a un residuo de aminoácido cargado negativamente como se ha descrito en la presente memoria y cuyo fragmento interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los autoanticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, y por tanto facilita la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra del fluido corporal que se somete a detección. Un "fragmento" como es proporcionado en el contexto de una preparación del TSHR mutado de acuerdo con la presente invención puede ser "uno que se mantiene libre", es decir, que no es parte de, o está fusionado a, otros aminoácidos
o polipéptidos, o dichos fragmentos pueden estar constituidos dentro de un polipéptido mayor del cual forman una parte o región. Dichos fragmentos pueden, por tanto estar incorporados en un polipéptido de tipo "andamio", en donde se proporcionan aminoácidos adicionales para "retener" los aminoácidos de la preparación del fragmento del TSHR mutado en una conformación, disposición o secuencia que se asemeje o se asemeje sustancialmente a una conformación, disposición o secuencia de aminoácidos como están presentes en un sitio activo de una preparación del TSHR de tipo natural.
La información completa de secuencias para las secuencias de aminoácidos del TSHR humano de tipo natural se puede obtener fácilmente por referencia a publicaciones de la técnica, y/o bases de datos de aminoácidos para las secuencias del receptor, y como tales las secuencias completas de preparaciones mutadas adecuadas y fragmentos mutados basados en las mismas de acuerdo con la presente invención se pueden determinar fácilmente sobre la base de la secuencia de tipo natural conocida junto con el contenido de la presente memoria descriptiva..
Una preparación de TSHR mutado como es proporcionada por la presente invención tiene utilidad en diagnóstico en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes de suero de pacientes, los anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, y proporciona por tanto un paso adelante significativo en proporcionar un diagnóstico fiable de la enfermedad autoinmune asociada con una respuesta autoinmune al TSHR, aliviando mucho de los problemas asociados con los métodos de diagnóstico y los kits conocidos hasta ahora en la técnica como se ha indicado antes, y en particular proporciona ventajas sobre, y superiores a, la enseñanza proporcionada por los documentos WO 01/63296 y WO 01/27634.
De acuerdo con la presente invención, por tanto, se proporciona el uso de una preparación de un TSHR mutado sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede en la detección diferencial y la identificación de los autoanticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, en una muestra de fluido corporal obtenida de un sujeto (en particular un ser humano) del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella.
También se proporciona por la presente invención el uso de una preparación del TSHR mutado sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede en el diagnóstico en un sujeto (en particular un sujeto humano) del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella.
La presente invención, por tanto, proporciona además un kit que comprende una preparación del TSHR mutado sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede, junto con medios de detección que facilitan la monitorización de la interactuación diferencial de la preparación del TSHR mutado con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH presentes en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.
Por la presente invención se proporciona además un método de detectar diferencialmente los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal obtenida de un sujeto del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella, cuyo método emplea una preparación del TSHR mutado para interactuar diferencialmente con, y detectar, los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en dicha muestra de fluido corporal del sujeto.
Por la presente invención se proporciona además un método de diagnosticar el comienzo o la presencia probables de la enfermedad tiroidea autoinmune en un sujeto (en particular un ser humano) del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella, cuyo método emplea una preparación de TSHR mutado sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede para interactuar diferencial-mente con, y detectar, los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal del sujeto, de modo que proporcione un diagnóstico del comienzo o la presencia probables de la enfermedad tiroidea autoinmune.
Por la presente invención se proporciona además un método de retrasar o impedir el comienzo de la enfermedad tiroidea autoinmune en un sujeto animal (en particular un sujeto humano) sospechoso de padecerla, susceptible a ella o que se está recuperando de dicha enfermedad, el cual método emplea una preparación del TSHR mutado sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede para interactuar inicial y diferenciadamente con, y detectar, los anticuerpos estimulantes y/o bloqueantes del THSR indicativos del comienzo o presencia de la enfermedad tiroidea autoinmune en una muestra de fluido corporal obtenida del sujeto, con lo cual se proporciona un diagnóstico del probable comienzo de dicha enfermedad tiroidea autoinmune en el sujeto, y después tratar terapéuticamente al sujeto de modo que se retrase el comienzo y/o se impida la enfermedad tiroidea autoinmune. Por la presente invención se proporciona además un método de tratar la enfermedad tiroidea autoinmune en un sujeto, cuyo método emplea una preparación de TSHR mutado sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede para interactuar inicial y diferenciadamente con, y detectar, los auto-anticuerpos estimulantes y/o bloqueantes del THSR producidos en respuesta al TSHR en una muestra del fluido corporal obtenido del sujeto, con lo cual se proporciona un diagnóstico de la enfermedad tiroidea autoinmune en el sujeto, y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico eficaz en el tratamiento de dicha enfermedad tiroidea autoinmune.
La cantidad de agente terapéutico administrada dependerá del estado de la enfermedad tiroidea autoinmune específica que se trata, posiblemente la edad del paciente y finalmente será a la discreción del médico que atiende el caso.
Por la presente invención se proporciona además, en combinación, un kit sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede, junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico eficaz en el tratamiento de la enfermedad tiroidea autoinmune sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede.
La muestra del tejido corporal que se somete a detección por la presente invención comprenderá típicamente muestras de sangre u otras fracciones de fluidos de la sangre, tales como en particular muestras de suero, o muestras de plasma, pero la muestra en principio será otra muestra biológica, tal como saliva u orina o extractos de tejidos solubilizados o puede ser obtenida mediante una aguja para biopsia.
Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede es también adecuada para uso como un agente terapéutico en el tratamiento de la enfermedad tiroidea autoinmune o puede ser usada en la identificación de un agente terapéutico adecuado para el tratamiento de la enfermedad tiroidea autoinmune. Por ejemplo, una preparación del TSHR mutado se puede usar terapéuticamente para interactuar con, y eliminar esencialmente los auto-anticuerpos del THSR estimulantes y/o bloqueantes circulantes en un sujeto (en particular un sujeto humano) del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella
Por lo tanto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede, junto con un vehículo, diluyente o excipiente para la misma farmacéuticamente aceptable, en donde la preparación de TSHR mutado puede interactuar diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes y/o bloqueantes producidos en respuesta al TSHR.
La presente invención proporciona además una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Graves. En particular, una preparación de TSHR mutado como la proporcionada por la presente invención es adecuada para uso en la fabricación un medicamento para el tratamiento de al menos algunos de los signos de los ojos de la enfermedad de Graves.
Las composiciones o medicamentos de acuerdo con la presente invención deben contener una cantidad terapéutica
o profiláctica de una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede ser cualquier sustancia compatible adecuada no tóxica para la administración de una preparación de TSHR mutado al paciente. Como vehículo se puede usar agua estéril, alcohol, grasas, ceras y sólidos inertes. También se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas adyuvantes farmacéuticamente aceptables, agentes tampones, agentes dispersantes y similares. Dichas composiciones pueden contener una sola preparación de TSHR mutado o pueden contener dos o más preparaciones de TSHR mutado de acuerdo con la Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención son útiles para administración parenteral. Preferiblemente, las composiciones serán administradas parenteralmente, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente. Por tanto, la invención proporciona composiciones para administración parenteral a un paciente, en donde las composiciones comprenden una solución o dispersión de una preparación de TSHR mutado en un vehículo aceptable, como se ha descrito antes. La concentración de una preparación de TSHR mutado en la composición farmacéutica puede variar ampliamente, es decir desde menos de aproximadamente 0,1% en peso, siendo usualmente al menos aproximadamente 1% en peso hasta tanto como 20% en peso o más. Las composiciones farmacéuticas típicas para inyección intramuscular estarían hechas para contener, por ejemplo, 1 ml de agua tamponada estéril y 1 a 100 g de una preparación purificada de TSHR mutado de la presente invención. Una composición típica para infusión intravenosa podría estar hecha para contener hasta 100 a 500 ml de estéril de Ringer y 100 a 500 mg de una preparación purificada de TSHR mutado de la presente invención. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables parenteralmente son bien conocidos en la técnica y están descritos con más detalles en diversas fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Science, 15th Edition, Mack Publishing Company. Easton, Pa. (1980).
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende:
una secuencia de nucleótidos que codifica una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
La presente invención proporciona además las secuencias de nucleótidos cebadores Arg 255 Asp F; Arg 255 Asp R; que se identifican en la Tabla 1 y/o una secuencia de nucleótidos que difiere de las mismas en una secuencia de codón de la misma debido a la degeneración del código genético. Se apreciará que aunque se proporcionen secuencias de nucleótidos solamente para los cebadores dados en la Tabla 1, los restantes nucleótidos que codifican preparaciones de TSHR de acuerdo con la presente invención se pueden obtener fácilmente por referencia a publicaciones de la técnica, y/o en las bases de datos de nucleótidos para secuencias del receptor, dado que la secuencia de longitud completa del TSHR humano de tipo natural es conocida en la técnica.
Más específicamente, puede verse con respecto a las técnicas específicas descritas en los Ejemplos que la mutación presente en una secuencia de polinucleótido como es proporcionada por la presente invención, y requerida para efectuar la mutación puntual presente en una preparación de TSHR humano mutado de acuerdo con la presente invención, se consigue mediante el uso del siguiente par de secuencias de cebadores identificadas en la Tabla 1: Arg 255 Asp F: Arg 255 Asp R -par a efectuar la mutación de 255 (Arg) a 255 (Asp). Se prefiere además que los cebadores identificados en la Tabla 1 se usen en amplificación por la PCR para obtener la secuencia de nucleótidos mutada requerida y la correspondiente preparación de TSHR humano mutado de acuerdo con la presente invención se obtiene adecuadamente por, o es obtenible por, expresión de un polinucleótido de acuerdo con la presente invención. Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede puede ser expresada en diversos sistemas que generan proteínas recombinantes. Por ejemplo, se puede preferir la expresión en células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (abreviadamente CHO por sus iniciales en inglés) y el uso específico de células CHO se describe en los Ejemplos junto con el vector pcDNA5.1/FRT. Alternativamente, una preparación de TSHR mutado de la invención se puede producir sintéticamente por sintetizadores convencionales de péptidos empleando métodos que son bien conocidos en la técnica.
La presente invención proporciona además un proceso de preparar una preparación de TSHR sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede, el cual procedimiento comprende:
- (i)
- proporcionar una célula hospedante sustancialmente como se describe en la presente memoria;
- (ii)
- hacer crecer la célula hospedante; y
(iii) recuperar del medio de crecimiento una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención.
La recuperación de una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención puede emplear típicamente técnicas convencionales de aislamiento y purificación, tales como, separaciones cromatográficas o separaciones inmunológicas, conocidas por los expertos ordinarios en la técnica.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en la forma de DNA, incluyendo, por ejemplo, cDNA, DNA sintético y DNA genómico apropiadamente obtenidos por clonación o producidos por técnicas sintéticas químicas o una de sus combinaciones. Una realización preferida de la presente invención comprende preferiblemente cDNA o DNA sintético.
Hay variantes de los polinucleótidos descritos en lo que antecede que codifican una preparación de TSHR mutado como el proporcionado por la presente invención. Una variante del polinucleótido puede ser una variante de origen natural, tal como una variante alélica de origen natural o puede ser una variante que no se sabe que se produzca naturalmente. Dichas variantes que no se producen naturalmente pueden ser preparadas por técnicas de mutagéneEntre los variantes de este tipo están las variantes que difieren de los polinucleótidos antes mencionados en sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras.
Los polinucleótidos variantes son adecuadamente al menos 70% idénticos en su longitud completa a un polinucleótido que codifica una preparación de TSHR mutado como se ha descrito en la presente memoria, y los polinucleótidos que son complementarios con dichos polinucleótidos o se hibridan con ellos. Alternativamente, la mayoría de los polinucleótidos altamente preferidos son los polinucleótidos que comprenden una región que es al menos 80% idéntica en su longitud completa a un polinucleótido que codifica una preparación de TSHR mutado como se ha descrito en la presente memoria y los polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos o se hibridan con ellos. A este respecto los polinucleótidos al menos 90% idénticos en su longitud completa a los mismos son particularmente preferidos, y entre estos son especialmente preferidos los polinucleótidos con al menos 95% de identidad. Además, los polinucleótidos que tienen al menos 97% de identidad son altamente preferidos entre los que tienen al menos 95% de identidad, y entre estos los que tienen al menos 98% de identidad, y al menos 99% de identidad son particular y altamente preferidos, siendo los más preferidos los de al menos 99% de identidad.
Sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede estos son polinucleótidos que se hibridan a las secuencias descritas antes en la presente memoria. A este respecto hay polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a los polinucleótidos antes descritos. Como se usa en la presente memoria, la expresión "condiciones rigurosas" significa que la hibridación ocurrirá solamente si hay al menos 95% y preferiblemente al menos 97% de identidad complementaria entre las secuencias.
La presente invención se refiere también a vectores, que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células hospedantes que están manipuladas genéticamente con vectores de la invención y a la producción por técnicas recombinantes de una preparación de TSHR mutado como se ha descrito antes en la presente invención.
La presente invención, por tanto, proporciona además un sistema vector biológicamente funcional que lleva un polinucleótido sustancialmente como se ha descrito en lo que antecede y que es capaz de introducir el polinucleótido en el genoma de un organismo hospedante.
Las células hospedantes puede ser manipuladas genéticamente para incorporar polinucleótidos y expresar una preparación de TSHR mutado de la presente invención y la presente invención proporciona además una célula hospedante que está transformada o transfectada con un polinucleótido o uno o más polinucleótidos o un sistema vector, cada uno sustancialmente como se describe en la presente memoria. La secuencia de DNA apropiada puede ser insertada en el vector por cualquiera de una variedad de técnicas usuales bien conocidas y rutinarias.
La presente invención proporciona además un proceso de identificar una preparación de TSHR mutado que puede usarse para la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR en el suero de un paciente y la TSH en una muestra de fluido corporal, comprendiendo dicho proceso identificar las regiones interactuantes potenciales del TSHR y los residuos de aminoácidos presentes en ellas que se identifican además en virtud de su capacidad (incluyendo su diferente capacidad con relación al TSHR de tipo natural) para interactuar con una pareja de unión para el TSHR (tal como los anticuerpos hMAb TSHR1, 9D33 o la TSH), puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la interactuación del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos del THSR estimulantes de suero de pacientes, los autoanticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH; realizar mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación resultante de TSHR mutado con la pareja de unión, de modo que se identifiquen las mutaciones puntuales que dan como resultado la inhibición de la interactuación de TSHR resultante mutado con al menos uno de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, en donde se realiza una mutación puntual para la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 se somete a una mutación puntual selectivamente para obtener un residuo de aminoácido cargado negativamente, tal que la preparación de TSHR mutado interactúe diferencial-mente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH.
La presente invención se puede usar también para identificar los residuos de aminoácidos que son claves para las regiones epitópicas del TSHR, con lo cual se proporciona un proceso que comprende identificar las regiones de interactuación potenciales del TSHR y los residuos de aminoácidos presentes en ellas que se identifican además en virtud de su capacidad (incluyendo diferente capacidad con respecto al TSHR de tipo natural) para interactuar con una pareja de unión para el TSHR (tal como los anticuerpos hMAb TSHR1, 9D33 o la TSH), puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la interactuación del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH; y realizar mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación resultante del TSHR mutado con la pareja de unión, de modo que se identifiquen los aminoácidos claves requeridos para la interactuación respectiva del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR del suero del paciente, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR suero del paciente y la TSH, en donde se realiza la mutación puntual para la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 se somete a mutación puntual selectivamente para obtener un residuo de aminoácido cargado negativamente, tal que la preparación de TSHR mutado interactúe diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH.
La presente invención puede ser empleada además para identificar los residuos de aminoácidos requeridos para la conformación de dicho TSHR de modo que se facilite su interactuación con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, con lo cual se proporciona un proceso que comprende identificar las regiones de interactuación potenciales del THSR y los residuos de aminoácidos presentes en las mismas que se identifican además en virtud de su capacidad incluyendo diferente capacidad con respecto al TSHR de tipo natural) para interactuar con una pareja de unión para el TSHR (tal como los anticuerpos hMAb TSHRI, 9D33 o la TSH), puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la conformación de dicho TSHR de modo que se facilite su interactuación con dicho uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH; realizar mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación resultante del TSHR mutado con la pareja de unión, de modo que se identifiquen los aminoácidos claves requeridos para la conformación de dicho TSHR de modo que se facilite la interactuación respectiva del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los autoanticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, en donde la mutación es la mutación de Arg 255 para dar un residuo de aminoácido cargado negativamente.
En cada uno de los procesos anteriores la interactuación de la preparación de TSHR mutado que se monitoriza es preferiblemente la estimulación del TSHR mutado, o el bloqueo de dicha estimulación, monitorizando la producción de AMP cíclico como resultado de la interactuación de la pareja de unión con la preparación del TSHR mutado.
Como se describe en la presente memoria, el aminoácido Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido identificado por la presente invención como un aminoácido clave del TSHR humano requerido para la unión del anticuerpo y además que su mutación puede conseguir el diagnóstico diferencial de las poblaciones de anticuerpos estimulantes y bloqueantes.
De acuerdo con la presente invención, por tanto, se proporciona el aminoácido Arg presente en la preparación del TSHR en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, para uso como sitio de unión para los anticuerpos del TSHR. Además se proporciona por la presente invención el aminoácido Arg presente en una preparación de TSHR en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, para uso como sitio de unión para los auto-anticuerpos del TSHR o uno o más de sus fragmentos. Además se proporciona por la presente invención el aminoácido Arg presente en una preparación del TSHR en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, para uso como sitio de unión para una pareja de unión al TSHR que comprende o se deriva de un anticuerpo monoclonal o recombinante humano o uno o más de sus fragmentos. Se proporciona además por la presente invención el uso de un residuo de aminoácido mutado cargado negativamente presente en una preparación del TSHR mutado en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, para la detección diferencial de uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, en una muestra de fluido corporal que se somete a detección, y preferiblemente en identificar los auto-anticuerpos estimulantes del THSR ausentes o presentes en la muestra del fluido corporal. Además se proporciona por la presente invención el uso de un residuo aminoácido mutado presente en una preparación de TSHR en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, para el diagnóstico de la enfermedad tiroidea autoinmune. Más específica-mente, se proporciona por la presente invención el uso de Asp presente en una preparación del TSHR mutado en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, para la detección diferencial de uno o más auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, en una muestra de tejido corporal que se somete a detección, y preferiblemente en identificar los auto-anticuerpos estimulantes del THSR presentes o ausentes en la muestra del fluido corporal. Se proporciona además por la presente invención el uso de Asp presente en una preparación de TSHR mutado en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, para el diagnóstico de la enfermedad tiroidea autoinmune.
También se proporciona un complejo de unión que comprende: (a) un sitio de unión como el representado por la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, y
(b) una pareja de unión para dicho sitio, la cual pareja de unión preferiblemente comprende o se deriva de un anticuerpo monoclonal o recombinante humano o uno o más de sus fragmentos.
Adecuadamente la pareja de unión comprende o se deriva de un anticuerpo monoclonal humano o uno o más de sus fragmentos, reactivo con el TSHR. Alternativamente, la pareja de unión comprende o se deriva de un anticuerpo recombinante humano o uno o más de sus fragmentos, reactivo con el TSHR. Preferiblemente la pareja de unión comprende un anticuerpo monoclonal o recombinante humano o uno o más de sus fragmentos, reactivo con el TSHR. Preferiblemente, la pareja de unión puede ser caracterizada además por su capacidad para inhibir la unión Una pareja de unión particularmente preferida de un complejo es el anticuerpo monoclonal humano del TSHR denominado hMAb TSHR1 como se describe en la solicitud de patente PCT WO 2004/050708A2. Como se ha indicado antes en el contexto de la técnica anterior, el sitio de unión del hMAb TSHR1 no ha sido descrito y en vista de la naturaleza compleja del TSHR y también de la naturaleza heterogénea de la respuesta de anticuerpos al mismo, no habría sido posible, sobre la base de la descripción de la técnica anterior, determinar o predecir la región epitópica o sitio de unión para el mismo.
Las siguientes explicaciones ilustrativas se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados en la presente memoria. Las explicaciones se proporcionan a modo de conveniencia y no son limitativas de la invención.
PAREJA DE UNIÓN PARA EL THSR describe una molécula que tiene una actividad de unión específica para el TSHR. Una pareja de unión como se describe en la presente memoria puede ser derivada naturalmente o ser producida total o parcialmente de un modo sintético. Dicha pareja de unión tiene un dominio o región que específica-mente se une a, y por tanto es complementaria, de una o más regiones epitópicas del TSHR, y puede incluir anticuerpos estimulantes y/o bloqueantes para el TSHR, que pueden ser auto-anticuerpos, anticuerpos monoclonales o recombinantes u otros ligandos tal como la TSH.
SITIO DE UNIÓN significa un sitio, tal como un átomo, grupo funcional o residuo de aminoácido del TSHR, que puede unirse a un anticuerpo del TSHR u otro ligando o a la pareja de unión para el mismo. Dependiendo de la molécula particular en la cavidad, los sitios pueden exhibir interactuaciones de unión atractivas o repulsivas producidas por la carga, consideraciones estéricas y similares.
BLOQUEO DEL TSHR por una pareja de unión denota la capacidad de la pareja de unión de unirse al TSHR y por tanto inhibir, por ejemplo, la producción de AMP cíclico formado como resultado de la de la estimulación del TSHR como se ha descrito en la presente memoria.
ANTICUERPOS BLOQUEANTES DEL TSHR son los que se unen al TSHR y efectúan el bloqueo del TSHR como se ha descrito en la presente memoria.
INTERACTUAR DIFERENCIALMENTE o INTERACTUACIÓN DIFERENCIAL, con respecto a una preparación de TSHR mutado como es proporcionado por la presente invención, significa que: (i) el efecto estimulante de los autoanticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado es sustancialmente reducido o esencialmente suprimido, cuando se compara con el efecto estimulante de los autoanticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación del TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de la preparación de TSHR mutado con la excepción de que la mutación de Arg en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa no está presente en la preparación del TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación de TSHR mutado está esencialmente no afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con la preparación de TSHR de referencia; y (iii) el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado está esencialmente no afectado o aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los autoanticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR de referencia. Las interactuaciones antes señaladas (tanto las inhibidas, no cambiadas o aumentadas) son en el contexto de cualquier estimulación del TSHR, o el bloqueo del TSHR. Con respecto a la interactuación de unión, o afinidad, de una preparación de TSHR mutado con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los autoanticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, como se describen con detalle en los Ejemplos, esto puede no parecer en ciertos casos que corresponda a los resultados observados con respecto a la estimulación y/o bloqueo de las preparaciones del TSHR mutado como las proporcionadas por la presente invención, pero puede ser debido, por ejemplo, a niveles reducidos de expresión del receptor mutado.
"F" (por la palabra inglesa "forward") en el contexto de definiciones de cebadores y su denominación de nota un cebador delantero.
CÉLULA HOSPEDANTE es una célula que ha sido transformada o transfectada o es capaz de transformación o transfección por una secuencia de polinucleótido exógena.
IDENTIDAD, como es conocido en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótido, como se determina comparando las secuencias.
PREPARACIÓN DE TSHR MUTADO denota una preparación de TSHR que incluye una o más mutaciones puntuales caracterizada porque la preparación resultante del TSHR facilita la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido que se somete a detección. Específicamente, sin embargo, MUTACIÓN PUNTUAL denota el reemplazamiento de un aminoácido o nucleótido por otro aminoácido o nucleótido. Esto abarca dentro del alcance de la presente invención una mutación puntual conseguida por el uso de cebadores de PCR y la expresión subsiguiente de las secuencias mutadas de nucleótidos. También está abarcado dentro del término mutación puntual como se usa en la presente memoria las mutaciones que se pueden conseguir, por técnicas de síntesis conocidas, por ejemplo empleando sintetizadores convencionales de péptidos para efectúa la síntesis de una secuencia de polipéptido deseada en donde la secuencia sintetizada incluirá el reemplazamiento de un aminoácido deseado con otro aminoácido.
"R" (por la palabra inglesa "reverse" en el contexto de las definiciones de cebadores y su denominación denota un cebador inverso.
ESTIMULACIÓN DEL TSHR por una pareja de unión como se ha descrito en la presente memoria denota la capacidad de la pareja de unión de unirse al TSHR y por ello efectuar, por ejemplo, la producción de AMP cíclico como resultado de dicha unión al TSHR. Dicha estimulación es análoga a las respuestas observadas en la unión de la TSH o los auto-anticuerpos del THSR al TSHR y de este modo una pareja de unión como se ha descrito en la presente memoria mimetiza el efecto de la TSH o un auto-anticuerpo para el TSHR, uniéndose al TSHR.
ANTICUERPOS ESTIMULANTES DEL TSHR son los que se unen al TSHR y efectúan la estimulación del TSHR como se ha descrito en la presente memoria.
TSH denota tirotropina u hormona estimulante del tiroides.
TSHR denota receptor de tirotropina u hormona estimulante del tiroides, también denominado en la técnica receptor de la TSH.
AUTO-ANTICUERPOS PARA (O DE) LA TSHR denota los anticuerpos producidos contra el TSHR en el curso de una enfermedad autoinmune asociada con el TSHR. Dependiendo del tipo de anticuerpos producidos, puede ocurrir bien sea la inhibición de la formación y liberación de T3 y T4 debido a la protección del TSHR de las moléculas de la TSH o bien sea, por otro lado, la T3 y T4 pueden ser liberadas de un modo incontrolado debido a que los anticuerpos producidos mimetizan las acciones de la TSH y estimulan la síntesis y liberación de las hormonas tiroideas.
PREPARACIÓN DE TSHR denota una secuencia de polipéptido que puede corresponder a la longitud completa del TSHR de tipo natural o puede incluir una o más variantes, análogos, derivados o sus fragmentos como se ha descrito en la presente memoria.
La presente invención se ilustrará a continuación por las siguientes Tablas y Ejemplos, que de ningún modo limitan el alcance de la invención.
Ejemplos
Se seleccionaron y mutaron a alanina diversos aminoácidos (abreviadamente a veces en lo sucesivo "aa") en el dominio extracelular del TSHR. Estos aa incluyeron:
Asp43 porque es un residuo cargado (las interacciones carga-carga son conocidas por ser importantes en la interactuación del TSHR con los auto-anticuerpos del THSR y con la TSH (Rees Smith B., McLachlan SM., Furmaniak J., 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocr. Rev. 9: 106-121). Además la Asp43 está localizada en la primera repetición (es decir, las más N terminal) del dominio rico en leucina [(abreviadamente LRD por la expresión inglesa Leucine rich domain); aa 36-281) del TSHR. Similarmente Glu61 se eligió por estar cargado y en la 2ª repetición del LRD del TSHR.
Glu157 (en la 6ª repetición del LRD del TSHR) se seleccionó sobre la base de estar cargado y su propuesta implicación en la formación de un puente salino con Lys183 del TSHR (Duprez L., Parma J., Costagliola S., Hermans J., Van-Sande J., Dumont JE., Vassart G., 1997 Constitutive activation of TSHR by spontaneous mutations affecting the N-terminal extracelular domain. FEBS Letters 409: 469-474). Dos aa cargados negativamente, Glu178 y Asp203 se seleccionaron sobre la base de su posición en las repeticiones 7ª y 8ª del LRD, respectivamente.
Los aa Asp232 y Arg255 cargados se seleccionaron sobre la base de sus posiciones en las repeticiones 9ª y 10ª del LRD del TSHR respectivamente. También un aa aromático Trp258 en la repetición 10ª del LRD fue mutado a alanina. Además, los aa Asp276 y Ser281 en el C terminal del LRD fueron mutados debido de su propuesta implicación en la activación del TSHR (Corvilain B., Van Sande J., Dumont J. E. y Vassart G., 2001 Somatic and germline mutations of the TSH receptor and thyroid disease. Clin. Endocrinol. 55:143-158; y Russo D., Arturi F., Chieari E., Filetti S., 1997 Molecular insights into TSHR abnormality and thyroid disease. J. Endocrinol. Invest. 20: 36-47).
MÉTODOS La secuencia de nucleótidos del TSHR de longitud completa (número de acceso Swiss prot: P16473 -http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=136448; Número de acceso de nucleótidos NCBI Entrez NM_000369-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide &val=4507700) se clonó en el vector pcDNA5.1/FRT (Invitrogen) usándolos sitios de restricción BamHI y XhoI siguiendo los métodos de clonación estándares.
Se diseñaron para cada mutación cebadores de PCR específicos "delantero" y "inverso" PCR (Tabla 1) para cambiar la secuencia codificadora de nucleótidos para que codificara la mutación del aminoácido apropiado. Se pusieron a punto dos reacciones separadas de la PCR (PCR 1 y PCR 2).
Reactivos añadidos en las reacciones PCR1: 32,5 µL de H2O, 2,5 µL de 20x trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP) (5 mmol/L), 5 µL de 10x de tampón de DNA-polimerasa Puf (10x tampón Pfu; Promega), 2,5 µL de cebador T7 10 pmol/µL T7 (Tabla 1), 2,5 µL de cebador "inverso" 10 pmol/µL para mutación, 4 µL de DNA molde de pcDNA5.1/FRT TSHR (100ng) y 1 µL DNA-polimerasa Pfu (3 unidades, Promega). Reactivos añadidos en la reacciones PCR2: 34,5 µL de H2O), 2,5 µL de 20x dNTP (5 mmol/L conc.), 5 µL de 10x tampón Pfu, 2,5 µL de cebador "delantero" para mutación (Tabla 1) de 10 pmol/µL, 2,5 µL de cebador inverso de la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (cebador BGHR por la expresión inglesa Bovine Growth Hormone Reverse) (Tabla 1) de 10 pmol/µL, 2 µL de DNA molde (100ng) y 1 µL DNA-polimerasa Pfu (3 unidades).
La cantidad de DNA molde usada es dependiente de la longitud de los productos de la PCR que se han de preparar. En el ejemplo mostrado antes, el producto de la PCR 1 es de una longitud de 800 pares de bases y el producto de la PCR 2 es de un longitud de 1600 pares de bases. Los tamaños de los productos de las PCR1 y PCR 2 dependen de la localización del aminoácido que ha de ser mutado dentro de la secuencia del TSHR.
Las reacciones PCR se llevaron a cabo usando el GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) a 94ºC durante 5 minutos seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 40ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos (con velocidades de rampa de 50%, 94ºC a 40ºC y 40ºC a 72ºC) seguido por 72ºC durante 7 minutos tras lo cual la mezcla de reacción se enfrió a 4ºC.
Los productos de la PCR1 y la PCR 2 se hicieron correr en geles de agarosa al 1% en tampón TAE (40 mmol/L Tris-HCl, pH 8. EDTA de 0,1 mmol/L, ácido acético glacial al 0,114%) y las bandas se recortaron del gel usando una hoja de escalpelo. Las bandas se limpiaron usando un kit Geneclean II (Anachem Ltd, Luton, LU2 0EB, UK) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de DNA se determinó usando métodos estándares de la técnica. Este DNA se usó para poner a punto la reacción PCR 3 para construir la secuencia del TSHR completa que contenía la mutación. Las reacciones PCR 3 contenían: 2,5 µL de tampón 10x Pfu, 1 µL de 20x dNTP, 200ng de producto de la PCR 1 y 200ng de producto de la PCR 2, 1 µL de DNA-polimerasa de Pfu y agua hasta un volumen final de 25 µL. Esta mezcla de reacción se colocó en el sistema GeneAmp PCR para 7 ciclos de 94ºC durante 1,5 minutos, 65ºC durante 1,5 minutos y 72ºC durante 1,5 minutos. La temperatura se aumentó luego a 94ºC, durante 2 minutos y la mezcla de reacción PCR 4 (2,5 µL de 10x tampón Pfu, 1,3 µL de 20x dNTP, 2,5 µL de cebador T7 de 10 pmol/µL, 2,5 µL de cebador BGHR de 10 pmol/L, 1 µL DNA-polimerasa de Pfu y agua hasta 25 µL) se añadió a la mezcla de reacción PCR 3. Esta mezcla se llevó a 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 52ºC durante 1 minuto y 72ºC 2 minutos (con una velocidad de rampa de 50% desde 94ºC a 52ºC y desde 52ºC a 72ºC) seguido por 10 minutos a 72ºC tras lo cual la mezcla de reacción se enfrió a 4ºC.
El producto de la PCR se limpió usando 50 µL de una mezcla fenol/cloroformo 1:1 precipitada con acetato de sodio y etanol y se secó al aire como se describe en la técnica. El DNA se volvió a suspender en 1 x tampón B para digestión por restricción (Roche Diagnostics, Lewes, BN7 1LG, UK) y se cortó con las enzimas de restricción BamHI/XhoI durante 4 horas a 37ºC. La banda de la PCR se hizo correr sobre un gel de agarosa al 1% y la banda se recortó y limpió usando un kit Geneclean II. El producto de la PCR se ligó luego en pBluescript (Stratagene) cortado con BamHI/XhoI y las mutaciones se verificaron usando secuenciación de DNA (kit de secuenciación de DNA Sequenase versión 2 de Amersham Biosciences) como se describe en la técnica. El DNA del TSHR mutado se separó luego del pBluescript usando las enzimas de restricción BamHI/XhoI y se clonó en el vector pcDNA 5.1/FRT (Invitrogen) y la secuencia se verificó de nuevo como antes.
Transfección de construcciones de TSHR mutado en células CHO usando el sistema Flp-In
Se usó un matraz confluente para células Flp-In-CHO (Invitrogen) para sembrar los pocillos de una placa de 24 pocillos a 1x105 – 1,5x105 células/pocillo en DMEM (Invitrogen), suero de ternera fetal al 10% (FCS) (Invitrogen), 1x L-Glutamina (Invitrogen) y 1 x aminoácidos no esenciales (AANE) (Invitrogen) sin antibióticos. Las células se incubaron durante una noche a 37ºC, CO2 al 5% y humedad >95%.
El DNA de pcDNA5.1/FRT TSHR (antes descrito) y el DNA de POG44 (Invitrogen) se diluyeron para dar soluciones de 0,01µg/mL y 0,1µg/mL, respectivamente en agua estéril. El DNA de POG44 DNA y el DNA del TSHR se mezclaron a 3 concentraciones diferentes: (1) 9 µL de DNA de POG44, 10 µL de DNA de TSHR y 31 µL de Optimem I (Invitrogen); (2) 8 µL de DNA de POG44, 20 µL de DNA de TSHR y 22 µL de Optimem I; (3) 9,5 µL de DNA POG44, 5 µL de DNA de TSHR y 35,5 µL de Optimem I y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron 50 µL de lipofectamina diluida 1:25 (Invitrogen) en Optimem I a cada tubo (1-3 anteriores) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Cada mezcla de incubación se añadió luego a 1 pocillo (de una placa de 24 pocillos) de células Flp-In-CHO confluentes al 95% y se incubó durante la noche en las condiciones descritas antes. Los medios de cultivo se retiraron y cambiaron por DMEM, FCS al 10%, 1x L-glutamina, 1x AANE y 1x penicilina (100 u/mL)/estreptomicina (100µg/mL) (Invitrogen) y la incubación se continuó durante la coche. Las células se desprendieron del pocillo usando solución 1 x tripsina/ EDTA solución (Invitrogen) y se dividieron en 4 nuevos pocillos y se dejaron crecer en los medios como antes con adición de 600µg/mL de higromicina (Invitrogen).
Las células transfectadas con ambos, el DNA del plásmido POG44 y del TSHR pcDNA5.1/FRT son capaces de insertar el DNA del TSHR en el genoma de las células Flp-In-CHO y conferir resistencia a higromicina a las células de modo que podrán crecer en medios de selección de higromicina. El sistema Flp-In de Invitrogen está diseñado de modo que el TSHR de nuestras construcciones será insertado en el sitio FRT en las células Flp-In-CHO por el POG44. Las células Flp-In-CHO contienen un sitio Flp-In por célula, por tanto los DNA del TSHR se insertaran en el mismo lugar en el genoma en cada experimento y estarán presentes en una copia por célula. Este sistema tiene la ventaja de que no es necesario detectar las colonias de células que tienen los niveles de expresión óptimos (seguido por clonar células para encontrar una línea celular estable). Consecuentemente, las células que expresan TSHR mutado que crecen en medios de selección de higromicina pueden ser expandidas rápidamente y usadas en ensayos diferentes.
Análisis de estimulación de la producción de AMP cíclico
La capacidad de hMAb TSHR1 y TSH para estimular la producción de AMP cíclico en células Flp-In-CHO que expresan ambos tipos de TSHR, el de tipo natural y el mutado, se analizó de acuerdo con el documento WO2004/050708A2. Dicho brevemente, las células CHO se sembraron en placas de 96 pocillos (12.500 – 20.000 células por pocillo) y se incubaron durante 48 horas en DMEM (Invitrogen) que contenía al suero de ternera fetal al 10%. El DMEM se retiró luego y se añadieron diluciones de TSH porcina (RSR Ltd; 0,01-3ng/mL) y Fab de hMAb TSHR1 (0,1-10ng/mL) en tampón de ensayo de AMP cíclico (solución salina tamponada de Hank libre de NaCl que contenía 1 g/L de glucosa, 20 mmol/L de HEPES, 222 mmol/L de sacarosa, 15 g/L seroalbúmina bovina (BSA) y 0,5 mmol/L de 3-isobutil-1-metil-xantina, pH 7,4)y se incubó durante 1 hora a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% en aire. Después de la retirada de las soluciones de análisis, las células se lisaron y ensayaron para AMP cíclico usando un sistema de inmunoensayo enzimático Biotrak de Amersham Biosciences. Los experimentos con sueros que contenía anticuerpos del receptor de la TSH con actividad agonista de TSH se llevaron a cabo usando el mismo método, excepto que las muestras de suero se diluyeron 1:10 en tampón de ensayo de AMP cíclico antes del ensayo.
Medida de la actividad agonista del TSH
En algunos experimentos, se evaluó la capacidad de los sueros de pacientes y anticuerpos monoclonales de ratón para el TSHR de inhibir la actividad estimulante de la TSH porcina. Esto se llevó a cabo comparando (a) el efecto estimulante de la TSH sola con (b) el efecto estimulante de la TSH en presencia de suero de pacientes o anticuerpo monoclonal de ratón. Dicho brevemente, 50 µL de suero de paciente diluido en tampón de ensayo de AMP cíclico o 50 µL de anticuerpo monoclonal de ratón se añadieron a pocillos de células seguido por 50 µL de tampón o 50 µL de TSH (0,6ng/mL - concentración final 0,3ng/mL) y se incubaron para el ensayo de estimulación descrito antes. Después de la retirada de la solución de análisis, las células se lisaron y analizaron en cuanto al AMPc usando un sistema de inmunoensayo enzimático Biotrak.
Preparación de preparaciones TSHR de tipo natural y mutado solubilizadas en detergente
Células Flp-In-CHO que expresan el TSHR de tipo natural o el mutado se hicieron crecer hasta confluencia en matraces de 175 cm2, las células se lavaron con PBS de Dulbecco (sin iones magnesio ni calcio) (Invitrogen) y se aplicaron por rascado en 10 mL de tampón A enfriado con hielo (NaCl 50 mmol/L, Tris-HCl 10 mmol/L, pH 7,5), que contenía inhibidor de proteasa de Roche Diagnostics (1 comprimido de código del producto 1836145 por 50 mL de solución) y 1 mmol/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)). Las células se centrifugaron a 1000xg durante 5 minutos a 4ºC, el sedimento se resuspendió en 1 mL de tampón A y se homogeneizó en un homogeneizador de vidrio sobre hielo. Las membranas celulares se sedimentaron a 12.000xg durante 30 minutos a 4ºC y se resuspendieron en 6 mL de tampón A más 0,5 g/L de aziduro de sodio y 2,75 g/L de yodoacetamida y se sedimentaron como antes. El sedimento de membranas se resuspendió luego en 1 mL de tampón A enfriado con hielo que contenía Triton X-100 al 1% y 0,5 g/L de aziduro de sodio y se homogeneizó. Las preparaciones de TSHR solubilizadas se centrifugaron a 90.000xg durante 2 horas a 4ºC y los líquidos sobrenadantes se conservaron a -70ºC en partes alícuotas.
Unión de TSH marcada y anticuerpos monoclonales marcados a los TSHR de tipo natural y mutado
En estos experimentos se prepararon, como se ha descrito previamente (documento WO2004/050708A2), TSH porcina (70 unidades por mg de RSR Ltd) y anticuerpos monoclonales (Fab o IgG) tanto no marcados como marcados con 125I.
Primeramente, se establecieron los perfiles de dilución de cada preparación de TSHR. En estos experimentos, tubos de plástico (Maxisorp Star; NUNC) se revistieron durante una noche a 4ºC con 200 µL de un anticuerpo monoclonal de ratón para el C terminal del TSHR a 10µg/mL en tampón de revestimiento (Na2CO3 0,1 mmol/L, pH 9,2). Después de lavar y pos-revestir (10 mg/mL de BSA en agua) los tubos se lavaron con tampón de ensayo (Tris-HCl 10 mmol/L pH 7,8, NaCl 50 mmol/L y BSA 1 mg/mL) que contenía Triton X-100 al 0,1%. En la etapa siguiente se añadieron a los tubos 200 µL preparaciones de TSHR de tipo natural o mutado y se incubaron durante una noche a 4ºC. Los contenidos de los tubos se retiraron por aspiración, los tubos se lavaron con tampón de ensayo y se añadieron 50 µL de tampón de partida (RSR Ltd), 50 µL de tampón de ensayo y 50 µL de 125I-TSH o anticuerpo monoclonal marcado con 125I (10.000 – 15.000 cpm) y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación. Después de aspiración de las soluciones, los tubos se lavaron y se sometieron a recuento en un contador gamma.
Las diluciones de las preparaciones del TSHR que dan entre 15-40% de unión de TSH o anticuerpo monoclonal marcados se usaron para preparar tubos revestidos de TSHR para análisis. En algunos experimentos los 50 µL de tampón de ensayo fueron sustituidos por soluciones con concentraciones crecientes de TSH (0,4 -500 unidades/mL)
o anticuerpo monoclonal (0,001 – 1,0µg/mL) no marcados. Se calcularon las concentraciones de TSH o anticuerpo monoclonal unido y libre y se usó una gráfica de unido frente a unido/libre (análisis de Scatchard) para calcular la afinidad de unión para el TSHR.
Análisis de la estimulación de células CHO que contienen TSHR mutado
Se determinó la capacidad de la TSH o el hMAb TSHR1 para estimular la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR que contenía diversas mutaciones. Los resultados se muestran en detalle en las Tablas 2a2j, 15a-15x, y 27a-27h y se resumen en las Tablas 3, 16 y 28. La mayoría de las mutaciones causaron algo de reducción en la respuesta a tanto la TSH como el hMAb TSHR1. Sin embargo, hubo claras diferencias entre los efectos de las mutaciones en la respuesta a la hormona y al anticuerpo en los cases de Arg80 a Ala, Arg80 a Asp, Tyr82 a Ala, Glu107 a Ala, Arg109 a Ala, Arg109 a Asp, Lys129 a Ala, Lys129 a Asp, Phe130 a Ala, Lys183 a Ala, Lys183 a Asp, Tyr185 a Ala, Asp232 a Ala, Arg255 a Ala, Trp258 a Ala y las dobles mutaciones Arg255 a Ala y Trp258 a Ala; Trp258 a Ala y Lys183 a Ala; Trp258 a Ala y Tyr185 a Ala. La mutación de cualquiera de estos aminoácidos causó una reducción marcada en la respuesta al hMAb TSHR1, mientras se mantuvo esencialmente la respuesta a la TSH.
Los efectos de mutar Asp232, Arg255 y Trp258 se investigaron en algún detalle. En el caso de Asp232 la glutamina cercana (Glu235) fue mutada a Ala. Sin embargo, esta mutación tuvo poco efecto (con respecto al tipo natural) sobre la estimulación por la TSH o el hMAb TSHR1 (Tabla 4a). Similarmente, la mutación de treonina 257 adyacente a Trp258 tuvo poco efecto sobre la estimulación de la hormona o anticuerpo (Tabla 4b). Sin embargo, las mutaciones dobles de Arg255 a Ala y Trp258 a Ala; Trp258 a Ala y Lys183 a Ala; Trp258 a Ala y Tyr185 a Ala tuvieron poco o ningún efecto sobre la estimulación por la TSH pero la estimulación por hMAb TSHR1 fue esencialmente suprimida (Tablas 4c, 27g y 27h respectivamente). Además, la mutación de Arg255 (aa positivamente cargado) al ácido aspártico negativamente cargado (en lugar del neutro Ala) también suprimió esencialmente la respuesta al hMAb TSHR1, pero tuvo poco o ningún efecto sobre la estimulación por la TSH (Tabla 4d). Estos resultados se resumen en las Tablas 5 y 28.
También se estudió el efecto de mutar Arg255 a Asp sobre la capacidad de sueros que contienen auto-anticuerpos del THSR del 14 pacientes diferentes con la enfermedad de Graves y los resultados se muestran en la Tabla 6. Como puede verse en la Tabla, las células CHO que expresan este mutante tuvieron respuesta más reducida (con respecto al tipo natural) a todos los 14 sueros. En contraste, las mutaciones de Arg80 a Ala, Arg80 a Asp, Glu107 a Ala, Arg109 a Ala, Arg109 a Asp, Lys129 a Ala, Lys183 a Ala y Lys183 a Asp afectaron algo a los sueros, pero no redujeron la respuesta a todos los sueros estimulantes analizados (Tablas 19a-19h y resumido en la Tabla 20). Sólo Arg 255 a Asp y la doble mutación Trp258 a Ala y Arg255 a Ala fueron capaces de reducir la respuesta de todos los sueros ensayados (Tablas 6, 19i y resumido en Tabla 20).
La Tabla 7 muestra la estimulación de la producción de AMP cíclico por diferentes dosis de hMAb TSHR1 IgG y el plasma donante (obtenido de la misma muestra de sangre usada para aislar linfocitos para la preparación del hibridoma hMAb TSHR1) en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Arg255 mutado a Asp. Los efectos de tanto la IgG como el plasma sobre el TSHR mutado fueron más reducidos con respecto al tipo natural y los efectos de respuesta a la dosis dieron similares. Los efectos de diversos anticuerpos monoclonales de ratón con actividad estimulante del tiroides (los mTSMAb preparados como en el documento WO 03/018632A2) también se analizaron en términos de su capacidad para estimular la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR de tipo natural y los TSHR con Arg255 mutado a Asp (Tabla 8), Arg80 a Asp, Glu107 a Ala, Arg109 a Ala, Arg109 a Asp, Lys129 a Ala, Lys183 a Ala, Lys183 a Asp (Tablas 21a-g). Como puede verse en la Tabla 8 y las Tablas 21a-g y resumido en la Tabla 22 el efecto estimulante de los mTSMAb fue esencialmente suprimido por las mutaciones. También se investigó la capacidad del suero de 4 pacientes con actividad antagonista de la TSH, para influenciar la estimulación por la TSH de la producción de AMP cíclico, en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Arg255 mutado a Asp. Todos los 4 sueros actuaron como potentes antagonistas de la TSH en células CHO que expresaban TSHR de tipo natural y mutado (Tabla 9).
Además, los estudios de dosis-respuesta indicaron que el efecto antagonista de la TSH era más fuerte a las dosis más bajas (mayor dilución) de suero de pacientes en las células que expresaban el receptor mutado (Tabla 10).
Además, la mutación Glu107 a Ala mostró un efecto antagonista aumentado similar con sueros de pacientes (Tablas 23a y 24), mientras que otras 2 mutaciones, Arg109 a Ala y Lys183 a Ala no tuvieron efecto (Tablas 23b&c y 24) (resumen en la Tabla 24). También se investigaron las acciones de un anticuerpo monoclonal de ratón frente al TSHR con fuertes actividades antagonistas de la TSH (y antagonista de hMAb TSHR1) (9D33, descritas en el documento WO2004/05078A2) (Tablas 11, 13a-j, 17a-v y resumen en las Tablas 14 y 18). Como puede verse en la Tabla 11, 9D33 fue capaz de bloquear la estimulación por la TSH de células CHO que expresan TSHR de tipo natural o TSHR con Arg255 mutado a Asp. Además, el efecto antagonista de 9D33 fue más fuerte a dosis más bajas en células que expresan el receptor mutado (Tabla 11). Otras dos mutaciones Asp160 a Ala y Arg274 a Ala mostraron efecto antagonista aumentado con 9D33 comparado con el TSHR de tipo natural (Tablas 17n y 17v), mientras que Lys58 a Ala, Arg80 a Ala, Arg80 a Asp, Tyr82 a Ala, Glu107 a Arg, Arg109 a Ala, Arg109 a Asp, Lys129 a Ala, Lys129 a Asp, Phe134 a Ala y Lys250 a Ala mostraron reducción en la capacidad de 9D33 de bloquear la estimulación de la TSH en células CHO que expresan estos TSHR mutados (Tabla 17 y resumen en la Tabla 18). Sin embargo, 19 de cada 32 mutaciones diferentes estudiadas no tuvieron efecto sobre la capacidad de 9D33 de bloquear la estimulación por la TSH de la producción de AMP cíclico (Tablas 13, 14, 17 y 18).
Análisis de la unión a TSHR mutado
Los efectos de mutar diversos aa de TSHR a alanina, arginina o ácido aspártico sobre la unión de la TSH, hMAb TSHR1 y el MAb 9D33 se muestran en las Tablas 12, 25, 29 y se resumen en la Tabla 26.
Las mutaciones de Asp43 a Ala, Glu61 a Ala, Asp203 a Ala, Gln235 a Ala, Glu251 a Ala, Asp276 a Ala y Ser281 a Ala tuvieron poco o ningún efecto sobre la unión de la TSH, el hMAb TSHR1 o el 9D33. Sin embargo, las mutaciones de Glu107 a Arg, Arg109 a Asp, Lys129 a Asp, Lys183 a Asp y Asp232 a Ala o Arg dieron como resultado que la unión de la TSH, el hMAb TSHR1 y el 9D33 MAb llegaran a ser no detectables. La mutación de Tyr206 a Ala tuvo una unión no detectable a la TSH y 9D33, mientras que el hMAb TSHR1 no se analizó. Las mutaciones de Glu157 a Ala, Asp160 a Ala, Lys209 a Ala, Thr257 a Ala y Trp258 a Ala impidieron la unión detectable a la TSH, pero tuvo poco o ningún efecto sobre la unión del hMAb TSHR1 y el MAb 9D33. Las mutaciones de Lys58 a Ala, Ile60 a Ala y Tyr82 a Ala mostraron una unión no detectable al MAb 9D33, mientras que la unión al hMAb TSHR1 y la TSH fue similar a la de al tipo natural. Las mutaciones de Arg80 a Ala y Arg80 a Asp dieron como resultado la unión no detectable del MAb 9D33 y hMAb TSHR1, mientras que la TSH todavía permanecía unida en el pocillo. Las mutaciones de Glu107 a Ala y Phe134 a Ala dieron como resultado una menor afinidad de unión para hMAb TSHR1 y el MAb 9D33, mientras que la TSH permanecía todavía en el pocillo. La mutación de Arg109 a Ala mostró una ligera reducción en la unión de la TSH, mientras que la unión del hMAb TSHR1 permanecía inalterada y la unión del MAb 9D33 fue no detectable. Las menores afinidades de unión para tanto TSH como hMAb TSHR1 se observaron cuando el Glu178 fue mutado a Ala, mientras que la unión del MAb 9D33 fue no afectada. En el caso de Lys129 a Ala, la TSH todavía permanecía en el pocillo, mientras que la afinidad para el hMAb TSHR1 fue marcadamente reducida y la unión del MAb 9D33 fue no detectable. Las mutaciones de Phe130 a Ala, Tyr185 a Ala y Arg255 a Ala dieron como resultado una marcada reducción en la unión del hMAb TSHR1 y una reducción en la unión del MAb 9D33, mientras que la TSH todavía permanecía en el pocillo. En el caso de Arg255 a Asp, la unión de TSH fue no detectable y la afinidad de unión del hMAb TSHR1 fue marcadamente reducida, mientras que la unión del MAb 9D33 fue no afectada. En el caso de Lys250 a Ala, Arg274 a Ala y Tyr279 a Ala, la unión de la TSH fue no detectable, mientras que las afinidades de unión del hMAb TSHR1 y 9D33 fueron reducidas. La mutación Lys183 a Ala aumentó la afinidades de unión de la TSH (no se analizaron el hMAb TSHR1 y el MAb 9D33) (Tabla 25) como lo hizo la doble mutación Tyr185 a Ala y Lys183 a Ala (no se analizó la unión del hMAb TSHR1, mientras que la del MAb 9D33 fue reducida) (Tabla 29).
La doble mutación Arg255 a Ala y Trp258 a Ala mostró unión no detectable de la TSH, una afinidad ligeramente reducida para hMAb TSHR1, mientras que el MAb 9D33 todavía estaba unido en el pocillo (Tabla 25). Las mutaciones Asp232 a Arg y Arg255 a Asp; Asp232 a Ala y Trp258 a Ala; Asp232 a Ala, Arg255 a Ala y Trp258 a Ala; Trp258 a Ala y Lys183 a Ala; Arg255 a Ala y Lys183 a Ala; Trp258 a Ala, Lys183 a Ala y Tyr185 a Ala; Arg255 a Ala, Trp258 a Ala, Tyr185 a Ala y Lys183 a Ala todas mostraron unión no detectable a TSH, hMAb TSHR1 y MAb 9D33 (Tabla 29). La doble mutación Asp232 a Ala y Arg255 a Ala tampoco mostraron unión a la TSH o el MAb 9D33 y la afinidad para el hMAb TSHR1 no se analizó (Tabla 29). En el caso de doble mutación Glu 157 a Ala y Asp203 a Ala, la unión de la TSH fue no detectable, la unión al hMAb TSHR1 fue similar al de tipo natural mientras que la unión del MAb 9D33 fue reducida (Tabla 29). Las mutaciones de Glu178 a Ala y Asp203 a Ala; Trp258 a Ala y Tyr185 a Ala; Arg255 a Ala y Tyr185 a Ala; Arg255 a Ala, Trp258 a Ala y Tyr185 a Ala dieron unión de la TSH no detectable, unión del hMAb TSHR1 marcadamente reducida y unión del MAB 9D33 ligeramente reducida (Tabla 29). En el caso de Arg255 a Ala, Lys183 a Ala y Tyr185 a Ala, ambas uniones del TSH y el hMAb TSHR1 fueron no detectables mientras que la unión del MAb 9D33 fue reducida (Tabla 29).
CONCLUSIONES / INTERPRETACIÓN
1) Se observaron los efectos de mutar aa individuales seleccionados del TSHR en términos de estimulación de la producción de AMP cíclico por diversos ligandos.
Para nuestra sorpresa, la mutación de algunos aa tenía una mayor influencia sobre la unión y/o la estimulación del hMAb TSHR1 que sobre la unión y/o estimulación de la TSH. Esta diferencia entre el efecto de la hormona y el anticuerpo fue más evidente en el caso de la mutación de los aa Arg80 a Ala, Arg80 a Asp, Tyr82 a Ala, Glu107 a Ala, Arg109 a Ala, Arg109 a Asp, Lys129 a Ala, Lys129 a Asp, Phe130 a Ala, Lys183 a Ala, Lys183 a Asp, Tyr185 a Ala, Asp232 a Ala, Arg255 a Ala y Trp258 a Ala. Además la doble mutación Arg255 a Ala y Trp258 a Ala tuvo un efecto más fuerte que la mutación Arg255 a Ala solo o Trp258 a Ala solo.
Además, la mutación de Arg255 a Asp opuestamente cargado suprimió esencialmente los efectos estimulantes del hMAb TSHR1, mientras que la estimulación por TSH fue esencialmente no afectada. También los auto-anticuerpos del receptor de la TSH en 14 pacientes diferentes con enfermedad de Graves tuvieron su efecto estimulante esencialmente suprimido por la mutación Arg255 a Asp al igual que 6 anticuerpos monoclonales estimulantes del tiroides de ratón.
En contraste a la mutación de Arg255 a Asp, las mutaciones de otros aa del TSHR incluyendo Arg80 a Ala, Arg80 a Asp, Glu107 a Ala, Arg109 a Ala, Arg109 a Asp, Lys129 a Ala, Lys183 a Ala, Lys183 a Asp y la doble mutación de Arg255 a Ala y Trp258 a Ala redujeron o suprimieron el efecto estimulante del hMAb TSHR1, pero no en todos los auto-anticuerpos del THSR de suero de pacientes analizados.
2) Consecuentemente, y sorprendentemente la mutación del aa Arg255 del TSHR fue la única encontrada que permitió una distinción clara entre las acciones estimulantes de la TSH y los auto-anticuerpos del THSR del suero de los pacientes (incluyendo el hMAb TSHR1).
3) Los sueros de pacientes con actividad antagonista de la TSH son eficaces en bloquear la estimulación de la TSH de células CHO que expresan el TSHR mutado (mutación del Arg255 a Asp). También, un anticuerpo monoclonal de ratón con potente actividad antagonista de TSH (9D33) es un antagonista de la TSH eficaz en células CHO que expresan el receptor de tipo natural o mutado (Arg255 a Asp).
También encontramos que la mutación del aa Arg109 a Ala impidió la capacidad de 9D33 de inhibir la estimulación de la TSH, pero esta mutación no tuvo efecto sobre la capacidad de un auto-anticuerpo del TSHR de suero (auto-anticuerpo antagonista de la TSH) de bloquear la estimulación de la TSH.
4) Consecuentemente la mutación de Arg255 del TSHR a Asp suprime esencialmente la capacidad de los auto-anticuerpos del THSR de tipo agonista de la TSH (incluyendo el hMAb TSHR1) de interactuar con el receptor. En contraste, los auto-anticuerpos del THSR de tipo antagonista de la TSH (y la TSH) son capaces de reaccionar bien con el receptor mutado. La mutación de Arg255 del TSHR a Asp se puede usar, por tanto, para distinguir entre auto-anticuerpos del THSR con actividades agonistas y antagonistas de la TSH.
5) El análisis de la unión de la TSH marcada y hMAb TSHR1 marcado a preparaciones del TSHR de tipo natural y mutado indicó que la mutación Arg255 a Ala redujo la afinidad del receptor para el hMAb TSHR1, pero tuvo poco efecto sobre la unión de la TSH. Esto es consistente con el efecto de la mutación en la estimulación de la producción de AMP cíclico.
En el caso de la mutación Asp232 a Ala, no fue detectable la unión de la hormona o el anticuerpo, debido probablemente a los reducidos niveles de expresión del receptor de la TSH mutado. La unión de la TSH también fue no detectable cuando Trp258 fue mutado a Ala, mientras que la unión del hMAb TSHR1 solamente se redujo aproximadamente 3 veces.
En las tablas AMP cíclico se abrevia a veces a AMPc y DT significa desviación típica.
F =cebador "delantero".
R = cebador “trasero”.
BGH R = cebador trasero de la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina
T7 = promotor de RNA-polimerasa del bacteriófago T7.
La secuencia en negritas representa el codón mutado. La secuencia situada encima de las bases en negritas muestra la secuencia original del THSR.
- Mutación de Asp43 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT*; n = 3)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1636 ± 204 1940 ± 48 119
- 0,3
- 2550 ± 196 2772 ± 98 109
- 1
- 11362 ± 1120 12660 ± 3610 111
- 3
- 14498 ± 1400 13308 ± 1030 92
- 10
- 24914 ± 4330 17962 ± 1360 72
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 902 ± 168 894 ± 104 99
- 0,03
- 1454 ± 82 1532 ± 326 105
- 0,1
- 4210 ± 240 3996 ± 612 95
- 0,3
- 9158 ± 1440 8986 ± 560 98
- 1
- 20136 ± 1380 11864 ± 1200 59
- 3
- 24812a 13496 ± 920 54
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 616 ± 30 680 ± 100
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1564 ± 390 1648 ± 120 105
- 0,3
- 3594 ± 426 3416 ± 522 95
- 1
- 10750 ± 200 6940 ± 530 65
- 3
- 17850 ± 940 16630 ± 1820 93
- 10
- 24850 ± 3050 20064 ± 1040 81
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1000 ± 98 742 ± 60 74
- 0,03
- 1380 ± 326 1164 ± 282 83
- 0,1
- 2920 ± 498 2136 ± 142 73
- 0,3
- 10700 ± 960 6650 ± 1040 62
- 1
- 17200 ± 4010 13980 ± 330 81
- 3
- 27864 ± 350 14260 ± 1460 51
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 720 ± 22 670 ± 16
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1avalor medio del duplicado
- Mutación de Glu61 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células (valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1648 998 61
- 0,3
- 3678 3204 87
- 1
- 19912 16020 80
- 3
- 25336 22304 88
- 10
- 28292 23370 83
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 740 482 65
- 0,03
- 824 612 74
- 0,1
- 2324 1688 73
- 0,3
- 4320 3392 79
- 1
- 24168 12914 53
- 3
- 23332 15842 68
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 578 366
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 1808 1312 73
- 0,1
- 3926 2738 70
- 0,3
- 11452 6400 56
- 1
- 20400 20962 103
- 3
- 20114 26718 133
- 10
- TSH (ng/mL)
- 992 722 73
- 0,01
- 1796 960 53
- 0,03
- 3316 2452 74
- 0,1
- 10440 5296 51
- 0,3
- 15826 13840 87
- 1
- 17582 19448 111
- 3
- 794 680
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1
- Mutación de Glu157 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células (valor medio ± DT; n = 3 o valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1682 1216 72
- 0,3
- 4150 1284 31
- 1
- 13668 6264 46
- 3
- 17390 8366 48
- 10
- 25920 13156 51
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 548 800 146
- 0,03
- 760 820 107
- 0,1
- 2560 1190 46
- 0,3
- 5124 2668 52
- 1
- 19034 3288 17
- 3
- 22720 12830 56
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 582 710
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1584 ± 66 1490 ± 12 94
- 0,3
- 3568 ± 174 2584 ± 250 72
- 1
- 14560 ± 1680 7260 ± 990 50
- 3
- 16560 ± 2210 15350 ± 3370 93
- 10
- 20900 ± 3930 14910 ± 1120 71
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1410 ± 270 1330 ± 206 94
- 0,03
- 1592 ± 28 1308 ± 216 82
- 0,1
- 3788 ± 534 1842 ± 54 49
- 0,3
- 10500 ± 170 2500 ± 1730 24
- 1
- 16730 ± 1650 7100 ± 740 42
- 3
- 32000 11380 ± 300 36
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 774 ± 58 1124 ± 42
- Experimento 3
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1040 1260 121
- 0,3
- 1644 2000 122
- 1
- 12588 10924 87
- 3
- 15736 14816 94
- 10
- 21950 26304 120
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 708 1026 145
- 0,03
- 914 1486 163
- 0,1
- 2458 2008 82
- 0,3
- 5916 2444 41
- 1
- 17014 8382 49
- 3
- 20002 15158 76
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 608 988
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1
- Mutación de Glu178 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1210 1346 111
- 0,3
- 2710 2012 74
- 1
- 9190 4528 49
- 3
- 13790 9524 69
- 10
- 24166 12492 52
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 970 828 85
- 0,03
- 1416 1148 81
- 0,1
- 2218 1464 66
- 0,3
- 4564 3188 70
- 1
- 12524 9918 79
- 3
- 18440 13722 74
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 540 910
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1354 1028 76
- 0,3
- 3372 1424 42
- 1
- 8820 3822 43
- 3
- 15524 8070 52
- 10
- 19540 12040 62
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 826 648 78
- 0,03
- 1042 810 78
- 0,1
- 2446 1182 48
- 0,3
- 5626 3018 54
- 1
- 13900 8050 58
- 3
- 19330 9080 47
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 804 672
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1
- Mutación de Asp203 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células (valor medio ± DT; n = 3 o valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1202 ± 222 968 ± 58 81
- 0,3
- 2508 ± 1198 1512 ± 162 60
- 1
- 8052 ± 1290 4824 ± 520 60
- 3
- 13696 ± 4150 8204 ± 310 60
- 10
- 16974 ± 1920 9680 ± 3420 57
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 796 ± 34 668 ± 96 84
- 0,03
- 1028 ± 72 984 ± 124 96
- 0,1
- 2216 ± 610 1248 ± 82 56
- 0,3
- nd 5700 ± 380 nd
- 1
- 14976 ± 1990 8258 ± 116 55
- 3
- 18592 ± 1740 11406 ± 4130 61
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 804 ± 48 614 ± 36
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1666 1712 103
- 0,3
- 2978 2642 89
- 1
- nd nd nd
- 3
- 13592 11414 74
- 10
- 14798 21486 123
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1146 660 58
- 0,03
- 1566 1360 87
- 0,1
- 2048 2232 109
- 0,3
- 5236 3112 59
- 1
- 16252 8790 54
- 3
- 16092 16328 101
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 610 560
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1 nd = no determinado
- Mutación de Asp232 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3 o valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1776 720 41
- 0,3
- 4086 1442 35
- 1
- 10000 3560 36
- 3
- 18030 8120 45
- 10
- 11250 11210 100
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 730 632 87
- 0,03
- 978 798 82
- 0,1
- 2436 1998 92
- 0,3
- 5600 5600 100
- 1
- 10170 7400 73
- 3
- 12800 9384 73
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 368 586
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1006 ± 156 804 ± 384 80
- 0,3
- 2236 ± 94 968 ± 24 43
- 1
- 11138 ± 1080 3894 ± 320 35
- 3
- 12188± 860 5984 ± 690 49
- 10
- 16212 ± 570 9476 ± 650 58
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 850 ± 54 606 ± 34 71
- 0,03
- 908 ± 148 956 ± 152 105
- 0,1
- 2026 ± 202 1652 ± 256 82
- 0,3
- 4488 ± 2060 3632 ± 384 81
- 1
- 12034 ± 860 7280 ± 1070 60
- 3
- 16886 ± 1400 12216 ± 1460 72
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 538 ± 40 560 ± 24
- os experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1
- Mutación de Arg255 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3 o valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1644 ± 156 706 ± 108 43
- 0,3
- 3370 ± 256 808 ± 44 24
- 1
- 16964 ± 1380 4172 ± 660 25
- 3
- 18078± 1210 8500 ± 880 47
- 10
- 17820± 1150 11208 ± 670 63
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 950 ± 86 826 ± 50 87
- 0,03
- 1444 ± 90 1416 ± 86 98
- 0,1
- nd 3784 ± 1410 nd
- 0,3
- 8624 ± 360 8920 ± 460 103
- 1
- 16014 ± 1220 12164 ± 1060 76
- 3
- 16244 ± 1570 13128 ± 1170 81
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 830 ± 140 718 ± 48
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1454 400 28
- 0,3
- 3126 534 17
- 1
- 6400 2278 36
- 3
- 11412 2606 23
- 10
- 16878 9584 57
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 450 404 90
- 0,03
- 778 610 78
- 0,1
- 1710 1566 92
- 0,3
- 4690 4680 100
- 1
- 10082 7180 71
- 3
- 14830 11938 80
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 496 290
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1 nd = no determinado
- Mutación de Trp258 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2040 1464 72
- 0,3
- 4908 4198 86
- 1
- nd 5964 nd
- 3
- 17958 11242 63
- 10
- 29824 14208 48
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1354 952 70
- 0,03
- 1464 1646 112
- 0,1
- 2954 3592 122
- 0,3
- 12154 10398 86
- 1
- 17270 14774 86
- 3
- 13142 17270 131
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 526 390
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2404 1206 50
- 0,3
- 5902 2518 43
- 1
- nd nd nd
- 3
- 32000 9550 30
- 10
- 32000 17782 56
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1026 514 50
- 0,03
- 2000 1416 71
- 0,1
- nd nd nd
- 0,3
- 10716 12022 112
- 1
- 16596 13804 83
- 3
- 26302 18620 71
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 698 1158
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1 nd = no determinado
- Mutación de Asp276 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1490 1530 103
- 0,3
- 3056 3208 105
- 1
- nd nd nd
- 3
- 12136 19610 162
- 10
- 21740 24030 111
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1184 1282 108
- 0,03
- 1470 1550 105
- 0,1
- 3188 3748 118
- 0,3
- 9466 9180 97
- 1
- 12796 15670 122
- 3
- 13820 23070 167
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 866 960
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1346 2130 158
- 0,3
- 4120 nd nd
- 1
- nd nd nd
- 3
- 14216 15236 107
- 10
- 18230 21320 117
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 866 1236 143
- 0,03
- 934 1594 171
- 0,1
- 2124 2160 102
- 0,3
- 5400 6000 111
- 1
- 9880 16640 168
- 3
- 16846 20480 122
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 894 1132
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1 nd = no determinado
- Mutación de Ser281 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio; n = 2)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1080 936 87
- 0,3
- 3236 2490 77
- 1
- nd 4722 nd
- 3
- 15556 10416 67
- 10
- 27712 17190 62
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 402 828 206
- 0,03
- 708 1152 163
- 0,1
- 2068 1464 71
- 0,3
- 5200 3188 61
- 1
- 18548 9918 53
- 3
- 24136 13722 57
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 550 356
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1500 1400 93
- 0,3
- 4706 4486 95
- 1
- nd nd nd
- 3
- 17110 11418 67
- 10
- 23010 16384 71
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 402 566 141
- 0,03
- 708 1028 145
- 0,1
- 2068 1824 88
- 0,3
- 5200 6250 120
- 1
- 18548 10032 54
- 3
- 24136 14130 59
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 582 696
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1 nd = no determinado
Tabla 3. Resumen de los efectos de la mutación (con relación al tipo natural) sobre la estimulación de células CHO que contienen TSHR mutado
- Mutación del aa
- Estimulación de la TSH Estimulación del Fab del hMAb TSHR1
- Asp43 a Ala
- Algo de reducción Algo de reducción
- Glu61 a Ala
- Algo de reducción Algo de reducción
- Glu 157 a Ala
- Reducción marcada de algunas dosis de la TSH Reducción marcada de algunas dosis de la TSH
- Glu178 a Ala
- Algo de reducción Algo de reducción
- Asp203 a Ala
- Algo de reducción Algo de reducción
- Asp232 a Ala
- Algo de reducción Reducción marcada
- Arg255 a Ala
- Algo de reducción Reducción marcada
- Trp258 a Ala
- Poco efecto Reducción marcada
- Asp276 a Ala
- Poco efecto Poco efecto
- Ser281 a Ala
- Algo de reducción Algo de reducción
- Mutación de Gln235 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/ pocillo de células) (valor medio ± DT (n = 3)
- Experimento 1
- TSHR tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 770 ± 6174 764 ± 108 99
- 0,3
- 3020 ± 398 2434 ± 140 81
- 1
- 5904 ± 650 6356 ± 970 108
- 3
- 10538 ± 2380 13320 ± 2080 126
- 10
- 17314 ± 1980 13486 ± 2290 78
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 252 ± 58 234 ± 24
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 422 ± 28 482 ± 34 114
- 0,03
- 816 ± 138 810 ± 116 99
- 0,1
- 1412 ± 86 1488 ± 264 105
- 0,3
- 4756 ± 280 4358 ± 690 92
- 1
- 9722 ± 2330 12656 ± 160 130
- 3
- 12826 ± 5000 14266 ± 2730 111
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 252 ± 58 234 ± 24
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1958 ± 40 1722 ± 172 88
- 0,3
- 3374 ± 244 3378 ± 556 100
- 1
- 11144 ± 1850 11128 ± 350 100
- 3
- 15536 ± 820 18374 ± 3140 118
- 10
- 17830 ± 1560 17616 ± 1750 99
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 518 ± 264 374 ± 70
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1074 ± 272 1054 ± 222 98
- 0,03
- 2062 ± 310 1878 ± 298 91
- 0,1
- 4192 ± 992 2912 ± 254 69
- 0,3
- 1260 ± 740 10458 ± 1240 93
- 1
- 14364 ± 720 18170 ± 1680 126
- 3
- 18175 ± 1220 20128 ± 3240 111
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 518± 264 374 ± 70
- En todos los experimentos se usó el Fab del hMAb TSHR1Fab
- Mutación de Thr257 del TSHR a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1080 ± 26 972 ± 24 90
- 0,3
- 2438 ± 382 1796 ± 366 74
- 1
- 16096 ± 4100 12862 ± 4960 80
- 3
- 16788 ± 3320 11692 ± 1250 70
- 10
- 23688 ± 3800 19994 ± 3380 84
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 550 ± 58 402 ± 132
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 680 ± 54 716 ± 216 105
- 0,03
- 996 ± 96 1142 ± 98 115
- 0,1
- 1752 ± 226 3188 ± 364 182
- 0,3
- 6962 ± 1320 6284 ± 100 90
- 1
- 12316 ± 4250 12486 ± 3100 101
- 3
- 18212 ± 3670 16674 ± 1650 92
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 550 ± 58 402 ± 132
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1532 ± 580 998 ± 80 65
- 0,3
- 3656 ± 744 2718 ± 286 74
- 1
- 8516 ± 2600 5694 ± 310 67
- 3
- 23294 ± 6540 21948 ± 740 94
- 10
- 30580 ± 400 27366 ± 2330 89
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 690 ± 50 584 ± 66
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 864 ± 62 776 ± 34 90
- 0,03
- 1244 ± 550 1084 ± 1,2 87
- 0,1
- 2882 ± 584 3390 ± 294 118
- 0,3
- 8584 ± 2260 6996 ± 680 82
- 1
- 19548 ± 5380 25080 ± 3710 128
- 3
- 30344 31488 ± 430 104
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 690 ± 50 584 ± 66
- En todos los experimentos se uso el Fab del hMAb TSHR1
- Mutación de Arg255 del TSHR a Ala y Trp258 a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1718 ± 92 1502 ± 78 87
- 0,3
- 3116 ± 204 122 ± 428 52
- 1
- 15540 ± 2370 2708 ± 340 17
- 3
- 14408 ± 1960 1958 ± 280 14
- 10
- 18652 ± 2170 5506 ± 130 30
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1968 ± 136 1786 ± 66 91
- 0,03
- 2754 ± 318 2628 ± 144 95
- 0,1
- 4246 ± 196 4488 ± 742 106
- 0,3
- 12026 ± 870 12608 ± 1570 105
- 1
- 18016 ± 3270 16362 ± 700 91
- 3
- 18256 ± 990 19162 ± 1230 105
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1014 ± 220 1386 ± 460
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1778 ± 24 646 ± 48 36
- 0,3
- 3282 ± 622 676 ± 14 21
- 1
- 7054 ± 2380 720 ± 270 10
- 3
- 15036 ± 700 1876 ± 240 12
- 10
- 18292 ± 2130 3330 ± 620 18
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 910 ± 146 796 ± 60 87
- 0,03
- 1998 ± 252 1558 ± 80 78
- 0,1
- 5492 ± 402 4066 ± 644 74
- 0,3
- 8304 ± 1280 7238 ± 850 87
- 1
- 16858 ± 1210 13718 ± 1250 81
- 3
- 17088 ± 2130 18132 ± 2870 106
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 666 ± 88 662 ± 78
- En todos los experimentos se uso el Fab del hMAb TSHR1
- Mutación de Arg255 del TSHR a Asp
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1124 ± 48 488 ± 60 43
- 0,3
- 2578 ± 152 478 ± 50 19
- 1
- 8950 ± 680 370 ± 150 4
- 3
- 14870 ± 2520 620 ± 110 4
- 10
- 13750 ± 1620 1440 ± 20
- 10
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1110 ± 166 776 ± 94 70
- 0,03
- 1360 ± 210 1206 ± 54 89
- 0,1
- 3246 ± 594 2806 ± 586 86
- 0,3
- 8880 ± 800 8340 ± 350 94
- 1
- 10030 ± 2040 12400 ± 390 124
- 3
- 12260 ± 140 9980 ± 510 81
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 270 ± 84 170 ± 40
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1088 ± 88 374 ± 18 34
- 0,3
- 2250 ± 240 360 ± 30 16
- 1
- 5904 ± 620 154 ± 8 3
- 3
- 10604 ± 420 190 ± 4 2
- 10
- 17010 150 ± 20 1
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 516 ± 58 590 ± 148 114
- 0,03
- 1048 ± 320 908 ± 54 87
- 0,1
- 3788 ± 644 2382 ± 858 63
- 0,3
- 6906 ± 1090 9278 ± 1310 134
- 1
- 18284 ± 3660 9910 ± 1100 54
- 3
- 17370 16000 92
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 670 ± 548 424 ± 54
Tabla 5. Resumen del efecto de las mutaciones (con relación al tipo natural) en la estimulación de células CHO que contienen TSHR mutado
- Mutación de aa
- Estimulación de la TSH Estimulación de Fab del hMAb TSHR1
- Gln235 a Ala
- Poco efecto Poco efecto
- Thr237 a Ala
- Poco efecto Poco efecto
- Arg255 a Asp
- Poco efecto Esencialmente suprimida
- Arg255 a Ala y Trp258 a Ala
- Poco efecto Esencialmente suprimida
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) valor medio ± DT (n = 3)
- Experimento 1
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 520 ± 350 650 ± 4 125
- Mezcla de HBD
- 570 ± 360 420 ± 360 74
- G1
- 11490 ± 1030 3840 ± 400 33
- G2
- 9250 ± 950 1420 ± 630 15
- G3
- 4590 ± 910 950 ± 240 21
- G4
- 7340 ± 370 750 ± 570 10
- G5
- 8480 ± 800 1390 ± 200 16
- G6
- 3820 ± 480 1140 ± 200 30
- G7
- 7880 ± 580 1680 ± 210 21
- G8
- 9310 ± 650 2530 ± 380 27
- TSH (3ng/mL)
- 10180 ± 640 12000 ± 1960 118
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 12060 ± 1130 1860 ± 190 15
- Experimento 2
- Tampón de ensayo de AMP cícli-150 ± 20
- 340 ± 330 227
- HBD
- 150a 150 ± 10 100
- G9
- 12250 ± 1590 1470 ± 150 12
- G10
- 5880 ± 160 560 ± 350 10
- G11
- 1790 ± 230 340 6300 19
- G12
- 3290 ± 360 140a 4
- G13
- 8580 ± 730 2160 ± 140 25
- G14
- 2750 ± 20 700 ± 80 25
- TSH (3ng/mL)
- 21130a 20580 ± 2520 97
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 19240 ± 2550 1510 ± 310 8
- a valor medio del duplicado HBD = mezcla de sueros sanguíneos de donantes sanos d
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Dilución o concentraciónb de la muestra
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- HBD/10
- 580 ± 180 270c 47
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico l
- 790 ± 180 450 ± 160 57
- TSH (3ng/mL)
- 19010 ± 2360 16120 ± 1230 85
- hMAb TSHR1 IgG
- 1ng/mL
- 4860 ± 720 940 ± 70 19
- 10ng/mL
- 16230 ± 230 3160 ± 380 19
- 100ng/mL
- 15410 ± 1400 5700 ± 360 37
- 1µg/mL
- 16340 ± 3690 5030 ± 780 31
- Dilución del plasma del donante
- 2000x
- 2400 ± 130 820 ± 120 34
- 1000x
- 4180 ± 980 970 ± 240 23
- 200x
- 11020 ± 900 1790 ± 240 16
- 100x
- 14860 ± 1560 2550 ± 530 17
- 20x
- 15750 ± 1480 3160 ± 500 20
- aEl plasma del donante se obtuvo de la misma muestra de sangre usada para aislar linfocitos para la preparación del hibridoma del hMAb TSHR1 bMuestras diluidas en tampón de ensayo de AMP cíclico. cValor medio del duplicado. HBD = mezcla de sueros sanguíneos de donantes sanos.
Tabla 8. Estimulación de la producción de AMP cíclico por 6 diferentes anticuerpos monoclonales estimulantes del tiroides de ratón (mTSMAbs) en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y con TSHR con Arg255 mutado a Asp
- AMP producido (fmol/ pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra de ensayoa
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico l
- 502 ± 76 456 ± 30 91
- hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 18220 ± 1210 1160 ± 150 6
- 2G2 (1µg/mL)
- 524 ± 22 540 ± 20 103
- TSMAb 1 (1µg/mL)
- 4810 ± 1250 1740 ± 170 36
- TSMAb 2 (1µg/mL)
- 3440 ± 420 860 ± 90 25
- TSMAb C (10ng/mL)
- 9960 ± 1130 1490 ± 150 15
- TSMAb D (1µg/mL)
- 10850 ± 1340 1520 ± 170 14
- TSMAb E (1µg/mL)
- 2490 ± 160 640 ± 10 26
- TSMAb F (100ng/mL)
- 16200 ± 2680 2670 ± 110 16
- aMuestras para análisis en tampón de AMP cíclico. 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo).
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra de ensayoa
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 936 ± 336 636 ± 86 68
- TSHb
- 9550 ± 740 9580 ± 840 100
- HBD
- 610 ± 84 514± 34 84
- HBD +TSHb
- 8510 ± 590 5070 ± 720 60
- B1
- 390 ± 92 496 ± 90 127
- B1 + TSHb
- 740 ± 590 520 ± 150 70
- B2
- 408 ± 30 408 ± 172 100
- B2 + TSHb
- 240 ± 20 440 ± 140 183
- B3
- 504 ± 20 522 ± 96 104
- B3 + TSHb
- 320 ± 60 550 ± 310 172
- B4
- 414 ± 326 474 ± 12 114
- B4 + TSHb
- 1180 ± 430 690 ± 340 58
- B. Resultados de la inhibición en %
- % inhibición de la estimulación de la TSHc
- Suero con actividad antagonista de la TSH
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- B1
- 91 90
- B2
- 97 91
- B3
- 96 89
- B4
- 86 86
- HBD = Mezcla de sueros sanguíneos de donantes sanos.aMuestras para análisis en tampón de AMP cíclico; todos los sueros se analizaron a una dilución final de 10.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL.c
Tabla 10. Producción de AMP cíclico inducida por la TSH en células CHO que expresan el TSHR de tipo natural y TSHR con Arg255 mutado a Asp. Efecto de diferentes diluciones del suero B3 (Tabla 9) con actividad antagonista de la TSH
- A. Niveles del AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Dilución de la muestra de ensayoa
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- B3 1000x
- 718 ± 68 462 ± 80 64
- B3 1000x + TSHc
- 11650 ± 710 3710 ± 570 32
- B3 100x
- 626 ± 50 228 ± 24 36
- B3 100x + TSHc
- 7590 ± 480 180 ± 20 2
- B3 10x
- 358 ± 46 190 ± 20 53
- B3 10x + TSHc
- 230 ± 98 310 ± 230 135
- HBD 1000x
- 718b 410 ± 22 57
- HBD 1000x + TSHc
- 12210 ± 820 12594 ± 496 103
- HBD 100x
- 768 ± 144 440 ± 62 57
- HBD 100x + TSHc
- 9970 ± 800 10960 ± 750 110
- HBD 10x
- 626 ± 106 346 ± 66 55
- HBD 10x + TSHc
- 8130 ± 980 6920 ± 360 85
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Dilución del suero con actividad antagonista de la TSH
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- B3 1000x
- 5 70
- B3 100x
- 24 98
- B3 10x
- 97 96
- HBD = Mezcla de sueros sanguíneos de donantes sanos.aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bValor medio del duplicado.cConcentración de la TSH final = 0,3 ng/mL.d en donde las diluciones de la muestra para análisis y la HBD son la misma
Tabla 11. Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo naturaly TSHR con Arg255 mutado a Asp. Efecto de diferentes diluciones de un anticuerpo monoclonal para el receptor de la TSH (9D33) con actividad antagonista de la TSH
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n =3)
- aMuestra de ensayo
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1208 ± 20 776± 344 64
- TSHb
- 15410 ± 1450 12410 ± 3030 81
- 2G2 1µg/m L + TSHb
- 10890 ± 1130 10770 ± 1040 99
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 11580 ± 720 11540 ± 260 100
- 2G2 100µg /mL + TSHb
- 11710 ± 1890 10450 ± 1140 89
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 12960c 11780 ± 750 91
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 11730 ± 220 11760 ± 940 100
- 9D33 0,1µg /mL + TSHb
- 9960 ± 520 5250 ± 610 53
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 7530 ± 1150 1160 ± 140 15
- 9D33 10µg/mL + TSHb
- 2560 ± 1470 700 ± 220 27
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1180 ± 70 490 ± 80 42
- 9D33 100µg
- 1178 ± 60 558 ± 216 47
- B. Resultados de la inhibición en %
- Concentración de anticuerpos
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- 2G2 1µg/mL
- 29 13
- 2G2 10µg/mL
- 25 7
- 2G2 100µg/mL
- 24 16
- 9D33 0,001µg/mL
- 16 5
- 9D33 0,01µg/mL
- 24 5
- 9D33 0,1µg/mL
- 35 58
- 9D33 1µg/mL
- 51 91
- 9D33 10µg/mL
- 83 94
- 9D33 100µg/mL
- 92 96
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración de la TSH final = 0,3ng/mL.cValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- Preparación del receptor
- Afinidad para la TSH Afinidad para Fab de hMAb TSHR1
- Tipo natural
- 4,2 ± 1,0 x 109 L/mol 2,9 ± 0,6 x 1010 L/mol
- Asp43 mutado a Ala
- 3,1 x 109 L/mol 3,0 x 1010 L/mol
- Glu61 mutado a Ala
- 2,7 x 109 L/mol 2,9 x 1010 L/mol
- GIu157 mutado a Ala
- Unión a TSH no detectable 1,9 x 1010 L/mol
- Glu178 mutado a Ala
- 0,9 x 109 L/mol 0,6 x 101U L/mol
- Asp203 mutado a Ala
- 1,9 x 109 L/mol 1,6 x 1010 L/mol
- Asp232 mutado a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión al Fab de hMAb TSHR1 Fab no detectable
- Arg255 mutado a Ala
- 1,9 x 109 L/mol 0,5 x 1010 L/mol
- Trp258 mutado a Ala
- Unión a TSH no detectable 1,0 x 1010 L/mol
- Asp276 mutado a Ala
- 3,4 x 109 L/mol 1,6 x 1010 L/mol
- Ser281 mutado a Ala
- 3,4 x 109 L/mol 2,3 x 1010 L/mol
Tabla 13a Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Asp43 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de un anticuerpo monoclonal para el receptor de laTSH (9D33) con actividad antagonista de la TSH
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP producido ((fmol/pocillo de células) (valor medio n = 3)
- Muestra para análisisa
- TSHR de tipo natural TSHR mutado Tipo mutado /natural(%)
- Solamente tampón ensayo de AMP cíclico
- 84 ± 13 128 ± 20 152
- TSH
- 7142 ± 389 6858 ± 2398 96
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 6631 ± 226 6854c 103
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 7928 ± 1448 7876 ± 343 99
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 6011 ± 642 7572 ± 196 126
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 5670 ± 1727 5989 ± 366 106
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 6809 ± 411 6160c 90
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 4958 ± 1852 5462 ± 467 110
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 1636 ± 226 1851 ± 314 113
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 1388 ± 416 1175 ± 116 85
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 681 ± 258 863 ±192 127
- 9D33 100µg
- 1097 ± 362 107 ± 16 10
- B. Resultados de inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 7 0
- 2G2 10µg/mL
- -11 -15
- 2G2 100µg/mL
- 16 -10
- 9D33 0,001µg/mL
- 21 13
- 9D33 0,01µg/mL
- 5 10
- 9D33 0,1µg/mL
- 31 20
- 9D33 1µg/mL
- 77 73
- 9D33 10µg/mL
- 81 83
- 9D33 100µg/mL
- 90 87
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,5 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 154 ± 16 113 ± 35 86
- TSH
- 15616 ± 3992 12824 ± 651 82
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 10613 ± 1188 15077 ± 2841 142
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 9163c 12327c 135
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 12967c 14982 ± 908 116
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 11478 ± 1868 14708 ± 1441 128
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 12543c 16118 ± 2133 129
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 13098 ± 253 7695 ± 3489 59
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- ,3249 ± 162 3960 ± 232 122
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 1819 ± 609 2800 ± 201 154
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 625 ± 27 1679 ± 546 269
- 9D33 100µg
- 87 ± 43 nd nd
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 32 -18
- 2G2 10µg/mL
- 41 4
- 2G2 100µg/mL
- 17 -17
- 9D33 0,001µg/mL
- 26 -15
- 9D33 0,01µg/mL
- 20 -26
- 9D33 0,1µg/mL
- 16 40
- 9D33 1µg/mL
- 79 69
- 9D33 10µg/mL
- 88 78
- 9D33 100µg/mL
- 96 87
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,5 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33) nd = no determinado
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 122 ± 25 ud nd
- TSH
- 6162 ± 458 4613c 75
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 5070 ± 271 5825c 115
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 4493c nd nd
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 4468 ± 1019 4083 ± 1170 91
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 2784 ± 625 4062 ± 637 146
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 3255 ± 124 4476 ± 1383 138
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 3439 ± 147 1886 ± 396 55
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 754 ± 372 540 ± 303 72
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 774 ± 372 519 ± 135 67
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 654 ± 115 395 ± 241 60
- 9D33 100µg
- 83 ± 42 34 ± 7 41
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 18 -26
- 2G2 10µg/mL
- 27 nd
- 2G2 100µg/mL
- 27 11
- 9D33 0,001µg/mL
- 55 12
- 9D33 0,01µg/mL
- 53 3
- 9D33 0,1µg/mL
- 44 59
- 9D33 1µg/mL
- 88 88
- 9D33 10µg/mL
- 87 89
- 9D33 100µg/mL
- 89 91
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33) ud = no detectable nd = no determinado
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 140 ± 11 134c 96
- TSH
- 6227 ± 1211 6167 ± 923 99
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 4307 ± 553 6428c 149
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 5579 ± 1128 4708 ± 908 84
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 6920 ± 1455 5204 ± 787 75
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 4916 ± 405 5093 ± 581 104
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 4600 ± 394 5671 ± 1164 123
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 3814 ± 342 2905 ± 295 76
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 760 ± 315 1322 ± 125 174
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 466c 498 ± 97 107
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 171c 275 ± 27 161
- 9D33 100µg
- 159 22 151 ± 23 95
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 31 -4
- 2G2 10µg/mL
- 10 24
- 2G2 100µg/mL
- -11 16
- 9D33 0,001µg/mL
- 21 17
- 9D33 0,01µg/mL
- 26 8
- 9D33 0,1µg/mL
- 39 53
- 9D33 1µg/mL
- 88 79
- 9D33 10µg/mL
- 93 92
- 9D33 100µg/mL
- 97 96
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 524c 141c 27
- TSH
- 12503 ± 1060 11847 ± 689 95
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 12569 ± 1992 13130c 104
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 14948 ± 1044 11648 ± 723 78
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 12514 ± 2316 11909 ± 533 95
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 10756 ± 1623 12067c 112
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 13418 ± 1640 14843 ± 2529 111
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 11906 ± 1805 11792 ± 898 99
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 10325 ± 816 10567 ± 685 102
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 8185c 4368c 53
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 6127 ± 166 2171c 35
- 9D33 100µg
- 156 ± 8 499 +37 320
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- -1 -11
- 2G2 10µg/mL
- -20 2
- 2G2 100µg/mL
- 0 -1
- 9D33 0,001µg/mL
- 14 -2
- 9D33 0,01µg/mL
- -7 -25
- 9D33 0,1µg/mL
- 5 0
- 9D33 1µg/mL
- 17 11
- 9D33 10µg/mL
- 35 63
- 9D33 100µg/mL
- 51 82
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 197 ± 34 325 ± 47 165
- TSH
- 6871 ± 970 10822 ± 1435 158
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 6407 ± 1141 11502 ± 2692 180
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 5803 ± 154 8806c c 152
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 8283 ± 1485 12027 ± 463 145
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 7451 ± 1473 12018 ± 2501 161
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 6528 ± 2277 11961 ± 1453 183
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 3019 ± 528 6107 ± 753 202
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 1765 ± 145 2858 ± 268 162
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 1369 ± 146 1873 ± 247 137
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 768 ± 158 1662 ± 177 216
- 9D33 100µg
- 223 ± 19 402 ± 57 180
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 7 -6
- 2G2 10µg/mL
- 16 19
- 2G2 100µg/mL
- -21 -11
- 9D33 0,001µg/mL
- -8 -11
- 9D33 0,01µg/mL
- 5 -11
- 9D33 0,1µg/mL
- 56 44
- 9D33 1µg/mL
- 74 74
- 9D33 10µg/mL
- 80 83
- 9D33 100µg/mL
- 89 85
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 365 ± 40 410 ± 82 112
- TSH
- 4491c 4179 ± 281 93
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 3900 ± 124 3723 ± 344 95
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 4478 ± 153 3549 ± 199 79
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 4038 ± 549 4191 ± 686 104
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 4400 ± 672 3655 ± 244 83
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 3301 ± 114 3796 ± 372 115
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 2804 ± 474 2225 ± 45 79
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 1256 ± 227 1486 ± 3217 118
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 536c 598c 112
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 435 ± 19 523 ± 53 120
- 9D33 100µg
- 356 ± 11 457c 128
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 13 11
- 2G2 10µg/mL
- 0 15
- 2G2 100µg/mL
- 10 0
- 9D33 0,001µg/mL
- 2 13
- 9D33 0,01µg/mL
- 26 9
- 9D33 0,1µg/mL
- 38 47
- 9D33 1µg/mL
- 72 64
- 9D33 10µg/mL
- 88 86
- 9D33 100µg/mL
- 90 87
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisias
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 119 ± 13 154 ± 41 129
- TSH
- 8836 ± 2375 8958 ± 703 101
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 7339 ± 1966 6244 ± 1452 85
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 5250 ± 626 7015 ± 758 134
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 7991 ± 3095 6842 ± 771 111
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 9371 ± 1878 7449c 79
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 7411 ± 1694 6123 ± 685 83
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 6379 ± 226 3435 ± 359 54
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 1893 ± 1164 1990 ± 197 105
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 1342 ± 451 1150 ± 84 86
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 689 ± 118 601 ± 17 87
- 9D33 100µg
- 179 ± 11 117 ± 25 65
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 17 30
- 2G2 10µg/mL
- 41 22
- 2G2 100µg/mL
- 10 1
- 9D33 0,001µg/mL
- -6 17
- 9D33 0,01µg/mL
- 16 32
- 9D33 0,1µg/mL
- 28 62
- 9D33 1µg/mL
- 79 78
- 9D33 10µg/mL
- 85 87
- 9D33 100µg/mL
- 92 93
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 94 ± 4 173 ± 58 184
- TSH
- 4846 ± 620 9761 ± 189 201
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 4887 ± 1492 7017c 144
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 5206c 6929 ± 1601 133
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 5128 ± 1801 13529 ± 2725 264
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 6502 ± 2731 5846 ± 613 90
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 4502 ± 716 7709 + 1418 171
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 4745 ± 290 41 19 ± 1045 87
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 1994 ± 361 1973 ± 45 99
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 1184 ± 136 1143 ± 322 97
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1332 ± 469 1066 ± 319 80
- 9D33 100µg
- 186 ± 15 172 ± 24 92
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- -1 28
- 2G2 10µg/mL
- -7 29
- 2G2 100µg/mL
- -6 -39
- 9D33 0,001µg/mL
- -34 40
- 9D33 0,01µg/mL
- 7 21
- 9D33 0,1µg/mL
- 2 58
- 9D33 1µg/mL
- 59 80
- 9D33 10µg/mL
- 76 88
- 9D33 100µg/mL
- 73 89
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 876 ± 26 536 + 108 61
- TSH
- 11487 ± 683 6935 ± 796 60
- 2G2 1µg/mL +TSHb
- 9762 ± 684 7202 ± 334 74
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 9374 ± 1023 6369 ± 33 68
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 12285 ± 1718 6513 ± 254 53
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 8773 ± 1226 6741 ± 381 77
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 10499 ± 1934 5660 ± 157 54
- 9D33 0,1µg/mL + TSHb
- 7500 ± 336 1647 ± 197 22
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 3468 ± 548 643 ± 80 19
- 9D33 10µg g/mL + TSHb
- 1243 ± 57 497 ± 132 40
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1063 ± 163 189 ± 24 18
- 9D33 100µg
- 695 ± 33 386 ± 28 56
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de estimulación de la TSHd
- Concentración de anticuerpos
- THSR de tipo natural THSR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 15 -4
- 2G2 10µg/mL
- 18 8
- 2G2 100µg/mL
- -7 6
- 9D33 0,001µg/mL
- 24 3
- 9D33 0,01µg/mL
- 9 18
- 9D33 0,1µg/mL
- 35 76
- 9D33 1µg/mL
- 70 91
- 9D33 10µg/mL
- 89 93
- 9D33 100µg/mL
- 91 97
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico.bConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL. cValor medio del duplicadod 2G2 es una anticuerpo monoclonal de ratón para tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- Mutación del aminoácido
- Inhibición de AMP cíclico mediado por TSH Estimulación por 9D33
- Asp43 a Ala
- Sin efecto
- GIu61 a Ala
- Sin efecto
- GIu178 a Ala
- Sin efecto
- Asp203 a Ala
- Sin efecto
- Gln235 a Ala
- Sin efecto
- Arg255 a Ala
- Sin efecto
- Arg255 a Asp
- Efecto aumentado
- Thr257 a Ala
- Sin efecto
- Trp258 a Ala
- Sin efecto
- Ser281 a Ala
- Sin efecto
- Arg255 a Ala y Trp258 a Ala
- Sin efecto
Tabla 15a Efecto de la mutación de Lys58 de TSHR a Ala en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que contienen el TSHR por hMAb TSHR1 y la TSH
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1410 ± 124 997 ± 132 71
- 0,3
- 1718 ± 381 1962 ± 135 114
- 1
- 3067 ± 270 8960 ± 1501 292
- 3
- 13569 ± 3730 6003 ± 242 44
- 10
- 16312 ± 1559 17808 ± 4348 109
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1410 ± 124 1621 ± 162 115
- 0,03
- 2881 ± 684 3020 ± 443 105
- 0,1
- nd nd nd
- 0,3
- 17623 ± 493 19584 ± 1889 111
- 1
- 15629 ± 427 26367 ± 1861 169
- 3
- 16621 ± 1196 20053 ± 3738 121
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 377 ± 229 356 ± 122
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1206 ± 70 777 ± 75 64
- 0,3
- 2571 ± 130 1298 ± 121 50
- 1
- 6754 ± 1140 2948 + 169 44
- 3
- 11485 ± 1262 7373 ± 197 64
- 10
- 12204 ± 1056 13538 ± 1409 111
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 675 ± 34 783 ± 57 116
- 0,03
- 1207 ± 251 1441 ± 175 119
- 0,1
- 3350 ± 326 3637 ± 245 109
- 0,3
- 9564 ± 785 8522 ± 335 89
- 1
- 12149 ± 73 14785 ± 1379 122
- 3
- 13701 ± 652 18020 ± 1527 132
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 429 ± 31 569 ± 23
- nd = no determinado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1432 ± 83 1574 ± 284 110
- 0,3
- 3834 ± 101 3060 ± 648 80
- 1
- 9355 ± 1170 6368 ± 673 68
- 3
- 17404 ± 2551 11276 ± 798 65
- 10
- 21898 ± 1209 22384 ± 3337 102
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1106 ± 127 966 ± 72 87
- 0,03
- 1678 ± 37 1624 ± 166 97
- 0,1
- 5942a 4550 ± 538 77
- 0,3
- 12023 ± 2060 9552 ± 846 79
- 1
- 18051 ± 1955 22768 ± 5454 126
- 3
- 24292 ± 1961 26734 ± 511 110
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 654 ± 19 857 ± 76
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1537 ± 223 1434 ± 115 93
- 0,3
- 3684 ± 149 2812 ± 192 76
- 1
- 9685 ± 723 7287 ± 833 81
- 3
- 17373 ± 656 12398 ± 775 71
- 10
- 20390a 18968 ± 286 93
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1104 ± 142 1191 ± 73 108
- 0,03
- 1699 ± 80 2014 ± 338 119
- 0,1
- 4731 ± 167 4642 ± 328 98
- 0,3
- 12871 ± 1429 11634 ± 434 90
- 1
- 17341 ± 592 17668 ± 1213 102
- 3
- 22282 ± 1483 20934 ± 554 94
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 834 ± 97 879 ± 54
- aValor medio del duplicado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1758 ± 502 719 ± 78 41
- 0,3
- 4283 ± 192 745 ± 55 17
- 1
- 11225 ± 673 465 ± 57 4
- 3
- 20033 ± 3422 443 ± 29 2
- 10
- 22299 ± 1244 1026 ± 350 5
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1019 ± 238 1612 ± 720 158
- 0,03
- 2350 ± 1100 3372 ± 721 143
- 0,1
- 5650 ± 304 5902a 104
- 0,3
- 12387 ± 3782 17557 ± 4187 142
- 1
- 20052 ± 2829 20003 ± 2029 100
- 3
- 28631 ± 1464 17696 ± 3212 62
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 683 ± 19 676 ± 66
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2311 ± 631 1159 ± 214 50
- 0,3
- 4772 ± 930 1352 ± 404 28
- 1
- 11729 ± 1421 1701 ± 19 15
- 3
- 19197 ± 6100 1714 ± 189 9
- 10
- 19820 ± 1443 1676 ± 293 8
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1069 ± 227 1375 ± 136 129
- 0,03
- 2810 ± 539 3133 ± 292 111
- 0,1
- nd 5894a nd
- 0,3
- 14592 ± 1531 13199 ± 2744 90
- 1
- 23710 ± 1972 19145 ± 1820 81
- 3
- 26019 ± 4795 21095 ± 3355 81
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 594 ± 38 1194 ± 231
- aValor medio del duplicado nd = no determinado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1153 ± 19 940 ± 157 82
- 0,3
- 1933 ± 194 923 ± 19 48
- 1
- 5567 ± 1067 895 ± 66 16
- 3
- 11325 ± 1045 1031 ± 87 9
- 10
- 18903 ± 3034 863 ± 127 5
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1015 ± 71 1015 ± 163 100
- 0,03
- 1620 ± 309 1379 ± 58 85
- 0,1
- 3470 ± 271 2301 ± 96 66
- 0,3
- 8692 ± 455 7790 ± 203 90
- 1
- 17173 ± 1433 9859 ± 744 57
- 3
- 19360 ± 1243 14095 ± 426 73
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 671 ± 69 1098 ± 66
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 728 ± 54 1029 ± 122 141
- 0,3
- 1435 ± 135 807 ± 70 56
- 1
- 6506 ± 317 855 ± 344 13
- 3
- 9982 ± 1363 1089 ± 225 11
- 10
- 24283 ± 6165 649 ± 346 3
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 815 ± 69 1015 ± 126 125
- 0,03
- 1088 ± 116 1962 ± 137 180
- 0,1
- 3291 ± 424 4496 ± 47 137
- 0,3
- 6511 ± 785 11286 ± 2733 173
- 1
- 13663 ± 1309 13474 ± 981 99
- 3
- 20084 ± 4514 15230 ± 3881 76
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 905 ± 258 785 ± 113
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1307 ± 198 1316± 177 100
- 0,3
- 2717 ± 99 1611 ± 225 59
- 1
- 7883 ± 576 2993 ± 741 38
- 3
- 11500 ± 1811 6786 ± 228 59
- 10
- 15890 ± 3356 10749 ± 1312 68
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 658 ± 164 1764 ± 110 268
- 0,03
- 1335 ± 162 2070a 155
- 0,1
- 3567 ± 428 3932 ± 553 110
- 0,3
- 8610a 8104 ± 723 94
- 1
- 13021a 13821 ± 1198 106
- 3
- 18076 ± 5118 15070 ± 2214 83
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 432 ± 53 914 ± 87
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1393 ± 27 1075 ± 85 77
- 0,3
- 3709 ± 434 1511 ± 140 41
- 1
- 7756 ± 918 3507 ± 455 42
- 3
- 13197 ± 2052 6528 ± 202 49
- 10
- 18635 ± 1877 9085a 49
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 861 ± 83 1047 ± 74 122
- 0,03
- 1390 ± 181 1535 ± 234 110
- 0,1
- 3846 ± 303 3790 ± 288 99
- 0,3
- 7900 ± 820 6400 ± 278 81
- 1
- 12747 ± 1290 9605 ± 642 75
- 3
- 15892 ± 125 16516a 104
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 682 ± 97 697 ± 12
- nd = no determinado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1814 ± 152 1135 ± 53 63
- 0,3
- 4032 ± 258 1096 ± 28 27
- 1
- 9770 ± 1020 985 ± 90 10
- 3
- 17529 ± 1597 1136 ± 65 6
- 10
- 22348 ± 3565 1760 ± 175 8
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1161 ± 153 1160 ± 68 100
- 0,03
- 2010 ± 197 1469 ± 111 73
- 0,1
- 4433 ± 794 1906 ± 138 43
- 0,3
- 10299a 3717 ± 283 36
- 1
- 18214 ± 1154 8438 ± 300 46
- 3
- 18540 ± 1065 14885 ± 2525 80
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 784 ± 38 1117 ± 57
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1417± 215 1331 ± 95 94
- 0,3
- 3190 ± 264 1259 ± 39 39
- 1
- 7438 ± 656 1053 ± 79 14
- 3
- 11470 ± 6099 1215a 11
- 10
- 19199 ± 1545 1793 ± 280 9
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1129 ± 64 1302 ± 118 115
- 0,03
- 1482 ± 246 1465a 99
- 0,1
- 3788 ± 432 1996a 53
- 0,3
- 8384 ± 643 4290 ± 120 51
- 1
- 12459a 7910 ± 64 63
- 3
- 15288 ± 691 12050a 79
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 416 ± 78 1057 ± 53
- aValor medio del duplicado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 500 ± 28 468 ± 129 94
- 0,3
- 1118± 133 350 ± 13 31
- 1
- 5204 ± 225 ud ud
- 3
- 5424 ± 566 ud ud
- 10
- 9834 ± 709 ud ud
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 376 ± 13 488 ± 2 130
- 0,03
- 608 ± 122 488 ± 65 80
- 0,1
- 1960 ± 109 496 ± 100 25
- 0,3
- 3516 ± 154 440 ± 183 13
- 1
- 7114 ± 67 1020 ± 340 14
- 3
- 8384 ± 666 2176± 244 26
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 404 ± 54 412 ± 23
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 682 ± 141 612 ± 69 90
- 0,3
- 1578 ± 294 650 ± 27 41
- 1
- 4592 ± 38 366 ± 71 8
- 3
- 6706 ± 420 430 ± 48 6
- 10
- 8858 ± 503 404 ± 26 5
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 712 ± 62 662 ± 92 93
- 0,03
- 1072 ± 120 670 ± 55 63
- 0,1
- 3680 ± 178 732 ± 115 20
- 0,3
- 6874 ± 79 572 ± 12 8
- 1
- 7652 ± 379 2038 ± 340 27
- 3
- 9250 ± 2392 3922 ± 650 42
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 410 ± 121 586 ± 24
- ud = no detectable En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 2160 ± 121 1287 ± 154 60
- 0,1
- 5494 ± 360 1704 ± 136 31
- 0,3
- 14680 ± 475 3291 ± 230 22
- 1
- 20089 ± 1269 7588 ± 451 38
- 3
- 25202 ± 1926 17348a 69
- 10
- TSH (ng/mL)
- 1436 ± 152 1486 ± 183 103
- 0,01
- 2355 ± 85 1886 ± 22 80
- 0,03
- nd 4588 ± 395 nd
- 0,1
- 13613 ± 712 8503 ± 292 62
- 0,3
- 20552 ± 921 19037 ± 1144 93
- 1
- 24503 ± 1410 20440 ± 299 83
- 3
- 1070 ± 141 902 ± 141
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 2090a 1122 ± 169 54
- 0,1
- 3104 ± 544 1529 ± 65 49
- 0,3
- 8081 ± 834 4013 ± 733 50
- 1
- 17745 ± 1891 5641 ± 475 32
- 3
- 23838 ± 3352 11764 ± 385 49
- 10
- TSH (ng/mL)
- 1037a 1632 ± 121 112
- 0,01
- 1709 ± 389 2063 ± 317 121
- 0,03
- 2634a 3970 ± 165 151
- 0,1
- 9355 ± 1215 10053 ± 1175 107
- 0,3
- 17724 ± 1701 12994 ± 2273 73
- 1
- 24335 ± 4993 20831a 86
- 3
- 739 ± 49 843 ± 85
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- aValor medio del duplicado nd = no determinado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1372 ± 71 481 ± 32 35
- 0,3
- 2649 ± 369 512 ± 71 19
- 1
- 6840 ± 108 606 ± 41 9
- 3
- 12527 ± 1189 888 ± 68 7
- 10
- 17301 ± 1894 4140 ± 1000 24
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 993 ± 120 756 ± 174 76
- 0,03
- 1433 ± 74 1034 ± 171 72
- 0,1
- 2742 ± 32 1740 ± 114 63
- 0,3
- 8283 ± 48 4818 ± 252 59
- 1
- 15571 ± 1346 11540 ± 379 74
- 3
- 20509 ± 2613 14110 ± 1 048 69
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 654 ± 72 481 ± 2
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1 192 ± 136 388 ± 19 33
- 0,3
- 2890 ± 205 431 ± 95 15
- 1
- 7784 ± 989 510 ± 56 7
- 3
- 14298 ± 2299 989 ± 95 7
- 10
- 20908 ± 696 2922 ± 196 14
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 967 ± 108 487 ± 50 50
- 0,03
- 1084 ± 32 711 ± 77 66
- 0,1
- 4432 ± 558 1148 ± 101 26
- 0,3
- 6555 ± 763 3211 ± 103 49
- 1
- 17706 ± 1115 7377 ± 813 42
- 3
- 21807 ± 2198 13421 ± 966 62
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 570 ± 14 420 ± 79
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1536 ± 125 1320 ± 213 86
- 0,3
- 4391 ± 441 1270 ± 267 29
- 1
- 10466 ± 1641 2398 ± 427 23
- 3
- 16666 ± 476 4050 ± 125 24
- 10
- 23264 ± 1103 10349 ± 944 44
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 868 ± 138 1761 ± 184 203
- 0,03
- 1561 ± 349 2482 ± 294 159
- 0,1
- 4548 ± 269 4236 ± 548 93
- 0,3
- 8505 ± 119 11128 ± 1340 131
- 1
- 17249 ± 430 11396 ± 1457 66
- 3
- 17007a 16021 ± 4948 94
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1099 ± 8 1217 ± 80
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1631 ± 75 1475 ± 76 90
- 0,3
- 3811 ± 556 1768 ±233 46
- 1
- 9073 ± 850 1821 ±143 20
- 3
- 15292 ± 1346 5892 ± 650 39
- 10
- 20878 ± 2859 10467a 50
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1682 ± 59 1715 ± 273 102
- 0,03
- 2042 ± 116 2889 ± 393 141
- 0,1
- 5969 ± 369 5326a 89
- 0,3
- 12989 ± 613 9891 ± 347 76
- 1
- 20148 ± 3038 15817a 79
- 3
- 23202 ± 1348 20875 ± 1639 90
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1168 ± 47 970 ± 257
- aValor medio del duplicado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 865 ± 26 367 ± 120 42
- 0,1
- 1553 ± 361 402 ± 64 26
- 0,3
- 5074a 284a 6
- 1
- 7400 ± 718 275 ± 76 4
- 3
- 9642 ± 210 412 ± 131 4
- 10
- TSH (ng/mL)
- 755 ± 116 514 ± 112 68
- 0,01
- 1034 ± 115 982 ± 44 95
- 0,03
- 3829 ± 514 2292 ± 294 60
- 0,1
- 4967a 4805 ± 170 97
- 0,3
- 9675 ± 1581 6491 ± 607 67
- 1
- 9847 ± 725 6092 ± 160 61
- 3
- 536a 244 ± 20
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 2539a 484 ± 96 19
- 0,1
- 4054 ± 540 508 ± 104 13
- 0,3
- 12154 ± 2505 438 ± 113 4
- 1
- 12618a 423a 3
- 3
- 18702 ± 804 511 ± 216
- 3
- 10
- TSH (ng/mL)
- 1236 ± 139 692 ± 122 56
- 0,01
- 4588 ± 952 2448 ± 410 53
- 0,03
- 5620 ± 610 4735 ± 757 84
- 0,1
- 15580 ± 2946 12130 ± 1978 78
- 0,3
- 22808a 16915 ± 852 74
- 1
- 23480 ± 1160 18031± 3157 77
- 3
- 679 ± 48 243 ± 31
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- aValor medio del duplicado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2990 ± 1000 1613 ± 706 54
- 0,3
- 6015 ± 512 2126 ± 163 35
- 1
- 16504 ± 2978 3905 ± 265 24
- 3
- 19850 ± 1256 7947 ± 841 40
- 10
- 21517 ± 1037 17480 ± 2580 81
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1614 ± 336 3371 ± 1847 209
- 0,03
- 2590 ± 672 4668 ± 47 180
- 0,1
- nd 6373a nd
- 0,3
- 14754 ± 1095 19325 ± 4162 131
- 1
- 19712 ± 2403 26459 ± 319 134
- 3
- 24515 ± 1525 21361 ± 805 87
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 704 ± 64 998 ± 123
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1820 ± 165 776 ± 83 43
- 0,3
- 3536 ± 433 899 ± 21 25
- 1
- 9107 ± 1296 1438 ± 274 16
- 3
- 10390 ± 870 3832 ± 701 37
- 10
- 11042 ± 688 6864 ± 636 62
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 694 ± 43 700 ± 54 101
- 0,03
- 1470 ± 395 1616 ± 48 110
- 0,1
- 2663 ± 155 2863 ± 400 108
- 0,3
- 8206 ± 678 4904 ± 625 60
- 1
- 8888 ± 1514 9401 ± 1058 106
- 3
- 11261 ± 937 9735 ± 739 86
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 620 ± 63 522 ± 68
- aValor medio del duplicado nd = no determinado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2205 ± 404 1284 ± 130 58
- 0,3
- 5369 ± 753 2149 ± 559 40
- 1
- 16037 ± 697 8482 ± 353 53
- 3
- 22039 ± 1469 12127 ± 1947 55
- 10
- 20117 ± 1880 24649 ± 1133 123
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1 189 ± 278 776 ± 70 65
- 0,03
- 2004 ± 570 1232 ± 52 61
- 0,1
- 5366 ± 665 2622 ± 267 49
- 0,3
- 11790 ± 1622 7654 ± 675 65
- 1
- 16489 ± 2900 12049 ± 1239 73
- 3
- 24168 ± 1405 18525 ± 602 77
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 999 ± 33 714 ± 142
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2089 ± 201 1404 ± 67 67
- 0,3
- 4016 ± 338 2460 ± 191 61
- 1
- 9400 ± 853 6484 ± 304 69
- 3
- 12799 ± 450 11263 ± 1128 88
- 10
- 14729 ± 2011 14146 ± 1380 96
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1108 ± 43 1022 ± 72 92
- 0,03
- 1511 ± 34 1475 ± 92 98
- 0,1
- 4111 ± 316 2660 ± 338 65
- 0,3
- 8747 ± 646 7108 ± 673 81
- 1
- 10290 ± 108 12726 ± 761 124
- 3
- 12027 ± 996 14785 ± 2611 123
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 584 ± 168 317 ± 19
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1328 ± 186 814 ± 98 61
- 0,3
- 3123 ± 117 1658 ± 180 53
- 1
- 8120 ± 1331 3850 ± 213 47
- 3
- 12867 ± 1041 7536 ± 839 59
- 10
- 19292 ± 2362 11234 ± 1575 58
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1100 ± 27 770 ± 48 70
- 0,03
- 2136 ± 566 901 ± 95 42
- 0,1
- nd 2012 ± 439 nd
- 0,3
- 11668 ± 2382 4149 ± 927 36
- 1
- 18079 ± 206 8590 ± 1072 48
- 3
- 16979 ± 868 11805 ± 1364 70
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 742 ± 66 546 ± 56
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1430 ± 532 578 ± 238 40
- 0,3
- 2906 ± 471 1465 ± 392 50
- 1
- 10703 ± 1591 3239 ± 699 30
- 3
- 10749 ± 662 6772 ± 2578 63
- 10
- 23355a 10965 ± 2713 47
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1054 ± 28 789 ± 164 75
- 0,03
- 2241 ± 232 804 ± 125 36
- 0,1
- 5517 ± 755 1419 ± 395 26
- 0,3
- 14042 ± 1192 2731 ± 1041 19
- 1
- 13411 ± 3331 7500 ± 531 56
- 3
- 22093 ± 2324 10942 ± 3387 50
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 988 ± 69 672 ± 180
- aValor medio del duplicado. nd = no determinado. En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR.
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1461 ± 50 766 ± 78 52
- 0,3
- 2482 ± 141 1006± 24 41
- 1
- 7550 ± 616 1163 ± 175 15
- 3
- 9020 ± 703 1875 ± 350 21
- 10
- 10168 ± 1016 4658 ± 518 46
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 910 ± 110 921 ± 121 101
- 0,03
- 1289 ± 184 1293 ± 124 100
- 0,1
- 3302 ± 482 2132 ± 269 65
- 0,3
- 6584 ± 630 6661 ± 293 101
- 1
- 8834 ± 878 10049 ± 996 114
- 3
- 9296 ± 1282 10131 ± 1244 109
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 530 ± 185 1020 ± 39
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1370 ± 113 1379 ± 177 101
- 0,3
- 2542 ± 236 1478 ± 290 58
- 1
- 6654 ± 690 806 ± 160 12
- 3
- 10310 ± 1621 2907 ± 267 28
- 10
- 14617 ± 3147 5071 ± 388 35
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 699 ± 168 1 144 ± 139 163
- 0,03
- , 1471 ± 144 2193 ± 76 149
- 0,1
- 3134 ± 388 4292 ± 917 137
- 0,3
- 5976 ± 693 7846 ± 475 131
- 1
- 8083 ± 1246 18003 ± 4157 222
- 3
- 8896 ± 565 17403 ± 1656 196
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 659 ± 105 1010 ± 108
- Experimento 3
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1123 ± 187 799 ± 17 71
- 0,3
- 2037 ± 537 914 ± 49 45
- 1
- 6313 ± 115 1697 ± 357 27
- 3
- 7121 ± 904 2997 ± 195 42
- 10
- 8543 ± 1196 4838 ± 957 57
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 964 ± 62 846 ± 14 88
- 0,03
- 1069 ± 139 1359 ± 87 127
- 0,1
- 2903 ± 332 3061 ± 1253 105
- 0,3
- 6579 ± 584 5867 ± 763 89
- 1
- 7556 ± 566 9442 ± 629 125
- 3
- 8963 ± 288 10414 ± 2070 116
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 610± 22 804 ± 103
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR.
Tabla 15p Efecto de la mutación de Lys183 de TSHR a Asp en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que contienen el TSHR por hMAb TSHR1 y la TSH
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1201 ± 198 882 ± 175 73
- 0,3
- 3025 ± 387 756 ± 74 25
- 1
- 9184 ± 1712 1070 ± 74 12
- 3
- 11693 ± 254 1596 ± 561 14
- 10
- 13439 ± 1799 2665 ± 318 20
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 838 ± 45 1332 ± 75 159
- 0,03
- 1387 ± 318 2531 ± 425 182
- 0,1
- 3993 ± 712 4037 ± 370 101
- 0,3
- 9320 ± 80 12166 ± 821 131
- 1
- 12667 ± 1548 21066 ± 2286 166
- 3
- 15764 ± 1934 22044 ± 1567 140
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 441 ± 41 837 ± 95
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1227 ± 154 668 ± 39 54
- 0,3
- 2518 ± 118 594 ± 38 24
- 1
- 8013 ± 646 809 ± 22 10
- 3
- 12474 ± 540 1097 ± 59 9
- 10
- 14960 ± 989 1822 ± 116 12
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 693 ± 33 1063 ± 219 153
- 0,03
- 1531 ± 101 1711 ± 125 112
- 0,1
- 3619 ± 171 3278 ± 7 91
- 0,3
- 10721 ± 729 10204 ± 685 95
- 1
- 13599 ± 380 13881 ± 1383 102
- 3
- 17172 ± 1329 15261 ± 1578 89
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 509 ± 51 710 ± 51
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1560 ± 238 938 ± 68 60
- 0,3
- 3654 ± 516 1178 ± 178 32
- 1
- 9506 ± 1399 1540 ± 537 16
- 3
- 13540 ± 3538 2974 ± 240 22
- 10
- 16190 ± 2880 4654 ± 390 29
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1134 ± 36 1148 ± 124 101
- 0,03
- 1344 ± 46 1492 ± 72 111
- 0,1
- 2218 ± 256 2586 ± 544 117
- 0,3
- 4980 ± 464 5260 ± 506 106
- 1
- 10620 ± 1080 8976 ± 526 85
- 3
- 16054 ± 1372 9619 ± 1098 60
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 930 ± 152 896 ± 120
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1754 ± 418 620 ± 82 35
- 0,3
- 2914 ± 210 620 ± 32 21
- 1
- 8630 ± 650 1030 ± 266 12
- 3
- 20120a 1690 ± 108 8
- 10
- 18380 ± 436 3360 ± 380 18
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 760 ± 22 840 ± 70 111
- 0,03
- 1174 ± 230 1150 ± 86 98
- 0,1
- 1994 ± 26 2476 ± 395 124
- 0,3
- 4980 ± 979 3770 ± 216 76
- 1
- 10460 ± 1392 6260 ± 792 60
- 3
- 16230 ± 1754 9060 ± 2086 56
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 694 ± 1 586 ± 56
- aValor medio del duplicado. En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1.
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2730 ± 626 1362 ± 632 50
- 0,3
- 4960 ± 300 3366 ± 320 68
- 1
- 11744± 1142 5307 ± 1033 45
- 3
- 14787 ± 2786 14223 ± 1327 96
- 10
- 19505 ± 1949 19885 ± 3161
- TSH (ng/mL)
- 1102
- 0,01
- 920 ± 816 822 ± 624 89
- 0,03
- 2360 ± 232 2092 ± 198 89
- 0,1
- 4276 ± 1166 4612 ± 754 108
- 0,3
- 14415a 6570 ± 2268 46
- 1
- 13467 ± 2475 20320 ± 4656 151
- 3
- 17150 ± 3474 20753 ± 5641 121
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 670 ± 46 730 ± 112
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1815 ± 256 1410 ± 264 78
- 0,3
- 3059 ± 388 2594 ± 71 85
- 1
- 10159 ± 2795 6218 ± 480 61
- 3
- 16264 ± 1688 12698 ± 705 78
- 10
- 18386 ± 170 18523 ± 3130 , 101
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1138 ± 139 979 ± 22 86
- 0,03
- 1588 ± 262 1523 ± 225 96
- 0,1
- 2438 ± 364 2804 ± 211 115
- 0,3
- 7787 ± 1111 7931 ± 414 102
- 1
- 12685 ± 1379 15817 ± 320 125
- 3
- 17173 ± 512 20529 ± 6651 120
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 763 ± 122 758 ± 65
- aValor medio del duplicado. En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1.
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2078 ± 431 745 ± 9 36
- 0,3
- 5275 ± 941 1504 ± 235 29
- 1
- 10842 ± 505 3057 ± 158 28
- 3
- 17487 ± 2798 7931 ± 2983 45
- 10
- 23304 ± 1886 12495 ± 689 54
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1605 ± 609 780 ± 80 49
- 0,03
- 2711 ± 343 1641 ± 375 61
- 0,1
- 5653a 2798 ± 373 49
- 0,3
- 15819 ± 2569 7423 ± 2337 47
- 1
- 22465 ± 3295 15616 ± 336 70
- 3
- 24344 ± 6711 16125 ± 1656 66
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 735 ± 69 592 ± 14
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1485 ± 77 1169 ± 88 79
- 0,3
- 3934 ± 295 1390 ± 333 35
- 1
- 8271 ± 419 14929 ± 144 60
- 3
- 15762 ± 1879 7564 ± 528 48
- 10
- 25020 ± 2040 16556 ± 2821 66
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1481 ± 286 1106 ± 230 75
- 0,03
- 2373 ± 519 1507 ± 160 64
- 0,1
- 6160a 2781 ± 632 45
- 0,3
- 12743 ± 2376 6478 ± 883 51
- 1
- 19059 ± 1638 14596 ± 2090 77
- 3
- 18790 ± 2563 16519 ± 1386 88
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 911 ± 164 989 ± 87
- aValor medio del duplicado. En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1.
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 872 ± 87 376 ± 33 43
- 0,3
- 1807 ± 541 345 ± 57 19
- 1
- 6117 ± 1041 336 ± 168 5
- 3
- 12613 ± 887 482 ± 112 4
- 10
- 17622 ± 2689 365 ± 176 2
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 565 ± 37 499 ± 36 88
- 0,03
- 730 ± 205 415 ± 83 42
- 0,1
- 1718 ± 238 401 ± 87 23
- 0,3
- 5104 ± 985 482 ± 68 9
- 1
- 9314 ± 805 247 ± 60 3
- 3
- 15288 ± 4763 337 ± 19 2
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 296 ± 96 326 ± 42
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 579 ± 70 310 ± 38 54
- 0,3
- 1860 ± 720 260 ± 15 14
- 1
- 6492 ± 3623 202 ± 19 3
- 3
- 19766 ± 8102 191 ± 38 1
- 10
- 23054 ± 6165 185 ± 49 1
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 528 ± 53 407 ± 56 77
- 0,03
- 536 ± 104 314 ± 27 59
- 0,1
- 3114 ± 586 292 ± 29 9
- 0,3
- 3318 ± 676 598 ± 706 18
- 1
- 15396 ± 4345 220 ± 3
- 1
- 3
- 18431 ± 4386 174 ± 16 1
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 364 ± 20 364 ± 10
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- nd nd nd
- 0,3
- 3513 ± 322 4225 ± 118 120
- 1
- 10885 ± 74 9440 ± 601 87
- 3
- 15718 ± 1932 15433 ± 841 98
- 10
- 21864 ± 441 18373 ± 860 84
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1168 ± 206 1677 ± 259 144
- 0,03
- 1830 ± 144 2466 ± 430 135
- 0,1
- 4133 ± 300 4506 ± 348 109
- 0,3
- 9269 ± 1709 11416 ± 747 123
- 1
- 18165 ± 2560 16101 ± 794 89
- 3
- 24491 ± 903 18142 ± 1121 74
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 873 ± 101 1143 ± 47
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1599 ± 213 1756 ± 288 110
- 0,3
- 3312 ± 554 3370 ± 398 102
- 1
- 9469 ± 2932 7817 ± 924 83
- 3
- 15451 ± 1813 10944 ± 1432 71
- 10
- 23359 ± 998 16126 ± 1202 69
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1543 ± 276 1242 ± 152 80
- 0,03
- 2150 ± 252 2129 ± 176 99
- 0,1
- nd 4235 ± 542 nd
- 0,3
- 14628 ± 2493 11155 ± 1593 76
- 1
- 18693 ± 1137 15395 ± 1097 82
- 3
- 18628 ± 1570 18313 ± 677 98
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1000 ± 82 899 ± 138
- nd = no determinado. En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR.
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1468 ± 150 1806 ± 113 123
- 0,3
- 2988 ± 150 2496 ± 368 84
- 1
- 8626 ± 473 6874 ± 146 80
- 3
- 13768 ± 1791 10810 ± 210 79
- 10
- 18100 ± 1361 12512 ± 297 69
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1204 ± 57 1324 ± 63 110
- 0,03
- 1496 ± 111 1764 ± 134 118
- 0,1
- 3344 ± 617 2570 ± 273 77
- 0,3
- 9270 ± 962 6872 ± 457 74
- 1
- 15644 ± 2238 11232 ± 1478 72
- 3
- 18494 ± 1815 11560 ± 2771 63
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 998 ± 94 1200 ± 105
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 990 ± 116 1332 ± 214 135
- 0,3
- 2186 ± 237 3034 ± 205 139
- 1
- 6726 ± 147 4690 ± 375 70
- 3
- 11466 ± 403 11476 ± 726 100
- 10
- 19820 ± 2013 16780 ± 1825 85
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 820 ± 133 1552 ± 322 186
- 0,03
- 1610 ± 150 2476 ± 321 187
- 0,1
- 3912 ± 298 4922 ± 750 126
- 0,3
- 10490 ± 1393 8630 ± 1595 82
- 1
- 12960 ± 2792 14110 ± 757 109
- 3
- 16684 ± 958 18476 ± 1985 111
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 660 ± 29 864 ± 106
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR,
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1390 ± 607 686 ± 63 49
- 0,3
- 2850 ± 170 1310 ± 284 46
- 1
- 7313 ± 587 3295 ± 25 45
- 3
- 13913 ± 3769 8454 ± 2347 61
- 10
- 14998 ± 1828 14567 ± 1722 97
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 666 ± 56 552 ± 30 83
- 0,03
- 712 ± 25 664 ± 28 93
- 0,1
- 2184 ± 104 1216 ± 340 56
- 0,3
- 3976 ± 254 2664 ± 14 67
- 1
- 11032 ± 1183 6310 ± 394 57
- 3
- 13956 ± 1306 9688 ± 1557 69
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 590 ± 30 553 ± 24
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1380 ± 2 76 996 ± 56 72
- 0,3
- 2858 ± 18 1510 ± 252 53
- 1
- 9024 ± 1360 4654 ± 1369 52
- 3
- 12920 ± 959 8230 ± 1371 64
- 10
- 15570 ± 454 12430 ± 2176 80
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 702 + 152 1022 ± 370 146
- 0,03
- 854 ± 98 976 ± 72 114
- 0,1
- 1412 ± 106 1578 ± 382 112
- 0,3
- 3364 ± 122 3960 ± 587 118
- 1
- 9936 ± 1003 8954 ± 1158 90
- 3
- 12894 ± 1009 11234 ± 856 87
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 618 ± 51 608 ± 80
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR,
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1590 ± 124 656 ± 100 41
- 0,3
- 2760 ± 24 682 ± 188 7
- 1
- 8506 ± 419 996 ± 150 12
- 3
- 15260 ± 2326 680 ± 25 4
- 10
- 17580 ± 2606 784 ± 145 4
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 864 ± 24 1068 ± 124 124
- 0,03
- 1258 ± 80 926 ± 32 74
- 0,1
- 2410 ± 244 750 ± 250 31
- 0,3
- 5034 ± 178 1064 ± 220 21
- 1
- 13896 ± 1193 1236 ± 281 9
- 3
- 15820 ± 784 1424 ± 218 9
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 730 ± 16 750 ± 24
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1390 ± 136 686 ± 82 49
- 0,3
- 3116± 552 623 ± 114 20
- 1
- 6123 ± 514 410 ± 59 7
- 3
- 13878 ± 2820 500 ± 83 4
- 10
- 14995 ± 1266 674 ± 149 4
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 830 ± 32 684 ± 22 82
- 0,03
- 1164 ± 374 688 ± 118 59
- 0,1
- 1960 ± 126 766 ± 106 39
- 0,3
- 3780 ± 567 695 ± 162 18
- 1
- 8691 ± 662 810 ± 227 9
- 3
- 12673 ± 742 1217 ± 170 10
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 676 ± 44 578 ± 26
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR,
- Mutación del aa
- Estimulación de la TSH Estimulación del Fab del hMAb TSHRI1
- Lys58 a Ala
- Sin efecto Sin efecto
- IIe60 a Ala
- Sin efecto Sin efecto
- Arg80 a Ala
- Sin efecto Reducción marcada
- Arg80 a Asp
- Sin efecto Reducción marcada
- Tyr82 a Ala
- Sin efecto Algo de reducción
- Glu 107 a Ala
- Algo de reducción Reducción marcada
- GIu107 a Arg
- Reducción marcada Reducción marcada
- Arg109 a Ala
- Sin efecto Reducción marcada
- Arg109 a Asp
- Algo de reducción Reducción marcada
- Lys129 a Ala
- Sin efecto Reducción marcada
- Lys129 a Asp
- Sin efecto Reducción marcada
- Phe130 a Ala
- Sin efecto Reducción marcada
- Phe134 a Ala
- Sin efecto Sin efecto
- Asp160 a Ala
- Algo de reducción Algo de reducción
- Lys183 a Ala
- Sin efecto Reducción marcada
- Lys183 a Asp
- Sin efecto Reducción marcada
- Tyr185 a Ala
- Sin efecto Reducción marcada
- Tyr206 a Ala
- Sin efecto Sin efecto
- Lys209 a Ala
- Algo de reducción Algo de reducción
- Asp232 a Arg
- Reducción marcada Reducción marcada
- Lys250 a Ala
- Sin efecto Sin efecto
- Glu251 a Ala
- Sin efecto Sin efecto
- Arg274 a Ala
- Sin efecto Sin efecto
- Tyr279 a Ala
- Reducción marcada Reducción marcada
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 545 ± 200 640 ± 34 117
- TSH
- 21110 ± 1582 17775 ± 1851 84
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 19943c 22426 ± 3322 112
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 24474 ± 1746 17626 ± 3253 72
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 21471 ± 1436 17478 ± 679 81
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 18865 ± 2836 23464 ± 2827 124
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 21648 ± 2909 16053c 74
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 27181c 22621 ± 610 83
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 13290 ± 2829 20233 ± 2223 152
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 7942 ± 2403 20192 ± 3977 254
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 2447 ± 1679 23258 ± 4341 950
- 9D33 100µg
- 832 ± 89 1204 ± 366 145
- B. Resultados de la inhibición en %
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 6 -26
- 2G2 10µg/mL
- -16 1
- 2G2 100µg/mL
- -2 2
- 9D33 0,001µg/mL
- 11 -32
- 9D33 0,01µg/mL
- -3 10
- 9D33 0,1µg/mL
- -29 -27
- 9D33 1µg/mL
- 37 -14
- 9D33 10µg/mL
- 62 -14
- 9D33 100µg/mL
- 88 -31
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 557 ± 105 889 ± 208 160
- TSH
- 16781 ± 1025 14407 ± 3748 86
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 12022 +2220 16669 ± 2167 139
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 12439 ± 2453 15501 +1141 125
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 13056 ± 1630 15106 ± 931 116
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 13587 ± 1777 18962 ± 4050 140
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 12993 ± 2404 18797c 145
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 11196 ± 1798 14519 ± 3400 130
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 6601 +712 12120c 184
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 4500 ± 678 7217 ± 512 160
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1627 ± 166 4886 ± 382 300
- 9D33 100µg
- 849 ± 207 1174 +312 138
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 28 -16
- 2G2 10µg/mL
- 26 -8
- 2G2 100µg/mL
- 22 -5
- 9D33 0,001µg/mL
- 19 -32
- 9D33 0,01µg/mL
- 23 -30
- 9D33 0,1µg/mL
- 33 0
- 9D33 1µg/mL
- 61 16
- 9D33 10µg/mL
- 73 50
- 9D33 100µg/mL
- 90 66
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mL cValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 714 ± 43 1088 ± 92 152
- TSH
- 18979c 19704 ± 2677 104
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 20640 ± 581 20980c 102
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 18496 ± 343 19799 ± 1419 107
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 19699 ± 1947 23450 ± 923 119
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 19575 ± 4282 25960 ± 1357 133
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 23162 ± 1504 18751 ± 865 81
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 17648 ± 2178 23899 ± 300 135
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 9905 ± 1476 20875 ± 800 211
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 5145 ± 495 20797 ± 3441 404
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 2241 ± 281 21076 ± 2980 904
- 9D33 100µg
- 965 ± 86 1571 ± 205 163
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- -9 -6
- 2G2 10µg/mL
- 3 0
- 2G2 100µg/mL
- -4 -19
- 9D33 0,001µg/mL
- -3 -32
- 9D33 0,01µg/mL
- -22 5
- 9D33 0,1µg/mL
- 7 -21
- 9D33 1µg/mL
- 49 -6
- 9D33 10µg/mL
- 73 -6
- 9D33 100µg/mL
- 88 -7
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 659 ± 58 514 ± 40 78
- TSH
- 20019 ± 1871 17217 ± 2685 86
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 16429 ± 308 17022 ± 1123 104
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 18361 ± 1176 15857 ± 2364 86
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 16916 ± 814 16942 ± 1683 100
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 15724 ± 1763 20521 ± 3779 131
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 15737 ± 1060 19300 ± 1479 123
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 16788 ± 1341 16258 ± 3120 97
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 8613 ± 674 21217 ± 2058 246
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 3517 ± 798 17035 ± 1707 484
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1869 ± 200 b 18217 ± 1061 975
- 9D33 100µg
- 950 ± 504 675 ± 80 71
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHc
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 18 1
- 2G2 10µg/mL
- 8 8
- 2G2 100µg/mL
- 16 2
- 9D33 0,001µg/mL
- 21 -19
- 9D33 0,01µg/mL
- 21 -12
- 9D33 0,1µg/mL
- 16 6
- 9D33 1µg/mL
- 57 -23
- 9D33 10µg/mL
- 82 1
- 9D33 100µg/mL
- 95 6
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLc 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 599 ± 71 548 ± 25 91
- TSH
- 8350 ± 1303 6602 ± 96 79
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 7358 ± 1153 5446 ± 265 74
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 9821 ± 1749 5906 ± 335 60
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 7962 ± 1218 5771 ± 19 72
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 6393 ± 1036 8064 ± 1472 126
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 9482 ± 1536 7608 ± 875 80
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 8910 ± 526 6485 ± 146 73
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 4009 ± 447 7291 ± 591 181
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 3395 ± 238 7648 ± 1386 225
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 2869 ± 254 5951 ± 1035 207
- 9D33 100µg
- 596 ± 33 679 ± 48 114
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHc
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 12 18
- 2G2 10µg/mL
- -18 11
- 2G2 100µg/mL
- 5 13
- 9D33 0,001µg/mL
- 23 -22
- 9D33 0,01µg/mL
- -14 -15
- 9D33 0,1µg/mL
- -7 2
- 9D33 1µg/mL
- 52 -10
- 9D33 10µg/mL
- 59 -16
- 9D33 100µg/mL
- 66 10
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLc 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- C. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 893 ± 103 1215 ± 93 136
- TSH
- 18593 ± 2469 14789 ± 3005 80
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 17253 ± 1508 13057 ± 1259 76
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 18423 ± 4503 9495 ± 1017 52
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 18952 ± 3984 13210 ± 2663 70
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 17646 ± 1558 9589 ± 516 54
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 20021 ± 949 11194 ± 147 56
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 16937 ± 2431 7651 ± 1178 45
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 11655 ± 4674 5613 ± 1549 48
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 5903 ± 1022 2386 ± 1294 40
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 3493 ± 395 2536 ± 388 73
- 9D33 100µg
- 996 ± 108 963 ± 192 97
- D. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHc
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 7 12
- 2G2 10µg/mL
- 1 36
- 2G2 100µg/mL
- -2 11
- 9D33 0,001µg/mL
- 5 35
- 9D33 0,01µg/mL
- -8 24
- 9D33 0,1µg/mL
- 9 48
- 9D33 1µg/mL
- 37 62
- 9D33 10µg/mL
- 68 84
- 9D33 100µg/mL
- 81 83
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLc 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1126 ± 74 1263 ± 73 112
- TSH
- 21406 ± 932 5857 ± 571 27
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 21490 ± 2227 5357 ± 756 25
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 18305 ± 2116 5502 ± 431 30
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 20965 ± 3258 4655 ± 243 22
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 23207 ± 5032 4504 ± 471 19
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 20373 ± 2048 5297 ± 1069 26
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 16380 ± 566 5577 ± 192 34
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 16364 ± 2028 5285 ± 885 32
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 8126 ± 407 5774 ± 866 71
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 3587c 5290 ± 619 147
- 9D33 100µg
- 973c 720 ± 105 74
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 0 9
- 2G2 10µg/mL
- 14
- 2G2 100µg/mL
- 2 21
- 9D33 0,001µg/mL
- -8 23
- 9D33 0,01µg/mL
- 5 10
- 9D33 0,1µg/mL
- 23 5
- 9D33 1µg/mL
- 24 10
- 9D33 10µg/mL
- 62 1
- 9D33 100µg/mL
- 83 10
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 734 ± 285 1214 ± 66 165
- TSH
- 15683 ± 3332 16060 ± 3546 102
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 16962 ± 3784 15661 ± 1152 92
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 16231c 12589± 1450 78
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 16675 ± 3301 16387 ± 1142 98
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 16646 ± 2135 15716 ± 283 94
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 18722 ± 1091 14075 ± 905 75
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 13435 ± 333 13803 ± 1416 103
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 8004 ± 2106 14551 ± 2498 182
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 4718 ± 867 11169 ± 488 237
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1991 ± 494 9554 ± 830 480
- 9D33 100µg
- 1155 ± 73 1148 ± 19 99
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- -8 2
- 2G2 10µg/mL
- -3 22
- 2G2 100µg/mL
- -6 -2
- 9D33 0,001µg/mL
- -6 2
- 9D33 0,01µg/mL
- -19 12
- 9D33 0,1µg/mL
- 14 14
- 9D33 1µg/mL
- 49 9
- 9D33 10µg/mL
- 70 30
- 9D33 100µg/mL
- 87 59
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 656 ± 50 312 ± 151 48
- TSH
- 16975c 12341 ± 1724 73
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 13540 ± 1490 11663 ± 980 86
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 12805 ± 785 10932 ± 1779 85
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 13629 ± 689 12795 ± 2243 94
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 14034 ± 1530 14046 ± 2244 100
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 12506 ± 1906 10787 ± 1468 86
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 10790 ± 1948 14003 ± 89 130
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 7392 ± 661 15087 ± 2096 204
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 3293 ± 457 11271 ± 1633 342
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 2062 ± 439 10178 ± 1136 494
- 9D33 100µg
- 564 ± 66 367 ± 45 65
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulaciónde TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 20 5
- 2G2 10µg/mL
- 25 11
- 2G2 100µg/mL
- 20 4
- 9D33 0,001µg/mL
- 17 -14
- 9D33 0,01µg/mL
- 26 13
- 9D33 0,1µg/mL
- 36 -13
- 9D33 1µg/mL
- 56 -22
- 9D33 10µg/mL
- 81 9
- 9D33 100µg/mL
- 88 18
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 748 ± 106 710 ± 70 95
- TSH
- 21197 ± 1858 11364 ± 1348 54
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 20669 ± 1577 13312 ± 424 64
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 21235 ± 2707 11279 ± 1786 53
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 20993 ± 1117 14886 ± 2848 71
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 20299 ± 2578 12194 ± 1369 60
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 21147 ± 908 12452 ± 1342 59
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 19098 ± 1944 12812 ± 1016 67
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 10880 ± 1530 14217 ± 959 131
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 6851 ± 1132 12058 ± 80 176
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 3170 ± 713 10607 ± 754 335
- 9D33 100µg
- 1029 ± 120 1140 ± 58 111
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHc
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 2 -17
- 2G2 10µg/mL
- 0 0
- 2G2 100µg/mL
- 1 -31
- 9D33 0,001µg/mL
- 4 -7
- 9D33 0,01µg/mL
- 0 -10
- 9D33 0,1µg/mL
- 10 -13
- 9D33 1µg/mL
- 49 -25
- 9D33 10µg/mL
- 68 -6
- 9D33 100µg/mL
- 95 7
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLc 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 412c 401 ± 16 97
- TSH
- 12783 ± 422 4914 ± 292 38
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 12434 ± 264 5191c 42
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 11974 ± 467 4830 ± 119 40
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 12042 ± 1466 4168 ± 45 35
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 10568 ± 844 5012 ± 134 47
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 11833 ± 1266 8035c 68
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 9392 ± 1300 4905 ± 805 52
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 5031 ± 397 6339 ± 823 126
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 2515 ± 278 4567 ± 505 182
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 776c 3346 ± 419 431
- 9D33 100µg
- 509 ± 46 473 ± 102 93
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 3 -6
- 2G2 10µg/mL
- 6 2
- 2G2 100µg/mL
- 6 15
- 9D33 0,001µg/mL
- 17 -2
- 9D33 0,01µg/mL
- 7 -64
- 9D33 0,1µg/mL
- 27 0
- 9D33 1µg/mL
- 61 -29
- 9D33 10µg/mL
- 80 7
- 9D33 100µg/mL
- 94 32
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico bConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- aMuestra para análisis
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1019 ± 65 915 ± 83 90
- TSH
- 18088 ± 2962 11466 ± 995 63
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 15207 ± 1297 12415 ± 570 82
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 16741 ± 1303 11439 ± 440 68
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 19281 ± 3245 12223 ± 895 63
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 14911 ± 417 10584 ± 1719 71
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 15722 ± 693 11744 ± 281 75
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 14409 ± 810 9104 ± 407 63
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 10277 ± 629 5212 ± 251 51
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 7116 ± 438 3071 ± 421 43
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 3953 ± 523 1572 ± 150 40
- 9D33 100µg
- 1110 ± 43 890 ± 78 80
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHc
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 16 -8
- 2G2 10µg/mL
- 7 0
- 2G2 100µg/mL
- -7 -7
- 9D33 0,001µg/mL
- 18 8
- 9D33 0,01µg/mL
- 13 -2
- 9D33 0,1µg/mL
- 20 21
- 9D33 1µg/mL
- 43 55
- 9D33 10µg/mL
- 61 73
- 9D33 100µg/mL
- 78 86
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLc 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1045 ± 98 740 ± 160 71
- TSH
- 19796 ± 1401 20249 ± 425 102
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 20013 ± 2808 19662 ± 1329 98
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 19219 ± 3257 19001 ± 657 99
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 20722 ± 1156 20770 ± 594 100
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 20420 ± 2123 22086 ± 351 108
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 18407 ± 1250 21142 ± 1984 115
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 18571 ± 1082 21620 ±1118 116
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 13342 ± 433 21312 ± 1471 160
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 9106 ± 1056 16724 ± 1503 184
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 4341 ± 1186 11788 ± 760 272
- 9D33 100µg
- 1193 ± 108 1149 ± 112 96
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- -1 3
- 2G2 10µg/mL
- 3 6
- 2G2 100µg/mL
- -5 -3
- 9D33 0,001µg/mL
- -3 -9
- 9D33 0,01µg/mL
- 7 -4
- 9D33 0,1µg/mL
- 6 -7
- 9D33 1µg/mL
- 33 -5
- 9D33 10µg/mL
- 54 17
- 9D33 100µg/mL
- 78 42
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 521 ± 32 483 ± 60 93
- TSH
- 16267 ± 1932 12291 ± 1040 76
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 15536 ± 1852 13116 ± 693 84
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 14976 ± 1066 10613 ± 759 71
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 15211 ± 1303 12054 ± 447 79
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 12507 ± 1070 14316 ± 554 114
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 14146 ± 50 11125 ± 1618 79
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 13139 ± 526 1312 ± 116 10
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 10290c 985 ± 285 10
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 3445 ± 491 796 ± 135 23
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 2211 ± 125 752 ± 82 34
- 9D33 100µg
- 498 ± 3 539 ± 53 108
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 4 -7
- 2G2 10µg/mL
- 8 14
- 2G2 100µg/mL
- 6 2
- 9D33 0,001µg/mL
- 23 -16
- 9D33 0,01µg/mL
- 13 9
- 9D33 0,1µg/mL
- 19 89
- 9D33 1µg/mL
- 63 92
- 9D33 10µg/mL
- 79 94
- 9D33 100µg/mL
- 86 94
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 371 ± 17 264 ± 29 71
- TSH
- 13792 ± 1706 12173 ± 3906 88
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 9996 ± 1289 14200 ± 5323 142
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 12279 ± 2013 10616 ± 2142 86
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 10520 ± 1450 12789 ± 902 122
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 10372c 13874 ± 1472 134
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 12431 ± 2262 17223 ± 6145 139
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 9470 ± 865 14012 ± 1217 148
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 2920 ± 597 10713 ± 3015 367
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 2828 ± 744 3857 ± 316 136
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 2210 ± 391 3220 ± 261 146
- 9D33 100µg
- 260 ± 76 320 ± 12 123
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 28 -17
- 2G2 10µg/mL
- 11 13
- 2G2 100µg/mL
- 24 -5
- 9D33 0,001µg/mL
- 25 -14
- 9D33 0,01µg/mL
- 10 -42
- 9D33 0,1µg/mL
- 31 -15
- 9D33 1µg/mL
- 79 12
- 9D33 10µg/mL
- 79 68
- 9D33 100µg/mL
- 84 74
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 0,3 ng/mL cValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- aMuestra para análisis
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 346 ± 47 405 ± 38 117
- TSH
- 8666 ± 185 5131 ± 788 59
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 8025 ± 514 3993 ± 499 50
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 9382 ± 722 4641 ± 1139 49
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 6810 ± 871 4838 ± 543 71
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 6931 ± 631 4903 ± 880 70
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 7419 ± 989 3778 ± 300 51
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 6250 ± 208 4025 ± 1208 64
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 3686 ± 390 2757 ± 297 75
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 2197 ± 141 1818 ± 233 83
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1293 ± 113 1294 ± 177 100
- 9D33 100µg
- 437 ± 30 294 ± 46 67
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHc
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 7 22
- 2G2 10µg/mL
- -8 10
- 2G2 100µg/mL
- 21 6
- 9D33 0,001µg/mL
- 20 4
- 9D33 0,01µg/mL
- 14 26
- 9D33 0,1µg/mL
- 28 22
- 9D33 1µg/mL
- 57 46
- 9D33 10µg/mL
- 75 65
- 9D33 100µg/mL
- 85 75
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLc 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 33c 118 ± 60 358
- TSH
- 8951 ± 1717 4807 ± 518 54
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 9852 ± 2211 4219 ± 193 43
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 10415 ± 1974 5199 ± 1202 50
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 10829 ± 2611 5153 ± 1552 48
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 11064 ± 2932 5476 ± 216 49
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 9945 ± 366 5437 ± 632 55
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 10451 ± 299 3132 ± 251 30
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 2849 ± 627 1717 ± 219 60
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 1955 ± 582 1038 ± 27 53
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1263 ± 204 614 ± 329 49
- 9D33 100µg
- 103 ± 106 178 ± 18 173
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- -10 12
- 2G2 10µg/mL
- -16 -8
- 2G2 100µg/mL
- -20 -7
- 9D33 0,001µg/mL
- -24 -14
- 9D33 0,01µg/mL
- -11 -13
- 9D33 0,1µg/mL
- -17 35
- 9D33 1µg/mL
- 68 64
- 9D33 10µg/mL
- 78 78
- 9D33 100µg/mL
- 86 87
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico bConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 125 ± 13 127 ± 39 102
- TSH
- 7714 ± 372 6022 ± 922 78
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 9832 ± 2099 7272 ± 732 74
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 6648 ± 859 6423 ± 781 97
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 9666 ± 1599 6251 ± 289 65
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 7654 ± 1675 6523 ± 485 85
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 7699 ± 770 7540 ± 1313 98
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 8113 ± 222 3392 ± 190 42
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 2495 ± 581 1439 ± 466 58
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 2487 ± 396 776 ± 128 31
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 920 ± 210 832 ± 207 90
- 9D33 100µg
- 117 ± 31 132 ± 10 113
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHc
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- -27 -21
- 2G2 10µg/mL
- 14 -7
- 2G2 100µg/mL
- -25 -4
- 9D33 0,001µg/mL
- 1 -8
- 9D33 0,01µg/mL
- 0 -25
- 9D33 0,1µg/mL
- -5 44
- 9D33 1µg/mL
- 68 76
- 9D33 10µg/mL
- 68 87
- 9D33 100µg/mL
- 88 86
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLc 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- aMuestra para análisis
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 638 ± 46 173 ± 26 27
- TSH
- 14724 ± 601 5685 ± 1592 39
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 15078 ± 2313 10707 ± 2563 71
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 16435 ± 427 11223 ± 2495 68
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 17412c 7649 ± 1735 44
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 13867c 8335 ± 691 60
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 19164 ± 1515 7447 ± 3118 39
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 18410c 5547 ± 2107 30
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 7982 ± 1605 1292 ± 512 16
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 3503 ± 1401 772 ± 89 22
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 964 ± 474 710 ± 148 74
- 9D33 100µg
- 529 ± 22 860 ± 212 163
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 2 -88
- 2G2 10µg/mL
- -12 -97
- 2G2 100µg/mL
- -18 -35
- 9D33 0,001µg/mL
- 6 -47
- 9D33 0,01µg/mL
- -30 -31
- 9D33 0,1µg/mL
- -25 2
- 9D33 1µg/mL
- 54 77
- 9D33 10µg/mL
- 76 86
- 9D33 100µg/mL
- 93 88
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico bConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1068 ± 164 1491 ± 182 140
- TSH
- 22245c 15844 ± 2736 71
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 19749 ± 2395 21309 ± 1640 108
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 17609 ± 981 13048 ± 1718 74
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 22060 ± 2265 17966 ± 1997 81
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 21265 ± 375 19697 ± 2129 93
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 21435 ± 3957 24374 ± 4050 114
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 16626 ± 1019 20358 ± 2627 122
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 10260 ± 1863 17657 ± 2149 172
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 7115 ± 1337 9725 ± 1349 137
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 2012c 6387 ± 916 317
- 9D33 100µg
- 1349 ± 122 1714 ± 144 127
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 11 -34
- 2G2 10µg/mL
- 21 18
- 2G2 100µg/mL
- 1 -13
- 9D33 0,001µg/mL
- 4 -24
- 9D33 0,01µg/mL
- 4 -54
- 9D33 0,1µg/mL
- 25 -28
- 9D33 1µg/mL
- 54 -11
- 9D33 10µg/mL
- 68 39
- 9D33 100µg/mL
- 91 60
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 636 ± 116 779 ± 119 122
- TSH
- 23009 ± 3972 11398 ± 2719 50
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 17299 ± 1029 18350c 106
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 18521 ± 472 11028 ± 839 60
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 17147c 6999 ± 631 41
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 19901c 12930 ± 1264 65
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 15319 ± 2933 17445 ± 1677 114
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 18030 ± 4806 8723 ± 1100 48
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 7108 ± 1592 4776 ± 933 67
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 4059 ± 704 2300 ± 680 57
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 1809 ± 1090 1546 ± 614 85
- 9D33 100µg
- 718 ± 122 954 ± 49 133
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 25 -61
- 2G2 10µg/mL
- 20 -3
- 2G2 100µg/mL
- 25 39
- 9D33 0,001µg/mL
- 14 -13
- 9D33 0,01µg/mL
- 33 -53
- 9D33 0,1µg/mL
- 22 23
- 9D33 1µg/mL
- 69 58
- 9D33 10µg/mL
- 82 80
- 9D33 100µg/mL
- 92 86
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisisa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 621 ± 37 157c 25
- TSH
- 5355 ± 1126 3335c 62
- 2G2 1µg/mL + TSHb
- 4032c 4830c 120
- 2G2 10µg/mL + TSHb
- 4399 ± 504 3099 ± 407 70
- 2G2 100µg/mL + TSHb
- 4247c 3292 ± 271 78
- 9D33 0,001µg/mL + TSHb
- 3663 ± 310 4012 ± 591 110
- 9D33 0,01µg/mL + TSHb
- 3881 ± 459 4330 ± 631 112
- 91333 0,1µg/mL + TSHb
- 4788 ± 1443 721 ± 111 15
- 9D33 1µg/mL + TSHb
- 741 ± 104 169 ± 3 23
- 9D33 10µg /mL + TSHb
- 885c 145c 16
- 9D33 100µg/mL + TSHb
- 645 ± 53 131c 20
- 9D33 100µg
- 637c 710 ± 23 111
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de TSHd
- Concentración de anticuerpos
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- 2G2 1µg/mL
- 25 -45
- 2G2 10µg/mL
- 18 7
- 2G2 100µg/mL
- 21 1
- 9D33 0,001µg/mL
- 32 -20
- 9D33 0,01µg/mL
- 28 -30
- 9D33 0,1µg/mL
- 11 78
- 9D33 1µg/mL
- 86 95
- 9D33 10µg/mL
- 83 96
- 9D33 100µg/mL
- 88 96
- aMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod 2G2 es un anticuerpo monoclonal de ratón para la tiroglobulina (control negativo para 9D33)
- Mutación del aa
- Inhibición de la estimulación del AMP cíclico mediada por la TSH por 9D33
- Lys58 a Ala
- Reducción marcada
- Ile60 a Ala
- Sin efecto
- Arg80 a Ala
- Reducción marcada
- Arg80 a Asp
- Reducción marcada
- Tyr82 a Ala
- Reducción marcada
- Glu107 a Ala
- Sin efecto
- GIu107 a Arg
- Reducción marcada
- Arg109 a Ala
- Reducción marcada
- Arg109 a Asp
- Reducción marcada
- Lys129 a Ala
- Reducción marcada
- Lys129 a Asp
- Reducción marcada
- Phe130 a Ala
- Sin efecto
- Phe134 a Ala
- Reducción marcada
- Asp160 a Ala
- Efecto mejorado
- Lys183 a Ala
- Sin efecto
- Lys183 a Asp
- Sin efecto
- Tyr185 a Ala
- Sin efecto
- Tyr206 a Ala
- Sin efecto
- Lys209 a Ala
- Sin efecto
- Lys250 a Ala
- Algo de reducción
- GIu251 a Ala
- Sin efecto
- Arg255 a Asp
- Efecto mejorado
- Arg274 a Ala
- Efecto mejorado
Tabla 19a Estimulación de la producción de AMP cíclico por 8 sueros de pacientes con enfermedad de Graves en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Arg80 mutado a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 720 ± 122 1003 ± 85 139
- Mezcla de HBD
- 787 ± 125 848 ± 153 108
- G1
- 14546 ± 1913 10329 ± 1326 71
- G9
- 9192a 633 ± 36 7
- G15
- 10180 ± 1530 5538 ± 958 54
- G17
- 6592 ± 291 6897 ± 77 105
- G19
- 9042 ± 1407 6907 ± 621 76
- G20
- 11821 ± 1569 1895 ± 702 16
- G21
- 11951 ± 1402 11911 ± 2267 100
- G22
- 10877 ± 752 12125 ± 2063 111
- TSH (3ng/mL)
- 12439 ± 1630 18231 ± 1357 147
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 15900 ± 1903 965 ± 164 6
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 645 ± 99 1208 ± 141 187
- Mezcla de HBD
- 496 ± 78 1150 ± 206 232
- G1
- 23914 ± 3837 9108 ± 130 38
- G9
- 14026 ± 2339 434a 3
- G15
- 9131a 2592 ± 1027 28
- G17
- 6311 ± 545 7947 ± 733 126
- G19
- 10232 ± 1812 8840 ± 135 86
- G20
- 7893 ± 359 1670 ± 275 21
- G21
- 11033 ± 1326 12006 ± 1256 109
- G22
- 14261 ± 686 15182 ± 2888 106
- TSH (3ng/mL)
- 26172 ± 3344 18825 ± 1323 72
- Fab de hMAb TSHR1(10ng/mL)
- 22054 ± 1743 830 ± 44 4
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves
Tabla 19c Estimulación de la producción de AMP cíclico por 8 sueros de pacientes con enfermedad de Graves en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Glu107 mutado a Ala
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 467 ± 55 1044 ± 120 224
- Mezcla de HBD
- 349 ± 31 563 ± 16 161
- G1
- 24022 ± 2266 11449 ± 1745 48
- G2
- 10291 ± 2092 9515 ± 1660 92
- G3
- 1750 ± 89 945 ± 68 54
- G4
- 5654 ± 902 630 ± 105 11
- G5
- 1997 ± 429 841 ± 90 42
- G6
- 8862 ± 648 2741 ± 502 31
- G7
- 8524 ± 1333 563 ± 9 7
- G10
- 1072 ± 78 862 ± 57 80
- TSH (3ng/mL)
- 21689 ± 4541 14393 ± 3517 66
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 20193a 1269 ± 214 6
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1109 ± 216 837 ± 166 75
- Mezcla de HBD
- 469 ± 68 538 ± 156 115
- G1
- 20487 ± 2394 18398 ± 2682 90
- G11
- 1541 ± 40 471 ± 116 31
- G15
- 12402 ± 671 6619a 53
- G16
- 2382 ± 166 508a 21
- G17
- 8351 ± 142 240a 3
- G18
- 2160a 271 ± 33 13
- G19
- 11235 ± 1167 7134 ± 458 63
- G20
- 10485 ± 1872 5486 ± 231 52
- TSH (3ng/mL)
- 22177 ± 3724 18545 ± 1365 84
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 18509 ± 1980 8835a 48
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves
Tabla 19e Estimulación de la producción de AMP cíclico por 8 sueros de pacientes con enfermedad de Graves en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Arg109 mutado a Asp
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1164 ± 135 156 ± 17 13
- Mezcla de HBD
- 684 ± 9 142a 21
- G1
- 13261 ± 1829 12183 ± 440 92
- G9
- 10959 ± 1289 3985 ± 714 36
- G15
- 10163 ± 1093 2895 ± 372 28
- G17
- 8802 ± 1300 ud nd
- G19
- 9120 ± 1226 7588 ± 261 83
- G20
- 9028 ± 0 774 ± 170 9
- G21
- 11249 ± 665 2711 ± 47 24
- G22
- 10929 ± 605 592 ± 159 5
- TSH (3ng/mL)
- 13087 ± 1240 12308 ± 500 94
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 12318 ± 513 29701a 24
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves ud = no detectable nd = no determinado
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 733 ± 130 774 ± 116 106
- Mezcla de HBD
- 555 ± 82 676 ± 63 122
- G1
- 14504 ± 1914 12217 ± 1309 84
- G9
- 11371 ± 1268 6705 ± 490 59
- G15
- 8331 ± 413 5896 ± 841 71
- G17
- 6769 ± 1311 3642 ± 534 54
- G19
- 6232a 5588 ± 433 90
- G20
- 6974 ± 416 4561a 65
- G21
- 9638 ± 923 6384 ± 717 66
- G22
- 11167 ± 849 8579 ± 1015 77
- TSH (3ng/mL)
- 12021 ± 597 10747 ± 1097 89
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 15281 ± 2616 5457 ± 294 36
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves
Tabla 19g Estimulación de la producción de AMP cíclico por 8 sueros de pacientes con enfermedad de Graves en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Lys183 mutado a Ala Tabla 19i Estimulación de la producción de AMP cíclico por 8 sueros de pacientes con enfermedad de Graves en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Arg255 mutado a Ala y Trp258 a Ala Tabla 21a Estimulación de la producción de AMP cíclico por 6 diferentes anticuerpos monoclonales de ratón estimulantes del tiroides (mTSMAbs) en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Arg80 mutado a Asp. Tabla 21c Estimulación de la producción de AMP cíclico por 6 diferentes anticuerpos monoclonales de ratón estimulantes del tiroides (mTSMAbs) en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Arg109 muta-do a Ala Tabla 21e Estimulación de la producción de AMP cíclico por 6 diferentes anticuerpos monoclonales de ratón estimulantes del tiroides (mTSMAbs) en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Lys129 muta-do a Ala Tabla 21g Estimulación de la producción de AMP cíclico por 6 diferentes anticuerpos monoclonales de ratón estimulantes del tiroides (mTSMAbs) en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y TSHR con Lys183 muta-do a Asp
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 564a 501 ± 30 89
- Mezcla de HBD
- 388 ± 7 423 ± 83 109
- G1
- 20190a 13292 ± 1339 66
- G2
- 11793 ± 1112 4213 ± 350 36
- G3
- 3406 ± 149 2699 ±46 79
- G4
- 3465 ± 102 2473 ± 302 71
- G5
- 3850 ± 297 4540a 118
- G6
- 2702 ± 76 2148 ± 262 79
- G7
- 3666 ± 72 11567 ± 604 316
- G10
- 3682 ± 136 9445a 257
- TSH (3ng/mL)
- 15633 ± 1329 15528 ± 2057 99
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 12921 ± 1927 2685-1166 21
- Experimento 2
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 609 ± 103 824 ± 115 135
- Mezcla de HBD
- 767a 847 ± 82 110
- G7
- 8582 ± 919 21820 ± 3119 254
- G10
- 6900 ± 1020 11315 ± 582 164
- TSH (3ng/mL)
- 6652 ± 507 10158a 153
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1177 ± 84 1060 ± 129 90
- Mezcla de HBD
- 1083 ± 90 818 ± 87 76
- G1
- 23805 ± 711 16885 ± 3813 71
- G2
- 15218 ± 742 5498 ± 463 36
- G3
- 6751 ± 299 2222a 33
- G4
- 8658a 1891 ± 383 21
- G5
- 9597 ± 880 5432 ± 502 57
- G6
- 6452 ± 251 6751 ± 295 105
- G7
- 9408 ± 1016 8245 ± 1419 88
- G10
- 10221 ± 634 5346 ± 794 52
- TSH (3ng/mL)
- 20683 ± 1193 20430 ± 1646 99
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 21674 ± 6631 2088 ± 332 11
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 971 ± 158 852 ± 39 88
- Mezcla de HBD
- 195 ± 15 192 ± 11 98
- G1
- 23823 ± 3713 10040a 42
- G15
- 16707a 988 ± 184 6
- G16
- 5936a 284 ± 56 5
- G18
- 4188 ± 249 539 ± 54 13
- G19
- 9319± 2112 1166 ± 187 13
- G21
- 18524a 1131 ± 90 6
- G22
- 20146 ± 599 10350a 51
- G23
- 3135 ± 965 614 ± 112 20
- TSH (3ng/mL)
- 22914 ± 3567 21673 ± 2216 95
- Fab de hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 22605 ± 2137 1228 ± 48 5
- aValor medio del duplicado HBD = mezcla de suero sanguíneo de donantes sanos G1-G23 = suero de pacientes con la enfermedad de Graves
Tabla 20 Resumen del efecto de la mutación (con respecto al tipo natural) sobre la estimulación de la producción de AMP por sueros (n = 8) de pacientes con la enfermedad de Graves
- Mutación del aa
- Reducción marcada Reducción Efecto pequeño Sin efecto Efecto aumentado
- Arg80 a Ala
- 2/8 1/8 2/8 3/8 0/8
- Arg80 a Asp
- 3/8 1/8 1/8 3/8 0/8
- GIu107 a Ala
- 2/8 4/8 1/8 1/8 0/8
- Arg109 a Ala
- 3/8 3/8 1/8 1/8 0/8
- Arg109 a Asp
- 5/8 1/8 1/8 1/8 0/8
- Lys129 a Ala
- 0/8 2/8 5/8 1/8 0/8
- Lys183 a Ala
- 0/8 1/8 4/8 1/8 2/8
- Lys183 a Asp
- 1 /8 4/8 2/8 1 /8 0/8
- Arg255 a Asp
- 8/8 0/8 0/8 0/8 0/8
- Arg255 a Ala y Trp258 a Ala
- 6/8 2/8 0/8 0/8 0/8
- Se muestra para cada mutación el número de sueros afectados de 8 sueros analizados.
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 484 ± 74 880 ± 142 182
- hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 15218 ± 1052 1284 ± 469 8
- 2G2 (1µg/mL)
- 726 ± 164 946 ± 207 130
- TSMAb 1 (1µg/mL)
- 4862 ± 510 1480 ± 160 30
- TSMAb 2 (1µg/mL)
- 3390 ± 459 945 ± 200 28
- TSMAb C (10ng/mL)
- 5261 ± 472 1532 ± 320 29
- TSMAb D (1µg/mL)
- 6714 ± 398 1255 ± 316 19
- TSMAb E (1µg/mL)
- 6861 ± 1025 1083 ± 199 16
- TSMAb F (100ng/mL)
- 11271 ± 1753 1424 ± 279 13
- 2G2 es un anticuerpo monoclonal para tiroglobulina (control negativo)
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 470 ± 85 1130 ± 119 240
- hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 19175a 1238 ± 15 6
- 2G2 (1µg/mL)
- 632 ± 214 1057 ± 129 167
- TSMAb 1 (1µg/mL)
- 5986 ± 374 1049 ± 170 18
- TSMAb 2 (1µg/mL)
- 4214 ± 448 1106 ± 105 26
- TSMAb C (10ng/mL)
- 7181 ± 678 1267 ± 140 18
- TSMAb D (1µg/mL)
- 10157a 1149 ± 120 11
- TSMAb E (1µg/mL)
- 7425a 1224 ± 50 16
- TSMAb F (100ng/mL)
- 13203 ± 891 1158 ± 137 9
- aValor medio del duplicado 2G2 es un anticuerpo monoclonal para tiroglobulina (control negativo)
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 727 ± 41 1036 ± 190 143
- hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 18093 ± 2166 9972 ± 697 55
- 2G2 (1µg/mL)
- 935a 718 ± 161 77
- TSMAb 1 (1µg/mL)
- 5622 ± 381 526a 9
- TSMAb 2 (1µg/mL)
- 4325 ± 731 444 ± 86 10
- TSMAb C (10ng/mL)
- 5807 ± 708 3706 ± 207 64
- TSMAb D (1µg/mL)
- 8462 ± 1673 3047 ± 395 36
- TSMAb E (1µg/mL)
- 6729 ± 813 3246 ± 612 48
- TSMAb F (100ng/mL)
- 13964 ± 1780 6727 ± 791 48
- aValor medio del duplicado 2G2 es un anticuerpo monoclonal para tiroglobulina (control negativo)
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 630 ± 22 413 ± 1 66
- hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 17787 ± 1359 3733 ± 395 21
- 2G2 (1µg/mL)
- 645 ± 103 359 ± 113 56
- TSMAb 1 (1µg/mL)
- 4489 ± 576 491 ± 36 11
- TSMAb 2 (1µg/mL)
- 4102 ± 413 278a 7
- TSMAb C (10ng/mL)
- 7440 ± 548 709a 10
- TSMAb D (1µg/mL)
- 9305 ± 1019 591 ± 30 6
- TSMAb E (1µg/mL)
- 8387 ± 720 530 ± 52 6
- TSMAb F (100ng/mL)
- 12292 ± 1280 473a 4
- aValor medio del duplicado 2G2 es un anticuerpo monoclonal para tiroglobulina (control negativo)
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1196 ± 28 1002 ± 154 84
- hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 28890 ± 2504 10900 ± 818 38
- 2G2 (1µg/mL)
- 1396 ± 146 331a 24
- TSMAb 1 (1µg/mL)
- 6220 ± 850 4700 ± 840 76
- TSMAb 2 (1µg/mL)
- 5706 ± 792 3394 ± 560 59
- TSMAb C (10ng/mL)
- 10288a 540 ± 186 5
- TSMAb D (1µg/mL)
- 13806 ± 716 816 ± 26 6
- TSMAb E (1µg/mL)
- 8746 ± 968 656 ± 82 8
- TSMAb F (100ng/mL)
- 20126 ± 1972 2264a 11
- aValor medio del duplicado 2G2 es un anticuerpo monoclonal para tiroglobulina (control negativo)
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 717 ± 98 601 ± 83 84
- hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 25794 ± 1025 3182 ± 771 12
- 2G2 (1µg/mL)
- 784 ± 77 796 ± 104 102
- TSMAb 1 (1µg/mL)
- 4213a 881 ± 188 21
- TSMAb 2 (1µg/mL)
- 3455 ± 435 524a 15
- TSMAb C (10ng/mL)
- 7935a 655a 8
- TSMAb D (1µg/mL)
- 9919 ± 983 556 ± 89 6
- TSMAb E (1µg/mL)
- 8487 ± 1541 703 ± 20 8
- TSMAb F (100ng/mL)
- 15068 ± 1503 797 ± 131 5
- aValor medio del duplicado 2G2 es un anticuerpo monoclonal para tiroglobulina (control negativo)
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Muestra para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclico
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo muta-do/natural (%)
- Solamente tampón de ensayo de AMP cíclico
- 909 ± 51 1005 ± 136 111
- hMAb TSHR1 (10ng/mL)
- 25297a 1755 ± 83 7
- 2G2 (1µg/mL)
- 1296 ± 126 1256 ± 134 97
- TSMAb 1 (1µg/mL)
- 8228 ± 1348 653 ± 174 8
- TSMAb 2 (1µg/mL)
- 8026 ± 1398 370a 5
- TSMAb C (10ng/mL)
- 10381 ± 70 540 ± 144 5
- TSMAb D (1µg/mL)
- 16466 ± 5817 1350 ± 98 8
- TSMAb E (1µg/mL)
- 10765 ± 1543 325 ± 13 8
- TSMAb F (100ng/mL)
- 17634 ± 1701 390 ± 34 2
- aValor medio del duplicado 2G2 es un anticuerpo monoclonal para tiroglobulina (control negativo)
- Mutación del aa
- Reducción marcada Reducción Efecto pequeño Sin efecto
- Arg80 a Asp
- 6/6 0/6 0/6 0/6
- Glu107 a Ala
- 6/6 0/6 0/6 0/6
- Arg109 a Ala
- 2/6 3/6 1/6 0/6
- Arg109 a Asp
- 6/6 0/6 0/6 0/6
- Lys129 a Ala
- 4/6 2/6 0/6 0/6
- Lys 183 a Ala
- 6/6 0/6 0/6 0/6
- Lys 183 a Asp
- 6/6 0/6 0/6 0/6
- Arg255 a Asp
- 6/6 0/6 0/6 0/6
- Se muestra el número de anticuerpos monoclonales afectados de 6 anticuerpos monoclonales analizados para cada mutación.
Tabla 23a Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo natural y
TSHR con Glu107 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de B3 (Tabla 9) con actividad antagonista de la TSH
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Dilución de la muestra de ensayoa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- B3 1000x
- 1041 ± 143 1073 ± 251 103
- B3 1000x + TSHb
- 15561 ± 1630 10918 ± 601 70
- B3 100x
- 567c 214± 24 38
- B3 100x + TSHb
- 10246 ± 469 478c 5
- B3 10x
- 161 ± 3 168 ± 33 104
- B3 10x + TSHb
- 165c 156 ± 26 95
- HBD 1000x
- 877 ± 154 1518 ± 195 173
- HBD 1000x + TSHb
- 18086 ± 1390 11896 ± 1044 66
- HBD 100x
- 931 ± 73 1001 ± 244 108
- HBD 100x + TSHb
- 18850 ± 1541 11777 ± 759 62
- HBD 10x
- 563 ± 302 515 ± 308 91
- HBD 10x + TSHb
- 20456 ± 1912 10284 ± 146 50
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de la TSHd
- Suero con actividad antagonista de la TSH
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- B3 1000x
- 14 8
- B3 100x
- 46 96
- B3 10x
- 99 98
- HBD = Mezcla de suero sanguíneo de donantes sanosaMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicadod donde las diluciones de la muestra para análisis y de la HBD son la misma.
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Dilución de la muestra de ensayoa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- B3 1000x
- 510 ± 100 1224c 240
- B3 1000x + TSHb
- 20938c 12248 ± 824 58
- B3 100x
- 425c 378 ± 55 89
- B3 100x + TSHb
- 20790c 10358 ± 1447 50
- B3 10x
- 226 ± 18 269 ± 16 119
- B3 10x + TSHb
- 349 ± 64 294 ± 46 84
- HBD 1000x
- 419c 473c 113
- HBD 1000x + TSHb
- 21126 ± 884 14225 ± 2494 67
- HBD 100x
- 462c 478c 103
- HBD 100x + TSHb
- 22146 ± 919 11051c 50
- HBD 10x
- 378 ± 14 302c 80
- HBD 10x + TSHb
- 22973 +514 14197 ± 1977 62
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de la TSHd
- Suero con actividad antagonista de la TSH
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- B3 1000x
- 1 14
- B3 100x
- 6 6
- B3 10x
- 98 98
- HBD = Mezcla de suero sanguíneo de donantes sanosaMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mLcValor medio del duplicado d donde las diluciones de la muestra para análisis y de la HBD son la misma.
- A. Niveles de AMP cíclico
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Dilución de la muestra de ensayoa
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural
- B3 1000x
- 535 ± 52 549 ± 31 103
- B3 1000x + TSHb
- 12400 ± 790 14656 ± 2399 118
- B3 100x
- 389 ± 36 267 ± 12 69
- B3 100x + TSHb
- 3420 ± 159 2929 ± 310 86
- B3 10x
- 149 ± 6 150c 101
- B3 10x + TSHb
- 157 ± 21 170c 108
- HBD 1000x
- 569c 648 ± 65 114
- HBD 1000x + TSHb
- 12762 ± 150 13589 ± 2282 106
- HBD 100x
- 548 ± 16 404 ± 237 74
- HBD 100x + TSHb
- 13803 ± 747 13112 ± 1442 95
- HBD 10x
- 396 ± 102 368c 93
- HBD 10x + TSHb
- 11959 ± 940 14161 ± 1648 118
- B. Resultados de la inhibición en%
- % de inhibición de la estimulación de la TSHd
- Suero con actividad antagonista de la TSH
- TSHR de tipo natural TSHR mutado
- B3 1000x
- 3 -8
- B3 100x
- 75 78
- B3 10x
- 99 99
- HBD = Mezcla de suero sanguíneo de donantes sanosaMuestras para análisis en tampón de ensayo de AMP cíclicobConcentración final de la TSH = 1,5 ng/mL cValor medio del duplicadod donde las diluciones de la muestra para análisis y de la HBD son la misma.
Tabla 24 Resumen del efecto de la mutación (con respecto al tipo natural) sobre la inhibición de la estimulación del AMP cíclico mediada por la TSH por el suero B3 (Tabla 9) con actividad antogonista de la TSH
- Mutación del aa
- Inhibición de la estimulación de la producción de AMP cíclico mediada por la TSH por el suero B3 con actividad antagonista de la TSH
- Glu107 a Ala
- Efecto mejorado
- Arg109 a Ala
- Sin efecto
- Lys183 a Ala
- Sin efecto
- Arg255 a Asp
- Efecto mejorado
Tabla 25 Análisis de Scatchard de unión de TSH, Fab de hMAb TSHR1 y MAb 9D33 a preparaciones del receptor de TSH de tipo natural (no mutado) y mutado.
- Preparación del receptor
- Afinidad para la TSH Afinidad para Fab de hMAb TSHR1 Afinidad para MAb 9D33
- Tipo natural
- 6,0 ± 0,9 x 109 L/mol 3,4 ± 1,0 x 1010 L/mol 1,8 ± 0,7 x 1010 L/mol
- Asp43 a Ala
- 3,4 x 109 L/mol 2,7 x 1010 L/mol 1,4 x 1010 L/mol
- Lys58 a Ala
- 5,9 x 109 L/mol 1,6 x 1010 L/mol Unión del MAb 9D33 no detectable
- IIe60 a Ala
- 5,1 x 109 L/mol 4,4 x 1010 L/mol Unión del MAb 9D33 no detectable
- GIu61 a Ala
- 2,4 x 109 L/mol 3,4 x 109 L/mol 0,9 x 1010 L/mol
- Arg80 a Ala
- 4,2 x 109 L/mol Unión del Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Arg80 a Asp
- 2,8 x 109 L/mol Unión del Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Tyr82 a Ala
- 4,0 x 109 L/mol 1,8 x 1010 L/mol Unión del MAb 9D33 no detectable
- GIu107 a Ala
- 3,7 x 109 L/mol 0,1 x 1010 L/mol 0,6 x 1010 L/mol
- Glu107 a Arg
- Unión a TSH no detectable Unión del Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Arg109 a Ala
- 1,1 x 109 L/mol 2,3 x 101ü L/mol Unión del MAb 9D33 no detectable
- Arg109 a Asp
- Unión a TSH no detectable Unión del Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Lys129 a Ala
- 2,2 x 109 L/mol 0,3 x 1010 L/mol Unión del MAb 9D33 no detectable
- Lys129 a Asp
- Unión a TSH no detectable Unión del Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Phe130 a Ala
- 2,4 x 109 L/mol 0,3 x 1010 L/mol 0,9 x 1010 L/mol
- Phe134 a Ala
- 2,1 x 109 L/mol 0,9 x 1010 L/mol 0,5 x 1010 L/mol
- Glu 157 a Ala
- Unión a TSH no detectable 2,2 x 1010 L/mol 1,3 x 1010 L/mol
- Asp160 a Ala
- Unión a TSH no detectable 1,8 x 1010 L/mol 1,0 x 1010 L/mol
- Glu178 a Ala
- 1,0 x 109 L/mol 0,5 x 1010 L/mol 1,3 x 1010 L/mol
- Lys 183 a Ala
- 16 x 109 L/moI nt nt
- Lys183 a Asp
- Unión a TSH no detectable Unión del Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Tyr185 a Ala
- 3,4 x 109 L/mol 0,4 x 1010 L/mol 0,9 x 1010 L/mol
- Asp203 a Ala
- 2,2 x 109 L/mol 1,9 x 1010 L/mol 1,4 x 1010 L/mol
- Tyr206 a Ala
- Unión a TSH no detectable nt Unión del MAb 9D33 no detectable
- Lys209 a Ala
- Unión a TSH no detectable 1,3 x 1010 L/mol 0,8 x 1010 L/mol
- Asp232 a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión del Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Asp232 a Arg
- Unión a TSH no detectable Unión del Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Gln235 a Ala
- 4,9 x 1010 L/mol 2,5 x 1010 L/mol 1,1 x 1010 L/mol
- Lys250 a Ala
- Unión a TSH no detectable 0,9 x 1010 L/mol 0,6 x 1010 L/mol
- GIu251 a Ala
- 2,0 x 109 L/mol 1,9 x 1010L/mol 0,8 x 1010 L/mol
- Arg255 a Ala
- 2,3 x 109 L/mol 0,7 x 1010 L/mol 0,8 x 1010 L/mol
- Arg255 a Asp
- Unión a TSH no detectable 0,3 x 1010 L/mol 1,3 x 1010 L/mol
- Thr257 a Ala
- Unión a TSH no detectable 1,8 x 1010 L/mol 0,7 x 1010 L/mol
- Trp258 a Ala
- Unión a TSH no detectable 1,4 x 1010 L/mol 1,2 x 1010 L/mol
- Arg274 a Ala
- Unión a TSH no detectable 0,8 x 1010 L/mol 0,5 x 1010 L/mol
- Asp276 a Ala
- 5,5 x 109 L/mol 1,6 x 1010 L/mol 1,3 x 1010 L/mol
- Tyr279 a Ala
- Unión a TSH no detectable 0,7 x 1010 L/mol 0,6 x 1010 L/mol
- Ser281 a Ala
- 3,4 x 109 L/mol 2,3 x 1010 L/mol 0,9 x 1010 L/mol
- Arg255 a Ala y Trp258 a Ala
- Unión a TSH no detectable 1,0 x 1010 L/mol 1,1 x 1010 L/mol
- nt = no analizado
- Mutación del aa
- Afinidad para la TSH Afinidad para Fab de hMAb TSHR1
- Arg80 a Ala
- Inalterada Unión no detectable
- Arg80 a Asp
- Inalterada Unión no detectable
- Tyr82 a Ala
- Inalterada Inalterada
- GIu107 a Ala
- Inalterada Marcadamente reducida
- Arg109 a Ala
- Reducida Inalterada
- Arg109 a Asp
- Unión no detectable Unión no detectable
- Lys129 a Ala
- Inalterada Marcadamente reducida
- Lys129 a Asp
- Unión no detectable Unión no detectable
- Phe130 a Ala
- Inalterada Marcadamente reducida
- Lys183 a Ala
- Aumentada not tested
- Lys183 a Asp
- Unión no detectable Unión no detectable
- Tyr185 a Ala
- Inalterada Marcadamente reducida
- Asp232 a Ala
- Unión no detectable Unión no detectable
- Arg255 a Ala
- Inalterada Marcadamente reducida
- Arg255 a Asp
- Unión no detectable Marcadamente reducida
- Trp258 a Ala
- Unión no detectable Ligeramente reducida
- Arg255 a Ala y Trp258 a Ala
- Unión no detectable Ligeramente reducida
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1737 ± 112 1136 ± 109 65
- 0,3
- 5032 ± 458 1686 ± 419 34
- 1
- 9528 ± 1680 2499 ± 1359 26
- 3
- 14622 ± 2685 6831 ± 65 47
- 10
- 20515 ± 3415 9527 ± 1081 46
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 953 ± 166 1037 ± 56 109
- 0,03
- 836 ± 447 1128 ± 57 135
- 0,1
- 2083 ± 337 1114 ± 113 53
- 0,3
- 13295 ± 5822 1197 ± 112 9
- 1
- 22327 ± 1531 4622 ± 245 21
- 3
- 20802 ± 6167 7710 ± 329 37
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1108 ± 206 1029 ± 67
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2278 ± 607 2489 ± 91 109
- 0,3
- 4233 ± 270 2856 ± 227 63
- 1
- 13534 ± 999 5506 ± 1111 41
- 3
- 20909 ± 500 13767 ± 1284 66
- 10
- 23297 ± 3180 19498 ± 1786 84
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1071 ± 531 1769 ± 426 165
- 0,03
- 2110 ± 36 2291 ± 230 109
- 0,1
- 4574 ± 181 2306 ± 339 50
- 0,3
- 12723 ± 362 2342 ± 342 18
- 1
- 22463 ± 916 6969 ± 1339 31
- 3
- 24331 ± 834 13458 ± 745 55
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 877 ± 118 2467 ± 251
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1845 ± 349 2199 ± 25 119
- 0,3
- 2995 ± 74 2388 ± 474 80
- 1
- 10614 ± 386 7005 ± 975 66
- 3
- 14298 ± 3757 13707 ± 903 96
- 10
- 17794 ± 1486 14808 ± 1165 83
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1682 ± 329 2574 ± 408 153
- 0,03
- 1913 ± 132 3206 ± 86 168
- 0,1
- 3881 ± 90 3702 ± 114 95
- 0,3
- 11501 ± 1064 10892 ± 616 95
- 1
- 17275 ± 970 16664 ± 1429 96
- 3
- 19963 ± 2506 20605 ± 1452 103
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 895 ± 30 1531 ± 114
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1326 ± 139 815 ± 51 61
- 0,3
- 2244a 1195 ± 57 53
- 1
- 6558 ± 1708 1965 ± 89 30
- 3
- 14499 ± 3232 5238 ± 636 36
- 10
- 19735 ± 1460 10913 ± 826 55
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 949 ± 64 637 ± 93 67
- 0,03
- 1343 ± 240 1106 ± 98 82
- 0,1
- 4351 ± 928 1367 ± 120 31
- 0,3
- 9438 ± 1460 2540 ± 232 27
- 1
- 18296 ± 2078 7852 ± 1106 43
- 3
- 20253 ± 735 13321 ± 3239 66
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 613 ± 45 500 ± 55
- aValor medio del duplicado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 1653 ± 187 609 ± 20 37
- 0,1
- 2956 ± 209 623 ± 42 21
- 0,3
- 9782 ± 1779 1153 ± 516 12
- 1
- 13850 ± 1496 1341 ± 424 10
- 3
- 14827 ± 1864 2713 ± 289 18
- 10
- TSH (ng/mL)
- 1031 ± 94 604 ± 39 59
- 0,01
- 2142 ± 256 779 ± 72 36
- 0,03
- 4658 ± 332 1581 ± 139 34
- 0,1
- 9352 ± 995 3877 ± 1 16 41
- 0,3
- 16490 ± 2070 5499 ± 486 33
- 1
- 14656 ± 501 5532 ± 1145 38
- 3
- 671 ± 36 608 ± 20
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1166 ± 68 849 ± 33 73
- 0,3
- 2407 ± 359 967± 70 40
- 1
- 6155 ± 2046 1227 ± 129 20
- 3
- 13626 ± 2714 1315 ± 128 10
- 10
- 14114 ± 3164 2830 ± 386 20
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1373 ± 284 1254 ± 39 91
- 0,03
- 2761 ± 611 1445 ± 123 52
- 0,1
- nd 2793 ± 528 nd
- 0,3
- 10839 ± 1399 5434 ± 543 50
- 1
- 18337 ± 2139 6879 ± 748 38
- 3
- 16581 ± 5023 6697 ± 367 40
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 747 ± 160 749 ± 148
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1 nd = no determinado
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 1411 ± 110 1098 ± 86 78
- 0,1
- 5592a 1036 ± 91 19
- 0,3
- 8555a 2660 ± 164 31
- 1
- 16325a 2976 ± 246 18
- 3
- 20490a 196 ± 83 l0
- 10
- TSH (ng/mL)
- 1456 ± 63 1018 ± 106 70
- 0,01
- 1755 ± 173 1079 ± 17 61
- 0,03
- 5811 ± 153 1087 ± 95 19
- 0,1
- 10213 ± 897 2613a 26
- 0,3
- 20782 ± 3649 2703a 13
- 1
- 25952 ± 435 2743a 11
- 3
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1233 ± 208 1095 ± 71
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1649 ± 194 968 ± 72 59
- 0,3
- 2786 ± 320 1051 ± 60 30
- 1
- 8364 ± 344 949 ± 305 11
- 3
- 13271 ± 1940 794 ± 316 6
- 10
- 17431 ± 3371 399 ± 83 2
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1185 ± 49 1219 ± 246 103
- 0,03
- 1745 ± 269 1463 ± 98 84
- 0,1
- 2938 ± 462 1571 ± 173 53
- 0,3
- 8603 ± 1998 1274 ± 300 15
- 1
- 19137 ± 1060 1291 ± 243 7
- 3
- 19796 ± 947 832 ± 330 4
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1032 ± 76 836 ± 179
- aValor medio del duplicado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1371 ± 89 387 ± 51 28
- 0,3
- 2655 ± 312 299 ± 173 11
- 1
- 9988 ± 2996 161a 2
- 3
- 12979 ± 2336 178 ± 28 1
- 10
- 11756 ± 1444 161a 1
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 904 ± 85 400 ± 81 44
- 0,03
- 1555 ± 196 391 ± 50 25
- 0,1
- 3714 ± 1022 203 ± 185 5
- 0,3
- 9529a 238 ± 127 2
- 1
- 11451 ± 782 163 ± 32
- 1
- 3
- 11743 ± 761 158 ± 25 1
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 739 ± 94 293 ± 155
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1735 ± 359 880 ± 62 51
- 0,3
- 3378 ± 590 664 ± 153 20
- 1
- 8934 ± 3094 529 ± 132 6
- 3
- 8362 ± 1905 746 ± 144 9
- 10
- 18753 ± 1985 683 ± 84 4
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- nd 888 ± 52 nd
- 0,03
- 1726 ± 322 950 ± 68 55
- 0,1
- nd 973 ± 211 nd
- 0,3
- 17281 ± 542 749 ± 24 4
- 1
- 14866 ± 2236 657 ± 134 4
- 3
- 22039 ± 4147 610 ± 59
- 3
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 755 ± 305 647 ± 203
- aValor medio de lduplicado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1 nd = no determinado
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2232 ± 344 757 ± 111 34
- 0,3
- 4812 ± 202 825 ± 97 17
- 1
- 12703 ± 1110 610 ± 38 5
- 3
- 20706 ± 7441 545 ± 221
- 3
- 10
- 25117 ± 2140 721 ± 280 3
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1850 ± 307 1282 ± 278 69
- 0,03
- 2715 ± 486 1177 ± 341 43
- 0,1
- 5609 ± 757 1327 ± 31 24
- 0,3
- 14284 ± 1250 771 ± 320 5
- 1
- 21333 ± 2573 1822 ± 280 9
- 3
- 26438 ± 4181 1156 ± 501 4
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 997 ± 249 752 ± 95
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1305 ± 30 389 ± 81 30
- 0,3
- 3818 ± 743 328 T33 9
- 1
- 8506 ± 1163 309 ± 56 4
- 3
- 18696 ± 553 ud nd
- 10
- 27645 ± 1765 ud nd
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1234 ± 104 423 ± 138 34
- 0,03
- 1621 ± 145 439 ± 201 27
- 0,1
- 5228 ± 415 809 ± 257 15
- 0,3
- 15209 ± 2728 ud nd
- 1
- 20651 ± 720 364 ± 110 2
- 3
- 25628 ± 256 422 ± 47 2
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 1346± 29 374 ± 126
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1, ud = no detectable nd = no determinado
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1718 ± 13 622 ± 49 36
- 0,3
- 5342a 792 ± 100 15
- 1
- 9732 ± 1608 995 ± 223 10
- 3
- 16827 ± 1629 1335 ± 174 8
- 10
- 20111 ± 1948 3233 ± 1444 16
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 1436a 1304 ± 105 91
- 0,03
- 1640 ± 168 2394 ± 891 146
- 0,1
- 4569 ± 866 5146 ± 407 113
- 0,3
- 12178 ± 887 10690 ± 1722 88
- 1
- 18346 ± 4068 13288 ± 2771 72
- 3
- 21378 ± 1576 19801 ± 2390 93
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 548 ± 62 625 ± 57 114
- aValor medio del duplicado En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1
- AMP cíclico producido (fmol/pocillo de células) (valor medio ± DT; n = 3)
- Experimento 1
- THSR de tipo natural THSR mutado Tipo mutado/natural (%)
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 2376 ± 212 1130 ± 235 48
- 0,3
- 1982 ± 366 1117 ± 168 56
- 1
- 5949 ± 822 2012 ± 289 34
- 3
- 11555 ± 2562 3347 ± 546 29
- 10
- 14591 ± 3475 5184 ± 558 35
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 793 ± 87 1096 ± 221 138
- 0,03
- 1184 ± 307 2202 ± 916 186
- 0,1
- 1761 ± 122 nd nd
- 0,3
- 6254 ± 381 nd nd
- 1
- 10869 ± 1184 17880 ± 2456 165
- 3
- 14479 ± 246 20189 ± 2735 139
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 625 ± 72 668 ± 39
- Experimento 2
- hMAb TSHR1 (ng/mL)
- 0,1
- 1133 ± 113 890 ± 75 79
- 0,3
- 3122 ± 134 941 ± 31 30
- 1
- 8972 ± 700 1477 ± 82 16
- 3
- 14236 ± 940 2406 ± 337 14
- 10
- 16292 ± 1113 4418 ± 1000 27
- TSH (ng/mL)
- 0,01
- 814 ± 147 873 ± 43 107
- 0,03
- 885 ± 142 1409 ± 177 159
- 0,1
- 2754 ± 435 2339 ± 116 85
- 0,3
- 6713 ± 647 4650 ± 871 69
- 1
- 13019 ± 1190 13522 ± 1159 104
- 3
- 17402 ± 768 20202 ± 1233 116
- Tampón de ensayo de AMP cíclico
- 550 ± 16 846 ± 65
- En todos los experimentos se usó Fab de hMab TSHR1 nd = no determinado
Tabla 28Resumen de los efectos de la mutación (respecto al tipo natural) sobre la estimulación de células CHO que contienen TSHR mutado
- Mutación del aa
- Estimulación del TSH Estimulación del Fab del hMAb TSHR1
- Glul 57 a Ala y Asp203 a Ala
- Reducción marcada Algo de reducción
- GIu178 a Ala y Asp203 a Ala
- Sin efecto Sin efecto
- Asp232 a Ala y Arg255 a Ala
- Reducción marcada Reducción marcada
- Asp232 a Arg y Arg255 a Asp
- Reducción marcada Reducción marcada
- Asp232 a Ala y Trp258 a Ala
- Reducción marcada Reducción marcada
- Asp232 a Ala, Arg255 a Ala y Trp258 a Ala
- Reducción marcada Reducción marcada
- Trp258 a Ala y Lys183 a Ala
- Sin efecto Reducción marcada
- Trp258 a Ala y Tyr185 a Ala
- Sin efecto Reducción marcada
- Preparación del receptor
- Afinidad para la TSH Afinidad para Fab de hMAb TSHR1 Afinidad para el MAb 9D33
- Tipo natural
- 6,0 ± 0,9 x 109 L/mol 3,4 ± 1,0 x 1010 L/mol 1,8 ± 0,7 x 1010 L/mol
- Asp232 a Ala y Arg255 a Ala
- Unión a TSH no detectable nt Unión del MAb 9D33 no detectable
- Asp232 a Arg y Arg255 a Asp
- Unión a TSH no detectable Unión de Fab de hMAb TSHR1no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Asp232 a Ala y Trp258 a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión de Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Asp232 a Ala, Arg255 a Ala y Trp 258 a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión de Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- GIu157 a Ala y Asp203 a Ala
- Unión a TSH no detectable 1,5 x 1010 L/mol 0,6 x 1010 L/mol
- Glu178 a Ala y Asp203 a Ala
- Unión a TSH no detectable 0,2 x 1010 L/mol 0,8 x 1010 L/mol
- Tyr185 a Ala y Lys183 a Ala
- 13,9 x 109 L/mol nt 0,6 x 1010 L/mol
- Trp258 a Ala y Lys183 a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión de Fab de hMAb TSHR1no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Trp258 a Ala y Tyr185 a Ala
- Unión a TSH no detectable 0,2 x 1010 L/mol 0,9 x 1010 L/mol
- Arg255 a Ala y Lys183 a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión de Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Arg255 a Ala y Tyr185 a Ala
- Unión a TSH no detectable 0,1 x 1010 L/mol 0,9 x 1010 L/mol
- Arg255 a Ala, Lys183 a Ala y Tyr185 a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión de Fab de hMAb TSHR1 no detectable 0,3 x 1010 L/mol
- Trp258 a Ala, Lys183 a Ala y Tyr185 a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión de Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- Arg255 a Ala, Trp258 a Ala y Ty258 a Ala
- Unión a TSH no detectable 0,1 x 1010 L/mol 0,8 x 1010 L/mol
- Arg255 a Ala, Trp258 a Ala, Tyr185 a Ala y Lys183 a Ala
- Unión a TSH no detectable Unión de Fab de hMAb TSHR1 no detectable Unión del MAb 9D33 no detectable
- nt = no analizado
Claims (30)
- 1.
- Una preparación del receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSHR) mutado, que incluye al menos una mutación puntual, caracterizada porque al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido mutado a un residuo de aminoácido cargado negativamente en dicha preparación del TSHR mutado, con lo cual dicha preparación de TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, porque (i) el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado se reduce o suprime, cuando se compara con el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación del TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de dicha preparación del TSHR mutado con la excepción de que dicha mutación de Arg situada en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa no está presente en dicha preparación del TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación de TSHR mutado no es afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con dicha preparación del TSHR de referencia, y (iii) el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado no es afectado o es aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con dicha preparación del TSHR de referencia, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado es eficaz en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.
- 2.
- Una preparación del TSHR mutado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa está mutado puntualmente a Asp.
- 3.
- A preparación de TSHR mutado de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye al menos una mutación puntual, caracterizada porque al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido mutado a Asp en dicha preparación de TSHR mutado, con lo cual dicha preparación de TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, porque (i) el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado se reduce o suprime, cuando se compara con el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación del TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de dicha preparación del TSHR mutado con la excepción de que dicha mutación de Arg situada en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa no está presente en dicha preparación del TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación de TSHR mutado no es afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con dicha preparación del TSHR de referencia, y (iii) el efecto bloqueante de los autoanticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado no es no afectado o es aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con dicha preparación del TSHR de referencia, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado es eficaz en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.
- 4.
- Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un TSHR humano de longitud completa mutado.
- 5.
- Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un fragmento mutado de un TSHR humano.
- 6.
- Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que incluye más mutaciones de aminoácidos que representan sustituciones, adiciones o deleciones que no alteran la actividad del receptor de la TSH de la preparación de TSHR mutado.
- 7.
- Uso de una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la detección diferencial e identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en una muestra de fluido corporal obtenida de un sujeto del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella y/o en el diagnóstico de un sujeto del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella.
- 8.
- Un kit que comprende una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, junto con medios de detección que facilitan la monitorización de la interactuación diferencial de la preparación de TSHR mutado con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la
- 9.
- En combinación, un kit de acuerdo con la reivindicación 8, junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico eficaz en el tratamiento de la enfermedad tiroidea autoinmune.
- 10.
- Un método de detectar diferencialmente los auto-anticuerpos estimulantes para el THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes para el THSR y la TSH en una muestra de fluido corporal obtenida de un sujeto del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella, el cual método emplea una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para interactuar diferencialmente y detectar los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH producidos en respuesta al TSHR contenido en dicha muestra del fluido corporal del sujeto.
- 11.
- Una composición farmacéutica que comprende una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, junto con un vehículo, diluyente o excipiente para el mismo farmacéuticamente aceptable.
- 12.
- Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en terapia.
- 13.
- Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Graves.
- 14.
- Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de signos en los ojos de la enfermedad de Graves.
- 15.
- Un polinucleótido que comprende:
una secuencia de nucleótidos que codifica una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
- 16.
- Secuencias de nucleótidos cebadores Arg 255 Asp F; Arg 255 Asp R identificadas en la Tabla 1; o una secuencia de nucleótidos que difiere de las mismas en secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, en donde la secuencia del cebador mutante Arg 255 AspF es aggaactgatagcagacaacacctggactctta, y la secuencia del cebador mutante Arg 255 AspR es taagagtccaggtgttgtctgctatcagttcct.
- 17.
- Un sistema vector biológicamente funcional que lleva un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 15 y que es capaz de introducir el polinucleótido en el genoma de un organismo hospedante.
- 18.
- Una célula hospedante que está transformada o transfectada con un polinucleótido o uno o más polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 15 o un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 17.
- 19.
- Un proceso de preparar una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho proceso:
- (i)
- proporcionar una célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 18;
- (ii)
- dejar crecer la célula hospedante; y
(iii) recuperar del medio de crecimiento una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención
- 20.
- Un proceso de identificar una preparación de TSHR mutado que se puede usar para la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR y auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH en una muestra de fluido corporal, comprendiendo dicho proceso identificar potenciales regiones de interactuación del TSHR y residuos de aminoácidos presentes en las mismas que se identifican además en virtud de su capacidad de interactuar con una pareja de unión para el TSHR, puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la interactuación del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH; producir mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación resultante del TSHR mutado con la pareja de unión, de modo que se identifiquen las mutaciones puntuales que dan como resultado la inhibición de la interactuación del TSHR mutado resultante con al menos uno de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en donde se produce una mutación puntual para la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 se somete a una mutación puntual selectivamente para obtener un residuo de aminoácido cargado negativamente tal que la preparación de TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes de los THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH.
- 21.
- Un proceso de identificar los residuos de aminoácidos requeridos para la interactuación del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, cuyo proceso comprende identificar potenciales regiones de interactuación del TSHR y residuos de aminoácidos presentes en las
mismas que además son identificadas en virtud de su capacidad de interactuar con una pareja de unión para el TSHR, puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la interactuación del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH; y producir mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación resultante del TSHR mutado con la pareja de unión, de modo que se identifique los aminoácidos claves requeridos para la interactuación respectiva del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en donde se produce una mutación puntual para la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde el Arg 255 se somete a una mutación puntual selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente de tal modo que la preparación del TSHR mutado interactúe diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los autoanticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH.
- 22.
- Un proceso de identificar los residuos de aminoácidos requeridos para la conformación del TSHR de modo que se facilite su interactuación con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, que comprende identificar potenciales regiones de interactuación del TSHR y los residuos de aminoácido presentes en las mismas que se identifican adicionalmente en virtud de su capacidad de interactuar con una pareja de unión para el TSHR, puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la conformación de dicho TSHR de modo que se facilite su interactuación con dicho uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH; producir mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación de TSHR mutado resultante con la pareja de unión, de modo que se identifiquen los aminoácidos claves requeridos para la conformación de dicho TSHR, de modo que se facilite la interactuación respectiva del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en donde se produce una mutación puntual para la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR de longitud completa, en donde la Arg 255 se somete a mutación puntualmente a un residuo de aminoácido cargado negativamente de tal modo que la preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH.
- 23.
- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 20 a 22, en donde al menos la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa se somete a una mutación puntual selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente.
- 24.
- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho residuo de aminoácido cargado negativamente es Asp.
- 25.
- Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en donde la interactuación de la preparación del TSHR mutado que se monitoriza es la estimulación del TSHR mutado o el bloqueo de dicha estimulación.
- 26.
- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende monitorizar la producción de AMP cíclico como resultado de la interactuación de la pareja de unión con la preparación del TSHR mutado.
27.Uso en una preparación del TSHR mutado de un residuo de aminoácido que es diferente de la arginina en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 está mutado puntual y selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente tal que la preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, para la detección diferencial de uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.
- 28.
- Uso en una preparación del TSHR mutado de un residuo de aminoácido que es diferente de la arginina en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 está mutado puntual y selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente tal que la preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en identificar los auto-anticuerpos estimulantes del THSR que está ausentes de, o presentes en, la muestra del fluido corporal.
- 29.
- Uso en una preparación del TSHR mutado de un residuo de aminoácido que es diferente de la arginina en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 está mutado puntual y selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente tal que la preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en el diagnóstico de una enfermedad autoinmune asociada con el TSHR sometiendo a detección una muestra de fluido corporal.
- 30.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 27, 28 o 29, en donde el residuo de aminoácido de la posición 255 de un TSHR humano de longitud completa es Asp.
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