ES2366660T3 - Aplicaciones con entrecruzamientos entre cadenas seleccionadas en ácidos nucleicos y métodos para su producción. - Google Patents

Abstract

Método para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias amplificables de un grupo de secuencias amplificables presentes en un cromosoma que comprende producir un ácido nucleico entrecruzado entre cadenas seleccionadas, con un método que comprende - hibridizar, como mínimo, una secuencia de cadena sencilla seleccionada con un ácido nucleico de cadena sencilla complementaria o un análogo funcional del mismo, - en el que dicha, como mínimo, una secuencia seleccionada o dicho ácido nucleico complementario o ambos comprenden un agente de entrecruzamiento, y cromosómica, - en el que, como mínimo, una de dichas secuencias seleccionadas es una secuencia repetitiva - en el que dichos entrecruzadores entre cadenas seleccionadas dificultan adicionalmente la hibridación y/o la replicación de dicha secuencia seleccionada para disminuir la cantidad de amplificación de un subgrupo de secuencias amplificables y someter dicho grupo a una reacción de amplificación.

Description

Sector de la invención

La presente invención se refiere al sector del entrecruzamiento de ácidos nucleicos y las utilizaciones de los mismos. De manera más específica, la presente invención se refiere a un método para producir entrecruzamientos seleccionados entre cadenas en ácidos nucleicos y las utilizaciones de los mismos. Un aspecto importante de la presente invención se refiere a la utilización de entrecruzamientos seleccionados entre cadenas para la amplificación selectiva de ciertos ácidos nucleicos en una reacción de amplificación.

Antecedentes de la invención

Se han identificado muchos compuestos diferentes que poseen actividad de entrecruzamiento de ácidos nucleicos. El entrecruzamiento de ácidos nucleicos se utiliza más habitualmente para fines terapéuticos en la intervención con trastornos proliferativos, tal como el cáncer. La mayoría de agentes de entrecruzamiento reticulan ácidos nucleicos de maneras muy específicas y en puntos específicos en los ácidos nucleicos. Sin embargo, la frecuencia de estos puntos específicos en la mayoría de ácidos nucleicos es tan elevada que se disponen de entrecruzamientos de forma eficaz a lo largo de las moléculas de ácido nucleico. Para la utilización de estos compuestos de entrecruzamiento en la intervención de cáncer, esta actividad denominada entrecruzamiento aleatorio aparente no evita cierto efecto terapéutico. Sin embargo, en la situación ideal los entrecruzamientos sólo se aplicarían en el ácido nucleico de las células con las que podría interferir la proliferación. Por ejemplo, mediante la aplicación de los entrecruzamientos sólo a los ácidos nucleicos implicados en la transformación de dicha célula, es decir, los oncogenes o el ARN de dichos oncogenes. Dicha especificidad no era posible con los métodos actuales de entrecruzamiento. La actividad de entrecruzamiento aleatorio aparente de agentes de entrecruzamiento también evita la utilización de estos compuestos en ensayos que requieren un entrecruzamiento más específico. La Patente de Estados Unidos No. 5.589.339 da a conocer métodos para la hibridación por sustracción del ADNc. En estos métodos, el ADNc derivado del ARNm transcrito de una fuente de células diana se somete a una hibridación por sustracción utilizando un ácido nucleico de cadena sencilla de una fuente de células de referencia, de manera que se forman moléculas de doble cadena. A continuación, las cadenas de estas moléculas de doble cadena se entrecruzan químicamente utilizando un agente de entrecruzamiento entre cadenas, aziridinilbenzoquinona, y el ADNc de cadena sencilla no sustraído restante derivado únicamente de la fuente de células diana se utiliza como material de sonda. En un aspecto de la presente invención se da a conocer un método para la producción de entrecruzamientos en regiones seleccionadas de un ácido nucleico En un aspecto, dicho método se puede utilizar para evitar, como mínimo, en parte, que ciertas regiones en un ácido nucleico tomen parte en un proceso, tal como, pero sin limitarse al mismo, un proceso que comprende una hibridación o una amplificación o ambas. En un aspecto, dicho método de producción de entrecruzamientos seleccionados entre cadenas se utiliza en un proceso para producir una sonda privada, como mínimo, en parte de secuencias repetitivas. Dicha sonda es útil para la detección de, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico en el pintado de cromosomas en el sector de la citogenética.

La introducción de la hibridación por fluorescencia in situ (FISH) ha cambiado significativamente la citogenética. Lichter y otros, TIG Diciembre 1997, Vol. 13, No. 12, páginas 475-479 describen sondas para el pintado de cromosomas generadas mediante la amplificación de ADN repetitivo. La determinación del cariotipo humano por FISH se aplica actualmente de manera satisfactoria para elucidar la redistribución compleja de cromosomas. El análisis por FISH multicolor de cromosomas no se limita necesariamente a la utilización de pintados de todo los cromosomas. Recientemente, se han generado grupos de sondas que reconocen de manera específica las regiones (sub)teloméricas de un cromosoma concreto y que se aplican en un formato de FISH multicolor para detectar translocaciones crípticas, que aparecen frecuentemente en retrasos mentales.

La tinción selectiva de 24 cromosomas humanos en la actualidad se lleva a cabo a través de combinaciones binarias de sondas que están marcadas con 5 fluoróforos distintos (Schroek y otros, 1996; Speicher y otros, 1996).

Para este marcaje denominado combinatorio (también llamado FISH multiplex), el número de dianas reconocibles (n) que utilizan diferentes fluoróforos (k) tienen n = 2k-1 colores. De este modo, cinco fluoróforos permiten un máximo de 31 colores, suficientes para reconocer 24 cromosomas, pero insuficiente, por ejemplo, para explorar las utilizaciones de sondas específicas de los brazos p y q para la detección de redistribuciones intracromosómicas.

De este modo, el análisis FISH multicolor de cromosomas se beneficiaría directamente de un método para incrementar el número de dianas simultáneamente reconocibles más allá de los 27 descritos hasta ahora (Nederlof y otros, 1992; Dauwerse y otros, 1992; Morrison y Legator, 1997). Se puede conseguir una multiplicidad de FISH más elevada mediante un marcaje en proporción. Esta técnica, mediante la cual una sonda determinada está compuesta de una mezcla de sondas con diferentes marcadores fluorescentes, presenta un gran potencial.

Como ilustración, se puede considerar que el número de colores reconocibles puede componerse con los tres colores primarios azul, verde y rojo. Sin embarco, en la práctica, el marcaje en proporción es considerablemente más complejo que el marcaje combinatorio. El reconocimiento de cromosomas teñidos con sondas marcadas proporcionales no es una decisión de “color sí o no” (como en el enfoque binario), sino que requiere una medición precisa del color.

Características de la invención

La presente invención da a conocer métodos para el entrecruzamiento seleccionado de ácidos nucleicos. Se pueden seleccionar y entrecruzar de manera específica regiones específicas en ácidos nucleicos con un entrecruzamiento “no específico” menor o no detectable en regiones no seleccionadas. El método se utiliza en una aplicación no limitante para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias de un grupo de secuencias potencialmente amplificables. El método se utiliza en otra aplicación no limitante para la preparación de una sonda para la detección de ácidos nucleicos, en el que se evita que las secuencias seleccionadas, como mínimo, en parte, participen en una reacción de hibridación. En un aspecto, la presente invención da a conocer un método para la generación de una sonda para la detección de cromosomas o partes de los mismos. En un ejemplo no limitante de dicha sonda, ésta se marca mediante un aspecto de la técnica COBRA de la presente invención.

Descripción detallada de la presente invención

En una realización, la presente invención da a conocer un método para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias amplificables de un grupo de secuencias amplificables presentes en un cromosoma que comprende producir un ácido nucleico entrecruzado entre cadenas seleccionadas, con un método que comprende

- hibridizar, como mínimo, una secuencia de cadena sencilla seleccionada con un ácido nucleico de cadena sencilla complementaria o un análogo funcional del mismo,

- en el que dicha, como mínimo, una secuencia seleccionada o dicho ácido nucleico complementario

o ambos comprenden un agente de entrecruzamiento, y

- en el que, como mínimo, una de dichas secuencias seleccionadas es una secuencia repetitiva cromosómica,

-en el que dichos entrecruzadores entre cadenas seleccionadas dificultan adicionalmente la hibridación y/o la replicación de dicha secuencia seleccionada para disminuir la cantidad de amplificación de un subgrupo de secuencias amplificables y someter dicho grupo a una reacción de amplificación.

En una realización preferente de la presente invención, sólo dicho ácido o ácidos nucleicos de cadena sencilla o dicho ácido o ácidos nucleicos complementarios comprenden un agente de entrecruzamiento. Dicho ácido nucleico, preferentemente dicho ácido nucleico complementario, también puede ser un análogo funcional de un ácido nucleico. Uno de dichos análogos comprende ácido nucleico de péptido (PNA). También se da a conocer un método en el que dicho ácido nucleico o dicho ácido nucleico complementario o ambos son ADN. Un principio preferente para la selección de una región de ácido nucleico es a través de la hibridación con uno o más ácidos nucleicos complementarios a dicha región. Los entrecruzamientos se pueden disponer a través de un agente de entrecruzamiento. Los entrecruzamientos se pueden disponer mediante la hibridación de uno o más ácidos nucleicos complementarios a un ácido nucleico, seleccionando de este modo las regiones para el entrecruzamiento y poniendo en contacto dicho ácido nucleico con un agente de entrecruzamiento. Las regiones de doble cadena seleccionadas están entrecruzadas, mientras que las regiones de cadena sencilla no seleccionadas no están entrecruzadas. Para algunos objetivos, el exceso de agente de entrecruzamiento y/o el agente de entrecruzamiento (o intermedios de reacción) que no contribuye a los intermedios de doble cadena se pueden eliminar o desactivar antes de la utilización del ácido nucleico entrecruzado de forma selectiva.

Preferentemente, los agentes de entrecruzamiento se utilizan de manera que entrecruzan ácidos nucleicos de doble cadena y que presentan una actividad de entrecruzamiento menor o indetectable en ácidos nucleicos de cadena sencilla. De manera alternativa, el agente de entrecruzamiento se une a uno o más ácidos nucleicos complementarios antes de la hibridación, con lo cual se consigue el entrecruzamiento de regiones seleccionadas después de la hibridación de dicho ácido nucleico complementario a la región seleccionada. Preferentemente, la actividad de entrecruzamiento del agente de entrecruzamiento es baja cuando el ácido nucleico está en forma de cadena sencilla y elevada cuando el ácido nucleico está en forma de cadena doble.

Las regiones en un ácido nucleico se pueden seleccionar para el entrecruzamiento mediante la adición de ácido nucleico complementario a la forma de cadena sencilla de dicho ácido nucleico y para la realización de una hibridación. Sin embargo, se puede sacar ventaja de las regiones complementarias en un ácido nucleico en que dichas regiones complementarias son inducidas para hibridizarse entre sí después de que dicho ácido nucleico se haya convertido en cadena sencilla y se permita su hibridación. De manera particular en este caso, pero sin limitarse a este caso, la selección de regiones diferentes puede variar mediante la variación de las condiciones de hibridación. Las regiones también se pueden seleccionar para el entrecruzamiento mediante la utilización de una combinación de los métodos mencionados anteriormente. Por ejemplo, se pueden seleccionar algunas regiones a través de la adición de un ácido o ácidos complementarios, mientras que otras regiones o las mismas se pueden seleccionar a través de la hibridación de regiones complementarias en un ácido nucleico.

Naturalmente, es esencial que los ácidos nucleicos complementarios comprendan secuencias que sean complementarias a una región seleccionada en un ácido nucleico. Sin embargo, no es necesario que todas las secuencias en los ácidos nucleicos complementarios sean de hecho complementarias a una región seleccionada en un ácido nucleico. Pueden ser útiles secuencias adicionales en dichos ácidos nucleicos complementarios para un objetivo específico o pueden estar únicamente presentes por conveniencia, siempre y cuando no eviten la función primaria de dichos ácidos nucleicos complementarios, es decir, hibridizarse a una región seleccionada.

El nivel de entrecruzamiento y la naturaleza del entrecruzamiento determinan la fuerza del entrecruzamiento entre la región de ácido nucleico seleccionada y el ácido nucleico complementario. La fuerza requerida del entrecruzamiento varía con la aplicación específica de la presente invención. En aplicaciones en las que se lleva a cabo un entrecruzamiento seleccionado para evitar la desnaturalización de un ácido nucleico de doble cadena entrecruzado de forma selectiva, la fuerza de la unión debería ser suficientemente elevada para, como mínimo, en parte, evitar la desnaturalización en condiciones que permitirían la desnaturalización de la región seleccionada sin entrecruzamiento.

En una realización de la presente invención, el agente de entrecruzamiento comprende un metal de transición, preferentemente platino, capaz de entrecruzar ácidos nucleicos de doble cadena. En un aspecto preferente de esta realización, el agente de entrecruzamiento comprende (trans)-diclorodiaminoplatino.

El (trans)-diclorodiaminoplatino (II) (trans-DDP) puede formar entrecruzamientos entre cadenas entre residuos de bases adyacentes en una cadena de ADN (Cohen y otros, 1980). Los entrecruzamientos entre cadenas entre dos residuos de guanina (G), o entre un residuo de G y un residuo de citosina (C), o entre un residuo de G y un residuo de citosina (C) separados por, como mínimo, un residuo, son los más favorables. (Eastman y otros, 1988; Pinto y otros, 1985; Lepre y otros, 1987). Los entrecruzamientos entre cadenas 1,3 entre trans-DDP y dos residuos de G separados por una base intermedia son estables en oligonucleótidos de cadena sencilla. Tan pronto como los oligonucleótidos platinados se hibridizan a sus cadenas complementarias, los entrecruzamientos entre cadenas 1,3 se redistribuyen para formar un entrecruzamiento entre cadenas (Dalbies y otros, 1994). Este efecto de entrecruzamiento entre cadenas de trans-DDP se puede utilizar en una estrategia para entrecruzar de manera selectiva ciertas secuencias de ácido nucleico en un grupo de secuencias de ácido nucleico.

En la presente invención se da a conocer un método para el entrecruzamiento entre cadenas seleccionado de secuencias seleccionadas en una secuencia de ácido nucleico que comprende hibridizar, como mínimo, una secuencia de cadena sencilla seleccionada con un ácido nucleico de cadena sencilla complementario, en el que dicha secuencia seleccionada o dicho ácido nucleico complementario o ambos comprenden un agente de entrecruzamiento, en el que dicho entrecruzamiento dificulta la hibridación posterior y/o la replicación de dicha secuencia seleccionada.

En la presente invención, las secuencias repetitivas en un ácido nucleico se entrecruzan de manera selectiva para bloquear la amplificación de la región o regiones seleccionadas.

Para el pintado de cromosomas, se utiliza como sonda ADN específico de cromosomas. Esta sonda se obtiene, en general, mediante la realización de una amplificación basada en PCR, tal como, pero sin limitarse a ésta, DOP-PCR, en ADN de cromosoma específico, que se aísla mediante selección por flujo o microseccionado. El ADN cromosómico contiene muchas secuencias repetitivas, tales como ADN telomérico, repeticiones centroméricas, LINEs, SINEs y VNTRs. Durante la DOP-PCR, estas secuencias repetitivas también se amplificarán y en experimentos hibridación in situ, crearán un marcaje diferencial de todos los cromosomas. Normalmente, este marcaje de base se evita mediante la adición de ADN repetitivo a la mezcla de hibridación, que consiste en un grupo de secuencias repetitivas. Sin embargo, la técnica de utilizar ADN repetitivo para este objetivo no es ideal ya que la señal de base no se reduce completamente y además se reduce la señal de la sonda.

A efectos de sortear la necesidad de bloqueo durante la hibridación, sería deseable excluir la presencia de secuencias repetitivas en el ADN sonda. Los métodos para eliminar las secuencias repetitivas mediante sustracción son conocidos en la técnica (Craig y otros, 1997). Los métodos de sustracción no son preferentes porque requieren una manipulación adicional de la sonda y no es fácil reproducir la sustracción. El problema con los métodos actuales de producción de una sonda con un nivel satisfactorio bajo de secuencias repetitivas es que durante la generación de la sonda, también se generan secuencias repetitivas. Dado que también se generan secuencias repetitivas en la sonda, deben tomarse medidas para eliminar su hibridación o para eliminarlas de la sonda. Sin embargo, estas medidas presentan problemas tal como se ha mencionado anteriormente. Con los métodos de la presente invención se ha diseñado una estrategia nueva para producir una sonda, en la que la sonda se genera en condiciones que evitan o disminuyen la cantidad de secuencias repetitivas generadas. Este procedimiento da lugar a una sonda que presenta una contaminación inferior con secuencias repetitivas que (para la mayoría de objetivos) se pueden utilizar de manera directa. Sin embargo, si se desea una eliminación adicional de secuencias repetitivas, la sonda generada a través de los métodos de la presente invención también presenta un sustrato mejor para la prevención posterior de la hibridación de estrategias con secuencias repetitivas o la eliminación de secuencias repetitivas de la sonda, ya que la sonda ya estaba menos contaminada con las secuencias repetitivas con las que empezar.

El siguiente ejemplo es un ejemplo no limitante de un aspecto de la presente invención en el que se describe una estrategia de diseño de una sonda con una cantidad baja de secuencias repetitivas. La DOP-PCR se realiza con cebadores degenerativos en el ADN cromosómico, aislado mediante selección por flujo o microseccionado. Durante la DOP-PCR, las secuencias repetitivas son entrecruzadas por secuencias de nucleótidos marcadas con trans-DDP, complementarias a estas secuencias, donde dichas secuencias de nucleótidos son preferentemente una o más secuencias de oligonucleótidos marcadas con trans-DDP.

La hibridación de las secuencias de nucleótidos marcadas con trans-DDP a su diana da lugar a un entrecruzamiento entre cadenas estable de las secuencias de nucleótidos a las regiones repetitivas seleccionadas. Estas secuencias de nucleótidos se pueden modificar eliminando el grupo hidroxilo en 3’, desactivando de este modo la función de las secuencias de nucleótidos como cebador por la polimerasa. Por lo tanto, la amplificación se bloqueará en la posición de las secuencias de nucleótidos entrecruzadas y de manera preferente se amplificarán las secuencias no bloqueadas que no contienen secuencias repetitivas seleccionadas. En consecuencia, el producto de amplificación se puede utilizar como sonda para experimentos de pintado de cromosomas de forma directa sin añadir un ácido o ácidos nucleicos repetitivos a la mezcla de hibridación. De manera alternativa, debido a la presencia reducida de secuencias repetitivas se necesita añadir a la mezcla de hibridación una cantidad significativamente menor de ácido o ácidos nucleicos repetitivos, mejorando de este modo de manera significativa la acción de una sonda en presencia de ácido o ácidos nucleicos repetitivos.

El bloqueo de la amplificación de secuencias específicas también se puede utilizar en otras aplicaciones de la PCR o en ensayos de transcripción in vitro. Además, en todas las situaciones en las que se requiere un aumento de la estabilidad de una conexión entre una cadena de ADN o una cadena de ARN y su diana, se puede aplicar un entrecruzamiento selectivo, por ejemplo a través de trans-DDP. En la técnica antisentido, se evita la traducción de ciertos ARN mensajero (ARNm) mediante la presencia de oligonucleótidos antisentido entrecruzados de forma selectiva. El trans-DDP puede crear una conexión estable entre estos oligonucleótidos y el ARNm. En cambio, también es posible con trans-DDP aumentar la traducción mediante la estabilización de estructuras secundarias de ARNm.

En un aspecto de la presente invención se utiliza un proceso para la generación de una sonda a partir de la cual, se evita, como mínimo de forma parcial, que las secuencias repetitivas actúen como una sonda (es decir, un ácido nucleico dispuesto con un marcador utilizado para la detección de la presencia de dicha sonda) a través de la disposición de regiones seleccionadas en una sonda de ácido nucleico con entrecruzamientos entre cadenas. Dicha sonda se puede utilizar en aplicaciones en las que se utilizan sondas de ácidos nucleicos para la detección de la presencia de la sonda, tales como, pero sin limitarse a éstas, microarreglos, transferencias Southern, transferencias Northern, pintado de cromosomas, etc. Las ventajas de una sonda a partir de la cual se evita que las secuencias seleccionadas actúen de sonda son claras para el experto en la materia e incluyen, pero sin limitarse a ésta, una especificidad mejorada de dicha sonda.

En un aspecto de la presente invención se utiliza un proceso para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias amplificables de un grupo de secuencias amplificables que comprende proporcionar entrecruzamientos seleccionados entre cadenas para disminuir o bloquear, como mínimo, en parte, la amplificación de un subgrupo de secuencias amplificables y someter dicho grupo a una reacción de amplificación.

Se selecciona un grupo de secuencias amplificables entre las secuencias presentes en un cromosoma. Preferentemente, se selecciona un grupo de secuencias amplificables entre las secuencias de una parte de un cromosoma.

Se puede utilizar un conjunto de fragmentos producidos durante la amplificación seleccionada como sonda para la detección de secuencias de ácido nucleico. La sonda se puede marcar con técnicas convencionales o la sonda se puede marcar a través del ULS, sistema de unión universal descrito en los documentos WO 92/01699, WO 96/35696, WO 98/15564 y WO 98/45304). Cuando la sonda se produce a partir de secuencias de un cromosoma completo, la sonda se puede utilizar para teñir un cromosoma completo. De manera similar, cuando la sonda se produce a partir de secuencias de una parte de un cromosoma, la sonda se puede utilizar para teñir una parte de dicho cromosoma.

Dichos cromosomas marcados o partes de los mismos se pueden utilizar para la tipificación de un cromosoma y/o una célula o para la identificación de una enfermedad.

También se da a conocer la utilización de una técnica de marcaje especial de moléculas bioorgánicas, denominada COBRA (Combined Binary Ratio labelling (marcaje en proporción binario combinado)). COBRA se basa en la combinación estratégica de marcaje binario y marcaje en proporción. En una aplicación no limitante, la técnica se utiliza para conseguir una multiplicidad FISH de 24, 48, 96 ó más en base a la tecnología existente y sólo requiere un buen microcopio de fluorescencia digital.

En un aspecto, COBRA utiliza un marcaje combinatorio (es decir, binario) y el marcaje denominado proporcional para incrementar el número de colores identificables para la utilización en la detección de ácido nucleico en, por ejemplo, citogenética. El marcaje por COBRA se puede utilizar para el marcaje y/o detección de moléculas bioorgánicas, tales como ácido nucleico, proteína, lípido y/o carbohidrato. Se utiliza un conjunto de fluoróforos separados espectralmente para el marcaje en proporción de tal manera que se utilizan dos fluoróforos para producir un color determinado. Cuando esto se aplica para tres fluoróforos, y cada par de fluoróforos da lugar a 5 colores, se consigue un total de 12 colores (triángulo inferior en la figura 1). Este grupo de sondas primarias se marca fluorescentemente de manera directa utilizando métodos, tales como traducción de muescas, marcaje cebado aleatorio, marcaje por PCR y/o marcaje químico. Un segundo grupo de 12 sondas, que reconocen diferentes dianas, se marcan exactamente igual, pero además se añade un fluoróforo. En un ejemplo, dicho fluoróforo es un hapteno, por ejemplo, biotina o digoxigenina. Este hapteno se revela utilizando avidina o anticuerpos marcados con un cuarto marcador fluorescente, espectralmente bien diferenciable de los tres fluoróforos primarios utilizados para el marcaje en proporción. De este modo, el grupo de 12 se multiplica por 2, lo cual da lugar a 24 colores utilizando sólo 4 fluoróforos (dos triángulos del centro en la figura 1), que es un fluoróforo menos que los descritos hasta ahora para realizar la tinción de los 24 cromosomas humanos. Se pueden utilizar fluoróforos “libres” adicionales para repetir este proceso, explorando un segundo marcador binario, que de nuevo da lugar a la duplicación del número de colores alcanzables (produciendo 48 colores) (triángulos superiores en la figura 1).

De manera clara, se pueden conseguir incrementos incluso más importantes en el número de colores si se producen más de 12 colores primarios en el triángulo básico, ya sea mediante la utilización de más de tres fluoróforos o mediante la diferenciación de más proporciones.

De manera matemática, el número total de colores COBRA alcanzable se puede describir de la siguiente manera, como mínimo en el caso en el que se utilizan dos fluoróforos de forma simultánea por diana. Asumiendo que se utilizan n fluorocromos para el marcaje en proporción y asumiendo que, como ejemplo no limitante, sólo 2 de estos fluorocromos se utilizan de manera simultánea por diana, mientras que adicionalmente m fluorocromos se pueden marcar de forma binaria a la misma diana y se pueden resolver r proporciones para el marcaje en proporción, entonces el número de colores diferentes que se pueden diferenciar se proporciona por la siguiente fórmula:

Fórmula I:

No. de colores = (n + ((r x n)/(2 x (n – 2)))) x 2m

con: 2  n ,

0  r 

0  m 

En un aspecto, las sondas de la presente invención se marcan utilizando un método para la generación de colores denominado COBRA, adecuado para el marcaje de sondas, mediante la mezcla de fluorocromos según la fórmula I, en la que n es el número de fluorocromos utilizados para el marcaje en proporción, mientras que, en este ejemplo no limitante, sólo 2 de estos fluorocromos se utilizan de manera simultánea por diana, m es el número de fluorocromos utilizados para el marcaje binario de la misma diana y r es el número de proporciones que se pueden resolver mediante marcaje en proporción.

El experto en la materia será capaz claramente de elegir los fluoróforos adecuados para la utilización en COBRA.

El experto en la materia será capaz claramente de elegir las proporciones adecuadas de fluoróforos en el marcaje en proporción.

En COBRA, los fluorocromos utilizados para el marcaje se pueden seleccionar del grupo DEAC, Cy3, fluoresceína, LissamineTM, etc.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término metal de transición significa un metal del grupo VIII de la tabla periódica de los elementos. Un metal de transición preferente para la utilización en un agente de entrecruzamiento es el platino. En un aspecto, la presente invención utiliza un método para proporcionar, como mínimo, una secuencia seleccionada en un ácido nucleico con entrecruzamientos entre cadenas que comprende hibridizar, como mínimo, una secuencia de cadena sencilla seleccionada con un ácido nucleico de cadena sencilla complementario, en el que dicha secuencia seleccionada o dicho ácido nucleico complementario o ambos comprenden un agente de entrecruzamiento. Dichos entrecruzadores entre cadenas seleccionados dificultan una hibridación posterior y/o la replicación de dichas secuencias seleccionadas.

En otro aspecto, la presente invención utiliza un método para la generación de una sonda, en el que se evita, como mínimo, en parte, que, como mínimo, una secuencia seleccionada en dicha sonda actúe como una sonda al proporcionar dicha secuencia seleccionada con entrecruzamientos seleccionados. Dicha secuencia seleccionada comprende, como mínimo, una secuencia repetitiva.

En un aspecto de la presente invención, se utiliza un método para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias amplificables de un grupo de secuencias amplificables que comprende producir un ácido nucleico o sonda entrecruzada entre cadenas seleccionada, en el que dichos entrecruzamientos entre cadenas seleccionados se proporcionan para disminuir la cantidad de amplificación de un subgrupo de secuencias amplificables y someter dicho grupo a una reacción de amplificación. Preferentemente, se evita que un ácido nucleico de cadena sencilla participe en dicha amplificación mediante la desactivación de la función de extensión del cebador de ácido nucleico de cadena sencilla complementaria hibridizada y entrecruzada, preferentemente mediante la modificación del grupo hidroxilo en 3’.

Dicho grupo de secuencias amplificables se selecciona entre las secuencias presentes en un cromosoma.

Después de la amplificación, dicha amplificación conducirá a un conjunto de secuencias amplificadas, que puede, entre otras cosas, después del marcaje, utilizarse como una sonda. Dado que dicho grupo de secuencias amplificables se selecciona entre las secuencias presentes en un cromosoma, dicha sonda se puede utilizar en la preparación del pintado de cromosomas.

También se da a conocer un método referido como COBRA para el marcaje de un grupo de, como mínimo, dos moléculas bioorgánicas con un grupo de, como mínimo, dos colores, que comprende generar dicho grupo de colores mediante la combinación de un marcaje en proporción con un marcaje binario. En un aspecto de COBRA, como mínimo en el caso en el que se utiliza de manera simultánea dos fluoróforos por diana, el número total de colores diferenciables de dicha combinación se puede calcular según la fórmula I,

No. de colores = (n + ((r x n)/(2 x (n – 2)))) x 2m

en la que n es el número de fluoróforos utilizados para el marcaje en proporción, en la que, en un ejemplo no limitante, sólo 2 de estos fluorocromos se utilizan de manera simultánea por diana, m es el número de fluoróforos utilizados para el marcaje binario de la misma diana y r es el número de proporciones que se pueden resolver mediante marcaje en proporción.

con: 2  n ,

0  r 

0  m 

En un aspecto adicional de COBRA, como mínimo, una de dichas moléculas bioorgánicas comprende ácido nucleico, proteína, carbohidrato y/o lípido.

En otro aspecto de la presente invención se da a conocer la utilización de, como mínimo, una sonda para la identificación simultánea de secuencias de, como mínimo, un cromosoma o parte del mismo, en la que, como mínimo, la sonda se prepara según un método de la presente invención, en el que dicha sonda se marca según un método COBRA para duplicar el número de marcadores identificables obtenibles por marcaje en proporción, que comprende añadir a un primer grupo de fluoróforos, utilizados para al marcaje en proporción de un primer grupo de sondas, un fluoróforo nuevo y marcar un segundo grupo de sondas.

En una realización de la presente invención, se da a conocer una sonda para la detección mejorada de cromosomas o partes de los mismos. En otra realización, la presente invención da a conocer la utilización de entrecruzamientos entre cadenas seleccionados para disminuir la cantidad de producto amplificado de ciertas secuencias amplificables.

En otra realización, la presente invención da a conocer la identificación de una enfermedad mediante el tipificado de, como mínimo, un cromosoma, en la que se marca, como mínimo, un cromosoma, con, como mínimo, una sonda preparada según el método de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención, se da a conocer un kit para la detección de ácido nucleico, que comprende, como mínimo, una sonda obtenible mediante el método de la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un kit para realizar el método de la presente invención que comprende, como mínimo, una sonda marcada con un método COBRA.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un kit para generar una sonda según la presente invención, que comprende, como mínimo, un agente de entrecruzamiento, preferentemente unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que es complementaria a una secuencia repetitiva cromosómica.

La presente invención da a conocer además un kit para la detección de ácido nucleico, que comprende, como, mínimo, un conjunto de secuencias amplificadas o una sonda. La presente invención da a conocer además un kit para realizar el entrecruzamiento selectivo de ácido nucleico, en el que dicho kit comprende, como mínimo, un agente de entrecruzamiento, preferentemente unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que es complementaria a una secuencia repetitiva cromosómica.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término “entrecruzamiento entre cadenas” se refiere a una unión física entre un agente de entrecruzamiento y un ácido nucleico de doble cadena, en el que dicha unión física disminuye la tendencia de un ácido nucleico de doble cadena a desnaturalizarse. Preferentemente, pero no necesariamente, un entrecruzamiento entre cadenas une físicamente a las dos cadenas complementarias del ácido nucleico de doble cadena.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término “unión física” es un enlace covalente o no covalente.

Tal como se utiliza en la presente invención, se define una sonda como un conjunto de secuencias de ácido nucleico que comprende, como mínimo, dos secuencias diferentes, preferentemente marcadas con un marcador que facilita la detección de dicha sonda. Dicha sonda se puede utilizar de manera directa para la detección de, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico o dicha sonda se puede manipular según los métodos de la presente invención antes de la detección de, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término “complementario” en relación a los ácidos nucleicos se utiliza de manera funcional, lo que significa que la homología de un ácido nucleico con un ácido nucleico complementario es suficientemente elevada para permitir la hibridación de un ácido nucleico complementario con un ácido nucleico bajo las condiciones de hibridación severas o no severas deseadas. Esta definición funcional es necesaria para permitir que se puedan utilizar para diferentes condiciones de hibridación en la realización de la presente invención. Un ejemplo no limitante que ilustra la necesidad de una definición funcional es el entrecruzamiento de una región específica que se repite varias veces en un ácido nucleico, pero en la que las regiones repetidas varían ligeramente en la secuencia de nucleótidos exacta. La elección de una secuencia de nucleótidos que es completamente homóloga a una región implica automáticamente que dicha secuencia de nucleótidos no es completamente homóloga a las secuencias de las regiones repetidas. Sin embargo, la secuencia elegida es funcionalmente homóloga a las secuencias en las regiones repetidas, es decir complementarias, cuando la desigualdad de las secuencias de dichas regiones repetidas no evita, bajo las condiciones de hibridación elegidas, la hibridación de la secuencia elegida con dichas regiones repetidas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Bloqueo de la hibridación de ADN repetitivo por ADN repetitivo marcado con trans-DDP.

Se hibridizan dos portamuestras con cromosomas en la metafase con ADN repetitivo marcado con Cy3-ULS. El primer portamuestras se hibridiza previamente con ADN repetitivo no marcado. El segundo portamuestras se hibridiza previamente con ADN repetitivo marcado con trans-DDP.

Dado que la hibridación de ADN repetitivo marcado con trans-DDP a su diana creará una conexión entre cadenas estable, se evita la hibridación de ADN marcado con Cy3-ULS en el segundo portamuestras. Por lo tanto, la señal de Cy3 en los cromosomas es mucho menor en el segundo portamuestras que en el primer portamuestras (véase la tabla 1 para más detalle).

Los portamuestras 1, 2 y 3 son portamuestras de control. Los números 1:0 representan la proporción de la cantidad de ADN repetitivo en relación con la cantidad de trans-DDP. Para los portamuestras 2 y 3, no se utilizó trans-DDP y no hubo entrecruzamiento. De este modo, los resultados obtenidos deben observarse como valores de referencia. Los resultados de los portamuestras 4 y 5 muestran que el ADN repetitivo estaba sobremarcado con trans-DDP y, como resultado de esto, el bloqueo de la hibridación se volvió más difícil (proporción 1:2). Un marcaje no saturado de trans-DDP se representa en los portamuestras 8 y 9. Los mejores resultados se obtuvieron con una proporción de 1:1.

Ejemplo 2

Bloqueo de la amplificación de secuencias específicas durante la PCR por cebador didesoxi marcado con trans-DDP.

Se realizan dos reacciones PCR en paralelo: en la primera reacción, la PCR se realiza en ADN plasmídico con dos cebadores específicos de secuencia (cebador A y cebador B). Esta reacción produce un producto de amplificación de una longitud definida. En la segunda reacción, se realiza una PCR idéntica. Sin embargo, a la mezcla de reacción también se añaden dos oligonucleótidos marcados con trans-DDP, que presentan un nucleótidos didesoxi en su extremo 3’ y que son complementarios a las secuencias en la región que pueden amplificarse por el cebador A y por el cebador B. Esta segunda reacción no producirá un producto, ya que la amplificación es bloqueada por los oligonucleótidos marcados con trans-DDP.

Ejemplo 3

Bloqueo de secuencias repetitivas durante la DOP-PCR.

Se realiza una DOP-PCR en la que la amplificación de secuencias repetitivas es bloqueada por la adición de secuencias de nucleótidos marcados con trans-DDP que carecen del grupo hidroxilo en 3’ y son complementarias a varias secuencias repetitivas. Con el producto de amplificación se realiza un experimento de hibridación in situ en cromosomas en la metafase. En comparación con un producto de amplificación no bloqueado, esta sonda proporciona una señal de base considerablemente menor en los cromosomas que no son diana.

Ejemplo 4

a.

Dos fluorocromos para el marcaje en proporción (n = 2), sin proporciones (r = 0) y sin marcador binario (m = 0) dan lugar a dos colores, tal como se esperaba.

b.

Tres fluorocromos para el marcaje en proporción (n = 3), 3 proporciones (r = 3) y 1 marcador binario (m = 1) dan lugar a 24 colores (la situación que se demostrará en este documento).

c.

El incremento del número de proporciones a r = 4 y el número de fluorocromos para el marcaje en proporción a 4 da lugar a 28 colores.

d.

Cada fluorocromo binario da lugar a la duplicación del número de colores; es decir, hasta 56 (para 1) o hasta 112 (para 2).

El principio de este concepto se demuestra en 24 cromosomas humanos utilizando marcaje enzimático de sondas y el mezclado de sondas para realizar un marcaje en proporción (fluoresceína, lissamine y Cy5 como fluoróforos primarios y DEAC como marcador combinatorio), así como la unión directa del código de color con las sondas utilizando marcaje químico. En el último, DEAC, Cy3 y Cy5 sirvieron como fluoróforos primarios y la fluoresceína o un derivado se utilizaron como marcador binario.

Procedimientos

Tinción FISH con múltiples colores de cromosomas humanos

La preparación de cromosomas humanos en la metafase se realizó tal como se ha descrito por Wiegant y otros. Se utilizaron cromosomas de individuos humanos normales, así como de células JVM-2 cultivadas in vitro. Las sondas para todos los cromosomas se obtuvieron de Cytocell, Reino Unido. Se amplificaron todos los ADN sonda mediante DOP-PCR para generar un grupo de sondas para pintar los 24 cromosomas humanos.

Marcaje enzimático de sondas

Todas las sondas se marcaron de manera fluorescente mediante la incorporación de dUTP marcados, ya sea mediante PCR o mediante traducción de muescas utilizando fluoresceína-dUTP, digoxigenina-dUTP (Boehringer Mannheim, Alemania), lissamine-dUTP (NEN Life Science Products, Estados Unidos) o Cy5-dUTP (Amersham, Reino Unido). Las sondas marcadas con digoxigenina se detectaron de manera indirecta utilizando dietilaminocoumarina (DEAC, Molecular Probes, Estados Unidos).

Marcaje químico de sondas utilizando ULS (Universal Linkage System (Sistema de Unión Universal)

Se eligieron DEAC-ULS, Cy3-ULS y Cy5-ULS como fluoróforos primarios y la fluoresceína como cuarto marcador combinatorio para demostrar las sondas marcadas con digoxigenina-ULS (dig-ULS). Se utilizó la siguiente estrategia para marcar y disolver el grupo de sondas marcadas con ULS:

En primer lugar, las sondas para pintar específicas de cromosoma para los cromosomas 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y X (100-400 ng) se marcaron en una reacción con dig-ULS según las instrucciones del fabricante. A continuación, este grupo de sondas se purificó en una columna de giro rápido Qiagen (Qiagen Inc., Valencia, CA, Estados Unidos) según las instrucciones del fabricante. La mezcla de sondas marcadas se eluyó de la columna Qiagen utilizando 100 l de Tris HCl 10 mM a pH 8,5.

En segundo lugar, se marcaron de manera fluorescente todas las sondas para pintar específicas de cromosoma según la tabla 2 mezclando 30 l de los compuestos ULS indicados (o mezclas de los mismos) con 1 mg de ADN sonda para pintar específicas de cromosoma (todas de Cytocell) utilizando DEAC-ULS (26,7 M), Cy3-ULS (20 M) y Cy5-ULS (13,3 M) en un volumen final de 100 l de agua. En el caso de que las sondas se marquen con mezclas de dos compuestos ULS diferentes, los compuestos ULS se mezclaron en primer lugar en la proporción deseada antes de añadir el ADN sonda. Después de una incubación de 15 minutos a 65oC, las sondas marcadas se purificaron en columnas de giro rápido Qiagen (Qiagen Inc., Valencia, CA, Estados Unidos). Las sondas marcadas se eluyeron de las columnas Qiagen utilizando 100 l de Tris HCl 10 mM a pH 8,5. Antes de la hibridación, las sondas marcadas con ULS fluorescentes se combinaron en cantidades tal como se indican en la columna derecha de la tabla 2 junto con los 100 l de la mezcla de sondas marcadas con dig-ULS de la primera etapa. A continuación, esta mezcla de sondas se precipitó con etanol en presencia de 10 veces en exceso de ADN de esperma de pescado de peso molecular bajo (Boehringer Mannheim) y 3 veces en exceso de ADN Cot1 humano (Gibco, BRL) (un método alternativo para la supresión de secuencias repetitivas se presenta a continuación). A continuación, la mezcla de sondas se disolvió en 10 l de formamida desionizada al 50%, 2 veces SSC, fosfato sódico 50 mM a pH 7, sulfato de dextrano al 10%. Estos 10 l de mezcla de sondas se utilizaron como solución de hibridación.

Tinción FISH de cromosomas humanos en la metafase:

Los portamuestras con cromosomas en la metafase se trataron previamente con ARNasa A y pepsina según Wiegan y otros. Las preparaciones de cromosomas se desnaturalizaron mediante su incubación durante 90 s a 80oC en formamida al 60%, 2 veces SSC, pH 7 en una placa caliente. Después de la eliminación del cubreobjeto, los portamuestras se deshidrataron mediante una serie de etanoles y se secaron al aire. A continuación, se aplicaron 10 l de mezcla de hibridación bajo un cubreobjeto de 18x18 mm, se sellaron con cemento de caucho y se realizó la hibridación durante 120 horas a 37oC en una cámara húmeda. La mezcla de hibridación contenía formamida al 50%, 2 veces SSC, fosfato de sodio 50 mM a pH 7, sulfato de dextrano al 10%, 100-500 ng de cada sonda marcada con DEAC, Cy3 y Cy5 (sondas marcadas tanto individualmente como de forma proporcional) (véase la tabla 2), 100-400 ng de cada sonda marcada con dig-ULS, 3 veces de ADN Cot1 humano en exceso y 10 veces de ADN de esperma de pescado de peso molecular bajo en exceso en 10 l. Antes de la aplicación, las sondas se desnaturalizaron durante 10 minutos a 80oC, seguido de incubación durante 60 minutos a 37oC para permitir la prehibridación con las 3 veces de ADN Cot1 humano en exceso.

Después de un lavado posterior a la hibridación de 10 minutos en 2 veces de SSC/Tween 20 al 0,1% a 37oC para eliminar los cubreobjetos, los portamuestras se lavaron dos veces durante 5 minutos en formamida al 50%, 2 veces de SSC, pH 7 a 44oC. A continuación, se realizaron 2 lavados (5 minutos cada uno) en 0,1 veces de SSC a 60oC y un lavado de 5 minutos a temperatura ambiente en TNT (Tris.HCl 0,1 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%). Las sondas marcadas con DIG-ULS se detectaron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra la digoxina (Sigma), seguido de un anticuerpo antiratón de conejo conjugado a FITC (Sigma). Los cromosomas se contratiñeron con DAPI. Los portamuestras se embebieron en Vectashield (cuando se utilizaron sondas marcadas enzimáticamente)

o Citifluor (Agar, Stansted, Reino Unido) (cuando se utilizaron sondas marcadas químicamente) antes de la evaluación microscópica.

Microscopía por imagen digital

Se realizó la obtención de imágenes digitales por fluorescencia utilizando un microscopio de epifluorescencia Leica DM-RXA (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con una lámpara de arco de mercurio de 100 W y ruedas de filtro controladas por ordenador con filtros de excitación y emisión para la visualización de DEAC, fluoresceína, Cy3 y Cy5, utilizando un equipo HQ-FITC Pinkel más filtros SP 570, HQ-Cy3, HQ-Cy5 y DEAC (Chroma Technology), respectivamente. Se excitó DAPI con una luz UV utilizando el bloque A. Se utilizó un objetivo de 63 aumentos (N.A. 1.32, PL APO, Leica). La obtención de imágenes y el análisis se realizaron en una estación de trabajo de Cytovision (Applied Imaging, Sunderland, Reino Unido). Este sistema consiste en un PC (procesador Pentium 133 MHz, 24 Mb de Ram, disco de 2,1 Gb y pantalla de 17”) en interfaz con una cámara Coolview (Photonic Science). La cámara presenta un enfriamiento termoeléctrico que permite en la integración de un chip hasta alrededor de 30 segundos. Las imágenes se digitalizan en un formato de imágenes de 768x512 de 8 bits.

La obtención de imágenes se realizó tal como se ha descrito anteriormente. Los cromosomas se segmentaron interactivamente mediante la limitación de la imagen de DAPI. La imagen segmentada se utilizó como máscara para la imagen en color, que estaba compuesta de las 3 imágenes correspondientes con los fluorocromos marcados de forma proporcional (verde para DEAC, rojo para Cy3 y azul para Cy5) y de la imagen de fluoresceína. Cabe indicar que este procedimiento no requiere la limitación de los tres colores. La cuarta imagen de fluoresceína se evaluó de forma binaria, es decir, se diferenciaron los cromosomas con o sin fluorescencia por fluoresceína. Esto se realizó hallando el umbral óptimo en el histograma de la imagen de fluoresceína para los píxeles que se encuentran en la máscara de DAPI. Habitualmente, se observaron dos distribuciones gausianas correspondientes a cromosomas positivos y negativos por fluoresceína.

La clasificación se realizó en dos etapas: a la clasificación de cromosomas le siguió una clasificación de pixeles para detectar translocaciones finales. La clasificación de cromosomas se basó principalmente en el valor modal del color de cada cromosoma, por ejemplo, su posición en uno de los triángulos de color (el que tiene o no tiene el marcador binario), tal como se muestra en la figura 1. Por lo tanto, se calculó la distancia más corta del valor modal medido del color de un cromosoma al color proporcional teóricamente esperado de todas las clases de cromosomas. A efectos de compensar las contribuciones de fluorescencia no específica y de incrementar la robustez del método, los valores de color esperados teóricamente se deformaron sobre un triángulo formado por los valores modales medidos de los cromosomas con sólo un color proporcional. Además del valor modal del color, también se utilizó para la clasificación la longitud de los cromosomas. Teóricamente, los valores del color de los cromosomas deberían corresponder con las proporciones de sondas originales. Sin embargo, en la práctica, se obtiene una estrategia más robusta cuando se utilizaba una cantidad de metafases para la práctica del clasificador. Después de la clasificación del objeto, cada píxel del cromosoma se clasificó en base a la distancia más corta a las clases de cromosomas medidas. La información binaria (cuarto color) de cada píxel se utilizó para decidir sobre qué triángulo de color deben realizarse los cálculos de las distancias. La asignación de los colores de clasificación se considera útil y prevista, pero no se implementó en el software actual.

Finalmente, se generó un cariograma basado en la clasificación de cromosomas que muestra la proporción de colores, tal como se ha descrito anteriormente. Se produjo un cariograma en el que se asignó un pseudocolor a la correspondiente clase de cromosoma de cada píxel de cromosoma separado para facilitar la detección interactiva de translocaciones de cromosomas. Cuando fue necesario, se utilizó la imagen de bandas DAPI con fines comparativos.

Resultados

Se aplicó un procedimiento de tinción COBRA de 24 colores utilizando cuatro fluoróforos a cromosomas normales y anormales. Las condiciones óptimas para el marcaje de las sondas y la composición final del grupo de sondas requirieron un ajuste preciso debido al hecho de que algunas sondas actuaban de mejor forma que otras. Habitualmente, a las sondas FISH con menor acción se les asignaban combinaciones de colores de manera que se minimizaba el solapamiento de colores con otras sondas.

Los resultados de tinción óptimos se obtuvieron a tiempos de hibridación prolongados (5 días), aunque en muchos casos tres días eran suficientes. Se observó que la supresión de secuencias repetitivas era esencial para la tinción selectiva de cromosomas. La figura 2 muestra cómo los 24 cromosomas ocupan el espacio de color. Habitualmente, en una cierta imagen de cromosoma, las intensidades de la señal mostraban variaciones relativamente grandes debido a diferencias locales en la intensidad de FISH. Sin embargo, el color característico era suficientemente constante para formar agrupaciones con un ángulo definido en el espacio de color tridimensional (figura 2). Aunque algunas agrupaciones de cromosomas mostraron solapamiento, estaban suficientemente separadas para clasificarse automáticamente utilizando el procedimiento descrito anteriormente.

La figura 3 muestra las imágenes de cromosomas reales y el cariograma resultante. Los tiempos de integración variaban dependiendo del fluoróforo utilizado y variaban de 0,5 a 20 s. Un procedimiento completo de obtención y análisis COBRA tardaba aproximadamente 1 minuto.

Aplicado a cromosomas anormales mostrados en la línea celular JVM, Cobra permitía una detección fácil de cromosomas anormales (figura 4). Es esencial en el método ULS que en principio cada molécula sonda contenga el código de proporción, haciendo la mezcla obsoleta. El marcaje en proporción de DEAC, Cy3 y Cy5 funcionó de manera excelente y se podía combinar bien con el marcaje binario con fluoresceína. Los resultados obtenidos con estas sondas se muestran en la figura 5.

La robustez de COBRA dependía de la calidad de los cromosomas en la metafase obtenidos, como es el caso para el análisis automatizado de tanto los cromosomas en bandas Giemsa como los cromosomas teñidos con FISH. Los portamuestras de calidad buena siempre dieron lugar a imágenes de una relación buena de la señal con respecto al ruido que se podrían clasificar automáticamente, mientras que la intervención del usuario incrementaba al disminuir la calidad de tinción.

El principio de Cobra combina las ventajas del marcaje en proporción y el marcaje binario. Se “establece” para producir una proporción de sólo dos fluoróforos, pero utiliza la posibilidad de duplicar el número de colores mediante la introducción de haptenos indirectamente marcados que requieren sólo una decisión binaria. Tal como se muestra, esta estrategia es factible y permite la identificación de 24 cromosomas humanos utilizando sólo 4 fluoróforos.

El potencial completo de esta estrategia aún no se ha explorado. Hasta ahora se utilizaron en Cobra sondas de pintado. Considerando los tiempos de exposición cortos, se anticipa que se pueden utilizar otros tipos de sondas, tales como YAC o PAC, en una estrategia similar.

Tal como muestra la ecuación matemática, el número de colores aumenta en particular si se utilizan más colorantes o más proporciones para el conjunto de colores primarios. Se ha observado que la diferenciación de una proporción 6 ó 7 de dos colorantes es factible.

Dicha estrategia se consigue mejor si se utiliza el marcaje químico. El ULS es ventajoso para la producción a gran escala de sondas de pintado de calidad controlada. En este contexto, la estrategia de COBRA para la utilización eficaz de fluoróforos puede contribuir significativamente a un mayor incremento de la multiplicidad MFISH y, de este modo, a la explotación posterior en citogenética.

Ejemplo 5

Prevención de la hibridación cruzada entre diferentes tipos de HPV.

Base: Las sondas de tipificación HPV 31, 33 de KREATECH producen en células CaSki una señal de hibridación débil, aunque clara. Las células CaSki son HPV16. ¿Se puede evitar esta hibridación no deseada a través de la utilización de trans-DDP?

Esquema: seleccionar, por un lado, secuencias homólogas entre HPV16 y, por otro lado, HPV31 y 33. Marcar estas secuencias con trans-DDP y entrecruzar de forma irreversible estas secuencias después de la hibridación. Las secuencias restantes son específicas de HPV31 y/o 33. Después de la hibridación con esta fracción restante marcada con DIG-ULS en células CaSki no se espera hibridación.

Ejemplo 6

Utilización de trans-DDP en hibridaciones de filtro

Base: La prevención de la hibridación entre las secuencias que hacen que la interpretación del extremo resulte difícil. Por ejemplo, las secuencias repetitivas (por ejemplo, en un intrón) que enmascara la señal de una copia única. O la supresión de secuencias generalmente presentes en una biblioteca de ADNc específico de fase que favorece las secuencias únicas específicas de fase (se puede comparar con hibridaciones por sustracción).

Esquema: Se clona HPV16 en pSP64. Después de la digestión con una enzima de restricción que elimina el inserto del plásmido, se separan ambos fragmentos en gel de agarosa y se transfiere a una membrana de filtrado. Como sonda, el plásmido y el inserto se marcan con DIG-ULS. Cuando ésta se utiliza como tal, se obtienen dos bandas después de la hibridación, es decir las bandas HPV16 y pSP64. Sin embargo, mediante la adición de ADN de pSP64 marcado con trans-DDP, las secuencias de pSP64 se entrecruzarán irreversiblemente e incluso después de la desnaturalización no serán capaces de tomar parte en la posterior hibridación. Como resultado de esta hibridación, sólo se espera una banda predominante, es decir, la específica para HPV16 (éste es el caso ideal). Este ejemplo describe un entrecruzamiento de secuencias homólogas en solución. La inversión del sistema y la primera realización de una hibridación con matriz con pSP64 marcado con trans-DDP y posteriormente después de la extracción del filtro, una hibridación pSP64/HPV16 marcados con DIG-ULS dará lugar a un resultado comparable.

Ejemplo 7

En este ejemplo, un aspecto del principio Cobra se implementa con sondas marcadas con TRANSULS en una aplicación que utiliza mFISH.

Para la generación de una sonda específica del cromosoma 4 o el cromosoma 20 humanos, se realiza una DOP-PCR sobre preparaciones del cromosoma 4 o el cromosoma 20 humanos según el procedimiento escrito en la tinción FISH multicolor de cromosomas humanos, en la que la amplificación de secuencias repetitivas se bloquea mediante la adición de secuencias de nucleótidos marcadas con trans-DDP que carecen del grupo hidroxilo en 3’ y son complementarias a varias secuencias repetitivas. La sonda específica del cromosoma 4 se marcó de forma proporcional con DEAC-ULS y Cy3-ULS (50:50) según el procedimiento descrito en el marcaje químico de las sondas utilizando ULS. La sonda específica del cromosoma 20 se marcó de forma proporcional con DEAC-ULS y Cy3-ULS

(50:50) y se marcó de forma combinatoria con fluoresceína según el procedimiento descrito en el marcaje químico de las sondas utilizando ULS.

Se prepararon portamuestras con la extensión de cromosomas en la metafase de células JVM-2 y se tiñeron con FISH según el procedimiento descrito en la tinción FISH de cromosomas humanos en la metafase.

Los resultados se visualizaron según el procedimiento descrito bajo microscopía de imágenes.

Cuando se utilizaron sondas trans-ULS se obtuvieron resultados de tinción óptimos después de tiempos de hibridación sorprendentemente cortos en comparación con las sondas no marcadas con trans-ULS en, por ejemplo, el ejemplo 4. La hibridación durante toda la noche era a menudo suficiente para la tinción, mientras que para los resultados óptimos utilizando técnicas FISH sin trans-ULS como en el ejemplo 4, los tiempos de hibridación de cinco días eran óptimos. El marcaje cobra permitía una tipificación clara e inequívoca del cromosoma 4 y el cromosoma 20 en las extensiones en la metafase de las células JVM-2 después de la hibridación con las sondas durante toda la noche.

Ejemplo 8. Bloqueo de la hibridación de ADN repetitivo marcado con fluoróforo mediante ADN repetitivo marcado con trans-DDP.

En este ejemplo, se repitieron esencialmente los experimentos descritos en el ejemplo 1. Se hibridizó in situ una sonda específica de cromosoma 1 humano marcada con fluoresceína-ULS sobre las extensiones de cromosomas humanos en la metafase. Para un experto en la materia, es obvio que este tipo de sonda contiene secuencias de ADN repetitivas no específicas de cromosoma. La hibridación de estas secuencias se dificultaba a menudo mediante la adición de un exceso de ADN Cot 1 humano no marcado. Se utilizan secuencias de ADN repetitivas marcadas con trans-DDP para suprimir la hibridación de secuencias repetitivas no específicas de cromosoma presentes en una sonda específica de cromosoma. Todos los portamuestras, excepto uno, se desnaturalizaron e incubaron previamente con ADN repetitivo humano marcado con trans-DDP. La proporción ADN repetitivo:trans-DDP se proporciona en la tabla 1. Posteriormente, todos los portamuestras, excepto uno, se desnaturalizaron y se añadió una sonda marcada con fluoresceína-ULS a todos los portamuestras. La hibridación de ADN repetitivo marcado con trans-DDP a su diana creó una conexión entre cadenas estables, evitando la hibridación de ADN marcado con fluoresceína-ULS. Por lo tanto, se reduce la intensidad de la señal de fluoresceína en los cromosomas (véase la tabla 1 para más detalles). Los portamuestras 1, 2 y 3 son portamuestras de control. Para los portamuestras 2 y 3, no se utilizó trans-DDP y no hubo entrecruzamiento. De este modo, los resultados obtenidos deben observase como valores de referencia. Los resultados de los portamuestras 4 y 5 muestran que el ADN repetitivo se sobremarcó con trans-DDP, como resultado de lo cual, se dificultó el bloqueo de la hibridación (proporción 1:2). En los portamuestras 8 y 9 se representan un marcaje de trans-DDP no saturado. Los mejores resultados se obtuvieron con una proporción 1:1 (portamuestras 6). Para detalles experimentales sobre el marcaje de la sonda con ULS y la hibridación in situ, véase el ejemplo 4.

Ejemplo 9: Bloqueo de la amplificación de secuencias específicas durante PCR por cebadores marcados con trans-DDP.

En este ejemplo, se repitieron esencialmente los experimentos descritos en el ejemplo 2. Los cebadores del virus del papiloma humano (HPV) del tipo 16 HPVfor (5’-TCAAAAGCCACTGTGTCCTG-3’) y HPVrev (5’AACCACCCCCACTTCCAC-3’) produjeron un fragmento de 945 pb en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se diseñaron cuatro cebadores internos: cebador TU16for1 (5’-AGAGCTGCAAAAAGGAGATTATTTGAAAGCGA-3’), cebador TU16for2 (5’-AGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCA-3’), cebador TU16rev1 (5’TCCTGTGCAGTAAACAACGCATGTGCTGTC-3’), y el cebador TU16rev2 (3’CGTGTGTGCTTTGTACGCCACAACCGAAGCGTAGAGT-3’). Estos cebadores internos se agruparon (0,125 g/l cada uno). La mezcla de cebadores se marcó con 50 ng de trans-ULS por g de cebador según el protocolo de marcaje ULS estándar. A continuación, la mezcla de oligonucleótidos se purificó en columna a efectos de eliminar trans-ULS. El ADN genómico total de HPV 16 (40 ng final) se mezcló con cebadores internos marcados con trans-ULS (120-160 ng final) en una solución de 6 veces SSC. Esta solución se desnaturalizó y se incubó a 60oC durante 1 hora. Esta etapa se repitió dos veces más y le siguió una purificación en columna. Posteriormente, se llevó a cabo una amplificación PCR de la siguiente manera: se añadió una mezcla madre de PCR que consistía en un tampón de PCR, cebadores HPVfor y HPVrev (10 M cada uno), dNTP (2,5 mM cada uno) y Taq ADN polimerasa (5 unidades) a un tubo de PCR de 0,5 ml que contenía (i) sólo ADN genómico de HPV 16, o (ii) ADN de HPV16 y cebadores internos, o (iii) ADN de HPV 16 entrecruzado con cebadores internos marcados con trans-ULS. El perfil de PCR fue: 95oC durante 2 minutos, 23 ciclos de 95oC durante 45 segundos; 57oC durante 45 segundos; 72oC durante 1 minuto, y 1 ciclo de 95oC durante 45 segundos; 57oC durante 45 segundos; 72oC durante 15 minutos. Se desarrollaron diez l de cada mezcla amplificada por PCR en un gel de agarosa al 1% (véase la figura 6). El carril 1 muestra el fragmento de 945 pb (véase anteriormente). El rendimiento del fragmento de 945 pb se redujo cuando se añadieron los cebadores internos a la mezcla de PCR (carril 2). Cuando se utilizaron cebadores internos marcados con trans-ULS no se amplificó por PCR el fragmento de 945 pb. El entrecruzamiento irreversible de los cebadores internos bloqueó la elongación de la cadena por ADN polimerasa en posiciones bien definidas en el fragmento de 945 pb. Se pueden obtener resultados similares cuando se utilizan cebadores internos didesoxi marcados con trans-ULS.

Ejemplo 10: Bloqueo de secuencias repetitivas durante DOP-PCR y utilización de dichas sondas en hibridación in situ.

En este ejemplo se repitieron esencialmente los experimentos descritos en el ejemplo 3. Se marcó en el extremo el ADN Cot 1 humano con ddATP según el siguiente protocolo: se desnaturalizaron 50 g de ADN Cot 1 a 90oC durante 10 minutos y se mezclaron con tampón TdT, ddATP y TdT (transferasa terminal). La mezcla se incubó a 37oC durante toda la noche y se precipitó con etanol. A continuación, el ADN Cot 1 humano con ddATP en el extremo 3’ se marcó con el agente de entrecruzamiento trans-ULS. Se mezclaron cinco g del ADN con varias cantidades de trans-ULS, se incubaron a 85oC durante 30 minutos, y se purificaron en columna. Se obtuvieron los mejores resultados con una proporción de ADN Cot 1 humano con ddATP en el extremo 3’:trans-ULS de 1:0,3. El resultado FISH de esta muestra se presenta a continuación. La sonda de pintado del cromosoma 1 humano se mezcló con ADN Cot 1 humano con ddATP en el extremo 3’ marcado con trans-ULS (10 veces en exceso), se desnaturalizó y se dejó hibridizar y entrecruzar entre cadenas a 65oC durante toda la noche. A continuación, se amplificó por PCR una alícuota pequeña de esta muestra en dos rondas consecutivas de PCR, se purificó y se marcó con Cy3-ULS, todo de acuerdo con procedimientos estándar. La sonda del cromosoma 1 producida de esta manera se privó de secuencias repetitivas de copia elevada (en este ejemplo particular, secuencias homólogas de ADN Cot 1 humano). Este tipo de sonda elimina la utilización de ADN Cot 1 humano para suprimir el entrecruzamiento de estas repeticiones en experimentos de hibridación in situ. La aplicabilidad de la sonda del cromosoma 1 humano libre de repeticiones marcada con Cy3-ULS se demostró en FISH. La hibridación in situ fue esencialmente la misma que se describe en los ejemplos 4 y/o 12. Los resultados se muestran en la figura 7. Se observó un grado elevado de hibridación cruzada no específica de cromosoma cuando se utilizó la sonda de cromosoma 1 no privada de secuencias repetitivas de copia elevada son la adición de ADN Cot 1 humano (figura 7A). La adición de un exceso de cinco veces de ADN Cot 1 humano suprimió ampliamente la hibridación cruzada no específica de cromosoma. El cromosoma 1 humano se pudo identificar claramente (figura 7B). La supresión de la hibridación cruzada no específica de cromosoma sin necesidad de grandes cantidades de ADN supresor (en este caso, ADN Cot 1 humano) se obtuvo con sondas tal como se describe en el presente documento. El cromosoma 1 se pudo identificar claramente cuando se utilizó la sonda específica de cromosoma 1 privada de repeticiones tratada con trans-ULS (figura 7C).

Ejemplo 11: Prevención de la hibridación cruzada entre diferentes tipos de virus de papiloma humano

En este ejemplo se repitieron esencialmente los experimentos descritos en el ejemplo 5. Varios tipos del virus de papiloma humano (HPV) muestran un grado elevado de identidad entre sus secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, los genomas de HPV 18 y HPV 45 muestran una identidad del 79,7%. La generación de una sonda específica de HPV 45 libre de secuencias homólogas de HPV 18 puede ser posible mediante la utilización de un agente de entrecruzamiento. El ADN genómico total de HPV 45 se marcó con DIG-ULS según el procedimiento de marcaje ULS estándar. El ADN genómico total de HPV 18 se sonicó, se marcó en el extremo con biotina y se marcó con trans-DDP a una proporción de ADN:trans-ULS de 1:1. Los ADN marcados se purificaron en columna y se mezclaron según el siguiente esquema:

Tubo 1: HPV 45 marcado con DIG-ULS + HPV 18 no marcado (sonicado)

Tubo 2: HPV 45 marcado con DIG-ULS + HPV 18 biotinilado y marcado con trans-DDP.

La proporción de HPV 45: HPV 18 fue de 1:10 en ambos tubos. Los ADN, disueltos en una solución de 6 veces de SSC (concentración final) se desnaturalizaron e incubaron a 65oC durante 5 horas. Se añadieron a estos tubos partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina y se extrajeron los ADN biotinilados de la solución. Por consiguiente, el tubo 2 contiene principalmente ADN de HPV 45 marcado con DIG-ULS privado de secuencias homólogas de HPV 18. Las sondas se desnaturalizaron y se mezclaron con una solución DIGEASYHYB a una concentración final de 25 ng/ml. El ADN genómico de HPV 45 y HPV 18 se transfirió en manchas sobre tiras de membrana de nylon en concentraciones que variaban de 1000 pg a 0,1 pg. Se añadieron mezclas de sondas a las tiras diana y se dejó que hibridizaran durante toda la noche a 42oC. El resultado se muestra en la figura 8. La sonda de HPV 45 marcada con DIG-ULS se hibridiza a sí misma independientemente de la presencia de ADN de HPV 18 homólogo no marcado (carril 1). Las secuencias únicas de HPV 45 marcadas con DIG-ULS se hibridizan a ADN genómico total de PV 45, pero la señal era menos fuerte debido al tamaño de sonda reducido (carril 2). Las secuencias únicas de HPV 45 marcadas con DIG-ULS no se hibridizan al ADN genómico total de HPV 18 bajo la condición utilizada en este experimento (carril 3).

Ejemplo 12: Utilización de trans-DDP en hibridación de filtración.

En este ejemplo se repitieron esencialmente los experimentos descritos en el ejemplo 6. Se marcó una mezcla de cinco oligonucleótidos con 0,05 g de trans-ULS por g de ADN según el procedimiento de marcaje ULS estándar. A continuación, la mezcla de oligonucleótidos marcados con trans-ULS se dejó que se prehibridizaran con una mezcla de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina-ULS (25 ng) a 65oC durante toda la noche. La mezcla de oligonucleótidos marcados con trans-ULS se añadió en un exceso de cinco o diez veces, respectivamente. Después de desnaturalizarse, se añadieron estas mezclas a tampón DIGEASYHYB a una concentración final de 25 ng/ml de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina. Estas mezclas se dejaron hibridizar a 37oC durante 6 horas a la mezcla de cinco oligonucleótidos que se esparcieron como manchas sobre las tiras de nylon en cantidades diversas que variaban de 10000 a 1 pg. La hibridación se visualizó mediante la utilización de estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina y la posterior detección por quimioluminiscencia. Los resultados se muestran en la figura 9. Los siguientes ejemplos sirvieron como controles: (i) mezcla de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina no incubados con la mezcla de oligonucleótidos marcados con trans-ULS (carril 1), y (ii) mezcla de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina incubados previamente con un exceso de 5 y 10 veces de la mezcla de oligonucleótidos (sin trans-ULS) (carril 2 y 4, respectivamente). Los carriles 3 y 5 muestran claramente el efecto del compuesto de entrecruzamiento. Las señales de hibridación son muy débiles y significativamente inferiores en comparación con los controles.

Ejemplo 13: Marcaje en proporción binario combinado

En este ejemplo se repitieron esencialmente los experimentos descritos en el ejemplo 4.

a.

Dos fluorocromos para marcaje en proporción (n = 2), la ausencia de proporciones (r = 0) y marcaje binario (m = 0) da lugar a 2 colores, tal como se esperaba.

b.

Tres fluorocromos para el marcaje en proporción (n = 3), 3 proporciones (r =3) y 1 marcaje binario (m = 1) dan lugar a 24 colores (la situación que se demostrará en este ejemplo).

c.

El incremento del número de proporciones hasta r = 4 y del número de fluorocromos para el marcaje en proporción hasta 4 dan lugar a 28 colores.

d.

Cada fluorocromo binario da lugar a la duplicación del número de colores; es decir hasta 56 (para 1) o hasta 112 (para 2).

El principio de este concepto se demuestra en 24 cromosomas humanos utilizando marcaje enzimático de sondas y la mezcla de sondas para realizar el marcaje en proporción (fluoresceína, lissamine y Cy5 como fluoróforos primarios y DEAC como marcador combinatorio), así como la unión directa del código de color con las sondas utilizando marcaje químico. En el último, DEAC, Cy3 y Cy5 se utilizaron como fluoróforos primarios y la fluoresceína o un derivado como marcador binario.

Procedimientos:

I. Tinción FISH multicolor de cromosomas humanos

La preparación de cromosomas humanos en la metafase se realizó tal como se ha descrito por Wiegant y otros (1993). Se utilizaron cromosomas de individuos humanos normales, así como de las células JVM-2 cultivadas in vitro. Las sondas de todos los cromosomas se obtuvieron de Cytocell, Reino Unido. El ADN de todas las sondas se amplificaron mediante DOP-PCR para generar un grupo de sondas de pintado para los 24 cromosomas humanos.

II. Marcaje enzimático de sondas

Todas las sondas se marcaron de manera fluorescente mediante la incorporación de dUTP marcados mediante PCR o traducción de muescas utilizando fluoresceína-dUTP, digoxigenina-dUTP (Boehringer Mannheim, Alemania), lissamine-dUTP (NEN Life Science Products, Estados Unidos) o Cy5-dUTP (Amersham, Reino Unido). Las sondas marcadas con digoxigenina se detectaron de manera indirecta utilizando dietilaminocoumarina (DEAC, Molecular Probes, Estados Unidos).

III. Marcaje químico de sondas utilizando ULS (Universal Linkage System)

Se eligieron DEAC-ULS, Cy3-ULS y Cy5-ULS como fluoróforos primarios y la fluoresceína como el cuarto marcador combinatorio para demostrar las sondas marcadas con digoxigenina-ULS (DIG-ULS).

Se utilizó la siguiente estrategia para marcar y disolver el grupo de sondas marcadas con ULS:

En primer lugar, las sondas de pintado específicas de cromosoma para los cromosomas 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y X (100 – 400 ng) se marcaron en una reacción con DIG-ULS según las instrucciones de los fabricantes. A continuación, este grupo de sondas se purificó en una columna de giro rápido Qiagen (Qiagen Inc., Valencia, CA, Estados Unidos) según las instrucciones de los fabricantes. La mezcla de sondas marcadas se eluyó de la columna Qiagen utilizando 100 l de Tris.HCl 10 mM a pH 8,5.

En segundo lugar, todas las sondas de pintado específicas de cromosoma se marcaron de manera fluorescente según la tabla 2 mezclando 30 l de los compuestos ULS indicados (o mezclas de los mismos) con 1 mg de ADN sonda de pintado específica de cromosoma utilizando DEAC-ULS (26,7 M), Cy3-ULS (20 M) y Cy5-ULS (13,3 M) en un volumen final de 100 l de agua. En el caso de que las sondas se marcaran con mezclas de dos compuestos ULS diferentes, los compuestos ULS se mezclaban en primer lugar en la proporción deseada antes de añadir el ADN sonda. Después de una incubación de 15 minutos a 65oC, las sondas marcadas se purificaron en columnas de giro rápido Qiagen (Qiagen Inc., Valencia, CA, Estados Unidos). Las sondas marcadas se eluyeron de las columnas Qiagen utilizando 100 l de Tris.HCl 10 mM a pH 8,5. Antes de la hibridación, las sondas marcadas de ULS fluorescente se combinaron en cantidades tal como se indica en la columna derecha de la tabla 2 junto con los 100 l de la mezcla de sondas marcadas con DIG-ULS de la primera etapa. A continuación, esta mezcla de sondas se precipitó con etanol en presencia de 10 veces en exceso de ADN de esperma de pescado de peso molecular bajo (Boehringer Mannheim) y 3 veces en exceso de ADN Cot 1 humano (Gibco, BRL). A continuación, la mezcla de sondas se disolvió en 10 l de formamida desionizada al 50%, 2 veces SSC, fosfato sódico 50 mM a pH 7, sulfato de dextrano al 10%. Estos 10 l de mezcla de sondas se utilizaron como solución de hibridación.

IV. Tinción FISH de cromosomas humanos en la metafase.

Los portamuestras con cromosomas en la metafase se trataron previamente con ARNasa A y pepsina según Wiegen y otros (1991). Las preparaciones de cromosomas se desnaturalizaron mediante su incubación durante 90 s a 80oC en formamida al 60%, 2 veces de SSC, pH 7 en una placa caliente. Después de la extracción del cubreobjetos, los portamuestras se deshidrataron mediante una serie de etanoles y se secaron al aire. A continuación, se aplicaron 10 l de mezcla de hibridación bajo un cubreobjeto de 18x18 mm, se sellaron con cemento de caucho y se realizó la hibridación durante 120 horas a 37oC en una cámara húmeda. La mezcla de hibridación contenía formamida al 50%, 2 veces SSC, fosfato de sodio 50 mM a pH 7, sulfato de dextrano al 10%, 100-500 ng de cada sonda marcada con DEAC, Cy3 y Cy5 (sondas marcadas tanto individualmente como de forma proporcional) (véase la tabla 2), 100400 ng de cada sonda marcada con DIG-ULS, 3 veces en exceso de ADN Cot1 humano y 10 veces en exceso de ADN de esperma de pescado de peso molecular bajo en 10 l. Antes de la aplicación, las sondas se desnaturalizaron durante 10 minutos a 80oC, seguido de incubación durante 60 minutos a 37oC para permitir la prehibridación con las 3 veces en exceso de de ADN Cot1 humano.

Después de un lavado posterior a la hibridación de 10 minutos en 2 veces de SSC/Tween 20 al 0,1% a 37oC para eliminar los cubreobjetos, los portamuestras se lavaron dos veces durante 5 minutos en formamida al 50%, 2 veces de SSC, pH 7 a 44oC. A continuación, se realizaron 2 lavados (5 minutos cada uno) en 0,1 veces de SSC a 60oC y un lavado de 5 minutos a temperatura ambiente en TNT (Tris.HCl 0,1 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%). Las sondas marcadas con DIG-ULS se detectaron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra la digoxina (Sigma), seguido de un anticuerpo antiratón de conejo conjugado a FITC (Sigma). Los cromosomas se contratiñeron con DAPI. Los portamuestras se embebieron en Vectashield® (cuando se utilizaron sondas marcadas enzimáticamente) o Citifluor® (Agar, Stansted, Reino Unido) (cuando se utilizaron sondas marcadas químicamente) antes de la evaluación microscópica.

V. Microscopía por imagen digital

Se realizó la obtención de imágenes digitales por fluorescencia utilizando un microscopio de epifluorescencia Leica DM-RXA (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con una lámpara de arco de mercurio de 100 W y ruedas de filtro controladas por ordenador con filtros de excitación y emisión para la visualización de DEAC, fluoresceína, Cy3 y Cy5, utilizando un equipo HQ-FITC Pinkel más filtros SP 570, HQ-Cy3, HQ-Cy5 y DEAC (Chroma Technology), respectivamente. Se excitó DAPI con una luz UV utilizando el bloque A. Se utilizó un objetivo de 63 aumentos (N.A. 1.32, PL APO, Leica). La obtención de imágenes y el análisis se realizaron en una estación de trabajo de Cytovision (Applied Imaging, Sunderland, Reino Unido). Este sistema consiste en un PC (procesador Pentium de 133 MHz, 24 Mb de Ram, disco de 2,1 Gb y pantalla de 17”) en interfaz con una cámara Coolview (Photonic Science). La cámara presenta un enfriamiento termoeléctrico que permite en la integración de un chip hasta alrededor de 30 segundos. Las imágenes se digitalizan en un formato de imágenes de 768x512 de 8 bits.

Los cromosomas se segmentaron interactivamente mediante la limitación de la imagen de DAPI. La imagen segmentada se utilizó como máscara para la imagen en color, que estaba compuesta de las 3 imágenes correspondientes con los fluorocromos marcados de forma proporcional (verde para DEAC, rojo para Cy3 y azul para Cy5) y de la imagen de fluoresceína. Cabe indicar que este procedimiento no requiere la limitación de los tres colores. La cuarta imagen de fluoresceína se evaluó de forma binaria, es decir, se diferenciaron los cromosomas con o sin fluorescencia por fluoresceína. Esto se realizó hallando el umbral óptimo en el histograma de la imagen de fluoresceína para los píxeles que se encuentran en la máscara de DAPI. Habitualmente, se observaron dos distribuciones gausianas correspondientes a cromosomas positivos y negativos por fluoresceína.

La clasificación se realizó en dos etapas: a la clasificación de cromosomas le siguió una clasificación de pixeles para detectar translocaciones finales. La clasificación de cromosomas se basó principalmente en el valor modal del color de cada cromosoma, por ejemplo, su posición en uno de los triángulos de color (el que tiene o no tiene el marcador binario), tal como se muestra en la figura 1. Por lo tanto, se calculó la distancia más corta del valor modal medido del color de un cromosoma al color en proporción teóricamente esperado de todas las clases de cromosomas. A efectos de compensar las contribuciones de fluorescencia no específica y de incrementar la robustez del método, los valores de color esperados teóricamente se deformaron sobre un triángulo formado por los valores modales medidos de los cromosomas con sólo un color en proporción. Además del valor modal del color, también se utilizó para la clasificación la longitud de los cromosomas. Teóricamente, los valores del color de los cromosomas deberían corresponder con las proporciones de sondas originales. Sin embargo, en la práctica, se obtiene una estrategia más robusta cuando se utilizaba una cantidad de metafases para la práctica del clasificador. Después de la clasificación del objeto, cada píxel del cromosoma se clasificó en base a la distancia más corta a las clases de cromosomas medidas. La información binaria (cuarto color) de cada píxel se utilizó para decidir sobre qué triángulo de color deben realizarse los cálculos de las distancias. La asignación de los colores de clasificación se considera útil y prevista, pero no se implementó en el software actual. Finalmente, se generó un cariograma basado en la clasificación de cromosomas que muestra la proporción de colores, tal como se ha descrito anteriormente. Se produjo un cariograma en el que se asignó un pseudocolor a la correspondiente clase de cromosoma de cada píxel de cromosoma separado para facilitar la detección interactiva de translocaciones de cromosomas. Cuando fue necesario, se utilizó la imagen de bandas DAPI con fines comparativos.

Resultados:

Se aplicó un procedimiento de tinción COBRA de 24 colores utilizando cuatro fluoróforos a cromosomas normales y anormales. Las condiciones óptimas para el marcaje de las sondas y la composición final del grupo de sondas requirieron un ajuste preciso debido al hecho de que algunas sondas actuaban de mejor forma que otras. Habitualmente, a las sondas FISH con menor acción se les asignaban combinaciones de colores de manera que se minimizaba el solapamiento de colores con otras sondas.

Los resultados de tinción óptimos se obtuvieron a tiempos de hibridación prolongados (5 días), aunque en muchos casos tres días eran suficientes. Se observó que la supresión de secuencias repetitivas era esencial para la tinción selectiva de cromosomas. La figura 2 muestra cómo los 24 cromosomas ocupan el espacio de color. Habitualmente, en una cierta imagen de cromosoma, las intensidades de la señal mostraban variaciones relativamente grandes debido a diferencias locales en la intensidad de FISH. Sin embargo, el color característico era suficientemente constante para formar agrupaciones con un ángulo definido en el espacio de color tridimensional (figura 2). Aunque algunas agrupaciones de cromosomas mostraron solapamiento, estaban suficientemente separadas para clasificarse automáticamente utilizando el procedimiento descrito anteriormente.

La figura 3 muestra las imágenes de cromosomas reales y el cariograma resultante. Los tiempos de integración variaban dependiendo del fluoróforo utilizado y variaban de 0,5 a 20 s. Un procedimiento completo de obtención y análisis COBRA tardaba aproximadamente 1 minuto.

Aplicado a cromosomas anormales mostrados en la línea celular JVM, Cobra permitía una detección fácil de cromosomas anormales (figura 4). Es esencial en el método ULS que en principio cada molécula sonda contenga el código de proporción, haciendo la mezcla obsoleta. El marcaje en proporción de DEAC, Cy3 y Cy5 funcionó de manera excelente y se podía combinar bien con el marcaje binario con fluoresceína. Los resultados obtenidos con estas sondas se muestran en la figura 5.

La robustez de COBRA dependía de la calidad de los cromosomas en la metafase obtenidos, como es el caso para el análisis automatizado de los cromosomas en bandas Giemsa y los cromosomas teñidos con FISH. Los portamuestras de calidad buena siempre dieron lugar a imágenes de una relación buena de la señal con respecto al ruido que se podrían clasificar automáticamente, mientras que la intervención del usuario incrementaba al disminuir la calidad de tinción.

El principio Cobra combina las ventajas del marcaje en proporción y el marcaje binario. Se “establece” para producir proporciones de sólo dos fluoróforos, pero utiliza la posibilidad de duplicar el número de colores mediante la introducción de haptenos indirectamente marcados que requieren sólo una decisión binaria. Tal como se muestra, esta estrategia es factible y permite la identificación de 24 cromosomas humanos utilizando sólo 4 fluoróforos.

El potencial completo de esta estrategia aún no se ha explorado. Hasta ahora se utilizaron en Cobra sondas de pintado. Considerando los tiempos de exposición cortos, se anticipa que se pueden utilizar otros tipos de sondas, tales como YAC o PAC, en una estrategia similar.

Tal como muestra la ecuación matemática, el número de colores aumenta en particular si se utilizan más colorantes o más proporciones para el conjunto de colores primarios. Se ha observado que la diferenciación de una proporción de 6 ó 7 de dos colorantes es factible.

Dicha estrategia se consigue mejor si se utiliza marcaje químico. El ULS es ventajoso para la producción a gran escala de sondas de pintado de calidad controlada. En este contexto, la estrategia de COBRA para la utilización eficaz de fluoróforos puede contribuir significativamente a un mayor incremento de la multiplicidad MFISH y, de este modo, a la explotación posterior en citogenética.

Ejemplo 14: COBRA con sondas de cromosomas completas sin repeticiones

En este ejemplo, un aspecto del principio COBRA se implementa con sondas marcadas con trans-ULS en una aplicación mFISH. En este ejemplo, se repitieron esencialmente los experimentos descritos en el ejemplo

7.

Para la generación de una sonda específica del cromosoma 1 y el cromosoma 8 humanos privados de secuencias repetitivas, se realizó una DOP-PCR sobre preparaciones del cromosoma 1 y el cromosoma 8 humanos según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.

La amplificación de secuencias repetitivas se bloqueó por las secuencias de nucleótidos repetitivas complementarias marcadas con trans-DDP que carecían del grupo hidroxilo en 3’. El marcaje de sondas fue tal como se ha descrito en el marcaje químico de sondas que utilizan ULS en el ejemplo 4. La sonda específica del cromosoma 8 se marcó de forma proporcional con Cy3-ULS y Cy5-ULS (50:50). La sonda específica del cromosoma 1 se marcó de forma proporcional con Cy3-ULS y Cy5-ULS (50:50) y se marcó de forma combinatoria con dGREEN-ULS.

Se prepararon portamuestras con extensiones de cromosomas en la metafase y se tiñeron con FISH según el procedimiento descrito en la tinción FISH de cromosomas humanos en la metafase en el ejemplo 4.

Los resultados se representan en la figura 10.

Cuando se utilizaron sondas trans-ULS se obtuvieron resultados de tinción óptimos después de tiempos de hibridación sorprendentemente cortos en comparación con las sondas no marcadas con trans-ULS en, por ejemplo, el ejemplo 4. La hibridación durante toda la noche era a menudo suficiente para la tinción, mientras que para técnicas FISH sin trans-ULS como en el ejemplo 4, los tiempos de hibridación de varios días eran óptimos. El marcaje COBRA permitía una tipificación clara e inequívoca del cromosoma 1 y el cromosoma 8 en las extensiones en la metafase después de la hibridación con las sondas durante toda la noche.

Ejemplo 15: COBRA basada en el marcaje de proteínas.

De forma similar al marcaje y detección COBRA de ácidos nucleicos, el método COBRA ofrece la posibilidad de detectar muchas proteínas simultáneamente, incluso cuando el número de marcadores disponibles es limitado (menos que el número de proteínas a investigar). Es importante la amplia aplicabilidad de la tecnología de marcaje con ULS en el marcaje de moléculas bioorgánicas. Este ejemplo demuestra la utilización satisfactoria de marcadores ULS en el marcaje de proteínas y muestra pruebas del principio de marcaje COBRA y la detección de proteínas.

Las proteínas que van a detectarse en este ejemplo son avidina y albúmina de suero bovino (BSA).

Estas dos proteínas se marcaron de manera individual y múltiple con marcadores ULS en una solución acuosa en condiciones fisiológicas.

Los marcadores con los que se marcaron las proteínas son Flu-ULS (fluoresceína), DNP-ULS (dinitrofenol) y DIG-ULS (digoxigenina). Los marcadores utilizados para el marcaje en proporción fueron Flu y DNP. La digoxigenina fue el marcador binario.

La generación de las diversas soluciones de marcaje se realizó de la siguiente manera.

Para un marcaje individual de avidina o BSA, que actuaban como control para el marcaje de proteínas con ULS per se, el marcador consistía en 1 mg/ml de cualquiera entre Flu-ULS, DNP-ULS o DIG-ULS.

Para el marcaje en proporción, el marcador consistía en Flu-ULS y DNP-ULS mezclados en una proporción 1:1.

Para el marcaje en proporción-binario combinado, la mezcla de marcaje consistía en los marcadores en proporción + el marcador binario (DIG-ULS) en una cantidad equimolar.

Las proteínas se incubaron con los marcadores según la siguiente descripción.

Cada proteína (2 g/ml en 0,5 veces PBS) se marcó mezclando 50 l de la solución de proteínas con 50 l de una solución madre de marcador 1 mg/ml en 0,5 veces de PBS de

-el marcador individual, ya sea Flu-ULS, DNP-ULS o DIG-ULS

-el marcador en proporción (Flu-ULS:DNP-ULS)

-el marcador en proporción-binario (Flu-ULS:DNP-ULS + DIG-ULS)

El marcaje se realizó a 37oC durante 1 hora. Las proteínas marcadas con ULS se pusieron como manchas sobre las membranas de nitrocelulosa. Las soluciones que contenían la proteína marcada se pusieron como manchas sobre varias tiras (1 l por mancha). A continuación, las manchas se secaron al aire y posteriormente se bloquearon los filtros durante 15 minutos en una solución de bloqueo (1 vez de medio de bloqueo de Boehringer Mannheim, cat no. 1 585 762) en el tampón de maleico según las instrucciones de los fabricantes. A continuación, los filtros se incubaron en una solución que comprendía la misma solución de bloqueo, BSA 1 mg/ml, y anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina (AP). Los anticuerpos utilizados son anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina específicos para digoxigenina (anti-digoxigenina-AP de oveja; 1:5000; Roche Molecular Biochemicals 1 093 274), dinitrofenol (anti-DNP-AP de conejo; 1:1000; Sigma D5103) y fluoresceína (anti-fluoresceína-AP de oveja; 1:5000; Roche Molecular Biochemicals 1 416 338). Esta incubación tuvo lugar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, los filtros se lavaron 3 veces durante 5 minutos en tampón de TNT seguido de 2 lavados en agua durante 2 minutos cada uno. El sistema de detección NBT/BCIP para AP se aplicó según las instrucciones de los fabricantes. La reacción de AP se dejó que tuviera lugar durante 16 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante el lavado de los filtros en 1 vez de tampón de TE durante 15 minutos.

Los resultados se muestran en la tabla 3.

La columna Av-Flu combinada con las filas 1-4 de la tabla 3 representa los resultados de avidina marcada con Flu-ULS y detectada con anticuerpos marcados con AP. Las manchas sólo mostraron una señal positiva clara cuando la AP anti-Flu estaba presente. Esto demuestra que la avidina se marcó de manera satisfactoria con Flu-ULS.

Conjuntamente, y de forma similar, la tabla 3 muestra que tanto la avidina como la BSA se podían marcar con los marcadores diferentes descritos anteriormente. Además, las proteínas se podrían marcar con varios marcadores ULS de manera simultánea. En este ejemplo particular, las dos proteínas no se podían diferenciar entre sí únicamente en base a sus marcadores en proporción (tabla 3, filas 3 y 7). El marcaje de una proteína de una forma binaria posibilitó la diferenciación de las dos proteínas (tabla 3, filas 4 y 9). La tabla 3 muestra que ambas proteínas se pueden marcar con diferentes marcadores ULS y que el marcaje COBRA se podía aplicar de manera satisfactoria a las proteínas.

De manera alternativa, la detección simultánea de proteínas marcadas según el principio COBRA se posibilita mediante la utilización de sistemas de detección específica de marcadores. Cabe indicar que el principio de marcaje COBRA es independiente del tipo de moléculas diana.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Principio de COBRA. El grupo primario de 12 colores en proporción se duplica cada vez que se introduce un marcador binario independiente, dando lugar a 24 colores para 1 hapteno y en 48 colores para 2 haptenos.

Figura 2:

Los cromosomas humanos se tiñeron en 24 colores utilizando el principio COBRA.

Para cada uno de los 24 cromosomas, la intensidad de fluorescencia se representó en un espacio de colores tridimensional. Cada punto coloreado representa la intensidad de color medida de un punto de imagen (píxel) de un cierto cromosoma.

(a): tres colores primarios (fluoresceína, lissamine, Cy5); sin marcador DEAC binario;

(b); idem, con marcador DEAC binario;

Nota: La figura 1 es una vista superior esquemática de las agrupaciones 2 x 12 observadas a valores x, y, z iguales de los datos medidos mostrados en esta figura.

Figura 3:

Los cromosomas humanos normales marcados por COBRA en 24 colores (mismos datos que la figura 2).

(a) Imagen (12 colores) resultantes de los tres colorantes primarios utilizados en el marcaje en proporción;

(b)

imagen DEAC de la misma célula en metafase;

(c)

Cariograma resultante de la combinación de la imagen (a) y (b) y clasificación automatizada.

Figura 4:

COBRA (24 colores) aplicado a una línea celular JVM (leucemia B-prolinfocítica) que muestra translocaciones t (11,14), t (3,8) y t (1,15).

Figura 5:

Resultados del marcaje en proporción obtenido utilizando marcaje químico (sistema ULS). Los fluoróforos DEAC, Cy3 y Cy5 se utilizaron como marcadores primarios para el marcaje en proporción. Se demostró de manera indirecta el segundo grupo de 12 sondas marcadas con DIG-ULS utilizando inmunoconjugados marcados con fluoresceína.

(a)

Imagen (12 colores) resultantes de los tres colorantes primarios utilizados para el marcaje en proporción;

(b) Imagen del marcador binario (cuarto) (fluoresceína, pero no mostrado en color azul falso);

(c)

Imagen umbral (b) para identificar los grupos de cromosomas positivos y negativos en fluoresceína; nota: se utiliza aquí DEAC como marcador directo de sondas (mediante ULS), mientras que en las figuras 2, 3 y 4 se utiliza como marcador binario (como inmunoconjugado).

Figura 6: Bloqueo de la PCR con oligonucleótidos internos marcados con trans-ULS. La PCR de un fragmento de ADN con un cebador directo e indirecto (carril 1) se inhibió mediante la hibridación previa del ADN diana con un grupo de 4 oligonucleótidos internos (carril 2) y se bloqueó completamente si los oligonucleótidos internos se marcaban con trans-ULS (carril 3).

Figura 7: FISH con sonda específica del cromosoma 1 humano libre de repeticiones. La figura 7A muestra la imagen FISH de una sonda de extensión en metafase humana con la sonda del cromosoma 1 humano. No se utilizó el ADN de Cot 1. Cabe indicar el grado elevado de tinción no específica de otros cromosomas presentes en el complemento del genoma humano que hace que la identificación del cromosoma 1 sea difícil. La hibridación cruzada no específica reducida de secuencias repetitivas presentes en la sonda específica del cromosoma 1 se obtuvo mediante la prehibridación de la sonda con un exceso de 5 veces de ADN de Cot 1 humano (1 hora a 37oC). El cromosoma 1 se pudo identificar con facilidad (figura 7B). Mediante el uso de trans-ULS la sonda de pintado específica del cromosoma 1 privada de secuencias altamente repetitivas permitió la identificación inequívoca del cromosoma 1 sin la utilización de ADN de Cot 1 humano entre los otros cromosomas presentes en el complemento del genoma humano (figura 7C).

Figura 8: Análisis de la hibridación de filtración de HPV18 privada de secuencias homólogas en una sonda de HPV45 utilizando la tecnología trans-ULS. El ADN de HVP18 sonicado marcado en el extremo con biotina y marcado con trans-ULS se preasocian con ADN de HPV45 marcado con DIG-ULS. Los híbridos HPV18-HPV45 marcados con biotina se extraen posteriormente de la mezcla de sondas utilizando partículas magnéticas de estreptavidina. La detección de la hibridación se realiza utilizando anticuerpos DIG-AP en combinación con CDP-StarTM.

Carril 1, hibridación de una sonda de HPV45 marcada con DIG-ULS, preasociada con ADN de HPV18 sonicado no marcado sobre HPV45 genómico con manchas;

Carril 2, hibridación de una sonda de HPV45 marcada con DIG-ULS, preasociada con HPV18 marcado en el extremo con biotina y marcado con trans-ULS sobre HPV45 genómico con manchas;

Carril 3, hibridación de una sonda de HPV45 marcada con DIG-ULS, preasociada con HPV18 marcado en el extremo con biotina y marcado con trans-ULS sobre HPV18 genómico con manchas.

Figura 9: Análisis de la hibridación de filtración de una mezcla de sondas de oligonucleótidos con oligonucleótidos complementarios biotinilados.

Carril 1, mezcla de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina hibridizados sobre oligonucleótidos con manchas;

Carril 2, mezcla de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina preasociados con un exceso de cinco veces de los oligonucleótidos e hibridizados sobre oligonucleótidos con manchas;

Carril 3, mezcla de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina preasociados con un exceso de cinco veces de oligonucleótidos marcados con trans-ULS e hibridizados sobre oligonucleótidos con manchas;

Carril 4, mezcla de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina preasociados con un exceso de diez veces de los oligonucleótidos e hibridizados sobre oligonucleótidos con manchas;

Carril 5, mezcla de oligonucleótidos complementarios marcados con biotina preasociados con un exceso de diez veces de oligonucleótidos marcados con trans-ULS e hibridizados sobre oligonucleótidos con manchas.

Figura 10: COBRA con sondas de cromosomas completos libres de repeticiones. Los pintados de cromosomas humanos específicos para los cromosomas 1 y 8, sin presencia de secuencias repetitivas y marcados con COBRA según la presente invención, se sondaron sobre extensiones de cromosomas en metafase humanos. No se utilizó el ADN de Cot 1 humano. Los cromosomas 1 y 8 se marcaron de forma proporcional con Cy3-ULS y CY5-ULS, mientras que el cromosoma 1 se marcó únicamente de forma binaria (dGREEN-ULS). Aunque los dos cromosomas presentan los mismos marcadores en proporción (Cy3 y Cy5) y una proporción (50:50), el marcador binario posibilitó la discriminación de los dos cromosomas entre sí.

Referencias

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Schroek y otros, Science 273: 494-497, 1996.

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Tabla 1 Prueba de ADN repetitivo con ULS trans-DDP

Portamuestras

Desnaturalización 1 ADN repetitivo:ULS Desnaturalización (2) Sonda Resultad

o FISH

1

no no sí c#1-Flu ++++

2

sí sí 1:0 sí c#1-Flu ++

3

sí sí 1:0 no c#1-Flu -

4

sí sí 1:2 no c#1-Flu ++

5

sí sí 1:2 sí c#1-Flu ++

6

sí sí 1:1 sí c#1-Flu +/-

7

sí sí 2:1 sí c#1-Flu +

8

sí sí 4:1 sí c#1-Flu ++

9

sí sí 8:1 sí c#1-Flu ++

Tabla 2

Cromosoma l DEAC ULS (26,7 M) l Cy3 ULS (20 M) l Cy5 ULS (13,3 ng de ADN No. M) sonda en la mezcla de híbridos

1 30 0 0 500 2 0 0 30300 3 0 300 400 4 30 0 0 500 5 0 0 30600 6 0 300 500 7 22,5 9 0 300 8 22,5 0 9 400 9 0 22,5 7,5 500 10 22.5 9 0 500 11 7,5 0 22,5 500 12 0 22,5 7,5 400 13 22,5 0 9 300 14 19,5 0 15 300 15 0 18 15 300 16 15 18 0 300 17 19,5 0 15 300 18 0 18 15 400 19 7,5 22,5 0 400 20 7,5 0 22,5 400 21 0 10,5 22,5 300 22 7,5 22,5 0 400 X 0 10,5 22,5 400 Y 15 180 100

Tabla 3

Fila

Anticuerpo Av-Flu Av-DNP Av-Flu/DNP

1

AP anti-Flu + - +

2

AP anti-DNP - + +

3

AP anti-Flu AP anti-DNP + + +

4

AP anti-DIG - - -

BSA-Flu

BSA-DNP BSA-Flu/DNP BSA-DIG BSAFlu/DNP /DIg

5

AP anti-Flu + - + - +

6

AP anti-DNP - + + - +

7

AP anti-Flu AP anti-DNP + + + - +

8

AP anti-DIG - - - + +

9

AP anti-Flu AP anti-DNP AP anti-DIG + + + + +

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias amplificables de un grupo de secuencias amplificables presentes en un cromosoma que comprende producir un ácido nucleico entrecruzado entre cadenas seleccionadas, con un método que comprende

   - hibridizar, como mínimo, una secuencia de cadena sencilla seleccionada con un ácido nucleico de cadena sencilla complementaria o un análogo funcional del mismo,

   - en el que dicha, como mínimo, una secuencia seleccionada o dicho ácido nucleico complementario

   o ambos comprenden un agente de entrecruzamiento, y

   - en el que, como mínimo, una de dichas secuencias seleccionadas es una secuencia repetitiva cromosómica,

   -en el que dichos entrecruzadores entre cadenas seleccionadas dificultan adicionalmente la hibridación y/o la replicación de dicha secuencia seleccionada para disminuir la cantidad de amplificación de un subgrupo de secuencias amplificables y someter dicho grupo a una reacción de amplificación.

2. 2.

   Método, según la reivindicación 1, en el que dicho análogo funcional de dicho ácido nucleico de cadena sencilla complementaria comprende un ácido nucleico para péptido.

3. 3.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el agente de entrecruzamiento comprende un metal de transición, preferiblemente platino.

4. 4.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el agente de entrecruzamiento es trans-diclorodiaminoplatino (II).

5. 5.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que se evita que dicho ácido nucleico de cadena sencilla complementaria participe en dicha amplificación mediante la desactivación de la función de extensión del cebador de dicho ácido nucleico de cadena sencilla complementaria, preferentemente mediante la modificación del grupo hidroxilo en 3’.

6. 6.

   Conjunto de secuencias amplificables obtenibles mediante el método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende, como mínimo, una secuencia repetitiva cromosómica entrecruzada.

7. 7.

   Sonda para la detección de ácido nucleico que comprende un conjunto de secuencias amplificadas marcadas según la reivindicación 6.

8. 8.

   Utilización de una sonda, según la reivindicación 7, para la detección de cromosomas o partes de los mismos.

9. 9.

   Utilización de entrecruzadores entre cadenas seleccionadas para disminuir la cantidad de producto amplificado de ciertas secuencias amplificables que comprenden ácido nucleico repetitivo.

10. 10.

    Utilización, según la reivindicación 8, para la identificación de una enfermedad mediante la tipificación de, como mínimo, un cromosoma.

11. 11.

    Kit adecuado para la detección de ácido nucleico que comprende, como mínimo, una sonda según la reivindicación 7.

12. 12.

    Kit adecuado para la generación de una sonda, según la reivindicación 7 o según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, que comprende, como mínimo, un agente de entrecruzamiento unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que es complementario a una secuencia repetitiva cromosómica.

13. 13.

    Sonda, según la reivindicación 7, en la que dicho conjunto de secuencias amplificadas marcadas comprende un grupo de, como mínimo, dos moléculas bioorgánicas marcadas con un grupo de, como mínimo, dos colores generados mediante la combinación de marcaje en proporción y marcaje binario.

14. 14.

    Sonda, según la reivindicación 13, en la que el número total de colores diferenciables de dicha combinación se puede calcular, como mínimo en el caso en el que se utilizan de manera simultánea dos fluoróforos por diana, según la fórmula I

    “I” No. de colores = (n + ((r x n)/(2 x (n - 2)))) x 2m

    en la que n es el número de fluoróforos utilizados para el marcaje en proporción, m es el número de fluoróforos utilizados para el marcaje binario de la misma diana y r es el número de proporciones que se resuelven mediante marcaje en proporción, con:

    2  n  INFINITO, 0  r  INFINITO, 0  m  INFINITO.
15. 15. Sonda, según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en la que, como mínimo, una de dichas 5 moléculas bioorgánicas comprende ácido nucleico, proteína, carbohidrato y/o lípido.

16. 16.

    Utilización de, como mínimo, una sonda, según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, para la identificación simultánea de secuencias de, como mínimo, un cromosoma o parte del mismo.

17. 17.

    Utilización, según la reivindicación 16, para la identificación de una enfermedad mediante la tipificación de, como mínimo, un cromosoma.

    10 18. Kit para la detección de ácido nucleico que comprende, como mínimo, una sonda, según cualquiera de las reivindicaciones 13-15.