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ES2365719T3 - Ensayos y procedimientos que utilizan biomarcadores. - Google Patents

Ensayos y procedimientos que utilizan biomarcadores. Download PDF

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ES2365719T3 ES05779237T ES05779237T ES2365719T3 ES 2365719 T3 ES2365719 T3 ES 2365719T3 ES 05779237 T ES05779237 T ES 05779237T ES 05779237 T ES05779237 T ES 05779237T ES 2365719 T3 ES2365719 T3 ES 2365719T3
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Abstract

Procedimiento para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o de células de mamífero a Apo2L/TRAIL, comprendiendo el procedimiento las etapas de: examinar la muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno o antígenos Sialyl Lewis A y/o X, donde determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control es predictiva de que dicha muestra de tejido o de células es sensible a actividad inductora de apoptosis de Apo2L/TRAIL .

Description

SOLICITUDES RELACIONADAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La invención aquí descrita se refiere a procedimientos y ensayos para detectar biomarcadores predictivos de la sensibilidad de células de mamífero a Apo2L/TRAIL y/o anticuerpos agonistas del receptores de muerte.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] En la técnica se han identificado diversos ligandos y receptores que pertenecen a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF). Entre tales ligandos están incluidos el factor de necrosis tumoral-alfa (“TNF-alfa”), factor de necrosis tumoral-beta (“TNF-beta” o “linfotoxina-alfa”), linfotoxina-beta (“LT-beta”), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, LIGHT, ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando CD95), ligando Apo-2 (también denominado Apo2L o TRAIL), ligando Apo-3 (también denominado TWEAK), APRIL, ligando OPG (también denominado ligando RANK, ODF o TRANCE) y TALL-1 (también denominado BlyS, BAFF o THANK) (véanse, por ejemplo, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281:13051308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley y col., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986): Dealtry y col., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley y col., Immunity, 3:673682 (1995); Browning y col., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage y col. Nature, 357:80-82 (1992); documento WO 97/01633 publicado el 16 de enero de 1997; documento WO 97/25428 publicado el 17 julio de 1997; Marsters y col., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche y col., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne y col., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); documento WO98/28426 publicado el 2 de julio de 1998; documento WO98/46751 publicado el 22 de octubre de 1998; documento WO/98/18921 publicado el 7 de mayo de 1998; Moore y col., Science, 285:260-263 (1999) : Shu y col., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999) : Schneider y col., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay y col., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)). El documento WO 99/36535 describe el ligando Apo2 del ligando de TNF que induce la apoptosis en células de cáncer de mamífero.
[0003] La inducción de diversas respuestas celulares mediadas por tales ligandos de la familia TNF se inicia normalmente por su unión a receptores de células específicas. Algunos, pero no todos los ligandos de la familia de TNF, se unen e inducen diversa actividad biológica mediante “receptores de muerte” de la superficie celular para activar caspasas, o enzimas que llevan a cabo la ruta de muerte celular o apoptosis (Salvesen y col., Cell, 91:443446 (1997)). Entre los miembros de la superfamilia de receptores de TNF identificados hasta la fecha están incluidos TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (también denominado Apo-1 o CD95), DR4 (también denominado TRAIL-R1), DR5 (también denominado Apo-2 o TRAIL-R2), DcR1, DcR2, osteoprotegerina (OPG), RANK y Apo-3 (también denominado DR3 o TRAMP) (véanse, por ejemplo, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley y col., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman y col., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); documento EP 417.563 publicado el 20 de marzo de 1991; Loetscher y col., Cell, 61:351 (1990); Schall y col., Cell,
61:361 (1990); Smith y col., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin y col., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic y col., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett y col., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson y col., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche y col., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); Pan y col., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti y col., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters y col., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda y col., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow y col., Science, 278:138-141 (1997)).
[0004] La mayoría de estos miembros de la familia de receptores de TNF comparten la estructura típica de los receptores de la superficie celular que incluyen las regiones extracelular, transmembranaria e intracelular, mientras que los otros se encuentran de forma natural como proteínas solubles que carecen de un dominio transmembrana e intracelular. La parte extracelular de los TNFR típicos contiene un patrón repetitivo de secuencias de aminoácidos de múltiples dominios ricos en cisteína (CRD) a partir del extremo NH2.
[0005] El ligando denominado Apo-2L o TRAIL se identificó hace varios años como un miembro de la familia de TNF de citoquinas. (véanse, por ejemplo, Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:1269712690 (1996); documento WO 97/01633; documento WO 97/25428; patente de EE.UU. 5.763.223 publicada el 9 de junio de 1998; patente de EE.UU. 6.284.236 publicada el 4 de septiembre de 2001). El polipéptido Apo2L/TRAIL humano de secuencia nativa de longitud completa tiene 281 aminoácidos de longitud, proteína transmembrana de tipo II. Algunas células pueden producir una forma soluble natural del polipéptido mediante escisión enzimática de la región extracelular del polipéptido (Mariani y col., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Los estudios cristalográficos de formas solubles de Apo2L/TRAIL revelan una estructura homotrimérica similar a las estructuras de TNF y otras proteínas relacionadas (Hymowitz y col., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha y col., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya y col., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz y col., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Sin embargo, se encontró que Apo2L/TRAIL, a diferencia de otros miembros de la familia de TNF, tenía una característica estructural única en la que tres residuos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad en el homotrímero) se coordinan a un átomo de zinc, y que la unión del zinc es importante para la estabilidad y actividad biológica del trímero (Hymowitz y col., arriba; Bodmer y col., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).
[0006] En la bibliografía se ha informado que Apo2L/TRAIL puede desempeñar una función en la modulación del sistema inmunitario que incluye enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide [véanse, por ejemplo, Thomas y col., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen y col., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith y col., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song y col., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].
[0007] También se ha descrito que las formas solubles de Apo2L/TRAIL inducen apoptosis en una variedad de células cancerosas que incluyen tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga, riñón, ovario y cerebral, además de melanoma, leucemia y mieloma múltiple (véanse, por ejemplo, Wiley y col., arriba; Pitti y col., supra; patente de EE.UU. 6.030.945 concedida el 29 de febrero de 2000; patente de EE.UU. 6.746.668 concedida el 8 de junio de 2004; Rieger y col., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi y col., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak y col., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane y col., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani y col., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu y col., Cancer Res., 60:23842389 (2000); Chinnaiyan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Los estudios in vivo en modelos de tumor murino sugieren adicionalmente que Apo2L/TRAIL, solo o en combinación con quimioterapia o radioterapia, puede ejercer efectos antitumorales sustanciales (véase, por ejemplo, Ashkenazi y col., arriba; Walzcak y col., arriba; Gliniak y col., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan y col., arriba; Roth y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); documento WO 00/75191 (solicitud PCT US/00/15512); documento WO 02/09755 (solicitud PCT US/01/23691)). A diferencia de muchos tipos de células cancerosas, la mayoría de los tipos de células humanas normales parecen ser resistentes a la inducción de apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi y col., arriba; Walzcak y col., supra). Jo y col. han descrito que una forma soluble de Apo2L/TRAIL marcada con polihistidina indujo apoptosis in vitro en hepatocitos humanos aislados normales, pero no en no humanos (Jo y col., Nature Med., 6:564-567 (2000); véase también Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Se cree que ciertas preparaciones de Apo2L/TRAIL recombinante pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas en células enfermas frente a normales dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula marcadora, contenido de zinc y contenido de trímero en % (véase, Lawrence y col., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin y col., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).
[0008] Se ha encontrado que Apo2L/TRAIL se une a al menos cinco receptores diferentes. Al menos dos de los receptores que se unen a Apo2L/TRAIL contienen un dominio de muerte citoplásmica funcional. Uno de dichos receptores se ha denominado “DR4” (y alternativamente TR4 o TRAIL-R1) (Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); véanse también el documento WO98/32856 publicado el 30 julio de 1998; el documento WO99/37684 publicado el 29 julio de 1999; el documento WO 00/73349 publicado el 7 de diciembre de 2000; el documento US 6.433.147 concedido el 13 de agosto de 2002; el documento US 6.461.823 concedido el 8 de octubre de 2002 y el documento US 6.342.383 concedido el 29 de enero de 2002).
[0009] Otro de dichos receptores para Apo2L/TRAIL se ha denominado DR5 (también se ha denominado alternativamente Apo-2; TRAIL-R o TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, STRICK2 o KILLER) (véanse, por ejemplo, Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997), Pan y col., Science, 277:815-818 (1997), el documento WO98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998; el documento WO98/41629 publicado el 24 septiembre de 1998; Screaton y col., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak y col.; EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu y col., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); el documento WO98/35986 publicado el 20 de agosto de 1998; el documento EP870.827 publicado el 14 de octubre de 1998; el documento WO98/46643 publicado el 22 de octubre de 1998; el documento WO99/02653 publicado el 21 de enero de 1999; el documento WO99/09165 publicado el 25 de febrero de 1999; el documento WO99/11791 publicado el 11 de marzo de 1999; el documento US 2002/0072091 publicado el 13 de agosto de 2002; el documento US 2002/0098550 publicado el 7 de diciembre de 2001; el documento US 6.313.269 concedido el 6 de diciembre de 2001; el documento US 2001/0010924 publicado el 2 de agosto de 2001; el documento US 2003/01255540 publicado el 3 de julio de 2003; el documento US 2002/0160446 publicado el 31 de octubre de 2002, el documento US 2002/0048785 publicado el 25 de abril de 2002; el documento US 6.342.369
concedido en febrero de 2002; el documento US 6.569.642 concedido el 27 de mayo de 2003, el documento US
6.072.047 concedido el 6 de junio de 2000, el documento US 6.642.358 concedido el 4 de noviembre de 2003; el documento US 6.743.625 concedido el 1 de junio de 2004). Al igual que DR4, se describe que DR5 contiene un dominio de muerte citoplásmica y que puede ser capaz de señalizar apoptosis tras la unión al ligando (o tras la unión a una molécula tal como un anticuerpo agonista que imite la actividad del ligando). La estructura cristalina del complejo formado entre Apo-2L/TRAIL y DR5 se describe en Hymowitz y col., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).
[0010] Tras la unión al ligando, tanto DR4 como DR5 pueden desencadenar apoptosis independientemente reclutando y activando el iniciador de apoptosis, la caspasa 8, mediante la molécula adaptadora que contiene el dominio de muerte denominada FADD/Mort1 [Kischkel y col., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick y col., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer y col., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)].
[0011] Se ha descrito que Apo2L/TRAIL también se une a aquellos receptores denominados DcR1, DcR2 y OPG que se cree que funcionan de inhibidores, en vez de transductores de la señalización (véanse, por ejemplo, DCR1 (también denominado TRID, LIT o TRAIL-R3) [Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane y col., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider y col., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti y col., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); y Mongkolsapaya y col., J. Immunol., 160:3-6 (1998); DCR2 (también llamado TRUNDD o TRAIL-R4) [Marsters y col., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan y col., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti y col., Immunity, 7:813-820 (1997)] y OPG [Simonet y col., supra]. A diferencia de DR4 y DR5, los receptores DcR1 y DcR2 no señalizan apoptosis.
[0012] En la bibliografía se ha informado de ciertos anticuerpos que se unen a los receptores DR4 y/o DR5. Por ejemplo, los anticuerpos anti-DR4 dirigidos contra el receptor DR4 y que tienen actividad agonista o apoptótica en ciertas células de mamífero se describen en, por ejemplo, el documento WO 99/37684 publicado el 29 de julio de 1999; el documento WO 00/73349 publicado el 12 de julio de 2000; el documento WO 03/066661 publicado el 14 de agosto de 2003. Véanse también, por ejemplo, Griffith y col., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai y col., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); el documento WO 02/097033 publicado el 2 de diciembre de 2002; el documento WO 03/042367 publicado el 22 de mayo de 2003; el documento WO 03/038043 publicado el 8 de mayo de 2003; el documento WO 03/037913 publicado el 8 de mayo de 2003. Asimismo se han descrito ciertos anticuerpos anti-DR5, véanse, por ejemplo, el documento WO 98/51793 publicado el 8 de noviembre de 1998; Griffith y col., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa y col., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hilander y col., “An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice”, resumen, 2º Congreso internacional de anticuerpos monoclonales en cánceres, 29 de agosto-1 de septiembre de 2002, Banff, Alberta, Canadá; el documento WO 03/038043 publicado el 8 de mayo de 2003; el documento WO 03/037913 publicado el 8 de mayo de 2003. Además, se han descrito ciertos anticuerpos que tienen reactividad cruzada tanto con receptores DR4 como DR5 (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.252.050 concedida el 26 de junio de 2001).
[0013] La transformación neoplásica de algunas células de mamífero se ha asociado en ciertos casos a cambios característicos en la expresión de antígenos Sialyl Lewis A y Sialyl Lewis X. Están presentes cantidades relativamente altas de Sialyl Lewis A/X, por ejemplo, en algunos adenocarcinomas humanos de colon, páncreas y estómago, y se han utilizado ensayos usando anticuerpos dirigidos contra las estructuras de hidratos de carbono sobre estos antígenos como medio para detectar cánceres pancreáticos y gastrointestinales (véase, por ejemplo, Ugorski y col., Acta Biochimica Polonica, 49:2:303-311 (2002)). El nivel de expresión de estos marcadores tumorales de hidratos de carbono también ha se ha correlacionado con el resultado clínico, los tiempos de supervivencia del paciente y un indicador de enfermedad metastásica.
[0014] Se ha observado que tanto Sialyl Lewis A como Sialyl Lewis X se unen a una familia de proteínas de unión a hidratos de carbono que participan en la extravasación de células de la circulación sanguínea llamadas las selectinas. Algunos informes sugieren que Sialyl Lewis A y X son ligandos para E-selectina y pueden ser responsables de la adhesión de células cancerosas humanas al endotelio. Las estructuras de Lewis sialyladas presentes sobre la superficie de células cancerosas son transportadas por las cadenas de hidratos de carbono de glicoproteínas y glicolípidos y se unen a la E-selectina presente sobre células endoteliales. Por consiguiente, las selectinas y sus ligandos de hidrato de carbono pueden pueden desempeñar una función importante en la recirculación selectiva de células tumorales durante la metástasis.
[0015] Se cree que la biosíntesis de Sialyl Lewis A y X es dependiente de la adición final de fucosa de guanosinadifosfato-fucosa (GDP-Fuc) en el enlace alfa (1,3) y alfa (1,4) a precursores sialylados mediante enzimas específicas del tipo de célula y específicas de la fase de desarrollo, una etapa catalizada por alfa-1,3/1,4-fucosiltransferasas (alfa 1,3/1,4 Fuc-T, FUT).
[0016] Hasta la fecha se han clonado y caracterizado varios genes de fucosiltransferasa humana. La expresión de estos genes (FUT 3-7) y sus productos enzimáticos (Fuc-TIII-VII) parece ser específica de tejido. Las enzimas codificadas por los cinco genes se llaman FUTIII, FUTIV, FUTV, FUTVI y FUTVII. Los tres genes que codifican FUTIII, FUTV y FUTVI están localizados en posiciones físicas próximas sobre el cromosoma 19p13.3. Los estudios bioquímicos y de clonación molecular sugieren que la expresión específica de linaje del resto de Sialyl Lewis A/X se determina por expresión específica de linaje de genes alfa-1,3-fucosiltransferasa, cuyos productos enzimáticos operan en precursores de oligosacáridos constitutivamente expresados para dar determinantes de Sialyl Lewis A/X localizados en la superficie. Las fucosiltransferasas humanas responsables de la actividad en tejidos epiteliales son FUT3 y FUT6. Los transcritos de FUT3 [también llamados el gen alfa(1,3/1,4)fucosiltransferasa de Lewis] y FUT6 [el gen alfa(1,3)fucosiltransferasa en plasma] están presentes tanto en tejidos normales como transformados. Los transcritos de fucosiltransferasa también son frecuentes en numerosas líneas celulares de adenocarcinoma con expresión destacadamente alta de FUT3 y 6 en carcinoma de colon (véanse, por ejemplo, Ugorski y col., Acta Biochimica Polonica, 49:303-311 (2002); Nakamori y col., Dis. Colon Rectum., 40:420-431 (1997); Takada y col., Cancer Res., 53:354-361 (1993); Ichikawa y col., J. Surg. Oncol., 75:98-102 (2000)); Nakagoe y col., J Exp Clin Cancer Res., marzo de 2002; 21(1):107-13; Matsumoto y col., Br J Cancer. 21 de enero de 2002; 86(2):161-7; Ito y col., J Gastroenterol. Diciembre de 2001; 36(12):823-9; Nakagoe y col., Cancer Detect Prev. 2001; 25(3):299-308; Kumamoto y col., Cancer Res. 1 de junio de 2001; 61(11):4620-7; Murata y col., Dis Colon Rectum. Abril de 2001; 44(4):A2-A4; Nakagoe y col., J Exp Clin Cancer Res. Marzo de 2001; 20(1):85-90; Nakagoe y col., J Gastroenterol. Marzo de 2001; 36(3):166-72; Nakagoe y col., Tumour Biol. Marzo-Abril de 2001; 22(2):115-22; Nakagoe y col., Can J Gastroenterol. Octubre de 2000; 14 (9):753-60; Izawa y col., Cancer Res. 1 de marzo de 2000; 60(5):1410-6; Tanaka y col., Hepatogastroenterology. Marzo-Abril de 1999; 46(26):875-82; Matsushita y col., Cancer Lett. 27 de noviembre de 1998; 133(2):151-60; Sato y col., Anticancer Res. Septiembre-Octubre de 1997; 17(5A):3505-11; Yamada y col., Br J Cancer. 1997; 76(5):582-7; Nakamori y col., Dis Colon Rectum. Abril de 1997; 40(4):420-31; Srinivas y col., Scand J Immunol. Septiembre de 1996; 44(3):197-203; Matsushita y col., Lab Invest. Diciembre de 1990; 63(6):780-91; Ashizawa y col., J Exp Clin Cancer Res. Marzo de 2003; 22(1):91-8; Nakagoe y col., J Exp Clin Cancer Res. Septiembre de 2002; 21(3):363-9; Nakagoe y col., Anticancer Res. Enero-Febrero de 2002; 22 (1A):451-8; Nakagoe y col., J Clin Gastroenterol. Abril de 2002; 34(4):408-15; Nakagoe y col., Cancer Lett. 25 de enero de 2002; 175(2):213-21; Tatsumi y col., Clin Exp Metastasis. Noviembre de 1998; 16(8):743-50; Ikeda y col., J Surg Oncol. Julio de 1996; 62(3):171-6; Ikeda y col., Eur J Surg Oncol. Abril de 1995; 21(2):168-75; Togayachi y col., Int J Cancer. 24 de septiembre de 1999; 83(1):70-9; Satoh y col., Clin Cancer Res. Abril de 1997; 3(4):495-9; Satoh y col., Respiration. 1998; 65(4):295-8; Satoh y col., Anticancer Res. Julio-Agosto de 1998; 18(4B):2865-8; Fukuoka y col., Lung Cancer. Mayo de 1998; 20(2):109-16; Fujiwara y col., Anticancer Res. Marzo-Abril de 1998; 18(2A):10436; Ogawa y col., Int J Cancer. 22 de abril de 1997; 74(2):189-92; Ogawa y col., J Thorac Cardiovasc Surg. Agosto de 1994; 108(2):329-36; Asao y col., Cancer. 15 de diciembre de 1989; 64(12):2541-5; Narita y col., Breast Cancer. 29 de marzo de 1996; 3(1):19-23; Yamaguchi y col., Oncology. Julio-Agosto de 1998; 55(4):357-62; Sikut y col., Int J Cancer. 29 de mayo de 1996; 66(5):617-23; Saito y col., Anticancer Res. Julio-Agosto de 2003; 23(4):3441-6; Fujii y col., Urol Int. 2000; 64(3):129-33; Idikio y col., Glycoconj J. Noviembre de 1997; 14(7):875-7; Inoue y col., Obstet Gynecol. Marzo de 1992; 79(3):434-40; Yamashita y col., Eur J Cancer. Enero de 2000; 36(1):113-20; Hamanaka y col., Pancreas. Agosto de 1996; 13(2):160-5; Ho y col., Cancer Res. 15 de agosto de 1995; 55(16):3659-63.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
[0017] La invención descrita en este documento proporciona procedimientos y ensayos que examinan la expresión de uno o más biomarcadores en una muestra de tejido o de células de mamífero, donde la expresión de uno o más de tales biomarcadores es predictiva de si la muestra de tejido o de células será sensible o no a agentes inductores de apoptosis, tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas anti-DR5. En diversas realizaciones de la invención, los procedimientos y ensayos examinan la expresión de biomarcadores, tales como ciertas fucosiltransferasas, en particular fucosiltransferasa 3 (FUT3) y/o fucosiltransferasa 6 (FUT6), además de antígenos Sialyl Lewis A y/o X.
[0018] Tal como se ha descrito anteriormente, la mayoría de los tipos de células humanas normales parecen ser resistentes a la inducción de apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi y col., arriba; Walzcak y col., arriba). También se ha observado que algunas poblaciones de tipos de células humanas enfermas (tales como ciertas poblaciones de células cancerosas) son resistentes a inducción de apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi y col., J. Clin. Invest., 1999, arriba; Walczak y col., Nature Med., 1999, arriba). Por consiguiente, examinando una muestra de tejido o de células de mamífero para la expresión de ciertos biomarcadores a modo de ensayo puede obtenerse convenientemente y eficientemente información útil en la evaluación de terapias apropiadas o eficaces para tratar pacientes. Por ejemplo, la información obtenida de un ensayo para detectar la expresión de FUT3 o FUT6 en una muestra de tejido o de células de mamífero puede proporcionar a los médicos datos útiles que pueden usarse para determinar una pauta terapéutica óptima (usando Apo2L/TRAIL o anticuerpos agonistas de receptores de muerte) para pacientes que padecen un trastorno tal como cáncer.
[0019] La invención proporciona procedimientos para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o de células de mamífero (tal como una célula cancerosa) a Apo2L/TRAIL o un anticuerpo agonista de receptores de muerte. En ciertas realizaciones, los procedimientos comprenden obtener una muestra de tejido o de células de mamífero y examinar el tejido o célula para la expresión de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6. Los procedimientos también pueden comprender examinar el tejido o célula para la expresión de otro biomarcador tal como el antígeno o antígenos Sialyl Lewis A y/o X. Los procedimientos pueden realizarse en una variedad de formas de ensayo que incluyen ensayos que detectan la expresión de ARNm, ensayos enzimáticos que detectan la presencia de actividad enzimática, ensayos inmunohistoquímicos y otros tratados en este documento. La determinación de la expresión de tales biomarcadores en dichos tejidos o células será predictiva de que tales tejidos o células serán sensibles a la actividad inductora de apoptosis de Apo2/TRAIL y/o anticuerpo de receptores de muerte. En realizaciones opcionales, los tejidos o células también pueden examinarse para la expresión de receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2.
[0020] Otros procedimientos de la invención incluyen procedimientos de inducción de apoptosis en una muestra de tejido o de células de mamífero que comprende las etapas de obtener una muestra de tejido o de células de mamífero, examinar el tejido o célula para la expresión de uno o más biomarcadores, tales como fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígenoo antígenos Sialyl Lewis A y/o X y, tras determinar que dicha muestra de tejido o de células expresa dicho uno o más biomarcadores, exponer dicha muestra de tejido o de células a una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista de receptores de muerte. Las etapas en los procedimientos para examinar la expresión de uno o más biomarcadores pueden realizarse en una variedad de formas de ensayo que incluyen ensayos que detectan la expresión de ARNm, ensayos enzimáticos que detectan la presencia de actividad enzimática y ensayos inmunohistoquímicos. En realizaciones opcionales, los procedimientos también comprenden examinar la muestra de tejido o de células para la expresión de receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2. Opcionalmente, la muestra de tejido o de células comprende tejido o células de cáncer.
[0021] En otro aspecto, la presente invención proporciona Apo2L/TRAIL para utilizar en un método de tratamiento de un trastorno en un mamífero, en el que el método de tratamiento comprende: examinar una muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno o antígenos Sialyl Lewis A y/o X, y tras determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control, administrar al mamífero una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL para así inducir apoptosis y tratar el trastorno.
[0022] Las etapas en los procedimientos para examinar la expresión de uno o más biomarcadores pueden realizarse en una variedad de formas de ensayo que incluyen ensayos que detectan la expresión de ARNm, ensayos enzimáticos que detectan la presencia de actividad enzimática y ensayos inmunohistoquímicos. En realizaciones opcionales, los procedimientos también comprenden examinar la muestra de tejido o de células para la expresión de receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2. Opcionalmente, los métodos comprenden, además de administrar una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL y/o anticuerpo agonista de receptores de muerte, administrar un agente o agentes quimioterapéuticos o radioterapia a dicho mamífero.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0023]
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del ligando Apo-2 humano (SEC ID NO:2) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID NO:1). El “N” en la posición de nucleótido 447 se usa para indicar que la base de nucleótidos puede ser “T” o “G”. Las Figuras 2A y 2B muestran la secuencia de nucleótidos de un ADNc (SEQ ID NO:4) para DR4 humano de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:3). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos respectivas para DR4 humano también se informan en Pan y col., Science, 276:111 (1997). La Figura 3A muestra la secuencia de 411 aminoácidos (SEQ ID NO:5) de DR5 humano como se ha publicado en el documento WO 98/51793 el 19 de noviembre de 1998. En la técnica se conoce una variante de corte y empalme de la transcripción de DR5 humano. Esta variante de corte y empalme de DR5 codifica la secuencia de 440 aminoácidos (SEQ ID NO:6) de DR5 humano mostrada en las Figuras 3B y 3C como se ha publicado en el documento WO 98/35986 el 20 de agosto de 1998. La Figura 3D muestra las secuencias de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO:7) para DcR1 humano de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:8). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos respectivas para DcR1 humano (y dominios particulares del mismo) también se muestran y se describen en el documento WO 98/58062. La Figura 3E muestra las secuencias de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO:9) para DcR2 humano de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:10). Las secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos respectivas para DcR2 humano (y dominios particulares del mismo) se muestran en el documento WO 99/10484. La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc (SEQ ID NO:11) para (1,3/1,4) fucosiltransferasa (FUT3) humana de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:12). Estas secuencias se corresponden con el número de acceso de GenBank HSU27328 y se describen, por ejemplo, en Kukowska-Latallo y col., Genes Dev. Agosto de 1990; 4(8):1288-303. La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc (SEQ ID NO:13) para alfa (1,3) fucosiltransferasa (FUT6) humana de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:14). Estas secuencias se corresponden con el número de acceso de GenBank HSU27333 y se describen, por ejemplo, en Koszdin y Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 31 de agosto de 1992; 187(1):152-7. La Figura 6 proporciona un cuadro resumen de los datos obtenidos en el análisis de 28 líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para sensibilidad o resistencia a actividad apoptósica de Apo2L (+ suero bovino fetal al 0,5% “FBS” o FBS al 10%) o anticuerpo monoclonal “mAb” contra DR5, “XL” reticulado o no reticulado,
+
suero bovino fetal al 0,5% “FBS” o FBS al 10%) y expresión de FUT 3, FUT 6, Sialyl Lewis A y Sialyl Lewis
X.
La Figura 7 proporciona una comparación de la sensibilidad de diversas líneas de células de cáncer de colon
o colorrectal para el anticuerpo contra DR5 y la expresión de FUT 3, mediada mediante PCR cuantitativa. La Figura 8 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para sensibilidad o resistencia al anticuerpo contra DR5 (más reticulante) y expresión de Sialyl Lewis X o A, determinada por FACS. La Figura 9A muestra una prueba de correlación de rangos de Spearman que analiza la sensibilidad o la resistencia de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal y la correlación con la expresión de FUT3. La Figura 9B muestra los resultados de una prueba exacta de Fisher que analiza la sensibilidad (“sens”) o la resistencia (“res”) de las diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal y la significancia estadística entre la expresión de FUT 3 y Sialyl Lewis A/X y la sensibilidad de las líneas celulares respectivas a la actividad apoptósica del anticuerpo contra DR5. La Figura 10 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la expresión de receptores DcR1 o DcR2 (determinada por PCR cuantitativa) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares a Apo2L o anticuerpo contra DR5. La Figura 11 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la expresión de receptores DcR1 o DcR2 (determinada por FACS) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares a Apo2L o anticuerpo contra DR5. La Figura 12 muestran tinción inmunohistoquímica para Sialyl Lewis A y X en cuatro líneas de células de cáncer colorrectal, CaCo2, SW 1417, DLD-1 y Colo 205, y su correlación con la expresión de Sialyl Lewis A y X medida por FACS y su correlación con la sensibilidad a Apo2L. La Figura 13 muestra un resumen de experimentos de IHC que demuestran la expresión de Sialyl Lewis A y X en muestras de tejido de mucosa de colon normal, tejido de hígado normal, cáncer de colon primario y metástasis de cáncer de colon.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0024] Las técnicas y procedimientos descritos o citados en este documento son generalmente bien entendidos y comúnmente se emplean usando metodología convencional por aquellos expertos en la materia tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según corresponda, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos comercialmente disponibles se llevan a cabo generalmente según protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que se indique lo contrario.
[0025] Antes de describir los presentes procedimientos y ensayos debe entenderse que la presente invención no se limita a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, construcciones y reactivos descritos ya que éstos pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es con el fin de sólo describir realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado sólo por las reivindicaciones adjuntas.
[0026] Debe indicarse que, tal como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una alteración genética” incluye una pluralidad de dichas alteraciones y la referencia a “una sonda” incluye la referencia a una o más sondas y equivalentes de las mismas conocidas para aquellos expertos en la materia, etc.
[0027] Las publicaciones citadas en este documento se citan para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder las publicaciones en virtud de una fecha de prioridad anterior o fecha anterior de la invención. Adicionalmente, las fechas de publicación reales pueden ser diferentes de aquellas mostradas y requieren verificación independiente.
I. DEFINICIONES
[0028] Los términos “Apo2L/TRAIL”, “Apo-2L” y “TRAIL” se usan en este documento para referirse a una secuencia de polipéptidos que incluye los residuos de aminoácidos 114-281, ambos incluidos, 95-281, ambos incluidos, los residuos 92-281, ambos incluidos, los residuos 91-281, ambos incluidos, los residuos 41-281, ambos incluidos, los residuos 15-281, ambos incluidos, o los residuos 1-281, ambos incluidos, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1, además de fragmentos biológicamente activos, variantes de deleción, inserción o sustitución de las secuencias anteriores. En una realización, la secuencia de polipéptidos comprende los residuos 114-281 de la Figura 1) y opcionalmente consiste en los residuos 114-281 de la Figura 1. Opcionalmente, la secuencia de polipéptidos comprende los residuos 92-281 o los residuos 91-281 de la Figura 1. Los polipéptidos Apo-2L pueden estar codificados por la secuencia de nucleótidos nativa mostrada en la Figura 1. Opcionalmente, el codón que codifica el residuo Pro119 (Figura 1) puede ser “CCT” o “CCG”. En otras realizaciones, los fragmentos o las variantes son biológicamente activos y tienen al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencias de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias, e incluso más preferentemente al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad de secuencias con una cualquiera de las secuencias de Apo2L/TRAIL anteriormente citadas. Opcionalmente, el polipéptido Apo2L/TRAIL es codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de polinucleótidos codificante proporcionada en la Figura 1. La definición engloba variantes de sustitución de Apo2L/TRAIL en las que al menos uno de sus aminoácidos nativos está sustituido por un residuo de alanina. Variantes de sustitución particulares de Apo2L/TRAIL incluyen aquellas en las que al menos un aminoácido está sustituido por un residuo de alanina. Estas variantes de sustitución incluyen aquellas identificadas, por ejemplo, como “D203A”; “D218A” y “D269A.” Esta nomenclatura se usa para identificar variantes de Apo2L/TRAIL en las que los residuos de ácido aspártico en las posiciones 203, 218 y/o 269 (usando la numeración mostrada en la Figura 1) están sustituidas por residuos de alanina. Opcionalmente, las variantes de Apo2L pueden comprender una o más de las sustituciones de alanina que se citan en la Tabla I de la solicitud PCT publicada WO 01/00832. Las variantes de sustitución incluyen una o más de las sustituciones de residuos identificadas en la Tabla I del documento WO 01/00832 publicado el 4 de enero de 2001. La definición también engloba un Apo2L/TRAIL de secuencia nativa aislado de una fuente de Apo2L/TRAIL o preparado por procedimientos recombinantes o sintéticos. El Apo2L/TRAIL de la invención incluye los polipéptidos denominados en lo sucesivo Apo2L/TRAIL o TRAIL descritos en las publicaciones PCT nº WO97/01633 y WO97/25428. Los términos “Apo2L/TRAIL” o “Apo2L” se usan para referirse generalmente a formas de Apo2L/TRAIL que incluyen formas monómeras, dímeras o trímeras del polipéptido. Todas las numeraciones de residuos de aminoácidos referidos en la secuencia de Apo2L usan la numeración según la Figura 1, a menos que se establezca específicamente lo contrario. Por ejemplo, “D203” o “Asp203” se refiere al residuo de ácido aspártico en la posición 203 en la secuencia proporcionada en la Figura 1.
[0029] El término “dominio extracelular de Apo2L/TRAIL” o “DEC de Apo2L/TRAIL” se refiere a una forma de Apo2L/TRAIL que está esencialmente libre de dominios transmembrana y citoplásmico. Generalmente, el DEC tendrá menos del 1% de tales dominios transmembrana y citoplásmico y preferentemente tendrá menos del 0,5% de tales dominios. Se entenderá que cualquier dominio o dominios transmembrana identificados para los polipéptidos de la presente invención se identifican según los criterios habitualmente empleados en la materia para identificar ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero lo más probable en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio como se ha identificado inicialmente. En realizaciones preferidas, el DEC consistirá en una secuencia de dominio extracelular soluble del polipéptido que está libre de los dominios transmembrana y citoplásmico o intracelulares (y no está unido a la membrana). Secuencias particulares del dominio extracelular de Apo-2L/TRAIL se describen en las publicaciones PCT nº WO97/01633 y WO97/25428.
[0030] El término "monómero del Apo2L/TRAIL" o "monómero del Apo2L" se refiere a una cadena covalente de una secuencia del dominio extracelular del Apo2L.
[0031] El término "dímero del Apo2L/TRAIL" o "dímero del Apo2L" se refiere a dos monómeros del Apo2L unidos en un enlace covalente mediante un enlace disulfuro. El término, tal y como se utiliza en este documento, incluye los dímeros del Apo2L que permanecen libres y los dímeros del Apo2L que están dentro de formas triméricas del Apo2L (es decir, asociados con otro, un tercer monómero del Apo2L).
[0032] El término "trímero del Apo2L/TRAIL" o "trímero del Apo2L" se refiere a tres monómeros del Apo2L que están asociados de forma no covalente.
[0033] El término "agregado del Apo2L/TRAIL" se usa para referirse a formas oligoméricas superiores autoasociadas del Apo2L/TRAIL, tales como los trímeros del Apo2L/TRAIL, los cuales forman, por ejemplo, formas hexaméricas y nanoméricas del Apo2L/TRAIL. La determinación de la presencia y cantidad de monómero, dímero o trímero (u otros agregados) del Apo2L/TRAIL puede hacerse usando procedimientos y ensayos conocidos en el estado de la técnica (y usando materiales disponibles comercialmente), tales como la HPLC por exclusión de tamaño nativo ("SEC"), la exclusión por tamaño de desnaturalización usando dodecilsulfato de sodio ("SDS-SEC"), la HPLC en fase inversa, y la electroforesis capilar.
[0034] “Receptor del ligando Apo-2” incluye los receptores denominados en la técnica como “DR4” y “DR5” cuyas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos se muestran en las Figuras 2 y 3 respectivamente. Pan y col. han descrito el miembro de la familia de receptores de TNF denominado como “DR4” (Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); véanse también el documento WO98/32856 publicado el 30 de julio de 1998; el documento WO 99/37684 publicado el 29 de julio de 1999; el documento WO 00/73349 publicado el 7 de diciembre de 2000; el documento US
6.433.147 concedido el 13 de agosto de 2002; el documento US 6.461.823 concedido el 8 de octubre de 2002 y el documento US 6.342.383 concedido el 29 de enero de 2002). Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997) y Pan y col., Science, 277:815-818 (1997) describieron otro receptor para Apo2L/TRAIL (véanse también el documento WO98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998; el documento WO98/41629 publicado el 24 de septiembre de 1998). Este receptor se denomina como DR5 (el receptor también se ha denominado alternativamente como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 o KILLER; Screaton y col., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak y col., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu y col., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); el documento WO98/35986 publicado el 20 de agosto de 1998; el documento EP870.827 publicado el 14 de octubre de 1998; el documento WO98/46643 publicado el 22 octubre de 1998; el documento WO99/02653 publicado el 21 de enero de 1999; el documento WO99/09165 publicado el 25 de febrero de 1999; el documento WO99/11791 publicado el 11 de marzo de 1999; el documento US 2002/0072091 publicado el 13 de agosto de 2002; el documento US 2002/0098550 publicado el 7 de diciembre de 2001; el documento US 6.313.269 concedido el 6 de diciembre de 2001; el documento US 2001/0010924 publicado el 2 de agosto de 2001; el documento US 2003/01255540 publicado el 3 de julio de 2003; el documento US 2002/0160446 publicado el 31 de octubre de 2002, el documento US 2002/0048785 publicado el 25 de abril de 2002; el documento US 6.569.642 concedido el 27 de mayo de 2003, el documento US
6.072.047 concedido el 6 de junio de 2000, el documento US 6.642.358 concedido el 4 de noviembre de 2003). Como se ha descrito anteriormente, otros receptores para Apo-2L incluyen DcR1, DcR2 y OPG (véase, Sheridan y col., supra; Marsters y col., supra; y Simonet y col., supra). El término “receptor para Apo-2L” cuando se usa en este documento engloba el receptor de secuencia nativa y variantes del receptor. Estos términos engloban el receptor para Apo-2L expresado en una variedad de mamíferos que incluye seres humanos. El receptor para Apo-2L puede expresarse endógenamente cuando se produce naturalmente en una variedad de linajes de tejido humano, o puede expresarse por procedimientos recombinantes o sintéticos. Un “receptor para Apo-2L de secuencia nativa” comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un receptor para Apo-2L derivado de la naturaleza. Por tanto, un receptor para Apo-2L de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos del receptor para Apo-2L que se produce naturalmente a partir de cualquier mamífero. Dicho receptor para Apo-2L de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término “receptor para Apo-2L de secuencia nativa” engloba específicamente formas truncadas o secretadas que se producen naturalmente del receptor (por ejemplo, una forma soluble que contiene, por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes que se producen naturalmente (por ejemplo, formas alternativamente cortadas y empalmadas) y variantes alélicas que se producen naturalmente. Las variantes del receptor pueden incluir fragmentos o mutantes de deleción del receptor para Apo-2L de secuencia nativa. La Figura 3A muestra la secuencia de 411 aminoácidos de DR5 humano como se ha publicado en el documento WO 98/51793 el 19 de noviembre de 1998. Una variante de corte y empalme de transcripción de DR5 humano se conoce en la técnica. Esta variante de corte y empalme de DR5 codifica la secuencia de 440 aminoácidos de DR5 humano mostrada en las Figuras 3B y 3C tal como se ha publicado en el documento WO 98/35986 el 20 de agosto de 1998.
[0035] “Anticuerpo de receptores de muerte” se usa en este documento para referirse generalmente a un anticuerpo
o anticuerpos dirigidos contra un receptor en la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral y que contiene un dominio de muerte que puede señalizar apoptosis, y dichos anticuerpos incluyen anticuerpo contra DR5 y anticuerpo contra DR4.
[0036] “Anticuerpo del receptor DR5”, “anticuerpo contra DR5” o “anticuerpo anti-DR5” se usan en un amplio sentido para referirse a anticuerpos que se unen a al menos una forma de un receptor DR5 o dominio extracelular del mismo. Opcionalmente, el anticuerpo contra DR5 está fusionado o ligado a una secuencia o molécula heteróloga. Preferentemente, la secuencia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo a formar complejos de mayor orden u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo contra DR5 se une al receptor DR5, pero no se une ni reacciona de forma cruzada con ningún receptor para Apo-2L adicional (por ejemplo DR4, DcR1 o DcR2). Opcionalmente, el anticuerpo es un agonista de actividad de señalización de DR5.
[0037] Opcionalmente, el anticuerpo contra DR5 de la invención se une a un receptor DR5 en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 20 mM medido en un ensayo de unión BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos contra DR5 de la invención presentan un valor de CI50 de aproximadamente 0,6 nM a aproximadamente 18 mM medida en un ensayo de unión BIAcore.
[0038] “Anticuerpo del receptor DR4”, “anticuerpo contra DR4” o “anticuerpo anti-DR4” se usa en un amplio sentido para referirse a anticuerpos que se unen a al menos una forma de un receptor DR4 o dominio extracelular del mismo. Opcionalmente, el anticuerpo contra DR4 está fusionado o ligado a una secuencia o molécula heteróloga. Preferentemente, la secuencia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo a formar complejos de mayor orden u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo contra DR4 se une al receptor DR4, pero no se une ni reacciona de forma cruzada con ningún receptor para Apo-2L adicional (por ejemplo DR5, DcR1 o DcR2). Opcionalmente, el anticuerpo es un agonista de actividad de señalización de DR4.
[0039] Opcionalmente, el anticuerpo contra DR4 de la invención se une a un receptor DR4 en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 20 mM medido en un ensayo de unión BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos contra DR5 de la invención presentan un valor de CI50 de aproximadamente 0,6 nM a aproximadamente 18 mM medido en un ensayo de unión BIAcore.
[0040] El término “agonista” se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que potencie, estimule o active parcial o completamente una o más actividades biológicas de Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo. Ejemplos de dichas actividades biológicas de unión de Apo2L/TRAIL a DR4 o DR5 incluyen apoptosis, además de aquellas adicionalmente descritas en la bibliografía. Un agonista puede funcionar de un modo directo o indirecto. Por ejemplo, el agonista puede funcionar para potenciar, estimular o activar parcial o completamente una o más actividades biológicas de DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo, como resultado de su unión directa a DR4 o DR5 que produce la activación del receptor o la transducción de señales. El agonista también puede funcionar indirectamente para potenciar, estimular o activar parcial o completamente una o más actividades biológicas de DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo, como resultado de, por ejemplo, estimular otra molécula efectora que a continuación produce la activación de DR4 o DR5 o la transducción de señales. Se contempla que un agonista puede actuar como molécula potenciadora que funciona indirectamente para potenciar o aumentar la activación o actividad de DR4 o DR5. Por ejemplo, el agonista puede potenciar la actividad de Apo-2L endógeno en un mamífero. Esto podría llevarse a cabo, por ejemplo, complejando previamente DR4 o DR5 o estabilizando complejos del ligando respectivo con el receptor DR4 o DR5 (tal como, estabilizando el complejo nativo formado entre Apo-2L y DR4 o DR5).
[0041] El término “biomarcador” como se usa en la presente solicitud se refiere generalmente a una molécula que incluye un gen, proteína, estructura de hidrato de carbono o glicolípido, cuya expresión en o sobre un tejido o célula de mamífero puede detectarse mediante procedimientos convencionales (o procedimientos descritos en este documento) y es predictiva de la sensibilidad de células o tejidos de un mamífero a Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte. Dichos biomarcadores contemplados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, “(1,3/1,4) fucosiltransferasa” o “FUT3”, “alfa (1,3) fucosiltransferasa” o “FUT6”, “Sialyl Lewis A”, y “Sialyl Lewis X”. Opcionalmente, la expresión de dicho biomarcador se determina que es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control. Opcionalmente, por ejemplo, la expresión de dicho biomarcador se determinará en un ensayo de PCR o FACS que es al menos 50 veces, o preferentemente al menos 100 veces, superior en la muestra de tejido o de células de prueba que la observada para una muestra de tejido o de células de control. Opcionalmente, la expresión de dicho biomarcador se determinará en un ensayo de IHC para puntuar al menos 2 o más para la intensidad de tinción.
[0042] “(1,3/1,4) fucosiltransferasa” o “FUT3” se usa en este documento para referirse a una molécula que tiene características estructurales como se describen en este documento y opcionalmente que cataliza la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante, GDP-fucosa, a un sustrato receptor en un enlace α3-o α4-para GlcNAc (FUT III-VII y IX). La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos para FUT3 humana se proporciona en la Figura 4. Estas secuencias se corresponden con el número de acceso de GenBank HSU27328 y se describen, por ejemplo, en Kukowska-Latallo y col., Genes Dev. 1990 Aug; 4(8):1288-303. Las FUT son generalmente glicoproteínas transmembrana de tipo II que residen en las vacuolas de Golgi y normalmente están compuestas por una cola citoplásmica del extremo N, una región que abarca la membrana y un dominio catalítico orientado lumenalmente en el aparato de Golgi. Entre la región que abarca la membrana y el dominio catalítico está una región llamada el tallo (Paulson y Colley, J. Biol. Chem., 264:17615-17618 (1989)).
[0043] “Alfa (1,3) fucosiltransferasa” o “FUT6” se usa en este documento para referirse a una molécula que estructuralmente se refiere a, por ejemplo, la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos para FUT6 humana proporcionada en la Figura 5. Estas secuencias se corresponden con el número de acceso de GenBank HSU27333 y se describen, por ejemplo, en Koszdin y Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 31 de agosto de 1992; 187(1):152-7. FUT 6 se expresa normalmente en células epiteliales y en tejidos de hígado, riñón y gastrointestinal, específicamente estómago, yeyuno y colon (y normalmente se expresa mínimamente en bazo, pulmón y cuello del útero). FUT 6 no se detecta normalmente en cerebro, corteza suprarrenal o leucocitos de sangre periférica.
5 [0044] “Sialyl Lewis A” se usa en este documento para referirse a una estructura o antígeno de hidratos de carbono de tetrasacáridos que tiene la siguiente secuencia o estructura que puede estar unida a la membrana o en forma soluble circulando, por ejemplo, en suero:
10 NeuAcα2-->3Galβ1-->3[Fucα1-->4]GlcNAcβ1-->R (NeuAcalfa2-->3Galbeta1->3(Fucalfa1-->4)GlcNAcbeta1->R) [0046] Por “sujeto” o “paciente” se indica cualquier sujeto individual para el que sea desea terapia que incluye seres humanos, ganado, perros, cobayas, conejos, pollos, insectos, etc. También se pretende incluir como sujeto cualquier sujeto que participe en ensayos de investigación clínica que no muestren ningún síntoma de enfermedad, o sujetos que participan en estudios epidemiológicos, o sujetos usados como controles.
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[0045] “Sialyl Lewis X” se usa en este documento para referirse a una estructura o antígeno de hidratos de carbono de tetrasacáridos que tiene la siguiente secuencia o estructura que puede estar unida a la membrana o en forma soluble circulando, por ejemplo, en suero: NeuAcα2-->3Galβ1-->4[Fucα1-->3]GlcNAcβ1-->R (NeuAcalfa2-->3Galbeta1->4(Fucalfa1-->3)GlcNAcbeta1->R)
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[0047] El término “mamífero” como se usa en este documento se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero que incluye seres humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención el mamífero es un ser humano.
[0048] Por “muestra de tejido o de células” se indica una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra de tejido o de células puede ser tejido sólido como de un órgano fresco, congelado y/o conservado o muestra de tejido o biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente de la sangre; fluidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; células de cualquier tiempo de la gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido también puede ser células o líneas de células primarias o cultivadas. Opcionalmente, la muestra de tejido o de células se obtiene de un tumor primario o metastásico. La muestra de tejido puede contener compuestos que no están mezclados de forma natural con el tejido en la naturaleza, tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos
o similares.
[0049] Con los fines en este documento, una “sección” de una muestra de tejido indica una parte individual o trozo de una muestra de tejido, por ejemplo, una fina porción de tejido o células cortada de una muestra de tejido. Se entiende que pueden tomarse múltiples secciones de muestras de tejido y someterse a análisis según la presente invención, siempre que se entienda que la presente invención comprende un procedimiento por el cual la misma sección de muestra de tejido se analiza a niveles tanto morfológicos como moleculares, o se analiza con respecto tanto a proteína como a ácido nucleico.
[0050] Por “correlacionar” o “correlacionan” se indica comparar, de cualquier forma, el rendimiento y/o los resultados de un primer análisis o protocolo con el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, los resultados de un primer análisis o protocolo pueden usarse en la realización de un segundo protocolo y/o los resultados de un primer análisis o protocolo pueden usarse para determinar si debería realizarse o no un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la realización de análisis o protocolo inmunohistoquímico, los resultados de IHC pueden usarse para determinar si debería realizarse o no una pauta terapéutica específica.
[0051] Por “ácido nucleico” se pretende incluir cualquier ADN o ARN. Por ejemplo, el ácido nucleico cromosómico, mitocondrial, vírico y/o bacteriano presente en la muestra de tejido. El término “ácido nucleico” engloba tanto una como ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico de doble cadena e incluye cualquier fragmento o porción de una molécula de ácido nucleico intacta.
[0052] Por “gen” se indica cualquier secuencia de ácidos nucleicos o porción de la misma con una función funcional en codificar o transcribir una proteína o regular otra expresión génica. El gen puede consistir en todos los ácidos nucleicos responsables de codificar una proteína funcional o sólo una parte de los ácidos nucleicos responsables de codificar o expresar una proteína. La secuencia de ácidos nucleicos puede contener una anomalía genética dentro de exones, intrones, regiones de iniciación o terminación, secuencias promotoras, otras secuencias reguladoras o regiones adyacentes únicas al gen.
[0053] La palabra “marcador” cuando se usa en este documento se refiere a un compuesto o composición que está conjugado o fusionado directamente o indirectamente con un reactivo, tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo y facilita la detección del reactivo con el que está conjugado o fusionado. El marcador puede ser por sí mismo detectable (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición del sustrato que es detectable.
[0054] El término “anticuerpo” en este documento se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada.
[0055] Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto que comprende preferentemente la región de unión a antígeno o región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
[0056] Los “anticuerpos nativos” son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro entre las cadenas regularmente separados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas.
[0057] El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables se diferencian ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida por todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad tanto en los dominios variables de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se llaman las regiones estructurales (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran parte una configuración de lámina β, conectadas por tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina β. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en una estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC).
[0058] La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y que todavía puede reticular el antígeno.
[0059] “Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL. En conjunto, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que sólo comprende tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión entero.
[0060] El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de las cadenas pesadas que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en este documento para Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes portan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpo se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
[0061] Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos llamados kappa (κ) y lambda (λ) basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
[0062] Los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varios de éstos pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se llaman α, δ, ε, γ y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son conocidas.
[0063] Los fragmentos de anticuerpos “Fv de cadena sencilla” o “scFv” comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL de anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptidos. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269315 (1994).
[0064] El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable (VH) de las cadenas pesadas conectado a un dominio variable (VL) de las cadenas ligeras en la misma cadena de polipéptidos (VH -VL). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
[0065] El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan mediante el cultivo de hibridomas, sin estar contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo al obtenerse de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden prepararse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
[0066] Los anticuerpos monoclonales en este documento incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a secuencias en anticuerpos correspondientes derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas son idénticas a u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. nº 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en este documento incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo tal como babuino, mono Rhesus o cinomolgo) y secuencias de la región constante humanas (patente de EE.UU. nº 5.693.780).
[0067] Formas “humanizas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen la mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En general, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana están sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles véase Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
[0068] El término “región hipervariable” cuando se usa en este documento se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos de una “región determinante de la complementariedad” o “CDR” (por ejemplo, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de las cadenas ligeras y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de las cadenas pesadas; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un “bucle hipervariable” (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de las cadenas ligeras y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de las cadenas pesadas; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos de la “región estructural” o “FR” son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable que se han definido en este documento.
[0069] Un anticuerpo “que une” un antígeno de interés es uno que puede unirse a ese antígeno con suficiente afinidad y/o avidez de forma que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico o de diagnóstico para reconocer una una célula que expresa el antígeno.
[0070] Con los fines en este documento, “inmunoterapia” se referirá a un procedimiento para tratar un mamífero (preferentemente un paciente humano) con un anticuerpo, donde el anticuerpo puede ser un anticuerpo sin conjugar
o “desnudo”, o el anticuerpo puede conjugarse o fusionarse con una molécula o moléculas o agente o agentes heterólogos, tales como uno o más agentes citotóxico, generándose así un “inmunoconjugado”.
[0071] Un anticuerpo “aislado” es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el antagonista o anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) en más del 95% en peso de anticuerpo tal como se determina por el procedimiento de Lowry, y lo más preferentemente en más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos del extremo N o internos usando un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o preferentemente tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, generalmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
[0072] La expresión “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad de un agente (por ejemplo, Apo2L/TRAIL, anticuerpo anti-DR4 o DR5, etc.) que es eficaz para prevenir, mejorar o tratar la enfermedad o afección en cuestión.
[0073] Los términos “tratar”, “tratamiento” y “terapia” como se usan en este documento se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva. Tratamiento o administración consecutiva se refiere a un tratamiento de al menos una vez al día sin interrupción en el tratamiento por uno o más días. Tratamiento o administración intermitente, o tratamiento o administración de un modo intermitente, se refiere a tratamiento que no es consecutivo, sino que es de naturaleza cíclica.
[0074] El término “citoquina” es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen la hormona de crecimiento tal como la hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana con N-metionilo y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas, tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante tiroidea (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral α y β; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF), tales como TGF-α y TGF-β; factor de crecimiento I y II similar a la insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones, tales como interferón α, β y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleuquinas (IL), tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17; y otros factores de polipéptidos que incluyen LSI y el ligando kit (KL). Como se usa en este documento, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.
[0075] El término “agente citotóxico” como se usa en este documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o produce la destrucción de células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.
[0076] Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan); briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como el antibiótico enediína (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina γ1I y caliqueamicina θI1, véase, por ejemplo, Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, que incluye dinemicina A; bifosfonatos tales como clodronato; una esperamicina; además del cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enediína de cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (AdriamycinTM) (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolinodoxorubicina, 2-pirrolinodoxorubicina y desoxi-doxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reparadores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (GemzarTM); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NavelbineTM); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En esta definición también están incluidos agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógeno (SERM) que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (FarestonTM); e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales tales como, por ejemplo, 4(5)imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™) y anastrozol (Arimidax™); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
[0077] Un “agente inhibidor del crecimiento” cuando se usa en este documento se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente célula cancerosa que sobreexpresa cualquiera de los genes identificados en este documento, tanto in vitro como in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce significativamente el porcentaje de células que sobreexpresan dichos genes en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un sitio distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxol e inhibidores de topo II, tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también afectan a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado “Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs” de Murakami y col. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la pág. 13.
[0078] Los términos “apoptosis” y “actividad apoptótica” se usan en un amplio sentido y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que normalmente va acompañada de uno o más cambios celulares característicos que incluyen condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación de ADN cromosómico o pérdida de función mitocóndrica. Esta actividad puede determinarse y medirse, por ejemplo, por ensayos de viabilidad celular (tales como ensayos con azul Alamar o ensayos de MTT), análisis por FACS, activación de caspasas, fragmentación de ADN (véase, por ejemplo, Nicoletti y col., J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991), y poli-ADP-ribosa-polimerasa, “PARP”, ensayos de escisión conocidos en la técnica.
[0079] Como se usa en este documento, el término “trastorno” se refiere en general a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con las composiciones descritas en este documento que incluye cualquier enfermedad o trastorno que pueda tratarse por cantidades eficaces de Apo2L/TRAIL, un anticuerpo anti-DR4 y/o un anticuerpo anti-DR5. Éste incluye trastornos crónicos y agudos, así como aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de trastornos que van a tratarse en este documento incluyen cánceres benignos y malignos; trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, trastornos autoinmunitarios, artritis (incluyendo artritis reumatoide), esclerosis múltiple y VIH/SIDA.
[0080] Los términos “cáncer”, “canceroso” o “maligno” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que normalmente se caracteriza por un crecimiento celular irregular. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma y sarcoma. Más ejemplos particulares de dichos cánceres incluyen carcinoma de células escamosas, mieloma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, cáncer (del tracto) gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de hígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer del cuello del útero, cáncer cerebral, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer de cabeza y cuello.
[0081] El término “enfermedad relacionada con la inmunidad” significa una enfermedad en la que un componente del sistema inmunitario de un mamífero produce, media o contribuye de otro modo a la morbilidad en el mamífero. También están incluidas enfermedades en las que la estimulación o la intervención de la respuesta inmunitaria tiene un efecto paliativo sobre la progresión de la enfermedad. Incluido dentro de este término están enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias mediadas por inmunidad, enfermedades inflamatorias no mediadas por inmunidad, enfermedades infecciosas y enfermedades de inmunodeficiencia. Ejemplos de enfermedades relacionadas con la inmunidad e inflamatorias, algunas de las cuales son inmunitarias o están mediadas por linfocitos T, que pueden tratarse según la invención incluyen lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (esclerodermia), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjögren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmunitaria (pancitopenia inmunitaria, hemoglobinuria paroxística nocturna), trombocitopenia autoinmunitaria (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada por inmunidad), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad renal mediadas por inmunidad (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nervioso central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis activa crónica autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedades inflamatorias y pulmonares fibróticas tales como enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerosa: enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel autoinmunitarias o mediadas por inmunidad que incluyen enfermedades de piel ampollosa, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinófilas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades asociadas a trasplante que incluyen rechazo de injerto y enfermedades de injerto frente a huésped. Las enfermedades infecciosas incluyen SIDA (infección por el VIH), hepatitis A, B, C, D y E, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones protozoicas e infecciones parasíticas.
[0082] “Enfermedad autoinmunitaria” se usa en este documento en un amplio sentido general para referirse a trastornos o afecciones en mamíferos en los que la destrucción de tejido normal o sano se produce a partir de respuestas inmunitarias humorales o celulares del mamífero individual a sus propios constituyentes de tejido. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso, tiroiditis, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes autoinmunitaria y enfermedad inflamatoria del intestino (EII).
[0083] El término “marcado” cuando se usa en este documento se refiere a una molécula quimérica que comprende un anticuerpo o polipéptido fusionado con un “polipéptido etiqueta”. El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo o para proporcionar alguna otra función, tal como la capacidad para oligomerizar (por ejemplo, tal como se produce con péptidos que tienen dominios de cremallera de leucina), aunque es suficientemente corto de forma que generalmente no interfiere con la actividad del anticuerpo o polipéptido. El polipéptido etiqueta también es casi preferentemente único de manera que un anticuerpo específico de etiqueta no reacciona sustancialmente de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente al menos seis residuos de aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 residuos).
[0084] El término “ión metálico divalente” se refiere a un ión metálico que tiene dos cargas positivas. Ejemplos de iones metálicos divalentes incluyen, pero no se limitan a, zinc, cobalto, níquel, cadmio, magnesio y manganeso. Formas particulares de dichos metales que pueden emplearse incluyen formas de sal (por ejemplo, formas de sal farmacéuticamente aceptable), tales como formas de cloruro, acetato, carbonato, citrato y sulfato de los iones metálicos divalentes anteriormente mencionados. Opcionalmente, un ión metálico divalente para uso en la presente invención es zinc y preferentemente la forma de sal, sulfato de zinc o cloruro de zinc.
[0085] “Aislado” cuando se usa para describir los diversos péptidos o proteínas divulgados en este documento significa péptido o proteína que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que normalmente podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos para el péptido o proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el péptido o proteína se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos del extremo N o internos usando un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata, o (3) hasta homogeneidad por técnicas de espectroscopía de masa o de mapeo de péptidos. El material aislado incluye péptido o proteína in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente de su entorno natural no estará presente. Generalmente, sin embargo, el péptido o proteína aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
[0086] “Identidad de secuencias de aminoácidos en porcentaje (%)” con respecto a las secuencias identificadas en este documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr la identidad de secuencias en un porcentaje máximo, y sin considerar sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencias. El alineamiento para determinar la identidad de secuencias de aminoácidos en porcentaje puede lograrse de diversas formas que están dentro de las enseñanzas en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento que incluye asignar algoritmos necesarios para lograr el máximo alineamiento con respecto a las secuencias de longitud completa que se comparan. Para los fines en este documento, los valores de identidad de aminoácidos en porcentaje pueden obtenerse usando el programa informático de comparación de secuencias, ALIGN-2, que era propiedad de Genentech, Inc. y el código fuente que ha sido presentado con la documentación de usuario en la oficina de derechos de autor de EE.UU., Washington, DC, 20559, registrado bajo el nº de registro de derechos de autor de EE.UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible por Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos los parámetros de comparación de secuencias están fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.
[0087] La “rigurosidad” de reacciones de hibridación puede ser fácilmente determinada por un experto en la materia, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para la hibridación apropiada, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para la re-hibridación cuando las cadenas complementarias están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de identidad deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas mayores tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas menores menos. Para detalles adicionales y la explicación de la rigurosidad de reacciones de hibridación véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
[0088] “Condiciones de alta rigurosidad”, como se define en este documento, se identifican por aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado; cloruro sódico 0,015 M / citrato de sodio 0,0015 M / dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante; 50% (v/v) de formamida con albúmina de suero bovino al 0,1% / Ficoll al 0,1% / polivinilpirrolidona al 0,1% de / tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x disolución Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
[0089] “Condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse como se describe por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen incubación durante la noche a 37ºC en una disolución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 3750ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para adaptar factores tales como la longitud de la sonda y similares.
[0090] El término “cebador” o “cebadores” se refiere a secuencias de oligonucleótidos que se hibridan con un polinucleótido diana de ARN o ADN complementario y sirven de puntos de partida para la síntesis por etapas de un polinucleótido a partir de mononucleótidos por la acción de una nucleotidiltransferasa tal como se produce, por ejemplo, en una reacción en cadena de la polimerasa.
[0091] El término “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. La células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
[0092] El ácido nucleico está “operativamente ligado” cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está operativamente ligado a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está situado de forma que facilite la traducción. Generalmente, “operativamente ligado” significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La ligación se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se usan según la práctica convencional.
[0093] La “citotoxicidad celular mediada por anticuerpos” y “ADCC” se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos espontáneos (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido sobre una célula diana y posteriormente producen la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar ADCC, los linfocitos NK, sólo expresan FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de EE.UU. nº 5.500.362 ó 5.821.337. Células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre de periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos espontáneos (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes y col. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).
[0094] Las “células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcγRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre de periférica (PBMC), linfocitos citolíticos espontáneos (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose PBMC y linfocitos NK.
[0095] Los términos “receptor Fc” y “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, que incluyen variantes alélicas y formas alternativamente cortadas y empalmadas de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activador”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”) que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activador FcγRIIA contiene un motivo de activación de inmunorreceptores basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptores basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcR que incluyen aquellos que van a identificarse en el futuro están englobados por el término “FcR” en este documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim y col., J. Immunol., 24:249 (1994)). Los FcR en este documento incluyen polimorfismos tales como el dimorfismo genético en el gen que codifica FcγRIIIa produciendo tanto una fenilalanina (F) como una valina (V) en la posición de aminoácido 158, localizada en la región del receptor que se une a IgG1. Se ha mostrado que la valina homocigótica FcγRIIIa (FcγRIIIa-158V) tiene una mayor afinidad por IgG1 humana y median en el aumento de ADCC in vitro con respecto a la fenilalanina homocigótica FcγRIIIa (FcγRIIIa-158F) o receptores heterocigóticos (FcγRIIIa-158F/V).
[0096] La “citotoxicidad dependiente de complemento” o “CDC” se refiere a la capacidad de una molécula de lisar una diana en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejado con un antígeno consanguíneo. Para evaluar la activación del complemento puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
II. PROCEDIMIENTOS TÍPICOS Y MATERIALES DE LA INVENCIÓN
[0097] Los procedimientos y ensayos descritos en este documento están dirigidos al examen de la expresión de uno
o más biomarcadores en una muestra de tejido o de células de mamífero, donde la determinación de esa expresión de uno o más de dichos biomarcadores es predictiva o indicativa de si la muestra de tejido o de células será sensible
o no a agentes inductores de apoptosis tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas anti-DR5. Los procedimientos y ensayos incluyen aquellos que examinan la expresión de biomarcadores tales como ciertas fucosiltransferasas, en particular fucosiltransferasa 3 (FUT3) y/o fucosiltransferasa 6 (FUT6), además de los antígenos Sialyl Lewis A y/o X.
[0098] Tal como se ha descrito anteriormente, hay algunas poblaciones de tipos de células humanas enfermas (tales como ciertas poblaciones de células cancerosas) que son resistentes a la inducción de apoptosis. Por tanto, se cree que los procedimientos y ensayos desxritos pueden proporcionar medios convenientes, eficientes y potencialmente rentables para obtener datos e información útil en la evaluación de terapias apropiadas o eficaces para tratar pacientes. Por ejemplo, en un paciente que ha sido diagnosticado con cáncer o una afección relacionada con la inmunidad podría realizarse una biopsia para obtener una muestra de tejido o de células, y la muestra podría examinarse a modo de diversos ensayos in vitro para determinar si las células del paciente serían sensibles o no a un agente terapéutico, tal como Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte.
[0099] La invención proporciona procedimientos para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o de células de mamífero (tal como una célula cancerosa) a Apo2L/TRAIL o un anticuerpo agonista de receptores de muerte. En los procedimientos, se examina una muestra de tejido o de células para la expresión de uno o más biomarcadores. Los procedimientos pueden realizarse en una variedad de formas de ensayo que incluyen ensayos que detectan la expresión de ARNm, ensayos enzimáticos que detectan la presencia de actividad enzimática y ensayos inmunohistoquímicos. La determinación de la expresión de dichos biomarcadores en dichos tejidos o células será predictiva de que dichos tejidos o células serán sensibles a la actividad inductora de apoptosis de Apo2L/TRAIL y/o anticuerpo de receptores de muerte. Los solicitantes encontraron sorprendentemente que la expresión de dichos biomarcadores particulares se correlaciona con la sensibilidad de dichos tejidos y células a agentes inductores de apoptosis, tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas de receptores de muerte.
[0100] Tal como se describe más adelante, la expresión de diversos biomarcadores en una muestra puede analizarse mediante varias metodologías, muchas de las cuales se conocen en la técnica y son entendidas por el experto que incluyen, pero no se limitan a, análisis inmunohistoquímico y/o Western, ensayos cuantitativos basados en sangre (como, por ejemplo, ELISA en suero) (para examinar, por ejemplo, niveles de expresión de proteínas), ensayos enzimáticos de actividad bioquímica, hibridación in situ, análisis Northern y/o análisis por PCR de ARNm y análisis de Southern genómico (para examinar, por ejemplo, la deleción o amplificación de genes), además de uno cualquiera de la amplia variedad de ensayos que pueden realizarse por análisis de matrices de genes y/o tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de genes y productos génicos se encuentran, por ejemplo, en Ausubel y col. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (transferencia Northern), 4 (transferencia Southern), 15 (inmunotransferencia) y 18 (análisis por PCR).
[0101] Los protocolos siguientes que se refieren a la detección de biomarcadores particulares, tales como fucosiltransferasa 3 (FUT3), fucosiltransferasa 6 (FUT6), Sialyl Lewis A, y Sialyl Lewis X, en una muestra se proporcionan más adelante para fines ilustrativos.
[0102] Los procedimientos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o prueban la presencia de proteínas Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X en una muestra de tejido o de células de mamífero. Puede emplearse una variedad de procedimientos para detectar proteínas relacionadas con Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X e incluyen, por ejemplo, análisis inmunohistoquímico, inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA, citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) y similares. Por ejemplo, un procedimiento opcional de detección de la expresión de proteína relacionada con Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X en un tejido o muestra comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo de Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X, un fragmento reactivo con Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X del mismo o una proteína recombinante que contiene una región de unión a antígeno de un anticuerpo de Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X; y a continuación detectar la unión de la proteína relacionada con Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X en la muestra.
[0103] En realizaciones particulares de la invención, la expresión de proteínas de Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X en una muestra se examina usando protocolos de inmunohistoquímica y tinción. Se ha observado que la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido es un procedimiento fiable de evaluación o detección de la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas de inmunohistoquímica (“IHC”) utilizan un anticuerpo para la sonda y visualizan antígenos celulares in situ, generalmente por procedimientos cromogénicos o fluorescentes.
[0104] Para la preparación de muestras puede usarse una muestra de tejido o de células de un mamífero (normalmente un paciente humano). Ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, células cancerosas tales como células de cáncer de colon, mama, próstata, ovario, pulmón, estómago, páncreas, linfoma y leucemia. La muestra puede obtenerse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, extirpación quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una realización, la muestra se fija y se incorpora en parafina o similares.
[0105] La muestra de tejido puede fijarse (es decir, conservarse) por metodología convencional (véase, por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, 3ª edición (1960) Lee
G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, Nueva York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Un experto en la materia entenderá que la elección de un fijador se determina con el fin de que la muestra va a teñirse histológicamente o analizarse de otro modo. Un experto en la materia también entenderá que la duración de la fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y el fijador usado. A modo de ejemplo, para fijar una muestra puede usarse formalina tamponada neutra, Bouin o paraformaldehído.
[0106] Generalmente, la muestra se fija primero y a continuación se deshidrata mediante una serie ascendente de alcoholes, se infiltra y se incorpora en parafina u otros medios de seccionamiento de manera que la muestra de tejido pueda seccionarse. Alternativamente, el tejido puede seccionarse y fijarse las secciones obtenidas. A modo de ejemplo, la muestra de tejido puede incorporarse y procesarse en parafina por metodología convencional (véase por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). Ejemplos de parafina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Una vez que se incorpora la muestra de tejido, la muestra puede seccionarse por un microtomo o similares (véase por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). A modo de ejemplo de este procedimiento, las secciones pueden oscilar de aproximadamente tres micrómetros a aproximadamente cinco micrómetros de espesor. Una vez seccionada, las secciones pueden unirse a portaobjetos por varios procedimientos convencionales. Ejemplos de adhesivos a portaobjetos incluyen, pero no se limitan a, silano, gelatina, poli-L-lisina y similares. A modo de ejemplo, las secciones incorporadas en parafina pueden unirse a portaobjetos positivamente cargados y/o portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina.
[0107] Si la parafina se ha usado como material de incorporación, las secciones de tejido en general se desparafinan y se rehidratan en agua. Las secciones de tejido pueden desparafinarse por varias metodologías estándar convencionales. Por ejemplo, pueden usarse xilenos y una serie gradualmente descendente de alcoholes (véase por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). Alternativamente pueden usarse agentes no orgánicos desparafinantes comercialmente disponibles tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).
[0108] Opcionalmente, posterior a la preparación de muestras, puede analizarse una sección de tejido usando IHC. La IHC puede realizarse en combinación con técnicas adicionales, tales como tinción morfológica y/o hibridación por fluorescencia in situ. Existen dos procedimientos generales de IHC; ensayos directos e indirectos. Según el primer ensayo, la unión de anticuerpo al antígeno diana (por ejemplo, Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X) se determina directamente. Este ensayo directo usa un reactivo marcado tal como un marcador fluorescente o un anticuerpo primario marcado con enzima que puede visualizarse sin más interacción de anticuerpos. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario sin conjugar se une al antígeno y a continuación un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. Si el anticuerpo secundario está conjugado con un marcador enzimático, se añade un sustrato cromogénico o fluorogénico para proporcionar la visualización del antígeno. La amplificación de señales se produce debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos en el anticuerpo primario.
[0109] Los anticuerpos primarios y/o secundarios usados para la inmunohistoquímica normalmente se marcarán con un grupo detectable. Existen numerosos marcadores que pueden agruparse en general en las siguientes categorías:
(a)
Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, volúmenes 1 y 2, Coligen y col.; Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991), por ejemplo, y la radiactividad puede medirse usando recuento por centelleo.
(b)
Partículas de oro coloidal.
(c)
Marcadores fluorescentes que incluyen, pero no se limitan a, quelatos de tierras raras (quelatos de europio), Texas Red, rodamina, fluoresceína, dansilo, Lissamine, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina o fluoróforos comercialmente disponible, tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de uno cualquiera o más de los anteriores. Los marcadores fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo usando, por ejemplo, las técnicas desveladas en Current Protocols in Immunology, arriba. La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro.
(d)
Existen diversos marcadores enzima-sustrato y la patente de EE.UU. nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunas de éstas. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente mediante una reacción química y puede a continuación emitir luz que puede medirse (usando, por ejemplo, un quimioluminómetro) o donar energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; la patente de EE.UU. nº 4.737.456), luciferina, 2,3dihidroftalazindionas, malato-deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido-oxidasas (por ejemplo, glucosaoxidasa, galactosa-oxidasa y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina-oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan y col., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay en Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nueva York, 73:147-166 (1981).
[0110] Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i)
Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno-peroxidasa como sustrato, donde la hidrógenoperoxidasa oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'tetrametilbencidina (TMB));
(ii)
fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenilfosfato como sustrato cromogénico; y
5
15
25
35
45
55
(iii) β-D-galactosidasa (β-D-Gal) con sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-β-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidasa).
[0111] Existen numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato para aquellos expertos en la materia. Para una revisión general de éstas véanse las patentes de EE.UU. nº 4.275.149 y 4.318.980. Algunas veces, el marcador está indirectamente conjugado con el anticuerpo. El experto será consciente de diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro amplias categorías de marcadores mencionados anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a avidina y, por tanto, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno. Por tanto, puede lograrse la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
[0112] Aparte de los procedimientos de preparación de muestras descritos anteriormente, puede desearse otro tratamiento de la sección de tejido antes de, durante o tras la IHC, por ejemplo, pueden llevarse a cabo procedimientos de recuperación de epítopos, tales como calentamiento de la muestra de tejido en tampón citrato (véase, por ejemplo, Leong y col. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).
[0113] Tras una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido se expone a anticuerpo primario durante un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones adecuadas de forma que el anticuerpo primario se une al antígeno de proteína diana en la muestra de tejido. Pueden determinarse las condiciones apropiadas para lograr esto mediante experimentación rutinaria. El grado de unión del anticuerpo a la muestra se determina usando uno cualquiera de los marcadores detectables descritos anteriormente. Preferentemente, el marcador es un marcador enzimático (por ejemplo, HRPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico, tal como el cromógeno 3,3'-diaminobencidina. Preferentemente, el marcador enzimático se conjuga con el anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo de cabra anti-conejo).
[0114] Opcionalmente, los anticuerpos empleados en el análisis de IHC para detectar la expresión de Sialyl Lewis A o anti-Sialyl Lewis X son anticuerpos anti-Sialyl Lewis A y anti-Sialyl Lewis X, respectivamente. Opcionalmente, el anticuerpo anti-Sialyl Lewis A y anti-Sialyl Lewis X es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos Anti-Sialyl Lewis A y anti-Sialyl Lewis X están fácilmente disponibles en la técnica, incluyendo a partir de diversas fuentes comerciales.
[0115] Por tanto, las muestras preparadas pueden montarse y cubrirse con cubreobjetos. A continuación, se determina la evaluación del portaobjetos, por ejemplo, usando un microscopio, y pueden emplearse criterios de intensidad de tinción usados normalmente en la técnica. Si el antígeno es la proteína Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X, los criterios de intensidad de tinción pueden evaluarse del siguiente modo:
TABLA 1
Patrón de tinción
Puntuación
No se observa tinción en las células
0
Se detecta tinción débil/apenas perceptible en más del 10% de las células.
1+
Se observa tinción de débil a moderada en más del 10% de las células.
2+
Se observa tinción de moderada a fuerte en más del 10% de las células.
3+
[0116] Normalmente, una puntuación del patrón de tinción de aproximadamente 2+ o superior en dicho ensayo de IHC se cree que es predictiva o indicativa de la sensibilidad de una célula de mamífero (tal como una célula cancerosa de mamífero) a Apo2L/TRAIL o un anticuerpo agonista de receptores de muerte.
[0117] En procedimientos alternativos, la muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico para dicho biomarcador en condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo-biomarcador y a continuación detectar dicho complejo. La presencia del biomarcador puede llevarse a cabo de varias formas, tales como por procedimientos de transferencia Western y ELISA, para analizar una amplia variedad de tejidos y muestras, que incluyen plasma o suero. Existe un amplio intervalo de técnicas de inmunoensayo que usan dicho formato de ensayo, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.016.043, 4.424.279 y 4.018.653. Éstas incluyen tanto ensayos de un único sitio y de dos sitios como tipo “sándwich” de los tipos no competitivos, además de los ensayos de unión competitiva tradicionales. Estos ensayos también incluyen la unión directa de un anticuerpo marcado a un biomarcador diana.
[0118] Los ensayos de tipo sándwich están entre los ensayos más útiles y comúnmente usados. Existen varias variaciones de la técnica de ensayos de tipo sándwich, y todas pretenden estar englobadas por la presente invención. Brevemente, en un ensayo directo típico, un anticuerpo sin marcar se inmoviliza sobre un sustrato sólido, y la muestra que va a probarse se pone en contacto con la molécula unida. A continuación, después de un periodo de incubación adecuado, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un inmunocomplejo, se añade un segundo anticuerpo específico para el antígeno, marcado con una molécula indicadora que puede producir una señal detectable, y se incuba dejando el tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo-anticuerpo marcado con antígeno. Cualquier material sin reaccionar se lava, y la presencia del antígeno se determina mediante la observación de una señal producida por la molécula indicadora. Los resultados pueden ser cualitativos, por simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse comparando con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de biomarcador.
[0119] Las variaciones en el ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo en el que tanto la muestra como el anticuerpo marcado se añaden simultáneamente al anticuerpo unido. Estas técnicas son muy conocidas para aquellos expertos en la materia, que incluyen cualquier variación mínima tal como será fácilmente evidente. En un ensayo de tipo sándwich directo típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad por el biomarcador está tanto covalentemente como pasivamente unido a una superficie sólida. La superficie sólida es normalmente vidrio o un polímero, donde los polímeros más comúnmente usados son celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos de microplacas o cualquier otra superficie adecuada para realizar un inmunoensayo. Los procedimientos de unión son muy conocidos en la técnica y generalmente consisten en reticulación, unión covalente o adsorción física, el complejo polímeroanticuerpo se lava en la preparación para la muestra de prueba. A continuación, se añade una alícuota de la muestra que va a probarse al complejo en fase sólida y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-40 minutos o durante la noche si es más conveniente) y bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, de temperatura ambiente a 40ºC, tal como entre 25ºC y 32ºC, ambos incluidos) para permitir la unión de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Tras el periodo de incubación, la fase sólida de la subunidad de anticuerpo se lava y se seca y se incuba con un segundo anticuerpo específico para una parte del biomarcador. El segundo anticuerpo se une a una molécula indicadora que se usa para indicar la unión del segundo anticuerpo al marcador molecular.
[0120] Un procedimiento alternativo implica inmovilizar los biomarcadores diana en la muestra y a continuación exponer la diana inmovilizada a un anticuerpo específico que puede o no marcarse con una molécula informadora. Dependiendo de la cantidad de diana y la intensidad de la señal de la molécula informadora, una diana unida puede ser detectable mediante marcaje directo con el anticuerpo. Alternativamente, se expone un segundo anticuerpo marcado, específico para el primer anticuerpo, al complejo diana-primer anticuerpo para formar un complejo terciario diana-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta mediante la señal emitida por la molécula informadora. Por “molécula informadora”, como se usa en el presente documento, indica una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección del anticuerpo unido a antígeno. Las moléculas informadoras más habitualmente usadas en este tipo de ensayo son tanto enzimas, fluoróforos como moléculas que contienen radionucleidos (es decir, radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes.
[0121] En el caso de un inmunoensayo de enzima, se conjuga una enzima con el segundo anticuerpo, generalmente mediante glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, tal como será fácilmente reconocido, existe una amplia variedad de técnicas de conjugación diferentes que están fácilmente disponibles para el experto. Las enzimas comúnmente usadas incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa-oxidasa, glucosa-galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que van a usarse con las enzimas específicas se eligen generalmente para la producción, tras la hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogénicos que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogénicos indicados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo marcado con enzima se añade al primer complejo anticuerpo-marcador molecular, se deja que se unan, y a continuación se lava el reactivo en exceso. A continuación, se añade al complejo de anticuerpoantígeno-anticuerpo una disolución que contiene el sustrato apropiado. El sustrato reaccionará con la enzima ligada al segundo anticuerpo dando una señal visual cualitativa que puede cuantificarse adicionalmente, normalmente espectrofotométricamente, para dar una indicación de la cantidad de biomarcador que estaba presente en la muestra. Alternativamente, los compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Si se activa por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía de la luz, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido de emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio óptico. Como en el EIA, se deja que el anticuerpo marcado fluorescente se una al primer complejo anticuerpo-marcador molecular. Después de eliminarse por lavado el reactivo sin unir, el complejo terciario restante se expone continuación a luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. Las técnicas de inmunofluorescencia y EIA están ambas muy bien establecidas en la técnica. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas informadoras tales como moléculas de radioisótopos, quimioluminiscentes o bioluminiscentes.
[0122] Se contempla que las técnicas anteriormente descritas también puedan emplearse para detectar la expresión de polipéptidos de FUT3 o FUT 6.
[0123] Los procedimientos de la invención incluyen adicionalmente protocolos que examinan la presencia y/o expresión de ARNm, tales como ARNm de FUT3 y/o FUT6 en una muestra de tejido o de células. Los procedimientos para la evaluación de ARNm en células son muy conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementario (tales como hibridación in situ usando ribosondas de FUT3 y/o FUT6 marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para FUT3 y/o FUT6, y otros procedimientos de detección de tipo amplificación tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares).
[0124] Las muestras de tejido o de células de mamíferos pueden analizarse convenientemente para, por ejemplo, ARNm de FUT3 y/o FUT6 usando transferencia Northern, puntual o análisis de PCR. Por ejemplo, los ensayos de RT-PCR, tales como los ensayos de PCR cuantitativa, son muy conocidos en la técnica. En una realización ilustrativa de la invención, un procedimiento para detectar un ARNm de FUT3 y/o FUT6 en una muestra biológica comprende producir ADNc de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc así producido usando un polinucleótido de FUT3 y/o FUT6 como cebadores de sentido directo y de sentido contrario para amplificar ADNc de FUT3 y/o FUT6 en el mismo; y detectar la presencia del ADNc de FUT3 y/o FUT6 amplificado. Además, dichos procedimientos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de ARNm de FUT3 y/o FUT6 en una muestra biológica (por ejemplo, examinando simultáneamente los niveles en la secuencia de ARNm de control comparativa de un gen “de mantenimiento” tal como un miembro de la familia de actina). Opcionalmente puede determinarse la secuencia del ADNc de FUT3 y/o FUT6 amplificado.
[0125] Las realizaciones de material de este aspecto de la invención incluyen cebadores de FUT3 y/o FUT6 y pares de cebadores que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que se hibridan selectivamente o específicamente con moléculas de ácidos nucleicos de la invención o con cualquier parte de los mismos. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metálico o enzima. Dichas sondas y cebadores pueden usarse para detectar la presencia de polinucleótidos de FUT3 y/o FUT6 en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa proteínas de FUT3 y/o FUT6. Como entenderá el experto, pueden prepararse muchísimos cebadores y sondas diferentes basándose en las secuencias proporcionadas en este documento y usadas eficazmente para amplificar, clonar y/o determinar la presencia y/o niveles de ARNm de FUT3 y/o FUT6.
[0126] Los procedimientos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan ARNm, tales como FUT3 y FUT6 u otros ARNm de fucosiltransferasa, en una muestra de tejido o de células, mediante tecnologías de micromatrices. Usando micromatrices de ácido nucleico, se transcriben inversamente muestras de ARNm de prueba y de control de muestras de tejido de prueba y de control y se marcan para generar sondas de ADNc. Las sondas se hibridan a continuación con una matriz de ácidos nucleicos inmovilizada sobre un soporte sólido. La matriz está configurada de forma que se conozca la secuencia y posición de cada miembro de la matriz. Por ejemplo, una selección de genes que tiene posibilidad de expresarse en ciertos estados de enfermedad puede disponerse en matriz sobre un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro de matriz particular indica que la muestra de la que se derivó la sonda expresa ese gen. El análisis de expresión génica diferencial de tejido de enfermedad puede proporcionar valiosa información. La tecnología de micromatrices utiliza técnicas de hibridación de ácidos nucleicos y tecnología de computación para evaluar la expresión del perfil de ARNm de miles de genes dentro de un único experimento (véase, por ejemplo, documento WO 01/75166 publicado el 11 de octubre de 2001; (véanse, por ejemplo, el documento US 5.700.637, la patente de EE.UU. 5.445.934 y la patente de EE.UU. 5.807.522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. y col., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999) para una discusión de la fabricación de matrices). Las micromatrices de ADN son matrices en miniatura que contienen fragmentos génicos que se sintetizan directamente o se aplican en puntos sobre vidrio u otros sustratos. Normalmente se representan miles de genes en una única matriz. Un experimento de micromatrices típico implica las siguientes etapas: 1. preparación de diana marcada fluorescentemente de ARN aislado de la muestra, 2. hibridación de la diana marcada con la micromatriz, 3. lavado, tinción y barrido de la matriz,
4. análisis de la imagen barrida y 5. generación de perfiles de expresión génica. Actualmente se están usando dos tipos principales de micromatrices de ADN: matrices de oligonucleótidos (normalmente 25 a 70 meros) y matrices de expresión génica que contienen productos de PCR preparados a partir de ADNc. En la formación de una matriz, los oligonucleótidos pueden ser tanto prefabricados como aplicados por puntos a la superficie o sintetizarse directamente sobre la superficie (in situ).
[0127] El sistema Affymetrix GeneChip® es un sistema de micromatrices comercialmente disponible que comprende matrices fabricadas mediante síntesis directa de oligonucleótidos sobre una superficie de vidrio. Matrices de sondas/genes: los oligonucleótidos, normalmente de 25 unidades, se sintetizan directamente sobre una oblea de vidrio mediante una combinación de fotolitografía basada en semiconductores y tecnologías químicas de síntesis en fase sólida. Cada matriz contiene hasta 400.000 oligonucleótidos diferentes y cada oligonucleótido está presente en millones de copias. Como las sondas de oligonucleótidos se sintetizan en localizaciones conocidas sobre la matriz, los patrones de hibridación y las intensidades de señal pueden interpretarse en términos de identidad génica y niveles relativos de expresión por el software Affymetrix Microarray Suite. Cada gen está representado sobre la matriz por una serie de sondas de oligonucleótidos diferentes. Cada par de sondas consiste en un oligonucleótido de apareamiento perfecto y un oligonucleótido de desapareamiento. La sonda de apareamiento perfecto tiene una secuencia exactamente complementaria al gen particular y, por tanto, mide la expresión del gen. La sonda de desapareamiento se diferencia de la sonda de apareamiento perfecto en una única sustitución de bases en la posición de bases central, alterando la unión del transcrito del gen diana. Esto ayuda a determinar la hibridación de base y no específica que contribuye a la señal medida para el oligonucleótido de apareamiento perfecto. El software Microarray Suite resta las intensidades de hibridación de las sondas de desapareamiento de aquellas de las sondas de apareamiento perfecto para determinar el valor de intensidad absoluto o específico para cada conjunto de sondas. Las sondas se eligen basándose en la actual información de Genbank y otros repositorios de nucleótidos. Se cree que las secuencias reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Se usa un GeneChip Hybridization Oven para llevar a cabo la hibridación de hasta 64 matrices a la vez. La estación hidráulica realiza el lavado y la tinción de las matrices de sondas. Está completamente automatizada y contiene cuatro módulos, conteniendo cada módulo una matriz de sondas. Cada módulo está controlado independientemente por el software Microarray Suite usando protocolos hidráulicos previamente programados. El escáner es un escáner de fluorescencia láser confocal que mide la intensidad de fluorescencia emitida por el ARNc marcado unido a las matrices de sondas. El terminal de trabajo informático con el software Microarray Suite controla la estación hidráulica y el escáner. El software Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones hidráulicas usando protocolos de hibridación previamente programados, de lavado y de tinción para la matriz de sondas. El software adquiere y convierte los datos de intensidad de hibridación en una llamada de presencia/ausencia para cada gen usando algoritmos apropiados. Finalmente, el software detecta cambios en la expresión génica entre experimentos por análisis de comparación y formatea las salidas en archivos .txt que pueden usarse con otros programas informáticos para el análisis de datos adicional.
[0128] La expresión de un biomarcador seleccionado también puede evaluarse examinando la deleción génica o amplificación génica. La deleción o amplificación génica puede medirse mediante una cualquiera de una amplia variedad de protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo, por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ (por ejemplo, FISH) usando una sonda apropiadamente marcada, procedimientos citogenéticos o hibridación genómica comparativa (CGH) usando una sonda apropiadamente marcada. A modo de ejemplo, estos procedimientos pueden emplearse para detectar la deleción de la amplificación de los genes FUT3 y/o FUT6.
[0129] Adicionalmente puede examinarse el estado de metilación del biomarcador, tal como el gen FUT3 y/o FUT6, en una muestra de tejido o de células. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de islas CpG en las regiones reguladoras de 5' del gen producida frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas puede producir una expresión alterada de diversos genes. Son muy conocidos en la técnica una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, pueden utilizarse, en soluciones de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de islas CpG. Además, la MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN por bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas sin metilar en uracilo), seguido de amplificación usando cebadores específicos para ADN metilado frente a sin metilar. Los protocolos que implican la interferencia de metilación también pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, unidad 12, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995; De Marzo y col., Am. J. Patol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536); y Lethe y col., Int.
J. Cancer 76 (6): 903-908 (1998).
[0130] La expresión de un biomarcador seleccionado en una muestra de tejido o de células también puede examinarse mediante ensayos funcionales o basados en actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, pueden realizarse ensayos conocidos en la técnica para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática determinada en la muestra de tejido o de células.
[0131] En los procedimientos de la presente invención se contempla que la muestra de tejido o de células también pueda examinarse para la expresión de Apo2L/TRAIL o receptores en la muestra que se unen a Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte. Como se ha descrito anteriormente y en la técnica, actualmente se cree que Apo2L/TRAIL se une a al menos cinco receptores diferentes: DR4, DR5, DcR1, DcR2 y OPG. Usando procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en este documento, la expresión de Apo2L/TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2 y/o OPG puede detectarse al nivel de ARNm y al nivel de proteínas. Como se muestra en las Figuras 10 y 11, los datos sugieren que examinar la muestra de tejido o de células para la expresión de receptores DcR1 y/o DcR2 puede facilitar adicionalmente información de si la muestra de tejido o de células será sensible o no tanto a Apo2L/TRAIL como a anticuerpo de receptores de muerte. A modo de ejemplo, las técnicas de IHC descritas anteriormente pueden emplearse para detectar la presencia de una o más de dichas moléculas en la muestra. Se contempla que en procedimientos en los que un tejido o muestra está siendo examinado no sólo para la presencia de un marcador de antígeno de FUT o Lewis, sino también para la presencia, por ejemplo, de DR4, DR5 o DcR1, puedan prepararse portaobjetos separados a partir del mismo tejido o muestra, y probar cada portaobjetos con un reactivo específico para cada biomarcador o receptor específico. Alternativamente, puede prepararse un único portaobjetos a partir de la muestra de tejido o de células, y los anticuerpos dirigidos contra cada biomarcador o receptor pueden usarse en conexión con un protocolo de tinción multicolor para permitir la visualización y detección de los biomarcadores o receptores respectivos.
[0132] Posteriormente a la determinación de que la muestra de tejido o de células expresa uno o más de los biomarcadores indicando que la muestra de tejido o de células será sensible a la actividad de Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte, se contempla que una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte pueda administrarse al mamífero para tratar un trastorno, tal como cáncer o trastorno relacionado con la inmunidad que está afectando al mamífero. El médico experto puede realizar el diagnóstico en mamíferos de las diversas afecciones patológicas descritas en este documento. Las técnicas de diagnóstico disponibles en la técnica permiten, por ejemplo, el diagnóstico o la detección de cáncer o enfermedad relacionada con la inmunidad en un mamífero. Por ejemplo, los cánceres pueden identificarse mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, palpación, análisis de sangre, rayos X, RMN y similares. Las enfermedades relacionadas con la inmunidad también pueden identificarse fácilmente.
[0133] Apo2L/TRAIL o el anticuerpo de receptores de muerte puede administrarse según procedimientos conocidos tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalaciones. Opcionalmente, la administración puede realizarse mediante infusión por minibombas usando diversos dispositivos comercialmente disponibles.
[0134] Las dosificaciones eficaces y los programas para administrar Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte pueden determinarse empíricamente, y el hacer tales determinaciones está dentro de la capacidad de los expertos en la materia. Pueden emplearse dosificaciones únicas o múltiples. Actualmente se cree que una dosificación o cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL usada sola puede variar de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más por día. El escalado entre especies de las dosificaciones puede realizarse de un modo conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en Mordenti y col., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991).
[0135] Cuando se utiliza la administración in vivo de Apo2L/TRAIL, las cantidades de dosificación normal pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferentemente de aproximadamente 1 µg/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. La orientación de las dosificaciones particulares y los procedimientos de administración se proporciona en la bibliografía; véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que las diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administración que elige como diana, por ejemplo, un órgano o tejido puede necesitar la administración de un modo diferente al de otro órgano o tejido.
[0136] Se contempla que se pueden utilizar terapias adicionales en los procedimientos. La terapia o terapias pueden incluir, pero no se limitan a, administración de radioterapia, citoquina(s), agente(s) inhibidor(es) del crecimiento, agente(s) quimioterapéutico(s), agente(s) citotóxico(s), inhibidores de tirosina-cinasas, inhibidores de farnesil-transferasa ras, inhibidores de la angiogénesis e inhibidores de cinasas dependientes de ciclinas que se conocen en la técnica y se definen adicionalmente con particularidad anteriormente. Se contempla que tales otras terapias puedan emplearse como un agente separado de Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte. Además, terapias basadas en anticuerpos terapéuticos que eligen como diana antígenos tumorales, tales como Rituxan™ o Herceptin™, además de anticuerpos antiangiogénicos tales como anti-VEGF.
[0137] La preparación y los programas de dosificación de agentes quimioterapéuticos pueden usarse según las instrucciones del fabricante o tal como se determina empíricamente por el médico experto. La preparación y los programas de dosificación para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte, o puede administrarse simultáneamente con el mismo.
[0138] También puede desearse administrar anticuerpos contra otros antígenos, tales como anticuerpos que se unen a CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, factor endotelial vascular (VEGF), u otros miembros de la familia de TNFR (tales como OPG, TNFR1, TNFR2, GITR, Apo-3, TACI, BCMA, BR3). Alternativamente, o adicionalmente, dos o más anticuerpos que se unen al mismo antígeno o a dos o más antígenos diferentes descritos en este documento pueden coadministrarse al paciente. Algunas veces también puede ser beneficioso administrar una o más citoquinas al paciente. Tras la administración, pueden analizarse las células tratadas in vitro. Si ha habido tratamiento in vivo, un mamífero tratado puede monitorizarse de diversas formas muy conocidas para el médico experto. Por ejemplo, las células tumorales pueden examinarse patológicamente para ensayar necrosis o el suero puede analizarse para respuestas del sistema inmunitario.
[0139] Para el uso en las aplicaciones descritas o sugeridas anteriormente pueden usarse kits o artículos de fabricación. Dichos kits pueden comprender un medio portador que está compartimentalizado para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios de recipiente, tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada medio de recipiente uno de los elementos separados que van a usarse en el procedimiento. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender una sonda que está marcada de manera detectable o que puede marcarse de manera detectable. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína FUT3 y/o FUT6 o un gen FUT3 y/o FUT6 o mensajero, respectivamente. Si el kit utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede tener recipientes que contienen un nucleótido o nucleótidos para la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos diana y/o un recipiente que comprende un medio informador, tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o estreptavidina unida a una molécula informadora, tal como un marcador enzimática, fluorescente o de radioisótopo.
[0140] El kit comprenderá normalmente el recipiente descrito anteriormente y uno o varios recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario que incluyen tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones para uso. Puede estar presente una etiqueta en el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar indicaciones para su uso tanto in vivo como in vitro, tales como aquellas descritas anteriormente.
[0141] Los kits pueden incluir varios otros componentes, por ejemplo, un recipiente, una etiqueta en dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho recipiente; incluyendo la composición un anticuerpo primario que se une a una secuencia de polipéptidos de FUT3 y/o FUT6, indicando la etiqueta en dicho recipiente que la composición puede usarse para evaluar la presencia de proteínas FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para usar el anticuerpo de FUT3 y/o FUT6 para evaluar la presencia de proteínas FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero. El kit puede comprender adicionalmente un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido y aplicar anticuerpo y sonda a la misma sección de una muestra de tejido. El kit puede incluir tanto un anticuerpo primario como secundario, estando el anticuerpo secundario conjugado con un marcador, por ejemplo, un marcador enzimático.
[0142] Alternativamente, un kit puede comprender un recipiente, una etiqueta en dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho recipiente; incluyendo la composición un polinucleótido que se hibrida con un complemento de polinucleótido de FUT3 y/o FUT6 bajo condiciones rigurosas, indicando la etiqueta en dicho recipiente que la composición puede usarse para evaluar la presencia de FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para usar el polinucleótido de FUT3 y/o FUT6 para evaluar la presencia de ARN
o ADN de FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero.
[0143] Otros componentes opcionales en el kit incluyen uno o más tampones (por ejemplo, tampón de bloqueo, tampón de lavado, tampón de sustrato, etc.), otros reactivos, tales como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que está químicamente alterado por un marcador enzimático, disolución de recuperación de epítopos, muestras de control (controles positivos y/o negativos), portaobjeto(s) de control, etc.
EJEMPLOS
[0144] Adicionalmente se describen y se ilustran diversos aspectos de la invención a modo de los siguientes ejemplos, ninguno de ellos pretende limitar el alcance de la invención.
PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES:
Cultivo celular y líneas celulares
[0145] Las siguientes líneas de células de adenocarcinoma colorrectal humano: HCT-8, COLO 205, HCT 116, SW403, LoVo, SW948, Caco-2, COLO 201, SW1417, DLD-1, CX-1, HCT-15, LS 180, RKO, RKO-AS45-1, SK-CO-1, SW480, SW620, SW837, CL-40, COLO-206F, COLO 320DM, COLO 320HSR, COLO-678, HT-29, KM12, LS1034, SW1116 se obtuvieron del depósito ATCC (Manassas, Virginia), DSMZ (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares), JCRB (banco japonés de recursos celulares) o ECACC (Colección europea de cultivos celulares) y se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mM y HEPES 10 mM.
Ensayos de citotoxicidad
[0146] Se usó el ensayo de MTT (ensayo de proliferación celular no radiactivo CellTiter 96® de Promega), que es un ensayo colorimétrico basado en la capacidad de células viables para reducir una sal de tetrazolio amarilla soluble (MTT) a cristales de formazán azules, para determinar la cantidad de células viables después del tratamiento con Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5. El ensayo de MTT se realizó mediante la adición de una disolución de colorante optimizada previamente mezclada a pocillos de cultivo de una placa de 96 pocillos que contenía diversas concentraciones (0 a 1000 ng/ml) de Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5. Durante una incubación de 4 horas, las células vivas convierten el componente de tetrazolio de la disolución de colorante en un de producto de formazán. A continuación, la disolución de solubilización/parada se añadió a los pocillos de cultivo para solubilizar el producto de formazán, y la absorbancia se registró a 570 nm usando un lector de placas de 96 pocillos (SpectraMax). La lectura de absorbancia a 570 nm es directamente proporcional al número de células normalmente usadas en los ensayos de proliferación. Aunque la absorbancia máxima para el producto de formazán es 570 nm y las disoluciones puras aparecen azules, el color al final del ensayo puede no ser azul y depende de la cantidad de formazán presente con respecto a otros componentes (incluyendo suero, rojo fenol acidificado y MTT sin reducir) en el medio de cultivo.
[0147] Los números de células se optimizaron realizando una valoración de células para producir una señal de ensayo próxima al extremo superior del intervalo lineal del ensayo. Como diferentes tipos de células tienen diferentes niveles de actividad metabólica, esto se hizo para cada línea celular por separado. Para la mayoría de las células tumorales examinadas se usaron de 5.000 células por pocillo a 20.000 células por pocillo.
[0148] A continuación, se muestra una descripción etapa por etapa de los ensayos empleados:
1.
Las células usadas para el bioensayo fueron de cultivos madre.
2.
Determinación del número de células y viabilidad con azul de tripano, y suspensión de las células hasta un número final de 5.000 a 20.000 células por pocillo.
3.
Dispensión de 50 µl de la suspensión de células en una placa de 96 pocillos.
4.
Incubación de las placas a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 durante la noche.
5.
Adición de 50 µl de medio de cultivo que contiene diversas concentraciones que varían de 0 a 1000 ng/ml de Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5 a muestras de la placa de 96 pocillos. Los controles fueron 50 µl de medio de cultivo (sin Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5) y 100 µl de medio de cultivo (sin células). Cada experimento se realizó en un conjunto de pocillos por triplicado y en tres días independientes. El volumen total de los pocillos fue de 100 µl/pocillo.
6.
Incubación de las placas a 37ºC durante 72 horas en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
7.
Adición de 15 µl de disolución de colorante a cada pocillo.
8.
Incubación de las placas a 37ºC durante hasta 4 horas en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
9.
Adición de 100 µl de la disolución de solubilización/parada a cada pocillo.
10.
Incubación de las placas durante la noche a 37ºC durante la noche.
11.
Registro de la absorbancia a 570 nm de longitud de onda usando un lector de placas de 96 pocillos. Se usó una longitud de onda de referencia de 750 nm para reducir el ruido de fondo aportado por los residuos de células, huellas y otra absorbancia no específica.
12.
El promedio de los valores de absorbancia para el control negativo se usó como valor de blanco y se restó de todas las otras lecturas. El promedio de los valores de absorbancia para cada concentración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5 se dividió por el promedio de los valores de absorbancia del control positivo (100% de células viables – sin tratar) para calcular la cantidad de células viables (en %).
13.
Se representó el porcentaje de células viables (eje Y) frente a una concentración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5 (eje X, escala logarítmica) y el valor de CI50 se determinó localizando el valor del eje X (ng/ml) correspondiente al 50% de células viables.
Protocolo de marcado de Affymetrix
[0149] Se tomó una lectura de DO 260/280 para todas las muestras, y las muestras se ejecutaron en el BioAnalyzer. Se usaron 5 µg de ARN total de alta calidad.
A. Síntesis de la primera cadena de ADNc:
1. Hibridación de cebadores
[0150]
DEPC-H2O x µl Mezclar con agitación. Centrifugar rápido. l ARN(5ug) y µl Incubar a 70ºC durante 10 minutos. l Adición (dilución 1:4 de mezcla madre para 5 µg) 1 µl Centrifugar rápido y poner sobre hielo l Cebador T7-(dT)24 1 µl Volumen 1 µl
2. Ajuste de temperatura
[0151]
5X-tampón de 1ª cadena de ADNc 4 µl Añadir 7 µl (de la mezcla que queda) a cada muestra. DTT0,1M 2 µl Mezclar con agitación. Centrifugar rápido. l Mezcla de dNTP 10 mM 1 µIncubar a 42ºC durante 2 minutos. l Volumen 7 µl
3. Síntesis de la primera cadena
[0152]
Añadir 1 µl de SSII RT a cada muestra. SSII RT 1 µl Mezclar pipeteando arriba y abajo -O-con vórtex ligeramente. Centrifugar rápido. Volumen total 20 µL Incubar a 42ºC durante 1 hora. l
B. Síntesis de la segundo cadena de ADNc
[0153]
1.
Colocar los productos de reacción de la primera cadena sobre hielo. Centrifugar brevemente para rebajar la condensación en los laterales del tubo.
2.
Preparar la siguiente mezcla madre de la segunda cadena.
H2O tratada con DEPC 91 µl 5X-tampón de reacción de la 2ª cadena 30 µl Mezcla de dNTP 10 mM 3 µl 10 U/µl de ADN ligasa 1 µl 10 U/µl de ADN-polimerasa I 4 µl 2 U/µl de ARNasa H 1 µl Volumen total 130 µl
3.
Añadir 130 µl de la mezcla madre de la segunda cadena a los 20 µl de ADNc de la primera cadena (volumen final = 150 µl)
4.
Mezclar pipeteando arriba y abajo -O-con agitación ligeramente. Centrifugar rápido.
5.
Incubar a 16ºC durante 2 horas en un baño de agua de refrigeración.
6.
Añadir 2 µl [10 U] de ADN-polimerasa T4. Mezclar pipeteando arriba y abajo -O-con agitación ligeramente. Centrifugar rápido.
7.
Incubar durante 5 minutos a 16ºC.
8.
Añadir 10 µl de EDTA 0,5 M. Agitar ligeramente. Centrifugar rápido.
9.
Avanzar al procedimiento de purificación para ADNc -O-guardar a -20ºC para uso posterior.
[0154] Purificación del ADNc de doble cadena (módulo de purificación de muestras GeneChip)
1.
Añadir 600 µl de tampón de unión a ADNc a 162 µl de la preparación de síntesis de ADNc de doble cadena
final. Mezclar con agitación durante 3 segundos.
2.
Comprobar que el color de la mezcla es amarillo (similar al del tampón de unión a ADNc sin el producto de la reacción de síntesis de ADNc). Si el color de la mezcla es naranja o violeta, añadir 10 µl de acetato sódico 3 M, pH 5,0, y mezclar. El color de la mezcla virará a amarillo.
3.
Aplicar 500 µl de la muestra a la columna de centrifugación para la purificación del ADNc que se encuentra en un tubo de recogida de 2 ml y centrifugar durante 1 minuto a ≥ 8.000 x g (≥ 10.000 rpm). Desechar el flujo continuo como residuo peligroso.
4.
Volver a cargar la columna de centrifugación con el resto de la mezcla (262 µl) y centrifugar como antes. Desechar el flujo continuo como residuo peligroso y desechar el tubo de recogida.
5.
Transferir la columna de centrifugación a un nuevo tubo de recogida de 2 ml (suministrado). Pipetear 750 µl de tampón de lavado de ADNc sobre la columna de centrifugación. Centrifugar durante 1 minuto a ≥ 8.000 x g (≥ 10.000 rpm). Desechar el flujo continuo.
6.
Abrir la tapa de la columna de centrifugación y centrifugar durante 5 minutos a velocidad máxima (≤ 25.000 x g). Colocar las columnas en la centrífuga usando dos cubos. Posicionar las tapas sobre el cubo contiguo de manera que estén orientadas en la dirección opuesta a la rotación, es decir, si la rotación es en la dirección de las agujas del reloj, orientar las tapas en una dirección contraria a las agujas del reloj. Esto evita dañar las tapas. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
7.
Transferir la columna de centrifugación a un tubo de recogida de 1,5 ml. Pipetear 10 µl de tampón de elución de ADNc directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación. Asegurar que el tampón de elución de ADNc se dispensa directamente sobre la membrana. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar 1 minuto a velocidad máx. (≤ 25.000 x g) para eluir.
Establecimiento y ejecución de la reacción de IVT
[0155] Enzo: kit de marcaje del transcrito de ARN de alto rendimiento de Bioarray (nº de artículo 900182)
1.
Usar 10 µl del ADNc de doble cadena purificado
2.
Preparar la siguiente mezcla madre de IVT: H2O destilada o desionizada 12 µl 10X tampón de reacción HY 4 µl 10X ribonucleótidos marcados con biotina 4 µl 10X DTT 4 µl 10X mezcla inhibidora de ARNasa 4 µl 20X ARN-polimerasa T7 2 µl Volumen total: 30 µl
3.
Añadir 30 µl de la mezcla madre de IVT a 10 µl de ADNc de doble cadena (volumen total = 40 µl)
4.
Mezclar pipeteando arriba y abajo -O-con agitación ligeramente. Centrifugar rápido.
5.
Colocar inmediatamente el tubo en un baño de agua a 37ºC. Incubar durante 5 horas.
6.
Guardar a -20ºC si no se purifica inmediatamente el ARN.
[0156] Purificación de ARNc marcado con biotina (módulo de purificación de muestras GeneChip)
1.
Añadir 60 µl de H2O al producto de reacción de IVT y mezclar con agitación durante 3 segundos.
2.
Añadir 350 µl de tampón de unión de ARNc de IVT a la muestra, mezclar con agitación durante 3 segundos.
3.
Añadir 250 µl de etanol (96-100%) al lisado y mezclar bien pipeteando. No centrifugar.
4.
Aplicar la muestra (700 µl) a la columna de centrifugación para la purificación de ARNc de IVT colocando en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar durante 15 segundos a ≥ 8.000 xg (≥ 10.000 rpm).
5.
Pasar el eluato por la columna una vez más. Centrifugar durante 15 segundos a ≥ 8.000 xg (≥ 10.000 rpm). Desechar el flujo continuo como residuo peligroso y desechar el tubo de recogida.
6.
Transferir la columna de centrifugación a un nuevo tubo de recogida de 2 ml (suministrado).
7.
Añadir 500 µl de tampón de lavado de ARNc de IVT y centrifugar durante 15 segundos a ≥ 8.000 x g (≥
10.000 rpm) para lavar. Desechar el flujo continuo.
8.
Pipetear 500 µl (v/v) de etanol al 80% sobre la columna de centrifugación y centrifugar durante 15 segundos a ≥ 8.000 xg (≥ 10.000 rpm). Desechar el flujo continuo.
9.
Abrir la tapa de la columna de centrifugación y centrifugar durante 5 minutos a la velocidad máxima (≤
25.000 x g). Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
10.
Transferir la columna de centrifugación a un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml.
11.
Pipetear 11 µl de agua libre de ARNasa directamente sobre la membrana de la columna de
5 centrifugación. Dejar reposar durante 1 minuto. Centrifugar durante 1 minuto a la velocidad máxima (≤ 25.000 x g) para eluir.
12. Pipetear 10 µl de agua libre de ARNasa directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación. Dejar reposar durante 1 minuto. Centrifugar durante 1 minuto a la velocidad máxima (≤ 25.000 x g) para eluir.
10 Cuantificación del ARNc (producto de IVT)
[0157] Usar el análisis espectrofotométrico para determinar el rendimiento de ARN. Aplicar el convenio de que 1 DO a 260 nm es igual a 40 µg/ml de ARN. 15 [0158] Comprobar la DO a 260 nm y 280 nm para determinar la concentración y la pureza de la muestra.
[0159] Mantener la relación A260/A280 próxima a 2,0 para ARN puro (relaciones entre 1,9, y 2,1 son aceptables).
20 Para la cuantificación del ARNc cuando se usa ARN total como material de partida, debe calcularse un rendimiento de ARNc ajustado para reflejar el remanente de ARN total marcado. Usando una estimación del 100% de remanente, usar la siguiente fórmula para determinar el rendimiento de ARNc ajustado:
rendimiento de ARNc ajustado = ARNm – (ARNi total) (y)
25 ARNm = cantidad de ARNc medido después de IVT (µg) ARNi total = cantidad de partida de ARN total (µg) y = fracción de reacción de ADNc usada en IVT
Fragmentar el ARNc para la preparación de la diana 30 [0160] Para la fragmentación, usar la concentración de ARNc ajustada.
1. Añadir 2 µl de 5x tampón de fragmentación para cada 8 µl de ARN más H2O.
35 20 µg de ARNc 1 a 32 µl 5X tampón de fragmentación 8 µl Agua libre de ARNasa hasta 40 µl Volumen total: 40 µl
40 2. Incubar a 94ºC durante 30 minutos. Poner inmediatamente sobre hielo tras la incubación.
[0161] Preparar la diana de hibridación
1. Calentar 20X controles de hibridación de eucariotas y el oligonucleótido B2 durante 5 minutos a 65ºC. 45 Kit de control de hibridación eucariota GeneChip de Affymetrix, art. nº 900362 (para 150 reacciones)
2.
Agitsr ligeramente, centrifugar.
3.
Mezcla madre (suponiendo que la concentración de ARNc fragmentado es 0,5 µg/µl):
Matriz patrón (µl) Conc. final ARNc fragmentado 15 µg 30 0,05 µg/µl Oligonucleótido B2 (3 nM) 5 50 pM 20x adición de control 15 1,5, 5, 25, 100 pM (Bio B, C, D, Cre) ADN de esperma de arenque 3 0,1 mg/ml BSA acetilada 3 0,5 mg/ml AND de cot-1 humano (1 mg/ml) 30 0,1 mg/ml 2X tampón de hibridación MES 150 1X H2O 64 Volumen final 300
50 4. Separar 270 µl de mezcla madre en alícuotas en tubos y añadir 30 µl de ARNc fragmentado a cada uno. Esta es
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Materiales de Affymetrix
[0162]
Artículo
Cebador T7-(dT)24
Adiciones de control
Superscript II/5X tampón de la primera cadena/DTT 0,1 M
5X tampón de la segunda cadena
dNTP 10 mM
10 U/µl de ADN-ligasa de E. coli
10 U/µl de ADN-polimerasa I de E. coli
2 U/µl de ARNasa H
10 U/µl de ADN-polimerasa T4
EDTA 0,5 M
Kit de marcado de transcritos de ARN de alto rendimiento
ENZO
Módulo de purificación de muestras GeneChip
Albúmina de suero bovino acetilada
IgG de cabra – calidad de reactivo
Anticuerpo anti-estreptavidina (cabra), biotinilado
R-Ficoeritrina-estreptavidina
20X SSPE
Kit de control eucariota
Agua, calidad para biología molecular
ADN de Cot-1 humano
NaCl 5 M libre de RNasa, libre de ADNsa
Antiespumante 0-30
Tween-20 al 10%
Ácido monohidratado libre de MES
Sal sódica de MES
Sal disódica de EDTA, disolución 0,5 M
Tough Spots,
Horno de hibridación GeneChip 640
Escáner GeneChip 3000 con terminal de trabajo
Estación hidráulica
Cargador automático con lector de código de barras externo Affymetrix 00-0129
PCR cuantitativa
Síntesis de ADNc:
[0163]
la mezcla de hibridación.
5.
Equilibrar las matrices de sondas hasta temperatura ambiente inmediatamente antes del uso.
6.
Llenar la matriz de sondas con 1x tampón de hibridación MES e incubar en el horno asador durante 10 minutos a 45ºC, 60 rpm.
7.
Calentar la mezcla de hibridación en un baño de agua a 99ºC durante 5 minutos.
8.
Transferir la mezcla de hibridación a un baño de agua de 45ºC durante 5 minutos.
9.
Centrifugar la mezcla de hibridación durante 5 minutos a la máxima velocidad.
10.
Eliminar 1x tampón de hibridación MES de las matrices de sondas.
11.
Llenar la matriz de sondas con los 200 µl superiores de la mezcla de hibridación.
12.
Cerrar el tapón con Tough-Spots.
13.
Hibridar la matriz de sondas a 45ºC, 60 rpm, durante 19 horas.
14.
Lavar, teñir y cribar la matriz de sondas según los protocolos de Affymetrix.
Proveedor Nº de catálogo Biosearch Technologies Por encargo en la empresa -Invitrogen 18064-014 Invitrogen 10812-014 Invitrogen 18427-088 Invitrogen 18052-019 Invitrogen 18010-025 Invitrogen 18021-071 Invitrogen 18005-025 Sigma E-7889
Affymetrix o ENZO 900182 (ENZO) Affymetrix 900371 Invitrogen 15561-020 Sigma I-5256 Vector Labs BA-0500 Molecular Probes S-866 BioWhittaker 51214 Affymetrix 900362 Ambion 9934 Roche 1-581-074 Ambion 9760 Sigma A-8082 Pierce Chemical 28320 Sigma M5287 Sigma M3885 Sigma E7889 Label Dots USA Scientific 9902 Affymetrix 800139 Affymetrix 00-0074 Affymetrix 00-0081 Condiciones de incubación:
Componente
Volumen (µl)
10X tampón RT
10
25X mezcla de dNTP
4
10X cebadores al azar
10
MultiScribe RT
5
(50 U/µl)
H2O libre de ARNasa
21
ARN (100 ng)
50
Volumen final
100
[0164]
5 25°durante 10 minutos 37°durante 2 horas
[0165] Reacción TaqMan usando el detector de la secuenciación ABI Prism 7700: 10
Componente
Volumen (ul)
PCR TaqMan Universal
25
Mezcla madre (2X)
Sonda TaqMan (20X)
2,5
(Assays-on-Demand™)
ADNc (100ng)
2
H2O
20,5
Volumen final
50
Condiciones de ciclado térmico:
[0166]
15 95º durante 10 minutos 40 ciclos: 95º durante 15 segundos 60º durante 1 minuto
• Sondas TaqMan: Assays-on-Demand™ (sondas TaqMan® MGB, FAM™ marcada con colorante) 20
• Amplificación del control endógeno, GAPDH (concentración de sonda 100 nM, concentraciones de cebador directo e inverso 200 nM), se realizó para normalizar la cantidad de ARN de muestra (ADNc) añadido a cada reacción.
25 [0167] La cuantificación relativa se realizó usando el procedimiento de la curva patrón. Para la cuantificación normalizada a un control endógeno, las curvas patrón se prepararo tanto para la diana como para la referencia endógena. Para cada muestra experimental, la cantidad de diana y de referencia endógena se determinó a partir de la curva patrón apropiada. A continuación, la cantidad de diana se dividió entre la cantidad de referencia endógena para obtener un valor de diana normalizado. Una de las muestras experimentales sirvió de calibrador, o 1x muestra.
30 Cada uno de los valores diana normalizados se dividió a continuación entre el valor de la diana normalizada con el calibrador para generar los niveles de expresión relativos.
FACS/Citometría de flujo (protocolo de tinción del 2º anticuerpo):
35 [0168] Todas las incubaciones y centrifugaciones se realizaron a 4ºC y los tubos se mantuvieron sobre hielo mientras que no estuvieron en la nevera.
1. Determinar el formato del tubo identificando las líneas celulares que van a usarse, los anticuerpos de interés, y cualquier condición especial o tratamiento.
a. Controles. 40
i. Sin teñir, 2º anticuerpo, y compensación si los fluorócromos tienen espectros de emisión que se solapan.
b. Ejemplo:
Tubo
Línea celular Tiempo (min) 1º anticuerpo 2º anticuerpo
1
por ejemplo, COLO-205 0 - -
2
por ejemplo, COLO-205 0 - Anti-FITC de ratón
3
por ejemplo, COLO-205 0 Anti-Sialyl Lewis A Anti-FITC de ratón
imagen2
2. Etiquetar los tubos de FACS.
a. BD Falcon 12 x 75 mm de poliestireno de base redonda. Nº de catálogo: 352052
3. Preparar las células para la tinción.
a.
Tratar las células adherentes con acutasa o tripsina.
i. Innovative Cell Technologies Inc, Acutasa.
ii. Gibco, Tripsina. Nº de catálogo: 25200-106.
b.
Proceder con el resto de las etapas si las células están en suspensión.
4.
Separar en alícuotas las células en tubo cónico de 15 ml o 50 ml.
5.
Centrifugar las células durante 5 min, 1200 rpm, 4ºC.
6.
Aspirar el sobrenadante.
7.
Resuspender las células en 5 ml de tampón de FACS.
8.
Centrifugar las células durante 5 min, 1200 rpm, 4ºC.
9.
Aspirar el sobrenadante.
10.
Resuspender las células en tampón de bloqueo.
a. Determinar el volumen de tampón de bloqueo necesario:
i. Número de tubos por línea celular/tratamiento X 100 µl de tampón de bloqueo por tubo.
ii. Se desean 1x106 células por 100 µl de tampón de bloqueo.
11.
Separar en alícuotas 100 µl de las células en el tubo apropiado.
a. Basándose en el formato de tubo predeterminado.
12.
Añadir el 1º anticuerpo al tubo apropiado.
a.
Lewis A:
i. Usar 10 µl de de mezcla madre 0,2 µg/µl por tubo.
1. La concentración final es 2 µg.
ii. Chemicon: anti-Sialyl Lewis A. Nº de catálogo: MAB2095.
b.
Lewis X:
i. Usar 5 µl de de mezcla madre 0,5 µg/µl por tubo.
1. La concentración final es 2,5µg.
ii. BD Pharmingen: CD15 (Sialyl Lewis X). Nº de catálogo: 551344.
13.
Incubar durante 30 min a 4ºC.
14.
Añadir 1 ml de tampón de FACS a cada tubo.
15.
Centrifugar las células durante 5 min, 1200 rpm, 4ºC.
16.
Aspirar el sobrenadante
17.
Sacudir cuidadosamente los tubos para sacar el sedimento.
a. “Gradilla” – Colocar los tubos a través de la superficie de la gradilla de tubos de 12 x 75 mm.
18.
Repetir las etapas 14-17.
19.
Añadir 100 µl de tampón de bloqueo a cada tubo.
20.
Añadir el 2º anticuerpo al tubo apropiado.
a.
Usar 10 µl por tubo.
b.
Jackson, Cabra anti-ratón FITC. Nº de catálogo: 115-096-068.
21.
Incubar durante 30 min a 4ºC.
22.
Repetir las etapas 14-17 dos veces.
23.
Resuspender las células en tampón de FACS/PI.
a.
Determinar el volumen necesario:
i. Se necesita 1 ml de disolución por tubo.
ii. PI= 1 µl por 1 ml de tampón.
b.
Molecular Probes, yoduro de propidio. Nº de catálogo: P3566.
24.
Colocar los tubos en un cubo con hielo o gradilla de tubos con hielo.
25.
Cubrir con papel de aluminio y llevar al laboratorio de FACS para que un operario cualificado adquiera y analice las muestras. 5% de tampón de bloqueo:
1.
FBS al 5% de volumen total.
2.
Tampón de FACS.
3.
Filtrar la disolución mediante un filtro de 0,2 µm.
Tampón de FACS:
1.
980 ml de PBS.
2.
8 ml de EDTA 0,25M.
3.
20 ml de FBS.
4.
Filtrar la disolución mediante un filtro de 0,2 µm.
Procedimiento inmunohistoquímico: Sialyl Lewis A
[0169]
Anticuerpo: Sialyl Lewis A AB-1
Clon: 121SLE Proveedor: NeoMarkers Nº de catálogo MS-279-P Especie de Ig: Ratón Procedimiento de IHC: Parafina Pretratamiento: Ninguno Manipulación de IHC: Teñidor automático Isotipo: IgM de ratón Especie del procedimiento: Humana Concentración de IgG: 200 µg/ml
Procedimiento normal:
[0170]
Desparafinar e hidratar en agua destilada. Bloquear biotina endógena con el sistema de bloqueo de avidina-biotina de vector. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Bloquear con suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Incubar las secciones con el anticuerpo monoclonal de ratón Sialyl Lewis A diluido a 5 µg/ml con suero de caballo normal al 10% durante 60 minutos a temperatura ambiente.
[0171] Usar un isotipo de ratón IgM diluido a 5 µg/ml en suero de caballo normal al 10% para el control negativo.
Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con anticuerpo de caballo biotinilado anti-ratón; diluido 1:200 en suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con el sistema diluido Vector ABC Elite durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con DAB potenciado con metal de Pierce durante 5 minutos Aclarar en agua de grifo corriente durante 5 minutos. Contrateñir con hematoxilina de Mayers durante 1 minuto. Aclarar en agua de grifo corriente durante 5 minutos. Azular con hematoxilina con reactivo de azulado de Richard-Allan durante 1 minuto. Aclarar en agua de grifo corriente durante 2 minutos. Deshidratar, purificar y montar en medios de montaje sintéticos.
Procedimiento inmunohistoquímico: Sialyl Lewis X
[0172]
Anticuerpo: anti-Sialyl Lewis X de ratón
Clon: KM93 Proveedor: Chemicon Nº de catálogo. MAB2096 Especie de Ig: Ratón Procedimiento de IHC: Parafina Pretratamiento: DAKO Target Retrieval Manipulación de IHC: Teñidor automático Isotipo: IgM de ratón Especie del procedimiento: Humana Concentración de IgG: 100 µg/ml
Procedimiento normal:
[0173]
Desparafinar e hidratar en agua destilada. Detener la actividad de peroxidasa endógena con disolución de bloqueo KPL – concentrado diluido 1:10 en dH2O, temperatura ambiente durante 4 minutos. Aclarar en agua destilada durante 5 minutos. Incubar en DAKO Target Retrieval (S1700) precalentado hasta 99 grados durante 20 minutos en un baño de agua hirviendo. Sacar del baño hirviendo y dejar enfriar durante 20 minutos. Bloquear biotina endógena con el sistema de bloqueo de avidina-biotina de Vector. Bloquear con suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Incubar las secciones con el anticuerpo monoclonal de ratón Sialyl Lewis X diluido a 5 µg/ml con suero de caballo normal al 10% durante 60 minutos a temperatura ambiente.
[0174] Usar un isotipo de ratón IgM diluido a 5 µg/ml en suero de caballo normal al 10% para el control negativo.
Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con anticuerpo de caballo biotinilado anti-ratón de Vector; diluido 1:200 en suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con el sistema diluido Vector ABC Elite durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con DAB potenciado con metal de Pierce durante 5 minutos Aclarar en agua de grifo corriente durante 5 minutos. Contrateñir con hematoxilina de Mayers durante 1 minuto. Aclarar en agua de grifo corriente durante 5 minutos. Azular con hematoxilina con reactivo de azulado de Richard-Allan durante 1 minuto. Aclarar en agua de grifo corriente durante 2 minutos. Deshidratar, purificar y montar en medios de montaje sintéticos.
Resultados experimentales:
[0175] Los experimentos se realizaron usando los procedimientos y materiales descritos anteriormente. Los resultados de estos experimentos se ilustran en las Figuras 6-13, tal como se describe a continuación.
[0176] La Figura 6 proporciona un cuadro resumen de los datos obtenidos en el análisis de 28 líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la sensibilidad o resistencia a actividad apoptótica de Apo2L (+ suero bovino fetal al 0,5% “FBS” o FBS al 10%) o anticuerpo monoclonal “mab” contra DR5, “XL” reticulado o no reticulado, + suero bovino fetal “FBS” al 0,5% o FBS al 10%) y expresión de FUT 3, FUT 6, Sialyl Lewis A y Sialyl Lewis X. [0177] La Figura 7 proporciona una comparación de la sensibilidad de diversas líneas de células de cáncer de colon
o colorrectal para el anticuerpo contra DR5 y la expresión de FUT 3, medida mediante PCR cuantitativa. [0178] La Figura 8 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la sensibilidad o resistencia al anticuerpo contra DR5 (más reticulante) y expresión de Sialyl Lewis X o A, determinadas mediante FACS. [0179] La Figura 9A muestra una prueba de correlación de rangos de Spearman que analiza la sensibilidad o la resistencia de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal y la correlación con la expresión de FUT3. [0180] La Figura 9B muestra los resultados de una prueba exacta de Fisher que analiza la sensibilidad (“sens”) o resistencia (“res”) de las diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal y la significancia estadística entre la expresión de FUT 3 y Sialyl Lewis A/X y la sensibilidad de las líneas celulares respectivas a la actividad apoptótica del anticuerpo contra DR5. [0181] La Figura 10 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la expresión de receptores DcR1 o DcR2 (determinada mediante PCR cuantitativa) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares a Apo2L o anticuerpo contra DR5. [0182] La Figura 11 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la expresión de receptores DcR1 o DcR2 (determinada mediante FACS) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares a Apo2L o anticuerpo contra DR5. [0183] La Figura 12 muestra la tinción inmunohistoquímica para Sialyl Lewis A y X en cuatro líneas de células de cáncer colorrectal, CaCo 2 (Colo2), SW 1417, DLD-1 y Colo 205, y su correlación con la expresión de Sialyl Lewis A y X medida mediante FACS y su correlación con la sensibilidad a Apo2L/TRAIL. Las líneas de células de cáncer colorrectal Colo 2 y SW1417 no muestran tinción y muestran una débil tinción, respectivamente, o los antígenos Sialyl Lewis son negativos y débilmente positivos, respectivamente, por FACS y son resistentes a Apo2L/TRAIL. Las líneas celulares de cáncer colorrectal DLD-1 y Colo 205 muestran tinción moderada y fuerte, respectivamente, para antígenos Sialyl Lewis, son moderadas y fuertemente positivas, respectivamente, por FACS y son sensibles a Apo2L/TRAIL. [0184] La Figura 13 muestra un resumen de experimentos de IHC que demuestran la expresión de Sialyl Lewis A y X en muestras de tejido de mucosa de colon normal, tejido de hígado normal, cáncer de colon primario y metástasis de cáncer de colon. Las muestras de tejido de colon normal y cáncer de colon primario dispuestas en matriz en una micromatriz de tejido se probaron en el experimento de IHC, mientras que las muestras de tejido del hígado normal y cáncer de colon metastásico estuvieron sobre portaobjetos de vidrio individuales. La prevalencia de expresión de Sialyl Lewis A y X y la intensidad de tinción inmunohistoquímica aumenta de tejido de colon normal a cáncer de colon primario a cáncer de colon metastásico. Las células de hígado normal no se tiñeron ni para Sialyl Lewis A ni X.

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Procedimiento para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o de células de mamífero a Apo2L/TRAIL, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    examinar la muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno o antígenos Sialyl Lewis A y/o X, donde determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control es predictiva de que dicha muestra de tejido o de células es sensible a actividad inductora de apoptosis de Apo2L/TRAIL .
  2. 2.
    Procedimiento para inducir apoptosis en una muestra de tejido o de células de mamífero, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    examinar una muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno o antígenos Sialyl Lewis A y/o X, y tras determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control, exponer dicha muestra de tejido o de células a una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL para así inducir apoptosis en una muestra de tejido o de células de mamífero.
  3. 3.
    Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina detectando la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6.
  4. 4.
    Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina mediante inmunohistoquímica para detectar la expresión del antígeno o antígenos Sialyl Lewis A y/o X.
  5. 5.
    Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de examinar la expresión de los receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2 en dicha muestra de tejido o de células.
  6. 6.
    Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra de tejido o de células comprende tejido o células de cáncer.
  7. 7.
    Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dichas células de cáncer son células o tejido de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal o pancreático.
  8. 8.
    Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 114-281 de la figura 1 (SEQ ID No. 1).
  9. 9.
    Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 41-281 de la figura 1 (SEQ ID No. 1) o un fragmento del mismo que tiene actividad apoptótica.
  10. 10.
    Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido Apo2L/TRAIL está unido a una molécula de polietilenglicol.
  11. 11.
    Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento de un trastorno relacionado con el sistema inmunitario o cáncer en un mamífero, en el que el método de tratamiento comprende:
    examinar una muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno o antígenos Sialyl Lewis A y/o X, y tras determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control, administrar al mamífero una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL para así inducir la apoptosis y tratar el trastorno relacionado con el sistema inmunitario o cáncer.
  12. 12.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según la reivindicación 11, en el que dicho cáncer es cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal o pancreático.
  13. 13.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en el que dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina detectando la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6.
  14. 14.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en el que dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina mediante inmunohistoquímica para detectar la expresión del antígeno o antígenos Sialyl Lewis A y/o X.
  15. 15.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende además la etapa de examinar la expresión de los receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2 en dicho tejido o célula.
  16. 16.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que dicha muestra de tejido o de células comprende tejido o células de cáncer.
  17. 17.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según la reivindicación 16, en el que dichas células o tejido de cáncer comprende células o tejido de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal o pancreático.
  18. 18.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en el que el Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 114-281 de la figura 1 (SEQ ID No. 1).
  19. 19.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 41-281 de la figura 1 (SEQ ID No. 1) o un fragmento del mismo que tiene actividad apoptótica.
  20. 20.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en el que dicho polipéptido Apo2L/TRAIL está unido a una molécula de polietilenglicol.
  21. 21.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, en el que un agente o agentes quimioterapéuticos o radioterapia también se administran a dicho mamífero.
  22. 22.
    El Apo2L/TRAIL para uso en un método de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, en el que una citoquina, agente citotóxico o agente inhibidor del crecimiento también se administran a dicho mamífero.
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