ES2360298T3 - Herpesvirus recombinantes de pavos y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un herpesvirus recombinante de pavos que comprende una secuencia de DNA extraño que en términos de la secuencia del DNA del virus de la la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) consiste en una secuencia que codifica la glicoproteína I del virus de la laringotraqueitis infecciosa y la glicoproteína D del virus de la laringotraqueitis infecciosa dentro del fragmento EcoRI nº 9 del genoma viral del herpesvirus de pavos, en donde la secuencia de DNA extraño que codifica dichas glicoproteínas es capaz de ser expresada en una célula hospedante infectada con el herpesvirus de pavos.

Description

A lo largo de esta solicitud se mencionan varias publicaciones con números arábigos entre paréntesis. Las citas completas para estas publicaciones se encuentran al final de la descripción, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La capacidad de aislar DNA y clonar tal DNA aislado en plásmidos bacterianos ha expandido grandemente los métodos disponibles para preparar vacunas virales. Los métodos usados para conseguir la presente invención implican modificar las secuencias de DNA clonadas de varios agentes patógenos virales de animales, mediante inserciones, deleciones, cambios de bases únicos o múltiples e inserciones subsiguientes de estas secuencias modificadas en el genoma del virus. Una utilidad de la adición de una secuencia extraña se logra cuando la secuencia extraña codifica una proteína extraña que es expresada durante la infección viral del animal. El virus vivo resultante puede usarse luego en una vacuna para producir una respuesta inmunitaria en un animal hospedante y proporcionar protección al animal contra la enfermedad. Un virus con estas características se denomina un vector viral, porque se convierte en un vector vivo que llevará y expresará la proteína extraña en el animal hospedante. En efecto, llega a ser un sistema de administración elaborado para la(s) proteína(s) extraña(s).

Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de herpesvirus de pavos (abreviadamente en lo sucesivo HVT por la expresión inglesa Herpesvirus of Turkey) como un vector viral para la vacunación de aves contra enfermedades. El grupo de herpesvirus comprende diversos agentes patógenos que infectan y causan enfermedades en cierto número de especies dianas: cerdos, ganado vacuno, pollos, caballos, perros, gatos etc. Cada herpesvirus es específico para su especie hospedante, pero todos ellos están relacionados en la estructura de sus genomas, su modo de replicación y en cierta extensión, en la patología que causan en el animal hospedante y en el mecanismo de la respuesta inmunitaria del hospedante a la infección por el virus.

La aplicación de las técnicas de DNA recombinante a los virus animales tiene una historia relativamente reciente. Los primeros virus que se manipularon por ingeniería genética han sido los que poseían los genomas más pequeños. En el caso de los papovavirus, debido a que estos virus son tan pequeños y no pueden acomodar mucho DNA extra, su uso en ingeniería genética ha sido como replicones defectuosos. La expresión del gen extraño de estos virus requiere un virus auxiliar de tipo natural y está limitada a sistemas de cultivos de células. Para los adenovirus, hay una pequeña cantidad de DNA no esencial que puede reemplazarse por secuencias extrañas. Los únicos DNA extraños que parece que se han expresado en adenovirus son los de los genes del antígeno T de papovavirus (Mansour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985; Thummel et al., Cell, 1983; Scolnick, et al., Cell, 1981; Thummel et al., Cell 1981), y el gen de la timidina-quinasa del virus herpes simplex (abreviadamente en lo sucesivo HSV por la expresión inglesa Herpes Simplex Virus) (Haj-Ahmed y Graham, J. of Virology, 1986). Estas publicaciones no identifican las regiones no esenciales del HVT, en donde puede insertarse el DNA extraño, ni muestran cómo se logra la expresión de los genes extraños en el HVT, por ejemplo que secuencia de promotor y secuencia de terminación debe usarse.

Otro grupo de virus que se ha manipulado por ingeniería genética son los poxvirus. Un miembro de este grupo, el virus de la viruela de las vacas (denominado en lo sucesivo “virus vaccinia”), ha sido el objeto de mucha investigación sobre la expresión de genes extraños. Los poxvirus son virus que contiene DNA grandes que se replican en el citoplasma de la célula infectada. Dichos virus tienen una estructura que es única en el sentido de que no contienen ninguna cápsida que esté basada en simetría icosaédrica o simetría helicoidal. Los poxvirus son los que más probablemente han evolucionado de los microorganismos similares a bacterias por la pérdida de función y degeneración. En parte debido a esta singularidad, los avances hechos en ingeniería genética de los poxvirus no pueden extrapolarse directamente a otros sistemas virales, incluyendo los herpesvirus y el HVT. Las construcciones de virus recombinante del virus vaccinia se han hecho en un número de laboratorios que expresan los siguientes genes extraños insertados: gen de la timidina-quinasa del HSV (Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982; Panicali y Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (Paoletti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984; Smith et al., Nature, 1983), gen de la glicoproteína D del HSV, gen de hemaglutinina del virus de la gripe (Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1983; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983), gen del antígeno del virus de la malaria (Smith et al., Science, 1984) y gen de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (Mackett et al., Science, 1986). Las características globales generales del DNA recombinante del virus vaccinia son similares a las técnicas usadas para todos los virus, especialmente en lo que se refieren a las técnicas de referencia (Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982). Sin embargo en detalle, las técnicas del virus vaccinia no son aplicables al herpesvirus ni al HVT. La utilidad del virus vaccinia como vector de vacunas es un problema, debido a su relación cercana al virus de la viruela humana y su patogenicidad respecto a los seres humanos. Por tanto, el uso del herpesvirus HVT específico de hospedante es la mejor solución para la vacunación de las aves de corral.

Entre los herpesvirus de primate, solo el HSV de los seres humanos y, en una extensión limitada, el herpesvirus saimiri de los simios ha sido manipulado por ingeniería genética para contener secuencias de DNA extraño. El primer uso de DNA recombinante para manipular el HSV implicó clonar un trozo de DNA de la región de unión L-S en la región grande única de DNA del HSV, específicamente en el gen de timidina-quinasa (Moccarski et al., Cell, 1980). Este inserto no fue un trozo extraño de DNA, más bien fue un trozo que se presenta naturalmente de DNA de herpesvirus que se duplicó en otro lugar en el genoma. Este trozo de DNA no se manipuló genéticamente para expresar específicamente una proteína, y por tanto este trabajo no implica la expresión de proteínas en herpesvirus. La siguiente manipulación del HSV implicó la creación de deleciones en el genoma de virus mediante una combinación de técnicas de DNA recombinantes y de selección por timidina-quinasa. Usando este método se ha suprimido el gen alfa-22 del HSV (Post et al., Cell, 1981), y se ha suprimido una secuencia de 15.000 pares de bases de DNA de la región de repetición interna del HSV (Poffenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981).

Los siguientes casos implican la inserción de genes que codifican proteínas en los herpesvirus: la inserción de la glicoproteína C del HSV en un mutante por deleción que ocurre naturalmente de este gen en HSV (Gibson y Spear,

J. of Virology, 1983); la inserción de la glicoproteína D del HSV de tipo 2 en HSV de tipo 1 (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982) sin manipulación de secuencias de promotor ya que el gen no es "extraño"; la inserción de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en el HSV bajo el control del promotor ICP4 del HSV (Shih et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984); y la inserción de la hormona de crecimiento bovina en el herpesvirus saimiri con un promotor de SV40 (el promotor no funcionó en este sistema y un promotor situado aguas arriba (es decir, la región que se extiende en dirección 5�) endógeno sirvió para transcribir el gen) (Desrosiers et al.,, 1984). Dos genes extraños adicionales (gen de ovalbúmina de pollo y el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr) se han insertado en el HSV (Arsenakis y Roizman, 1984) y la glicoproteína X del virus de la pseudo-rabia se han insertado en el HSV (Post et al., 1985).

Estos casos de deleción o de inserción de genes en herpesvirus demuestran que es posible manipular genéticamente genomas de herpesvirus mediante técnicas de DNA recombinantes. Los métodos que se han usado para insertar genes implican la recombinación homóloga entre el DNA viral clonado en plásmidos y el DNA viral purificado transfectado en la misma célula animal. Sin embargo, la extensión a la cual se puede generalizar la ubicación de la deleción y los sitios para inserción de los genes extraños no se conoce de estos estudios previos.

El virus de la enfermedad de Marek (abreviadamente en lo sucesivo MDV por la expresión inglesa Marek’s Desease Virus) es el agente causante de la enfermedad de Marek, la cual abarca la parálisis de aves de corral, una enfermedad linfoproliferante común de los pollos. La enfermedad ocurre más comúnmente en pollos jóvenes entre una edad de 2 y 5 meses. Los signos clínicos sobresalientes son una parálisis progresiva de una o más de las extremidades, la falta de coordinación debida a la parálisis de las patas, la caída del miembro debido a la implicación del ala, y una posición de cabeza agachada debido a la implicación de los músculos del cuello. En casos agudos, da como resultado una depresión grave. En el caso de cepas altamente oncogénicas, hay una atrofia tímica y bursal característica. Además hay tumores linfáticos que afectan a las gónadas, los pulmones, el hígado, el bazo, los riñones y el timo (Mohanty y Dutta, 1981).

La mayoría de los pollos son vacunados contra el MDV el primer día de vida para proteger por vida al ave contra el MDV. Antes de la presente invención, el método de vacunación principal para el MDV implicaba usar cepas que se presentan naturalmente del herpesvirus de pavo (HVT). Sería ventajoso incorporar otros antígenos en esta vacuna del primer día de vida, pero los esfuerzos para combinar las vacunas convencionales no han demostrado hasta la fecha ser satisfactorios debido a la competencia e inmunosupresión entre los agentes patógenos. Las vacunas multivalentes a base de HVT obtenidas por manipulación genética en esta invención representan una forma nueva para vacunar simultáneamente contra un número de agentes patógenos diferentes. Por primera vez, se describe un HVT recombinante con un gen extraño insertado en una región no esencial del genoma del HVT.

Los tipos de ingeniería genética que se han realizado sobre estos herpesvirus consisten en clonar partes del DNA del virus en plásmido bacterianos, reconstruyendo el DNA del virus mientras está en estado clonado de manera que el DNA contenga deleciones de ciertas secuencias, y añadiendo además secuencias de DNA extraño bien sea en el lugar de las deleciones o bien sea en sitios separados de las deleciones.

Un gen extraño de interés adecuado como diana para la inserción en el genoma del HVT puede obtenerse de un organismo patógeno de interés. Típicamente, el gen de interés procederá de agentes patógenos que en las aves de corral provocan enfermedades que tienen un impacto económico sobre la industria aviar. Los genes pueden proceder de organismos para los cuales existen vacunas, y debido a las nuevas ventajas de la tecnología de vectorización las vacunas procedentes del HVT serán superiores. También, el gen de interés puede proceder de agentes patógenos para los cuales actualmente no hay vacuna, pero que cumplen el requisito de control de la enfermedad. Típicamente, el gen de interés codifica polipéptidos inmunogénicos del agente patógeno y puede representar proteínas de superficie, proteínas segregadas y proteínas estructurales.

Un agente patógeno aviar relevante que es una diana para la vectorización del HVT es el virus de la laringotraqueitis infecciosa (en lo sucesivo abreviado como ILTV por la expresión inglesa Infectious LaringoTracheitis Virus). El ILTV es un miembro de la familia de los herpesviridiae, y este agente patógeno provoca una enfermedad aguda en pollos que se caracteriza por una depresión respiratoria, jadeo y expectoración de exudados sanguinolentos. La replicación viral está limitada a las células de las vías respiratorias, en donde en la tráquea la infección da lugar a una erosión del tejido y a hemorragia. En pollos, ningún fármaco ha sido eficaz en reducir el grado de formación de lesiones o en disminuir los signos clínicos. La vacunación de aves con varias formas modificadas del ILTV derivado del pase por células y/o regímenes tediosos de administración ha conferido una protección aceptable en los pollos sensibles. Debido al grado de atenuación de las vacunas del ILTV actuales debe tenerse cuidado de asegurarse que se mantiene el nivel correcto de virus; suficiente para proporcionar la protección pero no para causar la enfermedad en la bandada.

Una diana adicional para el método de vectorización del HVT es la enfermedad de Newcastle, una enfermedad infecciosa altamente contagiosa y debilitante que es causada por el virus de la enfermedad de Newcastle (abreviadamente en lo sucesivo NDV por la expresión inglesa Newcastle Disease Virus). El NDV es un virus de RNA monocatenario de la familia de los paramyxovirus. Los varios tipos de patógenos del NDV (velogénico, mesogénico, lentogénico) difieren con relación a la gravedad de la enfermedad, la especificidad y los síntomas, pero la mayoría de los tipos parecen infectar el sistema respiratorio y el sistema nervioso. El NDV infecta principalmente a los pollos, los pavos y otras especies aviares. Históricamente la vacunación se ha usado para evitar la enfermedad, pero debido a las interferencias de los anticuerpos maternos, el periodo de vida del ave y la vía de administración, el productor necesita adaptar los protocolos de inmunización para ajustarse a necesidades específicas.

El agente terapéutico que ha de ser administrado mediante un vector viral de la presente invención debe ser una molécula biológica que sea un subproducto de la replicación del virus de la viruela de los cerdos. Esto limita el agente terapéutico en el primer análisis a bien sea DNA, RNA o proteínas. Hay ejemplos de agentes terapéuticos de cada una de estas clases de compuestos en la forma de un DNA anti-sentido, RNA anti-sentido (S. Joshi et al., J. of Virology, 1991), ribozimas (M. Wachsman et al., J. of General Virology, 1989), tRNA supresores (R.A. Bhat, et al., Nucleic Acids Research, 1989), RNA bicatenario inductor de interferón y numerosos ejemplos de agentes terapéuticos proteicos, desde hormonas, por ejemplo, insulina hasta linfoquinas, por ejemplo, interferones e interleuquinas, hasta opiáceos naturales. El descubrimiento de estos agentes terapéuticos y la elucidación de su estructura y función no hacen obvia la capacidad para usarlos en un sistema de administración de vector viral.

El documento EP-A431668 se refiere a HVT, que contienen un gen heterólogo incorporado en una región de inserción del genoma del HVT, así como a vacunas de vectores que comprenden dicho HVT recombinante que expresa un polipéptido antigénico heterólogo y que induce una respuesta inmunitaria adecuada sobre la infección de un animal hospedante apropiado. El documento WO 93/25665 describe HVT recombinantes para la expresión de genes extraños insertados en el sitio Stul único del gen US2 que codifica polipéptidos antigénicos procedentes de diversos virus aviares, y, además, que más de una secuencia codificadora de antígenos puede ser insertada en la región codificadora del antígeno del herpesvirus, es decir, en el sitio XhoI de la región EcoRI nº 9.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Esta invención proporciona un herpesvirus recombinante de pavos que comprende una secuencia de DNA extraño que codifica la glicoproteína I del virus de la laringotraqueitis infecciosa y la glicoproteína D del virus de la laringotraqueitis infecciosa dentro del fragmento EcoRI nº 9 de un genoma viral de herpesvirus de pavos, y la secuencia de DNA extraño que codifica dichas glicoproteínas es capaz de ser expresada en una célula hospedante infectada con el herpesvirus de pavos.

Por último, esta invención proporciona vectores de homología para producir un herpesvirus recombinante de pavos, células hospedantes y vacunas para uso en inmunización..

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figuras 1A-1C: Detalles de la construcción del HVT y datos del mapa.

La Figura 1A muestra un mapa de fragmentos de restricción por BamHI del genoma del HVT. Los fragmentos están numerados en orden de tamaño decreciente; las letras se refieren a los fragmentos pequeños cuyo tamaño comparativo no se ha determinado.

La Figura 1B muestra el fragmento BamHI nº 16 del genoma del HVT mostrando la ubicación de la inserción del gen de β-galactosidasa en S-HVT-001.

La Figura 1C muestra el fragmento BamHI nº 19 del genoma del HVT mostrando la ubicación de la inserción del gen de β-galactosidasa.

Leyenda: B = BamHI; X = XhoI; H = HindIII; P = PstI; S = SalI; N = NdeI; R = EcoRI.

Figuras 2A-2D: Inserción en el plásmido 191-47.

La Figura 2A contiene un diagrama que muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el plásmido 191-47. Las Figuras 2A a 2D muestran las secuencias localizadas en cada una de las uniones entre los fragmentos de DNA en el plásmido 191-47. (SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, y 27).

Nota.- Las Figuras 3-7 se refieren a ejemplos útiles para la compresión de la invención.

Figuras 3A-3B: Detalles de la construcción S-HVT-003.

La Figura 3A muestra un mapa de restricción de DNA del HVT en la región del fragmento BamHI nº 16. Este fragmento está contenido en un fragmento grande HindIII. La Figura 3A también muestra el sitio XhoI el cual fue primero cambiado al sitio EcoRI (R) mediante el uso de un "enlazador" y procedimientos estándares de clonación. La Figura 3A también muestra detalles de la construcción del gen beta-gal y del gen del virus de la bursitis infecciosa (abreviadamente en lo sucesivo IBDV por la expresión inglesa Infectious Bursal Disease Virus) insertado en el fragmento BamHI nº 16 para uso en una recombinación de homólogos. Ambos genes estuvieron bajo el control del promotor del gen gX del virus de la pseudo-rabia (abreviadamente PRV por la expresión inglesa Pseudorabies Virus) (gX).

La Figura 3B muestra el genoma del S-HVT-003, incluyendo la ubicación de los dos genes extraños insertados, β-gal e IBDV.

En la Figura 3: H = HindIII; B = BamHI; X = XhoI; R = EcoRI; Xb = XbaI; Hp = HpaI; S = SmaI; UL = región larga única (unique long); US = región corta única (unique short); IR = región de repetición interna (internal repeat); TR = región de repetición terminal (terminal repeat).

Figura 4.

Transferencia Western que indica la expresión diferencial del antígeno del IBDV de 32kD en lisados celulares de células infectadas con S-HVT-003 (32kD presente) y células infectadas con S-HVT-001 (32kD negativo). Los polipéptidos específicos del IBDV se identificaron mediante sondeo de la transferencia con antisuero de rata hiperinmunitario dirigido contra los viriones del IBDV desnaturalizados. Este suero reacciona principalmente con el antígeno de 32kD inmunodominante (VP3 del IBDV). Las pistas de las manchas contienen: 1) patrones de peso molecular de proteínas, 2) células fibroblastos de embrión de pollo (abreviadamente en lo sucesivo CEF por la expresión inglesa Chick Embryo Fibroblasts) no infectadas, 3) células CEF infectadas con S-HVT-001, 4), 5) y 6) S-HVT-003 y 7) polipéptidos de viriones del IBDV.

Figura 5:

Transferencia Western que indica la expresión diferencial del antígeno VP2 de 42kD en lisados celulares de células infectadas con S-HVT-003 (42kD presente) y células infectadas con S-HVT-001 (42kD negativo). Los polipéptidos específicos del IBDV se identificaron mediante el uso de un antisuero específico antipéptido de conejo VP2. Las pistas contienen: 1) patrones de pesos moleculares de proteínas, 2) células CEF infectadas con HVT de tipo natural, 3) células CEF infectadas con S-HVT-001, 4) células CEF infectadas con S-HVT-003, 5) células CEF infectadas con S-HVT-003 y 6) polipéptidos de viriones de IBDV.

Figuras 6A-6C: Detalles de la construcción de S-HVT-004.

La Figura 6A es un mapa de restricción de DNA del HVT en la región del fragmento BamHI nº 16. Este fragmento está contenido en un fragmento HindIII grande. También se muestra el sitio XhoI (X) en donde los solicitantes han hecho su inserción. Antes de la inserción, el XhoI se cambió primeramente al sitio EcoRI (R) mediante el uso de un "enlazador" y de procedimientos estándares de clonación

La Figura 6B proporciona detalles de la construcción del gen β-gal y el gen gA del MDV en el fragmento BamHI nº 16 para usarse en la recombinación de homólogos. El gen beta-gal estaba bajo el control del promotor del gen gX del PRV (gX), mientras que el gen gA del MDV estaba bajo el control de su propio promotor.

La Figura 6C es el genoma del S-HVT-004, mostrando la ubicación de los dos genes extraños insertados, β-gal y gA del MDV.

En la Figura 6: H = HindIII; B = BamH; X = XhoI; R = EcoRI; Xb = XbaI; UL = región larga única; US = región corta única; IR = región de repetición interna; TR = región de repetición terminal.

Figuras 7A-7B:

Descripción detallada de la inserción de gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) en un vector de homología 46722.A12. La Figura 7A muestra un diagrama que indica la orientación de los fragmentos DNA ensamblados en el gen marcador. El origen de cada fragmento está descrito en el apartado Materiales y Métodos. Las Figuras 7A y 7B muestran las secuencias de DNA localizadas en las uniones entre los fragmentos de DNA y en los extremos del gen marcador (SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 y 33). Las Figuras 7A y 7B muestran además los sitios de restricción usados para generar cada fragmento de DNA en la unión apropiada y la ubicación de la región de codificación del gen lacZ. Los números entre paréntesis ( ) se refieren a los aminoácidos y los sitios de restricción entre corchetes [ ] indican los restantes sitios que se destruyen durante la construcción. Se usan las siguientes abreviaturas: virus de la pseudo-rabia (PRV por la expresión inglesa Pseudorabies Virus), gen del operón de lactosa Z (lacZ), Escherichia coli (E. coli), señal de poliadenilación (pA) y glicoproteína X (gpX)

Figura 8:

Mapa de restricción con BamHI y NotI del genoma del HVT. Se muestran las regiones larga única (UL) y única corta (US). Las repeticiones de regiones largas y cortas están indicadas por las cajas o marcos. Los fragmentos BamHI están numerados en orden decreciente de tamaño. Está indicada la localización de las sondas P1-P4. El origen de cada sonda es como sigue: P1 - BamHI nº 6, P2 - BamHI nº 2, P3 – BamHI nº 13, y P4 - sub-fragmento BgIII a Stul de 4,0 KB del fragmento XbaI nº 5 genómico del HVT (8,0 KB).

Figura 9: Muestra el procedimiento para la construcción del plásmido pSY229.

Nota.- Las Figuras 10-12 se refieren a ejemplos útiles para la comprensión de la invención.

Figuras 10A-10B:

Descripción detallada del inserto del casete del gen MDV en los vectores de homología 456-18.18 y 456

17.22. Las Figuras 10A y 10B muestran un diagrama que indica la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el casete y la ubicación de los genes gA y gB del MDV. El origen de cada fragmento está descrito en el apartado Materiales y Métodos. Las secuencias localizadas en las uniones entre cada fragmento y en los extremos del gen marcador se muestran en las Figuras 10A y 10B, incluyendo la unión A (SEQ ID NO: 34), la unión B (SEQ ID NO. 35) y la unión C (SEQ ID NO. 36). Los sitios de restricción usados para generar cada fragmento están indicados en la unión apropiada. Los números entre paréntesis () se refieren a los aminoácidos y los sitios de restricción entre corchetes [ ] indican los restantes sitios que se destruyeron durante la construcción.

Figuras 11A-11B:

Descripción detallada del inserto del fragmento HindIII en el vector de homología 556-41.5. El diagrama de las Figuras 11A y 11B muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el casete. El origen de cada fragmento está descrito en el apartado Materiales y Métodos. Las Figuras 11A y 11B muestran además las secuencias de DNA localizadas en las uniones entre cada fragmento de DNA del plásmido y en los extremos del gen marcador, incluyendo la unión A (SEQ ID NO. 37), la unión B (SEQ ID NO. 38) y la unión C (SEQ ID NO. 39). Los sitios de restricción usados para generar cada fragmento están indicados en la unión apropiada. También se da la localización del gen gD del MDV y una parte del gen gI. Los números entre paréntesis ( ) se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [ ] indican los restantes sitios que se destruyeron durante la construcción.

Figuras 12A-12C:

Descripción detallada del inserto del fragmento SalI en el vector de homología 255-18.B16. La Figura 12A muestra un diagrama que indica la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el casete. El origen de cada fragmento está descrito en el apartado Materiales y Métodos. Las Figuras 12A a 12C muestran además las secuencias de DNA localizadas en las uniones entre cada fragmento y en los extremos del gen marcador, incluyendo la unión A (SEQ ID NO. 40), la unión B (SEQ ID NO: 41), la unión C (SEQ ID NO:42), la unión D (SEQ ID NO:43), la unión E (SEQ ID NO: 44), la unión F (SEQ ID NO: 45), la unión G (SEQ ID NO: 46) y la unión H ((SEQ ID NO: 47). Los sitios de restricción usados para generar cada fragmento están indicados en la unión apropiada. Se muestra la localización del gen híbrido F del NDV y lacZ-HN del NDV. Los números entre paréntesis ( ) se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [ ] indican los restantes sitios que se destruyeron durante la construcción.

Figuras 13A-13B:

Muestran como el sitio XhoI único del fragmento BamHI nº 10 del genoma del HVT se convirtió en un sitio PacI y un sitio NotI mediante la inserción de la secuencia de DNA sintético en el sitio XhoI (Nucleótidos nº 1333-1338; SEQ ID NO: 48). La Figura 13A muestra el sitio XhoI convertido en un sitio Pacl para generar el plásmido 654-45.1 (SEQ ID NO: 55) y la Figura 13B muestra el sitio XhoI convertido en un sitio NotI para generar el plásmido 686-63.A1 (SEQ ID NO: 56).

Figura 14:

Mapa de restricción y marcos de lectura abiertos (abreviadamente en lo sucesivo ORF por la expresión inglesa Open Reading Frame) de la secuencia que rodea el sitio de inserción en el tramo largo único del HVT (SEQ ID NO: 48). Este mapa muestra el sitio de restricción XhoI (SEQ ID NO: 48; nucleótidos 13331338) usado para la inserción de genes extraños. También se muestran cuatro marcos de lectura abiertos en esta secuencia. El ORF A está interrumpido por la inserción del DNA en el sitio XhoI. La secuencia de aminoácidos del ORF A (SEQ ID NO: 50; nucleótidos 1402 a 602; 267 aminoácidos) no muestra una identidad de secuencia significativa con cualquier secuencia de aminoácidos conocida en las bases de datos de proteínas. El UL 54 (SEQ ID NO: 49; nucleótidos 146 a 481; 112 aminoácidos) y UL 55 (SEQ ID NO: 51, nucleótidos 1599 a 2135; 179 aminoácidos) muestran una identidad de secuencia significativa con las proteínas UL 54 y UL 55 del tipo I de herpesvirus simplex, respectivamente. El ORF B (SEQ ID NO: 52; nucleótidos 2634 a 2308; 109 aminoácidos) no muestra una identidad de secuencia significativa con ninguna secuencia de aminoácidos conocida en las bases de datos de proteínas. Las investigaciones se llevaron a cabo sobre bases de datos del National Center for Biotechnological Information (NCBI) del National Health Institute (NHI) de EE.UU. usando el programa de ordenador Blast.

Figura 15:

Mapa de restricción de cósmidos 407-32.1C1, 672-01.A40, 672-07.C40 y 654-45.1. Está ilustrado el solapamiento de los fragmentos EcoRI nº 9 y BamHI nº 10 de DNA genómico del HVT. Un sitio XhoI único en los fragmentos EcoRI nº 9 y BamHI nº 10 se ha convertido en un sitio PacI único en el plásmido 654-45.1

o un sitio NotI en el plásmido 686-63.A1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Esta invención proporciona un herpesvirus recombinante de pavos (HVT) que comprende una secuencia de DNA extraño insertada en un sitio no esencial en el genoma del HVT. La secuencia de DNA extraño es capaz de ser expresada en una célula hospedante infectada con el HVT recombinante y su expresión está bajo el control del promotor localizado aguas arriba (es decir, la región que se extiende en dirección 5�) de la secuencia de DNA extraño.

Como se define en la presente memoria, "un sitio no esencial del genoma del HVT" significa una región en el genoma viral del HVT el cual no es necesario para la infección viral o la replicación.

Como se define en la presente memoria, "genoma viral" o "DNA genómico" significa el DNA completo que contiene el herpesvirus de pavos natural. Como se define en la presente memoria, la "secuencia de DNA extraño" o el "gen" significa cualquier DNA o gen que es exógeno al DNA genómico.

Como se define en la presente memoria, un "marco de lectura abierto" es un segmento de DNA que contiene codones que pueden ser transcritos en RNA que a su vez puede ser traducido a una secuencia de aminoácidos y que no contiene un codón de terminación.

La invención proporciona además como sitio de inserción apropiado en el genoma del HVT, útil para la construcción del herpesvirus recombinante de la presente invención, el fragmento EcoRI nº 9 del genoma del HVT, siendo un sitio de inserción preferido dentro de este fragmento una endonucleasa de restricción XhoI.

Esta invención proporciona un herpesvirus recombinante de pavos que comprende un herpesvirus del genoma viral de pavos, que contiene una secuencia de DNA extraño insertada en el fragmento EcoRI nº 9 del herpesvirus del genoma viral de pavos, y la secuencia de DNA extraño es capaz de ser expresada en la célula hospedante infectada con el herpesvirus de pavos.

En una realización, la secuencia de DNA extraño está insertada en un marco de lectura abierto A (ORF A) del fragmento EcoRI nº 9. La inserción de las secuencias de DNA extraño en el sitio XhoI del fragmento EcoRI nº 9 interrumpe el ORF A lo que indica que la región ORFA completa no es esencial para la replicación del virus recombinante.

Para los fines de esta invención, "un herpesvirus recombinante de pavos" es un herpesvirus vivo de pavos que ha sido generado, por los métodos recombinantes muy conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, los métodos establecidos en TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES en el apartado Materiales y Métodos, y al virus no se le ha delecionado material genético esencial para la replicación del herpes-virus de pavos. El herpesvirus de pavos purificado dio como resultado una inserción estable de las secuencias de DNA extraño o de un gen en el fragmento EcoRI nº 9.

El herpesvirus recombinante de pavos de la invención comprende una secuencia de DNA extraño que codifica la glicoproteína I del virus de la laringotraqueitis infecciosa y la glicoproteína D del virus de la laringotraqueitis infecciosa que son antigénicas en un animal en el que se introduce el herpesvirus recombinante.

La siguiente descripción explica un herpesvirus recombinante de pavos con una inserción de secuencia de DNA extraño en el fragmento EcoRl nº 9 el cual comprende además una secuencia de DNA extraño que codifica el polipéptido antigénico seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos del virus de la enfermedad de Marek, del virus de la enfermedad de Newcastle, del virus de la laringotraqueitis infecciosa, del virus de la bronquitis infecciosa y del virus de la enfermedad bursal infecciosa.

La secuencia de DNA extraño puede codificar el polipéptido antigénico del virus de la enfermedad de Marek y codifica la glicoproteína gA del virus de la enfermedad de Marek, la glicoproteína gB del virus de la enfermedad de Marek

o la glicoproteína gD del virus de la enfermedad de Marek. En otra realización las secuencias de DNA extraño que codifican la glicoproteína gA, la glicoproteína gB o la glicoproteína gD del virus de la enfermedad de Marek están insertadas en el sitio Stul único de la región codificadora del gen US2 del herpesvirus de pavos.

La secuencia de DNA extraño puede codificar también un polipéptido antigénico el cual es derivado o derivable de un grupo que consiste de: gA del MDV, gB del MDV, gD del MDV, HN del NDV, F del NDV, gB del ILTV, gI del ILTV, gD del ILTV, IBV, VP2 del IBDV, VP3 del IBDV, VP4 del IBDV, virus de la encefalomielitis aviar, reovirus aviar, paramixovirus aviar, virus de la gripe aviar, adenovirus aviar, virus de viruela aviar, coronavirus aviar, rotavirus aviar, virus de la anemia del pollo (agente), Salmonella spp., E. coli, Pasteurella spp., Bordetella spp., Eimeria spp., Histomonas spp., Trichomonas spp., nemátodos de aves de corral, céstodos, tremátodos, ácaros/piojos de aves de corral, protozoos de aves de corral.

La invención proporciona además un herpesvirus recombinante de pavos que contiene una secuencia de DNA extraño que codifica un polipéptido antigénico del virus de la laringotraqueitis infecciosa. Se prefiere que el polipéptido antigénico sea la glicoproteína gD del LTV o gI del ILTV.

Los HVT recombinantes proporcionados están manipulados por ingeniería genética para que contengan más de una secuencia de DNA extraño que codifica un antígeno del ILTV. Además de los genes gI y gD del ILTV, los genes gB, gD y gI pueden ser vectorizados juntos en el genoma del HVT. El HVT recombinante denominado S-HVT-138 es una realización de tal virus recombinante.

La descripción también proporciona un HVT recombinante que contiene más de una secuencia de DNA extraño que codifica un polipéptido antigénico del MDV, así como una o más secuencias de DNA extraño que codifica(n) un polipéptido antigénico del ILTV.

Además, el HVT recombinante puede contener las secuencias de DNA extraño que codifican gB del MDV, gA del MDV, gD del MDV, gI del ILTV y gD del ILTV. Preferiblemente, este HVT recombinante se denomina S-HVT-139 o SHVT-140.

En un herpesvirus recombinante de pavos la secuencia de DNA extraño puede estar bajo el control de un promotor de herpes virus endógeno situado aguas arriba (es decir, en la región que se extiende en dirección 5�).

Además, la secuencia de DNA extraño puede estar bajo el control de un promotor heterólogo situado aguas arriba, por ejemplo, seleccionado de gX de PRV, alfa-4 de HSV-1, HCMV temprano inmediato, gA de MDV, gB de MDV, gD de MDV, gB de ILT, VP8 de BHV-1.1 y gD de ILT.

Esta invención proporciona un vector de homología para producir un herpesvirus recombinante de pavos insertando DNA extraño que codifica la glicoproteína I del virus de la laringotraqueitis infecciosa y la glicoproteína D del virus de la laringotraqueitis infecciosa en el genoma viral de un herpesvirus de pavo, que comprende una molécula de DNA bicatenario que consiste en: a) el DNA extraño bicatenario de acuerdo con la reivindicación 1; b) en un extremo del DNA extraño, el DNA bicatenario de herpesvirus de pavos homólogo al genoma viral localizado en un lado la región codificadora del sitio EcoRI nº 9 de la región codificadora del genoma viral del herpesvirus de pavos; y c) en el otro extremo del DNA extraño, el DNA bicatenario de herpesvirus de pavos homólogo al genoma viral localizado en el otro lado del fragmento EcoRI nº 9 de la región codificadora del genoma viral de herpesvirus de pavos. Los ejemplos de vectores de homología se denominan 751-87.A8 y 761-7.A1

Para los fines de esta invención, un "vector de homología" es un plásmido construido para insertar DNA extraño en un sitio específico en el genoma de un herpesvirus de pavos.

En una realización de la invención, el DNA bicatenario de herpesvirus de pavos es homólogo a las secuencias de DNA presentes en el fragmento EcoRl nº 9 del genoma del herpesvirus de pavos. Preferiblemente, este vector de homología se denomina 172-63.1.

En una realización de la invención, el DNA bicatenario del herpesvirus de pavos es homólogo a las secuencias de DNA presentes en la región codificadora del gen US2 del genoma del herpesvirus de pavos. Preferiblemente, este vector de homología se denomina 435-47.1.

En otra realización, la secuencia de DNA extraño codifica un marcador detectable. Los ejemplos de los marcadores detectables incluyen pero sin limitación β-galactosidasa de E. coli y β-glucuronidasa de E. coli.

Esta invención proporciona una vacuna útil para inmunizar un ave contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa, que comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz del herpesvirus recombinante de pavos de la invención y un vehículo adecuado.

La presente invención también proporciona una vacuna que comprende el herpesvirus recombinante de pavos de la invención para inmunizar un ave de corral contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa. El uso comprende administrar al ave de corral una dosis inmunizante eficaz de la vacuna de la presente invención. La vacuna puede ser administrada por cualesquiera de los métodos muy conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Alternativamente, la vacuna puede ser administrada intranasalmente u oralmente.

Esta invención proporciona una célula hospedante infectada con el herpesvirus recombinante de pavo. En una realización, la célula hospedante es una célula aviar.

Para los fines de esta invención, una "célula hospedante" es una célula usada para propagar un vector y su inserto. La infección de la célula se logró por los métodos muy conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, comose establece en TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES en Materiales y Métodos. Los métodos para construir, seleccionar y purificar el herpesvirus recombinante de pavos se detallan más adelante.

Para los fines de esta invención, una "cantidad inmunizante eficaz" del herpesvirus recombinante de pavos de la presente invención está en el intervalo de 103 a 109 UFP/dosis. En otra realización, la cantidad inmunizante es 105 a 107 UFP/dosis. En una realización preferida, la cantidad inmunizante es 106 UFP/dosis.

Los vehículos adecuados para el virus recombinante son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, proteínas, azúcares, etc. Un ejemplo de tal vehículo adecuado es un medio de cultivo equilibrado fisiológicamente que contiene uno o más agentes estabilizantes, tal como proteínas hidrolizadas, lactosa, etc. Preferiblemente, la vacuna viva se crea tomando fluidos de cultivo de tejidos y añadiendo agentes estabilizantes, tales como proteínas hidrolizadas estabilizantes. Preferiblemente, la vacuna inactivada usa fluidos de cultivo de tejido directamente después de la inactivación del virus.

Esta invención se ilustra además en el apartado Detalles Experimentales que sigue. Este apartado se facilita para ayudar a un entendimiento de la invención.

DETALLES EXPERIMENTALES:

Materiales y métodos

PREPARACIÓN DE HERPESVIRUS DE MUESTRAS DE RAZA DE PAVOS. Los herpesvirus de muestras de raza de pavos se prepararon infectando células de cultivo de tejidos con una multiplicidad de infección (abreviadamente en lo sucesivo MOI por la expresión inglesa Multiplicity of Infection) de 0,01 UFP/célula en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina (estos componentes se obtuvieron de Irvine Scientific o un proveedor equivalente, y en la presente memoria en lo sucesivo se mencionan como medio DME completo) más 1% de suero bovino fetal. Después de que se completó el efecto citopático, el medio y las células se cosecharon y las células se sedimentaron a 3000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga clínica. Las células infectadas se volvieron a suspender en un medio completo que contenía 20% de suero bovino fetal, 10% de DMSO y se conservaron congeladas a -70ºC.

PREPARACION DEL HERPESVIRUS DE DNA DE PAVOS. Todas las manipulaciones del herpesvirus de pavos (HVT) se hicieron usando la raza FC-126 (ATCC nº 584-C) Para la preparación del DNA viral del HVT procedente del citoplasma de células infectadas, los fibroblastos de embrión de pollo primarios se infectaron a una MOI suficiente para provocar un efecto citopático extensivo antes del sobrecrecimiento de las células. Todas las incubaciones se llevaron a cabo a 39ºC en un incubador humidificado con 5% de CO2 en aire. Los mejores rendimientos de DNA se obtuvieron cosechando monocapas que se infectaban máximamente, pero que mostraban lisis incompleta de células (típicamente 5-7 días). Las células infectadas se cosecharon rascando las células en el medio usando un rascador de células (marca Costar) La suspensión de células se centrifugó a 300 rpm durante 10 minutos a 5ºC en un rotor GS-3 (Sorvall Instruments). El sedimento resultante se resuspendió en PBS frío (20 ml/matraz rodante) y se sometió a otra centrifugación durante 10 minutos a 3000 rpm en frío. Después de decantar el PBS, el sedimento celular se volvió a suspender en un matraz rodante de 4 ml de un tampón RSB (Tris pH 7,5 10 mM, EDTA 1 mM, y Cl2Mg 1,5 mM). Se añadió NP40 (Nonidet P=40; Sigma) a la muestra a una concentración final de 0,5 % con un mezclamiento ocasional. La muestra se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm en frío para sedimentar los núcleos y separar los residuos celulares. El líquido sobrenadantes se transfirió cuidadosamente a un tubo de centrífuga Corex de 15 ml. Tanto el EDTA (0,5 M pH 8,0) como el SDS (dodecilsulfato sódico; mezcla madre 20%) se añadieron a la muestra a las concentraciones finales de 5 mM y 1% respectivamente. Se añadieron 100 μl de proteinasa-K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim) por cada 4 ml de muestra, se mezclaron y se incubaron a 45ºC durante 1-2 horas. Después de este periodo, se añadió a la muestra un volumen igual de fenol saturado con agua y se agitó suavemente a mano. La muestra se centrifugó en una centrífuga clínica durante 5 minutos a 3000 rpm para separar las fases. El NaAc se añadió a la fase acuosa a una concentración final de 0,3M (solución madre, 3M pH 5,2), y el ácido nucleico se precipitó a -70ºC durante 30 minutos después de la adición de 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío. El DNA en la muestra se sedimentó mediante centrifugación durante 20 minutos a 8000 rpm en un rotor HV-4 a 5ºC. El líquido sobrenadante se retiró cuidadosamente y el sedimento de DNA se lavó una vez con 25 ml de etanol al 80%. El sedimento de DNA se secó brevemente a vacío (2-3 minutos) y se volvió a suspender en un matraz rodante de 50 μl de células infectadas, con tampón TE (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM). Típicamente, los rendimientos de DNA viral variaron de 5-10 μg/matraz rodante de células infectadas. Todo el DNA viral se conservó a aproximadamente 10ºC.

REACCIÓN DE RELLENO CON POLIMERASA. El DNA se volvió a suspender en tampón que contenía Tris 50 mM pH 7,4, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, y 400 micromoles de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos. Se añadieron diez unidades de DNA-polimerasa Klenow (BRL) y la reacción se dejó transcurrir durante 15 minutos a temperatura ambiente. El DNA se extrajo luego con fenol y se precipitó con etanol como antes.

SECUENCIACIÓN DE DNA. La secuenciación se llevó a cabo usando el kit USB Sequenase y 35S-dATP (NEN). Las reacciones que usan tanto las mezclas como dGTP y las mezclas dITP se llevaron a cabo para clarificar áreas de compresión. Alternativamente, las áreas comprimidas se resolvieron sobre geles de formamida. Los moldes eran subclones de plásmidos bicatenarios o subclones M13 monocatenarios, y se prepararon los cebadores bien sea para el vector justo fuera del inserto que va a ser secuenciado o para la secuencia previamente obtenida. La secuencia obtenida se ensambló y comparó usando el programa de ordenador Dnastar. La manipulación y comparación de las secuencias obtenidas se llevó a cabo con los programas de ordenador Superclone y Supersee de Coral Software.

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. Las técnicas para la manipulación de bacterias y el DNA, incluyendo procedimientos tales como la digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, extracción de DNA de geles, ligamiento, fosforilación con quinasa, tratamiento con fosfatasa, crecimiento de cultivos bacterianos, transformación de bacterias con DNA y otros métodos de biología molecular, descritos por Maniatis et al., (1982) y Sambrook et al., (1989). La reacción en cadena la polimerasa (PCR) se usó para introducir sitios de restricción convenientes para la manipulación de varios DNA. Los métodos usados están descritos por Innis et al., (1990). En general los fragmentos amplificados eran menores de 500 pares de bases en tamaño y se confirmaron regiones críticas de fragmentos amplificados mediante la secuenciación de DNA. Excepto cuando se indica, estas técnicas se usaron con pequeñas variaciones.

TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. El método general para la transferencia Southern se tomó de Maniatis et al.,(1982). El DNA se transfirió a filtros de nitrocelulosa (S&S BA85) en 20X de SSC (1X ssc = NaCl 0,15M, citrato sódico 0,015K, pH 7,0) y se prehibridó en una solución de hibridación que consistía en formamida al 30%, solución de Denhardt 1X (0,02% de polivinilpirrolidona (PVP), 0,02% de seroalbúmina bobina (BSA), 0,02% de Ficoll), 6X SSC, NaH2PO4 50 mM, pH 6,8, DNA de esperma de salmón 200 μg/ml durante 4-24 horas a 55ºC. Se añadió el DNA sonda marcado que se habla marcado mediante traslado de muesca usando un kit de Bethesda Research Laboratories (BRL) y un nucleótido marcado con 32P. El DNA sonda se separó de los nucleótidos no incorporados mediante una columna NACS (BRL) o una columna Sephadex G50 (Pharmacia). Después de hibridación durante la noche a 55ºC, el filtro se lavó una vez con 2X SSC a la temperatura ambiente seguido por dos lavados con SSC 0,1X, dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,1% durante 30 minutos a 55ºC. El filtro se secó y auto-radiografió.

MÉTODO DE CLONACIÓN DE DNA. La clonación de cDNA se refiere a los métodos usados para convertir las moléculas de RNA en moléculas de DNA siguiendo el estado de los métodos de la técnica. Los métodos de los inventores están descritos (Gubler y Hoffman, 1983). La firma Bethesda Research Laboratoires (Gaithersburg, Maryland) ha diseñado un kit de clonación de cDNA que es muy similar a los procedimientos usados por los inventores y contiene un conjunto de reactivos y protocolos que pueden usarse para duplicar nuestros resultados.

Para clonar especies de mRNA de virus, una línea de células hospedantes sensible a la infección por el virus se infectó en 5-10 unidades formadoras de placas por célula. Cuando el efecto citopático fue evidente, pero antes de la destrucción total, se separó el medio y las células se lisaron en 10 ml de tampón de lisis (tiocianato de guanidina 4M, antiespumante A al 0,1%, citrato sódico 25 mM pH 7,0, N-lauroil-sarcosina al 0,5%, beta-mercaptoetanol 1M). El lisado de células se virtió en un homogeneizador Dounce esterilizado y se homogeneizó sobre hielo 8-10 veces hasta que la solución fue homogénea. Para la purificación del RNA, 8 ml de lisado de células se pusieron en capas cuidadosamente sobre 3,5 ml de solución de CsCl (CsCl 5,7 M, citrato sódico 25 mM, pH 7,0) en un tubo de centrífuga Beckman SW41. Las muestras se centrifugaron durante 18 horas a 20ºC a 36.000 rpm en un rotor Beckman SW41. Los tubos se pusieron sobre hielo y los líquidos sobrenadantes de los tubos se retiraron cuidadosamente mediante aspiración para dejar el sedimento de RNA sin perturbación. El sedimento se volvió a suspender en un vaso de agua destilada de 400 μl y se añadieron 2,6 ml de solución guanidina (guanidina HCl 7,5 M, citrato de sodio 25 mM, pH 7,0 ditiotreitol 5 mM). Se añadieron 0,37 volúmenes de ácido acético 1 M, seguidos por 0,75 volúmenes de etanol frío y la muestra se puso a -20ºC durante 18 horas para precipitar el RNA. El precipitado se recogió mediante centrifugación en una centrífuga Sorvall durante 10 minutos a 4ºC a 10.000 rpm en un rotor SS34. El sedimento se disolvió en 1,0 ml de agua destilada, se volvió a centrifugar a 13.000 rpm y se guardó el líquido sobrenadante. El RNA se volvió a extraer del sedimento dos veces más como se indicó antes con 0,5 ml de agua destilada, y se reunieron los líquidos sobrenadantes. Se añadió a la muestra un volumen de 0,1 de solución de acetato de potasio 2M seguido por 2 volúmenes de etanol frío y la muestra se puso a -20ºC durante 18 horas. El RNA precipitado se recogió mediante centrifugación en el rotor SS34 a 4ºC durante 10 minutos a 10000 rpm. El sedimento se disolvió en 1 ml de agua destilada y la concentración se tomó por lectura de la absorción a A260/280. El RNA se conservó a 70ºC.

Se seleccionó mRNA que contiene colas de poliadenilato (poli A) usando celulosa oligo-dT (Pharmacia nº 27-55430). El RNA de poli A retenido se eluyó de la columna con tampón de elución (Tris 5 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM dodecilsulfato sódico al 0,1%) Tres mg de RNA total se hirvieron y se-enfriaron y se aplicaron a 100 mg de columna de celulosa oligo-dT en un tampón aglutinante (Tris 0,1 M, pH 7,5, LiCl 0,5 M, EDTA 5 mM, pH 8,0, dodecilsulfato de litio al 0,1%). El RNA poli-A retenido se eluyó de la columna con un tampón de elución (Tris 5 mM, pH 7,5, EDTA1 mM, pH 8,0, dodecilsulfato de litio al 0,1%). Este mRNA se volvió a aplicar a una columna de oligo-dT en un tampón aglutinante y se eluyó contra un tampón de elución. La muestra se precipitó con acetato sódico 200 mM y 2 volúmenes de etanol frío a -20ºC durante 18 horas. El RNA se volvió a suspender en 50 μl de agua destilada.

Diez μg de RNA de poli-A se desnaturalizaron en hidróxido de metil-mercurio 20 mM durante 6 minutos a 22ºC. Se añadió β-mercaptoetanol hasta 75 mM y la muestra se incubó durante 5 minutos a 22ºC. La mezcla de reacción para la síntesis de la primera cadena de cDNA en 0,25 ml contenía 1μg de cebador de oligo-dT (P-L Bio-Chemicals) o 1 μg de cebador sintético, 28 unidades de inhibidor de ribonucleasa placentaria (Bethesda Research Laboratoires nº 5518SA), Tris 100 mM, pH 8,3, KCl 140 mM, MgCl2 10 mM, dATP, dCTP, dGTP y dTTP 0,8 mM (Pharmacia), 100 microcurios de dCTP marcado con 32P (New England Nuclear nº NEG-013H), y 180 unidades de transcriptasa inversa del AMV (Molecular Genetics Resources nº MG 101). La mezcla de reacción se incubó a 42ºC durante 90 minutos, y luego se terminó con EDTA 20 mM, pH 8,0. La muestra se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo

(1:1) y se precipitó con acetato de amonio 2M y 2 volúmenes de etanol frío a -20ºC durante 3 horas. Después de la precipitación y centrifugación, el sedimento se disolvió en 100 ml de agua destilada. La muestra se cargó en una columna Sephadex de 15 ml de G-100 (Pharmacia) en un tampón (Tris 100 mM. pH 7,5, EDTA 1 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM). El borde delantero de las fracciones de DNA eluidas se reunió, y el DNA se concentró mediante liofilización hasta que el volumen fue alrededor de 100 μl, luego el DNA se precipitó con acetato de amonio más etanol como se indica antes.

La muestra de la primera cadena completa se usó para la reacción de la segunda cadena que siguió el método de Gubler y Hoffman (1983) excepto que se usaron 50 μg/ml de los dNTP, 5,4 unidades DNA-polimerasa I (Boerhinger Mannheim nº 642-711), y 100 unidades/ml de DNA-ligasa de E. coli (New England Biolabs nº 205) en un volumen total de 50 microlitros. Después de la síntesis de la segunda cadena, el cDNA se extrajo y precipitó con fenol/cloroformo. El DNA se resuspendió en 10 μl de agua destilada, se trató con 1 pμg de RNasa A durante 10 minutos a 22ºC y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1% (Agarosa de Tipo II de Sigma) en Tris-acetato 40 mM, pH 6,85. El gel se tiñó con bromuro etidio, y el DNA del intervalo de tamaño esperado se retiró del gel y electroeluyó en Tris-acetato 8mM, pH 6,85. El DNA electroeluido se liofilizó hasta alrededor de 100 microlitos y se precipitó con acetato de amonio y etanol como se indicó antes. El DNA se volvió a suspender en 20 μl de agua.

Las colas de oligo-dC se añadieron al DNA para facilitar la clonación. La mezcla de reacción contenía DNA, cacodilato potásico 100 mM, pH 7,2, ditiotreitol 0,2 mM, CaCl2 2 mM, 80 μmoles de dCTP, y 25 unidades de desoxinucleotidil-transferasa terminal (Molecular Genetic Resources nº S1001) en 50 μl. Después de 30 minutos a 37ºC la reacción se terminó con EDTA10 mM, y la muestra se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó como se indicó antes.

La muestra de DNA provista de colas de dC se asoció a 200 ng del vector plasmídico pBR322 que contenía colas de oligo-dG (Bethesda Research Laboratoires nº 5355 SA/SB) en 200 μl de Tris 0,01 M pH 7,5, NaCl 0,1M, EDTA 1 mM, pH 8,0 a 65ºC durante 2 minutos y luego a 57ºC durante 2 horas. Se prepararon células de E. coli DH-I competentes frescas y se transformaron como se describió por Hanahan (1983) usando la mitad de la muestra de cDNA asociado en veinte partes alícuotas de 200 μl de células. Las células transformadas se cultivaron en placas de agar de caldo de Luria (LB = Luria broth), más 10 µg/ml de tetraciclina. Las colonias se escrutaron respecto de la presencia de insertos en el gen de ampicilina usando Ampscreen (Bethesda Research Labs nº 5537 UA) y se tomaron para análisis las colonias positivas.

TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES. El método está basado en el procedimiento de polibreno-DMSO de Kawai y Nishizawa (1984) con las siguientes modificaciones. La generación del virus HVT recombinante depende de la recombinación de homólogos entre el DNA viral del HVT y el vector de homología plasmídico que contiene el DNA extraño deseado flanqueado por las secuencias clonadas de herpesvirus apropiadas. Las transfecciones se llevaron a cabo en placas Petri de 6 centímetros (plástico Corning) de células primarias fibroblastos de embrión de pollo (abreviadamente CEF por la expresión inglesa chick embryo fibroblast) confluentes al 50%. Las células se cultivaron en placas el día anterior en un medio de crecimiento de CEF (1X F10/199, suero de ternero fetal al 5%, glutamina al 2%, aminoácidos no esenciales al 1%, y penicilina/estreptomicina al 2%) que contenía 4 µg/ml de polibreno (solución madre 4 mg/ml en 1X HBSS). Para las co-transfecciones en la células de CEF se usaron 5 μg de DNA del HVT intacto y suspendido en 1 mililitro de un medio de CEF contenía 30 μg/ml de polibreno (solución madre 4 mg/ml en 1X HBSS. La suspensión de polibreno-DNA (1 ml) se añadió luego a una placa Petri de 6 cm de células de CEF desde la cual el medio se había aspirado, y se incubó a 39ºC durante 30 minutos. Las placas se hicieron balancear periódicamente durante este tiempo para redistribuir el inóculo. Después de este periodo, se añadieron 4 ml del medio de crecimiento de CEF directamente para lavar la placa Petri, y se incubaron durante 2,5 horas adicionales a 39ºC. En este momento, el medio se retiró de cada placa Petri, y las células se agitaron por sacudidas con 2 ml de DMSO al 30% (Dimetilsulfóxído, J.T. Baker Chemical Co.) en 1X HBSS durante 4 minutos a la temperatura ambiente. El DMSO al 30% se retiró cuidadosamente y las monocapas se lavaron 1 vez con 1X HBSS a la temperatura ambiente. Las células se incubaron luego a 39ºC después de la adición de 5 ml de medio de crecimiento de CEF. El siguiente día, el medio se cambió para retirar cualesquier indicios últimos de DMSO y para estimular el crecimiento de las células. El efecto citopático del virus se hace evidente en 6 días. La generación de una solución madre de alta concentración (80%-90% de CPE) puede usualmente hacerse en una semana desde esta fecha. Las muestras de reserva de HVT se prepararon volviendo a poner en suspensión las células infectadas en el medio de crecimiento de CEF que contenía 20% de suero de ternero fetal, DMSO al 10% y conservación a -70ºC.

MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Para el virus de la pseudo-rabia se ha demostrado la capacidad para generar herpesvirus mediante la co-transfección de fragmentos subgenómicos solapantes (Zijl et al., 1988). Si se realizan por ingeniería genética deleciones y/o inserciones directamente en los fragmentos subgenómicos antes de la co-transfección, este procedimiento da como resultado una frecuencia alta de virus que contiene la alteración genómica, reduciendo grandemente la cantidad de escrutinio requerido para purificar el virus recombinante. Este método se usó para construir el HVT recombinante.

Una genoteca de subclones que contiene fragmentos subgenómicos solapantes del HVT se generó como sigue. El DNA de HVT se obtuvo de la American Type Culture Collection (FC126 ("Calnek")). Dichos fragmentos se cizallaron y luego se seleccionaron por tamaños sobre un gradiente de glicerol como se describió por Van Zijl et al., (1988) con fragmentos de 40-50 KB escogidos como la población de inserto. Las fracciones reunidas se diluyeron dos veces con TE, se añadieron un décimo de volumen de NaAc 3M y 2,5 volúmenes de etanol, y el DNA se precipitó a 30K rpm en un rotor Beckman SW41 durante 1 hora. A los fragmentos cizallados se les dio extremos romos mediante el tratamiento inicial con DNA-polimerasa de T4, usando concentraciones de DNTP bajas para promover la retirada de los extremos colgantes de 3' seguido por el tratamiento con polimerasa de Klenow para rellenar los extremos 3' rebajados (adherentes). Estos fragmentos de inserto se ligaron luego al vector cósmido pWE15 (Strategene) el cual se digerió con BamHI, se trató con fosfatasa intestinal de ternero, y se hizo romo mediante el tratamiento con polimerasa de Klenow. La mezcla ligada se empaquetó luego usando extractos de empaquetamiento Gigapack XL (Stratagene). La ligación y empaquetamiento se recomendaron por el fabricante.

Los mapas de restricción publicados para las enzimas BamHI, HindIII, y XhoI permitieron el uso de fragmentos subclonados como sondas específicas para escrutar la genoteca cosmídica respecto a los subclones que abarca el genoma. Las sondas se generaron a partir de fragmentos de restricción subclonados. Los fragmentos se marcaron luego usando un sistema no radiactivo (Genius, Boehringer Mannheim). El escrutinio se facilitó escogiendo las colonias seguido de los medios por crecimiento durante la noche. Los conjuntos de 5 filtros y de una placa Petri maestra se estamparon con una placa Petri de microtitulación y de nuevo se dejaron crecer durante la noche. El glicerol se añadió a los pocillos a 15% y las placas se congelaron a -20ºC para proporcionar cultivos de reserva (stock) de cada colonia. Los filtros fueron del tipo BioRad Colony Lift Membranes y se trataron e hibridaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se lavaron en 0,1X SSC, SDS al 0,1%, 65ºC. Los clones que se hibridaron con la sonda no radioactiva se detectaron de acuerdo con las instrucciones del kit de Genius.

Las colonias se seleccionaron para un análisis adicional sobre la base de su hibridación para dos o más de las sondas específicas. Estas se digirieron luego con BamHI, y se compararon con los mapas publicados del HVT (Buckmaster et al., 1988). Los tres cósmidos (407-32.2C3, 407-32.IG7, y 407-32.5G6) se obtuvieron esta manera. Una descripción detallada de cada clon se da más adelante. Se encontró que la amplificación en cloranfenicol (Maniatis et al., 1982) fue necesaria para lograr rendimientos razonables de DNA de estos clones. Además, un clon cósmido (407-32.5G6) fue inestable y tuvo que ser cultivado de la reserva (stock) congelada original con el fin de obtener preparaciones de DNA satisfactorias.

El vector pWE15 permitió que los insertos fueran escindidos con NotI. Sin embargo, están presentes cuatro sitios NotI en el genoma del HVT, de manera que los insertos que abarcan estos sitios no pueden ser escindidos con NotI. Dos de los sitios NotI están presentes en el fragmento BamHI nº 2 del HVT, este fragmento se clonó directamente en pSP64. Los otros dos sitios están presentes en la región corta única en el fragmento BamHI nº1. Este fragmento se clonó directamente en el vector pWE15. Los tres cósmidos cizallados y los dos fragmentos BamHI cubren todo salvo una parte pequeña de los extremos del genoma del HVT. Debido a que estas regiones están repetidas en las porciones internas del genoma, está disponible toda la información genética.

Un sitio Stul en el gen US2 del HVT se estableció como un sitio útil para la inserción del DNA extraño utilizando elMÉTODO DE RECOMBINACION DE HOMOLOGOS PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES (véase el Ejemplo 6). El gen US2 del HVT está localizado en el fragmento BamHI nº1 el cual contiene cinco sitios Stul. Para facilitar el uso de este sitio para la inserción del DNA extraño por el sitio Stul dentro del gen US2 se convirtió en un sitio único HindIII. Esto se logró digeriendo parcialmente el subclon BamHI nº 1 con Stul e insertando luego un fragmento de 10 KB que confiere resistencia a kanomicina (NeoR) en el sitio usando enlazadores HindIlI. El gen de resistencia a kanomicina permitió la selección positiva de los clones recombinantes. El fragmento NeoR se retiró por digestión con HindIII seguido por el religamiento del clon generador 430-84.215.

El DNA se preparó por experimentos de reconstrucción mediante la digestión por restricción con enzimas las cuales cortaron los subclones fuera o flanqueando las inserciones del HVT. En algunos casos, se usó un cósmido no digerido en una reconstrucción. Los DNA digeridos se extrajeron una vez con fenol y se precipitaron con etanol. El DNA se volvió a suspender a una concentración de 0,5 a 1 μg/ml. Los experimentos de reconstrucción viral se llevaron a cabo usando Lipofectina (BRL) para mediar la transfección. Se añadieron dos a tres microgramos de cada uno del subclon a 0,5 ml de medio MEM (sales de Earle) complementados con aminoácidos no esenciales al 1% y de penicilina/estreptomicina al 2%/ (MEM+). Los controles consistieron en MEM+ sin DNA, con varios μg de DNA del HVT, o con 4 de 5 de los subclones. Separadamente, se añadieron 30 μl de Lipofectina a otros 0,5 ml de MEM+. Estas dos mezclas se combinaron luego y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Las células fibroblastos de embrión de pollo (CEF) se prepararon para transfección en la siguiente manera. Los CEF (Spafas) se cultivaron en placas Petri de 6 pocillos a 39ºC en un medio F10/M199 (1:1) que contenía aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina/estreptomicina al 2%, y suero de ternero fetal al 5% (CEF+). Las células se transfectaron hasta una confluencia de 90-95%. Para la transfección, los pocillos se aspiraron y lavaron tres veces con MEM+, y luego se incubaron cuatro horas a 39ºC con la mezcla de 1 ml de Lipofectina/DNA antes indicada. Luego se añadió un ml de más de CEF+ a los pocillos, y las células se incubaron durante la noche y se alimentaron con CEF+. Las placas Petri se examinaron luego diariamente respecto de la aparición de placas.

La lipofectina con el DNA del HVT de control dio como resultado la aparición de placas en cinco días. Cuando se usaron solo cuatro de los cinco subclones, no se obtuvieron placas. Cuando los cinco fragmentos genómicos solapantes del HVT se usaron para reconstruir el virus, las placas aparecieron desde 5 a 19 días después de la lipofección inicial. En el caso de las placas que aparecieron tardías, las placas no se vieron inicialmente sobre la monocapa infectada, y fue solo después del pase de la monocapa y el cultivo en placas Petri sobre una superficie más grande cuando aparecieron las placas. Después del pase, las placas generalmente aparecieron en 3 días. Los virus recombinantes se purificaron en placas Petri aproximadamente tres veces, y luego se analizaron para la inserción de DNA extraños.

ESCRUTINIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINANTES. Cuando el gen extraño codificó la enzima βgalactosidasa, las placas que contenían el gen se visualizaron más fácilmente. El compuesto químico Bluogal® (Bethesda Research Laboratoires) se incorporó al nivel de 200-300 μg/ml en agarosa durante el ensayo de placas, y las placas que expresaron β-galactosidasa activa se volvieron azules. Luego se toramron las placas azules y se purificaron mediante aislamientos de placas azules adicionales. Otros genes extraños se insertaron mediante re-combinación de homólogos de manera que éstos reemplazaron al gen de β-galactosidasa. En este caso no se tomaron las placas no azules para purificación del virus recombinante.

ESCRUTINIO PARA LA EXPRESIÓN DE GENES EXTRAÑOS EN HVT RECOMBINANTES USANDO ENSAYOS DE PLACAS NEGRAS. Para analizar la expresión de antígenos extraños expresados por virus HVT recombinantes, las monocapas de células CEF se infectaron con HVT recombinante, se recubrieron con medio de agarosa nutriente y se incubaron durante 4-5 días a 39ºC. Una vez que se desarrollaron las placas, la capa de agarosa se separó de la cápsula, la monocapa se lavó con PBS, se fijó con metanol al 100% durante 10 minutos a la temperatura ambiente y las células se secaron al aire.

Después de rehidratar la placa Petri con PBS, el anticuerpo primario se diluye a la dilución apropiada con PBS y se incuba con la monocapa de células durante 2 horas a la temperatura ambiente durante la noche. Luego se separó el anticuerpo no unido de las células lavando tres veces con PBS a la temperatura ambiente. Un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina se diluye con PBS y se incuba con las células durante dos horas a la temperatura ambiente. El anticuerpo secundario no unido se separa luego lavando las células tres veces con PBS a la temperatura ambiente. Después, la monocapa se lava en un tampón de desarrollo de color (Tris 100 mM, pH 9,5/ NaCl 100 mM/ MgCl2 5mM), y luego se incuba 10 minutos a toda la noche a la temperatura ambiente con una solución de sustrato recientemente preparada (0,3 mg/ml de Azul Nitro tetrazolio + 0,15 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfatasa en un tampón de desarrollo de color). Finalmente, la reacción se obtuvo reemplazando la solución de sus-trato con TE (Tris 10mM, pH 7,5/ EDTA1 mM). Las placas que expresan el antígeno correcto se tiñeron de negro.

MÉTODO PARA LA HIBRIDACIÓN EN PLACAS PARA VALORAR LA PUREZA DE LAS CEPAS (STOCKS) DE HVT RECOMBINANTES. Cuando no existe un reactivo inmunológico adecuado para detectar la presencia de un antígeno particular en un virus de HVT recombinante, la hibridación de placas puede usarse para valorar la pureza de una cepa de virus. Inicialmente, las monocapas de células CEF se infectan con varias diluciones de las cepas virales para dar 50-100 placas/10 cm. La placa de Petri, se cubre con agarosa nutriente y se incuba durante 4-5 días a 39ºC. Una vez que ocurre el crecimiento de las placas, la posición de cada placa se marca sobre el fondo de la placa de Petri. La cubierta de agarosa se retira luego, la placa de Petri se lava con PBS y la monocapa de CEF restante se transfiere a una membrana de nitrocelulosa (NC) o a una membrana de nilón BioRad pre-humedecida con PBS (tomando nota de la posición de membrana respecto a la placa de Petri). Las células contenidas sobre las membranas de NC se lisan luego colocando las membranas en 1,5 ml de NaCl 3M y NaOH 0,5 M durante 5 minutos. Las membranas se neutralizan colocándolas en 1,5 ml de acetato sódico 3M (pH 5,2) durante cinco minutos. El DNA de las células lisadas se une luego a las membranas de NC mediante tratamiento en horno a 80ºC durante 1 hora. Después de este periodo las membranas se pre-hibridan en una solución que contiene 6X SSC, leche descremada al 3%, SDS al 0,5%, (±) DNA de esperma de salmón (50 µg/ml) durante 1 hora a 65ºC. Se añade luego DNA sonda radiomarcado (alfa 32P-dCTP) y las membranas se incuban a 65ºC durante la noche (~12 horas). Después de la hibridación las membranas NC se lavan dos veces (30 minutos cada vez) con 2X de SSC a 65ºC, seguido por dos lavados adicionales a 65ºC con 0,5X de SSC. Las membranas NC se secan luego y se exponen a una película de rayos X (Kodak XOMATAR) a -70ºC durante 12 horas. Las señales positivas se alinean luego con la posición de las placas sobre la placa de Petri y la pureza de la cepa se registra como el porcentaje de placas positivas sobre el total.

CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR DE HOMOLOGIA PARA LA INSERCION, DEL GEN DE BETA-GALACTOSIDASA EN EL GEN US2 DEL HVT. El gen de βgalactosidasa (lacZ) se insertó en el fragmento EcoRI nº 7 del HVT en el sitio Stul único. El gen marcador está orientado en la misma dirección que el gen US2. Una descripción detallada del gen marcador se da en las Figuras 7A y 7B. Este se construye utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al.,, 1982 y Sambrook et al., 1989) mediante la unión de fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintéticas indicadas en las Figuras 7A y 7B. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción de aproximadamente 413 de pares de bases SalI a BamHI del fragmento de restricción BamHI nº 10 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El fragmento 2 es un fragmento de restricción de aproximadamente 3010 pares de bases BamHI a Pvull del plásmido pJF751 (Ferrari et al., 1985). El fragmento 3 es un subfragmento de restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a SalI del fragmento de restricción BamHI nº 7 del PRV (Lomniczi et al., 1984).

RNA AISLADO DE CÉLULAS DE BAZO DE POLLO ESTIMULADAS CON CONCAVALINA A. Se diseccionaron bazos de pollo de 3 semanas de SPAFAS, Inc., se lavaron y se fragmentaron a través de una jeringa/aguja para liberar las células. Después de permitir que sedimenten el estroma y los residuos, las células se sedimentaron y se lavaron dos veces con PBS. El sedimento de células se trató con un tampón hipotónico de lisis para lisar los glóbulos rojos (eritrocitos), y los esplenocitos se recuperaron y se lavaron dos veces con PBS. Los esplenocitos se resuspendieron a 5 x 106 células/ml en RPMI que contenía FBS al 5% y 5 μg/ml de concanavalina A y se incubaron a 39ºC durante 48 horas. El RNA total se aisló de las células usando reactivo de lisis de isetionato guanidina y protocolos del kit de aislamiento de RNA Promega (Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Se usaron 4 μg de RNA total en cada primera cadena que contenla los cebadores anti-sentido apropiados y la transcriptasa inversa del AMV (Promega Corporation, Madison, Wisconsin). La síntesis de cDNA se llevó a cabo en el mismo tubo siguiendo la reacción de transcriptasa inversa, usando los cebadores con sentido apropiado y DNA-polimerasa Vent® (Life Technologies, Inc., Bethesda, Maryland).

CLON SUBGENÓMICO 172-07.BA2. El plásmido 172-07.BA2 se construyó con el fin de generar HVT recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 25.000 pares de bases de DNA del HVT genómico. Este puede serusado junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción del HVT recombinante. Este plásmido puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinantes (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989) mediante la unión de dos fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 2.999 pares de bases BamHI a BamHI de pSP64 (Promega). El segundo fragmento es de aproximadamente 25.000 pares de bases, el fragmento BamHI nº 2 de HVT (Buckmaster et al., 1988).

VECTOR DE HOMOLOGÍA 172-29.31. El plásmido 172-29.31 se construyó con el fin de insertar DNA extraño en el HVT. Este contiene un sitio de enzima de restricción XhoI único en el cual puede ser insertado el DNA extraño. Cuando un plásmido que contiene un inserto de DNA extraño en el sitio XhoI se usa de acuerdo con la COTRANSFECCION DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES o el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES resultará un virus que contiene el DNA extraño. Este plásmido puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 2999 pares de bases BamHI a BamHI de pSP64 (Promega). El segundo fragmento es el fragmento de aproximadamente 3300 pares de bases BamHI nº 16 del HVT (Buckmaster et al., 1988). La secuencia completa del fragmento BamHI nº 16 se da en la SEQ ID NO: 3. Adviértase que el fragmento se clonó de tal manera que el ORF del UL43 está en la orientación transcripcional opuesta al gen de β-lactamasa del pSP64.

VECTOR DE HOMOLOGÍA 172-63.1. El plásmido 172-63.1 se construyó con el fin de insertar DNA extraño en el HVT. Este contiene un sitio de enzima de restricción XhoI único en el cual puede ser insertado el DNA extraño. Cuando un plásmido que contiene un inserto de DNA extraño en el sitio XhoI se usa de acuerdo con la COTRANSFECCION DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES o el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES resultará un virus que contiene el DNA extraño. Este plásmido puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 2999 pares de bases EcoRI a EcoRI del pSP64 (Promega). El segundo fragmento es el fragmento de aproximadamente 5500 pares de bases EcoRI nº 9 del HVT. Adviértase que el fragmento EcoRI se clonó de manera que el sitio XhoI único está más cerca del sitio HindIII único en el vector pSP64.

Ejemplo comparativo:

VECTORES DE HOMOLOGÍA 255-18.B16. El plásmido 255-18.B16 se construyó con el fin de insertar los genes HN y F del NDV en el HVT. Los genes HN y F del NDV se insertaron como un fragmento SalI en el vector de homología 172-29.31 en el sitio XhoI. Los genes HN y F del NDV se insertaron en la misma orientación transcripcional que el ORF de UL43 en el vector de homología parental. Una descripción detallada del fragmento SalI se muestra en las Figuras 12A-12C. El fragmento SalI insertado puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintético indicadas en las Figuras 12A, 12B y 12C. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción de aproximadamente 416 pares de bases SalI a BamHI del fragmento 10 de restricción BamHI del PRV (Lomniczi et al., 1984). El fragmento 2 es el fragmento de aproximadamente 3009 pares de bases de BamHI a PvuII del plásmido pJF751 (Ferrari et al., 1985). El fragmento 3 es un fragmento de restricción de aproximadamente 1200 pares de bases AvaIl a EcoRI de cDNA del gen HN del NDV de longitud completa. El fragmento 4 es un fragmento de restricción de aproximadamente 179 pares de bases EcoRI a PvuII del plásmido pSP64 (Promega). El fragmento 5 es un subfragmento de restricción de aproximadamente 357 pares de bases SmaI a BamHI del fragmento de restricción N del BamHI del HSV-1. El fragmento 6 es un fragmento de restricción de aproximadamente 1812 pares de bases BamHI a PstI del cDNA del gen F del de longitud completa. El fragmento 7 es un fragmento de restricción de aproximadamente 235 pares de bases PstI a Scal del plásmido pBR322.

CLON SUBGENÓMICO 378-50.BA1. El cósmido 378-50.BA1 se construyó con el fin de generar un HVT recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 29.500 pares de bases de DNA genómico del HVT. Este puede ser usado junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUSRECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción del HVT recombinante. Este cósmido puede construirse uniendo dos fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 8164 pares de bases BamHI a BamHI del pWE15 (Stratagene) El segundo fragmento es el fragmento de aproximadamente 29.500 pares de bases BamHI nº 1 del HVT (Buckmaster et al., 1988).

CLON SUBGENÓMICO 407-32.1C1. El cósmido 407-32.1C1 se construyó con el fin de generar el HVT recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 38.850 pares de bases del DNA del HVT genómico (véase la Figura 8). Esta región incluye los fragmentos BamHI 11, 7, 8, 21, 6, 18, aproximadamente 1250 pares de bases del fragmento 13, y aproximadamente 6.700 pares de bases del fragmento 1. Este puede ser usado junto con otrosclones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción de HVT recombinantes. Este cósmido puede construirse como se describió antes en el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Este se aisló de la genoteca de DNA cizalla-da mediante escrutinio con las sondas P1 y P4 (descritas en la Figura 8). Una cepa bacteriana que contiene el cósmido se ha depositado el 3 de marzo de 1993 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC 75428.

CLON SUBGENÓMICO 407-32.2C3. El cósmido 407-32.2C3 se construyó con el fin de generar un HVT recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 40.170 pares de bases del DNA del HVT genómico (véase la Figura 8). Esta región incluye los fragmentos BamHI nº 10, 14, 19, 17, 5 y aproximadamente 2.100 pares de basesdel fragmento 2. Este puede ser usado junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARAGENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES PARA LA CONSTRUCCION DE HVT RECOMBINANTES. Este cósmido puede construirse como se describió antesen el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Este se aisló de la genoteca DNA compartida mediante el cribado con las sondas P1 y P2 (descritas en la Figura 8). Una cepa bacteriana que contiene el cósmido se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de Acceso ATCC 75430.

CLON SUBGENÓMICO 407-32.5G6. El cósmido 407-32.5G6 se construyó con el fin de generar el HVT recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 40.000 pares de bases del DNA del HVT genómico (véase la Figura 8). Esta región incluye los fragmentos BamHI nº 9, 3, 20, 12, 16, 13 de aproximadamente 1.650 pares de bases del fragmento 2, y aproximadamente 4.000 pares de bases del fragmento 11. Este se puede usar junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción de HVT recombinantes. Este cósmido puede construirse como se describió antes en el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Este se aisló de la genoteca de DNA cizallada mediante escrutinio con las sondas P2 y P3 (descritas en la Figura 8). Una cepa bacteriana que contiene el cósmido se ha depositado el 3 de Marzo de 1993 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC 75427.

VECTOR DE HOMOLOGÍA 435-47.1. El plásmido 415-47.1 se construyó con el fin de insertar DNA extraño en el HVT. Este contiene un sitio de enzima de restricción HindIII único en el cual puede insertarse el DNA extraño. Cuando se usa un plásmido que contiene un inserto de DNA extraño en el sitio HindIII de acuerdo con la COTRANSFECCION DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES o el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES resultará un virus que contiene el DNA extraño. Este plásmido puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982, y Sambrook et al., 1989), uniendo los dos fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 2999 pares de bases EcoRI a EcoRI del pSP64 (Promega). El segundo fragmento es un fragmento de aproximadamente 7300 pares de bases de EcoRI nº 7

5 del HVT. Adviértase que el sitio HindIII del vector pSP64 se separó digiriendo el subclon con HindIII seguido por un relleno con polimerasa de Klenow en reacción y religamiento. Luego se insertó un enlazador HindIII sintético (CAAGCTTG) en el sitio Stul único del fragmento EcoRI nº 7.

CLON SUBGENÓMICO 437-26.24. El plásmido 437-26.24 se construyó con el fin de generar el HVT recombinante. Este contenía una región de aproximadamente 13.600pares de bases del DNA de HVT genómico. Este puede ser10 usado junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES PARA LA CONSTRUCCION DE HVT RECOMBINANTES. Este plásmido se construyó utilizando las técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 2970 pares de bases HindIII a BamHI del pSP64

15 (Promega). El segundo fragmento es el subfragmento de aproximadamente 13.600 pares de bases BamHI a Stul del fragmento BamHI nº 2 del HVT (Buckmaster et al., 1988). Adviértase que el fragmento BamHI nº 2 contiene cincositios Stul, el sitio utilizado en esta subclonación se convirtió en un sitio HindIII como se describió en el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES.

20 CLON SUBGENÓMICO 437-26.26. El plásmido 437-26.26 se construyó con el fin del generar HVT recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 15300 pares de bases del DNA del HVT genómico. Este puede serusado junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES PARA LA CONSTRUCCION DE HVT RECOMBINANTES. Este plásmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis

25 et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 2.970 pares de bases HindIII a BamHI del pSP64 (Promega). El segundo fragmento es el subfragmento de aproximadamente 15.300 pares de bases BamHI a Stul del fragmento BamHI nº 2 del HVT (Buckmaster et al., 1988). Adviértase que el fragmento BamHI nº 2 contiene cincositios Stul, el sitio utilizado en esta subclonación se convirtió en un sitio HindIII como se describió en el MÉTODO

30 PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTE DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES.

Ejemplo comparativo:

VECTORES DE HOMOLOGÍA 456-18.18 y 456-17.22. Los plásmidos 45618.18 y 456-17.22 se construyeron con el fin de insertar los genes gA y gB del MDV en en el HVT. Los genes del MDV se insertaron como un casete en el vector de homología 435-47.1 en el sitio HindIII único. Los genes del MDV se insertaron en el sitio HindIII como un 35 fragmento PstI a EcoRI de extremos romos (véanse las Figuras 10A y 10B). Los sitios HindIII y EcoRI se hicieron romos mediante llenado con polimerasa de Klenow en reacción. El sitio PstI se hizo romo mediante la reacción con DNA-polimerasa de T4. Adviértase que el casete del MDV se insertó en ambas orientaciones. El plásmido 456-18.18 contiene los genes del MDV insertados en la orientación transcripcional opuesta al gen US2 en el vector de homología parental. El plásmido 456-17.22 contiene los genes del MDV insertados en la misma orientación transcripcional 40 que el gen US2 en el vector de homología parental. Una descripción detallada del casete del MDV se da en las Figuras 10A y 10B. Este puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989) uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintético indicadas en las Figuras 10A y 10B. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción de aproximadamente 2178 pares de bases PvuII a EcoRV del fragmento de restricción EcoRI del MDV genómico de 6,9 KB (Ihara et al.,

45 1989). El fragmento 2 es un fragmento genómico del MDV de aproximadamente 3898 pares de bases SalI a EcoRI (Ross et al., 1989).

Ejemplo comparativo:

VECTOR DE HOMOLOGÍA 528-0.3.37. El plásmido 528-03.37 se construyó con el fin de insertar el gen gD del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) en el HVT. El gen gD seguido por la señal de poliadenilación de gX del PRV 50 se insertó como un casete en el vector de homología 435-47.1 en el sitio HindIlI único. El casete se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1989 y Sambrook et al., 1989) uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un sub-fragmento de restricción de aproximadamente 2.060 pares de bases EcoRI a BclI del fragmento de restricción genómico KpnI nº 8 del ILTV (10,6 KB). El segundo fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a SalI del

55 fragmento de restricción BamHI nº 7 del PRV (Lomniczi et al., 1984). Adviértase que los fragmentos están orientados de manera que los sitios Bcll y NdelI están contiguos.

Ejemplo comparativo:

VECTOR DE HOMOLOGÍA 528-11.43. El plásmido 528-11.43 se construyó con el fin de insertar el gen gB del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) (A. M. Grifin, 1991) en el HVT. El gen gB se insertó como un fragmento EcoRI en el vector de homología 435-47.1 en el sitio HindIII único. El gen gB se insertó en el sitio HindIII de extremos romos como un fragmento EcoRI de extremos romos. Los sitios HindlII y EcoRI se hicieron romos por llenado con polimerasa de Klenow en reacción. El gen gB se insertó en la misma orientación transcripcional que el gen US2 en el vector de homología parental. El fragmento EcoRI puede obtenerse como un fragmento genómico del virus del ILTV de 3,0 KB.

VECTOR DE HOMOLOGÍA 518-46.B3. El plásmido 518-46.B3 se construyó con el fin de insertar un DNA extraño en el HVT. Este contiene un sitio de enzima de restricción HindIII único en el cual puede insertarse el DNA extraño. Cuando un plásmido que contiene un inserto de DNA extraño en el sitio HindIII se usó de acuerdo con la COTRANSFECCION DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES o con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES resultará un virus que contiene el DNA extraño. Este plásmido puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989) uniendo tres fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 1649 pares de bases PvuI a SalI del pSP64 (Promega). El segundo fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 1368 pares de bases PvuI a SalI del PSP65 (Promega). El tercer fragmento es el fragmento XhoI a XhoI del plásmido 437-47.1 de aproximadamente 3400 pares de bases.

Ejemplo comparativo:

VECTOR DE HOMOLOGÍA 535-70.3. El plásmido 535-70.3 se construyó con el fin de insertar los genes gB y gA del MDV y el gen F del MDV en el HVT. El gen F se insertó como un casete en el vector de homología 456-17.22 en el sitio HindIII entre los genes gA y gB del MDV (véase la Unión B, Figura 10A) El gen F está bajo el control del promotor del HCMV temprano inmediato y seguido por la señal de poliadenilación de TK del HSV-1. El gen F se insertó en la misma orientación transcripcional que el gen US2 en el vector de homología parental. El casete puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 1191 pares de bases PstI a AvaII del sub-fragmento XbaI E genómico del HCMV (D.R. Thomsen et al., 1991). El segundo fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 1812 pares de bases BamHI a PstI del clon de cDNA del gen F del NDV de longitud completa (cepa B1). El último fragmento es un sub-fragmento de restricción de aproximadamente 784 pares de bases SmaI a SmaI del fragmento de restricción Q del HSV-1 (McGeoch et al., 1985).

Ejemplo comparativo:

VECTOR DE HOMOLOGÍA 549-24.15. El plásmido 549-24.15 se construyó con el fin de insertar los genes gB y gA del NDV y los genes F y HN del NDV en el HVT. Los genes HN y F se insertan como un casete en el vector de homología 456-17.22 en el sitio HindIII localizado entre los genes gA y gB del MDV (véase la Unión B, Figura 10A). Los genes HN y F están bajo el control de los promotores gpX del PRV y temprano inmediato del HCMV respectivamente. Los genes HN y F van seguidos por las señales de poliadenilación gX de PRV y TK de HSV-1 respectivamente. El casete puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 413 pares de bases SalI a BamHI del fragmento BamHI nº 10 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El segundo fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 1.811 pares de bases SmaII a SalI del clon de cDNA del gen HN del NDV de longitud completa (cepa B1). El tercer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a SalI del fragmento BamHI nº7 de restricción del PRV (Lomniczi et al., 1984). El cuarto fragmento es un subfragmento de restricción PstI a AvaII de aproximadamente 1191 pares de bases del sub-fragmento XbaI E genómico del HCMV (D.R. Thomsen et al., 1981). El quinto fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 1812 pares de bases de BamHI a PstI del clon de cDNA del gen F del NDV de longitud completa (cepa B1) El último fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 784 pares de bases SmaI a SmaI del fragmento Q de restricción BamHI -1 del HSV (McGeoch et al., 1985).

Ejemplo comparativo:

VECTOR DE HOMOLOGÍA 549-62.10. El plásmido 549-62.10 se construyó con el fin de insertar los genes de gB y gA del NDV y el gen HN del NDV en el HVT. El gen HN se insertó como un casete en un vector de homología 456

17.22 en el sitio HindIII entre los genes gA y gB del MDV (véase la Unión B, Figura 10A). El gen HN está bajo el control del promotor gpX del PRV y seguido por la señal de poliadenilación gX del PRV. El gen HN se insertó en la misma orientación transcripcional que el gen US2 en el vector de homología parental. El casete se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982, y Sambrook et al., 1989) uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 413 pares de bases SalI a BamH.I del fragmento BamHI nº 10 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El segundo fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 1811 pares de bases AvaII a Nael del clon de cDNA del gen HN del NDV de longitud completa (cepa B1). El último fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a SalI del fragmento de restricción BamHI nº7 del PRV (Lomniczi et al., 1984).

CLON SUBGENÓMICO 550-60.6. El plásmido 550-60.6 se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. Este contiene una región de aproximadamente 12.300 pares de bases del DNA del HVT genómico. Puede usarse juntocon otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES PARA LA CONSTRUCCION DE UN HVT RECOMBINANTE. Este plásmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982, y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 4176 pares de bases EcoRV a BamHI de pBR622. El segundo fragmento es el subfragmento de aproximadamente 12.300 pares de bases del fragmento BamHI nº 2 del HVT (Buckmaster et al., 1988). Este fragmento se generó de la siguiente manera. El plásmido 437-26.26 se linealizó con HindIII y luego se recortó con el ExoIII Mung Bean Deletion Kit (Stratagene). Las muestras de las reacciones de 3 y 4 minutos se reunieron y se digirieron con BamHI dando como resultado una población de fragmentos que contiene el subfragmento deseado de 12300 pares de bases. Esta población se clonó en el fragmento pBR322 y los clones resultantes se escrutaron para el tamaño y mapa de restricción apropiado. Afortunadamente, el subfragmento recortado que se generó del clon 550-60.6 terminó en los nucleótidos GG los cuales generaron un segundo sitio BamHI cuando se ligaron al sitio EcoRV (ATCC) de pBR322. Una cepa bacteriana que contiene este plásmido se ha depositado el 3 de marzo de 1993 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC Nº 75429.

Ejemplo comparativo:

VECTORES DE HOMOLOGÍA 566-41.5. El plásmido 566-41.5 se construyó con el fin de insertar los genes gA, gB y gD del MDV en el HVT. El gen gD del MDV se insertó como un fragmento HindIII en el vector de homología 456

17.22 en el sitio HindIII localizado entre gA y gB del MDV (véanse las Figuras 10A y 10B). El gen gD del MDV se insertó en la misma orientación transcripcional que los genes gA y gB en el vector de homologia parental. Una descripción detallada del fragmento HindIII que contiene el gen gD del MDV se muestra en las Figuras 11A y 11B. Adviértase que la señal de poliadenación de herpesvirus se añadió al casete del gen gD. El fragmento HindIII insertado puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989) uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintético indicadas en las Figuras 11A y 11B. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción de aproximadamente 784 pares de bases SmaI a SmaI del fragmento Q de restricción BamHI del HSV-1 (McGeoch et al., 1988). Adviértase que este fragmento está orientado de manera que la secuencia de poliadenilación (AATAAA) está localizado lo más cerca a la Unión B. El fragmento 2 es un sub-fragmento de aproximadamente 2177 pares de bases SalI a NcoI del fragmento de restricción genómico BglII de 4,2 KB del MDV (Ross et al., 1991).

Ejemplo comparativo

VECTOR DE HOMOLOGÍA 567-72.1D. El plásmido 567-72.1D se construyó para los fines de insertar los genes gB, gA, y gD del MDV y los genes clavo y matriz del virus de la bronquitis infecciosa (IBV) en el HVT. Los genes del IBV están insertados en forma de un casete en el vector de homología 566-41.5 en el sitio NotI único localizado aguas arriba (es decir, hacia el extremo 5’) del gen gD de MDV (véase la Unión C, Figura 11B). Los genes de las proteínas matriz y clavo del IBV están bajo el control de los promotores temprano inmediato del HSV-1 y gpX del PRV, respectivamente. Los genes clavo y matriz del IBV van seguidos por las señales de poliadenilación TK del HSV-1 y gX del PRV respectivamente. Los genes del IBV están insertados en la misma orientación transcripcional que el gen US2 en el vector de homología parental. El casete puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 413 pares de bases SalI a BamHI del fragmento BamHI nº 10 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El segundo fragmento contiene los aminoácidos 1 a 223 del gen matriz del IBV. La región codificante se obtuvo del clon de cDNA de la cepa Arkansas del IBV. El tercer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a SalI del fragmento de restricción BamHI nº 7 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El cuarto fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 1191 pares de bases PstI a AvalI del fragmento genómico XbaI E del HCMV (D.R. Thomsen et al., 1981). El quinto fragmento contiene los aminoácidos 4 a 1162 aminoácidos del gen clavo del IBV. La región codificante se obtuvo del clon de cDNA de la cepa Arkansas del IBV. El último fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 784 pares de bases SmaI a SmaI del fragmento de restricción Q de BamHI del HSV1 (McGeoch et al., 1985).

Ejemplo comparativo:

VECTOR DE HOMOLOGÍA 603-57.F1. El plásmido 603-57.F1 se construyó con el fin de insertar el gen VP2 del IBDV en el HVT. El gen VP2 del IBDV se insertó como un casete en el vector de homología 435-47.1 en un sitio HindIII único. El gen VP2 está bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV y va seguido por la señal de poliadenilación de TK del HSV-1. El gen VP2 se insertó en la misma orientación transcripcional que el US2 en el vector de homología parental. El casete puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 1191 pares de bases PstI a AvaII del fragmento genómico de XbaI E del HCMV (D.R. Thomsen et al., 1981). El segundo fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 1081 pares de bases BclI a BamHI del clon de cDNA de longitud completa del IBDV (véase la SEQ ID NO:1). Adviértase que el sitio BclI se introdujo en el clon de cDNA directamente aguas arriba de la metionina del iniciador VP2 convirtiendo la secuencia CGCAGC en TGATCA. Los fragmentos primero y segundo están orientados de manera que los sitios AvaII y BclI estén contiguos. El tercer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 784 pares de bases SmaI a SmaI del fragmento de restricción Q de BamHI de HSV-1 (McGeoch et al., 1985).

Ejemplo comparativo:

VECTOR DE HOMOLOGÍA 633-13.27. El plásmido 633-13.27 se construyó con el fin de insertar los genes gB, gA y gD del MDV y los genes HN y F del NDV en el HVT. Los genes HN y F están bajo el control de los promotores tempranos inmediatos gpX del PRV y de HCMV respectivamente. Los genes HN y F van seguidos por las señales de poliadenilación del gX del PRV y de TK del HSV-1, respectivamente. Todos los cinco genes estaban insertados en la misma orientación transcripcional que el gen US2 en el vector de homología parental. Los genes estaban insertados en el siguiente orden: gen gA del MDV, gen HN del NDV, gen F del NDV, gen gD del MDV y gen gB del MDV.

Ejemplo comparativo:

VECTOR DE HOMOLOGÍA 634-29.16. El plásmido 634-29.16 se construyó con el fin de insertar los genes gB y gD del ILTV en el HVT. El gen marcador lacZ va seguido por los genes gB y gD del ILTV insertados como un casete en el vector de homología 172-29.31 en el sitio XhoI único. El casete se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 4229 pares de bases SalI a SalI derivado del gen marcador lacZ antes descrito y mostrado en las Figuras 7A y 7B. El segundo fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 2060 pares de bases EcoRI a BclI del fragmento de restricción genómico nº 8 de KpnI de ILTV (10,6 KB). El tercer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a SalI del fragmento de restricción BamHI nº7 del PRV (Lomniczi et al., 1984). Adviértase que los fragmentos segundo y tercero están orientados de manera que los sitios BclI a NdeI estén contiguos. El cuarto fragmento es el fragmento EcoRI genómico de 3,0 KB del ILTV que contiene el gen gB. Todos los tres genes están en la misma orientación transcripcional que el gen UL43.

CLON SUBGENÓMICO 415-09.BA1. El cósmido 415-09.BA1 se construyó con el fin de regenerar HVT recombinantes. Contiene un fragmento BamHI nº 1 de aproximadamente 29.500 pares de bases de DNA del HVT genómico.Este se usó junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUSRECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción de HVT recombinantes. Este cósmido se construyó uniendo dos fragmentos de restricción (Sambrook et al., 1989) de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento de restricción de aproximadamente 4430 pares de bases BamHI a BamHI de pSY1005 derivado de pHC79. (Bethesda Research Laboratories, Inc.) y pWE15 (Stratagene, Inc.). El primer fragmento es el fragmento BamHI nº 1 de aproximadamente 29.500 pares de bases del genoma del HVT (Buckmaster et al., 1988).

CLON SUBGENÓMICO 672-01.A40. El cósmido 672-01.A40 se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. Este se aisló como un subclon del cósmido 407-32.1CI (véanse la Figuras 8 y 15). El cósmido 672-01.A40 contiene un subfragmento de aproximadamente 14.000 pares de bases NotI a AscI y aproximadamente un subfragmento de aproximadamente 1300 pares de bases AscI a BamHI del cósmido 407-32.1C1. El cósmido se construyó uniendo los fragmentos de restricción (Sambrook et al., 1989) de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento de aproximadamente 2700 pares de bases NotI a BamHI construido a partir de pNEB193 (New England Biolabs, Inc.) el cual contiene el enlazador NotI insertado en el sitio SmaI. El fragmento I es una región de aproximadamente 15.300 pares de bases del DNA del HVT genómico. Esta región incluye los fragmentos BamHI 11 y 7, y aproximadamente1250 pares de bases del fragmento 13. Se usó junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODOPARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción del HVT recombinantes.

CLON SUBGENÓMICO 654-45.1. El plásmido 654-45.1 se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. Se aisló como un subclon AscI del cósmido 407-32.1C1 (véanse las Figuras 8 y 15). El cósmido se construyó uniendo los fragmentos de restricción (Sambrook et al., 1989) de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento AscI de aproximadamente 2.000 pares de bases construido a partir de un fragmento AatII a PvuII de 2.000 pares de bases de pNEB 193 (New England Biolabs, Inc.) con los extremos hechos romos con DNA-polimerasa de Klenow y enlaza-dores AscI insertados. El fragmento 1 es un fragmento de aproximadamente 8.600 pares de bases AscI a AscI de DNA del HVT genómico. Esta región incluye los fragmentos 10 y 21 de BamHI y aproximadamente 1.100 pares de bases del fragmento nº 6 y aproximadamente 1.300 pares de bases del fragmento 7. El sitio XhoI (nucleótidos nº 1339-1344; SEQ ID NO: 48) se ha convertido en un sitio PacI único usando enlazadores de DNA sintéticos. El sitio PacI se usó en la inserción y expresión de genes extraños en HVT. (Véase la Figura 13A). Se usó junto con otrosclones subgenómicos de acuerdo con el MÉTODO PARA LA GENERACION DE HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción del HVT recombinante.

CLON SUBGENÓMICO 686-63.A1. El plásmido 686-63.A1 se construyó con el fin de generar HVT recombinante. Se aisló como un subclon AscI del cósmido 407-32.1CI (véanse las Figuras 8 y 15). El cósmido se construyó uniendo los fragmentos de restricción (Sambrook et al., 1989) de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento de aproximadamente 2.000 pares de bases AscI construido del fragmento AatII a PvuII de 2000 pares de bases de pNEB193 (New England Biolabs, Inc) hecho de extremos romos con los enlazadores DNA-polimerasa de Klenow y AscI insertados. El fragmento 1 es un fragmento de aproximadamente 8.600 pares de bases AscI a AscI del DNA del HVT genómico. Esta región incluye los fragmentos BamHI 10 y 21 y aproximadamente 1.100 pares del fragmento 6 y aproximadamente 1.300 pares de bases del fragmento 7. El sitio XhoI (Nucleótidos nº 1339-1344; SEQ ID NO: 48) se ha convertido en un sitio NotI único usando enlazadores de DNA sintético. El sitio NotI se usó para la inserción y expresión de genes extraños en el HVT (véase la Figura 13B). Se usó junto con otros clones subgenómicos deacuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción del HVT recombinantes.

CLON SUBGENÓMICO 672-07.C40. El cósmido 672-07.C40 se construyó con el fin de generar HVT recombinante. Se aisló como un subclon del cósmido 407-32.1C1 (véanse las Figuras 8 y 15). El cósmido 672-07.C40 contiene un subfragmento BamHI a AscI de aproximadamente 1.100 pares de bases y un subfragmento AscI a NotI de aproximadamente 13.000 pares de bases del cósmido 407-32.11. El cósmido se construyó uniendo los fragmentos de restricción (Sambrook et al., 1989) de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento NotI a BamHI de aproximadamente 2700 pares de bases construido a partir de pNEB193 (New England Biolabs, Inc.) que contenía un enlazador NotI insertado en el sitio SmaI. El fragmento 1 es una región de aproximadamente 14.100 pares de bases de DNA del HVT genómico. Esta región incluye los fragmentos BmaHI nº 6 y 18 y un fragmento BamHI a NotI de aproximadamente 2.600 pares de bases en el fragmento BamHI nº 1. Se usó junto con otros clones subgenómicosde acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES para la construcción del HVT recombinante.

Ejemplo comparativo:

CLON SUBGENÓMICO 706-57.A3. El plásmido 706-57.A3 se construyó con el fin de generar HVT recombinante. El plásmido 706-57.A3 contenía el gen VP2 de IBDV insertado en el sitio PacI del plásmido 654-45.1. El gen VP2 del IBDV usó el promotor VP8 del IBRV y la señal de poliadenilación US3 del ILTV. El cósmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante Sambrook et al., 1989). El primer fragmento es un fragmento de 208 pares de bases HindIII a BamHI codificado para el promotor VP8 del IBRV (Carpenter et al., 1991). El segundo fragmento es un fragmento de aproximadamente 1626 pares de bases que codifica el gen VP2 del IBDV derivado por transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (Sambrook et al., 1989) de RNA genómico (USDA) de la cepa de inoculación estándar del IBDV (Kibenge et al., 1990). El cebador anti-sentido usado para la transcripción inversa y el PCR fue 5´-CTGGTTCGGCCCATGATCAGATGACAAACCTGCAAGATC-3´ (SEQ ID NO: 53). El cebador con sentido usado para PCR fue 5'-CTGGTTCGGCCCATGATCAGATGACAAACCTGCAAGATC-3' (SEQ ID NO: 54) El fragmento de DNA generado mediante PCR se clonó en el vector PCR-Direct® (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California). El fragmento VP2 del IBDV se subclonó después a continuación para el promotor VP8 usando los sitios BclI generados por los cebadores de PCR. La secuencia de DNA en esta unión añade los aminoácidos metionina, aspartato y glutamina antes de la metionina iniciadora natural de VP2. El fragmento de DNA contiene la secuencia codificadora del aminoácido 1 hasta el aminoácido 536 de la poliproteína del IBDV (SEQ ID NO: 2) la cual incluye la secuencia de codificación completa de la proteína VP2. El tercer fragmento es un fragmento de aproximadamente 494 pares de bases que codifica la señal de poliadenilación US3 del ILTV.

CLON SUBGENÓMICO 711-92.1A. El plásmido 711-92.1A se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. El plásmido 711-92.1A contiene los genes gD y gI del ILTV insertados en el sitio PacI del plásmido 654-45.1. Los genes gD y gI del ILTV usan sus promotores del ILTV endógenos respectivos y la señal de poliadenilación endógena compartida única. El plásmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989). El primer fragmento es un subfragmento de restricción SalI a HindIII de aproximadamente 3556 pares de bases del fragmento nº 8 genómico Asp 718I (10,6 kb).

Ejemplo comparativo:

CLON SUBGENÓMICO 717-38.12. El plásmido 717-38.12 se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. El plásmido 717-38.12 contiene los genes HN y F del NDV insertados en el sitio PacI del plásmido 654-45.1. El gen HN del NDV usa el promotor temprano inmediato del HCMV y la señal de poliadenilación de gX del PRV. El gen F del NDV usa el promotor temprano inmediato del HCMV y la señal de poliadenilación TK de HSV. El plásmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989). El primer fragmento es un sub-fragmento de restricción de aproximadamente 413 pares de bases SalI a BamHI del fragmento BamHI nº 10 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El segundo fragmento es un fragmento de restricción AvalI a Nael de aproximadamente

1.811 pares de bases del clon de cDNA del gen HN del NDV (cepa B1). El tercer fragmento es un subfragmento de restricción Ndel a SalI de aproximadamente 754 pares de bases del fragmento de restricción nº7 de BamHI del PRV (Lomniczi et al., 1984). El cuarto fragmento es un subfragmento de restricción PstI a AvaII de aproximadamente 1191 pares de bases del fragmento XbaI E genómico del HCMV (D.R. Thomsen et al., 1981). El quinto fragmento es un fragmento de restricción BamHI a PstI de aproximadamente 1.812 pares de bases del clon de cDNA del gen F del NDV de longitud completa (cepa B1; SEQ ID NO: 12). El sexto fragmento es un subfragmento de restricción SmaI a SmaI de aproximadamente 784 pares de bases del fragmento de restricción Q de BamHI del HSV-1 (McGeoch et al., 1985).

Ejemplo comparativo:

CLON SUBGENÓMICO 721-38.1J. El cósmido 721-38.1J se construyó con el fin de insertar los genes gA, gD, y gB del MDV en la región corta única del HVT y con el fin de generar HVT recombinante. El cósmido 721-38.1J contenía los genes gA, gD, y gB del MDV insertados en el sitio Stul en el gen US2 del HVT convertido en un sitio HindIII único dentro del fragmento BamHI nº 1 de la región corta única del HVT. Esta región del fragmento BamHI nº 1 del HVT que contiene los genes del MDV se obtuvo de S-HVT-062. El cósmido 721-38.1J se construyó mediante una restricción parcial digerida con BamHI de DNA de S-HVT-062 y aislamiento de un fragmento de aproximadamente 39.300 pares de bases. El cósmido se construyó utilizando técnicas de estándares de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento BamHI de aproximadamente 8.200 pares de bases del vector cósmido pWE15. El primer fragmento es un fragmento BamHI de aproximadamente 900 pares de bases de la región de repetición del genoma del HVT. El segundo fragmento es un sub-fragmento BamHI a Stul de aproximadamente 15.500 pares de bases del BamHI nº 1 del HVT. El tercer fragmento es un casete de aproximadamente 8.400 pares de bases que contiene los genes gA, gD y gB del MDV (véanse las Figuras 10 y 11). El cuarto fragmento es un subfragmento HindIII a BamHI de aproximadamente 14.500 pares de bases de BamHI nº 1 del HVT.

Ejemplo comparativo:

CLON SUBGENÓMICO 722-60.E2. El cósmido 722-60.E2 se construyó con el fin de insertar los genes gA, gD y gB del MDV y los genes HN y F del NDV en la región corta única del HVT y con el fin de generar HVT recombinantes. El cósmido 722-60.E2 contiene los genes gA, gD y gB del MDV y los genes HN y F del NDV insertados en el sitio Stul en el gen US2 del HVT convertido en un sitio HindIII dentro del fragmento BamHI nº 1 de la región corta única del HVT. Todos los cinco genes están insertados en la misma orientación transcripcional que el gen US2 del HVT. Esta región del fragmento BamHI nº 1 del HVT que contiene los genes del MDV y NDV se derivó de S-HVT-106. El cósmido 722-60.E2 se construyó mediante una restricción parcial digerida con BamHI de S-HVT-106 y el aislamiento de un fragmento de aproximadamente 46.300 pares de bases. El cósmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989) uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento BamHI de aproximadamente 6100 pares de bases del vector cósmido pSY1626 derivado de pHC79 (Bethesda Research Labs, Inc.) y pWE15 (Strategene, Inc.). El primer fragmento es un fragmento BamHI de aproximadamente 900 pares de bases de la región de repetición del genoma del HVT. El segundo fragmento es un subfragmento BamHI nº1 de aproximadamente 15.500 pares de bases BamHI a Stul del HVT. El tercer fragmento es un casete de aproximadamente 15.400 pares de bases que contiene el gen gA del MDV (Figuras 10A y 10B, SEQ ID NO: 8), el promotor gX del PRV (Lomniczi et al., 1984). El gen HN del NDV (SEQ ID NO: 10), el sitio de poliadenilación gX del PRV (Lomniczi et al., 1984), el promotor temprano inmediato del HCMV (D.R. Thomsen et al., 1981), el gen F del NDV (SEQ ID NO: 12), el sitio de poliadenilación de TK del HSV (McGeoch et al., 1985), el gen gD del MDV (Figuras 11A y 11B), el sitio de poliadenilación US3 del ILTV de aproximadamente 450 pares de bases y el gen gB del MDV (Figuras 10A y 10B). El cuarto fragmento es un subfragmento Stul a BamHI de aproximadamente

14.500 pares de bases del BamHI nº 1 del HVT.

Ejemplo comparativo:

CLON SUBGENÓMICO 729-37.1. El plásmido 729-37.1 se construyó con el fin de generar HVT recombinante. El plásmido 729-37.1 contiene los genes gD y gB del ILTV insertados en el sitio NotI del plásmido 686-63.A1. Los genes gD y gB del ILTV usan sus promotores del ILTV endógenos respectivos y los genes gD y gB del ILTV van cada uno seguido por unas señales de poliadenilación gX del PRV. El casete de genes gD y gB del ILTV se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989). El primer fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 2.052 pares de bases SalI a XbaI del fragmento nº 8 del ILTV Asp 7l8I genómico (10,6 KB). El segundo fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 572 pares de bases XbaI a Asp 718I del fragmento de restricción BamHI nº7 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El tercer fragmento es un fragmento de restricción de restricción EcoRI a EcoRI de aproximadamente 3059 pares de bases de DNA genómico del ILTV. El cuarto fragmento es un subfragmento de restricción EcoRI a SalI de aproximadamente 222 pares de bases del fragmento de restricción BamHI nº7 del PRV (Lomniczi et al., 1984).

Ejemplo comparativo:

CLON SUBGENÓMICO 739-27.16. El cósmido 739-27.16 se construyó con el fin de construir un virus HVT/MDV aquimérico que contiene genes del HVT de la región larga única y genes del MDV de tipo 1 de la región corta única. El cósmido 739-27-16 contiene la región corta única completa del MDV tipo 1. Esta región contiene el fragmento completo SmaI B y dos fragmentos SmaI K. El cósmido 739-27.16 se construyó mediante una restricción parcial digerida con SmaI de DNA del MDV y el aislamiento de un fragmento de aproximadamente 29.000 a 33.000 pares de bases. El cósmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento BmaHI de aproximadamente 8200 pares de bases (hecho de extremos romos con DNA-polimerasa de Klenow) del vector cósmido pWE15. El primer fragmento es un fragmento SmaI K de aproximadamente 4.050 pares de bases de la región de repetición interna corta del genoma del MDW. El segundo fragmento es un fragmento SmaI B de aproximadamente 21.000 pares de bases del MDV. El tercer fragmento es un fragmento SmaI K de aproximadamente 3.650 pares de bases de la región de repetición terminal corta del genoma del MDV (Fukuchi et al., 1984, 1985).

CLON SUBGENÓMICO 751-87.A8. El plásmido 751-87.A8 se construyó con el fin de generar HVT recombinante. El plásmido 75-187.A8 contiene el gen del factor de crecimiento mielomonocítico de pollo (cGMF) insertado en el sitio PacI del plásmido 654-45.1. El gen del cMGF usó el promotor temprano inmediato del HCMV y la señal de poliadenilación de TK del HSV-1. El cósmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989). Se insertaron los siguientes fragmentos en el sitio PacI del clon subgenómico 654-45.1 del HVT. El primer fragmento es un subfragmento de restricción PstI a AvalI de aproximadamente 1.191 pares de bases del fragmento XbaI E del HCMV genómico (D.R. Thomsen et al., 1981). El segundo fragmento es un fragmento de aproximadamente 640 pares de bases que codifica el gen cMGF (58) derivado por transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Sambrook et al., 1989) DE RNA DE POLLOS ESTIMULADO CON CONCANAVALINA A. El cebador anti-sentido usado para la transcripción inversa y la PCR fue 5’CGCAGGATCCGGGGCGTCAGAGGCGGGCGAGGTG-3' (SEQ ID NO: 57). El cebador con sentido usado para la PCR fue 5'-GAGCGGATCCTGCAGGAGGAGACACAGAGCTG-3' (SEQ ID NO: 58). El fragmento de cMGF se subclonó después al promotor IE del HCMV usando los sitios BamHI generados por los cebadores de PCR. El fragmento de DNA contenía la secuencia codificadora del aminoácido 1 hasta el aminoácido 201 de la proteína cMGF (58) que incluyó una secuencia delantera de 23 aminoácidos en el extremo amino terminal y 178 aminoácidos en la proteína cMGF madura. El tercer fragmento es un subfragmento de restricción SmaI a SmaI de aproximadamente 784 pares de bases del fragmento de restricción BmaHI Q del HSV-1 (McGeoch et al., 1985).

Ejemplo comparativo:

CLON SUBGENÓMICO 761-07.A1- El plásmido 761-07.A1 se construyó con el fin de generar HVT recombinante. El plásmido 761-07.A1 contiene el gen de interferón de pollo insertado en el sitio PacI del plásmido 654-45.1. El gen del interferón de pollo usa el promotor de HCMV temprano inmediato y la señal de poliadenilación de TK del HSV-1. El cósmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989). Se insertaron los siguientes fragmentos en el sitio PacI del clon subgenómico 654-45.1 del HVT. El primer fragmento es un sub-fragmento de restricción PstI a AvaII de aproximadamente 1191 pares de bases del fragmento XbaI E del HCMV genómico (D.R. Thomsen et al., 1981). El segundo fragmento es un fragmento de aproximadamente 577 pares de bases que codifica el gen de interferón de pollo (59) obtenido mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Sambrook et al., 1989) de RNA AISLADO DE ESPLENOCITOS DE POLLO ESTIMULADOS CON CONCANAVALINA A. El cebador anti-sentido usado para la transcripción inversa y la PCR fue 5’TGTAGAGATCTGGCTAAGTGCGCGTGTTGCCTG-3’ (SEQ ID NO: 59). El cebador con sentido usado para la PCR fue 5'-TGTACAGATCTCACCATGGCTGTGCCTGCAAGC-3' (SEQ ID NO: 60). El fragmento del gen del interferón de pollo se subclonó después al promotor IE del HCMV usando los sitios BgIII generados por los cebadores de la PCR. El fragmento de DNA contiene la secuencia que codifica los aminoácidos 1 al aminoácido 193 de la proteína interferón de pollo (59) que incluye una secuencia de señal de 31 aminoácidos en el extremo amino terminal y 162 aminoácidos de la proteína madura interferón de pollo. El tercer fragmento es un subfragmento de restricción SmaI a SmaI de aproximadamente 784 pares de bases del fragmento de restricción BamHI Q del HSV-1 (McGeoch et al., 1985).

Los siguientes ejemplos, es decir, los ejemplos 1-16A y C, así como los ejemplos 17-22 se presentan como técnica anterior útil para la comprensión de la invención que se describe en el ejemplo 16B.

EJEMPLO 1

S-HVT-001

El S-HVT-001 es un herpesvirus de pavos (HVT) que contiene el gen de la β-galactosidasa de E. coli insertado en la región larga única del genoma del HVT. El mapa obtenido por enzimas de restricción del HVT ha sido publicado (T. Igarashi et al., 1985). Esta información se usó como un punto de partida para diseñar la inserción de los genes extraños en el HVT. El mapa de restricción por BamHI del HVT se muestra en la Figura 1A. De estos datos, se identificaron como dianas diferentes regiones del DNA de HVT en las cuales pueden hacerse las inserciones de genes extraños. El gen extraño escogido para la inserción fue el gen de la β-galactosidasa de E. col (lacZ), que se usó en el PRV. El promotor fue un promotor gpX del PRV. El gen lacZ se insertó en la región larga única del HVT, específicamente en el sitio XhoI en el fragmento BamHI nº 16 (de 3329 pb) y se mostró que se expresaba en el HVT recombinante por formación de placas azules usando el sustrato Bluogal® (Bethesda Research Laboratories). Similarmente el gen lacZ se había insertado en el sitio Sall en la región de repetición contenida en el fragmento BamHI nº 19 (de 900 pb).

Estos experimentos muestran que el HVT es susceptible de experimentar los procedimientos descritos en esta solicitud para la inserción y expresión de genes extraños en los herpesvirus. En particular, se han identificado dos sitios para la inserción del DNA extraño (Figuras 1B y 1C).

EJEMPLO 2

S-HVT-003

El S-HVT-003 es un herpesvirus de pavos (HVT) que contiene el gen de la β-galactosidasa de E. coli y el segmento grande de la cepa S40747 de virus de la enfermedad bursal infecciosa (IBDV) (como una copia de cDNA) (SEQ ID NO: 1) insertado en la región larga única del genoma del HVT. Este DNA del IBDV contiene un marco de lectura abierto que codifica tres proteínas (5'VP2-VP4-VP3 3') (SEQ ID NO: 2), dos de las cuales son antígenos para proporcionar protección contra las infecciones del virus de la enfermedad bursal infecciosa de los pollos. La expresión de los genes tanto para β-galactosidasa como para la proteína del IBDV está bajo el control del promotor del gen gpX del virus de la pseudo-rabia (PRV). El S-HVT-003 se obtuvo mediante una recombinación de homólogos. El SHVT-003 se depositó el 21 de julio de 1987 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC VR 2178.

Los genes del IBDV se clonaron por el MÉTODO DE CLONACIÓN DE cDNA. Los clones que representan el genoma del IBDV se escrutaron mediante el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DEL DNA frente a manchas que contienen el RNA del IBDV auténtico. Los clones positivos se caracterizaron luego por cartografía de restricción para identificar los grupos de clones. Se identificaron dos de tales clones que se encontraron juntos y que representan la región de codificación completa del segmento grande del RNA del IBDV (RNA bicatenario de 3,3 KB). Un clon de cDNA (2-84) contenía un fragmento de aproximadamente 2500 pares de bases que representa la primera mitad del gen del IBDV. El segundo clon (2-40) contenía un fragmento de aproximadamente 2000 pares de bases que representa la mitad distal del gen del IBDV. El plásmido 2-84/2-40 que representa el gen del IBDV completo se construyó uniendo el clon 2-84 y 2-40 en un sitio PvuII único presente en las secuencias solapantes. El genoma del IBDV se obtuvo del plásmido de 2-84/2-40 como un fragmento SmaI a HpaI de aproximadamente 3400 pares de bases. La confirmación de la naturaleza de las proteínas codificadas por el gen del IBDV se obtuvo expresando el clon (2-84/2-40) en E. coli y detectando el antígeno VP3 usando el antisuero preparado contra las proteínas purificadas del IBDV en trasferencias Western. El cDNA del segmento grande del RNA del IBDV que codifica los antígenos del IBDV muestra un marco de lectura abierto que en la presente memoria en adelante será denominado el gen del IBDV. La secuencia de la cepa Australiana del IBDV se ha publicado la cual lleva la homología cercana a la secuencia de la firma solicitante (Hudson et al., 1986). La comparación de las diferencias de aminoácidos entre los dos virus reveló 29 cambios de aminoácidos en la región que codifica 1012 aminoácidos. Hubo solo tres diferencias de aminoácidos deducidas para el VP4 y solo 8 en el VP3. En contraste el VP2 contenía 18 cambios de aminoácidos, 14 de los cuales estaban agrupados entre los aminoácidos 139 a 332.

Para la inserción en el genoma del HVT, la región de codificación para el gen del IBDV se clonó entre el promotor gpX del PRV y la secuencia de la señal de poli-A de TK del HSV, creando el plásmido 191-23. Para ayudar en la identificación de los HVT recombinantes obtenidos mediante la recombinación de homólogos que contienen el gen del IBDV, el fragmento del IBDV promovido por gpX del plásmido 191-23 se insertó detrás (en tandem a) el gen lacZ controlado por el promotor de gpX. El plásmido resultante, 191-47 contiene el gen lacZ de E. coli y el gen I del BDV bajo el control de los promotores gpX individuales del PRV. En la construcción del plásmido 191-47, se unieron varios fragmentos de DNA mediante técnicas de DNA recombinante usando bien sea los sitios de restricción que ocurren naturalmente o bien sea el enlazador de DNA sintético. Los detalles relativos a la construcción de estos genes contenidos en el plásmido 191-47 pueden verse en las Figuras 2A, 2B, 2C, y 2D.

El primer segmento de DNA (segmento 1, Figura 2A) contiene la región de promotor gpX que incluye los residuos que codifican los primeros siete aminoácidos del gen gpX y se derivó del subclon del fragmento BamHI nº 10 del PRV como un fragmento SalI a BamHI de aproximadamente 800 pares de bases. El segundo segmento de DNA (Segmento 2, Figura 2A) contiene la región que codifica β-galactosidasa de E. coli del aminoácido 10 al aminoácido 1024 y se derivó del plásmido pJF751 (obtenido de Jim Hoch, Scripps Clinic and Research Foundation) como un fragmento BamHI a BalI de aproximadamente 3300 pares de bases seguido por un fragmento AvaI a SmaI de aproximadamente 40 pares de bases. El tercer segmento de DNA (Segmento 3, Figura 2A) contiene la secuencia de señal poli A de gpX y se derivó del subclon del fragmento BamHI nº7 del PRV como un fragmento de aproximadamente NdeI a Stul de 700 pares de bases. El segmento tres se unió al segmento dos mediante ligamiento del extremo NdeI el cual se había llenado de acuerdo con LA REACCIÓN DE LLENADO POR POLIMERASA, al sitio Smal. El cuarto segmento de DNA (Segmento 4, Figura 2A) contiene el promotor gpX (caja TATA y sitio cap) y se derivó del subclon del fragmento BamHI nº 10 del PRV como un fragmento de aproximadamente 330 pares de bases Nael a Alul. Adicionalmente, el segmento cuatro contiene aproximadamente 36 pares de bases de la secuencia delantera no traducida de TK 5’ del HSV como un fragmento PstI a BglII en el cual el sitio PstI se había unido al sitio Alul a través del uso del enlazador de DNA sintético (McKnight y Kingbury, 1982) Los segmentos DNA cuatro a seis se insertaron como una unidad en el sitio KpnI único del segmento tres el cual estaba localizado 3' de la secuencia de señal poli A de gpX. El quinto segmento de DNA (Segmento 5, Figura 2A) contiene la región de codificación completa del segmento grande IBDV de RNA (clon de cDNA) como un fragmento de aproximadamente 3400 pares de bases SmaI a HpaI. El sitio SmaI del segmento cinco fue fundido al sitio BglII del segmento cuatro el cual se habíallenado de acuerdo con LA REACCIÓN DE LLENADO POR POLIMERASA. La expresión del gen IBDV (5'VP2-VP4VP3 3') está bajo el control del promotor gpX (segmento 4) el cual utiliza sus codones propios natural de inicio y de detención. El sexto segmento de DNA (Segmento 6, Figura 2a) contiene la secuencia de señal de poli-A de TK del HSV como un fragmento SmaI a HpaI de aproximadamente 800 pares de bases (obtenido de Bernard Roizman, Universidad de Chicago). El sitio HpaI del segmento cinco se fusionó al sitio SmaI del segmento seis por el uso de un enlazador de DNA sintético.

En resumen, la construcción usada para crear HVT-003 (plásmido 191-47) contiene (5' a 3') el promotor del PRV, la caja TATA del gpX, el sitio cap del gpX, los primeros siete aminoácidos de gpX, el gen de β-galactosidasa de E. coli (lacZ), la secuencia de señal poli-A del PRV, el promotor gpX del PRV, y la caja TATA de gpX, el sitio cap de gpX, una fusión dentro de la secuencia delantera 5' no traducida para el gen gpX del IBDV, el codón de iniciación del IBDV, una fusión en el extremo 3' no traducido del IBDV para el extremo 3' no traducida para TK del HSV, y la secuencia de señal poli-A de TK. El casete que contiene estos genes se manipuló por ingeniería genética de manera que estuviera franqueado por dos sitios de endonucleasa de restricción de EcoRI. Como resultado puede obtenerse un fragmento de aproximadamente 9100 pares de bases que contiene tanto el gen lacZ como el gen del IBDV mediante la digestión con EcoRI. De aquí en adelante, el fragmento EcoRI de 9161 pares de bases que se denominará casete IBDV/lacZ. Los siguientes procedimientos se usaron para construir el S-HVT003 mediante la combinación de homólogo. El casete IBDV/lacZ se insertó en el sitio XhoI único presente dentro de un subclon del fragmento BamHI nº 16 del HVT. Para lograr esto, el sitio XhoI se cambió primeramente al sitio EcoRI por uso de un enlazador de EcoRI. Se había mostrado previamente que el sitio no esencial en el HVT mediante la inserción del lacZ (S-HVT001). También se mostró que las regiones de homología flanqueantes en el BamHI nº 16 se eficaces en una recombinación de homólogos. En las Figuras 3A y 3B se muestra la ubicación genómica de los mapas del fragmento BamHI nº 16 en la región larga única del HVT. El fragmento BamHI nº 16 es de una longitud de aproximadamente 3329 pares de bases (SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, y 7). El DNA del HVT se preparó mediante el procedimiento de PREPARACION DE DNA DE HERPESVIRUS. Las co-transfecciones del DNA del HVT y del plásmido de DNA en células fibroblastos de embrión de pollo (CEF) se hicieron de acuerdo con la TRANSFECCION DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES. El virus recombinante resultante de la reserva (stock) de co-transfección se purificó mediante tres rondas sucesivas de purificación de placas usando el procedimiento ESCRUTINIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINANTES. Cuando 100% de las placas eran azules, el DNA se analizó respecto ala presencia del gen del IBDV por el MÉTODO DE TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Las transferencias Southern del DNA de S-HVT-003 digerido con EcoRI con la sonda traducida específica del IBDV (plásmido 284/240) se confirmaron por la presencia del fragmento EcoRI de 9100 pares de bases. Este resultado confirmó que el S-HVT-003 contenía tanto el gen lacZ como el gen del IBDV incorporado en su genoma. Las transferencias Southern adicionales, usando una sonda específica para el BamHI nº 16, confirmaron que la recombinación de homólogos ocurrió en la posición apropiada en el BamHI nº 16 y que no se crearon deleciones. No se observaron diferencias in vitro en el crecimiento del S-HVT-003 en comparación al virus tipo natural (S-HVT-000).

La expresión de las proteínas específicas del IBDV del S-HVT-003 se analizó in vitro usando el MÉTODO DE TRANSFERENCIA WESTERN DE DNA. Los lisados celulares se prepararon como se describió en PREPARACION DE LISADOS DE CELULA DE HERPESVIRUS. Explicado en pocas palabras consiste en lo siguiente: las proteínas contenidas en los lisados celulares de S-HVT-003 se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida, se transfirió a nitrocelulosa, y se sondó con bien sea un antisuero producido contra las proteínas de la cápsida del IBDV desnaturalizadas o bien sea un antisuero producido contra un péptido sintético correspondiente a una región dominante inmunoprecipitada de la proteína cápsida (VP2) del IBDV de 40 KD. Los filtros se lavaron y trataron con proteína A marcada con [125I] para detectar la posición de los anticuerpos unidos.

La Figura 4 muestra los resultados obtenidos usando el antisuero preparado contra las proteínas de la cápsida del IBDV purificadas desnaturalizadas, las cuales han demostrado los solicitantes que reaccionan principalmente con VP3 (proteína de 32 kd). Como se ve, el S-HVT-003 produce una proteína la cual es inmunológicamente indistinguible de la proteína VP3 auténtica de los viriones de IBDV intactos. Además, la poliproteína parece ser procesada correctamente, produciendo la especie VP3 que co-emigra con la proteína VP3 auténtica. La evidencia reciente usando la cepa de IBDV Australiana indica que la VP4 está implicada en el procesamiento de la poliproteína del precursor de las especies de proteína VP2 y VP3 maduras (Jagadish et al., 1988). La Figura 5 muestra los resultados obtenidos usando un antisuero de conejo producido contra un péptido sintético que es homólogo a una región de 14 aminoácidos de la proteína VP2 (40 kd) de la cápsida del IBDV Como se ve, el S-HVT-003 produce una proteína que es inmunológicamente indistinguible de la proteína VP2 viral auténtica. Además, la proteína VP2 producida del SHVT-003 co-emigra con las especies de 40 KD del VP2 aislado de los viriones del IBDV intactos. Esta especie representa un componente principal de las partículas virales infecciosas (completas).

En resumen, el análisis de la expresión de las proteínas específicas del IBDV de S-HVT-003 ha mostrado que la poliproteína es procesada en el cultivo de células CEF, produciendo proteínas del tamaño apropiado para reaccionar con los agentes inmunológicos específicos para las proteínas bien sea VP2 o bien sea VP3 en las transferencias Western.

El siguiente conjunto de experimentos se llevó a cabo en pollos para analizar la expresión in vivo de los genes del IBDV contenidos en el S-HVT-003 como se determinó mediante los datos de seroconversión, los resultados de neutralización de suero, y protección frente a la inoculación con IBDV.

El primer experimento se diseño para mostrar la seroconversión de pollos para el IBDV al ser vacunados con S-HVT

003. Once pollos de once semanas de edad, seronegativos al HVT y al IBDV se obtuvieron de SPAFAS Inc. Se vacunaron seis aves subcutáneamente en la región abdominal con 0,5 ml de una suspensión celular de células de CEF que contenía el S-HVT-003 (40.000 UFP/ml) Las muestras de suero se obtuvieron cada siete días durante ocho 5 semanas para todas las aves en este estudio. En el día 28 (cuarta semana), tres de estas aves recibieron un inóculo de recuerdo de S-HVT-003, mientras que las otras 3 aves recibieron 0,5 ml de una vacuna del IBDV inactivada inoculada subcutáneamente en la región cervical. A tres aves adicionales se les administró solo la vacuna inactivada el día 28. Dos aves sirvieron como controles de contacto y no recibieron vacunación. En el día 56, todas las aves se sacrificaron y se les hizo la autopsia. La Tabla 1 muestra los resultados del ensayo de neutralización de suero contra 10 el IBDV. No se observó ninguna actividad de SN detectable en las aves a las que se les administró solo S-HVT-003. Adicionalmente, solo una de las tres aves a las que se les administró solo la vacuna inactivada demostró una actividad de SN baja pero detectable. Los títulos de SN también se detectaron en una de las tres aves que recibió el SHVT-003 seguido por el inóculo de recuerdo de vacuna de IBDV inactivado; estos títulos tenían un valor mucho más alto que con la vacuna de IBDV inactivada sola. Estos resultados sugieren que el S-HVT-003 está cebando al pollo

15 para una respuesta secundaria contra el IBDV. El análisis in vitro de las muestras de suero por TRANSFERENCIA WESTERN confirmó la seroconversión de los pollos para el IBDV con la vacunación con el S-HVT-003 tanto antes como después de los inóculos de recuerdo administrados el día 28.

TABLA 1

DÍA

Grupo de vacuna

Ave nº 28 - 31 35 38 42 49

HVT-003

265 <2 <2 <2 <2 <2

HVT-003

266 <2 <2 <2 <2 <2

267

<2 <2 <2 <2 <2

HVT-003

260 <2 <2 <2 <2 <2

IBDV

264 <2 <2 1:64 1:256 1:512

269

<2 <2 <2 <2 <2

C

261 <2 <2 <2 <2 <2

IBDVa

262 <2 <2 <2 1:4 1:4

263

<2 <2 <2 <2 <2

C

270 <2 <2 <2 <2 <2

271

<2 <2 <2 <2 <2

a Comercial

20 En el segundo experimento, veinticinco pollitos SPF de 1 día se vacunaron con el S-HVT-003 (20 con 0,2 ml subcutáneamente, y 5 con gotas bilaterales para ojos). Veinte pollos se mantuvieron como controles. En los días 4 y 7 de la post-infección, dos aves de control y 5 aves vacunadas se sangraron, se sacrificaron y sus bazos se extirparon para aislamiento del virus. Las suspensiones de esplenocitos (células del bazo) se hicieron mediante el método estándar, y las células ~1 x 106 en 3 ml del medio de cultivo de fibroblasto de embrión de pollo (CEF) se inocularon

25 directamente sobre células secundarias. Los cultivos se incubaron durante 6-7 días y luego se calificaron respecto a los efectos citopáticos (CPE) como se determinó observando la morfología de las células. Los cultivos se sometieron a pase una segunda vez y de nuevo se calificaron para el CPE. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Todas las aves de control no vacunadas permanecieron negativas para el HVT respecto a los aislamientos de esplenocitos tanto para el día 4 como para el día 7. Cuatro de cinco aves vacunadas con el S-HVT-003 fueron positivas para el

30 HVT el cuarto día tanto para los pases primero como segundo. Un ave no produjo virus, esto puede representar un fallo de la vacunación. Cinco de cinco aves fueron positivas para el HVT el día séptimo en ambos pases 1 y 2. Globalmente, el experimento de recuperación de vector demuestra que el S-HVT-003 se replica, así como el virus HVT de tipo natural in vivo y que la inserción del casete IBDV/lacZ en el sitio XhoI de BamHI nº 16 no da como resultado una atenuación detectable del virus. Los experimentos subsecuentes que examinan el virus recuperado del ES

35 CRUTINIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINANTES confirmaron que la estabilidad in vivo del S-HVT003, demostrando la expresión β-galactosidasa en 100% de los virus.

TABLA 2

Fecha de la cosecha

Día 4

Día 7

Muestra

P1 P2 P1 P2

Nº1

- -

Nº 2

- -

Nº 3

- -

Nº 4

- -

T 1

- -

T 2

2 + 2 +

T 3

2 + 2 +

T 4

+ 4+

T 5

3 + 3 +

T 6

2 + contaminados

T 7

+ 5 +

T 8

+ 5 +

T 8

+ 5 +

T 9

+ 5 +

T 10

+ 5 +

N= control, T = vacunado

CPE varió de negativo (-) a 5+

En los días 0, 4, 7, 14, 21 y 27 después de la infección, se obtuvieron muestras de sangre del resto de los pollos para determinar los títulos de ELISA en suero contra de antígenos del BDV y HVT, así como respecto a ensayos neutralizantes del virus contra el IBDV. Adicionalmente, 21 días después de la post-infección cinco pollos de control 5 y 14 pollos vacunados se inocularon con el IBDV virulento mediante una gota bilateral para ojos (103,8DIH50) (DIH50 = dosis que infecta e 50% de los huev0s). Todas las aves se sacrificaron seis días después de la inoculación y se calcularon las relaciones peso de bolsa aviar/peso corporal. Un resumen de los resultados se muestra en las Tablas 3 y 4, respectivamente. Como se presenta en la Tabla 3, no se detectaron anticuerpos contra los antígenos del HVT por ELISA antes de los días 21-27 después de la vacunación. En los pollos, la respuesta inmune durante las prime10 ras dos semanas después de la puesta es tanto inmadura como suprimida parentalmente y, por tanto, estos resultados no son totalmente inesperados. En contraste, los ensayos ELISA del IBDV eran negativos hasta 21 días después de la vacunación, y fueron solo detectables después de la inoculación el día 27. Los niveles de ELISA vistos el día 27 después de la vacunación indican una respuesta primaria al IBDV. La Tabla 4 que compara las relaciones aves se sacrificaron seis días después de la inoculación y se calcularon las relaciones peso de bolsa aviar/peso

15 corporal para los controles inoculados y los grupos vacunados/inoculados no mostró diferencias significativas. La vacunación con S-HVT-003 bajo estas condiciones no evitó la infección de las aves vacunadas mediante la inoculación del IBDV como se indicó por la muerte de cuatro aves vacunadas después de la inoculación.

Tabla 3

ELISA VN

Grupo de muestra

HVT IBDV IBDV

C-0

(n = 3) 0 0 <100

C-4

(n = 2) 0 0 n.d.

T-4

(n = 5) 0 0 n.d.

C-7

(n = 2) 0 0 <100

T-7

(n = 5) 0 0 <100

C-14

(n = 5) 0 0 n.d.

T-14

(n = 14) 0 0 <100

C-21

(n = 5) 0 0 n.d.

T-21

(n = 14) 1 0 <100

C-27

(n = 5) 0 0 n.d.

CC-27

(n = 5) 0 5 n.d.

CT-27

(n = 10) 3,2 2 n.d.

C = control T= vacunados CC = control de inoculados CT = inoculados y vacunados

Los títulos de ELISA son valores de la media geométrica (abreviadamente en lo sucesivo GMT por la ex20 presión inglesa Geometric Mean Titer) y varían de 0-9.

TABLA 4

Grupo de muestra

Peso corporal Peso bursal BBR

Control (n=5)

258,8 1,5088 0,0058

Inoculado

209 0,6502 0.0031

Control (n=5)

Inoculado

215,5 0,5944 0,027

Tratado (n=10)

Los valores son valores medios. Los pesos corporales son diferentes en el grupo de control debido a que las aves inoculadas no se alimentaron bien. Murieron cuatro aves tratadas e inoculadas.

Se llevó a cabo un tercer experimento repitiendo el experimento 2 pero usando pollos inmunológicamente sensibles

5 (3 semanas de edad). Seis pollos de tres semanas se vacunaron intraperitonealmente con 0,2 ml de S-HVT-003 (una gota en cada ojo). Las muestras de suero se obtuvieron cada siete días durante seis semanas y las aves se inocularon con el virus IBDV de inóculo estándar USDA virulento en el día 43 después de la vacunación. Seis días después de la inoculación, los grupos de control, vacunado-inoculado, e inoculado se sacrificaron y las bolsas se recogieron para sondar con anticuerpos monoclonales (MAB) anti-IBDV (proporcionados por el Dr. David Snyder, del

10 Virginia-Maryland Regional Collage of Veterinary Medicine). Los homogeneizados bursales se prepararon mezclando 1 mL de NP40 al 0,5% con una bolsa aviar. Las bolsas aviares se molieron luego y se trataron con ultrasonidos brevemente. Los líquidos sobrenadantes de los homogeneizados se hicieron reaccionar con el MAB R63 que se había fijado a las placas de Petri ELISA de 96 pocillos a través de una unión por proteína A. Después de la incubación se añadió una preparación marcada con biotina del MAB R63se. Después del lavado se añadió un conjugado

15 de avidina-peroxidasa de rábano silvestre y se incubaron. Los ensayos se desarrollaron con tampón Tris-maleato (TMB) + sustrato H2O2. Los resultados de los ensayos se recogen en la Tabla 5. Los datos muestran la presencia de niveles altos de antígeno de IBDV en toda la bolsa aviar en el grupo vacunado/inoculado y en el grupo inoculado. No se detectó un antígeno IBDV en los controles. El antígeno específico de IBDV no pudo ser detectado en las diluciones de más de 1/1000, y no parece haber diferencias entre los grupos vacunados y no vacunados inoculados. Los

20 títulos de HVT como se determinaron mediante ELISA fueron primeramente detectables en el día 7 en cuatro de seis aves vacunadas. En el día 14, seis de seis aves vacunadas mostraron títulos de HVT. Todas las seis aves continuaron mostrando títulos de HVT a través del experimento. No se apreciaron título de IBDV antes de la inoculación. En contraste, el análisis de estas mismas muestras de suero por el procedimiento de transferencia Western demostró la seroconversión de los pollos vacunados con S-HVT-003 a IBDV antes de la administración del inóculo de virus. El

25 nivel de respuesta, sin embargo, sigue siendo pequeño por la inoculación. La comparación entre los grupos vacunados/inoculados e inoculados solamente demuestra claramente el nivel de reacción mediante las transferencias Western que es mucho mayor en el grupo vacunado/inoculado. Estos resultados muestran que el S-HVT-003 está seroconvertido en aves vacunadas con IBDV, y sugiere que el nivel de expresión específica del IBDV no es suficientemente alto para inducir una respuesta de neutralización en las aves.

30 El S-HVT-003 muestra el mérito del método de vacunación que los solicitantes han inventado. El HVT se ha diseñado para expresar simultáneamente los antígenos extraños (de β-galactosidasa y los antígenos de IBDV) que son reconocidos por el hospedante por una respuesta inmune dirigida a estas proteínas.

TABLA 5

Serología: Título por ELISA de herpes/ IBDV

Fecha de sangrado

Ave nº

11/1 11/10 11/14 11/24 12/1 12/8 12/15 12/22

Vacunadas e inoculadas

221

0/0 7/0 5/0 6/0 5/0 5/0 5/0 3/3

41

0/0 4/0 4/0 1/0 1/0 1/0 1/0 1/3

42

0/0 3/0 2/0 1/0 5/0 5/0 5/0 3/2

43

0/0 0/0 5/0 5/0 5/0 5/0 3/0 3/2

44

0/0 1/0 5/0 1/0 2/0 1/0 1/0 2/4

45

0/0 0/0 1/0 1/0 1/0 1/0 1/0 1/3

Control

28

0/0 0/0

38

0/0 0/0

73

0/0 0/0

75

0/0 0/0

Inoculadas solamente

40

0/0 0/3

74

0/0 0/5

39

0/0 0/3

72

0/0 0/3

El nivel máximo del título es 9

35 Ejemplo 3 S-HVT-004

El S-HVT-004 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de la glicoproteína (gA) del virus de enfermedad de Marek (MDV) insertado en la región única larga, y el gen de β-galactosidasa lacZ de E. coli también insertado en la región única larga. Es más probable que el antígeno del MDV desencadene la respuesta antigénica adecuada que el antígeno equivalente del HVT.

El gen gA del MDV (SEQ ID NO: 8 y 9) se clonó mediante procedimientos estándares de clonación del gen gA de DNA. Se ha descrito un fragmento de restricción EcoRI que contiene el gen gA del MDV (Isfort et al., 1984) y este fragmento se identificó por tamaños en los clones de DNA. La región del DNA descrita que contiene el gen gA se secuenció por los solicitantes y se encontró que como se esperaba contenía un gen de glicoproteína. El DNA deeste gen se usó para encontrar el gen correspondiente en el HVT por el MÉTODO DE TRANSFERENCIA DE SOUTHERN DE DNA, y en el HVT se identificó un gen que contenía una secuencia muy similar. Este gen es el mismo gen previamente llamado gA (Isfort et al., 1984).

Para la inserción en el genoma del HVT, el gen gA del MDV se usó intacto debido a que tendría ya buenas secuencias de señal de herpesvirus. El gen lacZ se insertó en el fragmento XhoI en el fragmento BamHI nº 16, y el gen gA del MDV se insertó detrás del lacZ como se muestra en las Figuras 6A y 6B. Las regiones flanqueantes en el BamHI nº 16 se usaron para la recombinación de homólogos. El DNA del HVT y el DNA plasmídico se co-transfectaron deacuerdo con el MÉTODO DE TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES en células fibroblastos primarios de embrión de pollo (CEF). El virus de la reserva (stock) de transfección se purificó mediante purificaciones sucesivas de placas usando el MÉTODO DE ESCRUTINIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINANTES. Al final de este procedimiento cuando 100% de las placas eran azules, el DNA se analizó respecto a la presencia del gen gA del MDV. El S-HVT-004 es un virus recombinante que contiene tanto el gen de βgalactosidasa y el gen gA del MDV incorporados en su genoma.

La Figura 6C muestra la estructura de S-HV0-004.

Ejemplo 4

VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE

El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) está estrechamente relacionado con PI-3 en la estructura global. Los genes de hemaglutinina (HN) y los genes de fusión (F) de PI-3 se manipularon por ingeniería genética para la expresión en el virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina (abreviadamente en lo sucesivo IBR por la expresión inglesa Infectious Bovine Rhinotracheitis (ref)). Similarmente los genes de hemaglutinina (HN) y de fusión (F) se clonaron en el NDV para usarse en el sistema de administración de herpesvirus (herpesvirus de pavos, HVT).

El método que se utilizó para la construcción de las secuencias de control de herpesvirus se ha aplicado al NDV.

VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA

El virus de la bronquitis infecciosa (IBV) es un virus de pollos relacionado estrechamente con la estructura global del virus de la gastroenteritis transmisible (abreviadamente en lo sucesivo TGE por la expresión inglesa Transmissible GastroEnteritis). El antígeno neutralizante principal del virus de la TGE se manipuló por ingeniería genética para la expresión en el PRV (ref). Similarmente los antígenos neutralizantes principales se clonaron a partir de tres cepas del IBV: Massachusetts (SEQ ID NO: 14 y 15), Connecticut (SEQ ID NO: 18 y 18) y Arkansas-99 (SEQ ID NO: 16 y 17) para usarse en el sistema de administración de herpesvirus (HVT).

Los procedimientos que se utilizaron para la construcción de las secuencias de control de herpesvirus para la expresión se han aplicado al IBV.

EJEMPLO 5

S-HVT-045

S-HVT-045 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen (gB) de la glicoproteína gB del virus de la enfermedad de Marek (MDV) insertado en una región única corta. Es más probable que el antígeno del MDV desencadene la respuesta antígénica apropiada que el antígeno equivalente del HVT. El S-HVT-045 ha sido depositado el 15 de octubre de 1992 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR. 2383.

El gen gB del MDV se clonó por técnicas estándares de DNA recombinantes. El gen del MDV se localizó a 3,9 KB del fragmento EcoRI-Sall usando una sonda oligonucleotídica basada en la secuencia gB del HSV en una región que se encontró conservada entre los genes gB conocidos de herpesvirus. El mapa de restricción del fragmento de restricción EcoRI-Sall de 3,9 KB es similar al mapa publicado (Ross et al., 1989).

Para la inserción en el genoma del HVT, el gen gB del MDV se usó intacto porque ya tendría buenas secuencias de señas de herpesvirus. El gen gB del MDV gB se insertó en un fragmento BamHI-EcoRI de 17,15 KB derivado del fragmento BamHI nº 1 del HVT. El sitio usado para la inserción fue el sitio Stul en el gen US2 del HVT, previamente utilizado para la construcción del S-HVT-012. El sitio se alteró inicialmente mediante la inserción de un enlazador HindIII único, y el gen gB del MDV se insertó mediante métodos estándares de clonación de DNA. Las regiones

5 flanqueantes en el fragmento BamHI-EcoRI de 17,15 KB se usaron, junto con los fragmentos del HVT clonados restantes usando el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. El virus obtenido de la reserva (stock) de transfección se purificó en placas y el DNA se analizó respecto a la presencia del gen gB del MDV. El S-HVT-045 es un virus recombinante que contiene el gen gB del MDV incorporado en el genoma en el sitio Stul del gen US2 del HVT.

10 ENSAYO DE S-HVT-045 RECOMBINANTE

Se llevaron a cabo dos estudios para demostrar la eficacia de estos virus HVT/MDV recombinantes para proteger contra la inoculación con virus virulento de la enfermedad de Marek. En el estudio A, los pollos libres de agentes patógenos específicos (abreviadamente SPF por la expresión inglesa specific pathogen free) se vacunaron bien sea con el S-HVT-045 ó bien sea el S-HVT-046. Siete días después de la vacunación, los pollos vacunados y los pollos 15 de control se inocularon con una cepa MD-5 altamente virulenta del virus de la enfermedad de Marek. Después de un periodo de observación después de 6 semanas de la inoculación respecto a signos clínicos típicos de la enfermedad de Marek, a todos los pollos se les realizó la autopsia y se examinaron respecto a un diagnóstico de lesiones de la enfermedad de Marek. Los resultados de la Tabla 6, muestran que ambos virus recombinantes dieron una protección completa contra la inoculación que causaba la enfermedad de Marek en 90% de los pollos de control no

20 vacunados.

En un segundo estudio, los pollos de un día se vacunaron bien sea con S-HVT-045 o bien sea con S-HVT-047. Un tercer grupo de pollos se vacunó con la vacuna convencional con licencia de USDA compuesta de virus HVT y SB-1. Cinco días después de la vacunación, los pollos vacunados y un grupo de pollos de control no vacunados se inocularon con el virus virulento de Marek, cepa RB1B. Los pollos se observaron durante 8 semanas respecto a signos

25 clínicos de la enfermedad de Marek, después se les hizo la autopsia y se observaron las lesiones de Marek. Este estudio demostró la capacidad del HVT-045 y del HVT-047 de proporcionar 100% de protección contra la inoculación (Tabla 1). La vacuna comercial dio una protección de 96%, y 79% de los pollos no vacunados desarrollaron la enfermedad de Marek.

TABLA 6. EFICACIA DE LOS VIRUS HVT/MDV RECOMBINANTES PARA PROTEGER POLLOS SUSCEPTIBLES 30 CONTRA EL VIRUS VIRULENTO DE LA ENFERMEDAD DE MAREK

Protección de Marek

Grupo de vacuna

Inoculación con MD-5 Inoculación con RB1B

S-HVT-045

20/20 24/24

S-HVT-046

20/20 No ensayado

S-HVT-047

No ensayado 24/24

HVTa

No ensayado 24/25

Controles

2/20 5/24

aComercial

Ejemplo 6

D-HVT-012

35 El S-HVT-012 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de la β-galactosidasa (lacZ) insertado en la región única corta. El gen lacZ se usó para determinar la viabilidad de este sitio de inserción en el HVT [ATCC F-126 ("Calnek")]. El S-HVT-012 ha sido depositado el 15 de octubre de 1992 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA bajo el

40 número de acceso ATTC VR. 2382.

Para la inserción en el genoma del HVT, el gen de β-galactosidasa se introdujo en el sitio StuI único del fragmento clonado EcoRl nº 7 del HVT, es decir, el fragmento que contenía el sitio StuI dentro del gen US2 del HVT (como se describe en el apartado Materiales y Métodos). Las regiones flanqueantes del fragmento EcoRl nº 7 se usaron parala recombinación homóloga. El DNA del HVT y el DNA del plásmido se co-transfectaron de acuerdo con el MÉTODO 45 DE TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR VIRUS COMBINANTES en células fibroblastos primarias de embriones de pollos (CEF). Se obtuvo un virus azul obtenido de la reserva (stock) de transfección por sucesivas etapas de purificaciones en placas usando el método de ESCRUTINIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINAN

TES. Al final de este método, cuando el 100% de las placas eran azules, el DNA se analizó en cuanto a la presencia del gen IacZ. El S-HVT-012 es un virus recombinante que contiene el gen IacZ incorporado en su genoma en el sitio StuI dentro del gen US2 del HVT.

El S-HVT-012 se puede formular como una vacuna del mismo modo que el S-HVT-045. Cuando se administra a 5 pollos, y dicha vacuna proporciona protección contra el virus de la enfermedad de Marek.

Ejemplo 7

Sitios para la inserción de DNA extraño en el HVT

Para definir los sitios de inserción apropiados, se generó una genoteca de fragmentos de restricción BamHI y EcoRl del HVT. Varios de estos fragmentos de restricción (fragmentos BamHl nº 16 y nº 13, y los fragmentos EcoRl nº 6, nº 10 7, y nº 9 (véase la Figura 1)) se sometieron a análisis por cartografía de restricción. Se identificó un sitio de restricción único en cada fragmento como un sitio de inserción potencial. Estos sitios incluían XoII en los fragmentos BamHl nº 13 y nº 16, y el fragmento EcoRI nº 9 y Sall en el fragmento EcoRI nº 6 y StuI en el fragmento EcoRl nº 7. Se insertó un gen marcador de β-galactosidasa (IacZ) en cada uno de los sitios potenciales. Puede usarse unplásmido que contenía dicho inserto de DNA extraño de acuerdo con COTRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENE15 RAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES PARA CONSTRUIR UN HVT que contiene el DNA extraño. Para que este método sea útil es importante que el sitio de inserción esté en una región no esencial para la replicación del HVT y que el sitio esté flanqueado por DNA del HVT apropiado para mediar la recombinación homóloga entre DNA de virusy plásmidos. Se utilizarán plásmidos que contienen el gen marcador IacZ en la COTRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES. La generación de virus recombinantes se determinó por ESRUTI

20 NIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINANTES. Tres de los cinco sitios activos se usaron satisfactoriamente para generar un virus recombinante. En cada caso el virus resultante se purificó esencialmente hasta 100%, definiendo claramente un sitio apropiado para la inserción de DNA extraño. Los tres vectores de homología usados para definir estos sitios se describen más adelante.

Ejemplo 7A

25 Vector de homología 172-29.31

El vector de homología 172-29.31 contiene el fragmento BamHI nº 16 del HVT y es útil para la inserción de DNA extraño en el HVT. El plásmido 172-29.31 contiene un sitio de restricción XhoI único en el cual puede clonarse el DNA extraño. El sitio XhoI en el vector de homología 172-29.31 se puede usar para insertar DNA extraño en el HVT por la construcción de al menos tres HTV recombinantes (véanse los Ejemplos 1-3).

30 El vector de homología 172-29.31 se caracterizó además por análisis de secuenciación de DNA. Se determinaron las secuencias completas del fragmento BamHI nº 16. También se determinaron aproximadamente 2092 pares de bases del fragmento adyacente BamHI nº 13 (véase la SEQ ID NO: 3). Esta secuencia indica que el marco de lectura abierto que codifica la glicoproteína A (gA) del HVT se extiende a la unión BamHI nº 16 - BamHI nº 13. El gen gA del HVT es el homólogo a la glicoproteína C (gC) del HSV-1. Este sitio XhoI interrumpe un ORF que está directa

35 mente aguas arriba (hacia el extremo 5’) del gen gA del HVT. Este ORF muestra la homología de secuencia de aminoácidos con el p43 del PRV y el gen 15 del virus de la varicela-zoster (abreviadamente en lo sucesivo VZV por la expresión inglesa Varicella-Zoster Virus) Los genes del PRV y del VZV son los homólogos de UL43 del HSV-1. Por tanto este ORF se denominó UL43 del HVT (SEQ ID NO: 5). Deberá advertirse que el UL43 del HVT no exhibe una homología directa con el UL43 del HSV-1. Aún cuando el UL43 del HVT está localizado aguas arriba (hacia el ex

40 tremo 5’) del gC homólogo del HVT está codificado en la misma cadena de DNA que el gA del HVT, en donde como el UL43 del HSV-1 está en la cadena opuesta respecto a gC del HSV-1. El sitio XhoI interrumpe el UL43 en aproximadamente el aminoácido 6 lo que sugiere que el gen UL43 no es esencial para la replicación del HVT.

Ejemplo 7B

Vector de homología 435-47.R17

45 El vector de homología 435-47.R17 contiene el fragmento EcoRI de HVT nº7 y es útil para la inserción del DNA extraño en el HVT. El plásmido 435-47.R17 contiene un sitio de restricción HindIII único en el cual puede ser clonado el DNA extraño. El sitio de restricción HindIII en el plásmido resulta de la inserción del enlazador HindIII en el sitio Stul que ocurre naturalmente del fragmento EcoRI nº7. El sitio HindIII en el vector de homología 435-47.R17 puede ser usado para insertar el DNA extraño en el HVT mediante la construcción de por lo menos 25 recombinantes del

50 HVT.

El análisis de secuencias de DNA en el Stul indicó que este fragmento contiene marcos de lectura abiertos que codifican US10, US2 y US3. El sitio Stul interrumpe el US2 en aproximadamente el aminoácido 124, lo que sugiere que el gen US2 no es esencial para la replicación del HVT.

Ejemplo 7C Vector de homología 172-63.1

El vector de homología 172-63.1 contiene el fragmento EcoRI nº 9 del HVT y es útil para la inserción del DNA extraño en el HVT. El plásmido 172-63.1 contiene un sitio de restricción XhoI único en el cual puede ser clonado el DNA extraño. El sitio XhoI de un vector de homología 172-63.1 puede ser usado para insertar el DNA extraño en el HVT mediante la construcción del S-HVT-014 (Véase el Ejemplo 8).

Ejemplo 8

S-HVT-014

El S-HVT-014 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de β-galactosidasa de E. coli (lacZ) insertado en la región única larga. El gen lacZ se usó para determinar la viabilidad de este sitio de inserción en el HVT [ATCC F-126 ("Calnek")].

Para la inserción en el genoma del HVT, el gen de β-galactosidasa se introdujo en el sitio XhoI único del fragmento EcoRI nº 9 clonado (como se describió en el apartado Materiales y Métodos). El sitio XhoI en el fragmento EcoRI nº 9 del genoma del HVT es el mismo sitio que el sitio XhoI en el fragmento BamHI nº 10 usado para la construcción de herpesvirus recombinante de pavos descrito en los Ejemplos 16 a 19. Las regiones flanqueantes del fragmento EcoRI nº 9 se usaron para la recombinación de homólogo. El DNA del HVT y el DNA de plásmido se cotransfectaron de acuerdo con el procedimiento de TRANSFECCION DE DNA PARA GENERAR VIRUS RECOMBINANTES en células fibroblastos de embrión de pollo primarios (CEF). Se purificó un virus azul obtenido de la reserva (stock) de transfección mediante sucesivas purificaciones en placas usando el procedimiento de ESCRUTINIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINANTES. Al final de este procedimiento 100% de las placas eran azules. El S-HVT-014 es un virus recombinante que contiene el gen lacZ incorporado en su genoma en el sitio XhoI en el fragmento EcoRI nº 9 del HVT.

El S-HVT-014 puede ser formulado como una vacuna de la misma manera que el S-HVT-045. Cuando se administra a pollos, dicha vacuna proporciona protección contra el virus de la enfermedad de Marek.

Ejemplo 9

S-HVT-005

El S-HVT-005 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de β-galactosidasa de E. coli (lacZ) insertado en la región única larga. El gen lacZ se usó para determinar la viabilidad de este sitio de inserción en el HVT [ATCC F-126 ("Calnek")].

Para la inserción en el genoma del HVT, el gen de β-galactosidasa se introdujo en una deleción (supresión) de aproximadamente 1300 pares de bases del fragmento nº 9 XhoI del HVT. La deleción que cae entre los sitios MluI y EcoRI únicos retira la región codificadora completa del gen gA del HVT (véase la SEQ ID NO: 3). Las regiones flanqueantes XhoI del fragmento EcoRI nº 9 se usaron para la recombinación de homólogos. El DNA del HVT y el DNAdel plásmido se co-transfectaron de acuerdo con el MÉTODO DE TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR VIRUS RECOMBINANTES en células fibroblastos de embrión de pollo primarios (CEF). Se purificó mediante purificaciones sucesivas en placas un virus azul obtenido de la reserva (stock) de transfección usando el ESCRUTINIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINANTES. Al final de este procedimiento, cuando 100% de las placas eran azules, se analizó el DNA respecto a la presencia del gen lacZ. El S-HVT-005 es un virus recombinante que contiene el gen lacZ incorporado en el genoma en el lugar de la deleción del gen gA delecionado del HVT.

El S-HVT-005 puede ser formulado como una vacuna en la misma forma que el S-HVT-045. Cuando se administra a pollos, dicha vacuna proporciona protección contra de la enfermedad de Marek.

Ejemplo 10

Vacunas para la enfermedad de Marek

El HVT recombinante que expresa glicoproteínas del virus de la enfermedad de Marek proporciona vacunas superiores para la enfermedad de Marek. Nosotros hemos construido varios HVT recombinantes que expresan glicoproteínas del MDV: S-HVT-0:4 (Ejemplo 3), S-HVT-045 (Ejemplo 5), S-HVT-046 (Ejemplo 10A), S-HVT-047 (Ejemplo 10B), S-HVT-062 (Ejemplo 10C).

Ejemplo 10A

S-HVT-046

El S-HVT-046 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes de la glicoproteína B (gB) del virus de la enfermedad de Marek (MDV) y de la glicoproteína A (gA) insertados en la región única corta. Los genes del MDV están insertados en la misma orientación transcripcional que el gen US2. Es más probable que los antígenos del MDV desencadenen la respuesta antigénica adecuada que el antígeno equivalente del HVT.

El S-HVT-046 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, 437-26.24 con BamHI y HindIII, 437-26.26 con BamHI y HindIII, y 456-17.22 sin corte. La inserción del DNA apropiado se confirmó mediante un análisis de transferencia Southern.

Ejemplo 10B

S-HVT-047

El S-HVT-047 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB y gA del MDV insertados en la región única corta. Los genes del MDV están insertados en la orientación transcripcional opuesta como el gen US2. Es más probable que los antígenos del MDV desencadenen la respuesta antigénica adecuada que el antigénico equivalente del HVT.

El S-HVT-047 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se uso la siguiente combinación de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, 437-26.24 con BamHI y HindIII, 437-26.26 con BamHI y HindIII, y 456-17.18 sin corte. La inserción del DNA apropiado se confirmó mediante un análisis de transferencia Southern.

Ejemplo 10C

S-HVT-062

El S-HVT-062 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen gB del MDV, los genes de las glicoproteínas D (gD) y gA insertados en la región única corta. Los genes del MDV están insertados en la orientación transcripcional como el gen US2. Es más probable que los antígenos del MDV desencadenen la respuesta antigénica adecuada que el antígeno equivalente del HVT. El S-HVT-062 ha sido depositado el 23 de Febrero de 1993 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR. 2401.

El S-HVT-062 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 40732.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, 437-26.24 con BamHI y HindIII, 556-60.6 con BamHI y HindIII, y 456-17.22 sin corte. La inserción del DNA apropiado se confirmó mediante análisis por transferencia Southern.

ENSAYO DE HVT RECOMBINANTES QUE EXPRESAN ANTÍGENOS DEL MDV

Se llevaron a cabo dos estudios para demostrar la eficacia de los virus HVT/MDV recombinantes para proteger contra la inoculación con un virus virulento de la enfermedad de Marek. En el Estudio 1, los polluelos libres de agentes patógenos específico (SPF) de un día se vacunaron con bien sea el S-HVT-045, el S-HVT-046 o el S-HVT-047. Cinco días después de la vacunación, los polluelos vacunados y los polluelos de control no vacunados se inocularon con el MDV. Después de 6 semanas de la inoculación de periodo de observación para signos clínicos típicos de la enfermedad de Marek, todos los pollos se sometieron a autopsia y se examinaron para el diagnóstico de lesiones de la enfermedad de Marek. Los resultados recogidos en la Tabla 7 muestran que estos virus recombinantes dan una protección completa contra la inoculación del virus que causa la enfermedad de Marek en 84% de los pollos de control no vacunados.

En el segundo estudio, los pollos de un día se vacunaron con el S-HVT-062. Dos grupos más de pollos se vacunaron con las vacunas convencionales adquiridas con licencia de USDA compuestas de HVT y una combinación de los virus HVT y SB-1. Cinco días después de la vacunación, los pollos vacunados y el grupo de pollos de control no vacunados se inocularon con el MDV. Los pollos se observaron durante 8 semanas respecto a signos clínicos de la enfermedad de Marek, y luego se sometieron a autopsia y se observaron respecto a lesiones de la enfermedad de Marek. Este estudio demostró la capacidad del S-HVT-062 para proporcionar 100% de protección contra la inoculación (Tabla 7). Las vacunas comerciales dieron 81% y 95% de protección, respectivamente y 100% de los pollos no vacunados desarrollaron la enfermedad de Marek.

TABLA 7. EFICACIA DE LOS VIRUS HVT/MDV RECOMBINANTES CONTRA LA INOCULACIÓN DE VIRUS VIRULENTO DE MAREK

imagen1

1 1 1 1 1 2 2 2 2 2

S-HVT-045 S-HVT-046 S-HVT-047 Controles HVT/SB-1 S-HVT-062 S-HVT-062 Controles EVTc HVT/SB-1c 2,2 X 103 2,2 X 103 2,2 X 103 7,5 X 102 1,5 X 101 7,5 X 102 7,5 X 102 24/24 (100%) 20/20 (100%) 24/24 (100% 7/44 (16%) 24/25 (96%) 32/32 (100%) 22/22 (100%) 0/20 (0%) 17/21 (81%) 22/21 (95%)

ªUFP/0,2 ml.bNº de protegidos/total; Inoculación 5 días después de la vacunación cVacuna comercial

Ejemplo 11

Vacunas bivalentes contra la enfermedad de Newcastle y la enfermedad de Marek

Un HVT recombinante que expresa las proteínas del NDV produce vacunas bivalentes que protegen tanto contra la

5 enfermedad de Marek como la enfermedad de Newcastle. Se construyeron varios HVT recombinantes que expresan las proteínas del NDV, a saber: S-HVT-007 (Ejemplo 11A), S-HVT-048 (Ejemplo 11B), SI-IVT-049 (Ejemplo 11C), SHVT-050 (Ejemplo 11D), y S-HVT-106 (Ejemplo. 11E).

Ejemplo 11A

S-HVT-007

10 El S-HVT-007 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene un gen de proteína híbrida lacZ de E. coli-HN del NDV bajo el control del promotor gX del PRV gX y el gen F del NDV bajo el control del promotor HSV-1 a4 insertado en la región única larga. Los genes del NDV están insertados en la misma orientación transcripcional que el gen UL43.

Para construir el S-HVT-007, el DNA del HVT y el plásmido 255-18.B16 se cotransfectaron de acuerdo con el proce

15 dimiento de TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR VIRUS RECOMBINANTES en células fibroblastos de embrión de pollos primarios (CEF). Por sucesivas purificaciones de placas se purificó un virus azul obtenido de la reserva (stock) de transfección usando el método de ESCRUTINIO BLUOGAL PARA HERPESVIRUS RECOMBINANTES. Al final de este procedimiento el 100% de las placas eran azules.

Ejemplo 11B

20 S-HVT-048

El S-HVT-048 es un herpesvirus recombinante de pavos que contienen los genes gB y gA del MDV y el gen F del MDV bajo el control promotor temprano inmediato del HCMV insertado en la región única corta. Los genes de MDV y NDV están insertados en la misma orientación transcripcional que el gen US2.

El S-HVT-048 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A

25 PARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, 437-26.24 con BamHI y HindIII, 437-26.26 con BamHI y HindIII, y 535-70.3 sin corte. La inserción del DNA apropiado se confirmó por análisis de transferencia Southern.

Ejemplo 11C

30 S-HVT-049

El S-HVT-049 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB y gA del MDV y el gen HN del NDV bajo el control del promotor gX del PRV insertado en la región única corta. Los genes de MDV y NDV están insertados en la misma orientación transcripcional que el gen US2.

El S-HVT-049 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A

35 PARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, 437-26.24 con BamHI y HindIII, 437-26.26 con BamHI y HindIII y 54.9-62.10 sin corte. La inserción del DNA apropiado se confirmó por análisis de transferencia Southern.

Ejemplo 11D S-HVT-050

El S-HVT-050 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB y gA del MDV y el gen HN (SEQ ID NO: 10 y 11) y los genes F (SEQ ID NO: 12 y 13) del NDV. Los genes de NDV están bajo el control de los promotores gX de PRV y le inmediato del HCMV respectivamente. Todos los cuatro genes están insertados en la región

5 única corta en la misma orientación transcripcional que el gen US2.

El S-HVT-050 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS DE DNA. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, 437-26.24 con BamHI y HindIII, 437-26.26 con BamHI y HindIII, y 549-24.15 sin corte. La inserción del DNA apropia

10 do se confirmó mediante análisis de transferencia Southern. El S-HVT-050 ha sido depositado el 23 de febrero de 1993 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR. 2400.

Ejemplo 11E

15 S-HVT-106

El S-HVT-106 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gA, gB, gD del MDV y los genes HN y F del NDV. Los genes de NDV están bajo el control de los promotores gX del PRV e inmediato del HCMV respectivamente. Todos los cinco genes están insertados en la región única corta en la misma orientación transcripcional que el gen US2.

20 El S-HVT-106 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR EL HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, 437-26.24 con BamHI y HindIII, 437-26.26 con BamHI y HindIII y 633-13.27 sin corte.

ENSAYO DE HVT RECOMBINANTES QUE EXPRESAN ANTÍGENOS DEL NDV

25 Se llevaron a cabo dos estudios para demostrar la eficacia de estos virus HVT/MDV/NDV recombinantes para proteger contra la inoculación con virus virulentos de la enfermedad de Marek y Newcastle. En el Estudio 1, los pollos libres de agente patógeno específico (SPF) de un día se vacunaron con bien sea el S-HVT-048, el S-HVT-049, el SHVT-050 o una vacuna convencional con licencia de USDA compuesta de virus NZV B1/B1. Tres semanas después de la vacunación, los pollos vacunados y los pollos de control no vacunados se inocularon con NDV. Las aves se

30 observaron luego respecto a signos clínicos de la enfermedad. Los resultados, de la Tabla 8, muestran que esto virus recombinantes (S-HVT-048 y S-HVT-050) dieron una protección completa contra la inoculación que causó la enfermedad de Newcastle en 100% de los pollos de control no vacunados. El virus recombinante S-HVT-049 dio una protección parcial contra de la enfermedad de Newcastle.

En el segundo estudio, los pollos de un día se vacunaron con S-HVT-050. Dos grupos más de pollos se vacunaron 35 con las vacunas convencionales con licencia de USDA compuesta de HVT y una combinación de virus de HVT y SB

1. Cinco días después de la vacunación, los pollos vacunados y un grupo de pollos de control no vacunados se inocularon con el MDV. Los pollos se observaron durante ocho semanas respecto a signos clínicos de la enfermedad de Marek, y luego se les hizo la autopsia y se observaron las lesiones de Marek. Este estudio demostró la capacidad del S-HVT-050 para proporcionar una protección mayor que las vacunas comerciales de la enfermedad de Marek.

40 TABLA 8. EFICACIA DE LOS VIRUS HVT/MDV/NDV RECOMBINANTES CONTRA LOS VIRUS VIRULENTOS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK Y NEWCASTLE

% de protección

Estudio

Dosisa NDVb MDVc

1

S-HVT-048 4,0 X 104 219/19 (100)

1

S-HVT-049 3,0 X 104 4/20 (20)

1

S-HVT-050 1,5 X 104 20/20 (100)

1

Controles 0/2 (0)

1

NDV Bl/Bld 18/18 (100)

2

S-HVT-050 7,5 X 102 13/14 (93)

2

S-HVT-050 1,5 X 103 16/74 (94)

2

Controles 5/23 (22)

2

HVTd 20/26 (77)

2

HVT/SB-ld 10/12 (83)

aUFP/ 0,2 ml.

bNº de protegidos/Total; Inoculación 3 semanas después de la vacunación

cNº de protegidos /Total; Inoculación 3 semanas después de la vacunación dVacuna comercial

Ejemplo 12

Vacunas bivalentes contra la laringotraqueitis infecciosa y la enfermedad de Marek

Un HVT recombinante que expresa glicoproteínas del virus ILT produjo vacunas bivalentes que protegen contra

5 tanto la enfermedad de Marek como la laringotraqueitis infecciosa. Se obtuvieron varios HVT recombinantes que expresan glicoproteínas de S-HVT-051 del ILTV (Ejemplo 12A), S-HVT-052 (Ejemplo 12B) y S-HVT-104 (Ejemplo 11C).

Ejemplo 12A

S-HVT-051

10 El S-HVT-051 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen gB del ILTV insertado en la región única corta. El gen del ILTV está insertado en la misma orientación transcripcional que el gen US2.

El S-HVT-051 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI,

15 437-26.24 con BamHI y HindIII, 437-26.26 con BamHI y HindIII, y 528-11.34 sin corte. La inserción del DNA apropiado se confirmó mediante el análisis de transferencia Southern.

Ejemplo 12B

S-HVT-052

El S-HVT-052 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen gD de ILTV insertado en la región única 20 corta. El gen del ILTV está insertado en la orientación transcripcional opuesta al gen US2.

El S-HVT-052 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, 437-26.24 con BamHI y HindIII, 437-26.26 con BamHI y HindIII, y 528-03.37 sin corte. La inserción del DNA apropia

25 do se confirmó mediante análisis de transferencia Southern.

Ejemplo 12C

S-HVT-104

El S-HVT-104 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene seis genes extraños. Los genes gA, gB y gD del MDV están insertados en la región corta única en la misma orientación transcripcional que el gen US2. Un gen

30 marcador lacZ de E. coli y los genes gB y gD del ILTV están insertados insertados en la región BamHI nº 16 en la misma orientación transcripcional que el gen UL43.

Para construir el S-HVT-104, el DNA del S-HVT-062 y el plásmido 634-29.16 se co-transfectaron de acuerdo con el método de TRANSFECCION DE DNA PARA GENERAR VIRUS RECOMBINANTES en células fibroblastos de embrión de pollo primarios (CEF).

35 ENSAYO DE HVT RECOMBINANTES QUE EXPRESAN ANTÍGENOS DEL ILTV

El siguiente estudio se llevó a cabo para demostrar la eficacia de estos HVT/ILTV recombinantes para proteger contra la inoculación con el virus virulento de laringotraqueitis infecciosa. Los pollos libres de agente patógeno específico (SPF) de un día se vacunaron con bien sea el S-HVT-051, el S-HVT-052, una combinación del S-HVT-051 o bien sea el S-HVT-052, o una vacuna convencional con licencia de USDA compuesta de ILTV. Dos a tres semanas des

40 pués de la vacunación, los pollos vacunados y los pollos de control no vacunados se inocularon con el ILTV. Las aves se observaron luego con respecto a los signos clínicos de la enfermedad. Los resultados recogidos en la Tabla 9, muestran que estos virus recombinantes (S-HVT-051 y S-HVT-052) dieron una protección contra el ILTV comparable con la vacuna ILTV comercial.

Los animales vacunados con las vacunas descritas en la presente memoria pueden diferenciarse fácilmente de los

45 animales infectados con el ILTV virulento. Esto se logra mediante analizando las aves sospechosas respecto a anticuerpos para cualesquiera antígenos de ILTV distinto de gB o gD. Los ejemplos de tales antígenos son las glicoproteínas C, E y G de ILTV. Las aves no infectadas vacunadas serán negativas para estos antígenos mientras que las aves infectadas serán positivas.

TABLA 9. EFICACIA DE LOS VIRUS HVT/ILTV RECOMBINANTES CONTRA LA INOCULACIÓN DE VIRUS VIRULENTE DE LARINGOTRAQUEITIS INFECCIOSO

Grupo de vacuna

Dosisa Protecciónb

S-HVT-051

28/30 (93%)

2,1 X 103

S-HVT-052

1,7 X 103 29/29 (100%)

S-HVT-051+

2,1 X103 24/24 (100%)

S-HVT-052

1,7 X 103

Controles

2/30 (7%)

ILTCc

29/30 (97%)

aUFP/0,2 ml.

b Nº de protegidos/Total; Inoculación 2-3 semanas después de la vacunación

cVacuna comercial.

Ejemplo 13

5 Vacunas bivalentes contra de la enfermedad de Marek y la enfermedad bursal infecciosa

El HVT recombinante que expresa proteínas del IBDV produce vacunas bivalentes que protegen contra tanto la enfermedad de Marek como la enfermedad bursal infecciosa. Se construyeron diversos HVT recombinantes que expresan proteínas del IBDV. Estos virus incluyen el S-HVT-003 (ejemplo 2) y el S-HVT-096.

El S-HVT-096 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen VP2 del IBDV, bajo el control del pro

10 motor temprano inmediato del HCMV, insertado en la región única corta. El gen de IBDV está insertado en la misma orientación transcripcional que el gen US2.

El S-HVT-096 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI,

15 437-26.24 con BamHI y HindIII, 556-60.6 con BamHI y 602-57.F1 sin corte. La inserción del DNA apropiado se confirmó mediante análisis de transferencia Southern.

El S-HVT-096 se analizó para la expresión de VP2 mediante placas negras y análisis de transferencia Western. Ambos ensayos indicaron que el virus estaba expresando niveles altos de proteína que reaccionan específicamente con un anticuerpo monoclonal neutralizante del IBDV. Este virus será útil como una vacuna contra la enfermedad

20 bursal infecciosa.

Ejemplo 14

Vacunas bivalentes contra la bronquitis infecciosa y la enfermedad de Marek

El S-HVT-066 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB, gD y gA del MDV y los genes clavo y matriz del IBV. Los genes clavo y matriz IBV están bajo el control de los promotores temprano inmediato y

25 del HCMV y gX del PRV respectivamente. Todos los cinco genes están insertados en la región única corta. Los genes del MDV e IBV están insertados en la misma orientación transcripcíonal que el gen US2.

El S-HVT-066 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS DE DNA SUBGENÓMICOS. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 17207.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI,

30 43726.24 con BamHI y HindIII, 556-60.6 con BamHI, y 567-72.1D sin corte. La inserción del DNA apropiado se confirmó mediante análisis de transferencia Southern.

El S-HVT-066 se analizó para la expresión de la proteína clavo del IBV mediante placas negras y análisis de transferencia Western. Ambos análisis indicaron que el virus estaba expresando altos niveles de proteína que reaccionaron específicamente con el anticuerpo monoclonal neutralizante del IBV. Estos virus serán útiles como vacuna contra la

35 bronquitis infecciosa.

Ejemplo 15

Vacunas que utilizan HVT para expresar antígenos de varios agentes patógenos

Se anticipa que los antígenos de los siguientes patógenos pueden ser utilizados para desarrollar vacunas para aves: Virus de la anemia de pollos (agente), virus de la encefalomielitis aviar, Reovirus aviar, Paramixovirus aviar, virus de 40 la gripe aviar, Adenovirus aviar, Virus de la viruela aviar, Coronavirus aviar, Rotavirus aviar, Salmonella spp, E. coli, Pasteurella spp, Haemofilus spp, Clamidia spp, Mycoplasma spp, Campilobacter spp, Bordetella spp, Nemátodos de

aves, Céstodos, Trematodos, ácaros de aves/piojos Protozoos de aves (Eimeria spp, Histomonas spp, Trichomonas spp).

Ejemplo 16

Se describen vacunas trivalentes contra la laringotraqueitis infecciosa, la enfermedad de Marek y la enfermedad de Newcastle y vacunas bivalentes contra laringotraqueitis infecciosa y la enfermedad de Marek. La protección superior contra la laringotraqueitis infecciosa se logra con una vacuna que combina el S-HVT-123 (que expresa gB y gD de ILTV) con el S-HVT-138, 139 o 143 (que expresan gD y gI del ILTV).

Ejemplo 16A

S-HVT-123

El S-HW-123 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB y gD del ILTV insertados en un sitio XhoI convertidos en un sitio NotI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figuras 13B y 15; (SEQ ID NO: 48). El S-HVT-123 contiene además los genes gA, gD y gB del MDV insertados en el sitio StuIl único convertido en el sitio HindIII en el gen HVT-US2. Los genes del ILTV y los genes del MDV usan cada uno sus propios promotores respectivos. El S-HVT123 es útil como vacuna en aves en contra la laringotraqueitis infecciosa y la enfermedad de Marek.

El S-HVT-123 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 721-38.1J sin corte, 729-37.1 con AscI.

Ejemplo 16B

S-HVT-138

El S-HVT-138 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gD y gI del ILTV insertado en un sitio XhoI único convertido en el sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figuras 13A y 15). Los genes gD y gI de ILTV están en la orientación transcripcional opuesta al marco de lectura abierto (ORP A) en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figura 14, (SEQ ID NO: 48, 58). Los genes gD y gI del ILTV están expresados como transcritos solapantes de promotores del ILTV endógenos y comparten su señal de poliadenilación endógena propia.

El S-HVT-138 es útil como vacuna de pollos contra la laringotraqueitis infecciosa y la enfermedad de Marek.

El S-HVT-138 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 711-92.1A sin corte, 415-09.BA1 con BamHI.

Los sueros de pollos vacunados con S-HVT-138 reaccionan con las transferencias Western con la proteína gI de ILTV lo que indica que la vacuna de S-HVT-138 expresó la proteína de ILTV y produce una respuesta inmune en las aves. Los pollos vacunados con S-HVT-138 estuvieron protegidos contra la inoculación del virus de la virulento laringotraqueitis infecciosa.

Ejemplo 16C

S-HVT-139

El S-HVT-139 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gD y gI del ILTV insertados en un sitio XhoI único convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT. Los genes gD y gI de ILTV están en la orientación transcripcional opuesta al marco de lectura abierto (ORF A) en el fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figuras 13A y 15; Secuencia ID NO: 48, 50). El S-HVT139 contiene además los genes gA, gD y gB del MDV insertados en el sitio Stul único convertido en un sitio HindIII en el gen US2 del HVT. Los genes gD y gI del ILTV se expresan como transcritos solapantes de sus propios promotores de ILTV endógenos respectivos, y los genes del MDV también se expresan desde sus propios promotores endógenos. El S-HVT-139 es útil como vacuna en aves en contra la enfermedad de Marek y la laringotraqueitis infecciosa.

El S-HVT-139 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 711-92.1A sin corte, 721-38.1J sin corte.

Ejemplo 16D S-HVT-140

El S-HVT-140 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gD y gI del ILTV insertados en un sitio XhoI único convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HTV (Figuras 13A y 15). Los genes gD y gI del ILTV están en la orientación transcripcional opuesta al marco de lectura abierto (ORF A) dentro del fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figura 14; Secuencia ID NO: 48, 50). El S-HVT-140 contiene además los genes gA, gD y gB del MDV y los genes F y HN del NDV insertados en el sitio Stul único convertido en un sitio HindIII en el gen US2 de HVT. Los genes gD y gI del ILTV se expresan como transcritos solapantes de sus propios promotores del ILTV endógenos respectivos, y los genes del lMDV también se expresan desde sus propios promotores de MDV endógenos respectivos. El gen F del NDV es transcrito desde el promotor temprano inmediato del HCMV, y el gen HN del NDV es transcrito desde el promotor gX del PRV. El S-HVT140 es útil como vacuna en aves contra la laringotraqueitis infecciosa, la enfermedad de Marek y la enfermedad de Newcastle.

El S-HVT-140 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 711-92.1A sin corte, 722-60.E2 sin corte.

Ejemplo 17

Se describen vacunas trivalentes contra la enfermedad bursal infecciosa, la enfermedad de Marek y la enfermedad de Newcastle y vacunas bivalentes contra la enfermedad bursal infecciosa y la enfermedad de Marek.

Ejemplo 17A

HVT-126

El S-HVT-126 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen VP2 del IBDV insertado en el sitio XhoI convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) en el genoma del HVT (Figuras 13A y 15). El gen del IBDV está en la misma orientación transcripcional que el marco de lectura abierto (ORF A) en el fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figura 14, SEQ ID NO: 48, 50). El gen VP2 del IBDV se expresa desde un promotor de VP8 del IBRV. El S-HVT-126 es útil como vacuna para pollos contra la enfermedad bursal infecciosa y la enfermedad de Marek.

El S-HVT-126 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A.40 con NotI, 706-57.A3 sin corte, 415-09.BA1 con BamHI.

Ejemplo 17B

HVT-137

El S-HVT-137 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen VP2 del IBDV insertado en un sitio XhoI único convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) en el genoma del HVT (Figuras 13A y 15). El gen del IBDV está en la misma orientación transcripcional que el marco de lectura abierto (ORF A) dentro del fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figura 14; SEQ ID NO: 48, 50). El S-HVT137 contiene además los genes gA, gD y gB del MDV insertados en el sitio Stul único convertido en el sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gen VP2 del IBDV se expresa desde un promotor VP8 del IBRV. Los genes del MDV se expresan desde sus propios promotores del MDV endógenos respectivos. El S-HVT-137 es útil como vacuna en pollos contra la enfermedad bursal infecciosa y la enfermedad de Marek.

El S-HVT-137 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 706-57.A3 sin corte, 721-38.1J sin corte.

Ejemplo 17C

HVT-143

El S-HVT-143 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen VP2 del IBDV insertado en el sitio XhoI único convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figuras 13A y 15). El IBDV está en la misma orientación transcripcional que el marco de lectura abierto (ORF A) en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figura 14; SEQ ID NO: 48, 50). El S-HVT-113 contiene además los genes gA, gD y gB del MDV y los genes F y HN del NDV insertados en el sitio Stul único convertido en el sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gen VP2 de IBDV se expresa desde un promotor VP8 del IBRV. Los genes del MDV se expresan desde sus propios promotores del MDV endógenos respectivos. El gen F del NDV se transcribe desde el promotor temprano inmediato del HCMV y el gen HN del NDV se transcribe desde el promotor gX del PRV. El S-HVT-143 es útil como vacuna en pollos contra la enfermedad bursal infecciosa, la enfermedad de Marek y la enfermedad de Newcastle.

El S-HVT-143 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 606-57.A3 sin corte, 722-60.E2 sin corte.

Ejemplo 18

HVT-128

El S-HVT-128 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes HN y F del NDV insertados en un sitio XhoI único convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figuras 13A y 15). El S-HVT-128 además contiene los genes gA, gD y gB del MDV insertados en un sitio Stul único convertido en el sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gen HN se expresa desde el promotor gX del PRV y el gen F del NDV se expresa desde el promotor temprano inmediato del HCMV. Los genes del MDV se expresan desde los promotores del MDV endógenos. El S-HVT-128 es útil como vacuna en pollos contra la enfermedad de Newcastle y la enfermedad de Marek.

El S-HVT-128 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI y 717-38.12 sin corte. A una mezcla de estos seis cósmidos se añadió una dilución limitante de un virus del HVT recombinante que contiene los genes gA, gD y gB del MDV insertados en la región corta única (véase el HVT-062) y el gen lacZ con el promotor gX del PRV insertado en el sitio XhoI convertido aun sitio NotI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) en la región larga única del HVT. Se seleccionó un virus recombinante S-HVT-128 que fue lacZ negativo.

Ejemplo 18B

HVT-136

El S-HVT-136 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes HN y F del NDV insertados en el sitio XhoI convertido en el sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) en la región larga única del HVT. (Figura 14; SEQ ID NO: 48 y 50). El gen HN del NDV se expresa desde el promotor gX del PRV y el gen F del NDV se expresa desde el promotor temprano inmediato del HCMV. El S-HVT-136 es útil como vacuna para pollos contra la enfermedad de Newcastle y la enfermedad de Marek.

El S-HVT-136 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI y 717-38.12 sin corte, y 415-09.BA1 BA1 con BamHI.

Ejemplo 19

S-HVT-145

Vacuna de virus HVT/MDV recombinantes

El S-HVT-145 es una vacuna de virus recombinante, que contiene las secuencias genómicas del MDV y del HVT, que protege contra la enfermedad de Marek; dicho virus se produce combinando cósmidos de DNA genómico del MDV que contiene los genes que codifican los antígenos protectores relevantes del serotipo 1 y cósmidos de DNAgenómico del HVT de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. El virus resultante es una vacuna que tiene la respuesta inmunoprotectora para el serotipo 1 virulento del MDV y características de crecimiento atenuadas del HVT. En una realización, una vacuna de virus quimérico que contiene los genes del MDV de los genes del fragmento corto único y los genes del HVT del fragmento largo único es útil como vacuna contra la enfermedad de Marek en pollos. Los antígenos protectores del MDV en la región corta única (gD, gE y gI) producen una respuesta inmunoprotectora frente al MDV mientras que los elementos virulentos presentes en el fragmento largo único del MDV (55, 56, 57) están reemplazados por las secuencias largas únicas atenuantes de HVT. El resultado es una vacuna de virus atenuado que protege contra la enfermedad de Marek. La protección multivalente contra la enfermedad de Marek, la laringotraqueitis infecciosa, la enfermedad bursal infecciosa, la enfermedad de Newcastle u otro agente patógeno de pollo se logra insertando los genes gB, gD y gI de ILTV, el gen VP2 del IBDV, los genes HN y F del NDV o un gen antígeno de agente patógeno de aves en el sitio XhoI convertido en un sitio PacI o el sitio NotI en el fragmento EcoRl nº 9 (BamHI nº 10) en la región larga única del virus recombinante HVT/MDV (Figuras 13 y 15).

Se construyó un cósmido que contenía la región corta única completa del MDV. El DNA genómico del MDV contiene varios sitios SmaI en las repeticiones largas únicas e internas y terminales del virus, pero no en los sitios SmaI en el fragmento corto único del virus. La región corta única completa del MDV se aisló por digestión por restricción parcial del DNA genómico del MDV con SmaI. Se asiló un fragmento de DNA de aproximadamente 29.000 a 33.000 pares de bases y se clonó en un sitio terminado en extremos romos del vector cósmido pWE15. Para generar un HVT-145, un virus quimérico HVT/MDV recombinante, el cósmido que contiene la región corta única del MDV se combinó con cósmidos que contienen la región larga única del HVT de acuerdo con el METODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07-BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 407-32.1C1 con NotI, y 739-27.16 con NotI.

La vacuna vírica resultante proporciona una protección superior contra la enfermedad de Marek o como vacuna multivalente contra la enfermedad de Marek y la laringotraqueitis infecciosa, la enfermedad bursal infecciosa, la enfermedad de Newcastle u otro agente patógeno aviar. Esta vacuna es superior debido a la expresión de los genes del MDV en la vacuna quimérica del HVT/MDV, que es más segura y proporciona una mejor protección contra la enfermedad de Marek que las vacunas actualmente disponibles que contienen HVT y 2(SB-1) del tipo MVD o HVT solo. En segundo lugar se puede demostrar la expresión de los genes de glicoproteínas del MDV en ausencia de genes de HVT homólogos tanto para fines de diagnóstico como reguladores. Esto es útil ya que los anticuerpos para una glicoproteína del MDV reaccionarán de forma cruzada con las glicoproteínas homólogas del HVT. Finalmente, un virus recombinante de HVT/MDV que contiene una sola copia de cada gen de glicoproteína es más estable que un virus recombinante que contiene dos copias de un gen de glicoproteína homóloga de HVT y de MDV el cual puede delecionarse (suprimirse) mediante recombinación de homólogos.

En una realización alternativa, los cósmidos que contienen genes de antígenos protectores del MDV del fragmento largo único (gB y gC del MDV) se combinan con cósmidos que contiene secuencias de gen de HVT de la región corta única y de la región larga única, evitando eficazmente los genes virulentos del MDV en la unión de repetición única y en la unión de repetición terminal/larga única (55, 56 y 57).

La cepa SB-1 es un serotipo 2 del MDV con una patogenicidad atenuada. La vacunación con una combinación del HVT y de virus vivos SB-1 protege contra la inoculación del MDV virulento mejor que la vacunación con cualquier virus solo. En una realización alternativa de la presente invención, una vacuna de virus recombinante comprende genes de antígenos protectores de los serotipos 1 del MDV virulentos combinados con genes atenuantes de los serotipos 2 y 3 de MDV no virulentos, tal como el SB-1 y el HVT. El DNA genómico correspondiente a la región larga única es contribuido por el serotipo SB-1. El DNA genómico correspondiente a la región corta única es contribuido por el serotipo SB-1.Tres antígenos de las glicoproteínas principales (gB, gA y gD) del serotipo MDV 2 están insertados en la región corta única del virus.

El virus recombinante se construye utilizando los clones subgenómicos del HVT 672-01.A40, 672-07.C40 y 72138.1J para reconstruir la región corta única. El clon subgenómico 721-38.1J contiene una inserción de los genes gB, gA y gD del MDV. Un exceso molar grande de estos clones se co-transfeccionó con una dosis sub-infecciosa de DNA genómico de SB-1. Para determinar la dosis sub-infecciosa apropiada, la transfección del SB-1 se titula hasta una dosis que ya no da placas de virus en un cultivo de células. Tal dosis contiene fragmentos subgenómicos que se extienden a la región larga única del SB-1 que se recombina con los clones subgenómicos cortos únicos del HVT. Por tanto, un virus resultante de la combinación entre las regiones de homólogos solapantes de los fragmentos subgenómicos SB-1 y HVT está altamente favorecido. Alternativamente, los fragmentos genómicos de SB-1 de la región larga única se subclonan en vectores cósmidos. Se produjo un virus recombinante que contiene la región única largade SB-1, la corta única del HVT con los genes gB, gA y gD del MDV usando el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Este método también se usó con el clon subgenómico del HVT para insertar los genes de antígenos de otros agentes patógenos aviares incluyendo, pero sin limitación: el virus de laringotraqueitis infecciosa, el virus de la enfermedad de Newcastle y el virus de la enfermedad bursal infecciosa.

Ejemplo 20

El HVT recombinante que expresa un factor de crecimiento mielomonocítico de pollo (cMGF) o un interferón de pollo (cIFN) son útiles como vacunas contra el virus de la enfermedad de Marek y también son útiles para mejorar la respuesta inmune frente a otras enfermedades de las aves. El factor de crecimiento mielomonocítico de pollos (cMGF) está relacionado con la proteína de mamífero G-CSF e interleuquina-6 (58) y el interferón de pollo (cIFN) es homólogo al interferón de mamífero de tipo 1 (59). Cuando se usa en combinación con las vacunas descritas en los ejemplos previos, el S-HVT-144 o el HVT que expresan el cIFN son útiles para proporcionar la inmunidad mucosal, humoral o mediada por células mejorada contra los virus que provocan la enfermedad aviar incluyendo, pero sin limitación: virus de la enfermedad de Marek, el virus de la enfermedad de Newcastle, el virus de la laringotraqueitis infecciosa, el virus de la bronquitis infecciosa, el virus de la enfermedad bursal infecciosa. El HVT recombinante que expresa el cMGF o el cIFN son útiles para proporcionar una inmunidad mejorada contra la enfermedad aviar causada por los organismos descritos en el Ejemplo 15.

Ejemplo 20A S-HVT-144

El S-HVT-144 es un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de factor de crecimiento mielomonocítico de pollos (cMGF) en un sitio XhoI convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 en la región larga única del HVT. El gen cMGF está en la orientación transcripcional opuesta al marco de lectura abierto (ORF A) en el fragmento EcoRl nº 9 del genoma del HVT (Figura 14; SEQ ID NO: 48 y 50). El gen cMGF se expresa desde un promotor temprano inmediato de citamegalovirus humano. El S-HVT-144 es útil como vacuna para pollos contra la enfermedad de Marek.

El S-HVT-144 se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES APARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 751-87.A8 con AscI, 415-09.BA1 con BamHI.

Ejemplo 20B. HVT recombinante que expresa interferón de pollo

Un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de interferón de pollos (cIFN) insertado en un sitio XhoI se convirtió en un sitio PacI en el fragmento EcoRl nº 9 dentro de la región larga única del HVT. El gen del cIFN se expresa desde un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. El HVT recombinante que expresa cIFN es útil como vacuna para pollos contra la enfermedad de Marek.

El HVT recombinante que expresa el cIFN se construye de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 761-07.A1 con AscI, 415-09.BA1 con BamHI.

El HVT recombinante que expresa citoquinas aviares se combinó con HVT que expresa genes de antígenos de la enfermedad aviar para mejorar la respuesta inmune. Las citoquinas adicionales que se expresan en el HVT y tienen efectos estimulantes inmunológicos incluyen, pero sin limitación: el factor beta de crecimiento transformante, la familia de factores de crecimiento epidérmico, los factores de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento de hepatocitos, los factores de crecimiento de tipo insulina, el factor de crecimiento de nervios de tipo B, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento endotelial vascular, interleuquina 1, antagonista del receptor de IL-1, interleuquina 2, interleuquina 3, interleuquina 4, interleuquina , interleuquina 6, receptor soluble de IL6, interleuquina 7, interleuquina 8, interleuquina 9, interleuquina 10, interleuquina 11, interleuquina 12, interleuquina 13, angiogenina, quimoquinas, factores de estimulación de colonias, factores de estimulación de colonias de granulositos-macrófagos, eritropoyetina, interferón, gamma-interferón, factor inhibidor de leucemia, oncostatina M, pleiotrofina, inhibidor de proteasa de leucocitos secretores, factor de células madres, factores de necrosis tumoral, y receptores del TNF solubles. Estas citoquinas son de especies aviares u otros animales incluyendo seres humanos, bovinos, equinos, felinos, caninos o porcinos.

Ejemplo 20C. HVT recombinante que expresa genes del virus de la enfermedad de Marek y el gen del interferón de pollo.

Un herpesvirus recombinante de pavos contiene el gen de interferón de pollos (cIFN) insertado en un sitio XhoI convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 dentro de la región larga única del HVT y además contiene los genes gA, gD y gB del MDV insertados en un sitio Stul único convertido en un sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gen del cIFN se expresa desde un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. Los genes del MDV se expresan desde los promotores del MDV endógenos. El HVT recombinante que expresa el cIFN y los genes gA, gB y gD del MDV es útil como vacuna con una respuesta inmune mejorada para pollos contra la enfermedad de Marek.

El HVT recombinante que expresa los genes del MDV y el gen del cIFN se construye de acuerdo con el MÉTODO DE LA GENERACION DE HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usó la combinación siguiente de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 17207.Ba2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 761-07.A1 con AscI, 72138.1J sin corte.

Ejemplo 20D.- HVT recombinante que expresa los genes del virus de la enfermedad de Marek, los genes del virus de la enfermedad de Newcastle y el gen del interferón de pollos.

Un herpesvirus recombinante de pavos contiene el gen de interferón de pollos (cIFN) insertado en un sitio XhoI convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 en la región larga única de HVT y contiene además los genes gA, gD y gB del MDV, y los genes HN y F NDV insertados en el sitio StuI único convertido en el sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gen del cIFN se expresa desde un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. Los genes del MDV se expresan desde los promotores del MDV endógenos. El gen HN del NDV está bajo el control del promotor gX del PRV y el gen F del NDV está bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV. El HVT recombinante que expresa el gen del cIFN y los genes gA, gB y gD del MDV es útil como vacuna con una respuesta inmune mejorada para pollos contra la enfermedad de Marek y la enfermedad de Newcastle.

El HVT recombinante que expresa los genes del MDV, los genes del NDV y el gen del cIFN se construye de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y de enzimas: 40732.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 76107.A1 con AscI, 722-60.E2 sin corte.

Ejemplo 20E .- HVT recombinante que expresa los genes del virus de la enfermedad de Marek y el gen del factor de crecimiento mielomonocítico de pollos.

Un herpesvirus recombinante de pavos contiene el gen del factor de crecimiento mielomonocítico de pollos (cMGF) insertado en el sitio XhoI convertido en el sitio PacI en el fragmento EcoRl nº 9 en la región larga única del HVT y contiene además los genes gA, gD y gB del MDV insertados en el sitio Stul único convertido en un sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gene cMGF se expresa desde un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. Los genes del MDV se expresan desde los promotores del MDV endógenos. El HVT recombinante que expresa cMGF y gA, gB y gD del MDV es útil como vacuna para pollos con una respuesta inmune mejorada contra la enfermedad de Marek.

El HVT recombinante que expresa el gen cMGF y los genes del MDV se construyó de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI, 17207.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-91.A40 con NotI, 751-87.A8 con AscI, 721-38.J sin corte.

Ejemplo 20F .- HVT recombinante que expresa los genes del virus de la enfermedad de Marek, los genes de virus de la enfermedad de Newcastle y el gen del factor de crecimiento mielomonocítico de pollos.

Un herpesvirus recombinante de pavos contiene el gen del factor de crecimiento mielomonocítico de pollos (cGMF) insertado en el sitio XhoI convertido en un sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 en la región larga única del sitio StuI y contiene además los genes gA, gD y gB del MDV y los genes HN y F del NDV insertados en el sitio Stul único convertido en el sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gen de cGMF se expresa desde un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. Los genes del MDV se expresan desde los promotores del MDV endógenos. El gen HN del NDV está bajo el control del promotor gX del PRV y el gen F del NDV está bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV. El HVT recombinante que expresa el cIFN y los genes gA, gB y gD del MDV es útil como vacuna con una respuesta inmune mejorada en pollos contra la enfermedad de Marek y la enfermedad de Newcastle.

El HVT recombinante que expresa los genes del MDV, los genes del NDV y el gen del cGMF se construye de acuerdo con el MÉTODO PARA GENERAR HERPESVIRUS RECOMBINANTES A PARTIR DE FRAGMENTOS SUBGENÓMICOS SOLAPANTES. Se usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas: 40732.2C3 con NotI, 172-07.BA2 con BamHI, 407-32.5G6 con NotI, 672-07.C40 con NotI, 672-01.A40 con NotI, 75187.A8 sin corte, 722-60.E2 sin corte.

Ejemplo 21.- Herpesvirus recombinante de pavos que expresa antígenos de microorganismos que causan enfermedad.

El herpesvirus recombinante de pavos (HVT) es útil para expresar antígenos de microorganismos que causan enfermedad en animales además de a las especies avícolas. El HVT recombinante es útil como vacuna en animales incluyendo, pero limitación humanos, equinos, bovinos, porcinos, caninos y felinos.

El HVT recombinante es útil como vacuna contra las enfermedades equinas cuando los antígenos extraños de las enfermedades o los organismos de las enfermedades se expresan en el vector del HVT, incluyendo pero sin limitación: la gripe equina, el herpesvirus-1 equino y el herpesvirus-4 equino. El HVT recombinante es útil como vacuna contra las enfermedades bovinas cuando los antígenos extraños de las siguientes enfermedades u organismos de enfermedades se expresan en el vector del HVT, incluyendo pero sin limitación: el herpesvirus de tipo 1 bovino, el virus de la diarrea viral bovina, el virus sincitial respiratorio bovino, el virus de la parainfluenza bovina. El HVT recombinante es útil como vacuna contra las enfermedades de los cerdos cuando los antígenos extraños de las siguientes enfermedades u organismos de enfermedades se expresan en el vector HVT, incluyendo pero sin limitación: el síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS/SIRS), el virus del cólera de cerdo, el virus de la gripe de cerdos, el parvovirus de cerdos, el rotavirus de cerdo. El HVT recombinante es útil como vacuna contra las enfermedades felinas o caninas cuando los antígenos extraños de las siguientes enfermedades u organismos de la enfermedad se expresan en el vector del HVT, incluyendo pero sin limitación: el herpesvirus felino, el virus de la leucemia felina, el virus de la inmunodeficiencia felina y la Dirofilaria immitis (gusano del corazón). Los microorganismos que causan enfermedad en perros incluyen, pero sin limitación: el herpesvirus canino, el virus del moquillo canino, el adenovirus canino de tipo 1 (hepatitis), el adenovirus de tipo 2 (enfermedad respiratoria), la parainfluenza, la Leptospira canicola, la icterohemorragia, el parvovirus, el coronavirus, el Borrelia burgdorferi, el herpesvirus canino, la Bordetella bronquiséptica, la Dirofilaria immitis (gusano del corazón) y virus de la rabia.

Ejemplo 22 .Vacunas humanas que usan herpesvirus recombinante de pavos como vector.

El herpesvirus recombinante de pavos (HVT) es útil como vacuna contra enfermedades humanas. Por ejemplo, el agente patógeno de la gripe humana es un virus de rápida evolución cuyos epítopos virales neutralizantes están cambiando rápidamente. Una vacuna del HVT recombinante útil es una en la cual los epítopos neutralizantes del virus de la gripe se cambian rápidamente para proteger contra nuevas cepas de virus de la gripe. Los genes HA y NA de la gripe humana se clonan usando una reacción en cadena de la polimerasa en el HVT recombinante. El HVT recombinante es útil como vacuna contra otras enfermedades humanas cuando los antígenos extraños de las siguientes enfermedades u organismos enfermos se expresan en el vector del HVT: virus de superficie y antígenos de núcleo de la hepatitis B; virus de la hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana, virus-1 de herpes simplex, virus-2 de herpes simplex, citomegalovirus humano, virus de Epstein-Barr, virus de varicela-zóster, herpesvirus humano-6, herpesvirus humano-7, virus de la gripe humana, virus de anginas, virus hantaan, virus de neumonía, rinovirus, poliovirus, virus sincitial respiratorio humano, retrovirus, virus de leucemia de células T humanas, virus de la rabia, virus de paperas, malaria (Plasmodium falciparum), Bordetella pertussis, Difteria, Rickettsia prowazekii, Borrelia bergdorferi, toxoide del tétano y antígenos de tumores malignos.

El HVT recombinante que expresa citoquinas humanas se combina con HVT que expresa genes para de los antígenos de la enfermedad humana para mejorar la respuesta inmune. Las citoquinas adicionales incluyen, pero sin limitación: factor beta del crecimiento transformante, la familia de factores de crecimiento epidérmico, los factores de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento de hepatocitos, los factores de crecimiento análogo a insulina, el factor de crecimiento nervioso B, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, un factor de crecimiento endotelial vascular, interleuquina 1, antagonista del receptor de IL-1, interlequina 2, interleuquina 3, interleuquina 4, interleuquina 5, interleuquina 6, receptor soluble de IL-6, interleuquina 7, interleuquina 8, interleuquina 9, interleuquina 10, interleuquina 11, interleuquina 12, interleuquina 13, angiogenina, quimioquinas, factores estimulantes de colonias, factores estimulantes de colonias de granulocitos-macrófagos, eritropoyetina, interferón, gamma-interferón, factor inhibidor de leucemia, oncostatina M, pleiotrofina, inhibidor de proteasa de leucocitos, factor de células madres, factores de necrosis tumoral, y receptores de TNF solubles de seres humanos y animales se expresan en el HVT y tienen efectos estimulantes de la inmunidad.

Ejemplo 23. Producción mejorada de un herpesvirus recombinante para vacuna de pavos.

Las citoquinas, tal como los interferones y las interleuquinas inhiben la replicación de los virus en cultivo de células y en animales. La inhibición de la producción del interferón celular o de la interleuquina mejora el crecimiento del HVT recombinante en el cultivo de células. El interferón de pollos (cIFN) expresado en un vector recombinante de viruela de cerdo se añadió a cultivos de células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) e infectados con SHVT-012 que expresa β-galactosidasa. El cIFN añadido al medio de cultivo de células reduce tanto la expresión de la βgalactosidasa como el título del S-HVT-012 en una manera dependiente de la dosis. Este resultado indica que el crecimiento del HVT está limitado por la adición exógena de interferón de pollo. Se utilizan varias estrategias para mejorar el crecimiento del HVT en las células de CEF mediante la separación o inactivación de la actividad de interferón de pollo en las células de CEF.

En una realización, un anticuerpo neutralizante de interferón de pollo se añade al medio de cultivo para inhibir la actividad de interferón de pollo y mejorar el crecimiento del HVT recombinante en el cultivo de células de CEF. El anticuerpo anti-cIFN se derivó del suero de ratón o de conejo de animales inyectados con la proteína interferón de pollo, preferiblemente el cIFN procede de un virus recombinante de viruela de cerdo que expresa el interferón de pollo.

Los virus de la viruela segregan proteínas inhibidoras de citoquinas como una estrategia de evasión inmune. Un tipo de mecanismo de evasión inmune del virus de la viruela implica receptores solubles de virus de viruela para interleuquinas, interferón o factores de necrosis tumoral que inactivan las citoquinas y permiten la replicación viral (60). En una realización de la invención, el virus de la viruela de las aves es útil como fuente de proteínas de inhibición de interferón de pollo y otras proteínas de evasión inmune. El medio acondicionado de los cultivos de célula CEF infectadas con FPV se añade a las células de CEF infectadas con HVT para inhibir la actividad del interferón y aumentar el título del HVT. En una realización adicional, la proteína recombinante inhibidora de interferón de pollo u otra proteína de evasión inmune del virus de la viruela se expresa en un vector en combinación con una composición de vacuna del HVT para aumentar el título del HVT.

Las células de fibroblastos de embrión de pollo se manipularon por ingeniería genética para expresar genes extraños (61). En una realización adicional, una línea de células de CEF negativas al interferón se construye mediante la introducción de un vector que expresa un gen que codifica RNA anti-sentido para interferón de pollo en la línea de célula CEF. El HVT recombinante crecido en una línea de células de CEF negativas al interferón demostró títulos de virus mejorados en comparación con el HVT crecido en una línea de células de CEF que producen interferón. En una realización adicional, una línea de células CEF positiva al factor de crecimiento mielomonocítico (cMGF) de pollo se construye mediante la introducción de un vector que expresa el gen cMGF en las células de CEF. El HVT recombinante crecido en la línea de células de CEF positivas al cMGF demuestra títulos de virus mejorados en comparación con el cultivo del HVT en línea de células de CEF negativas al cMGF.

El HVT recombinante de la presente invención es útil como vacuna contra la enfermedad de Marek y contra otras enfermedades como se indicó en los ejemplos previos. Un aumento de la eficacia en el crecimiento del HVT recombinante en las células CEF es útil en la producción de la vacuna.

Referencias

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61.

B. Scgumacher, et al., Virology 203, 144-148 (1994).

LISTADO DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: SYNTRO CORPORATION

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Herpesvirus recombinantes de pavos y sus usos.

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 60

(iv)

DIRECCIÓN DE CORREPONDENCIA:

(A)

DESTINATARIO: John P. White

(B)

CALLE: 1185 Avenue of the Americas

(C)

CIUDAD: New York

(D)

ESTADO: New York

(E)

PAIS: EE.UU. DE AMÉRICA

(F)

CÓDIGO POSTAL: 10036

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

(B)

ORDENADOR: IBM, PC COMPATIBLE

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0 Versión nº 1.25

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-agosto-1995

(C)

CLASIFICACIÓN:

(viii) AGENTE/INFORMACIÓN DEL AGENTE

(A)

NOMBRE: White, John P.

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 28.678

(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES

(A)

TELÉFONO: (212) 278-0400

(B)

TELEFAX: (212) 391-0526

(C)

TÉLEX: 422523

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 3350 pares de bases

(B)

TIPO: Ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(ix)

ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 129..2522

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

imagen2

imagen2

imagen2

imagen3

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 797 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

imagen4

imagen2

imagen5

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 5426 pares de bases

(B)

TIPO: Ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D) TOPOLOGÍA: lineal 10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

15 (iv) ANTI-SENTIDO: NO

(ix) ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 73..1182

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/ producto = “HVT UL42”

5 (ix) ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1306..2574

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/ producto = “HVT UL43”

10 (ix) ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 2790..4259

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/ producto = “gA de HVT”

15 (ix) ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 4701..5339

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/ producto = “HVT UL45”

20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen6

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 369 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 422 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 489 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 212 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

imagen7

imagen8

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

imagen2

imagen2

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1506 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D) TOPOLOGÍA: lineal 10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

15 (iv) ANTI-SENTIDO: NO

(ix) ASPECTO:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1506 20

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 501 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 1734 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

imagen9

imagen2

imagen10

imagen2

imagen2

imagen11

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO 15

(ix) ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1734

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 577 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 1662 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

imagen12

imagen2

imagen13

imagen2

imagen14

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO 15

(ix) ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1662

20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

imagen2

imagen2

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 553 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

74

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

imagen15

imagen16

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 3469 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(ix)

ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..3489

imagen17

imagen2

imagen2

imagen2

imagen18

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 1162 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1846 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 5 (iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(ix)

ASPECTO: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 1..1846

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 615 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 2116 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

imagen19

imagen2

imagen2

imagen2

imagen20

imagen2

imagen21

imagen22

imagen2

imagen23

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO 15

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 705 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 10

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21: 20

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble25 (D) TOPOLOGÍA: lineal

imagen24

imagen25

imagen2

imagen2

imagen2

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO 30

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(ix)

ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS35 (B) LOCALIZACIÓN: 13..57

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 45

imagen26

40

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

50 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 57 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico 55 (C) TIPO DE CADENA: doble

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 99 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 103 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 66 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 66 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(ix)

ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 16..66

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 17 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10

imagen27

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen28

imagen29

15 20

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 132 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

25

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

30

(ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS(B) LOCALIZACIÓN: 1..93

imagen30

35 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

40 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 66 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

imagen31

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

imagen2

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 130 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 120 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:47:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:48:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2681 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen32

imagen2

imagen2

imagen33

imagen2

imagen2

imagen34

imagen2

imagen2

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(ix)

ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 146..481

(ix)

ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: complemento (602..1402)

(ix)

ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1599..2135

(ix)

ASPECTO:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: complemento (2308..2634)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

imagen2

imagen35

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 111 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO 15

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:50:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 266 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido 5 (C) TIPO DE CADENA: doble

imagen36

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

10 (iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

imagen37

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:51: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 178 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido 5 (C) TIPO DE CADENA: doble

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

10 (iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

imagen38

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:52:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 108 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 25

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO 30 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

imagen2

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:53:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Cebador oligonucleotídico de DNA

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:54:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Cebador oligonucleotídico de DNA

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:55:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:56:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 63 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:57:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:58:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:59:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:60:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:

imagen2

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un herpesvirus recombinante de pavos que comprende una secuencia de DNA extraño que en términos de la secuencia del DNA del virus de la la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) consiste en una secuencia que codifica la glicoproteína I del virus de la laringotraqueitis infecciosa y la glicoproteína D del virus de la laringotraqueitis infecciosa dentro del fragmento EcoRI nº 9 del genoma viral del herpesvirus de pavos, en donde la secuencia de DNA extraño que codifica dichas glicoproteínas es capaz de ser expresada en una célula hospedante infectada con el herpesvirus de pavos.

2. 2.

   Un vector para producir un herpesvirus recombinante de pavos insertando una secuencia de DNA extraño que en términos de la secuencia del DNA del virus la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) consiste en una secuencia que codifica la glicoproteína I del virus de la laringotraqueitis infecciosa y la glicoproteína D del virus de la laringotraqueitis infecciosa en el genoma viral del herpesvirus de pavo, comprendiendo dicho vector una molécula de DNA bicatenario que consiste esencialmente en:

   a) dicho DNA extraño en forma bicatenaria;

   b) en un extremo del DNA extraño, DNA bicatenario de herpesvirus de pavos situado en un lado del fragmento EcoRI nº 9 de la región codificadora del genoma viral del herpesvirus de pavos; y;

   c) en el otro extremo del DNA extraño, DNA bicatenario de herpesvirus de pavos situado en el otro lado del fragmento EcoRI nº9 de la región codificadora del genoma viral del herpes virus de pavos.

3. 3.

   El vector de la reivindicación 2, en donde la secuencia de DNA extraño codifica un marcador detectable.

4. 4.

   El vector de la reivindicación 3, en donde el marcador detectable es beta-galactosidasa de E. coli o beta glucuronidasa de E. coli.

5. 5.

   Una vacuna útil para inmunizar un ave contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa, que comprende una cantidad inmunizante eficaz del herpesvirus recombinante de pavos de la reivinidación 1 y un vehículo adecuado.

6. 6.

   Una vacuna que comprende el herpesvirus recombinante de pavos de la reivindicación 1 para uso en inmunizar un ave contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa.

7. 7.

   Una célula hospedante infectada con el herpevirus recombinante de pavo de la reivindicación 1.

8. 8.

   La célula hospedante de la reivindicación 7, en donde la célula hospedante es una célula aviar.