ES2351993T3 - Inmunosupresión mediante chaperonina 10. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: una cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina 10 con la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Description

Inmunosupresión mediante chaperonina 10.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende: una cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina 10 con la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1, y un vehículo excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de injerto frente a hospedante (GVHD - siglas en inglés) es un estado que puede desarrollarse cuando se han introducido en un individuo células inmunológicamente competentes, por ejemplo durante el trasplante de médula ósea o de células madre. La GVHD se refiere al proceso inmunológico en el que las células recientemente trasplantadas despliegan una respuesta de rechazo contra el tejido hospedante. La GVHD puede desarrollarse después del trasplante o la transfusión de tejido de la médula ósea, células madre hematopoyéticas, productos de la sangre no irradiados y órganos sólidos que contienen tejido linfoide.

Existen dos tipos de GVHD, la aguda y la crónica. La GVHD aguda se desarrolla en el espacio de los tres primeros meses tras el trasplante, y los síntomas clínicos incluyen dermatitis, enteritis y hepatitis. La GVHD crónica se desarrolla, habitualmente, tres meses después del trasplante y es un síndrome autoinmune que afecta a múltiples órganos y tejidos, tales como la piel, tracto gastrointestinal y el hígado.

Células T donantes son las responsables de provocar el desarrollo de la GVHD. Células T donantes reconocen los antígenos de las células hospedantes como extraños y responden proliferando y liberando citoquinas que, a su vez, pueden activar a células del sistema inmune innato.

El trasplante alogeneico de la médula ósea o el trasplante de células hematopoyéticas sigue siendo la terapia curativa más eficaz para el tratamiento de malignidades hematológicas, tales como leucemia, mieloma, linfoma y anemia aplástica. La GVHD aguda grave es la causa principal de la mortalidad y la morbidez durante el trasplante de la médula ósea. La GVHD crónica también puede dar como resultado la muerte, y los supervivientes están a menudo gravemente discapacitados.

Fármacos inmunosupresores juegan un gran papel en la prevención, el tratamiento terapéutico y el control de la GVHD aguda y crónica. Los fármacos se pueden administrar al paciente antes y después del trasplante. Los fármacos actuales utilizados en el tratamiento terapéutico de la GVHD incluyen ciclosporina, metotrexato, tacrolimus, sacrolimus, micofenolato de mofetilo y esteroides. Los regímenes de inmunosupresión implican, a menudo, la administración de una combinación de fármacos para el efecto máximo.

Chaperonina 10 (cpn 10) está presente en una diversidad de organismos, desde bacterias a seres humanos, y es un miembro de la familia de proteínas de choque térmico (chaperonas) que se encuentran entre las proteínas más evolutivamente estables que existen. Las moléculas de chaperona están implicadas en el plegamiento post-traducción, la fijación como objetivo y la reunión de otras proteínas (Hartman et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 3394-8), pero no forman parte, por sí mismas, de la estructura reunida final (Ellis et al., 1991, Annu. Rev. Biochem. 60, 321-47). Estas proteínas juegan papeles esenciales en las células normales, pero su producción está suprarregulada durante el estrés celular (p. ej. disrupción metabólica, infección, inflamación, transformación).

Inesperadamente, se descubrió que chaperonina 10 tiene la misma secuencia de aminoácidos que el factor temprano del embarazo (EPF - siglas en inglés) (Morton et al., publicación internacional WO 95/15338). El EPF es una sustancia asociada al embarazo que aparece en el suero materno en el espacio de 6-24 h tras la fertilización (Morton et al., 1974, Nature 249; 459-460 y Morton et al., 1976. Proc. R. Soc. Lond., 193; 413-9). Está presente durante al menos la primera mitad del embarazo y es esencial para el desarrollo continuado y la supervivencia del embrión (Morton et al., 1987, Current Topics in Developmental Biology 23; 73-92). Resulta ahora claro que el EPF tiene muchas funciones fisiológicas y su producción no está confinada al embarazo.

Se ha informado que el EPF puede actuar como un inmunosupresor, liberar factores supresores a partir de linfocitos (Rolfe et al., 1988, Clin. Exp. Immunol. 73, 219-225) y aumentar las propiedades inhibidoras de la roseta de un suero inmunosupresor anti-linfocitos (Morton et al., 1974 y 1976, véase antes). El EPF puede suprimir la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado a trinitroclorobenceno en ratones (Noonan et al., 1979, Nature, 278, 649-51), suprimir la proliferación de linfocitos inducida por mitógenos (Athanasas-Platsis, 1993, Tésis de Doctorado, Universidad de Queensland) y suprimir la producción de IFN-\gamma mediante células T CD4+.

Sin embargo, no ha habido evidencia directa alguna en cuanto a si el EPF o cpn10 pueden tener un potencial como un agente inmunosupresor en los trasplantes y, en particular, en la prevención de la GVHD. Chaperonina 60, una proteína de choque térmico relacionada, que también puede actuar como un inmunosupresor, no ha demostrado poseer efectos terapéuticos algunos en la GVHD. De hecho, la técnica anterior enseña que proteínas de choque térmico pueden tener efectos adversos sobre el trasplante (Ogita et al., 2000, Transplantation, 69, 2273-2277).

El documento WO 95/15338 describe una chaperonina 10 recombinante y su uso para tratar injerto de piel en ratas y en ratones in vivo, con el fin de prolongar la supervivencia de los injertos y de reducir el rechazo de los injertos trasplantados.

Morton H et al., muestran el uso de cpn 10 recombinante (factor temprano del embarazo (EPF)) in vivo como un medicamento testado en ratas en cuanto a su papel en la prolongación de los tiempos de supervivencia de injertos de piel (Morton H et al., "Production of a recombinant form of early pregnancy factor that can prolong allogeneic skin graft survival time in rats". IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY, vol. 78, nº 6, diciembre de 2000 (12-2000), páginas 603-607).

Objeto de la invención

Los autores de esta invención han reconocido que los fármacos inmunosupresores, actualmente utilizados para el tratamiento terapéutico y el control de la GVHD tienen los siguientes defectos importantes:

(i)

inducen efectos secundarios graves, por ejemplo hipertensión que puede requerir una medicación adicional para el control, nefrotoxicidad, que se produce en hasta el 40% de pacientes y, con frecuencia, fuerza al doctor a administrar dosis sub-óptimas del fármaco para limitar la toxicidad, efectos del SNC, tales como tremor, dolor de cabeza, depresión, paraestesia, visión borrosa, crisis, riesgo incrementado de infecciones bacterianas, fúngicas o virales, riesgo incrementado de cáncer, en particular cáncer de piel, pérdida del apetito, náuseas y un crecimiento incrementado del pelo;

(ii)

la GVHD es resistente a los fármacos en un importante porcentaje de pacientes y se requiere una terapia con fármacos de combinación;

(iii)

los fármacos son muy costosos; y

(iv)

los fármacos han demostrado interacciones adversas con otros fármacos terapéuticos, tales como antibióticos, NSAIDs (siglas inglesas de fármacos anti-inflamatorios no esteroides), anti-epilépticos y anti-hongos, inmunizaciones tales como rubéola y polio, y alimentos naturales, tales como pomelos (en el caso de ciclosporina).

Por lo tanto, existe una enorme demanda del desarrollo de un nuevo fármaco para tratar y controlar la GVHD que tenga menos efectos secundarios que los tratamientos actualmente disponibles y que sea más eficaz en pacientes que muestren una resistencia a los actuales fármacos en el mercado.

Los autores de la presente invención han descubierto, de forma inesperada, que cpn 10 posee un enorme potencial clínico como una nueva terapia en el tratamiento y control de la GVHD.

Sumario de la invención

En esta memoria se describe el uso de cpn 10 en el trasplante, en particular para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de injerto frente a hospedante.

También se describe la administración de cpn 10 a un animal donante y/o receptor o células, tejidos u órganos derivados del donante, así como el tratamiento del animal tanto donante como receptor.

Por lo tanto, en un primer aspecto, un método para tratar, de modo terapéutico o profiláctico, la enfermedad de injerto frente a hospedante (GVHD) incluye las etapas de:

(i)

administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina 10 (cpn 10) o un derivado de cpn 10 a un animal donante o célula, órgano o tejido obtenido del mismo; y

(ii)

administrar a un animal receptor una cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o un derivado de cpn 10 para, con ello, retrasar, mejorar, suprimir o reducir de otro modo uno o más síntomas de la GVHD tras el trasplante de la una o más células, tejidos u órganos al animal receptor.

Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o un derivado de cpn 10 se administra a un animal receptor tanto antes como después de la etapa (ii).

Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o derivado de cpn 10 administrada a un animal se encuentra en el intervalo de 0,1-100 mg por kg/peso corporal. Más preferiblemente, se encuentra dentro del intervalo de 0,1-10 mg por kg/peso corporal.

Preferiblemente, el animal es un mamífero.

Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

De manera adecuada, la célula, tejido u órgano es la médula ósea o se deriva de la médula ósea.

De manera adecuada, el método para tratar de un modo terapéutico o profiláctico la GVHD incluye, además, la etapa de administrar a dicho animal donante y/o a dicho animal receptor al menos otro agente inmunosupresor, seleccionado del grupo que consiste en ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetilo y metotrexato.

De manera adecuada, el método para tratar de un modo terapéutico o profiláctico la GVHD incluye, además, la etapa de administrar un esteroide a dicho animal donante y/o a dicho animal receptor.

En un segundo aspecto, un método para inhibir, suprimir o reducir de otro modo la producción de TNF\alpha en un animal incluye la etapa de administrar a dicho animal una cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o derivado de cpn 10 para, con ello, inhibir, suprimir o reducir de otro modo la producción de TNF\alpha en dicho animal.

Preferiblemente, el animal es un mamífero,

Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

De acuerdo con este aspecto, también se describe un método para inhibir, suprimir o reducir de otro modo la producción de TNF\alpha por parte de una o más células, tejidos u órganos obtenidos de un animal, que incluye la etapa de administrar a dichas células, tejidos u órganos una cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o derivado de cpn 10 para, con ello, inhibir la producción de TNF\alpha por parte de dicho animal.

En un tercer aspecto, en esta memoria se describe un método para inducir, aumentar o incrementar de otro modo la producción de IL-10 en un animal, que incluye la etapa de administrar a dicho animal una cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o un derivado de cpn 10 para, con ello, inducir, aumentar o incrementar de otro modo la producción de IL-10 en dicho animal.

Preferiblemente, el animal es un mamífero.

Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

De acuerdo con este aspecto, un método de inducir, aumentar o incrementar de otro modo la producción de IL-10 por parte de una o más células, tejidos u órganos obtenidos de un animal incluye la etapa de administrar a dichas células, tejidos u órganos una cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o un derivado de cpn 10 para, con ello, inducir la producción de IL-10 en dicho animal.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para uso de acuerdo con el método de cualquiera de los aspectos antes mencionados, que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina (cpn 10) que tiene la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El al menos otro agente inmunosupresor es un fármaco inmunosupresor o un anticuerpo especifico dirigido contra linfocitos B o T o receptores de la superficie que median en su activación.

Preferiblemente, el fármaco inmunosupresor es uno cualquiera de ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetilo y metotrexato.

En un aspecto adicional, se describe una composición farmacéutica del cuarto aspecto que comprende, además, un esteroide.

Preferiblemente, dicha proteína cpn 10 tiene una secuencia de aminoácidos recogida en la Fig. 1. (SEQ ID NO:1).

A lo largo de esta memoria descriptiva, "comprenden", "comprende" y "que comprenden" se utilizan de forma inclusiva más que exclusiva, y se entenderá que implican la inducción de un número entero o grupos de números enteros establecidos pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: La secuencia de aminoácidos de la proteína cpn 10 (SEQ ID NO:1).

Fig. 2: El efecto del tratamiento in vivo con cpn 10 sobre las respuestas proinflamatorias, inducidas por LPS y aloantígenos, de macrófagos peritoneales de ratones y sobre la diferenciación de células T.

Fig. 3: Supervivencia de ratones después del trasplante de la médula ósea y el tratamiento post-trasplante de cpn 10. En el periodo post-trasplante (días 0 a 21) se inyectó a los animales, por vía subcutánea, vehículo (grupo singeneico, n = 8 y grupo control alogeneico n = 10) o cpn 10 (10 y 100 \mug/animal/día: cpn 10, 10 \mug/día alogeneico, n = 10 y cpn 10 100 \mug/día alogeneico n = 10). B. Puntuaciones clínicas de la GVHD en ratones representadas a lo largo del tiempo (0-45 días; ** P< 0,01).

Fig.4: Supervivencia de ratones después del trasplante de la médula ósea y del tratamiento pre-trasplante de cpn 10. Ratones receptores y donantes fueron tratados durante 5 días antes del trasplante con inyecciones subcutáneas de cpn 10 (100 \mug/día) o diluyente control. Se formaron entonces cinco grupos de animales: Grupo 1: control singeneico (n = 8) representaba B6D2F1 trasplantado con B6D2F1 singeneico de la médula ósea y células T; Grupo 2: control alogeneico (n =10) consistía en receptores B6D2F1 pre-tratados con diluyente, a los que se les trasplantaron células de donantes B6 pre-tratados con diluyente; Grupo 3: ratones B6D2F1 receptores alogeneicos pre-tratados (n=10), ratones B6D2F1 receptores fueron tratados antes del trasplante con cpn 10 y se les trasplantaron células donantes B6 pre-tratadas con vehículo; Grupo 4: ratones B6D2F1 receptores pre-tratados con diluyentes solamente que recibieron un trasplante de donantes B6 pre-tratados con cpn 10 (alogeneico: donante pre-tratado, n = 10); y Grupo 5: tanto ratones receptores B6D2F1 como donantes B6 fueron pre-tratados con cpn 10 antes del trasplante (alogeneico: pre-tratados con receptor y donante, n = 10). (*P < 0,01 frente al control alogeneico). B. Puntuaciones clínicas de la GVHD en ratones representadas a lo largo del tiempo (0-30 días; ***P < 0,001).

Descripción detallada

Los autores de la invención han demostrado que cpn 10 tiene una actividad inmunosupresora importante en el modelo de trasplante en ratón in vivo y que el tratamiento con cpn 10 aumenta la tasa de supervivencia de ratones que padecen la GVHD. Esta es la primera demostración de los efectos inmunosupresores beneficiosos de cpn 10 y de las tasas incrementadas de supervivencia en un modelo de GVHD in vivo.

La eficacia del tratamiento con cpn 10 se incrementa si tanto los animales donantes como receptores son tratados con cpn 10 antes del proceso de trasplante. Se demuestra también que cpn 10 inhibe la secreción de TNF\alpha mediada por lipopolisacáridos y fomenta la producción de IL-10 en macrófagos de ratón. IL-10 es una potente citoquina inmunosupresora, que es un poderoso inhibidor de respuestas inmunes adaptativas innatas a LPS.

La GVHD aguda tras un trasplante de médula ósea (BMT - siglas en inglés) alogeneico es una enfermedad mediada por células T, en la que células T donantes reconocen antígenos del hospedante dispares y se diferencian de una manera Th1 dominante. Las citoquinas Th1 derivadas de células T resultantes ceban células mononucleares donantes que liberan cantidades citopáticas de citoquinas inflamatorias (p. ej. TNF\alpha) cuando entran en contacto con un lipopolisacárido (LPS). El LPS escapa a través de la mucosa gastrointestinal que está lesionada por la GVHD y por la radiación precedente. Por lo tanto, TNF\alpha, junto con la producción desregulada de citoquinas citotóxicas, induce la apoptosis en el tejido hospedante. La mortalidad por GVHD en modelos de BMT es evitada mediante la inmunosupresión dirigida a células T, particularmente por agentes que inhiben la generación de IL-2.

La presente descripción queda ejemplificada con respecto al trasplante de médula ósea. Sin embargo, se apreciará que el concepto es aplicable a otras células, tejidos y órganos que incluyan células inmuno-competentes, capaces de iniciar una respuesta inmune en el hospedante. Ejemplos no limitantes de células, tejidos y órganos de este tipo incluyen el hígado, pulmón, corazón, riñón y células madre y progenitoras.

La descripción, según se describe en esta memoria, puede ser ampliamente aplicable a cualquier animal, pero está particularmente dirigida a mamíferos y, de preferencia, seres humanos. Por ejemplo, puede dirigirse a un trasplante en ganado, animales domésticos, animales de laboratorio y animales para espectáculos (por ejemplo, caballos de carreras y camellos).

Para los fines de esta memoria descriptiva, por "aislado" se quiere dar a entender material que ha sido separado de su estado natural o ha sido sometido de otra manera a una manipulación humana. El material aislado puede estar sustancial o esencialmente exento de componentes que normalmente le acompañan en su estado natural, o puede ser manipulado con el fin de estar en un estado artificial junto con componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural. El material aislado puede estar en una forma nativa, química, sintética o recombinante.

Por "proteína" se quiere dar a entender un polímero de aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales o no naturales, D- y L-aminoácidos, según son bien entendidos en la técnica.

Un "péptido" es una proteína que no tiene más de cincuenta (50) aminoácidos.

Un "polipéptido" es una proteína que tiene más de cincuenta (50) aminoácidos.

La expresión "ácido nucleico", tal como se utiliza en esta memoria, designa ARNm, ARN, ARNc, ARNi y ADN de cadena sencilla o doble, incluido ADNc y ADN genómico.

Por "agente inmunosupresor" se quiere dar a entender un agente que puede suprimir de manera profiláctica o terapéutica una respuesta autoinmune o inmune contra una célula, tejido u órgano alogeneico o xenogeneico trasplantado, o suprimir la enfermedad de injerto frente a hospedante.

Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 administrada a un individuo se encuentra en el intervalo de 0,1-100 mg.

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Más preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 administrada a un individuo se encuentra en el intervalo de 0,1-10 mg.

Se apreciará por parte de la persona experta que las cantidades farmacéuticamente eficaces antes mencionadas se calculan en términos de un ser humano típico de 70 kg de peso. Por consiguiente, las dosis pueden variar en función del peso, la edad, el sexo, la salud general, la forma física del individuo y de cualesquiera otros tratamientos a los que está siendo sometido el individuo. Además de ello, la cantidad de cpn 10 administrada será independiente de la frecuencia y del tiempo de administración.

También se apreciará que las cantidades farmacéuticamente eficaces de cpn 10 antes mencionadas se pueden administrar a animales, por ejemplo animales domésticos y ganado. Las dosis variarán en función del peso y tipo de animal, como resultará evidente para los expertos en la técnica.

La cpn 10 administrada a un ser humano u otro animal puede ser cualquier forma de cpn 10 aislada, incluida, pero no limitada a cpn 10 recombinante (SEQ ID NO.1), cpn 10 nativa, cpn 10 pegilada, cpn 10-GSM recombinante o cualquier otra proteína derivada de cpn 10.

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cpn 10 adecuadas son bien conocidas en la técnica, a pesar de que, por conveniencia, la persona experta es remitida a la siguiente secuencia de cpn 10 de mamíferos

(i)

cpn 10 humana (NCBI nº de acceso de entrada U07550; Chen et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1219, 189-190);

(ii)

cpn 10 de ratón (NCBI nº de acceso de entrada U09659; Dickson et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 26858-864); y

(iii)

cpn 10 de rata (NCBI nº de acceso de entrada X71429; Ryan et al., 1994, FEBS Lett, 337, 152-156).

Tanto el donante como el receptor pueden ser tratados con cpn 10 antes del proceso de trasplante.

Preferiblemente, el donante se ve sometido a un tratamiento con cpn 10 durante no más de 7 días antes del proceso de trasplante. Más preferiblemente, el donante se ve sometido a un tratamiento con cpn 10 durante 2 a 5 días antes del proceso de trasplante.

Preferiblemente, el receptor se ve sometido a un tratamiento con cpn 10 durante no más de 7 días antes del proceso de trasplante y durante no más de 90 días después del proceso. Más preferiblemente, el receptor se ve sometido a un tratamiento con cpn 10 durante 2 a 5 días antes del proceso de trasplante y durante no más de 60 días después del proceso. Incluso más preferiblemente, el receptor se ve sometido a un tratamiento con cpn 10 durante 2 a 5 días antes del proceso de trasplante y durante 10 a 30 días después del proceso.

Tal como se utiliza en esta memoria, proteínas "derivadas" de la memoria descriptiva son proteínas tales como proteínas cpn 10 que han sido alteradas, por ejemplo por conjugación o formación de complejo con otros restos químicos o mediante técnicas de modificación post-traducción según se entiende en la técnica, incluidas proteínas del participante en la fusión.

Otros derivados contemplados por la descripción incluyen, pero no se limitan a la pegilación, modificación a cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis de péptidos, polipéptidos o proteínas, y el uso de reticuladores y de otros métodos que imponen limitaciones conformacionales a los polipéptidos, fragmentos y variantes de la descripción. Ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contempladas por la presente descripción incluyen modificaciones de grupos amino, tales como mediante acilación con anhídrido acético; acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; amidinación con acetemidato de metilo; carbomoilación de grupos amino con cianato; piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato, seguido de reducción con NaBH_{4}; alquilación reductora mediante reacción con un aldehído, seguido de reducción con NaBH_{4} y trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobenceno-sulfónico (TNBS - siglas en inglés).

El grupo carboxilo se puede modificar mediante activación con carbodiimida a través de la formación de O-acilisourea, seguido de la subsiguiente derivatización, a modo de ejemplo, en una correspondiente amida.

El grupo guanidina de los residuos arginina se puede modificar mediante formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.

Los grupos sulfhidrílo se pueden modificar por métodos tales como oxidación con ácido perfórmico en ácido cisteico; formación de derivados de mercurio utilizando ácido 4-cloromercurilfenilsulfónico, 4-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenol, cloruro de fenilmercurio y otros compuestos de mercurio; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; y carbamoilación con cianato a pH alcalino.

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Residuos de triptófano se pueden modificar, por ejemplo, mediante alquilación del anillo indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfonilo o mediante oxidación con N-bromosuccinimida.

Los residuos de tirosina se pueden modificar mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.

El anillo de imidazol de un residuo histidina se puede modificar mediante N-carboetoxilación con pirocarbonato de dietilo o mediante alquilación con derivados del ácido yodoacético.

Ejemplos de incorporar aminoácidos no naturales y derivados durante la síntesis de los péptidos incluyen, pero no se limitan al uso de ácido 4-amino-butírico, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, t-butilglicina, norleucina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, 2-tienil-alanina y/o isómeros D de aminoácidos.

Los derivados también pueden incluir participantes en la fusión y etiquetas de epitopos. Ejemplos bien conocidos de participantes en la fusión incluyen, pero no se limitan a glutation-S-transferasa (GST), la porción Fe de IgG humana, proteína de unión a maltosa (MBP - siglas en inglés) y hexahistidina (HIS_{6}) que son particularmente útiles para el aislamiento de la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad. Para los fines de la purificación de los polipéptidos de fusión mediante cromatografía de afinidad, matrices relevantes para la cromatografía de afinidad son resinas conjugadas con glutation, amilasa y níquel o cobalto, respectivamente. Muchas matrices de este tipo están disponibles en forma de un "kit", tal como el sistema QIAexpress^{TM} (Qiagen) útil con participantes en la fusión (HIS_{6}) y el sistema de purificación de GST de Pharmacia.

Un ejemplo particular de un participante en la fusión es GST tal como se describe en Ryan et al. (véase antes). En algunos casos, los participantes en la fusión también tienen sitios de escisión de proteasas, tales como para el factor X_{a} o trombina, que permiten a la proteasa relevante que digiera parcialmente el polipéptido de fusión de la invención y, con ello, libere el polipéptido recombinante de la invención a partir de ella. El polipéptido liberado se puede después aislar del participante en la fusión mediante subsiguiente separación cromatográfica. Tras la escisión de GST-cpn 10 se produce, por ejemplo, el derivado GSM-proteína cpn 10.

Participantes en la fusión de acuerdo con la memoria descriptiva incluyen también, dentro de su alcance, "etiquetas de epítopos" que habitualmente son secuencias cortas de péptidos para las que está disponible un anticuerpo especifico. Ejemplos bien conocidos de etiquetas de epitopos para las que están fácilmente disponibles anticuerpos monoclonales específicos incluyen c-myc, hemaglutinina y etiquetas FLAG.

Proteínas cpn 10 de la memoria descriptiva (incluidos fragmentos, variantes, derivados y homólogos) se pueden preparar por cualquier proceso adecuado conocido por los expertos en la técnica, que incluyen la síntesis química y expresión recombinante.

Preferiblemente, cpn 10 es cpn 10 recombinante.

Por ejemplo, la proteína cpn 10 recombinante se puede preparar mediante un proceso que incluye las etapas de:

(i)

preparar una construcción de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cpn 10, operativamente enlazada a uno o más secuencias de nucleótidos reguladoras en un vector de expresión;

(ii)

transfectar o transformar una célula hospedante adecuada con la construcción de expresión; y

(iii)

expresar la proteína recombinante en dicha célula hospedante.

Un "vector de expresión" puede ser un vector extracromosómico autorreplicante, tal como un plásmido, o un vector que se integra en un genoma hospedante.

Por "operativamente enlazada" se quiere dar a entender que dicha o dichas secuencias de nucleótidos reguladoras están situadas con relación al ácido nucleico recombinante de la invención para iniciar, regular o controlar de otro modo la transcripción.

Secuencias de nucleótidos reguladoras serán generalmente apropiadas para la célula hospedante utilizada para la expresión. En la técnica se conocen numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una diversidad de células hospedantes. Típicamente, dicha una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir pero no se limitan a secuencias de promotor, secuencias conductoras o de señal, sitios de unión a ribosomas, secuencias de comienzo y terminación de la transcripción, secuencias de comienzo y terminación de la traducción, secuencias de donante/aceptor de corte y empalme y secuencias de reforzador o activador.

Están contemplados por la invención promotores constitutivos inducibles, según se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, promotores represibles por tetraciclina e inducibles por metalotionina. Los promotores pueden ser promotores que se producen de forma natural o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor.

En una realización preferida, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células hospedantes transformadas. Genes marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula hospedante utilizada.

Células hospedantes adecuadas para la expresión pueden ser procarióticas o eucarióticas, tales como Escherichia coli (por ejemplo DH5\alpha), células de levaduras, células SF9 utilizadas con un sistema de expresión de baculovirus, células CHO, células COS, CV-1 y 293, sin limitación a ellas.

La proteína cpn 10 recombinante puede prepararse convenientemente por una persona experta en la técnica utilizando protocolos convencionales, según se describe, por ejemplo en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), en particular en las Secciones 16 y 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, compiladores Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), en particular los Capítulos 10 y 16; y CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, compiladores Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), en particular en los Capítulos 1, 5 y 6.

En el documento WO 95/15338 se proporciona un ejemplo para la producción y purificación de cpn 10 sintética recombinante utilizando el sistema pGEX. Para producir la cpn 10 (SEQ ID NO:1) se utilizó un sistema de expresión bacteriano de alto rendimiento, del que se sabe que produce cpn 10 activa (Ryan et al., véase antes) utilizada en los experimentos descritos en esta memoria.

Composiciones farmacéuticas

La memoria descriptiva proporciona un uso de cpn 10 par el tratamiento terapéutico de enfermedades o estados médicos provocados por el trasplante de células, tejidos u órganos, en particular la GVHD.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cpn 10 que tiene la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1.

De manera adecuada, la composición farmacéutica comprende un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, apropiado.

De manera adecuada, la composición farmacéutica comprende cpn 10, un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos otro agente inmunosupresor. Preferiblemente, el otro agente inmunosupresor es un fármaco inmunosupresor o un anticuerpo especifico dirigido contra linfocitos B o T o receptores en superficie que median en su activación. Más preferiblemente, el agente inmunosupresor es uno cualquiera de ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetilo y metotrexato. La composición farmacéutica también puede comprender un esteroide.

Por "vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" se quiere dar a entender un material de carga sólido o líquido, diluyente o sustancia encapsulante que se puede utilizar de manera segura en la administración sistémica. Dependiendo de la vía particular de administración, se puede utilizar una diversidad de vehículos, bien conocidos en la técnica. Estos vehículos pueden seleccionarse de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas con fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y sales, tales como sales de ácidos minerales, incluidos hidrocloruros, bromuros y sulfatos, ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos y malonatos, y agua apirógena.

Una útil referencia que describe vehículos, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables es Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991).

Se puede emplear cualquier vía de administración segura para proporcionar a un paciente la composición de la descripción. Por ejemplo, se pueden emplear las vías oral, rectal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intra-articular, intra-muscular, intra-dermal, subcutánea, por inhalación, infraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdermal y similares. La inyección intra-muscular y subcutánea es apropiada, por ejemplo, para la administración de composiciones inmunogénicas, vacunas y vacunas de ADN.

Formas de dosificación incluyen comprimidos, dispersiones, suspensiones, inyecciones, soluciones, jarabes, trociscos, cápsulas, supositorios, aerosoles, parches transdermales y similares. Estas formas de dosificación pueden también incluir la inyección o el implante de dispositivos de liberación controlada, diseñados específicamente para este fin u otras formas de implantes modificados para actuar adicionalmente de esta manera. La liberación controlada del agente terapéutico puede efectuarse revistiendo al mismo, por ejemplo, con polímeros hidrófobos que incluyen resinas acrílicas, ceras, alcoholes alifáticos superiores, ácido poliláctico y poliglicólico y determinados derivados de celulosa, tales como hidroxipropilmeti-celulosa. Además, la liberación controlada se puede efectuar utilizando otras matrices polímeras, liposomas y/o microesferas.

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Las composiciones anteriores se pueden administrar de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea farmacéuticamente eficaz. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debería ser suficiente para influir en una respuesta beneficiosa en un paciente a lo largo de un periodo de tiempo apropiado. La cantidad de agente o agentes a administrar dependerá del sujeto a tratar, incluida la edad, el sexo, el peso y estado general de salud del mismo, factores que dependerán del juicio del médico.

Con el fin de que la presente memoria descriptiva sea comprendida más fácilmente y puesta en práctica, se remite a la persona experta a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos Métodos Trasplante

Ratones fueron trasplantados de acuerdo con un protocolo convencional según se describe en Hill et al., 1997, Blood, 90, 3204-3213, y Hill et al., 1999, J. Clin. Invest., 104, 459-467. El día 0, ratones B6D2F1 recibieron una irradiación corporal total (TBI - siglas en inglés, fuente de 137Cs) en dos dosis separadas por tres horas para minimizar la toxicidad gastrointestinal. 5 x 10^{6} células de la médula ósea y 2 x 10^{6} células T donantes esplénicas purificadas con lana de nilón, procedentes de ratones B6 (alogénicos) o ratones B6D2F1 (singenéicos) se resuspendieron en 0,25 ml de medio L-15 de Leibovitz y se inyectaron por vía intravenosa en los receptores irradiados.

Preparación de cpn 10 recombinante

Células XL-1-Blue de E. coli se transformaron con cpn 10 utilizando el vector de expresión pPL550 y se desarrollaron a 37ºC. Se indujo a las células en desarrollo exponencial que expresaran las proteínas mediante un incremento en la temperatura hasta 42ºC durante 4 h. Las células se sedimentaron, se resuspendieron en 30 ml de TrisHCl 0,025 M pH 8,0 y se almacenaron a -30ºC.

Se descongeló un sedimento de células procedente de un cultivo de 1 L, las células se Usaron con lisozima (100 \mug/ml; 15 min a 37ºC), seguido de tratamiento mediante ultrasonidos (5 x 10 s, 4ºC) y el desecho celular se separó mediante centrifugación (30 min, 4ºC, 48 384 x g).

La cpn 10 se purificó del lisado clarificado mediante intercambio de iones y cromatografía de interacción hidrofóbica. La proteína se identificó en fracciones de la columna como una banda de \sim 10 kDa utilizando SDS-PAGE en geles de Tris-tricina al 10-20% (100 x 100 x 1 mm, Novex).

El lisado se aplicó a una columna de 200 ml de Macroprep HighQ (BIO-RAD) utilizando TrisHCl 0,025 M pH 8,0 como tampón de corrida a un caudal de 8 ml/min. La fracción no ligada se retuvo y el pH se ajustó a 6,8. La muestra se aplicó a un cartucho EconoPac S de 5 ml (BIO-RAD) utilizando tampón fosfato de sodio 0,025 M pH 6,8 como tampón de corrida a un caudal de 2 ml/min. La columna se eluyó con un gradiente de NaCl 0 \rightarrow 1 M en tampón fosfato de sodio 0,025 M pH 6,8, aplicado a lo largo de 30 min a razón de 2 ml/min.

Las fracciones con contenido en cpn 10 se agruparon y se añadió un volumen igual de (NH_{4})_{2}SO_{4} 3 M en tampón fosfato de sodio 0,05 M, pH 6,8. La muestra se aplicó a un cartucho de intercambio iónico de alta capacidad HIC EconoPac Methyl de 5 ml utilizando (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,5 M en tampón fosfato de sodio 0,05 M, pH 6,8 como tampón de corrida a un caudal de 2 ml/min. La columna se eluyó con un gradiente de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,5 \rightarrow 0 M en tampón fosfato de sodio 0,05 M, pH 6,8 aplicado a lo largo de 15 min a razón de 2 ml/min.

Las fracciones que contenían cpn 10 se agruparon, dializaron frente a solución salina durante una noche, se dispensaron en partes alícuotas apropiadas y se almacenaron a -30ºC.

Tratamiento con cpn 10

Cpn 10 humana recombinante se diluyó en PBS antes de la inyección. A ratones se les inyectó por vía subcutánea cpn 10 cada día (10 \mug/dosis ó 100 \mug/dosis) antes o después del BMT, según se describe. Ratones procedentes de los grupos control recibieron solamente inyección de diluyente.

Evaluación de la GVHD

El grado de GVHD sistémica se evaluó mediante supervivencia y mediante un sistema de puntuación que suma los cambios en cinco parámetros clínicos: pérdida de peso, postura (joroba), actividad, textura del pelaje e integridad de la piel (Indice máximo = 10) (Cooke et al., 1996, Blood, 88, 3230-3239; Hill et al., 1999, J. Clin. Invest., 104 459-467). A ratones individuales se les etiquetó la oreja y se les clasificó semanalmente de 0 a 2 para cada criterio. Animales con una GVHD clínica grave (puntuaciones > 6) fueron sacrificados de acuerdo con las directrices éticas, y se consideró el día de la muerte como el día siguiente.

Análisis estadístico

Se representaron curvas de supervivencia utilizando las estimaciones de Kaplan-Meier y se compararon mediante análisis de log-rango. Se utilizó el test de Mann Whitney-U para el análisis estadístico de las puntuaciones clínicas. P < 0,05 fue considerado estadísticamente diferente.

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Ejemplo 1 Experimentos con macrófagos de ratón in vitro

Se llevaron a cabo experimentos in vitro para determinar el efecto de cpn 10 en una población de células fisiológicas.

Ratones

Ratones C57BL/6 hembras (B6, H-2^{b}, Ly-5.2^{+}), B6 Ptprc^{a} Ly-5^{a} (H-2^{b}, Ly-5.1^{+}) y B6D2F1 (H-2^{b/d}, Ly-5.2^{+}) se adquirieron del Australian Research Centre (Perth, Australia del Oeste, Australia). Ratones C57BL/6 IL-10^{-/-} (B6, H-2^{b}, Ly-5.2^{+}) fueron suministrados por la Universidad Nacional de Australia (Canberra, Australia). La edad de los ratones utilizados como receptores del trasplante oscilaba entre 8 y 14 semanas. Los ratones se alojaron en jaulas micro-aislantes esterilizadas y recibieron agua en autoclave acidificada (pH 2,5) y pienso normal durante las dos primeras semanas post-trasplante.

Trasplante de la médula ósea

Se realizó un trasplante a ratones de acuerdo con un protocolo convencional (Hill et al., 1997, véase antes). En síntesis, el día 1, ratones B6D2F1 recibieron una radiación corporal total de 1300 cGy (fuente de ^{137}Cs a razón de 108 cGy/min), dividida en dos dosis separadas por 3 horas para minimizar la toxicidad gastrointestinal. Células de la médula ósea del donante (5 x 10^{6} por animal) y células T esplénicas (3 x 10^{6} por animal) se resuspendieron en 0,25 ml de medio L-15 de Leibovitiz (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y se inyectaron por vía intravenosa en los receptores. La supervivencia se vigiló diariamente y las puntuaciones clínicas de la GVHD se midieron semanalmente. Cpn 10 o diluyente control se inyectó por vía subcutánea a dosis de 100 \mug por animal. El grado de GVHD sistémica se evaluó según se describe antes.

Cultivos de células

Los medios de cultivo utilizados a lo largo del experimento eran FCS al 10%/IMDM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con 50 unidades/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, \beta-mercaptoetanol 0,02 mM y HEPES 10 mM. Los experimentos se realizaron a pH 7,75 y a 37ºC en una incubadora humidificada, suplementada con 5% de CO_{2}.

Para los experimentos de estimulación de LPS in vitro, macrófagos o esplenocitos peritoneales se estimularon con concentraciones clasificadas de LPS, TNF\alpha e IL-10 determinadas en sobrenadantes de cultivo a las 5 horas y 48 horas, respectivamente. Para los experimentos de alo-antígenos in vitro, células T C57BL/6 purificadas se cultivaron en placas de 96 pocillos (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) con 10^{5} macrófagos peritoneales B6D2F1 irradiados (2000 cGy) (MLC primario) y los sobrenadantes se recolectaron a las 72 horas. Después, los cultivos se pulsaron con ^{3}H-timidina (1 \muCi por pocillo) y la proliferación se determinó 16 h más tarde en un lector 1205 Betaplate (Wallac, Turku, Finlandia). Para la estimulación de mitógenos in vitro células T C57BL/6 purificadas se cultivaron en placas de 96 pocillos de fondo plano, pre-revestidas con CD3 y CD28 monoclonales a unas concentraciones finales de 10 \mug/ml. Los sobrenadantes se recolectaron a las 48 horas y se pulsaron con ^{3}H-timidina (1 \muCi por pocillo). La proliferación se determinó 16 h más tarde.

ELISAs de citoquinas

Los anticuerpos utilizados en los ensayos de IFN\gamma, IL-10, IL-4 y TNF\alpha se adquirieron de PharMingen (San Diego, CA) y los ensayos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. En síntesis, se diluyeron muestras a razón de 1:3 a 1:24 y las citoquinas se capturaron mediante anticuerpo monoclonal (mAb) primario especifico y se detectaron mediante mAbs secundarios marcados con biotina. Los ensayos marcados con biotina se desarrollaron con estreptavidina y sustrato (Kirkegaard y Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Las placas se leyeron a 450 nm utilizando el lector de microplacas Spectraflour Plus (Tecan, Durham, NC). Se utilizaron citoquinas recombinantes (PharMingen) como patrones para los ensayos ELISA. Las muestras y los patrones se desarrollaron por duplicado, y la sensibilidad de los ensayos era 0,063 U/ml para IFN\gamma y 15 pg/ml para IL-10, IL-4 y TNF\alpha.

Resultados

La administración in vivo de cpn 10 redujo la capacidad de macrófagos peritoneales de producir TNF\alpha (Fig. 2A). Ratones B6 (n=3) fueron tratados durante 5 días con cpn 10 (100 \mug, una vez al día) (cpn 10+) o diluyente control (cpn 10-). Los macrófagos peritoneales se recolectaron mediante lavado peritoneal el día 6 y se agruparon en el grupo de tratamiento a partir de animales individuales. Las células se extendieron en placas a razón de 2 x 10^{5}/pocillo en ausencia (no mostrada) o presencia de LPS (1 \mug/ml). Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron a las 5 horas y los niveles de TNF\alpha (pg/ml) se evaluaron mediante ELISA. Los resultados se normalizan a la producción por cada 10^{5} macrófagos, basado en la tinción con CD11b. La Fig 2A muestra datos de dos experimentos idénticos. La secreción inducida por LPS de TNF\alpha se redujo en un 40% a partir de estas células.

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El tratamiento in vivo con cpn 10 aumentó la producción de IL-10 a partir de esplenocitos (Fig. 2B). Ratones B6 fueron tratados con cpn 10 o diluyente control según se describe antes. Los esplenocitos se recolectaron el día 6 y se agruparon en un grupo de tratamiento a partir de animales individuales antes del cultivo a razón de 5 x 10^{5}/pocillo en ausencia (no mostrada) o presencia de LPS (10 \mug/ml). Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron a las 48 horas y los niveles de IL-10 (pg/ml) se determinaron mediante ELISA. Los datos procedentes de dos experimentos idénticos se muestran en la Fig. 2B. En comparación con animales control se observó una producción significativamente incrementada de IL-10.

El tratamiento in vivo con cpn 10 indujo la producción de TNF\alpha a partir de macrófagos peritoneales IL10^{-/-} (Fig. 2C). Ratones B6 IL10^{-/-} fueron tratados con cpn 10 o diluyente control y los macrófagos peritoneales se recolectaron mediante lavado peritoneal el día 6 y se agruparon en el grupo de tratamiento a partir de animales individuales. Después de 5 horas de cultivo en ausencia (LPS 0) o presencia LPS (0,1, 1 y 10 \mug/ml) se determinó la cantidad de TNF\alpha en los sobrenadantes del cultivo. La reducción en la producción de TNF\alpha inducida por LPS, mediada por cpn 10 (Fig. 2A), no requiere IL-10, dado que se observaron reducciones similares en la secreción de TNF\alpha cuando macrófagos peritoneales procedentes de ratones IL-10^{-/-} tratados con cpn 10 fueron estimulados con LPS in vitro. Así, la secreción reducida de TNF\alpha y la producción incrementada de IL-10 parecen ser consecuencias independientes del tratamiento con cpn 10.

El tratamiento con cpn 10 no parecía afectar a la secreción de IFN\gamma o IL-4 de células T. Informes previos han sugerido que cpn 10 puede inhibir la proliferación de células T en respuesta a mitógenos (Morton H. 1998 Immunol. Cell Biol., 76, 483-496). Respuestas inmunes de Th1 se caracterizan, habitualmente, por citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF\alpha e IFN\gamma. Las respuestas de Th2 implican una secreción de IL-4 e IL-10, y las respuestas de células T reguladores (Treg) se caracterizan por una producción de IL-10 y TGF\beta. Dado que las respuestas de Th2 y Treg suprimen la proliferación y las respuestas de Th1 suprimen la producción de citoquinas, se investigó la capacidad de cpn 10 de influir en la diferenciación de células T.

La administración in vivo de cpn 10 no afectó a la respuesta proliferativa de linfocitos T a aloantígenos (Fig. 2D). Ratones B6 (n=3) fueron tratados con inyecciones diarias de cpn 10 o diluyente control. Las poblaciones de células T derivadas de esplenocitos fueron estimuladas in vitro con esplenocitos alogénicos durante 7 días en un cultivo mixto de linfocitos (MLC - siglas en inglés). Células T purificadas (0,5 x 10^{5}, 1 x 10^{5} y 2 x 10^{5}/pocillo) fueron estimuladas con macrófagos peritoneales B6D2F1 alogénicos irradiados (0,5 x 10^{5}/pocillo) y la proliferación se midió a las 72 horas a través del ensayo de incorporación de ^{3}[H]-timidina estándar. Los valores registrados en la Fig. 2D representan la media \pm SE (error típico) de pocillos por triplicado. La proliferación de células T dentro de estos CMLs no difería significativamente entre animales tratados con cpn 10 y control, lo que indica que cpn 10 no es un regulador del crecimiento de células T.

Las Figs 2E-G muestran los efectos de la administración in vivo de cpn 10 sobre la diferenciación de células T. Animales B6 fueron tratados in vivo con cpn 10 según se describe antes. Células T (2 x 10^{6}/pocillo) procedentes de animales tratados con cpn 10 y tratados con vehículo se estimularon en el cultivo durante 7 días con esplenocitos B6D2F1 alogénicos irradiados (3 x 10^{6}/pocillo) (cultivo mixto de linfocitos primarios). El día 7 se recogieron células T y se re-estimularon con anticuerpos unidos a la placa contra CD3 y CD28 que estimulan células T. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron a las 24 horas y se determinaron mediante ELISA las concentraciones de IFN\gamma, IL-4 e IL-10. Los valores de la concentración en las Figs 4E-G representan la media \pm SE por triplicado.

Ni la secreción de IL-4 en células T (Fig 2E) ni la secreción de IFN\gamma (Fig. 2F) diferían de manera significativa entre animales tratados con cpn 10 y animales control, sugiriendo que cpn 10 no influye en el equilibrio de Th1/Th2.

En contraposición, la secreción de IL-10 en células T se habla elevado significativamente (Fig. 2G). También se observó una elevación similar en la secreción de IL-10 cuando el tratamiento con cpn 10 se llevó a cabo in vitro durante el cultivo de células (MLC) más que in vivo, y la proliferación, IFN\gamma e IL-4 no se vieron de nuevo afectadas (datos no mostrados). Estos datos indican que cpn 10 puede reforzar la producción de IL-10 en respuesta a la estimulación con LPS y aloantígeno, y sugiere que la producción de IL-10 reforzada por cpn 10 puede ser debida, en parte, a IL-10 derivada de células T.

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Ejemplo 2 Efecto del tratamiento pre- y post-trasplante con cpn 10 en el modelo de GVDH in vivo

Se llevaron a cabo experimentos in vivo para investigar si la administración de cpn 10 en el periodo pre-trasplante podía prevenir la GVHD.

Administración post-tratamiento de cpn10

Células de la médula ósea (5 x 10^{6}/animal) y células T purificadas (descritas anteriormente) procedentes de ratones B6 donantes fueron trasplantadas en ratones receptores B6D2F1 (grupos alogeneicos) letalmente irradiados (1100 cGy). Los receptores B6D2F1 en el grupo control singeneico recibieron dosis iguales de médula ósea de B6D2F1 y células T. En el periodo post-trasplante (días 0 a 21) se inyectó a los animales, por vía subcutánea, vehículo (grupo singenéico, n = 8 y grupo control alogenéico, n = 10) o cpn10 (10 y 100 \mug/animal/día: cpn10 10 \mug/día alogenéico, n = 10 y cpn10 100 \mug/día alogenéico n = 10). Se determinaron las puntuaciones clínicas de la GVHD (según se describe antes) como una medida de la gravedad de la GVHD en los animales supervivientes. Se observó una GVHD clínicamente más leve los días 14 y 21 en animales alogenéicos a los que se inyectaron 100 \mug/día de cpn10, en comparación con los control alogenéicos tratados con vehículo (**p < 0,01). No hubo diferencia significativa alguna en el porcentaje de supervivencia entre grupos alogenéicos inyectados con vehículo e inyectados con cpn10. La Fig. 3 muestra las curvas de supervivencia de ratones mediante análisis de Kaplan-Meier.

La administración de cpn10 después del trasplante de médula ósea (BMT) fracasó en prevenir la mortalidad por GVHD y solamente redujo brevemente la morbidez según se determina mediante puntuaciones clínicas de la GVHD (Fig. 3B). Se observó una GVHD clínicamente más leve el día 14 y el día 21 en animales alogenéicos a los que se inyectaron 100 \mug/día de cpn10 en comparación con el control alogenéico tratado con vehículo (**p < 0,01).

Administración pre-tratamiento de cpn10

Ratones B6D2F1 receptores y B6 donantes fueron tratados durante 5 días pre-trasplante con cpn10 (100 \mug/día/vía subcutánea) o diluyente control. Células de la médula ósea (5 x 106/animal) y células T (3 x 10^{6}/animal) recolectadas el día 6 de ratones donantes B6 fueron trasplantadas en receptores B6D2F1 letalmente irradiados. Se formaron cinco grupos de receptores:

Grupo 1: control singenéico (n=8) representaba a B6D2F1 trasplantados con células de la médula ósea de B6D2F1 singenéicas y células T.

Grupo 2: el control alogenéico (n= 10) consistía en receptores B6D2F1 pre-tratados con diluyente, a los que se trasplantaron células procedentes de donantes B6 pre-tratados con diluyente.

Grupo 3: ratones pre-tratados con receptores alogenéicos (n =10) y ratones B6D2F1 receptores fueron tratados pre-trasplante con cpn10 y se les trasplantaron células donantes B6 pre-tratadas con vehículo.

Grupo 4: ratones B6D2F1 receptores pre-tratados con diluyente solamente que recibieron el trasplante de donantes B6 pre-tratados con cpn10 (donante alogénico pre-tratado n = 10).

Grupo 5: tanto ratones receptores B6D2F1 como ratones donantes B6 fueron pre-tratados con cpn10 antes del trasplante (receptor alogenéico y pre-tratado con donante, n= 10).

Las puntuaciones clínicas de la GVHD según se describe antes se determinaron como una medida de la gravedad de la GVHD en los animales supervivientes.

Se observaron puntuaciones clínicas significativamente menores el día 7 en el grupo 5 (tanto receptores como donantes pre-tratados con cpn10 antes del trasplante), en comparación con el grupo control alogenéico (Fig 4B; ***p< 0,001). La Fig.4 muestra las curvas de supervivencia de ratones mediante análisis de Kaplan-Meier.

La administración de cpn10 a donantes y receptores del trasplante durante 5 días antes del trasplante retardó significativamente la mortalidad por GVHD (*P < 0,01 frente al control alogenéico). Además, la gravedad de la GVHD, según se determina por la puntuación clínica, también se redujo en una fase temprana después de la BMT. La capacidad de cpn10 por demorar la mortalidad de GVHD cuando se administraba antes a BMT es consistente con el efecto anti-inflamatorio descrito en esta memoria, es decir una limitación de la producción de TNF\alpha (Hill et al., 1998, J. Clin. Invest., 102, 115-123; Hill et al., 1997, véase antes). El fracaso de la administración de cpn10 después de BMT para prevenir el desarrollo de la GVHD es consistente con una ausencia del efecto sobre la activación de células T y diferenciación a las dosis y la planificación utilizada en este Ejemplo, según se caracterizó en la Fig. 3.

El acondicionamiento del trasplante (irradiación letal) en estos modelos establece un proceso de la lesión del tracto gastrointestinal (GI) progresiva, una fuga de LPS y una generación de citoquinas inflamatorias que, a su vez, induce una lesión adicional del tracto GI y, de esta forma, el proceso continúa en forma de un bucle de retroalimentación positivo. El proceso se puede interrumpir mediante agentes farmacológicos que protegen al intestino de una lesión por radiación (tal como IL-11 y el factor de crecimiento de queratinocitos; Krijanovski et al., 1999, Blood, 94, 825-831), dirigen antagonistas de LPS (Cooke et al., 2001, J. Clin. Invest., 107, 1581-1589) o inhibidores de TNF\alpha propiamente dichos (Hill et al., 1997, véase antes). Sin embargo, estos agentes tienden a demorar más que a prevenir la GVHD, a menos que se neutralice por completo TNF\alpha o que existan efectos adicionales sobre la activación y diferenciación de células T. Así, la demora en la mortalidad por GVHD mediante la administración de cpn10 es consistente con una limitación de la señalización de LPS y de la subsiguiente producción de TNF\alpha en una fase temprana después de BMT, pero también un fracaso de impactar sobre la función de células T alorreactiva subsiguiente.

Por lo tanto, cpn10 tiene el potencial de convertirse en un importante fármaco terapéutico en el tratamiento de la GVHD. La eficacia incrementada en el tratamiento de la GVHD observada cuando se administra cpn10 tanto a donantes como a receptores antes del proceso de trasplante es consistente con el hecho de que TNF\alpha procede de fuentes tanto de tejido como de órganos en el periodo de post-trasplante (Cooke et al., 2000, J. Immunol., 165, 6612-6619; Speiser et al., 1997, J. Immunol. 158, 5185-5190).

Además, cpn10 puede ser útil en el tratamiento de la GVHD en combinación con agentes inmunosupresores tradicionales que limitan la respuesta inmune adaptiva secundaria.

A lo largo de la memoria descriptiva, el objetivo ha sido describir las realizaciones preferidas, sin limitar la memoria descriptiva a una realización cualquiera o colección especifica de características. Por lo tanto, se apreciará por parte de los expertos en la técnica que, a la vista de la presente descripción, se pueden realizar diversas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas, sin apartarse del alcance de la memoria descriptiva.

Claims (4)

1. Una composición farmacéutica que comprende: una cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina 10 con la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, que comprende, además, al menos otro agente inmunosupresor.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en la que el otro agente inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetilo y metotrexato.

4. Un polipéptido aislado que contiene la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1.