ES2343843T3 - Procedimiento para examinar la sensibilidad de celulas cancerosas a un agente anticanceroso. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de ensayo para predecir la sensibilidad de una célula cancerosa a un compuesto representado por la siguiente fórmula I, que comprende usar un índice cualquiera de: 1) se reduce la expresión de pRB; 2) se expresa p16; 3) se potencia la expresión de la ciclina E; 4) se reduce la expresión de pRB y se potencia la expresión de la ciclina E; o 5) se expresa p16 y se potencia la expresión de la ciclina E: Fórmula (I) **(Ver fórmula)** (en la que, R1 representa (1) un átomo de hidrógeno o (2) un grupo hidroxilo; R3 representa (1) un átomo de hidrógeno, (2) un grupo hidroxilo o (3) un grupo alcoxi C1-6; y R2 representa (1) un átomo de hidrógeno, (2) un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, (3) un grupo aralquilo C7-10 que puede tener un sustituyente, (4) un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, (5) la fórmula (II): **(Ver fórmula)** (en la que, A) n representa un número entero de 0 a 4; X representa i) -CHRN4-, ii) -NRN5- o iii) -O-; RN1 y RN2 son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa i) un átomo de hidrógeno o ii) un grupo alquilo C1-6; RN3 y RN4 son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa i) un átomo de hidrógeno, ii) un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, iii) un grupo alquilo C2-10 insaturado que puede tener un sustituyente, iv) un grupo alcoxi C1-6 que puede tener un sustituyente, v) un grupo arilo C6-14 que puede tener un sustituyente, vi) un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, vii) un grupo aralquilo C7-10 que puede tener un sustituyente, viii) un grupo cicloalquilo C3-8 que puede tener un sustituyente, ix) un grupo cicloalquilalquilo C4-9 que puede tener un sustituyente, x) un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, xi) un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, xii) -NRN6RN7 (en la que RN6 y RN7 son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-6) o xiii) RN3 y RN4 se unen junto con el átomo e carbono al que están unidos para formar un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente (el grupo heterocíclico no aromático puede tener un sustituyente); RN5 representa i) un átomo de hidrógeno, ii) un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, iii) un grupo alquilo C2-10 insaturado que puede tener un sustituyente, iv) un grupo arilo C6-14 que puede tener un sustituyente, v) un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, vi) un grupo aralquilo C7-10 que puede tener un sustituyente, vii) un grupo cicloalquilo C3-8 que puede tener un sustituyente, viii) un grupo cicloalquilalquilo C4-9 que puede tener un sustituyente, ix) un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, x) un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, o xi) RN3 y RN5 se unen conjuntamente con el átomo de nitrógeno al que están unidos para formar un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente (el grupo heterocíclico no aromático puede tener un sustituyente), B) X, n, RN3, RN4 y RN5 representan los grupos definidos anteriormente; y RN1 y RN2 representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que RN1 y RN2 están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente, C) X, n, RN2, RN4 y RN5 representan los grupos definidos anteriormente, y RN1 y RN3 representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que RN1 y RN3 están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente, o D) X, n, RN1, RN4 y RN5 representan los grupos definidos anteriormente; y RN2 y RN3 representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que RN2 y RN3 están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente), o (6) la fórmula (III): **(Ver fórmula)** (en la que, RN8 y RN9 son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa i) un átomo de hidrógeno, ii) un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, iii) un grupo arilo C6-14 que puede tener un sustituyente, iv) un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente v) un grupo aralquilo C7-10 que puede tener un sustituyente, o vi) un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente)).
Description
Procedimiento para examinar la sensibilidad de
células cancerosas a un agente anticanceroso.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de ensayo para predecir la sensibilidad de una célula
cancerosa a un compuesto útil como fármaco anticanceroso
representado por la fórmula (I) (que se denomina en lo sucesivo
presente compuesto).
\vskip1.000000\baselineskip
La quimioterapia del cáncer se ha realizado
convencionalmente con fármacos anticancerosos, que han resultado
ser eficaces sobre cada tipo de cáncer de órgano, solos o en
combinación con otros fármacos. Además, en tipos de cánceres
específicos, se han establecido terapias convencionales por medio de
ensayos aleatorios controlados a gran escala que se han hecho
populares en los últimos años. Sin embargo, estas terapias han
conseguido porcentajes de respuesta, en general, sólo del
20-50%. Aunque más de la mitad de los pacientes no
pueden tener efectos terapéuticos, en la presente situación se usa
quimioterapia asociada con el riesgo de reacciones adversas (JACR
Monograph Nº 7, 10-19, 2002).
Con la intención de clasificar a los pacientes
dependiendo de la eficacia de los fármacos anticancerosos,
convencionalmente se han intentado procedimientos de "ensayos de
sensibilidad a fármacos". Los ensayos para determinar la
sensibilidad a fármacos anticancerosos incluyen el ensayo SDI (Jpn J
Cancer Res. 85: 762-765, 1994),
CD-DST (Jpn J Cancer Res. 92:
203-210, 2001), HDRA (Clin Cancer Res. 1:
305-311, 1995) o similares, y todos estos
procedimientos tienen procedimientos comunes en los que se recoge
una muestra de célula cancerosa y se expone a un fármaco
anticanceroso para evaluar la sensibilidad al fármaco anticanceroso.
Sin embargo, estos procedimientos tienen los problemas de que las
células cancerosas deben mantenerse vivas en un tubo de ensayo, los
resultados de ensayo y los efectos clínicos no necesariamente
concuerdan, o similares, y por lo tanto su velocidad de ejecución
se mantiene aproximadamente en un 0,5% (summary math of
questionnaire by Japan Research Society for Appropriate Cancer
Chemotherapy, 1996).
En relación con fármacos de dirección molecular
que se dirigen a moléculas específicas de las células cancerosas,
se ha presentado un caso en el que la sensibilidad a un fármaco se
predice satisfactoriamente por medio de un diagnóstico molecular
tal como el ensayo de Herceptina (Clin Cancer Res. 7:
1669-1675, 2001). Sin embargo, en relación con
otros fármacos, no puede predecirse la sensibilidad por una sola
molécula diana, lo que sugiere que con frecuencia la sensibilidad
se especifica por una pluralidad de moléculas (Nat Genet. 24:
236-244, 2000). La tecnología de micromatriz de
ADNc desarrollada recientemente permitió el análisis de expresión de
genes en una cantidad extremadamente grande y, por lo tanto, un
análisis exhaustivo de factores que especifican la sensibilidad.
Por ejemplo, los efectos terapéuticos de Gleevec, un fármaco para
tratar la leucemia mielógena crónica, pueden predecirse mediante el
análisis de expresión de los 15 a 30 agrupamientos génicos que se
han propuesto por el resultado del análisis de micromatriz de ADNc
(Jpn J Cancer Res. 93: 849-56, 2002).
El desarrollo futuro de un fármaco anticanceroso
usado en la quimioterapia para el cáncer debe tener como objetivo
proporcionar una combinación con un procedimiento de diagnóstico
para evaluar la sensibilidad al fármaco antes del tratamiento, y
por lo tanto es importante encontrar una molécula para el
diagnóstico molecular que permita predecir la sensibilidad al
fármaco que se va a desarrollar.
En el Journal of Antibiotics, Japan Antibiotics
Research Association, Tokio JP, vol. 47, 1994,
1395-1401, se han presentado actividades citocidas
del macrólido FD-895, que es un derivado del
presente compuesto, contra diversas líneas de células cancerosas
cultivadas.
El presente inventor descubrió, en los
documentos WO 02/060890, WO 03/099813 y WO 04/011661, que el
presente compuesto expresaba una actividad antitumoral
extremadamente potente contra la línea de células cancerosas de
mama humana (BSY-1), y también contra la línea de
células cancerosas de colon humano (WiDr).
Por otra parte, se descubrió que el presente
compuesto era menos eficaz para la línea celular de cáncer
microcítico de pulmón (Calu-1) en comparación con
las cepas de células cancerosas anteriores, lo que demuestra que la
actividad antitumoral del presente compuesto dependía de las células
cancerosas.
Si se demuestra que ciertas moléculas están
asociadas con la sensibilidad de las células cancerosas al presente
compuesto, y pueden examinarse células cancerosas extraídas de un
paciente con cáncer por biopsia o similar con respecto a la
expresión de estas moléculas, entonces el presente compuesto puede
administrarse selectivamente sólo a los pacientes con cáncer que es
de esperar que se beneficien de la actividad antitumoral del
presente compuesto y por lo tanto es de esperar que el efecto
terapéutico mejorado reduzca efectos adversos innecesarios.
En la investigación de las características
moleculares de la cepa BSY-1 que tiene una alta
sensibilidad al presente compuesto, los presentes inventores se
centraron en moléculas que controlan la transición G1/S en el ciclo
celular que se ha propuesto que está alterada en cánceres de mama y
de pulmón. Se examinaron cuatro moléculas, incluyendo p16 y pRB que
son genes supresores de tumores, y la ciclina D1 y la ciclina E que
compiten con ellos o los controlan negativamente, con respecto a
sus niveles respectivos de expresión de proteína. Como resultado,
BSY-1 mostró las características moleculares de una
expresión reducida de pRB, la expresión positiva de p16 y un alto
nivel de expresión de la ciclina E.
Se examinaron 25 líneas de células cancerosas
humanas incluyendo BSY-1, WiDr y
Calu-1 para clarificar sus respectivas
características con respecto a la expresión reducida o la mutación
de pRB (denominado en lo sucesivo bajo nivel de expresión de pRB),
la expresión positiva de p16 o un alto nivel de expresión de la
ciclina E. Mientras tanto, se usaron ratones en los que se
implantaron estas células cancerosas para medir la actividad
antitumoral del presente compuesto sobre ellas. Muchas de las líneas
de células cancerosas humanas que tenían al menos una de estas
características presentaron alta sensibilidad al presente compuesto,
mientras que la mayoría de las líneas de células cancerosas que
carecían de estas características eran menos sensibles.
A ratones en los que se implantaron siete cepas
con características de bajo nivel de expresión de pRB y alto nivel
de expresión de ciclina E y a ratones en los que se implantaron seis
cepas con características de expresión positiva de p16 y alto nivel
de expresión de ciclina E se les administró el presente compuesto.
Como resultado, cuatro de estas cepas mostraron una eliminación
especialmente completa de tumores, y una cepa mostró una reducción
sostenida a largo plazo de tumores, aunque no una eliminación
completa.
Se ha descubierto que en una célula cancerosa
pueden examinarse sus características con respecto al bajo nivel de
expresión de pRB, la expresión positiva de p16 o un alto nivel de
expresión de ciclina E para predecir la sensibilidad de la célula
cancerosa al presente compuesto. El descubrimiento completó la
presente invención.
Concretamente, la presente invención se refiere
a los siguientes.
1. Un procedimiento de ensayo para predecir la
sensibilidad de una célula cancerosa a un compuesto representado
por la siguiente fórmula I, que comprende usar un índice cualquiera
de:
1) se reduce la expresión de pRB;
2) se expresa p16;
3) se potencia la expresión de la ciclina E;
4) se reduce la expresión de pRB y se potencia
la expresión de la ciclina E; o
5) se expresa p16 y se potencia la expresión de
la ciclina E: Fórmula (I)
(en la que, R^{1} representa
- (1)
- un átomo de hidrógeno o
- (2)
- un grupo hidroxilo;
R^{3} representa
- (1)
- un átomo de hidrógeno,
- (2)
- un grupo hidroxilo o
- (3)
- un grupo alcoxi C_{1-6}; y
R^{2} representa
- (1)
- un átomo de hidrógeno,
- (2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- (3)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- (4)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- (5)
- la fórmula (II):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- (en la que,
- \quad
- A)
- n representa un número entero de 0 a 4;
- X representa
- i)
- -CHR^{N4}-,
- ii)
- -NR^{N5}- o
- iii)
- -O-;
- R^{N1} y R^{N2} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa
- i)
- un átomo de hidrógeno o
- ii)
- un grupo alquilo C_{1-6};
- R^{N3} y R^{N4} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa
- i)
- un átomo de hidrógeno,
- ii)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- iii)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- iv)
- un grupo alcoxi C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- v)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- vi)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- vii)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- viii)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- ix)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- x)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- xi)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- xii)
- -NR^{N6}R^{N7} (en la que R^{N6} y R^{N7} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}) o
- xiii)
- R^{N3} y R^{N4} se unen junto con el átomo e carbono al que están unidos para formar un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente (el grupo heterocíclico no aromático puede tener un sustituyente);
- R^{N5} representa
- i)
- un átomo de hidrógeno,
- ii)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- iii)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- iv)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- v)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- vi)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- vii)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- viii)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- ix)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- x)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, o
- xi)
- R^{N3} y R^{N5} se unen conjuntamente con el átomo de nitrógeno al que están unidos para formar un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente (el grupo heterocíclico no aromático puede tener un sustituyente),
- \quad
- B)
- X, n, R^{N3}, R^{N4} y R^{N5} representan los grupos definidos anteriormente; y R^{N1} y R^{N2} representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que R^{N1} y R^{N2} están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente,
- \quad
- C)
- X, n, R^{N2}, R^{N4} y R^{N5} representan los grupos definidos anteriormente, y R^{N1} y R^{N3} representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que R^{N1} y R^{N3} están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente, o
- \quad
- D)
- X, n, R^{N1}, R^{N4} y R^{N5} representan los grupos definidos anteriormente; y R^{N2} y R^{N3} representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que R^{N2} y R^{N3} están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente), o
\newpage
- (6)
- la fórmula (III):
\vskip1.000000\baselineskip
- (en la que, R^{N8} y R^{N9} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa
- i)
- un átomo de hidrógeno,
- ii)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- iii)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- iv)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente
- v)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente, o
- vi)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente)).
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que R^{2} es
1) un átomo de hidrógeno;
2) un grupo alquilo C_{1-6}
que puede tener un sustituyente,
3) un grupo aralquilo C_{7-10}
que puede tener un sustituyente o
4) un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14
miembros que puede tener un sustituyente.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (IV):
Fórmula
(IV)
\vskip1.000000\baselineskip
(en la que n representa un número
entero de 0 a
4;
R^{aN1} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6}; y
R^{aN3} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno
- 2)
- un grupo N-alquilamino C_{1-6},
- 3)
- un grupo N,N-di-alquilamino C_{1-6},
- 4)
- un grupo etilmetilamino,
- 5)
- un grupo piridilo,
- 6)
- un grupo pirrolidin-1-ilo,
- 7)
- un grupo piperidin-1-ilo,
- 8)
- un grupo morfolin-4-ilo o
- 9)
- un grupo 4-metilpiperazin-1-ilo).
\vskip1.000000\baselineskip
4. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (V):
Fórmula
(V)
(en la que n_{1} y n_{2} son
iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un número entero
de 0 a
4;
X_{b} representa
- 1)
- -CHR^{bN4}-,
- 2)
- -NR^{bN5}- o
- 3)
- -O-;
R^{bN1} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6};
R^{bN8} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6},
- 3)
- un grupo arilo C_{6-14} o
- 4)
- un grupo aralquilo C_{7-10};
R^{bN4} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo alcoxi C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 6)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 9)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- 10)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 11)
- NR^{bN6}R^{bN7} (en la que R^{bN6} y R^{bN7} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}) o
- 12)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente; y
R^{bN5} es
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente
- 6)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- 9)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente o
- 10)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente).
\vskip1.000000\baselineskip
5. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (VI):
Fórmula
(VI)
(en la que n_{3} representa el
número entero 1 ó
2;
R^{cN1} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6}; y
R^{cN5} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6}).
\vskip1.000000\baselineskip
6. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (VII):
Fórmula
(VII)
(en la que n_{1} y n_{2} son
iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un número entero
de 0 a
4;
X_{d} representa
- 1)
- -CHR^{dN4}-,
- 2)
- -NR^{dN5}- o
- 3)
- -O-; y
R^{dN2} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6};
R^{aN8} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6},
- 3)
- un grupo arilo C_{6-14} o
- 4)
- un grupo aralquilo C_{7-10};
R^{dN4} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo alcoxi C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 6)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 9)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- 10)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 11)
- -NR^{dN6}R^{dN7} (en el que R^{dN6} y R^{dN7} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}) o
- 12)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente; y
R^{dN5} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo heteroarilo de anillo de 5 a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 6)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- 9)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente o
- 10)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente).
\vskip1.000000\baselineskip
7. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (VIII):
Fórmula
(VIII)
(en la que n_{3} representa un
número entero de 1 a 3;
y
R^{eN4} representa
- 1)
- un grupo amino,
- 2)
- un grupo N-alquilamino C_{1-6},
- 3)
- un grupo pirrolidin-1-ilo,
- 4)
- un grupo piperidin-1-ilo o
- 5)
- un grupo morfolin-4-ilo).
\vskip1.000000\baselineskip
8. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (IX):
Fórmula
(IX)
(en la que n_{3} representa un
número entero de 1 a
3;
R^{fN8} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6},
- 3)
- un grupo arilo C_{6-14} o
- 4)
- un grupo aralquilo C_{7-10}; y
R^{fN5} es
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo heterocíclico no aromático de 3 miembros a 8 miembros que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 6)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente o
- 9)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente).
\vskip1.000000\baselineskip
9. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (X):
Fórmula
(X)
(en la que n_{3} representa un
número entero de 1 a 3;
y
R^{gN5} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede estar sustituido,
- 3)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede estar sustituido,
- 4)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede estar sustituido,
- 5)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede estar sustituido,
- 6)
- un grupo piridilo que puede estar sustituido o
- 7)
- un grupo tetrahidropiranilo que puede estar sustituido).
\vskip1.000000\baselineskip
10. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, en el que el compuesto representado por la fórmula (I)
es un compuesto cualquiera seleccionado entre el grupo constituido
por los siguientes compuestos:
1)
(8E,12E,14E)-7-acetoxi-3,6,21-trihidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-oli-
da,
da,
2)
(8E,12E,14E)-7-((4-cicloheptilpiperazin-1-il)-carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,
19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida,
19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida,
3)
(8E,12E,14E)-3,6,16,21-tetrahidroxi-7-((4-isopropilpiperazin-1-il)carbonil)oxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,
19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida y
19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida y
4)
(8E,12E,14E)-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-7-((4-metilpiperazin-1-il)carbonil)oxi-18,19-
epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida.
epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida.
\vskip1.000000\baselineskip
11. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, que comprende ensayar una expresión reducida de pRB,
una expresión de p16 o una expresión aumentada de ciclina E midiendo
los niveles de sus ARNm codificantes respectivos.
12. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 11, en el que el procedimiento para medir el nivel del
ARNm es un procedimiento de RT-PCR cuantitativo.
13. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 11, en el que el procedimiento para medir el nivel del
ARNm es un procedimiento de punta de ADN.
14. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 1, que comprende ensayar una expresión reducida de pRB,
una expresión de p16 o una expresión aumentada de ciclina E midiendo
los niveles de sus proteínas respectivas.
15. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 14, en el que el procedimiento para medir los niveles de
sus proteínas respectivas es un procedimiento de transferencia de
western.
16. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 14, en el que el procedimiento para medir los niveles de
sus proteínas respectivas es un procedimiento de
inmunohistotinción.
17. El procedimiento de ensayo de acuerdo con el
apartado 14, en el que el procedimiento para medir los niveles de
sus proteínas respectivas es un procedimiento ELISA.
18. Un kit para su uso en el procedimiento de
ensayo de acuerdo con el apartado 12, que comprende un cebador que
contiene al menos 15 secuencias de bases consecutivas de los genes
de pBR, p16 o ciclina E.
19. Un kit para su uso en el procedimiento de
ensayo de acuerdo con el apartado 15, 16 ó 17, que comprende un
anticuerpo contra pRB, p16 o la ciclina E.
Una célula cancerosa puede examinarse para
aclarar sus características con respecto al bajo nivel de expresión
de pRB, la expresión positiva de p16 o el alto nivel de expresión de
la ciclina E, lo cual permite la predicción de la sensibilidad de
la célula cancerosa al presente compuesto, permitiendo la
administración selectiva del presente compuesto sólo a los
pacientes con cáncer que es de esperar que se beneficien de la
actividad antitumoral del presente compuesto. Se esperan un mayor
efecto terapéutico y menos efectos adversos innecesarios.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente descripción, la pRB es una
proteína con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa que se
codifica por una secuencia de bases descrita en el Genbank con el Nº
de Acceso NM000321. El gen RB que codifica pRB se aisló como un gen
supresor de tumores que muta en el retinoblastoma (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84: 9059-9063, 1987) y después su mutación
se ha confirmado en diversas células malignas.
La p16 es una proteína con un peso molecular de
aproximadamente 16 kDa que se codifica por una secuencia de bases
descrita en el Genbank con el Nº de Acceso HM000077. La p16 se une a
CDK4 y CDK6 y reprime la fosforilación por CDK4/6 de pRB, ayudando
de esta manera a que pRB conserve la actividad (Science 264:
436-440, 1994).
La ciclina E es una proteína con un peso
molecular de aproximadamente 52 kDa que se codifica por una
secuencia de bases descrita en el Genbank con el Nº de Acceso
M74093, y su nivel de expresión aumenta temporalmente en la
transición G1/S del ciclo celular para jugar un papel principal para
la progresión del ciclo celular. Sin embargo, se ha notificado que
el cáncer aumenta su nivel absoluto y altera el patrón de su aumento
temporal de la expresión (Int. J Cancer 104:
369-75, 2003).
Además, se ha notificado una correlación inversa
entre p16 y pBR en el nivel de expresión en muchos tipos de cáncer
y, por lo tanto, la expresión positiva de p16 y el bajo nivel de
expresión de pRB se consideran atribuidos al mismo acontecimiento
(EMBO J. 14: 503-511, 1995).
El presente compuesto puede fabricarse por
procedimientos descritos en los documentos WO 02/060890, WO
03/099813 y WO 04/011661. Además, en los documentos WO 02/060890,
WO 03/099813 y WO 04/011661 se describe que el presente compuesto
tiene actividad anticancerosa.
La presente invención es un procedimiento de
ensayo para predecir la sensibilidad de una célula cancerosa al
presente compuesto, que comprende examinar las características de la
célula cancerosa con respecto al bajo nivel de expresión de pRB, la
expresión positiva de p16 o un alto nivel de expresión de la ciclina
E. La célula cancerosa puede ser una célula extraída como una
muestra del tejido canceroso o una célula cultivada in
vitro, y preferentemente es una célula recogida de un tejido
canceroso por biopsia, y más preferentemente el tejido canceroso es
un tejido canceroso recogido por biopsia para el diagnóstico de un
cáncer.
Un paciente con cáncer, cuyas células cancerosas
recogidas se han considerado altamente sensibles al presente
compuesto por el procedimiento de la presente invención, puede
seleccionarse para administrar el presente compuesto esperando que
el paciente se beneficie por la actividad anticancerosa del presente
compuesto. Por consiguiente, se esperan mejores efectos
terapéuticos y menos efectos adversos innecesarios.
En la presente invención, el procedimiento para
examinar las características de la célula cancerosa con respecto al
bajo nivel de expresión de pBR, la expresión positiva de p16 o un
alto nivel de expresión de ciclina E puede ser un procedimiento
para medir el nivel de ARNm transcrito o un procedimiento para medir
el nivel de proteínas traducidas. El procedimiento para medir el
nivel de ARNm incluye un procedimiento de RT-PCR y
un procedimiento de punta de ADN, y el procedimiento para medir el
nivel de proteína incluye un procedimiento de transferencia de
western, un procedimiento de inmunohistotinción, y un procedimiento
ELISA. Puede usarse cualquier procedimiento para medir un nivel de
expresión y la presente invención no se limita a estos ejemplos.
Además, la presente invención incluye una
realización en la que la mutación de la proteína (Reports concerning
mutation of pRB: Proc Natl Acad Sci USA 87: 6922-6,
1990; Proc Natl Acad Sci USA 87:6-10, 1990) que es
sustancialmente igual a la reducción de la expresión se detecta
como el ADN/ARNm mutado analizando las secuencias de bases o la
movilidad electroforética del ADN/ARNm (Oncogene 8:
1913-9, 1993), o una realización en la que la
proteína mutada se detecta por un anticuerpo o movilidad
electroforética que pueden identificar la mutación.
En lo sucesivo, se describirá con detalle el
procedimiento para medir el nivel de expresión de pRB, p16 y
ciclina E a partir de tejidos tumorales muestreados, y el nivel de
expresión también puede medirse a partir de las células cultivadas
por el mismo procedimiento, y por lo tanto la presente invención no
está limitada a estos procedimientos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara un ARNm a partir de un tejido tumoral
muestreado por un procedimiento rutinario (Experimental Medicine,
número extra, "PCR and its application" 8:
1063-1071, 1990). El nivel de expresión de
pRB/p16/ciclina E puede medirse usando un ARNm preparado como molde
por RT-PCR. En la RT-PCR, la
reacción de transcripción inversa y la posterior PCR
(RT-PCR) pueden realizarse usando un Core Kit de
RT-PCR a tiempo real (Takara Code PR032A) o
similar.
Para medir el nivel de expresión por
cuantificación del ARNm, es preferible la RT-PCR
cuantitativa. Aunque ha habido informes de diversos procedimientos
de RT-PCR cuantitativa (Genome Res. 6:
986-994, 1996), es deseable la
RT-PCR competitiva, en la que la
RT-PCR se realiza en coexistencia con una cantidad
conocida de ARN molde competitivo que se amplifica preferentemente
por el mismo cebador, y se determinan las cantidades de los dos
productos amplificados para comparar.
Se prepara un cebador para detectar un ARNm que
codifica pRB/p16/ciclina E (denominado ARNm diana) basándose en la
información de secuencia descrita en el Número de Acceso del Genbank
mencionado anteriormente. Y se prepara un ARN molde competitivo que
tiene la secuencia complementaria al cebador pero tiene un peso
molecular diferente o un sitio de escisión por enzimas de
restricción diferente de los del ARNm diana para la determinación.
El cebador se dirige a un sitio en el que con frecuencia se produce
la mutación (el sitio en pRB se indicó en Proc Natl Acad Sci USA
87: 6922-6, 1990; Proc Natl Acad USA 87:
6-10, 1990), con lo que sólo puede determinarse la
proteína mutada o sólo la proteína normal.
La RT-PCR se realiza añadiendo
la cantidad conocida diluida de ARN molde competitivo a la muestra
de ARNm preparada a partir del tejido tumoral y añadiendo el
cebador a la misma. Basándose en los pesos moleculares de los
productos amplificados o un producto digerido por enzimas de
restricción del mismo, se determina si procede del ARNm diana o el
ARN molde competitivo, y se calcula un valor cuantitativo del ARNm
diana mediante una relación de los productos amplificados y la
cantidad del ARN molde competitivo añadido. El nivel de ARNm puede
medirse como un valor relativo en comparación con un ARNm de actina
o ARNr 18S o similar que se expresan universalmente. Se mide el
nivel de ARNm de pRB/p16/ciclina E en células cancerosas muy
sensibles y poco sensibles para decidir un valor límite, y después
se compara con el valor límite para juzgar el nivel de
expresión.
Además, la aparición de bandas electroforéticas
con diferente movilidad de la de la célula convencional o la
detección de proteínas mutadas es decisiva en el bajo nivel de
expresión.
La célula cancerosa, que tiene características
de bajo nivel de expresión de pRB, expresión positiva de p16 o alto
nivel de expresión de ciclina E, preferentemente en el caso de un
bajo nivel de expresión de pRB y alto nivel de expresión de ciclina
E, o expresión positiva de p16 y alto nivel de expresión de ciclina
E, se considera altamente sensible al presente compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrae un ARNm a partir de un tejido tumoral
muestreado por un procedimiento rutinario (Experimental Medicine,
número extra, "PCR and its application" 8:
1063-1071, 1990), se marca con fluorescencia por
reacción de transcripción inversa y el ADNc marcado sintetizado se
hibrida en una micromatriz (IntelliGene Human Cancer CHIP Ver. 4.0,
X102, TAKARA BIO INC.) en la que se aplica de forma puntual el
oligonucleótido de un gen asociado con cáncer (Nature genetics
supplement 21; 10-14; 1999).
La muestra de tejido tumoral y la muestra de
tejido normal se marcan con diferentes colorantes fluorescentes
tales como Cy3 (rojo) y Cy5 (verde) para juzgar en qué muestra
aumentan los genes. El software de análisis informático hace
posible la presentación de imágenes. Por ejemplo, muestra una imagen
roja cuando el gen hibridado con el ADNc marcado se amplifica más
cuando procede de la muestra de tejido tumoral que cuando procede de
la muestra de células normales, una imagen amarilla cuando la
amplificación es igual y una imagen verde cuando se amplifica
menos. La intensidad de estas señales se digitaliza por el software
de análisis informático, con lo que se calculan los datos de la
relación de expresión genética entre ellos (Cy3 = tejido
canceroso/Cy5 = tejido normal), y si la relación de expresión es 2
o más o 1/2 o menos, preferentemente 3 o más o 1/3 o menos, una
diferencia en la expresión se considera significativa.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Cuando la pRB es verde, el p16 es amarillo o
rojo, o la ciclina E es roja, la célula cancerosa se considera muy
sensible al presente compuesto. Preferentemente, cuando la pRB es
verde y la ciclina E es roja, o la p16 es amarilla o roja y la
ciclina E es roja, se considera que la célula cancerosa es muy
sensible al presente compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo
anti-pRB/anticuerpo
anti-p16/anticuerpo anti-ciclina E
usado en el siguiente procedimiento de transferencia de western,
procedimiento de inmunohistotinción y procedimiento ELISA pueden ser
anticuerpos disponibles en el mercado. Por ejemplo, para el
anticuerpo anti-pRB, el anticuerpo de Rb puede
obtenerse en Cell Signaling Technology, Inc. (Nº de Catálogo 9302),
para el anticuerpo anti-p16, p16
(C-20) puede obtenerse en Santa Cruz Biotechnology,
Inc. (Nº de Catálogo sc-468), y para el anticuerpo
anti-ciclina E, puede obtenerse
anti-ciclina E humana purificado en Pharmingen/BD
Company (Nº de Catálogo 554182).
Además, los anticuerpos pueden prepararse por
inmunización con un antígeno preparado basándose en la información
descrita en el Número de Acceso del Genbank mencionado
anteriormente. El antígeno puede obtenerse preparando un vector de
expresión de pRB/p16/ciclina E basándose en la información de
secuencia descrita en el Número de Acceso del Genbank mencionado
anteriormente y purificando la proteína pRB/p16/ciclina E a partir
de la célula de expresión en la que se introduce el vector. Estas
proteínas preferentemente se expresan como proteínas de fusión para
facilitar la purificación. Y como el otro procedimiento, el antígeno
puede prepararse sintetizando un péptido basándose en la
información de secuencia descrita en el Número de Acceso del Genbank
mencionado anteriormente y combinándolo con una proteína de
soporte. El anticuerpo puede purificarse a partir de un suero que
se obtiene a partir de un animal inmunizado con el antígeno, o un
cultivo de un hibridoma que se prepara a partir de la célula
productora de anticuerpos obtenida.
Además, para detectar la mutación de
pRB/p16/ciclina E, sobre todo de pRB, se expresa una proteína mutada
con la mutación descrita en Proc Natl Acad Sci USA 87:
6922-6, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 87:
6-10, 1990, o se sintetiza un péptido con sitios de
mutación y se inmuniza a un animal con la proteína/péptido,
obteniéndose de esta manera un anticuerpo que responde
específicamente a la proteína mutada. Por el contrario, también
puede prepararse un anticuerpo que responde a proteínas normales
pero no a proteínas mutadas, por inmunización con la proteína
normal. El procedimiento para preparar el anticuerpo se describe en
Methods in Enzymolgy 182, p663-679.
Se prepara una muestra para
SDS-PAGE que incluye pRB/p16/ciclina E a partir del
tejido tumoral muestreado. Específicamente, el tejido tumoral se
homogeneiza usando una solución de preparación de células (que
preferentemente contiene cada inhibidor de proteasa y un 10% de
glicerol), se mezcla con una cantidad igual de tampón de muestra
para SDS-PAGE y se trata térmicamente a 97ºC durante
cinco minutos, obteniéndose de esta manera la muestra para
SDS-PAGE, por ejemplo. El procedimiento de
transferencia de western puede realizarse de acuerdo con el
procedimiento descrito en Methods in Enzymology 182, p679, 688, sin
embargo, puede realizarse concretamente como se indica a
continuación, por ejemplo.
Se separa una cierta cantidad de cada muestra
por SDS-PAGE, se transfiere a una membrana Hybond
ECL, se hace reaccionar con el anticuerpo
anti-pRB/p16/ciclina E y se hace reaccionar con el
segundo anticuerpo marcado con enzima, para detectar la pRB/ciclina
E/p16 transferida a la membrana Hybond ECL por actividad enzimática.
Como controles preferibles, se aplica al mismo tiempo la célula
patrón que muestra la expresión de pRB/p16/ciclina E, más
preferentemente la célula MDA-MB435 que muestra
expresión de todas ellas, y la comparación con la expresión en la
célula MDA-MB435 determina la expresividad.
Además, la aparición de bandas con diferente
movilidad electroforética de la de la célula patrón o la detección
de proteínas mutadas es decisiva en el bajo nivel de expresión.
La célula cancerosa, que tiene características
de bajo nivel de expresión de pRB, expresión positiva de p16 o alto
nivel de expresión de ciclina E, preferentemente en el caso de bajo
nivel de expresión de pRB y alto nivel de expresión de ciclina E, o
expresión positiva de p16 y alto nivel de expresión de ciclina E, se
considera muy sensible al presente compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de inmunohistotinción puede
realizarse de acuerdo con un procedimiento descrito en Experimental
Medicine, volumen separado (Immunostaining in
post-genome era, in situ hybridization, 1997)
y puede realizarse concretamente como se indica a continuación, por
ejemplo.
El tejido tumoral muestreado se infiltra con un
agente de inclusión para obtener un bloque, que después se corta en
piezas de 2-8 \mum de espesor y se aplica en un
portaobjetos para preparar una muestra de tejido. El anticuerpo
anti-pRB, el anticuerpo anti-p16 o
el anticuerpo anti-ciclina E se hace reaccionar con
la muestra de tejido y después se tiñe por interacción
avidina-biotina en una técnica inmunoenzimática (J.
Histochem. Cytochem. 27; 1131-1139, 1979). El bajo
nivel de expresión de pRB, la expresión positiva de p16 y el alto
nivel de expresión de ciclina E se juzgan comparando la intensidad
de tinción de pRB/p16/ciclina E entre el tejido del tumor y el
tejido normal en la muestra de tejido teñida. La detección de
proteínas mutadas es decisiva en la expresión de bajo nivel.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La célula cancerosa, que tiene características
de bajo nivel de expresión de pRB, expresión positiva de p16 o alto
nivel de expresión de ciclina E, preferentemente en el caso de bajo
nivel de expresión de pRB y alto nivel de expresión de ciclina E, o
expresión positiva de p16 y alto nivel de expresión de ciclina E, se
considera muy sensible al presente compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento ELISA puede realizarse de
acuerdo con un procedimiento descrito en Antibodies A Laboratory
Manual (Ed Harlow et al, Cold Spring Harbor Laboratory), y
puede realizarse concretamente como se indica a continuación, por
ejemplo.
Se prepara una fracción que incluye
pRB/p16/ciclina E a partir del tejido tumoral muestreado. En
concreto, el tejido tumoral se homogeneiza con una solución de
preparación de células (que preferentemente contiene cada inhibidor
de proteasa y un 10% de glicerol), a la que se añade un 1% de
NP-40 para obtener una fracción soluble y un
residuo. La fracción soluble se usa directamente para el
procedimiento ELISA, o el residuo se somete a extracción usando
NaCl 0,5 M y se usa para el procedimiento ELISA después de que la
concentración de NaCl se haya reducido a 0,1-0,15
M.
La fracción soluble y la fracción extraída con
NaCl se aplican a una placa de 96 pocillos recubierta con el
anticuerpo anti-pRB, el anticuerpo
anti-p16 o el anticuerpo
anti-ciclina E para reaccionar con el anticuerpo.
La pRB, p16 o ciclina E que se une al anticuerpo aplicado como un
recubrimiento se intercala con un anticuerpo marcado con enzima
para cada proteína, y la pRB, p16 o ciclina E expresada en el tejido
tumoral se determina midiendo la actividad de la enzima de
unión.
Se miden las cantidades de la pRB/p16/ciclina E
en células cancerosas muy sensibles y poco sensibles para decidir
un valor límite, y la comparación con el nivel límite determina la
expresividad.
La célula cancerosa, que tiene características
de bajo nivel de expresión de pRB, expresión positiva de p16 o alto
nivel de expresión de ciclina E, preferentemente en el caso de bajo
nivel de expresión de pRB y alto nivel de expresión de ciclina E, o
expresión positiva de p16 y alto nivel de expresión de ciclina E, se
considera muy sensible al presente compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 es un resultado de análisis de los
niveles de expresión de pRB/ciclina E/p16/ciclina D1 en cada línea
de células cancerosas humanas, por transferencia de western.
La Fig. 2 es un resultado de análisis de los
niveles de expresión de pRB/p16/ciclina E en las cepas de
SY-1, H-526 y H-460
por inmunohistotinción.
La Fig. 3 es un resultado de análisis de los
niveles de expresión de p16/ciclina E en una muestra clínica de
cáncer endometrial por inmunohistotinción.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra
correlaciones entre el nivel de ARNm de p16 y el % de T/C, y entre
el nivel de ARNm de p16 y el nivel de expresión de la proteína
p16.
\vskip1.000000\baselineskip
En lo sucesivo se describirán ejemplos para
demostrar la utilidad de la presente invención, pero son ejemplares
y la invención no se limita a los siguientes ejemplos concretos en
ningún caso.
\vskip1.000000\baselineskip
En 25 líneas de células cancerosas humanas
incluyendo BSY-1 que mostraba una alta sensibilidad
a
(8E,12E,14E)-7-acetoxi-3,6,21-trihidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-epoxitricosano-8,12,14-trien-11-olida
(denominada en lo sucesivo compuesto 1) representada por la
siguiente fórmula II en el documento WO 02/060890, y WiDr que
mostraba sensibilidad a los compuestos que se representan por la
formula I en el documento WO 03/099813 en la que R1 es un grupo
hidroxilo, se analizó la expresión de las moléculas relacionadas con
el ciclo celular pRB, p16, ciclina E y ciclina D1 por el
procedimiento de transferencia de western.
Las 25 líneas de células cancerosas humanas se
implantaron por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos,
se recogieron los tumores cuando alcanzaron un volumen tumoral de
100 mm^{3} o mayor y se homogeneizaron con una solución de
preparación de células que incluía cada inhibidor de proteasa
(Leupeptina, p-APMSF, EDTA,
o-NaV04) y un 10% de glicerol, estando ajustada la
solución de preparación celular por peso de la muestra tumoral para
tener una cantidad constante. Cada solución de preparación celular
se mezcla con una cantidad igual de tampón de muestra para
SDS-PAGE y se trata con calor a 97ºC durante cinco
minutos para obtener la muestra para SDS-PAGE. Una
cierta cantidad de cada muestra para SDS-PAGE se
separa por SDS-PAGE, se transfiere a la membrana
Hybond ECL, se hace reaccionar con el anticuerpo
anti-pRB/ciclina E/p16/ciclina D1. Después, se hizo
reaccionar con el segundo anticuerpo marcado con HRP, y se mezcló
con un sustrato de quimioluminiscencia (Super Signal: PIERCE), para
detectar una banda de la pRB/ciclina E/p16/ciclina D1 usando Image
Master VDS-CL (Amersham Pharmacia).
Como control para la comparación relativa del
nivel de expresión de pRB/p16/ciclina E/ciclina D1 en cada línea de
células cancerosas, se aplicaron células de
MDA-MB435 que mostraban expresión de todas las
moléculas a todas las SDS-PAGE y la detección se
realizó de la misma manera.
Los resultados se muestran en la Fig. 1.
BSY-1, que mostró una alta sensibilidad, tenía
características de deleción de pRB, expresión de p16 y un alto
nivel de expresión de ciclina E, por lo tanto, se estudió si estas
características estaban asociadas o no con la sensibilidad al
presente compuesto in vivo.
En la Fig. 1, los códigos A-Z,
E, A1-E1 y E muestran sus líneas de células
cancerosas humanas respectivas como se indica a continuación.
Con respecto a las 25 líneas de células
cancerosas humanas que se estudiaron en la expresión de
pRB/p16/ciclina E/ciclina D1 en el Ejemplo 1, se evaluó la
sensibilidad al representante de los presentes compuestos
[(8E,12E,14E)-7-((4-cicloheptilpiperazin-1-il)carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-epoxitricosano-8,12,
14-trien-11-olida] (denominada Compuesto 2) representado por la siguiente formula (III).
14-trien-11-olida] (denominada Compuesto 2) representado por la siguiente formula (III).
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\vskip1.000000\baselineskip
Las 25 células cancerosas humanas que
proliferaron en matraces de cultivo o en los tejidos subcutáneos de
los ratones desnudos se implantaron por vía subcutánea en los
costados de ratones desnudos, y los ratones se clasificaron en un
grupo de 5 ratones de control y un grupo de 5 ratones tratados con
el compuesto 2, de forma que el volumen medio del tumor de cada
grupo fuera uniforme cuando se alcanzó un volumen de tumor de 100
mm^{3} o mayor. Los ratones del grupo tratado se sometieron a una
infusión intravenosa de 10 mg/kg/día durante cinco días, y los
ratones del grupo de control no se trataron o se sometieron a
infusión con el vehículo. El volumen del tumor se midió desde el
día 1, después se midió a lo largo del tiempo los días 5, 8, 12 y 15
y se estimó una relación relativa de volumen del tumor (%T/C).
En la Tabla 1 se muestran correlaciones entre la
expresión de pRB/p16/ciclina E/ciclina D1 y la sensibilidad al
compuesto 2. El nivel de expresión de pRB/ciclina E/p16/ciclina D1
en la línea de células cancerosas humanas analizada en el Ejemplo 1
se evaluó relativamente, estando la ausencia de expresión
representada por "-" y la expresión representada por "+ a
+++" de acuerdo con la intensidad, y se mostró conjuntamente con
los resultados de la relación de volumen de tumor (%T/C). Además,
los niveles de expresión de pRB en la línea de células de cáncer
microcítico de pulmón, la línea de cáncer de ovario y la línea
celular de cáncer de próstata (Oncogen 9,
3375-3378, 1994; Prostate 21,
145-52, 1992; Exp Cell Res, 233,
233-9, 1997) que según se había notificado
expresaban pRB mutada, se describieron con "()".
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(Tabla pasa a página
siguiente)
De las 25 líneas de células cancerosas humanas
examinadas, 11 líneas de células cancerosas en las que no pudieron
detectarse bandas por transferencia de western (representadas por
"-") o no se había informado que tuvieran mutación o deleción
según la información bibliográfica (representadas con paréntesis),
se clasificaron en un grupo de bajo nivel de expresión de pRB
incluyendo 7 cepas (64%) que mostraron %T/C \leq 1%. Por otra
parte, 14 cepas de expresión de pRB no incluían las líneas de
células cancerosas de %T/C \leq % (p = 0,0006), lo que demuestra
que la sensibilidad al compuesto 2 podía ensayarse por una expresión
de bajo nivel de pRB.
Además, 7 cepas (70%) de 10 células cancerosas
de expresión positiva de p16 mostraron un valor de %T/C \leq 1%,
mientras que 15 cepas de ausencia de expresión de p16 no incluían la
línea de células cancerosas de %T/C \leq 1% (p = 0,0002) y por lo
tanto la sensibilidad al compuesto 2 podía ensayarse por expresión
positiva de p16, al igual que por un bajo nivel de expresión de
pRB.
De las 25 líneas de células cancerosas
examinadas, 11 cepas se clasificaron en un grupo de bajo nivel de
expresión de pRB (las bandas no podían detectarse por transferencia
de western, o se había notificado mutación y deleción en la
información bibliográfica) incluyendo 9 cepas que expresaban p16.
Por el contrario, 9 de 10 cepas de expresión de p16 mostraban un
bajo nivel de expresión de pRB, y las células cancerosas de
expresión positiva de p16 coincidían aproximadamente con las
células cancerosas de bajo nivel de expresión de pRB, como se
notifica (EMBO J. 14: 503-511, 1995).
En términos del alto nivel de expresión de la
ciclina E, 5 (56%) de 9 cepas de alto nivel de expresión (+++)
mostraron %T/C \leq 1%, mientras que 2 (13%) de 16 cepas de las
células cancerosas sin alto nivel de expresión mostraron %T/C
\leq 1%, por consiguiente, las células cancerosas de alto nivel de
expresión de ciclina E eran muy sensibles (p = 0,02).
Los efectos del compuesto 2 sobre 5 cepas que
incluían 4 cepas que mostraron la eliminación completa del tumor
(%T/C = 0%) y NCI-H146 que no se eliminaba pero
mostraba una reducción consecutiva del tumor durante un largo
período, se consideraron curativos, y todas estas cepas mostraron
las características de un bajo nivel de expresión de pRB, expresión
de p16 y un alto nivel de expresión de ciclina E.
De esta manera, la correlación entre las dos
características de un bajo nivel de expresión de pRB y un alto
nivel de expresión de ciclina E y los efectos curativos del
compuesto 2 indicaron que los efectos curativos aparecían en 5
cepas (71%) de 7 líneas de células cancerosas con las dos
características pero no aparecían en las otras 18 líneas de células
cancerosas (p = 0,0001). Además, en las células cancerosas con dos
características de expresión positiva de p16 y alto nivel de
expresión de ciclina E, los efectos curativos aparecían en 5 cepas
(83%) de 6 líneas de células cancerosas con las dos características,
pero no aparecían en la otras 19 líneas de células cancerosas (p =
0,00002). El alto nivel de expresión de la ciclina E se convirtió en
un indicador más útil al combinarse con los indicadores de bajo
nivel de expresión de pRB o expresión positiva de p16.
A partir de estos resultados, la sensibilidad de
las líneas de células cancerosas al compuesto 2 resultaron
predecibles por examen de las características de bajo nivel de
expresión de pRB, expresión de p16 y alto nivel de expresión de
ciclina E.
\vskip1.000000\baselineskip
En relación con el compuesto 1 que mostró una
alta actividad antitumoral contra BSY-1 en el
documento WO 02/060890, y los compuestos representativos de los
presentes compuestos representados por la fórmula 1 que mostraron
actividad antitumoral contra WiDr en el documento WO 03/099813, la
(8E,12E,14E)-3,6,16,21-tetrahidroxi-7-((4-isopropilpiperazin-1-il)carbonil)oxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-epoxitricosano-8,12,14-trien-11-olida
(la siguiente fórmula IV, denominada en lo sucesivo compuesto 3) y
la
(8E,12E,14E)-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,
20-pentametil-7-((4-metilpiperazin-1-il)-carbonil)oxi-18,19-epoxitricosano-8,12,14-trien-11-olida
(la siguiente fórmula V, denominada en lo sucesivo compuesto 4), se
evaluó la correlación entre las características de bajo nivel de
expresión de pRB, expresión de p16 y alto nivel de expresión de
ciclina E y la sensibilidad en la línea de células cancerosas
humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las células cancerosas que habían proliferado en
matraces de cultivo o en tejidos subcutáneos de los ratones
desnudos se implantaron por vía subcutánea en los costados de
ratones desnudos, y los ratones se clasificaron en un grupo de 5
ratones de control y un grupo de 5 ratones tratados con los
compuestos, de forma que el volumen medio del tumor de cada grupo
fuera uniforme cuando se alcanzó un volumen de tumor de 100 mm^{3}
o mayor. Los ratones del grupo tratado se sometieron a una infusión
intravenosa de 10 mg/kg/día durante cinco días, y los ratones del
grupo de control no se trataron o se sometieron a infusión con el
vehículo. El volumen del tumor se midió desde el día 1, y después
se midió a lo largo del tiempo los días 5, 8, 12 y 15 y se estimó
una relación relativa de volumen del tumor. Sin embargo, el
experimento se interrumpió básicamente el día 15 en la evaluación
del compuesto 1. En la Tabla 2 se muestra el %T/C de los compuestos
1, 2, 4 y el compuesto 2 del ejemplo 2 con cada célula
cancerosa.
Como se muestra en la Tabla 2, aunque el
compuesto 1 mostró un valor de %T/C algo elevado, todos los
compuestos ensayados mostraron actividades antitumorales, indicando
que la sensibilidad de cada línea de célula cancerosa humana a
estos compuestos indicaba la misma tendencia. Cuando se estimó la
correlación entre el %T/C de los compuestos 1, 3 y 4 y el del
compuesto 2, se obtuvieron proporciones tan elevadas como de 0,724,
0,948 y 0,923. Esto sugirió que cada línea de célula cancerosa
tenía una sensibilidad común entre compuestos representados por la
fórmula I.
Se analizó la expresión de las moléculas
relacionadas con el ciclo celular pRB/p16/ciclina E por el
procedimiento de inmunohistotinción en BSY-1 que
mostraba alta sensibilidad hasta la remisión, H526 que mostraba
presenta una alta sensibilidad sin remisión y H460 que mostraba una
baja sensibilidad al compuesto 2.
Las 3 líneas de células cancerosas humanas
mencionadas anteriormente se implantaron por vía subcutánea en los
costados de ratones desnudos, los tumores se recogieron cuando
alcanzaron un volumen tumoral de 100 mm^{3} o mayor y se fijaron
con formalina al 10% neutralizada durante un día para preparar un
bloque incluido en parafina. El bloque de parafina se cortó en
piezas de 4 \mum de espesor y se aplicó en un portaobjetos para
preparar una muestra para inmunohistotinción. La muestra para
inmunohistotinción se desparafinó y se calentó en un incubador para
activar la antigenicidad, se bloqueó una peroxidasa endógena y
después se hizo reaccionar con un primer anticuerpo contra
pRB/p16/ciclina E a temperatura ambiente durante una hora. La
muestra se hizo reaccionar con un segundo anticuerpo
anti-ratón o anti-conejo marcado con
preoxida y se observó al microscopio por visualización de la
actividad de la peroxidasa usando DAB como sustrato
colorimétrico.
Los resultados se muestran en la Fig. 2. En la
inmunohistotinción se obtuvo claramente el mismo resultado que en
el procedimiento de transferencia de western. El resultado indicó
que la expresión de las moléculas relacionadas con el ciclo
celular, pRB/p16/ciclina E podía analizarse incluso usando la
muestra de un bloque incluido en parafina usada comúnmente en la
práctica clínica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la expresión de moléculas
relacionadas con el ciclo celular p16/ciclina E mediante el
procedimiento de inmunohistotinción usando muestras clínicas
incluidas en parafina (12 tejidos normales y 12 tejidos con cáncer)
adquiridas en SuperBioChips Laboratories Inc.
Las muestras clínicas incluidas en parafina se
sometieron a inmunohistotinción usando los anticuerpos contra
p16/ciclina E de la misma manera que en el Ejemplo 4. Como
resultado, en una parte de los tejidos cancerosos, se observó una
sobreexpresión de p16 (3 de 12 casos) y la ciclina E (1 de 12
casos), aunque no se observó en los tejidos normales. En la Fig. 3,
se mostró el resultado de tinción en cáncer endometrial,
sobreexpresándose tanto p16 como ciclina E. El resultado indicó que
los tejidos cancerosos en los que se sobreexpresaban las moléculas
relacionadas con el ciclo celular p16/ciclina podían seleccionarse
incluso usando la muestra de un bloque de parafina usada en la
práctica clínica.
\vskip1.000000\baselineskip
Además del Ejemplo 5, en muchos otros cánceres
(10 muestras de cada cáncer; cáncer gástrico, cáncer de esófago,
cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer renal,
cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer de
ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer endometrial,
cáncer de la vesícula biliar, cáncer de laringe, carcinoma
cervical, linfoma maligno y melanoma maligno; total de 180
muestras), se analizó la expresión de las moléculas relacionadas
con el ciclo celular p16/ciclina E por el procedimiento de
inmunohistotinción usando muestras de tumores clínicos incluidos en
parafina adquiridas en SuperBioChips Laboratories Inc., de la misma
manera que en los Ejemplos 4 y 5.
Las muestras clínicas incluidas en parafina se
sometieron a inmunohistotinción usando los anticuerpos contra
p16/ciclina E de la misma manera que los Ejemplos 4 y 5, y se
encontró "la sobreexpresión de p16 y ciclina E" característica
en los 10 casos de carcinoma cervical, 4 de 10 casos de cáncer de
ovario y 3 de 10 casos de cáncer de mama, como se muestra en la
Tabla 2, lo que indica que los tejidos cancerosos de
"sobreexpresión de p16 y ciclina E" podían seleccionarse
usando la muestra de bloque incluido en parafina de la práctica
clínica y que ciertos tejidos cancerosos podían tener
frecuentemente la característica de "sobreexpresión de p16 y
ciclina E".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Las 28 líneas de células cancerosas humanas se
implantaron por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos,
los tumores se recogieron cuando alcanzaron un volumen tumoral de
100 mm^{3} o mayor, y se reunieron 3 tumores de cada cáncer. Los
tumores se congelaron con nitrógeno líquido y los ARN totales se
extrajeron usando TRIzol (SIGMA) y se purificaron con el Kit RNeasy
mini (OIAGEN). Después, se sintetizó ADNc con reactivos de
transcripción inversa Taqman® (ABI), y el nivel de ARNm de p16 en
cada tumor se midió por sistemas de detección de secuencia (7900HT,
ABI) usando ensayos de expresión de genes Taqman® (ABI) de p16 como
sonda y reactivos de RT-PCR Taqman® Gold como
reactivo de reacción. El valor obtenido se corrigió por el valor de
ARNr 18S para estimar los niveles relativos del ARNm de p16.
Los niveles relativos de los ARNm de p16 en las
líneas de células cancerosas humanas se recopilaron a partir del
nivel de expresión de la proteína p16 determinado por el
procedimiento de transferencia de western del Ejemplo 1 y la acción
antitumoral %T/C determinada en el Ejemplo 2, y mostrada en la Tabla
3. Además, la Fig. 4 es un gráfico que representa correlaciones
entre los niveles de ARNm de p16 y %T/C y entre los niveles de ARNm
de p16 y el nivel de expresión de la proteína p16.
Como se muestra en la Tabla 3 y en la Fig. 4, de
las 12 cepas de alto nivel de expresión con \geq 0,3 del nivel
relativo del ARNm de p16, 6 cepas (50%) mostraron %T/C = 1%,
mientras que de las 13 cepas de < 0,3, sólo una cepa mostró %T/C
\leq 1% (P = 0,02). La medición del nivel de ARNm de p16 demostró
que la sensibilidad al compuesto 2 podía ensayarse por exploración
en cánceres de la "sobreexpresión de p16".
Además, la Tabla 3 y la Fig. 4 mostraron una
correlación entre el nivel de expresión de la proteína p16, es
decir, las 8 cepas que mostraban el nivel de ARNm de p16 y la
sobreexpresión de la proteína p16 (++) tenían un valor de 0,5786
\pm 0,3259 del nivel de ARNm relativo de p16, mientras que, por
otra parte, las 2 cepas que mostraban expresión de la proteína p16
(+) tenían un valor de 0,3610, y las 15 cepas que no mostraban
expresión de la proteína p16 tenían un valor de 0,2073 \pm 0,2424.
Se considera que los procedimientos de detección del ARNm de p16
como RT-PCR dan los mismos resultados que los
obtenidos por el procedimiento de detección de la expresión de la
proteína p16.
\vskip1.000000\baselineskip
Las características de una célula cancerosa con
respecto al bajo nivel de expresión de pRB, la expresión positiva
de p16 o un alto nivel de expresión de ciclina E pueden examinarse
para evaluar la sensibilidad de la célula cancerosa al presente
compuesto.
De esta manera, el presente compuesto puede
usarse selectivamente en la preparación de un medicamento para el
tratamiento selectivo de un cáncer en un paciente con cáncer que es
de esperar que se beneficie de la actividad antitumoral del
presente compuesto, de forma que pueden esperarse mayores efectos
terapéuticos y menos efectos adversos innecesarios.
Claims (19)
1. Un procedimiento de ensayo para predecir la
sensibilidad de una célula cancerosa a un compuesto representado
por la siguiente fórmula I, que comprende usar un índice cualquiera
de:
1) se reduce la expresión de pRB;
2) se expresa p16;
3) se potencia la expresión de la ciclina E;
4) se reduce la expresión de pRB y se potencia
la expresión de la ciclina E; o
5) se expresa p16 y se potencia la expresión de
la ciclina E:
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula
(I)
\vskip1.000000\baselineskip
(en la que, R^{1} representa
- (1)
- un átomo de hidrógeno o
- (2)
- un grupo hidroxilo;
R^{3} representa
- (1)
- un átomo de hidrógeno,
- (2)
- un grupo hidroxilo o
- (3)
- un grupo alcoxi C_{1-6}; y
R^{2} representa
- (1)
- un átomo de hidrógeno,
- (2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- (3)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- (4)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- (5)
- la fórmula (II):
\vskip1.000000\baselineskip
- (en la que,
- \quad
- A)
- n representa un número entero de 0 a 4;
- X representa
- i)
- -CHR^{N4}-,
- ii)
- -NR^{N5}- o
- iii)
- -O-;
- R^{N1} y R^{N2} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa
- i)
- un átomo de hidrógeno o
- ii)
- un grupo alquilo C_{1-6};
- R^{N3} y R^{N4} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa
- i)
- un átomo de hidrógeno,
- ii)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- iii)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- iv)
- un grupo alcoxi C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- v)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- vi)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- vii)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- viii)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- ix)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- x)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- xi)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- xii)
- -NR^{N6}R^{N7} (en la que R^{N6} y R^{N7} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}) o
- xiii)
- R^{N3} y R^{N4} se unen junto con el átomo e carbono al que están unidos para formar un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente (el grupo heterocíclico no aromático puede tener un sustituyente);
- R^{N5} representa
- i)
- un átomo de hidrógeno,
- ii)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- iii)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- iv)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- v)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- vi)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- vii)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- viii)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- ix)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- x)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente, o
- xi)
- R^{N3} y R^{N5} se unen conjuntamente con el átomo de nitrógeno al que están unidos para formar un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente (el grupo heterocíclico no aromático puede tener un sustituyente),
- \quad
- B)
- X, n, R^{N3}, R^{N4} y R^{N5} representan los grupos definidos anteriormente; y R^{N1} y R^{N2} representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que R^{N1} y R^{N2} están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente,
- \quad
- C)
- X, n, R^{N2}, R^{N4} y R^{N5} representan los grupos definidos anteriormente, y R^{N1} y R^{N3} representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que R^{N1} y R^{N3} están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente, o
- \quad
- D)
- X, n, R^{N1}, R^{N4} y R^{N5} representan los grupos definidos anteriormente; y R^{N2} y R^{N3} representan un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros en el que R^{N2} y R^{N3} están unidos juntos para formarlo y que puede tener un sustituyente), o
- (6)
- la fórmula (III):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- (en la que, R^{N8} y R^{N9} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa
- i)
- un átomo de hidrógeno,
- ii)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- iii)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- iv)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente
- v)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente, o
- vi)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente)).
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R^{2} es
1) un átomo de hidrógeno;
2) un grupo alquilo C_{1-6}
que puede tener un sustituyente,
3) un grupo aralquilo C_{7-10}
que puede tener un sustituyente o
4) un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14
miembros que puede tener un sustituyente.
\newpage
3. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (IV):
Fórmula
(IV)
(en la que n representa un número
entero de 0 a
4;
R^{aN1} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6}; y
R^{aN3} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno
- 2)
- un grupo N-alquilamino C_{1-6},
- 3)
- un grupo N,N-di-alquilamino C_{1-6},
- 4)
- un grupo etilmetilamino,
- 5)
- un grupo piridilo,
- 6)
- un grupo pirrolidin-1-ilo,
- 7)
- un grupo piperidin-1-ilo,
- 8)
- un grupo morfolin-4-ilo o
- 9)
- un grupo 4-metilpiperazin-1-ilo).
\vskip1.000000\baselineskip
4. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (V):
Fórmula
(V)
(en la que n_{1} y n_{2} son
iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un número entero
de 0 a
4;
X_{b} representa
- 1)
- -CHR^{bN4}-,
- 2)
- -NR^{bN5}- o
- 3)
- -O-;
R^{bN1} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6};
R^{bN8} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6},
- 3)
- un grupo arilo C_{6-14} o
- 4)
- un grupo aralquilo C_{7-10};
R^{bN4} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo alcoxi C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 6)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 9)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- 10)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 11)
- NR^{bN6}R^{bN7} (en la que R^{bN6} y R^{bN7} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}) o
- 12)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente; y
R^{bN5} es
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente
- 6)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- 9)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente o
- 10)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente).
\newpage
5. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (VI):
Fórmula
(VI)
(en la que n_{3} representa el
número entero 1 ó
2;
R^{cN1} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6}; y
R^{cN5} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6}).
\vskip1.000000\baselineskip
6. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (VII):
Fórmula
(VII)
(en la que n_{1} y n_{2} son
iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un número entero
de 0 a
4;
X_{d} representa
- 1)
- -CHR^{dN4}-,
- 2)
- -NR^{dN5}- o
- 3)
- -O-; y
R^{dN2} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno o
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6};
R^{aN8} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6},
- 3)
- un grupo arilo C_{6-14} o
- 4)
- un grupo aralquilo C_{7-10};
R^{dN4} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo alcoxi C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 6)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 9)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- 10)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 11)
- -NR^{dN6}R^{dN7} (en el que R^{dN6} y R^{dN7} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}) o
- 12)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente; y
R^{dN5} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo alquilo C_{2-10} insaturado que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo heteroarilo de anillo de 5 a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 6)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente,
- 9)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente o
- 10)
- un grupo heterocíclico no aromático de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente).
\vskip1.000000\baselineskip
7. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (VIII):
Fórmula
(VIII)
(en la que n_{3} representa un
número entero de 1 a 3;
y
R^{eN4} representa
- 1)
- un grupo amino,
- 2)
- un grupo N-alquilamino C_{1-6},
- 3)
- un grupo pirrolidin-1-ilo,
- 4)
- un grupo piperidin-1-ilo o
- 5)
- un grupo morfolin-4-ilo).
\vskip1.000000\baselineskip
8. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (IX):
Fórmula
(IX)
(en la que n_{3} representa un
número entero de 1 a
3;
R^{fN8} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6},
- 3)
- un grupo arilo C_{6-14} o
- 4)
- un grupo aralquilo C_{7-10}; y
R^{fN5} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno,
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede tener un sustituyente,
- 3)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede tener un sustituyente,
- 4)
- un grupo heterocíclico no aromático de 3 miembros a 8 miembros que puede tener un sustituyente,
- 5)
- un grupo arilo C_{6-14} que puede tener un sustituyente,
- 6)
- un grupo heteroarilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente,
- 7)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede tener un sustituyente,
- 8)
- un grupo heteroaralquilo de 5 miembros a 14 miembros que puede tener un sustituyente o
- 9)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede tener un sustituyente).
\vskip1.000000\baselineskip
9. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R^{2} se representa por la siguiente
fórmula (X):
Fórmula
(X)
(en la que n_{3} representa un
número entero de 1 a 3;
y
R^{gN5} representa
- 1)
- un átomo de hidrógeno
- 2)
- un grupo alquilo C_{1-6} que puede estar sustituido,
- 3)
- un grupo cicloalquilo C_{3-8} que puede estar sustituido,
- 4)
- un grupo cicloalquilalquilo C_{4-9} que puede estar sustituido,
- 5)
- un grupo aralquilo C_{7-10} que puede estar sustituido,
- 6)
- un grupo piridilo que puede estar sustituido o
- 7)
- un grupo tetrahidropiranilo que puede estar sustituido).
\vskip1.000000\baselineskip
10. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el compuesto representado por la
fórmula (I) es un compuesto cualquiera seleccionado entre el grupo
constituido por los siguientes compuestos:
1)
(8E,12E,14E)-7-acetoxi-3,6,21-trihidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-oli-
da,
da,
2)
(8E,12E,14E)-7-((4-cicloheptilpiperazin-1-il)-carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,
19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida,
19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida,
3)
(8E,12E,14E)-3,6,16,21-tetrahidroxi-7-((4-isopropilpiperazin-1-il)carbonil)oxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,
19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida y
19-epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida y
4)
(8E,12E,14E)-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-7-((4-metilpiperazin-1-il)carbonil)oxi-18,19-
epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida.
epoxitricosan-8,12,14-trien-11-olida.
\vskip1.000000\baselineskip
11. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende ensayar una expresión reducida de
pRB, una expresión de p16 o una expresión aumentada de ciclina E
midiendo los niveles de sus ARNm codificantes respectivos.
12. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que el procedimiento para medir el nivel
de los ARNm es un procedimiento de RT-PCR
cuantitativo.
13. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que el procedimiento para medir el nivel
de los ARNm es un procedimiento de punta de ADN.
14. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende ensayar una expresión reducida de
pRB, una expresión de p16 o una expresión aumentada de ciclina E
midiendo los niveles de sus proteínas respectivas.
15. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que el procedimiento para medir los
niveles de sus proteínas respectivas es un procedimiento de
transferencia de western.
16. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que el procedimiento para medir los
niveles de sus proteínas respectivas es un procedimiento de
inmunohistotinción.
17. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que el procedimiento para medir los
niveles de sus proteínas respectivas es un procedimiento ELISA.
18. Un kit para su uso en el procedimiento de
ensayo de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende un
compuesto representado por la fórmula I y un cebador que contiene al
menos 15 secuencias de bases consecutivas de los genes de pRB, p16
o ciclina E.
19. Un kit para su uso en el procedimiento de
ensayo de acuerdo con las reivindicaciones 15, 16 ó 17, que
comprende un compuesto representado por la fórmula I y un anticuerpo
contra pRB, p16 o ciclina E.
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