ES2294796T3

ES2294796T3 - Moduladores del factor asociado al receptor tnf (traf), su preparacion y uso.

Info

Publication number: ES2294796T3
Application number: ES97914534T
Authority: ES
Inventors: David Wallach; Nikolai Malinin; Mark Boldin; Andrei Kovalenko; Igor Mett
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1996-04-02
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2017-04-01
Also published as: UA71889C2; JP4180114B2; PT894130E; SK287890B6; EP0894130A1; NO984551D0; SK287889B6; JP2000507826A; CN1197966C; CZ318398A3; DE69738370D1; SK287085B6; US20090291888A1; WO1997037016A1; US7485456B1; NO327054B1; ATE380866T1; EA004309B1; AU732793B2; CZ299094B6

Abstract

SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA UNA PROTEINA CAPAZ DE UNIRSE A UNA MOLECULA DEL FACTOR ASOCIADO AL RECEPTOR TNF (TRFA) DE UNA NECROSIS TUMORAL, PROTEINAS DE COMBINACION TRAF, SUS ISOFORMAS, ANALOGOS, FRAGMENTOS Y DERIVADOS CODIFICADOS POR LA SECUENCIA DE DNA, SUS METODOS PARA LA PRODUCCION DE LAS SECUENCIAS Y PROTEINAS DEL DNA, Y LOS USOS DE LA SECUENCIA Y PROTEINAS DEL DNA.

Description

Moduladores del factor asociado al receptor TNF (TRAF), sus preparación y uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de DNA que codifican proteínas capaces de unirse a TRAF2, a las proteínas codificadas por las mismas, y al uso de dichas proteínas y secuencias de DNA en el tratamiento o la prevención de un estado patológico asociado con la inducción del factor NF-\kappaB o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las que se unen dichas proteínas.

Fundamentos de la invención

La superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral/factor de crecimiento nervioso (TNF/NGF) se define por la homología estructural entre los dominios extra-celulares de sus miembros (Bazan, 1993; Beutler y van Huffel, 1994; Smith et al., 1994). Excepto para dos receptores, el receptor p55 del TNF y Fas/APO1, los diversos miembros de esta familia de receptores no muestran una clara similitud de estructura en sus dominios intracelulares. Sin embargo, hay mucha similitud de función entre los receptores, que indica que comparten rutas de señalización comunes. Un ejemplo de esta similitud es la capacidad de varios receptores de la familia TNF/NGF para activar el factor de transcripción NF-\kappaB. Esta capacidad común fue adscrita a una capacidad de una proteína citoplásmica que activa el NF-\kappaB, el factor 2 asociado al receptor de TNF (TRAF2) para unirse a los dominios intracelulares estructuralmente disimilares de varios de los receptores de la familia TNF/NGF. No se sabe por qué mecanismos actúa el TRAF2 ni cómo es su capacidad de respuesta a los distintos receptores a los que se une.

El TRAF2 es un miembro de una familia de proteínas recientemente descrita llamada TRAF que incluye varias proteínas identificadas, por ejemplo, como TRAF1, TRAF2 (Rothe, M., Wong, s. c., Henzel, W. J. y Goeddel, D (1994) Cell 78: 681-692; solicitud PCT publicada WO 95/33051), TRAF3 (Cheng, G. et al. (1995)), y TRAF6 (véase Cao et al., 1996a). Todas las proteínas pertenecientes a la familia de TRAF comparten un alto grado de identidad de aminoácidos en sus dominios C-terminales, mientras que sus dominios N-terminales pueden ser no relacionados. Como se muestra en una ilustración esquemática de TRAF2 (Fig. 1), la molécula contiene un motivo ring finger y dos motivos Zn-finger de tipo TFIIIA en su área C-terminal. La mitad C-terminal de la molécula incluye una región conocida como "dominio TRAF" que contiene una región cremallera de leucina potencial que se extiende entre los aminoácidos 264 a 358 (llamada N-TRAF) y otra parte hacia el extremo carboxi del dominio entre los aminoácidos 359 a 501 (llamada C-TRAF) que es responsable de la unión de TRAF a los receptores y a otras moléculas de TRAF para formar horno- o hetero-dímeros.

La activación del factor de transcripción NF-\kappaB es una manifestación de la cascada de señalización iniciada por alguno de los receptores TNF/NGF y mediada por TRAF2. El NF-\kappaB comprende miembros de una familia de proteínas formadoras de dímeros con homología con el oncogén Rel que, en su forma dímera, actúan como factores de transcripción. Estos factores son ubicuos y participan en la regulación de la expresión de múltiples genes. Aunque inicialmente identificado como un factor que está constitutivamente presente en las células B en el estadio de expresión de la cadena ligera Ig\kappa, el NF-\kappaB es conocido principalmente por su acción como activador transcripcional inducible. En la mayor parte de los casos conocidos, el NF-\kappaB se comporta como un factor primario, es decir que la inducción de su actividad es por activación de moléculas preexistentes presentes en la célula en su forma inactiva, en vez de su síntesis de novo que a su vez se basa en factores de transcripción inducibles que excitan el gen del NF-\kappaB. Los efectos del NF-\kappaB son altamente pleiotrópicos. La mayor parte de estos numerosos efectos comparten la característica común de inducirse rápidamente en respuesta a un estímulo extracelular. La mayoría de los agentes de activación del NF-\kappaB son inductores de defensa inmunitaria, incluyendo componentes de virus y bacterias, citocinas que regulan la respuesta inmunitaria, luz UV y otras. En consecuencia, muchos de los genes regulados por el NF-\kappaB contribuyen a la defensa inmunitaria (véanse Blank et al., 1992; Grilli et al., 1993; Baeuerle y Henkel, 1994, para
revisiones).

Una característica principal de la regulación del NF-\kappaB es que este factor puede existir en una forma citoplásmica de no unión de DNA que puede ser inducida para translocar al núcleo, unir DNA y activar la transcripción. Esta forma dual de las proteínas NF-\kappaB está regulada por I-\kappaB, una familia de proteínas que contiene repeticiones de un dominio que ha sido inicialmente observado en la proteína del eritrocito anquirina (Gilmore y Morin, 1993). En la forma no estimulada, el dímero del NF-\kappaB aparece en asociación con una molécula de I-\kappaB que impone en él localización citoplásmica y previene su interacción con la secuencia de DNA de unión del NF-\kappaB y activación de la transcripción. La disociación de I-\kappaB del dímero del NF-\kappaB constituye la etapa crítica de su activación por muchos de sus agentes de inducción (DiDonato et al., 1995). El conocimiento de los mecanismos que intervienen en su regulación es aún limitado. Tampoco hay nada más que una comprensión limitada de la forma en la que está determinada la especificidad de la célula en términos de capacidad de respuesta a los diversos agentes de inducción del NF-\kappaB.

Uno de los más potentes agentes de inducción del NF-\kappaB es la citocina factor de necrosis tumoral (TNF). Hay dos receptores de TNF distintos, los receptores p55 y p75. Sus niveles de expresión varían independientemente entre células diferentes (Vandenabeele et al., 1995). El receptor p75 responde preferencialmente a la forma de TNF unida a la célula (el TNF se expresa como proteína beta-transmembrana y como proteína soluble) mientras que el receptor p55 responde solo efectivamente a moléculas de TNF soluble (Grell et al., 1995). Los dominios intracelulares de los dos receptores son estructuralmente no relacionados y se unen a proteínas citoplásmicas diferentes. Sin embargo, al menos parte de los efectos del TNF, incluyendo el efecto citocida del TNF y la inducción del NF-\kappaB, pueden ser inducidos por ambos receptores. Esta característica es específica de la célula. El receptor p55 es capaz de inducir un efecto citocida o la activación del NF-\kappaB en todas las células que muestran tales efectos en respuesta al TNF. El p75-R puede tener tales efectos solamente en algunas células. Otras, aunque expresando el p75-R a niveles elevados, muestran la inducción de los efectos solamente en respuesta a la estimulación del p55-R (Vandenabeele et al., 1995). Aparte de los receptores de TNF, otros diversos receptores de la familia de receptores de TNF/NGF: CD30 (McDonald et al., 1995), CD40 (Berberich et al., 1994; Lalmanach-Girard et al., 1993), el receptor de linfotoxina beta y, en unos pocos tipos de células, Fas/APO1 (Rensing-Ehl et al., 1995), son también capaces de inducir la activación del NF-\kappaB. El receptor de IL-1 tipo 1, que también dispara eficazmente la activación del NF-\kappaB, comparte la mayoría de los efectos de los receptores de TNF a pesar del hecho de que no tiene similitud estructural con ellos.

La activación del NF-\kappaB en el disparo de estos varios receptores resulta de la I fosforilación inducida de sus moléculas de I-KB asociadas. Esta fosforilación marca I-\kappaB para la degradación, que lo más probablemente ocurre en el proteasoma. La naturaleza de la cinasa que fosforila el I-\kappaB, y su mecanismo de activación al tener lugar el disparo del receptor se desconocen aún. Sin embargo, en los últimos dos años se ha obtenido algún conocimiento más en cuanto a la identidad de tres proteínas asociadas al receptor que parecen tomar parte en la iniciación de la fosforilación (véase la ilustración gráfica en las Figuras 2a y 6). Una proteína llamada TRAF2, donada inicialmente por D. Goeddel y sus colegas (Rothe et al., 1994), parece jugar un papel central en la activación del NF-\kappaB por los diversos receptores de la familia de TNF/NGF. La proteína, que cuando se expresa a niveles elevados puede disparar por sí misma la activación del NF-\kappaB, se une a p75 del TNF-R activado (Rothe et al., 1994), receptor de linfotoxina beta (Mosialos et al., 1995), CD40 (Rothe et al., 1995a) y CD-30 (datos no publicados) y media la inducción del NF-\kappaB por ellos. TRAF2 no se une al receptor de p55 del TNF ni a FAS/APO1, pero puede unirse a una proteína asociada al receptor p55 llamada TRADD, y TRADD tiene la capacidad de unirse a una proteína asociada a Fas/APO1 llamada MORT1 (o FADD; véase Boldin et al. 1995b y 1996). Otra proteína que interacciona con el receptor, llamada RIP (véase Stanger et al., 1995) es también capaz de interaccionar con TRAF2 así como con FAS/APO1, TRADD, el receptor p55 de TNF y MORT-1. Así, aunque RIP ha sido asociada con la inducción de la citotoxicidad (muerte celular), su capacidad para interaccionar con TRAF2 la implica también en la activación del NF-\kappaB y también puede servir además para aumentar la interacción entre FAS/APO1, MORT1, receptor p55 de TNF y TRADD con TRAF2 en la ruta que conduce a la activación del NF-\kappaB. Estas asociaciones aparentemente permiten que el receptor p55 de TNF y Fas/APO1 disparen la activación del NF-\kappaB (Hsu et al., 1995; Boldin et al., 1995; Chinnalyan et al., 1995; Varfolomeev et al. 1996; Hsu et al., 1996,). El disparo de la activación del NF-\kappaB por el receptor de IL-1 ocurre independientemente de TRAF2 y puede implicar a una proteína-cinasa asociada al receptor de IL-1 recientemente clonada llamada IRAK (Croston et al., 1995).

No está claro cuál es el mecanismo por el que actúa TRAF2. Se han identificado varias moléculas citoplásmicas que se unen a TRAF2 (Rothe et al., 1994; Rothe et al., 1995b). Sin embargo, la información sobre estas moléculas no proporciona ninguna pista en cuanto a la forma por la cual TRAF2, que por sí mismo no posee ninguna actividad enzimática, dispara la fosforilación de I-\kappaB. Tampoco hay todavía información de los mecanismos que dictan la ruta, específica de la célula, de activación de TRAF2 por distintos receptores, tal como la observada para la inducción del NF-\kappaB por los dos receptores de TNF.

Además de las anteriormente mencionadas, de las varias proteínas TRAF, debe observarse también que TRAF2 se une a los receptores de TNF p55 (CAD120a) y p75 (CD120b), así como a otros varios receptores de la familia de receptores TNF/NGF, bien sea directamente o indirectamente a través de otras proteínas adaptadoras como se señaló anteriormente, por ejemplo con referencia al receptor FAS/APO1, y las proteínas adaptadores MORT-1, TRADD y RIP. Como tal, TRAF2 es crucial para la activación del NF-\kappaB (véase también Wallach, 1996). Sin embargo, TRAF3 realmente inhibe la activación del NF-\kappaB por algunos receptores de la familia de TNF/NGF (véase Rothe et al., 1995a), mientras que se requiere TRAF6 para la inducción del NF-\kappaB por IL-1 (véase Cao et al., 1996a).

En consecuencia, en cuanto a la activación del NF-\kappaB y su importancia en el mantenimiento de la viabilidad celular, las diversas rutas intracelulares implicadas en esta activación no han sido explicadas claramente hasta ahora, por ejemplo, cómo están implicadas directamente o directamente las diversas proteínas TRAF.

Además, como es sabido en relación con varios miembros de la familia del receptor de TNF/NGF y sus rutas de señalización intracelular asociadas que incluyen varias proteínas adaptadoras, mediadoras/moduladoras (véanse breves revisiones y referencias, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente de Israel de propiedad común y pendiente en común con la presente números 114615, 114986, 115319, 116588), el TNF y el ligando FAS/APO1, por ejemplo, pueden tener efectos tanto beneficiosos como perjudiciales sobre las células. El TNF, por ejemplo, contribuye a la defensa del organismo frente a tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación de una lesión induciendo la muerte de las células tumorales y de las células infectadas por virus, aumentando la actividad antibacteriana de los granulocitos, y así en esos casos la muerte celular inducida por el TNF es deseable. Sin embargo, el exceso de TNF puede ser perjudicial y se sabe que el TNF como tal juega un papel patogénico principal en varias enfermedades tales como la septicemia, la anorexia, enfermedades reumáticas, inflamación y las reacciones del injerto contra el hospedador. En tales casos, la muerte celular inducida por el TNF no es deseable. El ligando FAS/APO1, por ejemplo, tiene también efectos deseables y perjudiciales. Este ligando FAS/APO1 induce a través de su receptor la muerte de células T autorreactivas durante la maduración de las células T, esto es, la muerte de las células T que reconocen auto-antígenos, durante su desarrollo, previniendo así enfermedades autoimnunitarias. Además, varias células malignas y células infectadas por VIH llevan el receptor FAS/APO1 en su superficie y pueden así ser destruidas por activación de este receptor por su ligando o por anticuerpos específicos contra el mismo, y de esta forma la activación de las rutas intracelulares de la muerte celular (apoptosis) mediada por este receptor. Sin embargo, el receptor FAS/APO1 puede mediar efectos perjudiciales, por ejemplo la muerte incontrolada de tejido que se observa en ciertas enfermedades tales como hepatitis aguda, que viene acompañada por la destrucción de células hepáticas.

En vista de lo anterior, es decir que los receptores de la familia de TNF/NGF por una parte pueden inducir rutas de muerte celular, y por otra parte pueden inducir rutas de supervivencia celular (a través de la inducción del NF-\kappaB), aparentemente existe un fino equilibrio, intracelularmente entre estas dos rutas opuestas. Por ejemplo, cuando se desea conseguir la máxima destrucción de células cancerosas u otras células infectadas o enfermas, se desearía tener el TNF y/o el ligando FAS/APO1 induciendo solamente la ruta de muerte celular sin inducir el NF-\kappaB. En cambio, cuando se desea proteger células tales como, por ejemplo, en la inflamación, reacciones de injerto contra hospedador, hepatitis aguda, sería deseable bloquear la inducción de muerte celular del TNF y/o el ligando FAS/APO1 y potenciar, en vez de ello, su inducción del NF-\kappaB. Del mismo modo, en ciertas circunstancias patológicas sería deseable bloquear las rutas de señalización intracelular mediadas por el receptor de TNF p75 y el receptor de IL-1, mientras que en otras sería deseable potenciar estas rutas intracelulares.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevas proteínas, incluyendo todas las isoformas, análogos, fragmentos o derivados de las mismas, que son capaces de unirse a las proteínas asociadas al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF) y que están codificadas por una secuencia de DNA que es:

(a): una secuencia de cDNA del que en el presente texto se denomina clon 10, que comprende la secuencia de nucleótidos representada en la Fig. 4;

(b): una secuencia de cDNA que comprende la secuencia de nucleótidos representadas en la Fig. 6;

(c): un fragmento de una secuencia (a) o (b) que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a, al menos, la secuencia de aminoácidos 222 a 501 de TRAF2;

(d): una secuencia de DNA capaz de hibridarse con una secuencia de (a) a (c) bajo condiciones moderadamente rigurosas y que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a, al menos, la secuencia de aminoácidos 222 a 501 de TRAF2; o

(e): una secuencia de DNA que ha degenerado como resultado del código genético a las secuencias de DNA definidas en (a) a (d) y que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a, al menos, la secuencia de aminoácidos 222 a 501 de TRAF2.

Como las proteínas TRAF están implicadas en la modulación o mediación de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB, que es iniciado por algunos de los receptores TNF/NGF, así como otros que se indicaron anteriormente, las nuevas proteínas de la presente invención, por unión a proteínas TRAF, son por tanto capaces de afectar (modular o mediar) los procesos de señalización intracelular iniciados por varios ligandos (p. ej. TNF, ligando FAS y otros) que se unen a sus receptores tales como, por ejemplo, su modulación/mediación de la activación del NF-\kappaB, a través de la interacción directa o indirectamente con las proteínas TRAF.

Las nuevas proteínas de la presente invención son por tanto moduladores/mediadores directos de la actividad biológica intracelular de las proteínas TRAF (p. ej. la inducción de la activación del NF-\kappaB por TRAF2 y TRAF6 y la inhibición de la activación del NF-\kappaB por TRAF3).

Las nuevas proteínas de la presente invención son igualmente moduladores/mediadores indirectos de la actividad biológica intracelular de una diversidad de otras proteínas que son capaces de interaccionar con proteínas TRAF directamente o indirectamente (p. ej. receptor FAS/APO1, receptor p55 del TNF, receptor p75 del TNF, receptor de IL-1 y sus proteínas asociadas, tales como por ejemplo MORT-1, TRADD, RIP).

Otro objeto de la invención es proporcionar anticuerpos contra las anteriores nuevas proteínas de unión con TRAF, incluyendo isoformas, análogos, fragmentos y derivados de las mismas, que pueden ser usadas para inhibir el proceso de señalización o, más específicamente, para inhibir la activación del NF-\kappaB y su implicación asociada en procesos de supervivencia celular, cuando se desea. Del mismo modo, cuando las proteínas de unión con TRAF de la invención o la proteína TRAF a la que se unen (p. ej. TRAF3) son ellas mismas inhibidoras para la activación de del NF-\kappaB, entonces es un objeto proporcionar anticuerpos contra estas proteínas de unión de TRAF para activar el proceso de señalización o, más específicamente, para bloquear la inhibición de la activación del NF-\kappaB y por ello producir la activación mejorada del NF-\kappaB, cuando se desee.

Otro objeto de la presente invención es usar las anteriores nuevas proteínas de unión de TRAF, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de las mismas, para aislar y caracterizar proteínas o factores adicionales, que pueden estar implicadas en la regulación de la actividad de la proteína TRAF y/o la actividad del receptor anteriormente indicado, p. ej. otras proteínas que pueden unirse a proteínas TRAF e influir en su actividad, y/o aislar o identificar otros receptores u otras proteínas celulares más corriente arriba o corriente abajo en el proceso o procesos de señalización a las que se unen estas nuevas proteínas, análogos, fragmentos y derivados, y, por tanto, en cuya función también
intervienen.

Un objeto más de la presente invención es proporcionar inhibidores que pueden ser introducidos en las células para unirse o interaccionar con las nuevas proteínas de unión de TRAF y sus posibles isoformas, los cuales inhibidores pueden actuar para inhibir la actividad asociada a la proteína TRAF en, por ejemplo, la activación del NF-\kappaB y por tanto, si se desea, inhibir la activación del NF-\kappaB; o que puede actuar para inhibir la actividad inhibidora asociada a TRAF (p. ej. TRAF3) en la activación del NF-\kappaB y por tanto, si se desea, potenciar la activación del NF-\kappaB.

Además, es un objeto de la presente invención usar las nuevas proteínas de unión de TRAF antes mencionadas, isoformas y análogos, fragmentos y derivados de las mismas, como antígenos para preparar anticuerpos policlonales y/o monoclonales contra las mismas. Los anticuerpos, a su vez, pueden usarse, por ejemplo, para la purificación de las nuevas proteínas a partir de diferentes fuentes tales como extractos celulares o líneas de células transformadas.

Además, estos anticuerpos pueden usarse para fines de diagnóstico, p. ej. para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anómalo de efectos celulares mediados directamente por proteínas TRAF o mediados por el receptor p55 de TNF, receptor FAS/APO1 u otros receptores relacionados y sus proteínas celulares asociadas (p. ej. MORT-1, TRADD, RIP), que actúan directa o indirectamente para modular/mediar procesos intracelulares mediante la interacción con proteínas TRAF.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden las anteriores nuevas proteínas TRAF, isoformas o análogos, fragmentos o derivados de las mismas, así como composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anteriormente indicados.

De acuerdo con la presente invención, se han aislado varias proteínas de unión de TRAF nuevas, en particular proteínas de unión de TRAF-2. Estas proteínas de unión de TRAF-2 tienen alta especificidad de unión a TRAF2 (véanse los Ejemplos más adelante) y por tanto son moduladores o mediadores de la actividad intracelular de TRAF2. El TRAF2 está implicado en la modulación o mediación de al menos una ruta de señalización intracelular, siendo la ruta relacionada con la supervivencia o viabilidad celular en la que TRAF 2 está directamente implicado en la activación del NF-\kappaB la que juega un papel central en la supervivencia de la célula. De hecho, una de estas nuevas proteínas, llamadas NIK (de "NF-\kappaB inducing kinase": cinasa de inducción del NF-\kappaB) se une a TRAF2 y estimula la actividad del NF-\kappaB. La NIK es una cinasa que comparte similitud de secuencia con varias cinasas MAPKK (véase más adelante). Además, al ser capaz el TRAF2 de interacción directamente o indirectamente con el receptor p55 de TNF antes mencionado, receptor p75 de TNF, receptores FAS/APO1 y sus proteínas asociadas MORT-1, TRADD y RIP, también es un mediador o modulador de la actividad de inducción o activación del NF-\kappaB atribuida a estos receptores. TRAF2 es por tanto un modulador/mediador de las rutas de supervivencia de la célula (en oposición a las rutas de muerte celular) mediado por estos receptores y sus proteínas asociadas y como tal la cuantía de la interacción entre estos receptores y/o proteínas con TRAF2 es un factor importante en el resultado de la actividad de estos receptores (una vez activados por sus ligandos), es decir, si las células sobrevivirán o morirán. En consecuencia, las proteínas de la presente invención, por ejemplo NIK, desempeñan un papel clave en esta interacción entre TRAF2 y las otras proteínas/receptores con las que interacciona TRAF2, ya que proteínas tales como NIK, uniéndose específicamente a TRAF2, modularán su actividad y/o tendrán su actividad modulada por interacción con
TRAF2.

Las proteínas de unión de TRAF, tales como, por ejemplo, las proteínas de unión de TRAF2, incluyendo NIK, han sido aisladas y donadas usando el sistema de dos híbridos, parcialmente y totalmente secuenciado, y caracterizado, y como se detalla en el presente texto más adelante parecen ser proteínas de unión de TRAF2 altamente específicas, y por tanto moduladores/mediadores de TRAF2 específicos.

Como se usará a lo largo del presente texto, se entiende que la actividad de la proteína TRAF, por ejemplo la actividad de TRAF2, incluye su actividad en la modulación/mediación en la ruta de supervivencia de las células, especialmente en lo que concierne a la inducción/activación del NF-\kappaB. Del mismo modo, como se usa en el presente texto, se entiende que la actividad de la proteína de unión de TRAF, en particular proteína de unión de TRAF2, incluye su modulación/mediación de la actividad de TRAF, en particular de TRAF2, en virtud de su unión específica con proteínas TRAF, especialmente TRAF2, esta modulación/mediación, incluyendo la modulación/mediación de rutas de supervivencia de las células, en particular las relativas a la activación/inducción del NF-\kappaB en la que las proteínas TRAF, especialmente TRAF2, están implicadas directamente o indirectamente y como tal la proteína de unión de TRAF o TRAF2 pueden ser consideradas como moduladores/mediadores indirectos de todas las proteínas anteriormente mencionadas y posiblemente cierto número de otras que intervienen en la supervivencia de las células, especialmente la activación/inducción del NF/\kappaB y a las que se une TRAF2 (u otras proteínas TRAF), o con las que interacciona TRAF2 (u otras proteínas TRAF) de una manera directa o indirecta.

En consecuencia, la presente invención proporciona secuencias de DNA como se definieron anteriormente que codifican una proteína capaz de unirse a una molécula asociada al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF).

En otro aspecto, la invención proporciona proteínas o polipéptidos codificados por las secuencias de DNA codificadoras anteriormente señaladas de la invención, las isoformas, los análogos, fragmentos y derivados de dichas proteínas y polipéptidos, siempre y cuando sean capaces de unirse a TRAF2 al menos a los aminoácidos 222-501 secuenciados de TRAF2. Las realizaciones de estas proteínas/polipéptidos, y sus isoformas, análogos, fragmentos y derivados de acuerdo con la presente invención incluyen:

(a) una proteína que es la proteína codificada por el clon designado 10 en el presente texto, que comprende la secuencia de nucleótidos representada en la Fig. 4;

(b) una proteína, isoformas, fragmentos, análogos y derivados de la misma, siendo la proteína NIK, isoformas, fragmentos, análogos y derivados de la misma codificada por las secuencias de DNA antes señalada que codifican dicha proteína NIK, isoformas, fragmentos, análogos y derivados de la misma; y

(c) una proteína NIK, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de la misma, siendo la proteína NIK, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de la misma codificada por las secuencias de DNA anteriormente indicadas que codifican dicha proteína NIK, isoformas, análogos, fragmentos y derivados, en donde dichas proteína, isoformas, fragmentos y derivados tienen la secuencia de aminoácidos representada en la Fig. 6.

En otro aspecto más, la invención proporciona un vector que comprende cualquiera de las anteriores secuencias de DNA de acuerdo con la invención que son capaces de ser expresadas en células hospedadoras elegidas entre células procariotas y eucariotas; y las células procariotas y eucariotas transformadas que contienen dicho vector.

La invención proporciona también un método para producir una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado codificados por cualquiera de las anteriores secuencias de DNA de acuerdo con la invención, que comprende desarrollar las células hospedadoras anteriormente mencionadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, isoformas, análogos, fragmentos o derivados, efectuar modificación post-traduccional, según sea necesario, para obtener dicha proteína, isoformas, análogos, fragmentos o derivados y aislar dicha proteína expresada, isoformas, análogos, fragmentos o derivados.

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos activos o derivados de los mismos, específicos para las anteriores proteínas de unión de TRAF, análogos, isoformas, fragmentos o derivados de las mismas, o específicos para la proteína NIK, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma señalados anteriormente.

En un aspecto diferente, la presente invención proporciona los siguientes métodos de cribado:

(i) Un método para el cribado de un ligando capaz de unirse a una proteína de acuerdo con la presente invención, como se señalo antes, incluyendo isoformas, análogos, fragmentos o derivados de la misma, que comprende poner en contacto una matriz de cromatografía de afinidad a la que se une dicha proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, con un extracto celular, con lo que el ligando se une a dicha matriz, y eluir, aislar y analizar dicho
ligando.

(ii) Un método para el cribado de una secuencia de DNA que codifica un ligando capaz de unirse a una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma, de acuerdo con la presente invención como se señalo antes, que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el que una secuencia que codifica dicha proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma es portada por un vector híbrido, y secuencias de una genoteca de cDNA o de DNA genómico son portadas por el segundo vector híbrido, transformar células hospedadoras de levadura con dichos vectores, aislar las células transformadas positivamente y extraer dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica dicho ligando.

Del mismo modo, también se proporciona un método para aislar e identificar proteínas, isoformas, análogos, fragmentos de acuerdo con la presente invención señalados anteriormente, capaces de unirse directamente a TRAF2, que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el que una secuencia que codifica dicho TRAF2 es portada por un vector híbrido y la secuencia de una genoteca de cDNA o de DNA genómico es portada por el segundo vector híbrido, siendo usados los vectores para transformar células hospedadoras de levadura y siendo aisladas las células transformadas positivas, seguido por la extracción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicho TRAF2.

En otro aspecto más de la presente invención se proporciona el uso de los compuestos descritos anteriormente para la modulación o la mediación en células de la actividad del NF-\kappaB o cualquier otra actividad de señalización intracelular modulada o mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las que se une una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma de la invención, como se señaló anteriormente.

Las realizaciones de este uso anterior para la modulación/mediación en células de la actividad del NF-\kappaB o cualquier otra actividad de señalización intracelular modulada o mediada por TRAF2 u otras moléculas incluyen:

(i) Un uso como anteriormente, en el que dicho uso comprende introducir en células una secuencia de DNA que codifica dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado en forma de un vector adecuado que lleva dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de realizar la inserción de dicha secuencia en dichas células de una manera que dicha secuencia es expresada en dichas células.

(ii) Un uso como anteriormente en el que dicho uso es la transfección de células con un vector de un virus animal recombinante, que comprende las etapas de:

(a): construir un vector de virus animal recombinante que lleva una secuencia que codifica una proteína de superficie viral (ligando) que es capaz de unirse a un receptor de la superficie celular específico en la superficie de dichas células a tratar, y una segunda secuencia que codifica una proteína elegida entre dicha proteína, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de acuerdo con la presente invención, que cuando se expresa en dichas células es capaz de modular/mediar la actividad del NF-\kappaB y cualquier otra actividad de señalización intracelular modulada/mediada por TRAF2 u otra de dichas moléculas; y

(b): infectar dichas células con dicho vector de (a).

Del mismo modo, la presente invención proporciona también un uso para modular el efecto modulado/mediado por TRAF2 en células, que comprende tratar células con los anticuerpos o fragmentos o derivados activos de los mismos, de acuerdo con la presente invención como se señaló anteriormente, siendo dicho tratamiento por aplicación de una composición adecuada que contiene dichos anticuerpos, fragmentos o derivados activos de los mismos, a dichas células, en donde cuando la proteína de unión de TRAF-2 o porciones de la misma de dichas células son expuestas en la superficie extracelular, dicha composición se formula para aplicación extracelular, y cuando dichas proteínas de unión de TRAF-2 son intracelulares dicha composición se formula para aplicación intracelular.

Otros usos de la presente invención para modular el efecto modulado/mediado por TRAF-2 en células incluye:

(i) Un uso que comprende tratar células con una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido para al menos parte de la secuencia de DNA que codifica una proteína de unión de TRAF-2, siendo esta secuencia de DNA cualquiera de las anteriormente mencionadas de la invención, siendo capaz dicha secuencia de oligonucleótidos de bloquear la expresión de la proteína de unión de TRAF-2.

(ii) Un uso como en (i) anterior en el que dicha secuencia de oligonucleótidos se introduce en dichas células por medio de un virus recombinante como se señalo anteriormente, en donde dicha segunda secuencia de dicho virus codifica dicha secuencia de oligonucleótidos.

(iii) Un uso que comprende aplicar el procedimiento de la ribozima en el que un vector que codifica una secuencia de ribozima capaz de interaccionar con una secuencia de mRNA celular que codifica una proteína de unión de TRAF-2, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la invención señalada anteriormente, es introducido en dichas células en una forma que permite la expresión de dicha secuencia de ribozima en dichas células, y en donde cuando dicha secuencia de ribozima se expresa en dichas células interacciona con dicha secuencia de mRNA celular y segmenta dicha secuencia de mRNA lo que tiene por resultado la inhibición de la expresión de dicha proteína de unión de TRAF-2 en dichas células.

Ha de observarse que para todos los usos de la invención anteriores la proteína de la invención, como se ha indicado, puede ser específicamente NIK o al menos una de las isoformas de NIK, análogos, fragmentos y derivados de la misma.

En los anteriores usos y realizaciones de la invención se incluye también un uso para la prevención o el tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción del NF-\kappaB o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las que se une una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica para la modulación del efecto modulado/mediado por TRAF2 en células, que comprende como ingrediente activo al menos una de las proteínas de unión de TRAF-2, de acuerdo con la invención, sus fragmentos biológicamente activos, análogos, derivados o mezclas de los mismos.

Otras composiciones farmacéuticas o realizaciones de las mismas de acuerdo con la invención incluyen:

(i) Una composición farmacéutica para modular el efecto modulado/mediado por TRAF2 en células, que comprende como ingrediente activo un vector de virus animal recombinante que codifica una proteína capaz de unir un receptor de la superficie celular y que codifica al menos una proteína de unión de TRAF2, isoforma, fragmentos activos o análogos, de acuerdo con la invención.

(ii) Una composición farmacéutica para modular el efecto modulado/mediado por TRAF2 en células, que comprende como ingrediente activo una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de mRNA de la proteína de unión de TRAF2 de acuerdo con la invención.

Otra realización de la anterior composición farmacéutica es específicamente una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción del NF-\kappaB o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las que se une una proteína, análogo, isoforma, fragmento o derivado de acuerdo con la invención, comprendiendo ficha composición una cantidad efectiva de una proteína, análogo, isoforma, fragmento o derivado de acuerdo con la invención o una molécula de DNA que la codifica, o cualquier otra molécula a la que se une dicha proteína, análogo, isoforma, fragmento o derivado. En otra realización específica más, dicha composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de la proteína codificada por el clon 10 que comprende la secuencia de nucleótidos representada en la Fig. 4 NIK, una isoforma, análogo, derivado o fragmento de NIK, o una molécula de DNA que la codifica.

Una condición conocida asociada con la inducción del NF-\kappaB (anormal) es el SIDA, otras son p. ej. enfermedades autoinmunitarias así como tumores.

Otros aspectos y realizaciones de la invención son:

(i) Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada/mediada por TRAF2, que comprende:

a): cribar en busca de un ligando capaz de unirse a un polipéptido que comprende al menos una porción de TRAF2 que tiene los restos de aminoácidos 221-501 de TRAF2;

b): identificar y caracterizar un ligando distinto de TRAF2 o porciones de un receptor de la familia de receptores de TNF/NGF, que en dicha etapa de cribado se encuentra que es capaz de dicha unión; y

c): producir dicho ligando en forma sustancialmente aislada y purificada.

(ii) Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada/mediada por una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, de acuerdo con la invención, que comprende:

a): cribar en busca de un ligando capaz de unirse a un polipéptido que comprende al menos una porción de la secuencia de NIK representada en la Fig. 6;

c): producir dicho ligando en forma sustancialmente aislada y purificada.

(iii) Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada/mediada por NIK, que comprende:

c): producir dicho ligando en forma sustancialmente aislada y purificada.

Se proporcionan también otros aspectos y realizaciones de la presente invención que se plantean de la siguiente descripción detallada de la invención.

Ha de observarse que, cuando se usan a lo largo de este texto, se entiende que las expresiones "modulación/media- ción del efecto de TRAF (o TRAF2) en las células" y cualquier otra de tal "modulación/mediación" mencionada en la memoria abarcan el tratamiento tanto in vitro como in vivo y, además, abarca también la inhibición o la potenciación/aumento.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra una ilustración en diagrama de la estructura de la molécula de TRAF2.

La Fig. 2a-b muestra diagramas esquemáticos que ilustran algunas de las proteínas implicadas en la activación del NF-\kappaB, incluyendo las nuevas proteínas de unión de TRAF2 de la presente invención (p. ej. NIK), en los que (a) es un esquema parcial y (b) es un esquema más completo;

Las Figs. 3a-b muestran la secuencia de nucleótidos del extremo 5' del clon 9 (a) y la secuencia de aminoácidos deducida codificada por la misma (b);

La Fig. 4 muestra la secuencia de nucleótidos del clon 10;

Las Figs. 5a-b muestran la secuencia de nucleótidos del clon 15 (a) y la secuencia de aminoácidos deducida codificada por la misma (b);

La Fig. 6 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de NIK;

La Fig. 7 muestra un alineamiento de la secuencia de la proteína NIK con la secuencia de la proteína cinasa de ratón mMEKK (MAPK de ratón o cinasa cinasa ERK) y cierto número de otras cinasas. Están marcadas las regiones correspondientes a los motivos conservados I a XI en las proteína cinasas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de DNA que codifican proteínas capaces de unirse a una molécula de factor asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF), y a las proteínas codificadas por las mismas.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a secuencias de cDNA designadas en el presente texto clon 10 (representada en la Fig 4) que codifica una proteína capaz de unirse a TRAF2, y a la proteína codificada por esta secuencia de DNA.

En otra realización preferida, la invención se refiere a la secuencia de DNA que codifica la proteína NIK, y a la propia proteína NIK, como se caracterizó anteriormente.

Las secuencias de DNA y las de aminoácidos deducidas mencionadas anteriormente representan nuevas secuencias; no aparecen en los bancos de datos "GENE-BANK" ni "PROTEIN BANK" de secuencias de DNA o aminoácidos.

Dentro del alcance de la presente invención están también fragmentos de las secuencias de DNA anteriormente mencionadas y secuencias de DNA capaces de hibridarse con esas secuencias o parte de ellas, bajo condiciones moderadamente rigurosas, siempre y cuando codifiquen una proteína o un polipéptido biológicamente activos capaces de unirse a al menos la secuencia de los aminoácidos 222 a 501 de TRAF2.

La presente invención concierne también a una secuencia de DNA que está degenerada como resultado del código genético a las secuencias de DNA anteriormente mencionadas y que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activos capaces de unirse a al menos la secuencia de los aminoácidos 222 a 501 de TRAF2.

En cuanto a TRAF2, debe observarse que varios miembros de la familia de receptores TNF/NGF activan el factor de transcripción NF-\kappaB por asociación directa o indirecta con TRAF2, que es por tanto una proteína adaptadora para estos receptores y puede por tanto ser considerada también como modulador/mediador de la inducción de la actividad de activación del NF-\kappaB de estos receptores TNF/NGF (véase el esquema de la Fig. 2b). Otro receptor, el receptor de IL-1, activa el NF-\kappaB independientemente de TRAF2. Una de las realizaciones de una proteína de unión de TRAF2 preferida de acuerdo con la presente invención es la proteína NIK, que une NIK de una manera muy específica y estimula la actividad del NF-\kappaB. NIK es una cinasa de serina/treonina que tiene similitud de secuencia con varias MAPKK cinasas (véanse los Ejemplos más adelante). Los análogos o muteínas de NIK producidos de acuerdo con la presente invención (véanse los Ejemplos) que carecen de la actividad de cinasa de NIK no logran estimular la activación del NF-\kappaB, cuando estos análogos o muteínas se expresan en células. Además, tales análogos o muteínas de NIK cuando se expresan en células bloquean también la inducción del NF-\kappaB por el TNF así como por otros agentes inductores tales como la endotoxina bacteriana LPS, miristato acetato de forbol (un activador de la proteína cinasa C), y la proteína del HTLV-1 TAX. La inducción por TNF de la actividad del NF-\kappaB es por medio de cualquiera de los dos receptores de TNF (receptores de TNF p55 y p75) y por tanto parece que la muteína o análogos de NIK bloquean la inducción de la activación del NF-\kappaB por medio de estos receptores. Del mismo modo, el TNF y el ligando del receptor FAS/APO1, pueden también inducir la actividad del NF-\kappaB por medio de un receptor relacionado, el receptor FAS/APO1, cuya inducción es también bloqueada por muteínas/análogos de NIK. Además, los anteriores receptores tienen proteínas adaptadoras TRADD, RIP y MORT1, que pueden también inducir la actividad del NF-\kappaB, pero cuya inducción es también bloqueada por las muteínas/análogos de NIK. Además, tales muteínas/análogos de NIK bloquearon también la inducción del NF-\kappaB por IL-1 (que funciona por medio del receptor de IL-1). En consecuencia, resulta que NIK participa en una cascada de inducción del NF-\kappaB que es común a los receptores de la familia TNF/NGF y al receptor IL-1. NIK parece también actuar de una forma indirecta en la inducción de la activación del NF-\kappaB posiblemente potenciando la fosforilación de I-\kappaB directamente. Esto surge de las presentes observaciones de que los anteriores análogos/muteínas de NIK que carecen de actividad de cinasa (también llamados mutantes dominantes-negativos) cuando se expresan en células no efectuaron de modo alguno la activación inducida por TNF de la cinasa Jun, indicando que NIK actúa específicamente potenciando la fosforilación de I-\kappaB sin afectar a la cinasa MAP implicada en la fosforilación de Jun.

Así, la presente invención concierne a las secuencias de DNA que se describieron anteriormente que codifican proteínas de unión de TRAF biológicamente activas, p. ej proteínas de unión de TRAF2 tales como, por ejemplo, NIK, así como análogos, fragmentos y derivados de las mismas, y los análogos, fragmentos y derivados de las proteínas codificadas por ellas. La preparación de tales análogos, fragmentos y derivados es por procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989) en los que en las secuencias de codificación de DNA uno o más codones pueden ser borrados, añadidos o sustituidos por otros, para dar análogos codificados que tienen al menos un cambio de un resto de aminoácido con respecto a la proteína nativa u original. Son análogos aceptables aquellos que retienen al menos la capacidad de unión a TRAF2 con o sin mediación de cualquier otra actividad de unión o enzimática, p. ej. análogos que se unen a TRAF2 pero no señalan, es decir, no se unen a otra proteína secuencia abajo u otro factor, o no catalizan una reacción dependiente de señal. De tal manera pueden producirse análogos que tienen un llamado efecto dominante-negativo, es decir, un análogo que es defectuoso bien sea en la unión a TRAF2 o bien en la subsiguiente señalización después de tal unión, como se señaló anteriormente. Tales análogos pueden usarse, por ejemplo, para inhibir el CD40, p55 del TNF y p75 del TNF (FAS/APO1 y otros efectos receptores relacionados, así como se realiza mediado por varias proteínas asociadas a receptor (adaptadoras) como se señaló anteriormente, compitiendo con las proteínas de unión de TRAF2 naturales. Del mismo modo, pueden producirse los llamados análogos dominantes-positivos que servirían para potenciar el efecto de TRAF2. Estos tendrían las mismas o mejores propiedades de unión de TRAF2 y las mismas o mejores propiedades de señalización de las proteínas de unión de TRAF2 naturales. De forma análoga, pueden prepararse fragmentos biológicamente activos de los clones de la invención como se señaló antes con respecto a la preparación de los análogos. Fragmentos adecuados de las secuencias de DNA de la invención son aquellos que codifican una proteína o polipéptido que conserva la capacidad de unión de TRAF2 o que pueden mediar cualquier otra actividad de unión o enzimática como se señaló anteriormente. En consecuencia, pueden prepararse fragmentos de las proteínas codificadas de la invención que tienen un efecto dominante-negativo o un efecto dominante-positivo como se señaló anteriormente con respecto a los análogos. Del mismo modo, pueden prepararse derivados mediante modificaciones estándar de los grupos laterales de uno o más restos de aminoácido de las proteínas, sus análogos o fragmentos, o por conjugación de las proteínas, sus análogos o fragmentos, con otra molécula, p. ej. un anticuerpo, enzima, receptor, etc., como se conocen bien en la técnica.

De las anteriores secuencias de DNA de la invención que codifican una proteína de unión de TRAF (p. ej. proteína de unión de TRAF2, tal como, por ejemplo, NIK), isoforma, análogo, fragmento o derivado, se incluyen también, como realización de la invención, secuencias de DNA capaces de hibridarse con una secuencia de cDNA derivada de la región codificadora de una proteína de unión de TRAF original, en la que tal hibridación se realiza bajo condiciones moderadamente rigurosas, y cuyas secuencias de DNA hibridables codifican una proteína de unión de TRAF biológicamente activa. Estas secuencias de DNA hibridables, por tanto, incluyen secuencias de DNA que tienen una homología relativamente elevada con la secuencia de cDNA de las proteínas de unión de TRAF originales (p. ej. secuencia de cDNA de la proteína de unión de TRAF2, tal como, por ejemplo, la secuencia de cDNA de NIK) y como tales representan secuencias similares a la proteína de unión de TRAF que pueden ser, por ejemplo, secuencias derivadas de forma natural que codifican las diversas isoformas de la proteína de unión de TRAF, o secuencias de origen natural que codifican proteínas pertenecientes a un grupo de secuencias tipo proteína de unión de TRAF2 que codifican una proteína que tiene la actividad de proteínas de unión de TRAF2 (p. ej. proteínas de unión de TRAF2, tales como, por ejemplo, NIK). Además, estas secuencias pueden también, por ejemplo, incluir secuencias que no son de origen natural, producidas por síntesis, que son similares a la secuencia de cDNA de la proteína de unión de TRAF original, pero incorporan cierto número de modificaciones deseadas. Tales secuencias sintéticas, por consiguiente, incluyen todas las posibles secuencias que codifican análogos, fragmentos y derivados de proteínas de unión de TRAF (p. ej. proteínas de unión de TRAF-2, tales como p. ej. NIK), todas las cuales tienen la actividad de proteínas de unión de TRAF.

Para obtener las diversas secuencias similares a las de proteína de unión de TRAF de origen natural indicadas anteriormente, pueden emplearse procedimientos estándar de cribado y aislamiento de muestras de DNA o RNA derivado naturalmente a partir de varios tejidos, usando el cDNA de proteína de unión de TRAF natural o una porción del mismo como sonda (véanse, por ejemplo, los procedimientos estándar expuestos en Sambrook et al., 1989).

Del mismo modo, para preparar las anteriormente indicadas diversas secuencias sintéticas similares a proteína de unión de TRAF que codifican análogos, fragmentos o derivados de proteínas de unión de TRAF (p. ej. proteínas de unión de TRAF2, tales como, por ejemplo, NIK), pueden usarse cierto número de procedimientos estándar como se detalla más adelante en el presente texto concerniente a la preparación de tales análogos, fragmentos y derivados.

Un polipéptido o proteína "que corresponde sustancialmente" a la proteína de unión de TRAF incluye no sólo la proteína de unión de TRAF sino también proteínas y polipéptidos que son análogos de la proteína de unión con TRAF.

Los análogos que corresponden sustancialmente a la proteína de unión con TRAF son aquellos polipéptidos en los que uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión con TRAF han sido reemplazados con otro aminoácido, borrados y/o insertados, con la condición de que la proteína resultante muestre sustancialmente la misma actividad biológica, o más elevada, que la proteína de unión de TRAF a la que corresponde.

Para que correspondan sustancialmente a la proteína de unión de TRAF, los cambios en la secuencia de las proteínas de unión de TRAF, tales como las isoformas, son generalmente relativamente minoritarios. Aunque el número de cambios puede ser más de diez, preferentemente no hay más de diez cambios, preferentemente no más de cinco, y lo más preferentemente no más de tres de tales cambios. Aunque puede usarse cualquier técnica para encontrar proteínas potencialmente activas biológicamente que corresponden sustancialmente a las proteínas de unión de TRAF, una de estas técnicas es el uso de técnicas de mutagénesis convencionales en el DNA que codifica la proteína, con el resultado de unas pocas modificaciones. Las proteínas expresadas por tales clones pueden entonces ser sometidas a cribado en relación con su capacidad de unirse a proteínas TRAF (p. ej. TRAF2) y modular la actividad de la proteína TRAF (p. ej. TRAF2) en la modulación/mediación de las rutas intracelulares señaladas anteriormente.

Cambios "conservadores" son aquellos cambios que no cabría esperar que hiciesen cambiar la actividad de la proteína y normalmente son los primeros en ser cribados ya que no es de esperar que no cambien sustancialmente el tamaño, la carga o la configuración de la proteína, y por tanto no cabe esperar que cambien sus propiedades biológicas.

Las sustituciones conservadoras de las proteínas de unión de TRAF incluyen un análogo en el que al menos un resto de aminoácido en el polipéptido ha sido reemplazado conservadoramente por un aminoácido distinto. Tales sustituciones se hacen preferentemente de acuerdo con la siguiente lista, que se presenta en la Tabla IA, las cuales sustituciones pueden ser determinadas por experimentación rutinaria para proporcionar propiedades estructurales y funcionales modificadas de una molécula de polipéptido sintetizada, manteniendo al mismo tiempo la actividad biológica característica de la proteína de unión de TRAF.

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TABLA IA

Resto original	Sustitución de ejemplo

Ala	Gly; Ser
Arg	Lys
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asp
Gly	Ala; Pro
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln; Glu
Met	Leu; Tyr; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

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Alternativamente, otro grupo de sustituciones de la proteína de unión de TRAF son aquellas en las que al menos un resto de aminoácido en el polipéptido ha sido eliminado y se ha insertado un resto diferente en su lugar, de acuerdo con la siguiente Tabla IB. Los tipos de sustituciones que pueden hacerse en el polipéptido pueden basarse en el análisis de las frecuencias de cambios de aminoácidos entre una proteína homóloga de diferente especie, tales como las presentadas en la Tabla 1-2 de Schulz et al., G. E., Principies of Protein Structure Springer-Verlag, Nueva York, NY, 1798, y Figs. 3 a 9 de Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman and Co., San Francisco, CA 1983. Basándose en tal análisis, se definen en el presente texto sustituciones conservadoras alternativas como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes:

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TABLA IB

1.: Restos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly).

2.: Restos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln.

3.: Restos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys.

4.: Grandes restos alifáticos no polares: Met, Leu, Ile, Val (Cys).

5.: Grandes restos aromáticos: Phe, Tyr, Trp.

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Los anteriores tres restos de aminoácido entre paréntesis tienen papeles especiales en la arquitectura de las proteínas. Gly es el único resto que carece de cadenas laterales y por ello confiere flexibilidad a la cadena. Sin embargo, esto tiende a favorecer la formación de una estructura secundaria distinta de la helicoidal \alpha. Pro, a causa de su geometría inusual, constriñe estrechamente la cadena y tiende generalmente a favorecer estructuras similares a la vuelta \beta, aunque en algunos casos Cys es capaz de participar en la formación del enlace disulfuro, que es importante para el plegado de la proteína. Obsérvese que Schulz et al., supra, fusionan los Grupos 1 y 2, anteriormente. Obsérvese también que Tyr, a causa de su potencial de enlace de hidrógeno, tiene un significativo parentesco con Ser, y Thr, etc.

Las sustituciones conservadoras de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, p. ej., como se presentan anteriormente, son conocidas en la técnica y es de esperar que mantengan las propiedades biológicas y estructurales del polipéptido después de la sustitución del aminoácido. La mayoría de las deleciones y sustituciones de acuerdo con la presente invención son aquellas que no producen cambios radicales en las características de la molécula de proteína o polipéptido. Las "características" se definen de una forma no inclusiva para definir tanto los cambios en una estructura secundaria, p. ej. hélice \alpha o lámina \beta, como los cambios en la actividad biológica, p. ej. unión a proteínas TRAF y/o mediación del efecto de proteínas TRAF sobre la muerte celular.

Los ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que pueden usarse para obtener análogos de proteínas de unión de TRAF para ser usadas en la presente invención incluyen cualquier etapa de métodos conocidos, tales como se presentan en las Patentes de EE.UU. RE 33.653, 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, de Mark et al.; 5.116.943 de Koths et al., 4.965.195 de Namen et al.; 4.879.111 de Chong et al.; y 5.017.691 de Lee et al.; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la Patente de EE.UU. n° 4.904.584 (Shaw et al.).

Además de las sustituciones conservadoras discutidas anteriormente que no cambiarían significativamente la actividad de la proteína de unión de TRAF, se entiende que están dentro del alcance de la invención sustituciones conservadoras o bien cambios menos conservadores y más aleatorios, que conducen a un aumento de la actividad biológica de los análogos de las proteínas de unión de TRAF.

Cuando se ha de confirmar el efecto exacto de la sustitución o la deleción, un experto en la técnica apreciará que el efecto de la o las sustituciones, deleciones, etc., se evaluará por medio de ensayos rutinarios de unión y muerte celular. El cribado empleando tales pruebas estándar no supone una excesiva experimentación.

A nivel genético, estos análogos se preparan generalmente por mutagénesis de nucleótidos dirigida al sitio en el DNA que codifica la proteína de unión de TRAF, produciéndose así DNA que codifica el análogo, y a continuación sintetizando el DNA y expresando el polipéptido en un cultivo de células recombinantes. Los análogos muestran típicamente la misma o mayor actividad biológica cualitativa que la proteína de origen natural. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, Nueva York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

La preparación de una proteína de unión de TRAF de acuerdo con esto, o una secuencia de nucleótidos alternativa que codifica el mismo polipéptido pero que difiere de la secuencia natural debido a cambios permitidos por la degeneración conocida del código genético, puede conseguirse por medio de mutagénesis dirigida a un sitio del DNA que codifica un análogo preparado anteriormente o una versión nativa de una proteína de unión de TRAF. La mutagénesis específica de un sitio permite la producción de análogos mediante el uso de secuencias específicas de oligonucleótidos que codifican la secuencia de DNA de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de suficiente tamaño y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable a ambos lados del enlace de deleción que se atraviesa. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos de longitud, con aproximadamente 5 a 10 nucleótidos complementarios en cada lado de la secuencia que se altera. En general, la técnica de la mutagénesis específica de un sitio es bien conocida en este campo, como se ejemplifica mediante publicaciones tales como Adelman et al., DNA 2: 183 (1983), cuya descripción se incorpora al presente texto como referencia.

Como se apreciará, la técnica de la mutagénesis específica del sitio emplea típicamente un vector de fago que existe tanto en forma de hebra o cadena simple como de doble cadena. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida a un sitio incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo como se describe en Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), cuya descripción se incorpora al presente texto como referencia. Estos fagos son fácilmente disponibles en el mercado y su uso es generalmente bien conocido por los expertos en la técnica. Alternativamente, pueden emplearse vectores de plásmido que contienen un origen de replicación de fago de cadena simple (Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3, 1987) para obtener un DNA de cadena simple.

En general, la mutagénesis dirigida a un sitio de acuerdo con en el presente texto se realiza obteniendo primero un vector de cadena simple que incluye dentro de su secuencia una secuencia de DNA que codifica el polipéptido de interés. Se prepara sintéticamente un cebador de oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada mediante síntesis de DNA/oligonucleótidos automática. Este cebador se reasocia después con el vector que contiene la secuencia de proteína de cadena simple y se somete a enzimas de polimerización de DNA tales como el fragmento de Klenow I de polimerasa de E. coli, para completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. Así, una secuencia mutada y la segunda cadena lleva la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa después para transformar las células apropiadas, tal como células E. coli JM101, y se seleccionan los clones que incluyen vectores recombinantes que llevan la disposición de la secuencia mutada.

Una vez que se ha seleccionado tal clon, la secuencia mutada de proteína de unión de TRAF puede ser retirada y puesta en un vector apropiado, generalmente un vector de transferencia o expresión del tipo que puede emplearse para transfección de un hospedador apropiado.

En consecuencia, el gen o el ácido nucleico que codifica una proteína de unión de TRAF puede también ser detectado, obtenido y/o modificado, in vitro, in situ y/o in vivo, mediante el uso de técnicas conocidas de multiplicación o amplificación de DNA o RNA, tales como la PCR y la síntesis química de oligonucleótidos. La PCR permite la amplificación (aumento de su número) de secuencias de DNA específicas mediante reacciones repetidas de DNA polimerasa. Esta reacción puede usarse como sustitución de la clonación; todo lo que se requiere es el conocimiento de la secuencia de ácidos nucleicos. Para realizar la PCR, se diseñan cebadores que son complementarios a la secuencia de interés. Los cebadores son después generados mediante síntesis automática de DNA. Dado que pueden diseñarse cebadores para hibridarse con cualquier parte del gen, pueden crearse unas condiciones tales que pueden tolerarse desacuerdos en el emparejamiento de bases complementarias. La amplificación de estas regiones no coincidentes puede conducir a la síntesis de un producto mutagenizado, que tiene por resultado la generación de un péptido con nuevas propiedades (es decir, mutagénesis dirigida a un sitio). Véase también Ausubel, supra, cap. 16. También, acoplando la síntesis de DNA complementario (cDNA), usando transcriptasa inversa, con PCR, puede usarse RNA como material de partida para la síntesis del dominio extracelular de un receptor de prolactina sin clonación.

Además, pueden diseñarse cebadores de PCR para incorporar nuevos sitios de restricción u otras características tales como codones de terminación en los extremos del segmento génico a amplificar. Este emplazamiento de sitios de restricción en los extremos 5' y 3' de la secuencia génica amplificada permite que segmentos del gen que codifiquen la proteína de unión de TRAF o un fragmento de la misma sean diseñados a la medida para ligación de otras secuencias y/o sitios de clonación en vectores.

La PCR y otros métodos de amplificación de RNA y/o DNA son bien conocidos en la técnica y pueden usarse de acuerdo con la presente invención sin una experimentación excesiva, basándose en las enseñanzas y directrices presentadas en el presente texto. Los métodos conocidos de amplificación de DNA o RNA incluyen, pero sin limitarse a ellos, reacción en cadena de polimerasa (PCR) y procedimientos de amplificación relacionados (véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. números 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188 de Mullis et al., 4.795.699 y 4.921.794 de Tabor et al., 5.142.033 de Innis, 5.122.464 de Wilson et al., 5.091.310 de Innis; 5.066.584 de Gyllensten et al.; 4.889.818 de Gelfand et al.; 4.994.370 de Silver et al.; 4.766.067 de Biswas; 4.656.134 de Ringold; y en Innis et al., ed., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) y amplificación mediada por RNA que usa RNA antisentido respecto de la secuencia diana como molde para la síntesis de DNA de doble cadena (Patente de EE.UU. n° 5.130.238 de Malek et al., con el nombre comercial NASBA); e inmuno-PCR que combina el uso de la amplificación del DNA con el marcaje de anticuerpo (Ruzicka et al., Science 260: 487 (1993); Sano et al., Science 258: 120 (1992); Sano et al., Biotechniques 9: 1378 (1991)), patentes y referencia cuyo contenido completo se incorpora al presente texto como referencia.

De una manera análoga, fragmentos biológicamente activos de proteínas de unión de TRAF (p. ej. los de cualquiera de las proteínas de unión de TRAF2 tales como, por ejemplo, NIK) o sus isoformas) pueden ser preparados como se señaló antes con respecto a los análogos de las proteínas de unión de TRAF. Fragmentos adecuados de proteínas de unión de TRAF son aquellos que retienen la capacidad de proteína de unión de TRAF y que pueden mediar la actividad biológica de proteínas TRAF u otras proteínas asociadas con proteínas TRAF directa o indirectamente. En consecuencia, pueden prepararse fragmentos de proteína de unión de TRAF que tienen un efecto dominante-negativo o un efecto dominante-positivo, como se señalo antes con respecto a los análogos. Debe observarse que estos fragmentos representan una clase especial de análogos de la presente invención, es decir, hay porciones definidas de proteínas de unión de TRAF derivadas de la secuencia completa de la proteína de unión de TRAF (p. ej. de la de una cualquiera de las proteínas de unión de TRAF2, tales como, por ejemplo, NIK o sus isoformas), teniendo cada una de tales porciones o fragmentos cualquiera de las actividades deseadas anteriormente mencionadas. Tal fragmento puede ser, p. ej., un péptido.

Del mismo modo, pueden prepararse derivados mediante modificaciones estándar de los grupos laterales de uno o más restos de aminoácidos de la proteína de unión de TRAF, sus análogos o fragmentos, o por conjugación de la proteína de unión de TRAF, sus análogos o fragmentos, con otra molécula, p. ej. un anticuerpo, enzima, receptor, etc., como es bien conocido en la técnica. En consecuencia, "derivados", como se usa en el presente texto, cubre derivados que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que aparecen como cadenas laterales en los restos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la presente invención. Los derivados pueden tener restos químicos tales como restos carbohidrato o fosfato, siempre y cuando tal fracción tenga la misma actividad biológica o más alta que las proteínas de unión de TRAF.

Por ejemplo, los derivados pueden incluir ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acilo o grupos amino libres de los restos de aminoácido formados con restos acilo (p. ej. grupos alcanoílo o aroílo carbocíclico) o derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres (p. ej. los de los restos serilo o treonilo) formados con restos acilo.

Se entiende que el término "derivados" incluye solamente aquellos derivados que no cambian un aminoácido por otro de los veinte aminoácidos naturales que se presentan comúnmente.

Una proteína de unión de TRAF es una proteína o polipéptido, esto es, una secuencia de restos de aminoácido. Se entiende que un polipéptido que consiste en una secuencia más grande que incluye la secuencia completa de una proteína de unión de TRAF, de acuerdo con las definiciones del presente texto, está incluida en el alcance de tal polipéptido siempre y cuando las adiciones no afecten a las características básicas y nuevas de la presente invención, esto es, si conservan o bien si aumentan la actividad biológica de proteína de unión de TRAF o pueden ser segmentados para dejar una proteína o un polipéptido que tiene la actividad biológica de proteína de unión de TRAF. Así, por ejemplo, se entiende que la presente invención incluye proteínas de fusión de proteína de unión de TRAF con otros aminoácidos o péptidos.

Como se mencionó anteriormente, debe entenderse que las anteriores proteínas "de unión de TRAF" de la presente invención son cualquier proteína que pueda unirse a cualquier proteína TRAF y modular/mediar su actividad intracelularmente. Ejemplos particulares son las proteínas de unión de TRAF2 que pueden modular o mediar la actividad de señalización intracelular asociada con TRAF2, como se mencionó anteriormente, especialmente en lo que concierne a la implicación de TRAF2 en la inducción de la actividad del NF-\kappaB, en particular, después de la interacción entre TRAF2 y varios miembros de la familia de receptores TNF/NGF y/o sus proteínas adaptadoras asociadas, como se detalla anteriormente y más adelante. Un ejemplo específico de tales proteínas de unión de TRAF2 es la proteína NIK y sus diversos análogos, fragmentos, etc. (véanse los Ejemplos) que parece unirse a TRAF2 muy específicamente y tener una acción directa en la inducción de la actividad del NF-\kappaB, bloqueando esta actividad varios análogos/muteínas dominantes-negativos de NIK.

Todas la modificaciones anteriormente mencionadas están en el alcance de la presente invención siempre y cuando preserven la capacidad de las proteínas o polipéptidos codificados, o sus análogos y derivados, para unir al menos la secuencia de los aminoácidos 222 a 501 de TRAF2.

Todas las proteínas y polipéptidos de la presente invención, en virtud de su capacidad de unirse a TRAF2, se consideran mediadores o moduladores de la señalización de TRAF2. Como tales, dichas moléculas de la presente invención tienen un papel, por ejemplo, en el proceso de señalización en el que la unión de ligando TRAF2 a CD30, CD40, receptor de linfotoxina beta (LT-\beta), receptores de TNF p55 o p75, así como los otros receptores y proteínas adaptadoras señalados anteriormente en el presente texto, conduce a la activación del factor de transcripción NF-\kappaB. Particularmente interesante es la proteína NIK y una proteína NIK parcial, codificada por el clon 10 de la invención; un análisis de secuencia detallado de NIK y de esta proteína codificada por el clon 10 (originalmente llamada NMPI) reveló secuencias de aminoácidos codificadas que corresponden a I - XI motivos conservados característicos para las Ser/Thr- proteína cinasas, asignando así una función a esta proteína.

Las nuevas proteínas de clones, sus análogos, fragmentos y derivados, tienen cierto número de usos posibles, por ejemplo:

(i) Pueden usarse para imitar o potenciar la actividad de NF\kappaB, la función de TRAF2 y los receptores a los que se unen, en situaciones en las que se desea una función potenciada, tal como en aplicaciones antitumorales o inmuno-estimuladoras en las que se desean los efectos inducidos por TRAF2. En este caso las proteínas de la presente invención, sus análogos, fragmentos o derivados, que potencian los efectos de TRAF2 o receptores, pueden ser introducidas en las células por procedimientos estándar conocidos en sí. Por ejemplo, como las proteínas codificadas por los clones de DNA de la presente invención son intracelulares y deben ser introducidas solamente en las células en las que se desea el efecto de TRAF2, es necesario un sistema para la introducción específica de estas proteínas en las células. Una forma de hacer esto es creando un virus animal recombinante, p. ej. uno derivado de vaccinia, en cuyo DNA se introducirán los siguientes dos genes: el gen que codifica un ligando que se une a proteínas de la superficie celular específicamente expresadas por las células, p. ej. una tal como la proteína gp120 del virus del SIDA (VIH), que se une específicamente a algunas células (linfocitos CD4 y leucemias relacionadas) o cualquier otro ligando que se une específicamente a células que llevan un receptor que se une a TRAF2, de forma que el vector de virus recombinante sea capaz de unirse a tales células; y el gen que codifica las proteínas de la presente invención. Así, la expresión de la proteína de unión con la superficie celular en la superficie del virus dirigirá el virus específicamente a la célula tumoral u otra célula que lleve el receptor, después de lo cual las secuencias que codifican proteínas se introducirán en las células a través del virus, y una vez expresadas en las células el resultado será la potenciación del efecto del receptor o TRAF2, que conduce a un deseado efecto inmunoestimulador en estas células. La construcción de tal virus animal recombinante es por procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Otra posibilidad es introducir las secuencias de las proteínas codificadas en forma de oligonucleótidos que pueden ser absorbidos por las células y expresados en ellas.

(ii) Pueden ser usadas para inhibir la actividad del NF\kappaB, los efectos de TRAF2 o del receptor que se une a ellas, p. ej. en casos tales como los daños en tejidos como en el SIDA, choque séptico o rechazo del injerto contra el hospedador, en los que se desea bloquear la señalización intracelular inducida. En esta situación es posible, por ejemplo, introducir en las células, por procedimientos estándar, oligonucleótidos que tienen la secuencia de codificación antisentido para las proteínas de la invención, lo que bloquearía efectivamente la traducción de mRNAs que codifican las proteínas y bloqueando así su expresión, y conducen a la inhibición del efecto no deseado. Alternativamente, pueden usarse otros oligonucleótidos; los oligonucleótidos que preservaron su capacidad para unirse a TRAF2 de una manera que interfiere con la unión de otras moléculas con esta proteína, mientras que al mismo tiempo no median ninguna activación o modulación de esta molécula. Teniendo estas características, dichas moléculas pueden interrumpir la interacción de TRAF2 con su ligando natural, actuando para ello como inhibidores capaces de abolir los efectos mediados por TRAF2, tal como la activación del NF-\kappaB, por ejemplo. Tales oligonucleótidos pueden ser introducidos en las células usando el anterior método del virus recombinante, siendo la segunda secuencia llevada por el virus la secuencia de oligonucleótidos.

Otra posibilidad es usar anticuerpos específicos para las proteínas de la invención para inhibir su actividad de señalización intracelular.

Otra forma de inhibir el efecto no deseado es mediante el método de los ribozimas recientemente desarrollado. Los ribozimas son moléculas de RNA catalíticas que segmentan específicamente RNAs. Los ribozimas pueden construirse para que segmenten los RNAs diana que se elijan, p. ej. los mRNAs que codifican las proteínas de la presente invención. Tales ribozimas tendrían una secuencia específica para el mRNA de las proteínas y serían capaces de interaccionar con ellas (unión complementaria) seguido por la segmentación del mRNA, teniendo por resultado una disminución (o la pérdida completa) de la expresión de las proteínas, siendo el nivel de disminución de la expresión dependiente del nivel de la expresión del ribozima en la célula diana. Para introducir ribozimas en las células elegidas (p. ej. aquellas que llevan las proteínas de unión de TRAF2) puede usarse cualquier vector adecuado, p. ej. vectores de plásmido, virus animal (retrovirus), que se use normalmente para este fin (véase también el apartado (i) anterior, en el que el virus tiene, como segunda secuencia, un cDNA que codifica la secuencia del ribozima de elección). (Para revisiones, métodos, etc. relativos a ribozimas, véanse Chen et al., 1992; Zhao y Pick, 1993).

(iii) Pueden usarse para aislar, identificar y clonar otras proteínas que son capaces de unirse a ellas, p. ej. otras proteínas implicadas en el proceso de señalización intracelular que están corriente abajo de TRAF2. Por ejemplo, las secuencias de DNA que codifican las proteínas de la presente invención pueden usarse en el sistema de dos híbridos de levadura en el que las proteínas codificadas se usarán como "cebo" para aislar, clonar e identificar entre genotecas de cDNA o DNA genómico otras secuencias ("presas") que codifican proteínas que pueden unirse a las proteínas de clones. De la misma forma, también puede determinarse si las proteínas de la presente invención pueden unirse a otras proteínas celulares, p. ej. otros receptores de la superfamilia de receptores TNF/NGF.

(iv) Las proteínas codificadas, sus análogos, fragmentos o derivados pueden usarse también para aislar, identificar y donar otras proteínas de la misma clase, es decir, las que se unen a TRAF2 o a proteínas relacionadas funcionalmente, e implicadas en el proceso de señalización intracelular. En esta aplicación puede usarse el sistema de dos híbridos de levadura anteriormente señalado, o puede usarse un sistema recientemente desarrollado que emplea hibridación Southern no rigurosa seguida por clonación por PCR (Wilks et al., 1989).

(v) Otro método más para utilizar las proteínas codificadas de la presente invención, sus análogos, fragmentos o derivados, es usarlos en métodos de cromatografía de afinidad para aislar e identificar otras proteínas o factores a las que son capaces de unirse, p. ej. proteínas relacionadas con TRAF2 u otras proteínas o factores implicados en el proceso de señalización intracelular. En esta aplicación, las proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados de la presente invención, pueden ser unidas individualmente a matrices de cromatografía de afinidad y después ser puestas en contacto con extractos celulares o proteínas o factores aislados, sospechosos de estar implicados en el proceso de señalización intracelular. Después del procedimiento de cromatografía de afinidad, las otras proteínas o factores que se unen a las proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados de la presente invención, puede ser eluídas, aisladas y caracterizadas.

(vi) Como se señaló anteriormente, las proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados de la presente invención pueden usarse también como inmunógenos (antígenos) para producir anticuerpos específicos contra ellas. Estos anticuerpos pueden usarse con una finalidad de purificación de las proteínas de la presente invención, bien sea a partir de los extractos celulares o bien de líneas de células transformadas que producen dichas proteínas, sus análogos o sus fragmentos. Además, estos anticuerpos pueden usarse con fines de diagnóstico para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anormal del sistema receptor en el que funcionan, p. ej. efectos celulares inducidos por TARF2 superactivos o subactivos. Así, si tales trastornos estuviesen relacionados con un mal funcionamiento del sistema de señalización intracelular que implica a las proteínas de la presente invención, tales anticuerpos servirían de importante herramienta de diagnóstico. Se entiende que el término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) a anticuerpos que pueden ser marcados en forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y
F(ab')_{2} carentes del fragmento Fc de anticuerpo intacto, que son capaces de unirse al antígeno.

(vii) Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención, pueden ser usados para detectar cuantitativa o cualitativamente los clones de la invención en una muestra, o para detectar la presencia de células que expresan los clones de la presente invención. Esto puede realizarse por técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado fluorescentemente, acoplada con microscopía óptica, citometría de flujo o detección fluorométrica.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención pueden ser empleados histológicamente, como en microscopía de inmunofluorescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de los clones de la presente invención. La detección in situ puede realizarse tomando una muestra histológica de un paciente y proporcionando el anticuerpo marcado de la presente invención a tal muestra. El anticuerpo (o fragmento) se proporciona preferentemente aplicando o superponiendo el anticuerpo (o fragmento) marcado sobre una muestra biológica. Por medio del uso de tal procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de los clones sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, los profesionales con una experiencia normal en la técnica percibirán fácilmente que puede modificarse uno cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tal como los procedimientos de tinción) para conseguir tal detección in situ.

Tales ensayos para los clones de la presente invención comprenden típicamente incubar una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recientemente recolectadas tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo de tejidos, en presencia de un anticuerpo marcado detectablemente capaz de identificar las proteínas codificadas, y detectar el anticuerpo por cualquiera de las diversas técnicas bien conocidas en este campo.

(viii) Las proteínas codificadas de la presente invención pueden usarse también como moduladores indirectos de cierto número de otras proteínas en virtud de su capacidad de unión con otras proteínas intracelulares, las cuales otras proteínas intracelulares se unen directamente a otras proteínas intracelulares o a un dominio intracelular de una proteína transmembrana.

Con el fin de modular estas otras proteínas intracelulares o los dominios intracelulares de proteínas transmembrana, las proteínas de la presente invención pueden ser introducidas en las células de diversas formas como se menciona anteriormente en el presente texto en (ii).

Debe observarse también que el aislamiento, identificación y caracterización de las proteínas de la presente invención pueden realizarse usando cualquiera de los procedimientos de cribado estándar bien conocidos. Por ejemplo, uno de estos procedimientos de cribado, el procedimiento de los dos híbridos de levadura que fue usado para identificar las proteínas de la presente invención. Del mismo modo pueden usarse otros procedimientos tales como cromatografía de afinidad, procedimientos de hibridación de DNA, etc., que son bien conocidos en la técnica, para aislar, identificar y caracterizar las proteínas de la presente invención, o para aislar, identificar y caracterizar proteínas, factores, receptores, etc. adicionales que son capaces de unirse con las proteínas de la presente invención.

Además, las proteínas que se ha encontrado que se unen a las proteínas de la presente invención pueden emplearse ellas mismas, de una manera análoga a la forma en la que se usaron las proteínas de la presente invención como se señala anteriormente y más adelante, para aislar, identificar y caracterizar otras proteínas, factores, etc., que son capaces de unirse a las proteínas que se unen a las proteínas de la invención y que pueden representar factores implicados más adelante secuencia abajo en el proceso de señalización asociado, o que pueden tener actividades de señalización de ellos y que por tanto representarían proteínas implicadas en un proceso de señalización distinto.

Las secuencias de DNA y las proteínas codificadas de la presente invención pueden ser producidas por cualquier procedimiento estándar de DNA recombinante (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989) en el que células hospedadoras eucariotas o procariotas adecuadas son transformadas por vectores eucariotas o procariotas adecuados que contienen las secuencias que codifican las proteínas. En consecuencia, la presente invención concierne también a tales vectores de expresión y hospedadores transformados para la producción de las proteínas de la presente invención. Como se mencionó anteriormente, estas proteínas incluyen también sus análogos, fragmentos y derivados biológicamente activos, y así los vectores que los codifican incluyen también vectores que codifican análogos y fragmentos de estas proteínas, y los hospedadores transformados incluyen aquellos que producen tales análogos y fragmentos. Los derivados de estas proteínas son los derivados producidos por modificación estándar de las proteínas o sus análogos o fragmentos, producidos por los hospedadores transformados.

La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas para la modulación de los efectos mediados por TRAF2. Las composiciones farmacéuticas que comprenden, como ingrediente activo, uno cualquiera o más de lo siguiente: (i) una o más de las secuencias de DNA de la presente invención, o partes de las mismas, subclonadas en un vector de expresión apropiado; (ii) una proteína de acuerdo con la presente invención, sus fragmentos, análogos o derivados biológicamente activos, o una mezcla de los mismos; (iii) un vector de virus animal recombinante que codifica una proteína de acuerdo con la presente invención, sus fragmentos, análogos o derivados biológicamente activos.

Las composiciones farmacéuticas se aplican de acuerdo con la enfermedad a tratar y en cantidades beneficiosas para el paciente, que dependen del peso corporal y de otras consideraciones, que serán establecidas por el médico.

Como se señaló antes, una de las realizaciones específicas de las proteínas de unión de TRAF de la presente invención es la proteína de unión de TRAF2 NIK. Basándose en los hallazgos de acuerdo con la presente invención de que la NIK se une específicamente a TRAF2 y como tal es un mediador/modulador de TRAF2 y por tanto puede mediar o modular la actividad de TRAF2 en la activación del NF-\kappaB y por tanto su posible papel en las rutas de supervivencia de las células en formas que TRAF2 funciona independientemente o en unión con otras proteínas (p. ej. receptores p55 de TNF y p75 de TNF, receptor FAS/APO1, MORT-1, RIP y TRADD), es de importancia para diseñar fármacos que pueden potenciar o inhibir la interacción TRAF2-NIK, según se desee. Por ejemplo, cuando se desea aumentar la citotoxicidad celular inducida por el TNF, sería de desear inhibir la inducción del NF-\kappaB, inhibiendo la interacción TRAF2-NIK o inhibiendo TRAF2 y/o NIK específicamente. Del mismo modo, por ejemplo, cuando se desea inhibir la citotoxicidad celular inducida por el TNF, sería de desear potenciar la inducción del NF-\kappaB, potenciando la interacción TRAF2-NIK o potenciando la inducción del NF-\kappaB específica de TRAF2 y/o NIK. Hay muchas enfermedades en las que tales fármacos pueden ser de gran ayuda. Entre otras (véase también la discusión anterior) la hepatitis aguda en la que el daño agudo del hígado parece reflejar la muerte mediada por el receptor FAS/APO1 de las células hepáticas después de la inducción por el ligando Fas; muerte celular inducida por autoinmunidad, tal como la muerte de las células de Langerhans \beta del páncreas, que tiene por resultado la diabetes; la muerte de las células en el rechazo de injertos (p. ej. de riñón, corazón e hígado); la muerte de oligodendrocitos en el cerebro en la esclerosis múltiple; y el suicidio de las células T inhibido por SIDA que causa la proliferación del virus del SIDA y por tanto la enfermedad del SIDA.

En tales casos, sería de desear inhibir la ruta de la citotoxicidad (apoptosis) mediada por el receptor FAS/APO1 y potenciar la inducción del NF-\kappaB mediada por el receptor FAS/APO1 a través de TRAF2 y la interacción TRAF2-NIK. Una forma de hacer esto sería aumentar la cantidad de NIK en las células o aumentar la cantidad de TRAF2 y NIK, de forma que la inducción mediada por NIK o TRAF2-NIK de la activación del NF-\kappaB aumentará proporcionando niveles más altos de activación del NF-\kappaB y por tanto de supervivencia celular; o de forma que la interacción directa o indirecta entre receptor FAS/APO1 y TRAF2 (o TRAF2-NIK) aumentará con el resultado de una disminución de las interacciones del receptor FAS/APO1 con los mediadores citotóxicos de la célula (p. ej. MACH, véase el esquema en Fig. 2b) para proporcionar un aumento en la inducción de la activación del NF-\kappaB y la supervivencia de las células.

Por el contrario, en el caso, por ejemplo, de tumores y células infectadas (véase también la discusión anterior), se desearía aumentar la citotoxicidad celular mediada por el receptor FAS/APO1 para provocar el aumento de la muerte celular. En este caso sería de desear inhibir las interacciones receptor FAS/APO 1 -TRAF2 (o -TRAF2-NIK) y/o inhibir NIK directamente, y de este modo reducir la inducción de la actividad del NF-\kappaB.

Es posible que NIK o una o más de sus posibles isoformas, análogos o fragmentos pueda servir como inhibidores "naturales" de la propia NIK o de la interacción NIK-TRAF2, y como tal servir de inhibidores de la inducción de la activación del NF-\kappaB. Tales inhibidores pueden emplearse entonces como los inhibidores específicos señalados anteriormente, por ejemplo, los inhibidores a usar cuando se desea aumentar los efectos de la citotoxicidad celular del TNF o el ligando del receptor FAS/APO1 con el fin de aumentar la muerte celular. De hecho, como se ejemplifica más adelante en el presente texto, se han aislado varios análogos y muteínas de NIK de acuerdo con la presente invención que son análogos/muteínas cinasa-deficientes y que son capaces de bloquear la inducción de la activación del NF-\kappaB mediada por los receptores de TNF, el receptor FAS/APO1, sus proteínas asociadas TRADD, RIP y MORT1; así como mediadas por el receptor de IL-1 (cuya activación es a través de NIK pero independiente de TRAF2); así como mediadas por la endotoxina bacteriana (LPS), acetato miristato de forbol y la proteína del HTLV-1 TAX. Del mismo modo, también pueden cribarse otras sustancias tales como péptidos, compuestos orgánicos, anticuerpos, etc., para obtener fármacos específicos que son capaces de inhibir la interacción TRAF2-NIK o la actividad de NIK.

De manera similar, cuando se desea aumentar la activación del NF-\kappaB en varias situaciones como se señaló anteriormente, es posible, por ejemplo, aumentar la cantidad de NIK y/o TRAF2 en las células por varios métodos estándar señalados anteriormente en el presente texto (p. ej. introduciendo en las células DNA que codifica NIK y/o TRAF2 para inducir el aumento de la expresión, o preparar formulaciones adecuadas que contienen NIK y/o TRAF2 para la introducción directa en las células, o cualquier otra forma conocida por los expertos en la técnica). Del mismo modo, también pueden cribarse otras sustancias tales como péptidos, compuestos orgánicos, etc., para obtener fármacos específicos que son capaces de potenciar la actividad de NIK o de potenciar la interacción TRAF2-NIK.

Un ejemplo no limitante de cómo los inhibidores de péptido de la interacción de NIK-TRAF2 serían diseñados y cribados se basa en estudios previos de inhibidores de péptido de proteasas ICE o similares a ICE, la especificidad del sustrato de ICE y estrategias para el análisis de epítopos usando síntesis de péptidos. Se encontró que el requerimiento mínimo para la segmentación eficiente de un péptido por ICE implica cuatro aminoácidos a la izquierda del sitio de segmentación con una fuerte preferencia por el ácido aspártico en la posición P_{1} y siendo suficiente metilamina a la derecha de la posición P_{1} (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). Además, el péptido sustrato fluorogénico (un tetrapéptido), acetil-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metil-cumaril-7-amida), abreviado Ac-DEVD-AMC, corresponde a una secuencia en poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) que se ha encontrado que es segmentada en las células poco después de la estimulación de FAS-R, así como otros procesos apoptópicos (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994), y es segmentado efectivamente por las proteasas CPP32 (un miembro de la familia de proteasas CED3/ICE) y MACH.

Como Asp en la posición P_{1} del sustrato parece ser importante, los tetrapéptidos que tienen Asp como cuarto resto de aminoácido y varias combinaciones de aminoácidos en las tres primeras posiciones de restos, pueden ser cribados rápidamente en cuanto a la unión al sitio activo de las proteasas usando, por ejemplo, el método desarrollado por Geysen (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987) en el que un gran número de péptidos en soportes sólidos fueron cribados en relación con interacciones específicas con anticuerpos. La unión de proteasas MACH a péptidos específicos puede ser detectada por una diversidad de métodos de detección bien conocidos, dentro de los conocimientos de un experto en la técnica, tales como radiomarcaje, etc. Se demostró que este método de Geysen es capaz de analizar al menos 4000 péptidos en un día de trabajo.

De una forma similar puede ser aclarada la región de unión exacta o región de homología que determina la interacción entre TRAF2 y NIK (o cualquier otra proteína TRAF y proteína de unión de TRAF) y entonces pueden cribarse péptidos que pueden servir para bloquear esta interacción, p. ej. péptidos sintetizados que tienen una secuencia similar a la de la región de unión o complementaria a la misma que pueden competir con NIK natural (o proteína de unión de TRAF) por la unión a TRAF2 (o TRAF).

Dado que puede ser ventajoso diseñar inhibidores de péptido que inhiban selectivamente interacciones TRAF2-NIK (o TRAF-proteína de unión de TRAF) sin interferir con procesos fisiológicos de muerte celular en los que están implicados otros miembros de la ruta de señalización intracelular, p. ej. proteasas MACH de la ruta de muerte celular, que son miembros de la familia de proteasas CED3/ICE, la agrupación de péptidos que se unen a TRAF2 (o TRAF) o NIK (o proteínas de unión de TRAF) en un ensayo tal como el descrito anteriormente, puede ser sintetizada además como un péptido sustrato fluorogénico para ensayar la unión selectiva a tales otras proteínas para seleccionar solamente las específicas para TRAF2/NIK (o TRAF/proteína de unión de TRAF). Los péptidos que se determina que son específicos, por ejemplo, para TRAF2/NIK, pueden entonces ser modificados para potenciar la permeabilidad celular e inhibir la actividad de TRAF2 y/o NIK, bien sea reversiblemente o bien irreversiblemente. Thornberry et al (1994) publicaron que un tetrapéptido (aciloxi) metil cetona Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH_{2}OC (O)-[2,6-(CF_{3})_{2}]Ph era un potente desactivador de ICE. Del mismo modo, Milligan et al. (1995) publicaron que inhibidores de tetrapéptido que tienen una clorometilcetona (irreversiblemente) o grupos aldehído (reversiblemente) inhibían ICE. Además, se demostró que un benciloxicarboxil-Asp-CH_{2}OC(O)-2,6-diclorobenceno (DCB) inhibía ICE (Mashima et al., 1995). En consecuencia, de una forma análoga, los tetrapéptidos que se unen selectivamente, por ejemplo, a TRAF2 o NIK, pueden ser modificados, por ejemplo, con un grupo aldehído, clorometilcetona, (aciloxi) metil cetona o un grupo CH_{2}OC (O)-DCB para crear un inhibidor de péptido de la actividad de TRAF2/NIK. Además, para mejorar la permeabilidad, los péptidos pueden ser, por ejemplo, modificados químicamente o derivatizados para mejorar su permeabilidad a través de la membrana celular y facilitar el transporte de tales péptidos a través de la membrana y al citoplasma. Muranishi et al. (1991) publicaron la derivatización de hormona liberadora de tiropropina con ácido láurico para formar un derivado lauroílo lipófilo con buenas características de penetración a través de las membranas de la célula. Zacharia et al. (1991) publicaron también la oxidación de metionina para dar sulfóxido y la sustitución del enlace peptídico con su isoéster cetometileno (COCH_{2}) para facilitar el transporte de péptidos a través de la membrana celular. Estas son solo algunas de las modificaciones y derivados conocidos que están dentro de la experiencia de los profesionales de la
técnica.

Además, el fármaco o inhibidores de péptido, que son capaces de inhibir la actividad, por ejemplo, de NIK inhibiendo la interacción NIK-TRAF2 y de forma similar, la interacción entre proteínas TRAF y proteínas de unión de TRAF, pueden conjugarse o complejarse con moléculas que facilitan la entrada en la célula.

La Patente de EE.UU. n° 5.149.782 describe conjugar una molécula que se ha de transportar a través de la membrana celular con un agente de mezclado de la membrana tal como polipéptidos fusogénicos, polipéptidos de formación de canales iónicos, otros polipéptidos de la membrana y ácidos grasos de cadena larga, p. ej. ácido mirístico, ácido palmítico. Estos agentes de mezclado de la membrana introducen los conjugados moleculares en la bicapa lipídica de las membranas celulares y facilitan su entrada en el citoplasma.

Low et al., Patente de EE.UU n° 5.108.921, revisa los métodos disponibles para el suministro transmembrana de moléculas tales como, pero sin limitarse a ellas, proteínas y ácidos nucleicos, por el mecanismo de la actividad endocitótica mediada por receptor. Estos sistemas de receptor incluyen los que reconocen galactosa, manosa, manosa 6-fosfato, transferrina, asialoglicoproteína, transcobalamina (vitamina B_{12}), \alpha-2 macroglobulinas, insulina y otros factores de crecimiento de péptido tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Low et al. enseñan que pueden usarse ventajosamente receptores de nutrientes, tales como receptores para biotina y folato, para potenciar el transporte a través de la membrana celular debido a la localización y la multiplicidad de los receptores de biotina y folato en las superficies de la membrana de la mayor parte de las células y los procesos asociados de transporte transmembrana mediados por receptor. Así, un complejo formado entre un compuesto que se ha de suministrar al citoplasma y un ligando, tal como biotina o folato, se pone en contacto con una membrana celular que lleva receptores de biotina o folato para iniciar el mecanismo de transporte transmembrana mediado por receptor y permitir de esta forma la entrada del compuesto deseado en la célula.

Es conocido que ICE tiene la facultad de tolerar sustituciones liberales en la posición P_{2}, y esta tolerancia para sustituciones liberales fue explotada para desarrollar un marcador de afinidad potente y altamente selectivo que contiene una etiqueta de biotina (Thornberry et al., 1994). En consecuencia, la posición P_{2}, así como posiblemente el término N del inhibidor de tetrapéptido, puede ser modificado o derivatizado de forma tal como con la adición de una molécula de biotina, para mejorar la permeabilidad de estos inhibidores de péptido a través de la membrana de la célula.

Además, se sabe en la técnica que fusionar una secuencia de péptido deseada con una secuencia de péptido guía/señal para crear un "péptido quimérico" permitirá que tal "péptido quimérico" sea transportado a través de la membrana de la célula al citoplasma.

Como apreciarán los expertos en la técnica de los péptidos, se entiende que los inhibidores de péptido de la interacción TRAF-proteína de unión de TRAF, por ejemplo la interacción TRAF2-NIK de acuerdo con la presente invención, incluyen inhibidores o fármacos peptidomiméticos, que también pueden ser cribados rápidamente en relación con la unión, por ejemplo, con TRAF2/NIK para diseñar inhibidores quizás más estables.

Se apreciará también que los mismos medios para facilitar o potenciar el transporte de inhibidores de péptido a través de las membranas de las células que se discutieron antes son también aplicables a las proteínas de unión de TRAF, por ejemplo NIK, sus análogos, fragmentos o sus mismas isoformas, así como otros péptidos y proteínas que ejercen su efecto intracelularmente.

Por lo que se refiere a los anticuerpos mencionados a lo largo del presente texto, se entiende que el término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) contra anticuerpos que pueden ser marcados en forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como, pero sin limitarse a ellas, segmentación enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos contra antígenos, las cuales poblaciones contienen sitios de unión del epítopo sustancialmente similares. Los mAbs puede obtenerse por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); Patente de EE.UU. n° 4.376.110; Ausubel et al., ed., Harlow y Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan et al., ed., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience N.Y. (1992-1996), referencias cuyo contenido se incorpora en su totalidad al presente texto como referencia. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produce un mAb (anticuerpo monoclonal) de la presente invención puede ser cultivado in vitro, in situ o in vivo. La producción de títulos elevados de mAbs in vivo o in situ hace a este el método de la invención actualmente preferido.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas, diferentes porciones de las cuales son derivadas de especies animales diferentes, tales como las que tienen la región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y aumentar los rendimientos de producción, por ejemplo, cuando los mAbs murinos tienen un mayor rendimiento a partir de hibridomas pero una inmunogenicidad más alta en seres humanos, por lo que se usan mAbs quiméricos humanos/murinos. Los anticuerpos quiméricos y métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., solicitud de patente europea 125023 (publicada el 14 de Noviembre de 1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el 19 de Febrero de 1985); Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de Marzo de 1986); Neuberger et al., Solicitud PCT WO 8601533 (publicada el 13 de Marzo de 1986); Kudo et al., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de Junio de 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., Solicitud de Patente Internacional WO 8702671 (publicada el 7 de Mayo de 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); y Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. Estas referencias se incorporan enteramente al presente texto como referencia.

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión del antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede ser preparado inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (p. ej. una cepa de ratón) que la fuente del mAb contra el que se prepara un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo contra estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 4.699.880, que se incorpora al presente texto como referencia.

El anticuerpo anti-Id puede también ser usado como "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal, produciendo un anticuerpo denominado anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-Id. Así, usando anticuerpos contra los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad.

En consecuencia, los mAbs generados contra las proteínas de unión de TRAF, análogos, fragmentos o derivados de las mismas (p. ej. NIK, sus isoformas, análogos, fragmentos o derivados) de la presente invención pueden usarse para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados tales como ratones BALB/c. Las células esplénicas de tales ratones inmunizados se usan para producir hibridomas anti-Id que segregan mAbs anti-Id. Además, los mAbs anti-Id pueden acoplarse a un portador tal como hemocianina de la lapa californiana (KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin) y usarse para inmunizar otros ratones BALB/c. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del mAb original específico para un epítopo de la anterior proteína de unión de TRAF, o análogos, fragmentos y derivados de la misma.

Los mAbs anti-Id tienen entonces sus propios epítopos idiotípicos, o "idiotipos", similares estructuralmente al epítopo que se está evaluando, tal como la proteína GRB-a.

Se entiende también que el término "anticuerpo" incluye tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')2, que son capaces de unir el antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se depuran con mayor rapidez de la circulación, y pueden tener menos unión no específica con el tejido que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Se apreciará que Fab y F(ab')2 y otros fragmentos de la anticuerpos útiles en la presente invención pueden ser usados para la detección y determinación cuantitativa de la proteína de unión de TRAF de acuerdo con los métodos descritos en el presente texto para moléculas intactas de anticuerpo. Tales fragmentos se producen típicamente por segmentación proteolítica, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2).

Se dice que un anticuerpo es "capaz de unir" con una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unirse así la molécula al anticuerpo. Se entiende que el término "epítopo" se refiere a la porción de cualquier molécula capaz de ser unida por un anticuerpo que puede también ser reconocida por ese anticuerpo. Los epítopos o "determinantes antigénicos" consisten normalmente en agrupamientos de moléculas con actividad química de superficie, tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcares, y tienen características estructurales tridimensionales así como características de carga específicas.

Un "antígeno" es una moléculas o una porción de una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo que es adicionalmente capaz de inducir a un animal para que produzca un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener un epítopo o más de uno. Se entiende que la reacción específica mencionada anteriormente indica que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser provocados por otros antígenos.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención pueden ser usados para detectar cuantitativa o cualitativamente la proteína de unión de TRAF (p. ej. NIK) en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan la proteína de unión de TRAF de la presente invención. Esto puede realizarse mediante técnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado fluorescentemente (véase más adelante) acoplado con microscopía óptica, citometría de flujo o detección fluorométrica.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención pueden ser empleados histológicamente, como en microscopía de inmunofluorescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de la proteína de unión de TRAF de la presente invención. La detección in situ puede realizarse retirando una muestra histológica de un paciente, y proporcionando el anticuerpo marcado de la presente invención a tal muestra. El anticuerpo (o fragmento) se proporciona preferentemente por aplicación o por superposición del anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica. Mediante el uso de tal procedimiento es posible determinar no solo la presencia de la proteína de unión de TRAF sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, los profesionales con una experiencia normal en la técnica observarán fácilmente que puede modificarse un método cualquiera entre una variedad de métodos histológicos (tal como procedimientos de tinción) con el fin de conseguir tal detección
in situ.

Tales ensayos para la proteína de unión de TRAF de la presente invención comprenden típicamente incubar una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién recolectadas tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo de tejido, en presencia de un anticuerpo marcado detectablemente capaz de identificar la proteína de unión de TRAF y detectar el anticuerpo por cualquiera entre cierto número de técnicas bien conocidas en este campo.

La muestra biológica puede ser tratada con un soporte o vehículo en fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro soporte o vehículo sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas de células o proteínas solubles. El soporte o vehículo puede entonces ser lavado con tampones adecuados y después ser sometido a tratamiento con un anticuerpo marcado detectablemente de acuerdo con la presente invención, como se señaló antes. El soporte o vehículo en fase sólida puede entonces lavarse con el tampón por segunda vez para eliminar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido en dicho soporte o vehículo sólido puede entonces detectarse por medios convencionales.

Por "soporte en fase sólida", "vehículo en fase sólida", "soporte sólido", "soporte" o "vehículo", se entiende cualquier soporte o vehículo capaz de unir antígeno o anticuerpos. Los soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, amilasas de nilón, celulosas naturales o modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble hasta cierto punto o bien insoluble, para los fines de la presente invención. El material de soporte puede tener prácticamente cualquier configuración estructural posible, siempre y cuando la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. Así, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en una esfera, o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo o en la superficie exterior de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana, como en una lámina, una tira de ensayo, etc. Los soportes o vehículos preferidos incluyen esferas de poliestireno. Los expertos en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para unir anticuerpo o antígeno, o podrán determinarlos utilizando una experimentación de rutina.

La actividad de unión de una tanda dada de anticuerpo según la invención, como se señaló antes, puede determinarse de acuerdo con métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica podrán determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación de rutina.

Pueden añadirse a los ensayos otras etapas tales como lavado, agitación, filtración y similares como sea costumbre o se precise para la situación en particular.

Una de las formas en las que un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser marcado detectablemente es uniéndolo a una enzima y puede usarse en un inmunoensayo enzimático (EIA). Esta enzima, a su vez, cuando se expone más adelante a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de manera tal que produce un resto químico que puede ser detectado, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden ser usadas para marcar detectablemente el anticuerpo incluyen, pero sin limitarse a ellas, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolin-esterasa. La detección puede realizarse por métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección puede realizarse también por comparación visual de la cuantía de la reacción enzimática de un sustrato con patrones preparados del mismo modo.

La detección puede realizarse usando cualquiera de una diversidad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, marcando radiactivamente los anticuerpos o los fragmentos de un anticuerpo es posible detectar R-PTP-asa usando un radioinmunoensayo (RIA). Una buena descripción del RIA puede encontrarse en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, de Work, T. S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) con particular referencia al capítulo titulado "An Introduction to Radioinmune Assay and Related Techniques", de Chard, T., incorporado al presente texto como referencia. El isótopo radiactivo puede ser detectado por medios tales como el uso de un contador g o un contador de centelleo, o mediante autorradiografía.

También es posible marcar un anticuerpo de acuerdo con la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el compuesto marcado fluorescentemente es expuesto a una luz de longitud de onda apropiada, su presencia puede ser detectada debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje más comúnmente usados están el isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, picocianina, aloficocianina, oftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo puede también ser marcado detectablemente usando metales que emiten fluorescencia tales como ^{152}E, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden ser unidos al anticuerpo usando grupos quelantes de metales tales como ácido dietilentriamina pentaacético (ETPA).

El anticuerpo puede ser también marcado detectablemente acoplándolo con un compuesto quimioluminiscente. La presencia de un anticuerpo etiquetado de forma quimioluminiscente se determina después detectando la presencia de luminiscencia que surge en el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes son luminol, isoluminol, éster acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato.

Del mismo modo, puede usarse un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica incrementa la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes con fines de marcaje son luciferina, luciferasa y ecuorina.

Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede ser adaptada para la utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como un ensayo "de dos sitios" o "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) se une a un soporte o vehículo sólido y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado detectablemente para permitir la detección y/o cuantificación del complejo temario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.

Típicamente, y preferentemente, los ensayos inmunométricos incluyen ensayos "forward" en los que el anticuerpo unido a la fase sólida se pone en contacto primero con la muestra que se está ensayando para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo binario anticuerpo-antígeno en fase sólida. Después de un periodo de incubación adecuado, el soporte o vehículo sólido se lava para eliminar el residuo de la muestra de fluido incluyendo el antígeno que no ha reaccionado, si lo hay, y después se pone en contacto con la solución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (que funciona como "molécula informadora"). Después de un segundo periodo de incubación para permitir que el anticuerpo marcado se compleje con el antígeno unido al soporte o vehículo sólido a través del anticuerpo sin marcar, el soporte o vehículo sólido se lava por segunda vez para eliminar el anticuerpo marcado que no ha reaccionado.

En otro tipo de ensayo "sándwich", que puede ser también útil con los antígenos de la presente invención, se usan los ensayos llamados "simultáneo" e "inverso". Un ensayo simultáneo implica una sola etapa de incubación ya que el anticuerpo unido al soporte o vehículo sólido y el anticuerpo marcado se añaden al mismo tiempo a la muestra que se ensaya. Una vez completa la incubación, el soporte o vehículo sólido se lava para eliminar el resto de fluido de muestra y el anticuerpo marcado no complejado. La presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte o vehículo sólido se determina después como se haría en un ensayo sándwich "forward" convencional.

En el ensayo "inverso", se utiliza primero la adición por etapas de una solución de anticuerpo marcado a la muestra de fluido, seguida por la adición de anticuerpo sin marcar unido a un soporte o vehículo sólido después de un periodo de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava de una manera convencional para liberarla de los restos de la muestra que se está ensayando y de la solución de anticuerpo marcado que no ha reaccionado. Después se realiza la determinación del anticuerpo marcado asociado con un soporte o vehículo sólido como en los ensayos "simultáneo" y "forward".

Como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden vectores de virus animal recombinantes que codifican las proteínas de unión de TRAF, el cual vector también codifica una proteína de la superficie del virus, capaz de unirse a proteínas de la superficie de una célula diana específica (p. ej. células cancerosas) para dirigir la inserción de las secuencias de la proteína de unión de TRAF en las células. Otras composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden como ingrediente activo una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de la proteína de unión de TRAF.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención incluyen una cantidad suficiente de ingrediente activo para conseguir el fin propuesto. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos adecuados aceptables farmacéuticamente que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparados que pueden ser usados farmacéuticamente y que pueden estabilizar tales preparados para la administración al sujeto en necesidad de los mismos, y son bien conocidos en la técnica.

Se sospecha que la proteína de unión de TRAF y sus isoformas o isótopos se expresa en distintos tejidos a niveles acusadamente diferentes y aparentemente también con distintos patrones de isotipos de una manera análoga a la expresión de otras diversas proteínas implicadas en las rutas de señalización intracelular como se indica en las solicitudes de patente pendientes en común y de propiedad común con la presente, anteriormente expuestas. Estas diferencias pueden contribuir posiblemente a las características específicas del tejido de la respuesta al ligando Fas/APO1 y al TNF. Como en el caso de otros homólogos de CED3/ICE (Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995), los presentes inventores han mostrado previamente (en las solicitudes de patente anteriormente mencionadas) que se ha encontrado que las isoformas de MACH que contienen regiones de CED3/ICE incompletas (p. ej. MACH\alpha3) tienen un efecto inhibidor sobre la actividad de las moléculas de MACH\alpha1 o MACH\alpha2 co-expresadas; también se ha encontrado que bloquean la inducción de la muerte por Fas/APO1 y p55-R. La expresión de tales isoformas inhibidoras en células puede constituir un mecanismo de autoprotección celular frente a la citotoxicidad mediada por Fas/APO1 y TNF. La amplia heterogeneidad de las isoformas de MACH, que excede en gran medida a la observada para cualquiera de las otras proteasas de la familia de CED3/ICE, debe permitir una sintonización particularmente fina de la función de las isoformas de MACH activas.

De acuerdo con la presente invención, también se han aislado análogos/muteínas de una de las proteínas de unión de TRAF, concretamente de la proteína de unión de TRAF2 NIK. Estos análogos/muteínas de NIK (véase anteriormente y véanse los Ejemplos más adelante) son inhibidores para los mediados por NIK así como inhibidores para la inducción de la activación del NF-\kappaB mediada por los receptores de TNF, receptor FAS/APO1, sus proteínas relacionadas, el receptor de IL-1 y otros agentes. Por tanto, como se señaló antes, las proteínas de unión de TRAF o sus posibles isoformas pueden tener efectos variables en diferentes tejidos en relación con su interacción con proteínas TRAF y su influencia a través de ello sobre la actividad de las proteínas TRAF, o señalización intracelular mediada por las proteínas TRAF.

También es posible que alguna de las posibles isoformas de la proteína de unión de TRAF sirva para otras funciones. Por ejemplo, NIK o algunos análogos o isoformas de NIK pueden actuar también como sitios de adaptación o "de atraque" ("docking sites") para moléculas que están implicadas en otros efectos no citotóxicos de, por ejemplo, receptores Fas/APO1 y TNF a través de la interacción con TRAF2 o incluso independientemente de TRAF2.

Debido a la peculiar capacidad de los receptores Fas/APO1 y TNF para causar la muerte celular, así como la capacidad de los receptores de TNF de disparar otras actividades dañosas para el tejido, los errores en la función de estos receptores podrían ser particularmente nocivas para el organismo. En realidad, se ha demostrado que tanto el funcionamiento excesivo como el deficiente de estos receptores contribuyen a manifestaciones patológicas de varias enfermedades (Vassalli, 1992; Nagata y Golstein, 1995). La identificación de las moléculas que participan en la actividad de señalización de los receptores y el descubrimiento de formas de modular la actividad de estas moléculas podrían dirigir nuevos métodos terapéuticos. En vista del supuestamente importante nuevo papel de las proteínas TRAF, p. ej. TRAF2 y por tanto TRAF-proteína de unión de TRAF, p. ej. interacción TRAF2-NIK en la activación del NF-\kappaB mediada por Fas-APO1 y TNF, parece particularmente importante diseñar fármacos que puedan bloquear la interacción TRAF-proteína de unión de TRAF, p. ej. interacción TRAF2-NIK cuando se desea matar células (inhibiendo la activación del NF-\kappaB) y, al revés, cuando se desea preservar a las células, esta interacción debe ser potenciada (para potenciar la activación del NF-\kappaB).

Del mismo modo, todas la proteínas de unión de TRAF antes mencionadas, análogos, fragmentos, isoformas y derivados de la presente invención, pueden usarse para purificar mediante cromatografía de afinidad las diversas proteínas TRAF a las que se unen. Por ejemplo, las proteínas de unión de TRAF2 como NIK, y análogos, fragmentos y muteínas de NIK (véanse los Ejemplos más adelante) pueden ser usadas para la purificación de TRAF2 por cromatografía de afinidad. Por tanto, de la misma forma que la proteína NIK, se aislaron y se produjeron análogos/muteínas de la presente invención (véanse los Ejemplos más adelante) usando estos métodos y cualquier otro método equivalente fácilmente evidente para los expertos en la técnica (como se detalló anteriormente en el presente texto), puede ser identificada y producida cualquier otra proteína de unión de TRAF2. Tal método para identificar y producir estas proteínas de unión de TRAF, p. ej. proteínas de unión de TRAF2, incluirá una etapa de cribado en la que la proteína TRAF (p. ej. TRAF2), o al menos una porción específica de la misma (p. ej. la porción de TRAF2 entre los aminoácidos 222-501) se usa como sustrato o "cebo" para obtener proteínas o cualquier otro ligando capaz de unirse a la misma; seguido por las etapas de identificación y caracterización de tales proteínas/ligandos así obtenidas; y subsiguientemente producir tales proteínas/ligandos en formas sustancialmente aisladas y purificadas. Todas estas etapas son bien conocidas por los expertos en la técnica y se detallan en el presente texto, anteriormente y más adelante.

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitantes y en los dibujos adjuntos.

Debe observarse que los procedimientos de (i) cribado de dos híbridos y ensayo de expresión de \beta-galactosidasa de dos híbridos; (ii) expresión inducida, marcaje metabólico e inmunoprecipitación de proteínas; (iii) unión in vitro; (iv) evaluación de la citotoxicidad; y (v) análisis Northern y de secuencia, así como otros procedimientos usados en los Ejemplos que siguen, han sido detallados en publicaciones previas por los presentes inventores con respecto a otras proteínas y rutas de señalización intracelular (véanse, por ejemplo, Boldin et al., 1995a, 1995b, y Boldin et al. 1996). Estos procedimientos aparecen también de forma detallada en la Solicitud de Israel pendiente en común y de propiedad común números 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 y 120367, así como la correspondiente solicitud PCT n° PCT/US96/10521).

Ejemplos Materiales y Métodos i) Genotecas de cDNA a) Genoteca de cDNA de células B

Se usó una genoteca cebada de oligo dT construida a partir de células B humanas (Durfee et al., 1993). Los cDNAs de la genoteca fueron insertados en el sitio XhoI del vector basado en pACT pSE1107 en fusión con el dominio de activación de GAL-4.

b) Genoteca de cDNA de \lambdagt10 de testículo

Se usó una genoteca de cDNA de testículo humano. La genoteca es una genoteca cebada de hexanucleótido aleatoria con un tamaño de inserción medio de 200 a 400 pb.

ii) Cepas de levadura

Se usaron dos cepas de levadura como cepas hospedadoras para la transformación y el cribado: la cepa HF7c que fue usada en el cribado de dos híbridos y la cepa SFY526 que fue usada en los ensayos de b-galactosidasa. Ambas cepas llevan los marcadores auxotróficos trp 1 y leu2, concretamente estas cepas de levadura no pueden crecer en medio sintético mínimo carente de triptófano y leucina, a menos que sean transformadas por un plásmido que lleva las versiones de tipo silvestre de estos genes (TRP1, LEU2). Las dos cepas de levadura llevan mutaciones por deleción en sus genes GAL4 y GAL80 (mutaciones gal4-542 y gal80-538, respectivamente).

Las cepas SFY526 y HF7c llevan el informador lacZ en sus genotipos; en la cepa SFY526 fusionado a las porciones UAS y TATA del promotor GAL1, y en HF7c tres copias de la secuencia de consenso del 17-mero de GAL4 y la porción TATA del promotor CYC1 están fusionadas con lacZ. Tanto UAS del GAL1 como los 17-meros de GAL4 responden al activador transcripcional GAL4. Además, la cepa HF7c lleva el informador HIS3 fusionado con la porción UAS y TATA del promotor GAL1.

iii) Clonación de TRAF2 humano

El TRAF2 humano fue clonado mediante PCR a partir de una genoteca de cDNA HL60 (para la secuencia de TRAF2 y otros detalles véanse Rothe et al., 1994; Rothe et al., 1995a; Cheng et al., 1996; Hsu et al., 1996; y Wallach, 1996). Los cebadores usados eran: a) cebador forward 30-mero CAGGATCCTCATGGCTGCAGCTAGCGTGAC correspondiente a la secuencia de codificación de hTRAF2 partiendo del codón para la primera metionina (subrayado) e incluyendo un enlazador con el sitio BamHI; b) cebador inverso 32-mero GGTCGACTTAGAGCCCTGTCAGGTCC
ACAATG que incluye el codón de parada del gen hTRAF2 (subrayado) y un sitio de restricción SalI en su enlazador. El programa de PCR estaba formado por una etapa inicial de desnaturalización de 2 min a 94°C seguida por 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 64°C, 1 min y 40 segundos a 72°C. El TRAF2 humano amplificado se insertó después en los sitios BamHI - SalI del vector pGBT9 en unión con el dominio de unión de DNA GAL 4.

iv) Cribado de dos híbridos de la genoteca de células B

El cribado de dos híbridos es una técnica (véanse los detalles en publicaciones y solicitudes de patente anteriormente mencionadas) usada con el fin de identificar factores que están asociados con una molécula particular que sirve de "cebo". En la presente invención el TRAF2 que fue clonado en el vector pGBT9 sirvió de cebo. El TRAF2 fue co-expresado junto con la genoteca de cDNA de células B cribada, en la cepa de levadura HF7c. El TRAF2 clonado por PCR era una fusión recombinante con el dominio de unión de DNA CAL4 y la genoteca de cDNA cribada fue fusionada con el dominio de activación GAL4 en el vector pSE1107. El gen informador en HF7c fue fusionado HIS3 con la secuencia activadora secuencia arriba (UAS) del promotor GAL1 que responde al activador transcripcional GAL4. Los transformantes que contenían tanto el plásmido pGBT9 como el pSE1107 fueron seleccionados por el desarrollo en placas sin triptófano ni leucina. En una segunda etapa, los clones positivos que expresaban dos proteínas híbridas que interaccionan entre sí, y por tanto HGAL1-HIS3 activado, fueron recogidas de las placas carentes de triptófano, leucina e histidina y que contenían 3-aminotriazol (3AT) 50 mM.

v) Ensayo de \beta-galactosidasa

Los clones positivos recogidos en el cribado de dos híbridos fueron sometidos a la prueba de desarrollo de color de lacZ en células de levadura SFY526, según el manual de Clontech Laboratories (para los detalles véanse las publicaciones y solicitudes de patente anteriormente mencionadas). En pocas palabras, se dejaron desarrollar los transformantes a 30°C durante 2 a 4 días hasta que alcanzaron aproximadamente 2 mm de diámetro, y después se transfirieron a filtros Whatman. Los filtros pasaron por un tratamiento de congelación/descongelación con el fin de permeabilizar las células, y después se empaparon en un tampón (16,1 mg/ml de Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O; 5,5 mg/ml de NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O; 0,75 mg/ml de KCl; 0,75 mg/ml de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, pH = 7) que contiene 0,33 mg/ml de X-gal y \beta-mercaptoetanol 0,35 mM. Las colonias fueron supervisadas en relación con el desarrollo de color azul, que es una indicación de la inducción de la \beta-galactosidasa.

vi) Expresión de cDNAs clonados

Se construyeron dos tipos de vectores de expresión:

a) Un vector basado en pUHD 10-3 que contiene el marco de lectura abierto (ORF) del clon 9, del 10 o del 15, en fusión con el epítopo de hemaglutinina (HA).

b) Un vector basado en pUHD 10-3 en el que la secuencia del octapéptido FLAG fue introducida justo enfrente del TRAF2 clonado, llamada por ello FLAG/B6/TRAF2.

Las construcciones que contienen un ORF del clon 9, 10 o 15 fueron transfectadas en células HeLa Bujard (para estas células, véase Gossen, M. y Bujard, M. (1992)) bien sea solas o cotransfectadas con FLAG/B6/TRAF2 usando el método estándar del calcio-fosfato (método, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel, F. M. et al.).

vii) Ensayo de luciferasa

Típicamente, 5 x 10^{5} células transfectadas fueron recolectadas lavando tres veces con PBS fría, y se resuspendieron en 400 \mul de tampón para extracción (K_{2}HP_{4}/KH_{2}P_{4} 0,1 M, pH = 7,8; DTT 1 mM). La lisis de las células se logró congelando en nitrógeno líquido y descongelando tres veces. Los residuos de las células se eliminaron mediante centrifugación (5 min a 10.000 x g). Para el ensayo de luciferasa, se añadieron 200 \mul de tampón para luciferasa (glicilglicina 25 mM, K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 15 mM pH = 7,8, MgSO_{4} 15 mM, EGTA 4 mM, ATP 2 mM, DTT 1 mM) a 50 \mul del lisado. A continuación, se añadieron a la reacción 100 \mul de D-luciferina 0,2 mM, glicilglicina 25 mM, DST 1 mM. La actividad de luciferasa se determinó leyendo la emisión de luz usando un luminómetro Lumitron ajustado en 10 segundos de integración (véanse anteriores publicaciones y solicitudes de patente para detalles adicionales).

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Ejemplo 1

Clonación de los nuevos clones 9, 10 y 15

Una genoteca de cDNA preparada a partir de células B fue cribada en relación con las proteínas que se asocian con TRAF2, usando la técnica de dos híbridos como se describe en Materiales y Métodos (iv). Solamente en los transformantes que expresaron tanto TRAF2 como una proteína capaz de interaccionar con él, se juntaron el dominio de unión de DNA GAL4 y el dominio de activación transcripcional. El resultado fue la activación y expresión del gen informador, en este caso HIS3 fusionado con la porción UAS y la porción TATA del promotor GAL1.

El cribado dio aproximadamente 2000 clones que pudieron crecer en placas de Trp-, Leu-, His- 3AT. El DNA preparado a partir de 165 clones positivos elegidos al azar sirvió para la co-transfección transitoria de la cepa de levadura SFY526 junto con TRAF2 donado en el vector pGBT9. El ensayo de actividad de \beta-galactosidasa se llevó a cabo en las colonias de levadura SFY526 transformadas, como se describe en Materiales y Métodos (v). El color azul que se desarrolló fue una indicación de colonias de levadura que contienen cDNA que codifica una proteína o polipéptido que se une a TRAF2.

Los resultados del cribado de dos híbridos; la capacidad de los clones escogidos para crecer en placas de 3AT y para inducir LacZ, según se mide en la prueba de color, se resumen en la Tabla 1. De los clones positivos comprobados, dos eran cDNAs que codifican proteínas conocidas; el propio TRAF2 que es capaz de autoasociarse y de formar homodímeros, y el receptor de linfotoxina beta cuyos dominios intracelulares se demostró que unen TRAF2. Tres de los cDNAs donados (clones 9, 10 y 15) eran nuevos.

Los clones positivos se siguieron comprobando en una prueba de especificidad de unión, concretamente se comprobó su interacción con cebos no en cuestión. Como se muestra en la Tabla 2, los clones 9 y 10 reaccionaron solamente con TRAF2 y no se unieron a ninguna de una serie de proteínas no en cuestión comprobadas. El clon 15, por una parte, no se unió a MORT1, ni a los dominios intracelulares de los receptores p55 y p75 de TNF, pero sí que se unió débilmente a Lamina y a la Ciclina D.

Con el fin de reducir la región en la molécula de TRAF2 que interacciona con los clones 9, 10 y 15, se hicieron dos construcciones adicionales. Una construcción comprendía la parte N-terminal de la molécula de TRAF2, aminoácidos 1 a 221, que incluía los motivos Ring finger y Zn-finger. La segunda construcción incluía solamente la parte C-terminal de la molécula, aminoácidos 222 a 501, que cubre el "dominio TRAF" y 42 aminoácidos adicionales. Estas construcciones sirvieron de cebo en pruebas de dos híbridos. Los resultados indican claramente que aunque los clones 9, 10 y 15 no interaccionaron con la construcción que comprende los aminoácidos 1 a 221 de la molécula de TRAF2, todos ellos sí que se unieron a la construcción C-terminal que comprende el "dominio TRAF" con la misma eficacia con la que se unen a la molécula de TRAF2 de longitud completa.

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TABLA II Sumario de los resultados del cribado de dos híbridos usando TRAF2 como "cebo", en el que se recogieron los clones 9, 10 y 15

1

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TABLA III Pruebas de especificidad (interacción con cebos no en cuestión en la prueba de dos híbridos)

2

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Aplicando varias etapas de PCR al clon 10 del cDNA, el cDNA de longitud completa fue donado a partir de genotecas de cDNA obtenidas de RNA de tejidos humanos. Esta proteína fue designada NIK por la siglas de "NF-\kappaB Inducing Kinase: cinasa inductora del NF-\kappaB" debido al hecho de que contiene una región de proteínacinasa (véase más adelante). Debe observarse que la secuencia del clon 10, cuando se analizó inicialmente (antes de la obtención de NIK por PCR), se vio que codificaba una proteína, originalmente designada NMPI (véase la Solicitud de Patente IL 117800 de propiedad común, pendiente en común con la presente). Se vio que esta NMPI o proteína codificada por el clon 10 tiene secuencias que corresponden a los motivos

\hbox{conservados I a
XI que caracterizan a las proteína cinasas de Ser/Thr.}

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Ejemplo 2

Secuenciación de nuevos clones

Tres de los nuevos clones de cDNA (clones 9, 10 y 15) fueron purificados y amplificados en E. coli, y su DNA se sometió a análisis de secuencia. Se encontró que los tres clones eran clones de cDNA parciales.

Las longitudes totales de los clones 9, 10 y 15 eran de aproximadamente 2000, 2700 y 1300 pares de bases, respectivamente.

Las Figs. 3 y 5 muestran la parte secuenciada de los clones 9 y 15 y la Fig. 4 muestra la secuencia completa del clon 10.

Las Figs. 5a-b muestran la secuencia entera de nucleótidos del clon 15 secuenciada a partir de ambos extremos 5' y 3' (a) y los aminoácidos deducidos codificados por ella (b). Se encontró que el clon 15, que es un clon de cDNA parcial, codifica una proteína de una longitud de 172 aminoácidos.

Los clones 9 y 15 son clones parciales que carecen de la mayor parte de su extremo 5' de las secuencias de codificación de DNA. Las secuencias de aminoácidos deducidas mostradas en las Figs. 3b, 4b y 5b, están todas iniciadas a partir del primer nucleótido del clon respectivo.

La secuencia del clon 10 (un clon de cDNA parcial) que fue la más detalladamente analizada, codifica una proteína llamada NMP1 como se señaló anteriormente, que contiene motivos de Ser/Thr proteína cinasa. El clon de cDNA de longitud completa obtenido por PCR usando el clon 10 como se señaló anteriormente reveló la nueva cinasa de unión de TRAF2 NIK como se mencionó anteriormente.

La secuencia de nucleótidos completa y su secuencia deducida de aminoácidos de NIK se muestran en la Fig. 6 en la que está subrayado el iniciador ATG en el nucleótido n° 232, y en la que el codón de parada en el nucleótido n° 3073 está indicado por un asterisco. El clon NIK totalmente secuenciado de la Fig. 6 es de una longitud de 4596 nucleótidos, dentro de la cual está contenida la secuencia de codificación de NIK, que codifica una proteína NIK de 947 restos de aminoácidos.

Las búsquedas en bancos de datos revelaron que la nueva secuencia de aminoácidos de NIK muestra una homología particularmente elevada con un grupo de cinasas, algunas de las cuales se sabe que sirven como MAP cinasa cinasa cinasa.

La Fig. 7 muestra la alineación de:

: MEKKK de ratón (S1),

: BYR2 (S2),

: Tpl-2 (S3),

: Oncogén del sarcoma de Ewing (S4),

: SS3 (S5),

: (STE11) (S6),

: (NPK1) (S7),

: (BCK1) (S8), y

: (NIK) (S9).

Algunas de esas cinasas han sido identificadas en virtud de la actividad de oncogén que poseen cuando están en forma mutada.

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Ejemplo 3

Expresión de cDNAs clonados y su co-inmunoprecipitación con TRAF2

Células HeLa-Bujard fueron transfectadas con TRAF2 señalada con FLAG en un vector de expresión basado en pUHD 10-3 y construcciones que contienen ORF de cualquiera de los clones 9, 10 ó 15 fusionados con epítopo HA, como se describe en Materiales y Métodos (iv). Las células fueron después desarrolladas durante 24 h en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) más 10% de suero de ternera con ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína. Al final de ese tiempo de incubación las células fueron lisadas en tampón de precipitación radioinmunológica (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de Nonident P-40, 1% de desoxicolato, 0,1% de SDS y EDTA 1 mM; 1 ml/5 x 10^{5} células), y el lisado se preaclaró por incubación con antisuero de conejo no al caso y esferas de Proteína Sepharose G (Pharmacia, Sweden). La inmunoprecipitación se realizó mediante una incubación de 1 h a 4°C de partes alícuotas del lisado con anticuerpos monoclonales anti-FLAG (adquirido de Eastman Kodak Co.) o anti-HA (clon 12CA5 (Field, J. et al. (1988)). Las proteínas expresadas fueron analizadas en gel de SDS-PAGE y a continuación por
autorradiografa.

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Los resultados de tales experimentos demostraron que los clones de cDNA parciales 9, 10 y 15 codificaban proteínas de pesos moleculares alrededor de 50-65, 45 y 26 kDa respectivamente.

No pudo detectarse ninguna interacción del clon 15 con TRAF2, pero las proteínas codificadas por los clones 9 y 10 (NIK) así como la NIK de longitud completa fueron co-inmunoprecipitadas con la proteína TRAF2. Las muestras de células que fueron co-transfectadas con TRAF2 y uno de estos dos clones y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-FLAG o bien anti-HA, seguido por análisis en SDS-PAGE como se describió anteriormente, mostraron tres bandas en cada pista: una banda correspondiente a las proteínas codificadas por cualquiera de los clones 9 o 10, y las otras dos es un doblete de 42 y 44 kDa correspondiente a la proteína TRAF2.

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Ejemplo 4

Pruebas funcionales

Se encontró que NIK tenía inducción del NF-d3 por el ensayo de retardo en gel. Típicamente, se transfectaron 0,5-1 x 10^{6} células 293 EBNA con 10 \mug de clon 10 en pcDNA3 (Fig. 7 pista 1), 3 \mug de pcDNA3 que contiene cDNA para el receptor p75 de TNF (Fig. 7 pista 3), o con ambos clones 10 (10 \mug) y receptor p75 del TNF (3 \mug) en Fig. 7 pista 2. En cada una de las transfecciones la cantidad total de DNA transfectado se llevó a 15 \mug con el vector pcDNA3 "vacío". Como testigo sirven células 293 EBNA transfectadas con 15 \mug de vector pcDNA3 solo (Fig. 7, pista 4). Las células se desarrollaron durante 24 h en medio DMEM + 10% de suero de ternera y después se recolectaron y se trataron de acuerdo con Schreiber et al. (Schreiber, E. et al. (1989)). Se analizaron las muestras en gel de poliacrilamida al 5%. El NF-\kappaB se controló usando un juego de oligonucleótidos radiomarcados con ^{32}P correspondientes al sitio de unión del NF-\kappaB como sondas (las sondas eran GATGCCATTGGGGATTTCCTCTTT y CAGTAAAGAGGAAATCCCCAATGG).

Como se muestra en la Tabla IV, la NIK indujo al NF-\kappaB incluso más eficazmente que TRAF-2. Por otra parte, el clon 10 no tuvo este efecto en absoluto.

El ensayo del gen informador se realizó como sigue:

Células 293 EBNA fueron co-transfectadas con el vector pcDNA3 que contiene LTR de HIV unido al gen informador de la luciferasa, junto con plásmido pcDNA3 que contiene cDNA para el receptor p75 TNF solo, o plásmido pcDNA3 que contiene cDNA del clon 10 solo, o bien con plásmido pcDNA3 que contiene cDNA para el receptor p75 TNF y un plásmido pcDNA3 listado en las Tablas IV y V.

Los resultados mostrados en la Tabla V demuestran:

a) que la transfección con clon 10 no activa la inducción del NF-\kappaB, mientras que NIK lo hace intensamente.

b) que el clon 10 así como NIK en la que la lisina del sitio activo fue reemplazada con alanina (NIK*) inhibía intensamente la inducción del NF-\kappaB por el cDNA listado en la primera columna de la Tabla IV.

La deleción del 3' UTR de NIK (NIK-3'UTR) incrementó en gran medida su expresión y en consecuencia su capacidad para bloquear la inducción del NF-\kappaB cuando se expresó en forma mutada.

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TABLA IV Activación del NF-\kappaB por NIK. Ensayo de retardo en gel. Los números son cuentas de eventos de disminución de la radioactividad detectado por la placa "phosphoimager"

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3

TABLA V Efecto dominante-negativo del clon 10, mutante NIK K -> A en la inducción del NF-\kappaB por sobreexpresión de TRAF2, TRADD, MORT1/FADD, TNFR-i, TNFR-II, quimera TFNR-I/FAS, RIP y activación del NF-\kappaB por NIK. Prueba de luciferasa

4

Ejemplo 5

Características adicionales de NIK

Además de las pruebas de especificidad del Ejemplo 2 anterior, otra prueba de dos híbridos de las propiedades de unión de NIK reveló (no se muestran los resultados) que el clon parcial de NIK (NIK 624-947) aislado inicialmente se une específicamente a la región C-terminal de TRAF2 (dominio C-TRAF), mientras que, en cambio, la NIK de longitud completa se unió tanto al dominio C-TRAF como a una región secuencia arriba de él (dominio N-TRAF). NIK tampoco se une a TRAF3. Además, una molécula quimérica que contiene el dominio C-TRAF de TRAF2 y la porción N-terminal de TRAF3 podía unir la molécula de NIK parcial (NIK 624-947) pero no la NIK de longitud completa, lo que indica que la unión de NIK de longitud completa a TRAF2 requiere ambos dominios C-TRAF y N-TRAF de TRAF2.

Además, NIK no se autoasocia ni se une a los dominios intracelulares de los receptores de TNF p55 y p75, al receptor CD40 (un miembro de la familia de receptores TNF/NGF) ni a FAS/APO1 (receptor CD95). NIK tampoco se une a las proteínas intracelulares asociadas con estos receptores, tales como por ejemplo TRADD, MORT1 y RIP. Estos resultados se correlacionan con los mostrados en la Tabla II anterior, relativos a las especificidades de unión de las proteínas codificadas por los clones 9, 10 y 15. Las diversas interacciones entre los diversos receptores y proteínas se representan esquemáticamente en las Figs. 2a y 2b, siendo más completa la Fig. 2b.

El análisis de transferencia Northern reveló que hay un transcripto único de NIK expresado en varios tejidos a niveles distintos, el cual transcripto tiene un tamaño de aproximadamente 5000 nucleótidos que es esencialmente el mismo que el cDNA de NIK donado (como se señaló anteriormente, véase la Fig. 6).

Además, como se señaló anteriormente con respecto a la proteína codificada por el clon 10 (originalmente designada NMPI), la proteína NIK de longitud completa tiene también un motivo de proteína cinasa de Ser/Thr similar a varias MAP cinasa cinasa cinasa (MAPKKK) y también procede de las alineaciones de secuencia que se indican en la Fig. 7.

La prueba in vitro de la actividad de cinasa NIK reveló que NIK puede ser autofosforilada pero no cuando la lisina del sitio activo y la lisina adyacente son reemplazadas con alanina (análogo o muteína de NIK designado NIK KK429-430AA, que indica que las lisinas en las posiciones 429 y 430 están reemplazadas con alaninas). Esto guarda también relación con los resultados anteriores expuestos en el Ejemplo 4 y mostrados en la Tabla IV con respecto a la muteína NIK*.

Como se mencionó antes, la sobreexpresión de la NIK en células 293 EBNA indujo NF-\kappaB en una cuantía incluso mayor que la sobreexpresión de TRAF2, pero la sobreexpresión de la NIK parcial (NIK 624-947) no produjo activación del NF-\kappaB. Además, el análogo/muteína de NIK anteriormente mencionado, NIK KK429-430AA, tampoco produjo activación del NF-\kappaB cuando se sobreexpresó en estas células. Así, la inducción del NF-\kappaB por NIK depende de una función de cinasa intacta de NIK. En cambio, la RIP (véanse las Figs. 2a, b), que también tiene un dominio de cinasa, puede inducir aún la activación del NF-\kappaB cuando se actividad de cinasa ha sido eliminada por mutación.

La activación del NF-\kappaB al tener lugar la sobreexpresión de NIK no pudo distinguirse de la producida tratando las células con TNF y, como con la sobreexpresión de TNF o TRAF2, los componentes principales del NF-\kappaB activado por NIK fueron p50 y p65. La sobreexpresión de NIK produjo la degradación de I\kappaB\alpha y el bloqueo de esta degradación con N-acetil-Leu-Leu-norleucinol (ALLN) tuvo por resultado (como con el TNF) la acumulación de moléculas de I\kappaB que tienen una migración más lenta en SDS-PAGE, indicadora de una I\kappaB\alpha fosforilada.

Otras pruebas han revelado que el NF-\kappaB puede ser activado en células 293-EBNA por el TNF, así como por la sobreexpresión de los receptores de TNF p55 y p75, o la sobreexpresión de un receptor de TNF p55 en el que el dominio intracelular del receptor de TNF p55 es reemplazado por el del receptor FAS/APO1. El NF-\kappaB puede ser también activado por la sobreexpresión de TRAF2, TRADD, RIP o MORT1, pero no por un mutante de deleción de MORT1 que carece de la región secuencia arriba del "dominio de muerte" de MORT1. Como se señaló antes, la NIK de longitud completa, pero no la muteína de NIK, NIK KK429-430AA, ni la NIK parcial (NIK 624-947), induce la activación del NF-\kappaB. Además, la expresión de la muteína NIK KK429-430AA o NIK 624-947 en células 293-EBNA junto con cualquiera de los otros agentes anteriormente señalados, es decir los receptores o proteínas asociadas, tuvo por resultado el bloqueo de la inducción de la activación del NF-\kappaB por todos estos agentes, lo que indica que la actividad de NIK está directamente implicada en esta inducción del NF-\kappaB. Del mismo modo la inhibición antes observada por moléculas de NIK inactivas se correlaciona con menos reducción de I\kappaB.

El NF-\kappaB es también activado por la IL-1 (véase el esquema de la Fig. 2b). Este efecto es aparentemente independiente de TRAF2 (la IL-1 no une TRAF2 y el efecto de IL-1 no es bloqueado por la expresión de un mutante dominante-negativo de TRAF2). Sin embargo, este efecto de IL-1 es inhibido por la expresión de mutantes de NIK. Además, la actividad del NF-\kappaB observada en la sobreexpresión del homólogo Rel p65 en células 293-EBNA no se afectó por la coexpresión de mutantes de NIK deficitarios de cinasa, lo que indica que NIK no afecta a la función de las proteínas Rel directamente, sino que participa en su activación inducida por receptor.

La actividad citotóxica del TNF (aparentemente mediada por proteasa MACH asociada con MORT1; véase la Fig. 2b) está sometida a regulación negativa por algunos genes inducibles por NF-\kappaB. Las consecuencias antagonizantes de la inducción del gen mediada por NF-\kappaB y la activación de MACH pueden explicar por qué el propio TNF, así como IL-1, pueden inducir resistencia celular a la citotoxicidad del TNF. En esta línea, también se ha encontrado de acuerdo con la presente invención que la expresión de mutantes dominantes-negativos de NIK en células 293-EBNA incrementó de forma significativa su susceptibilidad a la destrucción por TNF, y que la sobreexpresión de NIK original (longitud completa, de tipo silvestre) inhibía la destrucción de las células por TNF o por sobreexpresión del receptor de TNF p55 (este receptor tiene un dominio intracelular que contiene una región de "dominio de muerte" que, cuando se expresa en células, en ausencia de cualquier TNF, puede inducir su propia citotoxicidad celular - véanse publicaciones citadas anteriormente de los presentes inventores, y solicitudes de propiedad común y pendientes en común con la presente).

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Ejemplo 6

Otras pruebas funcionales para la actividad biológica de NIK

De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado también que la expresión de mutantes dominantes-negativos de NIK podría también bloquear la inducción de la activación del NF-\kappaB en células 293-EBNA por otros agentes inductores que incluyen: (i) la bien conocida endotoxina bacteriana, lipopolisacárido (LPS); (ii) un bien conocido miristato acetato de forbol, que es un conocido activador de proteína cinasa C; y (iii) la proteína TAX del HTLV-1.

Además, se ha encontrado que la expresión de mutantes dominantes-negativos de NIK en las células 293-EBNA no tiene esencialmente ningún efecto sobre la activación, inducida por TNF, de la cinasa Jun, lo que indica que NIK actúa de una manera específica y posiblemente directa potenciando la fosforilación de I\kappaB sin afectar a las cinasas MAP implicadas en la fosforilación de Jun.

En vista de todo lo mencionado antes, se plantea que la actividad de cinasa de NIK es parte de una cascada de señalización que es responsable de la activación del NF-\kappaB, y la cual cascada es común a los dos receptores de TNF, el receptor de FAS/APO1 y el receptor de IL-1. La NIK parece jugar un papel específico en esta cascada. La unión de NIK a TRAF2 puede servir para permitir que NIK sea afectada tanto por los receptores de TNF como por el receptor de FAS/APO1. Por analogía con las cascadas de la cinasa MAP, la NIK puede servir como sustrato para una cinasa (MAPKKKK) al ser reclutada por TRAF2 a los receptores estimulados, de forma que, cuando NIK es fosforilada, fosforila y activa otras cinasas (o puede inducir directamente la activación del NF-\kappaB por fosforilación directa de I\kappaB). La activación del NF-\kappaB inducida por IL-1 es independiente de TRAF2 y por tanto la activación de NIK por el receptor de IL-1 puede ser mediada por otra proteína IRAK, una cinasa de serina/treonina que es reclutada al receptor de IL-1 después de la estimulación (Cao et al., 1996b), y también por TRAF6 que se une a IRAK (véase Cao et al., 1996a, así como el esquema de la Fig. 2b). Como se señaló antes, la diana de NIK o de una cascada de cinasas activadas por ella, es probable que sea I\kappaB. La NIK puede también fosforilar proteínas TRAF o proteínas reguladoras que se unen a ella por ejemplo TANK-I/TRAF (véanse Cheng y Baltimore, 1996; Rothe et al., 1996) creando sitios de adaptación o atraque ("docking") para otras proteínas.

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68. Zhao, J. J. and Pick, L. (1993) Nature 365: 448-451.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Yeda Research and Development Co. Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Weizmann Institute of Science

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: P.O.B. 95.

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: +972-8-9344093

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: +972-8-9470739

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: David Wallach

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 24 Borochov Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76406

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Nicolai Malinin

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Beit Clore, Weizmann Institute of Science

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Mark Boldin

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Beit Clore, Weizmann Institute of Science

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Andrei Kovalenko

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Beit Clore, Weizmann Institute of Science

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Igor Mett

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 60 Levin Epstein Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76462

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Moduladores del factor asociado al receptor del TNF (TRAF), su preparación y uso

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disco blando

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release n° 1.0, versión n° 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

: NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/IL97/00117

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: IL 117800

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 02-ABR-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: IL 119133

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-AG-1996

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1906 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 604 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2631 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: Fig. 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1253 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 417 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4596 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 947 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleotide PCR primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGATCCTC ATGGCTGCAG CTAGCGTGAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleotide PCR primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCGACTTA GAGCCCTGTC AGGTCCACAA TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleotide probe"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGCCATTG GGGATTTCCT CTTT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleotide probe"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTAAAGAG GAAATCCCCA ATGG

\hfill

24

Claims

1. Una secuencia de DNA que codifica una proteína NIK capaz de unirse a una molécula de factor asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF), que es

(a): una secuencia de cDNA del denominado clon 10 en el presente texto, que comprende la secuencia de nucleótidos representada en la Fig. 4;

(b): una secuencia de cDNA que comprende la secuencia de nucleótidos representada en la Fig. 6;

(c): un fragmento de una secuencia (a) o (b) que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a al menos los aminoácidos 222 a 501 de TRAF2;

(d): una secuencia de DNA capaz de hibridarse con una secuencia de (a) a (c) bajo condiciones moderadamente rigurosas y que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a al menos los aminoácidos 222 a 501 de TRAF2; o

(e): una secuencia de DNA está degenerada como resultado del código genético a las secuencias definidas en (a) a (d) y que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a al menos los aminoácidos 222 a 501 de TRAF2;

2. La secuencia de DNA según la reivindicación 1, en la que la molécula de TRAF es TRAF2.

3. La secuencia de DNA según las reivindicaciones 1 o 2, el cual DNA codifica una proteína que también modula la actividad del NF-\kappaB.

4. La secuencia de DNA según la reivindicación 3, que codifica una isoforma o un análogo de NIK, siendo capaces dichos isoforma o análogo de unirse a TRAF2, y que es capaz de modular la actividad del NF-\kappaB.

5. Un vector que comprende una secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4.

6. El vector de acuerdo con la reivindicación 5, capaz de ser expresado en una célula hospedadora eucariota.

7. El vector según la reivindicación 5, capaz de expresarse en una célula hospedadora procariota.

8. Células hospedadoras eucariotas o procariotas que contienen un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. Una proteína NIK, o una isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, codificada por una secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, siendo capaz dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma de unirse a al menos la porción de la proteína TRAF2 entre los aminoácidos 222 a 501 de TRAF2.

10. Un método para preparar una proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma según la reivindicación 9, que comprende desarrollar una célula hospedadora transformada según la reivindicación 8, bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, efectuar modificación post-traduccional, según sea necesario, para obtener dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, aislar dicha proteína expresada, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma.

11. Anticuerpos o fragmentos activos o derivados de los mismos, específicos para la proteína NIK, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma según la reivindicación 9.

12. Un método para aislar e identificar proteínas, según la reivindicación 9, capaces de unirse directamente a TRAF2, que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el que una secuencia que codifica dicha TRAF2 es portada por un vector híbrido y la secuencia procedente de una genoteca de cDNA o DNA genómico es portada por el segundo vector híbrido, siendo entonces usados los vectores para transformar células hospedadoras de levadura, y siendo aisladas las células transformadas positivas, seguido por la extracción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicha TRAF2.

13. El método según la reivindicación 12, en el que dicha proteína es NIK o al menos una de las isoformas de NIK, análogos, fragmentos y derivados de la misma.

14. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, al menos una proteína NIK, sus fragmentos biológicamente activos, análogos y derivados según la reivindicación 9, o sus mezclas.

\newpage

15. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, un vector de virus animal recombinante que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de la superficie de la célula y codificar al menos una proteína NIK, isoforma, fragmentos activos o análogos, según la reivindicación 9.

16. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de mRNA de la proteína de unión de TRAF2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

17. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de una proteína codificada por el clon 10, que comprende la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 4 o una secuencia de DNA que la codifica.

18. Un método para el cribado de un ligando capaz de unirse a una proteína según la reivindicación 9, que comprende poner en contacto una matriz de cromatografía de afinidad a la que está unida dicha proteína, con un extracto celular, con lo que el ligando se une a dicha matriz, y eluir, aislar y analizar dicho ligando.

19. Un método para el cribado de una secuencia de DNA que codifica un ligando capaz de unirse a una proteína según la reivindicación 9, que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el que una secuencia que codifica dicha proteína es portada por un vector híbrido y secuencias procedentes de una genoteca de cDNA o DNA genómico son portadas por el segundo vector híbrido, transformar células hospedadoras de levadura con dichos vectores, aislar las células transformadas positivamente, y extraer dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica dicho ligando.

20. El uso de al menos una proteína NIK, sus fragmentos, análogos y derivados biológicamente activos según la reivindicación 9, o sus mezclas, para la preparación de una composición farmacéutica para la modulación del efecto sobre las células modulado o mediado por TRAF2.

21. El uso de un vector de virus animal recombinante que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de la superficie de la célula y que codifica al menos una proteína NIK, isoforma, fragmento activo o análogo, según la reivindicación 9, para la preparación de una composición farmacéutica para la modulación del efecto sobre las células modulado o mediado por TRAF2.

22. El uso de una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de mRNA de la proteína de unión de TRAF2, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de una composición farmacéutica para la modulación del efecto modulado o mediado por TRAF2 sobre las células.

23. El uso de una proteína NIK, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, según la reivindicación 9, o de una molécula de DNA que la codifica, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de un estado patológico asociado con la inducción del NF-\kappaB o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las que se une una proteína NIK, según la reivindicación 9.