ES2268767T3

ES2268767T3 - Deteccion de cancer de endometrio.

Info

Publication number: ES2268767T3
Application number: ES98909221T
Authority: ES
Inventors: Alexander Lopata; Lois A. Salamonsen; Michael A. Quinn
Original assignee: Diagnotech Pty Ltd
Current assignee: Diagnotech Pty Ltd
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2018-03-20
Also published as: JP2002501613A; KR20010006344A; DE69835010T2; CN1257550A; WO1998042865A1; CA2284099A1; US6607894B1; CA2284099C; ZA982403B; NZ337868A; EP0979304A4; MY119567A; JP4183757B2; AUPO573697A0; EP0979304B1; DE69835010D1; JP2007202556A; EP0979304A1; ATE331039T1

Abstract

La invención se refiere a procedimientos para ensayar la presencia y/o riesgo de cáncer endometrial por medio de la medición de los niveles de la metaloproeinasa de matriz-2 y/o de la metaloproteinasa de matriz-9 en lavados uterinos. El procedimiento puede ser cualitativo y cuantitativo y es adaptable a la selección a gran escala y a ensayos clínicos.

Description

Detección de cáncer de endometrio.

Esta invención se refiere a métodos para la detección del cáncer, y en particular a la detección del cáncer de endometrio. El método de la invención es aplicable al cribado a gran escala, por ejemplo en mujeres en riesgo incrementado de cáncer de endometrio.

Antecedentes de la invención

Actualmente está claro que en muchas malignidades hay una alta correlación entre la agresividad del tumor y la expresión de proteasas por las células tumorales. En los últimos siete años, por ejemplo, se han acumulado pruebas convincentes que implican directamente a miembros de la familia de las metaloproteinasas matriciales en la invasión y metástasis tumoral.

Los clínicos son conscientes desde hace mucho tiempo de la necesidad de desarrollar criterios objetivos para la detección precoz del cáncer, y para evaluar los factores de pronóstico cuando se tratan pacientes que tienen un tumor maligno. En general, la fase del cáncer de endometrio, el grado de invasión en el miometrio, el grado y tipo histológico de tumor, y el grado de invasión del espacio linfo-vascular tienen algún valor predictivo en cuanto a la agresividad de la enfermedad. Sin embargo, ninguno de estos factores es preciso, y todos dependen de una evaluación subjetiva. Por ejemplo, el tipo y grado del tumor se determinan por examen histológico, y se ha informado de que la evaluación de éstos puede dar como resultado una cifra de desacuerdo de hasta 85% entre patólogos individuales diferentes (Baak y Oort, 1991). Por tanto, actualmente no hay medios de predecir la prognosis para una paciente individual.

Cada vez está más claro que la predicción precisa del curso del cáncer de endometrio, y la probabilidad de supervivencia después de los diversos tipos de tratamiento, también dependen de las propiedades intrínsecas de las células malignas y su interacción con el huésped (Baak, 1991). Un objetivo principal de investigación en este campo, por tanto, es descubrir las propiedades biológicas que determinan el potencial invasivo y metastático del tumor.

Se sabe, por estudios con otros tipos de cáncer, que técnicas cuantitativas relacionadas con la biología de las células tumorales, tales como la ploidía del ADN (Iversen, 1986; van der Putten et al, 1989; Berchuck et al, 1992; Podratz et al, 1993; Lukes et al, 1994), la expresión de caderina E, que media en la adhesión célula-célula (Sakuragi et al, 1994), y la secreción de metaloproteinasas matriciales (MMPs) implicadas en la invasión celular (Liotta et al, 1986; Stetler-Stevenson et al, 1993) pueden mejorar la evaluación de la prognosis y la predicción de supervivencia, proporcionando medidas objetivas reproducibles relacionadas con el comportamiento de las células neoplásicas. Se ha demostrado que alteraciones en el contenido de ADN celular (ploidía) se correlacionan con el comportamiento biológico en cánceres de ovario, mama, colon, pulmón y próstata (Seckinger et al, 1989), así como en malignidades uterinas (Moberger et al, 1985; van der Putten et al, 1989). En general, los cánceres con un contenido en ADN diploide normal tienen una mejor prognosis que los cánceres con un contenido de ADN anormal, aneuploide o poliploide. La determinación de la ploidía de ADN en el cáncer de endometrio y otros cánceres ha llegado a ser, por tanto, una poderosa herramienta para evaluar la prognosis y la probabilidad de supervivencia en relación con la recurrencia de la enfermedad, y es un mejor pronosticador que los marcadores moleculares o genéticos (Lukes et al, 1994).

Actualmente está claro que en muchas malignidades hay una alta correlación entre la agresividad del tumor y la expresión de proteasas en el tejido tumoral. En los últimos siete años, por ejemplo, se han acumulado pruebas convincentes que implican directamente a miembros de la familia de las metaloproteinasas matriciales (MMP) y de los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMPs) en la invasión y metástasis tumoral (reseñado por Stetler-Stevenson et al, 1993). Se ha sugerido que la detección de MMPs en los fluidos biológicos, especialmente como complejos con TIMPs, se puede usar para detectar el cáncer metastático (Patente de EE.UU. Nº 5.324.634, de Zucker). Estas enzimas también son sintetizadas y secretadas por células normales durante la remodelación tisular (menstruación) e invasión (implantación del embrión) fisiológicas (Salamonsen, 1995, 1996). Las MMPs pueden estar presentes en tejidos bien en la forma totalmente activa, o bien en una forma latente que requiere la activación antes de que se pueda mostrar la actividad enzimática.

Los autores de la invención han establecido recientemente que las MMPs son liberadas en la cavidad uterina durante el ciclo ovárico y las primeras fases del embarazo en monos tití (nuestros resultados no publicados). Además, se ha informado de que se produce una sobreexpresión de estas enzimas en muchas células tumorales, por ejemplo las de carcinomas colorrectales y de células escamosas.

Recientemente se ha demostrado que las células de cáncer de ovario, pero no las células epiteliales ováricas normales, secretan niveles aumentados de metaloproteinasas matriciales similares a la MMP-2 y la MMP-9, que degradan directamente las proteínas de la membrana basal (Moser et al, 1994; Salamonsen, 1996). Esta capacidad proteolítica estaba correlacionada con el potencial invasivo de las malignidades ováricas. Además, se ha usado inmunohistoquímica empleando anticuerpos monoclonales para localizar la MMP-2 en el citoplasma y las membranas plasmáticas de diversas células neoplásicas, incluyendo cánceres de endometrio, mientras que la TIMP-2 fue localizada principalmente en el estroma de estos tejidos (Hoyhtya et al, 1994). Aparte de esto, se sabe poco acerca de la expresión de MMPs y TIMPs en los cánceres de endometrio. Tal información es esencial para desarrollar estrategias para controlar el comportamiento biológico del cáncer de endometrio y de otros tipos de malignidades.

Los autores de la invención han descubierto ahora, inesperadamente, que se pueden detectar metaloproteinasas matriciales en lavados uterinos de pacientes con cáncer de endometrio, pero no en lavados similares de mujeres control. Este hallazgo hace posible un ensayo diagnóstico sensible que puede ser realizado con una invasión mínima, y un ensayo de cribado que se puede utilizar para cribar poblaciones en riesgo o la población general, o para el uso en pruebas clínicas o tratamientos putativos. El ensayo es también adecuado para verificar la eficacia del tratamiento y para la detección de recurrencias.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un método de ensayar la presencia y/o riesgo de cáncer de endometrio, que comprende medir el nivel o actividad de la metaloproteinasa matricial 2 (MMP-2) y/o la metaloproteinasa matricial 9 (MMP-9) en una muestra de lavados uterinos de la cavidad uterina de una paciente en riesgo de, o que se sospecha que padece, cáncer de endometrio, en el que un nivel o actividad elevado de MMP-2 y/o MMP-9 en el fluido de la paciente, comparado con un control, indica que está presente el cáncer de endometrio en la paciente.

Para los fines de esta memoria descriptiva, la expresión "detección del cáncer de endometrio" se usa en su sentido más amplio, e incluye la determinación de la probable presencia o ausencia de cáncer, o de células en un estado precanceroso o las fases tempranas de desarrollo de cáncer. Por tanto, la invención abarca no sólo la detección de cáncer de endometrio activo, sino también el riesgo de desarrollar tal cáncer activo.

Los lavados uterinos se pueden obtener usando cualquier solución adecuada, que se administra a la cavidad uterina y después se recupera y se recoge para su ensayo. Las soluciones adecuadas serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, e incluyen cualquier solución estéril no tóxica que no interfiera con la medición de la MMP-2 y/o MMP-9. Un ejemplo de una solución adecuada es el suero salino estéril. Se puede utilizar cualquier número de medios para la administración y recuperación de la solución de lavado; a modo de ejemplo, se usa, convenientemente, una jeringuilla y un tubo. El lavado se puede recoger en los medios de recuperación o transferir a otro recipiente. Los medios de administración, recuperación y recogida se elegirán de modo rutinario para que proporcionen comodidad y conveniencia tanto para el paciente como para el clínico.

En el método de la invención, se puede emplear cualquier técnica adecuada para determinar los niveles de MMP-2 y/o MMP-9 en los lavados. Los ejemplos de técnicas adecuadas incluyen los basados en determinar la actividad enzimática, y/o los basados en determinar la presencia o niveles de enzima. Se puede medir la MMP-2 y/o MMP-9 total, incluyendo la MMP-2 y/o MMP-9 latente, la activa y la unida a TIMP. Los expertos en la técnica podrán determinar fácilmente si una técnica es adecuada o no, si es necesario usando muestras de control positivo y negativo. Por ejemplo, la zimografía en gelatina es adecuada para la detección de todas las formas de MMP-2 y MMP-9. Opcionalmente, el ensayo zimográfico puede ser acoplado con densitometría con el fin de proporcionar una evaluación semicuantitativa de cada tipo y forma de enzima (es decir, latente o activa). Se puede ensayar también la enzima activa usando ensayos de actividad basados en el sustrato.

Se puede medir la actividad gelatinolítica total presente en los lavados uterinos; aunque esto no distingue entre los diferentes tipos de MMPs presentes, produce una estimación rápida de la actividad total de MMP. No obstante, la medida del nivel o actividad de la MMP-2 y/o MMP-9 se reivindica en la presente memoria.

Los niveles enzimáticos totales también se pueden medir usando métodos tales como ELISA, ensayo fluorométrico, ensayo quimioluminiscente o radioinmunoensayo. Los métodos de ensayo ELISA y quimioluminiscente son particularmente preferidos, dado que éstos son rápidos, sensibles y específicos, y son fácilmente automatizados para su uso a gran escala. Estos métodos también proporcionan determinaciones cuantitativas. Se detallan varios métodos apropiados para medir estas enzimas en Barrett (1995).

Opcionalmente, también se pueden determinar en los lavados uterinos los niveles de inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMPs), por ejemplo por zimografía inversa o ELISA.

Adicionalmente, se puede recoger una muestra de células endometriales superficiales al mismo tiempo que se obtienen los lavados uterinos, por ejemplo, por inserción de un cepillo uterino en la cavidad uterina, las células endometriales pueden ser sometidas a un examen citológico para la determinación de la ploidía y morfometría nuclear, y los niveles de MMP-2 y/o MMP-9, determinados como se describió anteriormente, pueden ser correlacionados con la ploidía del ADN como un indicador de la prognosis del cáncer de endometrio, cuando está presente el cáncer de endometrio.

Se pueden usar técnicas de citometría de imagen normales y equipos automatizados para la determinación de la ploidía y la morfología nuclear.

La invención se puede usar para proporcionar un método para evaluar la prognosis del cáncer de endometrio, que comprende las etapas de medir la actividad MMP en lavados uterinos obtenidos antes de la cirugía en una paciente que se somete a cirugía por cáncer de endometrio, obtener una muestra de células endometriales de dicha paciente, obtener una muestra de tumor y de endometrio normal adyacente para su examen histológico, y correlacionar la actividad MMP, la ploidía del ADN y el grado y tipo de tumor como un indicador de la prognosis.

Si por cualquier razón no es posible la cirugía para retirar el útero, el tratamiento primario del cáncer de endometrio puede ser conservativo, usando radioterapia, quimioterapia, ablación endometrial (por ejemplo, usando terapia fotodinámica, o curetaje, en vez de histerectomía); en algunos casos se usa el curetaje conjuntamente con otros métodos. En pacientes que se someten a tal tratamiento conservativo, el seguimiento y detección de la recurrencia del cáncer es particularmente importante.

Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método de verificar la eficacia de un tratamiento putativo del cáncer de endometrio, que comprende medir el nivel o actividad de MMP-2 y/o MMP-9 en una muestra de lavados uterinos de la cavidad uterina de la paciente, para detectar de este modo si el cáncer de endometrio ha recurrido, en el que un nivel o actividad disminuido de MMP-2 y/o MMP-9 en la muestra tomada después del tratamiento respecto a la muestra tomada antes del tratamiento indica que el tratamiento putativo está teniendo éxito.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de detectar la recurrencia del cáncer de endometrio en una paciente que se ha sometido a un tratamiento conservativo para el cáncer de endometrio primario, que comprende la etapa de medir el nivel o actividad de MMP-2 y/o MMP-9 en una muestra de lavados uterinos de la cavidad uterina de la paciente, en el que un nivel o actividad elevados de MMP-2 y/o MMP-9 en el fluido de la paciente, comparado con un control, indica que el cáncer de endometrio está presente o ha recurrido en la paciente.

Preferiblemente, las actividades de la MMP-2 y la MMP-9 se determinan por zimografía densitométrica cuantitativa o ELISA, como se describe anteriormente.

El método de la invención es adecuado para el cribado de mujeres asintomáticas o en buen estado de salud, o de poblaciones en riesgo, tales como mujeres diabéticas o mujeres que están sometidas a una terapia de sustitución hormonal postmenopáusica.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un kit para ensayar la presencia y/o riesgo de cáncer de endometrio, que comprende:

(a): una solución adecuada para lavar la cavidad uterina, y

(b): un medio para la administración, recuperación y recogida de los lavados uterinos.

Preferiblemente, el kit comprende además:

(c): un medio para determinar el nivel de MMP-2 y/o -9 en dichos lavados.

El kit puede incluir opcionalmente uno o más de:

(d): un medio para tomar una muestra de epitelio endometrial,

(e): uno o más portaobjetos de microscopio, y

(f): un receptáculo que contiene un fijador histológico.

En una realización preferida, el kit comprende:

(a): una solución estéril fisiológicamente aceptable para lavar la cavidad uterina,

(b): una jeringuilla estéril,

(c): un tubo de alimentación o catéter estéril,

(d): un receptáculo para los lavados uterinos, y opcionalmente,

(e): un cepillo uterino, y/o

(f): uno o más portaobjetos de microscopio.

Preferiblemente, el kit comprende adicionalmente un receptáculo que contiene un fijador histológico; más preferiblemente el fijador es paraformaldehído al 4%.

Para los fines de esta memoria descriptiva, se entenderá claramente que las palabras "que comprende" significan "que incluyen pero no están limitados a", y que la palabra "comprende" tiene un significado correspondiente.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los resultados de zimografía usando diluciones en serie de una muestra de lavados uterinos de una paciente con cáncer de endometrio.

La Figura 2 compara los resultados obtenidos con una serie de muestras de lavados uterinos de pacientes con cáncer de endometrio, en los que se realizó zimografía en ausencia (mitad izquierda del gel) o presencia (mitad derecha del gel) de inhibidores específicos de la actividad MMP.

La Figura 3 compara los resultados zimográficos obtenidos usando muestras de lavados uterinos en pacientes con cáncer de endometrio (Figura 3a) con muestras de pacientes de control (Figura 3b). Las muestras de control fueron cargadas a una concentración cuatro veces la de las muestras de las pacientes con cáncer.

La Figura 4 compara los resultados de zimografía para una muestra de lavados uterinos de una paciente con cáncer de endometrio (Calle 3) con muestras de diversas pacientes de control. Las calles 5 y 7 y 6 y 8, respectivamente, son de las mismas pacientes; sin embargo, las muestras en las calles 7 y 8 están a cuatro veces la concentración de las de las calles 5 y 6.

Las Figuras 5 y 6 muestran, cada una, una serie de diferentes muestras de pacientes con cáncer de endometrio, ejecutadas a la misma concentración con el fin de permitir la comparación directa entre muestras.

La Figura 7 muestra los resultados del ensayo ELISA de MMP-9, mostrando la densidad óptica para cada pocillo en la placa de microtitulación.

La Figura 8 muestra una representación en escala de grises de la reacción de color en la placa de microtitulación.

Descripción detallada de la invención Pacientes

La invención será descrita ahora en detalle, sólo a modo de referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, y a las Figuras.

Casi todas las pacientes que tienen tratamiento quirúrgico para el cáncer de endometrio en el Royal Women’s Hospital están incluidas en el grupo de estudio (Tabla 1).

Las mujeres que tienen procedimientos quirúrgicos o diagnósticos por otras dolencias, y han dado consentimiento a una irrigación uterina, están incluidas en el grupo de control.

Para incrementar el tamaño de las poblaciones de estudio más rápidamente, también se incluyen las pacientes que están siendo tratadas por cáncer de útero en el Mercy Hospital.

Una población de estudio comprende mujeres postmenopáusicas y perimeno- páusicas que están siendo investigadas por sangrado uterino. En estas pacientes se realiza una irrigación a vacío de la cavidad uterina antes de que se realice la histeroscopia y la dilatación y curetaje diagnósticos.

La segunda población comprende mujeres que van a tener cirugía por cáncer de endometrio. En este grupo la cavidad uterina se irriga al principio de la cirugía.

Una tercera población comprende mujeres asintomáticas, en el mismo intervalo de edades que los grupos de estudio anteriores, que tendrían una irrigación uterina y una citología epitelial endometrial, como grupo de control.

En todas las pacientes con cáncer, se van a recoger las siguientes muestras para los estudios descritos en la presente memoria:

(1): Un sobrenadante, exento de células, de los lavados uterinos para el análisis por zimografía de las enzimas secretadas (MMPs) y sus inhibidores (TIMPs). Hasta la fecha la MMP-2 y la MMP-9 han sido examinadas por zimografía en gelatina (Tabla 1), ELISA e inmunoelectrotransferencia ("inmunoblotting"). Las determinaciones de los autores de la invención de la MMP-1 y la MMP-3 usando zimografía en caseína han mostrado que estas enzimas están ausentes, o son liberadas a niveles muy bajos en las secreciones uterinas.

(2): Células endometriales para la determinación de la ploidía del ADN: en cada paciente, tales células se obtienen del sedimento de células que procede de los lavados uterinos, de epitelio endometrial recuperado con un cepillo uterino, y de marcas al toque del tumor maligno en portaobjetos de microscopio. Cada preparación se ha usado para el análisis de la ploidía, y se han obtenido resultados consistentes de los tres métodos empleados. Se ha informado previamente de que las determinaciones de la ploidía proporcionan un parámetro objetivo y reproducible para evaluar la prognosis en pacientes de cáncer.

(3): Se fijan trozos de tumor y de endometrio normal adyacente en fijador de Carnoy y en paraformaldehído. Se estudian por inmunohistoquímica secciones histológicas de estos tejidos buscando la presencia de MMPs, y buscando la transcripción de genes para estas enzimas e inhibidores usando hibridación in situ. Las muestras de tumor y de tejido normal adyacente de algunas pacientes son congeladas también para un estudio adicional posterior, p. ej., análisis directo de MMPs en el tejido.

Recogida de fluido uterino y células

Una jeringuilla que contiene 5 ml de suero salino se acopla a un tubo de alimentación. El tubo de alimentación se inserta a través del cérvix y se irriga la cavidad uterina, y el fluido que se vuelve a recoger en la jeringuilla se transfiere a un tubo de ensayo. También se inserta en la cavidad uterina un cepillo uterino, y las células endometriales superficiales son recogidas para citología.

El fluido uterino se centrifuga a 3000 rpm durante 10 minutos. Se recogen alícuotas del sobrenadante y se almacenan a -80ºC para un análisis de MMP/TIMP posterior. El sedimento de células endometriales y la muestra de citología endometrial obtenida del cepillo uterino son untados sobre portaobjetos revestidos con 3-minopropiltrietoxisilano (AAS) al 2%. Estos portaobjetos citológicos se fijan en paraformaldehído al 4% y después se tiñen con Feulgen para la evaluación de la ploidía del ADN usando citometría de imagen.

Procesado de los contenidos uterinos

En los grupos de estudio de cáncer y de control, los lavados uterinos se centrifugan inmediatamente a 3000 rpm durante 10 min para agrupar en un sedimento las células, y el sobrenadante se congela para estudios de MMP y TIMP posteriores. El sedimento de células de ambos grupos se prepara para la determinación de la ploidía del ADN usando citometría de imagen como se describe más adelante. En pacientes que sufren resección quirúrgica por cáncer de endometrio se preparan las siguientes muestras. Después de abrir el útero reseccionado se toman al menos dos preparaciones al toque de la superficie del tumor para determinaciones de la ploidía del ADN, como con el sedimento celular. Además, una muestra de tejido maligno, particularmente en un área de invasión, y una muestra de tejido endometrial normal adyacente, se excinden para estudios inmunohistoquímicos y de hibridación in situ antes de que el resto del útero se procese para el examen histopatológico. Este último incluye la evaluación de la profundidad de la invasión miometrial, así como el grado y tipo de tumor. Además se determina la presencia o ausencia de metástasis en nódulos linfáticos o adnexales.

Estudios de la ploidía del ADN

El sedimento de células epiteliales descamadas obtenidas de los lavados uterinos se dispersa, se lava con medio de cultivo, se resuspende y se filtra a través de un filtro de nylon de 60 \mum de malla. La suspensión de células se fija a portaobjetos de vidrio revestidos con polilisina por centrifugación citospin. En estas preparaciones y para las marcas al toque de tumores uterinos se usa un sistema de análisis de imágenes ópticas computerizadas para cuantificar el teñido de Feulgen del ADN. El instrumento se calibra usando células que tienen una cantidad conocida de ADN (hepatocitos de rata), que han sido teñidas junto con las muestras de ensayo en un extremo del portaobjetos. Se seleccionan y analizan entre 200 y 300 células. Según se escanean los núcleos individuales se generan histogramas del contenido en ADN por célula, y se hace la determinación de la ploidía en base a estos histogramas mediante la localización de los picos principales y secundarios (índice de ADN diploide 1,0 \pm 0,1).

Análisis de MMPs y TIMPs en los lavados uterinos

Las actividades enzimáticas en los lavados uterinos se analizan por zimografía en gelatina (MMP-2, MMP-9) o caseína (MMP-1, MMP-3, MMP-7). Las muestras se someten a electroforesis SDS-PAGE en geles de acrilamida al 10% que contienen bien gelatina o bien caseína (cada una 1 mg/ml) bajo condiciones no reductoras. Después de lavar en un tampón que contiene 50 mmol/l de Tris-HCl, 5 mmol/l de CaCl_{2}, NaN_{3} al 0,02% (p/v; pH 7,5) y Triton X-100 al 1%, los geles se incuban en el mismo tampón sin Triton a 37ºC durante 2-24 h, y se tiñen con Azul Brillante Coomasie. La actividad gelatinasa o caseinasa se visualiza por teñido negativo del gel. Esta técnica detecta tanto MMPs latentes como activas, porque el SDS activa las MMPs latentes. Donde sea apropiado, se añaden inhibidores de MMPs durante la incubación (5 mmol/l de EDTA y 2,5 mmol/l de o-fenantrolina). Para la cuantificación, con el fin de compensar la amplia variabilidad en el contenido de proteínas de los lavados uterinos entre individuos, el volumen cargado se relaciona con el volumen total del fluido del lavado uterino, permitiendo así la evaluación de concentraciones de MMP relativas en la luz uterina de cada individuo. Los geles se someten a análisis densitométrico usando un Desk Scanner HP con software Deskscan y la versión 1.54 del programa NIH Image dotada de macros de representación de gel, midiendo el área bajo los picos representados mediante el perfil de calle, bien para la enzima de interés o bien para una muestra individual. Las comparaciones cuantitativas se hacen sólo dentro de un gel o un conjunto de geles, vertidos y ejecutados en paralelo. Cada gel contiene al menos dos diluciones de un patrón, y cada conjunto de geles contiene cuatro diluciones de este patrón. Donde las actividades de una enzima de interés son muy altas, las muestras se diluyen adicionalmente y se vuelven a ejecutar. El uso de la zimografía de esta manera como técnica cuantitativa ha sido descrito (Kleifner y Stetler-Stevenson, 1994, y las referencias enumeradas allí). La técnica es muy sensible, siendo el límite de detección mucho más bajo que con métodos tales como ELISA, los cuales tienen un límite de detección en el intervalo de ng por muestra, y tanto para MMP-2 como para MMP-9 el límite de detección es del orden de 2 pg por muestra (1 nM).

Ensayo de la actividad gelatinasa

Este ensayo implica la incubación de la muestra con un sustrato de colágeno marcado con ^{14}C. El sustrato se aísla de piel de cobaya, se dializa, se marca con ^{14}C y, justo antes de su uso, se desnaturaliza por calor a 60ºC durante 20 min para ser convertido en una forma, ^{14}C-gelatina, que puede ser digerida por las enzimas MMP-2 y MMP-9.

La actividad gelatinolítica total se mide incubando el sustrato con 100 \mug/ml de tripsina. Las muestras, o bien se dejan sin tratar, o bien se preincuban con acetato aminofenilmercúrico para activar las MMPs latentes. Las muestras de ensayo se incuban a 37ºC durante 4-24 h, y la reacción es inactivada por la adición de ácido tricloroacético al 30%/ácido tánico al 1%. Se forma un precipitado de cualquier sustrato sin digerir. Cualquier actividad enzimática se mide contando la cantidad de sustrato marcado digerido y liberado al sobrenadante. Usando este sistema de ensayo, es posible calcular la actividad específica en cada muestra; una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima capaz de degradar 1 \mum de sustrato por minuto a 37ºC. El ensayo es útil para definir tanto la actividad enzimática ya activa en la muestra, como la actividad potencialmente disponible después de la activación de la enzima latente; en términos fisiológicos esto representaría la velocidad a la cual la enzima en la muestra está degradando los componentes de la matriz extracelular. El ensayo sólo mide la actividad gelatinasa total; no distingue entre la actividad de gelatinasas tales como la MMP-2 y la MMP-9. Las MMPs específicas pueden ser diferenciadas por zimografía.

Inmunohistoquímica e hibridación in situ

Se han descrito en la bibliografía reactivos específicos y métodos para el análisis de MMPs y TIMPs (por ejemplo, Rawdanowicz et al, 1994; Jeziorska et al, 1996; Salamonsen y Wooley, 1996). Los antisueros están disponibles comercialmente en la actualidad (por ejemplo en Biogenesis Ltd., Reino Unido, Triple Point Biologics, Oregón, EE.UU., The Binding Site, Reino Unido) y están disponibles también enzimas y TIMPs puras (Calbiochem, Cambridge, Massachusetts, EE.UU.). Todos los genes relevantes han sido clonados, y las secuencias están publicadas y disponibles en el dominio público.

La inmunohistoquímica se realiza en tejidos fijados en Carnoy o paraformal- dehído, implantados en cera, usando los antisueros detallados anteriormente y el sistema de detección de fosfatasa alcalina/antifosfatasa alcalina (APAAP) (Serotec) (Salamonsen et al, 1991; Salamonsen et al, 1993; Rawdanowicz et al, 1994). La fijaciónen paraformaldehído es, de manera general, más conveniente, y da mejores resultados para muestras pequeñas. La hibridación in situ usa sondas de ADN o ARN marcadas con digoxigenina.

Ejemplo 1 MMPs liberadas en la cavidad uterina en pacientes en las que se investiga El cáncer de endometrio

Se examinó por zimografía la MMP-2 y la MMP-9 en muestras de 52 pacientes con cáncer de endometrio y 40 pacientes de control que se sometían a procedimientos diagnósticos por sangrado uterino o por otras dolencias ginecológicas, y la ploidía del ADN de células endometriales superficiales por citometría de imagen. Para las pacientes en las que se encontró que tenían cáncer de endometrio, se evaluó el grado de malignidad. La MMP-2 y MMP-9 fueron resueltas adicionalmente, en los siguientes tipos moleculares putativos: MMP-2 latente, MMP-2 activa, MMP-9 dimérica, pro-MMP-9 glicosilada y MMP-9 activa. Las identidades de la MMP-2 y la MMP-9 latentes y activas fueron confirmadas posteriormente, como se describe en un ejemplo posterior.

Los resultados se resumen en las Tablas 1 y 2. Además, se midió la MMP-1, MMP-3 y MMP-7 usando zimografía en caseína, pero no se encontraron niveles detectables ni en los lavados uterinos del control ni en los del cáncer de endometrio.

La Tabla 1 resume los resultados de zimografía obtenidos en pacientes con cáncer de endometrio de diversos grados en relación con otros parámetros clínicos y patológicos en este grupo. La zimografía de gelatinasa resolvió dos formas moleculares de MMP-2 y tres formas moleculares de MMP-9. Hasta la fecha la actividad gelatinolítica más débil detectada en los lavados uterinos de cáncer de endometrio reveló una forma de MMP-2 (asignada como +) y dos formas de MMP-9 (ambas asignadas como +), en la paciente codificada como J.O. Si un total de tres signos más, puntuado como la suma de cualquiera de los niveles de restos MMP, se establece como nivel mínimo requerido para una diagnosis positiva de cáncer de endometrio, ninguno de los controles mostrados en la Tabla 2 sería diagnosticado como falso positivo. Hasta la fecha no se han encontrado resultados falsos negativos (ausencia de ninguna actividad MMP) en el grupo del cáncer de endometrio. En términos de los lavados uterinos individuales de pacientes con cáncer, el nivel de actividad gelatinolítica observado osciló entre 3 y 22 signos más.

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2

3

La Tabla 2 resume los resultados de zimografía obtenidos en las pacientes de control (sin cáncer de endometrio clínicamente detectable), así como otros parámetros clínicos y patológicos en este grupo. La zimografía de gelatinasa reveló la presencia de un nivel muy bajo de MMP-2 latente en cinco pacientes y un nivel muy bajo de la gelatinasa de 120 kDa (MMP-9 putativa) en una paciente. Hasta la fecha no se detectaron otras formas de MMP en lavados uterinos diluidos para los ensayos de zimografía. La ausencia de actividad gelatinolítica detectable en los lavados uterinos de la mayoría de las pacientes de control, o una muy baja actividad de una única forma molecular de MMP, puntuado como un máximo de un signo más, sugiere que cuando se detectan varios restos de MMP en los lavados uterinos se puede hacer una diagnosis específica y sensible del cáncer de endometrio.

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Ejemplo 2 Ensayo ELISA de MMP-9 y MMP-2

El kit de ELISA de MMP-9 Biotrak^{TM} (Calbiochem^{R}) proporciona una determina- ción simple y específica de la MMP-9 en muestras de lavado uterino. La sensibilidad del ensayo es 0,6 ng/ml. El ensayo usa dos anticuerpos dirigidos contra diferentes epitopos de la MMP-9. Cualquier MMP-9 presente en las muestras o los patrones se une a una placa de microtitulación prerrevestida con anti-MMP-9. Esto es seguido de una segunda etapa de incubación, en la que se añade un anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante y se forma un complejo inmovilizado. La cantidad de complejo de peroxidasa en cada pocillo se determina por una reacción de color que implica la adición de un sustrato de tetrametilbencidina a cada pocillo. El color azul resultante se mide a 630 nm en un espectrofotómetro de placas de microtitulación (Beckman).

Se genera una curva patrón representando la densidad óptica media a 630 nm contra los ng/ml de patrón. A partir de esta, la concentración (ng/ml) de cada muestra se determina por extrapolación desde el gráfico.

Una placa de microtitulación (96 pocillos) permite la construcción de una curva patrón y la medida de 40 desconocidos por duplicado. El protocolo ELISA permite que se obtengan resultados en un día.

Se prepararon muestras de 10 pacientes con cáncer y 10 pacientes de control sin diluir y diluidas 1:4, y después se ensayó la presencia o ausencia de MMP-9. La Figura 7 representa los datos en bruto, donde se muestra la densidad óptica para cada pocillo en la placa de microtitulación. La Figura 8 es una representación en escala de grises de la reacción de color resultante en la placa de microtitulación; esto, a su vez, es una representación somera de la cantidad de MMP-9 presente en las muestras de lavado uterino. Todas las muestras de cáncer tienen un valor de densidad óptica significativamente por encima de los controles, tanto que los valores medidos de las muestras de cáncer estuvieron fuera de la curva patrón. Como continuación de este trabajo, se hacen diluciones en serie de varias muestras y se ensayan usando la prueba ELISA. Este procedimiento de titulación establece valores límite o niveles basales de MMP-9 (en ng/ml) para detectar el cáncer de útero.

Este método también se puede usar para medir MMP-2, usando un kit ELISA de MMP-2 Biotrak^{TM}, adquirido también en Calbiochem^{R}.

Ejemplo 3 Estudios de biología celular

En pacientes que se sabía que tenían cáncer de útero, se realizó una histerectomía como parte del procedimiento de tratamiento. Después de la resección del útero, donde fue posible, se excindieron tejidos endometriales de dos sitios:

(a): en el sitio correspondiente a la ubicación de la lesión maligna, y

(b): en un sitio donde el endometrio pareció ser normal en un examen macroscópico.

Ambas muestras de tejido tumoral y normal se homogeneizaron en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), que contenía NaCl 0,15 M, CaCl_{2} 10 mM, y Brij 35 al 0,05%, en hielo. Se obtuvieron los sobrenadantes por centrifugación, y las concentraciones de proteínas se determinaron por el método de unión al tinte usando el reactivo de ensayo de proteínas BioRad.

La expresión de MMP en los homogenatos tisulares fue examinada por zimografía en gelatina. Los sobrenadantes, corregidos para la misma cantidad de proteína por calle, fueron sometidos a electroforesis SDS-PAGE usando geles impregnados de gelatina como se describe anteriormente.

Los zimogramas indicaron que se liberó tanto MMP-9 como MMP-2 de todas las muestras de tejido. Estuvo claro, sin embargo, que las muestras de tejido de la región del endometrio normal liberaron niveles de MMP significativamente más bajos que las muestras de tejido tumoral de la misma paciente. Por tanto, apareció que había una regulación en ascenso, particularmente de MMP-9, en el tejido tumoral.

Estos estudios indican que los elevados niveles de MMP-9 y MMP-2, detectados por medio de la invención que se describió en las secciones previas, procedieron predominantemente de secreciones del tejido canceroso presente en el útero, en vez de proceder de tejido no humano.

Ejemplo 4 Cultivo de células cancerosas endometriales

Después de una histerectomía se excindió del útero tejido endometrial que procedía del sitio del tumor, como se describe anteriormente. Esta muestra de tejido fue diseccionada en trozos más pequeños, y después se lavó en Medio Esencial Mínimo alfa (MEM) que contenía FCS al 10%. Los fragmentos de tejido tumoral se incubaron después a 37ºC durante 40 minutos en una solución de colagenasa/MEM sin FCS. Las células disociadas se lavaron en MEM + FCS al 10% y después se sembraron sobre placas de cultivo de 7 cm^{2}.

Las células, que crecieron vigorosamente, llegaron a ser confluentes en 3 a 4 días, y parecieron comprender una población de células morfológicamente homogénea. En contraste, las células epiteliales procedentes de una región normal del endometrio no pudieron establecer monocapas adecuadas en el mismo periodo de tiempo. Cuando las células tumorales llegaron a ser confluentes, el medio de cultivo fue reemplazado por MEM libre de suero. Las células fueron cultivadas bajo condiciones libres de suero durante 24 horas antes de recogerse el medio para determinar por zimografía el perfil de las MMPs secretadas. Se identificó tanto pro-MMP-2 como pro-MMP-9 en los geles. Este estudio indicó que las células cancerosas cultivadas secretan un perfil enzimático similar al secretado por las células cancerosas en la cavidad uterina.

Ejemplo 5 Inmunoelectrotransferencia ("Inmunoblotting")

Se sometieron muestras de lavados uterinos a electroforesis SDS-PAGE usando geles al 10%. Se ejecutaron las muestras bajo condiciones reductoras, y fueron transferidas después a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno). La membrana se lavó en tampón de bloqueo antes de ser sondada con un anticuerpo monoclonal de la MMP-2 (IM33L, Calbiochem^{R}). Esto fue seguido de tres lavados de 10 minutos en TBS (pH 7,4) y la incubación de la membrana con un anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante. Se usó después una reacción de quimioluminiscencia para detectar el antígeno MMP-2 inmovilizado. En esta reacción, la enzima peroxidasa de rábano picante cataliza la emisión de luz a partir de la oxidación del reactivo luminol. Se usó un reactivo potenciador para aumentar la emisión. La luz emitida, que es dependiente de la cantidad de antígeno en la membrana, fue capturada en película de autorradiografía, produciendo un registro permanente de los resultados.

La MMP-9 fue detectada de la misma manera usando un anticuerpo monoclonal específico de la MMP-9 (IM37L, Calbiochem^{R}).

Esta técnica definió claramente la identidad de las enzimas detectadas en los lavados uterinos de pacientes con cáncer de endometrio. La inmunoelectro- transferencia mostró que las dos enzimas principales detectadas por zimografía eran MMP-2 y MMP-9. Se detectaron también bandas adicionales, pero la naturaleza molecular de estas gelatinasas aún está por identificar. Provisionalmente, estas se contemplan como formas alternativas de MMP-2 y MMP-9 (por ejemplo, las formas putativas de MMP-2 y MMP-9 mostradas en la Tabla 1).

Ejemplo 6 Análisis uterino por ultrasonidos y análisis de MMP del fluido uterino para la detección del cáncer de endometrio

El objetivo de esta prueba prospectiva fue evaluar la sensibilidad y especificidad de los ensayos de MMP con fluido uterino para detectar el cáncer de endometrio en mujeres que son investigadas por sangrado uterino anormal por ultrasonografía vaginal. Dado que la investigación implicaba histerosonografía de infusión salina, se proporcionó una muestra de lavado uterino inicial para el análisis de MMPs en nuestro laboratorio en pacientes que consintieron hacerse la prueba. La población que fue investigada comprende mujeres peri- y postmenopáusicas con una edad de 45 a 65 años. Se esperaba que este estudio revelara la incidencia de niveles elevados de MMPs uterinos en una población de mujeres con un riesgo más alto de tener cáncer de útero que mujeres asintomáticas de la misma edad. Se ha estimado que la incidencia del cáncer de endometrio en la población en riesgo oscila de 2 a 10%.

La Tabla 3 resume los resultados obtenidos. De las 105 pacientes en las que se estudió el fluido uterino por zimografía en gelatina, 8 (7,6%) pacientes tenían niveles elevados de MMPs. De las 8 pacientes con un ensayo MMP positivo, se encontró que 5 tenían cáncer de útero, mediante un examen histopatológico de sus tejidos endometriales. En las otras 3 pacientes no se detectaron anormalidades por examen histopatológico. No obstante, los elevados niveles de MMPs en el fluido uterino pueden justificar un seguimiento regular de tales pacientes, particularmente para determinar si esta elevación está asociada con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer de útero. No se obtuvieron resultados falsos negativos.

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Los autores de la invención han encontrado que las secreciones uterinas de todas las mujeres con cáncer de endometrio en el presente estudio contenían niveles notablemente elevados de MMP-2 y MMP-9, comparado con niveles ausentes o muy bajos en las secreciones uterinas del grupo de control. Esta distinta y consistente diferencia en los niveles enzimáticos entre los grupos de cáncer y de control sugiere fuertemente que el análisis de las MMP en las secreciones uterinas es útil como prueba diagnóstica sensible y fiable para todos los grados de carcinoma de endometrio.

Dado que la irrigación uterina es un procedimiento relativamente simple y no intrusivo, el ensayo de las muestras de lavado uterino por zimografía en gelatina, o un medio alternativo de ensayo de las MMP, tal como el ELISA, se puede usar como ensayo de cribado de rutina para la malignidad endometrial, opcionalmente junto con un frotis de Pap para enfermedades cervicales. El análisis estadístico preliminar sugiere que la sensibilidad de la prueba acorde con la invención es 100%. Esto se compara muy favorablemente con la sensibilidad de 80% observada usualmente con el frotis de Pap convencional. El ELISA o los ensayos quimioluminiscentes pueden ser automatizados fácilmente, y son adecuados para el uso en el cribado a gran escala y en ensayos clínicos.

Además, los hallazgos actuales de los autores de la invención sugieren fuertemente que la MMP-2 y la MMP-9 están implicadas en el crecimiento del cáncer de endometrio, y probablemente en la extensión del tumor en el útero. Esto puede proporcionar la base lógica para usar inhibidores de enzimas específicos, junto con otras modalidades de tratamiento, en el tratamiento global de los cánceres de útero.

El número de pacientes para cada grado de adenocarcinoma endometrial era demasiado pequeño para extraer ninguna conclusión acerca del nivel de MMP-2 y MMP-9 en relación con el grado histológico o profundidad de la invasión miometrial. En general, no obstante, los niveles más altos de ambas MMPs se encontraron en las dos pacientes que tenían la invasión más profunda. Se encontró que cada una de estas mujeres tenía células tumorales poliploides y un grado de malignidad estimado como moderado (Tabla 1). Esto sugiere que los niveles de MMP-2 y MMP-9 proporcionan un suplemento útil a los indicadores de pronóstico conocidos previamente.

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Claims

1. Un método de detectar la presencia y/o riesgo de cáncer de endometrio, que comprende medir el nivel o actividad de la metaloproteinasa matricial 2 (MMP-2) y/o la metaloproteinasa matricial 9 (MMP-9) en una muestra de lavados uterinos de la cavidad uterina de una paciente en riesgo de, o que se sospecha que padece, cáncer de endometrio, en el que un elevado nivel o actividad de MMP-2 y/o MMP-9 en el fluido de la paciente, comparado con un control, indica que el cáncer de endometrio está presente en la paciente.

2. Un método de detección de la recurrencia del cáncer de endometrio en una paciente que se ha sometido a un tratamiento conservativo para el cáncer de endometrio primario, que comprende la etapa de medir el nivel o actividad de MMP-2 y/o MMP-9 en una muestra de lavados uterinos de la cavidad uterina de la paciente, en el que un elevado nivel o actividad de MMP-2 y/o MMP-9 en el fluido de la paciente, comparado con un control, indica que el cáncer de endometrio está presente o ha recurrido en la paciente.

3. Un método de verificar la eficacia de un tratamiento putativo para el cáncer de endometrio en una paciente, que comprende medir el nivel o actividad de MMP-2 y/o MMP-9 en una muestra de lavados uterinos de la cavidad uterina de la paciente, para detectar de este modo si el cáncer de endometrio ha recurrido, en el que un nivel o actividad disminuidos de MMP-2 y/o MMP-9 en la muestra tomada después del tratamiento, respecto a la muestra tomada antes del tratamiento, indica que el tratamiento putativo está teniendo éxito.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se miden las enzimas gelatinolíticas totales en los lavados uterinos.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la actividad de las MMP se detecta por zimografía, opcionalmente junto con medición densitométrica.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los niveles enzimáticos totales se miden usando ELISA, ensayo fluorométrico, ensayo quimioluminiscente o radioinmunoensayo.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que los niveles de MMP se miden por ELISA.

8. Un método según la reivindicación 6, en el que los niveles de MMP se miden por ensayo quimioluminiscente.

9. Un método según la reivindicación 5, en el que los niveles de MMP-2 y MMP-9 se miden por zimografía densitométrica cuantitativa.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra de lavados uterinos comprende fluido uterino diluido.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se mide la actividad de las MMP de una muestra de lavados uterinos exenta de células.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la paciente en riesgo de cáncer de endometrio es perimenopáusica o postmeno- páusica, genéticamente predispuesta al cáncer de endometrio, o está tomando medicación que tiene como efecto secundario potencial el cáncer de endometrio.

13. Un kit para detectar la presencia y/o riesgo de cáncer de endometrio en una paciente en riesgo de, o que se sospecha que padece, cáncer de endometrio, que comprende:

(a): una solución adecuada para irrigar la cavidad uterina de la paciente, y

(b): un medio para la administración, recuperación y recogida de los lavados uterinos, y

(c): un medio para determinar el nivel o actividad de la MMP-2 y/o MMP-9 en dichos lavados.

14. Un kit según la reivindicación 13, que comprende además uno o más de:

(d): un medio para tomar una muestra de epitelio endometrial,

(e): uno o más portaobjetos de microscopio, y

(f): un receptáculo que contiene un fijador histológico.

15. Un kit según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, que comprende:

(a): una solución estéril fisiológicamente aceptable para irrigar la cavidad uterina de la paciente,

(b): una jeringuilla estéril,

(c): un tubo de alimentación o catéter estéril,

(d): un receptáculo para recibir los lavados uterinos,

(e): un medio para determinar el nivel o actividad de la MMP-2 y/o MMP-9 en dichos lavados, y opcionalmente,

(f): un cepillo uterino, y/o

(g): uno o más portaobjetos de microscopio.

16. Un kit según la reivindicación 15, que comprende adicionalmente un receptáculo que contiene un fijador histológico.

17. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el fijador es paraformaldehído al 4%.