DE3751751T2

DE3751751T2 - Für das t-zell oberflächenprotein t4 kodierende dna und verwendung von t4-fragmenten bei der behandlung von aids

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Publication number: DE3751751T2
Application number: DE3751751T
Authority: DE
Inventors: Richard Axel; Leonard Chess; Dan Littman; Paul Maddon; J Mcdougal; Robin Weiss
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1986-08-21
Filing date: 1987-08-20
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2007-08-21
Also published as: DK217288D0; DK175520B1; EP0280710B1; EP0280710A1; US6570000B1; AU616639B2; JP3134874B2; ATE135747T1; US5871913A; AU7879287A; DK217288A; JPH01500879A; EP0280710A4; WO1988001304A1; CA1340627C; DE3751751D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In dieser Anmeldung sind verschiedene Publikationen durch arabische Zahlen in Klammern angegeben. Die vollständigen Zitate dieser Literaturstellen finden sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Patentansprüchen. Die Offenbarungen dieser veröffentlichungen in ihrer Gänze sind hierbei durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, vollständig zu beschreiben.
Die unterschiedlichen funktionellen Klassen von T-Lymphozyten erkennen Antigene auf der Oberfläche unterschiedlicher Populationen von Targetzellen. T-Helferzellen treten in starkem Maße mit Makrophagen und B-Zellen in Wechselwirkung. Cytotoxische T-Zellen treten mit einem breiten Bereich von Antigene tragenden Targetzellen in Wechselwirkung. Diese zellulären Erkennungsvorgänge werden höchstwahrscheinlich durch die spezifische Verbindung von Oberflächenmolekülen sowohl auf dem Effektor als auch auf den Targetzellen vermittelt. Die Oberfläche der T-Zellen ist durch eine Zahl von polymorphen sowie nichtpolymorphen Proteinen, die für den größten Teil auf T-Lymphozyten beschränkt sind, charakterisiert. Obwohl die meisten dieser Moleküle allen T-Zellen gemeinsam sind, werden auf den verschiedenen funktionellen Klassen von T-Zellen grundlegend zwei Klassen von Oberflächenproteinen unterschieden. Diese Proteine wurden mit T- Zellen-Targetzellen-Wechselwirkungen in Verbindung gebracht.
Eine Klasse der Oberflächenmoleküle unterscheidet die funk tionellen Hauptuntergruppen der T-Lymphozyten: die Oberflächenglycoproteine T4 und T8. Früh in der Thymusentwicklung werden die Glycoproteine T4 und T8 auf der Oberfläche der Thymozyten coexprimiert (1). Im peripheren Immunsystem werden die T4- und T8-Moleküle auf wechselseitig ausschließlichen Untergruppen von T-Zellen und nur selten auf derselben Zelle exprimiert (2, 3). Das T4-Molekül wird auf T-Zellen exprimiert, die mit Targets bzw. Zielen wechselwirken, die die Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) -Moleküle der Klasse II tragen, während Ta-tragende T-Zellen mit Targets bzw. Zielen wechselwirken, die MHC-Proteine der Klasse I exprimieren (4, 5, 6, 7, 8, 9). Die T4-Population der T- Lymphozyten enthält Helferzellen, während die T8-Population den Großteil der cytotoxischen Zellen und Suppressorzellen enthält (6, 10). Seltene T4&spplus;-T-Zellen können jedoch als cytotoxische Zellen oder Suppressorzellen fungieren (6, 10). Dies legt die Vermutung nahe, daß die Expression von T4 oder T8 stärker zwingend mit der Erkennung der MHC-Klasse als mit der Effektorfunktion verbunden ist. Die Signifikanz dieser Moleküle bei T-Zellen-Targetzellen-Wechselwirkungen kann durch Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern demon striert werden. Gegen spezielle Epitope des T4-Moleküls (oder des Mäuseäquivalents L3T4) gerichtete Antikörper hemmen eine antigeninduzierte T-Zellenproliferation, Lymphokinfreisetzung und Helferzellenfunktion (7, 8, 11, 12, 13). In ähnlicher Weise hemmen gegen T8 (oder das Mäuseäquivalent Lyt2) gerichtete monoklonale Antikörper ein durch cytotoxische T-Zellen vermitteltes Töten (14, 15). Diese Beobachtungen führten zusammen mit der Tatsache, daß T4 und T8 keinen signifikanten Polymorphismus zeigen, zu der Hypothese, daß T4 und T8 nicht polymorphe Regionen der Moleküle der Klasse II bzw. der Klasse I erkennen.
Eine zweite Klasse von Proteinen, von denen angenommen wird, daß sie sich auf verschiedenen Effektor-T-Zellen unterscheiden, sind die Rezeptoren, die Antigene in Verbindung mit polymorphen Regionen der MHC-Moleküle erkennen (16, 17, 18). Die Wechselwirkungen der Helfer-T-Lymphozyten sind in großem Maße auf Antigene tragende Targetzellen, die MHC-Proteine der Klasse II exprimieren, beschränkt, während cytotoxische T-Zellen und Suppressor-T-Zellen auf Targetzellen bzw. Zielzellen, die MHC-Moleküle der Klasse I tragen, beschränkt sind (4, 5, 6, 7, 8, 9). Diese speziellen Wechselwirkungen können durch den (die) T-Zellenrezeptor(en), die Antigene im Zusammenspiel mit speziellen MHC-Molekülen erkennen, vermittelt werden (17, 18). Somit können die T-Lymphozyten zwei unabhängige Rezeptoren mit der Fähigkeit zur Erkennung sowohl konstanter als auch polymorpher Determinanten von MHC- Proteinen aufweisen, wobei diese Rezeptoren für ein spezielles Zielen auf funktionell unterschiedliche Populationen von T-Zellen verantwortlich sein können.
Das beim Menschen vorkommende erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) ist durch eine Verarmung an T4&spplus;-Lymphozyten gekennzeichnet. Als Folge wird die T-Zellen-vermittelte Immunität bei AIDS-Patienten beeinträchtigt. Dies führt zum Auftreten schwerer opportunistischer Infektionen und unüblicher Neoplasmen. AIDS rührt von der Infektion der T-Lymphozyten mit einer Ansammlung von eng verwandten Retroviren (LAV, HTLV-III oder ARV), die nun als Humanimmunodefizienzviren (HIV) bezeichnet werden, her. Der Bereich der Infektiosität dieser Mittel ist auf Zellen beschränkt, die das T4-Glycoprotein auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Folglich kann das T4-Glycoprotein nicht nur als Rezeptor für Moleküle auf der Oberfläche von Targetzellen, sondern auch als Rezeptor für das AIDS-Virus dienen. Gegen T4 gerichtete monoklonale Antikörper unterbinden in vitro eine Infektion von T4&spplus;-Zellen durch das AIDS-Virus. Darüber hinaus haben jüngste Untersuchungen gezeigt, daß sich, wenn T4&spplus;- T-Lymphozyten dem AIDS-Virus ausgesetzt werden, das 110-kd- Hüllglycoprotein des Virus mit dem T4-Molekül auf der Wirtzelle verbindet. Der lymphotrope Charakter des Virus könnte folglich durch die eingeschränkte Expression seines Rezeptors T4 in Unterpopulationen von T-Lymphozyten erklärt werden.
Die Verarmung an T4&spplus;-T-Lymphozyten bei AIDS führt zur Beeinträchtigung der zellulären Immunantwort. Darüber hinaus geht AIDS häufig mit Fehlfunktionen des zentralen Nervensystems (ZNS) sehr häufig als Folge einer subakuten Encephalitis einher. AIDS-Virus-RNA und -DNA wurde in infizierten Gehirnen identifiziert, wobei das Virus sowohl aus Gehirn als auch aus Gehirnflüssigkeit von Patienten mit neurologischen Störungen isoliert wurde. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, daß das AIDS-Virus Gehimzellen infiziert und direkt für die bei AIDS-Patienten beobachteten ZNS- Läsionen verantwortlich ist. Somit kann das AIDS-Virus neurotrop und lymphotrop sein. Es ist folglich von Bedeutung zu bestimmen, ob T4 auch im Gehirn exprimiert wird oder ob weitere gehirnspezifische Oberflächenmoleküle als Rezeptor für das AIDS-Virus dienen können.
Das Aufdecken der speziellen Wechselwirkungen von T4 und T8 würde durch die Isolierung der T4- und Ta-Gene, die Bestimmung ihrer Struktur und die Fähigkeit, sie in unterschiedliche zelluläre Umgebungen einzuführen, erleichtert werden. Die Isolierung und Sequenz einer CDNA mit Kodierung für das T8-Molekül wurde jüngst berichtet (19, 20, 21). Die abgeleitete Proteinsequenz zeigt, daß T8 ein membrangebundenes Glycoprotein mit einer N-terminalen Domäne ist, die eine Homologie mit dem variablen Bereich der leichten Ketten von Immunoglobulin zeigt.
Jüngst wurde über die Isolierung und Nucleotidsequenz einer cDNA mit Kodierung für das die vollständige Länge aufweisende T-Zellen-Oberflächenprotein T4 berichtet (vgl. P.J. Maddon und Mitarbeiter, Cell, Band 42, Nr. 1, August 1985, S. 93-104 und M. Isobe und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Band 83, 5. 4399-4402). Es wurde vermutet, daß T4 eine Komponente des AIDS-Virusrezeptors ist, da der Bereich der Infektiosität der AIDS-Viren auf Zellen beschränkt ist, die das Oberflächen-T4-Protein exprimieren. Jüngste Untersuchungen zeigten, daß gegen T4-Epitope gerichtete monoklonale Antikörper eine AIDS-Virusinfektion von T5&spplus;-Zellen unterbinden. Die Verfügbarkeit von T4 sollte somit eine detaillierte Analyse dieses speziellen Erkennungsvorgangs ermöglichen (vgl. P.J. Maddon und Mitarbeiter, Cell, Band 42, Nr. 1, August 1985, S. 101).
Basierend auf diesen Erkenntnissen lag der vorliegenden Erfindung das Problem zugrunde, therapeutische Mittel auf der Basis von T4-Glycoproteinen anzugeben, die bei der Behandlung von durch AIDS-Viren verursachten Erkrankungen verwendet werden können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit Kodierung für ein wasserlösliches Polypeptid mit einem Teil eines T4-Glycoproteins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das wasserlösliche Polypeptid zur spezifischen Bildung eines Komplexes mit einem Human-Immunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein fähig ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein wasserlösliches Polypeptid mit der Fähigkeit zur speziellen Bildung eines Komplexes mit einem Human-Immunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das wasserlösliche Polypeptid einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt. Dieses Polypeptid wird durch das oben beschriebene einzelsträngige Nucleinsäuremolekül kodiert.
Das erfindungsgemäße lösliche Polypeptid kann als therapeutisches Mittel, d.h. als Prophylaxe, zur Behandlung eines mit Human-Immunodefizienzvirus infizierten Patienten verwendet werden. Darüber hinaus kann sich ein gegen das erfindungsgemäße lösliche Polypeptid gerichteter monoklonaler Antikörper als Impfstoff zur Immunisierung eines Menschen gegen Human-Immunodefizienzvirus eignen. Darüber hinaus kann sich ein gegen das erfindungsgemäße lösliche Polypeptid gerichteter monoklonaler Antikörper zur Herstellung von T4- Glycoprotein-anti-Idiotypen-Antikörpern eignen. Diese T4- Glycoprotein-anti-Idiotypen-Antikörper können sich als Prophylaxe zur Behandlung eines mit Human-Immunodefizienzvirus infizierten Patienten eignen.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1: Cytofluorographische Muster des indirekten Immunofluoreszenzanfärbens mit OKT(R)4 und OKT(R)8

5 x 10&sup5; Zellen wurden mit den monoklonalen Mäuseantikörpern OKT(R)4B oder OKT(R)8 inkubiert, gewaschen und anschließend mit FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Immunoglobulin inkubiert. Die Zellen wurden auf einem FACS-IV-Zellsorter analysiert und in der Form Zellzahl gegen log. Fluoreszenz mit Hilfe eines VAX-11/780-Computers aufgetragen. Nichttransformierte NIH-3T3-Zellen und L-Zellen lieferten identische cytofluorographische Ergebnisse. Fro 2.2 ist eine leukämische T-Zelllinie mit dem Phenotyp T3&supmin;; T4&spplus;; T8&spplus;; T11&spplus;. LTD-4 ist ein primärer T4&spplus;-L-Zellentransformant, der nach Transfer der gesamten genomischen DNA erhalten wird. 3A+ ist eine NIH-3T3-Zellinie, die mit dem retroviralen T4pMV6tk/neo-Expressionskonstrukt transformiert wurde.

Fig. 2: Northemblot-Analyse von RNA aus T4&spplus;- und T4&supmin;-L- Zellen und Humanzellen

3 µg von Poly(A)&spplus;-RNA oder 12 µg Gesamt-RNA (periphere T- Zellen und Thymozyten) wurden durch ein 0,8% Agarose- Formaldehyd-Gel elektrophoresiert, auf Genescreen (New England Nuclear) geblottet und mit einem ³²P-markierten 0,6- kb-T4-cDNA-Insert sondiert. Zu den T4&spplus;-Zellen gehören die LTD-4-Zellen (T4&spplus;, T8&supmin;-L-Zellentransformanten), SK-7-T- Zellhybridomzellen (T4&spplus;, T8&supmin;), CT-CLL-Leukämiezellen (T4+, T8&supmin;), Fro-2.2-Leukämiezellen (T4&spplus;, T8&supmin;), die T4-angereicherten peripheren T-Lymphozyten und Humanthymozyten. Zu den T4&supmin; -Zellen gehören die nichttransformierten Zellen, tk7-Zellen (T8&spplus;-L-Zelltransformanten), HeLa-Zellen, Humanneuroblastomzellen (IMR) und T8-angereicherte peripheren T-Lymphozyten. Die Humanthymozytenspur wurde viermal länger belichtet und auf einem einen hohen Kontrast aufweisenden Film photographisch aufgenommen.

Fig. 3: Restriktionsnucleasekarten von pT4B und des T4-Gens, Sequenzstrategie und rekombinante Vektoren

A. Ausrichten der BamHI-Restriktionsfragmente der pT4B-cDNA und des T4-Gens. Die Reihenfolge der BamHI-Fragmente im T4- Gen wurde durch Southernblot-Analyse und genomische Klonkartierung bestimmt. Die Ausrichtung des 5'Endes von pT4B und des T4-Gens ist durch gestrichelte Linien dargestellt, wobei der schwarze Bereich in pT4B der Kodiersequenz entspricht. Die angegebenen Größen sind in Kilobasen ausgedrückt.
B. Sequenzierstrategie: Die Pfeile geben die durch Subklonieren von Fragmenten in M13 und Sequenzieren dmit Hilfe des Didesoxyterminationsvorgehens (36) bestimmte Seguenzlänge an.
C. Eukaryontische Expressionsvektoren: Diese Konstrukte enthalten zwei Moloney-Mäuseleukämievirus-LTRs (lange endständige Sequenzwiederholungen), deren Orientierungen durch Pfeile angegeben sind. Die pT4B-cDNA wurde in die EcoRI- Stelle eines jeden Vektors in der angegebenen Orientierung subkloniert. (a) Das T4-pVcos7-Konstrukt. (b) Das T4- pMV6tk/neo-Konstrukt enthält das an den HSV-Thymidinkinasepromotor fusionierte Neomycinphosphotransferasegen.

Fig. 4: Southernblot-Analyse von DNA aus nichttransformierten und T4&spplus;-L-Zellen sowie aus T-, B- und nichtlymphoiden Humanzellen

10 µg zelluläre DNA wurden mit BamHI verdaut, durch ein 0,8% Agarosegel elektrophoresiert, auf Genescreen geblotted und mit einem nick-translatierten pT4B-cDNA-Insert sondiert. Die angegebenen Größenmarker sind in Kilobasen angegeben. Die Hybridisierungsbanden mit einer Größe von 20 kb, 6,6 kb, 4 kb, 1,8 kb und 1 kb erscheinen in allen Human-DNAs. DNAs eines nichtlymphoiden T4&supmin;-Ursprungs umfassen nichttransformierte L-Zellen, Humanfibroblasten (GM), Humanneuroblastomzellen (NB) und HeLa-Zellen. CB, CP58 und CP94 sind DNAs aus EVB-transformierten Human-B-Zellinien. LTD-4 ist der primäre T4&spplus;-L-Zelltransformant. RPMI und HSB2 sind T4&supmin;-Human-T-Zellenleukämielinien. E&spplus;-Zellen und Thymozyten (Thym) enthalten T4&spplus;-T-Zellen. OT-CLL, Jurkat (Jurk.), Fro 2.2, CEM und Molt 4 sind T4&spplus;-T-Zellen. g)M4 ist ein genomisches Klon, das das 3'Ende des T4-Gens umspannende Sequenzen enthält.

Fig. 5: Immunofällung des T4-Glycoproteins aus mit den retroviralen Expressionskonstrukten transformierten NIH-3T3- Zellen

Mit L-[³&sup5;S]-Methionin markierte Proteine aus zwei unabhängigen NIH-3T3-Transformanten, peripheren T-Lymphozyten und nichttransformierten 3T3-Zellen wurden zur Anreicherung der Glycoproteine einer Lentillectinchromatographie unterzogen. 2,5 x 10&sup6; cpm einer jeden Probe wurden vorgeklärt und anschließend mit monoklonalen OKT(R)4-Antikörpern und Protein- A-Sepharose immunogefällt. Die Perlen wurden gewaschen, in Probenpuffer gelöst und durch ein 10% SDS-Polyacrylamidgel unter reduzierenden (Spuren a-d) bzw. nichtreduzierenden (Spuren e und f) Bedingungen elektrophoresiert. Spur a: nichttransformierte NIH-3T3-Zellen; Spur b: T4C2-Zellen, mit dem T4-pVcos7-Konstrukt transformierte NIH-3T3-Zellen; Spuren c und e: 3A+-Zellen, mit dem T4-pMV6tk/neo-Konstrukt transformierte NIH-3T3-Zellen; Spuren d und f: periphere Human-T-Lymphozyten. Die relativen Molekülmassen (Mr) sind in Kilodalton angegeben.

Fig. 6: Nucleotidsequenz der T4-cDNA und translatierte Sequenz des T4-Proteins

Die nach der in Fig. 3B dargestellten Sequenzstrategie erhaltene Nucleotid- und vorausgesagte Aminosäuresequenz des cDNA-Klons pT4B. Die oberhalb der Aminosäuresequenz angegebenen Zahlen bezeichnen die Positionen der Aminosäurereste. Die Zahlen auf der rechten Seite geben die Nucleotidpositionen an. Alle extrazellulären Cysteine sind durch (.) oder (o) angegeben. Die Leadersequenz (L), die variabel-artige (V) Region, die joining-artige (J) Region, die Transmembran (TM)-Region und die Cytoplasma (CYT)-Region sind durch horizontale Pfeile unter der Sequenz angegeben, auch wenn die genauen Grenzen zweifelhaft sind. Ferner sind zwei potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen (Asn-Leu- Thr) angegeben (CHO).

Fig. 7: In-vitro-Translations-RNA von einer SP6-Transkription

Das die vollständige Länge aufweisende T4-cDNA-Insert wurde in den RNA-Expressionsvektor pSP65 (Promega Biotec) subkloniert. Linearisierte Plasmid-DNA wurde mit SP6-Polymerase transkribiert (40), worauf die RNA in einem Weizenkeimsystem (Bethesda Research Laboratories), das L-[³&sup5;S]-Methionin enthielt, translatiert wurde. Die in-vitro-Translationsprodukte wurden einer Elektrophorese durch ein 10% SDS-Polyacrylamidgel (Spur T4) unterzogen. Rinderhirnanhangdrüsen-RNA (BP) wurde als Vergleich verwendet. Die relativen Molekülmassen (Mr) sind in Kilodalton angegeben.

Fig. 8: Schematisches Diagramm des die Zellmembran umspannenden T4-Glycoproteins

T4 besteht aus vier VJ-artigen Tandem (in gleicher Richtung direkt hintereinander vorliegenden)-Domänen (V&sub1;J&sub1;-V&sub4;J&sub4;), einem die hydrophobe Membran umspannenden Segment (schraffierter Bereich) und einem geladenen Cytoplasmabereich (CYT). Zwei potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen im extrazellulären Bereich sind angegeben ( ). Die Positionen der Introns 2-8 im T4-Gen sind auch markiert ( ).

Fig. 9: Ausrichtung der variablen, joining (verbindenden) -und Transmembranregion von T4 mit Mitgliedern der Familie der Immunoglobulingene

A. Ausrichtung der Aminosäuresequenz des variablen Bereichs von T4 mit der leichten Kappa-Kette von Mäuseimmunoglobulin J606 (66), T8 (20), einer Human-T-Zellantigenrezeptor-ß-Kette YT35 (97) und einer Human-T-Zellantigenrezeptor-α-Kette HPB-MLT α (98). Die unveränderten Reste im variablen Bereich der leichten Kette sind bei der Ausrichtung enthalten (Erf.) Die Ausrichtung erfolgte, um die Identitäten und Strukturhomologien mit T4 zu maximieren. Diese erscheinen als einge rahmte Reste. Die Linien unter der Sequenz mit den Buchstaben A, B, C, C', D, E, F und G bezeichnen die Reste, die ß- Stränge bilden (67). Der ß-Strang G setzt sich in der J- Sequenz fort.
B. Ausrichtung der Aminosäuresequenz der joining-Rregion von T4 mit den Konsensus-J-Sequenzen der T-Zellantigenrezeptorß-Kette, den leichten Immunoglobulin-Lambda- und -Kappaketten und der J-Sequenz der Human-T-Zellrezeptor-α-Kette (99).
C. Ausrichtung der Transmembranregionen von T4 mit einer MHC-Klasse-II-ß-Kette (100). Die vermutliche Transmembrandomäne (TM) ist unter der Sequenz angegeben.

Fig. 10: Restriktionsnucleasekarte des T4-Gens in der menschlichen chromosomalen DNA

Die Positionen der neun Exons wurden durch Genomklonkartierung, Southernblot-Analyse und Nucleotidsequenzierung bestimmt. Die Leadersequenz (L), der variabel-artige Bereich (V), der joining-artige Bereich (J), der Transmembranbereich (TM) und der Cytoplasmabereich (CYT) sind durch Kästchen angegeben. Die Position des durch die Initiationskonsensussequenz umgebenen Methioninkodons ist am Beginn des Leaderexons (L) angegeben (ATG). Das Terminationskodon TGA ist am Ende des zweiten Cytoplasmaexons (CYT) dargestellt. Die angegebenen Größen sind in Kilobasen angegeben.

Fig. 11: Rekombinante retrovirale Expressionsvektoren und Konstruktion von transformierten Zellen

A. Rekombinante retrovirale Expressionsvektoren. pMV7 enthält zwei direkt wiederholte Moloney-Mäusesarkomvirus- LTRs in der durch Pfeile angegebenen Orientierung. pMV7 enthält ferner das bakterielle Neomycinphosphotransferasegen (neo), das an den HSV-Thymidinkinasepromotor (tk) fusioniert ist. Die die vollständige Länge aufweisenden cDNA-Inserte mit Kodierung für T4 (T4B) (70) oder T8 (T8F1) (20) wurden in der durch Pfeile angegebenen Orientierung unter Erzeugung von T4-pMV7 bzw. T8-pMV7 in die EcoRI-Stelle subkloniert. Die Kodiersequenzen sind als schwarze Bereiche angegeben. Die angegebenen Größen sind in Kilobasen angegeben.
B. Retrovirus-vermittelte Gentransferstrategie.

Fig. 12: Die Wirksamkeit der Infektion von natürlich isolierten und transformierten T4&spplus;-Zellen

Die Zellen wurden mit seriellen 10fach-Verdünnungen des AIDS-Virus angeimpft, 18 h bei 37ºC inkubiert, gewaschen und anschließend in Mikrokultur plattiert. Die Häufigkeit der infizierten Kulturen wurde durch einen ELISA 12 Tage nach Infektion bestimmt (46). Die Ergebnisse wurden in der Form % positive Kulturen gegen log Virusverdünnung aufgetragen. Der Titer des infektiösen Virus (ID-50) ist als der Reziprokwert der Verdünnung definiert, bei der 50% der Kulturen bezüglich des Virus positiv sind (47). Natürlich isolierte T4&spplus;-Zellen umfassen durch Phytohämagglutinin (PHA)-stimulierte normale periphere Lymphozyten ( ) und die T-Zellinie CEM (οο). Transfizierte T4&spplus;-Zellinien umfassen HSB2-T4&spplus;-T- Zellen ( ) und Raji-T4&spplus;-B-Zellen ( ). Die transfizierten T8&spplus;-Zellinien HSB2-T8&spplus; und Raji-T8&spplus; ( ) dienten als Vergleichsproben bei diesen Untersuchungen.

Fig. 13: Bildung von Synzytien in T4&spplus;-HeLa-Transformanten

A. Eine Monoschicht aus 2 x 10&sup5; HeLa-T4&spplus;-Transformanten wurde mit 2 x 10&sup4; AIDS-Viren produzierenden H9-Zellen vermischt und bei 37ºC inkubiert. Eine Inspektion der Kulturen nach 18 h zeigte, daß über 90% der Kerne in der Monoschichtlage in den Synzytien enthalten waren.
B. Monoklonale Anti-T4A-Antikörper (1:20) wurden den Mischkulturen zur Zeit des Ansetzens zugegeben. Eine Inspektion der Kulturen nach 18 h zeigte die vollständige Abwesenheit einer Zellfusion.
Die Kulturen wurden mit einer 160fachen Vergrößerung photographiert.

Fig. 14: Flußcytometrieanalyse des Bindens von AIDS-Viren an transformierte T4&spplus;-Zellen

Säule A: 5 x 10&sup5; Zellen wurden mit monoklonalen, mit Fluorescein konjugierten Anti-T4A () oder Anti-T8 (---)- Antikörpern inkubiert, gewaschen und durch Cytofluorometrie analysiert.
Säule B: 5 x 10&sup5; Zellen wurden mit Puffer (---) oder AIDS- Viren () inkubiert, gewaschen, mit Fluorescein-konjugierten Anti-AIDS-Virus-Antikörpern inkubiert und durch Cytofluorometrie analysiert.
Säule C: 5 x 10&sup5; Zellen wurden mit Puffer (---) oder mit monoklonalen Anti-T4A-Antikörpern und anschließend AIDS-Viren () oder mit monoklonalen Anti-T8-Antikörpern und anschließend AIDS-Viren (-.-.-) inkubiert. Nach einem Waschen wurden Fluorescein-konjugierte Anti-AIDS-Virus- Antikörper zugegeben und die Zellen anschließend durch Cytofluorometrie analysiert.
Die Fluoreszenzhistogramme (Zellzahl gegen Fluoreszenzintensität) einer jeden Zellinie sind horizontal angeordnet.

Fig. 15: Northernblot-Analyse von RNA aus menschlichem Gehirn und Mäusegehirn, Lymphoidzellen und Myeloidzellen bzw. Knochenmarkzellen

A. Northernblot-Analyse von Human-RNA-Proben. 1 µg Poly(A)&spplus;- RNA aus Raji-Zellen (T4&supmin;-B-Zellinie), U937-Zellen (monocytische T4&spplus;-Zellinie) und Jurkat-Zellen (T4+-T-Zellinie) und 5 µg Poly(A)&spplus;-RNA aus der Großhirnrinde wurden durch 1% Agarose-Formaldehyd-Gel elektrophoresiert, auf Hybond (Amersham) geblotted und mit dem ³²P-markierten T4-cDNA- Insert pT4B sondiert (70).
B. Northernblot-Analyse von Mäuse-RNA-Proben. 5 µg Poly(A)+- RNA aus 3T3-Zellen (Fibroblasten-Zellinie), Vorderhirn und Rautenhirn und 20 µg Gesamt-RNA aus Thymozyten wurden durch 1% Agarose-Formaldehyd-Gel elektrophoresiert, auf Hybond übertragen und mit dem ³²P-markierten L3T4-cDNA-Insert pL3T4B sondiert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit Kodierung für ein wasserlösliches Polypeptid mit einem Teil eines T4-Glycoproteins. Das durch das Nukleinsäuremolekül kodierte wasserlösliche Polypeptid vermag spezifisch mit einem Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein einen Komplex zu bilden. In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül zu mindestens 90% mit einem Nukleinsäuremolekül mit Kodierung für eine Aminosäuresequenz, bei der es sich zumindestens um einen Teil eines T4-Glycoproteins handelt, homolog. In dieser Anmeldung umfaßt der Ausdruck "wäßrige Lösung" - ohne darauf beschränkt zu sein - tensidfreie wäßrige Puffer und Körperflüssigkeiten, wie Blut, Plasma und Serum. Darüber hinaus bedeutet der Ausdruck "lösliches T4" ein Fragment eines T4-Glycoproteins, das in einer wäßrigen Lösung löslich ist. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert das Nukleinsäuremolekül für ein wasserlösliches Polypeptid, bei dem es sich um einen Teil eines Human-T4-Glycoproteins handelt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Nukleinsäuremolekül, das zu dem oben beschriebenen einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül komplementär ist. Dieses komplementäre Nukleinsäuremolekül kann mit einem nachweisbaren Marker markiert werden. Derartige nachweisbare Marker sind auf dem einschlägigen Fachgebiet der vorliegenden Erfindung bekannt. Zu ihnen gehören nachweisbare Enzyme, radioaktiv markierte Einheiten, fluoreszierende Einheiten und chemilumineszierende Einheiten.
Das einzelsträngige Nukleinsäuremolekül kann ein DNA-Molekül sein. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das DNA-Molekül einen Teil des durch die in Fig. 10 dargestellte Restriktionsenzymkarte dargestellten genomischen DNA-Moleküls. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül um ein cDNA-Molekül handeln. Dieses Molekül kann einen Teil der in Fig. 6 dargestellten Nukleinsäuresequenz umfassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein RNA-Molekül mit Kodierung für ein wasserlösliches Polypeptid, das einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Nachweis eines einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit Kodierung für ein wasserlösliches Polypeptid, das einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt und das dazu in der Lage ist, mit einem Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein spezifisch einen Komplex zu bilden. Dieses Verfahren umfaßt ein Inberührungbringen von einzeisträngigen Nukleinsäure molekülen mit einem markierten, einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül, das zu einem einzeisträngigen Nukleinsäuremolekül mit Kodierung für das oben definierte wasserlösliche Polypeptid komplementär ist, unter eine Hybridisierung komplementärer einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle zuzulassenden Bedingungen. Hybridisierte Nukleinsäuremoleküle werden zum Nachweis eines einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit Kodierung für ein einen Teil eines T4-Glycoproteins umfassendes wasserlösliches Polypeptid von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das nachgewiesene einzelsträngige Molekül ein DNA-Molekül aus chromosomaler DNA. Die chromosomale DNA kann aus Lymphoidzellen, Myeloidzellen oder Gehirnzellen stammen. Die Lymphoidzellen können T-Zellen oder B-Zellen sein. Darüber hinaus können die Myeloidzellen eine Granulozytenstelle (granulocyte site) oder Makrophagen sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Sequenz eines wasserlöslichen Polypeptids, die einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt. Das wasserlösliche Polypeptid vermag speziell mit einem Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein Komplexe zu bilden und wird durch das oben definierte einzelsträngige Nukleinsäuremolekül kodiert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das wasserlösliche Polypeptid zu mindestens 90% mit dem wasserlöslichen Polypeptid homolog.
Das wasserlösliche Polypeptid mit der Fähigkeit, mit einem Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein speziell Komplexe zu bilden, das einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt und das durch das oben definierte einzelsträngige Nukleinsäuremolekül kodiert wird, eignet sich als therapeutisches Mittel zur Behandlung eines mit Humanimmunodefizienzvirus infizierten Patienten, d.h. als Prophylaxe für AIDS. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das wasserlösliche Polypeptid die in Fig. 6 von zumindestens der Aminosäure -23 bis höchstens zur Aminosäure +374 dargestellte Aminosäuresequenz Weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Aminosäuresequenzen, die die in Fig. 6 von mindestens der Aminosäure +287 bis höchstens zur Aminosäure +374, von mindestens der Aminosäure +182 bis höchstens zur Aminosäure +286, von mindestens der Aminosäure +112 bis höchstens zur Aminosäure +181 und von mindestens der Aminosäure +1 bis höchstens zur Aminosäure +111 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Arzneimittelzubereitung, die sich als therapeutisches Mittel zur Behandlung eines mit Humanimmunodefizienzvirus infizierten Patienten eignet. Diese pharmazeutische Zubereitung umfaßt ein wasserlösliches Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung, das einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt, das mit einem Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein speziell Komplexe zu bilden vermag und das durch das oben definierte einzeisträngige Nukleinsäuremolekül kodiert ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Derartige pharmazeutisch akzeptable Träger sind auf dem einschlägigen Fachgebiet der vorliegenden Erfindung bekannt und umfassen - ohne darauf begrenzt zu sein - 0,01 bis 0,1 Mol, vorzugsweise 0,05 Mol Phosphatpuffer oder 0,8%ige Kochsalzlösung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Behandlung eines mit Humanimmunodefizienzvirus infizierten Patienten. Dieses Verfahren umfaßt das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Arzneimittelzubereitung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und das wasserlösliche Polypeptid enthält, an einen Patienten, um Humanimmunodefizienzviren (im folgenden als AIDS-Viren bezeichnet), mit denen der Patient infiziert ist, die Fähigkeit zu nehmen, T4&spplus;-Zellen zu infizieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein gereinigtes Polypeptid, das durch ein cDNA-Molekül, das mindestens einen Teil der in Fig. 6 dargestellten Nukleinsäuresequenz umfaßt, kodiert ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Vektor, der ein cDNA-Molekül umfaßt, bei dem es sich um einen Teil der in Fig. 6 dargestellten Nukleinsäuresequenz handelt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der Vektor ein Plasmid. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der Vektor ein Virus.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Wirtvektorsystem zur Herstellung eines einen Teil eines T4-Glycoproteins umfassenden wasserlöslichen Polypeptids. Dieses Wirtvektorsystem umfaßt ein erfindungsgemäßes Plasmid in einem geeigneten Wirt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der geeignete Wirt eine Bakterienzelle. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Bakterienzelle eine Escherichia-coli-Zelle. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die geeignete Wirtzelle eine eukaryontische Zelle. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die eukaryontische Zelle eine Säugetierzelle. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die eukaryontische Zelle eine Hefezelle. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der geeignete Wirt eine Insektenzelle.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Polypeptids, das einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt und mit einem Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein spezifisch Komplexe zu bilden vermag. Dieses Verfahren umfaßt ein Züchten eines erfindungsgemäßen Wirtvektorsystems unter geeigneten, die Produktion des wasserlöslichen Polypeptids zulassenden Bedingungen und ein Gewinnen des erhaltenen wasserlöslichen Polypeptids. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Wirtvektorsysteme und Verfahren zur Herstellung des wasserlöslichen Polypeptids, wobei der Vektor ein erfindungs gemäßes cDNA-Molekül und ein Virus umfaßt. Geeignete Wirte umfassen - ohne darauf begrenzt zu sein - Bakterienzellen, beispielsweise Escherichia-coli-Zellen, eukaryontische Zellen, beispielsweise Säugetierzellen und Hefezellen, sowie Insekten(zellen). Ein wasserlösliches Polypeptid, bei dem es sich um einen Teil eines T4-Glycoproteins handelt, kann durch Züchten eines ein Virus und ein erfindungsgemäßes cDNA-Molekül umfassenden Wirtvektorsystems unter geeigneten, die Produktion eines Teils eines T4-Glycoproteins erlaubenden Bedingungen hergestellt werden. Der erhaltene Teil des T4-Glycoproteins kann aus dem Wirtvektorsystem nach auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren gewonnen werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Antikörper mit der Fähigkeit, mit dem oben beschriebenen wasserlöslichen Polypeptid Komplexe zu bilden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper ein menschlicher monoklonaler Antikörper.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Impfstoff zur Immunisierung eines menschlichen Patienten gegen Humanimmunodefizienzvirus. Dieser Impfstoff umfaßt einen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Durch Verabreichen einer wirksamen immunisierenden Menge eines Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung an einen menschlichen Patienten kann die Bildung von Antikörpern mit der Fähigkeit zur Neutralisierung von Humanimmunodefizienzviren hervorgerufen werden, wodurch eine Immunisierung des Patienten gegen Humanimmunodefizienzvirus erreicht wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein monoklonaler Antikörper mit der Fähigkeit, mit einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper speziell Komplexe zu bilden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vermag der Antikörper darüber hinaus mit einem Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoprotein spezielle Komplexe zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Substanz (Anmerkung des Übersetzers: wohl der Antikörper) einen T4-Glycoprotein-anti-Ideotyp-Antikörper, der ein "inneres Bild" der T4-Bindungsdomäne mit der Fähigkeit zur Erkennung der Rezeptorbindungsdomäne eines Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoproteins enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Arzneimittelzubereitung, die einen erfindungsgemäß T4-Glycoprotein-anti-Idiotyp-Antikörper und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus ein Verfahren zur Behandlung eines mit Humanimmunodefizienzvirus infizierten Patienten durch Verabreichen einer wirksamen Menge der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung, die einen T4-Glycoproteinanti-Idiotyp-Antikörper und ein pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt, an einen Patienten, so daß die Humanimmunodefizienzviren, mit den der Patient infiziert ist, ihrer Fähigkeit beraubt werden, T4&spplus;-Zellen zu infizieren.
Die verschiedenen Prophylaxe- und Immunisierungsverfahren für AIDS, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, basieren auf der Fähigkeit der neuen Peptide, Antikörper und DNA- Moleküle, die hier beschrieben sind, mit speziellen Molekülen Komplexe zu bilden oder mit speziellen Molekülen zu hybridisieren und eine zur Neutralisierung des AIDS-Virus wirksame immunologische Antwort hervorzurufen. Diese Moleküle, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Behandlung von AIDS lassen sich besser unter Bezugnahme auf die folgenden Experimente und Beispiele, die lediglich zur Veranschaulichung dienen und den durch die beigefügten Patentansprüche definierten Umfang der vorliegenden Erfindung in keinster Weise einschränken sollen, verstehen.

Materialien und Methoden

Zellen und Antikörper

Durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation isolierte periphere Blutleukozyten wurden bezüglich bei einem Rosettentest mit Schaferythrozyten positive (E&spplus;)-Zellen einer Fraktionierung unterzogen. Die T4&spplus;- und T8&spplus;-Untergruppen in der E&spplus;-Population wurden durch positive Auswahl der T8- tragenden Zellen mit einem Anti-T8-Antikörper und mit mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-Antimaus-IgG konjugierten Humanerythrozyten isoliert (10). Eine cytofluorometrische Analyse dieser Untergruppen zeigte, daß die T4&spplus;-Zellen > 95% T4&spplus; und < 2% T8&spplus; waren, während die T8&spplus;-Zellen > 95% T8&spplus; und < 2% T4&spplus; waren.
Die Fro-2.2-T-Zellinie (T3&supmin;, T4&spplus;, T8&spplus;, T11&spplus;) stammte aus erwachsenen Patienten mit einer nicht differenzierten akuten Leukämie. Jurkatt-Zellen sind T3&supmin;, T4&spplus;, T8&spplus;, T11&spplus;. RPMI 8402-Zellen sind T3&supmin;, T4&supmin;, T8&supmin;, T11&spplus;. OT-CLL-Zellen sind Zellen einer chronischen lymphozytären Leukämie, die T3&spplus;, T4&spplus;, T8 und T11&spplus; sind (22). Die T4&spplus;-Zellinien CEM und Molt 4 wurden vom American Type Culture Collection erhalten. Alle leukämischen T-Zellinien wurden kontinuierlich in 5% fötales Kalbserum enthaltendem RPMI-1640-Medium gezüchtet. Die transformierten B-Zellinien CB, CP58 und CP94 wurden wie früher beschrieben (23) erhalten.
Affinitätsgereinigtes Kaninchen-Antimaus-IgG wurde nach dem Chromchloridverfahren (24) an Humanerythrozyten konjugiert.

Cotransformation von L-Zellen und NIH-3T3-Zellen

Mäuse-L-tk&supmin;aprt&supmin;-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DME), das mit 10% Kalbserum (Gibco) und 50 µg/ml Diaminopurin (DAP) ergänzt war, gehalten. Die L-Zellen wurden in einer Dichte von 5 x 10&sup4; Zellen pro 10- cm-Schale ein Tag vor Transformation ausplattiert. Calciumphosphatniederschläge wurden nach dem Verfahren von Graham und van der Eb (25) in der Modifikation von Wigler und Mitarbeitern (26) unter Verwendung von 100 ng pTK und 20 µg einer ein hohes Molekulargewicht aufweisenden T-Zellen- oder L-Zellen-DNA pro Schale hergestellt. Die L-Zellen wurden in DME mit 10% Kalbserum, 15 µg/ml Hypoxanthin, 1 µg/ml Aminopterin und 5 µg/ml Thymidin (HAT-Medium (27)) am folgenden Tag einer Selektion unterzogen. Nach 12-14 Tagen HAT-Selektion wurden die tk&spplus;-Transformanten mit Hilfe eines Rosettentests gessichtet.
Mäuse-NIH-3T3-Zellen wurden in mit 10% Serum neugeborener Kälber (Gibco) ergänztem DME gehalten. Die NIH-3T3-Zellen wurden in einer Dichte von 5 x 10&sup4;-Zellen pro 10-cm-Schale 2 Tage vor Transformation ausplattiert. Unter Verwendung von 10 µg Träger-DNA und entweder 10 µg T4-pMV6tk/neo oder 10 µg T4-pVcos7 und 500 ng pSV2neo wurde ein Calciumphosphatniederschlag auf die Zellen appliziert. Nach 2 Tagen wurden die Zellen in DME mit 10% Kalbserum und 500 µg/ml G418 (Geneticin(R), Gibco) einer Selektion unterzogen. Die Rosettentests erfolgten bei überlebenden Kolonien 1 Woche nach dem Züchten im selektiven Medium.

Rosettenuntersuchung

Nach einmaligem Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden die Platten mit 2,5 ml ausgereinigten monoklonalenr Antikörpern OKT(R)4A (1 mg/ml), die 1/500 in 5% fötales Kalbserum enthaltendem PBS verdünnt waren, während 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die freien Antikörper wurden von den Platten durch dreimaliges vorsichtiges Spülen in PBS entfernt. Nach Zugabe von 6 ml von mit gereinigten Kaninchen-Antimaus-IgG-Antikörpern konjugierten Humanerythrozyten (2% v/v Vorratssuspension, 1/10 verdünnt in PBS/5% fötales Kalbserum) wurden die Platten bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach 45 min wurden die freien Erythrozyten vorsichtig abgesaugt und vor der Inspektion auf bezüglich des Rosettentests positive Kolonien PBS zugegeben.

Cytofluorometrische Analyse

Haftende Zellen wurden mit 0,005 Mol EDTA in PBS entfernt und einmal mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,01% Natriumazid enthaltendem PBS (Cytowaschlösung) gewaschen. 5 x 10&sup6;- Zellen in 0,1 ml wurden in Röhrchen mit geeigneten Verdünnungen von OKT(R)R4-, OKT(R)R8 und Vergleichsantikörpern eingetragen. Das Zell-Antikörper-Gemisch wurde 45 min bei 4ºC inkubiert und anschließend zweimal in der Cytowaschlösung gewaschen. Nach Zugabe von mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiertem Ziege-Antimaus-IGG + A + M (Cappel) zu den Zellen erfolgte eine istündige Inkubation bei 4ºC. Die Zellen wurden anschließend 3mal in Cytowaschlösung gewaschen und in 0,5 ml PBS mit 0,01% Natriumazid resuspendiert. Die Zellen wurden auf einem Becton Dickinson FACS IV Zellsorter analysiert, die Daten gespeichert und unter Verwendung eines VAX-11/780-Computers (Digital Equipment Co.) graphisch aufgetragen.

RNA- und DNA-Isolierung

Die Gesamt-RNA wurde durch Homogenisieren in 4 Mol Guanidiniumthiocyanat und anschließendes Ultrazentrifugieren durch ein 5,7 Mol Cäsiumchloridkissen isoliert (28). Die Poly(A)&spplus;- Selektion erfolgte durch Oligo(dT)-Cellulosechromatographie (Typ 3, Collaborative Research) (29). Die ein hohes Molekulargewicht aufweisende genomische DNA wurde gemäß der Beschreibung von Wigler und Mitarbeitern (26) hergestellt.

cDNA- und Genombibliotheken

Doppelsträngige cDNA wurde aus Poly(A)&spplus;-RNA, die aus peripheren menschlichen T-Zellen stammte (20), synthetisiert. Nach Behandlung mit EcoRI-Methylase und T4-DNA-Polymerase wurde die doppelsträngige cDNA unter Verwendung von EcoRI- Linkem in die EcoRI-Stelle von λgt10 (30) kloniert. Die Charon-4-Humangenombibliothek wurde freundlicherweise von Dr. Tom Maniatis (Harvard University) (31) zur verfügung gestellt.

Synthese einer subtraktiven cDNA-Sonde

³²P-markierte cDNA wurde aus Poly(A)&spplus;-RNA aus dem primären Transformanten LTD-4 gemäß der Beschreibung von Davis und Mitarbeitern (32) synthetisiert. Nach Hybridisieren der cDNA mit überschüssiger untransformierter L-Zellen-Poly(A)&spplus;-RNA (Rot = 3000) wurden bezüglich Human-cDNAS angereicherte einzelsträngige Sequenzen durch Hydroxyapatitchromatographie (32) isoliert. Vor einer Filterhybridisierung wurde die subtraktive cDNA-Sonde mit Sekundärbutanol aufkonzentriert und auf einer in TE äquilibrierten G-50-Sephadex(R)-Säule entsalzt.

Sichten von cDNA- und Genombibliotheken

Die Bibliothek peripherer Human-T-Zellen wurde auf E.-coli- Zellen C600/HFL plattiert. Die Humangenombibliothek wurde auf E.-coli-Zellen LE392 plattiert. Das Sichten von Duplikatfiltern erfolgte nach dem Standardvorgehen (33), wobei die Hybridisierung in 50% Formamid und 5x SSC bei 42ºC durchgeführt wurde. Bei der Sichtung der CDNA-Bibliothek wurden 6 x 10&sup4; cpm subtraktive Sonde pro 137 mm Nitrocellulosefilter appliziert. Die Filter aus der Genombibliothek wurden mit nick-translatiertem (34) cDNA- Insert hybridisiert. Die Waschvorgänge wurden bei 68ºC durchgeführt, wobei das abschließende Waschen in 0,2xSSC erfolgte. Die Autoradiographie erfolgte bei -70ºC in Gegenwart von Verstärkungsschirmen während 1 bis 2 Tagen.

DNA-Seguenzierung

Restriktionsfragmente von pT4B wurden in die M13-Vektoren mp18 und mp19 (35) subkloniert. Die Sequenzierreaktionen erfolgten unter Verwendung der Didesoxykettenterminationstechnik (36). Die Sequenzierstrategie ist in Fig. 3B dargestellt.

Southern- und Northernblot-Hybridisierungen

Ein hohes Molekulargewicht aufweisende zelluläre DNAs wurden mit 5 Einheiten Restriktionsnuclease pro µg DNA nach der Empfehlung des Herstellers (Boehringer Mannheim) verdaut. Proben (10 µg) wurden einer Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel unterzogen. Die DNA-Fragmente wurden auf Genescreen (New England Nudear, (37)) übertragen und gemäß der Beschreibung von Church und Gilbert (38) hybridisiert.
RNA wurde auf einem 0,8% Agarose-Formaldehyd-Gel (39) laufengelassen und auf Genescreen übertragen. Die Northernhybridisierung erfolgte nach dem vom Hersteller vorgeschriebenen Vorgehen. Sowohl die Southern- als auch die Northern- Blots wurden mit nick-translatierten Sonden hybridisiert.

Synthese und in-vitro-Translation von SP6-RNA

Die kb-T4-cDNA wurde in die EcoRI-Stelle von pSP65 (Promega Biotec) subkloniert und mit HindIII linearisiert. Eine Transkription der linearisierten Plasmid-DNA (1 µg) mit SP6- Polymerase in Abwesenheit radioaktiv markierter Nucleotide erfolgte gemäß der Beschreibung bei (40), mit der Ausnahme, daß dem Transkriptionspuffer Gpppg und nichtmarkiertes CTP zugegeben wurden. Ein Zehntel des Reaktionsgemisches wurde in einem L-[³²S]-Methionin (Amersham) und 1 mMol S-Adenosylmethionin enthaltenden Weizenkeimsystemen (Bethesda Research Laboratories) translatiert. Die in-vitro-Translationsprodukte wurden unter reduzierenden Bedingungen wie im folgenden beschrieben einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.

Zellmarkierung, Lectinchromatographie und Immunofällung

Die Zellen wurden 12 h in einem 10% dialysiertes Kaibserum und 1 mCi L-[³²S]-Methionin (Amersham) enthaltenden, methioninfreien DME-Medium wie zuvor beschrieben (41) gezüchtet. Die Zellen wurden in 10 mMol Tris (pH-Wert 7,4), 150 mMol NaCl (TBS) mit 0,5% Nonidet P-40 (Shell) und 0,2 mMol Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma) solubilisiert. Die Lysate wurden 1 h bei 100.000 g zentrifugiert, worauf die Überstände entsprechend dem Vorgehen von Hedo und Mitarbeitern (42) einer Lentillectinchromatographie (Pharmacia) unterzogen wurden. Die Eluate wurden einmal mit einem Gemisch aus Vergleichsmausascites und Protein-A-Sepharose(R) (Pharmacia) 1 h bei 4ºC und zweimal mit Protein-A-Sepharose(R) alleine 1 h bei 4ºC vorabsorbiert. Von jedem Überstand wurden 2,5 x 10&sup4; cpm anschließend mit 10 Mikroliter monoklonalem Antikörper (etwa 1 mg/ml) und Protein-A-Sepharose(R) vermischt und auf einem Drehteller über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Perlen wurden anschließend viermal mit 0,5% NP-40 und 0,2% SDS enthaltendem kaltem TBS gewaschen und in einem Elektrophoreseprobenpuffer resuspendiert.

Gelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese erfolgte nach dem Verfahren von Laemmli (43). Die Immunofällungen und invitro-Translationsprodukte wurden in einem Probenpuffer mit oder ohne 2-Mercaptoethanol gelöst und anschließend auf 10% Polyacrylamidgele appliziert. Die Autoradiographie erfolgte auf einem Kodak-XAR-5-Film in Gegenwart von Verstärkungs schirmen (DuPont Chemical Company).

Cotransformation und Rosettentest

Mäuse-ψ-2-Zellen (44) wurden in mit 10% Kalbserum (CS) (Gibco) ergänztem, Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DME) gehalten. Die ψ-2-Zellen wurden meiner Dichte von 5 x 10&sup5; Zellen pro 10-cm-Schale 2 Tage vor Transformation ausplattiert. Calciumphosphatfällungen wurden nach dem Verfahren von Graham und van der Eb (25) gemäß der Modifikation von Wigler und Mitarbeitern (27) hergestellt. Die Fällungen wurden unter Verwendung von 10 µg Träger-DNA und entweder 10 µg T4-pMV7 oder 10 µg T8-pMV7 auf die Zellen appliziert. Nach 2 Tagen wurden die Zellen in DME/10% CS und 500 µg/ml G418 (Geneticin(R), Gibco) einer Selektion unterzogen.
Rosettentests zur Identifizierung von T4&spplus;- oder T8&spplus;-Kolonien erfolgten auf überlebenden Kolonien 1 Woche nach dem Züchten in selektivem Medium. Nach einmaligem Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden die Platten mit 2,5 ml gereinigter monoklonaler Antikörper OKT(R)4A oder OKT(R)R8 (1 mg/ml, Ortho), die 1/500 in 5% fötales Kalbserum (FCS) enthaltendem PBS verdünnt waren, 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die freien Antikörper wurden von den Platten durch dreimaliges vorsichtiges Spülen in PBS entfernt. Nach Zugabe von 6 ml Humanerythrozyten, die mit gereinigten Kaninchen-Antimaus-IgG-Antikörpern (2% v/v Vorratssuspension, verdünnt 1/10 in PBS/5% FCS) konjugiert waren, wurden die Platten bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach 45 min wurden die freien Erythrozyten vorsichtig abgesaugt und vor der Inspektion PBS zugegeben. Die T4&spplus;- und T8&spplus;-ψ-2-Klone wurden durch Kolonieisolierung gereinigt und durch Flußcytometrie und Northernblot-Analyse charakterisiert.

Produktion rekombinanter Retroviren und Infektion

T4&spplus;- und T8&spplus;-ψ-2-Klone wurden isoliert. Diese bilden die Vorratsiösungen des rekombinanten Retrovirus mit Titern von 10&sup5; cfu/ml. Die Virusvorratslösungen wurden durch Eintragen von 10 ml frischer DME/10% CS in eine nahezu konfluente Monoschicht der T4&spplus;- oder T8&spplus;-ψ-2-Klone hergestellt. Nach 24 h wurde das Medium entfernt und durch einen 0,45-µm-Filter (Millipore) futriert. Zur Infektion wurden 5 x 10&sup5; Zellen mit 2 ml Virusüberstand (oder einer Verdünnung) in Gegenwart von 8 µg/ml Polybren (Aldrich) inkubiert. Nach 3 h wurden 8 ml frisches Medium zugegeben. 3 Tage nach Infektion wurde in DME/10% CS, das 500 µg/ml G418 enthielt, abermals eine Kultur der Zellen angesetzt, die Zellen 2 Wochen gezüchtet, auf G418r-Kolonien bewertet und unter Verwenden des in situ Rosettenverfahrens oder der Flußcytometrie auf eine Oberflächen-T4- oder -T8-Expression untersucht.
ψ-2-Kulturüberstände wurden zur Infektion von Mäuse-ψ-AM- Zellen gemäß der obigen Beschreibung verwendet. Anhaftende T4&spplus;- oder T8&spplus;-Transformanten wurden im Rahmen des in-situ- Rosettentests und einer anschließenden Kolonieisolierung gereinigt. Nichthaftende T4&spplus;- oder T8&spplus;-Transformanten wurden durch Fluoreszenz-aktiviertes Zeilsortieren (FACS) gereinigt. Nichthaftende Humanlymphoidzellinien (HSB2, RPMI-T- Zellen, Raji-B-Zellen) und haftende Epithelzellen (HeLa) wurden durch Cokultivierung mit T4&spplus;- oder T8&spplus;-ψ-AM-Klonen (vorbehandelt mit 10 µg/ml Mitomycin-C während 2 h, Sigma) infiziert und gereinigt.
Die Zellinien wurden bezüglich G418-Resistenz bei einer Konzentration von 1,5 mg/ml mit Ausnahme der HeLa-Zellen, die 1 mg/ml erfordern, und der Fibroblasten, die 0,5 mg/ml erfordern, ausgewählt. Alle, rekombinante amphotrope Viren (ψ-AM) liefernden Zellkulturen wurden unter P3-Einschlußbedingungen gehalten.

AIDS-Virus

Der Prototyp-LAV-Stamm von HTLV-III/LAV wurde von J.-C. Cherman (Institut Pasteur, Paris, (45)) erhalten. Die in diesen Untersuchungen verwendeten Virusinocula stammten von der zweiten bis fünften Passage des Virus in unserem Labor. Inocula sind Kulturüberstände aus mit HTLV-III/LAV-infizierten, mit Phytohämagglutinin (PHA)-stimulierten peripheren Lymphozyten, die durch sequentielle Zentrifugation (7 min bei 300 g und anschließend 20 min bei 1500 g) geerntet wurden. Sie wurden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Für Bindungsuntersuchungen wurde das Virus aus Kulturüberständen aufkonzentriert und wie oben durch 90minütige Ultrazentrifugation bei 90.000 g über einem 15% Renograffin (E.R. Squibb)-Kissen in 0,01 Mol Tris, 0,15 Mol NaCl und 1 mMol EDTA bei einem pH-Wert von 8,0 geerntet.

Anti-HTLV-III/LAV-Reagenzien

Serum mit einem hohen Gehalt an Antikörpern gegen HTLV- III/LAV wurde von einem homosexuellen Mann mit chronischer Lymphadenopathie erhalten, wobei die Spezifität hiervon durch Immunofluoreszenz (46), Westernblot-Analyse (47) und Radioimmunofällung (48) beschrieben worden war. Teile der IgG-Fraktion wurden mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC, FITC/Protein-Verhältnis von 10,7 µg/ml), Meerrettichperoxidase (HPO, Typ VI, Sigma) und Agarose wie beschrieben (47, 49, 50, 51) gekuppelt. Parallel hierzu wurden Konjugate von IgG aus einem nichtimmunen Serum hergestellt.

Reverser Transkriptaseassay

Die Aktivität Magnesium-abhängiger, spezieller reverser Transkriptase (RT) wurde mit einem Matrizenprimer (A)n(dT)12-18 (oder (dA)n(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als negativer Vergleich) in Gegenwart von 7,5 mMol Mg²&spplus; gemessen (52).

Immunofluoreszenznachweis des Cytoplasma-AIDS-Virus

Kultivierte Zellen (1 x 10&sup5; in 0,1 ml) wurden auf Glasobjektträgern (Shandon Cytocentrifuge) zentrifugiert, in 95% Ethanol und 5% Essigsäure 30 min bei -20ºC fixiert und mit drei 10-min-Änderungen von PBS (0,01 Mol PO&sub4;, 0,15 Mol NaCl, pH-Wert 8,0) rehydratisiert. Die Objektträger wurden 30 min bei Raumtemperatur einer 1:500-Verdünnung von FITC-anti- HTLV-III/LAV (19 µg/ml) ausgesetzt. Die Objektträger wurden anschließend gewaschen (dreimalige Veränderung, jeweils 10 min) und anschließend unter ein Deckglas mit 50% Glycerin in PBS gestellt. Die Objektträger wurden mit einem Leitz- Orthoplanauflichtmikroskop bei einer 630fachen Vergrößerungsleistung (630 x power) untersucht. Unter diesen Bedingungen ist das FITC-anti-HTLV-III/LAV-Reagens für HTLV- III/LAV spezifisch. Nichtinfizierte PHA-stimulierte Zellen, mit Epstein-Barr (EB)-Virus infizierte B-Zellinien, eine Adenovirus-infizierte Zellinie, verschiedene T-Zellinien und mit HTLV-I und HTLV-II infizierte Zellinien wurden nicht angefärbt.

AIDS-Virusimmunoassay (Antigeneinfangassay)

Dies ist ein Sandwichimmunoassay, der detailliert bereits beschrieben wurde (47). Kurz gesagt wird Kulturüberstand in mit Anti-HTLV-III/LAV-IgG beschichtete Ausnehmungen einer Mikrotiterplatte eingetragen. Nach Waschen der Platten wird gebundenes Virusantigen mit HPO-anti-HTLV-III/LAV nachgewiesen. Dieser Assay, der zumindestens so empfindlich wie der RT-Assay ist, ist mit Kulturüberständen aus PHA-stimulierten Lymphozyten von zahlreichen Spendern, mit EB-Virus infizierten B-Zellinien, verschiedenen T-Zellinien, polyklonalen und klonierten IL-2-abhängigen T-Zellinien, der Myeloidzelllinie K562, sowie Linien, die HTLV-I oder HTLV-II tragen, negativ. Die Grenze OD&sub4;&sub9;&sub0; zur Unterscheidung eines positiven von einem negativen Überstand wurde in jedem Lauf aus dem Mittelwert plus 2 Standardabweichungen aus mindestens 10 Replikationsbestimmungen bei Vergleichsüberständen (nichtinfizierten Zellkulturüberständen), die gleichzeitig geerntet wurden, bestimmt.

AIDS-Virusinfektiositäts (ID-50)-Test

Der Mikrokulturassay für die Titration von infektiösem HTLV- III/LAV wurde detailliert beschrieben (47). Kurz gesagt werden mit PHA-stimulierte Lymphozyten oder Zellinien (2 x 10&sup6; Zellen/ml) mit seriellen 10fach-Verdünnungen an Virusinoculum angeimpft und 18 h bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden anschließend gewaschen und in Mikrokultur (10 bis 20 Kulturen pro Verdünnung: 1 x 10&sup5; Zellen pro Kultur in 0,25 ml Medium) plattiert. Alle 4 Tage wurden 100 µl Überstand entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Die Überstände wur den anschließend bezüglich viraler Antigene im Rahmen des oben beschriebenen Antigeneinfangassays untersucht. Ein infektlöser Virustiter (ID-50) ist als der Reziprokwert der Verdünnung definiert, bei der 50% der Kulturen bezüglich des Virus positiv sind (47).

VSV-Pseudotypassay

Gingivostomatitisvirus (VSV, Indianastamm, Wildtyp) wurde in den für den Hüllpseudotyp erforderlichen Retrovirus bildenden Zellen wie beschrieben (53) vermehrt. Geerntetes VSV wurde zur Inaktivierung von Nichtpseudotypvirionen mit hyperimmunem neutralisierendem Schaf-anti-VSV-Serum versetzt. Die Pseudotyptiter lagen in einem Bereich von 10&sup4; bis 10&sup5; PFU/ml. Für den Assay wurden 2 x 10&sup5; mit den VSV-Pseudotypen zu infizierende Zellen in Gewebekulturausnehmungen mit einem Durchmesser von 30 mm plattiert. HeLa-, NIH-3T3- und L-Zellen waren natürlich haftend. Alle anderen Zelltypen wurden durch Vorbehandlung des Substrats mit 50 µg/ml Poly- L-Lysin gebunden. Nach einer 1stündigen Virusadsorption wurden die Zellen gewaschen und 10&sup6; Nerz-CCL64-Zellen oder Rinder-MDBK-Zellen in jede Ausnehmung eingetragen. Diese Zellen liefern ausgezeichnete Plaques für eine sekundäre VSV-Infektion, sind jedoch gegenüber einer Infektion durch Pseudotypvirionen beständig. Nach einem Ansiedeln und Verteilen der Plaqueindikatorzellen (etwa 90 min) wurden die Monoschichten mit Agarmedium überschichtet. Die VSV-Plaques wurden 2 Tage nach der Infektion gezählt. Zur Hemmung einer Pseudotypplaquebildung durch Vorbehandlung der Zellen 30 min vor Zugabe der Pseudotypen gemäß der Beschreibung in (54) wurden anti-T4A-monoklonale Antikörper (1:20), Anti-HTLV- III-Serum (1:10) oder Anti-HTLV-I-Serum (1:10) verwendet.

Synzytiuminduktionsassay

2 x 10&sup5; Zellen wurden mit 2 x 10&sup4; H9-Zellen, die mit HTLV- III infiziert waren und HTLV-III bildeten (55), in Ausnehmungen eines Durchmessers von 10 mm cokultiviert. Die Kulturen wurden bei 37ºC inkubiert und nach 18 h wie früher beschrieben (54, 56) bezüglich einer Synzytiumbildung untersucht. Zellen mit fünf oder mehr Synzytien wurden als positiv bewertet. Die Synzytiumhemmung wurde durch Zugabe von anti-T4A-monoklonalen Antikörpern (1:20) zu den gemischten Kulturen zur Zeit des Ansetzens der Kulturen untersucht.

Cytofluorometrische Analyse und AIDS-Virusbindung

Das Verfahren ist detailliert in (46) beschrieben. Kurz gesagt wurde eine Zelloberflächen-T4- oder -T8-Expression durch direkte Immunofluoreszenz mit mit Fluorescein konjugierten monoklonalen Anti-T4A- oder anti-T8-Antikörpern (OKT(R)4A, OKT(R)8) nachgewiesen. Der Verdünnungs/Wasch- Puffer bestand aus 0,01 Mol PO&sub4;, 0,15 Mol NaC1, pH-Wert 7,4, worin 0,1% Rinderserumalbumin, 2% v/v AB&spplus;-Humanserum und 0,01% NaN&sub3; enthalten waren. Alle Reagenzien wurden bezüglich optimaler (sättigender) Bindung vortitriert. Die Zellen (5 x 10&sup5;) wurden in einer 25 µl Verdünnung der monoklonalen Antikörper während 30 min bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation (7 min bei 300 g) gewaschen, in 0,5 ml 1% Paraformaldehyd in Kochsalzlösung resuspendiert und mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsorter (FACS IV, Becton Dickinson) analysiert. Zur HTLV-III/LAV- Bindung wurden 5 x 10&sup5; Zellen mit HTLV-III/LAV (500 ng in 10 µl) während 30 min bei 37ºC inkubiert. Die gewaschenen Zellen wurden in 25 µl von mit Fluorescein konjugiertem Anti-HTLV-III/LAV während 30 min bei 4ºC resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, in 1% Paraformaldehyd resuspendiert und mit Hilfe einer FACS-Vorrichtung wie oben analysiert. Zur Hemmung der HTLV-III/LAV-Bindung wurden die Zellen mit Anti-T4A oder Anti-T8 (20 ng in 20 µl) während 30 min bei 4ºC vorinkubiert, worauf HTLV- Ill/LAV (500 ng in 10 µl) während 30 min bei 37ºC zugegeben wurde. Die Zellen wurden gewaschen, mit mit Fluorescein konjugiertem Anti-HTLV-III/LAV inkubiert, gewaschen, in Paraformaldehyd resuspendiert und mit einer FACS-Vorrichtung wie oben analysiert.

Zelloberflächenradioiodierung. Immunofällung und Gelelektrophorese

T4&spplus;-NIH-3T3-Transformanten wurden nach der Lactoperoxidasetechnik (18) wie folgt an der Oberfläche radioiodiert: 4 x 10&sup7; Zellen wurden in 1 ml PBS, das 0,5 mMol EDTA, 2 mCi Na¹²&sup5;I und 20 µg Lactoperoxidase enthielt, suspendiert. Zur Zeit 0, 1, 5, 10 und 15 min wurden 10 µl 0,03% H&sub2;O&sub2; zugegeben. Die Reaktion wurde bei 23 ºC durchgeführt und nach min durch zwei Zentrifugationen in 50 Volumina kalter, 10 mMol NaI enthaltender PBS abgestoppt. Markierte Zellen wurden in 4 Röhrchen aufgeteilt und wie angegeben mit HTLV- III/LAV (2 µg in 20 µl) während 30 min bei 37ºC inkubiert. Die nachfolgenden Waschvorgänge und Manipulationen erfolgten bei 0 bis 4ºC. Die gewaschenen Zellen wurden durch Zugabe von 1 ml Tensidlysierpuffer (LB, 0,02 Mol Tris, 0,12 Mol NaCl, pH-Wert 8,0, worin 0,2 mMol Phenylethylsulfonylfluorid, 5 µg/ml Aprotinin, 0,2 mmol EDTA, 0,2 mMol NaF, 0,2% Natriumdesoxycholat und 0,5% v/v Nonidet P-40 enthalten waren) lysiert. Die Röhrchen wurden 15 min auf Eis gehalten, worauf die Kerne durch Zentrifugation während 20 min bei 3000 g entfernt wurden.
Für die Absorptionen wurden Sepharosekonjugate von Humananti-HTLV-III/LAV-IgG-, nichtimmunen Human-IgG-, Anti-T4A- und Anti-T8-Antikörpern wie beschrieben (48) hergestellt. Die Lysate wurden mit 200 µl Sepharose-nichtimmunem Human- IgG während 1,5 h unter Drehbewegung vorabsorbiert und anschließend mit 20 µl Sepharosekonjugaten (wie angegeben) während 3 h unter Drehbewegung immunogefällt. Die Sepharoseabsorbenzien wurden dreimal gewaschen: einmal mit LB, einmal mit 0,5 Mol NaCl enthaltendem LB und einmal mit 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) enthaltendem LB. Das absorbierte Material wurde während 30 min bei 65ºC mit 20 µl Probenpuffer (0,01 Mol Tris, pH-Wert 8,0, worin 2% SDS, 5% 2-Mercaptoethanol (v/v), 25 µg Bromphenolblau und 10% Glycerin (v/v) enthalten waren, eluiert. Die Elektrophorese erfolgte in einem 3,3-20% Gradientenpolyacrylamidgel mit einem 3% Stapelgel (57). Die Autoradiogramme wurden mit einem Kodak- XAR-5-Film entwickelt.

Virushemmassay

2 x 10&sup5;-T4&spplus;-JM-T-Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 min dem AIDS- Virus ausgesetzt. Die Hemmer Ammoniumchlorid (20 mmol) oder Amantadin (20 mmol) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verlaufs der Virusinfektion (0 min, 30 min und 60 min) zugesetzt. Nach 6 h wurden die Zellen gewaschen und in frischem Medium (RPMI/10% FCS) replattiert. Die Wirkung dieser Mittel auf eine AIDS-Virusinfektion wurde 5 Tage nach Infektion bestimmt. Der Anteil der infizierten Zellen in den virale Antigene exprimierenden Kulturen wurde durch Immunofluoreszenzmikroskopie, wie bereits beschrieben (58), bestimmt.

RNA-Isolation und Northernblot-Hybridisierungen

Gesamt-RNA wurde aus den Zellen durch Homogenisieren in 4 Mol Guanidiniumthiocyanat und anschließende Ultrazentrifugation durch ein 5,7 Mol Cäsiumchloridkissen (28) isoliert. Die Poly(A)&spplus;-Selektion erfolgte durch Oligo(dT)-Cellulosechromatographie (Typ 3, Collaborative Research) (29).
Die RNA wurde durch ein 1% Agaroseformaldehydgel (39) elektrophoresiert und auf Hybond (Amersham) übertragen. Eine Northernblot-Hybridisierung erfolgte nach dem vom Hersteller vorgeschlagenen Vorgehen. Die Sonden wurden mit α³²-P-markierten Desoxynucleotidtriphosphaten zu einer spezifischen Aktivität von 0,5-1 x 10&sup9; cpm/µg nick-translatiert (59).

ERGEBNISSE

Isolieren einer T4-cDNA

Die zum Isolieren einer T4-cDNA verwendete Strategie umfaßte ursprünglich ein Konstruieren von L-Zelltransformanten, die T4 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Aus der mRNA eines T4&spplus;- transformierten Fibroblasten synthetisierte cDNA wurde durch subtraktive Hybridisierung angereichert und als Sonde zur Isolierung einer cDNA mit Kodierung für T4 aus einer cDNA- Bibliothek, die aus der mRNA von peripheren T-Lymphozyten hergestellt worden war, verwendet. Die Identität der T4&spplus;cDNA-Klone wurde durch Northernblot-Analyse und Southernblot-Analyse und schließlich durch die Fähigkeit dieser Klone, den T4&spplus;-Phenotyp auf Empfängerzellen zu übertragen, bestimmt. Ähnliche Techniken wurden früher zur Isolierung des Gens mit Kodierung für das T8-Protein verwendet (20).
Mäuse-L-Zellen mit einem Mangel an Thymidinkinase (tk) wurden mit Genom-DNA aus der leukämischen T-Zellen-Zellinie HUT-102 zusammen mit dem tk-haltigen Plasmid pTK cotransformiert (25, 26). tk&spplus;-L-Zellen-Transformanten, die T-Zellenoberflächenproteine exprimieren, wurden durch einen in-situ- Rosettentest identifiziert. tk+-Kolonien wurden gegen T4 gerichteten monoklonalen Mäuseantikörpern ausgesetzt und anschließend mit an Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulin gekuppelten roten Blutzellen inkubiert. T4&spplus;-Transformanten sind aufgrund ihrer spezifischen Assoziation an rote Blutzellen sichtbar rot. Auf diese Weise wurde der primäre T4&spplus;-Transformant LTD-4 erhalten. Die Expression des T4-Moleküls durch dieses Klon wurde unabhängig durch cytofluorometrische Analyse (Fig. 1) verifiziert.
Die mRNA-Population des T4&spplus;-Transformanten LTD-4 sollte sich von der einer nichttransformierten L-Zelle lediglich bezüglich der Expression der neu transformierten Gene unterscheiden. Diese Sequenzen wurden durch Hybridisieren von stark radioaktiver cDNA, die aus Poly(A)&spplus;-RNA des T4&spplus;-Transformanten hergestellt worden war, mit einem großen Überschuß an RNA aus nichttransformierten L-Zellen angereichert (32, 60). Selbst bei hohen Rot-Werten nicht zur Hybridisierung fähige cDNA wurde durch Hydroxyapatitchromatographie isoliert und zum Sichten einer peripheren Human-T-Zellen-cDNA-Bibliothek, die im λ-Kloniervektor gt10 konstruiert ist, verwendet. Vier schwach hybridisierende Plaques wurden identifiziert, plaquegereinigt und bezüglich der Anwesenheit von T4-Sequenzen analysiert.
Zur Bestimmung, ob eines dieser Klone für T4 kodiert, wurden anfänglich Northembiot-Analysen mit RNA aus peripheren T4&spplus;- und T4&supmin;-T-Zellen, Leukämiezellen, Thymozyten, L-Zellentransformanten und nichtlymphoiden Zellen durchgeführt (Fig. 2). Einer der vier Klone hybridisierte mit einer lediglich in T4&spplus;-Zellen vorhandenen RNA. Dieser Klon weist die in dem T4&spplus;-Transformanten LTD-4 vorhandene 3-kb-RNA, die auch in einer Population von peripheren T4&spplus;-Lymphozyten, verschiedenen leukämischen T4&spplus;-Zellinien und Thymozyten vorhanden ist, nach. Keine Hybridisierung wurde mit RNA aus nichttransformierten Fibroblasten, peripheren T4&supmin;-Lymphozyten, HeLa-Zellen oder Humanneuroblastomzellen beobachtet.
Das Expressionsmuster der durch dieses Klon nachgewiesenen RNA steht im Einklang mit der Möglichkeit, daß sie für T4 kodiert. Diese cDNA ist jedoch lediglich 0,6 kb lang, hybridisiert aber mit einer 3-kb-mRNA. Folglich wurde die periphere humane T-Zellen-cDNA-Bibliothek abermals gesichtet, wobei ein Klon (pT4B) erhalten wurde, der ein 3-kb-Insert, das nahezu so groß ist, wie die reife Messenger-RNA, enthält. Die Restriktionskarten dieses Klons sind in den Fig. 3A und 3B dargestellt.

Genomblot-Analyse

Als nächstes wurden Southernblot-Experimente (37) durchgeführt, um zu zeigen, daß der isolierte cDNA-Klon mit DNA aus dem T4&spplus;-Transformanten sowie mit Human-DNA, jedoch nicht mit nichttransformierter Mäuse-L-Zellen-DNA hybridisiert (Fig. 4). Genom-DNA aus den verschiedensten Humanzellen liefert einen Satz von fünf hybridisierenden Fragmenten nach Spaltung mit dem Enzym BamHI. Wie erwartet, können T4- Sequenzen in dem Transformanten LTD-4, jedoch nicht in nichttransformierter L-Zellen-DNA nachgewiesen werden. Das am nächsten am 3'Ende des Gens liegende BamHI-Fragment (6,6 kb) ist in LTD-4 vermutlich als Folge des Integrationsvorgangs nicht vorhanden. Darüber hinaus sind auf diesem groben Analyseniveau bei einem Vergleich von DNA aus Lymphoiden und nichtlymphoiden Zellen keine schwerwiegenden Umlagerungen sichtbar. Die Summe der Molekulargewichte der hybridisierenden Fragmente beträgt 33 kb. Dies legt die Vermutung nahe, daß das T4-Gen ziemlich groß ist. Ein vollständiger Satz der diesen Bereich umspannenden genomischen Klone wurde erhalten (siehe unten), wobei die BamHI-Fragmente durch Restriktionsanalyse dieser Klone geordnet wurden (Fig. 3A). Dies bestätigt, daß das Gen groß ist und Introns merklicher Länge enthalten muß.

Expression der T4-cDNA in transformierten Mäusefibroblasten

Ein weiterer Hinweis, daß die isolierte cDNA für T4 kodiert, würde erhalten werden, wenn dieses Klon Fibroblasten nach Transformation zu dem T4&spplus;-Phenotyp umwandeln könnte. Das T4- Gen in der chromosomalen DNA ist groß und umspannt mehrere genomische Klone. Folglich wurde das cDNA-Klon in die beiden retroviralen Expressionsvektoren pVcos7 und pMV6kt/neo, die die eine einzelne EcoRI-Klonierstelle flankierenden LTRs des Moloney-Mäuseleukämievirus enthalten, eingeführt (Fig. 3C). Der 5'LTR fördert die Transkription über die Klonierungsstelle hinweg, wobei der 3'LTR die zur Spaltung und Polyadenylierung notwendigen Sequenzen enthält. Der Vektor pMV6tk/neo enthält ferner den an den Kodierbereich des Neomycinphosphotransferasegens fusionierten tk-Promotor. Das sich pVcos7 bedienende Konstrukt erfordert eine Transformation mit einem nicht verknüpften selektierbaren Marker, während pMV6tk/neo den Neomycinresistenzmarker trägt, der eine verknüpfte Cotransformation erlaubt. Neo&spplus;-Kolonien von nach Transformation erhaltenen NIH-3T3-Zellen wurden durch ihre Fähigkeit, in das Neomycinanaloge G418 enthaltenden Medien zu wachsen, ausgewählt und unter Verwendung des Rosettentests zum Nachweis der Expression von T4 auf der Zelloberfläche gessichtet. Etwa 50% der mit pVcos7 erhaltenen G418- Kolonien und 75% der mit pMV6tk/neo erhaltenen Kolonien waren bei diesem Test bezüglich T4 positiv. Die Rosetten-positiven Kolonien wurden weiter durch Cytofluorometrie analysiert, um zu bestätigen, daß T4 auf der transformierten Zelloberfläche exprimiert wird (Fig. 1).
Metabolische Proteinmarkierungsexperimente wurden durchgeführt. Diese zeigen, daß die transformierten T4&spplus;-Fibroblasten und T-Lymphozyten ein T4-Protein identischen Molekulargewichts exprimieren. Nichttransformierte NIH-3T3-Zellen, T4&spplus;-Transformanten und T-Lymphozyten wurden 12 h in Gegenwart von L-[³&sup5;S]-Methionin radioaktiv markiert (41). Die Zellen wurden mit Hilfe von Tensid solubilisiert, worauf das Lysat über Lentillectinsäulen geleitet wurde, um hinsichtlich Glycoproteinen anzureichern (42). Die gebundene Glycoproteinfraktion wurde eluiert und mit gegen T4 gerichteten monoklonalen Antikörpern immunogefällt (Fig. 5). Unter reduzierenden Bedingungen wird in Extrakten von T-Lymphozyten und zwei unabhängigen T4&spplus;-Transformanten ein mit einer relativen Molekülmasse von 55 kd wanderndes Glycoprotein nachgewiesen.
Dieses Protein wird in Vergleichs-3T3-Fibroblasten nicht nachgewiesen. Unter nicht reduzierenden Bedingungen wird ein 51-kd-Glycoprotein mit Anti-T4 in T-Zellen und in den transformierten Fibroblasten immunogefällt.
Diese Experimente zeigen, daß die Transformanten ein mit Anti-T4 immunogefälltes 55-kd-Glycoprotein exprimieren, das von der Größe her mit dem auf der Oberfläche der T-Lymphozyten exprimierten Protein identisch ist. So zeigen Northern- und Southernblot-Analysen unter Verwendung der isolierten cDNA im Zusammenspiel mit der Fähigkeit dieser cDNA, den T4&spplus;-Phenotyp auf Mäusefibroblasten zu übertragen, daß die gesamte Kodiersequenz des T-Zellen-Oberflächenproteins T4 kloniert worden ist.

Nucleotidsequenz der T4-cDNA und die abgeleitete Proteinsequenz

Die vollständige Nucleotidsequenz des T4-Kodierbereichs wur de durch Sequenzieren beider Stränge des 3-kb-cDNA-Inserts unter Verwendung des Didesoxyterminationsverfahrens (35, 36) bestimmt. Die vollständige Nucleotidsequenz und die vorausgesagte Proteinsequenz sind in Fig. 6 dargestellt. Der längste offene Leserahmen beginnt bei der Position 76 mit einem von der Initiationskonsensussequenz PurNNATGPur umgebenen Methioninkodon (61). Dieser Leserahmen erstreckt sich über 1374 Nucleotide mit Kodierung für ein 458 Aminosäuren enthaltendes Polypeptid. Das Zusammenpassen dieses Leserahmens wurde durch Insertieren dieser cDNA in den RNA- Expressionsvektor pSP6 (40) bestätigt. Aus diesem Vektor synthetisierte RNA steuert bei in-vitro-Translation die Synthese eines nicht modifizierten 51-kd-Proteins, wobei das genaue Molekulargewicht auf einer Voraussage von der Nucleotidsequenz beruht (Fig. 7).
T4 besteht aus einer Leadersequenz, vier variabel-joining (VJ)-artigen Regionen in Tandemanordnung und einer membranumspannenden Domäne, die jeweils mit den entsprechenden Regionen der unterschiedlichen Elemente der Immunoglobulingenfamilie (62, 63) (Fig. 6 und 8) eine Homologie teilen. Ein Strang der hydrophoben Reste, der einem durch einen Kyte-Dolittle (64) Hydropathie (hydropathicity)-Plot vorausgesagten Leaderpeptid entspricht, folgt unmittelbar dem Initiationskodon. Obwohl die exakte Position, an der das native T4-Protein prozessiert wird, nicht bestimmt werden kann, wird angenommen, daß die Spaltung direkt nach dem Glycin an der Position &spplus;2 basierend auf bekannten Spaltungsmustern erfolgt (65). Folglich enthält das Signalpeptid 25 Aminosäuren und das prozessierte T4-Protein besteht aus 433 Resten.
Die Reste 1-94 des reifen Proteins teilen sowohl eine Aminosäure- als auch Strukturhomologie mit der variablen Domäne der leichten Kette von Immunoglobulin (Fig. 9A). Die Gesamthomologie dieser Domäne mit den variablen Regionen von Immunoglobulin beträgt 32%. Ein Seguenzvergleich zwischen den V-Regionen der Leichtketten-Immunoglobuline und des N- terminalen V-artigen Bereichs (V1) von T4 zeigt, daß acht von 14 invarianten Resten konserviert bleiben (66). Diese Domäne enthält zwei durch 67 Aminosäuren getrennte Cysteinreste, deren Positionen und Abstand analog zu denen sind, die in den leichten Ketten von Immunoglobulinen und verwandten Molekülen gefunden werden (67). Diese Cysteine sind in der Lage, die konservierten Intrastrangdisulfidbindungen, die charakteristisch für V-Domänen sind, zu bilden. Diese Vermutung wird durch unsere Beobachtung getragen, daß T4 unter nichtreduzierenden Bedingungen rascher wandert als unter reduzierenden Bedingungen, was im Einklang mit der Bildung mindestens einer Intrastrangverknüpfung steht (Fig. 5, Spuren e und f).
Neben den Homologien auf der Stufe einzelner Aminosäuren teilt die V1-Domäne von T4 strukturelle Merkmale mit den variablen Bereichen von Immunoglobulin. Die variablen und konstanten Domänen von Immunoglobulin falten sich in einem charakteristischen Muster, indem sich eine Reihe von anti- parallelen ß-Strängen unter Bildung von zwei ß-Faltblattstrukturen falten (67, 68). Diese ß-Faltblätter werden durch Disulfidbrücken und charakteristische hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten. Um zu bestimmen, wie sich die vor ausgesagte Sekundärstruktur der V-artigen Domäne von T4 mit der Struktur der V-Domänen der leichten Ketten von Immunoglobulinen vergleichen lassen, wurden zweidimensionale Strukturausrichtuntersuchungen durchgeführt. Ferner wurde ein Plot der wahrscheinlichen ß-Stränge und ß-Drehungen in diesen Sequenzen unter Verwendung des empirisch abgeleiteten Algorithmus von Chou und Fasman (69) erhalten. Diese Analysen legen die Vermutung nahe, daß sieben ß-Stränge in der Vartigen Domäne von T4 vorhanden sind, die nahezu mit denjenigen zusammenpassen, die in der V-Domäne von Immunoglobulin gefunden werden (Fig. 9A). Die beiden konservierten Cysteine von T4 finden sich in den ß-Strängen B und F und passen exakt mit den Positionen der Cysteine in dem V-Bereich überein, von dem bekannt ist, daß er die konservierte Disulfidbindung im Immunoglobulin bildet. Ein Tryptophanrest liegt 12 Aminosäuren stromab des ersten Cysteins und ein Tyrosinrest befindet sich zwei Aminosäuren vor dem zweiten Cystein. Diese Reste sind in hohem Maße charakteristisch für die ß- Stränge C bzw. F in den Leichtketten-V-Regionen. Darüber hinaus befindet sich ein Aspartatrest sechs Aminosäuren vor dem zweiten Cystein und ein Argininrest liegt an der Basis des ß-Strangs D. Diese geladenen Reste sind in hohem Maße charakteristisch für V-Domänen (67). Schließlich sind in den ß-Strängen Flecken von alternierenden hydrophoben Resten vorhanden, die die Wechselwirkung der beiden ß-Faltblattstrukturen verstärken.
Der V1-Domäne von T4 folgt ein Strang von Aminosäureresten, der eine signifikante Homologie mit den joining (J)-Regionen der Immunoglobuline und der T-Zellenantigenrezeptoren besitzt. In Fig. 9B ist dieser J-artige Bereich von T4 mit den Konsensus-joining-Sequenzen von Immunoglobulinleichtketten und den beiden Ketten des T-Zellenantigenrezeptors ausgerichtet. Diesem J-artigen Bereich folgt ein 265 Aminosäuren langer Strang, der strukturell in drei weitere VJ-artige Domänen mit einer statistisch signifikanten Sequenz- und Strukturhomologie zu den Prototypimmunoglobulin-VJ-Regionen unterteilt werden kann (Fig. 6 und 8). Darüber hinaus enthält diese Sequenz zwei potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen (Asn-Leu-Thr; Fig. 6).
An die extrazelluläre Domäne schließt sich eine durch Hydropathieplot (64) vorausgesagte vermutliche Transmembransequenz an, die lediglich hydrophobe und neutrale Aminosäurereste enthält. Dieses Segment besitzt eine auffallende Homologie mit dem Transmembranexon der ß-Ketten der Klasse II- Haupthistokompatibilitätsproteine (Fig. 9C). Eine Ausrichtung der Transmembranregionen von T4 mit den MHC-Klasse-II- ß-Ketten zeigt eine 48%ige Homologie ohne Lücken. An das Membran umspannende Segment schließt sich eine hochgeladene Sequenz aus 40 Aminosäuren, die die Cytoplasmadomäne umfaßt, an (Fig. 6 und 8).

Das T4-Gen: Chromosomale Lage und Intron-Exon-Positionen

Die T4-cDNA wurde zur Bestimmung der chromosomalen Lage des T4-Gens durch Analysieren ihres Aufspaltungsmusters in einer Gruppe von Mäuse-Human-Körperzellhybriden und durch in-situ- Hybridisierung mit Humanmetaphasechromosomen (101) verwendet. Genombiotexperimente und die in-vitro-Hybridisierung zeigen, daß das T4-Gen auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 12 zwischen den Regionen 12p12 und l2pter liegt.
Durch Screenen von Humangenombibliotheken, die in den λ-Kloniervektoren Charon 4 und EMLB-3 (31) konstruiert sind, mit einem radioaktiv markierten pT4B-cDNA-Insert wurde ein Satz überlappenden Genomklonen, die das T4-Gen umspannen, erhalten (70). Die Charakterisierung dieser Klone durch sowohl Restriktionsanalyse als auch Southernblot-Analyse zeigte, daß sie die gesamte T4-Kodiersequenz enthalten. Die vollständige Intron-Exon-Organisation des T4-Gens wurde anschließend durch Sequenzieren spezieller Fragmente der Genomklone unter Verwendung des Didesoxyterminationsverfahrens (35, 36) bestimmt.
Das T4-Gen besteht aus 9 Exons, die durch 8 Introns, wie in den Fig. 8 und 10 dargestellt, aufgespalten sind. Das erste Exon enthält den 5'untranslatierten Bereich und das Leadersegment. Die erste variabelartige Domäne V&sub1; ist durch ein bei der Nucleotidposition 289 gelegenes großen Intron aufgespalten (Fig. 6). Folglich ist die V&sub1;J&sub1;-Domäne durch das zweite und dritte Exon kodiert. Die V&sub2;J&sub2;-, V&sub3;J&sub3;-, V&sub4;J&sub4;- und Transmembran (TM)-Domäne sind jeweils durch separate Exons (Exons 4-7) kodiert. Die Cytoplasmadomäne (CYT) ist durch ein Intron aufgespalten, wobei mindestens ein Teil der Cytoplasmadomäne und des 3'nichttranslatierten Bereichs durch das neunte Exon kodiert sind.

Konstruktion von transformierten T4&spplus;- und T8&spplus;-Zellen

Der zur Untersuchung der Rolle von T4 bei der AIDS-Virusinfektion verwendete experimentelle Ansatz umfaßte ursprünglich die Einführung des T4-Gens in T4&supmin;-Zellinien, die eine Virusinfektion nicht unterstützen können. Die transformierten Zellen wurden anschließend bezüglich ihrer Empfänglichkeit gegenüber AIDS-Viren getestet. Daran schlossen sich Untersuchungen hinsichtlich des Mechanismus, mit dem T4 eine Virusinfektion vermittelt, an.
Ein die vollständige Länge aufweisendes cDNA-Klon mit Kodierung für das Oberflächenprotein T4 wurde in den retroviralen Expressionsvektor pMV7 subkloniert. Der Expressionsvektor pMV7 (Fig. 11A) enthält zwei direkt wiederholte Moloney-Mäusesarcomvirus-LTRs, die eine einzelne EcoRI-Klonierstelle flankieren. Der 5'LTR fördert merklich die Transkription über die Klonierstelle hinweg, während der 3'LTR für Sequenzen sorgt, die zur Spaltung und Polyadenylierung der RNA erforderlich sind. Darüber hinaus enthält pMV7 den an den Kodierbereich des bakteriellen Neomycinphosphotransferasegens (neo), einen dominanten selektierbaren Marker, der eine verknüpfte Cotransformation und Infektion zuläßt, fusionierten Herpesvirusthymidinkinasepromotor (tk).
T4-pMV7 wurde in ψ-2 bzw. ψ-AM-Zellen, defekte ecotrope bzw. amphotrope Proviren enthaltende NIH-3T3-Zellinien, eingeführt (Fig. 11B) (44, 59). Beide Zellinien können endogene virale RNA nicht einkapsidieren (encapsidating), sie sind jedoch in der Lage, alle nötigen transviralen Funktionen zu liefern. Eine stabile Transfektion dieser Zellinien mit T4- pMV7 führt zur Bildung rekombinanter retroviraler Stammsammlungen mit Kodierung für T4, die frei von Helferviren sind. Diese reinen viralen Stammsammlungen können anschließend zur wirksamen Einführung von T4-Sequenzen sowohl in Mäuse- als auch Humanzellen ohne Bildung von Retrovirus durch die Targetzelle verwendet werden.
Kurz gesagt wurde T4-pMV7-DNA unter Verwendung des Vorgehens eines DNA-vermittelten Gentransfers in ψ-2-Zellen eingeführt (Fig. 11B) (25, 27). Positive neo&spplus;-Kolonien wurden anhand ihrer Fähigkeit, in das Neomycin-Analoge G418 (Geneticin(R)) enthaltenden Medien zu wachsen, selektiert und bezüglich der Expression von T4 auf der Zelloberfläche mit Hilfe eines in situ-Rosettentests (20, 70) gesichtet. Kolonien von transfizierten ψ-2-Zellen, die T4 exprimieren, wurden anschließend identifiziert. Diese liefern rekombinanten Retrovirus in Titern von 10&sup5; cfu/ml. T4+-ψ-2-Klone wurden anschließend zur Erzeugung von Retroviren mit der Fähigkeit zur Infektion von Mäuse-ψ-AM-Zellen verwendet. T4 exprimierende ψ-AM-Klone, die rekombinante retrovirale Titer von 10&sup4; cfu/ml liefern, wurden isoliert. T4&spplus;-Humantransformanten wurden durch Cokultivierung der Zellen mit mit Mitomycin-C behandelten oder ψ-AM-Klonen erzeugt (Fig. 11B). T4&spplus;-Transformanten wurden nachfolgend durch Northernblot-Analyse und Flußcytometrie analysiert, um zu bestätigen, daß T4 exprimiert wird und auf der Zelloberfläche vorhanden ist. Das Oberflächenprotein T8 exprimierende Vergleichszellinien wurden in analoger Weise konstruiert.

T4 ist essentiell für eine AIDS-Virusinfektion

Um anfänglich zu bestimmen, ob die Anwesenheit des T4-Proteins auf der Oberfläche eines Humanlymphozyten ausreicht, um die Zelle für eine AIDS-Virusinfektion empfänglich zu machen, wurden Transformanten der primitiven leukämischen T- Zellinie HSB2 (71), die lediglich die Early-T-Lymphozytproteine T1 und T11 auf ihrer Oberfläche exprimiert, konstruiert. HSB2 exprimiert weder T4 noch T8, noch exprimiert es den T-Zellantigenrezeptor oder den assoziierten Komplex von T3-Proteinen. Transformanten von HSB2, die entweder das T4- oder T8-Protein auf der Zelloberfläche exprimieren, wurden ausgewählt und dazu verwendet, die Empfänglichkeit dieser Zellinien für eine AIDS-Virusinfektion zu bestimmen. Verschiedene unterschiedliche experimentelle Vorgehensweisen wurden verwendet, um eine AIDS-Virusinfektion zu bestimmen. Hierzu gehört die Expression von reverser Transkriptase (52), die Expression von Virus im Cytoplasma der Zelle durch Immunofluoreszenzmikroskopie (46), der Nachweis von viralen Antigenen im Kulturüberstand mit Hilfe eines Immunoassays (47) sowie die Produktion von infektiösen Virionen durch eine Überschichtsubkultur mit mit Phytohämagglutinin (PHA)- stimulierten peripheren Lymphozyten (46). Unter Verwendung dieser Tests wurde kein Hinweis auf eine AIDS-Virusinfektion der HSB2-Zellinie beobachtet (Tab. 1). Tabelle I Emfängliche der T4&spplus;&supmin; und T8&spplus; -Humantransformanten für eine AIDS-Virusinfektion Menschliche Zellen Maximale reverse Transkriptase Ctyoplasmavirus Überschichtvirusantigen Überschichtsubkultur Synzytiuminduktion VSV (AIDS) Pseudotypinfektion Virusbindung
5 x 10&sup6;-Zellen wurden mit dem AIDS-Virus angeimpft, 24 h bei 37ºC inkubiert, gewaschen und in frischem Medium replattiert. Die Zellen und Überstände wurden am 3., 6., 9., 12., 16., 20., 24., 24. und 28. Tag entfernt und in vier Virusnachweistests verwendet: Reverse Transkriptase, Cytoplasmavirus, Überschichtvirusantigen und Überschichtsubkultur.
Die Ergebnisse der Pseudotypinfektionsexperimente sind wie folgt ausgedrückt: + (≥10³ PFU/ml); - (10 PFU/ml); ND nicht bestimmt.
Darüber hinaus wurde früher gezeigt, daß eine ausgiebige Zelifusion erfolgt, wenn Rezeptoren für das AIDS-Virus tragende, nichtinfizierte Humanzellen mit das AIDS-Virus produzierenden Zellen cokultiviert werden (54). Bei diesem Test gibt es keine Synzytiuminduktion&sub1; wenn HSB2-Zellen mit AIDS- Virus produzierenden H9-Zellen vermischt werden (Tabelle 1), obwohl reichlich Synzytium bei HTLV-I und HTLV-II produzierenden Zellen gebildet wird (Daten nicht dargestellt).
Schließlich wurde die Virusaufnahme zur Verwendung von Pseudotypen des die Hüllglycoproteine des AIDS-Virus tragenden vesikulären Stomatitisvirus (VSV) (vgl. Tabelle 1) (53, 54) getestet. Wenn mit dem AIDS-Virus infizierte Zellen mit VSV superinfiziert werden, baut ein Teil der die Nachkommenschaft bildenden VSV-Viren ausreichend AIDS-Virushüllglycoprotein auf, um einer Neutralisation durch hyperimmunes Anti-VSV-Serum zu widerstehen. Der Wirtbereich dieser VSV (AIDS)-Pseudotypvirionen ist auf Zellen beschränkt, die für das AIDS-Virus spezifische Rezeptoren exprimieren. Nach der Aufnahme der Virionen in die Zelle und der Freisetzung der Virusnukleinsäure aus den Virionen repliziert sich das transkapsidierte VSV-Genom unter Bildung von keinem Pseudotyp darstellenden Teilchen. Während der zweiten Infektion dringt aus infizierten Zellen freigesetztes Nachkommen-VSV in benachbarte, gegenüber VSV (AIDS)-Pseudotypinfektion resistente Indikatorzellen (Nerz-CCL64- oder Rinder-MDBK-Zellen) ein und zerstören diese, was zur Bildung von VSV- Plaques führt, die anschließend bewertet werden. Somit liefet die Infektion mit VSV (AIDS)-Pseudotypen einen quantitativen cytopathischen Plaquetest für die Virusaufnahme (54). Bei diesem Test wurden gegenüber dem Hintergrund keine Plaques beobachtet, wenn HSB2-Zellen VSV (AIDS)-Pseudotypen ausgesetzt wurden (Tabelle I). Bei Vergleichsexperimenten mit Pseudotypen von in eine HTLV-I-Hülle einkapsidierter VSV-RNA (VSV (HTLV-I)) wurden zahlreiche Plaques beobachtet. Dies zeigt, daß die HSB2-Zelle, die HTLV-I-Rezeptoren trägt, in der Lage ist, VSV in wirksamer Weise zur replizieren. Diese Beobachtungen zeigen, daß das in eine AIDS-Virushülle einkapsidierte VSV-Genom nicht in HSB2-Zellen eindringen kann.
Als nächstes wurde untersucht, ob die Einführung einer funktionellen T4-cDNA in HSB2 diese Zelle einer AIDS-Virusinfektion gegenüber empfänglich macht (Tabelle I). Ein Einwirkenlassen von AIDS-Viren auf HSB2-T4&spplus;-Transformanten führt zu einer produktiven Virusinfektion, wie durch Expression der reversen Transkriptaseaktivität (52), der Expression des Virus im Cytoplasma der Zelle durch Immunofluoreszenzmikroskopie (46), den Nachweis des Virusantigens im Kulturüberstand mit Hilfe eines Immunoassays (47) sowie die Produktion von infektiösen Viren durch eine Überschichtsubkultur mit PHA-stimulierten Lymphozyten (Tabelle I) (46) bestimmt wurde. Vergleichs-HSB2-T8&spplus;-Zellen waren bei jedem der Tests deutlich negativ.
Darüber hinaus wurde auch die Wirksamkeit untersucht, mit der unterschiedliche T4&spplus;-T-Zellen mit dem AIDS-Virus infiziert werden. Serielle Zehnfachverdünnungen des AIDS-Virus wurden auf HSB2-T4&spplus;- und HSB2-T8&spplus;-Transformanten, die natürlich isolierte T4+-T-Zellinie CEM sowie PHA-stimulierte periphere Lymphozyten einwirkengelassen. Anschließend erfolgte ein Waschen und ein Plattieren in einer Mikrokultur. Die Häufigkeit der infizierten Kulturen wurde anschließend mit Hilfe eines Immunoassays 12 Tage nach Einwirkenlassen des Virus (Fig. 12) (47) bestimmt. Auf diese Weise wurde der zur Infektion von 50% der den AIDS-Viren ausgesetzten Kulturen erforderliche AIDS-Virustiter (ID-50) definiert. Der ID-50- Wert der PHA-stimulierten peripheren Lymphozyten liegt zwei bis drei Größenordnungen über dem, der entweder für natürlich isolierte oder für transformierte T4&spplus;-Zellinien beobachtet wird. Die Wirksamkeit der Infektion von HSB2-T4&spplus;-Zellen ist ungefähr 10mal größer als die, die bei der natürlich isolierten T4&spplus;-T-Zellinie CEM beobachtet wird (Fig. 12). Vergleichs-HSB2-T8&spplus;-Zellen waren selbst bei den höchsten untersuchten Virustitern nicht für eine Infektion empfänglich.
Die Fähigkeit der HSB2-T4&spplus;-Zellen, sowohl eine Synzytiumbildung als auch die Replikation der VSV (AIDS)-Pseudotypen zu unterstützen, wurde auch untersucht. Wenn HSB2-T4&spplus;-Zellen mit AIDS-Virus produzierenden H9-Zellen cokultiviert werden, wird ohne Schwierigkeiten innerhalb von 18 h eine Synzytiumbildung beobachtet (Tabellen I und II). Darüber hinaus wird eine Synzytiuminduktion durch Vorbehandeln der Kulturen mit monoklonalem Anti-T4A-Antikörper zerstört (Tabelle II). Schließlich werden bei Einwirkenlassen von VSV (AIDS)-Pseudotypen auf HSB2-T4&spplus;-Zellen infektiöse VSV-Teilchen gebildet, die benachbarte Indikatorzellen zerstören (Tabellen I und III). Darüber hinaus wird durch Vorbehandlung entweder mit einem Anti-AIDS-Virusantikörper oder einem monoklonalen Anti-T4A-Antikörper eine Plaquebildung gehemmt (Tabelle III). Vergleichs-HSB2-T8&spplus;-Zellen waren bei jedem der zum Nachweis einer AIDS-Virusinfektion verwendeten sieben Tests auffallend negativ (Tabellen I, II und III). Diese Beobachtungen liefern den genetischen Beweis, daß in einem unreifen Human-T-Lymphozyten die bloße Anwesenheit des T4-Proteins eine für eine AIDS-Virusinfektion erforderliche essentielle Funktion darstellt. Tabelle II Induktion von Synzytium bei T4&spplus;-Humantransformanten SYNCYTIUMINDUKTION HUMANZELLEN H9/AIDS
2 x 10&sup5;-Zellen wurden mit 2 x 10&sup4;-AIDS-Virus liefernden H9- Zellen (H9/AIDS) cokultiviert und bei 37ºC inkubiert. Die Kulturen wurden nach 18 h auf eine Synzytiumbildung untersucht. Die Ergebnisse sind in Form des ungefähren Prozentsatzes der in den Synzytien enthaltenen Kerne angegeben: - (keine Synzytien); ++ (25%); +++ (50%); +++++ (90%); ND (nicht bestimmt). Eine Synzytiumhemmung wurde durch Zugabe von monoklonalen Anti-T4A-Antikörpern (αT4A; 1:20) zu den gemischten Kulturen zur Zeit des Ansetzens der Kultur untersucht. Die natürlich isolierten T4&spplus;-T-Zellinien JM und 8166 dienten als positive Vergleichsproben in diesen Untersuchungen. Tabelle III Cytopathischer VSV-Pseudotyp-Plaquetest bei T4±- und T8±-Humantransformanten VSV-PSEUDOTYPTITER (PFU/ml) HUMANZELLEN
2 x 10&sup5;-Zellen wurden mit VSV (AIDS)-Pseudotypen (53, 54) 1 h bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden anschließend gewaschen, worauf in jede Ausnehmung 1 x 10&sup6; Nerz-CCL64- oder Rinder-MDBK-Plaqueindikatorzellen, die eine VSV-Infektion zulassen, jedoch gegenüber VSV (AIDS) resistent sind, eingetragen wurden. Die Kulturen wurden anschließend mit Agarmedium überschichtet und 2 Tage nach Infektion bezüglich VSV- Plaques bewertet. Zur Hemmung einer VSV (AIDS)-Pseudotypplaquebildung durch Vorbehandlung der Zellen 30 min vor Einwirkenlassen der Pseudotypen (54) wurden monoklonale Anti-T4A- Antikörper (αT4A; 1:20) oder Anti-AIDS-Virusserum (αAIDS; 1:10) verwendet. Als Vergleichsproben in diesen Experimenten wurden VSV (HTLV-I)-Pseudotypen verwendet, die sich auf den verschiedensten Humanzelltypen plattieren lassen (54). Anti- HTLV-I-Serum (1:10) wurde dazu verwendet, eine VSV (HTLV-I)- Pseudotypplaquebildung zu blockieren. Die Ergebnisse sind in PFU/ml angegeben. ND bedeutet nicht bestimmt.

Eine AIDS-Virusinfektion ist nicht auf T-Lymphozyten beschränkt

In zwei menschliche Nicht-T-Zellinien: HeLa-Zellen, eine von einem Cervicalcarcinom stammende Epithelzellinie (72), und Raji-Zellen, eine von einem Patienten mit Burkittschem Lymphom stammende B-Lymphoblastoide-Zellinie (73) wurde eine funktionelle T4-cDNA eingeführt (Fig. 11B). Vor einem Retrovirus-vermittelten Gentransfer exprimieren diese Zellinien kein(e) Oberflächen-T4-Protein oder T4-mRNA noch sind sie für eine AIDS-Virusinfektion empfänglich (Tabelle I). Darüber hinaus unterstützen die Elternzellinien weder eine Synzytiuminduktion noch ein Plattieren von VSV (AIDS)-Pseudotypen (Tabellen I, II und III).
Im Gegensatz dazu unterstützen T4&spplus;-Raji- und HeLa-Transformanten eine AIDS-Virusinfektion anhand aller oben beschriebenen Kriterien (Tabelle I). Die Effizienz, mit der Raji- T4&spplus;-Zellen mit AIDS-Viren infiziert werden können, ähnelt der der HSB2-T4&spplus;-Zellen und liegt ungefähr 10mal über der Effizienz der Infektion der natürlich isolierten T4&spplus;-T-Zelllinie CEM (Fig. 12). Darüber hinaus unterstützen Raji-T4&spplus;und HeLa-T4+-Zellen bei Cokultivieren mit AIDS-Viren produzierenden H9-Zellen die Synzytiuminduktion, die durch Vorbehandeln der Kulturen mit monoklonalen Anti-T4A-Antikörpern zerstört wird (Tabellen I und II; Fig. 13). Darüber hinaus führt ein Einwirken von VSV (AIDS)-Pseudotypen auf diese Zellen zur Produktion von infektiösem VSV und zur Bildung von Plaques, die durch Vorbehandlung mit Anti-AIDS-Virus-Antikörpern oder monoklonalen Anti-T4A-Antikörpern gehemmt werden (Tabellen I und III). In jedem dieser Tests waren Vergleichs-Raji-T8&spplus;- und -HeLa-T8&spplus;-Transformanten deutlich negativ (Tabellen I, II und III).
Folglich reicht die Einführung eines funktionellen T4-Gens entweder in Human-T-Lymphozyten, B-Lymphozyten oder Epithelzellen aus, um derartige Zellen für eine AIDS-Virusinfektion empfänglich zu machen. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, daß der in vivo beobachtete T4&spplus;-T-Zelltropismus eine Folge der eingeschränkten Expression des T4-Moleküls und nicht der Natur des Zelltyps, worin es exprimiert wird, ist.

Das AIDS-Virus bindet an Oberflächen-T4-Proteine

Die obigen Experimente liefern einen genetischen Beweis, daß für eine AIDS-Virusinfektion eine T4-Expression erforderlich ist, sie liefern jedoch keine Informationen bezüglich der Rolle dieses Moleküls im Viruslebenszyklus. Die Beobachtung, daß eine Oberflächenexpression von T4 für eine AIDS- Virusinfektion notwendig ist, legt die Vermutung nahe, daß T4 der AIDS-Virusrezeptor ist. Folglich wurde eine Cytofluorometrie durchgeführt, um das Binden des AIDS-Virus an die Oberflächen von transformierten T4&spplus;- und T8&spplus;-Humanzellen zu untersuchen (Tabelle I; Fig. 14). HSB2-Zellen, Raji-Zellen und HeLa-Zellen sowie die T4&spplus;- oder T8&spplus;-Transformanten wurden mit dem AIDS-Virus inkubiert. Nach einer Virusabsorption wurden die Zellen gewaschen, Fluorescein-konjugierten Anti-AIDS-Virus-Antikörpern ausgesetzt und durch Flußcytometrie analysiert. Dieser Test zeigte, daß das AIDS-Virus wirksam und spezifisch an die Oberflächen-T4 exprimierenden Humantransformanten, jedoch nicht an die T4&supmin;-Elternzellen oder die T8&spplus;-Transformanten bindet (Fig. 14, Spalte B; Tabelle I). Das Binden des AIDS-Virus an die T4&spplus;-Zellen wird durch Vorinkubieren mit monoklonalen Anti-T4A-Antikörpern, jedoch nicht durch Vorinkubieren mit monoklonalen Anti-T8- Antikörpern unterbunden (Fig. 14, Spalte C). Wenn transformierte T4&spplus;-Zellen AIDS-Viren ausgesetzt werden, fällt darüber hinaus das T4-Glycoprotein zusammen mit dem Virushüllglycoprotein aus. Dies legt die Vermutung nahe, daß eine direkte physikalische Assoziation bzw. Bindung zwischen diesen Molekülen erfolgt (Daten nicht dargestellt). Diese Ergebnisse zeigen, daß das AIDS-Virus an das T4-Molekül auf der Zelloberfläche bindet und daß diese Bindung von anderen T- Zell-spezifischen Proteinen unabhängig ist, da ein Binden an alle untersuchten T4&spplus;-Zelltypen stattfindet.

T4-mRNA wird im Gehirn exprimiert

Neben dem Zerbrechen des zellulären Immunsystems wird AIDS häufig von Störungen des zentralen Nervensystems (ZNS) begleitet, von denen man annimmt, daß sie die Folge der direkten Infektion der Gehirnzellen durch das AIDS-Virus sind (81). Es war folglich von Interesse zu bestimmen, ob T4 in Zellen im ZNS exprimiert wird. Dadurch ergäbe sich eine Erklärung für die neurotropen Eigenschaften des Virus. Es erfolgten Northemblot-Analysen von sowohl aus menschlichen Gehirnen als auch aus Mäusegehirnen hergestellter RNA, um zu bestimmen, ob T4-mRNA-Seguenzen im ZNS exprimiert werden (Fig. 15). Poly(A)&spplus;-RNA aus menschlicher Großhirnrinde enthält zwei unterschiedliche T4-mRNAs mit Molekulargewichten von etwa 3 bzw. 1,8 kb (Fig. 15A). Die in geringerer Menge vorhandene 3-kb-RNA ist von der Größe her mit der durch zwei leukämische T4&spplus;-Zellinien, U937-Zellen (monocytische Zelllinie) und Jurkat-Zellen (T-Zellinie), sowie durch periphere T-Lymphozyten exprimierten mRNA identisch. Die kleinere, in größerer Menge vorhandene 1,8-kb-mRNA, die in T-Lymphozyten fehlt, könnte von einem alternativen Spleißen oder alternativen 5' oder 3'Termini herrühren.
Eine sorgfältigere Analyse der Lokalisation der T4-mRNA er folgte durch Isolieren von Poly(A)&spplus;-RNA aus spezifischen Regionen des Mäusegehirns (Fig. 15B). Eine Hybridisierung mit radioaktiv markierter cDNA mit Kodierung für das Mäusehomologe von T4 (L3T4) liefert eine intensive 2,2-kb-mRNA im Mäusevordergehirn, die bei Rautengehirnproben fehlt. Die 2,2-kb-L3T4-mRNA ist in der Hirnrinde, dem Hypothalamus und am stärksten im Striatum nachweisbar, sie fehlt jedoch im Kleinhirn, Hirnstamm oder im Rückenmark (Daten nicht dargestellt). Diese im ZNS nachgewiesene 2,2-kb-mRNA ist etwa 1 kb kleiner als die 3,2-kb-mRNA mit Kodierung für L3T4 in Thymozyten (Fig. 15B). Diese Ergebnisse zeigen, daß der vom AIDS-Virus gezeigte Neurotropismus wahrscheinlich das Ergebnis einer Oberflächenexpression des T4-Moleküls auf Gehirnzellen ist. Die Menge der im Vorderhirn nachgewiesenen mRNA beträgt etwa 1/30 der Menge in den Thymozyten. Dies kann auf eine in geringer Menge erfolgende Expression durch eine große Zahl von Zellen oder eine in größerer Menge erfolgende Expression durch eine kleine Subpopulation von Zellen hindeuten. Es ist gegenwärtig nicht bekannt, ob T4 durch Neuronen oder Stützzellen exprimiert wird. Die Anwesenheit einer Transkriptvariante im ZNS macht es jedoch unwahrscheinlich, daß die T4-mRNA im Gehirn durch die selten eindringenden T-Lymphozyten exprimiert wird.

Diskussion

Die Auftrennung von T4 und T8 mit funktionell unterschiedlichen Untergruppen von T-Zellen legt die Vermutung nahe, daß diese Moleküle bei der Wechselwirkung von T-Lymphozyten mit geeigneten Targetzellen wichtig sein können. Als erste Stufe für ein Verstehen der speziellen Rolle dieser Proteine wur den von sowohl T4- als auch T8-Molekülen cDNA-Klone hergestellt und deren Nucleotidsequenzen bestimmt (20, 70). Ein Vergleich der abgeleiteten Proteinsequenzen von T4 und T8 legt die Vermutung nahe, daß diese Moleküle eine merkliche Sequenz- und Strukturhomologie mit den variablen (V)-Domänen von Immunoglobulin teilen und sich wie Mitglieder der Immunoglobulinsupergenfamilie verhalten. Die N-terminalen V-artigen Domänen von T4 und T8 sind jedoch ziemlich unterschiedlich: sie teilen lediglich eine 28%ige Homologie und sind somit untereinander weniger homolog als jedes von ihnen gegenüber den leichten Ketten von Immunoglobulin (Fig. 9A). Darüber hinaus sind die Regionen der maximalen Konservierung zwischen T4 und T8 auch die Regionen der stärksten Homologie zu Immunoglobulin und den T-Zellrezeptor-V-Regionen. Somit zeigen die Immunoglobulin-artigen Domänen dieser beiden Moleküle, auch wenn sie strukturell ähnlich sind, eine deutliche Sequenzdivergenz, die mit der Hypothese im Einklang steht, daß sie unterschiedliche Moleküle auf unterschiedlichen Untergruppen von Targetzellen erkennen.
Die von den N-terminalen Domänen von T4 und T8 gezeigte Strukturhomologie des V-artigen Bereichs kann bezüglich der Funktionen dieser Proteine von besonderer Bedeutung sein. Praktisch alle Mitglieder der Immunoglobulinsupergenfamilie nehmen beim Immunansprechen teil (62). Darüber hinaus zeigen einzelne Mitglieder dieser Familie eine starke Neigung, miteinander unter Bildung von Dimeren eine Bindung einzugehen. Diese Bindung bzw. Assoziation zeigt sich in der Wechselwirkung der schweren und leichten Ketten von Immunoglobul in, der α- und ß-Ketten des T-Zellantigenrezeptors, ß&sub2;-Mikroglobulin und Klasse-I-MHC-Proteinen und der α- und ß-Ketten von Klasse-II-MHC-Molekülen. Das T8-Glycoprotein bildet mit T6, einem vermutlichen MHC-artigen Molekül, auf der Oberfläche von Thymozyten (82) eine Disulfidbindung und existiert als Multimere der 32-kd-Untereinheit auf peripheren T-Lymphozyten (83). Die Anwesenheit von vier V-artigen Domänen in T4 legt die Vermutung nahe, daß diese Regionen miteinander sowie mit speziellen Liganden auf der Oberfläche anderer Zellen oder Viren eine Bindung eingehen bzw. assozueren. Diese speziellen Affinitäten der Immunoglobulin-artigen Moleküle können für die Erkennungsfunktionen von T4 und T8 wichtig sein.

Evolution von T4

In den Immunoglobulin- und T-Zellenantigenrezeptorgenen sind die V- und J-Exons weit voneinander getrennt, wobei sie lediglich nach dem Vorgang einer somatischen Rekombination nebeneinander zu liegen kommen (62, 63). Die T4-mRNA kodiert für vier benachbarte V- und J-artige Elemente ohne das Erfordernis eines DNA-Rekombinationsvorgangs. Es ist folglich möglich, daß T4 ein primitiveres Gen darstellt, das sich vor dem Auftreten von Umlagerungsmechanismen entwickelte. Weitere Unterstützung erhält diese These durch die jüngsten Beobachtungen, daß der erste V-artige Bereich von T4 (V1) durch ein in den V-Genen mit Kodierung entweder für die Immunoglobuline oder die T-Zellenantigenrezeptoren nicht vorhandenes Intron gespalten ist. Die sich anhäufenden Hinweise lassen die Vermutung zu, daß es viel wahrscheinlicher ist, daß Introns während der Evolution präzise entfernt werden, als daß Introns in eine vorher Intron-freie Umgebung insertiert werden. Somit dürfte T4 ein Urimmunoglobulingen darstellen, das Duplikationen, Divergenz und Umlagerungen erfahren hat, wobei die gegenwärtige Immunoglobulingenfamilie erzeugt wurde. Obwohl T4 in weit komplexeren Immunsystemen gegenwärtig Funktionen verrichtet, dürfte es einen bei primitiveren Zellimmunantworten wirksamen Rezeptor darstellen. Primitive Immunantworten, wie die von wirbellosen Tieren, scheinen kein mannigfaltiges System von Rezeptormolekülen zu umfassen, sie sind vielmehr in den einfachsten Fällen auf eine Unterscheidung zwischen selbst und nicht selbst (85, 86) beschränkt und sind wahrscheinlich in einem "statischen" Satz von Genen untergebracht, die keine Umlagerungen durchlaufen.
Ungeachtet des Zeitrangs des Auftretens von T4 im Evolutionsablauf, stellt die Organisation dieser Gene ein interessantes Beispiel einer Exonverschiebung dar. T4 besteht aus vier V-J-artigen Domänen, einer J-artigen Region und einem Transmembransegment, wobei jeder dieser Bestandteile mit unterschiedlichen Bestandteilen der Immunoglobulinsupergenfamilie eine Homologie teilt. Die V- und J-artigen Domänen sind mit den äquivalenten Regionen sowohl der Immunoglobuline als auch der T-Zellantigenrezeptorketten homolog. Die Transmembrandomäne zeigt eine merkliche Homologie mit diesem Bereich in den ß-Ketten von Klasse-II-MHC-Molekülen (Fig. 9C). T4 besteht folglich aus einer Sammlung von in verschiedenen Mitgliedern der Immunoglobulinsupergenfamilie konservierten Exons, die auf unterschiedliche Weise unter Erzeugung einer großen Zahl von unterschiedlichen Molekülen, die an der Immunantwort teilnehmen, verschoben sind.

T4 ist der AIDS-Virusrezeptor

Die hier gelieferten Daten lassen einen Mechanismus einer AIDS-Virusinfektion vermuten, der ein anfängliches spezifisches Binden des AIDS-Virus an T4-Moleküle auf der Zelloberfläche umfaßt. Dieses Binden bzw. Assozueren kann bei T- Lymphozyten, B-Lymphozyten und Epithelzellen gezeigt werden und erfordert somit nicht die Teilnahme weiterer T-Zell-spezifischer Proteine. Darüber hinaus zeigen die hier angegebenen Daten, daß der T4-AIDS-Virus-Komplex durch rezeptorvermittelte Endozytose eingeschleust wird und die Virushülle anschließend mit der Grenzmembran des Endosoms unter Freisetzung des Nucleocapsids in das Cytoplasma eine Fusion eingeht. Die Virusreplikation und Transkription kann anschließend sowohl in lymphoiden als auch nichtlymphoiden Zellinien erfolgen. Darüber hinaus wird das T4-Gen im Gehirn sowie in den Lymphozyten exprimiert. Dies liefert eine Erklärung für den neurotropen und lymphotropen Doppeicharakter des AIDS- Virus. Auf diese Weise wurde ein für die Vermittlung von Effektorzellen-Targetzellen-Wechselwirkungen wichtiges T- Lymphozytenoberflächenprotein durch ein Humanretrovirus ausgenutzt, um das AIDS-Virus speziell auf Populationen von T4&spplus;-Zellen zielen zu lassen.
Für eine Reihe von eine Hülle aufweisenden Viren wurden die Zelloberflächenrezeptoren identifiziert, wobei das Expressionsmuster dieser Rezeptoren häufig für den Wirtbereich und die tropischen Eigenschaften spezieller Viren verantwortlich ist (74, 76). Einige Viren infizieren lediglich einen engen Bereich von Zelltypen. Dies deutet auf die Expression des Virusrezeptors auf speziellen Populationen von Targetzellen hin. Das Rabiesvirus bzw. Tollwutvirus beispielsweise geht eine Wechselwirkung mit dem Nikotinacetylcholinrezeptor ein (87) und infiziert im großen Maße Skelettmuskeln und Neuronen, während das Epstein-Barr-Virus eine Wechselwirkung mit dem C3d-Komplementrezeptor Typ 2 eingeht (88) und B-Lymphozyten infiziert. Weitere Viren, wie die Myxoviren, gehen mit ubiquitär verteilten Sialinsäureresten auf der Zelloberfläche eine Wechselwirkung ein und infizieren einen viel breiteren Bereich von Zelltypen.
Die eingeschränkte Expression der Zelloberflächenrezeptoren bietet lediglich eine Erklärung für den Virustropismus. Einige Viren replizieren sich lediglich in einem eingeschränkten Satz von differenzierten Zelltypen, während andere lediglich in speziellen Zelltypen wirksam transkribiert werden. So induziert das Moloney-Mäuse-Leukämievirus (Mo- MuLV) T-Zelllymphome bei neugeborenen Mäusen, das engverwandte Friend-Helfermäuseleukämievirus (Fr-MuLV) induziert jedoch hauptsächlich Erythroleukämien (89, 90, 91). Es wird vermutet, daß dieser Tropismus das Ergebnis von Unterschieden in den LTRs ist, die die wirksame Transkription des Mo- MuLV-Genoms in T-Lymphozyten und des Fr-MuLV-Genoms in roten Vorläufern ermöglichen (92, 93, 94).
Wie hier gezeigt wurde, ist die primäre tropische Determinante des AIDS-Virus die Expression des T4-Proteins auf der Oberfläche der Targetzelle. Eine in-vivo-Infektion ist auf lymphoide Zellen und Myeloidzellen sowie Gehirnzellen (drei Populationen, die T4 exprimieren) beschränkt. In-vitro- Experimente zeigen, daß die Einführung von T4 in T4&supmin;-Human- B-Lymphozyten und Epithelzellen (Zellen, die keine natürlichen Targets bzw. Ziele für das AIDS-Virus sind) diese Zellen für eine produktive Infektion durch AIDS-Viren empfänglich machen.

Beispiel 1: Lösliche T4-Fragmente

Unter Verwendung einer eingeschränkten Proteaseverdauung von Zellpräparationen werden lösliche T4-Glycoproteinfragmente hergestellt. Andererseits können DNA-Expressionsvektoren mit Kodierung für T4-Fragmente, denen die Transmembrandomäne (ein neutrale und hydrophobe Reste enthaltender Bereich) fehlt, zur Produktion derartiger T4-Fragmente konstruiert und verwendet werden. Diese Fragmente sind in wäßrigen Lösungen löslich und enthalten Leader (Signal)-Sequenzen. Bei Expression in Säugetierzellen werden diese Fragmente zum rauhen endoplasmatischen Reticulum/Golgi-Apparat transportiert und schließlich aus den Zellen sezerniert.

Beispiel 2: Behandlung von AIDS-Patienten

Die in Beispiel 1 beschriebenen löslichen T4-Glycoproteinfragmente werden typischerweise in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger an mit Humanimmunodefizienzvirus infizierte Patienten verabreicht, um an im Blut des Patienten und in anderen Körperflüssigkeiten vorhandenes Virus zu binden und eine Infektion von T4&spplus;-Zellen in vivo zu blockieren. Andererseits oder darüber hinaus wird Patientenblut cyclisch durch eine entweder immobilisierte T4-Glycoproteine oder lösliche T4-Fragmente enthaltende Säule derart geleitet, daß das Virus aus dem Blut abgetrennt werden kann. Derartige Maßnahmen erlauben, daß das Immunsystem ein wirksameres immunologisches Ansprechen auf das Virus aufbaut, d.h. derartige Maßnahmen gewährleisten, daß sich nichtinfizierte T4&spplus;- T-Zellen vermehren.
Lösliche T4-Fragmente werden als Therapeutikum, d.h. als Hemmer einer extrazellulären und Zell-Zell-Verbreitung der HIV-Infektion verwendet. Die Anmelder haben gezeigt, daß lösliche T4-Fragmente eine in-vitro-HIV-Bindung an und eine Infektion von T4&spplus;-Targetzellen hemmen (vgl. Beispiel 4). Eine Verabreichung von löslichen T4-Fragmenten an mit HIV infizierte Personen hemmt eine extrazelluläre Verbreitung der Virusinfektion. Darüber hinaus werden Fusionen von HIV infizierten T4&spplus;-Zellen und nichtinfizierten T4&spplus;-Zellen (hierbei handelt es sich auch um einen Weg, auf dem sich das Virus verbreitet) durch Verabreichung löslicher T4-Fragmente gehemmt.
Folglich verlangsamt die Verabreichung von löslichen T4- Fragmenten den Verlauf der Erkrankung, lindert mehrere mit AIDS in Verbindung stehende Symptome und verhindert ein Auftreten von neuen pathologischen Veränderungen.
Lösliche T4-Fragmente, biochemisch reine, wäßrige lösliche Reagenzien, werden in Kombination mit anderen Reagenzien zum Testen auf Wettbewerber bzw. Konkurrenten der T4-HIV-Wechselwirkung verwendet. Somit werden lösliche T4-Fragmente in Kombination mit HIV-Hüllproteinen oder HIV-Hüllproteine enthaltenden biochemischen Gemischen verwendet, um bezüglich Inhibitoren einer Virusbindung zu sichten.

Beispiel 3: Herstellung löslicher T4-Fragmente

Ein cDNA mit Kodierung für das membrangebundene T4-Protein enthaltendes Plasmid (pT4B) wurde isoliert, charakterisiert und in den verschiedensten Säugetierzelltypen exprimiert (70). Lösliche T4-Fragmente werden in Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugetiersystemen hergestellt. Da sich das native T4-Protein wahrscheinlich in komplexer Weise faltet und glycosyliert wird, wird eine Expression in Säugetiersystemen bevorzugt. Lösliche T4-Fragmente werden durch Stumpfendigmachen von pT4B nach der V&sub4;J&sub4;-Domäne hergestellt. Derartige DNA-Fragmente enden vor dem Transmembransegment, das etwa bei der Nucleotidposition 1264 beginnt (Fig. 6).
Eine Reinigung und Charakterisierung der löslichen T4-Fragmente wird durch Konstruieren einer Zellinie, die das sezernierte Proteinfragment übermäßig exprimiert, deutlich verbessert. Strategien, die die übermäßige Expression von Proteinen gewährleisten, wurden in Bakterien-, Hefe-, Insektenund Säugetiersystemen verwendet. Ferner wurden induzierbare Expressionssysteme in Bakterien und Hefen zur übermäßigen Produktion von Proteinen, die bei konstitutiver Expression toxisch sein können, verwendet. Eine übermäßige Expression von löslichen T4-Fragmenten wird durch Amplifizieren eines für die Expression von löslichem T4 sorgenden Vektors (Expressionsvektors für lösliches T4), was zu einer konstitutiven übermäßigen Expression führt, erreicht. Die Amplifikation von Dihydrofolatreduktase (dhfr)-Genen durch Züchten in fortschreitend ansteigenden Konzentrationen des Arzneimittels Methotrexat (eines dhfr-Antagonisten) wurde in breitem Rahmen durchgeführt. Da die amplifizierte Einheit nicht auf dhfr-Kodiersequenzen beschränkt ist, führt dieser Ansatz zu einer Coamplifikation von hierzu benachbarten Sequenzen. Folglich wird dhfr als selektierbarer Marker und als Maßnahme zum Coamplifizieren von neu eingeführten Sequenzen verwendet. Diese Strategie wurde erfolgreich zur Erhöhung der Expression von mehreren unterschiedlichen, mit dhfr-Plasmiden cotransformierten Genen verwendet. Ein alternatives Amplifikationsschema umfaßt eine Cotransfektion des lösliches T4-exprimierenden cDNA-Expressionsvektors mit dem Plasmid pdLAT-3 und ein anschließendes Selektionsschema gemäß einer früheren Beschreibung (102).
Unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologien wird ein ein sezerniertes, lösliches, extrazelluläres Fragment von durch den menschlichen cDNA-Klon pT4B (70) kodiertem T4 exprimierender Vektor geschaffen. Die Basenpaare 1-1252 von pT4B (vgl. Fig. 6) kodieren für das für die Synthese eines sezernierten Proteins erforderliche Leaderpeptid von T4 sowie den extrazellulären Teil von T4, der die vier VJ- artigen Domänen (V1J1-V4J4) umfaßt, jedoch nicht für die Transmembranregion und die Cytoplasmaregion, die das Protein in der Membran verankern. Dieser Vektor enthält Sequenzen mit Kodierung für den extrazellulären Teil des T4-Proteins, der die HIV-Bindungsdomäne enthält. Diese Sequenzen befinden sich stromab des SV40-Early-Region-Promotors. Darüber hinaus befindet sich stromab von der stumpfendig gemachten T4-cDNA ein TAA-Terminationskodon, gefolgt von dem Polyadenylierungsbereich des Rinderwachstumshormongens, wodurch die für die Termination einer Proteinsynthese, die Transkriptionstermination und die Polyadenylierung des RNA-Transkripts erforderlichen Signale bereitgestellt werden. Das erhaltene lösliche T4-Minigen wird anschließend an das Mäusedihydrofolatreduktase (dhfr)-Gen ligiert, wobei ein Plasmid mit der Fähigkeit, nach Einbau in dhfr-Defekt (dhfr-)-Chinahamstereierstock (CHO)-Zellen amplifiziert zu werden, geschaffen wird.
Beispielsweise wird das 1, 8-kb-EcoRI-BamHI-Fragment von pT4B, das die gesamte T4-Kodiersequenz enthält, zwischen die Stul- und Bc1I-Stelle des Säugetierexpressionsvektors DSP (103), der so modifiziert ist, daß er den SV40-Early-Promotor und die Rinderwachstumshormonadenylierungssequenz enthält, insertiert. Durch die Verwendung synthetischer Linker wird das HaeII (bp 124) - HpaII (bp 1252)-Fragment von pT4B zwischen die KpnI- und XbaI-Stelle des Plasmids pUC18 insertiert. Ein löslicher T4-Expressionsvektor wird durch Ligieren der folgenden Fragmente geschaffen:
1. Ein 0,95-kb-BglII-SacI-Fragment des modifizierten DSP- Vektors, das das 1,8-kb-EcoRI-BamHI-Fragment von pT4B enthält (dieses Segment enthält den SV40-Early-Promotor, die T4-Leadersequenz und den aminoterminalen Teil der extrazellulären T4-Sequenz);
2. das 0,66-kb-SacI-XbaI-Fragment des Plasmids pUC18, das das HaeII-HpaII-Fragment von pT4B enthält (dieses Segment enthält den carboxyterminalen Teil der extrazellulären T4-Sequenz, gefolgt von einem TAA-Terminationskodon, das nach dem Valin 371 insertiert ist (Fig. 6)); und
3. das 2,48-kb-BglII-XbaI-Fragment des modifizierten DSP- Vektors, das die Rinderwachstumshormonpolyadenylierungssequenz enthält.
Schließlich wird das 2,2-kb-BglII-BamHI-Fragment aus einem anderen modifizierten BSP-Vektor, das eine Mäuse-dhfr-Expressionskassette enthält (ß-Globinpromotor-Mäuse-dhfr-Kodierregion-SV40-Polyadenylierungsregion), flankiert von einer BglII- und BamHI-Stelle, in die BamHI-Stelle eines Plasmids unter Erzeugung eines lösliches T4 exprimierenden Expressionsplasmids insertiert.
DXB-11, ein Klon von Chinahamstereierstockzellen mit einer dhfr-Defizienz (104), wird mit dem lösliches T4 exprimierenden Expressionsplasmids transfiziert. Die DXB-11-Transformanten werden anschließend in einem F12-Medium ohne Hypoxanthin oder Thymidin, das 10% dialysiertes fötales Rinderserum enthält, gezüchtet. Die Klone werden selektiert und stufenweise zunehmenden Konzentrationen an Methotrexat (mtx), einem dhfr-Antagonisten, ausgesetzt, um bezüglich stabiler Transformanten zu selektieren, die das neu eingeführte dhfr- Gen und benachbarte lösliche T4-Sequenzen amplifiziert haben.
Kulturüberstände der in mtx gezüchteten selektierten Klone werden einer Radioimmunofällung unterzogen, um lösliche T4- Fragmente nachzuweisen. Konfluente Kulturen von selektierten Klonen werden mit ³&sup5;S-Methionin und Cystein 18 h radioaktiv markiert, worauf die Kulturüberstände mit für T4 spezifischen monoklonalen Antikörpern (OKT4, OKT4A) sowie mit Vergleichsantikörpern OKT8 und nichtspezifischem Mäuse-IgG immunogefällt werden. Die Immunofällungen werden einer SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen und auf einen Film belichtet. Ein Protein mit einem Mr-Wert von etwa 45 kd (der vorausgesagten Größe eines löslichen T4-Fragments) wird sowohl durch OKT4 als auch durch OKT4A aus Kulturüberständen spezifisch immunogefällt.
Konditioniertes Medium (CM) wird serumfrei aus Kulturen ausgewählter Klone gesammelt, durch bei niedriger Geschwindigkeit durchgeführte Zentrifugation geklärt und auf das 10- fache aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wird zur Verringerung der Salzkonzentration auf das 2fache verdünnt, auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und auf S-Sepharose (Pharmacia) appliziert. Lösliche T4-Fragmente werden bei diesem pH-Wert auf dem Harz zurückgehalten und mit einem Salzgradienten eluiert.
Ähnliche Ansätze können in Bakterien, Hefen und Insekten durchgeführt werden, um lösliche T4-Fragmente herzustellen. Darüber hinaus können Fragmente, die eine kleinere Größe aufweisen als die hier beschriebenen, beispielsweise Fragmente, die lediglich die V1J1-Domäne enthalten, hergestellt werden.

Beispiel 4: Bindungstests und Infektiositätstests unter Verwendung löslicher T4-Fragmente

Die Anmelder haben die Fähigkeit eines gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 hergestellten löslichen T4-Fragments, mit T4&spplus;-Zellen zu konkurrieren und eine HIV-Bindung an T4&spplus;-Zellen zu unterbinden, untersucht. Serielle Verdünnungen des HIV-Virus wurden mit seriellen Verdünnungen von 10fach auf konzentriertem konditioniertem Medium aus ausgewählten, lösliche T4-Fragmente produzierenden Zellen vor einer Addition an die T4&spplus;-T-Zellinie CEM vorinkubiert. Eine HIV-Bindung an CEM-Zellen wurde durch Inkubieren mit mit FITC konjugierten Anti-HIV-Antikörpern und anschließende cytofluorometrische Analyse quantifiziert. Das konditionierte Medium aus ausgewählten, lösliche T4-Fragmente produzierenden Zellinien unterband eine HIV-Bindung an die Oberfläche von CEM-Zellen in einer verdünnungsabhangigen Weise, während mit konditioniertem Medium von entsprechenden nicht produzierenden Zellen kein Ansprechen beobachtet wurde.
Die Anmelder untersuchten auch die Fähigkeit löslicher T4- Fragmente, eine HIV-Infektiosität von T4&spplus;-Zellen in vitro zu unterbinden. Konditioniertes Medium aus einer ausgewählten, lösliches T4-Fragment produzierenden Zellinie wurde zu Kulturen von mit PHA stimulierten T4&spplus;-T-Zellen, die mit seriellen Verdünnungen von HIV angeimpft worden waren, zugegeben. Die HIV-Replikation wurde in den Kulturen an den Tagen 4, 8 und 12 mit Hilfe des oben beschriebenen Antigeneinfangtests überwacht. Lösliche T4-Fragmente unterbanden eine HIV-Infektiosität zu jedem Zeitpunkt um einen Faktor von etwa 1 log.

Beispiel 5: Herstellung von Anti-lösliches-T4-Fragment-Antikörpern

Acht Wochen alten Balb/c-Mäusen wurden intraperitoneal 50 µg eines gereinigten löslichen T4-Fragments gemäß der vorliegenden Erfindung (wie oben beschrieben hergestellt) in vollständigem Freundschem Adjuvans (1:1, v/v) injiziert. Die Mäuse erhielten anschließend in monatlichen Intervallen als Verstärkung(simpfung) eine Mischung aus dem löslichen T4- Fragment mit unvollständigem Freundschem Adjuvans. Anschließend wurden sie durch die Schwanzvene ausblutengelassen. Immunoglobulinfraktionen der Seren wurden durch Ammoniumsulfatfällung hergestellt. Spezielle Anti-lösliches-T4-Fragment-Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines immobilisierten T4-Fragments gereinigt.

Beispiel 6: Herstellung löslicher T4-Fragment-anti-Idiotyp- Antikörper

Syngenen und kongenen Mäusen wurden intraperitoneal 50 µg eines gereinigten Anti-lösliches-T4-Fragment-Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung (wie oben hergestellt) in vollständigem Freundschem Adjuvans injiziert. Anschließend erhielten die Mäuse in monatlichem Abstand eine Verstärkung mit dem Anti-lösliches-T4-Fragment-Antikörper in unvollständigem Freundschem Adjuvans. Am 4., 3. und 2. Tag vor der Fusion erhielten die Mäuse intravenös als Verstärkung 50 µg Immunoglobulin in Kochsalzlösung Spienozyten wurden anschließend mit nicht sezernierenden P3X63-AG8.653-Myelomzellen nach den hier beschriebenen und auf dem einschlägigen Fachgebiet, auf dem die vorliegende Erfindung liegt, bekannten Maßnahmen fusioniert. Zwei Wochen später wurden Hybridomüberstände bezüglich einer Bindungsaktivität gegenüber Anti-lösliches-T4-Fragment-Antikörpern im Rahmen eines Radioimmunoassays gesichtet. Positive Klone werden anschließend auf ihre Fähigkeit zur Bindung eines Humanimmunodefizienzvirus-Hüllglycoproteins und AIDS-Virus untersucht. Andererseits wurde im Rahmen eines einstufigen Vorgehens Mäusen intraperitoneal lösliches T4-Fragment in vollständigem Freundschem Adjuvans injiziert, worauf die Mäuse intravenös das lösliche T4-Fragment in Kochsalzlösung als Verstärkung erhielten. Anschließend wurden Mäusemilzzellen mit Myelomen wie oben fusioniert. Die Hybridomüberstände wurden anschließend direkt auf lösliche T4-Fragment-anti-Idiotyp- Antikörper untersucht.

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Claims

1. Isoliertes, einsträngiges Nucleinsäuremolekül mit Codierung für ein wasserlösliches Polypeptid mit einem Teil eines T4-Glycoproteins, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polypeptid zur spezifischen Bildung eines Komplexes mit einem Human-Immunschwächevirus-Hülleglykoprotein fähig ist.

2. Isoliertes einstrangiges Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das T4-Glycoprotein ein Human-T4-Glycoprotein ist.

3. Isoliertes einsträngiges Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül ist.

4. DNA-Molekül nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül ein cDNA-Molekül ist.

5. cDNA-Molekül nach Anspruch 4, wobei das cDNA-Molekül einen Teil der in Fig. 6 dargestellten Nucleotidsequenz umfaßt.

6. Isoliertes einsträngiges Nudeinsäuremolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nucleinsäure molekül ein RNA-Molekül ist.

7. Nucleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es zu mindestens 90% zu dem isolierten einsträngigen Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 homolog ist.

8. Isoliertes einstrangiges Nucleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es zu dem isolierten einsträngigen Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 komplementär ist.

9. Isoliertes einstrangiges Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem nachweisbaren Marker markiert ist.

10. Verfahren zum Nachweis eines einsträngigen Nucleinsäuremoleküls mit Codierung für ein wasserlösliches Polypeptid, welches einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt und zur spezifischen Bildung eines Komplexes mit einem Human-Immmunschwächevirus-Hülleglycoprotein fähig ist, dadurch gekennzeichnet, daß man einsträngige Nucleinsäuremoleküle unter Bedingungen, die eine Hybridisierung komplementärer, einsträngiger Nucleinsäuremoleküle gestatten, mit dem isolierten einsträngigen Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9 kontaktiert und die dabei gebildeten hybridisierten Nucleinsäuremoleküle von den einsträngigen Nucleinsäuremolekülen abtrennt, um auf diese Weise ein einsträngiges Nucleinsäuremolekül mit Codierung für ein einen Teil eines T4-Glycoproteins umfassendes wasserlösliches Polypeptid aufzufinden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das einsträngige Nucleinsäuremolekül mit Codierung für das einen Teil eines T4-Glycoproteins umfassende wasserlösliche Polypeptid aus einem von Chromosomen-DNA herrührenden einsträngigen DNA-Molekül besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromosomen-DNA aus einer Zelle aus der Gruppe Lymphzellen, Rückenmarkzellen und Gehirnzellen herrührt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphzelle aus einer T-Zelle besteht.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphzelle aus einer B-Zelle besteht.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückenmarkzelle aus einem Granulozyten besteht.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückenmarkzelle aus einem Makrophagen besteht.

17. Wasserlösliches Polypeptid mit der Fähigkeit zur spezifischen Bildung eines Komplexes mit einem Human-Immunschwächevirus-Hülleglycoprotein, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polypeptid einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt und durch das isolierte einsträngige Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 codiert ist.

18. Wasserlösliches Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest zu 90% zu dem wasserlöslichen Polypeptid nach Anspruch 17 homolog ist.

19. Wasserlösliches Polypeptid nach Anspruch 17 mit der Eignung als therapeutisches Mittel zur Behandlung des erworbenen Immunschwächesyndroms.

20. Wasserlösliches Polypeptid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 6 dargestellte Aminosäuresequenz zumindest von der Aminosäure -23 bis höchstens zur Aminosäure +374 umfaßt.

21. Wasserlösliches Polypeptid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 6 dargestellte Aminosäuresequenz von zumindest der Aminosäure +287 bis höchstens zur Aminosäure +374 umfaßt.

22. Wasserlösliches Polypeptid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 6 dargestellte Aminosäuresequenz von zumindest der Aminosäure +182 bis höchstens zur Aminosäure +286 umfaßt.

23. Wasserlösliches Polypeptid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 6 dargestellte Aminosäuresequenz von zumindest der Aminosäure +112 bis höchstens zur Aminosäure +181 umfaßt.

24. Wasserlösliches Polypeptid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 6 dargestellte Aminosäuresequenz von zumindest der Aminosäure +1 bis höchstens zur Aminosäure +111 umfaßt.

25. Verwendung des wasserlöslichen Polypeptids nach einem der Ansprüche 19 bis 24 zur Herstellung einer Arzneimittelzubereitung zur Behandlung einer Human-Immunschwächevirus-Infektion.

26. Arzneimittelzubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie das wasserlösliche Polypeptid nach einem der Ansprüche 19 bis 24 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

27. Durch das cDNA-Molekül nach Anspruch 4 codierte gereinigte Aminosäuresequenz.

28. Vektor, umfassend das cDNA-Molekül nach Anspruch 4.

29. Vektor nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um ein Plasmid handelt.

30. Vektor nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um ein Virus handelt.

31. Wirt-Vektor-System für die Herstellung eines einen Teil eines T4-Glycoproteins umfassenden wasserlöslichen Polypeptids, wobei das Systems das Plasmid nach Anspruch 29 in einem geeigneten Wirt enthält.

32. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der geeignete Wirt aus einer Bakterienzelle besteht.

33. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienzelle aus einer Escherichia coli-Zelle besteht.

34. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der geeignete Wirt aus einer eukaryontischen Zelle besteht.

35. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontische Zelle aus einer Säugetierzelle besteht.

36. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontische Zelle aus einer Hefezelle besteht.

37. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontische Zelle aus einer Insektenzelle besteht.

38. Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Polypeptids, welches einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt und zur spezifischen Komplexbildung mit einem Human-Immunschwächevirus-Hülleglycoprotein fähig ist, durch Wachsenlassen des Wirt-Vektor-Systems nach einem der Ansprüche 31 bis 37 unter Bedingungen, die die Produktion des wasserlöslichen Polypeptids gestatten, und Gewinnen des hierbei erhaltenen wasserlöslichen Polypeptids.

39. Wirt-Vektor-System zur Herstellung eines einen Teil eines T4-Glycoproteins umfassenden wasserlöslichen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß es das Virus nach Anspruch 30 in einem geeigneten Wirt umfaßt.

40. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die geeignete Zelle aus einer Bakterienzelle besteht.

41. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienzelle aus einer Escherichia coli-Zelle besteht.

42. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die geeignete Zelle aus einer eukaryontischen Zelle besteht.

43. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontische Zelle aus einer Säugetierzelle besteht.

44. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontische Zelle aus einer Hefezelle besteht.

45. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontische Zelle aus einer Insektenzelle besteht.

46. Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Polypeptids, welches einen Teil eines T4-Glycoproteins umfaßt und zur spezifischen Komplexbildung mit einem Human-Immunschwächevirus-Hülleglycoprotein fähig ist, durch Wachsenlassen des Wirt-Vektor-Systems nach Anspruch 39 unter Bedingungen, die die Produktion des wasserlöslichen Polypeptids gestatten, und Gewinnen des dabei erhaltenen wasserlöslichen Polypeptids.

47. Antikörper mit der Fähigkeit zur spezifischen Komplexbildung mit dem wasserlöslichen Polypeptid nach Anspruch 17.

48. Antikörper nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.

49. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem monoklonalen Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper handelt.

50. Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 48 oder 49 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Behandlung einer Human-Immunschwächevirus-Infektion.

51. Impfstoff zur Behandlung einer Human-Immunschwächevirus-Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß er den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 48 oder 49 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

52. Monoklonaler Antikörper mit der Fähigkeit zur spezifischen Komplexbildung mit dem monoklonalen Antikörper nach Anspruch 48 oder 49.

53. Monoklonaler Antik:rper nach Anspruch 52, welcher zusätzlich die Fähigkeit zur spezifischen Komplexbildung mit einem Human-Immunschwächevirus-Hülleglycoprotein besitzt.

54. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, daß er einen T4-glycoprotein-antiidiotypischen Antikörper umfaßt.

55. Verwendung des T4-glycoprotein-antiidiotypischen Antikörpers nach Anspruch 54 zur Herstellung einer Arzneimittelzubereitung zur Behandlung einer Human-Immunschwächevirus-Infektion.

56. Arzneimittelzubereitung, umfassend den T4-glycoproteinantiidiotypischen Antikörper nach Anspruch 54 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.