DE2711773A1 - Verfahren zur reinigung und isolierung von hepatitisvirus zur herstellung eines impfstoffes - Google Patents
Verfahren zur reinigung und isolierung von hepatitisvirus zur herstellung eines impfstoffesInfo
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Description
ι»?· -- ..'s 1Α-49 041
" 1
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Hepatitisvirus, der nachweisbar ist
als sein Oberflächenantigen, HB Ag, und vorzugsweise zur Herstellung von Impfstoffen angewandt wird.
Hepatitisvirus Typ B, der die sogenannte Serumhepatitis verursacht, verbreitet sich in biologischem
Material, wie Blut, Plasma, Serum, Urin und Stuhl. Hepatitis Typ B kann auch enthalten sein in Plasmafraktionen,
die für medizinische Behandlungen angewandt werden. Er kann sich in Abwässern bzw. Abfällen, die biologisches
Material enthalten, in Konzentrationen finden, die ausreichen, um die Infektion zu verbreiten.
Hepratitis-B-virus besteht aus einem inneren Kern, enthaltend Nukleinsäure und Protein, und einer äußeren
Proteinschicht. Es können sich auch lipide Substanzen finden, deren Verteilung jedoch noch nicht ganz aufgeklärt
ist. Bei Personen, die an akuter Hepatitis leiden, werden intakte Hepatitisviren gebildet, aber der Hauptanteil des
gebildeten Virusmaterials besteht aus Protein von dem äußeren Überzug. Eine zu starke Bildung dieses Überzugsproteins macht es möglich, mit Hepatitis-B-virus infiziertes
Material mit Hilfe verschiedener immunologischer Verfahren nachzuweisen. Das zuerst angewandte Verfahren war
eine radiale Immunodiffusion, ID (Berg et al., Vox. Sang. Band 22 (1972), S. 1), an das sich später wesentlich
empfindlichere radioimmunologische Verfahren anschlossen.
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Hepatitis-B ist eine ernste Erkrankung. Die Sterblichkeit
ist verhältnismäßig gering, aber die Zeit für die Rekonvaleszenz ist lang, und bleibende Leberschäden
sind nicht selten. Es existieren noch keine spezifischen Hepatitis-Arzneimittel, jedoch verschiedene Möglichkeiten
einer prophylaktischen Behandlung.
Aussichtsreiche Ergebnisse wurden erzielt durch die prophylaktische Anwendung von Immunoglobulin gegen Hepatitis-B.
Der Schutz hält jedoch nur kurze Zeit an. Außerdem kann dieses Behandlungsverfahren kaum zur Vermeidung von
Hepatitis-B bei größeren Berufs- oder Bevölkerungsgruppen angewandt werden. Eine Lösungsmöglichkeit für dieses
Problem könnte ein Impfstoff sein. Theoretisch kann ein Impfstoff gegen Hepatitis-B hergestellt werden, indem man
zunächst das Hepatitis-B-Virusmaterial isoliert und es dann auf geeignete Weise inaktiviert oder die intakten Viren von
überschüssigem Überzugsprotein befreit. Die Impfung mit einem derartigen Material kann zur Bildung von Antikörpern
gegen Hepatitis-B-virus führen und damit zu einem Schutz gegen eine Infektion mit Hepatitis-B. Ein Problem besteht
darin, das Virusmaterial in reinem Zustand zu isolieren, ohne die Struktur zu zerstören. Die bekannten Verfahren zur
Reinigung von Hepatitis-B-Virusmaterial sind alle verhältnismäßig kompliziert und schwierig im industriellen Maßstab
anzuwenden. Das weitest verbreitete Verfahren beruht auf der Trennung durch Ultrazentrifugation mit einem Dichtegradienten.
Hierzu ist jedoch eine aufwendige Apparatur erforderlich. Als Ausgangssubstanz wurde Blut von Personen angewandt mit
nachweisbarem Hepatitis-B-virus-Oberflächenantigen, HBsAg.
Es wurden bereits Verfahren entwickelt, um HB Agpositives
Material irreversibel an biologisches Material zu binden und davon zu entfernen. Der Zweck hierfür bestand
darin, den Hepatitisvirus an das zugesetzte Material zu binden, ohne eine Abspaltung (leakage) zu riskieren, um den
Virus ungefährlich zu machen durch Verbrennung oder chemische
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Inaktivierung. . if s
Im Zusammenhang mit Untersuchungen, bei denen Hepatitis-B- virus-Ma te rial an verschiedene AdsorbentLen gebunden
werden sollte, hat es sich gezeigt, daß Hepatitis-B-virusüberflächenantigen,HB
Ag,an Gele adsorbiert wurde, die sulfatisierte Kohlenhydrate enthielten. Das adsorbierte
Material konnte leicht von dem Gel eluiert werden durch Desorption mit einem Puffer, enthaltend Natriumchlorid. Es
wurde ein sehr reines Produkt erhalten mit einer Reinheit, die mindestens 30-mal größer war als die des Ausgangsmaterials.
Das ist von großer Wichtigkeit, da eine weitere Reinigung mit kleinen Volumina erreicht werden kann. Damit
ist das Verfahren gut geeignet zur Anwendung im größeren Maßstab. Eine weitere Reinigung nach üblichen Verfahren
führt zu einem praktisch reinen Produkt von Hepatitis-B-virus-Oberflächenantigen,
das zur Herstellung eines Impfstoffes geeignet ist. Das Verfahren besitzt gegenüber den
bisher angewandten Verfahren den Vorteil, daß es sowohl leicht im großen Maßstab durchzuführen als auch billig ist.
Es sind keine speziellen aufwendigen Vorrichtungen erforderlich.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 Adsorption von HB Ag aus Plasma mit vernetztem Agarose-Dextransuxfat-Konjugat in einer Säule
und anschließende direkte Desorption
Das Dextransulfatadsorbens wurde hergestellt, indem man
zunächst 2 g Dextransulfat in 150 ml 0,5m Natriumcarbonatlösung
mit 100 ml Sepharose 4B CL (Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala/Schweden), die mit 0,5m Natriumcarbonat äquilibriert war, vermischte. Dann wurden 5 g Cyanogenbromid in 50 ml
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destilliertem Wasser zugegeben. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit 5m Natriumhydroxydlösung auf 11 eingestellt und
15 Minuten auf diesem Wert gehalten. Anschließend konnte er fallen. Die Gelsuspension wurde dann 17 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt und anschließend gründlich gewaschen.
Reinigung und Isolierung von HB Ag
Ein HB Ag-positives Plasma von einem chronischen Hepatitisvirusträger wurde als Ausgangsmaterial angewandt.
Der Titer war, verglichen mit einem Standardantigen, 1:i6, bestimmt durch ein Doppel-Immunodiffusionsverfahren (ID).
Eine chromatographische Säule (Durchmesser 26 mm) wurde mit 100 ml Adsorbens gefüllt, das mit einem Puffer,
bestehend aus einer wäßrigen Lösung von 0,05m Tris, 0,02m Natriumeitrat und 0,10m Natriumchlorid, pH 7,5, äquilibriert
war. Dieser Trispuffer wird im folgenden als Puffer bezeichnet. Unter Anwendung einer Durchflußgeschwindigkeit von 50 ml/h
wurden 200 ml Plasma aufgebracht. Dann wurden 500 ml Puffer mit einer verminderten Durchflußgeschwindigkeit hindurchgeleitet
bevor das adsorbierte Material mit einem Puffer, enthaltend insgesamt 0,5m Natriumchlorid, eluiert wurde. Die
HB Ag-positiven Fraktionen in dem Eluat wurden zusammengegeben und mit Ammoniumsulfat (22 g/100 ml) ausgefällt. Nach
Zentrifugieren wurde der Niederschlag zusammengegeben und in Puffer gelöst. Die Lösung wurde einer Gelfiltration über eine
Säule (Durchmesser 50 mm), die bis zu einer Höhe von 850 mm mit Sepharose 6B CL gefüllt und mit Puffer äquilibriert war,
unterworfen.
Die erhaltenen HB Ag-positiven Fraktionen wurden elektronenmikroskopisch
untersucht, und es zeigte sich, daß sie ein nahezu reines Hepatitisvirusmaterial enthielten, das zur Herstellung
eines Impfstoffes geeignet war.
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Beispiel 2 Ansatzweise Adsorption von HB Ag aus Plasma
mit vernetztem Agarose-Dextransulfat-Konjugat
und anschließende direkte Eluierung
Das Agarose-Dextransulfat-Adsorbens wurde entsprechend Beispiel 1 hergestellt.
Reinigung und Isolierung von HB Ag
Zu 200 ml HB Ag-positivem Plasma mit einem Titer von 1:16, bestimmt durch ID, wurden 100 ml des mit Puffer äquilibrierten
Adsorbens entsprechend Beispiel 1 zugegeben. Nach 30 Minuten langem Rühren wurde das Gel auf einen Glasfilter
gegeben und mit 5 x 200 ml Puffer gewaschen. Anschließend wurde mit Hilfe von 2 χ 100 ml Puffer, enthaltend insgesamt
1m Natriumchlorid, desorbiert. Zu dem Eluat wurden 42 g
Ammoniumsulfat zugegeben. Der Niederschlag wurde gesammelt und entsprechend Beispiel 1 der Gelfiltration unterworfen.
Die entstehenden HB Ag-positiven Fraktionen wurden elektronenmikroskopisch untersucht, und es zeigte sich, daß
sie nahezu reines Hepatitisvirusmaterial enthielten, das zur Herstellung eines Impfstoffes geeignet war.
Beispiel 3 Adsorption von HB -Antigen aus Plasma mit
Agarose-Heparin-Konjugat in einer Säule und folgende Eluierung mit einem Salzgradienten
Das Agarose-Heparin-Adsorbens wurde hergestellt durch Vermischen von 100 ml einer Lösung von Heparin in Wasser
(5000 Einheiten/ml) mit 100 ml Sepharose 4B und 4 g Cyanogenbromid. Der pH-Wert wurde auf 11 eingestellt und 10 Minuten
konstant gehalten und konnte dann absinken. Die Gelsuspension wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann
gründlich gewaschen.
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Reinigiing und Isolierung von HB Ag
Ein HBgAg-positives Plasma mit einem Titer von 1:128,
bestimmt durch ID, wurde als Ausgangssubstanz angewandt.
Eine chromatographische Säule (Durchmesser 26 mm) wurde mit 100 ml Adsorbens gefüllt, das entsprechend Beispiel 1
mit Puffer äquilibriert war. Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 50 ml/h wurden 20 ml Plasma aufgebracht. Anschließend
wurden 200 ml Puffer durch die Säule geleitet bevor das adsorbierte Material mit einem linearen Gradienten eines
Puffers, enthaltend eine Endkonzentration von 2m Natriumchlorid, eluiert wurde. Die HB Ag-positiven Fraktionen wurden
elektronenmikroskopisch untersucht, und es zeigte sich,daß das zuletzt eluierte HBAg-positive Material aus nahezu reinem
Hepatitisvirusmaterial bestand, das zur Herstellung eines Impfstoffes geeignet war.
Beispiel 4 Adsorption von HB Ag aus Plasma mit Agarose-Chondriotinsulfat-Konjugat
in einer Säule und anschließende direkte Desorption
Das Agarose-Chondriotinsulfat-Adsorbens wurde hergestellt, indem man zunächst 0,8 g Chondriotinsulfat in 15 ml
0,5m Natriumcarbonatlösung mit 30 ml Sepharose 4 B CL, die mit
0,5m Natriumcarbonatlösung äquilibriert war, vermischte. Anschließend wurden 1,6 g Cyanogenbromid in 15 ml destilliertem
Wasser zugegeben. Der pH-Wert der Gelsuspension wurde mit 2,5m Natriumhydroxidlösung auf 11 gebracht und 10 Minuten auf diesem
Wert gehalten. Dann konnte er fallen. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur stehengelassen und 16 Stunden gerührt und
dann gründlich gewaschen.
Reinigung und Isolierung von HB AG
Ein HB_Ag-positives Plasma von einem chronischen Hepatitisvirusträger wurde als Ausgangssubstanz angewandt.
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-Tf-
Der Titer betrug, verglichen mit einem Standardantigen, 1:32, bestimmt durch ID.
Eine chromatographische Säule (Durchmesser 16 mm) wurde mit 30 ml Adsorptionsmittel, das mit Puffer entsprechend Beispiel
1 äquilibriert war, gefüllt. Unter Anwendung einer Durchflußgeschwindigkeit von 12 ml/h wurden 3 ml Plasma aufgebracht.
Anschließend wurden 60 ml Puffer durchgeleitet bevor das adsorbierte Material mit Puffer, enthaltend 1m Natriumchlorid,
eluiert wurde. Die HBAg-positiven Fraktionen in dem Eluat
wurden zusammengegeben und die Lipoproteine mit 8-%igem
Polyvinylpyrrolidon ausgefällt und"verworfen.
Die entstehende Lösung wurde elektronenmikroskopisch untersucht, und es zeigte sich, daß sie nahezu reines
Hepatitisvirusmaterial enthielt, das zur Herstellung eines Impfstoffes geeignet war.
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Claims (5)
- Patentansprüche1^ Verfahren zur Isolierung von Hepatitis-B-virus, der nachweisbar ist als Oberflächenantigen,HB Ag,und Vorzugsweise zur Herstellung eines Impfstoffes angewandt werden kann, dadurch gekennzeichnetdaß man alsAdsorbens ein sulfatisiertes Kohlenhydrat verwendet.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das sulfatisierte Kohlenhydrat an eine Matrix gebunden ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet , daß das sulfatisierte Kohlenhydrat ein sulfatisiertes Polysaccharid ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfatisierte Polysaccharid Dextransulfat, Agarose-Dextransulfat oder mit Cyanogenbromid vernetztes Agaroseheparin ist.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man nach der Adsorption an einem unlöslich gemachten sulfatisierten Polysaccharid das Produkt in an sich bekannter Weise desorbiert.6231709838/0972ORIGINAL INSPECTED
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