DE1924304B2

DE1924304B2 - Diäthylaminoäthyldextran (DEAE-D) als Adjuvans für Impfstoffe zur aktiven Immunisierung von Säugetieren

Info

Publication number: DE1924304B2
Application number: DE1924304A
Authority: DE
Inventors: Kurt Dr. Bauer; Manfred Prof. Dr. Mussgay; Guenther Prof. Dr. Wittmann
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1969-05-13
Filing date: 1969-05-13
Publication date: 1979-10-25
Also published as: US3632741A; BE750349A; CA918071A; NL7006934A; JPS4921049B1; NL169031B; FR2051519B1; FR2051519A1; ES379642A1; DE1924304C3; DE1924304A1; GB1256457A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Impfstoff für Säugetiere bei dem Diäthylaminoäthyldextran (DEAE-D) als Adjuvans direkt zur Antigenlösung zugesetzt wird. Neben einer bedeutenden Steigerung der Antikörperbildung und einer längeren Persistenz der Antikörpertiter bewirkt dieser neue Impfstoff auch eine erhebliche Potenzierung der Immunität bei den Impflingen, verglichen mit der Applikation des Antigens allein.

Die Notwendigkeit, Antigene mit Adjuvantien zu koppeln, um eine bessere Immunogenität zu erreichen, ist bekannt. Es gibt eine Reihe von Adjuvantien, die hierzu verwendet werden, unter denen Wasser-in-Öl-Emulsionen und Aluminiumhydroxyd am gebräuchlichsten sind.

Diese Adjuvantien geben je nach dem Antigen, das mit ihnen verwendet wird, oder je nach Tierart, bei der der Impfstoff angewandt wird, unterschiedlich günstige oder weniger günstige Ergebnisse. Allen oben genannten Adjuvantien ist gemeinsam, daß sie einen großen Anteil des Impfstoffes, nämlich 25 — 50% ausmachen. Zudem kann es, besonders bei Mincralölhaltigcn Adjuvantien zu starken Nebenwirkungen an der Impfstelle kommen.

Aus diesem Grund war es notwendig, ein Adjuvans zu suchen, das

a) die immunogcnc Wirksamkeil von Aniigenen. el. h. die Antikörperbildung und die Immunität erheblich steigert, und zwar sowohl im Hinblick auf deren Beginn als auch deren Dauer,

b) relativ schwach toxisch ist, so daß nur leichte ^4> Impfrcaktionen auftreten, die zu keinen Daucrvcrändcrungen an den Impfstellen führen, was besonders bei Schlachttieren von Bedeutung ist,

c) bei allen Säugetieren,

d) im Impfstoffvolumen wenig Raum cinnimmi. so daß praktisch der gan/.c Impfstoff nur aus Antigen besteht. Dies hat zur Folge, daß entweder die Impfdosis stark reduziert werden kann oder daß bei schwachen Antigenen erheblich mehr Antigen mir einer Impfdosis zugeführt werden kann, als es ^M bisher möglich war, und

e) keine aufwendigen und umständlichen Manipulationen bei der Herstellung des Impfstoffes notwendig macht.

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Es wurde gefunden, daß DEAE-D diese Forderung weitgehend erfüllt.

Der Anteil des erfindungsgemäßen Adjuvans in einer Vakzine soll 5 bis 250 mg DEAE-D pro ml Impfstoff betragen, wobei sich 50 mg als optimal erwiesen haben.

Das DEAE-D wird in Substanz zum Antigen gegeben. Dabei erweist sich folgendes Vorgehen als empfehlenswert: Eine entsprechende Menge DEAE-D wird in ein geeignetes Gefäß gegeben. Bei säureempfindlichen Antigenen wird der sauere pH-Wert des DEAE-D durch Zugabe einer entsprechenden Puffersubstanz ausgeglichen. Es hat sich am praktischsten erwiesen, hierzu eine gesättigte Trislösung zu verwenden. Bei einem Ausgangs-pH der Antigenlösung von 7,8-8,0 ist es notwindig, etwa 2,25 ml gesättigte Trislösung pro 10 g DEAE-D zuzusetzen, um in dem fertigen Impfstoff einen pH-Wert von 7,4-7,6 zu erhalten. Wünscht man höhere oder niedrigere pH-Werte, so ist entsprechend mehr oder weniger Trispuffer zuzusetzen. Das DEAE-D mit der Puffersubstanz wird zur Keimfreimachung 20 bis 30 Minuten bei 110^cC bis 120⁰C im Autoklaven erhitzt. Nach völliger Abkühlung gibt man die Antigenlösung zum festgewordenen DEAE-D und hält das Gemisch mindestens 48 Stunden lang unter gelegentlichem Schütteln bei einer geeigneten Temperatur. In dieser Zeit ist das DEAE-D gewöhnlich gelöst. Nachdem dies der Fall ist, schüttelt man die Vakzine 1 Stur, ie und läßt sie dann bis zur Verwendung nochmals mindestens 24 Stunden bei einer geeigneten Temperatur stehen.

Als Antigen kann man alle immunogen wirksamen Substanzen auf der Basis von Virusantigenen in gereinigtem, teilgereinigtem oder ungereinigtem Zustand verwenden. Eventuell vorhandene toxische oder virulente Eigenschaften der Antigene werden vor dem Zusatz von DEAE-D soweit vermindert oder zerstört, so daß die Antigene für Impfling ungefährlich sind. Die Antigene können einzeln oder multipel zugesetzt werden. Das DEAE-D kann Impfstoffen auch zusammen mit anderen Adjuvantien z. B. AI(OH)i. Saponin. öladjuvjntien usw. zugesetzt werden.

Als Beispiel für die Anwendung von DEAE-D-haltigcn Impfstoffen sei ein Immiinisierungsversuch beim Schwein mit einer aus inaktiviertem Maul- und Klauenseuche (MKS)-Virus und DF.AE-D als Adjuvans bestehendem Impfstoff angeführt. Das gewählte Versuchssystem eignet sich zum Nachweis der Wirksamkeit von DEAE-D-haltigen Impfstoffen besonders gut. d;i allgemein bekannt ist, daß Schweine mil den bisher gebräuchlichen M KS-Impfstoffen schlecht immunisiert werden können. Der Impfschutz erstreckt sich in der Regel nur auf 4 Wochen und die Tiler der neutralisierenden Antikörper in dieser Zeit sind sehr niedrig und erreichen nur in Einzelfällen Werie von I : 50.

Fs wurden 15 Schweinemil Impfstoffen geimpft, die aus Älhylälhylcnimin-inaktiviertem MKS-Virus vom TypO und 50. 100 und 200 mg DEAK-D pro ml bcsianden, Die Impfung erfolgte mil lOml-Dosen subkutan.

Zu verschiedenen Zeiten wurden St; unipmbcn dieser Tiere gewonnen und auf ihren Gehalt an neutralisierenden Antikörpern untersuch). Zwölf Wochen nach der Impfung erfolgte die Testinfeklion der Impflinge durch Zuslallcn von MKS-infiziericii. nicht sehnt/geimpften Konlrollschwcincn.

Die Ergebnisse des Versuchs zeigt Tabelle I.

In Tabelle 2 sind Ergebnisse eines Immunisieriingsversuchs am Meerschweinchen wiedergegeben. Zur Herstellung der Impfstoffe wurde eine bei 37 C wärme-inaktivierte MKS-Virussuspcnsion vom Typ 0 verwendet. DEAE-D wurde in verschiedenen Mengen zugesetzt. Die Meerschweinchen erhielten an 4 Stellen jeweils 0,5 ml des jeweiligen Impfstoffes intramuskulär injiziert.

Ein weiterer Versuch wurde mit inaktiviertem Virus der »Infektiösen bovinen Rhinotracheilis« durchgeführt. Dieses Virus gchöri /ur Gruppe der

Desoxyribonueleinsäure-haltigen Viren, wahrend das MKS-Virus zur Gruppe der Ribonueleinsfiure-haltigen Viren zugeordnet wird. Auch bei diesem Versuch bestätigte sich die Adjuvanswirksamkeit von DEAE-D, Aus den angeführten Ergebnissen geht hervor, daß DEAE-D in Verbindung mit einem Antigen die eingangs aufgestellten Forderungen an ein Antigen voll erfüllt.

a) Es steigert die immunogene Wirksamkeit von Antigenen erheblich, wie die rasche Antikörperbildung im Schwein (4. Tag nach der Impfung) sowie die hohen Antikörpertiter bei Schwein und Meerschweinchen und die lange Persistent, der Antikörper sowie die fast 100%ige Immunität der geimpften Schweine 12 Wochen p.vacc. zeigen.

b) Es ist wenig toxisch, denn 14-16 Wochen p.vaee, konnten bei den geimpften Schweinen an den Impfstellen keine nennenswerten Veränderungen mehr festgestellt werden,

c) Es wirkt bei verschiedenen Tierarten gleich gut, wie Versuche mit Schweinen, Meerschweinchen, Kaninehen und Mäusen zeigten.

Aus der oben gegebenen Herstellungsvorschrift geht außerdem hervor, daß DEAE-D auch die eingang, unter d) und e) gestellten Forderungen erfüllt, d. h. es spielt im Gesamtvolumen des Impfstoffes raummäßig keine Rolle, und bei der Impfstoffherstellung sind keine umständlichen Manipulationen notwendig.

Tabelle I

Impfung von Schweinen mit einem DEAE-D-haltigen MKS-Virus-ImpfstolT

Schwein	Geic>?ft mit	Neutralisationsliter der Seren	4T	T₁)*	ET	nach Impfung')	4 W	1	6 W	8 W	iOW	I2W
Nr.		OT 2T	595	39,9	243	2 W	1690	I	700	21	113	53
97	inaktiv. MKS-Virus + 50 mg	_	345	39,7	186	5450	705		122	166	21	25
98	DEAE-D pro ml Impfdosis	_ _		40,2	2000	1400	3600		5950	2700		102
101	10 ml subcutan	-	1255		2350	7200	t³)
103		-	300	39,1	81	1850	2100		150	195	195	113
107		-	96	39,5	130	785	1600		405	195	77	73
99	inaktiv. MKS-Virus + 100mg	_ -	170	39,9	390	5450	49		58	10	.	13
102	DEAL-D pro ml Impfdosis	-	545	41,0	405	195	4150		345	49	130	64
104	10 ml subcutait	-	112	39,5	510	4700	4150		995	113	365	130
105		-	195	39.6	995	3900	450		280	195	85	79
111		-	2	12	1010	300	40	21	7	4
100	inaktiv. MKS-Virus + 200mg	_ —	12	595	235	4150	595	510	680	260
106	DEAE-D pro ml Impfdosis	I 1	37	345	6200	4350	*)
108	10 ml subcutan	-	5	9	504	235	130	55	42	13
109		-	7	16	129	2000	1220	345	73	86
110		-			4900
127	aktives MKS-Virus	_
128	(Kontrolle)	-
Tabelle	1 (Fortsetzung)		Verlauf der Testinfekl					Reaktion an dei		r Impfstelle
Schwein	Geimpft mit	/■„')			Aphlhen	14-16'	der Impfung
Nr.		39,1		oB	W nach	sehr leichte Verschwar-
97	inaktiv. MKS-Virus -r 50 mg	39,4		oB		tung des Fettgewebes
98	DEAE-D pro ml Impfdosis	39,8		oB	oB
101	10 ml subcutan
103		39,1		oB	oB
107		39,2		oB	oB
99	inaktiv. MKS-Virus + 100 mg	39,0		oB	oB
102	DEAE-D pro ml Impfdosis	39,5		G₁ ⁷)	oB
104	10 ml subcutan	39,0		oB	oB
105		39.3		oB	oB
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i Ii 1 ■τ,	5	Fortsetzung	Geimpft mit	19	24 304	T?)	Aphthen	6	Reaktion an der Impfstelle
$	Schwein				39,6	oB		14-16 W nach der Impfung
ι	Nr.	inaktiv, MKS-Virus + 200 mg			40,6	oB	oB
	100	DEAE-D pro ml Impfdosis	*VerlaureJerTestinrekt.·)**			oB
	106	10 ml suDcutan	7i,³)	39,7	oB
	108		39,1	39,9	oB	I leichte Verschwartung
	109		38,9	41,6	G₄ ⁸)	I des Fettgewebes
	110	aktives MKS-Virus		41,3
	127	(Kontrolle)	39,3
	128	39,1
	39,1
	39,2

Zeichenerklärung:

') Reziproke Wert der Serumtiter nach Tagen (T) oder Wochen (W).

²) Tsstinfektion der Impflinge durch Zustellen der Kontrolltiere Nr. 127, 123.

³) Körpertemperatur vor Testinfektion.

⁴) Höchste Körpertemperatur im Verlauf von 1-7 Tagen nach Testinfektion.

⁵) Gestorben an Kreislaufversagen.

") Geschlachtet wegen starker Abmagerung.

⁷) Aphthenbildung an einer Klaue.

⁸) Aphthenbildung an 4 Klauen.

⁹) Aphthenbildung an 3 Klauen, Tier an MKS-bedingter Myocarditis verendet.

Tabelle 2

Die Bildung neutralisierender Antikörper bei Meerschweinchen nach Impfung mit MKS-Impfstoffen mit verschiedenen Mengen von DEAE-D

DEAE-D pro ml Impfstoff	ND5o-Werte der Seren 4 Wochen nach der Impfung
5 mg	1:15 - 1:113') 1:63²)
15 mg	1:64 - 1:280 1:151
30 mg	1:195 - 1:1080 1:451
45 mg	1:235 - 1:1500 1:937
60 mg	1:300 - 1:1500 1:674
Kontrolle³)	negativ -1:21 1:10

Zeichenerklärung: ') Extremwerte.

²) Mittelwert aus den Einzeltitern von 6 Meerschweinchen.

³) Inaktiviertes Viius ohne Adjuvans.

Claims

Patentanspruch:

1. Verwendung von Piäthylaminoäthyldextran (DEAE-D) als Adjuvans für Impfstoffe zur aktiven Immunisierung auf der Basis von Virusantigenen zur Bekämpfung von Erkrankungen der Säugetiere.

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