CZ2018190A3 - Způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně - Google Patents
Způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2018190A3 CZ2018190A3 CZ2018-190A CZ2018190A CZ2018190A3 CZ 2018190 A3 CZ2018190 A3 CZ 2018190A3 CZ 2018190 A CZ2018190 A CZ 2018190A CZ 2018190 A3 CZ2018190 A3 CZ 2018190A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- adipose tissue
- solution
- monosaccharide
- disaccharide
- ultrasonic
- Prior art date
Links
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000002792 vascular Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 14
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 12
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 12
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 3
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 claims description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 abstract description 6
- 239000012503 blood component Substances 0.000 abstract description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 abstract description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 210000004982 adipose tissue macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 150000002840 non-reducing disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/35—Fat tissue; Adipocytes; Stromal cells; Connective tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně z adipózní tkáně, při němž se adipózní tkáň podrobí ultrazvukové kavitaci a následné centrifugaci, kde se adipózní tkáň před a/nebo po ultrazvukové kavitaci promyje roztokem monosacharidu nebo disacharidu. Promývání sacharidy namísto obvyklého promývání roztokem chloridu sodného či nepromytí materiálu vede ke zvýšení viability buněk. Dále se promytím sacharidy spolehlivě odstraní zbytky a komponenty krve, což vede ke snížení rizika nežádoucích účinků přípravků obsahujících SVF buňky u pacientů.
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález poskytuje zlepšený způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně.
Dosavadní stav techniky
Adipózní tkáň je pojivová tkáň sestávající převážně z adipocytů. Kromě adipocytů obsahuje buňky stromální vaskulární frakce obsahující regenerativně cenné buňky, a také imunitní buňky včetně makrofágů adipózní tkáně. Úkolem adipózní tkáně je skladovat energii ve formě lipidů, poskytnout tepelnou izolaci organismu, a chránit některé orgány proti mechanickému poškození.
Stromální vaskulární frakce (SVF) buněk se izoluje z adipózní tkáně, například odebrané v rámci liposukcí. SVF je zdrojem preadipocytů, mesenchymálních kmenových buněk a endotheliálních progentorových buněk. Tyto buňky mají velký terapeutický a regenerační potenciál. Je tedy zapotřebí vyvíjet metody izolace těchto buněk, které vedou k produktům splňujícím striktní požadavky na medicínské přípravky pro podání pacientům.
Izolace stromální vaskulární frakce zahrnuje krok rozrušení tkáně, který se může provádět enzymaticky nebo mechanicky. Enzymatické metody jsou účinné, ale zahrnují rizika poškození některých typů buněk, kontaminace buněk enzymy není vhodná pro terapeutické aplikace, zejména není vhodná pro transplantaci, a regulatomí orgány považují takto získané buňky za biotechnologicky upravené, takže vyžadují specifické regulatomí procesy pro schválení takto získaných přípravků.
Mechanické metody spočívající v třepání a centrifugaci vedou k nízkému výtěžku SVF buněk. Později byly zveřejněny patentové přihlášky US 2012/0164113, WO 2014/000031 a WO 2014/015229, které popisují izolaci SVF z adipózní tkáně mechanickou cestou pomocí ultrasonické kavitace. Ultrasonická příprava SVF buněk dovoluje dosáhnout poměrně vysokých výtěžků. Regulatomí orgány považují takto získané přípravky za „minimálně manipulované“. Dokument WO 2014/138383 v odst. 0173 zmiňuje, že ponechání hematopoietických faktorů a dalších krevních komponent prodlužuje viabilitu buněk, a výslovně uvádí, že ultrasonické metody přípravy tyto komponenty v přípravku ponechávají.
Předkládaný vynález přináší zlepšení postupů využívajících ultrasonické kavitace, přičemž si klade za úkol zvýšení viability buněk a snížení rizika nežádoucích účinků přípravků obsahujících SVF buňky u pacientů (nežádoucí účinky s vyšší incidencí jsou zejména edém a erytém).
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně z adipózní tkáně, při němž se adipózní tkáň podrobí ultrazvukové kavitaci a následné centrifugaci, a jehož podstata spočívá v tom, že se adipózní tkáň před a/nebo po ultrazvukové kavitaci promyje roztokem monosacharidu nebo disacharidu pro odstranění krevních komponent.
Monosacharidem je s výhodou glukóza. Disacharidem je s výhodou neredukující disacharid, výhodněji sacharóza.
Ultrazvuková kavitace se s výhodou provádí pomocí sonikátoru. Sonikátory jsou komerčně
- 1 CZ 2018 - 190 A3 dostupné přístroje, obvykle vybavené sondou emitující ultrazvukové signály.
Ve výhodném provedení se ultrazvuková kavitace provádí při energii 20 až 70 W, s výhodou 40 až 60 W, výhodněji asi 50 W; hodnotě cyklu 30 až 70 %, s výhodou 40 až 60 % nebo asi 50 %; a době sonikace alespoň 60 sekund, s výhodou alespoň 90 sekund, nej výhodněji 90 až 150 sekund.
Ultrazvuková kavitace se s výhodou provádí tak, že se sonda ultrazvukového sonikátoru vloží do adipózní tkáně tak, aby byla ponořená ve spodní polovině adipózní tkáně, provede se sonikace po polovinu stanoveného času, a následně se sonda ultrazvukového sonikátoru vloží do adipózní tkáně tak, aby byla ponořená v horní polovině adipózní tkáně, a provede se sonikace po druhou polovinu stanoveného času. Adipózní tkáň je při sonikaci obvykle umístěna ve zkumavce.
Promytí roztokem monosacharidu nebo disacharidu se s výhodou provádí před ultrazvukovou kavitací, a výhodněji před kavitací i po ní. Může se použít standardní roztok glukózy nebo sacharózy o koncentraci 5 hmotn. %. Může se například použít roztok glukózy nebo sacharózy o koncentraci 2 až 10 hmotn. %.
Centrifůgaci lze provádět například při 900 až 1500 rpm, s výhodou při 1200 až 1000 rpm.
Následně po centrifůgaci lze produkt dále zpracovávat, například rozdispergováním peletu buněk v izotonickém roztoku, jako je 0,9% (hmotn.) roztok NaCl.
Další možný způsob zpracování produktu zahrnuje následně po centrifůgaci odebrání a uschování tukové tkáně z produktu po centrifůgaci, rozdispergování peletu buněk v izotonickém roztoku, jako je 0,9% (hmotn.) roztok NaCl, centrifůgaci této suspenze, odstranění supematantu, a následné resuspendaci peletu buněk v tukové tkáni odebrané z produktu po centrifůgaci. Tuto tukovou tkáň lze po jejím odebrání a před resuspendaci pelet zpracovat sonikaci a/nebo filtrací přes síto o velikosti ok 400 až 700 mikrometrů.
Ve výhodném provedení obsahuje postup kroky:
a. promytí adipózní tkáně roztokem monosacharidu nebo disacharidu, s výhodou roztokem glukózy nebo sacharózy, výhodněji 5% (hmotn.) roztokem glukózy nebo sacharózy,
b. ultrazvuková kavitace se sondou ponořenou ve spodní polovině adipózní tkáně, s výhodou při 50 W a 50% cyklu po dobu alespoň 50 sekund,
c. ultrazvuková kavitace se sondou ponořenou v horní polovině adipózní tkáně, s výhodou při 50 W a 50% cyklu po dobu alespoň 50 sekund,
d. centrifůgace produktu kroku c., s výhodou při 1100 až 1300 rpm, s výhodou po dobu 5 minut,
e. odstranění tukové vrstvy a přidání roztoku monosacharidu nebo disacharidu, s výhodou roztoku glukózy nebo sacharózy, výhodněji 5% (hmotn.) roztoku glukózy nebo sacharózy,
f. centrifůgace, s výhodou při 900 až 1100 rpm, s výhodou po dobu 5 minut;
g. dispergace peletu v 0,9% roztoku NaCl;
h. volitelně centrifůgace suspenze získané v kroku g., odstranění supematantu, a následná resuspendace peletu buněk v tukové tkáni.
S výhodou lze před započetím zpracování odebrané adipózní tkáně provést mikrobiální kontrolu pro vyloučení rizika mikrobiální kontaminace tkáně.
-2CZ 2018 - 190 A3
V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že v postupech využívajících ultrasonické kavitace vede promývání sacharidy namísto obvyklého promývání roztokem chloridu sodného či nepromytí materiálu ke zvýšení viability buněk. Dále se promytím sacharidy spolehlivě odstraní zbytky a komponenty krve, což vede ke snížení rizika nežádoucích účinků přípravků obsahujících SVF buňky u pacientů, jako jsou edémy, erytémy, či nežádoucí alergické a imunitní reakce na komponenty krve.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Adipózní tkáň odebraná při liposukci byla nejprve podrobena mikrobiální kultivační kontrole. Pokud není prokázána přítomnost mikrobiální kontaminace, může být adipózní tkáň podrobena dalšímu zpracování. Adipózní tkáň byla proplachována 5 % (hmotn.) glukózy až do vizuálního potvrzení odstranění zbytků krve z adipózní tkáně. Následně byla pročištěná adipózní tkáň alikvotována do sterilních 50ml zkumavek tak, aby byl v každé zkumavce objem 20 ml.
Do každé zkumavky byla postupně ponořena sonda ultrazvukového sonikátoru, tak aby špička sondy byla ponořená ve spodní polovině adipózní tkáně. Na ultrazvukovém sonikátoru byla nastavena energie na hodnotu 50 W a cyklus na hodnotu 50 %, a časový limit na hodnotu 60 sekund a přístroj byl spuštěn.
Po uplynutí časového limitu sonikace byla sonda ultrazvukového sonikátoru přesunuta tak, aby špička sondy byla ponořená v horní polovině adipózní tkáně. Na ultrazvukovém sonikátoru byla nastavena energie na hodnotu 50 W a cyklus na hodnotu 50 %, a časový limit na hodnotu 60 sekund a přístroj byl spuštěn.
Po dokončení ultrazvukové sonikace (kavitace) se provedla centrifůgace vzorků na přístroji Hettich Rotina 380R pro izolaci SVF při 1200 rpm/5 min při pokojové teplotě, (rpm = ot/min)
Po centrifůgaci byla opatrně odstraněna lipidová vrstva. Ke zbytku adipózní tkáně bylo přidáno 10 ml 5% roztoku glukózy a centrifůgace byla opakována při 1000 rpm/5 min při pokojové teplotě.
Po centrifůgaci byl opatrně odstraněn supernatant, zbylá tuková tkáň přesunuta do 50 ml zkumavky a proveden pooling všech buněčných peletů v 5,1 ml 0,9% roztoku NaCl.
Příklad 2
Byl proveden postup jako v Příkladu 1, ale suspenze buněčných peletů v roztoku NaCl získaná v posledním kroku Příkladu 1 byla následně centrifugo vána při 900 rpm/5 min při pokojové teplotě a byl odstraněn supernatant za vzniku peletu buněk.
Mezitím byla tuková tkáň odebraná v posledním kroku Příkladu 1 sonikována tak, že se do ní ponořila špička sondy ultrazvukového sonikátoru (cca doprostřed), na ultrazvukovém sonikátoru byla nastavena energie na hodnotu 40 W a cyklus na hodnotu 40 %, a časový limit na hodnotu 60 sekund a přístroj byl spuštěn. Následně bylo na zkumavku nasazeno 500 pm buněčné síto a trychtýř pro filtraci tukové tkáně.
Z přefiltrované tukové tkáně byl odebrán objem podle požadované velikosti přípravku, a v něm byl resuspendován pelet buněk.
-3 CZ 2018 - 190 A3
Příklad 3
Pro demonstraci účinku promývání sacharidy byly provedeny srovnávací příklady a porovnání viability buněk. Experimenty se lišily v činidlech použitých k promývání materiálu, jinak se jednalo o stejný postup jako v Příkladu 1 (v Příkladu 1 byl pro promývání použit 5% roztok glukózy).
Každý experiment byl zopakován ΙΟχ. V první skupině experimentů byl k promývání použit 0,9% roztok NaCl. V druhé skupině experimentů byl k promývání použit 5% roztok glukózy. Ve třetí skupině experimentů byl k promývání použit 5% roztok sacharózy. Roztoky jsou vodné roztoky, údaje v % jsou v hmotnostních %.
Následující tabulka uvádí výsledky stanovení viability buněk pro jednotlivé skupiny experimentů lišící se promývacím činidlem (viabilita je uvedena jako % živých buněk vzhledem k celkovému množství přítomných buněk):
| Promývání | 1. | 2. | 3. | 4. | 5. | 6. | 7. | 8. | 9. | 10. | Průměr | Rozptyl | SD |
| NaCl | 68% | 74% | 73% | 73% | 73% | 69% | 70% | 68% | 71% | 73% | 71,2% | 4,76 | 2,18 |
| Glukóza | 94% | 93 % | 97% | 97% | 95% | 98 % | 95% | 94% | 95% | 96% | 95,4 % | 2,24 | 1,5 |
| Sacharóza | 93% | 97% | 96% | 96% | 93% | 99% | 97% | 95% | 94% | 97% | 95,7 % | 3,41 | 1,85 |
Pro stanovení viability buněk byla použita následující metoda:
° Trypanová modř je smíchána s buněčnou suspenzí před nanesením do Bůrkerovy komůrky v poměru 1:1 ° Počítání buněk s příměsí trypanové modři - buňky, které jsou modré, jsou mrtvé (došlo k narušení membrány a absorpci barviva dovnitř buňky); buňky s neporušenou membránou neabsorbují barvivo dovnitř - nebarví se a jsou počítány jako živé ° Počítají se pouze ty buňky, které se nacházejí uvnitř čtverce a buňky, které se z vnitřní nebo vnější strany dotýkají dvou stanovených stran (např. horní a levá) ° Počítány jsou buňky ve čtyřech rohových čtvercích ° Pro vyhodnocení byla použita následující tabulka
| Naměřené hodnoty - počítám buněk a barvení Trypanovou modří (ředění 1 : 1) | |||||||||
| Počet živých buněk ve čtverci | 1. | 2. | 3. | 4. | Celkem buněk (živé čtv1+2+3+4) | 0 buněk/čtverec (čtv 1+2+3+4/4) | Ředění 1:1= x2 | Suspenze (ml) 1 ml= xl 2 ml= x2 | (X10000 =) |
| Počet mrtvých buněk ve čtverci | 1. | 2. | 3. | 4. | Celkem mrtvých (mrtvé čtv 1+2+3+4) | živé/živé + mrtvé (živé čtvl+2+3+4)/ (živé čtvl+2+3+4)+ (mrtvé čtvl+2+3+4) | Viabilita (%) živé/(živé + mrtvé) xlOO | bb |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (10)
1. Způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně z adipózní tkáně, při němž se adipózní tkáň podrobí ultrazvukové kavitaci a následné centrifůgaci, vyznačený tím, že
-4CZ 2018 - 190 A3 se adipózní tkáň před a/nebo po ultrazvukové kavitací promyje roztokem monosacharidu nebo disacharidu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se adipózní tkáň promyje roztokem monosacharidu nebo disacharidu před ultrazvukovou kavitací, s výhodou před kavitací i po ní.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že se ultrazvuková kavitace provádí při energii 20 až 70 W, s výhodou 40 až 60 W, výhodněji asi 50 W; hodnotě cyklu 30 až 70 %, s výhodou 40 až 60 % nebo asi 50 %; a době sonikace alespoň 60 sekund, s výhodou alespoň 90 sekund, nej výhodněji 90 až 150 sekund.
4. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že se ultrazvuková kavitace provádí tak, že se sonda ultrazvukového sonikátoru vloží do adipózní tkáně tak, aby byla ponořená ve spodní polovině adipózní tkáně, provede se sonikace po polovinu stanoveného času, a následně se sonda ultrazvukového sonikátoru vloží do adipózní tkáně tak, aby byla ponořená v horní polovině adipózní tkáně, a provede se sonikace po druhou polovinu stanoveného času.
5. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde roztokem monosacharidu nebo disacharidu je roztok glukózy nebo sacharózy.
6. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že roztok monosacharidu nebo disacharidu má koncentraci 2 až 10 hmotn. %, s výhodou koncentraci 5 % hmotn.
7. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že se produkt dále zpracuje rozdispergováním v izotonickém roztoku, jako je 0,9% hmotn. roztok NaCl.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že se produkt následně zpracuje centrifugaci suspenze produktu v 0,9% roztoku NaCl, odstraněním supematantu, a následnou resuspendaci peletu buněk v tukové tkáni; přičemž tuková tkáň je s výhodou tuková tkáň odebraná z produktu před dispergací v 0,9% roztoku NaCl a zpracovaná sonikaci a/nebo filtrací přes síto o velikosti ok 400 až 700 mikrometrů.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje kroky:
a. promytí adipózní tkáně roztokem monosacharidu nebo disacharidu, s výhodou 5% hmotn. roztokem glukózy nebo sacharózy,
b. ultrazvuková kavitace se sondou ponořenou ve spodní polovině adipózní tkáně, s výhodou při 50 W a 50% cyklu po dobu alespoň 50 sekund,
c. ultrazvuková kavitace se sondou ponořenou v horní polovině adipózní tkáně, s výhodou při 50 W a 50% cyklu po dobu alespoň 50 sekund,
d. centrifůgace produktu kroku c., s výhodou při 1100 až 1300 rpm, s výhodou po dobu 5 minut,
e. odstranění tukové vrstvy a přidání roztoku monosacharidu nebo disacharidu, s výhodou 5% hmotn. roztoku glukózy nebo sacharózy,
f. centrifůgace, s výhodou při 900 až 1100 rpm, s výhodou po dobu 5 minut;
g. dispergace peletu v 0,9% roztoku NaCl;
h. volitelně centrifůgace suspenze získané v kroku g., odstranění supematantu, a následná resuspendace peletu buněk v tukové tkáni.
-5 CZ 2018 - 190 A3
10. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že se před započetím zpracování odebrané adipózní tkáně provede mikrobiální kontrola pro vyloučení mikrobiální kontaminace tkáně.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-190A CZ307750B6 (cs) | 2018-04-19 | 2018-04-19 | Způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-190A CZ307750B6 (cs) | 2018-04-19 | 2018-04-19 | Způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2018190A3 true CZ2018190A3 (cs) | 2019-04-10 |
| CZ307750B6 CZ307750B6 (cs) | 2019-04-10 |
Family
ID=65992194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2018-190A CZ307750B6 (cs) | 2018-04-19 | 2018-04-19 | Způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307750B6 (cs) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ612801A (en) * | 2010-12-27 | 2014-12-24 | Intellicell Biosciences Inc | Ultrasonic cavitation derived stromal or mesenchymal vascular extracts and cells derived therefrom obtained from adipose tissue and use thereof |
| CN104704111A (zh) * | 2012-06-26 | 2015-06-10 | 安柏定企业有限公司 | 通过超声空化从脂肪组织分离干细胞及使用方法 |
| US20140255356A1 (en) * | 2013-03-06 | 2014-09-11 | Steven Victor | Isolation of stromal vascular fraction from vascular tissues |
| EP2792741B1 (en) * | 2013-04-18 | 2015-09-30 | Jaroslav Michalek | Method for isolation of adipose tissue-derived stromal vascular fraction cells |
-
2018
- 2018-04-19 CZ CZ2018-190A patent/CZ307750B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ307750B6 (cs) | 2019-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11389565B2 (en) | Molded placental tissue compositions and methods of making and using the same | |
| JP6196280B2 (ja) | グルカンの調製 | |
| CN103536967B (zh) | 一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法 | |
| García-Contreras et al. | Differences in exosome content of human adipose tissue processed by non-enzymatic and enzymatic methods | |
| Bieglmayer et al. | Membranes of Glyoxysomes from Castor‐Bean Endosperm: Enzymes Bound to Purified‐Membrane Preparations | |
| CN115176798A (zh) | 一种液基细胞保存液及其配制方法和应用 | |
| CN107410288B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞的储存液 | |
| CN105536064B (zh) | 一种复合型软组织修复水凝胶及其制备方法和用途 | |
| US11077147B2 (en) | Acellular biologic composition and method of manufacture | |
| CZ2018190A3 (cs) | Způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně | |
| CN104152408B (zh) | 亚全能干细胞的制备方法 | |
| CN106614524A (zh) | 一种间充质干细胞的保存液以及保存方法 | |
| Molenaar et al. | Biochemical and electron microscopic study of isolated yeast nuclei | |
| Kanai et al. | Separation and properties of “in vivo grown tubercle bacilli” associated with the lysosomal membrane | |
| CN113405869A (zh) | 一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法 | |
| Aronson et al. | Cell wall structure of the marine fungus, Atkinsiella dubia | |
| CN108865975B (zh) | 斑块组织消化试剂盒及其应用 | |
| CN108753692B (zh) | 一种鸡胚原始生殖细胞的3d培养方法 | |
| CN106177936A (zh) | 一种猪细小病毒病弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品及其制备方法 | |
| Sukhacheva et al. | Resident cardiomyocyte precursor stem cells in the myocardium of infants of the first two years of life with tetralogy of Fallot | |
| CN111019935B (zh) | 一种去除细胞内活性氧的方法 | |
| CN113502256B (zh) | 一种无菌外泌体的提取方法 | |
| CN114903030B (zh) | 一种活性有核细胞的保存方法 | |
| TWI742399B (zh) | 無酵素前處理與培養脂肪間質幹細胞的方法 | |
| CN114540296B (zh) | 一种复合外泌体的制备方法及其在定向增强血管生成能力方面的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20240419 |