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CN119604315A - Epha2 bcl-xl抑制剂抗体-药物缀合物及其使用方法 - Google Patents

Epha2 bcl-xl抑制剂抗体-药物缀合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

公开了与人肿瘤学靶标结合的抗EphA2抗体药物缀合物。所述抗体药物缀合物包含Bcl‑xL抑制剂药物部分和结合抗原靶标的抗EphA2抗体或其抗原结合片段，所述抗原靶标是例如肿瘤或其他癌细胞上表达的抗原。本公开进一步涉及通过施用本文提供的抗体药物缀合物用于治疗癌症的方法和组合物。还公开了包含Bcl‑xL抑制剂药物部分的接头药物缀合物及其制备方法。

Description

EPHA2 BCL-XL抑制剂抗体-药物缀合物及其使用方法
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2022年5月20日提交的美国临时申请号63/344,454的申请日权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含Bcl-xL抑制剂和结合抗原靶标(例如肿瘤或其他癌细胞上表达的抗原)的抗EphA2抗体或其抗原结合片段。本公开进一步涉及用于治疗和/或诊断表达靶抗原和/或适合通过调节Bcl-xL表达和/或活性进行治疗的癌症的方法和组合物，以及制备这些组合物的方法。还公开了包含Bcl-xL抑制剂药物部分的接头-药物缀合物及其制备方法。
背景技术
细胞凋亡(程序性细胞死亡)是一种进化上保守的途径，对于组织稳态、发育和受损细胞的清除至关重要。细胞凋亡失调会导致人疾病，包括恶性肿瘤、神经退行性疾病、免疫系统疾病和自身免疫性疾病(Hanahan和Weinberg,Cell.2011年3月4日；144(5):646-74；Marsden和Strasser,Annu Rev Immunol.2003；21:71-105；Vaux和Flavell,Curr OpinImmunol.2000年12月；12(6):719-24)。细胞凋亡的逃逸被认为是癌症的一个标志，参与肿瘤的发展和持续扩增以及对抗癌治疗的抵抗(Hanahan和Weinberg,Cell.2000年1月7日；100(1):57-70)。
Bcl-2蛋白家族包含细胞存活的关键调节因子，其可以抑制(例如，Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)或促进(例如，Bad、Bax)细胞凋亡(Gross等人.,Genes Dev.1999年8月1日；13(15):1899-911，Youle和Strasser,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2008年1月；9(1):47-59)。
面对应激刺激，细胞能否存活或发生凋亡，取决于促进细胞死亡的Bcl-2家族成员与促进细胞存活的家族成员之间的配对程度。大多数情况下，这些相互作用涉及促凋亡家族成员的Bcl-2同源3(BH3)结构域对接至促存活成员表面的凹槽中。Bcl-2同源(BH)结构域的存在定义了Bcl-2家族的成员，根据蛋白质中存在的特定BH结构域，该家族分为三个主要组。Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1等促存活成员包含BH结构域1-4，而凋亡过程中线粒体外膜透化的促凋亡效应子Bax和Bak包含BH结构域1-3(Youle和Strasser,Nat.Rev.Mol.CellBiol.2008年1月；9(1):47-59)。
Bcl-2家族促存活成员的过表达是癌症的一个标志，并且已表明这些蛋白质在肿瘤的发展、维持和抗癌治疗耐药性中发挥着重要作用(Czabotar等人,Nat.Rev.Mol.CellBiol.2014年1月；15(1):49-63)。Bcl-xL(也称为BCL2L1，源自BCL2-like 1)在癌症中经常被扩增(Beroukhim等人,Nature 2010年2月18日；463(7283):899-905)，并且已表明其表达与一组代表性癌细胞系(NCI-60)中对120多种抗癌治疗分子的敏感性呈负相关(Amundson等人,Cancer Res.2000年11月1日；60(21):6101-10)。
此外，一些使用转基因敲除小鼠模型和Bcl-2家族成员转基因过表达的研究强调了这些蛋白质在免疫系统疾病和自身免疫性疾病中的重要性(有关综述，请参见Merino等人],Apoptosis 2009年4月；14(4):570-83.doi:10.1007/s10495-008-0308-4.PMID:19172396)。T细胞区室中Bcl-xL的转基因过表达导致对糖皮质激素、g辐射和CD3交联诱导的细胞凋亡产生抵抗，表明转基因Bcl-xL过表达可以减少静息和活化T细胞的细胞凋亡(Droin等人,Biochim Biophys Acta 2004年3月1日；1644(2-3):179-88.doi:10.1016/j.bbamcr.2003.10.011.PMID:14996502)。在患者样品中，观察到抗凋亡Bcl-2家族蛋白的持续或高表达(Pope等人,Nat Rev Immunol.2002年7月；2(7):527-35.doi:10.1038/nri846.PMID:12094227)。特别是，从类风湿性关节炎患者的关节中分离出的T细胞表现出Bcl-xL表达增加，并且能够抵抗自发性细胞凋亡(Salmon等人,J Clin Invest.1997年2月1日；99(3):439-46.doi:10.1172/JCI119178.PMID:9022077)。
上述发现推动了名为BH3模拟物的新型药物的发现和开发。这些分子能够破坏Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡成员之间的相互作用，并且是细胞凋亡的有效诱导剂。该新型药物包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和Mcl-1抑制剂。描述的第一个BH3模拟物是ABT-737和ABT-263，靶向Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w(Park等人,J.Med.Chem.2008年11月13日；51(21):6902-15；Roberts等人,J.Clin.Oncol.2012年2月10日；30(5):488-96)。之后，还发现了Bcl-2的选择性抑制剂(ABT-199和S55746)–Souers等人,Nat Med.2013年2月；19(2):202-8；Casara等人,Oncotarget 2018年4月13日；9(28):20075-20088)、Bcl-xL(A-1155463和A-1331852-Tai等人,ACS Med Chem Lett.2014年8月26日；5(10):1088-93；Leverson等人,Sci TranslMed.2015年3月18日；7(279):279ra40)和Mcl-1(A-1210477、S63845、S64315、AMG-176和AZD-5991-Leverson等人,Cell Death Dis.2015年1月15日；6:e1590.；Kotschy等人,Nature 2016,538,477-482；Maragno等人,AACR 2019,Poster#4482；Kotschy等人,WO2015/097123；Caenepeel等人,Cancer Discov.2018年12月；8(12):1582-1597；Tron等人,Nat.Commun.2018年12月17日；9(1):5341)。选择性Bcl-2抑制剂ABT-199现已被批准用于在联合法中疗治疗CLL和AML患者，而其他抑制剂仍处于临床前或临床开发阶段。在临床前模型中，ABT-263在多种血液恶性肿瘤和实体瘤中显示出活性(Shoemaker等人,Clin.CancerRes.2008年1月1日；14(11):3268-77；Ackler等人,Cancer Chemother.Pharmacol.2010年10月；66(5):869-80；Chen等人,Mol.Cancer Ther.2011年12月；10(12):2340-9)。在临床研究中，ABT-263在淋巴恶性肿瘤中表现出客观的抗肿瘤活性(Wilson等人,LancetOncol.2010年12月；11(12):1149-59；Roberts等人,J.Clin.Oncol.2012年2月10日；30(5):488-96)，并且其活性正在与几种实体瘤疗法组合进行研究。选择性Bcl-xL抑制剂A-1155463或A-1331852在T-ALL(T细胞急性淋巴母细胞性白血病)和不同类型实体瘤的临床前模型中表现出体内活性(Tao等人,ACS Med.Chem.Lett.2014年8月26日；5(10):1088-93；Leverson等人,Sci.Transl.Med.2015年3月18日；7(279):279ra40)。BH3模拟物的使用在免疫系统疾病和自身免疫性疾病的临床前模型中也显示出益处。用ABT-737(Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w抑制剂)治疗可在体外有效抑制淋巴细胞增殖。重要的是，在关节炎和狼疮动物模型中用ABT-737治疗的小鼠表现出疾病严重程度显著降低(Bardwell等人.,J ClinInvest.1997年2月1日；99(3):439-46.doi:10.1172/JCI119178.PMID:9022077)。此外，研究表明，ABT-737在体外防止同种异体T细胞活化、增殖和细胞毒性，并抑制皮肤移植后的同种异体T细胞和B细胞反应，对淋巴细胞具有高度选择性(Cippa等人,.Transpl Int.2011年7月；24(7):722-32.doi:10.1111/j.1432-2277.2011.01272.x.Epub 2011年5月25日.PMID:21615547)。因此，治疗性靶向凋亡信号通路中的Bcl-xL或其上游和/或下游蛋白代表了肿瘤学以及免疫和自身免疫疾病领域新疗法开发的极具吸引力的方法。
EphA2受体属于受体酪氨酸激酶的肝配蛋白受体亚家族。研究表明，EphA2在肿瘤组织中大量产生；而以相当低的水平存在于大多数正常成人组织中。EphA2失调与多种病理过程有关，尤其是癌症。对于某些类型的癌症，EphA2与预后不良和患者生存率降低有关。因此，EphA2受体是抗体药物缀合物的有吸引力的靶标。
发明内容
在一些实施方案中，本公开部分地提供了具有针对癌细胞的生物活性的新颖抗体-药物缀合物(ADC)化合物。这些化合物可以减缓、抑制和/或逆转哺乳动物中的肿瘤生长，和/或可以用于治疗人类癌症患者。在一些实施方案中，本公开更具体地涉及能够结合并杀伤癌细胞的ADC化合物。在一些实施方案中，本文公开的ADC化合物包含将Bcl-xL抑制剂附接至全长抗EphA2抗体或抗原结合片段的接头。在一些实施方案中，ADC化合物还能够在结合后内化至靶细胞中。
在一些实施方案中，ADC化合物可由式(1)表示：
Ab-(L-D)p (1)
其中Ab是抗EphA2抗体或其抗原结合片段；
D是Bcl-xL抑制剂；
L是将Ab共价附接至D的接头；以及
p是1至16的整数。在一些实施方案中，Ab是靶向癌细胞的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，对于式(1)的ADC化合物，D包含共价附接至接头L的式(I’)或式(II’)的Bcl-xL抑制剂化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
R1和R2彼此独立地表示选自由以下组成的组的基团：氢；任选地被羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；a)C3-C6环烷基；三氟甲基；和直链或支链C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中该杂环烷基基团任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代；
或R1和R2与携带它们的碳原子形成C3-C6亚环烷基基团，
R3表示选自由以下组成的组的基团：氢；a)C3-C6环烷基；直链或支链C1-C6烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；-X1-O-Rc；-X1-COORc；-X1-PO(OH)2；-X1-SO2(OH)；
-X1-N3和：
Ra和Rb彼此独立地表示选自由以下组成的组的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NRdRe；C1-C6亚烷基-N+RdReRf；C1-C6亚烷基-苯基，其中该苯基可以被C1-C6烷氧基基团取代；和基团：
或Ra和Rb与携带它们的氮原子形成环B1；
或Ra、Rb和Rc与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基、
Rc、Rd、Re、Rf彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
或Rd和Re与携带它们的氮原子形成环B2，
或Rd、Re和Rf与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基、
Het1表示选自由以下组成的组的基团：
Het2表示选自由以下组成的组的基团：
A1是–NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、任选地被羟基基团取代的-C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、被羟基取代的C1-C6烷基、被C1-C6烷氧基基团取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；-RG1和RG2与各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或者在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、被羟基取代的C1-C6烷基、被C1-C6烷氧基基团取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基，C2-C6炔基和C3-C6环烷基，
以及RG5表示氢原子或任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基基团，
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基基团，
R5表示选自由以下组成的组的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；卤素；和-CN，
R6表示选自由以下组成的组的基团：
氢；
直链或支链-C1-C6亚烷基-R8基团；
-C2-C6烯基；
-X2-O-R7；
-X2-NSO2-R7；
-C＝C(R9)-Y1-O-R7；
C3-C6环烷基；
任选地被羟基基团取代的C3-C6杂环烷基；
C3-C6亚环烷基-Y2-R7；
C3-C6亚杂环烷基-Y2-R7基团，以及
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自由以下组成的组的基团：直链或支链C1-C6烷基基团；(C3-C6)亚环烷基-R8；
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自由以下组成的组的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基、-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R’c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b；-X’2-NR’aR’b；-NR’c-X’2-N3和
R9表示选自由以下组成的组的基团：直链或支链的C1-C6烷基、三氟甲基、羟基、卤素和C1-C6烷氧基，
R10表示选自由以下组成的组的基团：氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基，
R11表示选自由以下组成的组的基团：氢、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8和C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基基团，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基基团，或者R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
X1和X2彼此独立地表示直链或支链
C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自由以下组成的组的基团取代：三氟甲基、羟基、卤素和C1-C6烷氧基，
X’2表示直链或支链的C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自由以下组成的组的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；
C1-C6亚烷基-N+R'dR'eR'f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中该苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；和基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R’a、R’b和R’c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R'd、R'e和R'f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8D杂环烷基，
Y1表示直链或支链的C1-C4亚烷基，
Y2表示键、-O-、-O-CH2-、-O-CO-、-O-SO2-、-CH2-、-CH2-O、-CH2-CO-、-CH2-SO2-、-C2H5-、-CO-、-CO-O-、-CO-CH2-、-CO-NH-CH2-、-SO2-、-SO2-CH2-、-NH-CO-或-NH-SO2-，
m＝0、1或2，
B1、B2、B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基基团，所述基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自由以下组成的组的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、
-NH2、氧代和哌啶基，其中R3和，如果存在的话，R8基团之一共价附接至接头，并且其中原子的化合价不会由于一个或多个与其键合的取代基超出；或
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
n＝0、1或2，
------表示单键或双键，
A4和A5彼此独立地表示碳或氮原子，
Z1表示键、-N(R)-或-O-，其中R表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
R1表示选自由以下组成的组的基团：氢；任选地被羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；a)C3-C6环烷基；三氟甲基；和直链或支链C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中该杂环烷基基团任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代；
R2表示氢或甲基；
R3表示选自由以下组成的组的基团：氢；直链或支链C1-C4烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；-X1-O-Rc；-X1-COORc；-X1-PO(OH)2；-X1-SO2(OH)；-X1-N3和：
Ra和Rb彼此独立地表示选自由以下组成的组的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NRdRe；C1-C6亚烷基-N+RdReRf；C1-C6亚烷基-苯基，其中该苯基可以被C1-C6烷氧基基团取代；和基团：
或Ra和Rb与携带它们的氮原子形成环B1；
或Ra、Rb和Rc与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Rc、Rd、Re、Rf彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或Rd和Re与携带它们的氮原子形成环B2，
或Rd、Re和Rf与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Het1表示选自由以下组成的组的基团：
Het2表示选自由以下组成的组的基团：
A1是–NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、任选地被羟基基团取代的-C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、被羟基取代的C1-C6烷基、被C1-C6烷氧基基团取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；-RG1和RG2与各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或者在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、被羟基取代的C1-C6烷基、被C1-C6烷氧基基团取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基，C2-C6炔基和C3-C6环烷基，
以及RG5表示氢原子或任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基基团，
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基，
R5表示选自由以下组成的组的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；卤素；和-CN，
R6表示选自由以下组成的组的基团：
氢；
直链或支链-C1-C6亚烷基-R8基团；
-C2-C6烯基；
-X2-O-R7；
-X2-NSO2-R7；
-C＝C(R9)-Y1-O-R7；
a)C3-C6环烷基；
任选地被羟基基团取代的C3-C6杂环烷基；
C3-C6亚环烷基-Y2-R7；
C3-C6亚杂环烷基-Y2-R7基团，以及
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自由以下组成的组的基团：直链或支链C1-C6烷基基团；(C3-C6)亚环烷基-R8；
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自由以下组成的组的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基、-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R'c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b、-X’2-NR’aR’b、-NR’c-X’2-N3和：
R9表示选自由以下组成的组的基团：直链或支链的C1-C6烷基、三氟甲基、羟基、卤素和C1-C6烷氧基，
R10表示选自由以下组成的组的基团：氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基，
R11表示选自由以下组成的组的基团：氢、卤素、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8和C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基基团，或者R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
X1表示直链或支链C1-C4亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自由以下组成的组的基团取代：三氟甲基、羟基、卤素和C1-C6烷氧基，
X2表示直链或支链C1-C6亚烷基，其任选地被一个或两个选自由以下组成的组的基团取代：三氟甲基、羟基、卤素和C1-C6烷氧基，
X’2表示直链或支链的C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自由以下组成的组的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；
C1-C6亚烷基-N+R'dR'eR'f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中该苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；和基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R'a、R'b和R'c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R'd、R'e和R'f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Y1表示直链或支链的C1-C4亚烷基，
Y2表示键、-O-、-O-CH2-、-O-CO-、-O-SO2-、-CH2-、-CH2-O、-CH2-CO-、
-CH2-SO2-、-C2H5-、-CO-、-CO-O-、-CO-CH2-、-CO-NH-CH2-、-SO2-、-SO2-CH2-、
-NH-CO-或-NH-SO2-，
m＝0、1或2，
B1、B2、B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基，所述基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自由以下组成的组的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代和哌啶基，
其中R3、R8和G基团之一(如果存在)共价附接至接头，并且其中原子的化合价不会由于一个或多个与其键合的取代基超出。
在一些实施方案中，对于式(I)的ADC化合物，D包含共价附接至接头L的式(I)或式(II)的Bcl-xL抑制剂化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或其与药学上可接受的酸或碱的加成盐(即，药学上可接受的盐)，其中：
R1和R2彼此独立地表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，其任选地被以下取代：羟基或C1-C6烷氧基基团；C3-C6环烷基；三氟甲基；直链或支链
C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中该杂环烷基基团任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代；
或R1和R2与携带它们的碳原子形成C3-C6亚环烷基基团，
R3表示选自以下的基团：氢；C3-C6环烷基；直链或支链C1-C6烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；-X1-O-Rc；-X1-COORc；-X1-PO(OH)2；-X1-SO2(OH)；-X1-N3和：
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NRdRe；C1-C6亚烷基-N+RdReRf；C1-C6亚烷基-苯基，其中该苯基可以被C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或Ra和Rb与携带它们的氮原子形成环B1；
或Ra、Rb和Rc与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Rc、Rd、Re、Rf彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或Rd和Re与携带它们的氮原子形成环B2，
或Rd、Re和Rf与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Het1表示选自以下的基团：
Het2表示选自以下的基团：
A1是–NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、
-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、
任选地被羟基基团取代的C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、
C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或
RG1和RG2与各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或者在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基，
R5表示选自以下的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；卤素或-CN，
R6表示选自以下的基团：
氢；
-C2-C6烯基；
-X2-O-R7；
-X2-NSO2-R7；
-C＝C(R9)-Y1-O-R7；
C3-C6环烷基；
任选地被羟基基团取代的C3-C6杂环烷基；
C3-C6亚环烷基-Y2-R7；
C3-C6亚杂环烷基-Y2-R7基团，
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基；(C3-C6)亚环烷基-R8；或者：
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R’c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b、-X’2-NR’aR’b、-NR’c-X’2-N3和：
R9表示选自直链或支链C1-C6烷基、三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团，
R10表示选自氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基的基团，
R11表示选自氢、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8、C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8的基团，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基基团，或者R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
X1和X2彼此独立地表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链的C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；
C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；C1-C6亚烷基-N+R'dR'eR'f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中该苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基取代；
基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R’a、R’b和R’c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R’d、R’e和R’f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Y1表示直链或支链的C1-C4亚烷基，
Y2表示键、-O-、-O-CH2-、-O-CO-、-O-SO2-、-CH2-、-CH2-O、-CH2-CO-、-CH2-SO2-、-C2H5-、-CO-、-CO-O-、-CO-CH2-、-CO-NH-CH2-、-SO2-、-SO2-CH2-、-NH-CO-、-NH-SO2-、
m＝0、1或2，
p＝1、2、3或4，
B1、B2、B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基，所述基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代或哌啶基，
其中R3和R8基团之一(如果存在)共价附接至接头，并且其中原子的化合价不会由于一个或多个与其键合的取代基超出；或
或前述项的对映异构体、非对映异构体和/或其与药学上可接受的酸或碱的加成盐(即，药学上可接受的盐)，其中：
n＝0、1或2，
------表示单键或双键。
A4和A5彼此独立地表示碳或氮原子，
Z1表示键、-N(R)-或-O-，其中R表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
R1表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，其任选地被以下取代：羟基或C1-C6烷氧基；C3-C6环烷基；三氟甲基；直链或支链C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中该杂环烷基任选地被直链或支链C1-C6烷基取代；
R2表示氢或甲基；
R3表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C4烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；-X1-O-Rc；-X1-COORc；-X1-PO(OH)2；-X1-SO2(OH)；-X1-N3和：
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NRdRe；C1-C6亚烷基-N+RdReRf；C1-C6亚烷基-苯基，其中该苯基可以被C1-C6烷氧基取代；
基团：
或Ra和Rb与携带它们的氮原子形成环B1；
或Ra、Rb和Rc与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Rc、Rd、Re、Rf彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或Rd和Re与携带它们的氮原子形成环B2，
或Rd、Re和Rf与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Het1表示选自以下的基团：
Het2表示选自以下的基团：
A1是–NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、
-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、
任选地被羟基基团取代的C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或
RG1和RG2与各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或者在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基，
R5表示选自以下的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；卤素或-CN，
R6表示选自以下的基团：
氢；
-C2-C6烯基；
-X2-O-R7；
-X2-NSO2-R7；
-C＝C(R9)-Y1-O-R7；
C3-C6环烷基；
任选地被羟基基团取代的C3-C6杂环烷基；
C3-C6亚环烷基-Y2-R7；
C3-C6亚杂环烷基-Y2-R7基团，
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基；
(C3-C6)亚环烷基-R8；或者：
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R'c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b、-X’2-NR’aR’b、-NR’c-X’2-N3和：
R9表示选自直链或支链C1-C6烷基、三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团，
R10表示选自氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基的基团，
R11表示选自氢、卤素、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和
-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8、C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8的基团，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基，或者R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
X1表示直链或支链C1-C4亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X2表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链的C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；
C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；
C1-C6亚烷基-N+R'dR'eR'f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，
其中该苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基取代；
基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R'a、R'b和R'c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R'd、R'e和R'f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Y1表示直链或支链的C1-C4亚烷基，
Y2表示键、-O-、-O-CH2-、-O-CO-、-O-SO2-、-CH2-、-CH2-O、-CH2-CO-、-CH2-SO2-、-C2H5-、-CO-、-CO-O-、-CO-CH2-、-CO-NH-CH2-、-SO2-、-SO2-CH2-、-NH-CO-、-NH-SO2-，
m＝0、1或2，
p＝1、2、3或4，
B1、B2、B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基，所述基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代或哌啶基，
其中R3和R8基团之一(如果存在)共价附接至接头，并且其中原子的化合价不会由于一个或多个与其键合的取代基超出。
在一些实施方案中，对于式(I)或式(II)，G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或
RG1和RG2与各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或者在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基。
在一些实施方案中，p是1至8的整数。在一些实施方案中，p是1至5的整数。在一些实施方案中，p是2至4的整数。在一些实施方案中，p是2。在一些实施方案中，p是4。在一些实施方案中，p通过液相色谱-质谱法(LC-MS)测定。
在一些实施方案中，接头(L)包含附接基团、至少一个间隔基基团和至少一个可切割基团。在一些情况下，可切割基团包含焦磷酸基团和/或自分解基团(self-immolativegroup)。在具体实施方案中，L包含附接基团；至少一个桥连间隔基基团；和至少一个包含焦磷酸基团和/或自分解基团的可切割基团。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头-药物(或“接头-负载”)部分-(L-D)具有式(A)：
其中R1是附接基团，L1是桥连间隔基基团，并且E是可切割基团。
在一些实施方案中，可切割基团包含焦磷酸基团。在一些实施方案中，可切割基团包含：
在一些实施方案中，桥连间隔基基团包含聚氧乙烯(PEG)基团。在一些情况下，PEG基团可选自PEG1、PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14和PEG15。在一些实施方案中，桥连间隔基基团可以包含：-CO-CH2-CH2-PEG12-。在其他实施方案中，桥连间隔基基团包含丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基或辛酰基。在一些实施方案中，桥连间隔基基团包含己酰基。
在一些实施方案中，附接基团由至少一个选自马来酰亚胺基团、硫醇基团、环辛炔基团和叠氮基基团的反应性基团形成。例如，马来酰亚胺基团可以具有以下结构：
叠氮基基团可以具有以下结构：-N＝N+＝N-。
环辛炔基团可以具有以下结构：
并且其中-*是与抗体的键。
在一些情况下，环辛炔基团具有以下结构：并且其中-*是与抗体的键。
在一些实施方案中，附接基团具有包含 的式，并且其中-*是与抗体的键。
在一些实施方案中，抗体通过选自以下的附接基团与接头(L)连接：
其中-*是与抗体的键，并且其中是与桥连间隔基基团的键。如本文所用，术语“接合(joined)”是指共价附接或共价连接。
在一些实施方案中，桥连间隔基基团与可切割基团接合或共价连接。
在一些实施方案中，桥连间隔基基团是-CO-CH2-CH2-PEG12-。
在一些实施方案中，可切割基团是-焦磷酸-CH2-CH2-NH2-。
在一些实施方案中，可切割基团与Bcl-xL抑制剂(D)接合或共价连接。
在一些实施方案中，接头包含：附接基团、至少一个桥连间隔基基团、肽基团和至少一个可切割基团。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头-药物部分，-(L-D)，具有式(B)：
其中R1是附接基团，L1是桥连间隔基，Lp是包含1至6个氨基酸残基的肽基团，E是可切割基团，L2是桥连间隔基，m是0或1；并且D是Bcl-xL抑制剂。在一些情况下，m是1并且桥连间隔基包括：
在一些实施方案中，至少一个桥连间隔基包含PEG基团。在一些情况下，PEG基团选自PEG1、PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14和PEG15。在一些情况下，至少一个桥连间隔基选自*-C(O)-CH2-CH2-PEG1-**、*-C(O)-CH2-PEG3-**、*-C(O)-CH2-CH2-PEG12**、*-NH-CH2-CH2-PEG1-**、多羟基烷基、*-C(O)-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-C(O)-**、*-C(O)-CH2-CH2-PEG12-NH-C(O)CH2-CH2-**，其中**表示至少一个桥连间隔基与附接基团的直接或间接附接点，*表示至少一个桥连间隔基与肽基团的直接或间接附接点。
在一些实施方案中，L1选自*-C(O)-CH2-CH2-PEG1-**、*-C(O)-CH2-PEG3-**、*-C(O)-CH2-CH2-PEG12**、*-NH-CH2-CH2-PEG1-**，和多羟基烷基，其中**表示L1与R1的直接或间接附接点，*表示L1与Lp的直接或间接附接点。
在一些实施方案中，m是1且L2是-C(O)-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-C(O)-。
在一些实施方案中，肽基团包含1至12个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至10个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至8个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至6个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至4个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至2个氨基酸残基。在一些情况下，该氨基酸残基选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-磺基丙氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-蛋氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)和L-酪氨酸(Tyr)。例如，该肽基团可包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、磺基-Ala-Val-Cit、磺基-Ala-Val-Ala、Gly-Gly-Gly和/或Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:68)。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含与基团连接的1个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含基团：
在一些情况下，肽基团包含选自以下的基团：
在一些实施方案中，该自分解基团包含对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(多羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(多羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵。
在一些实施方案中，m为1且桥连间隔基包含
在一些实施方案中，接头-药物部分-(L-D)由选自以下的化合物形成：
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头-药物基团，-(L-D)，其包含选自以下的式：
并且其中-*是与抗体的键。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头药物基团，-(L-D)，其具有式(C)：
其中：R1是附接基团，L1是桥连间隔基；Lp是包含1至6个氨基酸的肽基团；D是Bcl-xL抑制剂；G1-L2-A是自分解间隔基；L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；L3是间隔基部分；并且R2是亲水性部分。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头药物基团，-(L-D)，其具有式(D)：
其中：R1是附接基团；L1是桥连间隔基；Lp是包含1至6个氨基酸的肽基团；A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；L3是间隔基部分；并且R2是亲水性部分。
在一些实施方案中，L1包含：或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，其中每个n是1至12的整数，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
在一些实施方案中，L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
在一些实施方案中，L1是并且n是1，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
在一些实施方案中，L1是并且n是12，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
在一些实施方案中，L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
在一些实施方案中，L1包含其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
在一些实施方案中，L1是桥连间隔基，其包含：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或
*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，L1的**表示与R1的直接或间接附接点，其中X1为
以及
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；以及
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。
在一些实施方案中，R2是亲水性部分，其包含聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽、被1至3个基团取代的C2-C6烷基，或被1至2个独立选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。在一些实施方案中，R2是 (其中n是1到6之间的整数)、
在一些实施方案中，亲水性部分包含下式的聚乙二醇： 其中R是H、-CH3CH2CH2NHC(＝O)ORa、-CH2CH2NHC(＝O)Ra或-CH2CH2C(＝O)ORa，R’是OH、-OCH3、-CH2CH2NHC(＝O)ORa、-CH2CH2NHC(＝O)Ra或-OCH2CH2C(＝O)ORa，且m和n各自为2至25之间的整数(例如，介于3至25之间)。
在一些实施方案中，所述亲水性部分包含
在一些实施方案中，该亲水性部分包含聚肌氨酸，例如具有以下部分
其中n是3至25之间的整数；并且R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，L3是具有结构的间隔基部分，
其中：
W是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(Rb)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-、-C(＝O)N(X-R2)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)-、-CH2NRbC(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)NRb-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、
-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；以及
X是键、三唑基或-CH2-三唑基-，其中X与R2连接。
在一些实施方案中，L3是具有结构的间隔基部分，
其中：
W为-CH2-、-CH2O-、-CH2N(Rb)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-、-C(＝O)N(X-R2)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)-、-CH2NRbC(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)NRb-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、
-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；以及
X是-CH2-三唑基-C1-4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-CH2-三唑基-C1-4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-或-C4-6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中每个n独立地为1、2或3并且其中X连接至R2。
在一些实施方案中，附接基团通过包含至少一个反应性基团的反应形成。在某些情况下，附接基团是通过以下形成的：使附接至接头的第一反应性基团以及附接至抗体或者作为抗体的氨基酸残基的第二反应性基团进行反应。
在一些实施方案中，至少一个反应性基团包括：
硫醇、
马来酰亚胺、
卤代乙酰胺、
叠氮化物、
炔烃、
环辛烯、
三芳基膦、
氧杂降冰片二烯、
环辛炔、
二芳基四嗪、
单芳基四嗪、
降冰片烯、
醛、
羟胺、
肼、
NH2-NH-C(＝O)-、
酮、
乙烯基砜、
氮杂环丙烷、
氨基酸残基、
-ONH2、-NH2、
-N3、-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(O)NHNH2、
其中：
每个R3独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R4是2-吡啶基或4-吡啶基；
每个R5独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R6独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基。
在一些实施方案中，第一反应性基团和第二反应性基团包括：
硫醇和马来酰亚胺、
硫醇和卤代乙酰胺、
硫醇和乙烯基砜、
硫醇和氮杂环丙烷、
叠氮化物和炔烃、
叠氮化物和环辛炔、
叠氮化物和环辛烯、
叠氮化物和三芳基膦、
叠氮化物和氧杂降冰片二烯、
二芳基四嗪和环辛烯、
单芳基四嗪和降冰片烯、
醛和羟胺、
醛和肼、
醛和NH2-NH-C(＝O)-、
酮和羟胺、
酮和肼、
酮和NH2-NH-C(＝O)-、
羟胺和
胺和 或
CoA或CoA类似物和丝氨酸残基。
在一些实施方案中，附接基团包括选自以下的基团：
以及
其中：
R32是H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；
R35是H、C1-6烷基、苯基或被1至3个-OH基团取代的C1-4烷基；
每个R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、被–C(＝O)OH取代的苄氧基、被–C(＝O)OH取代的苄基、被–C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R37独立地选自H、苯基和吡啶；
q是0、1、2或3；
R8是H或甲基；以及
R9是H、-CH3或苯基。
在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至6个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至4个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至2个氨基酸残基。在一些实施方案中，该氨基酸残基选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-磺基丙氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-蛋氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)和L-酪氨酸(Tyr)。在一些实施方案中，该肽基团包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、磺基-Ala-Val-Cit、磺基-Ala-Val-Ala、Gly-Gly-Gly和/或Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:78)。
在一些实施方案中，Lp选自：
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
，其中：-*是与抗体的键；并且A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：其中：
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
每个R独立地选自H、-CH3和-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
每个R独立地选自H、-CH3和-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
Xa是-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且Xa、A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，Xa是-CH2-或-NHCH2-；A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
Xb是-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且Xb、A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A和如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：
-*是与抗体的键；并且A和D如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A和D如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A和D如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A和D如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A和D如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A和D如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*、
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*、
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式：
其中：-*是与抗体的键；并且A、D和R如上所定义。在一些实施方案中，A是键或-OC(＝O)-*；
R是-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式化合物或由下式化合物形成：
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*、
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；以及
D是Bcl-xL抑制剂。
在一些实施方案中，A是键。
在一些实施方案中，A是-OC(＝O)-*。
在一些实施方案中，R是–CH3。
在一些实施方案中，R是-CH2CH2COOH。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头-药物基团-(L-D)，其由选自以下的化合物形成：
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头-药物基团，-(L-D)，其包含选自以下的式：
以及其中-*是与抗体的键。
在一些实施方案中，Bcl-xL抑制剂(D)包含式(I)的化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式(I)所述。在一些实施方案中，R1是直链或支链C1-6烷基并且R2是H。
在一些实施方案中，Bcl-xL抑制剂(D)包含式(II)的化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式(II)所述。A1和A5均表示氮原子，R1是直链或支链C1-6烷基；R2是H；n是1；并且------表示单键。
在一些实施方案中，Bcl-xL抑制剂(D)包含式(IA)或(IIA)的化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
Z1表示键或-O-，
R3表示选自以下的基团：氢；C3-C6环烷基；直链或支链C1-C6烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；和-X1-O-Rc，
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；和C1-C6亚烷基-SO2O-，
Rc表示氢或直链或支链的C1-C6烷基基团，
Het2表示选自以下的基团：
A1是–NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)OH、-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、任选地被羟基基团取代的C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、和任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；
-RG3是任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；或
RG1和RG2与各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基，
R5表示选自以下的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；卤素或-CN，
R6表示选自以下的基团：
-X2-O-R7；以及
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基；
(C3-C6)亚环烷基-R8；或者：
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R’c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b；-X’2-NR’aR’b：-NR’c-X’2-N3和：
R10表示选自氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基的基团，
R11表示选自氢、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8、C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8的基团，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基，或者R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
X1和X2彼此独立地表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链的C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中该苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；C1-C6亚烷基-N+R'dR'eR'f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中该苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基取代；
基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R’a、R’b和R’c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R’d、R’e和R’f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
m＝0、1或2，
p＝1、2、3或4，
B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基基团，该基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代或哌啶基。
在一些实施方案中，对于式(IA)或(IIA)，G选自由以下组成的组：-C(O)OH、-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、和任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；
-RG3是任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；或
-RG1和RG2与各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基。
在一些实施方案中，对于式(I)、(II)、(IA)或(IIA)，R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基；(C3-C6)亚环烷基-R8；或者：
其中Cy表示C3-C8环烷基。
在一些实施方案中，对于式(I)、(II)、(IA)或(IIA)，R7表示选自以下的基团：
在一些实施方案中，Bcl-xL抑制剂(D)包含式(IB)、(IC)、(IIB)或(IIC)的化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
对于式(IB)或(IC)，R3表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；和-X1-O-Rc；
对于式(IIB)或(IIC)中，Z1表示键，并且R3表示氢；或Z1表示-O-，并且R3表示-X1-NRaRb,
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；和C1-C6亚烷基-SO2O-，
Rc表示氢或直链或支链的C1-C6烷基
R6表示–X2-O-R7或任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：
R8表示选自以下的基团：-NR’aR’b；-O-X’2-NR’aR’b；和-X’2-NR’aR’b，
R10表示氟，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基基团，
X1和X2彼此独立地表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链的C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
R’d、R’e彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
B3表示C3-C8杂环烷基基团，所述基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基和氧代。
在一些实施方案中，R7代表以下基团：
在一些实施方案中，R7表示选自以下的基团：
在一些实施方案中，对于式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(II)、(IIA)、(IIB)或(IIC)，R8表示选自以下的基团：
其中-＊表示与接头的键。
在一些实施方案中，B3表示选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、氮杂环庚基和2,8-二氮杂螺[4,5]癸基的C3-C8杂环烷基。
在一些实施方案中，D表示通过共价键附接至接头L的Bcl-xL抑制剂，其中该Bcl-xL抑制剂选自表A1中的化合物：
表A1
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，D包含选自表A2中的式中的任一个的式，或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐。
表A2
其中-＊表示与接头的键。
在一些实施方案中，-(L-D)由选自表B的化合物或其对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐形成。在一些实施方案中，表B化合物中的马来酰亚胺基团与抗体或其抗原结合片段(Ab)形成共价键以形成包含部分的式(1)的ADC化合物，其中*表示与Ab的附接点。对于表A1、表A2、表B和表1中的化合物，取决于它们的电荷，这些化合物可以含有一种药学上可接受的单价阴离子抗衡离子M1 -。在一些实施方案中，单价阴离子抗衡离子M1 -可以选自溴离子、氯离子、碘离子、乙酸根、三氟乙酸根、苯甲酸根、甲磺酸根、甲苯磺酸根、三氟甲磺酸根、甲酸根等。在一些实施方案中，单价阴离子抗衡离子M1 -为三氟乙酸根或甲酸根。
表B.示例性接头药物组
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有根据表1中所示的任一结构的式。
表1.示例性ADC结构
*Ab：本文描述的任何抗体(例如，EphA2-DANAPA抗体)。
上面描述的ADC也可以用以下式表示：
Ab-(L-D)p(1),
其中Ab表示与上述接头-负载(L/P)共价连接的抗EphA2抗体或其抗原片段；p是1至16的整数。在一些实施方案中，p是1至8的整数。在一些实施方案中，p是1至5的整数。在一些实施方案中，p是2至4的整数。在一些实施方案中，p是2。在一些实施方案中，p是4。在一些实施方案中，p通过液相色谱-质谱法(LC-MS)测定。
如本文所用，“L/P”是指本文公开的接头-负载、接头-药物或接头-化合物，并且术语“L#-P#”和“L#-C#”可互换使用，指本文公开的特定接头-药物，而编号“P#”和“C#”可互换使用，指特定化合物，除非另有说明。例如，“L1-C1”和“L1-P1”均指本文公开的相同接头-负载结构，而“C1”和“P1”均指本文公开的相同化合物，包括前述项中任一者的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本文还提供了包含抗体-药物缀合物(例如，本文描述的任何示例性抗体-药物缀合物)的多个拷贝的组合物。在一些实施方案中，组合物中抗体-药物缀合物的平均p为约2至约4。
在一些实施方案中，本文还提供了药物组合物，其包含抗体-药物缀合物(例如，本文描述的任何示例性抗体-药物缀合物)或组合物(例如，本文描述的任何示例性组合物)，以及药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，本文进一步提供了所述ADC化合物和组合物的治疗用途，例如在治疗癌症中的用途。在一些实施方案中，本公开提供了治疗癌症(例如，表达ADC的抗体或抗原结合片段靶向的EphA2抗原的癌症)的方法。在一些实施方案中，本公开提供了减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增的方法。在一些实施方案中，本公开提供了确定患有或疑似患有癌症的受试者是否会对用本文公开的ADC化合物或组合物进行的治疗有应答的方法。
示例性实施方案是治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原EphA2。在一些实施方案中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴母细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
另一个示例性实施方案是减少或抑制受试者中肿瘤生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)。在一些实施方案中，肿瘤表达靶抗原EphA2。在一些实施方案中，所述肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌或脾癌。在一些实施方案中，肿瘤是胃癌。在一些实施方案中，肿瘤乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，肿瘤是乳腺癌或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用将肿瘤的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％。至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一个示例性实施方案是减少或减缓受试者体内癌细胞群扩增的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)。在一些实施方案中，癌细胞群表达靶抗原EphA2。
在一些实施方案中，癌细胞群来自肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌细胞群来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴母细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌细胞群来自淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，癌细胞群来自乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，癌细胞群来自乳腺癌或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用使癌细胞群减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％。至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用使癌细胞群的扩增减慢至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％。至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一个示例性实施方案是用于治疗患有或疑似患有癌症的受试者的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原EphA2。在一些实施方案中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴母细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，癌细胞群来自乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，癌细胞群来自乳腺癌或非小细胞肺癌。
另一个示例性实施方案是抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)在治疗患有或疑似患有癌症的受试者中的用途。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原EphA2。在一些实施方案中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴母细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
另一个示例性实施方案是抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)在制备用于治疗患有或疑似患有癌症的受试者的药物的方法中的用途。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原EphA2。在一些实施方案中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴母细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
另一个示例性实施方案是通过以下来确定患有或疑似患有癌症的受试者是否会对用抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如本文公开的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)进行治疗有应答的方法：提供来自受试者的生物样品；将样品与抗体-药物缀合物接触；并且检测抗体-药物缀合物与样品中癌细胞的结合。在一些实施方案中，样品中的癌细胞表达靶抗原。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原EphA2。在一些实施方案中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴母细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，样品是组织活检样品、血液样品或骨髓样品。
还公开了生产所述ADC化合物和组合物的方法。示例性实施方案是通过使抗体或抗原结合片段与接合或共价附接至Bcl-xL抑制剂的可切割接头在允许缀合的条件下反应来产生抗体-药物缀合物的方法。
附图说明
图1显示EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC(30mg/kg，SD，IV)、3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC(30mg/kg，SD，IV)和EphA2-DANAPA CysMab对照抗体(3.75mg/kg，SD，IV)单独或与紫杉醇组合(12.5mg/kg，SD，IV)的EBC-1生长动力学。
图2显示不同剂量的EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC单独或与紫杉醇组合的EBC-1生长动力学。
图3显示EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC、3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC和EphA2-DANAPA CysMab对照抗体单独或与吉西他滨组合的Panc03.27生长动力学。
图4显示EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC、3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC和EphA2-DANAPA CysMab对照抗体单独或与MAPK抑制剂LXH254和CFF272组合的Panc03.27生长动力学。
图5显示EphA2抗体与已转导而过表达EphA2的HKB-11细胞系的结合亲和力(第1轮)。
图6显示EphA2抗体与已转导而过表达EphA2的HKB-11细胞系的结合亲和力(第2轮)。
图7显示EphA2抗体与已转导而过表达EphA2的HKB-11细胞系的结合亲和力(第3轮)。
图8显示HKB11细胞上表达的人EphA2与抗EphA2 IgG抗体1C1及其轻链点突变IgG的结合动力学。
图9A和9B显示人、小鼠和食蟹猴EphA2胞外结构域与抗EphA2 IgG抗体1C1及其轻链点突变IgG的结合动力学。
具体实施方式
结合附图，通过参考以下详细描述可更容易地理解所披露的组合物和方法，这些附图形成本公开的一部分。
在本文中，描述涉及组合物和使用该组合物的方法。当本公开描述或要求保护与组合物相关的特征或实施方案时，这样的特征或实施方案同样适用于使用该组合物的方法。同样，当本公开描述或主张与使用所述组合物的方法相关联的特点或实施方案时，此类特点或实施方案同等地适用于该组合物。
当表达值的范围时，其包括使用该范围内的任何特定值的实施方案。此外，对范围中规定的值的引用包括该范围内的每个值。所有范围均包含其端点并且可组合。当通过使用前缀“约”将值表示为近似值时，将理解所述特定值形成另一个实施方案。除非上下文另有明确指示，否则对特定数值的引用至少包括该特定值。除非其使用的具体上下文另有规定，否则“或”的使用将意味着“和/或”。出于所有目的，本文引用的所有参考文献均通过引用并入。当参考文献和说明书冲突时，将以说明书为准。
除非描述的上下文另有说明，例如，在没有指示特定联结点的符号的情况下，当绘制结构或结构的片段时，它可以被单独使用或附接到ADC的其他组分，并且它可以以任何取向这样做，例如，抗体在任何合适的附接点附接到化学部分，例如接头-药物。然而，在指明的情况下，ADC的组分按照给定式中所示的取向附接。例如，如果将式(1)描述为Ab-(L-D)p，基团“-(L-D)”描述为则式(1)的详细结构是它不是
应当理解，出于清楚的目的本文描述于单独实施方案的上下文中的披露的组合物和方法的某些特征还可以按组合形式提供于单个实施方案中。相反地，出于简洁的目的描述于单个实施方案的上下文中的披露的组合物和方法的不同特征还可以分开地或以任何子组合形式提供。
如本申请通篇所使用的，抗体药物缀合物可以使用“靶抗原/抗体-接头-负载”的通用格式的命名约定来识别。仅举例来说，如果抗体药物缀合物被称为“靶X-L0-P0”，则此类缀合物将包含结合靶标X的抗体、指定为L0的接头和指定为P0的负载。可替代地，如果抗体药物缀合物被称为“抗靶X-L0-P0”，则此类缀合物将包含结合靶标X的抗体、指定为L0的接头和指定为P0的负载。在另一个替代方案中，如果抗体药物缀合物被称为“AbX-L0-P0”，则这样的缀合物将包含指定为AbX的抗体、指定为L0的接头和指定为P0的负载。包含非特异性同种型对照抗体的对照抗体药物缀合物可称为“同种型对照IgG1-L0-P0”或“IgG1-L0-P0”。
本文中给出的任何式还旨在代表化合物的非标记形式以及同位素标记形式。除了一个或多个原子被具有选定原子量或质量数的原子替换以外，同位素标记的化合物具有本文中给出的式所描述的结构。可以掺入本发明化合物中的同位素包括例如氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，例如3H、11C，13C、14C、15N、18F和36Cl。因此，应理解，本公开包括掺入一种或多种任何前述同位素(包括例如放射性同位素(如3H和14C))的化合物，或其中存在非放射性同位素(如2H和13C)的化合物。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(用14C)、反应动力学研究(例如用2H或3H)、检测或成像技术(例如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定)，或用于患者的放射治疗。特别地，18F或标记的化合物可能对于PET或SPECT研究是特别希望的。同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术来制备，例如使用适当的同位素标记的试剂代替未标记的先前使用的试剂来制备。
定义
整个说明书和权利要求书中使用了与本说明书的各方面相关的各种术语。除非另有说明，这些术语应具有其在本领域中的普通含义。其他具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/一种(a，an)”和“该(the)”包括复数形式。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“具有化学式”中的“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放术语(即，意思是“包括但不限于”)。另外，每当在实施方案中使用“包含”或另一开放式术语时，应当理解，可以使用中间术语“基本上由......组成”或封闭式术语“由......组成”来更狭义地要求保护同一实施方案。
当在数值和范围的上下文中使用时，术语“约”或“大约”是指近似或接近所列举的值或范围的值或范围，使得实施方案可以如预期那样实施，如显而易见的本领域技术人员可以从本文所包含的教导中获悉。在一些实施方案中，约是指数值量±20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或0.1％。在一个实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少10％的值范围。在另一个实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少5％的值范围。在另一个实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少1％的值范围。
术语“抗体-药物缀合物”、“抗体缀合物”、“缀合物”、“免疫缀合物”和“ADC”可互换使用，并且指一个或多个治疗化合物(例如，Bcl-xL抑制剂)与一个或多个抗体或抗原结合片段连接。在一些实施方案中，ADC由通用式定义：Ab-(L-D)p(式1)，其中Ab＝抗体或抗原结合片段(例如，抗EphA2抗体或其抗原结合片段)，L＝接头部分，D＝药物部分(例如，Bcl-xL抑制剂药物部分)，和p＝药物部分数量/抗体或抗原结合片段。在包含Bcl-xL抑制剂药物部分的ADC中，“p”是指与抗体或抗原结合片段连接的Bcl-xL抑制剂化合物的数量。
术语“抗体”以最广泛的意义使用，指通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶的免疫球蛋白分子，所述靶如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述物质的组合。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或重组来源。“完整”抗体是通常包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，间插更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。抗体可以是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体或嵌合抗体。抗体可以是任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。抗体可以是完整抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗体片段包括经修饰的或工程改造的氨基酸残基，例如一个或多个半胱氨酸残基，作为与药物部分缀合的位点(Junutula JR等人,Nat Biotechnol 2008,26:925-932)。在一个实施方案中，本公开提供了一种经修饰的抗体或抗体片段，所述经修饰的抗体或抗体片段包含在本文所述的位置处用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代。半胱氨酸取代位点位于抗体或抗体片段的恒定区，因此适用于多种抗体或抗体片段，并且选择这些位点以提供稳定和均一的缀合物。经修饰的抗体或片段可以具有一个、两个或更多个半胱氨酸取代，并且这些取代可以与如本文所述的其他修饰和缀合方法组合使用。用于在抗体的特定位置插入半胱氨酸的方法是本领域已知的，参见，例如，Lyons等人,(1990)Protein Eng.,3:703-708、WO 2011/005481、WO2014/124316、WO2015/138615。在某些实施方案中，经修饰的抗体包含在其恒定区上的选自以下位置用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，并且其中这些位置是根据EU系统编号的。在一些实施方案中，经修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上的选自以下位置用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199和203，其中位置根据EU系统编号，并且其中轻链是人κ轻链。在某些实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸取代两个或更多个氨基酸的组合，其中所述组合包含在抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360，或抗体轻链的位置107处的取代，并且其中这些位置根据EU系统编号。在某些实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸取代一个氨基酸，其中所述取代是抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360、抗体轻链的位置107、抗体轻链的位置165或抗体轻链的位置159处的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是κ链。在具体的实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸取代两个氨基酸的组合，其中所述组合包含在抗体重链的位置375和抗体重链的位置152处的取代，其中所述位置根据EU系统编号。在具体实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体重链的位置360处用半胱氨酸取代一个氨基酸，其中位置是根据EU系统编号的。在其他具体实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体轻链的位置107处用半胱氨酸取代一个氨基酸，并且其中位置是根据EU系统编号，并且其中轻链是κ链。
本文所用的术语“抗体片段”或“抗原结合片段”或“功能性抗体片段”是指抗体的至少一部分，所述至少一部分保留与抗原(例如，EphA2)表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗原结合片段还可以保留内化到抗原表达型细胞中的能力。在一些实施方案中，抗原结合片段还保留免疫效应子活性。术语抗体、抗体片段、抗原结合片段等旨在涵盖来自抗体的结合结构域在较大大分子例如ADC的背景下的使用。已经表明，全长抗体的片段可以实施全长抗体的抗原结合功能。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(例如包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)以及抗体的分离的CDR或其他表位结合片段所形成的多特异性抗体。抗原结合片段也可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、双特异性或多特异性抗体构建体、ADC、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Holliger和Hudson(2005)Nat Biotechnol.23(9):1126-36)。还可以基于多肽例如III型纤连蛋白(Fn3)将抗原结合片段移植到支架中(参见美国专利号：6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。术语“scFv”是指融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗原结合片段和至少一个包含重链可变区的抗原结合片段，其中轻链和重链可变区是例如经由合成的接头例如短的柔性多肽接头连续连接的并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则scFv可以以任一顺序(例如相对于多肽的N-末端和C-末端)具有VL和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。使用本领域技术人员已知的常规技术获得抗原结合片段，并以与完整抗体相同的方式筛选结合片段的效用(例如，结合亲和力、内化)。例如，抗原结合片段可以通过完整蛋白质的切割来制备，例如通过蛋白酶或化学切割。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，通常，每个重链可变区中存在三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任何一种来确定，这些方案包括描述于以下的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)J Mol Biol.273(4):927-48(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc(2001)Nucleic Acids Res.29(1):207-9；Lefranc等人(2003)Dev Comp Immunol.27(1):55-77)(“IMGT”编号方案)；或其组合。在针对给定CDR区(例如，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3)的组合卡巴特和乔西亚编号方案中，在一些实施方案中，这些CDR对应于被定义为卡巴特CDR的一部分的氨基酸残基，以及被定义为乔西亚CDR的一部分的氨基酸残基。如本文所使用的，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也称为“高变环”。
在一些实施方案中，在Kabat下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)(例如，位置35之后的一个或多个插入)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)(例如，位置27之后的一个或多个插入)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在一些实施方案中，在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)(例如，位置31之后的一个或多个插入)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)(例如，位置30之后的一个或多个插入)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，在一些实施方案中，CDR包含以下或由以下组成的组：例如人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)或人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在一些实施方案中，在IMGT下，VH中的CDR氨基酸残基编号为约26-35(CDR1)，51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号为约27-32(CDR1)，50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。在一些实施方案中，在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指自基本上同源的抗体群获得的一种抗体，即，构成该群体的个别抗体除以微量存在的可能天然存在的突变外为一致的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相反，常规(多克隆)抗体制剂通常包括针对(或特异性针对)不同表位的多种抗体。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本公开有待使用的单克隆抗体可以通过Kohler et al.(1975)Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法，或可以通过重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567)制备。也可以使用例如Clackson等人(1991)Nature 352:624-8和Marks等人(1991)J Mol Biol.222:581-97中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。该术语还包括单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文所述的单克隆抗体可以是非人的、人的或人源化的。该术语具体包括“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与对应的衍生自一个特定种类的抗体或属于一个特定抗体种类或亚类的序列相同或同源，而该一个或多个链的其余部分是与衍生自另一个种类的抗体的或属于另一个抗体种类或亚类的抗体连同此种抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们特异性结合靶抗原和/或表现出所需的生物活性即可。
本文使用的术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。该术语包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均衍生自人源序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自此类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人,(2000),J Mol Biol；296(1):57-86所述。免疫球蛋白可变结构域例如CDR的结构和位置可以使用熟知的编号方案来定义，例如Kabat编号方案、Chothia编号方案、或Kabat和Chothia的组合、和/或ImMunoGenTics(IMGT)编号方案。本发明的人抗体可以包含不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变、或通过在体内体细胞突变、或保守取代来引入突变以促进稳定性或生产)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一种哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已被移植到人框架序列中的抗体。
本文所用的术语“重组人抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，如从动物(例如，小鼠)(所述动物对于人免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；从转化以表达人抗体的宿主细胞中(例如，从转染瘤中)分离的抗体；从重组组合的人抗体文库中分离的抗体；以及通过任何其他方式(其涉及全部或部分的人免疫球蛋白基因、其他DNA序列的序列的剪接)制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中框架区和CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方案中，这种重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自人种系VH和VL序列并与之相关，但在体内可能不天然存在于人抗体种系库内。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两个或更多个物种的抗体。在一些情况下，重链和轻链的可变区对应于具有所期望特异性、亲和力和活性的衍生自一个物种的抗体的可变区，而恒定区与衍生自另一个物种(例如人)的抗体同源，以最小化后者物种中的免疫应答。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含来自非人(例如，鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体是一种类型的嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最少序列。总体上，人源化抗体将包括至少一个、并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环相应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的框架(FR)区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还任选地包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。可以通过在Fv框架区中和/或在替换的非人残基内的残基的取代来进一步修饰人源化抗体，以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或活性。
如本文所用，术语“Fc区”是指包含抗体恒定结构域的CH3、CH2和至少一部分铰链区的多肽。任选地，Fc区可以包括存在于一些抗体类别中的CH4结构域。Fc区可包含抗体恒定结构域的整个铰链区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含抗体的Fc区和CH1区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含抗体的Fc区CH3区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含来自抗体恒定结构域的Fc区、CH1区和κ/λ区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含恒定区，例如重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施方案中，与野生型恒定区相比，这样的恒定区被修饰。也就是说，多肽可以包含对三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)和/或轻链恒定区(CL)中的一个或多个的改变或修饰。示例性修饰包括一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。可以包括此类改变以优化效应子功能、半衰期等。
如本文关于抗体或抗原结合片段所使用的“内化”是指抗体或抗原结合片段在与细胞结合后能够穿过细胞的脂质双层膜进入内部隔室(即，“内化”)，优选进入细胞中的降解隔室中。例如，内化抗EphA2抗体是一种在与细胞膜上的EphA2结合后能够被摄入细胞的抗体。在一些实施方案中，本文公开的ADC中使用的抗体或抗原结合片段靶向细胞表面抗原(例如，EphA2)并且是内化抗体或内化抗原结合片段(即，抗原结合后，ADC转移通过细胞膜)。在一些实施方案中，内化抗体或抗原结合片段结合细胞表面上的受体。靶向细胞膜上受体的内化抗体或内化抗原结合片段可以诱导受体介导的内吞作用。在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合片段通过受体介导的胞吞作用被摄入细胞中。
如本文所用，关于抗体或抗原结合片段的“非内化”是指在与细胞结合后保留在细胞表面的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本文公开的ADC中使用的抗体或抗原结合片段靶向细胞表面抗原并且是非内化抗体或非内化抗原结合片段(即，ADC保留在细胞表面并且抗原结合后不转移通过细胞膜)。在一些实施方案中，非内化抗体或抗原结合片段结合非内化受体或其他细胞表面抗原。
术语“EPH受体A2”、“ephrin型A受体2”或“EphA2”如本文所用，是指任何天然形式的人EphA2。该术语包括全长人EphA2(例如，UniProt参考序列：NP_004422.2；SEQ ID NO:61)，以及由细胞加工产生的任何形式的人EphA2。该术语还包括人EphA2的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和保留人EphA2的一种或多种生物功能的同种型(即，变体和片段也包括在内，除非上下文指出该术语仅用于指野生型蛋白质)。EphA2可以从人中分离，或可以重组或通过合成方法产生。
如本文所用，术语“抗EphA2抗体”或“结合EphA2的抗体”是指结合(例如特异性结合)EphA2的任何形式的抗体或其抗原结合片段。该术语涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和生物学功能性抗原结合片段，只要它们与EphA2结合，例如特异性结合。WO2007/030642提供了示例性EphA2结合序列，包括示例性抗EphA2抗体序列，并通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文公开的ADC中使用的抗EphA2抗体是内化抗体或内化抗原结合片段。1C1(WO2007/030642)是示例性抗EphA2抗体。
如本文所用，术语“结合特异性”是指个体抗体或抗原结合片段相对于不同抗原决定簇优先与一个抗原决定簇反应的能力。特异性程度表示抗体或片段相对于不同抗原决定簇优先结合一个抗原决定簇的程度。此外，如本文所用，术语“特异性”、“特异性结合”和“特异性地结合”是指抗体或抗原结合片段(例如，抗EphA2抗体)和蛋白质和其他生物制品的异质群体中的靶抗原(例如，EphA2)之间的结合反应。可通过在给定条件集下比较与适当抗原的结合以及与无关抗原或抗原混合物的结合来测试抗体的结合特异性。如果抗体与适当抗原的结合亲和力比与不相关抗原或抗原混合物的亲和力高至少2、5、7、10或更多倍，则认为它是特异性的。“特异性抗体”或“靶特异性抗体”是仅结合靶抗原(例如，EphA2))，但不结合(或表现出最小结合)其他抗原的抗体。在一些实施方案中，特异性结合靶抗原(例如，EphA2)的抗体或抗原结合片段具有小于1x10-6M、小于1x10-7M、小于1x10-8M、小于1x10-9M、小于1x10-10M、小于1x10-11M、小于1x10-12M、或小于1x10-13M的KD。在一些实施方案中，KD为1pM至500pM。在一些实施方案中，KD在500pM至1μM、1μM至100nM或100mM至10nM之间。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体和抗原在单个抗原位点处相互作用的强度。不受理论的束缚，在每个抗原结合位点内，抗体“臂”的可变区在多个位点通过弱非共价力与抗原相互作用；相互作用越多，通常亲和力就越强。抗体的结合亲和力是抗原决定簇和抗体结合位点之间作用的吸引力和排斥力的总和。
术语“kon”或“ka”是指抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。可以使用标准测定法来确定该速率，例如表面等离子共振、生物层干涉测量法或ELISA测定法。
术语“koff”或“kd”是指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。可以使用标准测定法来确定该速率，例如表面等离子共振、生物层干涉测量法或ELISA测定法。
术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。KD通过ka/kd计算。可以使用标准测定法来确定该速率，例如表面等离子共振、生物层干涉测量法或ELISA测定法。
术语“表位”是指能够被抗体(或抗原结合片段)识别并特异性结合的抗原部分。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链)组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。当抗原是多肽时，可以由连续氨基酸或多肽的三级折叠并列的非连续氨基酸形成表位。表位可以是“线性的”或“构象的”。构象表位和线性表位的区别在于在变性溶剂的存在下丧失与前者而不是后者的结合。可以使用本领域已知的任何表位作图技术来鉴定抗体(或抗原结合片段)结合的表位，包括通过直接观察抗原-抗体复合物进行表位鉴定的X射线结晶学，以及监测抗体与抗原片段或突变变体的结合，或监测抗体和抗原不同部分的溶剂可及性。用于作图定位抗体表位的示例性策略包括但不限于基于阵列的寡肽扫描、有限蛋白水解、定点诱变、高通量诱变作图、氢-氘交换和质谱分析(参见，例如，Gershoni等人(2007)BioDrugs21:145-56；以及Hager-Braun和Tomer(2005)Expert Rev Proteomics 2:745-56)。
竞争性结合和表位分箱也可用于确定共享相同或重叠表位的抗体。可以使用交叉阻断测定来评估竞争性结合，例如“Antibodies,A Laboratory Manual,”Cold SpringHarbor Laboratory,Harlow and Lane(第1版1988,第2版2014)中描述的测定。在一些实施方案中，当测试抗体或结合蛋白在交叉阻断试验中减少参照抗体或结合蛋白与靶抗原如EphA2(例如，包含CDR和/或选自表C-D中鉴定的可变结构域的结合蛋白)的结合至少约50％(例如，50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或更多，或其间的任何百分比)，则鉴定为竞争性结合，和/或反之亦然。在一些实施方案中，竞争性结合可能是由于共享或相似(例如，部分重叠)表位，或由于空间位阻，其中抗体或结合蛋白在附近表位处结合(参见，例如，Tzartos,Methods in Molecular Biology(Morris编辑(1998)第66卷，第55-66页))。在一些实施方案中，竞争性结合可用于分选共享相似表位的结合蛋白组。例如，竞争结合的结合蛋白可以被“分箱”为一组具有重叠或附近表位的结合蛋白，而那些不竞争的结合蛋白则被放置在不具有重叠或附近表位的单独的结合蛋白组中。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语涵盖包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。该术语包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。该术语还包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。除非另有说明，特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体。
“重组”蛋白质是指使用重组技术(例如通过重组核酸的表达)制备的蛋白质(例如抗体)。
“分离的”蛋白质是指不伴有至少一些在其天然状态下通常与其相关的物质的蛋白质。例如，存在于活生物体中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但与活生物体中的一些或全部共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是分离的。该定义包括在本领域已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体。
本文所用的“分离的抗体”是已经从其来源环境的一种或多种(例如，大部分)组分(按重量计)中，例如从杂交瘤细胞培养物或用于其生产的不同细胞培养物的组分中，鉴定并分离的抗体。在一些实施方案中，进行分离以使其充分去除否则可能干扰抗体对于所需应用(例如，用于治疗用途)的适用性的组分。用于制备分离的抗体的方法是本领域已知的，并且包括但不限于蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、病毒截留过滤和超滤。
如本文所用，术语“变体”是指分别不同于参考核酸序列或氨基酸序列，但保留参考序列的一种或多种生物学特性的核酸序列或氨基酸序列。变体可含有相对于参考序列的一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入(或相应的密码子取代、缺失和/或插入)。核酸变体的变化可能不会改变参考核酸序列编码的肽的氨基酸序列，或者可能导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和/或截短。在一些实施方案中，本文公开的核酸变体编码与未修饰的核酸编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者编码保留未修饰的氨基酸序列的一种或多种功能特性的经修饰的氨基酸序列。肽变体序列的变化通常是有限的或保守的，因此未修饰的肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域中是相同的。在一些实施方案中，肽变体保留未修饰的肽序列的一种或多种功能特性。变体和未修饰的肽在氨基酸序列上可以因任意组合的一个或多个取代、添加、缺失而不同。
核酸或肽的变体可以是天然存在的变体或未知天然存在的变体。核酸和肽的变体可以通过诱变技术、通过直接合成或通过本领域已知的其他技术来制备。变体不一定需要对参考序列进行物理操作。只要序列与参考序列相比包含不同的核酸或氨基酸，则无论它是如何合成的，它都被认为是“变体”。在一些实施方案中，与参考序列相比，变体具有高序列同一性(即，60％核酸或氨基酸序列同一性或更高)。在一些实施方案中，肽变体包括具有氨基酸取代、缺失和/或插入的多肽，只要所述多肽与参考序列或参考序列的相应片段(例如，功能片段)(例如，那些还保留参考序列的一种或多种功能的变体)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，核酸变体涵盖具有氨基酸取代、缺失和/或插入的多核苷酸，只要该多核苷酸与参考序列或参考序列的相应片段(例如，功能片段)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％核酸序列同一性。
术语‘经保守修饰的变体’适用于氨基酸和核酸序列两者。对于核酸序列，经保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置处，密码子可以改变为所描述的任何相应密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是经保守修饰的变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每种沉默变异。对于多肽序列，经保守修饰的变体包括对多肽序列的单个取代、缺失或添加，从而使某个氨基酸取代为化学上类似的氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代是本领域众所周知的。
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变例如含有氨基酸序列的抗体或抗原结合片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入抗体或抗原结合片段中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在一些实施方案中，抗体内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文描述的功能测定来测试改变的抗体。
如本文所用，术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数目的直接函数。例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是匹配或同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性”的百分比，其中比较窗口中的氨基酸序列的片段可以包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(例如，缺口或突出端)以使两个序列最佳比对。可以通过以下方法计算该百分比：测定在这两个序列中出现相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数，将该匹配位置数除以该比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。输出是主题序列相对于查询序列的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是这两个序列共有的相同位置数目的函数，考虑缺口数、每个缺口的长度，它们需要被引入以进行两个序列的最佳比对。一般而言，本文公开的蛋白质及其变体，包括靶抗原的变体(例如EphA2)和抗体可变结构域的变体(包括单个变体CDR)之间的氨基酸同一性或同源性与本文描述的序列具有至少80％，例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、几乎100％或100％的同一性或同源性。
可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定。在一些实施方案中，使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-53)算法(所述算法已并入GCG软件包中的GAP程序中)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。在一些实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。一组示例性参数是Blossum 62评分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。也可使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)中的Meyers和Miller((1989)CABIOS 4:11-17)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。
术语“药剂”在本文中用于指化合物、化合物的混合物、生物大分子、由生物材料制成的提取物或其两种或更多种的组合。术语“治疗剂”或“药物”是指能够调节生物过程和/或具有生物活性的药剂。如本文所述的Bcl-xL抑制剂和包含它们的ADC是示例性治疗剂。
术语“化学治疗剂”或“抗癌剂”在本文中用于指不管作用机制如何，均有效治疗癌症的所有药剂。抑制转移或血管生成通常是化疗剂的特性。化疗剂包括抗体、生物分子和小分子，并且涵盖Bcl-xL抑制剂和包含它们的ADC，如本文所述。化疗剂可以是细胞毒性剂或细胞抑制剂。术语“细胞抑制剂”是指抑制或抑制细胞生长和/或细胞增殖的药剂。术语“细胞毒性剂”是指主要通过干扰细胞的表达活性和/或功能而导致细胞死亡的物质。
如本文所用，术语“特大B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma-extra large)”或“Bcl-xL”是指人Bcl-xL的任何天然形式，Bcl-xL是Bcl-2蛋白家族的抗凋亡成员。该术语涵盖全长人Bcl-xL(例如，UniProt参考序列：Q07817-1)，以及可能由细胞加工产生的任何形式的人Bcl-xL。该术语还包括人Bcl-xL的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和保留人Bcl-xL的一种或多种生物功能的同种型(即，变体和片段也包括在内，除非上下文指出该术语仅用于指野生型蛋白质)。Bcl-xL可以从人中分离，或者可以重组或通过合成方法产生。
如本文所用，术语“抑制”意指以可测量的量减少生物活性或过程，并且可以包括但不要求完全预防或抑制。在一些实施方案中，“抑制”意指降低Bcl-xL和/或其一种或多种上游调节剂或下游靶标的表达和/或活性。
本文使用的术语“Bcl-xL抑制剂”是指能够降低Bcl-xL和/或其一种或多种上游调节剂或下游靶标的表达和/或活性的药剂。示例性Bcl-xL调节剂(包括示例性Bcl-xL抑制剂)描述于WO2021/018858、WO2021/018857、WO2010/080503、WO2010/080478、WO2013/055897、WO2013/055895、WO2016/094509、WO2016/094517、WO2016/094505、Tao等人,ACSMedicinal Chemistry Letters(2014),5(10),1088-109和Wang等人,ACS MedicinalChemistry Letters(2020),11(10),1829-1836，每一篇都通过引用并入本文作为示例性Bcl-xL调节剂，包括示例性Bcl-xL抑制剂，其可以作为药物部分包含在本公开的ADC中。
如本文所用，“Bcl-xL抑制剂药物部分”、“Bcl-xL抑制剂”等是指ADC或组合物的组分，其提供Bcl-xL抑制剂化合物或经修饰以附接至ADC的化合物的结构，其与原始化合物相比保留基本上相同、相似或增强的生物功能或活性。在一些实施方案中，Bcl-xL抑制剂药物部分是式(1)的ADC中的组分(D)。
本文所用的术语“癌症”是指具有致癌细胞的典型特征的细胞的存在，例如不受控制的增殖、永生性、转移潜力、快速生长和增殖速率、和/或某些形态学特征。通常，癌细胞可以呈肿瘤或肿块的形式，但此类细胞可以单独存在于受试者体内，或可以作为独立细胞在血流中循环，例如白血病或淋巴瘤细胞。术语“癌症”包括所有类型的癌症和癌症转移，包括血液癌症、实体瘤、肉瘤、癌和其他实体和非实体瘤癌症。血液癌症可包括B细胞恶性肿瘤、血液癌症(白血病)、浆细胞癌症(骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤)或淋巴结癌症(淋巴瘤)。示例性B细胞恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤。白血病可包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒单核细胞性白血病(CMML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)等。术语“急性淋巴细胞性白血病”和“急性淋巴细胞性白血病”可以互换使用来描述ALL。淋巴瘤可包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等。其他血液癌症可以包括骨髓增生异常综合征(MDS)。实体瘤可包括癌，例如腺癌，例如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌或结直肠癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌、神经胶质瘤、黑色素瘤等。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
如本文所用，术语“肿瘤”是指由过度细胞生长或增殖产生的任何组织块，无论是良性的还是恶性的，包括癌前病变。在一些实施方案中，肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，肿瘤是胃癌。
术语“肿瘤细胞”和“癌细胞”在本文中可以互换使用，并且指源自肿瘤或癌症的单个细胞或细胞总群，包括非致瘤细胞和癌症干细胞。当仅指那些缺乏更新和分化能力的细胞以将这些细胞与癌症干细胞区分开来时，术语“肿瘤细胞”和“癌细胞”将被术语“非致瘤性”修饰。
如本文所用，术语“靶阴性”、“靶抗原阴性”或“抗原阴性”是指细胞或组织不存在靶抗原表达。术语“靶阳性”、“靶抗原阳性”或“抗原阳性”是指存在靶抗原表达。例如，不表达靶抗原的细胞或细胞系可被描述为靶阴性，而表达靶抗原的细胞或细胞系可被描述为靶阳性。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，是指需要治疗的任何人或非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如，哺乳动物和非哺乳动物)，例如任何哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人、黑猩猩、猿、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、大鼠、小鼠和豚鼠。非哺乳动物的非限制性实例包括鸟类和鱼。在一些实施方案中，受试者是人。
本文所用的术语“需要治疗的受试者”是指将从治疗(例如，用本文所述的任何一种或多种示例性ADC化合物进行的治疗)中在生物学、医学或生活质量方面受益的受试者。
本文所用的术语“治疗”是指疾病、障碍或病症的任何后果的任何改善，例如延长存活、降低发病率和/或减轻副作用，来自替代治疗方式的结果。在一些实施方案中，治疗包括延迟或改善疾病、障碍或病症(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在一些实施方案中，治疗包括延迟、减轻或改善疾病、障碍或病症的至少一种身体参数，包括患者可能无法辨别的那些。在一些实施方案中，治疗包括在身体上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或两者上调节疾病、障碍或病症。在一些实施方案中，治疗包括向受试者(例如患者)施用所述ADC化合物或组合物以获得本文列举的治疗益处。治疗可以是治愈、愈合、缓解、延迟、预防、减轻、改变、补救、改善、缓和、改进或影响疾病、障碍或病症(例如，癌症)、疾病、障碍或病症(例如，癌症)的症状，或对疾病、障碍或病症(例如，癌症)的易感性。在一些实施方案中，除了治疗患有疾病、障碍或病症的受试者之外，还可以预防性地提供本文公开的组合物以预防或降低发生该疾病、障碍或病症的可能性。
如本文所用，疾病、障碍或病症的术语“预防”是指疾病、障碍或病症的预防性治疗；或延缓疾病、障碍或病症的发作或进展。
如本文所用，“药物组合物”是指组合物的制剂，例如ADC化合物或组合物，以及至少一种适合施用于受试者的其他(和任选地多于一种其他)组分，例如药学上可接受的载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。本文提供的药物组合物采用允许施用并随后提供活性成分的预期生物活性和/或实现治疗效果的形式。本文提供的药物组合物优选不包含对于将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”和“生理学上可接受的载剂”可互换使用，是指不会对受试者造成显著刺激且不会消除所施用的ADC化合物或组合物和/或组合物中任何另外治疗剂的生物活性和性质的载剂或稀释剂。药学上可接受的载剂可以增强或稳定组合物或可以用于促进组合物的制备。药学上可接受的载剂可包括溶剂、分散体介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料和类似物及其组合，以上是如本领域普通技术人员已知的(参见，例如Remington’s PharmaceuticalSciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289至1329页)。除非任何常规载剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗或药物组合物中的用途。可选择载剂以使受试者中的不利副作用最小化，和/或使活性成分的降解最小化。佐剂也可以包含在任何这些制剂中。
如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。用于肠胃外施用的制剂可以例如包含赋形剂例如无菌水或盐水、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物油或氢化萘。其他示例性赋形剂包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和各类型淀粉、纤维素衍生物、明胶、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指不会消除本发明化合物的生物活性和性质，并且不会对其施用的受试者造成显著刺激的盐。此类盐的实例包括但不限于：(a)与无机酸形成的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；以及与有机酸形成的盐，例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；以及(b)由元素阴离子如氯、溴和碘形成的盐。例如，参见Haynes等人,“Commentary:Occurrence of Pharmaceutically Acceptable Anions and Cations in the CambridgeStructural Database,”J.Pharmaceutical Sciences,vol.94,no.10(2005),和Berge等人,“Pharmaceutical Salts,”J.Pharmaceutical Sciences,vol.66,no.1(1977)，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，根据其电荷，本文所述的抗体-药物缀合物(ADC)、接头、负载和接头-负载可以含有单价阴离子抗衡离子M1 -。可以使用任何合适的阴离子抗衡离子。在某些实施方案中，单价阴离子抗衡离子是药学上可接受的单价阴离子抗衡离子。在某些实施方案中，单价阴离子抗衡离子M1 -可以选自溴离子、氯离子、碘离子、乙酸根、三氟乙酸根、苯甲酸根、甲磺酸根、甲苯磺酸根、三氟甲磺酸根、甲酸根等。在一些实施方案中，单价阴离子抗衡离子M1 -为三氟乙酸根或甲酸根。
本文所用的术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指本文所述的化合物(例如本文所述的ADC化合物或组合物)的量，该量能够实现所需的治疗结果(即，减少或抑制酶或蛋白质活性的改善、症状的改善、症状或病症的减轻、疾病进展的延迟、肿瘤大小的减小、肿瘤生长的抑制、转移的预防)。在一些实施方案中，治疗有效量不会诱导或不引起不期望的副作用。在一些实施方案中，治疗有效量诱导或引起副作用，但仅是治疗临床医生考虑到患者状况可接受的那些副作用。在一些实施方案中，治疗有效量对于可检测地杀伤、减少和/或抑制癌细胞的生长或扩散、肿瘤的大小或数量、和/或癌症的水平、阶段、进展和/或严重性的其他测量是有效的。该术语还适用于在靶细胞中诱导特定应答的剂量，例如细胞生长的减少、减慢或抑制。可以通过首先施用低剂量并且随后递增地增加所述剂量直至实现所期望效果来确定治疗有效量。治疗有效量也可以根据预期的应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况而变化，例如受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。具体的量可以根据例如特定的药物组合物、受试者及其年龄和现有的健康状况或健康状况的风险、要遵循的给药方案、疾病的严重程度、是否与其他药物联合施用、施用时机、施用的组织和携带它的物理递送系统而变化。在癌症的情况下，治疗有效量的ADC可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤大小、抑制(例如，减缓或停止)肿瘤转移、抑制(例如，减缓或停止)肿瘤生长，和/或缓解一种或多种症状。
本文所用的术语“预防有效量”或“预防有效剂量”是指本文公开的化合物(例如本文所述的ADC化合物或组合物)在必要的剂量和时间段内有效达到所期望预防效果的量。通常，由于预防剂量在疾病之前或疾病早期阶段用于受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。在一些实施方案中，预防有效量可以预防疾病症状的发作，包括与癌症相关的症状。
术语“p”或“药物负载”或“药物:抗体比率”或“药物与抗体比率”或“DAR”是指药物部分的数量/抗体或抗原结合片段，即药物负载量，或式(1)的ADC中的-L-D部分的数量/抗体或抗原结合片段(Ab)。在包含Bcl-xL抑制剂药物部分的ADC中，“p”是指与抗体或抗原结合片段连接的Bcl-xL抑制剂化合物的数量。例如，如果两个Bcl-xL抑制剂化合物连接至抗体或抗原结合片段，则p＝2。在包含式(1)的ADC的多个拷贝的组合物中，“平均p”是指-L-D部分的平均数量/抗体或抗原结合片段，也称为“平均药物负载”。
抗体-药物缀合物
本公开的抗体-药物缀合物(ADC)化合物包括具有抗癌活性的那些。具体地，ADC化合物包括与药物部分(例如，Bcl-xL抑制剂)缀合(即，通过接头共价附接)的抗体或抗原结合片段，其中药物部分在未与抗体或抗原结合片段缀合时具有细胞毒性或细胞抑制作用。在一些实施方案中，药物部分在未缀合至抗体或抗原结合片段时能够降低Bcl-xL和/或其一种或多种上游调节剂或下游靶标的表达和/或活性。不受理论的束缚，在一些实施方案中，通过靶向Bcl-xL表达和/或活性，本文公开的ADC可以提供有效的抗癌剂。而且，不受理论的束缚，通过将药物部分缀合至结合与肿瘤细胞或癌症中的表达相关的抗原的抗体，ADC可以提供改善的活性、更好的细胞毒性特异性和/或减少的脱靶杀伤，如与单独施用时的药物部分相比。
因此，在一些实施方案中，选择ADC的组分以(i)保留抗体和药物部分单独表现出的一种或多种治疗特性，(ii)维持抗体或抗原结合片段的特异性结合特性；(iii)优化药物负载和药物抗体比；(iv)允许经由稳定附接至抗体或抗原结合片段而递送(例如，细胞内递送)药物部分；(v)保持ADC作为完整缀合物的稳定性直至转运或递送至靶位点为止；(vi)将施用之前或之后的ADC的聚集减至最少；(vii)在细胞环境中的切割或其他释放机制之后，允许实现药物部分的治疗作用(例如细胞毒性作用)；(viii)表现出类似于或优于分离的抗体和药物部分的体内抗癌治疗功效；(ix)使药物部分引起的脱靶杀伤最小化；和/或(x)表现出所期望的药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理/免疫特征。这些特性中的每一个都可以为治疗用途提供改进的ADC(Ab等人(2015)Mol Cancer Ther.14:1605-13)。
本公开的ADC化合物可以选择性地将有效剂量的细胞毒性剂或细胞生长抑制剂递送至癌细胞或肿瘤组织。在一些实施方案中，ADC的细胞毒性和/或细胞抑制活性取决于细胞中的靶抗原表达。在一些实施方案中，所公开的ADC对于杀伤表达靶抗原的癌细胞同时最小化脱靶杀伤特别有效。在一些实施方案中，所公开的ADC对不表达靶抗原的癌细胞不表现出细胞毒性和/或细胞抑制作用。
在某些方面，本文提供了ADC化合物，其包含抗EphA2抗体或其抗原结合片段(Ab)、Bcl-xL抑制剂药物部分(D)和将Ab共价附接至D的接头部分(L)。在一些实施方案中，本文提供了ADC化合物，其包含靶向癌细胞的抗体或其抗原结合片段(Ab)、Bcl-xL抑制剂药物部分(D)和将Ab共价附接至D的接头部分(L)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段能够例如以高特异性和高亲和力结合肿瘤相关抗原(例如，EphA2)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段在结合后内化至靶细胞中，例如内化至细胞中的降解区室中。在一些实施方案中，ADC在与靶细胞结合后内化、经历降解并释放Bcl-xL抑制剂药物部分以杀伤癌细胞。Bcl-xL抑制剂药物部分可以通过酶促作用、水解、氧化或任何其他机制从ADC的抗体和/或接头部分释放。
示例性ADC具有式(1)：
Ab-(L-D)p(1)
其中Ab＝抗EphA2抗体或抗原结合片段，L＝接头部分，D＝Bcl-xL抑制剂药物部分，并且p＝Bcl-xL抑制剂药物部分的数量/抗体或抗原结合片段。
A.抗体
在一些实施方案中，式(1)的抗EphA2抗体或抗原结合片段(Ab)特异性地结合细胞上的靶抗原。在一些实施方案中，式(1)的抗EphA2抗体或抗原结合片段(Ab)特异性地结合癌细胞上的靶抗原。在一些实施方案中，所述细胞或所述癌细胞表达EphA2。在一些实施方案中，靶抗原EphA2具有以下氨基酸序列：
<NCBI参考序列：NP_004422.2>
抗EphA2抗体或抗原结合片段可以以≤1mM、≤100nM或≤10nM或之间的任何量的解离常数(KD)结合靶抗原，如通过例如，分析测量的。在一些实施方案中，KD为1pM至500pM。在一些实施方案中，KD在500pM至1μM、1μM至100nM或100mM至10nM之间。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或抗原结合片段是四链抗EphA2抗体(也称为免疫球蛋白或全长或完整抗体)，包含两条重链和两条轻链。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或抗原结合片段是免疫球蛋白的抗EphA2抗原结合片段。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或抗原结合片段是免疫球蛋白的抗EphA2抗原结合片段，其保留结合靶癌抗原的能力和/或提供免疫球蛋白的至少一种功能。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或抗原结合片段是内化抗EphA2抗体或其内化抗EphA2抗原结合片段。在一些实施方案中，内化抗EphA2抗体或其内化抗EphA2抗原结合片段与细胞表面上表达的靶癌抗原结合并在结合后进入细胞。在一些实施方案中，在ADC进入并存在于表达靶癌抗原的细胞中之后(即，在ADC被内在化之后)，例如通过切割、通过抗体或抗原结合片段的降解或通过任何其他合适的释放机制，ADC的Bcl-xL抑制剂药物部分从ADC的抗EphA2抗体或抗原结合片段中释放出来。在一些实施方案中，所述癌症表达EphA2。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或无的突变。在一些实施方案中，这些突变被称为Fc的沉默、Fc沉默或Fc沉默突变。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被取代为A234和A235(也称为“LALA”)。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基N297被取代为A297(也称为“N297A”)。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基D265和P329被取代为A265和A329(也称为“DAPA”)。也可以使用其他抗体Fc沉默突变。在一些实施方案中，组合使用Fc沉默突变，例如D265A、N297A和P329A(也称为“DANAPA”)。
本披露的示例性抗EphA2抗体的氨基酸序列在表C和D中列出。
如本文所述，如果对抗EphA2抗体进行修饰，则用该修饰进一步指定它们。例如，如果抗EphA2抗体中的选定氨基酸已更改为半胱氨酸(例如，根据抗体重链的EU编号，E152C、S375C，以促进与接头-药物部分的缀合)，则它们被指定为“CysMab”；或，如果抗EphA2抗体已根据EU编号用IgG1恒定区的Fc沉默突变D265A、N297A和P329A进行修饰，则在抗体名称中添加“DANAPA”。如果抗EphA2抗体用于抗体药物缀合物，则它们使用以下格式命名：抗体名称-接头-负载。
表C.mAb CDR和可变区的氨基酸序列
表D.全长mAb IgG链的氨基酸和核酸序列
在一些实施方案中，本文公开的ADC的抗EphA2抗体或抗原结合片段可以包含上表中列出的任何重链和轻链可变结构域组或来自上表中列出的任何一组重链和轻链可变结构域的一组六个CDR。在一些实施方案中，本文公开的ADC的抗EphA2抗体或抗原结合片段可包含经保守修饰的氨基酸序列和/或与上表所列序列同源的氨基酸序列，只要ADC保留结合其靶癌抗原的能力(例如，KD小于1x10-8 M)并保留本文公开的ADC的一种或多种功能特性(例如，内化、结合抗原靶，例如肿瘤或其他癌细胞上表达的抗原等的能力)。
在一些实施方案中，本文公开的ADC的抗EphA2抗体或抗原结合片段还包含人重链和轻链恒定结构域或其片段。例如，所述ADC的抗EphA2抗体或抗原结合片段可以包含人IgG重链恒定结构域(例如IgG1)和人κ或λ轻链恒定结构域。在一些实施方案中，所述ADC的抗EphA2抗体或抗原结合片段包含人免疫球蛋白G亚型1(IgG1)重链恒定结构域及人Igκ轻链恒定结构域。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:2组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:12组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、以及由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:70组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:2组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:12组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:14组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:2组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:12组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:26组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:2组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:12组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:29组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:2组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:12组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:32组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:2组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:12组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:35组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:2组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:12组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:70组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、以及由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR3(LCDR3)。
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在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:27组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:30组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:33组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:36组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、以及由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:24组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:27组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:30组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:33组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:36组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:10组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、以及由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:10组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:10组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:24组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:10组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:27组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:10组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:30组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:10组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:33组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:10组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:4组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:15组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR2(LCDR2)、和由SEQ ID NO:36组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:11的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:11具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:19的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:19具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:20的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:20的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:20具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:21的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:21的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:21具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:22的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:22的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:22具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:23的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:23的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:23具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:25的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:25的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:25具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:28的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ IDNO:28的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:28具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:31的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:31的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:31具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:34的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:34的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:34具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:71的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:71的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:71具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:72的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:72的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:72具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:73的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列及SEQ ID NO:73的轻链可变区氨基酸序列或与公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:73具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列，以及SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ ID NO:77的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、或SEQ ID NO:77具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ ID NO:77的轻链氨基酸序列或与所公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ IDNO:77具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:41的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:41具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:41的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:41至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:43的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:43具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:43的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:43至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:45的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:45具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:45的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:45至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:47的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:47具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:47的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:47至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:49的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:49具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:49的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:49至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:51具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:51至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:53的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:53具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:53的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和轻链与SEQ ID NO:53至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:55的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:55具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:55的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和轻链与SEQ ID NO:55至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:57的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:57具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:57的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和轻链与SEQ ID NO:57至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:59的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:59具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:59的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和轻链与SEQ ID NO:59至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:75的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:75具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:75的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和轻链与SEQ ID NO:75至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:76的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:76具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:76的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和轻链与SEQ ID NO:76至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列或与SEQID NO:37具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:77的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:77具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:77的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:37至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和轻链与SEQ ID NO:77至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列或与SEQID NO:39具有至少95％同一性的序列，以及SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ ID NO:77的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、或SEQ ID NO:77具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ ID NO:77的轻链氨基酸序列或与所公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:39具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ IDNO:77具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列或与SEQID NO:39具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:41的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:41具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:41的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:39至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和轻链与SEQ ID NO:41至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:74的重链氨基酸序列或与SEQID NO:74具有至少95％同一性的序列，以及SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ ID NO:77的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、或SEQ ID NO:77具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:74的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ ID NO:77的轻链氨基酸序列或与所公开的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:74具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、或SEQ IDNO:77具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:74的重链氨基酸序列或与SEQID NO:74具有至少95％同一性的序列及SEQ ID NO:41的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:41具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:74的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:41的轻链氨基酸序列或与披露的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:74具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:41具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链氨基酸序列。
如果两个或更多个多肽中的残基占据多肽结构中的类似位置，则称这些残基“对应”。两个或更多个多肽中的类似位置可以通过基于氨基酸序列或结构相似性比对多肽序列来确定。本领域技术人员理解，可能需要在任一序列中引入空位以产生令人满意的比对。
在一些实施方案中，氨基酸取代是单个残基的。插入通常约为约1至约20个氨基酸残基，但只要保留生物功能(例如，与靶抗原结合)，可以容忍相当大的插入。缺失通常在约1至约20个氨基酸残基的范围内，尽管在一些情况下缺失可能大得多。取代、缺失、插入或其任何组合可用于得到最终衍生物或变体。通常这些变化在少数氨基酸上进行，从而将分子的改变，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性最小化。然而，在某些情况下，可以耐受更大变化。可以按照表2所示的图表进行保守取代。
表2
在变体抗体序列用于ADC的一些实施方案中，变体通常表现出相同定性的生物活性并将引发相同的免疫应答，尽管也可以根据需要选择变体来修饰抗原结合蛋白的特征。可替代地，可以设计变体以改变抗原结合蛋白的生物活性。例如，可以改变或去除糖基化位点。
各种抗体可以与本文所用的ADC一起使用以靶向癌细胞。如下所示，本文公开的ADC中的接头负载对于不同的肿瘤抗原靶向抗体出乎意料地有效。在癌细胞而非健康细胞上表达的合适抗原，或在癌细胞上以高于健康细胞的水平表达的合适抗原是本领域已知的，针对它们的抗体也是如此。本领域技术人员可以制备针对那些抗原靶标的其他抗体。这些抗体可以与本文公开的接头和Bcl-xL抑制剂负载一起使用。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段靶向EphA2提供了特定改进的药物:抗体比、聚集水平、稳定性(即，体外和体内稳定性)、肿瘤靶向性(即，细胞毒性、效力)、最小化脱靶杀伤和/或治疗功效。经改善的治疗功效可在活体外或活体内量测，且可包括经减慢的肿瘤生长速率和/或经减小的肿瘤体积。
在一些实施方案中，使用针对相同靶标的替代抗体或针对不同抗原靶标的抗体，并且提供至少一些上述有利的功能特性(例如，改进的稳定性、改进的肿瘤靶向性、改进的治疗功效等)。
接头
在一些实施方案中，ADC中的接头以足以具治疗有效性的方式具胞外稳定性。在一些实施方案中，接头在细胞外部稳定以使得ADC在存在于细胞外条件(例如，在转运或递送至细胞中之前)中时保持完整。在ADC上下文中使用的术语“完整”是指抗体或抗原结合片段保持附接于药物部分(例如，Bcl-xL抑制剂)。
如本文所用，在接头或包含接头的ADC的上下文中，“稳定”是指当ADC存在于细胞外条件下时，ADC样品中不超过20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约3％或不超过约1％的接头(或其间的任何百分比)被切割(或在整个ADC不完整的情况下)。在一些实施方案中，与替代性接头和/或具有替代性接头和/或Bcl-xL抑制剂负载的ADC相比，本文公开的接头和/或ADC是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的ADC可以保持完整超过约48小时、超过60小时、超过约72小时、超过约84小时或超过约96小时。
可例如通过在血浆中包括ADC达预先确定的时间段(例如，2、4、6、8、16、24、48或72小时)且随后定量血浆中存在的游离药物部分的量来确定接头在细胞外是否稳定。稳定性可以使ADC有时间定位到靶向癌细胞并防止药物部分过早释放，这可能会通过不加区别地损害正常组织和癌症组织来降低ADC的治疗指数。在一些实施方案中，接头在靶细胞外部稳定且一旦处于细胞内部则自ADC释放药物部分，使得药物可结合其靶标。因此，有效的接头将：(i)维持抗体或抗原结合片段的特异性结合特性；(ii)允许经由稳定附接至抗体或抗原结合片段而递送(例如，细胞内递送)药物部分；(iii)保持稳定和完整，直到ADC被运输或递送到其靶位点；以及(iv)允许切割或替代性释放机制之后的药物部分的治疗作用，例如，细胞毒性作用。
接头可能会影响ADC的物理化学性质。由于许多细胞毒性剂本质上是疏水性的，因此用另外的疏水部分将它们与抗体连接可能会导致聚集。ADC聚集体是不溶性的，通常会限制抗体上可实现的药物负载，这会对ADC的效力产生负面影响。一般来说，生物制品的蛋白质聚集体也与免疫原性增加有关。如下所示，本文公开的接头产生具有低聚集水平和期望的药物负载水平的ADC。
接头可以是“可切割的”或“不可切割的”(Ducry和Stump(2010)BioconjugateChem.21:5-13)。可切割接头被设计为在受到某些环境因素时(例如，当内化到靶细胞中时)释放药物部分(例如，Bcl-xL抑制剂)，而不可切割的接头通常依赖于抗体或抗原结合片段本身的降解。
如本文所使用的，术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，所述基团中不存在不饱和。如本文所使用的，术语“C1-C6烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，所述基团中不存在不饱和，具有从一个至六个碳原子，并且通过单键附接到分子的其余部分。“C1-C6烷基”基团的非限制性实例包括甲基(C1烷基)、乙基(C2烷基)、1-甲基乙基(C3烷基)、正丙基(C3烷基)、异丙基(C3烷基)、正丁基(C4烷基)、异丁基(C4烷基)、仲丁基(C4烷基)、叔丁基(C4烷基)、正戊基(C5烷基)、异戊基(C5烷基)、新戊基(C5烷基)和己基(C6烷基)。
如本文所使用的，术语“烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，所述基团包含至少一个双键。如本文所使用的，术语“C2-C6烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，所述基团包含至少一个双键，具有从两个至六个碳原子，通过单键附接到分子的其余部分。“C2-C6烯基”基团的非限制性实例包括乙烯基(C2烯基)、丙-1-烯基(C3烯基)、丁-1-烯基(C4烯基)、戊-1-基(C5烯基)、戊-4-基(C5烯基)、戊-1,4-二烯基(C5烯基)、六-1-烯基(C6烯基)、六-2-烯基(C6烯基)、六-3-烯基(C6烯基)、六-1-,4-二烯基(C6烯基)、六-1-,5-二烯基(C6烯基)和六-2-,4-二烯基(C6烯基)。如本文所使用的，术语“C2-C3烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，所述基团包含至少一个双键，具有从两个至三个碳原子，通过单键附接到分子的其余部分。“C2-C3烯基”基团的非限制性实例包括乙烯基(C2烯基)和丙-1-烯基(C3烯基)。
如本文所使用的，术语“亚烷基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，所述基团中不存在不饱和。如本文所使用的，术语“C1-C6亚烷基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，所述基团中不存在不饱和，具有从一个至六个碳原子。“C1-C6亚烷基”基团的非限制性实例包括亚甲基(C1亚烷基)、亚乙基(C2亚烷基)、1-甲基亚乙基(C3亚烷基)、正亚丙基(C3亚烷基)、异亚丙基(C3亚烷基)、正亚丁基(C4亚烷基)、异亚丁基(C4亚烷基)、仲亚丁基(C4亚烷基)、叔亚丁基(C4亚烷基)、正亚戊基(C5亚烷基)、异亚戊基(C5亚烷基)、亚新戊基(C5亚烷基)和亚己基(C6亚烷基)。
如本文所使用的，术语“亚烯基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，所述基团包含至少一个双键。如本文所使用的，术语“C2-C6亚烯基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，所述基团包含至少一个双键，并且具有从两个至六个碳原子。“C2-C6亚烯基”基团的非限制性实例包括亚乙烯基(C2亚烯基)、丙-1-亚烯基(C3亚烯基)、丁-1-亚烯基(C4亚烯基)、戊-1-亚烯基(C5亚烯基)、戊-4-亚烯基(C5亚烯基)、戊-1,4-二亚烯基(C5亚烯基)、己-1-亚烯基(C6亚烯基)、己-2-亚烯基(C6亚烯基)、己-3-亚烯基(C6亚烯基)、己-1-,4-二亚烯基(C6亚烯基)、己-1-,5-二亚烯基(C6亚烯基)和己-2-,4-二烯基(C6亚烯基)。如本文所用，术语“C2-C6亚烯基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，所述基团包含至少一个双键，并且具有从两个至三个碳原子。“C2-C3亚烯基”基团的非限制性实例包括亚乙烯基(C2亚烯基)和丙-1-亚烯基(C3亚烯基)。
如本文所使用的，术语“环烷基”、或“C3-C8环烷基”是指饱和、单环、稠合二环、稠合三环或桥接多环形环系统。稠合双环或桥连多环系统的非限制性实例包括双环[1.1.1]戊烷、双环[2.1.1]己烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[3.1.1]庚烷、双环[3.2.1]辛烷、双环[2.2.2]辛烷和金刚烷基。单环C3-C8环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
本文所用的术语“芳基”是指苯基、萘基、联苯基或茚基。
本文所用的术语“杂芳基”是指由5至10个环成员组成的任何单环基团或双环基团，其具有至少一个芳族部分并含有1至4个选自氧、硫和氮的杂原子(包括季氮)。
本文所用的术语“环烷基”是指含有3至10个环成员的任何单环或双环非芳族碳环基团，其可包括稠合、桥连或螺环系统。稠合双环或桥连系统的非限制性实例包括双环[1.1.1]戊烷、双环[2.1.1]己烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[3.1.1]庚烷、双环[3.2.1]辛烷和双环[2.2.2]辛烷。单环C3-C8环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
术语“杂环烷基”是指任何单环或双环非芳族碳环基团，由3至10个环成员组成，并且含有1至3个选自氧、硫、SO、SO2和氮的杂原子，应当理解，双环基团可以是稠合的或螺环类型的。C3-C8杂环烷基是指具有3至8个环碳原子的杂环烷基。杂环烷基可具有4至10个环成员。
术语亚杂芳基、亚环烷基、亚杂环烷基是指二价杂芳基、环烷基和杂环烷基。
本文所用的术语“卤代烷基”是指沿烃链被一个或多个卤素基团代替氢取代的直链或支链烷基链。适合在卤代烷基中取代的卤素基团的实例包括氟、溴、氯和碘。卤代烷基可包括用多个卤素基团取代烷基链中的氢，其中所述卤素基团可连接至烷基链中的相同碳或另一个碳。
如本文所用，烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基、芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基可任选地被1至4个选自以下的基团取代：任选取代的直链或支链(C1-C6)烷基、任选取代的直链或支链(C2-C6)烯基、任选取代的直链或支链(C2-C6)炔基、任选取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C1-C6)烷基-S-、羟基、氧代(或适当时的N-氧化物)、硝基、氰基、-C(O)-OR0’、-O-C(O)-R0’、-C(O)-NR0’R0”、-NR0’R0”、-(C＝NR0’)-OR0”、直链或支链(C1-C6)卤代烷基、三氟甲氧基、或卤素、其中R0’和R0”各自独立地是氢原子或任选取代的直链或支链(C1-C6)烷基、并且其中直链或支链(C1-C6)烷基的一个或多个碳原子任选地被氘代。
本文使用的术语“聚氧乙烯”、“聚乙二醇”或“PEG”是指由(OCH2CH2)基团组成的直链、支链或星形构型。在某些实施方案中，聚乙烯或PEG基团是-(OCH2CH2)t*-，其中t是1-40或4-40，并且其中“-”表示指向自分解间隔基的末端，“*-”表示与末端基团R'的附接点，其中R'是OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH。在其他实施方案中，聚乙烯或PEG基团是-(CH2CH2O)t*-，其中t是1-40或4-40，其中“-”表示指向自分解间隔基的末端，“*-”表示与末端基团R”的附接点，其中R”是H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH。例如，本文所用的术语“PEG12”是指t为12。
本文使用的术语“聚亚烷基二醇”是指由(O(CH2)m)n基团组成的直链、支链或星形构型。在某些实施方案中，聚乙烯或PEG基团是-(O(CH2)m)t*-，其中m是1-10，t是1-40或4-40，并且其中“-”表示指向自分解间隔基的末端，“*-”表示与末端基团R'的附接点，其中R'是OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH。在其他实施方案中，聚乙烯或PEG基团是-((CH2)mO)t*-，其中m是1-10，t是1-40或4-40，并且其中“-”表示指向自分解间隔基的末端，“*-”表示与末端基团R'的附接点，其中R'是H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH。
如本文所用，术语“反应性基团”是能够与抗体、抗体片段的官能团或附接于抗体或抗体片段的另一反应性基团形成共价键的官能团。此类官能团的非限制性实例包括本文提供的表3的反应性基团。
如本文所用，术语“附接基团”或“偶联基团”是指将桥连间隔基连接至抗体或其片段的二价部分。附接或偶联基团是通过反应性基团与抗体或其片段上的官能团之间的反应形成的二价部分。此类二价部分的非限制性实例包括本文提供的表3和表4中给出的二价化学部分。
本文所用的术语“桥连间隔基”是指共价附接在一起以形成二价部分的一个或多个接头组分，该二价部分将二价肽间隔基连接至反应性基团、将二价肽间隔基连接至偶联基团、或将附接基团连接至至少一个可切割基团。在某些实施方案中，“桥连间隔基”包含通过酰胺键附接至二价肽间隔基的N末端的羧基。
如本文所用，术语“间隔基部分”是指共价附接在一起以形成将自分解间隔基连接至亲水性部分的部分的一个或多个接头组分。
如本文所用，术语“二价肽间隔基”是指包含一个或多个共价附接在一起以形成将桥连间隔基连接至自分解间隔基的部分的氨基酸残基的二价接头。一个或多个氨基酸残基可以是选自丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨基酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、戊氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒代半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸和去甲基吡咯赖氨酸。
在某些实施方案中，“二价肽间隔基”是2至4个氨基酸残基的组合，其中每个残基独立地选自丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨基酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、戊氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒代半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸和去甲基吡咯赖氨酸，例如-ValCit*；-CitVal*；-AlaAla*；-AlaCit*；-CitAla*；-AsnCit*；-CitAsn*；-CitCit*；-ValGlu*；-GluVal*；-SerCit*；-CitSer*；-LysCit*；-CitLys*；-AspCit*；-CitAsp*；-AlaVal*；-ValAla*；-PheAla*；-AlaPhe*；-PheLys*；-LysPhe*；-ValLys*；-LysVal*；-AlaLys*；-LysAla*；-PheCit*；-CitPhe*；-LeuCit*；-CitLeu*；-IleCit*；-CitIle*；-PheArg*；-ArgPhe*；-CitTrp*；-TrpCit*；-PhePheLys*；-LysPhePhe*；-DPhePheLys*；-DLysPhePhe*；-GlyPheLys*；-LysPheGly*；-GlyPheLeuGly-[SEQ ID NO:62]；-GlyLeuPheGly-[SEQ ID NO:63]；-AlaLeuAlaLeu-[SEQ ID NO:64],-GlyGlyGly*；-GlyGlyGlyGly-[SEQ ID NO:65]；-GlyPheValGly-[SEQ ID NO:66]；和–GlyValPheGly-[SEQID NO:67]，其中“-”表示与桥连间隔基的附接点，“*”表示与自分解间隔基的附接点。
如本文所用，术语“接头组分”是指作为接头一部分的化学部分。接头组分的实例包括：亚烷基基团：-(CH2)n-，其可以是直链的或支链的(其中在这种情况下n是1-18)；亚烯基基团；亚炔基基团；烯基基团；炔基基团；乙二醇单元：-OCH2CH2-或-CH2CH2O-；聚乙二醇单元：(-CH2CH2O-)x(其中x在本例中为2-20)；-O-；-S-；羰基：-C(＝O)；酯：C(＝O)-O或O-C(＝O)；碳酸盐：-OC(＝O)O-；胺：-NH-；叔胺；酰胺：-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-或-C(＝O)N(C1-6烷基)；氨基甲酸酯：-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)O；脲：-NHC(＝O)NH；磺酰胺类：-S(O)2NH-或-NHS(O)2；醚：-CH2O-或–OCH2-；被一个或多个独立地选自羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸和膦酸酯的基团取代的亚烷基；被一个或多个独立地选自羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸和膦酸酯的基团取代的亚烯基；被一个或多个独立地选自羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸和膦酸酯的基团取代的亚炔基；C1-C10亚烷基，其中一个或多个亚甲基被一个或多个-S-、-NH-或-O-部分替换；具有两个可用附接点的环系统，例如选自苯基(包括1,2-、1,3-和1,4-二取代的苯基)、C5-C6杂芳基、C3-C8环烷基(包括1,1-二取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基、以及1,4-二取代的环己基)和C4-C8杂环烷基；选自以下的氨基酸残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨基酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、戊氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒代半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸和去甲基吡咯赖氨酸；2个或更多个氨基酸残基的组合，其中每个残基独立地选自如下氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨基酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、戊氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒代半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸和去甲基吡咯赖氨酸，例如Val-Cit；Cit-Val；Ala-Ala；Ala-Cit；Cit-Ala；Asn-Cit；Cit-Asn；Cit-Cit；Val-Glu；Glu-Val；Ser-Cit；Cit-Ser；Lys-Cit；Cit-Lys；Asp-Cit；Cit-Asp；Ala-Val；Val-Ala；Phe-Lys；Lys-Phe；Val-Lys；Lys-Val；Ala-Lys；Lys-Ala；Phe-Cit；Cit-Phe；Leu-Cit；Cit-Leu；Ile-Cit；Cit-Ile；Phe-Arg；Arg-Phe；Cit-Trp；和Trp-Cit；和自分解间隔基(immolative spacer)，其中所述自分解间隔基包含一个或多个对酸诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割、糖苷酶诱导的切割、磷酸二酯酶诱导的切割、磷酸酶诱导裂解、蛋白酶诱导裂解、脂肪酶诱导裂解或二硫键裂解敏感的保护(触发)基团。
这种自分解间隔基的非限制性实例包括：
其中：
PG是保护(触发)基团；
Xa是O、NH或S；
Xb是O、NH、NCH3或S；
Xc是O或NH；
Ya是CH2、CH2O或CH2NH；
Yb是CH2、O或NH；
Yc是键、CH2、O或NH，并且
LG是离去基团，例如本发明的接头-药物基团的药物部分(D)。
这种自分解间隔基的另外的非限制性实例描述于Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,7492–7509。
另外，接头组分可以是通过两个反应性基团之间的反应容易形成的化学部分。表3中给出了此类化学部分的非限制性实例。
表3
其中：表3中的R32为H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；表3中的R35为H、C1-6烷基、苯基或被1至3个-OH基取代的C1-4烷基；表3中的每个R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；表3中的R37独立地选自H、苯基和吡啶；表3中的q为0、1、2或3；表3中的R8和R13是H或甲基；表3中的R9和R14为H、-CH3或苯基；表3中的R是H或任何合适的取代基；并且
表3中的R50为H。
另外，接头组分可以是下表4中列出的基团。
表4.
如本文所用，当示出化合物的部分结构时，波浪线表示部分结构与分子的其余部分的附接点。
如本文所用，术语“自分解间隔基”和“自分解基团”是指包含一个或多个触发基团(TG)的部分，TG通过酸诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割、糖苷酶诱导的切割、磷酸二酯酶诱导的切割、磷酸酶诱导的切割、蛋白酶诱导的切割、脂肪酶诱导的切割或二硫键裂解而激活，并且在激活后，保护基团被去除，这会产生级联的分解反应，导致按时间顺序释放离去基团。这种级联反应可以是但不限于1,4-、1,6-或1,8-消除反应。
自分解间隔基或基团的非限制性实例包括：
其中这些基团可以任选地被取代，并且
其中：
TG是触发基团；
Xa是O、NH或S；
Xb是O、NH、NCH3或S；
Xc是O或NH；
Ya是CH2、CH2O或CH2NH；
Yb是CH2、O或NH；
Yc是键、CH2、O或NH，并且
LG是离去基团，例如本发明的接头-药物基团的药物部分(D)。
自分解间隔基的另外的非限制性实例描述于Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,7492–7509。
在某些实施方案中，自分解间隔基是具有以下结构的部分
其中Lp是可酶促切割的二价肽间隔基并且A、D、L3和R2如本文所定义。
在优选的实施方案中，自分解间隔基是具有以下结构的部分
其中Lp是可酶促切割的二价肽间隔基并且D、L3和R2如本文所定义。在一些实施方案中，D是含有季铵化叔胺的Bcl-xL抑制剂。
在其他优选的实施方案中，自分解间隔基是具有以下结构的部分
其中Lp是可酶促切割的二价肽间隔基并且D、L3和R2如本文所定义。
如本文所用，术语“亲水性部分”是指具有亲水性质的部分，当药物部分(D)附接至本发明的接头基团时，具有亲水性质的部分增加药物部分(D)的水溶解度。此类亲水基团的实例包括但不限于聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、被1至3个基团取代的C2-C6烷基的多肽。
药物部分
在一些实施方案中，作为接头部分的前体的中间体与药物部分(例如，Bcl-xL抑制剂)在适当的条件下反应。在一些实施方案中，在药物和/或中间体或接头上使用反应性基团。药物和中间体或衍生化药物(药物加接头)之间的反应产物随后在有利于药物和中间体或衍生化药物和抗体或抗原结合片段缀合的条件下与抗体或抗原结合片段反应。可替代地，中间体或接头可以首先与抗体或抗原结合片段、或衍生化抗体或抗原结合片段反应，然后与药物或衍生化药物反应。
许多不同的反应可用于将药物部分和/或接头部分共价附接至抗体或抗原结合片段。这通常通过抗体或抗原结合片段的一个或多个氨基酸残基的反应来完成，所述氨基酸残基包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基、半胱氨酸的巯基以及和芳族氨基酸的不同部分。例如，可以使用碳二亚胺反应进行非特异性共价附接，以将药物部分上的羧基(或氨基)基团连接至抗体或抗原结合片段上的氨基(或羧基)基团。另外，双官能试剂例如二醛或亚氨酸酯也可用于将药物部分上的氨基连接至抗体或抗原结合片段上的氨基。希夫碱(Schiff base)反应还可用于将药物(例如Bcl-xL抑制剂)附接至结合剂。该方法涉及含有二醇或羟基的药物的高碘酸盐氧化，从而形成醛，然后与结合剂反应。通过与结合剂的氨基形成希夫碱而发生附接。异硫氰酸酯也可用作将药物共价附接至结合剂的偶联剂。其他技术对于本领域技术人员来说是已知的并且在本公开的范围内。可以使用本领域已知的各种化学方法产生并连接至抗体或抗原结合片段的药物部分的实例包括Bcl-xL抑制剂，例如本文描述和例示的Bcl-xL抑制剂。
合适的药物部分可以包含式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(II)、(IIA)、(IIB)或(IIC)的化合物或对映异构体、非对映异构体和/或其与药学上可接受的酸或碱的加成盐。另外，药物部分可包含本文所述的Bcl-xL抑制剂(D)的任何化合物。
在一些实施方案中，药物部分(D)包含选自表A2的式。
在一些实施方案中，药物部分(D)包含本领域已知的Bcl-xL抑制剂，例如ABT-737和ABT-263。
在一些实施方案中，药物部分(D)包含选自以下的Bcl-xL抑制剂：
在一些实施方案中，接头-药物(或“接头-负载”)部分-(L-D)可包含表B中的化合物或任何前述的对映异构体、非对映异构体、氘代衍生物和/或药学上可接受的盐。
药物负载
药物负载由p表示，并且在本文中也称为药物比抗体比率(DAR)。药物负载可以是1至16个药物部分/抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，p是1至16的整数。在一些实施方案中，p是1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。在一些实施方案中，p是2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3的整数。在一些实施方案中，p是1至16的整数。在一些实施方案中，p是1至8的整数。在一些实施方案中，p是1至5的整数。在一些实施方案中，p是2至4的整数。在一些实施方案中，p是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，p是2。在一些实施方案中，p是4。
药物负载可能受到抗体或抗原结合片段上附接位点数量的限制。在一些实施方案中，ADC的接头部分(L)通过抗体或抗原结合片段上的一个或多个氨基酸残基上的化学活性基团附接至抗体或抗原结合片段。例如，接头可通过游离氨基、亚氨基、羟基、硫醇或羧基基团(例如，N-或C-末端、一个或多个赖氨酸残基的ε氨基基团、一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基团、或一个或多个半胱氨酸残基的巯基基团)与抗体或抗原结合片段附接。接头附接的位点可以是抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的天然残基，或它可以被引入到抗体或抗原结合片段中，例如，通过DNA重组技术(例如，通过将半胱氨酸残基引入到氨基酸序列中)或通过蛋白质生物化学(例如，通过还原、pH调节或水解)。
在一些实施方案中，可缀合至抗体或抗原结合片段的药物部分的数量受到游离半胱氨酸残基的数量限制。例如，在附接为半胱氨酸硫醇基团的情况下，抗体可具有仅一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或可具有仅一个或数个接头可经由其附接的具有足够反应性的硫醇基团。通常，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基团，这些基团可以与药物部分连接。事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基都涉及链间或链内二硫键。因此，在一些实施方案中，与半胱氨酸的缀合可能需要抗体的至少部分还原。接头-毒素与抗体的过量附接可通过还原可供用于形成二硫键的半胱氨酸残基来使抗体去稳定。因此，最佳的药物:抗体比率应当增加ADC的效能(通过增加每个抗体所附接的药物部分的数目)，同时不会使抗体或抗原结合片段不稳定。在一些实施方案中，最佳比率可以是2、4、6或8。在一些实施方案中，最佳比率可以是2或4。
在一些实施方案中，在缀合之前将抗体或抗原结合片段暴露于还原条件以产生一个或多个游离半胱氨酸残基。在一些实施方案中，可在部分或总体还原条件下用诸如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)等还原剂还原抗体以生成反应性半胱氨酸硫醇基团。不成对的半胱氨酸可以通过用有限摩尔当量的TCEP进行部分还原来产生，这可以还原连接轻链和重链(每个H-L配对一对)以及铰链区中两条重链(在人IgG1的情况下每个H-H配对两对)的链间二硫键，同时保持链内二硫键完整(Stefano等人(2013)Methods MolBiol.1045:145-71)。在实施方案中，抗体内的二硫键被电化学还原，例如通过使用施加交替的还原和氧化电压的工作电极。该方法可以允许二硫键还原与分析装置(例如，电化学检测装置、NMR分光计或质谱仪)或化学分离装置(例如，液相色谱仪(例如，HPLC)或电泳装置(参见，例如，US2014/0069822))在线偶联。在一些实施方案中，使抗体经历变性条件以显露出氨基酸残基(例如半胱氨酸)上的反应性亲核基团。
ADC的药物负载可以通过不同的方式控制，例如：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制缀合反应时间或温度；(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件；和/或(iv)通过重组技术改造抗体的氨基酸序列，从而修饰半胱氨酸残基的数量和位置，以控制接头-药物附接的数量和/或位置。
在一些实施方案中，将游离半胱氨酸残基引入抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中。例如，可以制备半胱氨酸工程改造抗体，其中亲本抗体的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸替代。任何形式的抗体都可以被如此工程改造，即突变。例如，亲本Fab抗体片段可以被工程改造以形成被称为“ThioFab”的半胱氨酸工程改造Fab。类似地，亲本单克隆抗体可以被工程改造以形成“ThioMab”。单位点突变在ThioFab中产生单个工程改造半胱氨酸残基，而由于IgG抗体的二聚体性质，单位点突变在ThioMab中产生两个工程改造半胱氨酸残基。编码亲本多肽的氨基酸序列变体的DNA可以通过本领域已知的多种方法来制备(参见例如WO 2006/034488中描述的方法)。这些方法包括但不限于通过对早期制备的编码多肽的DNA进行定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变进行制备。重组抗体的变体还可以通过限制性片段操作或通过使用合成寡核苷酸的重叠延伸PCR来构建。式(1)的ADC包括但不限于具有1、2、3或4个工程改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon等人(2012)MethodsEnzymol.502:123-38)。在一些实施方案中，一个或多个游离半胱氨酸残基已经存在于抗体或抗原结合片段中，无需使用工程改造，在这种情况下，存在的游离半胱氨酸残基可用于将抗体或抗原结合片段与药物部分偶联。
在包含抗体或抗原结合片段和接头部分的多个拷贝的反应混合物中，在超过一个亲核基团与药物-接头中间体或接头部分试剂反应、随后与药物部分试剂反应的情况下，所得产物可为ADC化合物的混合物，该混合物中分布有附接至混合物中的抗体或抗原结合片段的各拷贝的一个或多个药物部分。在一些实施方案中，由缀合反应得到的ADC混合物中的药物负载量在1至16个经附接的药物部分/抗体或抗原结合片段的范围内。药物部分的平均数目/抗体或抗原结合片段(即平均药物负载量或平均p)可通过此项技术中已知的任何常规方法，例如通过质谱分析(例如液相色谱-质谱法(LC-MS))和/或高效液相色谱(例如HIC-HPLC)来计算。在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段通过液相色谱-质谱法(LC-MS)测定。在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段的为约1.5至约3.5、约2.5至约4.5、约3.5至约5.5、约4.5至约6.5、约5.5至约7.5、约6.5至约8.5、或约7.5至约9.5。在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段为约2至约4、约3至约5、约4至约6、约5至约7、约6至约8、约7至约9、约2至约8、或约4至约8。
在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段为约2。在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段为约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4或约2.5。在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段为2。
在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段为约4。在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段为约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4或约4.5。在一些实施方案中，药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段为4。
在一些实施方案中，当关于药物部分的平均数量/抗体或抗原结合片段使用时，术语“约”意指正或负20％、15％、10％、5％或1％。在一个实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少10％的值范围。在另一个实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少5％的值范围。在另一个实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少1％的值范围。
各个ADC复合物或“种类”可在混合物中通过质谱法鉴定出且通过例如UPLC或HPLC(例如，疏水性相互作用色谱法(HIC-HPLC))分离。在一些实施方案中，具有单一负载值的均质或接近均质的ADC产物可例如通过电泳或色谱法自缀合混合物分离。
在一些实施方案中，较高的药物载量(例如p>16)可能导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性、或丧失细胞通透性。较高的药物负载还可能对某些ADC的药代动力学(例如清除率)产生负面影响。在一些实施方案中，较低的药物负载(例如，p<2)可以降低某些ADC针对靶标表达细胞的效力。在一些实施方案中，本公开的ADC的药物负载范围为约2至约16、约2至约10、约2至约8；约2至约6；约2至约5；约3至约5；约2至约4；或约4至约8。
在一些实施方案中，例如使用抗体或抗原结合片段上的链内二硫键的部分还原来实现约2的药物负载和/或平均药物负载，并且提供有益的性质。在一些实施方案中，例如使用抗体或抗原结合片段上的链内二硫键的部分还原来实现约4或约6或约8的药物负载和/或平均药物负载，并且提供有益的性质。在一些实施方案中，小于约2的药物负载和/或平均药物负载可能导致不可接受的高水平的未缀合抗体种类，其可以与ADC竞争结合靶抗原和/或提供减少的治疗功效。在一些实施方案中，超过约16的药物负载和/或平均药物负载可能导致不可接受的高水平的产品异质性和/或ADC聚集。由于稳定抗体或抗原结合片段所需的一个或多个化学键的损失，超过约16的药物负载和/或平均药物负载也可能影响ADC的稳定性。
本公开包括产生所描述的ADC的方法。简言之，ADC包含作为抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段、药物部分(例如，Bcl-xL抑制剂)、以及连接药物部分和抗体或抗原结合片段的接头。在一些实施方案中，可以使用具有用于共价附接至药物部分和抗体或抗原结合片段的反应性官能团的接头来制备ADC。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段被官能化以制备与接头或药物-接头中间体反应的官能团。例如，在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制备ADC。在一些实施方案中，用细菌转谷氨酰胺酶(BTG)-反应性谷氨酰胺制备抗体或抗原结合片段，所述反应性谷氨酰胺用含有环辛烯BCN(N-[(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧代辛烷)部分的胺特异性官能化。在一些实施方案中，进行接头或药物接头中间体与抗体或抗原结合片段的BCN部分的位点特异性缀合，例如，如本文描述和举例说明的。ADC的产生可以通过本领域技术人员已知的技术来完成。
在一些实施方案中，通过将抗体或抗原结合片段与接头和药物部分(例如Bcl-xL抑制剂)以顺序方式接触来产生ADC，使得抗体或抗原结合片段首先共价连接至接头，然后预先形成的抗体-接头中间体与药物部分反应。在接触药物部分之前，抗体-接头中间体可以经过或不经过纯化步骤。在其他实施方案中，通过使抗体或抗原结合片段与通过使接头与药物部分反应而预先形成的接头-药物化合物接触来产生ADC。在接触抗体或抗原结合片段之前，预先形成的接头-药物化合物可以进行或可以不进行纯化步骤。在其他实施方案中，抗体或抗原结合片段在一个反应混合物中接触接头和药物部分，允许抗体或抗原结合片段和接头之间以及接头和药物部分之间同时形成共价键。该产生ADC的方法可以包括反应，其中抗体或抗原结合片段在将接头添加至反应混合物之前接触抗体或抗原结合片段，反之亦然。在一些实施方案中，通过使抗体或抗原结合片段与接合至药物部分(例如Bcl-xL抑制剂)的接头在允许缀合的条件下反应来产生ADC。
根据上述方法制备的ADC可以进行纯化步骤。纯化步骤可涉及本领域已知的用于纯化蛋白质的任何生化方法或其方法的任何组合。这些包括但不限于切向流过滤(TFF)、亲和色谱、离子交换色谱、基于任何电荷或等电点的色谱、混合模式色谱，例如CHT(陶瓷羟基磷灰石)、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、透析、过滤、选择性沉淀或其任何组合。
治疗用途和组合物
本文公开了使用本文描述的组合物(例如公开的ADC化合物和组合物)来治疗受试者的障碍(例如癌症)的方法。组合物例如ADC可以单独施用或与至少一种另外的无活性剂和/或活性剂例如至少一种另外的治疗剂组合施用，并且可以以任何药学上可接受的制剂、剂量和给药方案施用。可以评估治疗效果的毒性以及功效指标并进行相应调整。功效测量包括但不限于体外观察到的细胞抑制和/或细胞毒性作用或体内、肿瘤体积减小、肿瘤生长抑制和/或延长存活。
确定ADC是否对细胞发挥细胞抑制作用和/或细胞毒性作用的方法是已知的。例如，ADC的细胞毒性或细胞抑制活性可以通过以下来测量：例如将表达ADC靶抗原的哺乳动物细胞暴露于细胞培养基中；将细胞培养约6小时至约6天的时间；并测量细胞活力(例如，使用CellTiter-(CTG)或MTT细胞活力测定)。基于细胞的体外测定也可用于测量ADC的活力(增殖)、细胞毒性和细胞凋亡诱导(半胱天冬酶激活)。
为了确定细胞毒性，可以测量坏死或细胞凋亡(程序性细胞死亡)。坏死通常伴随着质膜通透性增加、细胞肿胀和质膜破裂。例如，可以通过测量DNA片段化来定量细胞凋亡。商业光度法可用于定量体外DNA片段测定。此类测定法的实例，包括TUNEL(其检测片段化DNA中经标记的核苷酸的掺入)和基于ELISA的测定法，描述于Biochemica(1999)2:34-7(Roche Molecular Biochemicals)中。
细胞凋亡也可以通过测量细胞的形态变化来确定。例如，与坏死一样，质膜完整性的丧失可以通过测量某些染料(例如荧光染料，例如吖啶橙或溴化乙锭)的摄取来确定。以下描述了一种测量凋亡细胞数量的方法：Duke和Cohen,Current Protocols inImmunology(Coligan等人,编辑(1992)第3.17.1-3.17.16页)。细胞也可以用DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙啶)标记，并观察细胞沿内核膜的染色质凝缩和边集。在一些实施方案中，还可以通过筛选半胱天冬酶活性来确定细胞凋亡。在一些实施方案中，半胱天冬酶-测定可用于测量半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7的活性。在一些实施方案中，测定法在针对半胱天冬酶活性、荧光素酶活性和细胞裂解优化的试剂中提供发光半胱天冬酶-3/7底物。在一些实施方案中，以“添加-混合-测量”形式添加半胱天冬酶-3/7试剂可能导致细胞裂解，随后半胱天冬酶裂解底物并生成由荧光素酶产生的“发光型”发光信号。在一些实施方案中，发光可以与存在的半胱天冬酶活性的量成比例，并且可以充当细胞凋亡的指示剂。可以测量以确定细胞凋亡的其他形态变化包括例如细胞质凝缩、膜起泡增加和细胞收缩。确定这些对癌细胞的任何影响都表明ADC可用于治疗癌症。
可以例如通过测定细胞中染料例如中性红、台盼蓝、结晶紫或ALAMARTM蓝的摄取来测量细胞活力(参见例如Page等人(1993)Intl J Oncology 3:473-6)。在这样的测定中，将细胞在含有染料的培养基中孵育，洗涤细胞，并通过分光光度法测量反映细胞对染料的吸收的剩余染料。
还可以例如通过量化ATP(代谢活性细胞的指标)来测量细胞活力。在一些实施方案中，可以使用CellTiter-(CTG)细胞活力来评估制备的ADC或Bcl-xL抑制剂化合物的体外效力和/或细胞活力测定，如本文提供的实施方案中所述。在此测定中，在一些实施方案中，将单一试剂(CellTiter-试剂)直接添加至在补充血清的培养基中培养的细胞。添加试剂会导致细胞裂解并产生与存在的ATP量成比例的发光信号。ATP的量与培养物中细胞的数量成正比
还可以例如通过测量四唑盐的还原来测量细胞活力。在一些实施方案中，可以使用MTT细胞活力来评估制备的ADC或Bcl-xL抑制剂化合物的体外效力和/或细胞活力测定，如本文提供的实施方案中所述。在此测定中，在一些实施方案中，黄色四唑MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑溴化物)被代谢活性细胞部分地通过脱氢酶的作用还原，以产生减少NADH和NADPH等的当量。然后可以将所得的细胞内紫色甲臜溶解并通过分光光度法进行定量。
在某些方面，本公开内容的特征在于通过破坏Bcl-xL和/或其一种或多种上游调节剂或其下游靶标的表达和/或活性来杀伤、抑制或调节癌细胞或组织生长的方法。该方法可用于其中Bcl-xL表达和/或活性的破坏提供治疗益处的任何受试者。可以受益于破坏Bcl-xL表达和/或活性的受试者包括但不限于患有癌症或有风险患有癌症例如肿瘤或血液学癌症的受试者。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
在一些实施方案中，所公开的ADC可以在表达EphA2的任何细胞或组织中施用，例如表达EphA2的癌细胞或组织。示例性实施方案包括杀伤表达EphA2的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达EphA2的任何细胞或组织，例如癌细胞或转移性病变。表达EphA2的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌。表达EphA2的细胞的非限制性实例包括EBC-1细胞和包含编码EphA2或其部分的重组核酸的细胞。
示例性方法包括使细胞与有效量(即足以杀伤细胞的量)的ADC接触的步骤，如本文所述。该方法可用于培养的细胞，例如，体外、体内、离体、或原位。例如，表达EphA2的细胞(例如，通过肿瘤或转移性病变的活检收集的细胞；来自已建立的癌细胞系的细胞；或重组细胞)，可以在培养基中体外培养，并且可以通过向培养基中添加ADC来影响接触步骤。该方法将导致表达EphA2的细胞被杀伤，特别包括表达EphA2的癌细胞。可替代地，可以通过任何合适的施用途径(例如，静脉内、皮下或与肿瘤组织直接接触)将ADC施用给受试者以在体内发挥作用。
可以在合适的动物模型中评价所公开的ADC治疗组合物的体内效果。例如，可以使用异种癌症模型，其中将癌症外植体或传代的异种移植组织引入免疫受损的动物，例如裸鼠或SCID小鼠(Klein等人(1997)Nature Med.3:402-8)。可以使用测量肿瘤形成的抑制、肿瘤消退或转移等的测定法来预测功效。
体内测定法可评估细胞凋亡等机制对肿瘤死亡的促进作用。在一些实施方案中，可以检查来自用治疗组合物治疗的荷瘤小鼠的异种移植物中细胞凋亡灶的存在，并与未治疗的对照荷有异种移植物的小鼠进行比较。在治疗的小鼠的肿瘤中发现细胞凋亡灶的程度提供了组合物的治疗功效的指示。
本文进一步提供治疗障碍(例如癌症)的方法。本文描述的组合物，例如本文公开的ADC，可以出于治疗目的施用于非人哺乳动物或人受试者。该治疗方法包括向患有或疑似患有癌症的受试者施用治疗有效量的包含Bcl-xL抑制剂的组合物，例如ADC，其中抑制剂与结合抗原的靶向抗体相连，该抗原(1)在癌细胞上表达，(2)易于结合，和/或(3)与非癌细胞相比，定位于或主要表达于癌细胞表面。
示例性实施方案是治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，包括施用给受试者治疗有效量的本文公开的组合物，例如ADC、组合物或药物组合物(例如本文公开的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原。在一些实施方案中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
另一个示例性实施方案是将Bcl-xL抑制剂递送至表达EphA2的细胞的方法，该方法包括将Bcl-xL抑制剂与免疫特异性结合EphA2表位的抗体缀合并将细胞暴露于ADC。本公开的ADC指示的表达EphA2的示例性癌细胞包括乳腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞、食道癌细胞、头颈癌细胞、胃癌细胞、膀胱癌细胞、或结肠癌细胞。
在某些方面，本公开还提供减少或抑制肿瘤(例如，表达EphA2的肿瘤)生长的方法，所述方法包括施用治疗有效量的ADC或包含ADC的组合物。在一些实施方案中，治疗足以减少或抑制患者肿瘤的生长、减少转移性病灶的数量或大小、减少肿瘤负荷、减少原发性肿瘤负荷、减少侵袭性、延长存活时间和/或维持或改善生活质量。在一些实施方案中，当单独施用时，肿瘤对ADC的抗体或抗原结合片段(例如，抗EphA2抗体)的治疗具有抗性或难治性，和/或当单独施用时，肿瘤对Bcl-xL抑制剂药物部分的治疗具有抗性或难治性。
示例性实施方案是减少或抑制受试者中肿瘤生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如本文公开的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。在一些实施方案中，肿瘤表达靶抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌或脾癌。在一些实施方案中，肿瘤是胃癌。在一些实施方案中，肿瘤是乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌或结肠癌。在一些实施方案中，肿瘤是乳腺癌或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，ADC、组合物或药物组合物的施用将肿瘤的生长与不进行治疗的情况下的生长相比减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约，至少50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一个示例性实施方案是延迟或减慢受试者中肿瘤生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如本文公开的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。在一些实施方案中，肿瘤表达靶抗原。在一些实施方案中，肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，肿瘤是胃癌。在一些实施方案中，ADC、组合物或药物组合物的施用将肿瘤的生长与不进行治疗的情况下的生长相比延迟或减慢至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约，至少50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
在某些方面，本公开进一步提供减少或减缓癌细胞群体(例如，表达EphA2的癌细胞群)扩增的方法，该方法包括施用治疗有效量的ADC或包含ADC的组合物。
示例性实施方案是减少或减慢受试者体内癌细胞群扩增的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如本文公开的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。在一些实施方案中，癌细胞群表达靶抗原。在一些实施方案中，癌细胞群来自肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌细胞群来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病(包括急性淋巴细胞性白血病)、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌细胞群来自淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，ADC、组合物或药物组合物的施用使癌细胞群与没有治疗的群体相比减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施方案中，ADC、组合物或药物组合物的施用使癌细胞群的扩增与不进行治疗的情况下的扩增相比减慢至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
本文还提供了确定患有或疑似患有癌症的受试者是否会对使用所公开的ADC和组合物的治疗有应答的方法。示例性实施方案是通过以下来确定患有或疑似患有癌症的受试者是否会对用ADC、组合物或药物组合物(例如本文公开的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)进行治疗有应答的方法：提供来自受试者的生物样品；将样品与ADC接触；并且检测ADC与样品中癌细胞的结合。在一些实施方案中，样品是组织活检样品、血液样品或骨髓样品。在一些实施方案中，该方法包括提供来自受试者的生物样品；将样品与ADC接触；以及检测样品中癌细胞死亡的一种或多种标记物(例如，一种或多种细胞凋亡标记物的表达增加、培养物中癌细胞群的扩增减少等)。
本文进一步提供了所公开的ADC和组合物的治疗用途。示例性实施方案是用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，表达EphA2的癌症)的受试者的ADC、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。另一个示例性实施方案是ADC、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，表达EphA2的癌症)的受试者的用途。另一个示例性实施方案是ADC、组合物或药物组合物(例如，本文公开的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)在制造用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，表达EphA2的癌症)的受试者的药物的方法中的用途。用于鉴定患有表达靶抗原(例如，EphA2)的癌症的受试者的方法是本领域已知的，并且可以用于鉴定适合用公开的ADC化合物或组合物治疗的患者。
此外，出于兽医目的或作为人疾病的动物模型，本公开的ADC可施用于表达ADC能够与其结合的抗原的非人哺乳动物。就后者而言，这类动物模型可用于评价所公开的ADC的治疗功效(例如测试剂量及施用时程)。
用于实施前述方法的治疗组合物可以配制成包含适合于所需递送方法的药学上可接受的载剂的药物组合物。示例性实施方案是药物组合物，其包含本公开的ADC和药学上可接受的载剂，例如适合于所选择的施用方式(例如静脉内施用)的载剂。药物组合物还可以包含一种或多种另外的适合于治疗或预防例如癌症的无活性剂和/或治疗剂(例如标准护理剂等)。药物组合物还可包含一种或多种载剂、赋形剂和/或稳定剂组分等。配制此类药物组合物和合适制剂的方法是本领域已知的(参见例如"Remington'sPharmaceuticalSciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA)。
合适的载剂包括当与治疗组合物组合时保留治疗组合物的抗肿瘤功能并且通常不与患者的免疫系统反应的任何材料。药学上可接受的载剂包括生理上兼容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇、甲磺酸盐中的一种或多种及其组合。在许多情况下，组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。药学上可接受的载剂可进一步包含极少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，这类辅助物质增强ADC的保存期限或有效性。
本公开的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施用。施用途径和/或方式可以根据所希望的结果而变化。在一些实施方案中，治疗制剂被溶解并通过能够将治疗组合物递送至癌症部位的任何途径施用。潜在有效的施用途径包括但不限于肠胃外(例如静脉内、皮下)、腹膜内、肌内、肿瘤内、皮内、器官内、原位等。在一些实施方案中，施用是静脉内、皮下、腹膜内或肌内的。药学上可接受的载剂应当适合于施用途径，例如静脉内或皮下施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物，即ADC和/或任何另外的治疗剂，可被包裹在材料中，以保护化合物免受酸和其它可能使化合物失活的自然条件的作用。施用可以是全身的或局部的。
本文公开的治疗组合物在制造和储存条件下可以是无菌的和稳定的，并且可以是多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。形式取决于预期的施用模式和治疗应用。在一些实施方案中，所公开的ADC可以掺入适合肠胃外施用的药物组合物中。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预填充注射器或其他已知的递送或储存装置中的液体或冻干剂型组成。在一些实施方案中，一种或多种ADC或药物组合物以密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物的形式提供，并且可以被重构(例如，用水或盐水)至合适的浓度以用于对受试者施用。
通常，在本公开的药物组合物中采用治疗有效量或有效量的公开的组合物，例如公开的ADC。组合物，例如包含ADC的组合物，可以通过本领域已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。使用前述方法治疗癌症的剂量和施用方案将随方法和目标癌症而变化，并且通常取决于本领域已知的许多其他因素。
可以调整本文公开的组合物的剂量方案，例如包含单独的ADC或与至少一种另外的无活性和/或活性治疗剂组合的那些组合物的剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，一种或两种药物可以一次单次推注施用，可以在预定的时间内分几次施用，或一种或两种药物的剂量可以根据治疗情况的紧急程度按比例增加或减少。在一些实施方案中，治疗涉及通过可接受的施用途径单次推注或重复施用ADC制剂。在一些实施方案中，每天、每周、每月或其间的任何时间段向患者施用ADC。对于任何特定受试者，具体的剂量方案可以根据个体的需要以及治疗临床医生的专业判断随时间进行调整。为了易于给予和剂量均匀性，可以将肠胃外组合物配制成单位剂型。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待被治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生与所需药用载剂相关的所期望疗效的活性化合物的预定量。
包含ADC和/或任何另外的治疗剂的组合物的剂量值可以基于活性化合物的独特特征和要实现的具体治疗效果来选择。医生或兽医可以以低于达到期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的ADC的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望效果。一般而言，本公开的组合物用于治疗癌症的有效剂量可以根据许多不同的因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是人动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。所选择的剂量水平还可以取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本公开的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史。可以调整治疗剂量以优化安全性和功效。
本文提供的化合物的毒性和治疗功效可以通过标准制药程序在细胞培养物或动物模型中测定。例如，可以确定LD50、ED50、EC50和IC50，并且可以计算毒性作用和治疗作用之间的剂量比(LD50/ED50)作为治疗指数。从体外和体内测定获得的数据可用于估计或制定用于人的剂量范围。例如，本文公开的组合物和方法最初可以在异种癌症模型中进行评价。
在一些实施方案中，ADC或包含ADC的组合物在单次施用。在其他实施方案中，多次施用ADC或包含ADC的组合物。单次剂量之间的间隔可以是例如每天、每周、每月或每年。基于测量患者体内施用的药剂(例如，ADC)的血液水平，间隔也可以是不规则的，以便维持药剂的相对一致的血浆浓度。ADC或包含ADC的组合物的施用剂量和频率也可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，可以在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗应用中，有时需要在相对较短的间隔内相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选地直到患者表现出疾病的一种或多种症状部分或完全改善。此后，可以对患者施用较低的例如预防性方案。
上述治疗方法可以与多种另外的手术、化疗或放射治疗方案中的任何一种组合。在一些实施方案中，本文公开的ADC或组合物与一种或多种另外的治疗剂共同配制和/或共同施用，所述治疗剂例如一种或多种化疗剂、针对特定病症的一种或多种护理标准剂治疗。
还提供了用于本文所述的治疗和/或诊断应用的试剂盒。此类试剂盒可包括载体、包装或容器，其被隔开以接收一个或多个容器，例如小瓶、管等，所述一个或多个容器中的每个包含将在本文公开的方法中使用的单独元件之一。标签可以存在于容器上或与容器一起存在，以指示试剂盒内的ADC或组合物用于特定治疗或非治疗应用，例如预后、预防、诊断或实验室应用。标签还可以指示体内或体外使用的方向，例如本文所述的那些。在包括在试剂盒中或试剂盒上的一个或多个插页或一个或多个标签上还可包括指导和/或其他信息。标签可以在容器上或与容器相关联。当形成标签的字母、数字或其他字符被模制或蚀刻到容器本身中时，标签可以位于容器上。当标签存在于也保持容器的受器或载器中时，标签可以与容器相关联，例如作为包装插页。标签可以表明试剂盒内的ADC或组合物用于诊断或治疗病症，例如本文描述的癌症。
在一些实施方案中，试剂盒包含ADC或包含ADC的组合物。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种另外组分，包括但不限于：使用说明书；其他试剂，例如治疗剂(例如标准护理剂)；用于准备ADC进行施用的装置、容器或其他材料；药学上可接受的载剂；以及用于向受试者施用ADC的装置、容器或其他材料。使用说明书可以包括治疗应用的指导，包括例如在患有或疑似患有癌症的患者中的建议剂量和/或施用模式。在一些实施方案中，试剂盒包含ADC和使用ADC治疗、预防和/或诊断癌症的说明书。
已知Bcl-xL表达升高与放射治疗和化疗耐药相关。作为治疗癌症的单一疗法可能不够有效的抗体-药物缀合物(ADC)可以与其他治疗剂(包括非靶向和靶向治疗剂)或放射疗法(包括放射性配体疗法)联合施用以提供治疗益处。不希望受理论束缚，据信本文所述的ADC使肿瘤细胞对其他治疗剂(包括肿瘤细胞可能已产生抗性的标准护理化疗剂)和/或放射疗法的治疗敏感。在一些实施方案中，本文所述的抗体药物缀合物以有效致敏肿瘤细胞的量施用于患有癌症的受试者。如本文所用，术语“使…过敏/致敏”是指用ADC治疗增加了用其他治疗剂治疗和/或放射疗法针对肿瘤细胞的效力或功效。
组合疗法
在一些实施方案中，本公开提供了治疗方法，其中本文公开的抗体-药物缀合物与一种或多种(例如，1或2种)另外的治疗剂组合施用。本文公开了示例性的组合伴侣。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含PD-1抑制剂。在一些实施方案中，所述PD-1抑制剂选自PDR001(Novartis)、纳武单抗(Bristol-Myers Squibb)、兰洛利珠单抗(Merck&Co)、匹地利珠单抗(CureTech)、MEDI0680(Medimmune)、REGN2810(Regeneron)、TSR-042(Tesaro)、PF-06801591(Pfizer)、BGB-A317(Beigene)、BGB-108(Beigene)、INCSHR1210(Incyte)、或AMP-224(Amplimmune)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是PDR001。PDR001还被称为斯巴达珠单抗(Spartalizumab)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含LAG-3抑制剂。在一些实施方案中，LAG-3抑制剂选自LAG525(Novartis)、BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)或TSR-033(Tesaro)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，TIM-3抑制剂是MBG453(Novartis)、TSR-022(Tesaro)、LY-3321367(Eli Lily)、Sym23(Symphogen)、BGB-A425(Beigene)、INCAGN-2390(Agenus)、BMS-986258(BMS)、RO-7121661(Roche)或LY-3415244(Eli Lilly)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含PDL1抑制剂。在一个实施方案中，PDL1抑制剂选自FAZ053(Novartis)、阿特珠单抗(Genentech)、德瓦鲁单抗(Astra Zeneca)或avelumab(Pfizer)。
在某些实施方案中，本文描述的组合包含GITR激动剂。在一些实施方案中，GITR激动剂选自GWN323(诺华公司(NVS))、BMS-986156、MK-4166或MK-1248(默克公司(Merck))、TRX518(利普治疗公司(Leap Therapeutics))、INCAGN1876(因赛特公司(Incyte)/艾吉纳斯公司(Agenus))、AMG 228(美商安进公司(Amgen))或INBRX-110(印希彼公司(Inhibrx))。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含IAP抑制剂。在一些实施方案中，IAP抑制剂包含LCL161或国际申请公开号WO 2008/016893中所公开的化合物。
在实施方案中，该组合包含mTOR抑制剂，例如RAD001(也称为依维莫司)。
在实施方案中，该组合包含HDAC抑制剂，例如LBH589。LBH589也称为帕比司他。
在实施方案中，该组合包含IL-17抑制剂，例如CJM112。
在某些实施方案中，本文描述的组合包含雌激素受体(ER)拮抗剂。在一些实施方案中，雌激素受体拮抗剂与PD-1抑制剂、CDK4/6抑制剂或两者组合使用。在一些实施方案中，该组合用于治疗ER阳性(ER+)癌症或乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)。
在一些实施方案中，雌激素受体拮抗剂是选择性雌激素受体降解剂(SERD)。SERD是雌激素受体拮抗剂，可与受体结合并产生，例如，受体的降解或下调(Boer K.等人,(2017)Therapeutic Advances in Medical Oncology 9(7):465-479)。ER是一种激素激活的转录因子，对例如人生殖系统的生长、发育和生理非常重要。ER由例如，雌激素(17β雌二醇)激活。ER表达和信号转导与癌症(例如乳腺癌)，例如ER阳性(ER+)乳腺癌有关。在一些实施方案中，SERD选自LSZ102、氟维司群、布利司群(brilanestrant)、或依拉司群(elacestrant)。
在一些实施方案中，SERD包含国际申请公开号WO 2014/130310中所披露的化合物，该申请通过引用并入以其整体并入本文。
在一些实施方案中，SERD包含LSZ102。LSZ102的化学名称为：(E)-3-(4-((2-(2-(1,1-二氟乙基)-4-氟苯基)-6-羟基苯并[b]噻吩-3-基)氧基)苯基)丙烯酸。在一些实施方案中，SERD包含氟维司群(CAS登记号：129453-61-8)或国际申请公开号WO 2001/051056中所披露的化合物，该申请通过引用并入以其整体并入本文。在一些实施方案中，SERD包含依拉司群(CAS登记号：722533-56-4)或美国专利号7,612,114中所公开的化合物，该专利通过引用以其整体并入。依拉司群也称为RAD1901、ER-306323或(6R)-6-{2-[乙基({4-[2-(乙基氨基)乙基]苯基}甲基)氨基]-4-甲氧基苯基}-5,6,7,8-四氢萘-2-醇。依拉司群是一种口服生物可利用的非类固醇组合选择性雌激素受体调节剂(SERM)和SERD。例如，在Garner F等人,(2015)Anticancer Drugs 26(9):948-56也公开了依拉司群。在一些实施方案中，SERD是布利司群(CAS登记号：1365888-06-7)或国际申请公开号WO 2015/136017中所公开的化合物，该申请通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，SERD选自RU 58668、GW7604、AZD9496、巴多昔芬、哌喷昔芬(pipendoxifene)、阿佐昔芬、OP-1074、或阿考比芬，例如，如McDonell等人(2015)Journalof Medicinal Chemistry 58(12)4883-4887中所公开的。
其他示例性雌激素受体拮抗剂披露于，例如WO 2011/156518、WO 2011/159769、WO2012/037410、WO 2012/037411、和US2012/0071535中，所有这些均通过引用以其整体并入本文
在某些实施方案中，本文描述的组合包含细胞周期蛋白依赖性激酶4或6(CDK4/6)的抑制剂。在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂与PD-1抑制剂、雌激素受体(ER)拮抗剂或两者组合使用。在一些实施方案中，该组合用于治疗ER阳性(ER+)癌症或乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)。在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂选自利波西利、阿贝西利(abemaciclib)(EliLilly)或帕柏西利。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含利波西利(CAS登记号：1211441-98-3)或美国专利号8,415,355和8,685,980中所公开的化合物，其通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含国际申请公开号WO 2010/020675，以及美国专利号8,415,355和8,685,980中所披露的化合物，其通过引用并入以其整体并入本文。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含帕博西尼(CAS登记号：1211441-98-3)。帕博西尼也称为LEE011、或7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含阿贝西利(CAS登记号：1231929-97-7)。阿贝西利也称为LY835219或N-[5-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-2-吡啶基]-5-氟-4-[4-氟-2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-苯并咪唑-6-基]-2-嘧啶胺。阿贝西利是一种对CDK4和CDK6具有选择性的CDK抑制剂，并且已被公开，例如，在Torres-Guzman R等人(2017)Oncotarget10.18632/oncotarget.17778中。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包括帕博西尼(CAS登记号：571190-30-2)。帕博西尼也称为PD-0332991、或6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(1-哌嗪基)-2-吡啶基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮。帕博西尼以11nM的IC50抑制CDK4，并以16nM的IC50抑制CDK6，并且已公开在，例如Finn等人(2009)Breast Cancer Research 11(5):R77中。
在某些实施方案中，本文描述的组合包含趋化因子(C-X-C基序)受体2(CXCR2)的抑制剂。在一些实施方案中，CXCR2抑制剂选自6-氯-3-((3,4-二氧代-2-(戊烷-3-基氨基)环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基-N-甲氧基-N-甲基苯磺酰胺、达尼利星(danirixin)、瑞帕利星(reparixin)、或那伐利星(navarixin)。
在一些实施方案中，CSF-1/1R结合剂选自巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的抑制剂，例如，M-CSF的单克隆抗体或Fab(例如，MCS110)，CSF-1R酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-((2-(((1R,2R)-2-羟基环己基)氨基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶酰胺或BLZ945)，受体酪氨酸激酶抑制剂(RTK)(例如，培达替尼(pexidartinib))或靶向CSF-1R的抗体(例如，依米妥珠单抗(emactuzumab)或FPA008)。在一些实施方案中，CSF-1/1R抑制剂是BLZ945。在一些实施方案中，CSF-1/1R结合剂是MCS110。在其他实施方案中，CSF-1/1R结合剂是培达替尼。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含c-MET抑制剂。c-MET(在许多肿瘤细胞类型中过表达或突变的受体酪氨酸激酶)在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭、转移和肿瘤血管生成中起关键作用。抑制c-MET可能会诱导过表达c-MET蛋白或表达组成型激活的c-MET蛋白的肿瘤细胞死亡。在一些实施方案中，c-MET抑制剂选自卡玛替尼(INC280)、JNJ-3887605、AMG337、LY2801653、MSC2156119J、克唑替尼(crizotinib)、替万替尼、或戈伐替尼(golvatinib)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含转化生长因子β(也称为TGF-β、TGFβ、TGFb或TGF-β，在本文中可互换使用)抑制剂。在一些实施方案中，该TGF-β抑制剂选自夫苏木单抗或XOMA 089。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂(例如A2aR途径的抑制剂，例如腺苷抑制剂，例如A2aR或CD-73的抑制剂)。在一些实施方案中，A2aR拮抗剂与PD-1抑制剂和CXCR2抑制剂、CSF-1/1R结合剂、LAG-3抑制剂、GITR激动剂、c-MET抑制剂或IDO抑制剂中的一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种或全部)组合使用。在一些实施方案中，所述组合用于治疗胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、或黑色素瘤(例如难治性黑色素瘤)。在一些实施方案中，A2aR拮抗剂选自PBF509(NIR178)(Palobiofarma/Novartis)、CPI444/V81444(Corvus/Genentech)、AZD4635/HTL-1071(AstraZeneca/Heptares)、Vipadenant(Redox/Juno)、GBV-2034(Globavir)、AB928(Arcus Biosciences)、茶碱、Istradefylline(Kyowa Hakko Kogyo)、Tozadenant/SYN-115(Acorda)、KW-6356(Kyowa Hakko Kogyo)、ST-4206(Leadiant Biosciences)或Preladenant/SCH 420814(Merck/Schering)。不希望受理论束缚，据信在一些实施方案中，A2aR的抑制导致IL-1b的上调。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和/或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)的抑制剂。在一些实施方案中，IDO抑制剂与PD-1抑制剂和TGF-β抑制剂、A2aR拮抗剂、CSF-1/1R结合剂、c-MET抑制剂或GITR激动剂中的一种或多种(例如，两种、三种、四种或全部)组合使用。在一些实施方案中，所述组合用于治疗胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、或黑色素瘤(例如难治性黑色素瘤)。在一些实施方案中，IDO抑制剂选自(4E)-4-[(3-氯-4-氟苯胺基)-亚硝基亚甲基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(也称为依多司他(epacadostat)或INCB24360)、英多莫德(NLG8189)、(1-甲基-D-色氨酸)、α-环己基-5H-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-乙醇(也称为NLG919)、英多莫德、BMS-986205(以前称为F001287)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含半乳糖凝集素，例如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3抑制剂。在一些实施方案中，该组合包含半乳糖凝集素-1抑制剂和半乳糖凝集素-3抑制剂。在一些实施方案中，该组合包含靶向半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3两者的双特异性抑制剂(例如，双特异性抗体分子)。在一些实施方案中，半乳糖凝集素抑制剂与本文所述的一种或多种治疗剂组合使用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素抑制剂选自抗半乳糖凝集素抗体分子、GR-MD-02(Galectin Therapeutics)、Galectin-3C(MandalMed)、Anginex或OTX-008(OncoEthix，Merck)。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含MAP激酶途径的抑制剂，包括ERK抑制剂、MEK抑制剂和RAF抑制剂。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含MEK抑制剂。在一些实施方案中，MEK抑制剂选自曲美替尼、司美替尼、AS703026、BIX 02189、BIX 02188、CI-1040、PD0325901、PD98059、U0126、XL-518、G-38963、或G02443714。
在一些实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。Trametinib也称为JTP-74057、TMT212、CFF272、N-(3-{3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-1(2H)-基}苯基)乙酰胺或Mekinist(CAS号871700-17-3)。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包括司美替尼，其具有化学名称：(5-[(4-溴-2-氯苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺。司美替尼也称为AZD6244或ARRY 142886，例如，如PCT公开号WO2003077914中所述。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包含AS703026、BIX 02189或BIX 02188。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包含2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也称为CI-1040或PD184352)，例如，PCT公开号WO2000035436中描述)。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包含N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(也称为PD0325901)，例如，如PCT公开号WO2002006213中所描述的。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包含2’-氨基-3’-甲氧基黄酮(也称为PD98059)，其可获自Biaffin GmbH&Co.,KG,Germany。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包含2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫基]亚甲基]-丁二腈(也称为U0126)，例如，如美国专利号2,779,780中所述。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包括XL-518(也称为GDC-0973)，其具有CAS号1029872-29-4并且可从ACC Corp.获得。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包含G-38963。
在一些实施方案中，MEK抑制剂包含G02443714(也称为AS703206)
MEK抑制剂的另外的实例公开于WO 2013/019906、WO 03/077914、WO 2005/121142、WO 2007/04415、WO 2008/024725和WO 2009/085983中，其内容通过引用并入本文。MEK抑制剂的其他实例包括但不限于2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称为U0126并在美国专利号2,779,780中描述)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并氧杂环丁烷-1,7(8H)-二酮](也称为E6201，描述于PCT公开号WO2003076424中)；维莫非尼(PLX-4032，CAS 918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733，CAS1035555-63-5)；pimasertib(AS-703026，CAS1204531-26-9)；2-(2-氟-4-碘苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺(AZD8330)；和3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-(2-羟基乙氧基)-5-[(3-氧代-[1,2]噁嗪基-2-基)甲基]苯甲酰胺(CH 4987655或Ro 4987655)。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含RAF抑制剂。
RAF抑制剂包括但不限于维莫非尼(或PLX-4032，CAS 918504-65-1)、GDC-0879、PLX-4720(Symansis)、达拉菲尼(或GSK2118436)、LGX 818、CEP-32496、UI-152、RAF 265、瑞戈非尼(Regorafenib)(BAY 73-4506)、CCT239065、或索拉非尼(或甲苯磺酸索拉非尼或)。
在一些实施方案中，RAF抑制剂是达拉非尼。
在一些实施方案中，RAF抑制剂是LXH254。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含ERK抑制剂。
ERK抑制剂包括但不限于LTT462、尤利塞替尼(ulixertinib)(BVD-523)、LY3214996、GDC-0994、KO-947和MK-8353。
在一些实施方案中，ERK抑制剂是LTT462。LTT462是4-(3-氨基-6-((1S,3S,4S)-3-氟-4-羟基-环己基)吡嗪-2-基)-N-((S)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺，且是具有以下结构的化合物：
LTT462的制备描述于PCT专利申请公开WO2015/066188中。LTT462是细胞外信号调节激酶1和2(ERK 1/2)的抑制剂。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含紫杉烷、长春花生物碱、MEK抑制剂、ERK抑制剂或RAF抑制剂。
在一些实施方案中，本文描述的组合包含至少两种独立地选自MEK抑制剂、ERK抑制剂和RAF抑制剂的抑制剂。
在一些实施方案中，本文描述的组合包含抗有丝分裂药物。
在一些实施方案中，本文描述的组合包含紫杉烷。
紫杉烷类包括但不限于多西他赛、紫杉醇或卡巴他赛。在一些实施方案中，紫杉烷是多西他赛。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含长春花生物碱。
长春花生物碱包括但不限于长春新碱、长春花碱和环氧长春碱。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含拓扑异构酶抑制剂。
拓扑异构酶抑制剂包括但不限于托泊替康、伊立替康、喜树碱、二氟莫替康、片螺素D、玫瑰树碱、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、安吖啶、金精三羧酸和HU-331。
在一个实施方案中，本文描述的组合包括白细胞介素-1β(IL-1β)抑制剂。在一些实施方案中，IL-1β抑制剂选自卡那单抗(canakinumab)、格沃吉珠单抗(gevokizumab)、阿那白滞素、或利纳西普(Rilonacept)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含IL-15/IL-15Ra复合物。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Ra复合物选自NIZ985(Novartis)、ATL-803(Altor)或CYP0150(Cytune)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含小鼠双微体2同源物(MDM2)抑制剂。MDM2的人同源物也称为HDM2。在一些实施方案中，本文所述的MDM2抑制剂也称为HDM2抑制剂。在一些实施方案中，MDM2抑制剂选自HDM201或CGM097。
在实施方案中，MDM2抑制剂包含(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1r,4S)-4-(4-甲基-3-氧代哌嗪-1-基)环己基)甲基)氨基)苯基)-1,2-二氢异喹啉-3(4H)-酮(也称为CGM097)或PCT公开号WO 2011/076786中公开的化合物，用于治疗障碍例如，本文描述的障碍)。在一个实施方案中，本文公开的治疗剂与CGM097组合使用。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含低甲基化剂(HMA)。在一些实施方案中，HMA选自地西他滨或阿扎胞苷。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素是地塞米松。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含核苷类似物。在一些实施方案中，该核苷类似物是吉西他滨。
在一些实施方案中，本文描述的组合包含天冬酰胺酶。
在某些实施方案中，本文描述的组合包含作用于Bcl2家族的任何促存活蛋白的抑制剂。在某些实施方案中，本文所述的组合包含Bcl-2抑制剂。在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂是维奈托克(venetoclax)(也称为ABT-199)：
在一个实施方案中，Bcl-2抑制剂选自WO 2013/110890和WO 2015/011400中描述的化合物。在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂包括navitoclax(ABT-263)、ABT-737、BP1002、SPC2996、APG-1252、奥布妥拉甲磺酸盐(GX15-070MS)、PNT2258、Zn-d5、BGB-11417或奥利默森(olimersen)(G3139)。在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂是N-(4-羟基苯基)-3-[6-[(3S)-3-(吗啉代甲基)-3,4-二氢-1H-异喹啉-2-羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基]-N-苯基-5,6,7,8-四氢中氮茚-1-甲酰胺，化合物A1：
在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂是(S)-5-(5-氯-2-(3-(吗啉代甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)苯基)-N-(5-氰基-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-羟基苯基)-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺)，化合物A2：
在一个实施方案中，本文公开的抗体-药物缀合物或组合适合于体内治疗癌症。例如，该组合可用于抑制癌性肿瘤的生长。该组合还可以与以下一种或多种组合使用：标准护理治疗(例如，用于癌症或传染病)、疫苗(例如，治疗性癌症疫苗)、细胞疗法、激素疗法(例如，使用抗雌激素或抗雄激素)、放射疗法、手术或任何其他治疗剂或方式，以治疗本文的障碍。例如，为了实现抗原特异性免疫增强，可以将该组合与目的抗原一起施用。本文公开的组合可以按顺序或同时施用。
另外的实施方案
本公开提供了接头-药物基团、抗体-药物缀合物、接头基团和缀合方法的以下另外的实施方案。
接头-药物基团
在一些实施方案中，本发明的接头-药物基团可以是具有式(A’)结构的化合物或其药学上可接受的盐：
式(A’)
其中：
R1是反应性基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是二价肽间隔基；
G-L2-A是自分解间隔基；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；以及
D是当例如从本文公开的抗体药物缀合物或免疫缀合物中释放时能够抑制Bcl-xL蛋白的活性的药物部分。
本发明的接头-药物组的某些方面和实例在以下列举的实施方案的列表中提供。应认识到，每个实施方案中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外的实施方案。
实施方案1.式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是反应性基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
G-L2-A是自分解间隔基；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；以及
D是本文定义的药物部分，例如Bcl-xL抑制剂。
实施方案2.式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是反应性基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
基团选自：
其中，的*表示与D的附接点(例如，与药物部分的N或O的附接点)，的***表示与Lp的附接点；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；以及
D是本文定义的药物部分，例如Bcl-xL抑制剂。
实施方案3.式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(B’)结构：
式(B’)
其中：
R1是反应性基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
R2是亲水性部分；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；以及
D是如本文所定义的并且包含N的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N的直接键连接至A。
实施方案4.实施方案1至3中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为-ONH2、-NH2、 -N3、-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(O)NHNH2、
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；
*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**；或
*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，
其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
每个R3独立地选自H和C1-C6烷基；
R4是2-吡啶基或4-吡啶基；
每个R5独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R6独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基，被
-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
X1是
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是包含选自甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的二价肽间隔基；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或
-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；以及
L3的*表示与R2的附接点；
以及
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案5.实施方案1至4中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为-ONH2、
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)、(PheLys)、(ValAla)、(ValLys)和(LeuCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或
-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个 取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；以及
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案6.实施方案1至5中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或
-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个 基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
以及
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案7.实施方案1至6中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、
-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**或-NHC(＝O)NH-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个 取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
A是键或-OC(＝O)*，其中*表示与D的附接点；
以及
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案8.实施方案1至7中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**或-C(＝O)N(X-R2)-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
A是键或-OC(＝O)*，其中*表示与D的附接点；
以及
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案9.实施方案1至8中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是选自表3的反应性基团。
实施方案10.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是-ONH2、-NH2、 -N3、-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(O)NHNH2、
实施方案11.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是-ONH2、-NH2、 -N3、-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(O)NHNH2、
实施方案12.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是-ONH2、
实施方案13.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为-ONH2、实施方案14.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为
实施方案15.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-ONH2。
实施方案16.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R1是
实施方案17.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是
实施方案18.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案19.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案20.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案21.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中
每个R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案22.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中
每个R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案23.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中
Xa是–CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或–NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案24.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案25.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中
Xb是-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案26.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
实施方案27.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
实施方案28.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
实施方案29.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
实施方案30.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
实施方案31.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
其中n是2到24之间的整数。
实施方案32.实施方案1至9中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐，具有表B中的化合物的结构。
实施方案33.式(A’)接头-药物基团的接头，其具有式(C’)结构
式(C’)
其中
L1是桥连间隔基；
Lp是二价肽间隔基；
G-L2-A是自分解间隔基；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点，
以及
L3是间隔基部分。
实施方案34.实施方案33所述的接头，其中：
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
G-L2-A是自分解间隔基；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点，
以及
L3是间隔基部分。
实施方案35.实施方案33或34所述的接头，其中：
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
基团选自：
其中，的*表示与D的附接点(例如，与药物部分的N或O的附接点)，的***表示与Lp的附接点；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点，
以及
L3是间隔基部分。
实施方案36.实施方案33至35中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*
表示与Lp的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个
基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
每个R3独立地选自H和C1-C6烷基；
X1是
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是包含选自甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的二价肽间隔基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或
-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案37.实施方案33至36中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)、(PheLys)、(ValAla)、(ValLys)和(LeuCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、
-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个
基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
以及
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点。
实施方案38.实施方案33至37中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或
-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个
基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
以及
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点。
实施方案39.实施方案33至38中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、
-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**或-NHC(＝O)NH-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个
基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
以及
A是键或-OC(＝O)*，其中*表示与D的附接点。
实施方案40.实施方案33至39中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**或-C(＝O)N(X-R2)-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
以及
A是键或-OC(＝O)*，其中*表示与D的附接点。
实施方案41.式(C’)的接头，其具有式(D’)的结构，
其中
L1是桥连间隔基；
Lp是二价肽间隔基；
R2是亲水性部分；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点，
以及
L3是间隔基部分。
实施方案42.实施方案41所述的接头，其中：
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
R2是亲水性部分；
A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点，
以及
L3是间隔基部分。
实施方案43.实施方案41或42所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或
*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与Lp的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
每个R3独立地选自H和C1-C6烷基；
X1是
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是包含选自甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的二价肽间隔基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案44.实施方案41至43中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)、(PheLys)、(ValAla)、(ValLys)和(LeuCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的-NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或
-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
以及
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点。
实施方案45.实施方案41至44中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或
-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
以及
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点。
实施方案46.实施方案41至45中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、
-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**或-NHC(＝O)NH-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个
基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
以及
A是键或-OC(＝O)*，其中*表示与D的附接点。
实施方案47.实施方案41至46中任一项所述的接头，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**或-C(＝O)N(X-R2)-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个
基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
以及
A是键或-OC(＝O)*，其中*表示与D的附接点。
实施方案48.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案49.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案50.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案51.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中
每个R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案52.实施方案37至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中
每个R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案53.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中
Xa是–CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或–NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案54.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案55.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中
Xb是-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或–NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案56.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
实施方案57.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
实施方案58.实施方案37至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
实施方案59.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
实施方案60.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
实施方案61.实施方案33至47中任一项所述的接头，其具有以下结构：
其中n是2到24之间的整数。
为了说明的目的，本文描述的一般反应方案提供了合成本发明化合物以及关键中间体的潜在途径。有关各个反应步骤的详细说明，请参见下面的实例部分。尽管在方案中描述了具体的原料和试剂，并在下面进行了讨论，但是可以容易地替换其他起始材料和试剂以提供各种衍生物和/或反应条件。另外，根据本披露，可以使用本领域技术人员熟知的常规化学进一步修饰通过下述方法制备的许多化合物。
举例来说，式(B’)的化合物的一般合成如下文方案1所示。
方案1
本发明的抗体药物缀合物
本发明提供了抗体药物缀合物，在本文中也称为免疫缀合物，其包含含有一个或多个亲水性部分的接头。
本发明的抗体药物缀合物具有式(E’)的结构：
其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是二价肽间隔基；
G-L2-A是自分解间隔基；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；
D是如本文定义的药物部分，例如Bcl-xL抑制剂，并且可以包含N，其中D可以通过从A到药物部分的N的直接键连接到A，
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
本发明的抗体药物缀合物的某些方面和实例在以下列举的实施方案的列表中提供。应认识到，每个实施方案中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外的实施方案。
实施方案62.式(E’)的免疫缀合物，其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
G-L2-A是自分解间隔基；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；
D是如本文所定义的药物部分，其中D通过从A到D(例如，药物部分的N)的直接键连接至A，
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案63.实施方案62所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
基团选自：
其中，的*表示与D的附接点(例如，与药物部分的N或O的附接点)，的***表示与Lp的附接点；
R2是亲水性部分；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；
D是如本文所定义的并且包含N的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N的直接键连接至A，
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案64.实施方案62至63中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有式(F’)的结构，
其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基；
R2是亲水性部分；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；
D是如本文所定义的并且包含N的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N的直接键连接至A，
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案65.实施方案62至64中任一项所述的式(D’)的免疫缀合物，其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100是 -S-、-C(＝O)-、-ON＝***、-NHC(＝O)CH2-***、-S(＝O)2CH2CH2-***、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-***、-NHS(＝O)2CH2CH2-***、-NHC(＝O)CH2CH2-***、-CH2NHCH2CH2-***、-NHCH2CH2-***、 或其中R100的***表示与Ab的附接点；
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或
*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R100的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
每个R3独立地选自H和C1-C6烷基；
R4是2-吡啶基或4-吡啶基；
每个R5独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R6独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3,
-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基，被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
X1是
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是包含选自缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的二价肽间隔基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或–NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
D是如本文所定义的并且包含N的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N的直接键连接至A。
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案66.实施方案62至65中任一项所述的式(D’)的免疫缀合物，其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100是 其中R100的***表示与Ab的附接点；
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R100的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)、(PheLys)、(ValAla)、(ValLys)和(LeuCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的-NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个
基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A，
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案67.实施方案62至66中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100为其中R100的***表示与Ab的附接点；
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R100的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3取代的C2-C6烷基的亲水性部分。A是键、-OC(＝O)-*、
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或
-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，A的*表示与D的附接点；
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A，
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案68.实施方案62至67中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100为其中R100的***表示与Ab的附接点；
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R100的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**或-NHC(＝O)NH-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
A是键或-OC(＝O)*，其中*表示与D的附接点；
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A，
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案69.实施方案62至68中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Ab是抗EphA2抗体或其片段；
R100为其中R100的***表示与Ab的附接点；
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R100的附接点；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个t独立地选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
Lp是选自(ValCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与G的–NH-基团的附接点；
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**或-C(＝O)N(X-R2)-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点；
R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个
基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分；
A是键或-OC(＝O)*，其中*表示与D的附接点；
D是如本文所定义的并且包含N或O的药物部分，其中D通过从A到药物部分的N或O的直接键连接至A，
以及
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案70.实施方案62至65中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中
R100是 -S-、-C(＝O)-、-ON＝***、-NHC(＝O)CH2-***、-S(＝O)2CH2CH2-***、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-***、-NHS(＝O)2CH2CH2-***、
-NHC(＝O)CH2CH2-***、-CH2NHCH2CH2-***、-NHCH2CH2-***、 其中R100的***表示与Ab的附接点。
实施方案71.实施方案60至63中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中
R100是 其中R100的***表示与Ab的附接点。
实施方案72.实施方案62至65中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中
R100是 其中R100的***表示与Ab的附接点。
实施方案73.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH并且y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案74.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH并且y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案75.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH并且y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案76.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中
每个R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH并且y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案77.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中
每个R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH并且y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案78.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中
Xa是–CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或–NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，并且y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案79.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH并且y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案80.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中
Xb是-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH并且y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案81.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案82.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案83.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案84.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案85.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案86.实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其具有以下结构：
其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
本发明的接头-药物基团、接头和抗体药物缀合物的某些方面和实例在以下另外列举的实施方案的列表中提供。应认识到，每个实施方案中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外的实施方案。
实施方案87.实施方案1至2中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至40中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至63中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
G是其中G的*表示与L2的附接点，G的**表示与L3的附接点，G的***表示与Lp的附接点。
实施方案88.实施方案1至2中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至40中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至63中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
G是其中G的*表示与L2的附接点，G的**表示与L3的附接点，G的***表示与Lp的附接点。
实施方案89.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或
*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点(如果存在)或L1的**表示与R100(如果存在)的附接点。
实施方案90.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或
*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点(如果存在)或L1的**表示与R100(如果存在)的附接点。
实施方案91.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；或*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点(如果存在)或L1的**表示与R100(如果存在)的附接点。
实施方案92.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点(如果存在)或L1的**表示与R100(如果存在)的附接点。
实施方案93.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中L1是*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点(如果存在)或L1的**表示与R100(如果存在)的附接点。
实施方案94.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中L1是*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点(如果存在)或L1的**表示与R100(如果存在)的附接点。
实施方案95.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中L1是*-C(＝O)(CH2)m-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点(如果存在)或L1的**表示与R100(如果存在)的附接点。
实施方案96.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案32至46中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案60至70中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中L1是*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**，其中L1的*表示与Lp的附接点，L1的**表示与R1的附接点(如果存在)或L1的**表示与R100(如果存在)的附接点。
实施方案97.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案84至93中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物,其中Lp是可酶促切割的二价肽间隔基。
实施方案98.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案32至46中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案60至70中任一项或实施方案87至97中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中Lp是包含选自甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的二价肽间隔基。
实施方案99.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至98中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基。
实施方案100.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至99中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中Lp是包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔基，每个氨基酸残基独立地选自甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的二价肽间隔基。
实施方案101.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至100中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Lp是选自(ValCit)、(PheLys)、(ValAla)、(ValLys)和(LeuCit)的二价肽间隔基，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与式(B’)的-NH-基团的附接点或Lp的**表示与式(A’)的G的附接点。
实施方案102.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至101中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Lp是(ValCit)，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与式(B’)的-NH-基团的附接点或Lp的**表示与式(A’)的G的附接点。
实施方案103.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至101中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Lp是(PheLys)，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与式(B’)的-NH-基团的附接点或Lp的**表示与式(A’)的G的附接点。
实施方案104.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至101中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Lp是(ValAla)，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与式(B’)的-NH-基团的附接点或Lp的**表示与式(A’)的G的附接点。
实施方案105.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至101中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Lp是(ValLys)，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与式(B’)的-NH-基团的附接点或Lp的**表示与式(A’)的G的附接点。
实施方案106.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至101中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
Lp是(LeuCit)，其中Lp的*表示与L1的附接点，Lp的**表示与式(B’)的-NH-基团的附接点或Lp的**表示与式(A’)的G的附接点。
实施方案107.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至106中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中L2是键、亚甲基或C2-C3亚烯基。
实施方案108.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至107中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中L2是键或亚甲基。
实施方案109.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至108中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中L2是键。实施方案110.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至108中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中L2是亚甲基。
实施方案111.实施方案1至30中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至85中任一项或实施方案87至110中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
A是键、-OC(＝O)-、-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基。
实施方案112.实施方案1至32中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至61中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至86中任一项或实施方案87至111中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中A是键或-OC(＝O)。
实施方案113.实施方案1至32中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至61中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至86中任一项或实施方案87至112中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中A是键。
实施方案114.实施方案1至32中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至61中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至86中任一项或实施方案87至112中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中A或-OC(＝O)。
实施方案115.实施方案1至32中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至61中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至86中任一项或实施方案87至110中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
A是
实施方案116.实施方案1至32中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至61中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至85中任一项或实施方案86至110中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
A是-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-，其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基。
实施方案117.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至49中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至116中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案118.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至117中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、
-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案119.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至118中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、
-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是三唑基，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案120.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至118中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、
-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案121.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至118中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案122.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至118中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是键；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案123.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案83至118中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是三唑基，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案124.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至118中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
L3是具有结构的间隔基部分，
其中
W是-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基并且其中W的**表示与X的附接点；
X是***-CH2-三唑基-*，其中X的***表示与W的附接点，X的*表示与R2的附接点；
以及
L3的*表示与R2的附接点。
实施方案125.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案86至124中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2是选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或被1至3个或基团取代的C2-C6烷基的亲水性部分。
实施方案126.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2是糖。
实施方案127.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2为寡糖。
实施方案128.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2是多肽。
实施方案129.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2为聚亚烷基二醇。
实施方案130.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2是具有结构-(O(CH2)m)tR’的聚亚烷基二醇，其中R'为OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH，m为1-10且t为4-40。
实施方案131.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2是具有结构-((CH2)mO)tR”-的聚亚烷基二醇，其中R”为H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH，m为1-10且t为4-40。
实施方案132.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2为聚乙二醇。
实施方案133.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2是具有结构-(OCH2CH2)tR’的聚乙二醇，其中R'为OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH且t为4-40。
实施方案134.实施方案1至17中任一项所述的式(A')的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中R2是具有结构-(CH2CH2O)tR”-的聚乙二醇，其中R”为H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH且t为4-40。
实施方案135.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
R2是
其中R2的*表示与X或L3的附接点。
实施方案136.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
R2是 其中R2的*表示与X或L3的附接点。
实施方案137.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
R2是其中R2的*表示与X或L3的附接点。
实施方案138.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至125中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
R2为其中R2的*表示与X或L3的附接点。
实施方案139.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至138中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
X1是
实施方案140.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至138中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
X1是
实施方案141.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至140中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
每个m独立地选自1、2、3、4和5。
实施方案142.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至140中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
每个m独立地选自1、2和3。
实施方案143.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至142中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
每个n独立地选自1、2、3、4和5。
实施方案144.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至142中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
每个n独立地选自1、2和3。
实施方案145.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至144中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
每个t独立地选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。
实施方案146.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至144中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
每个t独立地选自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。
实施方案147.实施方案1至17中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案33至47中任一项所述的式(C’)的接头、以及实施方案62至72中任一项或实施方案87至144中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中：
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
实施方案148.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。
实施方案149.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
实施方案150.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
实施方案151.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。
实施方案152.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是1、2、3、4、5或6。
实施方案153.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是1、2、3或4。
实施方案154.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是1或2。
实施方案155.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是2。
实施方案156.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是4。
实施方案157.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是6。
实施方案158.实施方案62至72中任一项或实施方案87至147中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中y是8。
实施方案159.实施方案1至31中任一项所述的式(A’)的化合物或其药学上可接受的盐、实施方案62至72中任一项或实施方案87至158中任一项所述的式(E’)的免疫缀合物，其中当从所述免疫缀合物中释放时，D是Bcl-xL抑制剂。
其他接头基团
适合于制备本文公开的Bcl-xL抑制剂的ADC或免疫缀合物的接头基团的其他实例包括国际申请出版物中公开的那些，例如WO2018200812、WO2017214456、WO2017214458、WO2017214462、WO2017214233、WO2017214282、WO2017214301、WO2017214322、WO2017214335、WO2017214339、WO2016094509、WO2016094517和WO2016094505，其各自的内容通过引用以其整体并入。
例如，本文公开的Bcl-xL抑制剂的免疫缀合物可以具有选自以下的接头-负载(“-L-D”)结构：
其中：
Lc是接头组分，并且每个Lc独立地选自如本文披露的接头组分；
x是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；
y是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；
p是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；
D是本文公开的Bcl-xL抑制剂；
并且每个切割元件(CE)独立地选自自分解间隔基和易于切割的基团，所述切割选自酸诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割、糖苷酶诱导的切割、磷酸二酯酶诱导的切割、磷酸酶诱导的切割、蛋白酶诱导的切割、脂肪酶诱导的切割或二硫键切割。
在一些实施方案中，L具有选自以下的结构，或L包含选自以下的结构组分：
在一些实施方案中，Lc是接头组分并且每个Lc独立地选自
在一些实施方案中，接头L包含选自以下的接头组分：
-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)OC(R12)2(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)mO(CH2)mC(＝O)-；
-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X4C(＝O)NR11(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)X4C(＝O)NR11(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；
-**C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-
-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)mO(CH2)mC(＝O)-；
-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X4C(＝O)NR11(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；
-**C(＝O)X4C(＝O)X6(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；
-**C(＝O)(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O))X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5((CH2)mO)n(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5(CH2)mNR11((CH2)mO)n(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mNR11(CH2)mC(＝O)X2aX1aC(＝O)-；
-**C(＝O)O(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；
-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)nX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；
-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mC(＝O)NR11(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mC(R12)2-；
-**C(＝O)OCH2)mC(R12)2SS(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-、和
-**C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NR11(CH2)m-、其中：**表示与药物部分(D)的附接点，另一
端可连接至R100，即本文所述的偶联基团；
其中：
X1a是其中*表示与X2a的附接点；
X2a选自 其中*表示与X1a的附接点；
X3是
X4是-O(CH2)nSSC(R12)2(CH2)n-或-(CH2)nC(R12)2SS(CH2)nO-；
X5是其中**指示朝向药物部分的方向；
X6是其中**指示朝向药物部分的方向；
每个R11独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R12独立地选自H和C1-C6烷基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
缀合方法
本发明提供了将本发明的接头-药物基团与抗体或抗体片段缀合以产生抗体药物缀合物的多种方法，所述抗体药物缀合物包含具有一个或多个亲水性部分的接头。
形成式(E’)的抗体药物缀合物的一般反应方案如以下方案2所示：
方案2
其中：RG2是与相容的R1基团反应形成相应的R100基团(此类基团在表3和表4中说明)的反应性基团。D、R1、L1、Lp、L2、L3、R2、A、G、Ab、y和R100如本文所定义。
方案3进一步说明了用于形成式(E’)的抗体药物缀合物的一般方法，其中抗体包含与R1基团(如本文定义)反应的反应性基团(RG2)以将接头-药物基团经由R100基团(如本文定义)共价附接至抗体。仅出于说明目的，方案3显示了具有四个RG2基团的抗体。
方案3
一方面，接头-药物基团通过抗体中经修饰的半胱氨酸残基与抗体缀合(参见例如WO2014/124316)。方案4说明了用于形成式(E’)的抗体药物缀合物的这种方法，其中由抗体中的工程改造半胱氨酸残基产生的游离硫醇基团与R1基团(其中R1是马来酰亚胺)反应，通过R100基团(其中R100是琥珀酰亚胺环)将接头药物基团共价附接至抗体。仅出于说明目的，方案4显示了具有四个游离硫醇基团的抗体。
方案4
另一方面，接头-药物基团通过抗体中的赖氨酸残基与抗体缀合。方案5说明了用于形成式(E’)的抗体药物缀合物的这种方法，其中来自抗体中赖氨酸残基的游离胺基团与R1基团(其中R1是NHS酯、五氟苯基或四氟苯基)反应，以通过R100基团(其中R100是酰胺)将接头-药物基团共价附接至抗体。仅出于说明目的，方案5显示了具有四个胺基团的抗体。
方案5
在另一个方面，接头-药物基团通过在抗体的天然存在的二硫桥处形成肟桥而与抗体缀合。肟桥是通过还原抗体的链间二硫键最初产生酮桥并使用1,3-二卤代丙酮(例如1,3-二氯丙酮)重新桥连而形成的。随后与包含羟胺的接头-药物基团反应，从而形成肟连接(肟桥)，其将接头-药物基团附接至抗体(参见例如WO2014/083505)。方案6说明了形成式(E’)的抗体药物缀合物的这种方法。
方案6
形成式(F’)的抗体药物缀合物的一般反应方案如以下方案7所示：
方案7
其中：RG2是与相容的R1基团反应形成相应的R100基团(此类基团在表3和表4中说明)的反应性基团。D、R1、L1、Lp、Ab、y和R100如本文所定义。
方案8进一步说明了用于形成式(F’)的抗体药物缀合物的一般方法，其中抗体包含与R1基团(如本文定义)反应的反应性基团(RG2)以将接头-药物基团经由R100基团(如本文定义)共价附接至抗体。仅出于说明目的，方案8显示了具有四个RG2基团的抗体。
方案8
一方面，接头-药物基团通过抗体中经修饰的半胱氨酸残基与抗体缀合(参见例如WO2014/124316)。方案9说明了用于形成式(F’)的抗体药物缀合物的这种方法，其中由抗体中的工程改造半胱氨酸残基产生的游离硫醇基团与R1基团(其中R1是马来酰亚胺)反应，通过R100基团(其中R100是琥珀酰亚胺环)将接头药物基团共价附接至抗体。仅出于说明目的，方案9显示了具有四个游离硫醇基团的抗体。
方案9
另一方面，接头-药物基团通过抗体中的赖氨酸残基与抗体缀合。方案10说明了用于形成式(F’)的抗体药物缀合物的这种方法，其中来自抗体中赖氨酸残基的游离胺基团与R1基团(其中R1是NHS酯、五氟苯基或四氟苯基)反应，以通过R100基团(其中R100是酰胺)将接头-药物基团共价附接至抗体。仅出于说明目的，方案10显示了具有四个胺基团的抗体。
方案10
在另一个方面，接头-药物基团通过在抗体的天然存在的二硫桥处形成肟桥而与抗体缀合。肟桥是通过还原抗体的链间二硫键最初产生酮桥并使用1,3-二卤代丙酮(例如1,3-二氯丙酮)重新桥连而形成的。随后与包含羟胺的接头-药物基团反应，从而形成肟连接(肟桥)，其将接头-药物基团附接至抗体(参见例如WO2014/083505)。方案11说明了形成式(F’)的抗体药物缀合物的这种方法。
方案11
还提供了用于评估本发明抗体缀合物的分析方法学的某些方面的方案。此类分析方法和结果可以证明缀合物具有有利的性质，例如使它们更容易制造、更容易施用于患者、对患者更有效和/或可能更安全的性质。一个实例是通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定分子大小，其中相对于样品中存在的高分子量污染物(例如二聚体、多聚体或聚集抗体)或低分子量污染物(例如抗体片段、降解产物或单个抗体链)的量来测定样品中所需抗体种类的量。一般而言，由于例如聚集物对抗体样品的其他性质的影响，例如但不限于清除率、免疫原性和毒性，所以期望具有较高量的单体和较低量的例如聚集的抗体。另一个实例是通过疏水相互作用色谱(HIC)测定疏水性，其中相对于一组已知特性的标准抗体评估样品的疏水性。一般而言，由于疏水性对抗体样品的其他性质的影响，例如但不限于聚集、随时间的聚集、对表面的粘附、肝毒性、清除率和药代动力学暴露，所以希望具有低疏水性。参见Damle,N.K.,Nat Biotechnol.2008；26(8):884-885；Singh,S.K.,Pharm Res.2015；32(11):3541-71。当通过疏水相互作用色谱法测量时，较高的疏水性指数得分(即，从HIC柱洗脱更快)反映缀合物的较低疏水性。如下文实施例所示，大多数测试的抗体缀合物显示出大于0.8的疏水性指数。在一些实施方案中，提供了如通过疏水相互作用色谱法所测得的，具有0.8或更高疏水性指数的抗体缀合物。
实施例
以下实施例提供了本公开的说明性实施方案。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本公开的精神或范围的情况下执行多种修改和变化。这样的修改和变化包含在本公开的范围内。所提供的实施例不以任何方式限制本公开。
实施例1.Bcl-xL负载的合成和表征
使用本实施例中描述的示例性方法合成示例性负载。所有从商业来源获得的试剂均无需进一步纯化即可使用。无水溶剂从商业来源获得并且无需进一步干燥即可使用。
柱色谱法：使用以下在ISCORf 200或Rf+LumenTM上进行自动快速柱色谱分析：Rf正相硅胶柱(35-70μm，)、RediSep Rf正相硅胶高性能色谱柱(20-40μm，)、Rf反相C18色谱柱(40-63μm，)或RediSep Rf反相C18高性能色谱柱(20-40μm，)。
薄层色谱：使用涂有Merck Type 60F254硅胶的5x10cm板进行薄层色谱分析。
微波反应：使用CEMSP或Anton Paar单波微波反应器进行微波加热。
NMR：1H-NMR测量是在Bruker Avance III 500MHz光谱仪、Bruker Avance III400MHz光谱仪或Bruker DPX-400光谱仪上使用DMSO-d6或CDCl3作为溶剂进行的。1HNMR数据采用delta值的形式，以百万分率(ppm)为单位，使用溶剂的残留峰(对于DMSO-d6为2.50ppm，对于CDCl3为7.26ppm)作为内标。分裂模式指定为：s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、quint(五重峰)、sept(七重峰)、m(多重峰)、br s(宽单峰)、dd(双二重峰)、td(三二重峰)、dt(双三重峰)、ddd(双双二重峰)。
LC-MS分析：本发明的某些化合物通过在配备Agilent 6140四极杆LC/MS的Agilent HP1200上以正离子或负离子电喷雾电离模式操作的高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)来表征。分子量扫描范围为100至1350。在210nm和254nm处进行平行UV检测。样品以ACN溶液或THF/H2O(1:1)中的1mM溶液形式提供，采用5L定量环进样。LCMS分析在两台仪器上进行，其中一台使用碱性洗脱液，另一台使用酸性洗脱液。
碱性LCMS：Gemini-NX，3μm，C18，50mm×3.00mm内径，在23℃，以1mL min-1的流速，使用5mM碳酸氢铵(溶剂A)和乙腈(溶剂B)，梯度从100％溶剂A开始，到100％溶剂B结束，经过各种/一定的持续时间。
酸性LCMS：KINATEX XB-C18-100A，2.6μm，50mm*2.1mm色谱柱，40℃，流速1mL min-1，使用0.02％v/v甲酸水溶液(溶剂A)和0.02％v/v甲酸的乙腈溶液(溶剂B)，梯度从100％溶剂A开始，到100％溶剂B结束，持续不同/一定的时间。
本发明的某些其他化合物通过如下具体命名的方法进行HPLC-MS表征。对于所有这些方法，UV检测均通过二极管阵列检测器在230、254和270nm处进行。样品注射量为1μL。使用HPLC级溶剂，通过定义以下流动相的流速和百分比混合物来进行梯度洗脱：
溶剂A：10mM甲酸铵水性溶液+0.04％(v/v)甲酸
溶剂B：乙腈+5.3％(v/v)溶剂A+0.04％(v/v)甲酸。
这些命名方法的保留时间(RT)以分钟为单位报告。电离以正模式、负模式或正负切换模式记录。各个方法的具体细节如下。
LCMS-V-B方法：使用连接到配有ESI-APCI多模式源的Agilent MSD 6140单四极杆的Agilent 1200SL系列仪器(方法LCMS-V-B1和LCMS-V-B2)或使用连接到配有ESI-喷射流源的Agilent TOF 6230的Agilent 1290Infinity II系列仪器(方法LCMS-V-B1)；柱：Thermo Accucore 2.6μm，C18，50mm x 2.1mm，55℃。LCMS-V-B1和LCMS-V-B2方法的梯度详细信息如下表5所示：
表5.LCMS-V-B1和LCMS-V-B2方法的梯度详细信息
LCMS-V-C方法：使用连接到带有ESI-APCI多模式源的Agilent MSD 6140单四极杆的Agilent 1200SL系列仪器；柱：Agilent Zorbax Eclipse plus 3.5μm，C18(2)，30mm x2.1mm，35℃。LCMS-V-C方法的梯度详细信息如下表6所示：
表6.LCMS-V-C方法的梯度详细信息
制备型HPLC：本发明的某些化合物通过以下来纯化：高效液相色谱(HPLC)，在Armen Spot液相色谱或Teledyne EZ系统上，用Gemini-10μM C18，250mm×50mm内径色谱柱以118mL min-1的流速运行，采用UV二极管阵列检测(210–400nm)，使用25mM NH4HCO3水溶液和MeCN或0.1％ TFA水溶液和MeCN作为洗脱液。
本发明的某些其他化合物按照如下具体命名的方法通过HPLC纯化：
HPLC-V-A方法：这些分析是在Waters FractionLynx MS自动纯化系统上进行的，配有5μm C18(2)、100mm×20mm内径Phenomenex色谱柱，以20cm3min-1的流速运行，具有UV二极管阵列检测(210–400nm)和质量定向收集。质谱仪是Waters Micromass ZQ2000质谱仪，以正离子或负离子电喷雾电离模式运行，分子量扫描范围为150至1000。
方法HPLC-V-A1(pH 4)：溶剂A：10mM醋酸铵水溶液+0.08％(v/v)甲酸；溶剂B：乙腈+5％(v/v)溶剂A+0.08％(v/v)甲酸
方法HPLC-V-A2(pH 9)：溶剂A：10mM醋酸铵水溶液+0.08％(v/v)浓氨；溶剂B：乙腈+5％(v/v)溶剂A+0.08％(v/v)浓氨
HPLC-V-B方法：在AccQPrep HP125(Teledyne ISCO)系统上进行，配备NX5μm C18(2)、150mm×21.2mm内径Phenomenex色谱柱，以20cm3min-1的流速运行，并使用UV(214和254nm)和ELS检测。
方法HPLC-V-B1(pH 4)：溶剂A：水+0.08％(v/v)甲酸；溶剂B：乙腈+0.08％(v/v)甲酸。
方法HPLC-V-B2(pH 9)：溶剂A：水+0.08％(v/v)浓氨；溶剂B：乙腈+0.08％(v/v)浓氨。
方法HPLC-V-B3(中性)：溶剂A：水；溶剂B：乙腈。
GC-MS分析：气相色谱-低分辨率质谱联用(GC-MS)在Agilent 6850气相色谱仪和Agilent 5975C质谱仪上进行，使用具有0.25μm HP-5MS涂层的15m×0.25mm色谱柱，以氦气作为载气。离子源：EI+，70eV，230℃，四极杆：150℃，接口：300℃。
高分辨率MS：高分辨率质谱在配备喷射流电喷雾离子源的Agilent 6230飞行时间质谱仪上以正离子模式采集。使用Agilent 1290Infinity HPLC系统，以1.5ml/min的流速(5mM甲酸铵水溶液和乙腈梯度程序)将0.5μl注入质谱仪。喷射流参数：干燥气体(N2)流量和温度：分别为8.0l/min和325℃；雾化器气体(N2)压力：30psi；毛细管电压：3000V；鞘气流量和温度：325℃和10.0l/min；TOFMS参数：碎裂电压：100V；撇渣器电势(skimmerpotential)：60V；OCT 1RF Vpp：750V。在m/z范围105-1700内以995.6ms/谱的采集速率采集全扫描质谱，并通过Agilent MassHunter B.04.00软件进行处理。
化学命名：IUPAC首选名称是使用MarvinSketch或JChem for Excel(JChem版本16.6.13–18.22.3)中的ChemAxon的“结构到名称”(s2n)功能生成的，或者使用Draw4.2提供的化学命名功能。
缩写
Ahx 6-己酸单体
Boc 叔丁氧基羰基
Boc2O 二碳酸二叔丁酯
AgOTf 三氟甲磺酸银
tBuOH 叔丁醇
cc.或conc. 浓缩的
CyOH 环己醇
dba (1E,4E)-1,5-二苯基戊-1,4-二烯-3-酮,二亚苄基丙酮
DCM 二氯甲烷
DEA 二乙醇胺
DIAD 二异丙基偶氮二甲酸酯
DIBAL-H 二异丁基氢化铝
DIPA N-异丙基丙-2-胺,二异丙胺
DIPEA N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺,二异丙基乙胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
ee. 对映体过量
eq. 当量
EtO2 二乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
HF×Pyr 氟化氢吡啶
hs 智人
LDA 二异丙基酰胺锂
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
MTBE 甲基叔丁基醚
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
Pd(AtaPhos)2Cl2 双(二叔丁基(4-二甲氨基苯基)膦)二氯化钯(II)
PPh3 三苯基膦
rt 室温
RT 保留时间(分钟)
on 过夜
Pd\C 钯碳
TBAF 四丁基氟化铵
TBAOH 四丁基氢氧化铵
TBDPS-Cl 叔丁基氯二苯基硅烷
TBSCl 叔丁基氯二甲基硅烷
TEA N,N-二乙基乙胺
TFA 2,2,2-三氟乙酸
pTSA 4-甲基苯磺酸
THF 四氢呋喃
TIPSCl 氯(三异丙基)硅烷
TMP-MgCl 2,2,6,6-四甲基哌啶氯化镁氯化锂络合物溶液
DIAD 二异丙基偶氮二甲酸酯
Xantphos 4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨
BrettPhos 2-(二环己基膦)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯
JosiPhos (2R)-1-[(1R)-1-(二环己基膦基)乙基]-2-(二苯基膦基)二茂铁
JosiPhos Pd G3 {(R)-1-[(Sp)-2-(二环己基膦基)二茂铁基]乙基二叔丁基膦}[2-(2′-氨基-1,1′-联苯基)]甲磺酸钯(II)
Xantphos Pd G3 [(4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨)-2-(2’-氨基-1,1’-联苯基)]甲磺酸钯(II)
BINAP 2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘
rac-BINAP Pd G3 [(2,2′-双(二苯基膦基)-1,1′-联萘)-2-(2’-氨基-1,1’-联苯基)]甲磺酸钯(II)
Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2 [1,1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)
Pd2(dba)3 三(二亚苄基丙酮)二钯(0)
Pd(PPh3)2Cl2 双(三苯基膦)氯化钯
Pd(AtaPhos)2Cl2 双(二叔丁基(4-二甲氨基苯基)膦)二氯化钯(II)
命名的一般程序
以下是代表性的实验程序，在随后的准备工作中通过名称引用。
薗头(Sonogashira)一般程序
将1当量芳基卤化物、2当量乙炔、0.05当量Pd(PPh3)2Cl2、0.05当量CuI和DIPA(1mL/mmol)在THF(5mL/mmol)中的混合物保持在60℃。达到适当的转化后，减压除去挥发物，通过快速色谱法使用庚烷/EtOAc作为洗脱剂纯化粗制中间体。
HFIP脱保护一般程序
HFIP(10mL/mmol)中的底物在压力瓶中保持在100-120℃。达到适当的转化后，减压除去挥发物，通过快速色谱法使用庚烷/EtOAc作为洗脱剂纯化粗制中间体。
脱保护和水解一般程序
在60℃下搅拌1当量底物和100当量HFxPyr在MeCN(15mL/mmol)中的混合物。达到适当的转化后，减压除去挥发物，将残余物悬浮在THF-水(30mL/mmol)的1:1混合物中，添加150当量的LiOH x H2O，并将混合物在室温搅拌。达到适当转化率后，减压除去挥发物；粗产物通过快速色谱法纯化，使用DCM和MeOH(含有1.2％ NH3)作为洗脱剂。在一些替代程序中，THF-水1:1的混合物被1,4-二噁烷-水1:1的混合物替代。
烷基化一般程序
将1当量苯酚/氨基甲酸酯、1-2当量烷基碘/溴化物和2-3当量Cs2CO3在丙酮(5mL/mmol)中的混合物对于酚类在室温搅拌，对于氨基甲酸酯类在55℃搅拌。达到适当的转化后，在减压下除去挥发物，通过快速色谱法(例如使用庚烷/EtOAc作为洗脱剂)或反相快速柱色谱法纯化粗制中间体。
用甲苯磺酸酯进行烷基化的一般程序
在烘干的小瓶中安装PTFE涂覆的磁性搅拌棒，并加入1当量甲苯磺酸酯和5当量悬浮在MeCN(5mL/mmol)中的适当胺。然后将反应混合物温热至50℃并在该温度下搅拌直至观察不到进一步的转化。将反应混合物用DCM稀释，然后将其注射到DCM预调节的硅胶柱上。然后使用DCM和MeOH(1.2％ NH3)作为洗脱剂通过快速色谱法纯化。
Buchwald一般程序I
将1当量氯底物、2当量1,3-苯并噻唑-2-胺、0.1当量Pd2(dba)3、0.2当量XantPhos和3当量DIPEA在CyOH(5mL/mmol)中的混合物保持在140℃。达到适当的转化后，将反应混合物用DCM(10mL/mmol)稀释，注射至预调节的硅胶柱上并通过快速色谱法纯化(例如使用庚烷/EtOAc作为洗脱剂)。
Buchwald一般程序II
将氯化合物，2当量1,3-苯并噻唑-2-胺、10mol％JosiPhos Pd(G3)和3当量DIPEA悬浮在1,4-二噁烷(5mL/mmol)中的混合物在回流下搅拌直至观察不到进一步的转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后将其通过120g硅胶柱上的快速色谱法纯化，使用庚烷-EtOAc或DCM-MeOH(1.2％ NH3)作为洗脱剂。
Buchwald一般程序III
将1当量噻唑胺、1.2-1.5当量(Z)-N-(6-氯-4-甲基-哒嗪-3-基)-3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚胺，3当量Cs2CO3、0.1当量Pd2(dba)3、0.2当量XantPhos和3当量DIPEA在1,4-二噁烷(5mL/mmol)中的混合物保持回流。达到适当的转化率后，减压除去挥发物，通过快速柱色谱法纯化粗制中间体。
光信一般程序I
向1当量脂肪醇、1当量氨基甲酸酯/苯酚和1当量三苯基膦在甲苯(5mL/mmol)中的混合物中添加1当量偶氮二甲酸二叔丁基酯。对于氨基甲酸酯，将混合物在50℃下搅拌，对于苯酚，将混合物在室温搅拌。达到适当的转化后，减压除去挥发物，通过快速色谱法使用庚烷/EtOAc作为洗脱剂纯化粗制中间体。
光信一般程序II
向1.0-1.5当量脂肪醇、1当量氨基甲酸酯/苯酚和1-2当量三苯基膦在THF或甲苯(5mL/mmol)中的混合物中一次性添加1-3当量偶氮二甲酸二叔丁酯/偶氮二甲酸二异丙酯。如果需要，对于氨基甲酸酯，将混合物在室温或50℃下搅拌，对于苯酚，将混合物在室温搅拌。达到适当的转化率后，减压除去挥发物，通过快速柱色谱法纯化粗制中间体。
季盐脱保护一般程序
向适当季盐的THF(5mL/mmol)溶液中添加3当量TBAF，然后将其在室温搅拌直至观察不到进一步的转化。将反应混合物减压蒸发至干燥。向1当量脱甲硅烷基季盐在干MeCN(15mL/mmol)中的悬浮液中，添加100当量HF x Pyr，然后在60℃下搅拌。达到适当的转化后，减压除去挥发物，将残余物悬浮在THF-水(30mL/mmol)的1:1混合物中，添加150当量的LiOH x H2O，并将混合物在室温搅拌。达到适当转化率后，减压除去挥发物。粗产物通过快速色谱法纯化，使用DCM和MeOH(含有1.2％ NH3)作为洗脱剂。
炔丙胺制备一般程序
烘干的小瓶配备有PTFE涂层的磁力搅拌棒，装入2当量的PPh3并且添加2当量咪唑，然后添加DCM(5mL/mmol)。向所得混合物分批加入2当量碘，然后在室温搅拌15min。向所得混合物中加入溶解在DCM中的1当量合适的醇，并在室温搅拌，直到观察不到进一步的转化。向生成的碘代化合物中加入20当量的适当胺，然后在室温搅拌30min，同时观察到完全转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用DCM和MeOH(1.2％NH3)作为洗脱剂通过快速色谱法纯化。
银催化炔丙胺制备一般程序
24ml小瓶配备搅拌棒，并装入1当量2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-(4-乙炔基-2-氟-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸、20当量多聚甲醛/丙酮和20当量适当的胺在无水乙醇(5ml/mmol)中在20mol％甲苯磺酸银存在下于80℃搅拌直至观察不到进一步的转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用DCM和MeOH(1.2％ NH3)作为洗脱剂通过快速色谱法纯化。
水解一般程序
将适当的甲酯悬浮在THF-水(5mL/mmol)1:1混合物中并且添加10当量LiOH xH2O，并将混合物在50℃搅拌。达到适当转化率后，减压除去挥发物；粗产物通过快速色谱法纯化，使用DCM和MeOH(含有1.2％ NH3)作为洗脱剂。
胺取代和水解一般程序I
向制备12和13中的产物在乙腈和N-甲基-2-吡咯烷酮(10ml/mmol)的1:1混合物中加入适当的胺(3-10当量)，并将反应混合物在50℃搅拌2-24h。通过柱色谱(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化取代产物后，将产物溶解在THF(10ml/mmol)和水(2ml/mmol)中并且添加LiOH×H2O(3-5当量)。然后，将反应混合物在20-40℃搅拌1-4h。通过制备型HPLC(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)纯化水解产物，得到所期望产物。
胺取代和水解一般程序II
向制备14_01中的产物在乙腈和N-甲基-2-吡咯烷酮(10ml/mmol)的1:1混合物中加入适当的胺(3-10当量)，并将反应混合物在50℃搅拌2-24h。在室温添加70％ HF的吡啶溶液(50-100当量)后，将混合物搅拌4-18h。通过柱色谱(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化取代产物后，将产物溶解在THF(8ml/mmol)和水(2ml/mmol)中并且添加LiOH×H2O(5当量)，并在20-40℃搅拌1-4h。通过制备型HPLC(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)纯化水解产物，得到所期望产物。
胺取代和水解一般程序III
向在乙腈(13ml/mmol)中的制备13或制备16的产物中添加适当的胺(3当量)和Na2CO3(12当量)，并将反应混合物在微波反应器中于120℃搅拌1.5-3h。在添加KOH(3当量)后，将反应混合物在120℃搅拌0.75-1h。通过制备型HPLC或HILIC色谱法(使用乙腈和5mMNH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)纯化水解产物，得到所期望产物。
烷基化、脱保护和水解一般程序
将叔胺(1当量)和烷基化剂(10当量)在乙腈(3mL/mmol)中的混合物在室温搅拌。达到适当的转化后，减压除去挥发物，必要时通过反相快速柱色谱纯化，否则将残余物直接溶解于乙腈(3mL/mmol)中，添加HF×Pyr(100当量)并在60℃搅拌混合物。达到适当的转化后，减压去除挥发物，将残余物悬浮在1,4-二噁烷-水(10mL/mmol)的1∶1混合物中，添加LiOH×H2O(150当量)并将混合物在60℃搅拌。在达到所期望产物的适当转化后，减压除去挥发物并通过反相快速柱色谱法纯化粗产物。
制备1a：甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-碘-噻唑-4-甲酸酯
将50.00g甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)噻唑-4-甲酸酯(193.55mmol，1当量)悬浮600mL干MeCN中。添加52.25g N-碘琥珀酰亚胺(232.30mmol)并将所得混合物在室温搅拌过夜。
将反应混合物用饱和盐水稀释，然后用EtOAc萃取。将合并的有机层用1M Na2S2O3萃取，然后再次用盐水萃取。然后经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩滤液。使用庚烷作为洗脱剂通过快速色谱纯化粗产物以获得60g所期望产物(156mmol，80％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 12.03/11.06(br s),3.78(s,3H),1.47(s,9H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 153.8,82.5,77.7,52.3,28.3；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C10H14IN2O4S的计算值:384.9713；发现值384.9708.
步骤B：甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(3-羟基丙-1-炔基)噻唑-4-甲酸酯
经烘箱干燥的500mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒并配备回流冷凝器。将其中装入9.6g来自步骤A的产物(25mmol，1当量)、2.80g丙-2-炔-1-醇(2.91mL，50mmol，2当量)和36.10g DIPA(50mL，356.8mmol，14.27当量)，然后添加125mL干THF，并用氩气冲洗该系统。在惰性气氛下搅拌5分钟后，添加549mg Pd(PPh3)2Cl2(1.25mmol，0.05当量)和238mg CuI(1.25mmol，0.05当量)。然后将所得混合物升温至60℃并在该温度搅拌直至观察不到进一步的转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速色谱法将其纯化，得到7.30g所期望产物(23mmol，93％产率)，呈黄色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 12.1(br s,1H),5.45(t,1H),4.36(d,2H),3.79(s,3H),1.48(s,9H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 12.1(br s,1H),5.45(t,1H),4.36(d,2H),3.79(s,3H),1.48(s,9H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C13H17N2O5S的计算值:313.0852,发现值313.0866.
步骤C：甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(3-羟基丙基)噻唑-4-甲酸酯
将配备经PTFE涂层的磁性搅拌棒的经烘箱干燥的1L压力瓶中装入44.75g来自步骤B的产物(143.3mmol，1当量)、7.62Pd/C(7.17mmol，0.05当量)在340mL乙醇中，然后使用氢化系统将其置于氮气气氛下。之后，将其充满4巴H2气体并在室温搅拌过夜。观察到完全转化，但仅形成烯烃产物。通过硅藻土垫过滤催化剂后，用5mol％新催化剂重复整个过程。将所得混合物搅拌过夜以获得完全转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速色谱柱纯化，得到31.9g所期望产物(101mmol，70.4％产率)，呈浅黄色晶体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δppm 11.61(br s,1H),4.54(t,1H),3.76(s,3H),3.43(m,2H),3.09(t,2H),1.74(m,2H),1.46(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 162.8,143.1,135.4,60.3,51.9,34.5,28.3,23.4；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C13H21N2O5S的计算值:317.1165发现值317.1164(M+H).
步骤D：甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
将配备经PTFE涂层的磁性搅拌棒的经烘箱干燥的250mL单颈圆底烧瓶中装入3.40g 2-氟代-4-碘代-苯酚(14mmol，1当量)、5.00g来自步骤C的产物(16mmol，1.1当量)和4.10g PPh3(16mmol，1.1当量)，溶解在71mL干甲苯中。在氮气气氛下搅拌5min后，将3.10mLDIAD(3.20g，16mmol，1.1当量)一次性加入，同时将反应混合物升温。然后将反应混合物加热至50℃并在该温度下搅拌30min，此时反应达到完全转化。将反应混合物直接注射到预调节的硅胶柱上，然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速色谱法将其纯化。粗产物从MeOH中结晶以得到4.64g所期望产物(9.24mmol，66％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm11.64(br s,1H),7.59(dd,1H),7.45(dd,1H),6.98(t,1H),4.06(t,2H),3.73(s,3H),3.22(t,2H),2.06(m,2H),1.46(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 134,124.9,117.6,68.2,51.9,30.5,28.3,23.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C19H23N2O5FSI的计算值:537.0350；发现值537.0348.
制备1c：甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
经烘箱干燥的250mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒并配备回流冷凝器。将其中装入5.36g制备1a(10mmol，1当量)、1.66g N,N-二甲基丙-2-炔-1-胺(20mmol，2当量)和20mL DIPA(142.7mmol，14.27当量)，然后添加50mL干THF，并用氩气冲洗该系统。在惰性气氛下搅拌5分钟后，添加220mg Pd(PPh3)2Cl2(0.5mmol，0.05当量)和95CuI(0.5mmol，0.05当量)。然后将所得混合物升温至60℃并在该温度搅拌直至观察不到进一步的转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用DCM和MeOH(1.2％ NH3)作为洗脱剂通过快速色谱法将其纯化，得到4.5g所期望产物(7.8mmol，78％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm11.66(s,1H),7.29(dd,1H),7.19(m,1H),7.12(t,1H),4.09(t,2H),3.73(s,3H),3.44(s,2H),3.23(t,2H),2.24(s,6H),2.07(m,2H),1.45(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 162.8,147.3,129,119.2,115.4,84.3,68,51.9,48.1,44.2,30.6,28.3,23.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C24H31FN3O5S的计算值:492.1962；发现值492.1956(M+H).
制备2a：3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙-1-醇
步骤A：[(戊-4-炔-1-基氧基)甲基]苯
向烘箱干燥的烧瓶中添加4-戊炔-1-醇(11.1mL，119mmol，1当量)在THF(100mL)中的溶液，并将该溶液冷却至0℃。分批添加氢化钠(60％分散体；7.13g，178mmol，1.5当量)，在逐滴添加苄基溴(15.6mL，131mmol，1.1当量)之前，允许混合物在0℃下搅拌30min。使混合物升温至环境温度并搅拌16h，然后冷却至0℃，用饱和氯化铵水性溶液(30mL)淬灭并用水(30mL)稀释。将混合物用乙酸乙酯(2x150mL)萃取，将合并的有机萃取物依次用稀氢氧化铵水溶液、氢氧化铵(150mL)和盐水(100mL)洗涤，干燥(硫酸镁)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，330g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–10％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈黄色液体的所期望产物(19.5g，112mmol，94％)。LC/MS(C12H14O)175[M+H]+；RT 1.28(LCMS-V-B1).1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.37–7.32(m,4H),7.31–7.27(m,1H),4.52(s,2H),3.58(t,J＝6.1Hz,2H),2.32(td,J＝7.1,2.6Hz,2H),1.95(t,J＝2.7Hz,1H),1.83(tt,J＝7.1,6.2Hz,2H).
步骤B：[(己-4-炔-1-基氧基)甲基]苯
向烘箱干燥的烧瓶中，添加来自步骤A的产物(19.5g，112mmol，1当量)和四氢呋喃(200mL)并将该溶液冷却至-78℃。经30min逐滴添加n-丁基锂(66.9mL，135mmol，1.2当量)并将该反应物搅拌1h，然后逐滴添加碘甲烷(10.5mL，168mmol，1.5当量)并允许该混合物经1h升温至0℃。将该反应物通过添加饱和氯化铵水性溶液(40mL)淬灭，用水(40mL)稀释，用乙酸乙酯(3x100mL)萃取，并且将该合并的有机提取物用2M硫代硫酸钠水性溶液(200mL)和盐水(200mL)依次清洗，干燥(硫酸镁)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，330g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–10％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈黄色液体的所期望产物(19.2g，0.1mol，91％)。LC/MS(C13H16O)189[M+H]+；RT1.34(LCMS-V-B1).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.41–7.23(m,5H),4.46(s,2H),3.48(t,J＝6.3Hz,2H),2.23–2.14(m,2H),1.72(s,3H),1.70–1.65(m,2H).
步骤C：4-[3-(苄基氧基)丙基]-3,6-二氯-5-甲基哒嗪
将3,6-二氯-1,2,4,5-四嗪(5g，33.1mmol，1当量)和来自步骤B的产物(7.48g，39.8mmol，1.2当量)在四氢呋喃(30mL)中的溶液在密封烧瓶中在160℃加热19h。使反应冷却至环境温度，然后真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，220g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–30％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈橙色油状物的所期望产物(7.32g，23.5mmol，71％)。LC/MS(C15H16Cl2N2O)311[M+H]+；RT 1.35(LCMS-V-B1).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.45–7.18(m,5H),4.48(s,2H),3.53(t,J＝5.9Hz,2H),2.96–2.83(m,2H),2.42(s,3H),1.88–1.69(m,2H).
步骤D：3-(3,6-二氯-5-甲基哒嗪-4-基)丙-1-醇
向来自步骤C的产物(7.32g，23.5mmol，1当量)在二氯甲烷(100mL)中的冷却溶液中逐滴添加三氯化硼溶液(1M，在二氯甲烷中；58.8mL，58.8mmol，2.5当量)，并允许该混合物在环境温度搅拌1h。通过添加甲醇将该反应物淬灭并在真空中浓缩。将残余物在二氯甲烷(100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(150mL)之间分配，将有机相用盐水(150mL)洗涤，干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，80g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–80％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈黄色油状物的所期望产物(4.19g，19mmol，81％)。LC/MS(C8H10Cl2N2O)221[M+H]+；RT 0.84(LCMS-V-B1).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.67(t,J＝5.1Hz,1H),3.49(td,J＝6.0,5.1Hz,2H),2.91–2.80(m,2H),2.43(s,3H),1.72–1.59(m,2H).
制备2ab：3,6-二氯-4-(3-碘丙基)-5-甲基-哒嗪
将PPh3(59.3g，2当量)、咪唑(15.4g，2当量)和碘(57.4g，2当量)在560mL DCM中搅拌15min后，添加25.0g制备2a(113mmol)并搅拌2h。使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速色谱法纯化产物，得到34.7g所期望产物(92％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 3.41(t,2H),2.89(m,2H),2.43(s,3H),1.97(m,2H)；13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 157.7,156.8,141.5,140.2,31.4,31.1,16.7,7.8；HRMS(ESI)[M]+针对C8H9Cl2IN2的计算值:330.9266,发现值330.9255.
制备3a：甲基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：甲基2-{[(叔丁氧基)羰基][3-(3,6-二氯-5-甲基哒嗪-4-基)丙基]氨基}-5-[3-(2-氟-4-碘苯氧基)丙基]-1,3-噻唑-4-甲酸酯
使用光信通用程序I，从4.85g制备1a(9.04mmol，1当量)作为合适氨基甲酸酯和2g制备2a(9.04mmol，1当量)作为合适醇开始，获取4.6g期望的产物(69％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.56(dd,1H),7.44(dm,1H),7.08(m,2H),6.96(t,1H),4.05(t,2H),3.75(s,3H),3.21(t,2H),2.82(m,2H),2.4(s,3H),2.06(m,2H),1.88(m,2H),1.48(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 162.7,157.6,156.7,156.5/153.2,152.2,147,142.1,139.8,134,124.9,117.6,84,82.4,68.1,52.1,46.1,30.4,28.1,27.5,25.8,23.1,16.4；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C27H31Cl2FIN4O5S的计算值:739.0415,发现值739.0395.
步骤B：甲基2-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用HFIPA脱保护通用程序，从来自步骤A的产物作为合适氨基甲酸酯开始，获取3.70g期望的产物(97％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.71(t,1H),7.59(dd,1H),7.44(dm,1H),6.96(t,1H),4.03(t,2H),3.7(s,3H),3.29(m,2H),3.11(t,2H),2.84(m,2H),2.39(s,3H),2(m,2H),1.76(m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 164.6,163,152.3,147.1,134.1,124.8,117.6,82.4,68.1,51.9,44,30.7,28,26.9,23.3,16.4；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C22H23Cl2FIN4O3S的计算值:638.9891,发现值638.9888.
步骤C：甲基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
将3g来自步骤B的产物(4.69mmol，1当量)和1.81g碳酸铯(9.3853mmol，2当量)的悬浮液在80℃在25mL干1,4-二噁烷中搅拌3h至达到完全转化。将反应混合物直接蒸发至硅藻土，然后使用DCM-MeOH作为洗脱剂通过快速色谱法纯化以获得2.67g的标题化合物(94％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.57(dd,1H),7.43(dm,1H),6.97(t,1H),4.23(t,2H),4.08(t,2H),3.77(s,3H),3.22(t,2H),2.86(t,2H),2.29(s,3H),2.08(m,2H),2.03(m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 163.1,155.4,152.2,151.6,151.2,147,142.5,136,134.8,134,128.9,124.9,117.6,82.3,68.4,51.9,46.3,30.7,24.2,23,19.7,15.7；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C22H22ClFIN4O3S的计算值:603.0124,发现值603.0108.
制备3c：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-(4-乙炔基-2-氟-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-[2-氟-4-(2-三甲基甲硅烷乙炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
经烘箱干燥的250mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒并配备回流冷凝器。将其中装入5g制备3a(8.29mmol，1当量)、2.34mL乙炔基(三甲基)硅烷(16.58mmol，2当量)和10mL DIPEA，然后添加40mL干THF，并用氩气冲洗该系统。在惰性气氛下搅拌5分钟后，添加182mg Pd(PPh3)2Cl2(0.41mmol，0.05当量)和79mg(0.41mmol，0.05当量)。然后将所得混合物升温至60℃并在该温度下搅拌2小时以达到完全转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用庚烷-EtOAc作为洗脱剂通过快速色谱法纯化得到4.26g所期望产物(89％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.31(dd,1H),7.23(dn,1H),7.13(t,1H),4.25(t,2H),4.12(t,2H),3.77(s,3H),3.24(t,2H),2.87(t,2H),2.31(s,3H),2.1(m,2H),2.03(m,2H),0.21(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 163.0,155.3,151.7,151.3,136.1,129.4,129.0,119.4,115.3,104.6,93.7,68.2,51.9,46.3,30.7,24.1,23.0,19.7,15.7,0.4；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C27H30ClFN4O3SSi的计算值:573.1553,发现值573.1549.
步骤B：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-(2-三甲基甲硅烷乙炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
将配备经PTFE涂层的磁性搅拌棒的经烘箱干燥的100mL单颈圆底烧瓶中装入4.25g来自步骤A的产物(7.4mmol，1.0当量)、2.23g 1,3-苯并噻唑-2-胺(14.8mmol，2.0当量)和3.87mL DIPEA(2.87mg，22.2mmol，3.0当量)，然后添加40mL环己醇，并用氩气冲洗该系统。在惰性气氛下搅拌5分钟后，添加679mg Pd2(dba)3(0.74mmol，0.10当量)和858mgXantPhos(1.48mmol，0.20当量)。然后将所得混合物升温至140℃并在该温度下搅拌30min以达到完全转化。将反应混合物用DCM稀释并直接注射到预调节的硅胶柱上，然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速色谱法将其纯化。合并纯级分并减压浓缩，得到3.90g所期望产物(77％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 12.27/10.91(brs,1H),8.1-7.1(brm,4H),7.34(dd,1H),7.24(dm,1H),7.16(t,1H),4.25(t,2H),4.15(t,2H),3.78(s,3H),3.28(t,2H),2.87(t,2H),2.34(s,3H),2.13(m,2H),2.04(m,2H),0.19(s,9H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C34H36FN6O3S2Si的计算值:687.2038,发现值687.2020.
步骤C：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-(4-乙炔基-2-氟-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸
经烘箱干燥的10mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒并配备回流冷凝器。将其中装入343mg来自步骤B的产物(0.5mmol，1.0当量)，该产物溶解在2.5mL THF/H2O(4:1)中。然后添加105mg LiOH x H2O(2.50mmol，5.0当量)并将所得混合物加热至60℃并在此温度下搅拌4h。反应达到完全转化。将硅藻土凝胶添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用DCM和MeOH(1.2％ NH3)作为洗脱剂通过快速色谱法纯化，得到200mg标题化合物(66％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.88(d,1H),7.49(br.,1H),7.37(t,1H),7.36(dd,1H),7.25(dm,1H),7.19(t,1H),7.16(t,1H),4.27(t,2H),4.15(t,2H),4.11(s,1H),3.27(t,2H),2.87(t,2H),2.33(s,3H),2.14(m,2H),2.04(m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 164.2,151.5,147.9,129.4,126.5,122.5,122.3,119.5,115.5,114.5,82.9,80.5,68.5,46.2,31.0,23.9,23.1,20.3,12.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C30H26FN6O3S2的计算值:601.1486,发现值601.1498.
制备3d：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-(3-羟基丙-1-炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)噻唑-4-甲酸酯
使用薗头一般程序从4.00g的制备3a(6.63mmol，1.0当量)和2.26g叔丁基-二甲基-丙-2-炔氧基-硅烷(13.27mmol，2当量)作为合适的乙炔开始，得到2.80g所期望产物(65％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.27(dd,1H),7.19(dd,1H),7.14(t,1H),4.51(s,1H),4.25(m,2H),4.12(t,2H),3.77(s,3H),3.24(t,2H),2.87(t,2H),2.3(s,3H),2.1(quint.,2H),2.03(m,2H),0.88(s,9H),0.12(s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm163.0,128.9,119.1,115.5,68.3,52.1,51.9,46.3,30.7,26.2,24.2,23.0,19.7,15.7,-4.6；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C31H39ClFN4O4SSi的计算值:645.2128,发现值645.2120.
步骤B：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序II从来自步骤A的2.8g产物(4.34mmol，1.0当量)和1.30g1,3-苯并噻唑-2-胺(8.67mmol，2.0当量)开始，获得2.1g所期望产物(64％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 12.25/10.91(brs 1H),7.88(br,1H),7.51(br,1H),7.37(t,1H),7.29(dd,1H),7.2(t,1H),7.2(dd,1H),7.17(t,1H),4.49(s,2H),4.25(t,2H),4.14(t,2H),3.77(s,3H),3.27(t,2H),2.86(t,2H),2.32(s,3H),2.13(qn,2H),2.04(qn,2H),0.87(s,9H),0.1(s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 163.2,155.7,151.6,148.5,147.6,141.5,128.9,127.6,126.5,122.5,122.3,119.1,116.9,115.5,114.8,88.2,84,68.4,52.1,51.9,46.4,31,26.2,24,23.1,20.4,12.9,-4.6；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C38H44FN6O4S2Si的计算值:759.2613,发现值759.2609.
步骤C：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-(3-羟基丙-1-炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
经烘箱干燥的100mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒并配备回流冷凝器。将其中装入2.10g来自步骤B的产物(2.76mmol，1.0当量)，该产物溶解在15mL THF中。然后经2分钟的时间通过注射器逐滴添加3.32mL TBAF(3.32mmol，1.2当量，1M，在THF中)，并在该温度搅拌30min。用饱和NH4Cl对该反应混合物淬灭，然后直接蒸发至硅藻土，并使用庚烷-EtOAc作为洗脱剂通过快速色谱法将其纯化，得到1.6g期望的产物(90％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 11.14(brs,1H),7.83(brd,1H),7.49(brs,1H),7.36(m,1H),7.24(dd,1H),7.19(m,1H),7.18(dm,1H),7.15(t,1H),5.08(t,1H),4.28(m,2H),4.27(d,2H),4.17(t,2H),3.8(s,3H),3.29(m,2H),2.89(m,2H),2.35(s,3H),2.15(m,2H),2.07(m,2H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C32H30FN6O4S2的计算值:645.1748,发现值645.1738.
制备3f：乙基2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-1,3-噻唑-4-甲酸酯
步骤A：乙基2-[(己-4-炔-1-基)氨基]-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向乙基2-溴代-1,3-噻唑-4-甲酸酯(1.17g，4.97mmol，1当量)在乙腈中的溶液(16mL)中添加己-4-炔-1-胺(725mg，7.46mmol，1.5当量)和三乙胺(1.04mL，7.46mmol，1.5当量)并将该混合物在微波照射下在150℃加热4h。将反应在乙酸乙酯和盐水之间分配，将有机相干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，40g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–60％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈米色固体的所期望产物(741mg，2.94mmol，59％)。LC/MS(C12H16N2O2S)253[M+H]+；RT 2.32(LCMS-V-C).
步骤B：乙基2-{3-氯-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向3,6-二氯-1,2,4,5-四嗪(443mg，2.94mmol，1当量)在四氢呋喃(15mL)中的溶液中添加来自步骤A的产物(741mg，2.94mmol，1当量)并将该混合物在密封管中在110℃加热过夜。将反应真空浓缩并将残余物与甲醇一起研磨，过滤并在真空下干燥以提供呈米色固体的所期望产物(607mg，1.79mmol，61％)。LC/MS(C14H15ClN4O2S)339[M+H]+；RT 2.41(LCMS-V-C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(s,1H),4.38-4.25(m,4H),2.92(t,J＝6.3Hz,2H),2.34(s,3H),2.14–2.01(m,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H).
步骤C：乙基2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向烘箱干燥的微波小瓶添加来自步骤B的产物(607mg，1.79mmol，1当量)、2-氨基苯并噻唑(404mg，2.69mmol，1.5当量))、XantPhos(207mg，0.36mmol，0.2当量)、碳酸铯(1.17g，3.58mmol，2当量)和1,4-二噁烷(36mL)并将该容器排空并用氮气冲洗，然后添加三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(164mg，0.18mmol，0.1当量)并将该混合物用氮气喷淋(10min)然后在150℃在微波照射下加热4小时。将反应用乙酸乙酯稀释并通过硅藻土过滤，然后用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，24g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–100％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到固体，用乙醚研磨，过滤并真空干燥，得到所期望产物，呈黄色固体(329mg，0.73mmol，41％)。LC/MS(C21H20N6O2S2)453[M+H]+；RT 2.73(LCMS-V-C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(br s+s,2H),7.65(br s,1H),7.43–7.31(m,1H),7.28–7.15(m,1H),4.35-4.25(m,4H),2.96–2.85(m,2H),2.36(s,3H),2.15–2.00(m,2H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H).
制备3g：乙基5-(3-羟基丙基)-2-(4-甲基-3-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
步骤A：乙基2-(4-甲基-3-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向来自制备3f的产物(11.7g，25.8mmol，1当量)在二甲基甲酰胺(700mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙基胺(13.5mL，77.4mmol，3当量)。5min后，混合物冷却至0℃，加入4-(二甲基氨基)吡啶(630mg，5.16mmol，0.2当量)和2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(13.6mL，77.4mmol，3当量)并将该混合物在环境温度下搅拌过夜。将反应真空浓缩，然后在二氯甲烷和盐水之间分配，将有机相干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，330g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–40％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈黄色固体的所期望产物(9.61g，16.5mmol，64％)。LC/MS(C27H34N6O3SiS2)583[M+H]+；RT 2.90(LCMS-V-C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(s,1H),7.82(dd,J＝7.7,1.1Hz,1H),7.49-7.38(m,2H),7.28-7.19(m,1H),5.86(s,2H),4.38–4.23(m,4H),3.77-3.67(m,2H),2.89(t,J＝6.2Hz,2H),2.38(s,3H),2.13–2.01(m,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H),0.91(dd,J＝8.5,7.4Hz,2H),-0.11(s,9H).
步骤B：乙基5-溴-2-(4-甲基-3-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向步骤A的产物(9.61g，16.5mmol，1当量)在二氯甲烷中的溶液(400mL)中添加N-溴琥珀酰亚胺(3.52g，19.8mmol，1.2当量)并将该混合物在环境温度搅拌过夜。反应在二氯甲烷和水之间分配，将有机相用盐水洗涤，干燥(PTFE分相器)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，220g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–40％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈黄色固体的所期望产物(9.66g，14.6mmol，89％)。LC/MS(C27H33BrN6O3SiS2)663[M+H]+；RT 3.13(LCMS-V-C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.84(dd,J＝7.5,1.1Hz,1H),7.59-7.38(m,2H),7.24(ddd,J＝8.3,6.7,1.7Hz,1H),5.85(s,2H),4.37-4.23(m,4H),3.72(dd,J＝8.5,7.4Hz,2H),2.87(t,J＝6.2Hz,2H),2.38(s,3H),2.13–2.00(m,2H),1.32(t,3H),0.95-0.81(m,2H),-0.12(s,9H).
步骤C：乙基5-[(1E)-3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]丙-1-烯-1-基]-2-(4-甲基-3-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向烘箱干燥的密封烧瓶中添加来自步骤B的产物(9.66g，14.6mmol，1当量)、(E)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丙烯-1-基-硼酸频哪醇酯(5.74mL，17.5mmol，1.2当量)、碳酸钾(6.05g，43.8mmol，3当量)、[1,1’-二(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(1.19g，1.46mmol，0.1当量)、四氢呋喃(360mL)和水(120mL)，并将该混合物用氮气喷淋(10min)然后在120℃加热2h。将反应在乙酸乙酯和水之间分配，将有机层用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，220g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–30％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈黄色固体的所期望产物(6.46g，8.58mmol，59％)。LC/MS(C36H52N6O4Si2S2)753[M+H]+；RT 1.62(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.80(dd,J＝7.6,1.0Hz,1H),7.51-7.38(m,3H),7.24(ddd,J＝8.3,6.8,1.8Hz,1H),6.28(dt,J＝16.0,4.3Hz,1H),5.85(s,2H),4.37(dd,J＝4.4,2.1Hz,2H),4.35-4.25(m,4H),3.72(dd,J＝8.5,7.4Hz,2H),2.88(t,J＝6.3Hz,2H),2.37(s,3H),2.09–1.99(m,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H),0.93(s,9H),0.92-0.83(m,2H),0.11((s,6H),-0.11(s,9H).
步骤D：乙基5-{3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]丙基}-2-(4-甲基-3-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
在氮气气氛下向来自步骤C的产物(6.46g，8.58mmol，1当量)在乙酸乙酯中的溶液(300mL)中添加铂(IV)氧化物(390mg，1.72mmol，0.2当量)。将容器抽真空并用氮气回填(x3)，然后抽真空，置于氢气气氛下，并在环境温度下振荡3天。将反应物通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗脱并真空浓缩，得到所期望产物，呈棕色胶状物(6.72g，8.9mmol，＞100％)。LC/MS(C36H54N6O4Si2S2)755[M+H]+；RT 1.67(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(d,1H),7.48-7.35(m,2H),7.24(ddd,J＝8.2,6.5,1.9Hz,1H),5.84(s,2H),4.33–4.22(m,4H),3.76-3.62(m,4H),3.15(t,J＝7.5Hz,2H),2.87(t,J＝6.4Hz,2H),2.37(s,3H),2.10–1.98(m,3H),1.91–1.79(m,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H),0.95-0.85(m,11H),0.06(s,6H),-0.12(s,9H).
步骤E：乙基5-(3-羟基丙基)-2-(4-甲基-3-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤D的产物(6.72g，8.9mmol，1当量)在1,4-二噁烷(400mL)中的溶液添加盐酸(4M，在二噁烷中；67mL，267mmol，30当量)并将该混合物在环境温度搅拌1h。将该反应物冷却至0℃并用1N氢氧化钠水溶液(300mL)中和，然后在乙酸乙酯和水之间分配，将该有机相干燥(硫酸镁)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，120gRediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–80％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到固体，用乙醚研磨，过滤并真空干燥，得到所期望产物，呈白色固体(3.87g，6.04mmol，68％)。LC/MS(C30H40N6O4SiS2)641[M+H]+；RT 2.80(LCMS-V-C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.83(dd,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.48-7.37(m,2H),7.23(ddd,J＝8.3,6.7,1.8Hz,1H),5.85(s,2H),4.56(t,J＝5.1Hz,1H),4.33–4.22(m,4H),3.72(dd,J＝8.6,7.3Hz,2H),3.48(td,J＝6.3,5.1Hz,2H),3.17-3.08(m,2H),2.88(t,J＝6.4Hz,2H),2.38(s,3H),2.11–1.99(m,2H),1.87-1.75(m,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H),0.96–0.86(m,2H),-0.11(s,9H).
制备4c：叔丁基N-[3-(3-氟-4-羟基-苯基)丙-2-炔基]-N-甲基-氨基甲酸酯
使用薗头一般程序从10.00g 2-氟-4-碘苯酚(42.0mmol，1当量)作为合适的苯酚和10.67g叔丁基N-甲基-N-丙-2-炔基氨基甲酸酯(63.1mmol，1.5当量)作为炔烃，获得10.8g(92％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 10.32(s,1H),7.22(brd,1H),7.08(dm,1H),6.92(dd,1H),4.21(s,2H),2.85(s,3H),1.41(s,9H)；13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 150.8,146.4,129.0,119.6,118.4,113.2,84.4,82.7,38.5,33.8,28.5；HRMS-ESI(m/z):[M-C4H8+H]+针对C11H11FNO3的计算值:224.0717,发现值224.0720.
制备7：叔丁基-二苯基-[2-[[3,5-二甲基-7-[[5-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑-1-基]甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙氧基]硅烷
步骤A：3-溴-5,7-二甲基金刚烷-1-甲酸
在0℃将铁(6.7g，120mmol)在溴(30.7mL，600mmol，5当量)中搅拌1h后，添加3,5-二甲基金刚烷-1-甲酸(25g，1当量)并将该反应混合物在室温搅拌2天。添加EtOAc后，将反应混合物在0℃用饱和硫代硫酸钠溶液小心处理并搅拌15min。通过硅藻土垫过滤并用EtOAc冲洗后，分离有机相，用饱和硫代硫酸钠溶液和盐水洗涤，干燥，浓缩得到所期望产物(34.28g，74.6％)，其无需进一步纯化即可使用。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 12.33(br.,1H),2.21(s,2H),1.96/1.91(d+d,4H),1.50/1.43(d+d,4H),1.21/1.14(dm+dm,2H),0.86(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 176.8,66.8,54.0,48.7,48.5,45.7,43.3,35.5,29.4；HRMS-ESI(m/z):[M-H]-针对C13H18BrO2的计算值:285.0496；发现值285.0498.
步骤B：3-溴-5,7-二甲基-1-金刚烷基-甲醇
向在THF(77.6mL)中的来自步骤A的产物(34.3g，119mmol)中缓慢添加BH3-THF在THF中的1M溶液(358mL，3当量)并将该反应混合物搅拌18h。添加甲醇并搅拌30min后，通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(16.19g，49.6％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.51(t,1H),3.05(d,2H),1.91(s,2H),1.91(s,4H),1.19/1.09(d+d,2H),1.19/1.05(d+d,4H),0.85(s,6H)13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 70.4,68.9,54.9,49.8,49.3,43.8,41.4,35.7,29.7；HRMS-ESI(m/z):[M-Br]-针对C13H21O的计算值:193.1598发现值:193.1589.
步骤C：1-[3-溴-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]吡唑
向在甲苯(178mL)中的来自步骤B的产物(16.19g，59.26mmol)和1H-吡唑(4.841g，1.2当量)中一次性添加氰基亚甲基三丁基磷烷(18.64mL，1.2当量)并将该反应混合物在90℃搅拌2h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(17.88g，93％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.63(d,1H),7.43(d,1H),6.23(t,1H),3.90(s,2H),1.92-1.02(m,12H),0.83(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.0,131.8,105.2,67.7,61.4,54.4/48.8/44.6,50.4,35.7,29.6；HRMS-ESI(m/z):[M]+针对C16H23BrN2的计算值:322.1045发现值:322.1014.
步骤D：5-甲基-1-[[-3-溴-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]吡唑
在-78℃向来自步骤C的产物(17.88g，55.3mmol)在THF(277mL)中的溶液中添加丁基锂(2.5M，在THF中，66mL，3当量)，然后1h后，添加碘甲烷(17.2mL，5当量)。10min后，将反应混合物用NH4Cl饱和溶液淬灭，用EtOAc萃取，将合并的有机层干燥并浓缩，得到所期望产物(18.7g，100％)，其无需进一步纯化即可用于下一步。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm7.31(d,1H),6.00(d,1H),3.79(s,2H),2.23(s,3H),2.01(s,2H),1.89/1.85(d+d,4H),1.23/1.15(d+d,4H),1.16/1.05(d+d,2H),0.83(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm139.2,138.0,105.2,67.8,57.8,54.4,50.6,48.8,44.8,41.5,35.7,29.6,11.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C17H26BrN2的计算值:337.1279发现值:337.1289.
步骤E：2-[[-3,5-二甲基-7-[(5-甲基吡唑-1-基)甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙醇
在120℃将来自步骤D的产物(18.7g，55.3mmol)、乙二醇(123mL，40当量)和DIPEA(48.2mL，5当量)的混合物搅拌6h。在将该反应混合物用水稀释并用EtOAc萃取后，将合并的有机层干燥并浓缩得到期望的产物(18.5g，105％)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.29(d,1H),5.99(d,1H),4.45(t,1H),3.78(s,2H),3.39(q,2H),3.32(t,2H),2.23(s,3H),1.34(s,2H),1.27/1.21(d+d,4H),1.13/1.07(d+d,4H),1.04/0.97(d+d,2H),0.84(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.0,137.8,105.1,74.0,62.1,61.5,58.5,50.1,47.0,46.1,43.3,39.7,33.5,30.2,11.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C19H31N2O2的计算值:319.2386发现值:319.2387.
步骤F：叔丁基-二苯基-[2-[[-3,5-二甲基-7-[(5-甲基吡唑-1-基)甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙氧基]硅烷
向来自步骤E的产物(17.6g，55.3mmol)和咪唑(5.65g，1.5当量)在DCM(150ml)中的混合物中添加叔丁基-氯代-二苯基-硅烷(18.6g，1.2当量)并将该反应混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(27.0g，87.8％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.72-7.34(m,10H),7.29(d,1H),5.99(br.,1H),3.78(s,2H),3.67(t,2H),3.44(t,2H),2.21(s,3H),1.33(s,2H),1.26/1.18(d+d,4H),1.12/1.06(d+d,4H),1.03/0.96(d+d,2H),0.98(s,9H),0.82(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.0,137.8,105.1,74.2,64.4,61.7,58.5,50.0,46.9,46.0,43.4,39.6,33.5,30.1,27.1,19.3,11.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C35H49N2O2Si的计算值:557.3563发现值:557.3564.
步骤G：叔丁基-二苯基-[2-[[3-[(4-碘-5-甲基-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙氧基]硅烷
向来自步骤F的产物(27.0g，48.56mmol)在DMF(243mL)中的溶液中添加N-碘代琥珀酰亚胺(13.6g，1.25当量)并将该反应混合物搅拌2h。在用水稀释后，将该混合物用DCM萃取。将合并的有机层用饱和硫代硫酸钠溶液和盐水洗涤，干燥并浓缩，得到所期望产物(30.1g，90％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.68-7.37(m,10H),7.45(s,1H),3.89(s,2H),3.67(t,2H),3.44(t,2H),2.23(s,3H),1.30(s,2H),1.26/1.17(d+d,4H),1.12/1.05(d+d,4H),1.00/0.96(d+d,2H),0.98(s,9H),0.82(s,6H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δppm142.5,140.8,133.7,64.4,61.7,60.3,59.9,49.9,46.8,45.9,43.2,39.7,33.5,30.1,27.1,19.3,12.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C35H48IN2O2Si的计算值:683.2530发现值:683.2533.
步骤H：叔丁基-二苯基-[2-[[3,5-二甲基-7-[[5-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑-1-基]甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙氧基]硅烷
在0℃向在THF(128mL)中的来自步骤G的产物(17.5g，25.6mmol)中添加氯代(异丙基)镁-LiCl(1.3M，在THF中，24mL，1.2当量)，搅拌40min，用2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(15.7mL，3当量)处理，并将该反应混合物搅拌10min。在用NH4Cl饱和溶液稀释并用EtOAc萃取后，将合并的有机相浓缩并通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到所期望产物(15.2g，86.9％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.65(dm,4H),7.47(s,1H),7.45(tm,2H),7.40(tm,4H),3.80(s,2H),3.66(t,2H),3.44(t,2H),2.35(s,3H),1.35-0.94(m,12H),1.24(s,12H),0.97(s,9H),0.83(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 146.9,144.3,135.6,130.2,128.2,104.7,83.0,74.2,64.4,61.7,58.4,30.1,27.1,25.2,19.3,12.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C41H60BN2O4Si的计算值:683.4415发现值:683.4423.
制备8：叔丁基-[3-[3,5-二甲基-7-[[5-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑-1-基]甲基]-1-金刚烷基]丙氧基]-二苯基-硅烷
步骤A：1-[[3-烯丙基-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑
向在THF(232mL)中的制备7步骤D的产物(15.66g，46.43mmol)和AgOTf(597mg，0.05当量)中添加烯丙基-Mg-Cl在THF中的2M溶液(46.4mL，2当量)，并将该反应混合物搅拌0.5h。用NH4Cl饱和溶液淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相浓缩并通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(11.32g，81.7％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.27(d,1H),5.98(m,1H),5.76(m,1H),5.01/4.96(dm+dm,2H),3.73(s,2H),2.22(s,3H),1.83(d,2H),1.15-0.93(m,12H),0.78(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.0,137.7,135.0,117.7,105.0,59.0,47.8,44.2,35.0,31.8,30.6,11.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C20H31N2的计算值:299.2487发现值:299.2485.
步骤B：3-[3,5-二甲基-7-[(5-甲基吡唑-1-基)甲基]-1-金刚烷基]丙-1-醇
向在THF(85mL)中的步骤A的产物(10.2g，34.17mmol)中添加BH3-THF在THF中的1M溶液(85.4mL，2当量)并将该反应混合物搅拌1h。在0℃后用10M NaOH溶液(24mL，7当量)和33％过氧化氢溶液(73mL，25当量)处理后，在室温将该反应物搅拌1h。然后，将其用HCl水溶液淬灭，用EtOAc萃取，并通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(9.75g，90％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.28(d,1H),5.98(m,1H),4.33(t,1H),3.73(s,2H),3.32(m,2H),2.22(brs,3H),1.32(m,2H),1.12-0.92(m,12H),1.06(m,2H),0.78(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 137.7,105.0,62.1,59.1,39.7,30.7,26.5,11.9,HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C20H33N2O的计算值:317.2593发现值:317.2590
步骤C：叔丁基-[3-[3,5-二甲基-7-[(5-甲基吡唑-1-基)甲基]-1-金刚烷基]丙氧基]-二苯基-硅烷
向在DCM(92ml)中的步骤B的产物(9.75g，30.8mmol)和咪唑(3.1g，1.5当量)中添加叔丁基-氯代-二苯基-硅烷(9.45mL，1.2当量)，并将该反应混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(12.5g，73％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.63-7.39(m,10H),7.27(d,1H),5.98(d,1H),3.72(s,2H),3.59(t,2H),2.21(s,3H),1.42(m,2H),1.1-0.92(br.,12H),1.09(m,2H),0.98(s,9H),0.77(s,6H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 137.7,105.0,64.8,59.1,39.3,38.0,34.2,31.8,30.6,27.2,26.1,19.2,11.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C36H51N2OSi的计算值:555.3771发现值:555.3770.
步骤D：叔丁基-[3-[3-[(4-碘-5-甲基-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]丙氧基]-二苯基-硅烷
向在DMF(112mL)中的步骤C的产物(12.5g，22.54mmol)中添加N-碘代琥珀酰亚胺(6.34g，1.25当量)并将该反应混合物搅拌2h。在用硫代硫酸钠饱和溶液淬灭并用DCM萃取后，将合并的有机相用饱和硫代硫酸钠和盐水清洗、干燥、并蒸发以提供期望的产物(16.3g，105％)。LC/MS(C36H50IN2OSi)681[M+H]+.
步骤E：叔丁基-[3-[3,5-二甲基-7-[[5-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑-1-基]甲基]-1-金刚烷基]丙氧基]-二苯基-硅烷
在0℃向在THF(119mL)中的步骤D的产物(16.25g，23.9mmol)中添加氯代(异丙基)镁-LiCl(1.3M，在THF中，22mL，1.2当量)，将该混合物搅拌40min，用2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(14.6mL，3当量)处理，并搅拌10min。在用NH4Cl饱和溶液稀释并用EtOAc萃取后，将合并的有机相浓缩并通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到所期望产物(11.4g，70％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.59(d,4H),7.46(s,1H),7.45(t,2H),7.43(t,4H),3.74(s,2H),3.59(t,2H),2.35(s,3H),1.41(qn,2H),1.24(s,12H),1.09(m,2H),1.08(s,4H),1.05(s,2H),0.98(s,9H),0.98(s,2H),0.94(s,4H),0.78(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 146.9,144.2,135.5,133.8,130.3,128.3,104.6,83.0,64.7,64.7,59.0,50.6,48.2,46.5,44.1,39.2,37.9,31.8,30.7,27.2,26.1,25.2,19.2,12.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H62BN2O3Si的计算值:681.4623发现值:681.4631.
制备10：甲基3-溴-6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-l)丙基氨基]吡啶-2-甲酸酯
步骤A：甲基6-[双(叔丁氧基羰基)氨基]-3-溴-吡啶-2-甲酸酯
在0℃向在DCM(541mL)中的甲基6-氨基-3-溴-吡啶-2-甲酸酯(25.0g，108.2mmol)和DMAP(1.3g，0.1当量)中添加Boc2O(59.0g，2.5当量)并将该反应混合物搅拌2.5h。在添加NaHCO3饱和溶液并用DCM萃取后，将合并的有机相干燥和浓缩以提供期望的产物(45.0g，72.3％)。LC/MS(C17H23BrN2O6Na)453[M+Na]+.
步骤B：甲基3-溴-6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-甲酸酯
在0℃向在DCM(370mL)中的来自步骤A的产物(42.7g，74.34mmol)中添加TFA(17.1mL，3当量)，并将该反应混合物搅拌18h。在用NaHCO3饱和溶液和盐水清洗后，将合并的有机相干燥、浓缩，并通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(28.3g，115.2％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 10.29(s,1H),8.11(d,1H),7.88(d,1H),3.87(s,3H),1.46(s,9H)13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 165.6,153.1,151.8/148.3,143.5,116.3,109.2,53.2,28.4.LC/MS(C12H15BrN2O4Na)353[M+Na]+.
步骤C：甲基3-溴-6-[叔丁氧基羰基-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基]氨基]吡啶-2-甲酸酯
向在丙酮(150mL)中的来自步骤B的产物(10.0g，30.1967mmol)中添加Cs2CO3(29.5g，3当量)和3,6-二氯-4-(3-碘代丙基)-5-甲基-哒嗪(制备2ab，9.9g，1当量)并将该反应混合物搅拌18h。在用水稀释并用EtOAc萃取后，将合并的有机相用盐水清洗、干燥并浓缩以得到期望的产物(17.5g，108％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.13(d,1H),7.78(d,1H),3.91(t,2H),3.89(s,3H),2.79(m,2H),2.38(s,3H),1.82(m,2H),1.46(s,9H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 165.3,157.6,156.6,153.2,152.9,147.2,143.1,142.2,139.7,122.6,111.8,82.2,53.3,46.4,28.1,27.7,26.5,16.3；HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+针对C20H23BrCl2N4NaO4的计算值:555.0177发现值:555.0172.
步骤D：甲基3-溴-6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-l)丙基氨基]吡啶-2-甲酸酯
将来自步骤C的产物(17.5g，32.7mmol)在1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(330mL)中于110℃搅拌18h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化得到所期望产物(9.9g，70％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.63(d,1H),7.22(t,1H),6.57(d,1H),3.83(s,3H),3.30(m,2H),2.83(m,2H),2.37(s,3H),1.74(m,2H)13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 166.5,141.5,112.6,52.9,40.9,28.0,27.0,16.4.
制备11：(4-甲氧基苯基)甲基3-溴-6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]吡啶-2-甲酸酯
步骤A：3-溴-6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]吡啶-2-甲酸
在60℃将来自制备10的产物(35.39g，81.52mmol)和LiOH×H2O(13.68g，4当量)在1,4-二噁烷(408mL)和水(82mL)中的混合物搅拌1h。在用HCl的1M溶液淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相干燥、浓缩并通过快速色谱法(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(27.74g，81％)。LC/MS(C14H14BrCl2N4O2)421[M+H]+.
步骤B：(4-甲氧基苯基)甲基3-溴-6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]吡啶-2-甲酸酯
向在甲苯(660mL)和THF(20ml)中的步骤A的产物(27.7g，65.9mmol)、(4-甲氧基苯基)甲醇(16.4mL，2当量)和PPh3(34.6g，2当量)中逐滴添加偶氮二甲酸二异丙酯(26mL，2当量)并在50℃将该反应混合物搅拌1h。通过快速色谱法(硅胶，使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(23.65g，66.4％)。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.62(d,1H),7.37(dn,2H),7.21(t,1H),6.91(dm,2H),6.56(d,1H),5.25(s,2H),3.74(s,3H),3.30(q,2H),2.81(m,2H),2.33(s,3H),1.73(m,2H)；13CNMR(500MHz,dmso-d6)δppm 165.9,159.7,157.6,157.5,156.8,148.0,142.7,141.5,139.7,130.6,127.8,114.3,112.6,101.6,67.0,55.6,40.9,28.0,27.1,16.4；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C22H22BrCl2N4O3的计算值:539.0252,发现值:539.0246.
制备12：甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
步骤A：甲基6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]-3-[5-甲基-1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
在80℃将来自制备10的产物(15.0g，34.55mmol)、来自制备7的产物(30.7g，1.3当量)、Cs2CO3(33.8g，3.0当量)和Pd(AtaPhos)2Cl2(1.53g，0.1当量)在1,4-二噁烷(207mL)和H2O(34.5mL)中的混合物搅拌1.5h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(18.5g，58％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.69-7.37(m,10H),7.32(d,1H),7.23(s,1H),6.98(t,1H),6.63(d,1H),3.82(s,2H),3.67(t,2H),3.58(s,3H),3.46(t,2H),3.35(m,2H),2.86(m,2H),2.40(s,3H),2.06(s,3H),1.78(m,2H),1.35(s,2H),1.27/1.2(m+m,4H),1.15/1.09(m+m,4H),1.05/0.97(m+m,2H),0.97(s,9H),0.84(s,6H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C50H63Cl2N6O4Si的计算值:909.4057发现值:909.4053.
步骤B：甲基6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-3-[5-甲基-1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
在110℃将来自步骤A的产物(18.5g，20.3mmol)、Cs2CO3(13.2g，2当量)、DIPEA(7.1mL，2当量)和Pd(Ataphos)2Cl2(900mg，0.1当量)在1,4-二噁烷(102mL)中的混合物搅拌18h。过滤及浓缩后，将残余物用DCM吸收，用水清洗，并通过柱色谱法(硅胶，DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化，得到期望的产物(12.6g，71％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.85(d,1H),7.69(d,1H),7.66(dm,4H),7.47-7.36(m,6H),7.38(s,1H),3.97(t,2H),3.87(s,2H),3.68(t,2H),3.66(s,3H),3.47(t,2H),2.87(t,2H),2.30(s,3H),2.14(s,3H),1.99(br.,2H),1.38(s,2H),1.32-0.96(br.,10H),0.98(s,9H),0.85(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.9,137.6,120.5,64.4,61.7,58.9,52.3,46.0,43.4,30.2,27.1,24.6,21.0,15.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C50H62ClN6O4Si的计算值:873.4290发现值:873.4291.
步骤C：甲基6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在THF(95mL)中的来自步骤B的产物(8.46g，9.68mmol)中添加TBAF在THF中的1M溶液(10.6mL，1.1当量)并在0℃将该反应混合物搅拌2h。在用NH4Cl饱和溶液淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相用盐水清洗、干燥并通过柱色谱法(硅胶，DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(5.38g，88％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.86(d,1H),7.71(d,1H),7.38(s,1H),4.46(t,1H),3.97(t,2H),3.87(s,2H),3.70(s,3H),3.40(m,2H),3.35(t,2H),2.87(t,2H),2.30(s,3H),2.15(s,3H),1.99(m,2H),1.42-0.95(m,12H),0.87(s,6H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C34H44ClN6O4的计算值:635.3113发现值:635.3112.
步骤D：甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用Buchwald一般程序I在130℃持续1h，从步骤C(5.78mmol)的3.7g产物和1.74g1,3-苯并噻唑-2-胺(2当量)开始，获得3.1g所期望产物(72％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.96(d,1H),7.82(br.,1H),7.70(d,1H),7.50(br.,1H),7.38(s,1H),7.35(t,1H),7.17(t,1H),4.46(br.,1H),4.00(t,2H),3.88(s,2H),3.70(s,3H),3.40(brt.,2H),3.35(t,2H),2.86(t,2H),2.32(s,3H),2.16(s,3H),2.03-1.94(m,2H),1.42-0.96(m,12H),0.87(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.8,137.5,126.4,122.4,122.1,119.0,62.1,61.5,59.0,52.6,45.4,30.2,24.3,21.7,12.6,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C41H49N8O4S的计算值:749.3597发现值:749.3595.
步骤E：甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在DCM(50mL)中的来自步骤D的产物(3.85g，5.14mmol)和三乙基胺(2.15mL，3当量)中添加p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯(2.51g，1.5当量)并将该反应混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(3.2g，69％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.96(d,1H),7.81(br.,1H),7.77(d,2H),7.70(d,1H),7.50(br.,1H),7.46(d,2H),7.39(s,1H),7.35(t,1H),7.17(t,1H),4.06(t,2H),4.00(t,2H),3.85(s,2H),3.69(s,3H),3.49(t,2H),2.86(t,2H),2.40(s,3H),2.32(s,3H),2.15(s,3H),1.99(m,2H),1.32-0.93(m,12H),0.84(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.8,137.6,130.6,128.1,126.4,122.4,122.1,119,71.5,58.8,58.4,52.6,45.4,30.1,24.3,21.7,21.6,12.6,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C48H55N8O6S2的计算值:903.3686发现值:903.3685.
制备13：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[3-(p-甲苯基磺酰基氧基)丙基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
步骤A：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3-[3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]吡啶-2-甲酸酯
在80℃将来自制备11的产物(3.67g，6.79mmol)、来自制备8的产物(5.09g，1.1当量)、Pd(AtaPhos)2Cl2(301mg，0.1当量)和Cs2CO3(6.64g，3当量)在1,4-二噁烷(41mL)和H2O(6.8mL)中的混合物搅拌18h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(4.43g，64％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.62-7.38(m,10H),7.32(d,1H),7.26(s,1H),7.10(m,2H),6.98(t,1H),6.83(m,2H),6.63(d,1H),4.98(s,2H),3.74(s,2H),3.70(s,3H),3.58(t,2H),3.35(m,2H),2.84(m,2H),2.34(s,3H),2.02(s,3H),1.77(m,2H),1.43(m,2H),1.18-0.85(m,12H),1.09(t,2H),0.97(s,9H),0.77(s,6H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C58H71Cl2N6O4Si的计算值:1013.4683发现值:1013.4683；
步骤B：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3-[3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)吡啶-2-甲酸酯
在110℃将来自步骤A的产物(4.43g，4.37mmol)、Cs2CO3(2.84g，2当量)、DIPEA(1.5mL，2当量)和Pd(Ataphos)2Cl2(193mg，0.1当量)在1,4-二噁烷(22mL)中的混合物搅拌18h。在用水淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相干燥、浓缩并通过柱色谱法(硅胶，DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(2.83g，66％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm7.84(d,1H),7.68(d,1H),7.59(d,4H),7.44(t,2H),7.42(t,4H),7.38(s,1H),7.14(d,2H),6.87(d,2H),5.07(s,2H),3.96(t,2H),3.78(s,2H),3.71(s,3H),3.59(t,2H),2.86(t,2H),2.29(s,3H),2.08(s,3H),1.97(qn,2H),1.43(qn,2H),1.12(s,4H),1.10(s,2H),1.09(t,2H),0.97(s,9H),0.95(s,2H),0.94/0.91(d+d,4H),0.78(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 166.9,159.6,156.3,153.6,150.8,147.7,140.1,137.5,137.3,136.0,135.5,133.8,130.3,130.1,129.1,128.3,127.6,123.1,120.5,115.5,114.3,66.8,64.8,64.8,59.6,55.6,50.5,48.1,46.4,46.0,44.2,39.3,38.1,31.7,30.6,27.2,26.1,24.6,21.0,19.3,15.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C58H70ClN6O4Si的计算值:977.4916发现值:977.4915.
步骤C：(4-甲氧基苯基)甲基6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-3-[1-[[3-(3-羟基丙基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在THF(95mL)中的来自步骤B的产物(2.83g，2.89mmol)中添加TBAF在THF中的1M溶液(3.2mL，1.1当量)并在0℃将该反应混合物搅拌2h。在用NH4Cl饱和溶液淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相用盐水清洗、干燥并通过柱色谱法(硅胶，DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(2.21g，103％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.85(d,1H),7.70(d,1H),7.39(s,1H),7.17(d,2H),6.90(d,2H),5.09(s,2H),4.34(t,1H),3.96(t,2H),3.79(s,2H),3.74(s,3H),3.32(q,2H),2.86(t,2H),2.29(s,3H),2.09(s,3H),1.98(qn,2H),1.34(qn,2H),1.13(s,2H),1.13(s,4H),1.06(t,2H),0.99/0.95(d+d,4H),0.97(s,2H),0.78(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm166.9,159.7,156.4,153.6,150.8,147.7,140.2,137.5,137.3,136.0,130.2,129.1,127.6,123.1,120.4,115.5,114.3,66.8,66.8,62.1,59.7,55.6,50.6,48.2,46.5,46.0,44.3,39.7,38.1,31.8,30.6,26.5,24.6,21.0,15.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H52ClN6O4的计算值:739.3739发现值:739.3739.
步骤D：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-(3-羟基丙基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
在130℃将来自步骤C的产物(1.71g，2.31mmol)、1,3-苯并噻唑-2-胺(695mg，2当量)、Pd2dba3(212mg，0.1当量)、XantPhos(268mg，0.2当量)和DIPEA(1.2mL，3当量)在环己醇(14mL)中的混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷、DCM和MeCN作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(1.25g，63％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 12.08/10.87(brs/brs,1H),7.95(d,1H),7.81(br,1H),7.68(d,1H),7.50(br,1H),7.39(s,1H),7.35(t,1H),7.18(d,2H),7.17(t,1H),6.90(d,2H),5.10(s,2H),4.34(t,1H),3.99(t,2H),3.79(s,2H),3.74(s,3H),3.33(q,2H),2.85(t,2H),2.32(s,3H),2.11(s,3H),1.98(qn,2H),1.34(qn,2H),1.14(s,4H),1.14(s,2H),1.07(t,2H),1.00/0.95(d+d,2H),0.99/0.95(d+d,4H),0.79(s,6H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 140.0,137.6,130.2,126.4,122.4,122.0,119.0,114.3,66.7,62.1,59.6,55.6,50.6,48.2,46.5,45.4,44.3,39.7,30.6,26.5,24.3,21.7,12.6,11.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C49H57N8O4S的计算值:853.4223发现值:853.4229.
步骤E：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[3-(p-甲苯基磺酰基氧基)丙基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在DCM(15mL)中的来自步骤D的产物(1.25g，1.47mmol)和三乙基胺(0.61mL，3当量)中添加p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯(717mg，1.5当量)并将该反应混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供800mg(54％)期望的产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.95(d,1H),7.88(brs,1H),7.77(m,2H),7.68(d,1H),7.62(brs,1H),7.47(m,2H),7.39(s,1H),7.35(brs,1H),7.17(brs,1H),7.10(m,2H),6.90(m,2H),5.09(s,2H),4.00(m,2H),3.98(t,2H),3.77(s,2H),3.74(s,3H),2.85(t,2H),2.40(s,3H),2.32(s,3H),2.09(s,3H),1.98(m,2H),1.45(m,2H),1.17-0.8(m,12H),0.98(m,2H),0.77(s,6H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C56H63N8O6S2的计算值:1007.4312发现值:1007.4318.
制备15：乙基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸
在60℃将来自制备3a的产物(35.39g，81.52mmol)和LiOH×H2O(4当量)在1,4-二噁烷(408mL)和水(82mL)中的混合物搅拌1h。在用HCl的1M溶液淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相干燥、浓缩并通过快速色谱法(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(27.7g，81％)。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.56(dd,1H),7.43(brd.,1H),6.96(t,1H),4.18(t,2H),4.05(t,2H),3.28(t,2H),2.84(t,2H),2.29(s,3H),2.07(m,2H),1.97(m,2H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 166.4,154.8,152.1,151.8,151.1,147.1,143.9,135.7,134.0,133.8,129.0,124.9,117.6,82.3,68.8,46.3,31.0,24.0,22.5,19.8,15.7；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C21H20ClFIN4O3S的计算值:588.9973发现值:588.9969.
步骤B：乙基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
向步骤A的产物(27.7g，65.9mmol)、乙醇(2当量)和PPh3(2当量)在甲苯(660mL)和THF(20ml)中的混合物中逐滴添加偶氮二甲酸二异丙酯(2当量)并在50℃将该反应物搅拌1h。通过快速色谱法(硅胶，使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(23.65g，66.4％)。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.59(dd,1H),7.44(dm,1H),6.98(t,1H),4.29(m,2H),4.25(q,2H),4.08(t,2H),3.24(t,2H),2.89(t,2H),2.32(s,3H),2.09(m,2H),2.04(m,2H),1.28(t,3H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 162.6,155.4,152.2,151.7,151.3,147.0,134.0,124.9,117.6,82.4,68.3,60.7,46.3,30.8,24.1,23.1,19.7,15.7,14.6；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C23H24ClFIN4O3S的计算值:617.0286,发现值:617.0282.
制备16：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
步骤A：3-[1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)吡啶-2-甲酸
在60℃将1.5g(1.72mmol)制备12步骤B的产物、290mg(4当量)LiOH在17mL 4:1THF和水的混合物中的混合物搅拌以达到完全转化。通过添加1M HCl水溶液淬灭反应后，用EtOAc萃取混合物，干燥有机相，浓缩，并通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化，得到1.23g(83％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 13.11(s,1H),7.80(d,1H),7.66(d,4H),7.65(d,1H),7.44(t,2H),7.41(s,1H),7.40(t,4H),3.99(t,2H),3.86(s,2H),3.68(t,2H),3.47(t,2H),2.87(t,2H),2.29(s,3H),2.17(s,3H),1.99(qn,2H),1.39(s,2H),1.27/1.22(d+d,4H),1.17/1.12(d+d,4H),1.05/0.99(d+d,2H),0.98(s,9H),0.85(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 168.5,156.5,153.2,150.7,148.9,139.8,137.7,137.3,136.0,135.6,133.8,130.2,129.0,128.3,122.1,119.9,115.7,74.3,64.4,61.7,59.0,50.1,46.9,46.0,46.0,43.4,39.7,33.6,30.2,27.1,24.6,21.0,19.2,15.5,11.1；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C49H60ClN6O4Si的计算值:859.4134发现值:859.4130.
步骤B：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)吡啶-2-甲酸酯
向在7mL的甲苯中1.23g(1.43mmol)的来自步骤A的产物、0.35mL(2当量)的(4-甲氧基苯基)甲醇、748mg(2当量)的PPh3中逐滴添加0.56mL(2当量)的DIAD，并在50℃将该混合物搅拌直至完全转化。通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化产物，得到1.11g(79％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.84(d,1H),7.67(d,1H),7.65(d,4H),7.44(t,2H),7.41(s,1H),7.40(t,4H),7.15(d,2H),6.87(d,2H),5.07(s,2H),3.96(t,2H),3.83(s,2H),3.71(s,3H),3.66(t,2H),3.45(t,2H),2.86(t,2H),2.29(s,3H),2.08(s,3H),1.97(qn,2H),1.38(s,2H),1.25/1.18(d+d,4H),1.18/1.12(d+d,4H),1.01/0.93(d+d,2H),0.97(s,9H),0.82(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 166.8,159.7,156.3,153.6,150.8,147.7,140.1,137.6,137.3,136.0,135.6,133.8,130.2,130.2,129.1,128.2,127.7,123.0,120.4,115.6,114.3,74.2,66.8,64.4,61.7,59.3,55.6,49.9,46.8,46.0,46.0,43.3,39.7,33.6,30.1,27.1,24.6,21.0,19.3,15.5,10.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C57H68ClN6O5Si的计算值:979.4709发现值:979.4710.
步骤C：(4-甲氧基苯基)甲基6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在470mL的THF中的45.4g(46.3mmol)的来自步骤B的产物中添加51mL(1.1当量)的TBAF在THF中的1M溶液并将混合物搅拌2h。在用饱和NH4Cl溶液淬灭后，将该混合物用EtOAc萃取并将该有机相干燥及通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到21.6g(63％)期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.85(d,1H),7.70(d,1H),7.39(s,1H),7.18(d,2H),6.90(d,2H),5.10(s,2H),4.45(t,1H),3.96(t,2H),3.84(s,2H),3.74(s,3H),3.40(q,2H),3.33(t,2H),2.86(t,2H),2.29(s,3H),2.09(s,3H),1.98(qn,2H),1.39(s,2H),1.27/1.21(d+d,4H),1.18/1.12(d+d,4H),1.03/0.94(d+d,2H),0.84(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 166.8,159.7,156.3,153.6,150.8,147.8,140.2,137.6,137.3,136,130.2,129.1,127.7,123.0,120.4,115.6,114.3,74.0,66.8,62.2,61.5,59.0,55.6,50.0,46.9,46.0,46.0,43.3,39.7,33.5,30.1,24.6,21.0,15.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C41H50ClN6O5的计算值:741.3531发现值:741.3530.
步骤D：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
在130℃将7.1g(9.6mmol)的来自步骤C的产物、2.8g(19mmol)的1,3-苯并噻唑-2-胺、4.8mL(28mmol)的N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺，861mg(0.94mmol)的Pd2(dba)3和1.1g(1.9mmol)的XantPhos在66mL的环己醇中的混合物搅拌2h。将该产物通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到5.71g(63％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.95(d,1H),7.81(brd,1H),7.69(d,1H),7.49(brs,1H),7.39(s,1H),7.35(m,1H),7.19(m,2H),7.16(m,1H),6.91(m,2H),5.10(s,2H),4.46(t,1H),3.99(m,2H),3.85(s,2H),3.75(s,3H),3.40(m,2H),3.34(t,2H),2.85(t,2H),2.32(s,3H),2.11(s,3H),1.99(m,2H),1.45-0.9(m,12H),0.84(s,6H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C48H55N8O5S的计算值:855.4016发现值:855.4011.
步骤E：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在50mL的二氯甲烷中的5.0g(5.8mmol)的来自步骤D的产物中添加2.5mL(3.1当量)的N,N-二乙基乙胺和2.9g(1.5当量)的p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯，然后将该混合物搅拌18h。将该产物通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化以得到2.95g(50％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.95(d,1H),7.81(brs,1H),7.76(m,2H),7.45(brs,1H),7.45(m,2H),7.40(s,1H),7.35(m,1H),7.18(m,2H),7.17(m,1H),6.97(d,1H),6.90(m,2H),5.10(s,2H),4.05(m,2H),4.00(m,2H),3.82(s,2H),3.74(s,3H),3.47(m,2H),2.85(m,2H),2.40(s,3H),2.32(s,3H),2.10(s,3H),1.98(m,2H),1.87-1.34(m,12H),0.81(s,6H)；HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+针对C55H61N8O7S2的计算值:1009.4105发现值:1009.4102.
制备17：叔丁基-[2-[[3-[[5-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑-1-基]甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙氧基]-二苯基-硅烷
步骤A：(3-溴-1-金刚烷基)甲醇
向在THF(25mL)中的3-溴金刚烷-1-甲酸(10.0g，38.6mmol)缓慢添加BH3-THF在THF中的1M溶液(115mL，3当量)，并将该混合物搅拌48h。在添加甲醇并搅拌30min后，通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(8.37g，88％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.50(t,1H),3.02(d,2H),2.28/2.21(dm+dm,4H),2.11(m,2H),2.07(s,2H),1.66/1.56(dm+dm,2H),1.48/1.39(dm+dm,4H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm70.9,69.3,51.3,49.0,40.6,37.3,35.1,32.3.
步骤B：1-[(3-溴-1-金刚烷基)甲基]吡唑
向在甲苯(100mL)中的来自步骤A的产物(8.37g，34.1mmol)、1H-吡唑(2.79g，1.2当量)中添加(氰基亚甲基)三丁基磷烷(10.7mL，1.2当量)并在90℃将该混合物搅拌2h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(8.50g，84％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.63(dd,1H),7.43(dd,1H),6.23(t,1H),3.87(s,2H),2.24/2.13(m+m,4H),2.10(m,2H),2.07(s,2H),1.63/1.50(m+m,2H),1.47/1.43(m+m,4H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 138.9,131.7,105.1,68.0,61.8,51.8,48.5,39.8,38.3,34.6,32.1；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C14H20BrN2的计算值:295.0810发现值:295.0804.
步骤C：1-[(3-溴-1-金刚烷基)甲基]-5-甲基吡唑
在-78℃向在THF(30mL)中的来自步骤B的产物(1.70g，5.76mmol)中添加丁基锂(2.5M，在THF中，12mL，5当量)。1h后，将碘甲烷(7.2mL，5当量)添加至该混合物中。10min后，将反应混合物用NH4Cl饱和溶液淬灭，用EtOAc萃取，将合并的有机层干燥并浓缩，得到所期望产物(2.0g，112％)，其无需进一步纯化即可用于下一步。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm7.31(d,1H),6.01(d,1H),3.76(s,2H),2.25/2.15(d+d,4H),2.24(s,3H),2.16(s,2H),2.10(m,2H),1.63/1.52(d+d,2H),1.52/1.49(d+d,4H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.2,138.0,105.2,68.2,58.3,52.1,48.5,40.5,38.4,34.5,32.2,11.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C15H22BrN2的计算值:309.0966发现值:309.0962.
步骤D：2-[[3-[(5-甲基吡唑-1-基)甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙醇
在120℃将来自步骤C的产物(2.00g，6.47mmol)、乙二醇(14.4mL，40当量)和DIPEA(5.6mL，5当量)的混合物搅拌6h。在用水稀释并用EtOAc萃取后，将合并的有机相通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(1.62g，86.6％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.28(d,1H),5.99(m,1H),4.46(t,1H),3.75(s,2H),3.40(m,2H),3.32(m,2H),2.23(brs,3H),2.13(m,2H),1.61/1.52(m+m,4H),1.47/1.43(m+m,2H),1.45(s,2H),1.44-1.35(m,4H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 137.8,105.1,61.8,61.5,59.0,44.6,40.8,39.6,35.7,30.0,11.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C17H27N2O2的计算值:291.2073发现值:291.2069.
步骤E：叔丁基-[2-[[3-[(5-甲基吡唑-1-基)甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙氧基]-二苯基-硅烷
向在DCM(67ml)中的来自步骤D的产物(6.52g，22.5mmol)和咪唑(2.29g，1.5当量)中添加叔丁基-氯代-二苯基-硅烷(6.9mL，1.2当量)并将该反应混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(11.0g，92.7％)。LC/MS(C33H45N2O2Si)529[M+H]+.
步骤F：叔丁基-[2-[[3-[(4-碘-5-甲基-吡唑-1-基)甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙氧基]-二苯基-硅烷
向在DMF(105mL)中的来自步骤E的产物(11.0g，20.8mmol)中添加N-碘代琥珀酰亚胺(5.85g，1.25当量)并将该反应混合物搅拌3h。将该反应混合物用水稀释并用DCM萃取后，将合并的有机相用饱和硫代硫酸钠和盐水清洗、干燥并蒸发获得期望的产物(11.0g，81％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.70-7.36(m,10H),7.44(s,1H),3.86(s,2H),3.67(t,2H),3.45(t,2H),2.24(s,3H),2.12(m,2H),1.66-1.32(m,12H),0.98(s,9H)13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 142.4,140.9,64.4,61.4,60.4,60.3,30.0,27.1,12.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C33H44IN2O2Si的计算值:655.2217发现值:655.2217.
步骤G：叔丁基-[2-[[3-[[5-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑-1-基]甲基]-1-金刚烷基]氧基]乙氧基]-二苯基-硅烷
在0℃向在THF(84mL)中的来自步骤F的产物(11.0g，16.8mmol)中添加氯代(异丙基)镁-LiCl(1.3M，在THF中，17mL，1.2当量)，并将该反应混合物搅拌40min，用2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(10.3mL，3当量)处理，并搅拌10min。在用NH4Cl饱和溶液稀释并用EtOAc萃取后，将合并的有机相浓缩并通过柱色谱法(硅胶，庚烷和MTBE作为洗脱剂)纯化以得到所期望产物(9.0g，82％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.66(d,4H),7.47(s,1H),7.45(t,2H),7.40(t,4H),3.77(s,2H),3.67(t,2H),3.44(t,2H),2.36(s,3H),2.11(br,2H),1.60/1.48(d+d,4H),1.44(d,2H),1.44(s,2H),1.40(d,4H),1.23(s,12H),0.97(s,9H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 146.9,144.2,133.8,130.2,128.3,125.7,104.6,83.0,72.5,64.4,61.4,58.9,44.6,40.7,39.6,38.7,35.6,30.0,27.1,25.2,19.3,12.1；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C39H56BN2O4Si的计算值:655.4102发现值:655.4108.
制备18：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[5-甲基-1-[[3-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
步骤A：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]吡啶-2-甲酸酯
在80℃将来自制备11的产物(3.67g，6.79mmol)、来自制备17的产物(4.89g，1.1当量)、Pd(AtaPhos)2Cl2(301mg，0.1当量)和Cs2CO3(6.64g，3当量)在1,4-二噁烷(41mL)和H2O(6.8mL)中的混合物搅拌12h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(3.0g，45％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.69-7.37(m,10H),7.31(d,1H),7.24(s,1H),7.12(m,2H),6.98(t,1H),6.83(m,2H),6.62(d,1H),4.99(s,2H),3.76(s,2H),3.70(s,3H),3.66(t,2H),3.45(t,2H),3.35(m,2H),2.85(m,2H),2.34(s,3H),2.12(m,2H),2.02(s,3H),1.77(m,2H),1.65-1.33(m,12H),0.97(s,9H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C55H65Cl2N6O5Si的计算值:987.4163发现值:987.4158.
步骤B：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)吡啶-2-甲酸酯
在110℃将来自步骤A的产物(3.00g，3.00mmol)、Cs2CO3(1.95g，2当量)、DIPEA(1.0mL，2当量)和Pd(Ataphos)2Cl2(212mg，0.1当量)在1,4-二噁烷(15mL)中的混合物搅拌18h。通过柱色谱法(硅胶，DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(1.74g，60％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.84(d,1H),7.68(d,1H),7.68-7.37(m,10H),7.36(s,1H),7.16(m,2H),6.87(m,2H),5.08(s,2H),3.96(m,2H),3.81(s,2H),3.72(s,3H),3.67(t,2H),3.46(t,2H),2.87(t,2H),2.29(s,3H),2.13(m,2H),2.09(s,3H),1.98(m,2H),1.65-1.37(m,12H),0.97(s,9H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C55H64ClN6O5Si的计算值:951.4396发现值:951.4397.
步骤C：(4-甲氧基苯基)甲基6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
在0℃向在THF(20mL)中的来自步骤B的产物(1.73g，1.82mmol)中添加TBAF在THF中的1M溶液(2.0mL，1.1当量)并将该反应混合物搅拌2h。通过柱色谱法(硅胶，DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(1.06g，82％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.85(d,1H),7.71(d,1H),7.36(s,1H),7.19(m,2H),6.90(m,2H),5.10(s,2H),4.47(t,1H),3.96(m,2H),3.81(s,2H),3.75(s,3H),3.40(m,2H),3.34(t,2H),2.87(t,2H),2.29(s,3H),2.14(m,2H),2.10(s,3H),1.98(m,2H),1.67-1.36(m,12H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C39H46ClN6O5的计算值:713.3218发现值:713.3217.
步骤D：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
在130℃将来自步骤C的产物(1.00g，1.40mmol)、1,3-苯并噻唑-2-胺(421mg，2当量)、Pd2(dba)3(128mg，0.1当量)、XantPhos(162mg，0.2当量)和DIPEA(0.72mL，3当量)在环己醇(10mL)中的混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷、接着DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(600mg，53％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 12.18/10.84(brs/brs,1H),7.94(d,1H),7.83(br,1H),7.69(d,1H),7.57(br,1H),7.36(s,1H),7.35(brt,1H),7.20(d,2H),7.17(brt,1H),6.91(d,2H),5.11(s,2H),4.47(brt,1H),4.00(t,2H),3.81(s,2H),3.75(s,3H),3.41(brq,2H),3.35(t,2H),2.85(t,2H),2.32(s,3H),2.14(m,2H),2.12(s,3H),1.99(qn,2H),1.62/1.53(d+d,4H),1.53(s,2H),1.49/1.44(d+d,2H),1.44(s,4H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 139.9,137.6,130.1,126.4,122.4,122.0,118.9,114.2,66.7,61.9,61.5,59.5,55.6,45.4,44.7,40.8,39.5,35.6,30.1,24.3,21.7,12.6,10.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C46H51N8O5S的计算值:827.3703发现值:827.3709.
步骤E：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[5-甲基-1-[[3-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在二氯甲烷(7mL)中的来自步骤D的产物(600mg，0.726mmol)和N,N-二乙基乙胺(0.31mL，3当量)中添加p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯(357mg，1.5当量)并将该反应混合物搅拌18h。通过快速色谱法(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化提供354mg(50％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 12.22/10.85(brs/brs,1H),7.94(d,1H),7.81(br,1H),7.77(d,2H),7.70(d,1H),7.52(br,1H),7.45(d,2H),7.37(s,1H),7.35(t,1H),7.19(d,2H),7.17(t,1H),6.89(d,2H),5.10(s,2H),4.05(t,2H),4.00(t,2H),3.79(s,2H),3.74(s,3H),3.49(t,2H),2.86(t,2H),2.40(s,3H),2.32(s,3H),2.11(m,2H),2.11(s,3H),1.99(qn,2H),1.55-1.36(m,12H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 139.9,137.6,130.5,130.3,128.1,126.4,122.4,122.0,118.9,114.2,71.4,66.8,59.4,58.2,55.6,45.4,30.0,24.2,21.6,21.6,12.6,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C53H57N8O7S2的计算值:981.3792发现值:981.3795.
制备1b_01：甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
经烘箱干燥的500mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒并配备回流冷凝器。将其装入13.41g的制备1a(25mmol，1当量)、8.46g的叔丁基N-甲基-N-丙-2-炔基-氨基甲酸酯(50mmol，2当量)和50mL的DIPA(36.10g，50mL，356.8mmol，14.27当量)然后添加125mL的干THF并用氩气冲洗该系统。在惰性气氛下搅拌5分钟后，添加549mg Pd(PPh3)2Cl2(1.25mmol，0.05当量)和238mg CuI(1.25mmol，0.05当量)。然后将所得混合物升温至60℃并在该温度搅拌直至观察不到进一步的转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱纯化得到10.5g(18.2mmol，73％)所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 11.65(br s,1H),7.31(br d,1H),7.21(br d,1H),7.14(t,1H),4.23(s,2H),4.10(t,2H),3.73(s,3H),3.23(t,2H),2.86(s,3H),2.07(m,2H),1.46/1.41(s,18H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 129.1,119.2,115.4,68.1,51.9,38.6,33.8,30.5,23.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C28H37FN3O7S的计算值:578.2331,发现值578.2331.
制备2a_01：5-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-戊-1-醇
步骤A：戊-4-烯基苯甲酸酯
将30.00g的戊-4-烯-1-醇(0.35mol，1当量)和58.5mL的N,N-二乙基乙胺(0.42mol，1.2当量)在200mL的DCM中混合然后冷却至0℃。在0℃在惰性气氛下通过滴液漏斗将48.5mL的苯甲酰氯(0.42mol，1.2当量)添加至该混合物中。添加后，将混合物在0℃进一步搅拌30min，然后在室温继续搅拌。将混合物用100mL DCM稀释，然后将有机相分别用水、1M NaOH、1M HCl、盐水洗涤。将有机相经MgSO4干燥，过滤，浓缩并使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱纯化，得到63.19g(95％)所期望产物，呈无色液体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.97(dd,2H),7.66(t,1H),7.53(t,2H),5.91-5.81(m,1H),5.09-4.97(m,2H),4.27(t,2H),2.17(q,2H),1.81(qv,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 166.2,138.2,133.8,130.3,129.6,129.2,115.8,64.5,30.1,27.8；GC-MS-EI(m/z):[M]+针对C12H14O2的计算值:190.1,发现值190.
步骤B：4,5-二羟基戊基苯甲酸酯
将42.22g步骤A的产物(0.26mol，1.0当量)，50.40g 4-甲基-4-氧化-吗啉-4-鎓；水合物(0.37mol，1.7当量)混合在360mL的2-甲基异丙-2-醇和40mL的水中，然后添加6.57g的四氧代锇(2.5w％，在2-甲基异丙-2-醇中，0.64mmol，0.002当量)并在60℃将混合物搅拌24h。观察到全部转化。将混合物冷却至室温并添加1M Na2S2O3，然后在室温再搅拌10min。添加DCM并分离有机相，分别用水、盐水洗涤。将溶液经MgSO4干燥，过滤，浓缩并使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱纯化，得到36.9g(63％)所期望产物，呈白色固体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.99-7.50(m,5H),4.50(m,2H),4.28(m,2H),3.45(m,1H),3.30-3.24(m+m,2H),1.85-1.72(m+m,2H),1.59-1.33(m+m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm166.2,133.8-129.1,71.2,66.3,65.5,30.3,25.2；HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+针对C12H16NaO4的计算值:247.0941,发现值247.0941.
步骤C：5-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-羟基-戊基]苯甲酸酯
将24.86g步骤B的产物(0.11mol，1当量)和15.09g咪唑(0.22mol，2当量)在120mLN,N-二甲基甲酰胺中混合然后在惰性气氛下冷却至-20℃。经30min的时间以缓慢速率添加在40mL的N,N-二甲基甲酰胺中的16.71g的叔丁基-氯-二甲基-硅烷(0.11mol，1当量)，用10mL的DCM支持，然后静置至升温至室温并进一步搅拌。观察到完全转化。用浓NH4Cl淬灭然后蒸发大部分挥发物。将EtOAc和水添加至残余物中，将该有机相分离然后用水和盐水清洗、用MgSO4干燥、过滤、浓缩并使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱法纯化以得到33.71g(90％)的期望的产物，呈无色油状物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.95(m,2H),7.66(m,1H),7.52(m,2H),4.58(d,1H),4.29(m,2H),3.51-3.35(dd+dd,2H),3.48(m,1H),1.86-1.74(m+m,2H),1.67-1.34(m+m,2H),0.83(s,9H),0.01(s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm166.2,133.7,130.4,129.5,129.2,70.6,67.7,65.3,30.2,26.3,24.9,-4.9.
步骤D：[5-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-戊基]苯甲酸酯
将33.51g的来自步骤C的产物(0.10mol，1当量)、16.85g的咪唑(0.25mol，2.5当量)和1.21g的N,N-二甲基吡啶-4-胺(0.01，0.1当量)混合入230mL的N,N-二甲基甲酰胺中，然后以缓慢速率添加38mL的叔丁基-氯代-二苯基-硅烷(0.15mol，1.5当量)，用20mL的N,N-二甲基甲酰胺支持，然后在50℃搅拌过夜。观察到完全转化。将混合物冷却至室温，用浓NH4Cl淬灭然后蒸发大部分挥发物。将EtOAc和水添加至残余物中，将该有机相分离然后用水和盐水清洗、用MgSO4干燥、过滤、浓缩并使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱法纯化以得到56.43g(99％)的期望的产物，呈无色稠油状物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm7.91-7.37(m,15H),4.17(m,2H),3.76(m,1H),3.45(m,2H),1.72(m,2H),1.66-1.57(m+m,2H),0.99(s,9H),0.74(s,9H),-0.12/-0.16(s+s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm166.1,136.0-128.0,73.3,66.0,65.1,30.3,27.3,26.1,24.0,-5.1；HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+针对C34H48NaO4Si2的计算值:599.2983,发现值599.2981.
步骤E：5-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-戊-1-醇
将46.10g步骤D的产物(0.08mol，1当量)溶解在227mL MeOH和117mL THF中，然后将12.79g NaOH(0.32mol，4.0当量)溶解在85mL缓慢加入的水中，同时用冰冷却混合物。添加后，将混合物在室温搅拌直至观察到完全转化(约4小时)。添加EtOAc和水然后分离，并将该有机相用盐水清洗，用MgSO4干燥、过滤、浓缩并通过快速柱色谱法使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂纯化以得到29.32g(78％)的期望的产物，呈无色油状物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.65-7.37(m,10H),4.34(t,1H),3.71(m,1H),3.42(m,2H),3.26(m,2H),1.52(m,2H),1.42(m,2H),0.99(s,9H),0.77(s,9H),-0.13(s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm135.8,135.8,134.3,134.0,130.3,130.2,128.2,128.0,74.0,66.4,61.4,30.4,28.3,27.3,26.2,-5.1；HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+针对C27H44NaO3Si2的计算值:495.2721,发现值495.2706.
制备3a_01：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[5-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-戊基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：甲基2-[叔丁氧基羰基-[5-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-戊基]氨基]-5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用光信一般程序II从制备1b_01作为合适的氨基甲酸酯和制备2a_01作为合适的醇开始，获得2.5g(61％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm7.60-7.33(m,10H),7.28(dd,1H),7.17(m,1H),7.1(t,1H),4.22(s,2H),4.09(t,2H),3.94(m,2H),3.71(s,3H),3.67(m,1H),3.38(m,2H),3.22(t,2H),2.85(s,3H),2.07(m,2H),1.65(m,2H),1.48(m,2H),1.45/1.40(s+s,18H),0.93(s,9H),0.71(s,9H),-0.17/-0.22(s+s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 147.4,129,119.3,115.4,85.1,82.3,73.3,68.1,65.6,51.9,46.5,38.4,33.8,30.5,30.5,28.5/28,27.2,26.0,23.1,23.0,-5.3；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C55H79FN3O9SSi2的计算值:1032.5054,发现值1032.5060.
步骤B：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[5-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-戊基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用HFIP脱保护通用程序，从来自步骤A的产物作为合适氨基甲酸酯开始，获得1.2g(53％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.68-7.35(m,10H),7.56(t,1H),7.30(d,1H),7.20(d,1H),7.11(t,1H),4.22(br.,2H),4.07(t,2H),3.70(m,1H),3.68(s,3H),3.42/3.38(dd+dd,2H),3.11(t,2H),3.04(brq.,2H),2.86(br.,3H),1.99(quint.,2H),1.54(m,2H),1.53/1.45(m+m,2H),1.41(s,9H),0.97(s,9H),0.74(s,9H),-0.14/-0.18(s+s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 164.6,163.0,154.9,151.4,147.5,136.9,136.0,129.1,119.3,115.4,114.8,85.2,82.3,79.8,73.6,68.0,66.2,51.7,44.7,38.5,33.8,31.1,30.6,28.5,27.2,26.2,24.3,23.3,19.4,18.3,-5.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C50H71FN3O7SSi2的计算值:932.4530,发现值932.4526.
制备3e_01：乙基5-(3-氯丙基)-2-(甲基氨基)噻唑-4-甲酸酯
将2.25g的甲基硫脲(25.0mmol，1当量)在100mL的乙醇中的悬浮液冷却至0℃，然后在此温度逐滴添加7.46g的乙基3-溴代-6-氯代-2-氧代-己酸酯(27.5mmol，1.1当量)。在0℃搅拌15min后，添加7mL TEA(5.06g，50mmol，2当量)。将所得混合物在室温搅拌过夜。观察到完全转化。真空除去挥发物，然后将所得残余物在EtOAc和水之间分配。分离各层，然后用水洗涤有机层，然后用盐水洗涤。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩滤液。然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱纯化得到5g(76％)所期望产物。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.55(q,1H),4.21(q,2H),3.65(t,2H),3.09(m,2H),2.78(d,3H),1.98(m,2H),1.26(t,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 165.6,162.5,137.4,135.5,60.5,45.0,34.1,31.2,24.4,14.7；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C10H16ClN2O2S的计算值:263.0616,发现值263.0615.
制备3h_01：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基氨基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：甲基2-[叔丁氧基羰基-[2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基]氨基]-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用光信通用程序II从2.68g的制备1a(5mmol，1当量)和1.46g的2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙醇(1.42mL，10mmol，2当量)作为合适醇开始，获取2.8g(84％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.57(dd,1H),7.44(dm,1H),6.96(t,1H),4.12/4.02(m+m,2H),4.07(m,1H),4.05(t,2H),4.02/3.54(dd+dd,2H),3.75(s,3H),3.21(t,2H),2.06(m,2H),1.86/1.82(m+m,2H),1.51(s,9H),1.29(s,3H),1.22(s,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 134.0,124.9,117.6,73.8,68.9,68.1,52.0,44.0,32.2,30.5,28.1,27.3,25.9,23.1；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C26H35FIN2O7S的计算值:665.1188,发现值665.1175.
步骤B：甲基2-[2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基氨基]-5-[3-(2-氟-4-碘-苯氧基)丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用HFIP脱保护通用程序，从2.5g来自步骤A的产物(3.80mmol)作为合适氨基甲酸酯开始，获得1.6g(75％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm7.6(t,1H),7.59(dd,1H),7.45(dm,1H),6.97(dd,1H),4.10(m,1H),4.03(t,2H),4.01/3.48(dd+dd,2H),3.69(s,3H),3.27/3.19(m+m,2H),3.11(t,2H),1.99(m,2H),1.76/1.72(m+m,2H),1.31(s,3H),1.25(s,3H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C21H27FIN2O5S的计算值:565.0663,发现值565.0642.
步骤C：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用薗头一般程序从来自步骤B的400mg产物(0.71mmol，1当量)和240mg叔丁基N-甲基-N-丙-2-炔基-氨基甲酸酯(1.42mmol，2当量)作为合适的乙炔开始，得到300mg(70％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.60(t,1H),7.31(brd,1H),7.21(dd,1H),7.13(t,1H),4.23(brs,2H),4.09(m,1H),4.07(t,2H),4.00/3.48(dd+dd,2H),3.69(s,3H),3.27/3.19(m+m,2H),3.12(t,2H),2.86(brs,3H),2.00(m,2H),1.74(m,2H),1.41(s,9H),1.31(s,3H),1.25(s,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 164.5,136.9,136.4,129.1,119.3,115.4,85.2,82.3,73.8,69.0,68.0,51.7,41.4,38.4,33.8,33.2,30.6,28.5,27.3,26.1,23.3；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C30H41FN3O7S的计算值:606.2644,发现值606.2650.
制备3n_01：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙基氨基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：甲基2-[叔丁氧基羰基-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙基]氨基]-5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用光信通用程序II从577mg制备1b_01(1mmol，1当量)作为适当的氨基甲酸酯和380mg 3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙-1-醇(2mmol，2当量)作为合适的醇开始，得到600mg(80％)的所期望产物。
步骤B：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙基氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用HFIP脱保护通用程序，从来自步骤A的产物作为合适氨基甲酸酯开始，获得310mg(47％)的所期望产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.50(t,1H),7.30(d,1H),7.20(d,1H),7.11(t,1H),4.21(bs,2H),4.05(t,2H),3.62(t,2H),3.67(s,3H),3.19(q,2H),3.10(t,2H),2.84(brs,3H),2.04-1.94(m,2H),1.74-1.63(m,2H),1.40(s,9H),0.84(s,9H),0.00(s,6H).
制备4a_01：N-(6-氯-4-甲基-哒嗪-3-基)-3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚胺
步骤A：N-(6-氯-4-甲基-哒嗪-3-基)-1,3-苯并噻唑-2-胺
经烘箱干燥的2L单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒和回流冷凝器。将其中装入34.0g的6-氯代-4-甲基-哒嗪-3-胺(237mmol，1当量)、34mL的2-氯代-1,3-苯并噻唑(44.2g，260mmol，1.1当量)、124mL的DIPEA(91.8g，710mmol，3当量)和137g的Cs2CO3(710mmol，3当量)，然后添加1L的DMF并用氩气冲洗该系统。在惰性气氛下搅拌5分钟后，添加2.01g Pd2(dba)3(5.9mmol，0.025当量)和6.85g XantPhos(11.8mmol，0.05当量)。然后将所得混合物升温至75℃并在该温度下搅拌4小时以达到完全转化。将反应混合物冷却至室温，然后倒入3L水中，同时剧烈搅拌。30min后过滤除去沉淀产物，然后用水洗涤2次(2×2L)。产物在高真空下干燥过夜。将干燥的粗产物在1L庚烷:Et2O(3:2)中搅拌30min，然后过滤，得到64.5g(98％)所期望产物，呈绿色粉末。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 11.96(brs,1H),7.86(d,1H),7.65(s,1H),7.51(d,1H),7.38(t,1H),7.21(t,1H),2.37(s,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 130.3,129.5,126.6,122.8,122.3,17.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C12H10ClN4S的计算值:277.0309,发现值277.0305.
步骤B：N-(6-氯-4-甲基-哒嗪-3-基)-3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚胺
将配备经PTFE涂层的磁性搅拌棒的经烘箱干燥的2L单颈圆底烧瓶中装入64.5g的来自步骤A的产物(236mmol，1当量)、123mL的DIPEA(9.16g，708mmol，3当量)、14.43g的N,N-二甲基吡啶-4-胺(11.81mmol，0.05当量)在N2下在1L的干DCM中冷却至0℃。并且在强烈的机械搅拌期间，将46.00mL的2-(氯代甲氧基)乙基-三甲基-硅烷(43.32g，259mmol，1.1当量)经5min的时间逐滴添加至混合物中。当反应达到完全转化时，将其在0℃搅拌30min。向反应混合物中加入24.5mL水，然后向反应混合物中加入硅藻土，减压除去挥发物。使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱纯化得到46.62g(48％)所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.85(dm,1H),7.72(q,1H),7.53(dm,1H),7.47(m,1H),7.29(m,1H),5.89(s,2H),3.70(m,2H),2.39(d,3H),0.90(m,2H),-0.12(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm159.5,158.5,150.0,138.1,137.4,129.5,127.4,125.5,123.8,123.2,112.4,73.0,66.8,17.7,17.1,-1.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C18H24ClN4OSSi的计算值:407.1123,发现值407.1120.
制备5a_01：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-5-(p-甲苯基磺酰基氧基)戊基]-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[5-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-[叔丁基(二苯基甲硅烷基]氧基-戊基]-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序III从12g制备3a_01(13mmol)和6.30g制备4a_01(15.6mmol)作为合适的卤化物开始，获得14g(83％)所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.85-7.23(m,14H),7.58(s,1H),7.31(t,1H),7.19(m,1H),7.14(t,1H),5.86(s,2H),4.37(t,2H),4.20(s,2H),4.15(t,2H),3.73(s,3H),3.71(t,2H),3.67(m,1H),3.39(m,2H),3.27(t,2H),2.83(s,3H),2.41(s,3H),2.12(m,2H),1.72(m,2H),1.52(m,2H),1.40(s,9H),0.90(t,2H),0.89(s,9H),0.69(s,9H),-0.14(s,9H),-0.19/-0.23(s+s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 147.5,129.1,119.3,117.5,115.4,73.4,72.3,68.4,66.8,65.8,51.8,46.6,38.5,33.8,31.0,30.5,28.5,27.1,26.1,23.0,22.6,17.9,17.8,-1.0,-5.3；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C68H93FN7O8S2Si3的计算值:1302.5813,发现值1302.5819.
步骤B：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-5-羟基-戊基]-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
经烘箱干燥的100mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒并配备回流冷凝器。将其中装入1.40g的来自步骤A的产物(1.1mmol，1当量)和12mg的樟脑磺酸(0.054mmol，0.05当量)、5mL的DCM和1mL的MeOH。将所得混合物在室温搅拌过夜以达到完全转化。将反应混合物直接浓缩至硅藻土，然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱法纯化，得到700mg(55％)呈黄色固体的所期望产物。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.85-7.14(m,14H),7.56(s,1H),7.32(dd,1H),7.20(m,1H),7.15(t,1H),5.86(s,2H),4.56(t,1H),4.33(m,2H),4.20(s,2H),4.15(t,2H),3.74(s,3H),3.72(t,2H),3.65(m,1H),3.27(t,2H),3.27(t,2H),2.83(s,3H),2.41(s,3H),2.13(m,2H),1.73/1.64(m+m,2H),1.52(m,2H),1.40(s,9H),0.90(t,2H),0.86(s,9H),-0.13(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 154.9,147.6,129.1,119.4,117.5,115.4,82.4,73.7,72.9,68.4,66.8,64.5,51.9,46.8,38.5,33.8,31.0,30.6,28.5,27.2,23.1,22.5,17.9,17.8,-1.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C62H79FN7O8S2Si2的计算值:1188.4949,发现值1188.4938.
步骤C：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-5-(p-甲苯基磺酰基氧基)戊基]-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
将配备经PTFE涂层的磁性搅拌棒的经烘箱干燥的100mL单颈圆底烧瓶中装入700mg的来自步骤B的产物(0.58mmol，1当量)和907mg的N,N-二甲基-1-(p-甲苯基磺酰基)吡啶-1-鎓-4-胺氯化盐(2.9mmol，5当量；参见，例如，Tetrahedron Lett.2016,57,4620)溶解在35mL的DCM中并在室温搅拌过夜。反应达到完全转化。将反应混合物直接浓缩到硅藻土上，然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱法纯化，得到450mg(56％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.88-7.23(m,14H),7.58(m,2H),7.53(s,1H),7.31(m,2H),7.31(dd,1H),7.19(m,1H),7.15(t,1H),5.86(s,2H),4.20(s,2H),4.16(t,2H),4.15(t,2H),3.92(m,2H),3.84(m,1H),3.72(t,2H),3.70(s,3H),3.27(t,2H),2.83(s,3H),2.41(s,3H),2.33(s,3H),2.13(m,2H),1.47(m,2H),1.47(m,2H),1.40(s,9H),0.91(t,2H),0.86(s,9H),-0.13(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 147.5,145.3,130.4,129.1,128.0,119.3,117.4,115.5,72.9,72.6,70.4,68.4,66.8,51.8,46.2,38.6,33.8,31.0,30.1,28.5,27.0,23.1,22.4,21.5,17.8,17.8,-1.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C69H85FN7O10S3Si2的计算值:1342.5037,发现值1342.5039.
制备5g_01：乙基5-(3-碘丙基)-2-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：乙基5-(3-氯丙基)-2-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序III从3.15g制备3e_01(12mmol，1.2当量)和4.07g制备4a_01(10mmol，1当量)作为合适的卤化物开始，获得2.6g(41％)所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.84(d,1H),7.65(s,1H),7.45(d,1H),7.43(tm,1H),7.25(tm,1H),5.85(s,2H),4.30(q,2H),3.77(s,3H),3.71(t,2H),3.71(t,2H),3.22(t,2H),2.48(s,3H),2.10(quin,2H),1.31(t,3H),0.92(t,2H),-0.11(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 162.6,157.4,156.8,155.1,151.7,140.5,137.6,137.1,135.3,125.6,123.5,123.2,123.1,117.6,111.9,72.9,66.7,60.7,45.3,35.4,34.4,24.3,18.0,17.8,14.7,-1.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C28H38ClN6O3S2Si的计算值:633.1899,发现值633.1891.
步骤B：乙基5-(3-碘丙基)-2-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
100mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒和回流冷凝器。将其中装入2.6g的来自步骤A的产物(4.10mmol，1当量)、1.23g的NaI(8.2mmol，2当量)和20mL的干丙酮。当反应达到完全转化时，将反应混合物升温至60℃并在该温度搅拌3天。将反应混合物通过添加水稀释然后通过过滤收集沉淀的产物，用水洗涤，然后在高真空下干燥以获得2.5g(84％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.82(d,1H),7.61(s,1H),7.47-7.39(m,1H),7.47-7.39(m,1H),7.23(t,1H),5.83(s,2H),4.29(q,2H),3.75(s,3H),3.71(t,2H),3.33(t,2H),3.16(t,2H),2.42(s,3H),2.13(quint.,2H),1.33(t,3H),0.91(t,2H),-0.12(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 162.6,157.3,156.7,155.1,151.6,140.2,137.6,137.1,135.2,127.1,125.4,123.4,123.2,117.5,111.9,72.8,66.7,60.7,35.2,35.2,27.6,17.8,17.8,14.8,7.8,-1.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C28H38I N6O3S2Si的计算值:725.1255,发现值725.1248.
制备5j_01：乙基5-(3-{2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基]苯氧基}丙基)-2-[甲基(5-甲基-6-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}哒嗪-3-基)氨基]-1,3-噻唑-4-甲酸酯
步骤A：乙基5-{3-[4-(3-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基]丙基}-2-[甲基(5-甲基-6-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}哒嗪-3-基)氨基]-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向在二甲基甲酰胺(50mL)中的来自制备5g_01(1.75g，2.41mmol，1当量)的产物中添加在二甲基甲酰胺(10mL)和碳酸铯(2.36g，7.24mmol，3当量)中的来自制备6a_01(877mg，3.14mmol，1.3当量)的产物，并在80℃将该混合物加热16h。将该反应在真空中浓缩，然后在乙酸乙酯和盐水之间分配，并将该有机相干燥(硫酸镁)且在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，40g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–50％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈黄色油状物的所期望产物(1.75g，2mmol，83％)。LC/MS(C43H54FN7O6SiS2)876[M+H]+；RT 1.46(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.83(dd,1H),7.65(d,J＝1.1Hz,1H),7.49-7.39(m,2H),7.35-7.28(m,1H),7.27-7.12(m,3H),5.86(s,2H),4.25(q,J＝7.1Hz,2H),4.19(s,2H),4.14(t,J＝6.1Hz,2H),3.77(s,3H),3.76–3.68(m,2H),3.26(t,J＝7.7Hz,2H),2.84(s,3H),2.45(s,3H),2.19–2.05(m,1H),1.41(s,9H),1.30(t,3H),0.97-0.88(m,2H),-0.12(s,9H).
步骤B：乙基5-(3-{2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基]苯氧基}丙基)-2-[甲基(5-甲基-6-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}哒嗪-3-基)氨基]-1,3-噻唑-4-甲酸酯
将三氟乙酸(20mL)添加至步骤A的产物(1.5g，1.71mmol，1当量)在二氯甲烷(60mL)中的搅拌溶液中，并将混合物在环境温度下搅拌5h。将反应用二氯甲烷稀释，冷却至0℃并通过添加2N氢氧化钠水性溶液碱化。将有机相干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱(CombiFlash Rf，40g RediSepTM硅胶柱)纯化，用二氯甲烷中的0–10％甲醇梯度洗脱，得到呈黄色胶状物的所期望产物(329mg，0.42mmol，25％)。LC/MS(C38H46FN7O4SiS2)776[M+H]+；RT 2.58(LCMS-V-C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.84(dd,1H),7.67(d,J＝1.0Hz,1H),7.49-7.40(m,2H),7.31-7.22(m,2H),7.21-7.11(m,2H),5.86(s,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),4.15(t,J＝6.1Hz,2H),3.76(s,3H),3.76–3.67(m,2H),3.45(s,2H),3.33-3.22(m,2H),2.46(d,J＝1.0Hz,3H),2.30(s,3H),2.18–2.06(m,2H),1.29(t,J＝7.1Hz,3H),0.97-0.88(m,2H),-0.11(s,9H).
制备6a_01：叔丁基N-[3-(3-氟-4-羟基-苯基)丙-2-炔基]-N-甲基-氨基甲酸酯
使用薗头一般程序从10.00g 2-氟-4-碘苯酚(42.0mmol，1当量)作为合适的苯酚和10.67g叔丁基N-甲基-N-丙-2-炔基氨基甲酸酯(63.1mmol，1.5当量)作为炔烃反应物，获得10.8g(92％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 10.32(s,1H),7.22(brd,1H),7.08(dm,1H),6.92(dd,1H),4.21(s,2H),2.85(s,3H),1.41(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 150.8,146.4,129.0,119.6,118.4,113.2,84.4,82.7,38.5,33.8,28.5；HRMS-ESI(m/z):[M-C4H8+H]+针对C11H11FNO3的计算值:224.0717,发现值224.0720.
制备6b_01：4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯酚
使用薗头一般程序从10.00g 2-氟-4-碘苯酚(42.0mmol，1当量)作为合适的苯酚和5.24g N,N-二甲基丙-2-炔-1-胺(63mmol，1.5当量)作为炔烃反应物，得到7.30g(90％)所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.20(dd,1H),7.07(dm,1H),6.91(m,1H),3.39(m,2H),2.21(m,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 150.9,146.2,128.9,119.5,118.4,113.6,84.5,84.2,48.2,44.3；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C11H13FNO的计算值:194.0976,发现值194.0981.
制备6f_01：4-[3-(二甲基氨基)丁-1-炔基]-2-氟-苯酚
步骤A：4-(3-氟-4-三异丙基甲硅烷基氧基-苯基)丁-3-炔-2-醇
经烘箱干燥的500mL单颈圆底烧瓶配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒。将其中装入4.76g的2-氟代-4-碘代-苯酚(20mmol，1当量)和3.96g的K2CO3(40mmol，2当量)然后添加100mL的干MeCN。在室温近乎剧烈搅拌下向所得混合物中逐滴添加5.13mL的TIPSCl(4.62g，24mmol，1.2当量)。将所得混合物在室温搅拌30min，同时反应达到完全转化。将反应混合物通过硅藻土垫过滤以除去固体颗粒，然后向滤液中添加3.10mL的丁-3-炔-2-醇(2.81g，40mmol，2当量)和20mL的DIPA，并通过进气口置于氮气气氛下。添加702mg Pd(PPh3)2Cl2(1mmol，0.05当量)和190mg CuI(1mmol，0.05当量)后，将所得混合物在室温反应30min，至反应完全转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂通过快速柱色谱纯化得到6.2g(92％)所期望产物，呈黄色油状物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.26(dd,1H),7.12(dm,1H),6.98(t,1H),5.44(d,1H),4.55(m,1H),1.36(d,3H),1.24(sp,1H),1.05(d,18H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 153.2,144.1,128.8,122.3,119.6,116.5,93.4,81.4,57.1,25.0,18.0,12.5；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C19H30FO2Si的计算值:337.1994,发现值337.1994.
步骤B：4-(3-氟-4-三异丙基甲硅烷基氧基-苯基)-N,N-二甲基-丁-3-炔-2-胺
使用烷基化和原位生成碘一般程序从644mg步骤A的产物(2mmol，1当量)作为适当的醇和5mL N-甲基甲胺(10mmol，5当量，2M溶液，在MeOH中)开始，获得360mg(50％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.28(dd,1H),7.14(dm,1H),6.97(t,1H),3.67(q,1H),2.19(s,6H),1.27(d,3H),1.25(m,3H),1.05(d,18H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm153.1,144.0,129.0,122.3,119.8,116.6,88.2,84.1,52.3,41.3,20.1,18.0,12.5；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C21H35FNOSi的计算值:364.2466,发现值364.2470.
步骤C：4-[3-(二甲基氨基)丁-1-炔基]-2-氟-苯酚
在配备经PTFE涂层的磁力搅拌棒的经烘箱干燥的4mL小瓶中装入溶解在3.0mL的干THF中的200mg的来自步骤B的产物(0.55mmol，1当量)，然后在室温逐滴添加660μL的TBAF(1M，在THF中，0.66mmol，1.1当量)。当反应达到完全转化时，将所得混合物在室温搅拌15min。通过添加200μL浓NH4Cl将反应混合物淬灭，然后将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用DCM和MeOH(1.2％ NH3)作为洗脱剂通过快速柱色谱纯化得到80mg(70％)的所期望产物。制备13_01：甲基3-溴-6-(甲基氨基)吡啶-2-甲酸酯
步骤A：甲基6-[双(叔丁氧基羰基)氨基]-3-溴-吡啶-2-甲酸酯
在0℃向在DCM(541mL)中的甲基6-氨基-3-溴代-吡啶-2-甲酸酯(25.0g，108.2mmol)和DMAP(1.3g，0.1当量)中添加Boc2O(59.0g，2.5当量)并将该反应混合物搅拌2.5h。在添加NaHCO3饱和溶液并用DCM萃取后，将合并的有机相干燥和浓缩以提供期望的产物(45.0g，72.3％)。LC/MS(C17H23BrN2O6Na)453[M+H]+.
步骤B：甲基3-溴-6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-甲酸酯
在0℃向在DCM(370mL)中的来自步骤A的产物(42.7g，74.34mmol)中添加TFA(17.1mL，3当量)，并将该反应混合物搅拌18h。在用NaHCO3饱和溶液和盐水清洗后，将合并的有机相干燥、浓缩，并通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(28.3g，115.2％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 10.29(s,1H),8.11(d,1H),7.88(d,1H),3.87(s,3H),1.46(s,9H)13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 165.6,153.1,151.8/148.3,143.5,116.3,109.2,53.2,28.4.LC/MS(C12H15BrN2O4Na)353[M+H]+.
步骤C：甲基3-溴-6-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]吡啶-2-甲酸酯
向在丙酮(45mL)中的来自步骤B的产物(2.96g，8.93mmol)中添加Cs2CO3(8.7g，3当量)和碘甲烷(0.67mL，1.2当量)并将该反应混合物搅拌3h。在用水稀释并用EtOAc萃取后，将合并的有机相用盐水清洗、干燥并浓缩以得到期望的产物(3.5g，112％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.13(d,1H),7.78(d,1H),3.90(s,3H),3.27(s,3H),1.47(s,9H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 165.5,153.6,153.6,147.5,142.8,122.5,111.3,82.0,53.3,34.3,28.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C13H18BrN2O4的计算值:345.0450发现值:345.0429.
步骤D：甲基3-溴-6-(甲基氨基)吡啶-2-甲酸酯
将来自步骤C的产物(3.0g，8.9mmol)在1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(90mL)中于100℃搅拌18h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化得到所期望产物(2.1g，96％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.63(d,1H),7.04(q,1H),6.53(d,1H),3.83(s,3H),2.73(d,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 166.6,158.2,148.2,141.3,112.1,101.3,52.9,28.3；HRMS-ESI(m/z):[M]+针对C8H9BrN2O2的计算值:243.9847发现值:243.9843.
制备14_01：甲基3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]吡啶-2-甲酸酯
步骤A：甲基3-[1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-(甲基氨基)吡啶-2-甲酸酯
在80℃将来自制备13_01的产物(2.07g，8.45mmol)、来自制备7的产物(6.9g，1.2当量)、Cs2CO3(8.26g，3当量)和Pd(AtaPhos)2Cl2(374mg，0.1当量)在1,4-二噁烷(51mL)和水(8.5mL)中的混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(4.5g，74％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.66(dm,4H),7.47-7.38(m,6H),7.31(d,1H),7.23(s,1H),6.78(q,1H),6.59(d,1H),3.82(s,2H),3.67(t,2H),3.58(s,3H),3.46(t,2H),2.77(d,3H),2.06(s,3H),1.35(s,2H),1.27/1.20(d+d,4H),1.14/1.09(d+d,4H),1.05/0.97(d+d,2H),0.98(s,9H),0.84(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 140.1,137.4,135.6,130.2/128.3,109.8,74.2,64.4,61.7,58.9,52.2,50.0,46.9,46.0,43.4,39.8,33.5,30.1,28.4,27.1,10.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H57N4O4Si的计算值:721.4149发现值:721.4148.
步骤B：甲基3-[1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]吡啶-2-甲酸酯
使用Buchwald一般程序III从步骤A的产物开始回流18h，获得4.7g(86％)的所期望产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.78(dm,1H),7.69-7.36(m,10H),7.63(q,1H),7.63(d,1H),7.47(dm,1H),7.44(m,1H),7.35(s,1H),7.31(d,1H),7.24(m,1H),5.86(s,2H),3.86(s,2H),3.72(m,2H),3.67(t,2H),3.64(s,3H),3.61(s,3H),3.46(t,2H),2.36(d,3H),2.13(s,3H),1.40-0.94(m,12H),0.97(s,9H),0.92(m,2H),0.85(s,6H),-0.11(s,9H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C61H79N8O5SSi2的计算值:1091.5433发现值:1091.5426.
步骤C：甲基3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]吡啶-2-甲酸酯
在0℃向在THF(9mL)中的来自步骤B的产物(1.0g，0.916mmol)中添加TBAF在THF中的1M溶液(1.0mL，1.1当量)并将该反应混合物搅拌1h。在用NH4Cl饱和溶液淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相干燥、浓缩并通过柱色谱法(硅胶，DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(752mg，96％)。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.79(dm,1H),7.66(d,1H),7.64(s,1H),7.47(dm,1H),7.43(m,1H),7.36(s,1H),7.33(d,1H),7.25(m,1H),5.87(s,2H),4.46(t,1H),3.86(s,2H),3.73(m,2H),3.68(s,3H),3.62(s,3H),3.40(m,2H),3.35(t,2H),2.37(s,3H),2.14(s,3H),1.42-0.96(m,12H),0.92(m,2H),0.86(s,6H),-0.10(s,9H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H61N8O5SSi的计算值:853.4255发现值:853.4256.
步骤D：甲基3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]吡啶-2-甲酸酯
向在DCM(4.4mL)中的来自步骤C的产物(752mg，0.88mmol)和三乙基胺(0.5mL，4当量)中添加p-甲苯基磺酰基-4-甲基苯磺酸酯(575.4mg，1.76mmol，2当量)并将该反应混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(722mg，81％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.79(dm,1H),7.76(dm,2H),7.68(d,1H),7.64(s,1H),7.47(m,1H),7.46(dm,2H),7.43(td,1H),7.36(s,1H),7.33(d,1H),7.25(td,1H),5.87(s,2H),4.06(m,2H),3.84(s,2H),3.73(t,2H),3.66(s,3H),3.62(s,3H),3.48(m,2H),2.40(s,3H),2.37(s,3H),2.13(s,3H),1.31-0.94(m,12H),0.92(t,2H),0.83(s,6H),-0.10(s,9H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 141.2,137.5,130.6,128.1,127.2,123.4,123.4,123.1,114.7,112.0,72.9,71.5,66.7,58.8,58.4,52.6,36.6,30.1,21.6,17.8,17.4,10.8,-0.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C52H67N8O7S2Si的计算值:1007.4343发现值:1007.4344.
制备P1：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用炔丙胺制备一般程序从制备3d和二甲胺作为合适的胺开始。然后从合适的甲酯开始水解一般程序，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C34H35FN7O3S2的计算值:672.2221,发现值672.2205.
制备P2：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：乙基5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用烷基化一般程序从制备5g_01和制备6b_01作为合适的苯酚开始，获得所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.84(d,1H),7.67(s,1H),7.47(d,1H),7.44(t,1H),7.33(dd,1H),7.25(t,1H),7.22(dd,1H),7.16(t,1H),5.86(s,2H),4.26(q,2H),4.15(t,2H),3.77(s,3H),3.72(t,2H),3.49(brs,2H),3.27(t,2H),2.46(s,3H),2.27(s,6H),2.13(qn,2H),1.29(t,3H),0.92(t,2H),-0.11(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 129.0,127.2,123.5,123.2,119.2,117.7,115.5,111.9,72.8,68.5,66.7,60.7,48.2,44.0,35.3,31.1,23.2,17.9,17.8,14.6,-0.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C39H49FN7O4S2Si的计算值:790.3035,发现值790.3023.
步骤B：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用脱保护和水解一般程序从来自步骤A的产物作为合适的乙酯开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C31H31FN7O3S2的计算值:632.1908,发现值632.1913.
制备P3：2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基]苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸
步骤A：乙基5-{3-[4-(3-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基]丙基}-2-(4-甲基-3-{[(2Z)-3-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向来自制备3g的产物(500mg，0.78mmol，1当量)在甲苯(15mL)中的溶液中添加来自制备4c的产物(327mg，1.17mmol，1.5当量)，然后是三苯基膦(307mg，1.17mmol，1.5当量)和偶氮二甲酸二异丙酯(230μL，1.17mmol，1.5当量)并将混合物加热回流过夜。反应在二氯甲烷和水之间分配，将有机相干燥(PTFE分相器)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，24g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–50％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈灰白色泡沫状物的所期望产物(715mg，0.79mmol，>100％)。LC/MS(C45H56FN7O6SiS2)902[M+H]+；RT 1.46(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.82(dt,J＝7.6,0.9Hz,1H),7.48-7.37(m,2H),7.33(d,J＝11.6Hz,1H),7.28-7.13(m,3H),5.84(s,2H),4.32-4.17(m,6H),4.15(t,J＝6.1Hz,2H),3.72(dd,J＝8.5,7.4Hz,2H),3.27(d,J＝15.4Hz,2H),2.93-2.75(m,5H),2.36(s,3H),2.19–2.10(m,2H),2.10–1.98(m,2H),1.40(s,9H),1.28(t,3H),0.96–0.89(m,2H),-0.11(s,9H).
步骤B：乙基2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基]苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤A的产物(1.67g，1.85mmol，1当量)在乙腈(17mL)中的溶液中添加氟化氢-吡啶(3.22mL，37mmol，20当量)，并在60℃将该混合物加热2h。该反应在3:1二氯甲烷/异丙醇和2N氢氧化钠水溶液之间分配，并将该有机相用盐水清洗，干燥(PTFE分相器)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱(CombiFlash Rf，80gRediSepTM硅胶柱)纯化，用二氯甲烷中的0–7％甲醇梯度洗脱，得到呈黄色固体的所期望产物(1.02g，1.52mmol，82％)。LC/MS(C34H34FN7O3S2)672[M+H]+；RT 2.06(LCMS-V-C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,1H),7.38(ddd,J＝8.2,7.3,1.2Hz,1H),7.32-7.25(m,1H),7.23–7.12(m,3H),4.32–4.21(m,4H),4.15(t,J＝6.1Hz,2H),3.45(s,2H),3.32–3.23(m,2H),2.89(t,J＝6.4Hz,2H),2.35(s,3H),2.31(s,3H),2.20–2.10(m,2H),2.09-1.97(m,2H),1.30(t,J＝7.1Hz,3H).
步骤C：2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基]苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸
向来自步骤B的产物(1.02g，1.52mmol，1当量)在1,4-二噁烷(50mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(637mg，15.2mmol，10当量)并在110℃将该混合物加热过夜。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，80g RediSepTM硅胶柱)纯化，用二氯甲烷中的0–70％0.7N甲醇氨的梯度洗脱，得到固体，用乙腈研磨，过滤并在真空下干燥，得到所期望产物，呈黄色固体(657mg，1.02mmol，67％)。HRMS-ESI(m/z)[M+H]+针对C32H31FN7O3S2的计算值:644.1914,发现值644.1930.
制备P4：3-[[5-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-[4-羧基-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-2-基]氨基]-2-羟基-戊基]-二甲基-氨]丙烷-1-磺酸酯
步骤A：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-5-(二甲基氨基)戊基]-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用用甲苯磺酸酯烷基化的一般程序的烷基化，从制备5a_01和N-甲基甲胺作为合适的胺开始，获得所期望产物。
HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C64H84FN8O7S2Si2的计算值:1215.5421,发现值1215.5389.
步骤B：3-[[5-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-[4-羧基-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-2-基]氨基]-2-羟基-戊基]-二甲基-氨]丙烷-1-磺酸酯
将步骤A的产物悬浮在MeCN(5mL/mmol)中，然后加入氧硫杂环戊烷2,2-二氧化物(10当量)并在60℃搅拌持续(观察到完全转化)。将反应混合物浓缩。该粗混合物，其含有3-[[5-[[5-[3-[4-[3-[叔-丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟代-苯氧基]丙基]-4-甲氧基羰基-噻唑-2-基]-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]-2-[叔-丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-戊基]-二甲基-铵基]丙烷-1-磺酸酯(LC-MS-ESI(m/z):对于C67H90FN8O10S3Si2的[M+H]+计算值:1337.5,发现值1337.6)使用季盐脱保护一般程序直接转移到下一反应，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C39H48FN8O7S3的计算值:855.2787,发现值855.2786.
制备P5：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-[4-羟基-5-(三甲基氨)戊基]氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
步骤A：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-5-(二甲基氨基)戊基]-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用用甲苯磺酸酯烷基化的一般程序的烷基化，从制备5a_01和N-甲基甲胺作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C64H84FN8O7S2Si2的计算值:1215.5421,发现值1215.5389.
步骤B：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-[4-羟基-5-(三甲基氨)戊基]氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
将步骤A的产物溶解在乙腈(4mL/mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(1mL/mmol)的混合物中，然后添加碘甲烷(5当量)并在室温搅拌直至观察到完全转化(约1小时)。将反应混合物浓缩。该粗混合物，其含有[5-[[5-[3-[4-[3-[叔-丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟代-苯氧基]丙基]-4-甲氧基羰基-噻唑-2-基]-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]-2-[叔-丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-戊基]-三甲基-铵(LC-MS-ESI(m/z):对于C65H86FN8O7S2Si2的[M]+计算值:1229.6,发现值1229.4)使用季盐脱保护一般程序转移到下一反应，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C37H44FN8O4S2的计算值:747.2905,发现值747.2900.
制备P6：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-[3-(二甲基氨基)丙基]氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基2-[叔丁氧基羰基-[3-(二甲基氨基)丙基]氨基]-5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用光信一般程序II，从制备1b_01和3-(二甲基氨基)丙-1-醇开始，获得1.40g(定量，样品中含有约35n/n％DIAD-2H)的所期望产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.30(dd,1H),7.21(dm,1H),7.13(t,1H),4.23(s,2H),4.10(t,2H),4.01(t,2H),3.74(s,3H),3.22(t,2H),2.86(s,3H),2.24(t,2H),2.12(s,6H),2.08(m,2H),1.74(m,2H),1.51/1.41(s,18H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C33H48FN4O7S的计算值:663.3228,发现值663.3218.
步骤B：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[3-(二甲基氨基)丙基氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用HFIP脱保护通用程序，从来自步骤A的产物开始，获得0.95g(80％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.57(t,1H),7.31(d,1H),7.21(d,1H),7.13(t,1H),4.23(br.,2H),4.07(t,2H),3.69(s,3H),3.17(q,2H),3.12(t,2H),2.86(br.,3H),2.24(t,2H),2.11(s,6H),2.00(quint.,2H),1.63(m,2H),1.41(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 129.1,119.3,115.4,68,57.0,51.7,45.6,42.8,38.6,33.8,30.6,28.5,27.0,23.3；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C28H40FN4O5S的计算值:563.2703,发现值563.2694.
步骤C：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[3-(二甲基氨基)丙基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序III从来自步骤B的产物和制备4a_01开始，生产0.79g(51％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.84(d,1H),7.73(s,1H),7.46(dd,1H),7.43(td,1H),7.31(brd.,1H),7.25(td,1H),7.21(d,1H),7.16(t,1H),5.86(s,2H),4.35(t,2H),4.20(br.,2H),4.15(t,2H),3.76(s,3H),3.72(t,2H),3.27(t,2H),2.84(br.,3H),2.45(s,3H),2.32(t,2H),2.18(s,6H),2.13(m,2H),1.86(m,2H),1.40(s,9H),0.92(t,2H),-0.11(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 129.1,127.2,123.4,123.2,119.3,117.6,115.4,111.9,72.8,68.4,66.7,56.4,51.9,45.7,45.5,38.5,33.8,31.0,28.5,25.0,23.1,17.9,17.8,-1.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C46H62FN8O6S2Si的计算值:933.3987,发现值933.3990.
步骤D：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-[3-(二甲基氨基)丙基]氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用脱保护和水解一般程序，然后通过反相制备色谱法(C18，0.1％ TFA水溶液：MeCN)再纯化，从来自步骤C的产物开始，获得所期望的产物的TFA-盐。HRMS-ESI(m/z):[M+2H]2+针对C34H39FN8O3S2的计算值:345.1280,发现值345.1265.
P7的制备：2-({6-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-5-甲基哒嗪-3-基}(甲基)氨基)-5-(3-{2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基]苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸
步骤A：乙基2-({6-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-5-甲基哒嗪-3-基}(甲基)氨基)-5-(3-{2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基]苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
将三氟乙酸(20mL)添加到制备5j_01步骤A的产物(1.5g，1.71mmol，1当量)在二氯甲烷(60mL)中的搅拌溶液中，并将混合物在环境温度搅拌过夜。将反应用二氯甲烷稀释，冷却至0℃，然后通过加入2N氢氧化钠水溶液碱化，将有机相干燥(硫酸镁)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱(CombiFlash Rf，40g RediSepTM硅胶柱)纯化，用二氯甲烷中的0–10％甲醇梯度洗脱，得到呈黄色固体的所期望产物(361mg，0.56mmol，33％)。LC/MS(C32H32FN7O3S2)646[M+H]+；RT 1.98(LCMS-V-C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,1H),7.68(d,J＝1.2Hz,1H),7.53(d,J＝7.9Hz,1H),7.39(ddd,J＝8.2,7.2,1.3Hz,1H),7.32-7.11(m,4H),4.25(q,J＝7.1Hz,2H),4.15(t,J＝6.2Hz,2H),3.77(s,3H),3.46(s,2H),3.27(t,J＝7.7Hz,2H),2.47(d,J＝1.0Hz,3H),2.31(s,3H),2.19-2.07(m,2H),2.23(s,1H),1.30(t,J＝7.1Hz,3H).
步骤B：2-({6-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-5-甲基哒嗪-3-基}(甲基)氨基)-5-(3-{2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基]苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸
向来自步骤B的产物(361mg，0.56mmol，1当量)在1,4-二噁烷(15mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(352mg，8.39mmol，15当量)并在100℃将该混合物加热过夜。使反应冷却至环境温度，并且真空浓缩。将残余物用水研磨，过滤，用水然后乙醚洗涤，真空干燥得到所期望产物，呈黄色固体(286mg，0.46mmol，83％)[作为锂盐]。HRMS-ESI(m/z)[M+H]+针对C30H29FN7O3S2的计算值:618.1752,发现值618.1767.
制备P8：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-[2-氟-4-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
将经烘箱干燥的24mL小瓶配备PTFE涂层的磁力搅拌棒，并将其中装入溶解在2.5mL干THF中的250mg 1-甲基哌嗪(2.5mmol，5.0当量)然后经5分钟的时间通过注射器逐滴添加133mg 3-溴丁-1-炔(1.0mmol，2.0当量)，并在该温度搅拌30min。向该所得混合物添加301mg的制备3a(0.50mmol，1.0当量)、18.15mg Pd(PPh3)2Cl2(0.025mmol，0.05当量)和4.76CuI(0.025mmol，0.05当量)，然后将其加热至60℃并在该温度搅拌2h。反应达到完全转化。将硅藻土添加到反应混合物中并在减压下除去挥发物。然后使用DCM和MeOH(1.2％NH3)作为洗脱剂通过快速色谱纯化得到300mg(95％产率)的所期望产物。
步骤B：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序II从300mg的来自步骤A的产物(0.47mmol，1.0当量)和140mg 1,3-苯并噻唑-2-胺(0.94mmol，2.0当量)开始，获得150mg(42％)mg的所期望产物。
步骤C：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用水解一般程序从来自步骤B的产物作为合适的甲酯开始，获得所期望产物。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.87(d,1H),7.49(d,1H),7.36(t,1H),7.26(dd,1H),7.2(t,1H),7.16(dd,1H),7.13(t,1H),4.27(t,2H),4.12(t,2H),3.65(q,1H),3.27(t,2H),2.87(t,2H),2.62-2.21(brm,8H),2.14(s,3H),2.13(qn,2H),2.04(qn,2H),1.33(s,3H),1.25(d,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 164.3,155.4,151.5,151.4,148.6,147.2,145.1,140.2,136.3,130.2,129.0,129.0,127.6,126.5,122.5,122.3,119.2,116.4,115.5,115.4,88.4,84.1,68.5,51.7,46.3,46.1,31,23.9,23.0,20.3,19.6,12.9；HRMS-ESI(m/z)[M+H]+针对C37H40FN8O3S2的计算值:727.2649,发现值727.2630
制备P9：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-(3-吡咯烷-1-基丙-1-炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-(3-吡咯烷-1-基丙-1-炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用炔丙胺制备一般程序从258mg制备3d(0.40mmol，1当量)作为适当的炔丙醇和吡咯烷(20当量，670mg)开始，获得120mg所期望产物(43％)。
步骤B：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-(3-吡咯烷-1-基丙-1-炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用水解一般程序从来自步骤A的产物作为合适的甲酯开始，获得所期望产物。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.88(d,1H),7.49(d,1H),7.37(t,1H),7.29(dd,1H),7.2(dd,1H),7.19(t,1H),7.14(t,1H),4.27(t,2H),4.14(t,2H),3.52(s,2H),3.27(t,2H),2.88(t,2H),2.52(t,4H),2.34(s,3H),2.13(qn,2H),2.04(qn,2H),1.69(t,4H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 151.5,151.4,148.6,147.3,145.1,140.1,136.7,130.2,129.0,129.0,127.5,126.5,122.5,122.3,119.2,116.5,115.5,115.4,85.9,83.3,68.6,52.3,46.3,43.3,31.1,23.8,23.8,23.0,20.4,12.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C35H35FN7O3S2的计算值:684.2221,发现值684.2209.
制备P10：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用炔丙胺制备一般程序从100mg制备3d(0.155mmol，1当量)作为适当的炔丙醇和1-甲基哌嗪(310.7mg，20当量)开始，获得150mg所期望产物(79％)。
步骤B：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用水解一般程序从来自步骤A的产物作为合适的甲酯开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C36H38FN8O3S2的计算值:713.2486,发现值713.2474.
制备P11：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丁-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：乙基5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丁-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[甲基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用烷基化一般程序从制备5g_01和制备6f_01作为合适的苯酚开始，获得所期望产物。
步骤B：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丁-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用脱保护和水解一般程序从来自步骤A的产物作为合适的乙酯开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C32H33FN7O3S2的计算值:646.2065,发现值646.2057.
P12的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[2-(二甲基氨基)乙基氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基-[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)噻唑-4-甲酸酯
使用薗头一般程序，从1.00g制备3a(1.66mmol，1当量)和413mg的叔丁基N-[2-(二甲基氨基)乙基]-N-丙-2-炔基-氨基甲酸酯(1.83mmol，1.1当量)作为合适的炔烃，分离出所期望产物，呈黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.30(d,1H),7.21(d,1H),7.15(t,1H),4.27(brt,2H),4.26(t,2H),4.12(t,2H),3.77(s,3H),3.47(brt,2H),3.26(t,2H),2.89(t,2H),2.82(brs,2H),2.45(brs,6H),2.32(s,3H),2.11(qn,2H),2.04(qn,2H),1.43(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 163.1,155.4,151.8,151.4,151.4,147.5,142.4,136.2,135,129.1,129.1,119.2,115.5,114.8,82.3,80.3,68.3,56.3,52.0,46.4,46.4,44.6,43.1,30.7,28.5,24.2,23,19.7,15.7；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C34H43ClFN6O5S的计算值:701.2683,发现值701.2678.
步骤B：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基-[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序II从步骤A的产物和1,3-苯并噻唑-2-胺开始，获得所期望产物。LC-MS-ESI(m/z):[M+H]+针对C41H48FN8O5S2的计算值:815.3,发现值815.4.
步骤C：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[2-(二甲基氨基)乙基氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用脱保护和水解一般程序，然后通过反相制备色谱法(C18，在水中的25mMNH4HCO3:MeCN)再纯化，从来自步骤B的产物开始，获得所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C35H38FN8O3S2的计算值:701.2487,发现值701.2483.
P13的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[乙基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用银催化炔丙胺制备一般程序从制备3c，多聚甲醛作为醛和N-甲基乙胺作为合适的仲胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C34H35FN7O3S2的计算值:672.2221,发现值672.2206.
P14的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(二乙基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用银催化炔丙胺制备一般程序从制备3c，多聚甲醛作为醛和二乙胺作为合适的仲胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C35H37FN7O3S2的计算值:686.2377,发现值686.2386.
P15的制备：2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{4-[3-(4,4-二氟哌啶-1-基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(4,4-二氟-1-哌啶基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用炔丙胺制备一般程序从100mg制备3d(0.155mmol，1当量)作为适当的炔丙醇和4,4-二氟哌啶(20当量)开始，获得120mg所期望产物(72％)。
步骤B：2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{4-[3-(4,4-二氟哌啶-1-基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸
使用水解一般程序从来自步骤A的产物作为合适的甲酯开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C36H35F3N7O3S2的计算值:734.2189,发现值734.2185.
P16的制备：2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6-[2-(甲基氨基)乙氧基]-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸
步骤A：4-甲基吗啉-3-酮
将2-(甲基氨基)乙醇(5.32mL，66.6mmol，1当量)在乙醇(100mL)中的溶液和35％氢氧化钠水溶液(6.25mL)冷却至15-20℃并在经1h伴随剧烈搅拌下添加氯乙酰氯(13.3mL，166mmol，2.5当量)和35％氢氧化钠水溶液(22mL)。将混合物搅拌20min，然后用盐酸水溶液中和并用二氯甲烷(3×100mL)萃取。用水洗涤合并的有机萃取物，干燥(PTFE分相器)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，80g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–100％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈无色油状物的所期望产物(4.4g，38.2mmol，58％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.00(s,2H),3.84–3.78(m,2H),3.36–3.29(m,2H),2.86(s,3H).
步骤B：2-(丁-2-炔-1-基)-4-甲基吗啉-3-酮
冷却至-78℃，向二异丙基胺(6.45mL，45.9mmol，1.2当量)在四氢呋喃(130mL)中的溶液中逐滴添加n-丁基锂(2.06M，在己烷中；20.4mL，42mmol，1.1当量)。1分钟后，滴加步骤A的产物(4.4g，38.2mmol，1当量)的四氢呋喃(30mL)溶液。15分钟后，滴加1-溴-2-丁炔(4.02mL，45.9mmol，1.2当量)的四氢呋喃(15mL)溶液，并将混合物在-78℃下搅拌1h然后让其升温至环境温度。添加饱和氯化铵水溶液并用乙酸乙酯(x3)萃取混合物，将合并的有机萃取物干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，80g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–100％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈黄色油状物的所期望产物(5.15g，30.8mmol，81％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.09(dd,J＝7.6,3.5Hz,1H),4.01–3.94(m,1H),3.76(ddd,J＝11.9,10.0,3.6Hz,1H),3.52–3.41(m,1H),3.26–3.18(m,1H),2.86(s,3H),2.67–2.58(m,1H),2.57–2.44(m,1H),1.73(t,J＝2.6Hz,3H).
步骤C：2-[2-(甲基氨基)乙氧基]己-4-炔酸
向来自步骤B的产物(3.25g，19.4mmol，1当量)在甲醇(110mL)中的溶液添加1M氢氧化锂水溶液(60.3mL，60.3mmol，3.1当量)并将该混合物加热回流过夜。将反应在真空中浓缩，得到所期望产物，呈橙色胶状物(5.15g，27.8mmol，100％)，无需进一步表征，直接用于后续步骤。
步骤D：2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}(甲基)氨基)乙氧基]己-4-炔酸
在0℃向来自步骤C的产物(5.15g，27.8mmol，1当量)在1,4-二噁烷(45mL)和水(160mL)中的溶液中添加碳酸钾(15.4g，111mmol，4当量)，然后是9H-芴-9-基-甲基氯甲酸酯(7.19g，27.8mmol，1当量)，并允许该混合物升温至环境温度并搅拌2h。将该反应物在水和乙酸乙酯之间分配，水相用盐酸酸化至pH 2-3并用乙酸乙酯(3x300mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱(CombiFlash Rf，120g RediSepTM硅胶柱)纯化，用二氯甲烷中的0–20％甲醇梯度洗脱，得到呈深黄色胶状物的所期望产物(7.06g，17.3mmol，62％)。LC/MS(C24H25NO5)408[M+H]+；RT 0.74(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.90(t,J＝6.8Hz,2H),7.65(dd,J＝7.5,1.1Hz,2H),7.42(td,J＝7.4,3.0Hz,2H),7.34(td,J＝7.4,1.3Hz,2H),4.43–4.22(m,3H),3.50–3.42(m,1H),3.39–3.28(m,1H),3.26–3.15(m,3H),2.90–2.82(m,3H),2.51–2.44(m,2H),1.71(dt,J＝13.8,2.5Hz,3H).
步骤E：(9H-芴-9-基)甲基N-{2-[(1-羟基己-4-炔-2-基)氧基]乙基}-N-甲基氨基甲酸酯
将来自步骤D的产物(7.06g，17.33mmol，1当量)在四氢呋喃(120mL)中的溶液冷却至-10℃，然后逐滴添加在THF(40mL)中的三乙基胺(2.65mL，19.1mmol，1.1当量)和异丁基氯甲酸酯(2.7mL，20.8mmol，1.2当量)。通过过滤除去沉淀并将溶液冷却至-10℃。滴加硼氢化钠(2.62g，69.3mmol，4当量)的水(40mL)溶液，并将混合物在-10℃下搅拌1小时。使用1N盐酸水溶液将溶液的pH调节至pH 5，然后使用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 10。分离各层并将有机相依次用水(100mL)和盐水(50mL)洗涤，干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，80g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–100％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈无色胶状物的所期望产物(4.64g，11.8mmol，68％)。LC/MS(C24H27NO4)394[M+H]+；RT 0.77(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.90(d,J＝7.5Hz,2H),7.65(dt,J＝7.4,0.9Hz,2H),7.43(t,J＝7.4Hz,2H),7.35(td,J＝7.4,1.2Hz,2H),4.68–4.60(m,1H),4.39(d,J＝6.0Hz,1H),4.34(d,J＝6.7Hz,1H),4.28(t,J＝6.4Hz,1H),3.60–3.51(m,1H),3.46–3.36(m,2H),3.34–3.28(m,2H),3.19(dd,J＝16.6,5.5Hz,2H),2.84(d,J＝10.8Hz,3H),2.38–2.15(m,2H),1.71(t,J＝2.5Hz,3H).
步骤F：(9H-芴-9-基)甲基N-[2-({1-[(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基]己-4-炔-2-基}氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸酯
向来自步骤E的产物(4.64g，11.8mmol，1当量)和咪唑(1.56mL，23.6mmol，2当量)在二氯甲烷(200mL)中的冷却溶液中逐滴添加叔丁基(氯代)二苯基硅烷(6.13mL，23.6mmol，2当量)并允许该混合物升温至环境温度并搅拌过夜。将反应用2M氯化铵水溶液淬灭，将混合物用二氯甲烷(3x200mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(PTFE分相器)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，120g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–25％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈无色胶状物的所期望产物(5.86g，9.27mmol，79％)。LC/MS(C40H45NO4Si)632[M+H]+；RT 1.38(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.87(dd,J＝20.0,7.5Hz,2H),7.67–7.56(m,6H),7.53–7.39(m,7H),7.39–7.22(m,3H),4.38(t,J＝4.8Hz,1H),4.31(s,1H),4.24(t,J＝5.7Hz,1H),3.73–3.61(m,1H),3.60–3.44(m,2H),3.34–3.29(m,2H),3.29–3.18(m,1H),3.16–3.06(m,1H),2.81(d,J＝14.1Hz,3H),2.43–2.26(m,2H),1.69(t,J＝2.4Hz,3H),0.98(s,9H).
步骤G：(9H-芴-9-基)甲基N-[2-({1-[(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基]-3-(3,6-二氯-5-甲基哒嗪-4-基)丙-2-基}氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸酯
在150℃在密封烧瓶中将来自步骤F的产物(5.86g，9.27mmol，1当量)和3,6-二氯-1,2,4,5-四嗪(5.6g，37.1mmol，4当量)在甲苯(130mL)中的溶液加热过夜。反应在真空中浓缩并通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，120g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–30％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈粉色泡沫状物的所期望产物(2.99g，3.97mmol，43％)。LC/MS(C42H45Cl2N3O4Si)754[M+H]+；RT 1.37(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.90(d,J＝7.7Hz,1H),7.78(d,J＝7.4Hz,1H),7.68–7.59(m,5H),7.57–7.50(m,1H),7.47–7.41(m,6H),7.45–7.37(m,1H),7.36–7.28(m,2H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),4.30(d,J＝5.7Hz,1H),4.27–4.11(m,2H),3.81–3.60(m,3H),3.55–3.45(m 1H),3.20–2.98(m,4H),2.89–2.77(m,1H),2.58(d,J＝23.0Hz,3H),2.39(d,J＝13.1Hz,3H),1.01(s,9H).
步骤H：4-{3-[(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基]-2-[2-(甲基氨基)乙氧基]丙基}-3,6-二氯-5-甲基哒嗪
在环境温度将来自步骤G的产物(2.79g，3.7mmol，1当量)和二乙基胺(0.77mL，7.39mmol，2当量)在乙腈(60mL)中的溶液搅拌过夜。添加水并且将混合物用乙酸乙酯(3x70mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(100mL)洗涤，干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱(CombiFlash Rf，40g RediSepTM硅胶柱)纯化，用二氯甲烷中的0–16％甲醇梯度洗脱，得到呈橙色/粉红色胶状物的所期望产物(1.9g，3.57mmol，96％)。LC/MS(C27H35Cl2N3O2Si)532[M+H]+；RT 0.84(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.69–7.62(m,4H),7.54–7.41(m,6H),3.83–3.60(m,3H),3.42–3.36(m,1H),3.16–2.97(m,3H),2.45(s,3H),2.39–2.23(m,2H),2.06(s,3H),1.02(s,9H).
步骤I：叔丁基N-[2-({1-[(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基]-3-(3,6-二氯-5-甲基哒嗪-4-基)丙-2-基}氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸酯
向来自步骤H的产物(1.9g，3.57mmol，1当量)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中添加二-叔丁基二碳酸酯(1.53mL，7.14mmol，2当量)，然后是三乙基胺(1.99mL，14.3mmol，4当量)并在环境温度将该混合物搅拌4h。将该反应物在二氯甲烷和水之间分配，将水相酸化至pH 4并用二氯甲烷(3x80mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(PTFE分相器)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，40g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–25％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈无色胶状物的所期望产物(1.83g，2.9mmol，81％)。LC/MS(C32H43Cl2N3O4Si)532[M-Boc+H]+；RT 1.33(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.69–7.62(m,4H),7.54–7.41(m,6H),3.76(qd,J＝10.7,4.7Hz,2H),3.66(d,J＝5.5Hz,1H),3.44(q,J＝7.9,6.3Hz,1H),3.20–3.10(m,3H),3.04(dd,J＝14.0,4.1Hz,2H),2.58(s,3H),2.44(s,3H),1.31(d,J＝22.6Hz,9H),1.02(s,9H).
步骤J：叔丁基N-(2-{[1-(3,6-二氯-5-甲基哒嗪-4-基)-3-羟基丙-2-基]氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸酯
将来自步骤I的产物(1.83g，2.9mmol，1当量)在四氢呋喃(75mL)中的溶液冷却至0℃然后添加四丁基氟化铵(1M，在四氢呋喃中；2.9mL，2.9mmol，1当量)并在0℃搅拌30min，然后在环境温度搅拌1h。该反应物在二氯甲烷和水之间分配，并将水相用二氯甲烷(x2)萃取。用盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(PTFE分相器)并在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，24g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–100％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈浅橙色胶状物的所期望产物(0.73g，1.86mmol，64％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.93(t,J＝5.5Hz,1H),3.62–3.44(m,4H),3.23(dt,J＝9.6,6.0Hz,1H),3.11(d,J＝23.9Hz,2H),3.02(dd,J＝6.5,2.0Hz,2H),2.60(d,J＝8.1Hz,3H),2.45(s,3H),1.35(d,J＝13.0Hz,9H).
步骤K：甲基2-{[(叔丁氧基)羰基][2-(2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙氧基)-3-(3,6-二氯-5-甲基哒嗪-4-基)丙基]氨基}-5-(3-{4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤J的产物(125mg，0.32mmol，1当量)在甲苯(20mL)中的溶液中添加来自制备1c的产物(171mg，0.35mmol，1.1当量)、二-叔丁基偶氮二甲酸酯(146mg，0.63mmol，2当量)和三苯基膦(166mg，0.63mmol，2当量)并在50℃将该混合物搅拌1h。该反应在二氯甲烷和水之间分配，并将水相用二氯甲烷(x2)萃取，并将合并的有机萃取物用盐水清洗、干燥(硫酸镁)且在真空中浓缩。通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，12g RediSepTM硅胶柱)纯化，用异-庚烷中的0–100％乙酸乙酯的梯度洗脱，得到呈淡黄色胶状物的所期望产物(282mg，0.32mmol，102％)。LC/MS(C40H53Cl2FN6O8S)867[M+H]+；RT 0.97(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.30(dd,1H),7.23–7.17(m,1H),7.12(t,1H),4.29(dd,J＝13.9,5.7Hz,1H),4.10(t,J＝6.0Hz,2H),3.96–3.87(m,1H),3.74(s,3H),3.61–3.48(m,1H),3.42(s,3H),3.32(s,2H),3.25(dt,J＝7.1,3.9Hz,3H),3.16–2.99(m,2H),2.97–2.89(m,1H),2.58(d,J＝11.6Hz,2H),2.45(s,3H),2.23(s,6H),2.10(t,J＝6.9Hz,2H),1.52(s,9H),1.31(d,J＝39.6Hz,9H).
步骤L：甲基2-{[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙氧基)-3-(3,6-二氯-5-甲基哒嗪-4-基)丙基]氨基}-5-(3-{4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
在100℃在微波照射下将来自步骤K的产物(275mg，0.32mmol，1当量)在1,1,1,3,3,3-六氟代-2-丙醇(2.5mL，23.7mmol，74.7当量)中的溶液加热60min。反应在真空中浓缩并通过自动快速柱色谱法(CombiFlash Rf，12g RediSepTM硅胶柱)纯化，用二氯甲烷中的0–7％甲醇梯度洗脱，得到呈白色固体的所期望产物(154mg，0.2mmol，63％)。LC/MS(C35H45Cl2FN6O6S)767[M+H]+；RT 0.70(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.83(br s,1H),7.30(dd,J＝11.9,2.0Hz,1H),7.24–7.17(m,1H),7.12(t,J＝8.7Hz,1H),4.08(t,J＝6.1Hz,2H),3.82(dt,J＝9.0,4.5Hz,1H),3.70(s,3H),3.60–3.49(m,1H),3.46–3.39(m,4H),3.33(s,2H),3.29–3.18(m,1H),3.14(t,2H),3.10–3.02(m,2H),2.98(dd,J＝13.9,3.8Hz,1H),2.64–2.53(m,2H),2.44(s,3H),2.23(s,6H),2.07–1.95(m,2H),1.32(d,J＝30.8Hz,9H).
步骤M：甲基2-[6-(2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙氧基)-3-氯-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-(3-{4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤L的产物(154mg，0.2mmol，1当量)在1,4-二噁烷(14mL)中的溶液中添加碳酸铯(131mg，0.4mmol，2当量)、N,N-二异丙基乙基胺(0.07mL，0.4mmol，2当量)和双(二-叔丁基(4-二甲基氨基苯基)膦)二氯化钯(II)(14.2mg，0.02mmol，0.1当量)并在80℃将该混合物加热45min。将反应在二氯甲烷和水之间分配，水相用二氯甲烷(x2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱(CombiFlashRf，12g RediSepTM硅胶柱)纯化，用二氯甲烷中的0–8％甲醇梯度洗脱，得到呈奶油状物的所期望产物(136mg，0.19mmol，93％)。LC/MS(C35H44ClFN6O6S)731[M+H]+；RT 0.75(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.31(dt,J＝12.0,1.9Hz,1H),7.25–7.19(m,1H),7.14(t,1H),4.86(dd,1H),4.25(s,1H),4.13(t,J＝6.2Hz,2H),3.93(d,J＝13.5Hz,1H),3.78(s,3H),3.56(t,J＝5.6Hz,2H),3.42(s,3H),3.32(s,2H),3.30–3.23(m,2H),3.21–3.09(m,2H),3.08–3.00(m,1H),2.58–2.52(m,1H),2.34(s,3H),2.23(s,6H),2.12(p,J＝6.7Hz,2H),1.27(d,J＝28.5Hz,9H).
步骤N：甲基2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6-(2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙氧基)-4-甲基-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤M的产物(136mg，0.19mmol，1当量)在环己醇(4.5mL)中的溶液中添加2-氨基苯并噻唑(55.7mg，0.37mmol，2当量)和N,N-二异丙基乙基胺(0.1mL，0.56mmol，3当量)并将该混合物用氮气喷淋(10min)。添加Xantphos(21.5mg，0.04mmol，0.2当量)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(17mg，0.02mmol，0.1当量)，并将混合物在140℃下在微波照射下加热1h。将反应在二氯甲烷和水之间分配，水相用二氯甲烷(3x40mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(PTFE分相器)并在真空中浓缩。通过反相自动快速色谱法(CombiFlash Rf，C18 15.5g Gold RediSep柱)纯化，用5–95％的乙腈水溶液梯度洗脱，得到呈黄色固体的所期望产物(70.8mg，0.08mmol，45％)。LC/MS(C42H49FN8O6S2)845[M+H]+；RT 0.86(LCMS-V-B2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.52(br s,1H),7.88(d,J＝7.8Hz,1H),7.49(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(ddd,J＝8.2,7.3,1.3Hz,1H),7.31(dd,J＝11.9,1.9Hz,1H),7.24–7.12(m,3H),4.80(dd,1H),4.22(s,1H),4.15(t,J＝6.2Hz,2H),3.94(d,J＝13.4Hz,1H),3.78(s,3H),3.56(t,J＝5.7Hz,2H),3.44–3.37(m,1H),3.31(s,2H),3.28(d,1H),3.24–3.14(m,2H),3.12–2.97(m,2H),2.58(d,J＝12.3Hz,3H),2.33(s,3H),2.19(s,6H),2.14(q,J＝7.0Hz,2H),1.27(d,9H).
步骤O：甲基2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6-[2-(甲基氨基)乙氧基]-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤N的产物(70.8mg，0.08mmol，1当量)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中缓慢添加三氟乙酸(1mL)并在环境温度将该混合物搅拌1h。将该反应物在二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配，并将水相用二氯甲烷(3x30mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(PTFE分相器)并真空浓缩，得到所期望产物，呈亮黄色固体(59.8mg，0.08mmol，96％)。LC/MS(C37H41FN8O4S2)745[M+H]+；RT 1.07(LCMS-V-B1).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.88(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.49(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(ddd,J＝8.2,7.2,1.3Hz,1H),7.32(dd,J＝11.9,1.9Hz,1H),7.24–7.12(m,3H),4.79–4.69(m,1H),4.26–4.19(m,1H),4.15(t,J＝6.2Hz,2H),4.03(dd,J＝13.5,2.4Hz,1H),3.78(s,3H),3.60(t,J＝5.5Hz,2H),3.39(s,2H),3.32–3.27(m,2H),3.15(d,J＝14.6Hz,1H),3.08–2.99(m,1H),2.70(t,J＝5.5Hz,2H),2.38(s,3H),2.29(s,3H),2.22(s,6H),2.17–2.08(m,2H).
步骤P：2-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6-[2-(甲基氨基)乙氧基]-5H,6H,7H,8H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基}-5-(3-{4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基]-2-氟苯氧基}丙基)-1,3-噻唑-4-甲酸
向来自步骤O的产物(59.8mg，0.08mmol，1当量)在1,4-二噁烷(2mL)中的溶液中添加1M氢氧化锂水溶液(0.24mL，0.24mmol，3当量)并在50℃将该混合物加热2h。过滤收集固体并在真空下干燥，得到所期望产物，呈亮黄色固体(43mg，0.06mmol，73％)，为锂盐。HRMS-ESI(m/z)[M+H]+针对C36H40FN8O4S2的计算值:731.2598,发现值731.2623.
P17的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-(3-哌嗪-1-基丙-1-炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用银催化炔丙胺制备一般程序从制备3c，多聚甲醛作为醛和叔丁基-哌嗪-1-甲酸酯作为合适的仲胺开始，得到所期望产物。
步骤B：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-(3-哌嗪-1-基丙-1-炔基)苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
在60℃将来自步骤A的产物(207mg，0.25mmol)和HFxPyr(2.5mmol，10当量)在乙腈(4.3mL)中的混合物搅拌2.5h。通过快速色谱法在24g硅胶柱上使用DCM和MeOH(NH3)作为洗脱剂，将该产物纯化以得到143mg(79％)的期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C35H36FN8O3S2的计算值:699.2330,发现值699.2322.
P18的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(1-哌啶基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(1-哌啶基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用炔丙胺制备一般程序从100mg制备3d(0.155mmol，1当量)作为适当的炔丙醇和哌啶(264.2mg，20当量)开始，获得55mg所期望产物(50％)。
步骤B：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(1-哌啶基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用水解一般程序从步骤A的产物作为合适的甲酯开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C36H37FN7O3S2的计算值:698.2377,发现值698.2373.
P19的制备：6-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基}-3-(1-{[3-(2-{[(3S)-3,4-二羟基丁基]氨基}乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基]甲基}-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙胺作为合适的胺开始，得到具有二羟基保护胺的化合物。用10％ HCl溶液(室温，1h)水解并通过制备型HPLC纯化(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)提供所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H55N9O5的计算值:822.4125,发现值:822.4120.
P20的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和1-甲基哌嗪作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+2H]2+针对C45H58N10O3S的计算值:409.2207,发现值:409.2208.
P21的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和吡咯烷作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H54N9O3S的计算值:788,4070,发现值:788.4068.
P22的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-(4-羟基丁基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和4-氨基丁-1-醇作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H56N9O4S的计算值:806.4176,发现值:806.4174.
P23的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[[3-羟基-2-(羟基甲基)丙基]氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从开始制备12和(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)甲胺作为合适的胺，获得了具有二羟基保护胺的化合物。用10％ HCl溶液(室温，1h)水解并通过制备型HPLC纯化(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)提供所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H56N9O5S的计算值:822,4125,发现值:822.4099.
P24的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和2-氨基丙烷-1,3-二醇作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H54N9O5S的计算值:808.3969,发现值:808.3965.
P25的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-(3-羟基丙基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和3-氨基丙-1-醇作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H54N9O4S的计算值:792.4019,发现值:792.4012.
P26的制备：6-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-3-[1-[[3-[2-(3-羟基丙基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序II从制备14_01和3-氨基丙烷-1-醇作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C41H52N9O4S的计算值:766.3863,发现值:766.3860.
P27的制备：6-{3-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基}-3-[1-({3-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基金刚烷-1-基}甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和二甲胺作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H52N9O3S的计算值:762.3914,发现值:762.3912.
P28的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]苯酚
使用薗头一般程序从10.0g 4-碘苯酚(45.45mmol)和4.91g(1.3当量)N,N-二甲基丙-2-炔-1-胺开始，获得3.29g(41％)的所期望产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.83(brs,1H),7.25(d,2H),6.74(d,2H),3.44(s,2H),2.26(s,6H)；LC/MS(C11H14NO)176[M+H]+.
步骤B：甲基2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-[3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基丙基]噻唑-4-甲酸酯
向在DMF(973mL)中的步骤C制备1a的产物(77.0g，243.7mmol)、咪唑(33.14g，2当量)和DMAP(1.49g，0.05当量)中逐滴添加叔丁基(氯代)二苯基硅烷(93.5mL，1.5当量)，并在室温将该反应混合物搅拌16h。除去挥发物后，通过柱色谱法(硅胶，使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供13.56g(99％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 11.63(s,1H),7.60(d,4H),7.45(t,2H),7.42(t,4H),3.74(s,3H),3.67(t,2H),3.20(t,2H),1.87(qn,2H),1.47(s,9H),0.99(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 162.8,156.0,142.6,135.6,135.5,133.5,130.3,128.3,81.8,62.9,51.9,34.0,28.3,27.1,23.2,19.2；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C29H39N2O5SSi的计算值:555.2349,发现值:555.2336.
步骤C：甲基2-[叔丁氧基羰基-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基]氨基]-5-[3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用烷基化一般程序，从34.95g(63mmol)步骤B的产物和25.0g(1.2当量)3,6-二氯-4-(3-碘丙基)-5-甲基-哒嗪作为合适的碘化合物开始，获得51.0g(定量产率)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.63-7.37(m,10H),4.09(t,2H),3.75(s,3H),3.67(t,2H),3.20(t,2H),2.82(m,2H),2.40(s,3H),1.87(m,2H),1.87(m,2H),1.50(s,9H),0.97(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 62.9,52.0,46.1,33.9,28.1,27.5,27.1,25.9,23.8,16.4；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C37H47Cl2N4O5SSi的计算值:757.2413,发现值:757.2395.
步骤D：甲基5-[3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基丙基]-2-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用HFIP脱保护通用程序，从51.70g来自步骤C的产物(68mmol)开始，获得36.32g(81％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.71(t,1H),7.63-7.37(m,10H),3.69(s,3H),3.67(t,2H),3.30(m,2H),3.10(t,2H),2.85(m,2H),2.83(s,3H),1.79(m,2H),1.78(m,2H),0.98(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm62.9,51.7,44.1,34.2,28.0,27.1,27.0,23.4,16.4；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C32H39Cl2N4O3SSi的计算值:657.1889,发现值:657.1875.
步骤E：甲基5-[3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基丙基]-2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)噻唑-4-甲酸酯
在90℃将36.0g(54.7mmol)的来自步骤D的产物和35.7g(2当量)的Cs2CO3在1,4-二噁烷(383mL)中的混合物搅拌18h。用水稀释后，滤出沉淀的固体，用乙醚清洗，干燥以得到34.0g(99％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm7.61(d,4H),7.43(t,2H),7.42(t,4H),4.26(t,2H),3.77(s,3H),3.70(t,2H),3.23(t,2H),2.90(t,2H),2.33(s,3H),2.04(qn,2H),1.90(qn,2H),1.00(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 163.1,155.3,151.8,151.4,143.2,136.2,135.5,134.7,133.6,130.3,129.0,128.3,63.1,51.9,46.3,34.1,27.1,24.2,23.1,19.8,19.2,15.7；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C32H38ClN4O3SSi的计算值:621.2122,发现值:621.2097.
步骤F：甲基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-(3-羟基丙基)噻唑-4-甲酸酯
在室温将23.36g(37.6mmol)的来自步骤E的产物和45mL(1.2当量)的在THF中的1MTBAF溶液(5mL/mmol)的混合物搅拌2h。除去挥发物后，通过柱色谱法(硅胶，使用EtOAc和MeOH/NH3作为洗脱剂)纯化提供12.88g(89％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm4.54(br.,1H),4.25(m,2H),3.80(s,3H),3.45(t,2H),3.11(m,2H),2.88(t,2H),2.31(s,3H),2.04(m,2H),1.77(m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 163.1,155.2,151.2,143.8,136.1,134.5,129.0,60.5,52.0,46.3,34.6,24.2,23.2,19.7,15.7；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C16H20ClN4O3S的计算值:383.0945,发现值:383.0937.
步骤G：甲基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用光信一般程序I，从0.65g(1.2当量)步骤F的产物和250mg(1.43mmol)4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]苯酚的THF溶液(9mL/mmol)开始，得到0.28g(37％)所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.34(d,2H),6.91(d,2H),4.26(t,2H),4.03(t,2H),3.78(s,3H),3.40(s,2H),3.25(t,2H),2.88(t,2H),2.31(s,3H),2.22(s,6H),2.08(qn,2H),2.03(qn,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 163.1,158.9,155.3,151.7,151.3,142.7,136.2,134.9,133.3,129.0,115.2,115.0,85.2,84.1,67.1,52.0,48.3,46.3,44.3,30.8,24.1,23.1,19.7,15.7；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C27H31ClN5O3S的计算值:540.1836,发现值:540.1834.
步骤H：甲基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序I从0.27g来自步骤G的产物开始(0.5mmol)，获得0.29g(89％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.83(dm,1H),7.50(dm,1H),7.36(m,1H),7.35(m,2H),7.18(m,1H),6.94(m,2H),4.28(m,2H),4.09(t,2H),3.80(s,3H),3.39(s,2H),3.29(t,2H),2.88(t,2H),2.35(s,3H),2.23(s,6H),2.13(m,2H),2.07(m,2H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C34H36N7O3S2的计算值:654.2321,发现值:654.2322.
步骤I：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
向来自步骤H的产物(280mg，0.43mmol)在1:1THF和水(10mL/mmol)的混合物中添加90mg(5当量)的LiOHxH2O，并在50℃将该反应混合物搅拌18h。除去挥发物后，通过反相制备色谱法(C18，0.1％ TFA水溶液和MeCN作为洗脱剂)纯化提供132mg(48％)的期望的化合物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C33H34N7O3S2的计算值:640.2165,发现值:640.2160.
P29的制备：6-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-3-[1-[[3-[2-(3-甲氧基丙基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序II从制备14_01和3-甲氧基丙-1-胺作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H54N9O4S的计算值:780.4019,发现值:780.4019.
制备P30：6-[{6-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-5-甲基哒嗪-3-基}(甲基)氨基]-3-[1-({3-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基金刚烷-1-基}甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序II从制备14_01和二甲胺作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C40H50N9O3S的计算值:736.3757,发现值:736.3751.
P31的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-哌嗪-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和哌嗪作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H55N10O3S的计算值:803.4179,发现值:803.4177.
P32的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-(4-异丙基哌嗪-1-基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和1-异丙基哌嗪作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C47H61N10O3S的计算值:845.4649,发现值:845.4646.
P33的制备：3-[1-[[3-[2-(氮杂环庚烷-1-基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和氮杂环庚烷作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C46H58N9O3S的计算值:816.4383,发现值:816.4379.
P34的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[(3S)-3,4-二羟基丁基]-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基4-甲基苯磺酸酯
在0℃向在34mL的DCM中的1.0g(6.8mmol)的2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙醇和3.8mL(4当量)的三乙基胺中添加4.5g(2当量)的p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯。搅拌反应混合物直至观察不到进一步的转化，浓缩并用二异丙醚处理。然后，滤出沉淀的盐酸盐，浓缩母液并通过快速色谱法(硅胶，使用庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化，得到1.6g(81％)所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm7.79(dm,2H),7.49(dm,2H),4.08(m,2H),4.00(m,1H),3.91/3.44(dd+dd,2H),2.42(s,3H),1.83/1.77(m+m,2H),1.24/1.20(s+s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 132.7,132.7,130.7,128.1,108.6,72.3,68.7,68.4,32.9,27.2/25.9,21.6；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C14H21O5S的计算值:301.1110,发现值:301.1107.
步骤B：N-[2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基]丙-2-炔-1-胺
在50℃将来自步骤A的产物(7.6g，25.3mmol)、丙-2-炔-1-胺(16mL，10当量)和DIPEA(13.22mL，3当量)在127mL的MeCN中的混合物搅拌16h。浓缩后，在DCM中吸收并用浓NaHCO3溶液和盐水萃取，将合并的有机层干燥并浓缩，得到5.0g(107％)所期望产物，其不经任何进一步纯化即使用。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 4.07(m,1H),3.98/3.43(dd+t,2H),3.28(m,2H),3.05(t,1H),2.62/2.55(m+m,2H),2.23(brs,1H),1.63/1.59(m+m,2H),1.30(s,3H),1.25(s,3H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 108.2,83.4,74.6,74.1,69.2,45.1,37.8,33.6,27.3,26.2；HRMS(EI)(m/z):[M]+针对C10H17NO2的计算值:183.1259,发现值:183.1260.
步骤C：N-[2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基]-N-甲基-丙-2-炔-1-胺
在0℃向在N,N-二甲基甲酰胺(14mL)中的来自步骤B的产物(500mg，2.73mmol)中分批添加氢化钠(120mg，1.1当量)。在0℃搅拌0.5h后，将该混合物用碘甲烷(0.17mL，1当量)处理并在室温搅拌18h。在用饱和溶液NH4Cl和水淬灭后，将该混合物用Et2O萃取。将合并的有机相干燥并浓缩得到所期望产物(362mg，67％)。GC/MS(C11H19NO2)197[M+].
步骤D：乙基2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-5-[3-[4-[3-[2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用薗头一般程序从0.548g(0.89mmol)制备15的产物和350mg(2当量)来自步骤C的产物作为加入适当的乙炔，得到510mg(82％)所期望产物。LC/MS(C34H42ClFN5O5S)686[M+H]+.
步骤E：乙基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序I从510mg(0.52mmol)步骤D的产物和234mg(3当量)1,3-苯并噻唑-2-胺，得到200mg(48％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.88(dm,1H),7.49(brd,1H),7.37(m,1H),7.3(dd,1H),7.20(dm,1H),7.19(m,1H),7.16(t,1H),4.26(m,2H),4.25(q,2H),4.14(t,2H),4.04(m,1H),3.98/3.45(dd+dd,2H),3.46(s,2H),3.28(m,2H),2.87(t,2H),2.45/2.39(m+m,2H),2.34(s,3H),2.21(s,3H),2.13(m,2H),2.04(m,2H),1.63(m,2H),1.29(t,3H),1.29(s,3H),1.24(s,3H)；HRMS(ESI)(m/z):[M+H]+针对C41H47FN7O5S2的计算值:800.3064,发现值:800.3064.
步骤F：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[(3S)-3,4-二羟基丁基]-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
在60℃将200mg(0.25mmol)的来自步骤E的产物和53mg的LiOHxH2O(5当量)在5mL的THF/水(1:1)中的混合物搅拌18h。在0℃(pH＝2-3)将该反应混合物用0.125mL(6当量)的浓缩氯化氢处理并在室温搅拌，然后在60℃搅拌0.5h。在将该反应混合物浓缩以除去THF并冻干后，将固体溶解于在MeOH中的6N NH3溶液中并通过反相色谱法(使用5mM NH4HCO3和MeCN作为洗脱剂)纯化，以得到47mg(25％)期望的产物。HRMS(ESI)(m/z):[M+H]+针对C36H39FN7O5S2的计算值:732.2438,发现值:732.2441.
制备P35：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[2-羟基乙基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和2-(甲基氨基)乙醇作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H54N9O4S的计算值:792.4019,发现值:792.4019.
制备P36：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[3-甲氧基丙基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和3-甲氧基-N-甲基-丙-1-胺作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H58N9O4S的计算值:820.4332,发现值:820.4328.
制备P37：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[4-羟基丁基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和4-(甲基氨基)丁-1-醇作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H58N9O4S的计算值:820.4332,发现值:820.4339.
P38的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(1-哌啶基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和哌啶作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H56N9O3S的计算值:802.4227,发现值:802.4223.
P39的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吗啉代乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备12和吗啉作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H54N9O4S的计算值:804.4019,发现值:804.4012.
P40的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-(3-羟基丙基氨基)丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和3-氨基丙-1-醇作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H56N9O3S的计算值:790.4227,发现值:790.4220.
P41的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(3-吡咯烷-1-基丙基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和吡咯烷作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H56N9O2S的计算值:786.4278,发现值:786.4273.
制备P42：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(5-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
步骤A：甲基3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(5-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸酯
使用Buchwald一般程序I在130℃ 1.5h，从制备12步骤C的产物的140mg(0.22mmol)和54.3mg(1.5当量)的5-甲基-1,3-苯并噻唑-2-胺开始，获得126mg(75％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 12.08/10.89(brs/brs,1H),7.95(d,1H),7.69(d,1H),7.67(br,1H),7.38(s,1H),7.30(br,1H),7.00(d,1H),4.46(brs,1H),4.00(t,2H),3.88(s,2H),3.70(s,3H),3.41(t,2H),3.35(t,2H),2.85(t,2H),2.39(s,3H),2.32(s,3H),2.16(s,3H),1.98(qn,2H),1.39(s,2H),1.30/1.25(d+d,4H),1.18/1.12(d+d,4H),1.08/1.02(d+d,2H),0.87(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 139.8,137.5,123.6,121.6,119.0,62.1,61.5,59.0,52.7,50.1,47.0,46.0,45.4,43.3,30.2,24.3,21.7,21.6,12.6,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H51N8O4S的计算值:763.3760,发现值:763.3754.
步骤B：甲基3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(5-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸酯
向在DCM(2mL)中的来自步骤A的产物(119mg，0.16mmol)和三乙基胺(0.066mL，3当量)中添加p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯(76mg，1.5当量)并将该反应混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(93mg，65％)。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 12.17/10.83(brs/brs,1H),7.95(d,1H),7.77(d,2H),7.7(d,1H),7.69(br,1H),7.46(d,2H),7.42(br,1H),7.39(s,1H),7.00(d,1H),4.07(t,2H),4(t,2H),3.96(s,3H),3.85(s,2H),3.49(t,2H),2.85(t,2H),2.40(s,3H),2.39(s,3H),2.32(s,3H),2.15(s,3H),1.99(qn,2H),1.29(s,2H),1.17/1.1(d+d,4H),1.12/1.1(d+d,4H),1.02/0.97(d+d,2H),0.84(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm139.8,137.6,130.6,128.1,123.6,119.0,71.5,58.8,58.4,52.7,49.9,46.6,45.9,45.4,43.0,30.1,24.3,21.6,21.6,21.6,12.6,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C49H57N8O6S2的计算值:917.3842,发现值:917.3840.
步骤C：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(5-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从步骤B的产物和吡咯烷作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H56N9O3S的计算值:802.4227,发现值:802.4220.
P43的制备：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(5-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
步骤A：甲基3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(5-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸酯
使用Buchwald一般程序I在130℃ 2.5h，从制备12步骤C的产物的140mg(0.22mmol)和60mg(1.5当量)的5-甲基-1,3-苯并噻唑-2-胺开始，获得129mg(75％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.95(d,1H),7.69(d,1H),7.67(br.,1H),7.38(s,1H),7.02(br.,1H),6.80(dd,1H),4.46(br.,1H),4.00(t,2H),3.88(s,2H),3.80(s,3H),3.70(s,3H),3.41(t,2H),3.35(t,2H),2.85(t,2H),2.32(s,3H),2.16(s,3H),1.98(m,2H),1.39(s,2H),1.30/1.25(d+d,4H),1.18/1.12(d+d,4H),1.08/1(d+d,2H),0.87(s,6H)；13CNMR(500MHz,dmso-d6)δppm 139.8,137.5,122.6,119.0,110.5,62.1,61.5,58.9,55.8,52.6,50.1,47.0,46.0,45.4,43.3,30.2,24.3,21.7,12.6,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H51N8O5S的计算值:779.3703,发现值:779.3687.
步骤B：甲基3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(5-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸酯
向在DCM(2mL)中的来自步骤A的产物(122mg，0.16mmol)和三乙基胺(0.066mL，3当量)中添加p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯(77mg，1.5当量)并将该反应混合物搅拌1h。通过柱色谱法(硅胶，DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(79mg，54％)。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 12.17/10.83(brs/brs,1H),7.95(d,1H),7.77(d,2H),7.72(d,1H),7.67(brd,1H),7.46(d,2H),7.39(s,1H),7.02(br,1H),6.80(d,1H),4.07(t,2H),4.00(t,2H),3.86(s,2H),3.80(s,3H),3.69(s,3H),3.49(t,2H),2.86(t,2H),2.41(s,3H),2.33(s,3H),2.15(s,3H),1.99(qn,2H),1.29(s,2H),1.17/1.1(d+d,4H),1.12/1.10(d+d,4H),1.02/0.97(d+d,2H),0.84(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 139.9,137.6,130.6,128.1,119.0,110.6,71.5,58.8,58.4,55.9,52.6,49.9,46.6,45.9,45.8,43.0,30.1,24.3,21.6,21.6,12.7,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C49H57N8O7S2的计算值:933.3792,发现值:933.3794.
步骤C：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(5-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从步骤B的产物和吡咯烷作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H57N9O4S的计算值:818.4176,发现值:818.4172.
P44的制备：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-(3,4-二羟基丁基)氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序III从350mg制备3h_01(0.57mmol，1当量)和235mg制备4a_01(0.57mmol，1当量)作为合适的卤化物开始，获得490mg(87％)所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.84(d,1H),7.68(s,1H),7.47(d,1H),7.44(td,1H),7.32(brd.,1H),7.25(td,1H),7.22(d,1H),7.16(t,1H),5.86(s,2H),4.49/4.33(m+m,2H),4.20(br.,2H),4.17(m,1H),4.15(t,2H),4.04/3.63(dd+dd,2H),3.77(s,3H),3.72(t,2H),3.27(t,2H),2.84(br.,3H),2.45(s,3H),2.13(m,2H),1.75(m,2H),1.40(s,9H),1.37/1.24(s+s,6H),0.92(t,2H),-0.11(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm129.1,127.2,123.5,123.2,119.3,117.5,115.5,112.0,108.6,73.7,72.8,68.9,68.4,66.7,51.9,44.4,38.5,33.8,30.9,28.5,27.3/26.0,23.3,23.1,17.9,17.8,-1.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C48H63FN7O8S2Si的计算值:976.3927,发现值976.3916.
步骤B：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-(3,4-二羟基丁基)氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用脱保护和水解一般程序从来自步骤A的产物作为合适的甲酯开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C33H35FN7O5S2的计算值:692.2120,发现值692.2114.
P45的制备：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-(3-羟基丙基)氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：甲基5-[3-[4-[3-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙基-[5-甲基-6-[(Z)-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基]哒嗪-3-基]氨基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序III从300mg制备3n_01(0.46mmol，1当量)和187mg制备4a_01(0.46mmol，1当量)作为合适的卤化物开始，获得395mg(83％)所期望产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 7.82(dd,1H),7.60(s,1H),7.44(m,1H),7.44(dd,1H),7.31(dd,1H),7.24(m,1H),7.20(m,1H),7.15(t,1H),5.84(s,2H),4.39(t,2H),4.20(s,2H),4.14(t,2H),3.76(s,3H),3.70(t,2H),3.70(t,2H),3.25(t,2H),2.84(s,3H),2.42(s,3H),2.11(m,2H),1.91(m,2H),1.40(s,9H),0.91(t,2H),0.85(s,9H),0.01(s,6H),-0.12(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm 162.2,147.5,137.6,129.1,127.2,123.4,123.2,119.3,117.5,115.4,112.0,79.7,72.8,68.4,66.7,60.5,51.9,44.6,38.1,33.8,30.9,30.4,28.6,26.3,23.1,17.9,17.8,-0.9,-5.0；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C50H71FN7O7S2Si2的计算值:1020.4373,发现值1020.4365.
步骤B：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-(3-羟基丙基)氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用脱保护和水解一般程序从来自步骤A的产物作为合适的甲酯开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C32H33FN7O4S2的计算值:662.2014,发现值662.2016.
P46的制备：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-(4,5-二羟基戊基)氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用脱保护和水解一般程序从来自制备5a_01步骤A的产物作为合适的甲酯开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C34H37FN7O5S2的计算值:706.2276,发现值706.2274.
制备P47：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-(羧基甲基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备16和甲基2-氨基乙酸酯、氯化氢(1:1)作为合适的胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H50N9O5S的计算值:792.3656,发现值:792.3651.
制备P48：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[羧基甲基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备16和甲基2-(甲基氨基)乙酸酯、氯化氢(1:1)作为合适的胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H52N9O5S的计算值:806.3812,发现值:806.3807.
制备P49：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-[2-羟基乙基(甲基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和2-(甲基氨基)乙醇作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H56N9O3S的计算值:790.4227,发现值:790.4227.
制备P50：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-[3-甲氧基丙基(甲基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和3-甲氧基-N-甲基-丙-1-胺作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C46H60N9O3S的计算值:818.4540,发现值:818.4537.
制备P51：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-(3-甲氧基丙基氨基)丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和3-甲氧基丙-1-胺作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H58N9O3S的计算值:804.4383,发现值:804.4380.
制备P52：3-[1-[[3-[3-(氮杂环庚烷-1-基)丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和氮杂环庚烷作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C47H60N9O2S的计算值:814.4591,发现值:814.4588.
制备P53：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-(羧基甲基氨基)丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备13和甲基2-氨基乙酸酯、氯化氢(1:1)作为合适的胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H52N9O4S的计算值:790.3863,发现值:790.3855.
制备P54：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-(2-羧基乙基氨基)丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备13和3-氨基丙酸甲酯作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H54N9O4S的计算值:804.4019,发现值:804.4015.
制备P55：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-[羧基甲基(甲基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备13和甲基2-(甲基氨基)乙酸酯、氯化氢(1:1)作为合适的胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H54N9O4S的计算值:804.4019,发现值:804.4014.
P56的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-[2-羧基乙基(甲基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备13和乙基3-(甲基氨基)丙酸酯、氯化氢(1:1)作为合适的胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H56N9O4S的计算值:818.4176,发现值:818.4167.
制备P57：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[3-羧基丙基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备16和甲基4-(甲基氨基)丁酸酯、氯化氢(1:1)作为合适的胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H56N9O5S的计算值:834.4125,发现值:834.4115.
制备P58：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-[3-羧基丙基(甲基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备13和甲基4-(甲基氨基)丁酸酯、氯化氢(1:1)作为合适的胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C46H58N9O4S的计算值:832.4332,发现值:832.4324.
制备P59：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(3-羟基丙基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤A：3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-N-丙-2-炔基-丙-1-胺
在50℃将0.70mL(3.0mmol)的3-溴丙氧基-叔丁基-二甲基-硅烷、1.9mL(10当量)的炔丙胺和1.6mL(3当量)的DIPEA在乙腈(15mL)中的混合物搅拌直到观察不到进一步的转化。将反应混合物浓缩，用DCM稀释，并用饱和NaHCO3和盐水萃取。将合并的有机层干燥并浓缩以定量产率得到所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 3.62(t,2H),3.27(d,2H),3.02(t,1H),2.59(t,2H),2.19(brs,1H),1.57(m,2H),0.86(s,9H),0.02(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 73.9,61.5,45.2,37.9,32.7,26.3,-4.8；HRMS(EI)(m/z):[M-CH3]+针对C11H22NOSi的计算值:212.1471,发现值:212.1467.
步骤B：乙基5-[3-[4-[3-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙基氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)噻唑-4-甲酸酯
使用薗头一般程序从1.0g(1.64mmol)制备15的产物和737mg(2当量)来自步骤A的产物作为加入适当的乙炔，得到1.16g(96％)所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm45.2(t,2H),7.24(dd,1H),7.17(dd,1H),7.14(t,1H),4.27(br.,2H),4.25(q,2H),4.12(t,2H),3.65(t,2H),3.6(s,2H),3.25(t,2H),2.89(t,2H),2.32(s,3H),2.11(m,2H),2.04(m,2H),1.63(m,2H),1.28(t,3H),0.84(s,9H),0.02(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm128.8,119.1,115.4,68.3,61.3,60.7,46.3,45.2,38.4,32.4,30.8,26.3,24.2,23.1,19.7,15.7,14.6,-4.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C35H48ClFN5O4SSi的计算值:716.2869,发现值:716.2868.
步骤C：乙基2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙基氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用Buchwald一般程序I从1.16g(1.57mmol)步骤B的产物和730mg(2当量)1,3-苯并噻唑-2-胺，得到598mg(45％)的所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.87(d,1H),7.49(d,1H),7.37(td,1H),7.25(dd,1H),7.19(t,1H),7.17(t,1H),7.17(m,1H),4.26(br.,2H),4.25(q,2H),4.14(t,2H),3.63(t,2H),3.57(s,2H),3.27(t,2H),2.87(t,2H),2.69(t,2H),2.34(s,3H),2.13(m,2H),2.04(m,2H),1.61(m,2H),1.28(t,3H),0.84(s,9H),0.02(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 128.9,126.5,122.5,122.3,119.1,116.3,115.5,68.4,61.3,60.6,46.3,45.2,38.4,32.4,31.1,26.3,23.9,23.2,20.3,14.6,12.9,-4.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H53FN7O4S2Si的计算值:830.3354,发现值:830.3347.
步骤D：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟-4-[3-(3-羟基丙基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
在60℃将590mg(0.71mmol)的来自步骤C的产物和298mg的LiOHxH2O(10当量)在7mL的THF/水(1:1)中的混合物进行搅拌，直到观察不到进一步的转化。在0℃(pH＝2-3)下用0.71mL(12当量)浓氯化氢处理反应混合物并搅拌直至观察不到进一步的转化。在将反应混合物浓缩以除去THF并冻干后，将固体溶解在6N NH3的MeOH溶液中并通过反相色谱纯化(使用25mM NH4HCO3和MeCN作为洗脱剂)，得到100mg(21％)的所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C34H35FN7O4S2的计算值:688.2176,发现值:688.2179.
制备P60：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[[(3S)-3,4-二羟基丁基]氨基]乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
向在乙腈(30ml/mmol)中的来自制备18的产物(0.066mmol)中添加2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙胺、氯化氢(1:1)(3当量)并在60℃将该反应混合物搅拌48h。在添加KOH溶液(5当量)后，在60℃将该反应混合物搅拌1h。在添加HCl溶液(10当量)后，在60℃将该反应混合物搅拌1h。将产物通过制备型HPLC色谱法(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H52N9O5S的计算值:794.3812,发现值:794.3807.
制备P61：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[5-甲基-1-[[3-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备18和吡咯烷作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C42H50N9O3S的计算值:760.3757,发现值:760.3753.
P62的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[3-羟基丙基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备16和3-(甲基氨基)丙-1-醇作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+2H]2+针对C44H56N9O4S的计算值:403.7127,发现值:403.7126.
制备P63：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(5-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
步骤A：(4-甲氧基苯基)甲基6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在2mL的二氯甲烷中的260mg(0.35mmol)的制备16步骤C的产物中添加0.5mL(10当量)的N,N-二乙基乙胺和457mg(4当量)的p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯，然后将该混合物搅拌0.5h。将该产物通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化以得到259mg(85％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.85(d,1H),7.76(d,2H),7.71(d,1H),7.45(d,2H),7.40(s,1H),7.16(d,2H),6.89(d,2H),5.09(s,2H),4.05(t,2H),3.96(t,2H),3.81(s,2H),3.74(s,3H),3.46(t,2H),2.87(t,2H),2.40(s,3H),2.29(s,3H),2.08(s,3H),1.98(qn,2H),1.29(s,2H),1.13/1.11(d+d,4H),1.11/1.06(d+d,4H),0.98/0.90(d+d,2H),0.81(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 140.1,137.7,130.6,130.2,128.2,120.5,114.3,71.4,66.8,58.9,58.4,55.6,49.8,46.5,46.0,45.8,42.9,30.0,24.6,21.6,21.0,15.5,10.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C48H56ClN6O7S的计算值:895.3620,发现值:895.3619.
步骤B：(4-甲氧基苯基)甲基6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在3mL乙腈中的259mg(0.29mmol)的来自步骤A的产物中添加吡咯烷(3当量)，并在55℃将该反应混合物搅拌18h。将产物通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到221mg(98％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.85(d,1H),7.70(d,1H),7.40(s,1H),7.18(m,2H),6.91(m,2H),5.10(s,2H),3.96(m,2H),3.86(s,2H),3.75(s,3H),3.60-2.90(brs,6H),3.59(brt,2H),2.87(t,2H),2.29(s,3H),2.11(s,3H),2.10-1.70(brs,4H),1.98(m,2H),1.48-0.94(m,12H),0.86(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 140.1,137.7,130.2,120.5,114.3,66.8,58.9,56.9,55.6,46.0,30.0,24.6,21.0,15.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H57ClN7O4的计算值:794.4161,发现值:794.4160.
步骤C：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(5-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
将0.22g(0.28mmol)的来自步骤B的产物、93.5mg(2当量)的5-氟代-1,3-苯并噻唑-2-胺、25mg(0.1当量)的Pd2(dba)3、32mg(0.2当量)的XantPhos和0.14mL(3当量)的DIPEA在2mL的丁-2-醇中的混合物保持在100℃在微波反应器1h。将该产物通过柱色谱法(使用DCM/MeOH作为洗脱剂)纯化以得到偶联产物，在50℃将偶联产物用在2mL的乙腈中的3当量的KOH处理18h。将该水解产物通过制备型HPLC色谱法(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H53FN9O3S的计算值:806.3976,发现值:806.3971.
制备P64：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
步骤A：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸酯
将250mg(0.34mmol)的制备16步骤C、112mg(2当量)的6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-胺、31mg(0.1当量)的Pd2(dba)3、39mg(0.2当量)的XantPhos和0.17mL(3当量)的DIPEA在2.5mL的环己醇中的混合物在130℃保持2h。将该产物通过柱色谱法(使用DCM/MeOH作为洗脱剂)纯化以得到206mg(71％)的期望的产物。1HNMR(300MHz,dmso-d6)δppm 7.93(d,1H),7.69(d,1H),7.62(brs,1H),7.45(brs,1H),7.39(s,1H),7.19(m,2H),7.16(brd,1H),6.91(m,2H),5.10(s,2H),4.45(brs,1H),3.99(m,2H),3.85(s,2H),3.75(s,3H),3.40(t,2H),3.34(t,2H),2.85(t,2H),2.37(s,3H),2.31(s,3H),2.11(s,3H),1.98(m,2H),1.43-0.9(m,12H),0.84(s,6H)；13C NMR(300MHz,dmso-d6)δppm 140.0,137.6,130.2,127.5,121.7,118.9,114.3,66.7,62.1,61.5,59.0,55.6,45.4,30.1,24.2,21.7,21.4,12.6,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C49H57N8O5S的计算值:869.4173,发现值:869.4167.
步骤B：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸酯
向在2mL的二氯甲烷中的203mg(0.23mmol)的来自步骤A的产物中添加0.16mL(5当量)的N,N-二乙基乙胺和150mg(2当量)的p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯，然后将该混合物搅拌18h。将该产物通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化以得到84mg(38％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm10.74(br.,1H),7.94(d,1H),7.76(dm,2H),7.69(d,1H),7.61(br.,1H),7.45(dm,2H),7.44(br.,1H),7.40(s,1H),7.18(dm,2H),7.17(brd.,1H),6.90(dm,2H),5.09(s,2H),4.05(t,2H),3.99(t,2H),3.82(s,2H),3.74(s,3H),3.47(t,2H),2.84(t,2H),2.40(s,3H),2.37(brs.,3H),2.31(s,3H),2.10(s,3H),1.98(m,2H),1.35-0.87(m,12H),0.81(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 140.0,137.7,130.6,130.1,128.1,127.5,121.8,118.9,114.3,71.5,66.7,58.9,58.4,55.6,45.4,30.0,24.3,21.6,21.6,21.4,12.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C56H63N8O7S2的计算值:1023.4261,发现值:1023.4265.
步骤C：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
向在1mL乙腈中的84mg(0.082mmol)的来自步骤B的产物中添加吡咯烷(3当量)并在55℃将该反应混合物搅拌18h。用5当量的KOH处理后，在55℃将该混合物搅拌1h并将产物通过制备型HPLC色谱法(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H56N9O3S的计算值:802.4227,发现值:802.4227.
制备P65：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(6-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
步骤A：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-[(6-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
将250mg(0.34mmol)的步骤C制备16、114mg(2当量)的6-氟代-1,3-苯并噻唑-2-胺、31mg(0.1当量)的Pd2(dba)3、39mg(0.2当量)的XantPhos和0.17mL(3当量)的DIPEA在2.5mL的环己醇中的混合物在130℃保持2h。将该产物通过柱色谱法(使用DCM/MeOH作为洗脱剂)纯化以得到158mg(55％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 10.87(brs,1H),7.94(d,1H),7.77(brd,1H),7.69(d,1H),7.57(brs,1H),7.39(s,1H),7.20(m,1H),7.19(m,2H),6.91(m,2H),5.10(s,2H),4.45(brs,1H),3.99(m,2H),3.85(s,2H),3.75(s,3H),3.40(t,2H),3.34(t,2H),2.85(t,2H),2.31(s,3H),2.11(s,3H),1.98(m,2H),1.43-0.91(m,12H),0.84(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 140.0,137.7,130.2,118.9,114.3,114.0,108.4,66.7,62.1,61.5,59.0,55.6,45.4,30.1,24.3,21.6,12.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C48H54FN8O5S的计算值:873.3922,发现值:873.3917.
步骤B：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(6-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸酯
向在2mL的二氯甲烷中的158mg(0.23mmol)的来自步骤A的产物中添加0.125mL(5当量)的N,N-二乙基乙胺和117mg(2当量)的p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯，然后将该混合物搅拌18h。将该产物通过柱色谱法(硅胶，使用DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化以得到71mg(41％)的期望的产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 10.88(brs,1H),7.94(d,1H),7.77(br.,1H),7.76(dm,2H),7.69(d,1H),7.59(br.,1H),7.45(dm,2H),7.40(s,1H),7.21(t,1H),7.17(dm,2H),6.90(dm,2H),5.09(s,2H),4.05(t,2H),4.00(m,2H),3.82(s,2H),3.74(s,3H),3.47(t,2H),2.85(t,2H),2.40(s,3H),2.32(s,3H),2.10(s,3H),1.98(m,2H),1.35-0.87(m,12H),0.81(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 140.0,137.7,130.6,130.1,128.1,118.9,114.3,114.0,108.4,71.5,66.7,58.9,58.4,55.6,45.4,30.0,24.3,21.6,21.6,12.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C55H60FN8O7S2的计算值:1027.4010,发现值:1027.4003.
步骤C：3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(6-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸
向在1mL乙腈中的71mg(0.069mmol)的来自步骤B的产物中添加吡咯烷(3当量)并在55℃将该反应混合物搅拌18h。用5当量的KOH处理后，在55℃将该混合物搅拌1h并将产物通过制备型HPLC色谱法(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H53FN9O3S的计算值:806.3976,发现值:806.3969.
制备P66：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-(二甲基氨基)丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和N-甲基甲胺作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H54N9O2S的计算值:760.4121,发现值:760.4114.
制备P67：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[5-甲基-1-[[3-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备18和1-甲基哌嗪作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H53N10O3S的计算值:789.4022,发现值:789.4014.
制备P68：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-[3-羟基丙基(甲基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和3-(甲基氨基)丙-1-醇作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H58N9O3S的计算值:804.4383,发现值:804.4375.
制备P69：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-[[(3S)-3,4-二羟基丁基]氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
向在2mL乙腈中的来自制备13的产物(0.074mmol)中添加2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙胺、氯化氢(1:1)(4当量)并在60℃将该反应混合物搅拌18h。在添加KOH溶液(5当量)后，在60℃将该反应混合物搅拌0.5h。在添加HCl溶液(10当量)后，在60℃将该反应混合物搅拌1h。将产物通过制备HPLC色谱法(使用乙腈和5mM NH4HCO3水性溶液作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H58N9O4S的计算值:820.4332,发现值:820.4323.
制备P70：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[2-羧基乙基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备16和乙基3-(甲基氨基)丙酸酯、氯化氢(1:1)作为合适的胺开始，得到所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H54N9O5S的计算值:820.3968,发现值:820.3962.
制备P71：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-(2-羧基乙基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序III从制备16和3-氨基丙酸甲酯作为合适的胺开始，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C43H52N9O5S的计算值:806.3812,发现值:806.3793.
制备P72：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[3-(4-羟基丁基氨基)丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用胺取代和水解一般程序I从制备13和4-氨基丁-1-醇作为合适的胺开始，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C45H58N9O3S的计算值:804.4383,发现值:804.4383.
P73的制备：[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-2-吡啶基]甲醇
步骤A：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用胺取代和水解一般程序I没有水解步骤，从制备16和吡咯烷作为合适的胺开始，获得190mg的所期望产物。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.95(d,1H),7.81(d,1H),7.68(d,1H),7.50(brd.,1H),7.39(s,1H),7.35(t,1H),7.19(dm,2H),7.16(t,1H),6.91(dm,2H),5.10(s,2H),3.99(t,2H),3.85(s,2H),3.74(s,3H),3.41(t,2H),2.85(t,2H),2.46(t,2H),2.41(br.,4H),2.32(s,3H),2.11(s,3H),1.98(m,2H),1.62(m,4H),1.40(s,2H),1.28/1.22(d+d,4H),1.19/1.13(d+d,4H),1.03/0.94(d+d,2H),0.84(s,6H)；13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 140.0,137.7,130.2,126.4,122.4,122.1,118.9,114.3,66.7,59.5,59.0,56.6,55.6,54.5,50.0,46.9,46.0,45.4,43.2,30.1,24.3,23.6,21.7,12.6,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C52H62N9O4S的计算值:908.4645,发现值:908.4633.
步骤B：[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-2-吡啶基]甲醇
向在4.2mL的四氢呋喃中的190mg(0.21mmol)的来自步骤A的产物中添加24mg(3当量)的LiAlH4，并将该混合物搅拌40min。在用在MeOH中的0.1％ TFA淬灭并过滤后，将该产物通过制备型HPLC(MeCN和0.1％ TFA溶液作为洗脱剂)纯化以得到110mg(67％)的期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H56N9O2S的计算值:774.4277,发现值:774.4269.
P74的制备：[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-吡咯烷-1-基-甲酮
在0℃向在0.5mL的DMF中的50mg(0.063mmol)的P21、9.37mg(2.1当量)的吡咯烷和0.032mL(3当量)的DIPEA中添加36mg(1.5当量)的HATU，然后在室温将该混合物搅拌18h。将反应混合物倒入水中后，过滤出沉淀的固体，用水洗涤并干燥。通过柱色谱法(氨基柱，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化产物，得到29mg(65％)的所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C48H61N10O2S的计算值:841.4699,发现值:841.4698.
制备P75：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-N-异丙基-吡啶-2-甲酰胺
在0℃向在0.5mL的DMF中的50mg(0.063mmol)的P21、9.37mg(2当量)的丙-2-胺和0.032mL(3当量)的DIPEA中添加36mg(1.5当量)的HATU，然后在室温将该混合物搅拌18h。将反应混合物倒入水中后，过滤出沉淀的固体，用水洗涤并干燥。通过柱色谱法(氨基柱，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化产物，得到34mg(76％)的所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C47H61N10O2S的计算值:829.4699,发现值:829.4694.
制备P76：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酰胺
向在0.5mL的二噁烷中的50mg(0.063mmol)的P21和18mg(1.3当量)的叔丁氧基羰基叔丁基碳酸酯中添加0.006mL的吡啶，然后将该混合物搅拌10min。在将该混合物用6.5mg(1.3当量)的NH4HCO3处理后，将该反应物搅拌5天。通过柱色谱法(氨基柱，使用DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化产物，得到17mg(47％)的所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C44H55N10O2S的计算值:787.4230,发现值:787.4226.
实施例2.负载前体的合成与表征
为了准备接头/负载，“PMB保护的负载”也称为所考虑负载的前体。
用于以下前体的制备A：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
步骤A：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-(3,6-二氯-5-甲基-哒嗪-4-基)丙基氨基]吡啶-2-甲酸酯
在80℃将来自制备11的产物(9.78g，18.1mmol)、来自制备7的产物(13.6g，1.1当量)、Pd(AtaPhos)2Cl2(801mg，0.1当量)和Cs2CO3(17.7g，3当量)在1,4-二噁烷(109mL)和H2O(18mL)中的混合物搅拌8h。用盐水淬灭冷却反应后，将混合物用EtOAc萃取，并将合并的有机层干燥并浓缩，得到期望的产物(21.9g，119％)，其不经进一步纯化即用于下一步。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.68-7.35(m,10H),7.31(d,1H),7.27(s,1H),7.11(dm,2H),6.98(t,1H),6.83(dm,2H),6.62(d,1H),4.99(s,2H),3.80(s,2H),3.70(s,3H),3.65(t,2H),3.44(t,2H),3.34(q,2H),2.84(m,2H),2.34(s,3H),2.01(s,3H),1.77(m,2H),1.38-0.89(m,12H),0.97(s,9H),0.82(s,6H)；13CNMR(500MHz,dmso-d6)δppm 140.4,137.6,130.1,114.2,110.3,66.3,64.4,61.7,59.0,55.5,40.9,30.1,28.1,27.3,27.1,16.4,10.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C57H69Cl2N6O5Si的计算值:1015.4475发现值:1015.4474.
步骤B：(4-甲氧基苯基)甲基3-[1-[[3-[2-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)吡啶-2-甲酸酯
在110℃将来自步骤A的产物(21.9g，21.6mmol)、Cs2CO3(14g，2当量)、DIPEA(7.5mL，2当量)和Pd(Ataphos)2Cl2(954mg，0.1当量)在1,4-二噁烷(108mL)中的混合物搅拌18h。在用水淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相干燥、浓缩并通过柱色谱法(硅胶，DCM和EtOAc作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(8.4g，40％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm7.84(d,1H),7.67(d,1H),7.65(d,4H),7.44(t,2H),7.41(s,1H),7.40(t,4H),7.15(d,2H),6.87(d,2H),5.07(s,2H),3.96(t,2H),3.83(s,2H),3.71(s,3H),3.66(t,2H),3.45(t,2H),2.86(t,2H),2.29(s,3H),2.08(s,3H),1.97(qn,2H),1.38(s,2H),1.25/1.18(d+d,4H),1.18/1.12(d+d,4H),1.01/0.93(d+d,2H),0.97(s,9H),0.82(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 166.8,159.7,156.3,153.6,150.8,147.7,140.1,137.6,137.3,136.0,135.6,133.8,130.2,130.2,129.1,128.2,127.7,123.0,120.4,115.6,114.3,74.2,66.8,64.4,61.7,59.3,55.6,49.9,46.8,46.0,46.0,43.3,39.7,33.6,30.1,27.1,24.6,21.0,19.3,15.5,10.8；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C57H68ClN6O5Si的计算值:979.4709发现值:979.4710.
步骤C：(4-甲氧基苯基)甲基6-(3-氯-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基)-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
在0℃向在THF(86mL)中的来自步骤B的产物(8.4g，8.6mmol)中添加TBAF在THF中的1M溶液(9.4mL，1.1当量)并在室温将该反应混合物搅拌1.5h。在用NH4Cl饱和溶液淬灭并用EtOAc萃取后，将合并的有机相用盐水清洗、干燥、浓缩并通过柱色谱法(硅胶，DCM和MeOH作为洗脱剂)纯化以得到期望的产物(4.7g，74％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.85(d,1H),7.70(d,1H),7.39(s,1H),7.18(d,2H),6.90(d,2H),5.10(s,2H),4.45(t,1H),3.96(t,2H),3.84(s,2H),3.74(s,3H),3.40(q,2H),3.33(t,2H),2.86(t,2H),2.29(s,3H),2.09(s,3H),1.98(qn,2H),1.39(s,2H),1.27/1.21(d+d,4H),1.18/1.12(d+d,4H),1.03/0.94(d+d,2H),0.84(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm 166.8,159.7,156.3,153.6,150.8,147.8,140.2,137.6,137.3,136.0,130.2,129.1,127.7,123.0,120.4,115.6,114.3,74.0,66.8,62.2,61.5,59.0,55.6,50.0,46.9,46.0,46.0,43.3,39.7,33.5,30.1,24.6,21.0,15.5,10.9；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C41H50ClN6O5的计算值:741.3531发现值:741.3530.
步骤D：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-(2-羟基乙氧基)-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
在130℃将来自步骤C的产物(4.7g，6.3mmol)、1,3-苯并噻唑-2-胺(1.9g，2当量)、Pd2dba3(580mg，0.1当量)、XantPhos(730mg，0.2当量)和DIPEA(3.3mL，3当量)在环己醇(38mL)中的混合物搅拌2h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷、EtOAc和MeCN作为洗脱剂)纯化提供期望的产物(3.83g，71％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.95(d,1H),7.81(brd,1H),7.69(d,1H),7.49(brs,1H),7.39(s,1H),7.35(m,1H),7.19(m,2H),7.16(m,1H),6.91(m,2H),5.10(s,2H),4.46(t,1H),3.99(m,2H),3.85(s,2H),3.75(s,3H),3.40(m,2H),3.34(t,2H),2.85(t,2H),2.32(s,3H),2.11(s,3H),1.99(m,2H),1.45-0.9(m,12H),0.84(s,6H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C48H55N8O5S的计算值:855.4016发现值:855.4011.
步骤E：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-[2-(p-甲苯基磺酰基氧基)乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
向在DCM(45mL)中的来自步骤D的产物(3.83g，4.48mmol)和三乙基胺(1.87mL，3当量)中添加p-甲苯基磺酰基4-甲基苯磺酸酯(2.19g，1.5当量)并将该反应混合物搅拌2h。通过柱色谱法(硅胶，庚烷和EtOAc作为洗脱剂)纯化提供2.5g(55％)期望的产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.95(d,1H),7.81(brs,1H),7.76(m,2H),7.45(brs,1H),7.45(m,2H),7.40(s,1H),7.35(m,1H),7.18(m,2H),7.17(m,1H),6.97(d,1H),6.90(m,2H),5.10(s,2H),4.05(m,2H),4.00(m,2H),3.82(s,2H),3.74(s,3H),3.47(m,2H),2.85(m,2H),2.40(s,3H),2.32(s,3H),2.10(s,3H),1.98(m,2H),1.87-1.34(m,12H),0.81(s,6H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C55H61N8O7S2的计算值:1009.4104发现值:1009.4102.
胺取代程序III
向在1:1混合的乙腈和N-甲基-2-吡咯烷酮(10ml/mmol)中的来自前体制备A的产物中添加适当的胺(3-10当量)并在50℃将该反应混合物搅拌2-24h。将该产物通过制备反相色谱法纯化后，获得期望的产物。
P37的前体：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[4-羟基丁基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用胺取代程序III和4-(甲基氨基)丁-1-醇作为合适的胺，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C53H66N9O5S的计算值:940.4907发现值940.4906.
P36的前体：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[3-甲氧基丙基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用胺取代步骤III和3-甲氧基-N-甲基-丙-1-胺作为合适的胺，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C53H66N9O5S的计算值:940.4907发现值940.4904.
P35的前体：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[2-羟基乙基(甲基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用胺取代程序III和2-(甲基氨基)乙醇作为合适的胺，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C51H62N9O5S的计算值:912.4594发现值912.4592.
P27的前体：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用胺取代程序III和二甲胺作为合适的胺，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C50H60N9O4S的计算值:882.4489发现值882.4490.
P21的前体：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3,5-二甲基-7-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用胺取代程序III和吡咯烷作为合适的胺，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+2H]2+针对C52H62N9O4S的计算值:454.7362发现值454.7365.
P25的前体：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-(3-羟基丙基氨基)乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用胺取代程序III和3-氨基丙-1-醇作为合适的胺，获得了所期望的产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C51H62N9O5S的计算值:912.4591,发现值912.4581.
P19的前体：(4-甲氧基苯基)甲基6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯
使用胺取代程序III和2-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙胺作为合适的胺，获得所期望产物。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+针对C55H68N9O6S的计算值:982.5013,发现值982.5000.
实施例3.接头、接头-负载及其前体的合成和表征
使用本实施例中描述的示例性方法合成示例性接头、接头-负载及其前体。
缩写：
CuI 碘化亚铜(I)
DCC 二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DEA N-乙基乙胺
DIPEA： N,N-二异丙基乙胺
DMF： 二甲基甲酰胺
DMSO： 二甲基亚砜
EDC： N-乙基，N'-二甲基氨基丙基碳二亚胺
EEDQ 2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙酯
Fmoc： 芴基甲基氧基羰基
Fmoc-Cit-OH (2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酸
HBTU： (2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HOAt： 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
MgSO4 硫酸镁
MMAE： (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺(MMAE)
Na2SO4 硫酸钠
NH4Cl 氯化铵
NMP N-甲基吡咯烷酮
Pd(PPh3)2Cl2 二氯-三(三苯基膦)钯
PBr3 三溴磷烷
Pt/C 10％ 铂碳10％
RT 室温
SOCl2 亚硫酰氯
THF 四氢呋喃
TBAF 四丁基铵，氟化物
TBAI 四丁基铵，碘化物
TFA 三氟乙酸
TSTU： [二甲基氨基-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-亚甲基]-二甲基-铵；四氟硼酸盐
化学命名
IUPAC首选名称是使用Draw 2018(版本18.1.NET)提供的化学命名功能生成的。
材料、方法和一般程序
所有从商业来源获得的试剂均无需进一步纯化即可使用。无水溶剂从商业来源获得并且无需进一步干燥即可使用。快速色谱法在CombiFlash Rf(Teledyne ISCO)上使用预装硅胶柱(Macherey-Nagel Chromabond Flash)进行。使用涂有Merck Type 60F254硅胶的5x10cm板进行薄层色谱分析。微波加热在CEM仪器中进行。
1H-NMR测量在400MHz Bruker Avance或500MHz Avance Neo光谱仪上进行，使用DMSO-d6或CDCl3作为溶剂。1H NMR数据采用化学位移值的形式，以百万分率(ppm)为单位，使用溶剂的残留峰(对于DMSO-d6为2.50ppm，对于CDCl3为7.26ppm)作为内标。分裂模式指定为：s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、quint(五重峰)、m(多重峰)、br s(宽单峰)、br t(宽三重峰)、dd((双二重峰)、td(三二重峰)、dt(双三重峰)、ddd(双双二重峰)。IR测量是在配备ATR Golden Gate设备(SPECAC)的Bruker Tensor 27上进行的。HRMS测量在LTQOrbiTrap Velos Pro质谱仪(ThermoFisher Scientific)上进行。将样品溶解在CH3CN/H2O(2/1:v/v)中，浓度范围约为0.01至0.05mg/mL，并通过以0.1mL/min的流速注入2μL，将其引入源中。ESI电离参数如下：3.5kV和350℃传输离子毛细管。所有光谱都是在正离子模式下使用锁定质量获得的，分辨率为30,000或60,000。
HRMS测量在LTQ OrbiTrap Velos Pro质谱仪(ThermoFisher Scientific GmbH，Bremen，德国)上进行。将样品溶解在CH3CN/H2O(2/1:v/v)中，浓度范围约为0.01至0.05mg/mL，并通过以0.1mL/min的流速注入2μL，将其引入源中。ESI电离参数如下：3.5kV和350℃传输离子毛细管。所有光谱都是在正离子模式下使用锁定质量获得的，分辨率为30 000或60000。
-MS:
-MS数据是使用具有以下参数的仪器获取的(表7)：
表7.-MS参数
制备型HPLC：
使用具有以下参数的仪器获取制备型HPLC(“Prep-HPLC”)数据(表8)：
表8.制备型HPLC参数
使用了三种制备型HPLC方法：
a.TFA法：溶剂：A＝水+0.05％ TFA，B＝乙腈+0.05％ TFA，梯度从5％到100％ B，15到30个CV
b.NH4HCO3方法：溶剂：A＝水+0.02M NH4HCO3，B＝乙腈/水80/20+0.02MNH4HCO3，梯度从5％到100％ B，15到30个CV
c.中性法：溶剂：A＝水，B＝乙腈，梯度从5％到100％ B，15到30个CV
将含有纯化合物的所有级分合并并直接冷冻干燥以提供作为无定形粉末的化合物。
方法A
步骤1：(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧杂吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺
向3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸(855mg，4.01mmol)在THF(42mL)中的溶液中添加N,N'-二环己基甲烷二亚胺(1.05g，5.08mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(510mg，4.43mmol)。将反应混合物在室温搅拌20h。将沉淀过滤除去并将滤液添加至(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(1.27g，3.35mmol)在DMF(42mL)的溶液中。将反应混合物在室温搅拌20小时，用乙醚(250mL)稀释。通过过滤回收固体以提供(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙醇基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(1.81g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.87(s,1H),8.05(d,1H),7.82(d,1H),7.53(d,2H),7.21(d,2H),7.00(s,2H),5.95(t,1H),5.39(s,2H),5.07(t,1H),4.41(d,2H),4.34-4.40(m,1H),4.18-4.22(m,1H),3.42-3.65(m,4H),2.88-3.02(m,2H),2.73(s,2H),2.28-2.45(m,2H),1.91-1.99(m,1H),1.53-1.75(m,2H),1.30-1.147(m,2H),0.85(d,3H),0.81(d,3H).13C NMR(125MHz,dmso-d6):δ171.05,170.83,170.32,170.09,158.82,137.49,137.37,134.50,126.88,118.81,66.66,66.53,62.57,57.49,53.06,36.74,35.76,30.51,29.31,26.79,25.20,19.16,18.07.MS(ESI)m/z[M+H]+＝575.2。
步骤2：(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺
在0℃在氩气下向(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙醇基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(37.2mg，65μmol)在THF(1mL)中的溶液逐滴添加三溴化磷(45μL，97mmol)。将反应在0℃搅拌1h并在室温搅拌2h。UPLC-MS跟踪反应进程：在形成相应的吗啉加合物后，用大量过量的吗啉乙腈溶液处理等分试样。将反应用THF(3mL)稀释，通过加入2滴NaHCO3饱和溶液淬灭，在室温搅拌5min，经硫酸镁干燥并过滤。将残余物，含有粗(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙醇基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺(45mg)立即用于下一步。MS(ESI)m/z[M+H]+＝662.62(吗啉加合物)。
步骤3：接头引入的一般程序
向有效负载(19.6μmol)在DMF(30mL/mmol)中的悬浮液中添加步骤2的产物(1.2当量)在THF(50mL/mmol)和DIPEA(3当量)中的溶液。将反应在室温搅拌2小时。使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法纯化粗产物，得到所期望化合物。
制备L9A-P27：2-[[(5R,7S)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P27作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+＝1318.6557(δ＝0.2ppm)
L9A-P30的制备：2-[[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P30作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+＝1292.6386(δ＝-0.9ppm).
L9A-P33的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]氮杂环庚烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P33作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1372.7019(δ＝-0.3ppm).
L9A-P32的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-异丙基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P32作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+＝1401.7287(δ＝-0.1ppm).
制备L9A-P38：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]哌啶-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P38作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+＝1358.6803(δ＝-4.7ppm).
制备L9A-P39：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吗啉-4-鎓-4-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸酯；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P39作为适当的负载，获得了所期望的产物。
HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1360.6634(δ＝-1.9ppm).
L9A-P41的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[3-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P41作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1342.6844(δ＝-5.5ppm).
制备L9A-P42：3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(5-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P42作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1358.6807(δ＝-4.4ppm).
方法B
步骤1：
向对甲氧基苄基(PMB)保护的有效负载(11.3μmol)在DMF(0.4mL)中的悬浮液中添加(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙醇基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺(12.4mg，13.6μmol)在THF(0.2mL)和DIPEA(9.8μL，56.7μmol)中的溶液。将反应在室温搅拌4小时。使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法纯化粗产物，得到直接用于步骤2中的预期化合物。
步骤2：
向来自步骤1的产物在DCM(3.2mL)中的悬浮液中添加TFA(320μL，4.18mmol)。将反应在室温搅拌1小时。蒸发溶剂并将残余物溶解在DMF(500μL)中。使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法纯化该粗溶液，得到所期望产物。
制备L9A-P35：2-[[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-(2-羟基乙基)-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸
使用方法B和P35的前体作为适当的PMB保护的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1318.6531(δ＝-1.7ppm).
制备L9A-P36：2-[[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-(3-甲氧基丙基)-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸
使用方法B和P36的前体作为适当的PMB保护的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1376.6930(δ＝-3.1ppm).
制备L9A-P37：2-[[(5SR,7RS)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-(4-羟基丁基)-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸
使用方法B和P37的前体作为适当的PMB保护的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1376.6918(δ＝-3.9ppm).
方法C
制备L9C-P19：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[[(3S)-3,4-二羟基丁基]-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
步骤1：[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基(4-硝基苯基)碳酸酯
向(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙醇基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(来自方法A，步骤1)(580mg；1.0mmol)在干DMF中的溶液中添加DIPEA(0.5mL；3.025mmol；3当量)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(615mg；2.02mmol；2当量)。将反应混合物在室温搅拌68h。将反应混合物用乙醚(15mL)稀释，过滤固体得到标题化合物(589mg；79％)。1H NMR(dmso-d6):0.82(d,3H,J＝6.8Hz),0.85(d,3H,J＝6.8Hz),1.47-1.33(m,2H),1.74-1.54(m,2H),1.92-2.00(m,1H),2.32-2.45(m,2H),2.90-3.06(m,2H),3.49-3.46(m,2H),3.60-3.52(m,4H),4.21(dd,1H,J＝8.7and6.8Hz),4.39(m,1H),5.24(s,2H),5.39(s,2H),5.96(t,1H,J＝5.6Hz),7.00(s,2H),7.41(d,2H,J＝8.8Hz),7.57(dd,2H,J＝6.8and 2.4Hz),7.65(d,2H,J＝8.4Hz),7.83(d,1H,J＝8.8Hz),8.10(d,1H,J＝7.6Hz),8.31(dd,2H,J＝6.8and 2.4Hz),10.03(s,1H).LCMS正离子模式检测到740.14(M+H+).
步骤2：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[[(3S)-3,4-二羟基丁基]-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸.
向P19(15mg，0.016mmol)在DMF(0.5mL)中的悬浮液中添加DIPEA(14μL，0.0801mmol)和步骤1的碳酸酯(14.2mg，0.0192mmol)，并在室温将该混合物搅拌18h。使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法纯化粗产物，以提供标题化合物(6.9mg，产率30％)。1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm(m,2H),(m,4H),(m,10H),(m,2H),9.98(s),8.08(d),7.9(d,1H),7.82(d),7.8(大,1H),7.79(大NC,1H),7.6(m,2H),7.49(大NC,1H),7.43(br s,1H),7.37(t,1H),7.28(d,2H),7.19(t,1H),7(s,2H),5.97(br s),5.42(大),4.99(s,2H),4.38(m,1H),4.22(t,1H),4.03(t,2H),3.86(m,2H),3.57/3.46/3.28/3.21(m,6H),3.53(m,2H),3.42(m,2H),3.38(m,1H),3.01/2.94(2m,2H),2.89(t,2H),2.43/2.32(2m,2H),2.37(s,3H),2.2(s,3H),2.03(m,2H),1.95(m,1H),1.7/1.38(2m,2H),0.84(m,6H),0.84(m,6H).13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 137.6,135.5,128.7,126.8,122.7,122.1,119.1,118.4,69.7,66.9,66.2,58.9,58.4,58.3,53.7,50.5/47.1/43.5,48.3/46,46,39,36.9,36.6,32.8,30.9,30.5,30,27.7,24.4,21.3,19.8,13.5,10.8.HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1422.6688(δ＝1.6ppm).
制备L9C-P22：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-(4-羟基丁基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法C和P22作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1406.6728(δ＝1.0ppm).
制备L9C-P23：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-[3-羟基-2-(羟基甲基)丙基]氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法C和P23作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1422.6670(δ＝0.5ppm).
L9C-P24的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法C和P24作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1408.6518(δ＝0.8ppm).
制备L9C-P25：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-(3-羟基丙基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法C和P25作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1366.6396(δ＝-0.4ppm).
制备L9C-P26：6-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-(3-羟基丙基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法C和P26作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1366.6396(δ＝-0.4ppm).
制备L9C-P29：6-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-(3-甲氧基丙基)氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法C和P29作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1380.6575(δ＝1.2ppm).
制备L9C-P31：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]哌嗪-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法C和P31作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1403.6694(δ＝1.7ppm).
制备L9C-P40：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-(3-羟基丙基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法C和P40作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1390.6775(δ＝0.7ppm).
L9A-P43的制备：3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(5-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P43作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1374.6754(δ＝-4.5ppm).
方法D
L9A-P20的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
步骤1：(2S)-N-[4-(氯甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺
将SOCl2(102μL，1.39mmol)在THF(8ml)中的溶液制备为溶液A。制备(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(来自方法A，步骤1)(100mg，0.174mmol)在THF(4ml)中的溶液作为溶液B。然后每10min向溶液B中加入500μl溶液A。在样品中添加吗啉后，通过UPLC-MS跟踪反应。反应完成后，室温减压蒸发混合物，直接用于下一步(105mg，0.177mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.00(s,1H),8.10(d,1H),7.85(d,1H),7.60(d,2H),7.35(d,2H),7.00(s,2H),6.05(m,1H),5.25(m,2H),4.70(s,2H),4.40(m,1H),4.20(m,1H),3.65-3.40(m,6H),3.00(2m,2H),2.4/2.3(2m,2H),2.00(m,1H),1.7/1.6(2m,2H),1.40(2m,2H),0.80(2d,6H).IR:(νcm-1)3288,1703,1643.HR-ESI+:[M+H]+＝发现值593.2499(δ＝2.4ppm).
步骤2：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
向P20(15mg，14.4μmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加来自步骤1的产物(14.6mg，17.2μmol)和DIPEA(8μL，43.1μmol)的溶液。将反应在80℃搅拌18h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物以提供标题化合物(19.0mg，产率96％)。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1373.6974(δ＝-0.1ppm).
L9A-P21的制备：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法D和P21并作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1344.6688(δ＝-1.7ppm).
制备L9A-P2：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基-二甲基-氨]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P2作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+＝1188.4561(δ＝0.6ppm).
制备L9A-P1：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P1作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+＝1232.4802(δ＝-1.1ppm).
L9A-P10的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P10作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1269.5176(δ＝3.4ppm).
L9A-P9的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P9作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1240.4887(δ＝1.6ppm).
L9A-P15的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4,4-二氟-哌啶-1-鎓-1-基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P15作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1290.4831(δ＝-0.3ppm).
L9A-P18的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]哌啶-1-鎓-1-基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P18作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1254.4990(δ＝-1.8ppm).
制备L9A-P28：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P28作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+＝1196.4827(δ＝1.9ppm).
L9C-P16的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-6-[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]乙氧基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用方法C和P16作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1331.5131(δ＝-0.4ppm).
L9C-P12的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[2-(二甲基氨基)乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用方法C和P12作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1301.5034(δ＝-0.3ppm).
制备L9C-P44：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-(3,4-二羟基丁基)氨基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用方法C和P44作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1262.4527(δ＝-0.1ppm).
L9C-P45的制备：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-(3-羟基丙基)氨基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用方法C和P45作为适当的有效负载，在基于NH4HCO3的纯化步骤后获得所期望产物方法(制备型HPLC，一般程序)。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1262.4527(δ＝0.4ppm).
L9C-P46的制备：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-(4,5-二羟基戊基)氨基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用方法C和P46作为适当的有效负载，在基于NH4HCO3的纯化步骤后获得所期望产物方法(制备型HPLC，一般程序)。HRMS(ESI)[M+H]+＝1324.4903(δ＝-1.7ppm).
L9C-P17的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]哌嗪-1-基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用方法C和P17作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1299.4880(δ＝0.5ppm).
L9A-P11的制备：[3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]-1-甲基-丙-2-炔基]-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸
使用方法A和P11作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1202.4722(δ＝0.5ppm).
L9A-P8的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]丁-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸；2,2,2-三氟乙酸
使用方法D和P8作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1 284.5343(δ＝-1.9ppm).
L9A-P14的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基-二乙基-氨]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用方法D和P14作为适当的有效负载，在基于NH4HCO3的纯化步骤后获得所期望产物方法(制备型HPLC，一般程序)。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1242.5021(δ＝-0.2ppm).
制备L9A-P13：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基-乙基-甲基-氨]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
使用方法D和P13作为适当的有效负载，在基于NH4HCO3的纯化步骤后获得所期望产物方法(制备型HPLC，一般程序)。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1228.4855(δ＝-1.0ppm).
L9A-P34的制备：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[(3S)-3,4-二羟基丁基]-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸
使用方法D和P34作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1288.5086(δ＝0.6ppm).
方法F
L13A-P2的制备：[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基-[3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
步骤1：(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺
向(2S)-2-氨基-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺(900mg，3.07μmol)在DMF(10mL)中的悬浮液中依次添加3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(2.00g，3.07mmol)在DMF(10mL)中的溶液、EDC(650mg，3.38mmol)(作为粉末)和DIPEA(1.00mL，6.14mmol)。将反应在室温搅拌16h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用NH4HCO3方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望产物(1.64g，1.78mmol)。IR:(νcm-1)3600-3200,3287,2106,1668,1630,1100.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm9.82(m,1H),8.14(d,1H),7.87(d,1H),7.54(d,2H),7.23(d,2H),5.08(t,1H),4.43(d,2H),4.39(m,1H),4.20(m,1H),3.65-3.44(m,48H),3.39(t,2H),2.5-2.3(m,2H),1.97(m,1H),1.31(d,3H),0.87/0.84(2d,6H).HRMS(ESI)[M+H]+发现值:919.5234(δ＝3.4ppm).
步骤2：(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醇基氨基]-N-[(1S)-2-[4-(溴甲基)苯胺基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺
在0℃向来自步骤1的产物(72mg，7.83μmol)在THF(5mL)中的溶液添加PBr3在THF中的1M溶液(157μL，157μmol)，并在0℃将该反应混合物搅拌1h且在室温搅拌1h。将反应混合物用AcOEt(5mL)稀释，用NaHCO3饱和水溶液(0.5mL)处理，用MgSO4干燥，无需进一步处理即可用于下一步。IR:(νcm-1)3700-3100,1658,2106.HRMS(ESI)[M+H]+发现值:981.4390(δ＝1.3ppm).
步骤3：[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基-[3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
向来自步骤2的产物((21mg，2.09μmol)在DMF(2mL)中的溶液中依次添加2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟代-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸(P2)(11.0mg，1.74μmol)(作为粉末)和DIPEA(8.6μL，5.22μmol)。将反应在室温搅拌8h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望产物(15mg，0.91mmol)。IR:(νcm-1)3400-3150,2235,2105,1667.1H NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 7.90(dl,1H),7.76(d,2H),7.68(s,1H),7.58(dd,1H),7.51(m,1H),7.51(d,2H),7.41(m,1H),7.38(t,1H),7.25(m,1H),7.20(t,1H),4.55(s,2H),4.42(s,2H),4.39(m,1H),4.21(m,1H),4.19(t,2H),3.77(s,3H),3.60(m,4H),3.54/3.50(m+m,44H),3.38(t,2H),3.29(m,2H),3.05(s,6H),2.47(s,3H),2.46/2.38(m+m,1+1H),2.16(quint,2H),1.96(m,1H),1.32(d,3H),0.88/0.84(d+d,3+3H).13C NMR(500MHz,dmso-d6)δppm 133.9,129.7,126.4,122.6,122.1,120.0,119.3,118.1,115.3,70.5/70.1,70.1/67.5,68.7,66.2,57.8,53.7,50.6,49.7,49.5,36.4,35.3,31.0,30.9,23.3,19.5/18.6,18.4,17.7.19F NMR(500MHz,dmso-d6)δppm-133.8.HRMS(ESI)[M+H]+发现值:1532.6964(δ＝0.6ppm).
方法G
L19C-P7的制备：5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]噻唑-4-甲酸
步骤1：[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基(4-硝基苯基)碳酸酯
向9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯(5.0g，9.7mmol)在THF(20mL)和DCM(10mL)中的溶液中依次添加对硝基苯基氯代碳酸酯(4.1g，20.1mmol)和吡啶(1.65mL，20.4mmol)。将反应在室温搅拌15h。添加10％柠檬酸水溶液并将反应混合物用AcOEt萃取两次。有机层用盐水洗涤并经MgSO4干燥。在真空下蒸发后，将固体溶解在最少量的AcOEt中并添加乙醚以沉淀所期望化合物(5.6g，8.22mmol)。IR:(νcm-1)3350-3200,1760；1690；1670；1630,1523；1290.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.07(m,1H),8.31(d,2H),8.19(d,1H),7.89(d,2H),7.74(t,2H),7.64(d,2H),7.57(d,2H),7.41(m,2H),7.41(d,2H),7.4(m,1H),7.32(t,2H),5.24(s,2H),4.43(m,1H),4.36-4.19(m,3H),3.92(dd,1H),2(m,1H),1.32(d,3H),0.9/0.87(2d,6H).
步骤2：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
向2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[2-氟代-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸(P7)(366.0mg，559mmol)在DMF(10mL)中的溶液中依次添加来自步骤1的产物(378mg，556mmol)和DIPEA(368μL，2.22mmol)。将反应混合物在室温搅拌16小时，然后蒸发至干。粗产物通过硅胶色谱法(甲醇在DCM中的梯度)纯化，得到所期望化合物(15.6mg，9.64μmol)。
步骤3：5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]噻唑-4-甲酸
向来自步骤2的产物(424mg，366mmol)在DMF(4mL)中的溶液中添加哌啶(90μL，914mmol)并在室温将该反应混合物搅拌1h。蒸发至干后，粗产物通过硅胶色谱法纯化(梯度为在DCM中含有2％ NH4OH的甲醇)以提供期望的化合物。IR:(νcm-1)3270,3100-2400,1680,1520.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.58/10.2(2*s,1H),8.55/8.28(2*s,1H),7.9(d,1H),7.65(s,1H),7.62(d,2H),7.52(d,1H),7.39(m,1H),7.35-7(massif,3H),7.32(d,2H),7.2(m,1H),5.05(s,2H),4.48(m,1H),4.26(s,2H),4.15(t,2H),3.71(s,3H),3.3(t,2H),3.03(d,1H),2.9(s,3H),2.45(s,3H),2.11(quint,2H),1.91(m,1H),1.4-0.7(br s,2H),1.32(d,3H),0.88/0.78(2*d,6H).19F NMR(400MHz,dmso-d6)δppm-134.
步骤4：5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]噻唑-4-甲酸
向2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸(58mg，249μmol)在DMF(1mL)中的溶液中依次添加TSTU(77mg，255μmol)和DIPEA(190μL，1.12mmol)，并在室温将该反应混合物搅拌2h。在添加在DMF(1.5mL)中的来自步骤3的产物(84mg，89.6mmol)后，在室温将该反应混合物搅拌2h。使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用NH4HCO3纯化粗产物，以提供期望的化合物(64mg，55.5mmol)。IR:(νcm-1)3700-2700,2104,1693/1656,1227/1127.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 9.76(s,1H),8.16(dl,1H),7.83(d,1H),7.62(s,1H),7.56(d,2H),7.51(d,1H),7.36(d,1H),7.35(t,1H),7.29(d,2H),7.24-7.08(m,3H),7.18(t,1H),5.04(s,2H),4.44(hept,1H),4.28(dd,1H),4.26(s,2H),4.16(t,2H),3.94(s,2H),3.75(s,3H),3.58(m,10H),3.35(t,2H),3.27(t,2H),2.91(s,3H),2.45(s,3H),2.13(quint,2H),2.05(m,1H),1.32(d,3H),0.89/0.84(2d,6H).19FNMR(400MHz,dmso-d6)δppm-133.9.HRMS ESI[M+H]+发现值1152.4207(δ＝1.5ppm).
L23C-P7的制备：5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]噻唑-4-甲酸
产物根据方法G通过替换9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯用9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰]-4-脲基-丁基]氨基甲酰]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯而获得。IR:(νcm-1)3687-3060,2104,非常广泛-1656,1606,1515,754and725.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 7.90(d,1H),7.70(br s,1H),7.60(d,2H),7.50(m,2H),7.40(t,1H),7.30(d+m,3H),7.20(t,1H),7.15(dd,1H),5.45(m,2H),4.40(m,1H),4.30(m,1H),4.25(s,2H),4.15(t,2H),3.95(s,2H),3.80(s,3H),3.60/3.30(2m,12H),3.30(m,2H),3.00(2m,2H),2.90(s,3H),2.45(s,3H),2.15(quint,2H),2.00(m,1H),1.70/1.60(2m,2H),1.45/1.4(2m,2H),0.90/0.80(2d,6H).19F NMR(400MHz,dmso-d6)δppm-134.2.HRMS ESI[M+H]+发现值1238.4675(δ＝0.4ppm).
L110C-P7的制备：5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]噻唑-4-甲酸
产物根据方法G通过替换9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯用9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰]-4-脲基-丁基]氨基甲酰]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯，及2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸用3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]而获得。
乙氧基]丙酸。IR:(νcm-1)3560-3063,2100,非常广泛-1651,1608,1514,756和725.1HNMR(400MHz,dmso-d6)δppm 7.9(d,1H),7.7(br s,1H),7.6(d,2H),7.5(m,1H),7.4(t,1H),7.4-7.1(m,3H),7.3(d,2H),7.2(t,1H),5.4(m,2H),4.4(m,1H),4.3(s,2H),4.25(m,1H),4.15(t,2H),3.8(s,3H),3.65-3.4(m,50H),3.3(m,2H),3(2m,2H),2.9(s,3H),2.45(s,3H),2.4(m,2H),2.1(quint,2H),2(m,1H),1.7/1.6(2m,2H),1.4(2m,2H),0.85(2d,6H).19F NMR(400MHz,dmso-d6)δppm-134.4.HRMS(ESI)[M+H]+发现值1648.7209(δ＝1.4ppm).
方法H
L27C-P3的制备：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰亚胺基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤1：钠；2-(羟基甲基)-5-硝基-苯磺酸酯
向5-硝基-2-[(E)-2-(4-硝基-2-磺基-苯基)乙烯基]苯磺酸酯钠(25.0g；52.7mmol)在水(336mL)中的溶液中通入臭氧流1.5h。反应完成后，将混合物用氩气吹扫30分钟以除去过量的臭氧。然后，添加碳酸钠(39.1g；7当量)和硼氢化钠(3.99g；2当量)并在室温将该橙色溶液搅拌16h。将该反应混合物浓缩以得到期望的化合物(39.9g；sup100％)，呈固体(含有残留痕量的硼盐)。1H NMR(dmso):δ4.99(d,2H,J＝3.6Hz),5.36(t,1H,J＝5.6Hz),7.83(d,1H,J＝8.4Hz),8.21(d,1H,J＝8.4Hz),8.45(s,1H).
步骤2：钠；5-氨基-2-(羟基甲基)苯磺酸钠
将2-(羟基甲基)-5-硝基-苯磺酸酯钠(26.9g；105mmol)在水(403mL)中溶解。然后，反应混合物用氩气冲洗。添加10％碳钯(2.65g，10％wt.)，然后将黑色悬浮液用氩气冲洗，然后用氢气冲洗。将反应混合物在氢气氛下于室温搅拌3.5天。在 上过滤并用水和甲醇洗涤后，将滤液浓缩至干并与甲苯共蒸发3次。使用乙酸乙酯/甲醇(90/10至70/30)作为洗脱剂通过硅胶柱色谱纯化，得到所期望化合物(14.29g；60％)。1H NMR(dmso):δ4.52(d,2H,J＝5.2Hz),4.95(t,1H,J＝5.2Hz),5.04(s,2H),6.42(d,1H,J＝7.6Hz),6.93(d,1H,J＝7.6Hz),7.03(s,1H).
步骤3：钠；5-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸钠
向Fmoc-L-Cit-OH(882mg；2.22mmol)在二甲基甲酰胺(32.5mL)中的溶液添加来自步骤2的产物(500mg；2.22mmol)、HBTU(1.01g；2.66mmol)和DIPEA(917μL；5.55mmol)。将反应混合物在室温搅拌16小时，然后浓缩至干并与水(2x100mL)共蒸发。使用乙腈/水2/8至8/2作为洗脱剂，通过C18柱色谱纯化粗品，得到所期望化合物(1.0g；63％)。1H NMR(dmso):δ1.25-1.28(m,15H,DIPEA),1.36-1.72(m,4H),2.92-3.03(m,2H),3.11-3.18(m,2H,DIPEA),3.5-3.65(m,2H,DIPEA),4.30-4.12(m,4H),4.74(d,2H,J＝4.4Hz),5.05(t,1H,J＝5.6Hz),5.37(s,2H),5.97(t,1H,J＝4.8Hz),7.34-7.42(m,4H),7.62-7.90(m,7H),8.15(s,1H),10.05(s,1H).
步骤4：钠；5-[[(2S)-2-氨基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸钠
向来自步骤3的产物(11.2g；15.73mmol)在DMF(224mL)中的溶液中添加哌啶(3.1mL；2当量)。将反应混合物在室温搅拌3小时，然后添加水(400mL)。将水层用乙酸乙酯(2x300mL)和二氯甲烷(300mL)萃取。将碳酸钠(5.01g；3当量)添加至水层中并将混合物在室温下搅拌3h。将混合物冻干以得到所期望化合物(6.01g；估计为100％)，呈被钠盐污染的固体。1H NMR(dmso):δ1.55-1.64(m,4H),2.99-3.01(m,2H),3.58(m,1H),4.75(s,2H),5.06(s,1H),5.38(s,2H),5.98(t,1H,J＝5.6Hz),7.38(d,1H,J＝8.4Hz),7.72(dd,1H,J＝8.4&2.4Hz),7.86(d,1H,J＝2.4Hz,),10.17(s,1H).
步骤5：钠；5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸钠
向来自步骤4的产物(6.01g，15.73mmol)在二甲基甲酰胺(150mL)的溶液中添加中Fmoc-L-Val-OSu(6.85g，1当量)。将溶液在室温搅拌3小时，然后将反应混合物用饱和碳酸氢钠(100mL)和水(100mL)稀释并浓缩至干。使用乙酸乙酯/甲醇90/10至50/50作为洗脱剂在硅胶上纯化残余物以提供所期望化合物(4.44g，48％)。1H NMR(dmso):0.85-0.90(m,6H),1.31-1.76(m,4H),1.95-2.06(m,1H),2.91-3.05(m,2H),3.95(t,1H,J＝8.4Hz),4.24-4.35(m,3H),4.37-4.45(m,1H),4.76(d,2H,J＝6Hz),5.07(t,1H,J＝6.4Hz,),5.40(s,2H),6.03(t,1H,J＝5.6Hz),7.32-7.46(m,6H),7.67(d,1H,J＝8Hz),7.76(t,2H,J＝7.2Hz),7.88-7.91(m,3H),8.12(d,1H,J＝7.6Hz),10.08(s,1H).13CNMR(dmso):18.25,19.24,26.70,29.56,30.45,39.50,46.67,53.17,60.01,60.96,65.66,117.85,119.15,120.05,125.36,127.06,127.62,128.09,134.39,136.79,140.67,143.89,145.34,156.08,158.82,170.37,171.16.LCMS(2-100ACN/H2O+0.1％ AF)：93.85％保留时间＝8.4min，正模式：检测到682.15(MH+)，负模式：检测到680.17(MH-)。
步骤6：5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯磺酸酯
向来自步骤5的产物(450mg，0.64mmol)在DMF(6mL)中的溶液中添加DIPEA(1.34mL，7.67mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(778mg，2.56mmol)。将溶液在室温搅拌2h并加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(390mg，1.28mmol)。1h后，减压浓缩溶液，残余物通过硅胶色谱法(甲醇和乙酸在二氯甲烷中的梯度)纯化，得到所期望化合物(523mg)。
步骤7：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰亚胺基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
向2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[2-氟代-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸(P3)(70mg，109μmol)在DMF(550μL)中的溶液中依次添加DIPEA(0.19mL，1.39mmol)、步骤6的产物(111mg，131μmol)和DIEPA(95μL，544μmol)。将溶液在室温搅拌15小时并浓缩得到所期望化合物，其不经任何进一步处理即使用。
步骤8：5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰亚胺基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]-2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]噻唑-4-甲酸
向来自步骤7的产物(147mg，109μmol)在二噁烷(1.1mL)中的溶液中添加LiOHxH2(13.7mg，326μmol)在水(1.1mL)中的溶液。将溶液在室温搅拌12小时。添加1M HCl水溶液直至pH 7。将反应混合物蒸发至干并将残余物在DCM中研磨。用水和EtOH洗涤沉淀，得到所期望化合物(120mg)。
步骤9：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰亚胺基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
向来自步骤8的产物(120mg，109μL)的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(37.8mg，122μmol)和DIPEA(38.5μL，221μmol)。将溶液在室温搅拌1.5h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望化合物(9mg)。HRMS(ESI)[M+H]+1322.3831(δ＝-3.3ppm).
方法IL27A-P1的制备：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰亚胺基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
步骤1：2-(氯甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸
向5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸酯(300mg，426μmol)在NMP(6mL)中的溶液中经1h 7次添加SOCl2(31μL，426μmol)在NMP(1mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌1h。通过将反应混合物直接沉积在Oasis柱上并使用TFA方法使用C18反相制备型HPLC纯化产物，得到所期望产物(225mg)。IR:(νcm-1)3600-2200,1657,1250-1100.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.15/8.1/7.42/6(s+2d+m,4H),7.9(m,3H),7.75(m,3H),7.42/7.31(2m,5H),5.23(s,2H),4.4(m,1H),4.3-4.2(m,3H),3.95(dd,1H),3(m,2H),2(m,1H),1.7/1.6(2m,2H),1.48/1.37(2m,2H),0.88(2d,6H).HRMS(ESI)[M+H]+700.2199(δ＝-0.5ppm).
步骤2：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰亚胺基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-二甲基-铵；氯化物
向来自步骤1的产物(55.7mg，68.4μmol)在NMP(0.9mL)中的溶液中依次添加2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟代-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸(P1)(30mg，45.6μmol)、DIEPA(63.6μL，365μmol)和TBAI(13mg，36.5μmol)。将反应混合物在60℃下搅拌6h。所期望化合物直接用作步骤3中的溶液。
步骤3：[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基-[3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基]-二甲基-铵
向来自步骤2的产物(26.5μmol)的NMP溶液中添加二乙基胺(21.9μL，212μmol)。将反应混合物在室温搅拌24h。通过将反应混合物直接沉积在Oasis柱上并使用NH4HCO3方法，使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望产物(18mg)。步骤4：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰亚胺基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
向来自步骤3的产物(20mg，18.2μmol)在DMF(900μL)中的溶液依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(8.5mg，27.3μmol)和DIPEA(9.5μL，54.5μmol)。将溶液在室温搅拌1.5h。使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用NH4HCO3方法纯化粗产物，得到标题化合物(15.7mg)。HRMS(ESI)[M+H]+1294.4278δ＝1ppm.
方法J
制备L21A-P2：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
步骤1：叔丁基-[(2-碘-4-硝基-苯基)甲氧基]-二甲基-硅烷
向(2-碘代-4-硝基-苯基)甲醇(172g，61.64mmol)在二氯甲烷(300mL)中的溶液添加咪唑(5.04g，73.97mmol)。将混合物冷却至0℃后，在15min内逐滴添加叔丁基-氯-二甲基-硅烷(TBDMSCl)(11.15g，73.97mmol)在二氯甲烷(300mL)中的溶液。在室温搅拌16h后，将反应混合物用甲醇(20mL)淬灭并浓缩。将粗产物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)纯化，得到所期望产物(19.65g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.57(s,1H),8.31(d,1H),7.66(d,1H),4.67(s,2H),0.92(s,9H),0.14(s,6H).
步骤2：甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤1的产物(3.0g，7.63mmol)在DMF(55mL)中的溶液中依次添加甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-乙炔基-四氢吡喃-2-甲酸酯(3.39g，9.92mmol)、DIPEA(5.80mL，35.09mmol)、碘化亚铜(145mg，0.763mmol)和二氯代-二-(三苯基膦)钯(II)(535mg，0.763mmol)。将溶液用氩气冲洗并在室温搅拌16小时。用水(300mL)稀释后，水层用乙酸乙酯(2x300mL)萃取。用水(2x300mL)洗涤合并的有机层，干燥，过滤并浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)纯化，得到所期望产物(4.01g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.32(dd,1H),8.19(d,1H),7.75(d,1H),5.45(t,1H),5.16(t,1H),5.02-5.07(m,2H),4.82(s,2H),4.55(d,1H),3.65(s,3H),1.98-2.07(m,9H),0.92(m,9H),0.14(s,6H).
步骤3：甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(羟基甲基)-5-硝基-苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤2的产物(4.01g，6.60mmol)在THF(48mL)和水(48mL)中的溶液中添加乙酸(193mL，3.36mol)。将溶液在室温搅拌2天，然后用水(300mL)稀释。将水层用二氯甲烷(2x300mL)萃取。用水(2x300mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(400mL)洗涤合并的有机层，干燥，过滤并浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)纯化，得到所期望产物(2.67g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.29(dd,1H),8.15(d,1H),7.79(d,1H),5.68(t,1H),5.45(t,1H),5.16(t,1H),5.02-5.07(m,2H),4.62(d,2H),4.55(d,1H),3.65(s,3H),1.98-2.07(m,9H).
步骤4：甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-氨基-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯
来自步骤3的产物(2.67g，5.41mmol)在THF(59mL)中的溶液用氩气冲洗。在添加铂碳5％干(1.34g，50％w/w)后，反应混合物依次用氩气和H2冲洗，然后在室温在H2气氛(1atm)下搅拌2天。将反应混合物通过垫过滤，用乙酸乙酯/甲醇9/1(500mL)的溶液洗涤，并浓缩至干。所有顺序(包括添加铂载碳5％干(1.34g，50％w/w)，在H2(1atm)下搅拌在室温16h并通过垫过滤)重复进行以允许完全转化。将粗产物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)纯化，得到所期望产物(1.12g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ6.93(d,1H).6.67-6.33(m,2H),5.30(t,1H),4.96(t,1H),4.88(s,2H),4.81(t,1H),4.61(t,1H),4.39(d,1H),4.29-4.24(m,2H),3.78-3.72(m,1H),3.65(s,3H),2.65-2.54(m,2H),2.07-1.98(m,9H),1.79-1.68(m,1H),1.63-1.52(m,1H).
步骤5：甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤4的产物(1.00g，2.14mmol)在DMF(21mL)中的溶液中依次添加(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酸(Boc-Cit-OH)(589mg，2.14mmol)、DIPEA(707μl，4.28mmol)和HBTU(1.22g，3.21mmol)。将反应混合物在室温搅拌72h。用水(100mL)稀释并浓缩后，粗产物通过硅胶色谱法(甲醇在二氯甲烷中的梯度)纯化，得到所期望产物(1.05g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.82(s,1H),7.35-7.42(m,2H),7.24(d,1H),6.95(d,1H),5.94(t,1H),5.37(s,2H),5.30(t,1H),4.91-4.99(m,2H),4.79(t,1H),4.36-4.42(m,3H),4.01-4.08(m,1H),3.76(t,1H),3.65(s,3H),2.95-3.04(m,2H),2.54-2.65(m,2H),1.98-2.07(m,9H),1.68-1.79(m,1H),1.49-1.63(m,3H),1.30-1.42(m,11H).
步骤6：甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯
在0℃向来自步骤5的产物(950mg，1.31mmol)在二氯甲烷(7.5mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1.9mL，25.6mmol)。在室温将该反应混合物搅拌3h。将反应混合物浓缩至干并与甲苯(2x50mL)共蒸发以提供粗化合物。向在DMF(13mL)中的该粗品溶液中依次添加(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酸(Fmoc-Val-OH)(467mg，1.38mmol)、DIPEA(867μl，5.24mmol)和HBTU(845mg，2.23mmol)。将反应混合物在室温搅拌16小时。添加饱和碳酸氢盐水溶液(20mL)并将混合物在室温搅拌1小时，用水(100mL)稀释并浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱法(甲醇在二氯甲烷中的梯度)纯化，然后通过使用中性方法的反相C18色谱法纯化，得到所期望产物(680mg)。LC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝946.3.1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.90(s,1H).8.07(d,2H),7.89(d,2H),7.74(t,2H),7.44-7.38(m,3H),7.36-7.28(m,3H),7.24(d,1H),5.94(t,1H),5.37(s,2H),5.30(t,1H),4.99-4.92(m,2H),4.79(t,1H),4.42-4.36(m,4H),4.32-4.19(m,3H),3.94-3.90(m,1H),3.76(t,1H),3.65(s,3H),2.99-2.94(m,2H),2.65-2.54(m,2H),2.07-1.98(m,10H),1.70-1.55(m,4H),1.46-1.36(m,2H),0.89-0.84(m,6H).13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ171.19,170.33,169.58,169.45,169.27,167.77,158.81,156.12,143.89,143.76,140.69,139.48,137.54,134.88,128.44,127.62,127.06,125.35,120.08,119.42,116.65,75.78,74.61,72.65,71.20,69.49,65.68,60.49,60.10,53.14,52.40,46.68,32.32,30.43,29.54,27.19,26.77,20.39,20.34,20.24,19.22,18.25.
步骤7：甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(溴甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤6的产物(154mg，0.163mmol)在THF(8.2mL)中的溶液中依次添加三苯基膦(85.4mg，0.326mmol)和1-溴吡咯烷-2,5-二酮(58.0mg，0.326mmol)。将反应混合物在室温搅拌2h。5h后，将三苯基膦(85.4mg，0.326mmol)和1-溴吡咯烷-2,5-二酮(58.0mg，0.326mmol)添加到混合物中，并将反应在室温搅拌15h。将由此获得的粗产物用于下一步骤。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+OMe-Br+H]+＝960.7.
步骤8：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-二甲基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[2-[(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-甲氧基羰基-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]甲基]铵；溴化物
向来自步骤7的产物(207.63mg，206μmol)在DMF(5mL)中的溶液中依次添加2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟代-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸(P2)(100mg，158μmol)和DIPEA(135μL，792μmol)。将反应混合物在室温搅拌4h。浓缩粗产物并在不进一步处理的情况下用于下一步骤(246mg)。
步骤9：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-二甲基-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]铵；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
向来自步骤8的产物(246mg，158μmol)在二噁烷(2.0mL)中的溶液中添加氢氧化锂(39.7mg，946μmol)在水(2ml)中的溶液。反应完成后，添加1M HCl水性溶液直至pH 6-7。使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法纯化粗产物，得到预期化合物(68mg)。
步骤10：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-二甲基-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]铵；2,2,2-三氟乙酸酯
向来自步骤9的产物(30mg，21.0μmol)在DMF(1.2mL)中的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(12.8mg，41.3μmol)在DMF(500μL)和DIPEA(18.3μL，105μmol)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌3h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到标题化合物(6.5mg)。HRMS(ESI)[M-CF3COO]+发现值＝1392.5197(δ＝0.7ppm).
制备L106A-P2：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
步骤1：甲基(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(溴甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯
向甲基(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙醇基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯(L106C-P7制备，步骤16)(255mg，297μmol)在THF(14mL)中的溶液中依次添加三苯基膦(234mg，890μmol)和N-溴琥珀酰亚胺(158mg，890μmol)。将反应混合物在室温搅拌15小时。反应混合物不经任何处理用于下一步。
步骤2：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-二甲基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[2-[(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-甲氧基羰基-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]甲基]铵；溴化物
向来自步骤1的产物(297μmol)在THF的悬浮液中依次添加2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟代-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸(P2)(140mg，222μmol)在DMF(3mL)和DIPEA(116μL，665μmol)中的溶液。将反应在室温搅拌60小时。将反应混合物蒸发至干，不经处理直接用于下一步骤。
步骤3：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-二甲基-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]铵；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
向来自步骤2的产物(222μmol)在二噁烷(2mL)中的溶液中添加LiOH.H2O(218mg，5.20mmol)在水(2mL)中的溶液。将溶液在室温搅拌2h。添加1M HCl水性溶液直至pH 6-7。将反应混合物蒸发至干，并使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法纯化粗产物，得到预期化合物(112mg)。IR:(νcm-1)3500-2500,2237,1667,1197/1180/1130.1H NMR(400/500MHz,dmso-d6)δppm 12.55(m),10.35(s),8.65(d),8.1(large),7.89(d,1H),7.67(s,1H),7.66(dd,1H),7.53(df,1H),7.48(m,1H),7.4(m,1H),7.38(m,1H),7.27(m,1H),7.24(t,1H),7.2(dd,1H),7.19(m,1H),5.3-4.7(ml),4.64/4.54(2d,2H),4.51(br s,2H),4.5(m,1H),4.2(t,2H),3.78(s,3H),3.6(m,1H),3.5(d,1H),3.32(t,1H),3.28(t,1H),3.11(t,1H),3.1-2.9(m,4H),3.02(br s,6H),2.98(m,1H),2.48(s,3H),2.2-1.5(m,5H),1.38(d,3H),0.98(d,6H).
步骤4：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-二甲基-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]铵；2,2,2-三氟乙酸酯
向来自步骤3的产物(60mg，44.8μmol)在DMF(2.25mL)中的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(20.9mg，67.2μmol)和DIPEA(23.4μL，134μmol)。将溶液在室温搅拌3h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望产物(28.5mg)。IR:(νcm-1)3600-3100,2800-2200,2234,1705+1687+1614,1537.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm12.5(m,2H),10.5/8.20/7.90(s+2d,3H),7.80(d,1H),7.68(2s,2H),7.60-7.40(m,4H),7.40(m,2H),7.20(2t,2H),7.00(s,2H),5.20-5.00(m,3H),4.62/4.53(2d,2H),4.50(s,2H),4.38(t,1H),4.20(t,4H),3.80(s,3H),3.60-3.00(m,10H),3.02(2s,6H),2.81(m,2H),2.45(s,3H),2.42/2.30(2t,4H),2.15(m,2H),2.00(m,1H),1.95(m,2H),1.30(d,3H),0.89/0.82(2d,6H).HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+＝1306.4715(δ＝0.6ppm).
L106C-P7的制备：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
步骤1：2-碘-4-硝基-苯甲酸
向2-氨基-4-硝基-苯甲酸(10.0g，54.90mmol)在乙腈(280mL)中的溶液中添加p-甲苯磺酸一水合物(32.0g，168.2mmol)。将混合物在室温搅拌15min，然后在15min内滴加含有亚硝酸钠(8.00g，115.9mmol)和碘化钾(24.0g，144.6mmol)的水(140mL)溶液。将反应混合物搅拌19h。反应完成后，将混合物用硫代硫酸钠(13.02g，82.36mmol)淬灭并用3M氯化氢水性溶液(25mL)酸化。将水层用乙酸乙酯(2x250mL)萃取，将合并的有机层用1M氯化氢水溶液(100mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。将所得残余物吸收在二氯甲烷(1L)中并用1M HCl水溶液(100mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到所期望产物(15.0g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ13.8(br s,1H),8.64(s,1H),8.27(d,1H),7.86(d,1H).
步骤2：(2-碘-4-硝基-苯基)甲醇
向来自步骤1的产物(5.0g，17.06mmol)在THF(70mL)中的溶液中添加硼烷在THF(85mL，85mmol)中的1M溶液。将反应混合物在65℃搅拌4h。将反应混合物冷却至室温并通过加入甲醇(200mL)淬灭。将混合物在室温搅拌30min并浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)纯化，得到所期望产物(3.38g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.54(d,1H),8.29(dd,1H),7.70(d,1H),5.82(t,1H),4.47(d,2H).
步骤3：(4-氨基-2-碘苯基)甲醇
向来自步骤2的产物(3.70g，13.26mmol)在乙醇(100mL)和水(25mL)中的溶液中依次添加铁(3.70g，66.25mmol)和氯化铵(800mg，14.96mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌3h。将反应混合物经过滤，用乙醇洗涤，并浓缩至干。将所得残余物溶解在乙酸乙酯(100mL)中并用饱和碳酸氢钠溶液(100mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干，得到所期望产物(2.48g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.02-7.10(m,2H),6.57(d,1H),5.16(s,2H),4.97(t,1H),4.28(d,2H).
步骤4：4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯胺
向来自步骤3的产物(3.51g，13.37mmol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液中添加咪唑(0.95g，13.95mmol)。将混合物冷却至0℃并经15分钟滴加叔丁基-氯-二甲基-硅烷(2.40mL，13.85mmol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液。在室温搅拌16小时后，将反应混合物用甲醇(20mL)淬灭并浓缩。将粗产物通过硅胶色谱法纯化(梯度为乙酸乙酯的环己烷溶液)，得到所期望产物(3.64g 75％)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.05(s,1H),7.03(d,1H),6.55(d,1H),5.24(s,2H),4.46(s,2H),0.88(s,9H),0.06(s,6H).
步骤5：(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酸
向(2S)-2-氨基丙酸(3.22g，36.09mmol)在水(90mL)中的溶液中依次添加碳酸钠(7.29g，68.74mmol)和(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酸甲酯(15.0g，34.37mmol)在二甲氧基乙烷(90mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌16小时。用1M氯化氢水溶液将反应酸化至pH＝1后，用乙酸乙酯(3x500mL)萃取水层。将合并的有机层干燥、浓缩并用二乙醚(50mL)研磨，得到所期望产物(11.25g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δ12.48(s,1H),8.21(d,1H),7.89(d,2H),7.72-7.79(m,2H),7.28-7.46(m,5H),4.15-4.32(m,4H),3.90(t,1H),1.90-2.02(m,1H),1.28(d,3H),0.86-0.90(m,6H).
步骤6：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯胺基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯
向来自步骤5的产物(1.50g，3.65mmol)在二氯甲烷(18mL)和甲醇(18mL)中的溶液中依次添加来自步骤4的产物(1.33g，3.65mmol)和乙基2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸酯(EEDQ)(1.36g，5.48mmol)。悬浮液在室温搅拌16小时。浓缩后，将粗产物通过硅胶色谱(梯度为乙酸乙酯/环己烷)然后通过C18色谱(梯度为甲醇/水)纯化，得到所期望产物(1.18g)。1HNMR(400MHz,dmso-d6):δ10.05(s,1H).8.16-8.24(m,2H),7.88(d,2H),7.71-7.77(m,2H),7.55(d,1H),7.37-7.48(m,3H),7.27-7.37(m,3H),4.56(s,2H),4.38(t,1H),4.18-4.33(m,3H),3.91(t,1H),2.08-2.20(m,1H),1.30(d,3H),0.83-0.95(m,15H),0.06(s,6H).
步骤7：(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苄基氧基-6-(苄基氧基甲基)四氢吡喃-2-酮
在室温将(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苄基氧基-6-(苄基氧基甲基)四氢吡喃-2-醇(30.0g，55.49mmol)在DMSO(120mL)中的悬浮液搅拌30min并在室温逐滴用乙酸酐(90mL)经15min处理。将溶液搅拌16h，冷却至0℃，并用1M氯化氢水性溶液(100mL)处理。将反应混合物在室温搅拌20min并蒸发乙酸。将所得残余物用水(200mL)和乙酸乙酯(200mL)稀释。将水层用乙酸乙酯(2x200mL)萃取，将合并的有机层用水(2x500mL)和碳酸氢钠饱和溶液(2x500mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)纯化，得到所期望产物(25.05g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.19-7.39(m,20H),4.85(d,1H),4.57-4.72(m,5H),4.46-4.56(m,3H),4.36(d,1H),3.98-4.05(m,1H),3.84-3.92(m,1H),3.65-3.76(m,2H).
步骤8：(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苄基氧基-6-(苄基氧基甲基)-2-(2-三甲基甲硅烷乙炔基)四氢吡喃-2-醇
在-78℃下，在20min内向三甲基甲硅烷基乙炔(24mL，168.6mmol)在THF(325mL)中的溶液中添加2.5M丁基锂在己烷中的溶液(59.41mL，148.5mmol)。将溶液在-78℃搅拌45min并在0℃搅拌45min。将反应混合物冷却至-78℃并在45min内逐滴添加来自步骤7的产物(25.0g，46.41mmol)在THF(325mL)中的溶液。将反应混合物在该温度下搅拌4h并用水(200mL)淬灭。水层用乙酸乙酯(2x200mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干至得到所期望产物(29.56g)，为两种非对映异构体的混合物，比例为4/6。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.13-7.43(m,20H),4.87-4.99(m,1H),4.65-4.83(m,4H),3.43-3.57(m,3H),3.70-3.85(m,2H),3.55-3.68(m,3H),3.43-3.53(m,2H),0.11-0.22(m,9H).
步骤9：三甲基-[2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-三苄基氧基-6-(苄基氧基甲基)四氢吡喃-2-基]乙炔基]硅烷
在-15℃向来自步骤8的产物(29.56g，46.42mmol)在乙腈(83mL)和二氯甲烷(193mL)中的溶液在20min内添加三乙基硅烷(44.98mL，278.5mmol)在乙腈/二氯甲烷(37mL/18mL)混合物中的溶液及在30min内添加三氟化硼二乙醚(23.53mL，185.7mmol)在乙腈(37mL)中的溶液。在相同温度将该溶液搅拌5h并用水(500mL)稀释。水层用乙酸乙酯(2x500mL)萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干，得到所期望产物(28.82g)。1HNMR(400MHz,dmso-d6):δ7.10-7.44(m,20H),4.93(d,1H),4.67-4.86(m,4H),4.43-4.57(m,3H),4.16-4.28(m,1H),3.42-3.68(m,6H),0.15(s,9H).
步骤10：(2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5-三苄基氧基-2-(苄基氧基甲基)-6-乙炔基-四氢吡喃
向来自步骤9的产物(28.80g，46.39mmol)在甲醇(1.12L)和二氯甲烷(240mL)中的溶液中添加氢氧化钠1M水性溶液(80mL)。将溶液在室温搅拌1小时，用1M氯化氢水溶液酸化至pH＝1，并用水(500mL)稀释。蒸发甲醇并用乙酸乙酯(2x1L)萃取水层。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶色谱法(梯度为环己烷中的乙酸乙酯)纯化，得到所期望产物(20.00g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ3.42-3.67(m,7H),4.17(d,1H),4.44-4.56(m,3H),4.67-4.86(m,4H),4.90(d,1H),7.15-7.40(m,20H).
步骤11：(2S,3R,4R,5S,6R)-2-乙炔基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-3,4,5-三醇
在室温向来自步骤10的产物(20.00g，36.45mmol)在乙硫醇(400mL)中的溶液中经5min逐滴添加三氟化硼二乙醚(147.8mL，1166mmol)。在室温将该溶液搅拌16h，冷却至0℃，配备含饱和次氯酸钠水溶液的气阱，并在0℃用碳酸氢钠饱和水溶液(500mL)逐滴处理1h。浓缩至干后，粗产物通过硅胶色谱法纯化(梯度为甲醇的二氯甲烷溶液)，以得到期望的产物(4.05g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ5.28(d,1H),4.99(d,1H),4.91(d,1H),4.52(t,1H),3.77(d,1H),3.60-3.69(m,1H),3.35-3.43(m,1H),3.32(s,1H),2.97-3.13(m,4H).
步骤12：甲基(2S,3S,4R,5R,6S)-6-乙炔基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤11的产物(4.05g，21.52mmol)在碳酸氢钠(81mL)饱和水溶液和THF(81mL)中的溶液中添加(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基(TEMPO)(168mg，1.08mmol)。将悬浮液冷却至0℃，并在30min内分批加入1,3-二溴-5,5-二甲基-咪唑啉-2,4-二酮(12.31g，43.04mmol)。将反应混合物在0℃搅拌4h并通过加入甲醇(40mL)淬灭。在此温度搅拌30min后，添加饱和碳酸钾水性溶液(10mL)和二氯甲烷(100mL)。将有机层用水(2x200mL)萃取后，将合并的水层用3M氯化氢水溶液酸化至pH＝1并浓缩至干。将残余物吸收在甲醇(100mL)和3M氯化氢水溶液(20mL)中。将混合物浓缩并与甲醇(4x100mL)共蒸发数次。将粗产物通过硅胶色谱法纯化(甲醇在二氯甲烷铈显色剂中的梯度)以得到所期望产物(3.00g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ5.46(d,1H),5.32(d,1H),5.18(d,1H),3.93-4.00(m,1H),3.75(dd,1H),3.65(s,3H),3.40-3.44(m,1H),3.31(s,1H),3.09-3.19(m,2H).
步骤13：甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-乙炔基-四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤12的产物(3.00g，13.88mmol)在DMF(37.5mL)和吡啶(12.5mL)中的溶液中添加N,N-二甲基吡啶-4-胺(DMAP)(84.8mg，0.693mmol)。将反应混合物冷却至0℃并经5min逐滴用乙酸酐(20.0mL，213mmol)处理。将溶液在室温下搅拌3h并用1M氯化氢水性溶液(200mL)稀释。水层用乙酸乙酯(2x200mL)萃取。将合并的有机层用1M氯化氢水溶液(2x200mL)和饱和碳酸钾水溶液(200mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶色谱法纯化(乙酸乙酯环己烷铈显色剂中的梯度)得到所期望产物(4.60g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ5.33(t,1H),4.93-5.01(m,2H),4.70(d,1H),4.44(d,1H),3.67(s,1H),3.64(s,3H),2.02(s,3H),1.94-2.01(m,6H).
步骤14：甲基(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤13的产物(496mg，1.45mmol)在DMF(7.3mL)中的溶液中依次添加来自步骤6的产物(730mg，0.966mmol)、DIPEA(738μL，4.47mmol)、碘化亚铜(18.4mg，96.6mmol)和二氯代-双-(三苯基膦)钯(II)(67.8mg，96.6mmol)。将溶液用氩气冲洗并在室温搅拌16小时。用水(100mL)稀释后，水层用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。将合并的有机层用水(2x200mL)和饱和氯化铵水溶液(2x200mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)得到所期望产物(782mg)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.09(s,1H).8.20(d,1H),7.89(d,2H),7.70-7.78(m,3H),7.55(d,1H),7.32-7.46(m,4H),7.27-7.32(m,2H),5.41(t,1H),4.96-5.14(m,3H),4.67(s,2H),4.51(d,1H),4.36-4.44(m,1H),4.16-4.32(m,3H),3.88-3.95(m,1H),3.64(s,3H),1.94-2.07(m,10H),1.30(d,3H),0.84-0.93(m,15H),0.08(s,6H).
步骤15：甲基(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯
将来自步骤14的产物(750mg，0.773mmol)在THF(15mL)中的溶液用氩气冲洗，用干燥的5％碳载铂(75mg，50％w/w)处理，依次用氩气和H2冲洗，并在室温在H2气氛(1atm)下搅拌16h。将该反应混合物通过垫过滤，用THF清洗，并浓缩至干。完整顺序(包括添加干铂5％碳载(75mg，50％w/w)，在H2气氛(1atm)在室温处理16h，并通过垫过滤)再进行4次。将粗产物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)纯化，得到所期望产物(470g)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.90(s,1H),8.16(d,1H),7.89(d,2H),7.70-7.78(m,2H),7.37-7.49(m,4H),7.27-7.32(m,3H),7.23(d,1H),5.29(t,1H),4.95(t,1H),4.78(t,1H),4.60(s,2H),4.34-4.44(m,2H),4.16-4.32(m,3H),3.88-3.95(m,1H),3.72-3.79(m,1H),3.64(s,3H),2.69-2.78(m,1H),2.50-2.60(m,1H),1.92-2.03(m,10H),1.55-1.75(m,2H),1.30(d,3H),0.84-0.93(m,15H),0.05(s,6H).
步骤16：甲基(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤15的产物(470mg，0.483mmol)在THF(540μL)和水(540μL)中的溶液中添加乙酸(1.6mL，28.28mmol)。将溶液在室温搅拌16小时并用水(100mL)稀释。水层用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。将合并的有机层用水(2x200mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并通过硅胶色谱法(乙酸乙酯在环己烷中的梯度)得到所期望产物(354mg)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.87(s,1H),8.16(d,1H),7.89(d,2H),7.70-7.78(m,2H),7.37-7.50(m,4H),7.27-7.37(m,3H),7.25(d,1H),5.29(t,1H),4.91-4.98(m,2H),4.78(t,1H),4.34-4.44(m,4H),4.16-4.32(m,3H),3.88-3.95(m,1H),3.72-3.79(m,1H),3.64(s,3H),2.64-2.73(m,1H),2.50-2.60(m,1H),1.92-2.03(m,10H),1.69-1.79(m,1H),1.52-1.65(m,1H),1.30(d,3H),0.84-0.93(m,6H).
步骤17：甲基(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸酯
向来自步骤16的产物(310mg，0.361mmol)在THF(7.75mL)中的溶液中依次添加吡啶(146μL，1.80mmol)和4-硝基苯基氯代碳酸酯(182mg，0.901mmol)。将悬浮液在室温搅拌16h，浓缩，并通过硅胶色谱法(梯度为乙酸乙酯的二氯甲烷溶液)纯化，得到所期望产物(257mg)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.04(s,1H),8.31(d,2H),8.20(d,1H),7.89(d,2H),7.66-7.78(m,2H),7.56(d,2H),7.28-7.52(m,8H),5.31(t,1H),5.25(s,2H),4.96(t,1H),4.79(t,1H),4.40(d,2H),4.16-4.32(m,3H),3.88-3.95(m,1H),3.74-3.83(m,1H),3.61(s,3H),2.74-2.84(m,1H),2.60-2.71(m,1H),1.90-2.03(m,10H),1.72-1.83(m,1H),1.58-1.71(m,1H),1.30(d,3H),0.82-0.94(m,6H).LC-MS:MS(ESI)m/z[M+Na]+＝1047.6.
步骤18：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-[甲基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[2-[(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-甲氧基羰基-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]甲氧基羰基]氨基]丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
向来自步骤17的产物(130mg，127μmol)在DMF(1.5mL)中的溶液中依次添加2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[2-氟代-4-[3-(甲基氨基)丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸(P7)(101mg，168μmol)在DMF(1.5mL)中的溶液和DIPEA(83μL，502μmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用NH4HCO3方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望产物(80mg)。
步骤19：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-[甲基-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
向来自步骤18的产物(80mg，62.4μmol)在DMF(2.0mL)的溶液中添加在水(500μL)中的氢氧化锂一水合物(31.5mg，750μmol)。将反应混合物在室温搅拌2h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用NH4HCO3方法，使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望产物(25mg)。
步骤20：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[2-氟-4-[3-[甲基-[[2-[2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]乙基]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]丙-1-炔基]苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
向来自步骤19的产物(25mg，21.9μmol)在DMF(1mL)中的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(11.1mg，32.9μmol)和DIPEA(5.4μL，32.9μmol)。将溶液在室温搅拌1h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望产物(5mg)。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1336.4453(δ＝0.3ppm).
L108A-P2的制备：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]氧基-3-[3-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]丙酰基氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
步骤1：乙基2-[(6-氯-5-甲基-哒嗪-3-基)-甲基-氨基]-5-(3-氯丙基)噻唑-4-甲酸酯
将乙基5-(3-氯代丙基)-2-(甲基氨基)噻唑-4-甲酸酯(来自制备3e_01，15.44g，58.5mmol)在THF(600mL)中的溶液冷却至0℃并在0℃经0.5h时间分批添加NaH(60％，在油中)(2.8g，70.6mmol)。将悬浮液在0℃下搅拌0.5h。然后在0℃向该悬浮液滴加3,6-二氯-4-甲基-哒嗪(23.0g，141mmol)在THF(200mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌15h，冷却至0℃，然后缓慢加入水(25mL)。将水层用AcOEt萃取3次，有机层经MgSO4干燥。通过硅胶色谱法(AcOEt在石油醚中的梯度)纯化粗产物，得到所期望产物(7.0g，18.0μmol)。IR:(νcm-1)3450,1698,1203.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 7.81(s,1H),4.3(quad,2H),3.78(s,3H),3.31(t,2H),3.2(m,2H),2.4(s,3H),2.12(quint,2H),1.31(t,3H).
步骤2：乙基2-[(6-氯-5-甲基-哒嗪-3-基)-甲基-氨基]-5-(3-碘丙基)噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤1的产物(7.0g，18.0mmol)在丙酮(120mL)中的溶液中添加碘化钠(27g，178mmol)并将悬浮液加热回流(60℃)15h。在将反应混合物冷却至室温后，过滤沉淀物，用丙酮清洗并将滤液蒸发至干。将所得黄色固体用乙醚研磨，过滤并在五氧化二磷(P2O5)上于35℃干燥48h，得到所期望产物(7.6g，15.8mmol)，呈棕色固体。IR:(νcm-1)1703,1591.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 7.82(df,1H),7.28(dd,1H),7.2(dd,1H),7.13(t,1H),4.26(q,2H),4.12(t,2H),3.77(s,3H),3.41(s,2H),3.26(t,2H),2.42(s,3H),2.22(s,6H),2.11(m,2H),1.29(t,3H).
步骤3：乙基2-[(6-氯-5-甲基-哒嗪-3-基)-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤2的产物(3.5g，7.28mmol)在THF(400mL)中的溶液中依次添加4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟代-苯酚(来自制备6b_01，1.74g，8.74mmol)在THF(100mL)和碳酸铯(Cs2CO3)(4.73g，8.74mmol)中的溶液。将反应混合物在回流(70℃)下加热15h。将反应混合物冷却至室温，倒入水(100mL)中并用AcOEt萃取3次。将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并蒸发至干。将粗产物通过硅胶色谱法(甲醇在DCM中的梯度)纯化，得到所期望产物(2.40g，4.39mmol)。IR:(νcm-1)1698,1H NMR(400/500MHz,dmso-d6)δppm 7.8(s,1H),4.3(quad,2H),3.8(s,3H),3.7(t,2H),3.2(m,2H),2.4(s,3H),2.1(quint,2H),1.3(t,3H).
步骤4：乙基2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-(二甲基氨基)丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸酯
向来自步骤3的产物(961mg，1.76mmol)和1,3-苯并噻唑-2-胺(317mg，2.11mmol)在NMP(10mL)中的氩气饱和溶液中依次添加4,5-二(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)(509mg，0.88mmol)和三(二苄基亚丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3)(12.9mg，0.044mmol)。将反应混合物再次用氩气饱和15min，添加DIEPA(1mL，5.28mmol)并将反应混合物在150℃下搅拌15h。将反应混合物冷却至室温，加入水，并将水相用DCM萃取数次。收集有机相，用盐水洗涤，用MgSO4干燥并蒸发至干。将粗产物通过硅胶色谱法(甲醇在DCM中的梯度)纯化，得到所期望化合物(540mg，0.818mmol)。IR:(νcm-1)3700-2300,1706.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 11.55(m,1H),7.91(d,1H),7.68(s,1H),7.53(d,1H),7.39(m,1H),7.3(dd,1H),7.26-7.13(m,3H),4.26(q,2H),4.15(t,2H),3.77(s,3H),3.4(s,2H),3.27(m,2H),2.46(s,3H),2.21(s,6H).
步骤5：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[3-[3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)丙酰基氨基]-4-[(2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-甲氧基羰基-四氢吡喃-2-基]氧基-苯基]甲基]-二甲基-铵
向来自步骤4的产物(75mg，0.119mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(40μL，0.237mmol)和甲基(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[4-(溴甲基)-2-[3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)丙醇基氨基]苯氧基]四氢吡喃-2-甲酸酯(WO2017096311A1，128mg，0.158mmol)，并在室温将该反应物搅拌2h。使用C18反相制备型HPLC通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法纯化粗产物以得到该期望的化合物(88mg，51％产率)。1HNMR(400MHz,dmso-d6)δppm 8.9/8.2/7.35(2s+m,3H),7.9-7.2(m,11H),7.88(d,2H),7.68(d,2H),7.4/7.3(2t,4H),5.7(d,1H),5.52(t,1H),5.21(t,1H),5.1(t,1H),4.78(d,1H),4.52/4.4(2s,4H),4.3-4.15(m,7H),3.78(s,3H),3.62(s,3H),3.3(m,4H),3.08(s,6H),2.55(m,2H),2.48(s,3H),2.15(m,2H),2.01(3s,9H),1.3(t,3H).LCMS m/z＝660.
步骤6：[3-(3-氨基丙酰基氨基)-4-[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]氧基-苯基]甲基-[3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基]-二甲基-铵
向步骤5的产物(85mg，0.06mmol)在MeOH(4mL)中的溶液中添加LiOH二水合物(64mg，1.53mmol)并在室温将该反应物搅拌5h。将粗产物通过使用NH3/MeOH 7N作为洗脱剂纯化以得到期望的化合物(55mg，91％产率)。
步骤7：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-基]氧基-3-[3-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]丙酰基氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
向步骤6的产物(50mg，0.05mmol)在DMF(6mL)中的溶液中依次添加DIPEA(30μL，0.179mmol)和(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(28mg，0.09mmol)。将溶液在室温搅拌1.5h。通过将反应混合物直接沉积在柱上并使用TFA方法使用C18反相制备型HPLC纯化粗产物，得到所期望产物(15mg，20％产率)。1HNMR(400MHz,dmso-d6)δppm 8.4(br s,1H),7.9(m,1H),7.7(br s,1H),7.6(dd,1H),7.5(dl,1H),7.45(dl,1H),7.4(td,1H),7.25(m,3H),7.2(t,1H),7(s,2H),5(d,1H),4.55/4.4(2br s,4H),4.2(t,2H),4(d,1H),3.8(s,3H),3.55(2t,4H),3.45(m,2H),3.45/3.4(2m,3H),3.35(m,2H),3.3(t,2H),3.1(br s,6H),2.6(t,2H),2.45(s,3H),2.15(t,2H),2.15(quint,2H).19F NMR(400MHz,dmso-d6)δppm-133.8.HRMS(ESI)[M-CF3CO2]+发现值＝1195.3690(δ＝2.5ppm)
制备L107C-P7：2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
产物根据方法G通过替换2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸用3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸而合成。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 12.55(br s,1H),11.5-10.8(diffus,1H),9.92(s,1H),8.16(d,1H),7.99(t,1H),7.9(diffus,1H),7.86(d,1H),7.67(br s,1H),7.64(diffus,1H),7.58(d,2H),7.38/7.2(2m,3H),7.35(m,1H),7.32(d,2H),7.15(t,1H),7(s,2H),5.03(s,2H),4.39(quint,1H),4.28(s,2H),4.2(dd,1H),4.15(t,2H),3.77(s,3H),3.59(t,4H),3.5(m,44H),3.36(t,2H),3.28(t,2H),3.14(quad,2H),2.9(s,3H),2.49(s,3H),2.45/2.33(2t,4H),2.13(quint,2H),1.96(oct,1H),1.3(d,3H),0.87/0.83(2d,6H).HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1 687.7071(δ＝0).
制备L107A-P2：3-[4-[3-[2-[[6-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-5-甲基-哒嗪-3-基]-甲基-氨基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A获得期望的产物。(2S)-2-氨基-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺和(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙醇基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯被用于步骤1，P2在步骤3中用作合适的有效负载。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.2(s),8.23(d),7.99(t),7.89(large,1H),7.85(d),7.76(d,2H),7.67(s,1H),7.56(d,1H),7.5(d,2H),7.4(t,1H),7.38(m,2H),7.24(t,1H),7.2(t,1H),6.99(s,2H),4.55(s,2H),4.41(s,2H),4.39(m,1H),4.2(m,1H),4.19(m,2H),3.77(s,3H),3.65-3.33(m,24H),3.59(m,2H),3.29(t,2H),3.14(quad,2H),3.05(s,6H),2.46(s,3H),2.39(m,2H),2.33(t,2H),2.15(m,2H),1.96(m,1H),1.32(d,3H),0.89/0.84(2d,6H).13C NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 134.7,134.2,126,122.9,122.2,119.8,119.7,119.4,118.3,115.5,70.4/69.2/67.2,69,66.8,58.1,53.9,49.9,49.9/40.4,39,36.4,35.4,34.6,34.6,31.1,31.1,23.6,20.1,18.2,18.1.HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1 657.7339(δ＝0.4).
制备L9C-P59：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-(3-羟基丙基)氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用方法C和P59作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1288.4656(δ＝-4.5ppm).
制备L9C-P3：2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-5-[3-[4-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-甲基-氨基]丙-1-炔基]-2-氟-苯氧基]丙基]噻唑-4-甲酸
使用方法C和P3作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1244.4473(δ＝1.7ppm).
制备L9C-P60：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[[(3S)-3,4-二羟基丁基]-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用方法C和P60作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1394.6300(δ＝-3.6ppm).
制备L9A-P61：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P61作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1316.6347(δ＝-3.8ppm).
制备L9A-P62：2-[[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-(3-羟基丙基)-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法B和P62作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1362.6748(δ＝-5.0ppm).
制备L9A-P63：3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(5-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P63作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1362.6585(δ＝-2.3ppm).
制备L9A-P64：3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[4-甲基-3-[(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P64作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1358.6809(δ＝-4.3ppm).
制备L9A-P65：3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-6-[3-[(6-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基]-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P65作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1362.6557(δ＝-4.3ppm).
制备L9A-P66：3-[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]丙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P66作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1316.6703(δ＝-4.4ppm).
制备L9A-P67：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P67作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1345.6582(δ＝-6.0ppm).
制备L9A-P68：3-[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]丙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-(3-羟基丙基)-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P68作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1360.6941(δ＝-6.0ppm).
制备L9C-P69：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[3-[[(3S)-3,4-二羟基丁基]-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用方法C和P69作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1420.6913(δ＝3.0ppm).
制备L9A-P48：2-[[(5SR,7RS)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-(羧基甲基)-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P48作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1362.6399(δ＝-3.9ppm).
制备L9A-P70：2-[[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-(2-羧基乙基)-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P70作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1376.6548(δ＝-4.4ppm).
制备L9C-P71：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[2-羧基乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用方法C和P71作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1406.6280(δ＝-5.0ppm).
制备L9C-P72：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-(4-羟基丁基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用方法C和P72作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+计算值＝1404.6927
制备L9A-P49：3-[(5SR,7RS)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]丙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-(2-羟基乙基)-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P49作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1346.6794(δ＝-5.4ppm).
制备L9C-P51：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[3-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基-(3-甲氧基丙基)氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用方法C和P51作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1404.6889(δ＝-2.3ppm).
制备L9A-P50：3-[(5SR,7RS)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]丙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-(3-甲氧基丙基)-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P50作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1374.7111(δ＝-5.0ppm).
制备L9A-P52：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5RS,7SR)-3-[3-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]氮杂环庚烷-1-鎓-1-基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P52作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1370.7281(δ＝3.7ppm).
制备L9C-P53：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[3-[羧基甲基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用方法C和P53作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1390.6301(δ＝-7.2ppm).
制备L9A-P55：3-[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]丙基-(羧基甲基)-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P55作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1360.6561(δ＝-7.2ppm).
制备L9C-P54：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[3-[2-羧基乙基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]丙基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用方法C和P54作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1404.6464(δ＝-6.7ppm).
制备L9C-P47：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[(5SR,7RS)-3-[2-[羧基甲基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲氧基羰基]氨基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸
使用方法C和P47作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M+H]+发现值＝1392.6186(δ＝-0.6ppm).
制备L9A-P56：3-[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]丙基-(2-羧基乙基)-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P56作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1374.6740(δ＝-5.5ppm).
制备L9A-P58：3-[(5RS,7SR)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]丙基-(3-羧基丙基)-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P58作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1388.6891(δ＝-5.9ppm).
制备L9A-P57：2-[[(5SR,7RS)-3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-羧基-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基-(3-羧基丙基)-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法A和P57作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1390.6692(δ＝-5.3ppm).
L9A-P73的制备：(2S)-N-[4-[[1-[2-[[3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-(羟基甲基)-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基]吡咯烷-1-鎓-1-基]甲基]苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法B和P73作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1330.6754(δ＝-12.3ppm).
L9A-P74的制备：(2S)-N-[4-[[1-[2-[[3-[[4-[6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-2-(吡咯烷-1-羰基)-3-吡啶基]-5-甲基-吡唑-1-基]甲基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]氧基]乙基]吡咯烷-1-鎓-1-基]甲基]苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法B和P74作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1397.7343(δ＝0.2ppm).
制备L9A-P75：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]-N-异丙基-吡啶-2-甲酰胺；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法B和P75作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1385.7328(δ＝-0.8ppm).
制备L9A-P76：6-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-3-[1-[[3-[2-[1-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙氧基]-5,7-二甲基-1-金刚烷基]甲基]-5-甲基-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酰胺；2,2,2-三氟乙酸酯
使用方法B和P76作为适当的负载，获得了所期望的产物。HRMS(ESI)[M]+发现值＝1343.6874(δ＝0.3ppm).
制备L112A-P1：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
步骤A：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(羟基甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]氨基甲酰基]-4-脲基-丁基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯
根据WO2020/236817A2中所述的实验程序合成标题化合物，使用2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醇作为起始物料制备L26-P1。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.88(s,1H),8.07(d,1H),7.89(d,2H),7.72-7.76(m,2H),7.37-7.45(m,5H),7.30-7.34(m,2H),7.25(d,1H),5.95(t,1H),5.38(s,2H),4.95(t,1H),4.45(d,2H),4.38-4.42(m,1H),4.20-4.32(m,3H),3.90-3.94(m,1H),3.45-3.55(m,94H),3.38-3.43(m,4H),3.23(s,3H),2.89-3.03(m,2H),2.56-2.62(m,2H),1.94-2.04(m,1H),1.54-1.76(m,4H),1.29-1.49(m,2H),0.84-0.89(m,6H).UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M/2+Na]+发现值＝888.
步骤B：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(氯甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]氨基甲酰基]-4-脲基-丁基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯
每10min向在THF(0.7ml)中的来自步骤A的产物(50mg，0.0288mmol)中添加当量的硫酰氯(0.35M溶液，在THF中)，直到观察不到起始物料。浓缩混合物，粗产物不经进一步纯化用于下一步。
步骤C：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(碘甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]氨基甲酰基]-4-脲基-丁基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸酯
步骤B的产物(44mg，0.025mmol)和碘化钠(2当量)在丁烷-2-酮(30mL/mmol)中的混合物搅拌5h后，将反应浓缩并且粗产物不经进一步纯化用于下一步骤。
步骤D：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基]-二甲基-铵
搅拌负载P1(15mg，0.023mmol)、步骤C的产物(46.18mg，0.025mmol)和DIPEA(5当量)在DMF(0.7mL)的混合物44h后，将粗产物浓缩并用于下一步而无需进一步纯化。
步骤E：[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基-[3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基]-二甲基-铵
步骤D的产物(54mg，0.023mmol)和N-乙基乙胺(10当量)在DMF(0.7mL)中的混合物搅拌1h后，粗产物通过制备型HPLC纯化，得到所期望化合物(22mg)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[(M+2)/2]发现值＝1075.
步骤F：3-[4-[3-[2-[3-(1,3-苯并噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢-5H-吡啶并[2,3-c]哒嗪-8-基]-4-羧基-噻唑-5-基]丙氧基]-3-氟-苯基]丙-2-炔基-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸酯
将来自步骤E的产物(22mg，0.0097mmol)、DIEA(2当量)和(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(1.1当量)在DMF(0.3mL)的混合物搅拌15h后，将粗产物使用制备型HPLC及使用TFA方法纯化以得到L112A-P1(5.5mg)。HR-ESI+:m/z[M-CF3COO]+发现值＝2344.
实施例4.另外的接头、接头-负载及其前体的合成和表征。
使用本实施例中描述的示例性方法合成示例性接头、接头-负载及其前体。
合成2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸
在室温向2-甲基-4-硝基苯甲酸(300g，1.5371mol)在CCl4(3000mL)中的搅拌溶液中添加NBS(300.93g，1.6908mol)和AIBN(37.86g，0.2305mol)。将反应混合物在80℃下搅拌16h。通过TLC分析监测反应混合物。将反应混合物用饱和NaHCO3溶液(2L)稀释并用乙酸乙酯(2x2L)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将粗化合物通过硅胶柱色谱法使用在石油醚中的2-3％的乙酸乙酯作为洗脱剂纯化，并获得2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.35(d,J＝2.0Hz,1H),8.20(q,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.12(d,J＝8.8Hz,1H),4.97(s,2H),4.00(s,3H).
合成4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸
在室温向2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸(250g，0.9122mol)在MeCN(5000mL)中的混合物中添加丙-2-炔-1-醇(255.68g，265.50mL，4.5609mol，d＝0.963g/mL)和Cs2CO3(743.03g，2.2805mol)。将所得混合物加热至80℃ 16h。通过用乙酸乙酯(2L)洗涤的硅藻土垫过滤反应混合物。将滤液在减压下浓缩。将获得的粗化合物添加饱和NaHCO3溶液(1L)并且将水层通过使用2N HCl(2L)酸化至pH 2。在过滤真空干燥后，得到4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸。1H NMR(400MHz,DMSO):δ13.61(brs,1H),8.37(d,J＝2.4Hz,1H),8.23(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),8.10(d,J＝8.8Hz,1H),4.95(s,2H),4.37(d,J＝2.4Hz,2H),3.52(t,J＝2.4Hz,1H)
合成甲基4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸酯
在0℃向4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸(130g，0.5527mol)在MeOH(1300mL)中的搅拌溶液中缓慢添加SOCl2(526.08g，320.78mL，4.4219mol，d＝1.64g/mL)。在70℃将该反应物搅拌4h。在减压下蒸发反应溶剂。将获得的残余物溶解在乙酸乙酯(1000mL)中并用饱和NaHCO3(600mL)、水(500mL)和盐水溶液(500mL)洗涤。将分离的有机层经硫酸钠干燥、过滤并减压蒸发，以出产甲基4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸酯。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.56(t,J＝0.8Hz,1H),8.18–8.09(m,2H),5.03(s,2H),4.35(d,J＝2.4Hz,2H),3.96(s,3H),2.49(t,J＝2.4Hz,1H).合成甲基4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸酯
在室温向甲基4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸酯(110g，0.4414mol)在EtOH(1100mL)和H2O(550mL)混合物中的溶液中添加铁粉(197.21g，3.5310mol)和NH4Cl(188.88g，3.5310mol)。将所得混合物在80℃加热16h。将反应混合物冷却至室温并通过过滤并用乙酸乙酯(2L)洗涤。减压浓缩滤液至体积的一半。向残余物中添加乙酸乙酯(1.5L)并分离为两层，且用乙酸乙酯(2L)萃取水层。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并减压浓缩以获得粗产物。通过纯化SiO2柱色谱法(15-20％的乙酸乙酯，在石油醚中)产出甲基4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸酯。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.67(d,J＝8.8Hz,1H),6.78(t,J＝1.6Hz,1H),6.48(q,J＝8.4,2.4Hz,1H),4.79(s,2H),4.25(d,J＝2.4Hz,2H),3.70(d,J＝4.0Hz,3H),3.42(t,J＝2.4Hz,1H).
合成(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇
在0℃向在THF(1000mL)中的搅拌溶液中缓慢添加LiAlH4(1M，在THF中)(21.23g，798.2mmol，798.2mL)。在0℃将甲基4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸酯(70g，319.3mmol)在THF(800mL)中的溶液缓慢添加。在室温将该反应物搅拌4h。将该反应混合物冷却至0℃，然后非常缓慢地添加水(22mL)然后是添加20％ NaOH(22mL)和水(66mL)。将反应混合物在0℃搅拌30min。添加无水硫酸钠以吸收过量的水。通过过滤混合物。将滤饼用乙酸乙酯(1000mL)和10％MeOH/DCM(500mL)洗涤。将滤液在减压下浓缩。将所得粗化合物通过SiO2柱色谱法(在石油醚中的35-40％的乙酸乙酯，作为洗脱剂)纯化以得到(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.98(d,J＝8.0Hz,1H),6.56(d,J＝2.4Hz,1H),6.43(dd,J＝2.4,8.0Hz,1H),4.98(s,2H),4.64(t,J＝5.2Hz,1H),4.47(s,2H),4.34(d,J＝5.6Hz,2H),4.15(d,J＝2.4Hz,2H),3.46(t,J＝2.4Hz,1H).
合成(9H-芴-9-基)甲基(S)-(1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸酯
向(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇(1.92g，10.04mmol，1.0当量)、(9H-芴-9-基)甲基(S)-(1-氨基-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸酯(3.99g，10.04mmol，1.0当量)和(1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(4.20g，11.04mmol，1.1当量)在DMF(10mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙基胺(2.62mL，15.06mmol，1.5当量)。在环境温度搅拌1小时后，将混合物倒入水(200mL)中。将所得固体过滤，用水冲洗，并在真空下干燥，并获得(9H-芴-9-基)甲基(S)-(1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝571.5；Rt＝0.93min(2min酸性方法).
合成(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺
向(9H-芴-9-基)甲基(S)-(1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸酯(6.08g，10.65mmol，1.0当量)中添加二甲基胺(2M，在THF中，21.31mL，42.62mmol，4当量)。在环境温度搅拌1.5小时后，从已形成的胶状残留物中倾析出上清液。将残余物用乙醚(3x50mL)研磨，过滤所得固体，用乙醚洗涤，真空干燥。获得(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺。LCMS:MH+349.3；Rt＝0.42min(2min酸性方法).
合成叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
向(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(3.50g，10.04mmol，1.0当量)、(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(2.62g，12.05mmol，1.2当量)和(1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(4.58g，12.05mmol，1.2当量)在DMF(10mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙基胺(3.50mL，20.08mmol，2.0当量)。在环境温度搅拌2小时后，将混合物倒入水(200mL)中，并将所得悬浮液用EtOAc(3x100 mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并在真空下浓缩。通过ISCOSiO2色谱法(0-20％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.00(s,1H),7.96(d,J＝7.7Hz,1H),7.55(dq,J＝4.9,2.2Hz,2H,aryl),7.32(d,J＝8.9Hz,1H,aryl),6.76(d,J＝8.9Hz,1H),5.95(t,J＝5.8Hz,1H),5.38(s,2H),5.01(t,J＝5.5Hz,1H),4.54(s,2H),4.45(dd,J＝25.2,5.3Hz,3H),4.20(d,J＝2.4Hz,2H),3.83(dd,J＝8.9,6.7Hz,1H),3.49(t,J＝2.4Hz,1H),2.97(dh,J＝26.0,6.5Hz,2H),1.96(h,J＝6.6Hz,1H),1.74-1.50(m,2H),1.39(m,11H),0.84(dd,J＝16.2,6.7Hz,6H).LCMS:M+Na 570.5；Rt＝0.79min(2min酸性方法).
合成叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
在0℃向叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(2.00克，3.65mmol，1.0当量)在乙腈(13.3mL)中的溶液添加硫酰氯(0.53mL，7.30mmol，2.0当量)。在冰浴中搅拌一小时后，将溶液用水(40mL)稀释，通过过滤、风干和在高真空下干燥收集所得白色沉淀物，以出产叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(氯代甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯。LCMS:M+Na 588.5；Rt＝2.17min(5min酸性方法).
合成2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸
向6-硝基异苯并呋喃-1(3H)-酮(90g，502.43mmol，1.00当量)在MeOH(1000mL)中的溶液中添加在H2O(150mL)中的KOH(28.19g，502.43mmol，1.00当量)。将棕色混合物在25℃下搅拌1.5h。在减压下浓缩棕色混合物得到残余物并溶解在DCM(2000mL)中。向该混合物中添加叔丁基二苯基氯代硅烷(296.91g，1.08mol，277.49mL，2.15当量)和咪唑(171.03g，2.51mol，5.00当量)并在25℃搅拌12h。在减压下将混合物浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝1/0，1/1)纯化，并获得2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸，呈白色固体。1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 1.13(s,9H)5.26(s,2H)7.34-7.48(m,6H)7.68(br d,J＝8Hz,4H)8.24(br d,J＝8Hz,1H)8.46(br d,J＝8Hz,1H)8.74(s,1H).
合成(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇
向2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸(41g，94.14mmol，1当量)在THF(205mL)的混合物中添加BH3。THF(1M，470.68mL，5当量)。将黄色混合物在60℃下搅拌2h。向混合物中加入MeOH(400mL)，减压浓缩得到残余物。然后加入H2O(200mL)和DCM(300mL)，DCM(3×200mL)萃取，盐水(300mL)洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，减压浓缩得到残余物。通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝1/0、1/1)纯化残余物。获得(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇，呈白色固体。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm1.10(s,9H)4.58(s,2H)4.89(s,2H)7.32-7.51(m,6H)7.68(dd,J＝8,1.38Hz,4H)7.76(d,J＝8Hz,1H)8.15(dd,J＝8 2.26Hz,1H)8.30(d,J＝2Hz,1H).
合成2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛
向(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇(34g，80.65mmol，1当量)在DCM(450mL)中的溶液中添加MnO2(56.09g，645.22mmol，8当量)。将黑色混合物在25℃搅拌36h。向混合物中加入MeOH(400mL)，减压浓缩得到残余物。然后加入H2O(200mL)和DCM(300mL)，DCM(3×200mL)萃取，盐水(300mL)洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，减压浓缩得到残余物。通过硅胶色谱法(CH2Cl2＝100％)纯化残余物。获得2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛，呈白色固体。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.14(s,9H)5.26(s,2H)7.34-7.53(m,6H)7.60-7.73(m,4H)8.13(d,J＝8Hz,1H)8.48(dd,J＝8,2.51Hz,1H)8.67(d,J＝2Hz,1H)10.16(s,1H).
合成N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)丙-2-炔-1-胺
向2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛(12.6g，30.03mmol，1当量)在DCM(130mL)中的溶液中添加丙-2-炔-1-胺(4.14g，75.08mmol，4.81mL，2.5当量)和MgSO4(36.15g，300.33mmol，10当量)，然后在25℃将该悬浮混合物搅拌24小时。取少量反应液，用NaBH4处理，TLC显示有1个新斑点形成。将反应混合物过滤并且减压浓缩以给出残余物。获得(E)-N-[[2-[[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]甲基]丙-2-炔-1-亚胺，呈黄色固体。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.11(s,9H)2.48(t,J＝2.38Hz,1H)4.52(t,J＝2.13Hz,2H)5.09(s,2H)7.35-7.49(m,6H)7.63-7.72(m,4H)7.79(d,J＝8.53Hz,1H)8.25(dd,J＝8.53,2.51Hz,1H)8.68(d,J＝2.26Hz,1H)8.84(t,J＝1.88Hz,1H).
(E)-N-[[2-[[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]甲基]丙-2-炔-1-亚胺(12g，26.28mmol，1当量)溶解在MeOH(100mL)和THF(50mL)中，然后添加在NaBH4(1.49g，39.42mmol，1.5当量)并在-20℃搅拌黄色混合物2小时。LCMS显示检测到所期望化合物。通过在-20℃下加入MeOH(200mL)来淬灭反应混合物，然后减压浓缩得到残余物。将残余物用EtOAc(500mL)溶解，用盐水(150mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(洗脱剂为0-10％乙酸乙酯/石油醚梯度)。获得N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)丙-2-炔-1-胺，呈淡黄色油状物。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.12(s,9H)2.13(t,J＝2.38Hz,1H)3.33(d,J＝2.51Hz,2H)3.80(s,2H)4.93(s,2H)7.36-7.49(m,6H)7.69(dd,J＝7.91,1.38Hz,4H)7.77(d,J＝8.53Hz,1H)8.16(dd,J＝8.41,2.38Hz,1H)8.24(d,J＝2.26Hz,1H).
合成(9H-芴-9-基)甲基(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)丙-2-炔-1-胺(9g，19.62mmol，1当量)和Fmoc-OSu(7.28g，21.59mmol，1.1当量)在二噁烷(90mL)中的溶液中添加饱和NaHCO3(90mL)，并在20℃将白色悬浮液搅拌12h。将该反应混合物用H2O(150mL)稀释并用EtOAc萃取(150mL x 2)。将合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(洗脱剂为0-30％乙酸乙酯/石油醚)。获得(9H-芴-9-基)甲基(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(7.7g，11.08mmol，56.48％产率，98％纯度)，呈白色固体。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.12(s,9H)2.17(br d,J＝14.31Hz,1H)3.87-4.97(m,9H)6.98-8.28(m,21H).
合成(9H-芴-9-基)甲基(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向(9H-芴-9-基)甲基(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(5.0g，7.34mmol，1.0当量)在10％ AcOH/CH2Cl2(100mL)的冰浴冷却溶液中添加Zn(7.20g，110mmol，15当量)。移除冰浴，并将所得混合物搅拌2小时，此时通过垫过滤。在真空中将挥发物去除并将残余物溶解在EtOAc中，用NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)清洗，经MgSO4干燥、过滤、浓缩并在ISCO SiO2色谱法(0-75％ EtOAc/庚烷)后，获得(9H-芴-9-基)甲基(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝651.6；Rt＝3.77min(5min酸性方法).
合成(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向在CH2Cl2(40mL)中的(9H-芴-9-基)甲基(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(2.99g，4.59mmol，1.0当量)和(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(1.72g，4.59mmol，1.0当量)中添加乙基2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸酯(2.27g，9.18mmol，2.0当量)。搅拌10min后，添加MeOH(1mL)，溶液变得均匀。将该反应物搅拌16h，在真空中将挥发物去除并在通过ISCO SiO2色谱法(0-15％ MeOH/CH2Cl2)纯化后，获得(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝1008.8；Rt＝3.77min(5min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(1.60g，1.588mmol，1.0当量)中添加在MeOH(30mL，60mmol，37当量)和THF(10mL)中的2M二甲基胺。静置3h后，真空除去挥发物，将残余物与Et2O一起研磨以除去FMOC脱保护副产物。向所得固体中添加CH2Cl2(16mL)和吡啶(4mL)并向该非均相溶液中添加炔丙基氯甲酸酯(155μL，1.588mmol，1.0当量)。搅拌30分钟后，加入另外的氯甲酸炔丙酯(155μL，1.588mmol，1.0当量)。再搅拌20min后，添加MeOH(1mL)以淬灭剩余的氯甲酸酯，并真空除去挥发物。通过ISCO SiO2色谱法(0-15％ MeOH/CH2Cl2)纯化后，获得丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝867.8；Rt＝3.40min(5min酸性方法).合成丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(984mg，1.135mmol，1.0当量)在THF(7.5mL)中的溶液中添加1.0M在THF(2.27mL，2.27mmol，2.0当量)中的TBAF。在静置6h后，在真空中将挥发物去除，将残余物通过ISCOSiO2色谱法(0-40％ MeOH/CH2Cl2)纯化并获得丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝629.6；Rt＝1.74min(5min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向在CH2Cl2(10mL)中的丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(205mg，0.326mmol，1.0当量)中添加吡啶(158μL，1.96mmol，5当量)。将异质混合物在0℃冰浴和亚硫酰氯(71μL,0.98mmol，3当量)中冷却。在冰浴中搅拌3小时后，将该反应物通过ISCO SiO2色谱法(0-30％ MeOH/CH2Cl2)直接纯化并获得丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯代甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝647.6；Rt＝2.54min(5min酸性方法).合成2-(羟基甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺
在25℃向6-硝基异苯并呋喃-1(3H)-酮(500g，2.79mol)在MeOH(1500mL)中的搅拌悬浮液中添加MeNH2(3.00kg，29.94mol，600mL，31.0％纯度)并搅拌1h。将固体过滤并用水清洗两次(600mL)并在高真空下干燥以获得残余物。获得产物2-(羟基甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺，呈白色固体。LCMS:Rt＝0.537min,MS m/z＝193.2.1H NMR:400MHz DMSOδ8.57(br d,J＝4.4Hz,1H),8.31(dd,J＝2.4,8.6Hz,1H),8.21(d,J＝2.4Hz,1H),7.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.54(t,J＝5.6Hz,1H),4.72(d,J＝5.5Hz,2H),2.78(d,J＝4.4Hz,3H).
合成(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇
将2-(羟基甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺(560g，2.66mol)在THF(5000mL)中的溶液冷却至0℃，然后向其逐滴添加BH3-Me2S(506g，6.66mol)(2.0M，在THF中)60min并加热至70℃ 5h。LCMS显示起始材料被消耗。完成后，将甲醇中的4M HCl(1200mL)在0℃添加到反应混合物中，并在65℃加热8h。将反应混合物冷却至0℃，过滤固体并减压浓缩。获得产物(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇(520g)，呈白色固体。LCMS:Rt＝0.742min,MS m/z＝197.1[M+H]+.1H NMR:400MHz DMSOδ9.25(br s,2H),8.37(d,J＝2.4Hz,1H),8.14(dd,J＝2.4,8.5Hz,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),5.72(br s,1H),4.65(s,2H),4.15(br s,2H),2.55-2.45(m,3H)
合成1-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺
将(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇(520g，2.65mol)和咪唑(721g，10.6mol)在DCM(2600mL)中的溶液冷却至0℃，向其逐滴添加TBDPS-CL(1.09kg，3.98mol，1.02L)并搅拌2h。将混合物倒入冰水中(1000mL)并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发得到粗产物。将粗产物通过硅胶色谱纯化，用乙酸乙酯:石油醚(从10/1到1)洗脱得到残余物。获得产物1-(2-(((叔-丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺，呈黄色液体。LCMS:产物：Rt＝0.910min,MS m/z＝435.2[M+H]+.1H NMR:400MHz CDCl3δ8.23(d,J＝2.4Hz,1H),8.15(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.71-7.66(m,4H),7.50-7.37(m,6H),4.88(s,2H),3.65(s,2H),2.39(s,3H),1.12(s,9H)
合成(9H-芴-9-基)甲基(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(甲基)氨基甲酸酯
向1-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺(400g，920.3mmol)在THF(4000mL)中的溶液中添加Fmoc-OSu(341.5g，1.01mol)和Et3N(186.2g，1.84mol，256.2mL)，在25℃将该混合物搅拌1h。将混合物倒入水(1600mL)中并用乙酸乙酯(1000mL x 2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发得到粗产物。将粗产物通过硅胶色谱纯化，用石油醚:乙酸乙酯(从1/0至1/1)洗脱以得到(9H-芴-9-基)甲基(2-(((叔-丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(甲基)氨基甲酸酯，呈白色固体。LCMS:Rt＝0.931min,MS m/z＝657.2[M+H]+.1H NMR:EW16000-26-P1A,400MHz CDCl3δ8.21-7.96(m,1H),7.87-7.68(m,3H),7.68-7.62(m,4H),7.62-7.47(m,2H),7.47-7.28(m,9H),7.26-7.05(m,2H),4.81(br s,1H),4.62-4.37(m,4H),4.31-4.19(m,1H),4.08-3.95(m,1H),2.87(br d,J＝5.2Hz,3H),1.12(s,9H).
合成(9H-芴-9-基)甲基(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
将(9H-芴-9-基)甲基(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(甲基)氨基甲酸酯(3.0g，4.57mmol，1.0当量)在MeOH(90mL)和EtOAc(30mL)中的溶液脱气并通过三通旋塞阀吹扫至N2气囊。在重复脱气/N2吹扫2x后，添加10％ Pd/CdeGussa类型(0.486g，0.457mmol，0.1当量)。将所得混合物脱气并通过三通旋塞阀吹扫至2H2气囊。重复脱气/H2吹扫2x后，将反应在H2的气囊压力下搅拌4小时。将反应脱气并吹扫至N2，通过硅藻土垫过滤，进一步用MeOH洗脱。在真空中将挥发物去除并在高真空下抽气后，获得(9H-芴-9-基)甲基(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝627.7；Rt＝1.59min(2min酸性方法).
合成(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
向在2:1CH2Cl2/MeOH(60mL)中的(9H-芴-9-基)甲基(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(2.86g，4.56mmol，1.0当量)和(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(1.71g，4.56mmol，1.0当量)中添加乙基2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸酯(2.256g，9.12mmol，2.0当量)。将均相溶液搅拌16小时，在同时添加额外的(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(0.340g，0.2当量)和乙基2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸酯(0.452g，0.4当量)以驱动反应完成。在搅拌额外的5小时后，在真空中将挥发物去除，并通过ISCO SiO2色谱法(0-5％ MeOH/CH2Cl2)纯化后，获得(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔-丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝984.1；Rt＝1.54min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
向在THF(10mL)中的(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(2.05g，2.085mmol，1.0当量)中添加2.0M在MeOH(10.42mL，20.85mmol，10当量)中的二甲胺。搅拌16小时后，真空除去挥发物。将残余物溶解于CH2Cl2(20mL)和DIEA(0.533mL，4.17mmol，2当量)并且添加氯甲酸炔丙酯(0.264mL，2.71mmol，1.3当量)。在室温搅拌16小时后，将该反应物用CH2Cl2(20mL)稀释，用NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)清洗，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过ISCO SiO2色谱法(0-15％ MeOH/CH2Cl2)纯化以产出丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝843.8；Rt＝1.35min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
向丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(1.6g，1.90mmol，1.0当量)在THF(10.0mL)中的0℃溶液中添加在THF中的1.0M TBAF(3.80mL，3.80mmol，2.0当量)。在升温至室温并搅拌16h后，在真空中将挥发物去除，将残余物溶解在EtOAc中，用NaHCO3(饱和)、用NaCl(饱和)清洗，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并将残余物通过ISCO SiO2色谱法(0-30％ MeOH/CH2Cl2)纯化以产出丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝605.7；Rt＝0.81min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
向在CH2Cl2(10mL)中的丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(350mg，0.579mmol，1.0当量)中添加吡啶(0.278mL，3.47mmol，6当量)。将异质混合物在0℃冰浴和亚硫酰氯(0.126mL，1.73mmol，3当量)中冷却。在冰浴中搅拌3h后，将该反应物通过ISCOSiO2色谱法(0-30％ MeOH/CH2Cl2)纯化并获得丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯代甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝623.7；Rt＝2.19min(5min酸性方法).合成(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
向溶解在THF(20mL)中的(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(2.6g，2.64mmol，1.0当量)中添加乙酸(0.757mL，13.22mmol，5.0当量)和在THF中的1.0M TBAF(2.91mL，2.91mmol，1.1当量)。将溶液搅拌72小时，此时在真空中除去挥发物。通过ISCO SiO2色谱法(0-30％ MeOH/CH2Cl2)纯化后，获得(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝745.5；Rt＝1.07min(2min酸性方法).
合成(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
向在THF(20mL)中的(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(1.0gram，1.342mmol)中添加NaHCO3(677mg，8.05mmol)(6当量)，然后在冰水浴中冷却至0℃，然后是缓慢添加硫酰氯(0.245mL，3.36mmol)(2.5当量)。将混合物在0℃下搅拌15min，然后在室温搅拌1h。将反应在EtOAc和NaHCO3(饱和的)之间分配，分离，用NaCl(饱和的)洗涤，用MgSO4干燥并真空除去挥发物。将残余物通过ISCO SiO2色谱法(0-30％iPrOH/CH2Cl2)纯化以产出(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯代甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯。LCMS:MH+＝763.2；Rt＝1.18min(2min酸性方法).
一般程序1
合成丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
将丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(249mg，0.412mmol)和二(4-硝基苯基)碳酸酯(356mg，1.24mmol，3.0当量)在DMF(2mL)中的溶液旋转直至均匀并静置16小时。将溶液用DMSO(6mL)稀释并通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，无改性剂)纯化。接着冻干，获得丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝770.7,Rt＝2.45min(5min酸性方法).
合成叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
向(4-氨基苯基)甲醇(450.0mg，3.65mmol)和(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(1368.0mg，3.65mmol，1.0当量)在DCM(4.0mL)中的悬浮液中添加EEDQ(2259.0mg，9.13mmol，2.5当量)。在室温将混合物搅拌16小时，之后将该反应物通过ISCO SiO2色谱法(0-30％ MeOH/CH2Cl2)纯化并获得叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝480.6,Rt＝0.75min(2min酸性方法).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.97(s,1H),7.96(d,J＝7.7Hz,1H),7.60-7.48(m,2H),7.29-7.19(m,2H),6.76(d,J＝8.9Hz,1H),5.96(t,J＝5.8Hz,1H),5.40(s,2H),5.09(t,J＝5.7Hz,1H),4.43(d,J＝5.7Hz,3H),3.83(dd,J＝8.9,6.7Hz,1H),2.98(dp,J＝30.3,6.6Hz,2H),1.95(p,J＝6.7Hz,1H),1.80-1.54(m,2H),1.38(s,11H),0.84(dd,J＝15.9,6.8Hz,6H).
合成叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
向在DCM(20.0mL)中的叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(500.0mg，1.043mmol)中添加吡啶(0.506mL，6.26mmol，6.0当量)。将异质混合物在0℃冰浴中冷却并加入亚硫酰氯(0.228mL，3.13mmol，3当量)。在冰浴中搅拌4小时后，将该混合物升温至室温15min。将该反应物通过ISCO SiO2色谱法(0-30％ MeOH/CH2Cl2)纯化，获得叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(氯代甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝498.1,Rt＝2.02min(5min酸性方法).
合成(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯
根据一般程序1用(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(100.0mg，0.134mmol)，获得(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝910.5,Rt＝1.24min(2min酸性方法).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),8.26(s,2H),8.00(d,J＝7.7Hz,1H),7.93-7.58(m,4H),7.42(td,J＝33.3,32.9,13.8Hz,9H),7.14(s,1H),6.72(d,J＝9.0Hz,1H),6.01(s,1H),5.27(d,J＝23.7Hz,2H),4.58(s,2H),4.48-4.13(m,4H),3.89-3.78(m,1H),2.92(t,J＝35.0Hz,5H),2.00-1.86(m,1H),1.54(s,3H),1.37(m,11H,incl.Boc),0.82(dd,J＝15.4,6.7Hz,6H).
合成(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
向(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(3.64g，10.45mmol)、(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酸(3.55g，10.54mmol，1.0当量)和1-((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)-1H-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(V)(3.97g，10.54mmol，1.0当量)在DMF(10.0mL)中的溶液添加DIPEA(3.64mL，20.90mmol，2.0当量)。将混合物在室温搅拌45min。用100mL水稀释，搅拌5min。将沉淀物过滤并且减压干燥。干燥后，获得(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝670.3,Rt＝0.96min(2min酸性方法).
合成(9H-芴-9-基)甲基((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
根据一般程序1用(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(200.0mg，0.299mmol)，获得(9H-芴-9-基)甲基((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝835.7,Rt＝1.19min(2min酸性方法).合成叔丁基((R)-3-甲基-1-(((R)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
根据一般程序1用叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(200.0mg，0.365mmol)，获得叔丁基((R)-3-甲基-1-(((R)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝713.6,Rt＝1.08min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯
在0℃向丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯(48.0mg，0.079mmol)在DCM(1.0mL)中的溶液中添加TFA(0.2mL)。混合物在该温度搅拌1小时。然后在真空下除去溶剂。将残余物溶解在DMF(1.0mL)中，然后加入DIPEA(0.138mL，0.794mmol，10当量.)和(9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(40.2mg，0.119mmol，1.5当量)。将混合物在室温搅拌18小时。通过RP-HPLC ISCO金色谱(0-100％ MeCN/H2O，无改性剂)纯化反应。冻干后，获得丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝727.3,Rt＝2.28min(5min酸性方法).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.01(s,1H),8.09(d,J＝7.6Hz,1H),7.89(d,2H),7.74(t,J＝8.2Hz,2H),7.62(s,1H),7.45-7.36(m,3H),7.35-7.15(m,4H),5.95(t,J＝5.9Hz,1H),5.36(s,2H),5.03(s,1H),4.70(d,J＝14.8Hz,2H),4.54-4.36(m,5H),4.35-4.19(m,3H),3.96-3.87(m,1H),3.50(d,J＝26.0Hz,1H),2.97(dp,J＝20.1,6.6Hz,2H),2.82(s,3H),1.98(q,J＝6.8Hz,1H),1.73-1.50(m,2H),1.51-1.30(m,2H),0.86(dd,J＝10.2,6.7Hz,6H).
合成丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯
根据一般程序1用丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯(77.6mg，0.107mmol)，获得丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝892.4,Rt＝1.14min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
根据一般程序1用丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(250.0mg，0.398mmol)，获得丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝794.9,Rt＝1.07min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)丙-2-炔-1-胺(1.348g，2.94mmol)在DCM(10.0mL)中的溶液中添加吡啶(2.0mL)，然后是丙-2-炔-1-基氯甲酸酯(0.574mL，5.88mmol，2.0当量)。并将混合物在室温搅拌30min。将反应物用MeOH淬灭，用CH2Cl2(20mL)稀释，然后用水、NaCl(饱和)清洗，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩并通过ISCOSiO2色谱法(0-50％ EtOAc/庚烷)纯化，获得丙-2-炔-1-基2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LC/MS MH+＝541.6,Rt＝1.47min(2min酸性方法).1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.18(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H,Ar),8.10(d,J＝2.3Hz,1H,Ar),7.72-7.63(m,4H,Ph),7.54-7.35(m,7H,Ph+Ar),4.86(s,2H),4.80-4.53(m,4H),4.02(d,J＝22.3Hz,2H),2.76(d,J＝4.7Hz,1H),2.17(t,J＝2.4Hz,1H),1.13(d,J＝3.1Hz,9H).
合成丙-2-炔-1-基5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
在0℃向丙-2-炔-1-基2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(1.66g，2.07mmol)在DCM(9.0mL)和AcOH(1.0mL)中的溶液中添加锌(3.01g，46.1mmol，15.0当量)并在该温度将该混合物搅拌40min。通过硅藻土过滤反应并用DCM漂洗。滤液用NaHCO3(饱和)、水和NaCl(饱和)清洗，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩并通过ISCO SiO2色谱法(0-100％ EtOAc/庚烷)纯化，获得丙-2-炔-1-基5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LC/MS M+Na＝533.2,Rt＝1.35min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向悬浮在DCM(10.0mL)和MeOH(5.0mL)中的丙-2-炔-1-基5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(1.19g，2.33mmol)和(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(1.157g，2.33mmol，1.0当量)中添加EEDQ(0.691g，2.80mmol，1.2当量)并在室温搅拌3小时。真空除去溶剂，将残余物溶解在DMSO(3.0mL)中并通过RP-HPLC ISCO金色谱(0-100％ MeCN/H2O，0.05％ TFA改性剂)纯化。冻干后，获得丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LC/MS M+H＝990.0,Rt＝1.47min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
向丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(732.0mg，0.740mmol)在THF(5.0mL)中的溶液中添加乙酸(0.127mL，2.220mmol，3.0当量)和在THF中的1.0M TBAF(1.48mL，1.480mmol，2.0当量)。将混合物在室温搅拌20小时。LCMS指示剩余一些起始材料。添加在THF中的1.0M TBAF(0.75mL，0.750mmol，1.0当量)并在室温搅拌20小时。在真空中将溶剂去除，该材料通过ISCO SiO2色谱法(0-50％ MeOH/CH2Cl2)纯化，并获得丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LC/MS M+H＝751.6,Rt＝0.99min(2min酸性方法).
合成丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯
根据一般程序1用丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(556.0mg，0.740mmol)，获得丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯。LC/MS M+H＝916.8,Rt＝1.16min(2min酸性方法).
合成(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺
根据以下一般程序4所述用叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(2.00g，4.17mmol)，获得(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺。LC/MS M+H＝380.6,Rt＝0.40min(2min酸性方法).
合成(S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺
根据以下一般程序5所述用2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(100.0mg，0.322mmol)和(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(175.0mg，0.355mmol，1.1当量)，获得(S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺。LC/MS M+H＝575.4,Rt＝0.61min(2min碱性方法).
合成4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯
根据一般程序1用(S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(126.0mg，0.219mmol)，获得4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯。LC/MS M+H＝575.4,Rt＝0.61min(2min碱性方法).
合成叔丁基((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
根据一般程序1用叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(200.0mg，0.417mmol)，获得叔丁基((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯。LC/MS M+H＝645.5,Rt＝1.02min(2min酸性方法).
一般程序2
合成2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基乙-1-铵
向6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸(25mg，0.033mmol)、(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯代甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(25mg，0.033mmol，1.0当量)和TBAI(12mg，0.033mmol，1.0当量)在DMSO(1mL)中的悬浮液中添加DIPEA(0.03mL，0.164mmol，5.0当量)，并在室温搅拌16小时。添加在THF中的2.0M二甲胺(0.164mL，0.328mmol，10当量)。静置1.5小时后，通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％ MeCN/H2O，0.1％ TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基乙-1-铵。HRMS:M+＝1266.3000；Rt＝1.85min(5min酸性方法).
一般程序3
合成2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-N,N-二甲基乙-1-铵
向2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基乙-1-铵(42mg，0.027mmol)和79-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-79-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧杂七十九烷酸(42mg，0.032mmol，1.2当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIPEA(0.023mL，0.133mmol，5.0当量)并在室温搅拌5小时。添加DMSO(2mL)并将溶液通过RP-HPLC ISCO金色谱法(10-100％ MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后，获得2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-N,N-二甲基乙-1-铵。HRMS:M+＝2465.7800；Rt＝2.15min(5min酸性方法).
一般程序4
合成N-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N,N-二甲基乙-1-铵
在0℃在冰浴中向2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-N,N-二甲基乙-1-胺鎓(28mg，0.011mmol)在CH2Cl2(0.75mL)中的溶液中添加三氟乙酸(0.25mL)。将混合物在冰浴中搅拌1小时，此时真空除去挥发物。添加DMSO(1.5mL)并将溶液通过RP-HPLC ISCO金色谱法(10-100％MeCN/H2O，0.1％ TFA改性剂)纯化。冻干后，获得N-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N,N-二甲基乙-1-铵。HRMS:M+＝2367.3101；Rt＝1.86min(5min酸性方法).对于这个一般程序，在某些情况下，胺在没有RP-HPLC纯化的情况下按原样使用。
一般程序5
合成2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N-(2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基乙-1-铵(L11A-P27)
向N-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N,N-二甲基乙-1-铵(10.0mg，0.004mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(1.4mg，0.005mmol，1.2当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIPEA(6.7μL，0.039mmol，10.0当量)。将混合物在室温搅拌3.5小时。添加DMSO(1.5mL)并将溶液通过RP-HPLC ISCO金色谱法(10-100％ MeCN/H2O，0.1％ TFA改性剂)纯化。冻干后，获得2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)-N-(2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基乙-1-铵。HRMS:M+＝2562.3401；Rt＝2.04min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序2用4-甲氧基苄基6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3R,5S,7s)-3,5-二甲基-7-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸酯(30.0mg，0.033mmol)和(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(25.2mg，0.033mmol，1.0当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝1412.7600；Rt＝2.22min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序3用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓(42.0mg，0.026mmol)和79-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-79-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧杂七十九烷酸(40.4mg，0.031mmol，1.2当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2613.4199；Rt＝2.38min(5min酸性方法).
合成1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序4用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)吡咯烷-1-鎓(68.0mg，0.26mmol)，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2393.3301；Rt＝1.85min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓(L11A-P21)
根据一般程序5用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓(26.1mg，0.011mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(5.1mg，0.016mmol，1.5当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2588.3899；Rt＝2.05min(5min酸性方法).
一般程序6
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
向2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟代苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(75.0mg，0.114mmol)和叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(氯代甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(103.0mg，0.182mmol，1.6当量)在DMSO(2.0ml)中的悬浮液中添加TBAI(67.4mg，0.182mmol，1.6当量)和DIPEA(0.16mL，0.912mmol，9.0当量)。混合物溶解成溶液并在室温搅拌2小时。此后，通过RP-HPLC ISCO金色谱法(10-70％ MeCN/H2O，0.1％ TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M+＝1187.6；Rt＝0.93min(2min酸性方法).一般程序7
合成N-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
将有3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟代苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(50.0mg，0.042mmol)、25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(34.5mg，0.084mmol，2.0当量)、钠(R)-2-((S)-1,2-二羟基乙基)-4-羟基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-3-醇酸盐(12.5mg，0.63mmol，1.5当量)和五水合硫酸铜(II)(2.1mg，0.008mmol，0.2当量)的烧瓶密封并用N2 3x抽空/吹扫，通过注射器添加叔丁醇(5.0mL)和水(0.5mL)。将混合物在室温搅拌2小时。添加DMSO(1mL)并将溶液通过RP-HPLCISCO金色谱法(0-100％ MeCN/H2O，0.1％ TFA改性剂)纯化。冻干后，获得N-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1596.7531；Rt＝1.18min(2min酸性方法).对于这个一般程序，在某些情况下，使用DMF或DMSO代替叔丁醇。
合成N-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序4用N-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(30.0mg，0.019mmol)，获得N-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M+＝1497.2；Rt＝1.94min(5min酸性方法).
合成N-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((R)-2-((R)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L8A-P1)
根据一般程序5用N-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(24.0mg，0.016mmol)，获得N-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((R)-2-((R)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1691.7500；Rt＝4.35min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(50.0mg，0.042mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(39.4mg，0.084mmol，2.0当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:1/2M+＝828.1；Rt＝0.71min(2min酸性方法).
一般程序8
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L7A-P1)
将3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟代苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂六二十级基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(32.2mg，0.019mmol)在DCM/TFA(3:1，2.6mL)中的溶液冷却至0℃并在此温度搅拌1小时。在减压下蒸发混合物以产生粗de-Boc中间体后，将粗产物溶解在DMF(0.5mL)中和接着添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(12.1mg，0.039mmol，2.0当量)和DIPEA(0.1mL，0.584mmol，30.0当量)。将混合物在室温搅拌30min。通过RP-HPLC ISCO金色谱法(0-100％ MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1749.7400；Rt＝2.51min(5min酸性方法).
合成N-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序4用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(263.0mg，0.221mmol)，获得N-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1087.2700；Rt＝1.85min(5min酸性方法).合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序5用N-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(77.0mg，0.050mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(23.2mg，0.075mmol，1.5当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1282.4800；Rt＝2.15min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((1-(74-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L109A-P1)
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(51.8mg，0.037mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十五-75-烷酸(87.0mg，0.074mmol，2.0当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((1-(74-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝2453.8899；Rt＝2.17min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序6用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(50.0mg，0.079mmol)和叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(71.7mg，0.127mmol，1.6当量)，获得3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M+＝1162.2；Rt＝0.94min(2min碱性方法).
合成3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(40.0mg，0.034mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(25.8mg，0.055mmol，1.6当量)，获得3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M/2+＝815.4；Rt＝0.99min(2min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L7A-P2)
根据一般程序8用3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(37.0mg，0.023mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(10.6mg，0.034mmol，1.5当量)，获得3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M-＝1722.9；Rt＝0.91min(2min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序6用2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(118.0mg，0.170mmol)和丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯(127.0mg，0.204mmol，1.2当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1244.5100；Rt＝2.42min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序8用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(65.0mg，0.052mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(32.4mg，0.104mmol，2.0当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M+＝1341.1；Rt＝2.20min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L3A-P1)
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(65.0mg，0.049mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(45.4mg，0.097mmol，2.0当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1806.7700；Rt＝2.05min(5min酸性方法).
合成N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(36.0mg，0.029mmol)和25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(23.7mg，0.058mmol，2.0当量)，获得N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1653.7500；Rt＝2.29min(5min酸性方法).
合成N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L4A-P1)
根据一般程序8用N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(19.6mg，0.012mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(7.4mg，0.024mmol，2.0当量)，获得N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1748.7600；Rt＝2.15min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序6用2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(50.0mg，0.076mmol)和丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(73.8mg，0.114mmol，1.5当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M+＝1269.2；Rt＝2.24min(5min碱性方法).合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序8用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(45.9mg，0.036mmol)和2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(22.3mg，0.072mmol，2.0当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1363.5100；Rt＝2.26min(5min酸性方法).
合成N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L1A-P1)
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(21.9mg，0.016mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷(51.0mg，0.120mmol，7.5当量)，获得N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝2181.9800；Rt＝2.31min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L10A-P1)
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(20.0mg，0.015mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(51.4mg，0.110mmol，7.5当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝2298.0100；Rt＝2.44min(5min酸性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)二甲基氨)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯
根据一般程序6用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(50.0mg，0.079mmol)和丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(61.5mg，0.095mmol，1.2当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)二甲基氨)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯。LCMS:M+＝1243.2；Rt＝2.27min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(21.8mg，0.018mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(32.8mg，0.070mmol，4.0当量)，获得3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝2176.8301；Rt＝2.25min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L10A-P2)
根据一般程序8用3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(17.8mg，0.008mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(10.2mg，0.033mmol，4.0当量)，获得3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝2271.8186；Rt＝2.12min(5min酸性方法).
合成N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序7用3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(22.6mg，0.018mmol)和25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(29.8mg，0.073mmol，4.0当量)，获得N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M/2+＝1032.3；Rt＝2.25min(5min酸性方法).
合成N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L1A-P2)
根据一般程序8用N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(23.0mg，0.011mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(10.4mg，0.033mmol，3.0当量)，获得N-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝2155.8176；Rt＝2.23min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序6用2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(21.5mg，0.033mmol)和叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(21.2mg，0.042mmol，1.3当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M+＝1119.3；Rt＝2.15min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L9A-P1)
根据一般程序8用3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(36.6mg，0.033mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(20.3mg，0.065mmol，2.0当量)，获得3-(4-(3-(2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1214.4700；Rt＝2.10min(5min酸性方法).
合成3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵
根据一般程序6用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-(二甲基氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(25.0mg，0.040mmol)和叔丁基((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(25.6mg，0.051mmol，1.3当量)，获得3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。LCMS:M+＝1094.1；Rt＝2.14min(5min酸性方法).合成3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(L9A-P2)
根据一般程序8用3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵(31.6mg，0.029mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(26.9mg，0.087mmol，3.0当量)，获得3-(4-(3-(2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-4-羧基噻唑-5-基)丙氧基)-3-氟苯基)-N-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)-N,N-二甲基丙-2-炔-1-铵。HRMS:M+＝1188.4500；Rt＝2.07min(5min酸性方法).
一般程序9
合成4-甲氧基苄基6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸酯
向4-甲氧基苄基6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸酯(30.0mg，0.033mmol)和(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(35.9mg，0.039mmol，1.2当量)在DMF(1.0mL)中的溶液中添加DIPEA(0.03mL，0.164mmol，5.0当量)，并在室温将该混合物搅拌16小时。氨基甲酸酯形成后，添加THF中的2M二甲胺(0.164mL，0.329mmol，1.0当量)并搅拌混合物1.5小时。添加DMSO(2.0mL)并将溶液通过RP-HPLC ISCO金色谱法(10-100％ MeCN/H2O，0.1％ TFA改性剂)纯化。冻干后，获得4-甲氧基苄基6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸酯。HRMS:M+＝1460.7500；Rt＝2.31min(5min酸性方法).
合成1-(2-((((2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)(3-羟基丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十一-81-烷酸
根据一般程序3用4-甲氧基苄基6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸酯(32.0mg，0.022mmol)和79-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-79-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧杂七十九烷酸(43.3mg，0.033mmol，1.5当量)，获得1-(2-((((2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)(3-羟基丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十一-81-烷酸。HRMS:M-H+2Na＝2705.3601；Rt＝2.63min(5min酸性方法).
合成3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸
根据一般程序4用1-(2-((((2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)(3-羟基丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十一-81-烷酸(35.1mg，0.013mmol)，获得3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸。HRMS:M-H+2Na＝2485.2700；Rt＝2.02min(5min酸性方法).
合成6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸(L11C-P25)
根据一般程序5用3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸(17.3mg，0.007mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(2.6mg，0.009mmol，1.2当量)，获得6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸。HRMS:M+H＝2636.3701；Rt＝1.73min(5min酸性方法).
合成6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸
根据一般程序9用6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸(24.0mg，0.028mmol)和(9H-芴-9-基)甲基(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(27.9mg，0.031mmol，1.1当量)，获得6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸。HRMS:M+H＝1410.7300；Rt＝2.24min(5min酸性方法).
合成6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)(2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸
根据一般程序3用6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸(19.0mg，0.012mmol)和79-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-79-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧杂七十九烷酸(24.6mg，0.019mmol，1.5当量)，获得6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)(2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸。HRMS:M-H+2Na＝2655.3701；Rt＝2.59min(5min酸性方法).
合成3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)((S)-3,4-二羟基丁基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸
根据一般程序4用6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)(2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸(28.4mg，0.011mmol)，获得3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)((S)-3,4-二羟基丁基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸。HRMS:M+H＝2471.3301；Rt＝1.97min(5min酸性方法).
合成6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)((S)-3,4-二羟基丁基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸(L11C-P19)
根据一般程序5用3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苄基)氧基)羰基)((S)-3,4-二羟基丁基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸(35.6mg，0.014mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(10.7mg，0.034mmol，2.5当量)，获得6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)((S)-3,4-二羟基丁基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸。HRMS:M+H＝2666.3701；Rt＝2.19min(5min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序9用2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(40.0mg，0.062mmol)和(9H-芴-9-基)甲基((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(57.1mg，0.068mmol，1.1当量)，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M+H＝1117.8；Rt＝0.84min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序7用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(18.2mg，0.016mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(9.1mg，0.020mmol，1.2当量)，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝793.1；Rt＝1.17min(2min酸性方法).
合成2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(L7C-P3)
根据一般程序5用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(10.5mg，0.007mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(2.5mg，0.08mmol，1.2当量)，获得2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝891.2；Rt＝2.56min(5min酸性方法).
一般程序10
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸
向2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(2-氟代-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(30.0mg，0.039mmol)和叔丁基((R)-3-甲基-1-(((R)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(36.5mg，0.051mmol，1.3当量)在DMF(1.0mL)中的溶液中添加DIPEA(0.034mL，0.197mmol，5.0当量)。将混合物在室温搅拌2小时。添加DMSO(1.0mL)并将溶液通过RP-HPLC ISCO金色谱法(0-100％ MeCN/H2O，0.1％ TFA改性剂)纯化。冻干后，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝1262.5100；Rt＝2.47min(5min酸性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((R)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序8用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(40.0mg，0.032mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(11.8mg，0.038mmol，1.2当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((R)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝1357.5262；Rt＝1.16min(2min酸性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(L7C-P6)
根据一般程序7用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((R)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(10.0mg，0.008mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(6.9mg，0.015mmol，2.0当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝1824.7700；Rt＝2.19min(5min酸性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序10用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(50.0mg，0.081mmol)和叔丁基((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(57.7mg，0.081mmol，1.0当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M+H＝1192.2；Rt＝0.88min(2min碱性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序7用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(38.0mg，0.032mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(23.9mg，0.051mmol，1.6当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝830.6；Rt＝0.73min(2min碱性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(L7C-P7)
根据一般程序8用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(25.0mg，0.015mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(7.0mg，0.023mmol，1.5当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝877.9；Rt＝1.07min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序7用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(45.0mg，0.038mmol)和25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(21.7mg，0.053mmol，1.4当量)，获得5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝800.9；Rt＝1.14min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)噻唑-4-甲酸(L8C-P7)
根据一般程序8用5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)噻唑-4-甲酸(49.0mg，0.031mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(14.3mg，0.046mmol，1.5当量)，获得5-(3-(4-(3-((((2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(甲基)氨基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝848.6；Rt＝1.08min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序9用丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯(72.0mg，0.081mmol)和2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(52.0mg，0.081mmol，1.0当量)，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M+H＝1174.3；Rt＝1.12min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序7用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(22.0mg，0.019mmol)和25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(23.0mg，0.056mmol，3.0当量)，获得5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝1583.8199；Rt＝2.30min(5min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(L8C-P3)
根据一般程序5用5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(12.3mg，0.008mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(4.8mg，0.016mmol，2.0当量)，获得5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝1778.6500；Rt＝2.67min(5min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序7用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(20.0mg，0.017mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(23.9mg，0.051mmol，3.0当量)，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝1641.8900；Rt＝2.24min(5min酸性方法).
合成2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(L3C-P3)
根据一般程序5用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(5.5mg，0.003mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(2.1mg，0.007mmol，2.0当量)，获得2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝1837.6300；Rt＝2.61min(5min酸性方法).
合成5-((5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-4-羧基噻唑-2-基)(6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵
根据一般程序9用丙-2-炔-1-基(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸酯(30.0mg，0.034mmol)和5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵(28.8mg，0.034mmol，1.0当量)，获得5-((5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-4-羧基噻唑-2-基)(6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵。LCMS:M+H＝1387.1；Rt＝0.98min(2min酸性方法).
合成5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵
根据一般程序5用5-((5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-4-羧基噻唑-2-基)(6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵(35.6mg，0.026mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(12.0mg，0.039mmol，1.5当量)，获得5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵。LCMS:M/2+H＝791.2；Rt＝1.01min(2min酸性方法).
合成5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵(L3C-P4)
根据一般程序7用5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵(23.0mg，0.015mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(20.4mg，0.044mmol，3.0当量)，获得5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵。HRMS:M+H＝2047.8101；Rt＝2.24min(5min酸性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯
根据一般程序10用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯(40.0mg，0.054mmol)和丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(甲基)氨基甲酸酯(41.2mg，0.054mmol，1.0当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯。LCMS:M+H＝1378.1；Rt＝1.11min(2min酸性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯
根据一般程序7用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯(67.0mg，0.049mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(34.1mg，0.073mmol，1.5当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯。LCMS:M/2+H＝923.6；Rt＝1.06min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)噻唑-4-甲酸酯
根据一般程序4用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯(53.7mg，0.029mmol)，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)噻唑-4-甲酸酯。LCMS:M/2+H＝873.5；Rt＝1.03min(2min酸性方法).
合成5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N,N-三甲基戊-1-铵(L3C-P5)
根据一般程序5用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)噻唑-4-甲酸酯(50.8mg，0.029mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(13.6mg，0.044mmol，1.5当量)，获得5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N,N-三甲基戊-1-铵。HRMS:M+H＝1939.8199；Rt＝2.17min(5min酸性方法).
合成2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序10用丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(49.3mg，0.062mmol)和2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(40.0mg，0.062mmol，1.0当量)，获得2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M+H＝1297.0；Rt＝1.28min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序7用2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(49.0mg，0.038mmol)和25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(34.0mg，0.083mmol，2.2当量)，获得5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝1059.4；Rt＝1.16min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序4用5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(80.0mg，0.038mmol)，获得5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝1009.2；Rt＝1.14min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(L1C-P3)
根据一般程序5用5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(76.0mg，0.038mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(23.4mg，0.075mmol，2.0当量)，获得5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝2211.9700；Rt＝2.56min(5min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序10用丙-2-炔-1-基5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸酯(56.9mg，0.062mmol)和2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(40.0mg，0.062mmol，1.0当量)，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M+H＝1422.6；Rt＝1.33min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
在室温将5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟代苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(88.0mg，0.062mmol)在2.0M在THF(3.1mL，6.20mmol，100.0当量)中的二甲基胺中的溶液搅拌80min。真空除去溶剂，在DMSO(1.0mL)中稀释残余物并通过RP-HPLC ISCO金色谱法(0-100％MeCN/H2O，0.05％ TFA改性剂)纯化。冻干后，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M+H＝1199.2；Rt＝1.06min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸
根据一般程序7用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(20.8mg，0.017mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-27-烷酸(17.9mg，0.038mmol，2.2当量)，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸。LCMS:M/2+H＝1068.2；Rt＝0.99min(2min酸性方法).
合成2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸(L10C-P3)
根据一般程序5用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)噻唑-4-甲酸(36.3mg，0.017mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(5.3mg，0.017mmol，1.0当量)，获得2-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-5-(3-(4-(3-((((2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸。HRMS:M+H＝2327.9800；Rt＝2.45min(5min酸性方法).
合成5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵(L9C-P4)
根据一般程序10用4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(20.0mg，0.027mmol)和5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵(23.1mg，0.027mmol，1.0当量)，获得5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)戊-1-铵。HRMS:M+H＝1455.5300；Rt＝2.31min(5min酸性方法).
合成2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯
根据一般程序10用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(2-氟-4-(3-(甲基氨基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯(40.0mg，0.054mmol)和叔丁基((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(34.5mg，0.054mmol，1.0当量)，获得2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯。LCMS:M+H＝1253.8；Rt＝1.11min(2min酸性方法).
合成5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)噻唑-4-甲酸酯
根据一般程序4用2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-甲酸酯(64.8mg，0.052mmol)，获得5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)噻唑-4-甲酸酯。LCMS:M/2+H＝576.6；Rt＝0.99min(2min酸性方法).
合成5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N,N-三甲基戊-1-铵(L9C-P5)
根据一般程序5用5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羟基-5-(三甲基氨)戊基)氨基)噻唑-4-甲酸酯(59.0mg，0.051mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(19.1mg，0.061mmol，1.2当量)，获得5-((6-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基哒嗪-3-基)(4-羧基-5-(3-(4-(3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-2-基)氨基)-2-羟基-N,N,N-三甲基戊-1-铵。HRMS:M+H＝1347.5300；Rt＝2.23min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序3用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓(40mg，0.028mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂七十四-74-烷酸酯(51.5mg，0.042mmol，1.5当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2511.4099；Rt＝2.44min(5min酸性方法).
合成1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序4用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)吡咯烷-1-鎓(50mg，0.0199mmol)，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2291.3101；Rt＝1.93min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)吡咯烷-1-鎓(L30A-P21)
根据一般程序5用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓(37mg，0.015mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(11.4mg，0.0367mmol，2.5当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2486.3301；Rt＝2.14min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,44,44-十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十四氧代-43-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十五基)苄基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序3用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓(35mg，0.021mmol)和3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,42,42-十四甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十三氧代-41-氧杂-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氮杂四十三烷酸(21.9mg，0.021mmol，1.0当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,44,44-十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十四氧代-43-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂五十四基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:[(M+)+H+]+2/2＝1211.6500；Rt＝2.31min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(41-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十一基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓(L35A-P21)
根据一般程序4用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,44,44-十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十四氧代-43-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十五基)苄基)吡咯烷-1-鎓(24mg,0.0095mmol)和然后利用粗产物继续并且根据一般程序5用2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(5.9mg,0.019mmol,2当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(41-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十一基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2340.1699；Rt＝1.87min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,62,62-二十一甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧代-61-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂六十三基)苄基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序3用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓(47mg,0.0286mmol)和3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,60,60-二十甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58-十九氧代-59-氧杂-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十八氮杂六十烷酸(41.6mg,0.0286mmol,1.0当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,62,62-二十一甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧代-61-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂六十三基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2487.5400；Rt＝2.26min(5min酸性方法).
合成1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(59-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十九氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂五十九基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序4用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,62,62-二十一甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧代-61-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂六十三基)苄基)吡咯烷-1-鎓(46mg,0.0155mmol)，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(59-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十九氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂五十九基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2571.3401；Rt＝1.60min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(59-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十九氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂五十九基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓(L36A-P21)
根据一般程序5用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(59-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十九氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂五十九基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓(17.0mg,0.0055mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(2.4mg,0.0076mmol,1.4当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(59-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十九氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂五十九基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2766.3899；Rt＝1.82min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,80,80-二十七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十六氧代-79-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂八十一基)苄基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序3用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓(40mg,0.028mmol)和3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,78,78-二十六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧代-77-氧杂-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氮杂七十九烷酸(58.5mg,0.031mmol,1.1当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,80,80-二十七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十六氧代-79-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂八十一基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝3273.7500；Rt＝2.24min(5min酸性方法).
合成1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(77-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十五氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂七十七基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序4用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,80,80-二十七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十六氧代-79-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂八十一基)苄基)吡咯烷-1-鎓(20mg,0.0063mmol)，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(77-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十五氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂七十七基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2997.6001；Rt＝1.65min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(77-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十五氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂七十七基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓(L37A-P21)
根据一般程序5用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(77-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十五氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂七十七基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓(35mg,0.011mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(4.7mg,0.015mmol,1.4当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(77-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十五氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂七十七基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝3192.6399；Rt＝1.86min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十基)苄基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序3用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓(70mg，0.043mmol)和3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氮杂三十八烷酸(38.9mg，0.043mmol，1.0当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2307.2300；Rt＝2.20min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十基)苄基)吡咯烷-1-鎓(L38A-P21)
根据一般程序4用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十基)苄基)吡咯烷-1-鎓(67mg,0.029mmol)和然后使用粗反应产物和根据一般程序5用2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(13.5mg,0.044mmol,1.5当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2282.2500；Rt＝1.89min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)吡咯烷-1-鎓
在室温将1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十五-75-烷酸(67mg，0.059mmol，1.28当量)、二(4-硝基苯基)碳酸酯(17mg，0.057mmol，1.25当量)和DIPEA(48μL，0.28mmol，6.0当量)在DMF(1mL)中的混合物搅拌1h，同时添加1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓(65mg，0.046mmol，1.0当量)和额外的DIEA(80μL，0.46mmol，10当量)。搅拌1小时后，将溶液用DMSO(2.5mL)稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2584.4399；Rt＝2.39min(5min酸性方法).
合成1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓
根据一般程序4用1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)吡咯烷-1-鎓(58mg，0.021mmol)，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:[(M+)+H+)]+2/2＝1183.1700；Rt＝1.88min(5min酸性方法).
合成1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓(L42A-P21)
根据一般程序5用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)-1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)吡咯烷-1-鎓(61mg，0.024mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(10.2mg，0.033mmol，1.4当量)，获得1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-羧基吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)吡咯烷-1-鎓。HRMS:M+＝2559.3701；Rt＝2.07min(5min酸性方法).
合成1-(2-((((2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)(3-羟基丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十九-79-烷酸
在室温将1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十五-75-烷酸(45.9mg，0.040mmol，1.3当量)、二(4-硝基苯基)碳酸酯(12mg，0.0394mmol，1.28当量)和DIPEA(32μL，0.184mmol，6.0当量)在DMF(1mL)中的混合物搅拌1h，同时添加1-(2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)吡咯烷-1-鎓(50mg，0.0308mmol，1.0当量)和额外的DIEA(53.7μL，0.308mmol，10当量)。搅拌1小时后，将溶液用DMSO(2.5mL)稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，1-(2-((((2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)(3-羟基丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十九-79-烷酸。HRMS:(M+2H+)+2/2＝1316.7200；Rt＝2.64min(5min酸性方法).
合成3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸
根据一般程序4用1-(2-((((2-(((1s,3r,5R,7S)-3-((4-(6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)羰基)吡啶-3-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)氧基)乙基)(3-羟基丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十九-79-烷酸(39mg，0.014mmol)，获得3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸。修改一般程序4以截去在伯羟基上形成的少量TFA酯。在浓缩TFA/CH2Cl2后，将残余物溶解于DMSO(1mL)中，添加DIEA(125μL，50当量)，然后添加MeOH(1mL)。静置1小时后，截去酯并纯化溶液。HRMS:MH+＝2412.3101；Rt＝2.03min(5min酸性方法).
合成6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸(L42C-P25)
根据一般程序5用3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)-6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)吡啶甲酸(26mg，0.010mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸酯(4.0mg，0.013mmol，1.25当量)，获得6-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基-6,7-二氢吡啶并[2,3-c]哒嗪-8(5H)-基)-3-(1-(((1r,3s,5R,7S)-3-(2-((((2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(3-羟基丙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金刚烷-1-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶甲酸。HRMS:MH+＝2607.3601；Rt＝2.27min(5min酸性方法).
使用与L38A-P21所述类似的程序制备以下化合物：
L39A-P21
HRMS:M+＝2708.3999；Rt＝1.85min(5min酸性方法).
L40A-P21
HRMS:M+＝3134.6201；Rt＝1.81min(5min酸性方法).
可以使用与上述类似的程序来制备以下化合物：
L11A-P1、L11A-P21、L11A-P27、L11C-P19、L11C-P25、L30A-P1、L30C-P19、L30A-P21、L30C-P25、L30A-P27、L35A-P1、L35C-P19、L35A-P21、L35C-P25、L35A-P27、L36A-P1、L36C-P19、L36A-P21、L36C-P25、L36A-P27、L37A-P1、L37C-P19、L37A-P21、L37C-P25、L37A-P27、L38A-P1、L38C-P19、L38A-P21、L38C-P25、L38A-P27、L39A-P1、L39C-P19、L39A-P21、L39C-P25、L39A-P27、L40A-P1、L40C-P19、L40A-P21、L40C-P25、L40A-P27、L42A-P1、L42C-P19、L42A-P21、L42C-P25、L42A-P27、L67A-P1、L67C-P19、L67A-P21、L67C-P25、L67A-P27、L100A-P1、L100C-P19、L100A-P21、L100C-P25、L100A-P27、L103A-P1、L103C-P19、L103A-P21、L103C-P25、L103A-P27、L111A-P1、L111C-P19、L111A-P21、L111C-P25和L111A-P2。化合物的结构如表B所示。
实施例5.Bcl-xL抑制剂ADC的合成和表征
使用下述示例性方法合成示例性抗体-药物缀合物(ADC)。
缩写：
Ab 抗体
ADC 抗体-药物缀合物
BCN (N-[(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷)
BTG 细菌转谷氨酰胺酶
CV 柱体积
DAR 药物抗体比
DBCO 二苯并环辛炔
DFA 二氟乙酸
DMA 二甲基乙酰胺
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DTT 二硫苏糖醇
FA 甲酸
HIC 疏水相互作用色谱
LC-MS 液相色谱质谱法
L/P 接头-负载
mAb 单克隆抗体
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PES 聚醚砜
PG 丙二醇
PLRP-s 聚合物反相柱
rmp 还原可修饰蛋白
SEC 尺寸排阻色谱
TFA 三氟乙酸
Tris 三(羟基甲基)氨基甲烷
材料和方法：ADC BCL-xL的结合和分析表征
抗体规格
使用下述示例性方法合成示例性抗体-药物缀合物(ADC)。将表9中定义的抗EphA2抗体用于制备示例性ADC。抗EphA2 1C1抗体首先描述于WO2007030642中，将其通过引用以其整体并入。将IgG抗鸡溶菌酶抗体(即，3207DANAPA)用于制备同种型对照ADC。
表9：用于合成示例性ADC的抗体
体外Cysmab ADC制备
将抗体(典型地5-10mg)与rProtein A Sepharose树脂(GE)以10mg Ab比1ml树脂的比例在PBS中孵育15分钟，其中在适当尺寸的一次性柱中混合。添加半胱氨酸盐酸盐至终浓度为20mM，并在室温搅拌孵育30min，以使反应性半胱氨酸解封闭。在真空歧管上以多次添加的方式用50个柱体积的PBS快速洗涤树脂。然后将树脂重悬于含有250nM CuCl2的等体积PBS中。通过时间点监测抗体链间二硫键的重组。在每个时间点，除去25μL树脂浆料，添加1μL 20mM MC-valcit-MMAE，并将试管轻弹几次。将树脂离心，除去上清液，然后用50μL抗体洗脱缓冲液(Thermo)洗脱。将树脂沉淀，并使用Agilent PLRP-S 4000A 5um、4.6x50 mm柱通过反相色谱分析上清液(缓冲液A为水，0.1％ TFA，缓冲液B乙腈，0.1％ TFA，柱保持在80℃，流速1.5ml/min；梯度0分钟–30％ B、5分钟–45％ B、6.5分钟–100％ B、8分钟–100％ B、10分钟–30％)。
一旦确定抗体已重新形成其链间二硫键，则用10个柱体积的PBS洗涤树脂，并将该树脂重悬于等体积的PBS中，并添加DMSO中的12个当量的适当接头-负载(20mM)，然后在室温下孵育2小时。然后用50个柱体积的PBS洗涤树脂以去除过量的接头-负载。用抗体洗脱缓冲液从蛋白A树脂中洗脱ADC。然后将ADC透析到PBS中。然后使用Amicon Ultra-15、50KDa、再生纤维素(Millipore，UFC0905024)使用离心浓缩器将材料浓缩至4.5mg/ml，并通过0.22μm无菌PVDF过滤器，25mm(Millapore，SLGV013SL)进行无菌过滤并储存在4℃。进行了以下分析-分析型SEC以确定单体百分比，经还原的质谱法确定DAR，LAL测试以确定内毒素负载，并通过A280利用消光系数和抗体分子量确定蛋白质浓度。所有体外材料均为>90％单体。聚集百分比，如通过比较210和280nm处的高分子量峰吸光度面积与单体ADC的峰吸光度面积来确定。HRMS数据(蛋白质方法)表明重链+2物质的主要质量，通过比较DAR1、DAR2和DAR3物质的峰的MS强度计算出约4.0的DAR。
一般方法：根据以下方法通过液相色谱-质谱法(LC/MS)测定示例性ADC的药物比抗体比率(DAR)。对于所有LC方法，流动相A为MS级纯化水(Honeywell，LC015-1)，流动相B为MS级80％异丙醇(Honeywell LC323-1)：20％乙腈(Honeywell，LC015-1)，LC323-1)，补充有1％的甲酸(FA)(Thermo Scientific，85178)。柱温设定为80℃。针对所有合成的ADC优化了通用MS方法。分析所用柱为Agilent PLRP-S 4000A；2.1x150mm，8μm(Agilent，PL1912-3803)。使用的流速为0.3ml/min。使用的梯度为在Acuity Bio H-Class四元UPLC(Waters)上0-0.75分钟95％A、0.76-1.9分钟75％A、1.91-11.0分钟50％A、11.01-11.50 10％A、11.51-13.50分钟95％A、13.51-18分钟95％A。MS系统是Xevo G2-XS QToF ESI质谱仪(Waters)，在1.5-11分钟内获得数据，并在15000-80000道尔顿之间分析质量。通过对未缀合和缀合给定物质(mAb或相关片段)的积分MS(总离子电流)或UV(280nm)峰面积求和，通过将每个面积乘以附接的药物数量来加权，从解卷积光谱或UV色谱图中确定DAR。将求和的加权面积除以总面积之和，结果得出完整ADC的最终平均DAR值。
尺寸排阻色谱(SEC)：进行SEC以确定ADC的质量和纯化后的聚集百分比(％)。在分析柱Superdex 200Increase 5/150GL(GE Healthcare,28990945)上，在等度条件100％PBS pH 7.2((Hyclone SH30028.03))下进行分析，流速0.45ml/min，持续8分钟。根据280nm处的峰面积吸光度对ADC样品的聚集分数百分比进行定量。其计算基于280nm处高分子量洗脱液之间的比率除以高分子量和单体洗脱液在相同波长处的峰面积吸光度之和乘以100％。数据通过配备Wyatt miniDAWN光散射和Treos折射率检测器(Wyatt Technologies,Santa Barbara,CA)的Agilent Bio-Inert 1260HPLC采集。体内Cysmab ADC制备
将抗体(25-200mg)与rProtein A Sepharose树脂(Cytiva)以10mg Ab比1ml树脂的比例在PBS中孵育15分钟，其中在适当尺寸的一次性柱中混合。添加半胱氨酸盐酸盐至终浓度为20mM，并在室温搅拌孵育30min，以使反应性半胱氨酸解封闭。在真空歧管上以多次添加的方式用50个柱体积的磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)快速洗涤树脂。然后将树脂重悬于含有250nM CuCl2的等体积PBS中。通过时间点监测抗体链间二硫键的重组。在每个时间点，除去25L树脂浆料，添加1L 20mM MC-valcit-MMAE，并将试管轻弹几次。将树脂离心，除去上清液，然后用50L抗体洗脱缓冲液(Thermo)洗脱。将树脂沉淀，并使用Agilent PLRP-S4000A 5um、4.6x50mm柱通过反相色谱分析上清液(缓冲液A为水，0.1％ TFA，缓冲液B乙腈，0.1％ TFA，柱保持在80℃，流速1.5ml/min；梯度0分钟–30％ B、5分钟–45％ B、6.5分钟–100％B、8分钟–100％ B、10分钟–30％)。
一旦确定抗体已重新形成其链间二硫键，则用10个柱体积的PBS洗涤树脂，并将该树脂重悬于等体积的PBS中，并添加DMSO中的12个当量的适当接头-负载(20mM)，然后在室温下孵育2小时。然后用50个柱体积的PBS洗涤树脂以去除过量的接头-负载。用抗体洗脱缓冲液从蛋白A树脂中洗脱ADC。然后使用16/60或26/600S200增量pg SEC柱(GE)将ADC透析到PBS和制备型SEC中，如果需要，以PBS作为流动相。然后使用Amicon Ultra-15、50KDa、再生纤维素(Millipore，UFC0905024)使用离心浓缩器将材料浓缩至4.5mg/ml，并通过0.22μm无菌PVDF过滤器，25mm(Millapore，SLGV013SL)进行无菌过滤并储存在4℃。进行了以下分析-分析型SEC以确定单体百分比，质谱法确定DAR，LAL测试以确定内毒素负载，并通过A280利用消光系数和抗体分子量确定蛋白质浓度。所有体内材料均为>95％单体。聚集典型地为<10％。聚集百分比，如通过比较210和280nm处的高分子量峰吸光度面积与单体ADC的峰吸光度面积来确定。HRMS数据(蛋白质方法)表明重链+2物质的主要质量，通过比较DAR1、DAR2和DAR3物质的峰的MS强度计算出约4.0的DAR。
一般方法：根据以下方法通过液相色谱-质谱法(LC/MS)测定示例性ADC的药物比抗体比率(DAR)。对于所有LC方法，流动相A为MS级纯化水(Honeywell，LC015-1)，流动相B为MS级80％异丙醇(Honeywell LC323-1)：20％乙腈(Honeywell，LC015-1)，LC323-1)，补充有1％的甲酸(FA)(Thermo Scientific，85178)。柱温设定为80℃。针对所有合成的ADC优化了通用MS方法。分析所用柱为Agilent PLRP-S 4000A；2.1x150mm，8μm(Agilent，PL1912-3803)。使用的流速为0.3ml/min。使用的梯度为在Acuity Bio H-Class四元UPLC(Waters)上0-0.75分钟95％A、0.76-1.9分钟75％A、1.91-11.0分钟50％A、11.01-11.50 10％A、11.51-13.50分钟95％A、13.51-18分钟95％A。MS系统是Xevo G2-XS QToF ESI质谱仪(Waters)，在1.5-11分钟内获得数据，并在15000-80000道尔顿之间分析质量。通过对未缀合和缀合给定物质(mAb或相关片段)的积分MS(总离子电流)或UV(280nm)峰面积求和，通过将每个面积乘以附接的药物数量来加权，从解卷积光谱或UV色谱图中确定DAR。将求和的加权面积除以总面积之和，结果得出完整ADC的最终平均DAR值。
尺寸排阻色谱(SEC)：进行SEC以确定ADC的质量和纯化后的聚集百分比(％)。在分析柱Superdex 200Increase 5/150GL(GE Healthcare,28990945)上，在等度条件100％PBS pH 7.2((Hyclone SH30028.03))下进行分析，流速0.45ml/min，持续8分钟。根据280nm处的峰面积吸光度对ADC样品的聚集分数百分比进行定量。其计算基于280nm处高分子量洗脱液之间的比率除以高分子量和单体洗脱液在相同波长处的峰面积吸光度之和乘以100％。数据通过配备Wyatt miniDAWN光散射和Treos折射率检测器(Wyatt Technologies,Santa Barbara,CA)的Agilent Bio-Inert 1260HPLC采集。
实施例6.一组癌细胞系中负载P21和EphA2-L11A-P21ADC单独或与曲美替尼组合使用的体外活性评价
EphA2-L11A-P21抗体药物缀合物(ADC)单独或与曲美替尼组合在从ATCC(美国典型培养物保藏中心)或从其他商业细胞系供应商获得的癌细胞系中进行测试。EphA2-L11A-P21 ADC是根据本文所述的任何一种缀合方法制备的。细胞在组织培养箱中、5％ CO2、37℃的最适合生长的培养基中培养。在接种进行增殖测定之前，在测定前至少2天将细胞拆分，以确保最佳的生长密度。接种当天，使用0.25％胰蛋白酶将细胞从组织培养瓶中剥离。使用细胞计数器(Vi-Cell XR细胞活力分析仪，Beckman Coulter)测定细胞活力和细胞密度。将活力高于85％的细胞以每孔1000个细胞的密度接种在白色透明底384孔板(Greiner目录号781098)中的50μL标准生长培养基中。将板在组织培养箱中于37℃孵育过夜。
将ADC在标准磷酸盐缓冲溶液中制备至所需浓度。每个ADC进行一系列10个稀释。然后将准备好的药物处理添加到细胞中，最终浓度为100–0.005nM。将组合伴侣曲美替尼(MEK抑制剂)以固定浓度添加。使用声学传输装置(Echo525、Echo550、Beckman Coulter)将ADC或组合伴侣添加到细胞中。每种处理均在一式三份测定板中进行测试。将板在37℃孵育过夜或在组织培养箱中孵育5天。使用Promega CellTiter-增殖测定评估ADC抑制细胞增殖和存活的能力。在使用多模式读板器(Pherastar，BMG)读取之前，将板在室温孵育20分钟以稳定发光信号。接种后第二天(第0天读数)和处理5天后(第5天读数)对未处理细胞进行发光计数。将未处理细胞的第5天读数与第0天读数进行比较。在孵育期间至少有一个细胞倍增的测定被认为是有效的。为了评估药物处理的效果，使用含有未处理细胞(100％活力)的孔中的发光计数来归一化处理的样品。使用四参数逻辑回归方程计算抑制50％细胞生长或存活(GI50)所需的处理浓度。Amax是“最大生物效应”的(拟合)应答值，通过在未掩蔽的测量浓度范围内的拟合曲线达到。测试结果示于下表10、11和12中。
表10.一组癌细胞系中单独EphA2-L11A-P21 ADC的GI50和GI Amax
细胞系名称 接头负载 组合伴侣 GI50(μM) GI Amax
aspc1 EphA2-L11A-P21 单一药剂 ＞0.1 72.67
capan2 EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.00013 20.25
dv90 EphA2-L11A-P21 单一药剂 ＞0.1 129.86
ebc1 EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.00003 -8.42
hcc1143 EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.0001 32.5
jhom2b EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.00177 45.86
ncin87 EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.00033 31.95
ocum1 EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.00018 4.31
panc0327 EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.00025 30.2
skhep1 EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.00005 -51.44
skmel31 EphA2-L11A-P21 单一药剂 0.00009 -1.66
sw403 EphA2-L11A-P21 单一药剂 ＞0.1 51.22
表11.一组癌细胞系中EphA2-L11A-P21 ADC与曲美替尼组合使用的GI50和GIAmax
表12一组癌细胞系中负载P21的GI50和GI Amax
细胞系名称 负载 GI50(μM) GI Amax
aspc1 P21 0.04217 2.18
capan2 P21 0.00438 -81.72
dv90 P21 0.26583 16.76
ebc1 P21 0.00026 -96.78
hcc1143 P21 0.00099 -43.38
jhom2b P21 0.06881 -27.63
ncin87 P21 0.00077 -29.31
ocum1 P21 0.00049 -94.77
panc0327 P21 0.00235 -79.2
skhep1 P21 0.00005 -75.34
skmel31 P21 0.00005 -56.5
sw403 P21 0.00532 -64.33
实施例7.EBC-1细胞中EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC、3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC和EphA2-DANAPA CysMab对照抗体的体内功效研究
材料和方法
EBC-1细胞在补充有10％ FBS(HI-FBS#134K19，不含Tet)的DMEM培养基(Gibco11965-084)中于37℃(5％ CO2气氛)下培养。Panc03.27细胞在补充有15％ FBS和10单位/mL重组人胰岛素的RPMI-1640培养基(Gibco 11875-085)中于37℃(5％ CO2气氛)下培养。使用0.25％胰蛋白酶(Gibco 25200-056)处理进行传代培养。为了建立EBC-1和Panc03.27异种移植物，收获细胞并重悬于磷酸盐缓冲盐水和Matrigel的1:1v/v混合物中。将体积为200μL的总共5x106个EBC-1细胞和10x106个Panc03.27细胞皮下注射到雌性裸鼠(Charles River,USA)的胁腹中。细胞接种后定期监测肿瘤生长，并将动物随机分为治疗组(n＝8)，平均肿瘤体积约为200mm3。
EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC和3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC可以使用本文公开的任何ADC制备方法来合成。
对于EBC-1功效研究，EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC、3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC和EphA2-DANAPA CysMab对照抗体均与紫杉醇(LC Laboratories,Woburn,MA,Cat#:P-9600)组合给药，如图1和图2所示。对于Panc03.27功效研究，EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC、3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC和EphA2-DANAPA CysMab对照抗体均与吉西他滨(Hospira，NDC代码0409-0185-01)或MAPK抑制剂(MAPKi)LXH254和CFF272组合给药，分别如图3和图4所示。对于测试紫杉醇组合的研究，EphA2和同种型对照ADC以及EphA2CysMab抗体在治疗开始时以图1和图2中规定的剂量水平静脉内(IV)施用一次，然后是24小时后12.5mg/kg紫杉醇的单次IV给药。对于测试MAPK抑制剂组合的研究，EphA2和同种型对照ADC以及EphA2 CysMab抗体在治疗开始时以30mg/kg静脉内(IV)施用一次，然后24小时后开始LXH254和CFF272的重复给药。LXH254以50mg/kg每天两次口服(PO)施用，而CFF272以0.03mg/kg每天一次口服施用。对于测试吉西他滨组合的研究，在第0天和第14天静脉内(IV)施用EphA2和同种型对照ADC以及EphA2 CysMab抗体。在第1、4、7、15、18和21天(每次ADC或CysMab给药后q3Dx3)以100mg/kg腹膜内(IP)施用吉西他滨。根据小鼠个体体重，所有试剂的剂量为10mL/kg。在治疗当天，将ADC和CysMab在PBS中相应配制。将紫杉醇通过以下过程配制：首先在50％乙醇+50％ Cremophor EL(Kolliphor EL)中复溶，浓度为6mg/mL，然后用无菌盐水(0.9％氯化钠)进一步稀释至1.25mg/mL，然后在治疗当天施用。将吉西他滨在生理盐水中配制为10mg/mL，然后在治疗当天施用。
分析肿瘤体积数据相对于EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC组合组的统计显著性。使用不配对的双尾T检验进行组间比较。
作为功效的衡量标准，根据以下式计算％T/C值：(Δ实验组中的肿瘤体积/Δ媒剂对照组中的肿瘤体积)*100。根据以下式计算肿瘤消退：(Δ实验组中的肿瘤体积/开始时实验组中的肿瘤体积)*100。Δ肿瘤体积代表测量日的平均肿瘤体积减去治疗开始时的平均肿瘤体积。结果以平均值±SEM的形式呈现在数据表中。
结果
与单独使用媒剂对照和紫杉醇组相比，以30mg/kg给药的EphA2-DANAPA-L11C-P25ADC与12.5mg/kg紫杉醇组合使用显著(p<0.05)减少了EBC-1肿瘤的生长。当与紫杉醇组合时，该ADC的抗肿瘤活性也显著高于3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC和EphA2-DANAPACysMab对照抗体。EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC与紫杉醇组合使用显著比作为单一疗法更有效。到ADC给药后第31天，该组合导致在6/8动物中出现完全应答。EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC作为单一疗法也能够诱导肿瘤消退，尽管程度较小，因为在ADC给药后第31天仅在2/8的动物中观察到消退。本文总结的所有结果呈现在图1和表13中。
当EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC单独给药或与紫杉醇以30mg/kg的剂量组合给药时，观察到肿瘤消退。减少ADC剂量会增加组合组与其对应的剂量匹配的ADC单一疗法组之间的活性差异。将剂量减少至15mg/kg会损害单一疗法活性，因为ADC无法再使肿瘤消退或诱导停滞，而只会导致肿瘤生长延迟。当ADC单一疗法剂量减少至7.5mg/kg和3.75mg/kg时，活性进一步降低。尽管失去了单一疗法活性，但EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC与紫杉醇组合展示出即使在较低的ADC剂量下也能保持抗肿瘤活性。治疗后一周内，15mg/kg、7.5mg/kg和3.75mg/kg ADC加紫杉醇组的肿瘤消退程度与30mg/kg ADC加紫杉醇组相同。在3.75mg/kg剂量时发生肿瘤复发；然而，7.5mg/kg剂量与紫杉醇组合在给药后28天内诱导相当持久的应答。本数据集表明，在没有牺牲活性的情况下，与紫杉醇组合使用可使ADC剂量减少至少四倍，这表明有可能改善治疗窗。本文总结的所有结果呈现在图2和表14中。
与单独使用媒剂对照和吉西他滨组相比，以30mg/kg给药的EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC与吉西他滨组合使用显著(p<0.05)减少了Panc03.27肿瘤的生长。当与吉西他滨组合时，该ADC的抗肿瘤活性也显著高于3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC和EphA2-DANAPA CysMab对照抗体。EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC与吉西他滨组合使用显著比作为单一疗法更有效。EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC加吉西他滨组合组的平均肿瘤大小有所减小，并且未观察到完全消退。EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC加吉西他滨组中的复发肿瘤能够对治疗开始后第14天开始的第二轮给药产生应答。在随后的ADC和吉西他滨剂量后观察到肿瘤停滞。本文总结的所有结果呈现在图3和表15中。
与单独使用媒剂对照和MAPK组相比，以30mg/kg给药的EphA2-DANAPA-L11C-P25ADC与MAPK抑制剂LXH254(panRAF)和CFF272(MEK)组合使用显著(p<0.05)减少了Panc03.27肿瘤的生长。当与MAPK抑制组合时，尤其是在给药后前两周内，该ADC的抗肿瘤活性也显著高于3207-DANAPA-L11C-P25同种型对照ADC和EphA2-DANAPA CysMab对照抗体。EphA2-DANAPA-L11C-P25 ADC与组合使用显著比作为单一疗法更有效。观察到的最大应答是肿瘤停滞。本文总结的所有结果呈现在图4和表16中。
一般方法：根据以下方法通过液相色谱-质谱法(LC/MS)测定示例性ADC的药物比抗体比率(DAR)。对于所有LC方法，流动相A为MS级纯化水(Honeywell，LC015-1)，流动相B为MS级80％异丙醇(Honeywell LC323-1)：20％乙腈(Honeywell，LC015-1)，LC323-1)，补充有1％的甲酸(FA)(Thermo Scientific，85178)。柱温设定为80℃。针对所有合成的ADC优化了通用MS方法。分析所用柱为Agilent PLRP-S 4000A；2.1x150mm，8um(Agilent，PL1912-3803)。使用的流速为0.3ml/min。使用的梯度为在Acuity Bio H-Class四元UPLC(Waters)上0-0.75分钟95％A、0.76-1.9分钟75％A、1.91-11.0分钟50％A、11.01-11.50 10％A、11.51-13.50分钟95％A、13.51-18分钟95％A。MS系统是Xevo G2-XS QToF ESI质谱仪(Waters)，在1.5-11分钟内获得数据，并在15000-80000道尔顿之间分析质量。通过对未缀合和缀合给定物质(mAb或相关片段)的积分MS(总离子电流)或UV(280nm)峰面积求和，通过将每个面积乘以附接的药物数量来加权，从解卷积光谱或UV色谱图中确定DAR。将求和的加权面积除以总面积之和，结果得出完整ADC的最终平均DAR值。
进行尺寸排阻色谱(SEC)以确定ADC的质量和纯化后的聚集百分比(％)。在分析柱Superdex 200Increase 5/150GL(GE Healthcare,28990945)上，在等度条件100％PBS pH7.2((Hyclone SH30028.03))下进行分析，流速0.45ml/min，持续8分钟。根据280nm处的峰面积吸光度对ADC样品的聚集分数百分比进行定量。其计算基于280nm处高分子量洗脱液之间的比率除以高分子量和单体洗脱液在相同波长处的峰面积吸光度之和乘以100％。数据通过配备Wyatt miniDAWN光散射和Treos折射率检测器(Wyatt Technologies,SantaBarbara,CA)的Agilent Bio-Inert 1260HPLC采集。
实施例8.使用过表达EphA2的工程改造的HKB-11细胞系进行FACS结合研究
材料和方法
使用流式细胞术(FACS)评价EphA2抗体对细胞的结合亲和力。抗体的剂量滴定与已转导以过表达EphA2的HKB-11细胞系(HKB-11：ATCC，CRL-12568)一起孵育，以确定与细胞表面表达的EphA2结合的EC50值。在组织培养箱中，在5％ CO2、37℃的条件下，在最适合其生长的培养基中培养细胞系。使用细胞计数器(Vi-Cell XR细胞活力分析仪，BeckmanCoulter)测定细胞活力和细胞密度。将细胞以200,000个细胞/孔铺板在96孔U形底板(Corning，#3799)中，并用FACS缓冲液(运行缓冲液，#130-092-747)洗涤一次。所有后续步骤均在冰上和冰冷的FACS缓冲液中进行，以防止受体内化。将细胞重悬于100μL含有11点连续稀释的测试抗体的FACS缓冲液中，最终浓度为200nM–0.003nM。将细胞在4℃下孵育45分钟。孵育后，用200μL FACS缓冲液在冰冷的PBS中以1000rpm洗涤细胞三次，持续5分钟。然后将细胞与100μL Alexa647AffiniPure山羊抗人IgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch，#109-605-044)一起孵育，并在FACS缓冲液中按1:250稀释制备。将细胞在4℃下于黑暗中孵育45分钟。孵育后，用200μL FACS缓冲液在冰冷的PBS中以1000rpm洗涤细胞三次，持续5分钟。然后将细胞重悬于含有DAPI(ThermoFisher，#D1306)染色的100μL FACS缓冲液中，然后通过流式细胞术(分析仪10)读数。使用FlowJo v10.8.1分析数据，以获得活细胞的MFI(平均荧光强度)。使用GraphPad Prism 9软件计算了EC50值。进行了三轮实验来评价三组EphA2抗体。这些轮是在不同的日子进行的。本文本文总结的所有结果呈现在图5-7和表17中。
表17.HKB-11EphA2+细胞系的结合结果总结
抗体 批号 EC50(nM)
LC Germ(1C1) BA-71-QS06 3.15
3x germ DC-69-ID09 23.87
S93Q DA-62-QP06 2.13
S93V PA-62-QD06 20.16
S10T BB-60-FO04 11.98
S93A HD-58-MP05 3.44
LC Germ(1C1) BA-71-QS06 2.76
S72T FE-76-NO13 3.19
G77S ZF-74-CQ11 3.73
N92Q DE-54-AX20 3.83
N92A BC-56-WI24 n/a
LC Germ(1C1) HE-38-AZ34 2.82
S72T DE-39-AD34 2.12
G77S ZE-39-AG34 2.21
N92Q VE-39-AK34 1.95
S72T_N92Q HA-13-AF39 1.8
G77S_N92Q HE-07-PV32 2.59
S72T_G77S_N92Q PE-07-PN32 1.81
实施例9.KinExA表观平衡KD测定
材料和方法
使用KinExA在亲和平衡环境下评估了抗EphA2 IgG抗体1C1及其轻链点突变IgG与HKB-11细胞上表达的人EphA2的结合。使用KinExA 3200自动进样器(Sapidyne)通过KinExA测量平衡滴定反应中的游离抗体。使用KinExA Pro 4-5-X(Sapidyne)分析数据。
将表达人EphA2的HKB-11细胞在含有10％热灭活FBS(HI-FBS，Thermo Fishercat#10082)和1％ Pen/Strep(Thermo Fisher cat#15140)的DMEM(Thermo Fisher cat#11995)中培养。细胞松散地粘附，并通过轻轻敲击烧瓶将其分离。通过离心(1,100rpm，4min，RT)沉淀细胞并重悬于含有10％ HI-FBS的PBS中至平衡滴定所需的最终密度的2x(典型地为4e6个细胞/ml)。将细胞在缓冲液中以一份对一份(1:1)连续稀释10倍，以提供10个浓度点。
将抗EphA2抗体在含有10％ HI-FBS和0.04％叠氮化钠的PBS中稀释至平衡滴定所需结合位点的最终浓度的2x。对于多曲线分析，每个数据集需要三个抗体结合位点浓度：1)<5倍的KD(KD控制的曲线)；2)>15倍的KD(浓度控制的曲线)；3)浓度在(1)和(2)之间，典型地比(1)高5倍并且比(2)低10倍。将细胞和抗体以1:1的比例在eppendorf管中组合，并在4℃下旋转孵育过夜。包括缓冲液和单独的抗体样品。将细胞沉淀，并将上清液转移至覆盖有可穿透薄膜的2ml 96孔深孔板。
将聚苯乙烯珠(Sapidyne cat#442178)用PBS中的30μg/ml抗人IgG Fc捕获抗体(Jackson cat#709-006-098)包被，在4℃下旋转过夜。通过短暂离心沉淀珠子，去除包被缓冲液，并于室温下在含有10mg/ml BSA(EMD Millipore cat#126575)和0.02％叠氮化钠的PBS中旋转封闭珠子1小时。将三管制备好的珠子添加至玻璃珠小瓶中的30ml运行缓冲液(PBS，0.02％叠氮化钠)中。
预先确定平衡样品注射体积和标记浓度，以通过注射500μl标记(Gt-抗人H&L IgGJackson cat#109-605-003)实现0.5V-2.0V。通过n曲线分析对数据进行分析。本文总结的所有结果呈现在图8和表18中。
表18.KinExA表观平衡KD测定结果
实施例10.Biacore KD测定
材料和方法
使用Biacore评估抗EphA2 IgG抗体1C1及其轻链点突变IgG与人、小鼠和食蟹猴EphA2胞外域的结合。如下所述，使用Biacore 8k仪器(Cytiva，原名GE HealthcareLifesciences)经由SPR确定动力学速率常数。
使用人Fab捕获方法来确定抗体的动力学。所用的抗Fab抗体在人Fab捕获试剂盒(Cytiva，cat#28958325)中提供，并根据制造商的说明固定在CM5传感器芯片的所有8个通道上。每个通道具有两个流动池。参考流动池仅含有固定化的抗Fab，而反应流动池通过抗Fab捕获抗EphA2 IgG。HBS-EP+缓冲液，pH 7.6被用作运行缓冲液。可溶性人、小鼠和食蟹猴EphA2胞外域在8个通道上流过两个流动池。EphA2胞外域浓度从50nM开始，并在运行缓冲液中以一份对一份(1:1)连续稀释为六个浓度。使分析室保持在37℃。在每个样品清洗结束时，使用试剂盒中提供的10mM甘氨酸-HCl(pH2.1)溶液进行再生。
使用Biacore Insight评价软件分析数据。完成双参考减法以产生最终数据。将原始数据拟合至1:1结合模型，其中将参数Rmax设置为本地。本文总结的所有结果呈现在图9A、9B和表19中。

Claims (96)

1.一种式(1)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p(1)
其中Ab是抗EphA2抗体或其抗原结合片段；
L是将Ab共价附接至D的接头；
p是1至16的整数；并且
D是共价附接至所述接头L的式(I)或式(II)的Bcl-xL抑制剂化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
R1和R2彼此独立地表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，其任选地被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；C3-C6环烷基；三氟甲基；直链或支链C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中所述杂环烷基基团任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代；
或R1和R2与携带它们的碳原子形成C3-C6亚环烷基基团，
R3表示选自以下的基团：氢；C3-C6环烷基；直链或支链C1-C6烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；-X1-O-Rc；-X1-COORc；-X1-PO(OH)2；-X1-SO2(OH)；-X1-N3和：
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；Ca-C6亚烷基-NRdRe；C1-C6亚烷基-N+RdReRf；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或Ra和Rb与携带它们的氮原子形成环B1；
或Ra、Rb和Rc与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Rc、Rd、Re、Rf彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或Rd和Re与携带它们的氮原子形成环B2，
或Rd、Re和Rf与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Het1表示选自以下的基团：
Het2表示选自以下的基团：
A1是-NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、任选地被羟基基团取代的C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或
RG1和RG2与其各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基基团，
R5表示选自以下的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；卤素或-CN，
R6表示选自以下的基团：
氢；
-C2-C6烯基；
-X2-O-R7；
-X2-NSO2-R7；
-C＝C(R9)-Y1-O-R7；
C3-C6环烷基；
任选地被羟基基团取代的C3-C6杂环烷基；
C3-C6亚环烷基-Y2-R7；
C3-C6亚杂环烷基-Y2-R7基团，
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基基团；(C3-C6)亚环烷基-R8；或：
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R’c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b、-X’2-NR’aR’b、-NR’c-X’2-N3和：
R9表示选自直链或支链C1-C6烷基、三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团，
R10表示选自氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基的基团，
R11表示选自氢、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8、C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8的基团，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基基团，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基基团，或R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
X1和X2彼此独立地表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；C1-C6亚烷基-N+R′dR′eR′f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R’a、R’b和R’c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R′d、R′e和R′f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Y1表示直链或支链C1-C4亚烷基，
Y2表示键、-O-、-O-CH2-、-O-CO-、-O-SO2-、-CH2-、-CH2-O、-CH2-CO-、-CH2-SO2-、-C2H5-、-CO-、-CO-O-、-CO-CH2-、-CO-NH-CH2-、-SO2-、-SO2-CH2-、-NH-CO-、-NH-SO2-，
m＝0、1或2，
p＝1、2、3或4，
B1、B2、B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基基团，该基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代或哌啶基，
其中R3和，如果存在的话，R8基团之一共价附接至所述接头，并且其中原子的化合价不会由于一个或多个与其键合的取代基而超出；或
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
n＝0、1或2，
------表示单键或双键，
A4和A5彼此独立地表示碳或氮原子，
Z1表示键、-N(R)-或-O-，其中R表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
R1表示选自以下的基团：氢；任选地被羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C3-C6环烷基；三氟甲基；直链或支链C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中所述杂环烷基基团任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代；
R2表示氢或甲基；
R3表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C4烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；-X1-O-Rc；-X1-COORc；-X1-PO(OH)2；-X1-SO2(OH)；-X1-N3和：
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NRdRe；C1-C6亚烷基-N+RdReRf；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或Ra和Rb与携带它们的氮原子形成环B1；
或Ra、Rb和Rc与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Rc、Rd、Re、Rf彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或Rd和Re与携带它们的氮原子形成环B2，
或Rd、Re和Rf与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Het1表示选自以下的基团：
Het2表示选自以下的基团：
A1是-NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、任选地被羟基基团取代的C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或
RG1和RG2与其各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基基团，
R5表示选自以下的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；卤素或-CN，
R6表示选自以下的基团：
氢；
-C2-C6烯基；
-X2-O-R7；
-X2-NSO2-R7；
-C＝C(R9)-Y1-O-R7；
C3-C6环烷基；
任选地被羟基基团取代的C3-C6杂环烷基；
C3-C6亚环烷基-Y2-R7；
C3-C6亚杂环烷基-Y2-R7基团，
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基基团；(C3-C6)亚环烷基-R8；或：
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R’c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b、-X’2-NR’aR’b、-NR’c-X’2-N3和：
R9表示选自直链或支链C1-C6烷基、三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团，R10表示选自氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基的基团，
R11表示选自氢、卤素、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8、C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8的基团，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基，或R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
X1表示直链或支链C1-C4亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X2表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；C1-C6亚烷基-N+R′dR′eR′f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R’a、R’b和R’c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R′d、R′e和R′f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Y1表示直链或支链C1-C4亚烷基，
Y2表示键、-O-、-O-CH2-、-O-CO-、-O-SO2-、-CH2-、-CH2-O、-CH2-CO-、-CH2-SO2-、-C2H5-、-CO-、-CO-O-、-CO-CH2-、-CO-NH-CH2-、-SO2-、-SO2-CH2-、-NH-CO-、-NH-SO2-，
m＝0、1或2，
p＝1、2、3或4，
B1、B2、B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基基团，该基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代或哌啶基，
其中R3和，如果存在的话，R8基团之一共价附接至接头，并且其中原子的化合价不会由于一个或多个与其键合的取代基而超出；并且
其中所述抗EphA2抗体或抗原结合片段包含：
(a)三个重链互补决定区(HCDR)，其包含SEQ ID NO：2(HCDR1)、SEQ ID NO：3(HCDR2)和SEQ ID NO：4(HCDR3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含SEQ ID NO：12(LCDR1)、SEQ ID NO：13(LCDR2)和SEQ ID NO：14、26、29、32或35(LCDR3)的氨基酸序列；
(b)三个重链互补决定区(HCDR)，其包含SEQ ID NO：5(HCDR1)、SEQ ID NO：6(HCDR2)和SEQ ID NO：4(HCDR3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含SEQ ID NO：15(LCDR1)、SEQ ID NO：16(LCDR2)和SEQ ID NO：17、24、27、30、33或36(LCDR3)的氨基酸序列；
(c)三个重链互补决定区(HCDR)，其包含SEQ ID NO：7(HCDR1)、SEQ ID NO：8(HCDR2)和SEQ ID NO：9(HCDR3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含SEQ ID NO：18(LCDR1)、SEQ ID NO：13(LCDR2)和SEQ ID NO：17、24、27、30、33或36(LCDR3)的氨基酸序列；或
(d)三个重链互补决定区(HCDR)，其包含SEQ ID NO：10(HCDR1)、SEQ ID NO：6(HCDR2)和SEQ ID NO：4(HCDR3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含SEQ ID NO：15(LCDR1)、SEQ ID NO：16(LCDR2)和SEQ ID NO：17、27、30、33或36(LCDR3)的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中p是1至6或2至4的整数，或p是2或4；或p通过液相色谱-质谱法(LC-MS)确定。
3.如权利要求1或2所述的抗体-药物缀合物，其中L包含：
附接基团；
至少一个桥连间隔基基团；以及
至少一个可切割基团，任选地至少一个包含焦磷酸基团和/或自分解基团的可切割基团。
4.如权利要求3所述的抗体-药物缀合物，其中-(L-D)具有式(A)：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥连间隔基基团；
E是可切割基团。
5.如权利要求3或4所述的抗体-药物缀合物，其中所述可切割基团包含焦磷酸基团或所述可切割基团包含
6.如权利要求3或4所述的抗体-药物缀合物，其中所述桥连间隔基基团包含：
(i)聚氧乙烯(PEG)基团；
(ii)PEG基团，其选自PEG1、PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14和PEG15；
(iii)-CO-CH2-CH2-PEG12-基团；
(iv)丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基或辛酰基基团；或
(v)己酰基基团。
7.如权利要求6所述的抗体-药物缀合物，其中(i)所述附接基团由至少一个选自马来酰亚胺基团、硫醇基团、环辛炔基团和叠氮基基团的反应性基团形成；任选地其中：
a)所述马来酰亚胺基团具有结构：
b)所述叠氮基基团具有以下结构：-N＝N+＝N-；
c)所述环辛炔基团具有结构：并且其中-*是与所述抗体的键；或
d)所述环辛炔基团具有结构：并且其中-*是与所述抗体的键；或
(ii)所述附接基团具有包含以下的式：
并且
其中-*是与所述抗体的键。
8.如权利要求7所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体通过选自以下的附接基团与所述接头(L)接合：
其中-*是与所述抗体的键，并且其中是与所述桥连间隔基基团的键。
9.如权利要求8所述的抗体-药物缀合物，其中所述桥连间隔基基团是-CO-CH2-CH2-PEG12-。
10.如权利要求8或9所述的抗体-药物缀合物，其中所述桥连间隔基基团与可切割基团接合；任选地所述可切割基团是-焦磷酸-CH2-CH2-NH2-。
11.如权利要求8至10中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述可切割基团与Bcl-xL抑制剂(D)接合。
12.如权利要求1至3中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头包含：
附接基团，
至少一个桥连间隔基基团，
肽基团，和
至少一个可切割基团。
13.如权利要求12所述的抗体-药物缀合物，其中-(L-D)具有式(B)：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含1至6个氨基酸残基的肽基团，或Lp包含基团
E是可切割基团
L2是桥连间隔基；
m是0或1；并且
D是Bcl-xL抑制剂。
14.如权利要求12或13所述的抗体-药物缀合物，其中(i)所述附接基团由包括马来酰亚胺基团、硫醇基团、环辛炔基团和/或叠氮基基团的至少一个反应性基团形成，任选地其中：
a)所述马来酰亚胺基团具有结构：
b)所述叠氮基基团具有结构：-N＝N+＝N-；或
c)所述环辛炔基团具有结构：并且其中-*是与所述抗体的键；或
(ii)所述附接基团具有包含以下的式：
并且
其中-*是与所述抗体的键。
15.如权利要求12至14中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中：
(i)至少一个桥连间隔基包含PEG基团，任选地所述PEG基团选自PEG1、PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14和PEG15；或
(ii)至少一个桥连间隔基选自*-C(O)-CH2-CH2-PEG1-**、*-C(O)-CH2-PEG3-**、*-C(O)-CH2-CH2-PEG12**、*-NH-CH2-CH2-PEG1-**、多羟基烷基基团、*-C(O)-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-C(O)-**、和*-C(O)-CH2-CH2-PEG12-NH-C(O)CH2-CH2-**，其中**表示所述至少一个桥连间隔基与所述附接基团的直接或间接附接点，并且*表示所述至少一个桥连间隔基与所述肽基团的直接或间接附接点。
16.如权利要求12至15中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中L1选自*-C(O)-CH2-CH2-PEG1-**、*-C(O)-CH2-PEG3-**、*-C(O)-CH2-CH2-PEG12**、*-NH-CH2-CH2-PEG1-**和多羟基烷基基团，其中**表示L1与R1的直接或间接附接点，*表示L1与Lp的直接或间接附接点。
17.如权利要求12至16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中m是1且L2是-C(O)-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-C(O)-。
18.如权利要求12至17中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中
(i)所述肽基团包含1至6、1至4、1至3或1至2个氨基酸残基，任选地所述氨基酸残基选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-磺基丙氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-蛋氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)和L-酪氨酸(Tyr)；
(ii)所述肽基团包含Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、磺基-Ala-Val-Cit、磺基-Ala-Val-Ala、Gly-Gly-Gly和/或Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO：78)；或
(iii)所述肽基团选自：
19.如权利要求12至18中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中(i)所述可切割基团包含焦磷酸基团和/或自分解基团；(ii)所述可切割基团包含自分解基团；或(iii)所述可切割基团包含自分解基团，所述自分解基团包括对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(多羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(多羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵。
20.如权利要求13至19中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中m是0或1或m是1，并且所述桥连间隔基包含
21.如权利要求13至20中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中-(L-D)由选自以下的化合物形成：
22.如权利要求13至21中任一项所述的抗体药物缀合物，其中-(L-D)包含选自以下的式：
其中-*是与所述抗体的键。
23.如权利要求1或2所述的抗体-药物缀合物，其中-(L-D)具有式(C)：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含1至6个氨基酸的肽基团；
D是Bcl-xL抑制剂；
G1-L2-A是自分解间隔基；
L2是键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；并且
R2是亲水性部分。
24.如权利要求23所述的抗体-药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中-(L-D)具有式(D)：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥连间隔基；
Lp是包含1至6个氨基酸的肽基团；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；
L3是间隔基部分；以及
R2是亲水性部分。
25.如权利要求23或24所述的抗体-药物缀合物，其中：
(1)L1包含：
*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，
其中每个n是1至12的整数，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点；
(2)L1是n是1至12的整数或n是1或n是12，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点；
(3)L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点；
(4)L1包含其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点；或
(5)L1是桥连间隔基，其包含：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与Lp的直接或间接附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点；
X1是并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；并且
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
并且每个R3独立地选自H和C1-C6烷基。
26.如权利要求23至25中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R2是亲水性部分，所述亲水性部分包含聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽、被1至3个取代的C2-C6烷基、或被1至2个独立地选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。
27.如权利要求23至26中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R2是
其中n是1至6的整数、
28.如权利要求23或24所述的抗体-药物缀合物，其中所述亲水性部分包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中n是3至25的整数；并且R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；或
(ii)下式的聚乙二醇：其中R是H、-CH3、CH2CH2NHC(＝O)ORa、-CH2CH2NHC(＝O)Ra或-CH2CH2C(＝O)ORa，R’是OH、-OCH3、-CH2CH2NHC(＝O)ORa、-CH2CH2NHC(＝O)Ra或-OCH2CH2C(＝O)ORa，其中Ra是H或任选地被OH或C1-4烷氧基取代的C1-4烷基，并且m和n各自独立地是2至25的整数。
29.如权利要求23至27中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述亲水性部分包含
30.如权利要求23至29中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中：
(i)L3是具有结构的间隔基部分，
其中：
W是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(Rb)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-、-C(＝O)N(X-R2)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)-、-CH2NRbC(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)NRb-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是键、三唑基或-CH2-三唑基-，
其中X连接至R2；或
(ii)L3是具有结构的间隔基部分，
其中：
W是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(Rb)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-、-C(＝O)N(X-R2)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)-、-CH2NRbC(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)NRb-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个Rb独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是-CH2-三唑基-C1-4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-CH2-三唑基-C1-4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-C4-6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中每个n独立地是1、2或3，
其中X连接至R2。
31.如权利要求3至30中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述附接基团通过包含至少一个反应性基团的反应形成。
32.如权利要求3至31中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述附接基团通过使以下进行反应形成：
附接至所述接头的第一反应性基团，和
附接至所述抗体或作为所述抗体的氨基酸残基的第二反应性基团，其中任选地，
(i)所述反应性基团中的至少一个包含：
硫醇、
马来酰亚胺、
卤代乙酰胺、
叠氮化物、
炔烃、
环辛烯、
三芳基膦、
氧杂降冰片二烯、
环辛炔、
二芳基四嗪、
单芳基四嗪、
降冰片烯、
醛、
羟胺、
肼、
NH2-NH-C(＝O)-、
酮、
乙烯基砜、
氮杂环丙烷、
氨基酸残基、
-ONH2、-NH2、 -N3、-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(O)NHNH2、
其中：
每个R3独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R4是2-吡啶基或4-吡啶基；
每个R5独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R6独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；和/或
(ii)所述第一反应性基团和所述第二反应性基团包含：
硫醇和马来酰亚胺、
硫醇和卤代乙酰胺、
硫醇和乙烯基砜、
硫醇和氮杂环丙烷、
叠氮化物和炔烃、
叠氮化物和环辛炔、
叠氮化物和环辛烯、
叠氮化物和三芳基膦、
叠氮化物和氧杂降冰片二烯、
二芳基四嗪和环辛烯、
单芳基四嗪和降冰片烯、
醛和羟胺、
醛和肼、
醛和NH2-NH-C(＝O)-、
酮和羟胺、
酮和肼、
酮和NH2-NH-C(＝O)-，
羟胺和
胺和或
CoA或CoA类似物和丝氨酸残基。
33.如权利要求3至32中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述附接基团包含选自以下的基团：
酰胺；
以及
二硫化物，
其中：
R32是H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；
R35是H、C1-6烷基、苯基或被1至3个-OH基团取代的C1-4烷基；
每个R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基，被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R37独立地选自H、苯基和吡啶；
q是0、1、2或3；
R8是H或甲基；并且
R9是H、-CH3或苯基。
34.如权利要求23至33中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述肽基团包含1至4或1至3或1或2个氨基酸残基，任选地所述氨基酸残基选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-磺基丙氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-蛋氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)和L-酪氨酸(Tyr)。
35.如权利要求23至33中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述肽基团包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、磺基-Ala-Val-Cit、磺基-Ala-Val-Ala、Gly-Gly-Gly和/或Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO：78)。
36.如权利要求23至35中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中Lp选自：
37.如权利要求23至36中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中：
-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
其中：
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
每个R独立地选自H、-CH3和-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
每个R独立地选自H、-CH3和-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
Xa是-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
R是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
Xb是-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-并且每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；
其中：
A是键、-OC(＝v)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂；或
其中：
每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂，或
其中：
每个R独立地是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；
n是2至24的整数；并且
D是Bcl-xL抑制剂，或
其中：
A是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A的*表示与D的附接点；并且
D是Bcl-xL抑制剂。
38.如权利要求23至37中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中A是键和/或R是-CH3或-CH2CH2COOH。
39.如权利要求23至37中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中A是-OC(＝O)-*和/或R是-CH3或-CH2CH2COOH。
40.如权利要求23至39中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中-(L-D)由选自以下的化合物形成：
41.如权利要求1至40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D包含式(I)的化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
R1和R2彼此独立地表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，其任选地被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；C3-C6环烷基；三氟甲基；直链或支链C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中所述杂环烷基基团任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代；
或R1和R2与携带它们的碳原子形成C3-C6亚环烷基基团，
R3表示选自以下的基团：氢；C3-C6环烷基；直链或支链C1-C6烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；-X1-O-Rc；-X1-COORc；-X1-PO(OH)2；-X1-SO2(OH)；-X1-N3和：
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NRdRe；C1-C6亚烷基-N+RdReRf；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或Ra和Rb与携带它们的氮原子形成环B1；
或Ra、Rb和Rc与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Rc、Rd、Re、Rf彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或Rd和Re与携带它们的氮原子形成环B2，
或Rd、Re和Rf与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Het1表示选自以下的基团：
Het2表示选自以下的基团：
A1是-NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、任选地被羟基基团取代的C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或
RG1和RG2与其各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基基团，
R5表示选自以下的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；卤素或-CN，
R6表示选自以下的基团：
氢；
-C2-C6烯基；
-X2-O-R7；
-X2-NSO2-R7；
-C＝C(R9)-Y1-O-R7；
C3-C6环烷基；
任选地被羟基基团取代的C3-C6杂环烷基；
C3-C6亚环烷基-Y2-R7；
C3-C6亚杂环烷基-Y2-R7基团，
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基基团；
(C3-C6)亚环烷基-R8；或：
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R’c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b、-X’2-NR’aR’b、-NR’c-X’2-N3和：
R9表示选自直链或支链C1-C6烷基、三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团，R10表示选自氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基的基团，
R11表示选自氢、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8、C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8的基团，R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基基团，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基基团，或R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
X1和X2彼此独立地表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；C1-C6亚烷基-N+R′dR′eR′f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R’a、R’b和R’c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R′d、R′e和R′f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Y1表示直链或支链C1-C4亚烷基，
Y2表示键、-O-、-O-CH2-、-O-CO-、-O-SO2-、-CH2-、-CH2-O、-CH2-CO-、-CH2-SO2-、-C2H5-、-CO-、-CO-O-、-CO-CH2-、-CO-NH-CH2-、-SO2-、-SO2-CH2-、-NH-CO-、-NH-SO2-，
m＝0、1或2，
p＝1、2、3或4，
B1、B2、B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基基团，该基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代或哌啶基，
其中R3和，如果存在的话，R8基团之一共价附接至所述接头，并且其中原子的化合价不会由于一个或多个与其键合的取代基而超出。
42.如权利要求41所述的抗体-药物缀合物，其中R1是直链或支链C1-6烷基且R2是H。
43.如权利要求1至40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D包含式(II)的化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
n＝0、1或2，
------表示单键或双键，
A4和A5彼此独立地表示碳或氮原子，
Z1表示键、-N(R)-或-O-，其中R表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
R1表示选自以下的基团：氢；任选地被羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C3-C6环烷基；三氟甲基；直链或支链C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中所述杂环烷基基团任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代；
R2表示氢或甲基；
R3表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C4烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；
-X1-O-Rc；-X1-COORc；-X1-PO(OH)2；-X1-SO2(OH)；-X1-N3和：
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NRdRe；C1-C6亚烷基-N+RdReRf；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或Ra和Rb与携带它们的氮原子形成环B1；
或Ra、Rb和Rc与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Rc、Rd、Re、Rf彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或Rd和Re与携带它们的氮原子形成环B2，
或Rd、Re和Rf与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Het1表示选自以下的基团：
Het2表示选自以下的基团：
A1是-NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、任选地被羟基基团取代的C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或
RG1和RG2与其各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基，
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基基团，
R5表示选自以下的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；卤素或-CN，
R6表示选自以下的基团：
氢；
-C2-C6烯基；
-X2-O-R7；
-X2-NSO2-R7；
-C＝C(R9)-Y1-O-R7；
C3-C6环烷基；
任选地被羟基基团取代的C3-C6杂环烷基；
C3-C6亚环烷基-Y2-R7；
C3-C6亚杂环烷基-Y2-R7基团，
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基基团；
(C3-C6)亚环烷基-R8；或：
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R’c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b、-X’2-NR’aR’b、-NR’c-X’2-N3和：
R9表示选自直链或支链C1-C6烷基、三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团，R10表示选自氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基的基团，
R11表示选自氢、卤素、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8、C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8的基团，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基，或R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
X1表示直链或支链C1-C4亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X2表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；C1-C6亚烷基-N+R′dR′eR′f；C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R’a、R’b和R’c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R′d、R′e和R′f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
Y1表示直链或支链C1-C4亚烷基，
Y2表示键、-O-、-O-CH2-、-O-CO-、-O-SO2-、-CH2-、-CH2-O、-CH2-CO-、-CH2-SO2-、-C2H5-、-CO-、-CO-O-、-CO-CH2-、-CO-NH-CH2-、-SO2-、-SO2-CH2-、-NH-CO-、-NH-SO2-，
m＝0、1或2，
p＝1、2、3或4，
B1、B2、B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基基团，该基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代或哌啶基，
其中R3和，如果存在的话，R8基团之一共价附接至所述接头，并且其中原子的化合价不会由于一个或多个与其键合的取代基而超出。
44.如权利要求43所述的抗体-药物缀合物，其中A1和A5均表示氮原子，R1是直链或支链C1-6烷基；R2是H；n是1；并且------表示单键。
45.如权利要求1至44中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中G选自由以下组成的组：-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
-RG3选自由以下组成的组：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或
RG1和RG2与其各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；或在替代方案中，G选自由以下组成的组：
其中RG4选自任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C3-C6环烷基。
46.如权利要求1至40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D包含式(IA)或(IIA)的化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
Z1表示键或-O-，
R3表示选自以下的基团：氢；C3-C6环烷基；直链或支链C1-C6烷基；-X1-NRaRb；
-X1-N+RaRbRc；和-X1-O-Rc，
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；和C1-C6亚烷基-SO2O-，
Rc表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
Het2表示选自以下的基团：
A1是-NH-、-N(C1-C3烷基)、O、S或Se，
A2是N、CH或C(R5)，
G选自由以下组成的组：
-C(O)OH、-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、任选地被羟基基团取代的C1-C6烷基、卤素、-NO2和-CN，其中：
-RG1和RG2在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氢和任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；
-RG3是任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；或
RG1和RG2与其各自所附接的原子一起组合形成C3-C8杂环烷基；
R4表示氢、氟、氯或溴原子、甲基、羟基或甲氧基基团，
R5表示选自以下的基团：任选地被1至3个卤素原子取代的C1-C6烷基；卤素或-CN，
R6表示选自以下的基团：
-X2-O-R7；以及
任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-C6烷基基团；(C3-C6)亚环烷基-R8；或：
其中Cy表示C3-C8环烷基，
R8表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基，-NR’aR’b；-NR’a-CO-OR’c；-NR’a-CO-R’c；-N+R’aR’bR’c；-O-R’c；-NH-X’2-N+R’aR’bR’c；-O-X’2-NR’aR’b；-X’2-NR’aR’b：-NR’c-X’2-N3和：
R10表示选自氢、氟、氯、溴、-CF3和甲基的基团，
R11表示选自氢、C1-C3亚烷基-R8、-O-C1-C3亚烷基-R8、-CO-NRhRi和-CH＝CH-C1-C4亚烷基-NRhRi、-CH＝CH-CHO、C3-C8亚环烷基-CH2-R8、C3-C8亚杂环烷基-CH2-R8的基团，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基基团，或R14和R15与携带它们的碳原子形成环己基，
Rh和Ri彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
X1和X2彼此独立地表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；杂环烷基；-SO2-苯基，其中所述苯基可以被直链或支链C1-C6烷基取代；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-SO2OH；C1-C6亚烷基-SO2O-；C1-C6亚烷基-COOH；C1-C6亚烷基-PO(OH)2；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；C1-C6亚烷基-N+R′dR′eR′f.C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-OH；C1-C6亚烷基-苯基，其中所述苯基可以被羟基或C1-C6烷氧基基团取代；
基团：
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
或R’a、R’b和R’c与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
R’c、R’d、R’e、R’f彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基，
或R’d和R’e与携带它们的氮原子形成环B4，
或R′d、R′e和R′f与携带它们的氮原子形成桥连的C3-C8杂环烷基，
m＝0、1或2，
p＝1、2、3或4，
B3和B4彼此独立地表示C3-C8杂环烷基基团，该基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基、-NH2、氧代或哌啶基。
47.如权利要求46所述的抗体-药物缀合物，其中G选自由以下组成的组：-C(O)OH、-C(O)ORG3、-C(O)NRG1RG2、-C(O)RG2、-NRG1C(O)RG2、-NRG1C(O)NRG1RG2、-OC(O)NRG1RG2、-NRG1C(O)ORG3、-C(＝NORG1)NRG1RG2、-NRG1C(＝NCN)NRG1RG2、-NRG1S(O)2NRG1RG2、-S(O)2RG3、-S(O)2NRG1RG2、-NRG1S(O)2RG2、-NRG1C(＝NRG2)NRG1RG2、-C(＝S)NRG1RG2、-C(＝NRG1)NRG1RG2、卤素、-NO2和-CN。
48.如权利要求1至47中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R7表示选自以下的基团：直链或支链C1-Ca烷基基团；(C3-Ca)亚环烷基-R8；或：
其中Cy表示C3-C8环烷基。
49.如权利要求1至47中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中
R7表示选自以下的基团：
50.如权利要求1至40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D包含式(IB)、(IC)、(IIB)或(IIC)的化合物：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐，其中：
对于式(IB)或(IC)，R3表示选自以下的基团：氢；直链或支链C1-C6烷基；-X1-NRaRb；-X1-N+RaRbRc；和-X1-O-Rc；
对于式(IIB)或(IIC)，Z1表示键，并且R3表示氢；或Z1表示-O-，并且R3表示-X1-NRaRb，
Ra和Rb彼此独立地表示选自以下的基团：氢；任选地被一个或两个羟基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；和C1-C6亚烷基-SO2O-，
Rc表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团
R6表示-X2-O-R7或任选地被直链或支链C1-C6烷基基团取代的亚杂芳基-R7基团，
R7表示选自以下的基团：
R8表示选自以下的基团：-NR’aR’b；-O-X’2-NR’aR’b；和-X’2-NR’aR’b，
R10表示氟，
R12和R13彼此独立地表示氢原子或甲基基团，
R14和R15彼此独立地表示氢或甲基基团，
X1和X2彼此独立地表示直链或支链C1-C6亚烷基基团，其任选地被一个或两个选自三氟甲基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基的基团取代，
X’2表示直链或支链C1-C6亚烷基，
R’a和R’b彼此独立地表示选自以下的基团：氢；任选地被一个或两个羟基或C1-C6烷氧基基团取代的直链或支链C1-C6烷基；C1-C6亚烷基-NR’dR’e；
或R’a和R’b与携带它们的氮原子形成环B3，
R’d、R’e彼此独立地表示氢或直链或支链C1-C6烷基基团，
B3表示C3-C8杂环烷基基团，该基团可以：(i)是单环基团或双环基团，其中双环基团包括稠合、桥连或螺环系统，(ii)除所述氮原子外，还可以含有一个或两个独立地选自氧和氮的杂原子，(iii)被一个或两个选自以下的基团取代：氟、溴、氯、直链或支链C1-C6烷基、羟基和氧代。
51.如权利要求1至50中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R7表示以下基团：
52.如权利要求1至50中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R7表示选自以下的基团：
53.如权利要求41至52中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R8表示选自以下的基团：
其中--＊表示与所述接头的键。
54.如权利要求41至53中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中B3表示选自吡咯烷基基团、哌啶基基团、哌嗪基基团、吗啉基基团、氮杂环庚基基团和4，4-二氟哌啶-1-基基团的C3-C8杂环烷基基团。
55.如权利要求1至40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D表示附接至L的下列任一个：
或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐。
56.如权利要求1至40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D包含由选自表A2中的那些的式表示的基团。
57.如权利要求1至40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中-(L-D)由表B中的化合物或前述任一的对映异构体、非对映异构体和/或药学上可接受的盐形成。
58.如权利要求1至57中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中：
所述抗EphA2抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区以及含有SEQ ID NO：11、19、20、21、22、23、25、28、31、34、71、72或73的氨基酸序列的轻链可变区。
59.如权利要求1至57中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗EphA2抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸序列的轻链。
60.如权利要求1至57中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗EphA2抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸序列的轻链。
61.如权利要求1至57中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗EphA2抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸序列的轻链。
62.如权利要求60所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗EphA2抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的轻链。
63.如权利要求61所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗EphA2抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的轻链。
64.一种组合物，其包含多个拷贝的如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述组合物中抗体-药物缀合物的平均p是约2至约16，例如约2至约8，例如约2至约4。
65.一种药物组合物，其包含如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物或如权利要求64所述的组合物，以及药学上可接受的载剂。
66.一种治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求64所述的组合物或如权利要求65所述的药物组合物。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述癌症表达EphA2。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述癌症是肿瘤或血液癌症，任选地，所述癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病，包括急性淋巴母细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
70.一种减少或抑制受试者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求64所述的组合物或如权利要求65所述的药物组合物。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述肿瘤表达EphA2。
72.如权利要求70或71所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或脾癌。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺癌或非小细胞肺癌。
74.一种减少或抑制受试者的血液癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求64所述的组合物或如权利要求65所述的药物组合物。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述血液癌症表达EphA2。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中所述血液癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒单核细胞性白血病(CMML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤、或非霍奇金淋巴瘤或骨髓增生异常综合征(MDS)。
77.如权利要求70至76中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用使肿瘤生长或血液癌症减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
78.一种减少或减慢受试者中癌细胞群扩增的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求64所述的组合物或如权利要求63所述的药物组合物。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述癌细胞群表达EphA2。
80.如权利要求78或79所述的方法，其中所述癌细胞群来自肿瘤或血液癌症，任选地其中所述癌细胞群来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性淋巴母细胞性白血病的淋巴母细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述癌细胞群来自乳腺癌或非小细胞肺癌。
82.如权利要求78至81中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用使所述癌细胞群减少或使所述癌细胞群的扩增减慢至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
83.如权利要求66至82中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物作为单一疗法施用。
84.如权利要求66至82中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物辅助于另一种治疗剂或放射疗法施用。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物以有效地使所述肿瘤细胞对一种或多种另外的治疗剂和/或放射疗法敏感的量施用。
86.如权利要求66至82中任一项所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用至少一种另外的治疗剂。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述一种另外的治疗剂是Bcl-2抑制剂、紫杉烷、长春花生物碱、MEK抑制剂、ERK抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、核苷类似物或RAF抑制剂。
88.如权利要求86所述的方法，其中所述一种另外的治疗剂选自维奈托克、化合物A2、长春新碱、托泊替康、多西他赛、紫杉醇、LTT463、曲美替尼、吉西他滨和LXH254。
89.一种抑制表达Bcl-xL的细胞中的Bcl-xL活性的方法，所述方法包括使所述细胞与能够结合所述细胞的如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物在其中所述抗体药物缀合物结合所述细胞的条件下接触。
90.一种确定患有或疑似患有癌症的受试者是否会对使用如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求64所述的组合物或如权利要求65所述的药物组合物的治疗有应答的方法，所述方法包括提供来自所述受试者的生物样品；将所述样品与所述抗体-药物缀合物接触；并且检测所述抗体-药物缀合物与所述样品中癌细胞的结合。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述样品中的癌细胞表达EphA2。
92.如权利要求90或权利要求91所述的方法，其中所述癌症表达EphA2。
93.如权利要求90至92中任一项所述的方法，其中所述癌症是肿瘤或血液癌症，任选地，所述癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病，包括急性淋巴母细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
95.如权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述样品是组织活检样品、血液样品或骨髓样品。
96.一种制备如权利要求1至63中任一项所述的抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括在允许缀合的条件下，使抗EphA2抗体或抗原结合片段与接合至Bc1-xL抑制剂的可切割接头反应。
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