CN107847523B - 用于诱导有丝分裂后细胞的细胞分裂的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供用于诱导有丝分裂后细胞的细胞周期重新进入的方法。本公开还提供用于治疗疾病如心血管疾病、神经障碍、听力损失和糖尿病的细胞和组合物。

Description

用于诱导有丝分裂后细胞的细胞分裂的方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2015年4月7日提交的美国临时申请62/144,244和2015年4月22日提交的美国临时申请62/151,321的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

再生医学是为获得或恢复正常细胞功能的细胞、组织和器官的替代、工程改造和再生。大部分再生医学领域集中在细胞替代疗法，特别是基于干细胞的疗法。使得干细胞独特地适用于基于细胞的应用的一个特性是其在培养物中长期增殖的能力。这种增殖能力提供了一种原料来源，由此可衍生足够数量的细胞用于基于细胞的应用。然而，随着细胞老化，甚至许多在培养物中生长的干细胞，其增殖能力也趋于降低。

此外，许多成体细胞，包括心肌细胞、神经元和骨骼肌，被认为是通过肥大而不是增生实现生长的有丝分裂后细胞。有丝分裂后细胞不能分裂或再生，或者分裂或再生的能力极其有限。因此，许多含有这些有丝分裂后细胞的器官在任何重大损伤后充分修复或恢复功能的能力受到严格限制。

提供用于重新启动有丝分裂后的细胞分裂以再生细胞和/或替代受损细胞的方法将是有益的。这种能力对于体外培养和筛选以及用于治疗众多疾病和病症的体内应用将是有用的。

发明内容

本公开是基于某些药剂可以诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的发现，并且在某种程度上涉及诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的方法，其包括使所述有丝分裂后细胞与有效量的包含至少一种周期蛋白依赖性激酶(CDK)和至少一种周期蛋白或其各自的等同物的组合物接触，从而诱导所述有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入。

本公开的一个方面提供了被修饰以过度表达至少一种CDK和至少一种周期蛋白或其各自的等同物的分离的增殖性有丝分裂后细胞。本公开的另一个方面提供了被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其各自的等同物的分离的增殖性有丝分裂后细胞。

本公开的一个方面提供用于治疗心血管疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其各自的等同物的表达的组合物。

本公开的另一个方面提供用于治疗神经疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其等同物的表达的组合物。

在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与有效量的CDK激活剂、转化生长因子β抑制剂或其组合接触。在一些实施方案中，所述CDK激活剂是CDK1激活剂。

在一些实施方案中，所述接触在体外或体内进行。

在一些实施方案中，所述有丝分裂后细胞选自心肌细胞、神经细胞、胰腺细胞、毛细胞和骨骼肌细胞。在一个优选实施方案中，所述增殖性有丝分裂后细胞是增殖性心肌细胞。在一些实施方案中，所述增殖性心肌细胞被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其等同物。在其它实施方案中，所述增殖性心肌细胞被修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。在另一个优选实施方案中，所述增殖性有丝分裂后细胞是增殖性神经细胞。在一些实施方案中，所述增殖性神经细胞被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其各自的等同物。在其它实施方案中，所述增殖性神经细胞被修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。

在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种核酸。在一些实施方案中，所述周期蛋白依赖性激酶(CDK)和/或所述周期蛋白由核酸编码。在一些实施方案中，所述至少一种核酸是被修饰的mRNA。在其它实施方案中，所述至少一种核酸被组成型表达。

在一些实施方案中，所述周期蛋白选自周期蛋白A、周期蛋白B、周期蛋白D和周期蛋白E。在一些实施方案中，所述周期蛋白B是周期蛋白B1(CCNB1)。在一些实施方案中，所述周期蛋白D是周期蛋白D1(CCND1)。

在一些实施方案中，所述CDK选自CDK1、CDK2、CDK3、CDK4和CDK6。在一个优选实施方案中，所述CDK是CDK1。在另一个优选实施方案中，所述CDK是CDK4。在一些实施方案中，其中所述CDK被组成型表达。

在一些实施方案中，所述CDK是CDK1并且所述周期蛋白是CCNB1。

在一些实施方案中，所述组合物还包含CDK4、CCND1或两者。

在一些实施方案中，所述细胞还被修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。

在一些实施方案中，所述方法包括施用有效量的增加CDK4、CCND1或两者的表达的组合物。

另一个方面提供用于治疗心血管疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其各自的等同物的表达的组合物。

另一个方面提供用于治疗心血管疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开和描述的增殖性有丝分裂后细胞的群体。

另一个方面提供用于治疗神经疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开和描述的增殖性有丝分裂后细胞的群体。

在另一个方面提供用于治疗神经疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其等同物的表达的组合物。

附图说明

图1描绘了显示与初生(新生P0)和成体(6周龄)小鼠心脏细胞之间的细胞周期调控相关的差异表达基因的所选微阵列数据。数据表示为log₂，其比较了成体和新生心脏细胞。

图2表明，增殖性(初生)和非增殖性(成体)心脏细胞之间的几种主要差异调控基因的过度表达在小鼠心肌细胞中促进心脏细胞增殖(图A)。用表达对照、CDK1、CCNB1或AURKB的腺病毒转导的心肌细胞用EDU增殖标志物、肌钙蛋白T心脏标志物和DAPI核染色剂染色。所有三种基因都增强心脏增殖(图B)。

图3表明，CDK1、CCNB1和AURKB的过度表达促进人类诱导多能干细胞(hiPSC)衍生心肌细胞中的心脏细胞增殖。过度表达CDK1、CCNB1和AURKB的人类iPSC衍生心肌细胞显示增殖标志物磷酸化组蛋白H3(PHH3)的表达增加。

图4显示，使用三种不同技术定量心肌细胞的细胞数量，CDK1、CCNB1和AURKB在hiPSC衍生心肌细胞中过度表达72小时后，心肌细胞数量增加。图A显示响应于CDK1、CCNB1和AURKB过度表达的细胞核总数加倍，并且所染色的核总数的约30％对PHH3呈阳性。荧光激活细胞分选(FACS)也显示了hiPSC衍生心肌细胞中CDK1、CCNB1和AURKB的过度表达后细胞总数增加(图B)。ATP细胞含量分析显示，CDK1、CCNB1和AURKB在hiPSC衍生心肌细胞(n＝3，*p<0.05)中过度表达后，细胞数量增加两倍(图C)。

图5描绘了过度表达CDK1、CCNB1和AURKB的hiPSC衍生心肌细胞中的细胞分裂的延时成像。图5中的1-15是持续四天每小时采集的代表性图像。图5中的16显示在成像期结束时的细胞对心脏标志物肌钙蛋白T染色呈阳性。箭头表示两个分裂细胞及其后代。

图6描绘了从过度表达组成型活性CDK1(CDK1AF)、CCNB1和AURKB的α-MHC-GFP小鼠分离的成体小鼠心肌细胞中的细胞分裂的延时成像。图6中的1-8是持续四天每小时采集的代表性图像，其显示心肌细胞的细胞分裂。

图7表明组成型活性CDK1(CDK1AF)、CCNB1和AURKB的过度表达促进小鼠原代心肌细胞中的心脏细胞增殖。图像是用对照载体(图A)或CDK1AF、CCNB1和AURKB(图B)转导并用磷酸化组蛋白H3(PHH3)染色的成体小鼠心肌细胞的代表性图像。箭头表示分裂细胞。

图8显示了小鼠原理研究证据的结果。将CDK1AF、CCNB1和AURKB或GFP腺病毒注射到心肌梗塞(MI)后c57bl6/N心脏中的损伤部位。在梗塞后5天(图A)采集心脏以评估细胞增殖(PHH3染色)或在梗塞后6周(图B)采集心脏以评估心脏功能和组织学。将MI后六周采集的心脏固定并使用Masson Trichrome染色剂对于纤维化染色。

图9显示了小鼠原理研究证据的心脏功能评估结果。将CDK1AF、CCNB1和AURKB或GFP对照腺病毒注射到心肌梗塞(MI)后c57bl6/N心脏中的损伤部位。接着对动物进行超声心动图检查以通过测量射血分数％(图A)和随时间推移的射血分数下降(图B)来评估MI后3天、10天、24天和40天的心脏功能。

图10显示了通过细胞增殖(PHH3染色)评估的各种因素组合诱导人类心肌细胞的细胞周期重新进入的能力(图A)和通过总核计数评估的各种因素组合诱导人类心肌细胞存活的能力(图B)。在处理后4、8和12天评估细胞。

图11显示了CDK1、CCNB和Aurora的第一混合物(图A)，CDK4和CCND的混合物(图B)，以及CDK1、CDK4、CCNB和CCND的混合物(图C)的细胞周期分布差异。

图12显示了在心肌梗塞时将CDK1AF、CCNB、CDK4、CCND(G1/G2混合物)腺病毒注射到心肌中后改善的心脏功能，如通过超声心动图检查测量的射血分数(EF)所指示。

图13描绘了从对照和经过处理的动物中获取的组织切片，其显示经过处理的动物中的肌肉较粗(图A)和瘢痕大小降低(图B)。

图14显示了使用双标志物(MADM)分析的嵌合(mosaic)分析用CDK1AF、CCNB、CDK4、CCND混合物处理的分裂心肌细胞。

图15显示了当用CDK1AF、CCNB、CDK4、CCND混合物处理时在5天内进行三次连续细胞分裂的神经元的延时图像。

图16显示用CDK1AF、CCNB、CDK4、CCND混合物处理的细胞在感染后60-90小时进行大部分分裂，其中一些细胞分裂发生在迟至感染后120小时。柱高表示已经过分裂的细胞数量并且柱顶部的数字表示每个细胞进行的平均分裂次数。

具体实施方式

应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限制。

本公开的详细描述仅为读者方便起见而分成多个部分，并且任何部分中存在的公开内容可与另一部分组合。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述相似或相当的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用并入，以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。

除非另有说明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的组织培养、免疫学、分子生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。参见例如Sambrook和Russell编,(2001)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版；Ausubel等编,(2007)《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》系列；《酶学方法(Methods in Enzymology)》系列(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson等,(1991)《PCR 1：一种实用的方法(PCR 1:A Practical Approach)》(牛津大学出版社的IRL出版社)；MacPherson等,(1995)《PCR2：一种实用的方法(PCR 2:A PracticalApproach)》；Harlow和Lane编,(1999)《抗体：实验室手册(Antibodies,A LaboratoryManual)》；Freshney(2005)《动物细胞的培养：基本技术手册(Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique)》,第5版；Gait编,(1984)《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》；美国专利No.4,683,195；Hames和Higgins编,(1984)《核酸杂交(NucleicAcid Hybridization)》；Anderson(1999)《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》；Hames和Higgins编,(1984)《转录和翻译(Transcription and Translation)》；IRL出版社(1986)《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》；Perbal(1984)《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》；Miller和Calos编,(1987)《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(Cold SpringHarbor Laboratory)；Makrides编,(2003)《哺乳动物细胞中的基因转移和表达(GeneTransfer and Expression in Mammalian Cells)》；Mayer和Walker编,(1987)《细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology)》(Academic Press,London)；Herzenberg等编,(1996)《韦尔实验免疫学手册(Weir's Handbook of Experimental Immunology)》；《小鼠胚胎操纵：实验室手册(Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual)》,第3版(2002)Cold SpringHarbor Laboratory Press；Sohail(2004)《通过RNA干扰的基因沉默：技术和应用(GeneSilencing by RNA Interference:Technology and Application)》(CRC Press)；Sell(2013)《干细胞手册(Stem Cells Handbook)》。

包括范围在内的所有数值名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，都是近似值，其在适当时以0.1或1.0的增量(+)或(-)变化。应当理解，尽管并未总是明确说明，所有数值名称之前都有术语“约”。还应当理解，尽管并未总是明确说明，本文描述的试剂仅仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。

必须指出，除非上下文另有明确说明，否则如本文和所附权利要求中所使用的单数形式“一”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“心肌细胞”的提及包括多个心肌细胞。

I.定义

如本文所用，以下术语具有以下含义。

在包括范围在内的数值名称例如温度、时间、数量、浓度等之前使用的术语“约”表示近似值，其可以(+)或(-)10％、5％或1％变化。

关于本公开的组合物使用的“施用”等是指直接施用，其可以体外施用至心脏细胞，体内施用至心脏细胞，由医学专业人员施用至受试者或由受试者自我施用，和/或间接施用，其可能是开具本公开组合物处方的行为。当在本文中关于细胞使用时，是指将组合物引入细胞。通常，施用有效量，所述量可由本领域技术人员确定。可以使用任何施用方法。例如，如果将核酸或多肽的组合物施用至有丝分裂后细胞，则本领域技术人员可以使用转导、转染等来将核酸或多肽施用至细胞。此外，可以通过例如将小分子加入到细胞培养基或在体内注射到心脏损伤部位来向细胞施用小分子。如本文关于有需要的受试者使用的“施用”等是指将增殖和/或细胞周期重新进入因子或增殖性有丝分裂后细胞的组合物引入有需要的受试者中。可以通过例如血管内注射、心肌内递送、颅内递送等来实现对受试者的施用。

如本文所用，术语“细胞周期重新进入”是指有丝分裂后心脏细胞重新启动细胞周期的至少一个阶段(例如DNA合成、有丝分裂、核分裂和细胞分裂)的过程。

如本文所用，术语“心脏细胞”是指心脏中存在的提供心脏功能如心脏收缩或血液供应或以其它方式用于维持心脏结构的任何细胞。如本文所用的心脏细胞涵盖存在于心脏的心外膜、心肌或心内膜中的细胞。心脏细胞还包括例如心脏肌肉细胞或心肌细胞，以及心脏血管的细胞，例如冠状动脉或静脉的细胞。心脏细胞的其它非限制性实例包括构成心肌、血管和心脏细胞支持结构的上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、心脏干细胞或祖细胞、心脏传导细胞和心脏起搏细胞。心脏细胞可衍生自干细胞，包括例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞。所述细胞可以是任何适当的物种，例如动物如哺乳动物，例如犬、马、猫或人类细胞。

“包含”旨在是指组合物和方法包括所述要素，但不排除其它要素。用于限定组合物和方法的“基本上由……组成”应该是指排除对所述目的的组合具有任何实质意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除不会实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的其它材料或步骤。“由……组成”将意味着排除痕量以上的其它成分和实质性方法步骤的要素。由这些过渡术语各自限定的实施方案在本发明的范围内。

如本文所用，术语“衍生的”是指分化的，重新编程的，分离的或以其它方式纯化的。例如，衍生自成纤维细胞的心肌细胞是已经例如通过过度表达GMT因子混合物在体外或体内从成纤维细胞重新编程的心肌细胞。

如本文所用，关于增殖和/或细胞周期重新进入因子的组合物量的术语“有效量”等是指足以诱导心脏细胞(例如心肌细胞)的增殖和/或细胞周期重新进入的量。使所述细胞与可有效诱导细胞周期重新进入和/或增殖的增殖和/或细胞周期重新进入因子的组合物量接触。当在本文中关于向有需要的受试者施用使用时，术语“有效量”是指治疗疾病的诱导增殖和/或重新进入细胞周期的增殖和/或细胞周期重新进入因子或有丝分裂后细胞的组合物量。有效量可以一次或多次施用、应用或剂量施用。这种递送取决于多种变量，包括使用单个剂量单位的时间段，组合物的生物利用度，施用途径等。然而，应当理解，对于任何特定受试者，组合物(例如，增殖和/或细胞周期重新进入因子或增殖性心脏细胞的组合物)的具体量取决于多种因素，包括所使用的具体药剂的活性，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，排泄速率，组合物组合，所治疗的特定疾病的严重程度和施用形式。

如本文所用，术语“其等同物”是指与参考多肽或核酸序列(即，与本公开的实施方案一致的周期蛋白或其片段)不同但保留基本性质(即生物活性)的多肽或核酸序列。多核苷酸的典型变体的核苷酸序列不同于另一个参考多核苷酸。变体的核苷酸序列的变化可以改变或可以不改变参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可能导致参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、缺失、添加、融合和截短。通常，差异受到限制，使得参考多肽和变体的序列在整体上非常相似，并且在许多区域中是相同的。

如本文所用，“诱导”等当关于增殖和/或细胞周期重新进入使用时是指以更快的速率和/或更频繁地复制的有丝分裂后细胞。在本文描述的这个和其它方面的一些实施方案中，有丝分裂后细胞增殖相对于未处理的对照组增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更高。有丝分裂后细胞增殖增加的％或倍数可以通过测量在施用如本文所述的能够刺激增殖和/或细胞周期重新进入的组合物之后相对于其中有丝分裂后细胞不与所述组合物接触的对照组的有丝分裂后细胞复制数目来确定。增殖增加也可以基于在相应的经过处理和未处理的对照组中复制细胞与细胞总数的比率。在一些实施方案中，使用经过处理和未处理的对照组中的细胞总数来确定增殖。可以使用Yamagishi等.(2001)《发育生物学(DevBiol)》,239:190-203(其内容通过引用并入本文)中所述的BrdU结合方法(以及类似方法，例如EdU结合)来确定细胞增殖。检测细胞增殖的其它方法包括使用Ki67的抗体(对于细胞周期的G1、S、G2和M阶段)和磷酸化组蛋白3(PHH3)的抗体(对于细胞周期的M阶段)。

如本文所用，关于细胞的术语“分离的”是指在不同于细胞天然存在的环境中的细胞，例如，其中细胞天然存在于多细胞生物体中，并且从所述多细胞生物体中除去细胞，所述细胞是“分离的”。分离的被修饰的有丝分裂后细胞可以存在于遗传修饰的有丝分裂后细胞的混合群体中，或者包含遗传修饰的有丝分裂后细胞和未遗传修饰的有丝分裂后细胞的混合群体中。例如，分离的遗传修饰的有丝分裂后细胞可以在体外存在于遗传修饰的有丝分裂后细胞的混合群体中，或者包含遗传修饰的有丝分裂后细胞和未遗传修饰的有丝分裂后细胞的混合体外群体中。如本文关于核酸如DNA或RNA使用的术语“分离的”是指从分别存在于大分子天然来源中的其它DNA或RNA分离的分子。术语“分离的核酸”意在包括不以片段形式天然存在并且在天然状态下不存在的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其它细胞蛋白分离的多肽、蛋白质，并且意在涵盖纯化的和重组的多肽。在其它实施方案中，术语“分离的”是指从成分、细胞和其它方面分离，其中细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，它们在自然中正常缔合。例如，分离的细胞是从不同表型或基因型的组织或细胞分离的细胞。如本领域技术人员显而易见的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质不需要“分离”以将其与其天然存在的对应物区分开。

如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、载体、探针和引物。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽主链的多肽。所述术语包括融合蛋白，其包括(但不限于)具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合物，具有或不具有N端甲硫氨酸残基的融合物，免疫标记蛋白等。

如本文使用的术语“增殖”是指有丝分裂后细胞的生长和分裂。在一些实施方案中，术语“增殖”在本文中关于有丝分裂后细胞使用时是指在一段时间内数量增加的有丝分裂后细胞群体。术语“增殖和/或细胞周期重新进入因子”是指可以单独地或与其它药剂组合地诱导有丝分裂后细胞进行或进入DNA合成、有丝分裂、核分裂和/或胞质分裂的任何药剂。

如本文所用，术语“祖细胞”是指致力于分化成特定类型的细胞或形成特定类型的组织的细胞。祖细胞，如干细胞，可以进一步分化为一种或多种细胞，但比干细胞更成熟，因此其具有更有限/受限的分化能力。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，优选人类，但包括并且不限于非人类灵长类动物、鼠科动物(即小鼠和大鼠)、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊等。在一些实施方案中，受试者是人类受试者。

“治疗”定义为利用药剂作用于疾病、病症或病状以减轻或改善所述疾病、病症或病状和/或其症状的有害的或任何其它不良影响。如本文所用，“治疗”涵盖对有需要的受试者的治疗，并且包括心血管疾病(例如心力衰竭、心肌缺血、缺氧、中风、心肌梗塞和慢性缺血性心脏病)、神经疾病(例如癫痫、阿尔茨海默病和其它痴呆症、脑血管疾病(包括中风、偏头痛和其它头痛病症)、多发性硬化、帕金森病、神经感染、脑肿瘤、创伤性病症)、糖尿病或者听力损伤或损失的治疗。病状或有需要的受试者的“治疗”是指：(1)采取步骤以获得有益或期望的结果，包括诸如症状减轻等临床结果；(2)预防疾病，例如导致疾病的临床症状不会在可能易患上疾病但尚未经历或显示疾病症状的患者中发展；(3)抑制疾病，例如阻止或减少疾病或其临床症状的发展；(4)缓解疾病，例如导致疾病或其临床症状的消退；或(5)延缓疾病。为了本发明的一个目的，有益或期望的临床结果包括(但不限于)诱导心脏细胞的增殖，诱导细胞周期重新进入和/或促进心肌再生。为了本发明的另一个目的，有益或期望的临床结果包括(但不限于)诱导神经元的增殖，诱导细胞周期重新进入和/或促进神经元再生。

术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与例如载体核酸分子连接。载体可包括在细胞中引导自主复制的序列，或者可包括足以允许整合到心脏细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌或酵母人造染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如腺病毒，逆转录病毒，特别是复制缺陷型逆转录病毒，和慢病毒。

如本文所用，术语“病毒载体”是指包括通常促进核酸分子的转移或整合到细胞基因组中的病毒衍生的核酸元件的核酸分子或者是指介导核酸转移的病毒颗粒。除了核酸之外，病毒颗粒通常将包括各种病毒组分，有时还包括细胞组分。术语“病毒载体”也可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒或者指转移核酸本身。病毒载体和转移质粒包含主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。病毒载体可以是含有逆转录病毒(例如慢病毒)序列和非逆转录病毒序列的杂交载体、LTR或其它核酸。杂交载体可以指包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列的载体或转移质粒。

如本文所用的术语“腺病毒载体”是指任何腺病毒载体，其包括编码插入其基因组中的多肽的外源DNA。当任何缺陷的必需基因以反式提供时，载体必须能够复制和被包装。腺病毒载体理想地含有支持病毒DNA复制所需的每个末端重复序列的至少一部分，优选完整ITR序列的至少约90％，以及将基因组包封到病毒衣壳中所需的DNA。本领域已经描述了许多合适的腺病毒载体。美国专利No.6,440,944；参见美国专利No.6,040,174(复制缺陷型E1缺失载体和专门的包装细胞系)。在一些实施方案中，腺病毒表达载体是正常细胞中有复制缺陷的载体。在其它实施方案中，腺病毒载体是指腺相关病毒(AVV)载体。在一些实施方案中，腺病毒表达载体是假型的以增强靶向。

术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。

术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。

术语“慢病毒载体”或“慢病毒表达载体”可用于指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。应理解，核酸序列元件如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等以RNA形式存在于本发明的慢病毒颗粒中，并且以DNA形式存在于本发明的DNA质粒中。

术语“遗传修饰”是指在引入新的核酸(即细胞外源核酸)后在细胞中诱导的永久或瞬时遗传变化。遗传变化可以通过将新的核酸并入心脏细胞的基因组中，或者通过瞬时或稳定维持新的核酸作为染色体外元件来实现。当细胞是真核细胞时，可以通过将核酸引入细胞的基因组来实现永久性遗传变化。遗传修饰的合适方法包括病毒感染、转染、结合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。

如在本文中在损伤的细胞或组织的上下文中使用的术语“再生”等应被赋予其普通含义，并且还应指在受损(例如由于缺血、梗塞、再灌注或其它疾病而受损)的组织中生长和/或发育新细胞或组织(例如心脏)的过程。在一些实施方案中，组织再生包括细胞增殖的激活和/或增强。在一些实施方案中，组织再生包括细胞迁移的激活和/或增强。

术语“干细胞”是指能够自我更新并产生分化后代的细胞。术语“多能干细胞”是指可以产生所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞但不能产生完整生物体的干细胞。在一些实施方案中，用于诱导增殖和/或细胞周期重新进入的组合物可用于干细胞群体以提高增殖速率。在其它实施方案中，所述组合物不提高干细胞的增殖速率。

术语“诱导的多能干细胞”应被赋予其普通含义，并且还应指已经重新编程以表现出至少一个多能性特征的分化的哺乳动物体细胞(例如成体体细胞，如皮肤)。参见例如Takahashi等,(2007)《细胞(Cell)》,131(5):861-872；Kim等,(2011)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,108(19):7838-7843；Sell(2013)《干细胞手册(Stem CellsHandbook)》。

术语“有丝分裂后细胞”是不显示有丝分裂或细胞分裂的细胞。有丝分裂后细胞的非限制性实例包括构成脑(例如神经元)、心脏(例如心肌细胞)和骨骼肌的分化细胞。如本文所用，术语“增殖性有丝分裂后细胞”是指已被诱导以增殖和/或重新进入细胞周期的有丝分裂后细胞。例如，增殖性心肌细胞是已被诱导以增殖和/或重新进入细胞周期的不具有增殖能力或具有有限的增殖能力的心肌细胞。增殖性有丝分裂后细胞(例如，增殖性心肌细胞)可能经历任意次数的细胞分裂，例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十五、二十或更多次细胞分裂，然后再退出细胞周期并返回有丝分裂后状态。

II.诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的方法

本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见的是，本公开提供诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的方法，所述方法包括以下，或者可选地基本上由以下组成，或者此外由以下组成：使所述有丝分裂后细胞与可有效刺激有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的量的有效量的组合物(例如，一种或多种增殖和/或细胞周期重新进入因子)接触。所述细胞可以来自任何物种、动物、哺乳动物，例如犬、猫、鼠科动物、大鼠或人类细胞。

在一些实施方案中，接触在体外或体内进行。

在一个方面，本公开提供诱导有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)的增殖和/或细胞周期重新进入的方法，所述方法包括以下，或者可选地基本上由以下组成，或者此外由以下组成：使所述有丝分裂后细胞与有效量的组合物接触以刺激有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入。所述组合物能够增加编码周期蛋白依赖性激酶(CDK)、周期蛋白、aurora激酶、肌动蛋白结合蛋白anillin(ANLN)、细胞分裂周期(CDC)蛋白、钙粘蛋白、COP9信号体复合物亚基、cullin、GTP酶激活蛋白、胞质分裂的蛋白质调节剂和/或WNT1诱导型信号通路蛋白或其等同物的至少一个基因的表达。所述细胞可以来自任何物种、动物、哺乳动物，例如犬、猫、鼠科动物、大鼠或人类细胞。

在一些实施方案中，所述有丝分裂后细胞选自心肌细胞、神经细胞、胰腺细胞、毛细胞和骨骼肌细胞。

心脏细胞

本公开的心脏细胞包括心脏中存在的提供心脏功能的任何细胞。心脏细胞涵盖存在于心脏的心外膜、心肌或心内膜中的细胞。心脏细胞还包括例如心脏肌肉细胞或心肌细胞，以及心脏血管的细胞，例如冠状动脉或静脉的细胞。心脏细胞的其它非限制性实例包括构成心肌、血管和心脏细胞支持结构的上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、心脏干细胞或祖细胞、心脏传导细胞和心脏起搏细胞。

心脏细胞可以衍生自心脏细胞或非心脏细胞。心脏细胞可以来自或衍生自多种组织来源中的任何一种。例如，干细胞、心脏成纤维细胞、包皮成纤维细胞、真皮成纤维细胞、肺成纤维细胞等。心脏细胞可以是胚胎、胎儿或产后(例如成体)心脏细胞。在一个优选的实施方案中，心脏细胞是成体心脏细胞。在一些实施方案中，心脏细胞衍生自干细胞。

非心脏细胞可以使用本领域技术人员可用的任何方法在体外或体内分化为心脏细胞。例如，参见Ieda M.等,(2010)《细胞(Cell)》,142(3):375-386和Kwon C.等,《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,(2007)104(26):10894-10899中所述的方法。

在某些实施方案中，心脏细胞是心肌细胞。在某些实施方案中，心肌细胞是成体有丝分裂后心肌细胞。在另一个方面，成体有丝分裂后心肌细胞不具有增殖能力或具有低增殖能力。在一些实施方案中，心肌细胞是单核细胞。在其它实施方案中，心肌细胞是多核的。

当用于修饰的细胞是心脏细胞群体时，所述细胞群体由至少约60％心脏细胞、至少约65％心脏细胞、至少约70％心脏细胞、至少约75％心脏细胞、至少约80％心脏细胞、至少约85％心脏细胞、至少约90％心脏细胞、至少约95％心脏细胞、至少约98％心脏细胞、至少约99％心脏细胞或大于99％心脏细胞组成。

神经细胞

本公开的神经细胞包括神经系统中存在的提供神经功能的任何细胞。神经细胞涵盖存在于脑(例如大脑、小脑、脑干)和脊髓中的细胞，以及周围神经系统的细胞，包括感觉神经元。神经细胞还包括例如神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。神经元的非限制性实例包括运动神经元、锥体神经元、浦肯野细胞(purkinje cell)、视网膜神经元、嗅觉神经元、触觉和疼痛感觉神经元以及无长突细胞。

神经细胞可以衍生自神经或非神经细胞。神经细胞可以来自或衍生自多种组织来源中的任何一种。例如，干细胞、成纤维细胞、包皮成纤维细胞、真皮成纤维细胞、肺成纤维细胞等。神经细胞可以是胚胎、胎儿或产后(例如成体)神经细胞。在一个优选的实施方案中，神经细胞是成体神经细胞。在一些实施方案中，神经细胞衍生自干细胞(例如，神经干细胞)。

非神经细胞可以使用本领域技术人员可用的任何方法在体外或体内分化为神经细胞。例如，参见Guo等,(2014)《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》,14(2):188-202；Keirstead等,(2005)《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,25(19):4694-4705；Kim等,(2012)《神经生物学新见(Curr Opinion Neurobiol.)》,22(5):778-784中所述的方法。

在某些实施方案中，所述神经细胞是神经元。在某些实施方案中，所述神经元是成体有丝分裂后神经元。在优选实施方案中，所述成体有丝分裂后神经元不具有增殖能力或具有低增殖能力。

当用于修饰的细胞是神经细胞群体时，所述细胞群体由至少约60％神经细胞、至少约65％神经细胞、至少约70％神经细胞、至少约75％神经细胞、至少约80％神经细胞、至少约85％神经细胞、至少约90％神经细胞、至少约95％神经细胞、至少约98％神经细胞、至少约99％神经细胞或大于99％神经细胞组成。

胰腺细胞

本公开的胰腺细胞包括胰腺中存在的提供胰腺功能的任何细胞。胰腺细胞的实例包括朗格汉斯(Langerhans)胰岛内的细胞(例如，α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞和ε细胞)和腺泡细胞。在一些实施方案中，所述胰腺细胞是胰腺祖细胞。

胰腺细胞可以衍生自胰腺或非胰腺细胞。胰腺细胞可以来自或衍生自多种组织来源中的任何一种。例如，干细胞、成纤维细胞、包皮成纤维细胞，真皮成纤维细胞、肺成纤维细胞等。胰腺细胞可以是胚胎、胎儿或产后(例如成体)胰腺细胞。在一个优选的实施方案中，胰腺细胞是成体胰腺细胞。在一些实施方案中，胰腺细胞衍生自干细胞。

非胰腺细胞可以使用本领域技术人员可用的任何方法在体外或体内分化为胰腺细胞。例如，参见D'Amour等,(2005)《自然-生物技术(Nature Biotech.)》,23:1534-1541和美国专利No.8,633,024中所述的方法。

在某些实施方案中，胰腺细胞是β细胞或β细胞前体。在某些实施方案中，所述β细胞是成体β细胞。在优选实施方案中，所述成体有丝分裂后胰腺细胞不具有增殖能力或具有低增殖能力。

当用于修饰的细胞是胰腺细胞群体时，所述细胞群体由至少约60％胰腺细胞、至少约65％胰腺细胞、至少约70％胰腺细胞、至少约75％胰腺细胞、至少约80％胰腺细胞、至少约85％胰腺细胞、至少约90％胰腺细胞、至少约95％胰腺细胞、至少约98％胰腺细胞、至少约99％胰腺细胞或大于99％胰腺细胞组成。

毛细胞

本公开的毛细胞包括内毛细胞(静纤毛)和外毛细胞。毛细胞可以衍生自毛细胞或非毛细胞。毛细胞可以来自或衍生自多种组织来源中的任何一种。例如，干细胞、成纤维细胞、包皮成纤维细胞、真皮成纤维细胞、肺成纤维细胞等。毛细胞可以是胚胎、胎儿或产后(例如成体)毛细胞。在一个优选的实施方案中，毛细胞是成体毛细胞。在一些实施方案中，毛细胞衍生自干细胞。非毛细胞可以使用本领域技术人员可用的任何方法在体外或体内分化为毛细胞。例如，参见Mohammad等,(2014)《干细胞与发育(Stem Cells and Dev.)》,23(11):1275-1284中所述的方法。在优选实施方案中，所述成体有丝分裂后毛细胞不具有增殖能力或具有低增殖能力。

当用于修饰的细胞是毛细胞群体时，所述细胞群体由至少约60％毛细胞、至少约65％毛细胞、至少约70％毛细胞、至少约75％毛细胞、至少约80％毛细胞、至少约85％毛细胞、至少约90％毛细胞、至少约95％毛细胞、至少约98％毛细胞、至少约99％毛细胞或大于99％毛细胞组成。

骨骼肌细胞

本公开的骨骼肌细胞是指肌肉纤维的细胞。骨骼肌细胞可以衍生自骨骼肌细胞或非骨骼肌细胞。骨骼肌细胞可以来自或衍生自多种组织来源中的任何一种。例如，干细胞、成纤维细胞、包皮成纤维细胞、真皮成纤维细胞、肺成纤维细胞等。骨骼肌细胞可以是胚胎、胎儿或产后(例如成体)骨骼肌细胞。在一个优选的实施方案中，骨骼肌细胞是成体骨骼肌细胞。在一些实施方案中，骨骼肌细胞衍生自干细胞。非骨骼肌细胞可以使用本领域技术人员可用的任何方法在体外或体内分化为肌细胞。例如，参见Salani等,(2012)《细胞与分子医学杂志(J Cell Mol.Med.)》,16(7):1353-1364中所述的方法。在优选实施方案中，所述成体有丝分裂后骨骼肌细胞不具有增殖能力或具有低增殖能力。

当用于修饰的细胞是骨骼肌细胞群体时，所述细胞群体由至少约60％骨骼肌细胞、至少约65％骨骼肌细胞、至少约70％骨骼肌细胞、至少约75％骨骼肌细胞、至少约80％骨骼肌细胞、至少约85％骨骼肌细胞、至少约90％骨骼肌细胞、至少约95％骨骼肌细胞、至少约98％骨骼肌细胞、至少约99％骨骼肌细胞或大于99％骨骼肌细胞组成。

在一些实施方案中，有丝分裂后细胞是内源有丝分裂后细胞，因此所述细胞在受试者内并且诱导增殖和/或细胞周期重新进入的方法是通过体内修饰。在其它实施方案中，所述有丝分裂后细胞是外源的并且所述有丝分裂后细胞在体外修饰。

诱导增殖和/或重新进入细胞周期的有丝分裂后细胞可以来自多种来源中的任何一种。可以使用哺乳动物有丝分裂后细胞(例如，人类、犬、猫或鼠科动物)。在一些实施方案中，有丝分裂后细胞是哺乳动物心肌细胞。在一些实施方案中，有丝分裂后细胞可以衍生自干细胞(例如，多能干细胞、诱导多能干细胞、重新编程心脏细胞、心脏干细胞、神经干细胞)。在一些实施方案中，明确排除了胚胎干细胞。

有丝分裂后细胞可以从活体受试者中获得。细胞可以从获自活体生物体的组织获得。细胞可以从被认为是合适的组织供体的最近死亡的受试者获得。在一些实施方案中，对受试者筛查各种遗传病症、病毒感染等，以确定受试者是否是合适的细胞来源。通常，适用于本发明的细胞是非转化的(例如显示正常的细胞增殖)并且在其它方面是正常的(例如显示正常核型)。

有丝分裂后细胞可以衍生自非胚胎受试者、新生儿、儿童或成人的组织。有丝分裂后细胞可以衍生自从出生(包括剖宫产)到死亡的时期内的受试者采集的初生或产后组织。例如，诱导增殖和/或重新进入细胞周期的有丝分裂后细胞可以来自大于约10分钟龄、大于约1小时龄、大于约1天龄、大于约1月龄、大于约2月龄、大于约6月龄、大于约1岁、大于约2岁、大于约5岁、大于约10岁、大于约15岁、大于约18岁、大于约25岁、大于约35岁、>45岁、>55岁、>65岁、>80岁、<80岁、<70岁、<60岁、<50岁、<40岁、<30岁、<20岁或<10岁的受试者。

从组织中分离有丝分裂后细胞的方法是本领域已知的，并且可以使用任何已知的方法。作为非限制性实例，可以从获自经受心脏手术的患者的人类心房活检标本获得成体心脏细胞。可以使用Choi等,(2013)《移植学会会刊(Transplantation Proceedings)》,45:420-426的方法，用c-kit+祖细胞扩增培养基中扩增的胶原酶和心脏干细胞/祖细胞切碎和消化心脏组织。此外，可以使用Ieda等,(2009)《发育细胞(Dev.Cell)》,16(2):233-244的方法获得心脏成纤维细胞。包皮成纤维细胞可以从男性个体的包皮组织获得。可以通过切碎包皮组织，然后将组织解离成单细胞来获得成纤维细胞。包皮细胞团可以通过本领域已知的任何方式解离，包括物理去结块或使用例如胰蛋白酶的酶消化。

有丝分裂后细胞(例如，心肌细胞、神经细胞、胰腺细胞、毛细胞、骨骼肌细胞)可以用一种或多种包含编码细胞周期调控基因(例如，周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和/或aurora激酶)的核苷酸序列的核酸遗传修饰或非遗传修饰，或者可以通过引入多肽来修饰。如下文所讨论，有丝分裂后细胞可以通过过度表达包含编码周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和/或aurora激酶(例如，CDK1、CCNB1和AURKB)的核苷酸序列的核酸或通过引入包含周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和/或aurora激酶氨基酸序列(例如，CDK1、CCNB1和AURKB)的多肽诱导以增殖或重新进入细胞周期，或者此外通过引入化学物质(例如小分子)来进一步修饰以诱导内源周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和/或aurora激酶(例如，CDK1、CCNB1和AURKB)的表达。周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和aurora激酶的氨基酸序列是本领域中已知的。编码周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和aurora激酶的核苷酸序列是本领域中已知的。

另外，有丝分裂后细胞可以通过过度表达包含编码至少一种周期蛋白依赖性激酶(CDK)和至少一种周期蛋白或其各自的等同物(例如，CDK1和CCNB1)的核苷酸序列的核酸或通过引入包含至少一种周期蛋白依赖性激酶和至少一种周期蛋白氨基酸序列(例如，CDK1和CCNB1)的多肽而诱导以增殖或重新进入细胞周期，或者此外通过引入化学物质(例如小分子)来进一步修饰以诱导内源周期蛋白依赖性激酶和/或周期蛋白的表达。

在一些实施方案中，使有丝分裂后细胞与有效量的CDK激活剂、转化生长因子β抑制剂或其组合接触。在一些实施方案中，所述CDK激活剂是CDK1激活剂。CDK1激活剂的实例是Wee1抑制剂MK1775。已知MK1775间接诱导CDK1表达。转化生长因子β(TGF-β)抑制剂是通过抑制构成TGF-β信号转导系统途径的任何因子来抑制TGF-β信号转导的化合物，例如TGF-β配体、TGF-βI型受体、TGF-βII型受体、TGF-βIII型受体(β-聚糖和内皮糖蛋白)、TGF-β受体的可溶形式、Smad蛋白、针对信号通路中涉及的受体和配体的抗体、靶向通路成员的基于核酸的分子(例如，反义、siRNA、适体和核糖酶)，或其组合。

在一些实施方案中，所述TGF-β抑制剂选自SB431542、D4476、LDN-193189、地塞米松和LY364947。TGF-β抑制剂在本文中也可称为抗TGF-β化合物。抗TGF-β化合物的非限制性实例包括抗体(例如，夫苏木单抗(Fresolumimab)/GC1008(Genzyme,Cambridge,MA,USA)、PF-03446962(Pfizer,New York,NY,USA))，反义寡核苷酸(ASO)(例如，Trabedersen(AP12009)(Isarna Therapeutics,New York,NY,USA))，受体激酶抑制剂(例如，LY2157299(Eli Lilly,Indianapolis,IN,USA)，和与疫苗组合的TGF-βASO(例如，LucanixTM(Belagenpumatucel-L)(Nova Rx Corp,San Diego,CA,USA))，和TGF-β₂ASO+GMCSF表达载体(Mary Crowley Medical Research Centre,Dallas,TX,USA))。预期将TGF-β抑制剂添加到组合物中可用于改善细胞存活。

培养条件

本公开的细胞可以在本领域技术人员已知的任何条件下培养。在一些实施方案中，使细胞在1-20％氧气(O₂)和5％二氧化碳(CO₂)的条件中培养。在一些实施方案中，本公开的细胞在低氧条件下(例如，在少于10％O₂的存在下)培养。在一些实施方案中，本公开的细胞在约37℃下培养。在一些实施方案中，本公开的细胞可以在约37℃、5％CO₂和10-20％O₂下培养。在一些实施方案中，细胞在低氧条件下培养一段时间。例如，细胞可在常氧条件(～20％O₂)下培养一段时间，然后切换到低氧条件，例如约5％O₂。

体外修饰

在一个方面，本公开的方法和组合物诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入，其通过使所述有丝分裂后细胞与有效量的包含至少一种周期蛋白依赖性激酶(CDK)和至少一种周期蛋白或其各自的等同物的组合物接触，从而诱导所述有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入。

在一个方面，本公开的方法和组合物诱导有丝分裂后细胞增殖和/或细胞周期重新进入，其通过向有丝分裂后细胞施用能够刺激增殖和/或细胞周期重新进入的组合物(例如，能够增加周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和/或aurora激酶的表达的组合物)。

在一些实施方案中，所述组合物诱导有丝分裂后细胞以在体外经至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天、至少八天或至少九天的时期分裂。在一个实施方案中，至少约0.1％的有丝分裂后细胞被诱导增殖和/或重新进入细胞周期。在另一个实施方案中，至少约0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、5％、10％、15％的有丝分裂后细胞被诱导增殖和/或重新进入细胞周期。

在一些实施方案中，将诱导有丝分裂后细胞增殖和/或细胞周期重新进入的组合物在体外或离体施用至有丝分裂后细胞。所述有丝分裂后细胞在体外或离体被(遗传或非遗传)修饰以刺激增殖和/或细胞周期重新进入。一旦有丝分裂后细胞的至少一部分已在体外或离体至少开始增殖和或重新进入细胞周期，就可以将所述有丝分裂后细胞引入受试者中。在一些实施方案中，本公开的有丝分裂后细胞可以用作研究和药物开发中的实用工具。有丝分裂后细胞可通过本领域技术人员公知的各种方法进行培养。

有丝分裂后细胞的体外或离体修饰的优点是能够容易地鉴定适合于植入的细胞或鉴别被损伤或不增殖和/或不重新进入细胞周期的细胞。体外或离体修饰允许已经修饰的有丝分裂后细胞从未经修饰的那些有丝分裂后细胞纯化或分离。

有丝分裂后细胞可通过本领域技术人员公知的各种机制进行修饰。可以通过在合适的宿主中产生病毒来递送病毒构建体。然后从宿主细胞采集病毒，并且与有丝分裂后细胞接触。能够表达感兴趣基因的病毒和非病毒载体可以经由DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白-DNA复合物递送到有丝分裂后细胞。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可以用于本发明的方法中。除了将多核苷酸递送到有丝分裂后细胞或细胞群体外，可以通过蛋白质转染的非限制性技术将本文所述的蛋白质直接引入有丝分裂后细胞或细胞群体，可选地可以增强本发明蛋白质的表达和/或促进本发明蛋白质的活性的培养条件是其它非限制性技术。

编码本发明基因的载体的其它递送方法包括(但不限于)磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔、显微注射、原生质体融合或脂质体介导的转染。用本公开的载体转染的宿主细胞可包括(但不限于)大肠杆菌或其它细菌、酵母、真菌，或源自小鼠、人类或其它动物(例如哺乳动物)的细胞。还可使用由克隆DNA编码的蛋白质、融合物、多肽片段或突变体的体外表达。分子生物学领域的技术人员将理解，可使用多种表达系统和纯化系统来产生重组蛋白及其片段。

体内修饰

在一些实施方案中，本公开提供在体内诱导有丝分裂后细胞增殖和/或细胞周期重新进入的方法。在一些实施方案中，所述组合物诱导有丝分裂后细胞在体内在至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天、至少八天或至少九天的时期内分裂。在一个实施方案中，至少约0.1％的有丝分裂后细胞被诱导增殖和/或重新进入细胞周期。在另一个实施方案中，至少约0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、5％、10％、15％的有丝分裂后细胞被诱导增殖和/或重新进入细胞周期。

在一些实施方案中，有丝分裂后细胞在体内用有效量的组合物(例如遗传或非遗传)修饰以刺激有丝分裂后细胞(例如心肌细胞)的增殖和/或细胞周期重新进入，其中所述组合物能够增加周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和aurora激酶或其等同物的表达，并且其中所述组合物在体内施用至受试者。在其它实施方案中，有丝分裂后细胞在体内用有效量的包含至少一种周期蛋白依赖性激酶(CDK)和至少一种周期蛋白或其各自的等同物的组合物(例如遗传或非遗传)修饰，从而在体内诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入。本文所述的组合物可以含有核酸、多肽和/或其组合。

对于体内递送组合物以刺激有丝分裂后细胞(例如，有丝分裂后心肌细胞)的增殖和/或细胞周期重新进入，可以通过本领域技术人员公知的任何机制将所述组合物施用至有需要的受试者。非限制性实例包括口服、全身(例如经皮、鼻内或栓剂)，或肠胃外(例如肌肉内、静脉内或皮下)施用。

本公开提供在体内刺激有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的方法，所述方法通常包括以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：向有需要的受试者施用可有效刺激增殖和/或细胞周期重新进入的量，其中所述组合物能够增加周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和aurora激酶或其等同物的表达。在一些实施方案中，所述方法通常包括使有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)与可有效刺激增殖和/或细胞周期重新进入的量的组合物接触。所述组合物可以包含至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子，其包括以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：增加周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和/或aurora激酶或其等同物的表达的至少一种多肽、至少一种核酸、至少一种化学物质或其混合物。所述组合物可以包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子，其包含增加至少一种周期蛋白依赖性激酶和至少一种周期蛋白或其等同物的表达的至少一种多肽、至少一种核酸、至少一种化学物质或其混合物。在一些实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：CDK1、CCNB1和AURKB多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：CDK1和CCNB1多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：CDK1、CCNB1、CDK4和CCND1多肽。在另一个实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：CDK1、CCNB1和AURKB核酸。在另一个实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：CDK1和CCNB1核酸。在另一个实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：CDK1、CCNB1、CDK4和CCND1核酸。在其它实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：增加内源CDK1、CCNB1和AURKB的表达的化学物质。在其它实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：增加内源CDK1和CCNB1的表达的化学物质。在其它实施方案中，所述组合物包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：增加内源CDK1、CCNB1、CDK4和CCND1的表达的化学物质。在一些实施方案中，所述组合物中明确排除aurora激酶。

所述组合物可以是固体组合物、半固体组合物或液体组合物。在一些情况下，所述组合物是控释组合物，它可以是固体组合物、半固体组合物或液体组合物。例如，所述组合物可以是持续释放基质。

在一些实施方案中，所述组合物在治疗部位处或附近，例如在心脏或脑内或周围，施用至有需要的受试者。组合物的施用可以通过各种方式实现，包括经由血管内注射、心肌内递送和颅内递送。例如，可以使用导管(例如，经由心内膜导管系统)进行心肌内递送。经由导管进行心肌内或颅内递送可以是全局的、局灶性的或弥漫性的。

在一些实施方案中，被诱导增殖或重新进入细胞周期的有丝分裂后细胞与可植入装置相结合地施用至有需要的受试者。本发明考虑的合适的可植入装置包括血管内支架(例如，自扩张支架、球囊扩张支架和支架移植物)、骨架、移植物等。

刺激增殖和/或细胞周期重新进入的因子

如所讨论，有丝分裂后细胞(例如心肌细胞)可被修饰以增加细胞周期调控基因的表达。所述细胞周期调控基因，例如周期蛋白依赖性激酶(CDK)、周期蛋白和/或aurora激酶，可以由核酸编码或者可以是多肽。在一些实施方案中，所述细胞周期调控基因包括周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白、aurora激酶或其等同物。在其它实施方案中，所述细胞周期调控基因包括周期蛋白依赖性激酶和周期蛋白或其各自的等同物。有丝分裂后细胞可以通过引入包含增殖和/或细胞周期重新进入因子的组合物来修饰，例如周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白、aurora激酶、肌动蛋白结合蛋白anillin(ANLN)、细胞分裂周期(CDC)蛋白、钙粘蛋白、COP9信号体复合物亚基、cullin、GTP酶激活蛋白、胞质分裂的蛋白质调节剂和/或WNT1诱导型信号通路蛋白或其等同物中的至少一种。有丝分裂后细胞可以通过引入包含增殖和/或细胞周期重新进入因子的组合物来修饰，例如：(1)周期蛋白B1(CCNB1)、aurora激酶B(AURKB)和周期依赖性激酶1(CDK1)；(2)CCNB1和CDK1；(3)周期蛋白D1(CCND1)、周期依赖性激酶4(CDK4)；(4)CCNB1、CDK1、CCND1和CDK4；(5)CCNB1、CCND1和CDK4；或其任何组合。

在一些实施方案中，所述至少一种核酸被组成型表达。

周期蛋白依赖性激酶

周期蛋白依赖性激酶(CDK)通过与其调控周期蛋白复合而用于调控细胞周期进程。例如，CDK1结合周期蛋白B1(CCNB1)并且在M阶段内起作用，而CDK2/周期蛋白A复合物确保S阶段和S/G2过渡期中的进程并且CDK2/周期蛋白E促进G1/S阶段内的进程。Gerard等,(2012)《生理学前沿(Frontiers in Physiol.)》,3(413):1-18。

在一些实施方案中，所述CDK选自CDK1、CDK2、CDK3、CDK4和CDK6。在一些实施方案中，所述CDK是CDK1。在其它实施方案中，所述CDK是CDK4。在其它实施方案中，使用CDK1和CDK4。在一些实施方案中，所述CDK被组成型表达。

本领域中已知来自多种物种的CDK(例如CDK1)的氨基酸序列和编码CDK多肽的核苷酸序列。参见例如：(1)GenBank寄存编号NP_001777.1(智人(Homo sapiens)297氨基酸周期蛋白依赖性激酶1同种型1)；(2)GenBank寄存编号AAH14563.1(智人297氨基酸细胞分裂周期2，G1至S和G2至M)；(3)GenBank寄存编号NM_001786.4(编码智人周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)的核苷酸序列，转录变体1)；(4)GenBank寄存编号NM_033379.4(编码智人周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)的核苷酸序列，转录变体1)；(5)GenBank寄存编号NP_031685.2(小家鼠(Mus musculus)297周期蛋白依赖性激酶1)；(6)GenBank寄存编号NM_007659.3(编码小家鼠周期蛋白依赖性激酶1的核苷酸序列)。

在一些实施方案中，合适的CDK1核酸包含与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.7具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，合适的CDK1核酸包含编码CDK1多肽的核苷酸序列，其中在一些实施方案中，合适的CDK1多肽包含与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.8具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，合适的CDK4核酸包含与SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.17具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，合适的CDK4核酸包含编码CDK4多肽的核苷酸序列，其中在一些实施方案中，合适的CDK4多肽包含与SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.18具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

周期蛋白

周期蛋白通过激活周期蛋白依赖性激酶(CDK)而用于控制细胞通过细胞周期的进程。Galderisi等,(2003)《致癌基因(Oncogene)》,22(33):5208-5219。周期蛋白-CDK复合物通过磷酸化来激活其它蛋白质，这又导致细胞周期中的特定事件。周期蛋白被充分表征并分为多个家族。例如，周期蛋白A家族由两个成员CCNA1和CCNA2组成，而周期蛋白B家族由三个成员CCNB1、CCNB2和CCNB3组成。不同周期蛋白在细胞周期的不同阶段具活性。例如，周期蛋白A在合成阶段(S阶段)中具活性，在此期间DNA复制并发生在G1阶段与G2阶段之间。另一方面，周期蛋白D调控从G1阶段到S阶段的过渡。周期蛋白B调控从G2阶段到M阶段的进程。特别地，周期蛋白B1作为与CDK1结合的有丝分裂周期蛋白，并且是细胞进入和退出细胞周期的M阶段的进程所必需的。

在一些实施方案中，所述周期蛋白选自周期蛋白A、周期蛋白B、周期蛋白D和周期蛋白E。在一些实施方案中，所述周期蛋白B是周期蛋白B1(CCNB1)。在其它实施方案中，所述周期蛋白D是周期蛋白D1(CCND1)。在其它实施方案中，使用CCNB1和CCND1。

来自多种物种的周期蛋白多肽(例如，周期蛋白B1，CCNB1)的氨基酸序列和编码周期蛋白多肽(例如，周期蛋白B1，CCNB1)的核苷酸序列是本领域中已知的。参见例如：(1)GenBank寄存编号NP_114172(智人433氨基酸周期蛋白B1)；(2)GenBank寄存编号AAH06510.1(智人433氨基酸周期蛋白B1)；(3)GenBank寄存编号EAW51306.1(智人433氨基酸周期蛋白B1)；(4)GenBank寄存编号NM_031966.3(编码智人周期蛋白B1的核苷酸序列)；(5)GenBank寄存编号NP_758505.2(小家鼠430氨基酸周期蛋白B1)；(6)GenBank寄存编号NM_172301.3(编码小家鼠周期蛋白B1的核苷酸序列)。

在一些实施方案中，合适的CCNB1核酸包含与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.9具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，合适的CCNB1核酸序列包含编码CCNB1多肽的核苷酸序列，其中在一些实施方案中，合适的CCNB1多肽包含编码多肽的氨基酸序列，其包含与SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.10具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

在一些实施方案中，合适的CCND1核酸包含与SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.19具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，合适的CCNB1核酸序列包含编码CCNB1多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，合适的CCNB1多肽包含编码多肽的氨基酸序列，其包含与SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.20具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

Aurora激酶

Aurora激酶是对细胞周期控制至关重要的丝氨酸/苏氨酸激酶。Fu等,(2007)《分子癌症研究(Mol Cancer Res)》,5(1):1-10。这些激酶用于控制细胞分裂过程中的染色单体分离。迄今为止，已经鉴定了三种哺乳动物aurora激酶，即aurora激酶A(AURKA)、aurora激酶B(AURKB)和aurora激酶C(AURKC)。特别地，AURKB在某种程度上特定地用于将有丝分裂纺锤体附着于着丝粒。

来自多种物种的aurora激酶多肽(例如AURKB)的氨基酸序列和编码aurora激酶多肽(例如AURKB)的核苷酸序列是本领域中已知的。参见例如：(1)GenBank寄存编号NP_004208.2(智人344氨基酸aurora激酶B同种型1)；(2)GenBank寄存编号NP_001243763.1(智人303氨基酸aurora激酶B同种型2)；(3)GenBank寄存编号NP_001271455.1(智人345氨基酸aurora激酶B同种型3)；(4)GenBank寄存编号AAH00442.3(智人344氨基酸aurora激酶B)；(5)GenBank寄存编号NM_004217.3(编码智人AURKB核苷酸序列，转录变体1)；(6)GenBank寄存编号NM_001256834.1(编码智人AURKB的核苷酸序列，转录变体2)；(7)GenBank寄存编号NM_001284526.1(编码智人AURKB的核苷酸序列，转录变体3)；(8)GenBank寄存编号NP_035626.1(小家鼠345氨基酸aurora激酶B)；(9)GenBank寄存编号AAH03261.1(小家鼠345氨基酸aurora激酶B)；(10)GenBank寄存编号NM_011496.1(编码小家鼠aurora激酶B的核苷酸序列)。

在一些实施方案中，合适的AURKB核酸包含与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.11具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，合适的AURKB核酸序列包含编码AURKB多肽的核苷酸序列，其中在一些实施方案中，合适的AURKB多肽包含与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.12具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

已进一步发现，引入编码CDK1、CCNB1、CDK4和CCND1的核酸序列足以诱导有丝分裂后细胞(例如心肌细胞和神经元)增殖和/或细胞周期重新进入。在一些实施方案中，CDK是CDK1并且周期蛋白是CCNB1。

已经发现，引入编码CDK1、CCNB1和AURKB的核酸序列足以诱导心脏细胞(例如，有丝分裂后心肌细胞)增殖和/或细胞周期重新进入。

许多标志物和方法可用于鉴定已诱导增殖和/或重新进入细胞周期的有丝分裂后细胞。例如，可以通过对表达增殖标志物(例如Ki67、PHH3、EdU)和细胞特异性标志物的细胞进行免疫细胞化学分析来鉴定增殖细胞。不具有增殖能力或具有低增殖能力的细胞可以被鉴定为具有增殖标志物的低表达或无表达。低表达可以是相比于增殖对照样品(例如，干细胞或祖细胞)小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或无表达。心脏标志物的非限制性实例包括心脏肌钙蛋白T(cTnT)、肌球蛋白重链(MYH)、α肌动蛋白和/或连接蛋白43。神经标志物的非限制性实例包括巢蛋白、神经元核(NeuN)、微管相关蛋白2(MAP2)、βIII微管蛋白、神经元特异性烯醇酶(NSE)、少突胶质细胞谱系(Olig1/2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。胰腺标志物的非限制性实例包括Pax4、Nkx2.2、Ngn3、胰岛素、胰高血糖素和生长抑素。

各种细胞标志物的表达可通过常规生物化学或免疫化学方法(例如，酶联免疫吸附测定法、免疫组织化学测定法等)来检测。可选地，可以评估编码细胞特异性标志物的核酸的表达。编码细胞特异性标志物的核酸在细胞中的表达可以通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或杂交分析来证实，所述方法是过去常用于扩增、检测和分析编码任何标志物蛋白的mRNA的分子生物学方法。编码对心肌细胞、神经细胞、胰腺细胞、毛细胞和骨骼肌细胞具特异性的标志物的核酸序列是已知的，并且可通过诸如GenBank的公共数据库获得。因此，容易确定用作引物或探针所需的标志物特异性序列。

遗传修饰

在一些实施方案中，通过向有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)施用遗传修饰有丝分裂后细胞的组合物，诱导所述有丝分裂后细胞增殖和/或重新进入细胞周期。所述组合物可包含至少一种核酸，其包含编码细胞周期调控多肽(例如，周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和aurora激酶多肽(统称为“至少一种核酸”))的核苷酸序列。在一些实施方案中，在诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的组合物和/或方法中明确排除aurora激酶。

包含编码增殖和/或细胞周期重新进入因子的核苷酸序列的至少一种核酸可以是重组表达载体，其中合适的载体包括例如重组逆转录病毒、慢病毒和腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、核酸表达载体和质粒表达载体。在一些情况下，至少一种核酸被整合到有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)及其后代的基因组中。在其它情况下，至少一种核酸在有丝分裂后细胞及其后代中以游离基因状态持续存在。在一些情况下，内源性的天然形式的至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子可能已经存在于有丝分裂后细胞中，但向有丝分裂后细胞中添加另一种外源因子(例如至少一种核酸)以诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入。在其它情况下，至少一种核酸编码至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽，所述多肽具有与有丝分裂后细胞内由内源增殖和/或细胞周期重新进入因子编码核酸编码的多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施方案中，有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)用单独的表达构建体进行遗传修饰，每个表达构建体包含编码一个增殖和/或细胞周期重新进入因子的核酸序列。在一些实施方案中，有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)用多个表达构建体进行遗传修饰，每个表达构建体包含编码一个增殖和/或细胞周期重新进入因子的核酸序列。在一些实施方案中，有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)用三个独立的表达构建体进行遗传修饰，每个表达构建体包含编码一个增殖和/或细胞周期重新进入因子的核酸序列。在一些实施方案中，有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)用两个单独的表达构建体进行遗传修饰，每个表达构建体包含编码至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子的核酸序列。在一些实施方案中，有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)用一个表达构建体进行遗传修饰，所述表达构建体包含编码至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子的核酸序列。在一些实施方案中，有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)用一个表达构建体进行遗传修饰，表达构建体包含编码几种细胞周期调控因子的序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)用一个表达构建体进行遗传修饰，所述表达构建体包含编码全部CDK1和CCNB1并任选地包括CDK4和/或CCND1的序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码CDK1和CCNB1并任选地包括CDK4和/或CCND1的序列在一个表达载体中，两个表达载体中(例如，CDK1从作为CCNB1的单独的载体表达)或四个表达载体中(例如，CDK1、CCNB1、CDK4和CCND1都是从单独的载体表达)。

在一些实施方案中，有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)用一个表达构建体进行遗传修饰，所述表达构建体包含编码CDK1、CCNB1和AURKB中的全部三种的序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码CDK1、CCNB1和AURKB的序列在一个表达载体中，两个表达载体中(例如，CDK1从作为CCNB1和AURKB的单独的载体表达)或三个表达载体中(例如，CDK1、CCNB1和AURKB都是从单独的载体表达)。

在一些实施方案中，将一种或多种包含编码增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的核苷酸序列的外源核酸引入单个有丝分裂后细胞(例如，有丝分裂后心肌细胞)。在其它实施方案中，将一个或多个包含编码增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的核苷酸序列的外源核酸在体外引入有丝分裂后细胞群体(例如，有丝分裂后心肌细胞群体)。在一些实施方案中，将一个或多个包含编码增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的核苷酸序列的外源核酸在体内引入有丝分裂后细胞(例如，单个有丝分裂后心肌细胞或有丝分裂后心肌细胞群体)。

在心脏细胞群体用一个或多个包含编码增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的核苷酸序列的外源核酸遗传修饰(体外或体内)的情况下，可以将所述一个或多个外源核酸引入有丝分裂后细胞总群体的大于0.1％，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％或大于0.1％的其它百分比的细胞中。

在其它实施方案中，在有丝分裂后细胞群体用一个或多个包含编码增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的核苷酸序列的外源核酸遗传修饰(体外或体内)的情况下，可以将所述一个或多个外源核酸引入心脏细胞总群体的大于1％，例如2％、3％、5％、10％、12％、15％、20％或大于1％的其它百分比的细胞中。

在其它实施方案中，在有丝分裂后细胞群体用一个或多个包含编码增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的核苷酸序列的外源核酸遗传修饰(体外或体内)的情况下，可以将所述一个或多个外源核酸引入有丝分裂后细胞总群体的大于20％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于20％的其它百分比的细胞中。

在一些实施方案中，一个或多个包含编码增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的核苷酸序列的核酸在表达构建体中，所述表达构建体在遗传修饰的有丝分裂后细胞中提供一种或多种增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的产生。在一些实施方案中，所述表达构建体是病毒构建体，例如重组腺相关病毒构建体(例如，美国专利No.7,078,387)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体等。

合适的表达载体包括(但不限于)病毒载体(例如基于以下的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(例如Li等,(1994)《眼科学研究杂志(Invest Opthalmol VisSci)》,35:2543-2549；Borras等,(1999)《基因疗法(Gene Ther)》,6:515-524；Li和Davidson,(1995)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,92:7700-7704；Sakamoto等,(1999)《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》,5:1088-1097；WO 94/12649；WO 93/03769；WO93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(例如，Ali等,(1998)《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》,9(1):81-86,1998；Flannery等,(1997)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,94:6916-6921；Bennett等,(1997)《眼科学研究杂志(InvestOpthalmol Vis Sci)》,38:2857-2863；Jomary等,(1997)《基因疗法(Gene Ther)》,4:683-690；Rolling等,(1999),《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》,10:641-648；Ali等,(1996)《人类分子遗传学(Hum Mol Genet.)》,5:591-594；WO 93/09239；Samulski等,(1989)《病毒学杂志(J.Vir.)》,63:3822-3828；Mendelson等,(1988)《病毒学(Virol.)》,166:154-165；和Flotte等,(1993)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(例如，Miyoshi等,(1997)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,94:10319-10323；Takahashi等,(1999)《病毒学杂志(J.Vir.)》,73:7812-7816))；逆转录病毒载体(例如，鼠科动物白血病病毒、脾坏死病毒，和衍生自逆转录病毒如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体)；等等。

众多合适的表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购的。以下载体作为示例提供；对于真核细胞：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)和pAd(Life Technologies)。然而，可以使用任何其它载体，只要其与本公开的细胞相容即可。

根据使用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等可用于表达载体中(例如，Bitter等,(1987)《酶学方法(Methods in Enzymology)》,153:516-544)。

在一些实施方案中，编码增殖和/或细胞周期重新进入因子的核苷酸序列(例如，编码CCNB1的核苷酸序列、编码AURKB的核苷酸序列、编码CDK1的核苷酸序列、编码CCND1的核苷酸序列或编码CDK4的核苷酸序列)可操作地连接到控制元件，例如转录控制元件，例如启动子。转录控制元件在真核细胞(例如哺乳动物心脏细胞)中起作用。合适的转录控制元件包括启动子和增强子。在一些实施方案中，所述启动子是组成型活性的。在其它实施方案中，所述启动子是诱导型的。

合适的真核启动子(在真核细胞中具功能性的启动子)的非限制性实例包括CMV、CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-I。在一些实施方案中，将使用能够赋予心脏特异性表达的启动子。合适的心脏特异性启动子的非限制性实例包括结蛋白(Des)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)、肌球蛋白轻链2(MLC-2)、心脏肌钙蛋白T(cTnT)和心脏肌钙蛋白C(cTnC)。合适的神经元特异性启动子的非限制性实例包括突触蛋白I(SYN)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II、微管蛋白αI、神经元特异性烯醇酶和血小板衍生生长因子β链启动子和通过将巨细胞病毒增强子(E)与那些神经元特异性启动子融合形成的杂合启动子。

在一些实施方案中，将编码增殖和/或细胞周期重新进入因子的核苷酸序列可操作地连接到细胞类型特异性转录调控元件(TRE)，其中TRE包括启动子和增强子。合适的TRE包括(但不限于)衍生自以下基因的TRE：肌球蛋白轻链-2、α-肌球蛋白重链、AE3、心脏肌钙蛋白C和心脏肌动蛋白。Franz等,(1997)《心血管研究(Cardiovasc.Res.)》,35:560-566；Robbins等,(1995)《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,752:492-505；Linn等,(1995)《循环研究(Circ.Res.)》,76:584-591；Parmacek等,(1994)《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》,14:1870-1885；Hunter等,(1993)《高血压(Hypertension)》,22:608-617；和Sartorelli等,(1992)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,89:4047-4051。

适当的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的水平范围内。表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体也可能包括用于扩增表达的适当序列。

合适的哺乳动物表达载体(适用于哺乳动物有丝分裂后细胞中的表达载体)的实例包括(但不限于)：重组病毒、核酸载体，例如质粒、细菌人造染色体、酵母人造染色体、人类人造染色体、cDNA、cRNA和聚合酶链反应(PCR)产物表达盒。适于驱动编码增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽的核苷酸序列的表达的启动子的实例包括(但不限于)逆转录病毒长末端重复(LTR)元件；组成型启动子，例如CMV、HSV1-TK、SV40、EF-1α、β-肌动蛋白、磷酸甘油激酶(PGK)；诱导型启动子，例如含有Tet-操纵子元件的启动子；心脏特异性启动子，例如结蛋白(Des)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)、肌球蛋白轻链2(MLC-2)、心脏肌钙蛋白T(cTnT)和心脏肌钙蛋白C(cTnC)；神经特异性启动子，例如巢蛋白、神经元核(NeuN)、微管相关蛋白2(MAP2)、βIII微管蛋白、神经元特异性烯醇酶(NSE)、少突胶质细胞谱系(Olig1/2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)；和胰腺特异性启动子，例如Pax4、Nkx2.2、Ngn3、胰岛素、胰高血糖素和生长抑素。

在一些情况下，除了外源增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽之外，哺乳动物表达载体还编码有助于鉴定或选择已转染、转导或感染的细胞的标志基因。标志基因的实例包括(但不限于)编码荧光蛋白的基因，例如增强绿色荧光蛋白Ds-Red(DsRed：圆盘海葵属(Discosoma sp.))、红色荧光蛋白(RFP)(Bevis等,(2002)《自然-生物技术(Nat.Biotechnol.)》,20(11):83-87)、黄色荧光蛋白mCherry和青色荧光蛋白；以及编码赋予选择剂抗性的蛋白质的基因，例如新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因等。

在一个实施方案中，表达载体还包含以下，或者可选地基本上由以下组成，或者此外由以下组成：自杀基因。可通过与表达至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子多肽编码核苷酸的启动子相同或不同的启动子来调控自杀基因的表达。自杀基因是允许细胞阴性选择的基因。在本文所述的方法中，使用自杀基因作为安全系统，从而允许表达该基因的细胞通过引入选择剂而死亡。在重组基因造成突变从而导致不受控制的细胞生长的情况下，这是理想的。已经鉴定了许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk或TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因(也参见例如Yazawa K,Fisher W E,Brunicardi F C:Current progressin suicide gene therapy for cancer.《世界外科学杂志(World J.Surg.)》,(2002)26(7):783-9)。在一个实施方案中，自杀基因是胸苷激酶(TK)基因。在一个方面，TK基因是野生型TK基因。在其它方面，TK基因是所述基因的突变形式，例如sr23tk。可以使用更昔洛韦杀死表达TK蛋白的细胞。在另一个实施方案中，编码四环素激活蛋白的核酸和自杀基因由一个启动子调控。

合适的病毒载体的实例包括(但不限于)基于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒的病毒载体，以及游离基因载体。合适的基于逆转录病毒载体的实例是基于鼠类莫尼诺白血病病毒(MMLV)的载体；然而，也可以使用其它重组逆转录病毒，例如，禽白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒(MLV)、貂细胞病灶诱发病毒、鼠肉瘤病毒、网状内皮组织增生病毒、长臂猿白血病病毒、梅森辉瑞猴病毒(Mason Pfizer Monkey Virus)或Rous肉瘤病毒(例如，美国专利No.6,333,195)。

在其它情况下，基于逆转录病毒的载体是基于慢病毒的载体(例如，人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、猿免疫缺陷病毒(SIV)或猫免疫缺陷病毒(FIV))。Johnston等,(1999),《病毒学杂志(Journal of Virology)》,73(6):4991-5000(FIV)；Negre D等,(2002)《微生物学和免疫学的当前主题(Current Topics in Microbiology and Immunology)》,261:53-74(SIV)；Naldini等,(1996)《科学(Science)》,272:263-267(HIV)。

重组逆转录病毒可包含病毒多肽(例如逆转录病毒env)以帮助进入靶细胞。这种病毒多肽是本领域中公认的，例如美国专利No.5,449,614。病毒多肽可以是双嗜性病毒多肽，例如双嗜性env，其帮助进入源自多个物种的细胞，包括原始宿主物种之外的细胞中。病毒多肽可以是异嗜性病毒多肽，其帮助进入原始宿主物种之外的细胞中。在一些实施方案中，病毒多肽是单嗜性病毒多肽，例如单嗜性env，其帮助进入原始宿主物种的细胞中。

能够帮助逆转录病毒进入细胞中的病毒多肽的实例包括(但不限于)：MMLV双嗜性env、MMLV单嗜性env、MMLV异嗜性env、水泡性口炎病毒-g蛋白(VSV-g)、HIV-1env、长臂猿白血病病毒(GALV)env、RD114、FeLV-C、FeLV-B、MLV 10A1 env基因及其变体，包括嵌合体。Yee等,(1994)《细胞生物学方法(Methods Cell Biol.)》,Pt A:99-112(VSV-G)；美国专利No.5,449,614。在一些情况下，病毒多肽被遗传修饰以促进表达或增强与受体的结合。

通常，通过将病毒DNA或RNA构建体引入生产细胞来产生重组病毒。在一些情况下，所述生产细胞不表达外源基因。在其它情况下，所述生产细胞是包含一个或多个外源基因的“包装细胞”，例如编码一种或多种gag、pol或env多肽和/或一种或多种逆转录病毒gag、pol或env多肽的基因。逆转录病毒包装细胞可包含编码病毒多肽(例如帮助进入靶细胞的VSV-g)的基因。在一些情况下，包装细胞包含编码一种或多种慢病毒蛋白(例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev或nef)的基因。在一些情况下，包装细胞包含编码腺病毒蛋白如E1A或E1B或其它腺病毒蛋白的基因。例如，由包装细胞提供的蛋白质可以是逆转录病毒衍生的蛋白质，例如gag、pol和env；慢病毒衍生蛋白，例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev和nef；和腺病毒衍生蛋白，例如E1A和E1B。在许多实例中，包装细胞提供衍生自与病毒载体衍生的病毒不同的病毒的蛋白质。

包装细胞系包括(但不限于)任何可容易转染的细胞系。包装细胞系可以基于293T细胞、NIH3T3、COS或HeLa细胞系。包装细胞通常用于缺乏编码病毒包装所需的蛋白质的至少一种基因的包装病毒载体质粒。任何可以提供由这种病毒载体质粒编码的蛋白质缺乏的蛋白质或多肽的细胞可以用作包装细胞。包装细胞系的实例包括(但不限于)：Platinum-E(Plat-E)、Platinum-A(Plat-A)、BOSC 23(ATCC CRL 11554)和Bing(ATCC CRL 11270)。Morita等,(2000)《基因疗法(Gene Therapy)》,7(12):1063-1066；Onishi等,(1996)《实验血液学(Experimental Hematology)》,24:324-329；美国专利No.6,995,009。商业包装系也是有用的，例如Ampho-Pak 293细胞系、Eco-Pak 2-293细胞系、RetroPack PT67细胞系和Retro-X通用包装系统(均可从Clontech获得)。

逆转录病毒构建体可以衍生自一系列逆转录病毒，例如MMLV、HIV-1、SIV、FIV或本文所述的其它逆转录病毒。逆转录病毒构建体可以编码特定病毒的多于一个复制周期所需的所有病毒多肽。在一些情况下，通过添加其它因子或其它病毒多肽来改善病毒进入的效率。在其它情况下，由逆转录病毒构建体编码的病毒多肽不支持多于一个复制周期，例如，美国专利No.6,872,528。在这种情况下，添加其它因子或其它病毒多肽可以帮助促进病毒进入。在一个示例性实施方案中，重组逆转录病毒是包含VSV-g多肽但不包含HIV-1env多肽的HIV-1病毒。

逆转录病毒构建体可以包含：启动子、多克隆位点和/或抗性基因。启动子的实例包括(但不限于)CMV、SV40、EF1α、β-肌动蛋白；逆转录病毒LTR启动子和诱导型启动子。逆转录病毒构建体还可以包含包装信号(例如，源自MFG载体的包装信号；psi包装信号)。本领域已知的一些逆转录病毒构建体的实例包括(但不限于)：pMX、pBabeX或其衍生物。Onishi等,(1996)《实验血液学(Experimental Hematology)》,24:324-329。在一些情况下，逆转录病毒构建体是自我失活的慢病毒载体(SIN)载体。Miyoshi等,(1998)《病毒学杂志(J.Virol.)》,72(10):8150-8157。在一些情况下，逆转录病毒构建体是LL-CG、LS-CG、CL-CG、CS-CG、CLG或MFG。Miyoshi等,(1998)《病毒学杂志(J.Virol.)》,72(10):8150-8157；Onishi等,(1996)《实验血液学(Experimental Hematology)》,24:324-329；Riviere等,(1995)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,92:6733-6737。病毒载体质粒(或构建体)包括：pMXs、pMxs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo(pMXs-IB是携带杀稻瘟菌素抗性基因而不是pMXs-puro的嘌呤霉素抗性基因的载体)(Kimatura等,(2003)《实验血液学(ExperimentalHematology)》,31:1007-1014；MFG Riviere等,(1995)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,92:6733-6737)；pBabePuro(Morgenstern等,(1990)《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,18:3587-3596)；LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG(Miyoshi等,(1998)《病毒学杂志(J.Vir.)》,72:8150-8157)等作为逆转录病毒系统；和pAdexl(Kanegae等,(1995)《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,23:3816-3821)等作为腺病毒系统。在示例性实施方案中，逆转录病毒构建体包含杀稻瘟菌素(例如pMXs-IB)、嘌呤霉素(例如pMXs-puro、pBabePuro)；或新霉素(例如pMXs-neo)。Morgenstern等,(1990)《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,18:3587-3596。

从包装细胞生产重组病毒的方法及其用途是公认的；参见例如美国专利No.5,834,256；6,910,434；5,591,624；5,817,491；7,070,994；和6,995,009。许多方法开始于将病毒构建体引入包装细胞系。病毒构建体可以通过本领域已知的任何方法引入宿主成纤维细胞，包括(但不限于)：磷酸钙方法，脂质转染方法(例如，Felgner等,(1987)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,84:7413-7417)，电穿孔方法，显微注射，Fugene转染，核转染等，以及本文所述的任何方法。

一种或多种编码增殖和/或细胞周期重新进入因子的核酸可以使用各种众所周知的技术引入有丝分裂后细胞，例如基于非病毒的细胞转染。在一个示例性方面，将构建体并入载体并引入心脏细胞。引入心脏细胞可以通过本领域已知的任何基于非病毒的转染方法进行，例如(但不限于)电穿孔、磷酸钙介导的转移、核转染、声致穿孔、热休克、磁转染、脂质体介导转移、显微注射、微粒介导的转移(纳米颗粒)、阳离子聚合物介导的转移(DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇(PEG)等)或细胞融合。其它转染方法包括转染试剂如Lipofectamine^TM、Dojindo Hilymax^TM、Fugene^TM、jetPEI^TM、Effectene^TM和DreamFect^TM。

在一些实施方案中，至少一种核酸是合成信使RNA(mRNA)。合成mRNA提供用于制造感兴趣蛋白质的遗传信息，并且可以进行化学修饰以避免触发免疫应答。Zangi等,(2013)《自然-生物技术(Nature Biotech)》,31:898-907。由于mRNA不整合到宿主细胞基因组中，合成RNA作用持续一段时间，然后随着细胞分裂而消失。在一些实施方案中，例如用假尿苷和/或5-甲基-胞苷修饰合成mRNA，以降低对单链RNA的先天抗病毒反应。在一些实施方案中，合成RNA编码CCNB1、CCND1、CDK1、CDK4、AURKB或组合和/或其各自的等同物。

在一些实施方案中，合适的编码CDK1的合成RNA包含与SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.7具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，合适的编码CCNB1的合成RNA包含与SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.9具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，合适的编码AURKB的合成RNA包含与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.11具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，合适的编码CDK4的合成RNA包含与SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.17具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，合适的编码CCND1的合成RNA包含与SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.19具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

蛋白质修饰

在另一个方面，多肽可以使用本领域已知的任何方法引入有丝分裂后细胞。蛋白质递送(即蛋白质转导)是肽或蛋白质基序穿过细胞质膜的过程。将肽引入细胞的方法包括例如转染、显微注射、电穿孔、纳米颗粒、病毒样颗粒(VLP)。在一些实施方案中，蛋白质是CCNB1、CCND1、CDK1、CDK4、AURKB或其组合和/或其各自的等同物。

化学修饰

在另一个方面，本公开提供诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的方法，所述方法包括向所述细胞施用包含可有效刺激增殖和/或细胞周期重新进入的量的至少一种化学物质的组合物，其中所述化学物质组合物能够增加周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白和aurora激酶或其等同物的表达。在其它实施方案中，所述方法包括以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：使所述细胞与有效量的增加至少一种周期蛋白依赖性激酶、至少一种周期蛋白或其等同物的表达的至少一种化学物质接触。在一些实施方案中，所述化学物质增加CCNB1、CCND1、CDK1、CDK4、其组合和/或其各自的等同物的表达。

任何现在已知或稍后发现的能够增加周期蛋白依赖性激酶、周期蛋白或aurora激酶(例如CDK1、CDK4、CCNB1、CCND1或AURKB)或其各自的等同物的表达的化合物属于本公开的范围。化合物应理解为还涵盖可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体结合使用的所有药学上可接受的衍生物。

在其它方面，本公开提供诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的方法，所述方法包括以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：使所述细胞与有效量的化学物质组合物接触以刺激增殖和/或细胞周期重新进入，其中所述化学物质组合物能够抑制细胞增殖和/或细胞周期重新进入的负调控物的表达。例如，Wee1抑制剂可用于诱导CDK1的表达。在一些实施方案中，用小分子MK1775(Wee1抑制剂)激活CDK1可以从混合物中取代CDK1和/或CCNB。

其它药剂和细胞周期调控因子

有丝分裂后细胞(例如有丝分裂后心肌细胞)可以如上所述进行(遗传或非遗传)修饰，并且还可以与可以添加到组合物中的一种或多种其它药剂和/或因子接触，例如，可以包括一种或多种其它药剂和/或因子作为培养基或组合物的添加剂。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括其它细胞周期调控基因，包括例如肌动蛋白结合蛋白anillin(ANLN)、细胞分裂周期-5(CDC5)、钙粘蛋白-6(CDH6)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、周期蛋白依赖激酶3(CDK3)、着丝粒蛋白A (CENPA)、COP9信号体亚基5(COPS5)、cullin 3(CUL3)、GTP酶激活蛋白(CYK4)、胞质分裂的蛋白质调节剂1(PRC1)和/或WNT1诱导型信号通路蛋白1(WISP1)。

在一些实施方案中，可以使用在有丝分裂后细胞中释放细胞周期阻滞的化合物，例如p38抑制剂、p21抑制剂、p57抑制剂或其药学上可接受的衍生物，以促进增殖和/或细胞周期重新进入的增加。在一些实施方案中，可以使用小分子抑制剂。在其它实施方案中，siRNA可用于降低表达。p38、p21、p57等的小分子抑制剂和siRNA均可商购。

在一些实施方案中，将一种或多种增殖和/或细胞周期重新进入因子的第一组合物添加到有丝分裂后细胞持续一段时间，接着是一种或多种增殖和/或细胞周期重新进入因子的第二组合物。例如，CDK4和CCND1的组合可以用于增强G1和S中的细胞数量，这里称为“G1混合物”。因子的其它组合，例如CDK1和CCNB，可以作为“G2混合物”，并增强G2而不是G1或S中的细胞数量。CDK1、CCNB1、CDK4和CCND1的组合可以诱导G1/G2细胞的平衡分布。在一些实施方案中，添加G1混合物持续一段时间，接着是G2混合物。所述G2混合物可以添加到G1混合物中，或者可以替代G2混合物。在一些实施方案中，将G2混合物添加到有丝分裂后细胞持续一段时间后，可以将G1混合物添加到细胞中。除了G2混合物之外，还可以添加G1混合物，或者G1混合物可以替代G2混合物。在一个优选实施方案中，可以将CDK4和CCND1修饰的mRNA的G1混合物添加到有丝分裂后细胞群体持续一段时间，然后可以除去G1混合物，并且可以将CDK1和CCNB1修饰的mRNA的G2混合物添加到有丝分裂后细胞群体持续一段时间。G1和G2混合物可以以相似的模式交替以诱导有丝分裂后细胞的增殖。预期有丝分裂后细胞交替暴露于G1和G2混合物可有助于更有效地驱动细胞通过细胞周期。

III.组合物

本公开还提供被修饰以过度表达增殖和/或细胞周期重新进入因子(例如，CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物)的分离的增殖性有丝分裂后细胞。

在一个方面，本公开还提供一种组合物，其包括以下，或者可选地基本上由以下组成，或此外由以下组成：被修饰以过度表达增殖和/或细胞周期重新进入因子(例如，CDK1、CCNB1、CDK4、CCND1和/或AURKB或其组合和/或其各自的等同物)的分离的增殖性有丝分裂后细胞。

在一些方面提供被修饰以过度表达至少一种CDK和至少一种周期蛋白或其各自的等同物的分离的增殖性有丝分裂后细胞。在其它方面提供被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其各自的等同物的分离的增殖性有丝分裂后细胞。在一些实施方案中，所述细胞被进一步修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。

在另一个方面，提供基本上均质的增殖性有丝分裂后细胞群体。在一些实施方案中，组合物包含本文所述的增殖性有丝分裂后细胞群体和载体，任选地药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含稳定剂和/或防腐剂。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其它问题或并发症并与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

所述组合物可包含本领域技术人员熟知的药学上可接受的赋形剂，药学上可接受的盐、稀释剂、载体、媒介物和此类其它非活性剂。通常用于药物制剂的媒介物和赋形剂包括例如滑石、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水性或非水性溶剂、油类、石蜡衍生物、二醇等。可以使用水或生理上相容的有机溶剂如乙醇、1,2-丙二醇、聚二醇、二甲亚砜、脂肪醇、甘油三酸酯、甘油的偏酯等来制备溶液。肠胃外组合物可以使用常规技术制备，其可包括无菌等渗盐水、水、1,3-丁二醇、乙醇、1,2-丙二醇、与水混合的聚二醇、林格氏溶液等。在一个方面，添加着色剂以便于将组合物定位并适当安置到预期治疗部位。

组合物可包括防腐剂和/或稳定剂。防腐剂的非限制性实例包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、苯甲酸、山梨酸、山梨酸钾、丙酸、苯扎氯铵、苄醇、硫柳汞、苯基汞盐、氯己定、苯酚、3-甲酚、季铵化合物(QAC)、氯丁醇、2-乙氧基乙醇和亚胺脲。

为了控制张力，所述组合物可以包含生理盐，例如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以1至20mg/ml存在。可能存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁和氯化钙。

组合物可包括一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸盐缓冲液。通常将包括浓度在5-20mM范围内的缓冲液。组合物的pH通常将为5至8，更典型地为6至8，例如6.5至7.5，或7.0至7.8。

所述组合物可以通过任何适当的途径施用，这对于本领域技术人员将是显而易见的，这取决于待治疗的疾病或病状。典型的施用途径包括静脉内、动脉内、肌内、皮下、颅内、鼻内或腹膜内。

在一些实施方案中，所述组合物可包括冷冻保护剂。冷冻保护剂的非限制性实例包括二醇(例如乙二醇、丙二醇和甘油)、二甲亚砜(DMSO)、甲酰胺、蔗糖、海藻糖、右旋糖及其任何组合。

所述组合物可以包括在可植入装置中。本发明考虑的合适的可植入装置包括血管内支架(例如，自扩张支架、球囊扩张支架和支架移植物)、骨架、移植物等。这些可植入装置可以涂覆在至少一个表面上，或者用能够诱导有丝分裂后细胞的细胞周期重新进入的组合物进行浸渍。所述组合物也可以包含在可植入装置中的储槽内。在组合物包含在可植入装置中的储槽内的情况下，所述储槽被构造成允许组合物从装置中洗脱。所述组合物可包含CDK1、CDK4、CCNB1、CCND1和AURKB多肽，或其任何组合或各自的等同物。本公开还提供一种可植入装置，其包括包含编码CDK1、CDK4、CCNB1、CCND1和AURKB多肽的核苷酸序列或其任何组合或各自的等同物的组合物。

所述组合物可以包含本领域技术人员熟知的药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的盐、稀释剂、载体、媒介物和其它非活性剂。通常用于药物制剂的媒介物和赋形剂包括例如滑石、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水性或非水性溶剂、油类、石蜡衍生物、二醇等。可以使用水或生理上相容的有机溶剂如乙醇、1,2-丙二醇、聚二醇、二甲亚砜、脂肪醇、甘油三酸酯、甘油的偏酯等来制备溶液。肠胃外组合物可以使用常规技术制备，其可包括无菌等渗盐水、水、1,3-丁二醇、乙醇、1,2-丙二醇、与水混合的聚二醇、林格氏溶液等。在一个方面，添加着色剂以便于将组合物定位并适当安置到预期治疗部位。

在一些实施方案中，制剂是控制释放制剂。术语“控制释放制剂”包括持续释放和时间释放制剂。控制释放制剂是本领域公知的。这些包括允许组合物的持续性、周期性、脉冲或延迟释放的赋形剂。控制释放制剂包括(但不限于)将组合物(细胞和/或至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子)包埋到基质中；肠溶衣；微胶囊；凝胶和水凝胶；植入物；以及允许组合物控制释放的任何其它制剂。

在一个方面，提供包含上述组合物(细胞和/或至少一种增殖和/或细胞周期重新进入因子)、试剂和培养基的多部分试剂盒。所述试剂盒还可包括描述用于使细胞在培养物中生长或用于施用到有需要的受试者的文件或说明书。

IV.治疗方法

心血管疾病

在一个方面提供用于治疗心血管疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其各自的等同物的表达的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的增加CDK4、CCND1或两者的表达的组合物。

在另一个方面提供用于治疗心血管疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的增殖性有丝分裂后心脏细胞(例如心肌细胞)群体。在一些实施方案中，所述增殖性心肌细胞被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其等同物。在其它实施方案中，所述增殖性心肌细胞被修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。

在另一个方面提供用于治疗心血管疾病的方法，其通过向有需要的受试者施用有效量的包含增殖和/或细胞周期重新进入因子(例如，CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物)的组合物。

在一些方面，本公开的增殖性心脏细胞(例如心肌细胞)可以用于治疗有需要的受试者。在一些实施方案中，可以将增殖性心脏细胞施用至有需要的受试者，其中向受试者中施用增殖性心脏细胞可治疗受试者的心血管疾病。因此，在一些实施方案中，治疗心血管疾病的方法包括向有需要的受试者施用诱导增殖和/或重新进入细胞周期的心脏细胞群体。在其它实施方案中，治疗心血管疾病的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物的组合物。在其它实施方案中，治疗心血管疾病的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CDK4、CCNB1、CCND1或其组合和/或其等同物的组合物。

需要使用本公开的组合物、细胞和方法治疗的受试者包括(但不限于)具有先天性心脏缺陷的个体、患有退行性肌肉疾病的个体、患有导致缺血性心脏组织的病状的个体(例如具有冠状动脉疾病的个体)等。在一些实例中，方法可用于治疗退行性肌肉疾病或病状(例如，家族性心肌病、扩张型心肌病、肥厚性心肌病、限制型心肌病或导致缺血性心肌病的冠状动脉疾病)。在一些实例中，主题方法可用于治疗患有心脏或心血管疾病或病症的个体，例如心血管疾病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、冠状动脉瓣膜疾病、扩张型动脉疾病、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压(high blood pressure/hypertension)、心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、导致缺血性心肌病的冠状动脉疾病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞(心脏病发作)或静脉血栓栓塞。

适于使用本公开的组合物、细胞和方法治疗的受试者包括如下个体(例如哺乳动物受试者，例如人类、非人类灵长类动物、实验室非人类哺乳动物受试者如小鼠、大鼠等)，其具有包括(但不限于)导致缺血性心脏组织的病状的心脏病状(例如，具有动脉冠状疾病的个体)等。在一些实例中，适合治疗的个体患有心脏或心血管疾病或病状，例如心血管疾病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、冠状动脉瓣膜疾病、扩张型动脉疾病、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压(high blood pressure/hypertension)、心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、导致缺血性心肌病的冠状动脉疾病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞(心脏病发作)或静脉血栓栓塞。在一些实例中，适合用主题方法治疗的个体包括具有退行性肌肉疾病例如家族性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病，限制型心肌病或导致缺血性心肌病的冠状动脉疾病的个体。

神经疾病

在一个方面提供用于治疗神经疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其各自的等同物的表达的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的增加CDK4、CCND1或两者的表达的组合物。

在另一个方面提供用于治疗神经疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的增殖性有丝分裂后神经细胞(例如神经元)群体。在一些实施方案中，所述增殖性神经细胞被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其等同物。在其它实施方案中，所述增殖性神经细胞被修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。

在另一个方面提供治疗神经疾病的方法，其通过向有需要的受试者施用有效量的包含增殖和/或细胞周期重新进入因子(例如，CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物)的组合物。

在一些方面，本公开的增殖性神经细胞(例如神经元)可以用于治疗有需要的受试者。在一些实施方案中，可以将增殖性神经细胞施用至有需要的受试者，其中向受试者中施用增殖性神经细胞可治疗受试者的神经疾病。因此，在一些实施方案中，治疗神经疾病的方法包括向有需要的受试者施用诱导增殖和/或重新进入细胞周期的神经细胞群体。在其它实施方案中，治疗神经疾病的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物的组合物。在其它实施方案中，治疗神经疾病的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CDK4、CCNB1、CCND1或其组合和/或其等同物的组合物。

需要或适合使用本公开的组合物、细胞和方法治疗的受试者包括(但不限于)具有脊髓损伤(SCI)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、硬脑膜动静脉瘘、癫痫、记忆障碍、多发性硬化(MS)、帕金森病、周围神经病、阿尔茨海默病、疱疹后神经痛、脊髓肿瘤和中风的个体。

胰腺疾病

在一个方面提供用于治疗胰腺疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其各自的等同物的表达的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的增加CDK4、CCND1或两者的表达的组合物。

在另一个方面提供用于治疗胰腺疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的增殖性有丝分裂后胰腺细胞(例如β细胞)群体。在一些实施方案中，所述增殖性胰腺细胞被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其等同物。在其它实施方案中，所述增殖性胰腺细胞被修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。

在另一个方面提供治疗胰腺疾病的方法，其通过向有需要的受试者施用有效量的包含增殖和/或细胞周期重新进入因子(例如，CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物)的组合物。

在一些方面，本公开的增殖性胰腺细胞(例如β细胞)可以用于治疗有需要的受试者。在一些实施方案中，可以将增殖性胰腺细胞施用至有需要的受试者，其中向受试者中施用增殖性胰腺细胞可治疗受试者的胰腺疾病。因此，在一些实施方案中，治疗胰腺疾病的方法包括向有需要的受试者施用诱导增殖和/或重新进入细胞周期的胰腺细胞群体。在其它实施方案中，治疗胰腺疾病的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物的组合物。在其它实施方案中，治疗胰腺疾病的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CDK4、CCNB1、CCND1或其组合和/或其等同物的组合物。

需要或适合使用本公开的组合物、细胞和方法治疗的受试者包括(但不限于)患有糖尿病(例如，1型糖尿病或2型糖尿病)、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、遗传性胰腺炎、胰腺癌、囊性纤维化和先天性畸形的个体。

听力损失

在一个方面提供用于治疗听力损失的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其各自的等同物的表达的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的增加CDK4、CCND1或两者的表达的组合物。

在另一个方面提供用于治疗听力损失的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的增殖性有丝分裂后耳毛细胞群体。在一些实施方案中，所述增殖性毛细胞被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其等同物。在其它实施方案中，所述增殖性毛细胞被修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。

在另一个方面提供治疗听力损失的方法，其通过向有需要的受试者施用有效量的包含增殖和/或细胞周期重新进入因子(例如，CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物)的组合物。

在一些方面，本公开的增殖性毛细胞(例如，内耳毛细胞)可以用于治疗有需要的受试者。在一些实施方案中，可以向有需要的受试者施用增殖性毛细胞，其中向受试者中施用增殖性毛细胞可治疗受试者的听力损失。因此，在一些实施方案中，治疗听力损失的方法包括向有需要的受试者施用诱导增殖和/或重新进入细胞周期的毛细胞群体。在其它实施方案中，治疗听力损失的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物的组合物。在其它实施方案中，治疗听力损失的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CDK4、CCNB1、CCND1或其组合和/或其等同物的组合物。

需要或适合使用本公开的组合物、细胞和方法治疗的受试者包括(但不限于)具有由头部创伤、病毒或疾病、响亮噪音暴露、自身免疫性内耳疾病、遗传性病症、衰老(老年性耳聋)、内耳畸形和梅尼埃病(Meniere's disease)造成的听力损失的个体。

骨骼肌

在一个方面提供用于增加肌肉质量的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的增加CDK1和CCNB1或其各自的等同物的表达的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的增加CDK4、CCND1或两者的表达的组合物。

在另一个方面提供用于增加肌肉质量的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的增殖性有丝分裂后骨骼肌细胞群体。在一些实施方案中，所述增殖性骨骼肌细胞被修饰以过度表达CDK1和CCNB1或其等同物。在其它实施方案中，所述骨骼肌细胞被修饰以过度表达CDK4、CCND1或两者。

在另一个方面提供增加肌肉质量的方法，其通过向有需要的受试者施用有效量的包含增殖和/或细胞周期重新进入因子(例如，CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物)的组合物。

在一些方面，本公开的增殖性骨骼肌细胞可以用于治疗有需要的受试者。在一些实施方案中，可以向有需要的受试者施用增殖性骨骼肌细胞，其中向受试者中施用骨骼肌细胞可通过增加骨骼肌细胞数量来增进受试者的肌肉质量。因此，在一些实施方案中，增进肌肉质量的方法包括向有需要的受试者施用诱导增殖和/或重新进入细胞周期的骨骼肌细胞群体。在其它实施方案中，增进肌肉质量的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CCNB1和AURKB或其等同物的组合物。在其它实施方案中，增进肌肉质量的方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含CDK1、CDK4、CCNB1、CCND1或其组合和/或其等同物的组合物。

需要或适合使用本公开的组合物、细胞和方法的受试者包括(但不限于)具有骨骼肌疾病如肌肉萎缩、脑性麻痹、肌萎缩性侧索硬化和重症肌无力的个体或者希望增加肌肉质量的个体，例如举重运动员和健美运动员。

除非另有说明，否则整个说明书中使用的缩写具有以下含义：

Aa＝氨基酸

Bp＝碱基对

H＝小时

G＝克

Kb＝千碱基

kDa＝千道尔顿

Kg＝千克

L＝升

LC＝液相色谱

Mg＝毫克

Min＝分钟

mL＝毫升

mM＝毫摩尔浓度

nM＝纳摩尔浓度

nT＝核苷酸

pM＝皮摩尔浓度

s.d.＝标准偏差

μCi＝微居里

Μg＝微克

μL＝微升

μΜ＝微摩尔浓度

Μm＝微米

℃＝摄氏度

当代表氨基酸时，这些单字母符号具有以下含义：

A＝丙氨酸

R＝精氨酸

N＝天冬酰胺

D＝天冬氨酸

C＝半胱氨酸

E＝谷氨酸

Q＝谷氨酰胺

G＝甘氨酸

H＝组氨酸

I＝异亮氨酸

L＝亮氨酸

K＝赖氨酸

M＝甲硫氨酸

F＝苯丙氨酸

P＝脯氨酸

S＝丝氨酸

T＝苏氨酸

W＝色氨酸

Y＝酪氨酸

V＝缬氨酸

实施例

以下实施例旨在进一步说明本公开的某些实施方案。阐述所述实施例以向本领域普通技术人员提供并且不旨在限制其范围。

实施例1.诱导非增殖性心肌细胞的增殖

心肌细胞培养：

小鼠心肌细胞分离自初生(新生P0)和成体(6周龄)，如Ieda等,(2009)《发育细胞(Dev.Cell)》,16(2):233-244中所述。心肌细胞在含有10％FBS的DMEM/M199培养基中培养。

微阵列方案：

小鼠全基因组基因表达分析使用Affymetrix小鼠基因1.0ST阵列进行。使用Trizol(Invitrogen)从初生(新生P0)和成体(6周龄)心肌细胞中提取RNA。根据标准Affymetrix Genechip方案，从独立生物样品一式三份进行微阵列分析。使用AffymetrixPower Tool(APT,1.8.5版)分析数据。使用统计学/阈值组合限定差异基因表达。

过度表达：

根据Mohamed等,《心血管研究(Cardiovasc Res.)》,2014年7月1日；103(1):47-59构建腺病毒。简而言之，EGFP、CDK1、CCNB1和AURKB的编码区通过PCR扩增并亚克隆到pENTR^TM/SD/D-TOPO穿梭载体中。根据制造商推荐的方法，使用

克隆系统，通过pENTR^TM/SD/D-TOPO穿梭载体与pAd/CMV/V5-DEST载体(Life Technologies)之间的同源重组生成腺病毒。通过将编码质粒的腺病毒转染到HEK293细胞中并使用氯化铯柱纯化并滴定来产生腺病毒颗粒。为了感染心肌细胞，将25感染复数(MOI)的腺病毒温育24小时，然后用新鲜培养基更换培养基。

免疫细胞化学：

将细胞在室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟，用皂角苷进行透化，封闭，并用针对肌钙蛋白T(cTnT)(Thermo Scientific)、磷酸化组蛋白H3(PHH3)(Life Technologies)的初级抗体温育，然后用与Alexa 488(绿色)或594(红色)结合的次级抗体(MolecularProbes)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen)温育。

组织学：

对于Masson三色染色，在心肌梗塞后6周采集心脏，并包埋在石蜡中并横向切片。将脱蜡切片依次浸入Weigert铁苏木精工作溶液中持续10分钟，Biebrich猩红酸品红溶液中持续15分钟，磷钼酸-磷钨酸溶液中持续15分钟，苯胺蓝溶液中持续5-10分钟，以及1％乙酸溶液中持续2-5分钟。对于细胞注射心脏中的免疫组织化学研究，心脏在0.4％多聚甲醛中固定过夜，包埋到OCT化合物中，并冷冻在液氮中(Ieda等,2010；Ieda等,2009)。将心脏垂直切成7μm切片以显示两个心室。切片用针对PHH3(S10)和肌钙蛋白T(cTnT)的初级抗体，用与Alexa 488或594结合的次级抗体和DAPI染色。

增殖和细胞计数测定法：

使过度表达CDK1、CCNB1和AURKB或对照腺病毒载体的两月龄hiPSC衍生心肌细胞在培养物中生长。向培养基中施用EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；10μM)持续30分钟。使用Click-iT EdU细胞增殖测定试剂盒(Invitrogen Inc.)检测EdU结合，并通过显微镜分析。

通过使用DAPI阳性细胞的免疫荧光评估每个图像的总核计数来定量用对照或CDK1、CCNB1和AURKB腺病毒转导的两月龄hiPSC衍生心肌细胞的心肌细胞增殖核数量。

通过FACS分析确定用对照或CDK1、CCNB1和AURKB转导72小时的hiPSC衍生心肌细胞群体中的细胞总数。从培养皿采集细胞，并用FlowJo软件在FACS Calibur(BDBiosciences)上进行分析。

还使用Cell Titre Glo(Promega,Madison,Wis.,USA)分析细胞数量和活力。CellTitre Glo是细胞数量和活力的高度敏感指标，其通过测量ATP代谢，而无需像FACS中所需的那样从细胞培养板上分离细胞。在用Cell Titre Glo试剂温育对照细胞或用CDK1、CCNB1和AURKB转导的细胞后，记录含有Cell Titre Glo的孔的发光强度，其中强度与孔中的活的代谢细胞数量成正比。

延时成像：

将用腺病毒转导以过度表达CDK1、CCNB1和AURKB的心肌细胞一式四份地接种到24孔板中(10,000个细胞/孔)，并使用IncuCyte成像仪(Essen BioSciences,Ann Arbor,MI,USA)分析细胞增殖。将板在IncuCyte中以1小时的时间间隔扫描4天。用IncuCyte软件分析数据。

动物研究：

将CDK1AF、CCNB1和AURKB或GFP对照腺病毒注射到心肌梗塞(MI)后C57bl6/N心脏中的损伤部位，如Qian等,(2014)《自然(Nature)》,485(7400):593-8；Saxena等,(2008)《循环(Circulation)》,117:2224-2231中所述。在梗塞后五天采集心脏以评估细胞增殖或在梗塞后六周以评估心脏功能和组织学。

超声心动图检查：

使用二维测量评估心脏收缩功能，以测量感染CDK1AF、CCNB1和AURKB或GFP对照腺病毒的小鼠的射血分数(EF)。用1.75％异氟烷麻醉小鼠。核心温度保持在37-38℃，并且以随机盲法进行扫描。测量射血分数百分比(％EF)和EF随时间的下降。在梗塞后第3天、第10天、第24天和第40天对每只小鼠进行三次单独的扫描。

结果

在初生和成体心肌细胞之间差异调控细胞周期基因

为选择诱导心脏细胞增殖和/或细胞周期重新进入的潜在因子，进行微阵列分析以鉴定初生(新生P0)和成体(6周龄)小鼠心肌细胞之间差异表达的细胞周期基因。增殖性(初生)与非增殖性(成体)心肌细胞之间差异表达的代表性细胞周期基因如图1所示。

CDK1、CCNB1和AURKB促进小鼠和人类心肌细胞中的心脏细胞增殖

测试成体心肌细胞中的前15种下调细胞周期基因，以确定任何一种基因的过度表达是否可以增加通过EdU结合检测的增殖和/或细胞周期重新进入。过度表达AURKB(Aurora)、CCNB1、CDC5、CDK1、CDK2、CDK3、CENPA、COPS5、CUL3、CYK4和PRC1的心肌细胞显示增加的EdU结合(图2，图A)。另一方面，与对照相比，ANLN、CDH6和WISP1的过度表达显示出EdU结合减少(图2，图A)。增殖性细胞(EdU⁺)也对心脏细胞标志物心脏肌钙蛋白T(cTnT)染色呈阳性(图2，图B)。

接下来测试组合使用的三种因子(CDK1、CCNB1和AURKB)是否足以诱导非增殖性hiPSC衍生心肌细胞的增殖。通过腺病毒将CDK1、CCNB1和AURKB引入hiPSC衍生心肌细胞中。在对照细胞中未观察到磷酸化组蛋白H3(S10)阳性细胞。相比之下，过度表达CDK1、CCNB1和AURKB持续72小时的细胞显示磷酸化组蛋白H3表达增加(图3)。类似地，当在从7天龄小鼠中分离的无增殖能力的心肌细胞中引入组成型活性CDK1(CDK1AF)以及CCNB1和AURKB时，与用对照腺病毒转导的细胞相比，存在磷酸化组蛋白H3表达增加(图7)。

CDK1、CCNB1和AURKB的过度表达增加心肌细胞数量

接下来，对过度表达CDK1、CCNB1和AURKB的心肌细胞群体中的细胞数量进行定量。使用三种独立的方法。增殖心肌细胞核的定量显示，响应于CDK1、CCNB1和AURKB的过度表达72小时，核数量加倍(图4，图A)。此外，总核的30％对PHH3染色呈阳性。FACS分析显示，与对照相比，过度表达CDK1、CCNB1和AURKB的心肌细胞群体中的细胞数量增加2倍(图4，图B)。为了在不需要根据FACS所需从培养皿分离细胞的情况下测试细胞数量和细胞活力，进行ATPGlo测定法。使用该方法，观察到CDK1、CCNB1和AURKB过度表达72小时后的细胞数量增加2倍，与FACS分析中所报道的相似(图4，图C)。

进行延时成像以进一步评估CDK1、CCNB1和AURKB过度表达对心肌细胞增殖的诱导。4天过程中每小时采集图像。在过度表达CDK1、CCNB1和AURKB的小鼠和人类心肌细胞中观察到细胞分裂(图5和图6)。

这些数据一起表明，通过过度表达细胞周期基因如CDK1、CCNB1和AURKB，可以诱导非增殖性成体心肌细胞增殖和/或重新进入细胞周期。

CDK1、CCNB1和AURKB改善心脏梗塞后的心脏功能和结构

为了确定用CDK1、CCNB1和AURKB的过度表达诱导心肌细胞增殖在心肌损伤后是否是有益的，将CDK1AF、CCNB1和AURKB腺病毒或对照GFP腺病毒注射到小鼠中心肌梗塞后的损伤部位。梗塞后5天，与对照GFP注射心脏相比，在CDK1AF、CCNB1和AURKB注射心脏中，心脏显示损伤部位的增殖增加(图8，图A)。此外，在梗塞后6周，与GFP对照相比，在注射有CDK1AF、CCNB1和AURKB的五个心脏中有三个显示在梗塞区域内有显著量的心肌细胞(图8，图B)。

为了评估心脏功能，向动物注射CDK1AF、CCNB1和AURKB或GFP对照腺病毒。接着对动物进行超声心动图检查以评估梗塞后第3天、第10天、第24天和第40天的心脏功能。五个对照中仅一个存活。另一方面，被注射有CDK1AF、CCNB1和AURKB的七只小鼠中有五只存活(图9，图A)。此外，相比于唯一幸存对照，被注射有CDK1AF、CCNB1和AURKB的五只小鼠中有四只显示心脏功能随时间的退化较小(图9，图B)。

这些体内数据表明，诱导增殖和/或重新进入细胞周期的成体心肌细胞可以改善心肌梗塞后的心脏功能和结构。

实施例2.诱导有丝分裂后人类心肌细胞的增殖

为了确定用于诱导人类有丝分裂后心肌细胞的细胞增殖和/或细胞周期重新进入的最佳因子混合物，筛选因子组合。如先前Lian,X.等,(2013)《自然方案(Nat Protoc)》,8(1):162-175中所述生成人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞。在存在或不存在TGF-βi(SB431542，“SB”)、CDK激活剂(MK1775，“MK”)和IGF1的组合的情况下，用CDK1AF、CDK4、CCNB1、CCND1、AURKB的组合或GFP对照腺病毒处理细胞。进行分析以鉴定增加经历有丝分裂的细胞数量的因子混合物，如通过在用因子混合物处理后第4天、第8天和第12天增加的磷酸化组蛋白H3染色所评估。图10，图A。还进行分析以鉴定哪些因子混合物具有最高的细胞存活，如通过总核数的增加所评估。图10，图B。

这些数据表明，CDK1AF、CDK4、CCNB1和CCND1的组合是所筛选因子的混合物，其导致增殖性有丝分裂后心肌细胞的最佳存活和增加。还观察到使用SB431542抑制TGFβ信号传导增强了存活。此外，用小分子MK1775激活CDK1可以从混合物中取代CDK1和CCNB1。

实施例3.靶向细胞周期的不同阶段的混合物

为了更好地理解不同的因子混合物促进有丝分裂后细胞的细胞增殖和/或细胞周期重新进入的作用机制，使用荧光泛素细胞周期指示剂(FUCCI)技术使细胞的细胞周期行为可视化。Zielke等,(2015)《威利跨学科评论：发育生物学(WIREs Dev Biol)》,4:469-487。使用该系统，M/G1阶段中的细胞发红色荧光(mCherry)，S/G2阶段中的细胞发绿色荧光(GFP)，并且S阶段中的细胞发红色和绿色荧光。CDK1、CCNB1和AURKB的混合物组合(图A)与CDK4和CCND的混合物(图B)以及CDK1、CCNB、CDK4和CCND的混合物(图C)的比较表明，CDK1、CCNB1和AURKB的组合作为G2混合物，并增强G2而非G1或S中的细胞数量。CDK4和CCND1的组合作为G1混合物，并增加G1和S而非G2中的细胞数量。另一方面，CDK1、CCNB1、CDK4和CCND1的组合诱导G1/G2细胞的平衡分布。据信所述平衡分布有助于细胞存活。

实施例4.CDK1/CCNB1/CDK4/CCND1混合物改善心肌梗塞后的心脏功能

为了确定CDK1/CCNB1/CDK4/CCND1的G1/G2混合物是否可以改善心肌梗塞后的心脏功能，进行体内研究。动物手术方案由加利福尼亚大学旧金山机构动物护理和使用委员会批准。所有手术如前所述进行。Qian,L等,(2012)《自然(Nature)》,485:593-598。简言之，用2.4％异氟烷/97.6％氧气麻醉小鼠，并以仰卧位放置在加热垫(37℃)上。使用MiniVent845型小鼠呼吸机(Hugo Sachs Elektronik-Harvard Apparatus；中风体积，250μl；呼吸率，每分钟120次呼吸)，将动物用19G残端针插管并用室内空气通气。心肌梗塞(MI)是通过用7-0普理灵(prolene)缝线将左前降支(LAD)动脉永久结扎来诱导的，如Qian,L.等,(2012)《自然(Nature)》,485:593-598中所述。假手术动物作为手术对照，并进行与实验动物相同的程序，其中例外为LAD未结扎。在MI时，动物接受了G1/G2混合物注入心肌。

在MI前以及MI后第1周、第2周、第4周、第8周和第12周进行串联超声心动图检查以评估心脏功能。使用具有15MHz线性阵列超声换能器的Vevo 770高分辨率微成像系统(VisualSonics)进行超声心动图检查。以120Hz的帧速率在胸骨旁长轴和短轴视图中评估左心室。收缩末期或舒张末期分别定义为左心室看来最小和最大的阶段，并用于射血分数测量。为了计算缩短率，在乳头肌上以50mm/s的扫描速度从左心室M模式跟踪测量左心室收缩末期和舒张末期直径。B模式用于收缩末期和舒张末期尺寸的二维测量。

在病毒递送和冠状动脉结扎后12周对心脏进行标准Masson三色染色。为了确定瘢痕大小，使用ImagePro软件测量MI心脏的左心室内横跨四个层面的横断面上的瘢痕区域(蓝色)和健康区域(红色)。

结果表明，如通过超声心动图评估的射血分数(EF)变化所反映，与假手术处理的动物相比，用G1/G2混合物治疗显著增强心脏功能(图12)。最早在MI后1周出现功能改善。进行组织学分析以定量瘢痕大小并检测被处理心脏的梗塞区域内肌肉的存在。与体内成像观察结果一致，发现在从用G1/G2混合物处理的动物分离的心脏中，在梗塞区域内观察到较粗的肌细胞带(图13，图A)。此外，被处理动物的瘢痕大小显著降低(图13，图B)。

为了证实这种再肌型化作用是由于体内心肌细胞增殖，使用双标志物(MADM)小鼠的嵌合分析来进行谱系追踪。在从这些小鼠分离的细胞中，当细胞分裂时，它将上升到绿色和红色细胞，并且如果没有分裂，则它将保持黄色，因此区分分裂细胞和非分裂细胞。发现梗塞区域周围的再肌型化至少部分地是由于通过内源细胞增殖生成新的心肌细胞(图14)。

实施例5.诱导有丝分裂后神经元的增殖

为了确定G1/G2混合物是否也可以诱导有丝分裂后神经元的细胞增殖和/或细胞周期重新进入，从大鼠新生儿(P16-18)制备皮质神经元的原代培养物，如Arrasate,M.等,(2005)《美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,102(10):3840-3845中所报道。解剖脑皮层，依次用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂处理，并轻轻湿磨以在Optimem葡萄糖培养基中解离单个神经元。将细胞(约150,000个)接种在96孔组织培养板的每个孔中。两小时后，用含血清的培养基更换接种培养基。用pGW1-GFP作为形态标志物和神经元特异性启动子MAP2-DsRed标记细胞，指示这些细胞是成熟神经元。进行延时显微镜分析以鉴定分裂细胞。如图15中所示，G1/G2混合物诱导有丝分裂后神经元的细胞分裂。此外，确定大多数分裂发生在G1/G2混合物感染后60-90小时，而一些分裂发生在晚至感染后120小时。图16。

实施例6.诱导有丝分裂后胰腺β细胞的增殖

为了确定G1/G2混合物是否可以诱导有丝分裂后胰腺β细胞的细胞增殖和/或细胞周期重新进入，例如通过Clardy等,(2015)《科学报告(Scientific Reports)》,5:13681中所述的方法从其它非β细胞亚群纯化β细胞。将纯化的β细胞接种到组织培养板中，并用G1/G2腺病毒混合物或假腺病毒对照进行处理。用G1/G2混合物处理的β细胞在感染后48小时、72小时和96小时显示细胞分裂增加。用假混合物处理的β细胞显示细胞分裂没有增加。

实施例7.诱导有丝分裂后毛细胞的增殖

为了确定G1/G2混合物是否也可以诱导有丝分裂后内耳毛细胞的细胞增殖和/或细胞周期重新进入，使用与Ronaghi M等,(2014)《干细胞与发育(Stem Cells Dev)》,23(11)1275-1284中所述类似的方法，从诱导多能干细胞体外衍生内耳细胞。将分化的内耳细胞接种到组织培养板中并用G1/G2腺病毒混合物或假腺病毒对照进行处理。用G1/G2混合物处理的细胞在感染后48小时、72小时和96小时显示细胞分裂增加。用假混合物处理的细胞显示细胞分裂没有增加。

应当理解，虽然已经结合上述实施方案描述了本发明，但是前述描述和实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。在本发明的范围内的其它方面、优点和修改对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。

此外，在本发明的特征或方面根据马库什组进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到本发明也由此根据马库什组的任何个别成员或成员亚组来描述。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用明确地并入本文，其程度如同各自通过引用单独并入一样。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

序列表

<110> J·大卫格莱斯顿学会(根据J·大卫格莱斯顿意愿建立的遗嘱信托)(THE J.DAVID GLADSTONE INSTITUTES, A TESTAMENTARY TRUST ESTABLISHED UNDER THE WILL OF J.DAVID GLADSTONE)

<120> 用于诱导有丝分裂后细胞的细胞分裂的方法

<130> 120902-8001.WO00

<140> PCT/US2016/026059

<141> 2016-04-05

<150> 62/151,321

<151> 2015-04-22

<150> 62/144,244

<151> 2015-04-07

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1923

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

agcgcggtga gtttgaaact gctcgcactt ggcttcaaag ctggctcttg gaaattgagc 60

ggagagcgac gcggttgttg tagctgccgc tgcggccgcc gcggaataat aagccgggat 120

ctaccatacc cattgactaa ctatggaaga ttataccaaa atagagaaaa ttggagaagg 180

tacctatgga gttgtgtata agggtagaca caaaactaca ggtcaagtgg tagccatgaa 240

aaaaatcaga ctagaaagtg aagaggaagg ggttcctagt actgcaattc gggaaatttc 300

tctattaaag gaacttcgtc atccaaatat agtcagtctt caggatgtgc ttatgcagga 360

ttccaggtta tatctcatct ttgagtttct ttccatggat ctgaagaaat acttggattc 420

tatccctcct ggtcagtaca tggattcttc acttgttaag agttatttat accaaatcct 480

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tctcttgatt gatgacaaag gaacaattaa actggctgat tttggccttg ccagagcttt 600

tggaatacct atcagagtat atacacatga ggtagtaaca ctctggtaca gatctccaga 660

agtattgctg gggtcagctc gttactcaac tccagttgac atttggagta taggcaccat 720

atttgctgaa ctagcaacta agaaaccact tttccatggg gattcagaaa ttgatcaact 780

cttcaggatt ttcagagctt tgggcactcc caataatgaa gtgtggccag aagtggaatc 840

tttacaggac tataagaata catttcccaa atggaaacca ggaagcctag catcccatgt 900

caaaaacttg gatgaaaatg gcttggattt gctctcgaaa atgttaatct atgatccagc 960

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ctaagttcaa gtttcgtaat gctttgaagt atttttatgc tctgaatgtt taaatgttct 1440

catcagtttc ttgccatgtt gttaactata caacctggct aaagatgaat atttttctac 1500

tggtatttta atttttgacc taaatgttta agcattcgga atgagaaaac tatacagatt 1560

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tgtatattta actaaaatta ctagctttgg gaattaaact gtttaacaaa taaaaaaaaa 1920

aaa 1923

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Glu Asp Tyr Thr Lys Ile Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly

1 5 10 15

Val Val Tyr Lys Gly Arg His Lys Thr Thr Gly Gln Val Val Ala Met

20 25 30

Lys Lys Ile Arg Leu Glu Ser Glu Glu Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala

35 40 45

Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Leu Arg His Pro Asn Ile Val

50 55 60

Ser Leu Gln Asp Val Leu Met Gln Asp Ser Arg Leu Tyr Leu Ile Phe

65 70 75 80

Glu Phe Leu Ser Met Asp Leu Lys Lys Tyr Leu Asp Ser Ile Pro Pro

85 90 95

Gly Gln Tyr Met Asp Ser Ser Leu Val Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile

100 105 110

Leu Gln Gly Ile Val Phe Cys His Ser Arg Arg Val Leu His Arg Asp

115 120 125

Leu Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Asp Lys Gly Thr Ile Lys Leu

130 135 140

Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Ile Arg Val Tyr

145 150 155 160

Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ser Pro Glu Val Leu Leu

165 170 175

Gly Ser Ala Arg Tyr Ser Thr Pro Val Asp Ile Trp Ser Ile Gly Thr

180 185 190

Ile Phe Ala Glu Leu Ala Thr Lys Lys Pro Leu Phe His Gly Asp Ser

195 200 205

Glu Ile Asp Gln Leu Phe Arg Ile Phe Arg Ala Leu Gly Thr Pro Asn

210 215 220

Asn Glu Val Trp Pro Glu Val Glu Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Asn Thr

225 230 235 240

Phe Pro Lys Trp Lys Pro Gly Ser Leu Ala Ser His Val Lys Asn Leu

245 250 255

Asp Glu Asn Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Ile Tyr Asp Pro

260 265 270

Ala Lys Arg Ile Ser Gly Lys Met Ala Leu Asn His Pro Tyr Phe Asn

275 280 285

Asp Leu Asp Asn Gln Ile Lys Lys Met

290 295

<210> 3

<211> 2177

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

cgaacgcctt cgcgcgatcg ccctggaaac gcattctctg cgaccggcag ccgccaatgg 60

gaagggagtg agtgccacga acaggccaat aaggagggag cagtgcgggg tttaaatctg 120

aggctaggct ggctcttctc ggcgtgctgc ggcggaacgg ctgttggttt ctgctgggtg 180

taggtccttg gctggtcggg cctccggtgt tctgcttctc cccgctgagc tgctgcctgg 240

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taaaaaacta ccaaaacctc ttgaaaaggt acctatgctg gtgccagtgc cagtgtctga 540

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<210> 4

<211> 433

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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Met Ala Leu Arg Val Thr Arg Asn Ser Lys Ile Asn Ala Glu Asn Lys

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Ala Lys Ile Asn Met Ala Gly Ala Lys Arg Val Pro Thr Ala Pro Ala

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Ala Thr Ser Lys Pro Gly Leu Arg Pro Arg Thr Ala Leu Gly Asp Ile

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Gly Asn Lys Val Ser Glu Gln Leu Gln Ala Lys Met Pro Met Lys Lys

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Glu Ala Lys Pro Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile Asp Lys Lys Leu Pro

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Pro Val Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Val Lys Glu

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Glu Lys Leu Ser Pro Glu Pro Ile Leu Val Asp Thr Ala Ser Pro Ser

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Gly Ala Asp Pro Asn Leu Cys Ser Glu Tyr Val Lys Asp Ile Tyr Ala

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Tyr Leu Arg Gln Leu Glu Glu Glu Gln Ala Val Arg Pro Lys Tyr Leu

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Leu Gly Arg Glu Val Thr Gly Asn Met Arg Ala Ile Leu Ile Asp Trp

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210 215 220

Met Thr Val Ser Ile Ile Asp Arg Phe Met Gln Asn Asn Cys Val Pro

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Lys Lys Met Leu Gln Leu Val Gly Val Thr Ala Met Phe Ile Ala Ser

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Lys Tyr Glu Glu Met Tyr Pro Pro Glu Ile Gly Asp Phe Ala Phe Val

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Thr Asp Asn Thr Tyr Thr Lys His Gln Ile Arg Gln Met Glu Met Lys

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Val

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

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<210> 6

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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Ala Pro Ser Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gln Arg Val Leu Arg Lys Glu

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Pro Val Thr Pro Ser Ala Leu Val Leu Met Ser Arg Ser Asn Val Gln

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Tyr Asp Arg Arg Arg Ile Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Ala Pro Arg Gly

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<210> 7

<211> 2860

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

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gctgtggtac cgatctccag aagtgttgct gggctcggct cgttactcca ctccggttga 660

catctggagt atagggacca tatttgcaga actggccacc aagaagccgc ttttccacgg 720

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<210> 8

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<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

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Asp Glu Asn Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Val Tyr Asp Pro

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accactgtct cttggtttgt caactttcag atctgaaacc aagtatcttt ttttatgtaa 1800

ttatttattt gttcttaatt ggaaaatagg atgttcaaaa ttaaaggtgt gttttaaaaa 1860

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tattcctatc agcattcctt tcaatgccta tattgcattt cctagtgtga acaaactgtg 2040

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<210> 10

<211> 430

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

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Met Ala Leu Arg Val Thr Arg Asn Thr Lys Ile Asn Ala Glu Asn Lys

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Ala Lys Val Ser Met Ala Gly Ala Lys Arg Val Pro Val Thr Val Thr

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Ala Ala Ser Lys Pro Gly Leu Arg Pro Arg Thr Ala Leu Gly Asp Ile

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Gly Asn Lys Val Ser Glu Glu Leu Gln Ala Arg Val Pro Leu Lys Arg

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Lys Pro Val Glu Lys Val Pro Val Cys Glu Pro Glu Val Glu Leu Ala

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Gln Leu Glu Glu Glu Gln Ser Val Arg Pro Lys Tyr Leu Gln Gly Arg

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Leu Asp Asn Gly Glu Trp Thr Pro Thr Leu Gln His Tyr Leu Ser Tyr

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420 425 430

<210> 11

<211> 1957

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 11

ggagattcga aagcgtccgg gtcgcggggt aaaccggttc tccgtgtgcg agcgcctagt 60

ggcgtaggct gcggctttgc ggggaactgc gggggctgca gtggtccacg gggctgatcg 120

ggttccgttg ggcggatcca cgtgcccgct atccgcctgg aaggagaggt gcaggagtac 180

ccccgacctt ggctgcgtgc tgactcgctt ccttctgccc gcccaggctt gcactccccg 240

gggatctgcc tctgcatctc ttgccttcgc tgttgtttcc ctctctgtcc agctcccctc 300

ccgctctcgc cctggagaat ggctcagaag gagaacgcct acccgtggcc ctacggctca 360

aagacgtctc agtctggcct gaacacgttg tcccagagag tcctacggaa ggagcccgcc 420

acgacatctg cgcttgctct cgtgaaccgg ttcaacagcc agtccacagc tgcccctggc 480

cagaagttgg ctgagaacaa gagtcagggc tccactgcct cgcaaggatc ccagaacaag 540

cagcctttca ctattgacaa ctttgagatt gggcgtcctt tgggcaaagg caaatttgga 600

aacgtgtact tggctcggga gaagaagagc cgtttcatcg tggcactcaa gatcctcttc 660

aagtctcaga ttgagaagga gggggtagag caccagcttc gccgagagat cgaaatccag 720

gcgcacctga aacatcccaa catccttcaa ctctacaact acttctacga ccagcagagg 780

atctacttaa tcctggaata cgcccctcgc ggggaactct acaaggaact gcagaagagt 840

cggaccttcg atgagcagcg gactgccacg atcatggagg aactgtcaga tgccctgacc 900

tactgccaca agaagaaggt aattcacaga gacataaagc cggagaacct gctgttaggt 960

ctgcagggag aactgaagat tgcagacttt ggctggtcgg tgcatgcccc atccctgagg 1020

aggaagacca tgtgcggcac gctggactat ctgcccccag agatgattga ggggcgcatg 1080

cataatgaaa tggtagatct atggtgcatc ggggtgctct gctatgaact gatggtgggg 1140

aacccaccct tcgagagccc tagccacagt gagacgtatc gtcggattgt caaggtggac 1200

ctgaagttcc cctcttctgt gccttcgggc gcccaggacc tcatctccaa gctgctcaaa 1260

cataacccct ggcaacggct gcccctggcg gaggttgcag ctcacccttg ggtccgggcc 1320

aactcaagga gggttctgcc tccctctgcc ctttagcctg ctccttggtt ttttgtccct 1380

gtcatttttc agtgttcttt gtatgtctgt gtatgtgttc tgagaagggg tgggaactgg 1440

aaactattcc tagctccagt tctaggggat ctgatctctc ttctgacctc tacaggcaaa 1500

attaggcacc cctgtggtgc acatatatgc acaccaaaca catgaagtta caaacaaaca 1560

acaaacacac agatagtgct ggagagatgg ctcggtagtt aaaagcactg gctgctcttc 1620

ccaggaacct agaactcaat tctagcacta catggtgctc acgaccactg tctgtaacac 1680

ccagtcctgg ggaatctggg gccttcgagc ctctgcagac actaggcatg gatgtggtat 1740

acatgtatgc aggcaaaaca cccatgcact gacttttaag aaaccctcta gtctgattcc 1800

tttcaatttg tcaaatgttg aatgttattt ttaaaatatt ataagccatt taatacaatt 1860

tttctttgaa acatggtata gcctagtctg tcttaaattc agaaaaatta tgaagaacaa 1920

cattttataa taaagtctta aatgtttcat gtttttg 1957

<210> 12

<211> 345

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 12

Met Ala Gln Lys Glu Asn Ala Tyr Pro Trp Pro Tyr Gly Ser Lys Thr

1 5 10 15

Ser Gln Ser Gly Leu Asn Thr Leu Ser Gln Arg Val Leu Arg Lys Glu

20 25 30

Pro Ala Thr Thr Ser Ala Leu Ala Leu Val Asn Arg Phe Asn Ser Gln

35 40 45

Ser Thr Ala Ala Pro Gly Gln Lys Leu Ala Glu Asn Lys Ser Gln Gly

50 55 60

Ser Thr Ala Ser Gln Gly Ser Gln Asn Lys Gln Pro Phe Thr Ile Asp

65 70 75 80

Asn Phe Glu Ile Gly Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe Gly Asn Val

85 90 95

Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Lys Ser Arg Phe Ile Val Ala Leu Lys Ile

100 105 110

Leu Phe Lys Ser Gln Ile Glu Lys Glu Gly Val Glu His Gln Leu Arg

115 120 125

Arg Glu Ile Glu Ile Gln Ala His Leu Lys His Pro Asn Ile Leu Gln

130 135 140

Leu Tyr Asn Tyr Phe Tyr Asp Gln Gln Arg Ile Tyr Leu Ile Leu Glu

145 150 155 160

Tyr Ala Pro Arg Gly Glu Leu Tyr Lys Glu Leu Gln Lys Ser Arg Thr

165 170 175

Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Ile Met Glu Glu Leu Ser Asp Ala

180 185 190

Leu Thr Tyr Cys His Lys Lys Lys Val Ile His Arg Asp Ile Lys Pro

195 200 205

Glu Asn Leu Leu Leu Gly Leu Gln Gly Glu Leu Lys Ile Ala Asp Phe

210 215 220

Gly Trp Ser Val His Ala Pro Ser Leu Arg Arg Lys Thr Met Cys Gly

225 230 235 240

Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met Ile Glu Gly Arg Met His Asn

245 250 255

Glu Met Val Asp Leu Trp Cys Ile Gly Val Leu Cys Tyr Glu Leu Met

260 265 270

Val Gly Asn Pro Pro Phe Glu Ser Pro Ser His Ser Glu Thr Tyr Arg

275 280 285

Arg Ile Val Lys Val Asp Leu Lys Phe Pro Ser Ser Val Pro Ser Gly

290 295 300

Ala Gln Asp Leu Ile Ser Lys Leu Leu Lys His Asn Pro Trp Gln Arg

305 310 315 320

Leu Pro Leu Ala Glu Val Ala Ala His Pro Trp Val Arg Ala Asn Ser

325 330 335

Arg Arg Val Leu Pro Pro Ser Ala Leu

340 345

<210> 13

<211> 1041

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag 60

ttggcatggc tacctctcga tatgagccag tggctgaaat tggtgtcggt gcctatggga 120

cagtgtacaa ggcctgtgat ccccacagtg gccactttgt ggccctcaag agtgtgagag 180

tccccaatgg aggaggaggt ggaggaggcc ttcccatcag cacagttcgt gaggtggctt 240

tactgaggcg actggaggct tttgagcatc ccaatgttgt ccggctgatg gacgtctgtg 300

ccacatcccg aactgaccgg gagatcaagg taaccctggt gtttgagcat gtagaccagg 360

acctaaggac atatctggac aaggcacccc caccaggctt gccagccgaa acgatcaagg 420

atctgatgcg ccagtttcta agaggcctag atttccttca tgccaattgc atcgttcacc 480

gagatctgaa gccagagaac attctggtga caagtggtgg aacagtcaag ctggctgact 540

ttggcctggc cagaatctac agctaccaga tggcacttac acccgtggtt gttacactct 600

ggtaccgagc tcccgaagtt cttctgcagt ccacatatgc aacacctgtg gacatgtgga 660

gtgttggctg tatctttgca gagatgtttc gtcgaaagcc tctcttctgt ggaaactctg 720

aagccgacca gttgggcaaa atctttgacc tgattgggct gcctccagag gatgactggc 780

ctcgagatgt atccctgccc cgtggagcct ttccccccag agggccccgc ccagtgcagt 840

cggtggtacc tgagatggag gagtcgggag cacagctgct gctggaaatg ctgactttta 900

acccacacaa gcgaatctct gcctttcgag ctctgcagca ctcttatcta cataaggatg 960

aaggtaatcc ggagtgccca actttcttgt acaaagttgg cattataaga aagcattgct 1020

tatcaatttg ttgcaacgaa c 1041

<210> 14

<211> 303

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Met Ala Thr Ser Arg Tyr Glu Pro Val Ala Glu Ile Gly Val Gly Ala

1 5 10 15

Tyr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Arg Asp Pro His Ser Gly His Phe Val

20 25 30

Ala Leu Lys Ser Val Arg Val Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Leu Pro Ile Ser Thr Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Arg Arg Leu Glu

50 55 60

Ala Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Met Asp Val Cys Ala Thr

65 70 75 80

Ser Arg Thr Asp Arg Glu Ile Lys Val Thr Leu Val Phe Glu His Val

85 90 95

Asp Gln Asp Leu Arg Thr Tyr Leu Asp Lys Ala Pro Pro Pro Gly Leu

100 105 110

Pro Ala Glu Thr Ile Lys Asp Leu Met Arg Gln Phe Leu Arg Gly Leu

115 120 125

Asp Phe Leu His Ala Asn Cys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu

130 135 140

Asn Ile Leu Val Thr Ser Gly Gly Thr Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly

145 150 155 160

Leu Ala Arg Ile Tyr Ser Tyr Gln Met Ala Leu Thr Pro Val Val Val

165 170 175

Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu Gln Ser Thr Tyr Ala

180 185 190

Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Met Phe

195 200 205

Arg Arg Lys Pro Leu Phe Cys Gly Asn Ser Glu Ala Asp Gln Leu Gly

210 215 220

Lys Ile Phe Asp Leu Ile Gly Leu Pro Pro Glu Asp Asp Trp Pro Arg

225 230 235 240

Asp Val Ser Leu Pro Arg Gly Ala Phe Pro Pro Arg Gly Pro Arg Pro

245 250 255

Val Gln Ser Val Val Pro Glu Met Glu Glu Ser Gly Ala Gln Leu Leu

260 265 270

Leu Glu Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Ser Ala Phe Arg

275 280 285

Ala Leu Gln His Ser Tyr Leu His Lys Asp Glu Gly Asn Pro Glu

290 295 300

<210> 15

<211> 4304

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

cacacggact acaggggagt tttgttgaag ttgcaaagtc ctggagcctc cagagggctg 60

tcggcgcagt agcagcgagc agcagagtcc gcacgctccg gcgaggggca gaagagcgcg 120

agggagcgcg gggcagcaga agcgagagcc gagcgcggac ccagccagga cccacagccc 180

tccccagctg cccaggaaga gccccagcca tggaacacca gctcctgtgc tgcgaagtgg 240

aaaccatccg ccgcgcgtac cccgatgcca acctcctcaa cgaccgggtg ctgcgggcca 300

tgctgaaggc ggaggagacc tgcgcgccct cggtgtccta cttcaaatgt gtgcagaagg 360

aggtcctgcc gtccatgcgg aagatcgtcg ccacctggat gctggaggtc tgcgaggaac 420

agaagtgcga ggaggaggtc ttcccgctgg ccatgaacta cctggaccgc ttcctgtcgc 480

tggagcccgt gaaaaagagc cgcctgcagc tgctgggggc cacttgcatg ttcgtggcct 540

ctaagatgaa ggagaccatc cccctgacgg ccgagaagct gtgcatctac accgacaact 600

ccatccggcc cgaggagctg ctgcaaatgg agctgctcct ggtgaacaag ctcaagtgga 660

acctggccgc aatgaccccg cacgatttca ttgaacactt cctctccaaa atgccagagg 720

cggaggagaa caaacagatc atccgcaaac acgcgcagac cttcgttgcc ctctgtgcca 780

cagatgtgaa gttcatttcc aatccgccct ccatggtggc agcggggagc gtggtggccg 840

cagtgcaagg cctgaacctg aggagcccca acaacttcct gtcctactac cgcctcacac 900

gcttcctctc cagagtgatc aagtgtgacc cggactgcct ccgggcctgc caggagcaga 960

tcgaagccct gctggagtca agcctgcgcc aggcccagca gaacatggac cccaaggccg 1020

ccgaggagga ggaagaggag gaggaggagg tggacctggc ttgcacaccc accgacgtgc 1080

gggacgtgga catctgaggg cgccaggcag gcgggcgcca ccgccacccg cagcgagggc 1140

ggagccggcc ccaggtgctc ccctgacagt ccctcctctc cggagcattt tgataccaga 1200

agggaaagct tcattctcct tgttgttggt tgttttttcc tttgctcttt cccccttcca 1260

tctctgactt aagcaaaaga aaaagattac ccaaaaactg tctttaaaag agagagagag 1320

aaaaaaaaaa tagtatttgc ataaccctga gcggtggggg aggagggttg tgctacagat 1380

gatagaggat tttatacccc aataatcaac tcgtttttat attaatgtac ttgtttctct 1440

gttgtaagaa taggcattaa cacaaaggag gcgtctcggg agaggattag gttccatcct 1500

ttacgtgttt aaaaaaaagc ataaaaacat tttaaaaaca tagaaaaatt cagcaaacca 1560

tttttaaagt agaagagggt tttaggtaga aaaacatatt cttgtgcttt tcctgataaa 1620

gcacagctgt agtggggttc taggcatctc tgtactttgc ttgctcatat gcatgtagtc 1680

actttataag tcattgtatg ttattatatt ccgtaggtag atgtgtaacc tcttcacctt 1740

attcatggct gaagtcacct cttggttaca gtagcgtagc gtgcccgtgt gcatgtcctt 1800

tgcgcctgtg accaccaccc caacaaacca tccagtgaca aaccatccag tggaggtttg 1860

tcgggcacca gccagcgtag cagggtcggg aaaggccacc tgtcccactc ctacgatacg 1920

ctactataaa gagaagacga aatagtgaca taatatattc tatttttata ctcttcctat 1980

ttttgtagtg acctgtttat gagatgctgg ttttctaccc aacggccctg cagccagctc 2040

acgtccaggt tcaacccaca gctacttggt ttgtgttctt cttcatattc taaaaccatt 2100

ccatttccaa gcactttcag tccaataggt gtaggaaata gcgctgtttt tgttgtgtgt 2160

gcagggaggg cagttttcta atggaatggt ttgggaatat ccatgtactt gtttgcaagc 2220

aggactttga ggcaagtgtg ggccactgtg gtggcagtgg aggtggggtg tttgggaggc 2280

tgcgtgccag tcaagaagaa aaaggtttgc attctcacat tgccaggatg ataagttcct 2340

ttccttttct ttaaagaagt tgaagtttag gaatcctttg gtgccaactg gtgtttgaaa 2400

gtagggacct cagaggttta cctagagaac aggtggtttt taagggttat cttagatgtt 2460

tcacaccgga aggtttttaa acactaaaat atataattta tagttaaggc taaaaagtat 2520

atttattgca gaggatgttc ataaggccag tatgatttat aaatgcaatc tccccttgat 2580

ttaaacacac agatacacac acacacacac acacacacaa accttctgcc tttgatgtta 2640

cagatttaat acagtttatt tttaaagata gatcctttta taggtgagaa aaaaacaatc 2700

tggaagaaaa aaaccacaca aagacattga ttcagcctgt ttggcgtttc ccagagtcat 2760

ctgattggac aggcatgggt gcaaggaaaa ttagggtact caacctaagt tcggttccga 2820

tgaattctta tcccctgccc cttcctttaa aaaacttagt gacaaaatag acaatttgca 2880

catcttggct atgtaattct tgtaattttt atttaggaag tgttgaaggg aggtggcaag 2940

agtgtggagg ctgacgtgtg agggaggaca ggcgggagga ggtgtgagga ggaggctccc 3000

gaggggaagg ggcggtgccc acaccgggga caggccgcag ctccattttc ttattgcgct 3060

gctaccgttg acttccaggc acggtttgga aatattcaca tcgcttctgt gtatctcttt 3120

cacattgttt gctgctattg gaggatcagt tttttgtttt acaatgtcat atactgccat 3180

gtactagttt tagttttctc ttagaacatt gtattacaga tgcctttttt gtagtttttt 3240

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tgtttcacaa tacctcatgc ttcacttagc catggtggac ccagcgggca ggttctgcct 3360

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tacagctgtg ttattctttg cgtgtagcta tggaagttgc ataattatta ttattattat 3600

tataacaagt gtgtcttacg tgccaccacg gcgttgtacc tgtaggactc tcattcggga 3660

tgattggaat agcttctgga atttgttcaa gttttgggta tgtttaatct gttatgtact 3720

agtgttctgt ttgttattgt tttgttaatt acaccataat gctaatttaa agagactcca 3780

aatctcaatg aagccagctc acagtgctgt gtgccccggt cacctagcaa gctgccgaac 3840

caaaagaatt tgcaccccgc tgcgggccca cgtggttggg gccctgccct ggcagggtca 3900

tcctgtgctc ggaggccatc tcgggcacag gcccaccccg ccccacccct ccagaacacg 3960

gctcacgctt acctcaacca tcctggctgc ggcgtctgtc tgaaccacgc gggggccttg 4020

agggacgctt tgtctgtcgt gatggggcaa gggcacaagt cctggatgtt gtgtgtatcg 4080

agaggccaaa ggctggtggc aagtgcacgg ggcacagcgg agtctgtcct gtgacgcgca 4140

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ttcccagcac caacatgtaa ccggcatgtt tccagcagaa gacaaaaaga caaacatgaa 4260

agtctagaaa taaaactggt aaaaccccaa aaaaaaaaaa aaaa 4304

<210> 16

<211> 295

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

Met Glu His Gln Leu Leu Cys Cys Glu Val Glu Thr Ile Arg Arg Ala

1 5 10 15

Tyr Pro Asp Ala Asn Leu Leu Asn Asp Arg Val Leu Arg Ala Met Leu

20 25 30

Lys Ala Glu Glu Thr Cys Ala Pro Ser Val Ser Tyr Phe Lys Cys Val

35 40 45

Gln Lys Glu Val Leu Pro Ser Met Arg Lys Ile Val Ala Thr Trp Met

50 55 60

Leu Glu Val Cys Glu Glu Gln Lys Cys Glu Glu Glu Val Phe Pro Leu

65 70 75 80

Ala Met Asn Tyr Leu Asp Arg Phe Leu Ser Leu Glu Pro Val Lys Lys

85 90 95

Ser Arg Leu Gln Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val Ala Ser Lys

100 105 110

Met Lys Glu Thr Ile Pro Leu Thr Ala Glu Lys Leu Cys Ile Tyr Thr

115 120 125

Asp Asn Ser Ile Arg Pro Glu Glu Leu Leu Gln Met Glu Leu Leu Leu

130 135 140

Val Asn Lys Leu Lys Trp Asn Leu Ala Ala Met Thr Pro His Asp Phe

145 150 155 160

Ile Glu His Phe Leu Ser Lys Met Pro Glu Ala Glu Glu Asn Lys Gln

165 170 175

Ile Ile Arg Lys His Ala Gln Thr Phe Val Ala Leu Cys Ala Thr Asp

180 185 190

Val Lys Phe Ile Ser Asn Pro Pro Ser Met Val Ala Ala Gly Ser Val

195 200 205

Val Ala Ala Val Gln Gly Leu Asn Leu Arg Ser Pro Asn Asn Phe Leu

210 215 220

Ser Tyr Tyr Arg Leu Thr Arg Phe Leu Ser Arg Val Ile Lys Cys Asp

225 230 235 240

Pro Asp Cys Leu Arg Ala Cys Gln Glu Gln Ile Glu Ala Leu Leu Glu

245 250 255

Ser Ser Leu Arg Gln Ala Gln Gln Asn Met Asp Pro Lys Ala Ala Glu

260 265 270

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Asp Leu Ala Cys Thr Pro Thr

275 280 285

Asp Val Arg Asp Val Asp Ile

290 295

<210> 17

<211> 1365

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 17

gtgggggtga gggggcctct ctagctcgcg gcctgtgtct atggtctggc ccgaagcgtc 60

cagctgcccg ggaccgatcc ccggtgtatg gcgccgcagg aaccggctcc cgggcccaga 120

taaagggcca cctccagagc tcttagccga gcgtaagatc ccctgcttcg agaatggctg 180

ccactcgata tgaacccgtg gctgaaattg gtgtcggtgc ctatgggacg gtgtacaaag 240

cccgagatcc ccacagtggc cactttgtgg ccctcaagag tgtgagagtt cctaatggag 300

gagcagctgg agggggcctt cccgtcagca cagttcgtga ggtggccttg ttaaggaggc 360

tggaggcctt tgaacatccc aatgttgtac ggctgatgga tgtctgtgct acttcccgaa 420

ctgatcggga catcaaggtc accctagtgt ttgagcatat agaccaggac ctgaggacat 480

acctggacaa agcacctcca ccgggcctgc cggttgagac cattaaggat ctaatgcgtc 540

agtttctaag cggcctggat tttcttcatg caaactgcat tgttcaccgg gacctgaagc 600

cagagaacat tctagtgaca agtaatggga ccgtcaagct ggctgacttt ggcctagcta 660

gaatctacag ctaccagatg gccctcacgc ctgtggtggt tacgctctgg taccgagctc 720

ctgaagttct tctgcagtct acatacgcaa cacccgtgga catgtggagc gttggctgta 780

tctttgcaga gatgttccgt cggaagcctc tcttctgtgg aaactctgaa gccgaccagt 840

tggggaaaat ctttgatctc attggattgc ctccagaaga cgactggcct cgagaggtat 900

ctctacctcg aggagccttt gcccccagag ggcctcggcc agtgcagtca gtggtgccag 960

agatggagga gtctggagcg cagctgctac tggaaatgct gacctttaac ccacataagc 1020

gaatctctgc cttccgagcc ctgcagcact cctacctgca caaggaggaa agcgacgcag 1080

agtgagaaga ggggctgcct ttcccagtct tggtggagaa accctcgctg aagcggcagc 1140

ctctgtttcc ccccaaggct gtggagaatc ctccagtttt ttacagagaa tattttaagc 1200

cttaaataac aagtccccac ctctccttac gaggttcacc cccattaccc tcccctagct 1260

ctacactaaa gggcaggtgt atctgtcttc ttccctccct gatttatact gggatctttt 1320

ttatacagga aaacaagaca agacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1365

<210> 18

<211> 303

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 18

Met Ala Ala Thr Arg Tyr Glu Pro Val Ala Glu Ile Gly Val Gly Ala

1 5 10 15

Tyr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Arg Asp Pro His Ser Gly His Phe Val

20 25 30

Ala Leu Lys Ser Val Arg Val Pro Asn Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly

35 40 45

Leu Pro Val Ser Thr Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Arg Arg Leu Glu

50 55 60

Ala Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Met Asp Val Cys Ala Thr

65 70 75 80

Ser Arg Thr Asp Arg Asp Ile Lys Val Thr Leu Val Phe Glu His Ile

85 90 95

Asp Gln Asp Leu Arg Thr Tyr Leu Asp Lys Ala Pro Pro Pro Gly Leu

100 105 110

Pro Val Glu Thr Ile Lys Asp Leu Met Arg Gln Phe Leu Ser Gly Leu

115 120 125

Asp Phe Leu His Ala Asn Cys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu

130 135 140

Asn Ile Leu Val Thr Ser Asn Gly Thr Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly

145 150 155 160

Leu Ala Arg Ile Tyr Ser Tyr Gln Met Ala Leu Thr Pro Val Val Val

165 170 175

Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu Gln Ser Thr Tyr Ala

180 185 190

Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Met Phe

195 200 205

Arg Arg Lys Pro Leu Phe Cys Gly Asn Ser Glu Ala Asp Gln Leu Gly

210 215 220

Lys Ile Phe Asp Leu Ile Gly Leu Pro Pro Glu Asp Asp Trp Pro Arg

225 230 235 240

Glu Val Ser Leu Pro Arg Gly Ala Phe Ala Pro Arg Gly Pro Arg Pro

245 250 255

Val Gln Ser Val Val Pro Glu Met Glu Glu Ser Gly Ala Gln Leu Leu

260 265 270

Leu Glu Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Ser Ala Phe Arg

275 280 285

Ala Leu Gln His Ser Tyr Leu His Lys Glu Glu Ser Asp Ala Glu

290 295 300

<210> 19

<211> 3796

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 19

ttttctctgc ccggctttga tctctgctta acaacagtaa cgtcacacgg actacagggg 60

agttttgttg aagttgcaaa gtcctgcagc ctccagaggg ctgtcggcgc agtagcagag 120

agctacagac tccgcgcgct ccggagaccg gcagtacagc gcgaggcagc gcgcgtcagc 180

agccgccacc ggagcccaac cgagaccaca gccctcccca gacggccgcg ccatggaaca 240

ccagctcctg tgctgcgaag tggagaccat ccgccgcgcg taccctgaca ccaatctcct 300

caacgaccgg gtgctgcgag ccatgctcaa gacggaggag acctgtgcgc cctccgtatc 360

ttacttcaag tgcgtgcaga aggagattgt gccatccatg cggaaaatcg tggccacctg 420

gatgctggag gtctgtgagg agcagaagtg cgaagaggag gtcttcccgc tggccatgaa 480

ctacctggac cgcttcctgt ccctggagcc cttgaagaag agccgcctgc agctgctggg 540

ggccacctgc atgttcgtgg cctctaagat gaaggagacc attcccttga ctgccgagaa 600

gttgtgcatc tacactgaca actctatccg gcccgaggag ctgctgcaaa tggaactgct 660

tctggtgaac aagctcaagt ggaacctggc cgccatgact ccccacgatt tcatcgaaca 720

cttcctctcc aaaatgccag aggcggatga gaacaagcag accatccgca agcatgcaca 780

gacctttgtg gccctctgtg ccacagatgt gaagttcatt tccaacccac cctccatggt 840

agctgctggg agcgtggtgg ctgcgatgca aggcctgaac ctgggcagcc ccaacaactt 900

cctctcctgc taccgcacaa cgcactttct ttccagagtc atcaagtgtg acccggactg 960

cctccgtgcc tgccaggaac agattgaagc ccttctggag tcaagcctgc gccaggccca 1020

gcagaacgtc gaccccaagg ccactgagga ggagggggaa gtggaggaag aggctggtct 1080

ggcctgcacg cccaccgacg tgcgagatgt ggacatctga gggccaccgg gcaggcggga 1140

gccaccaagt agtggcaccc gcaaagagga aggagccagc ccgggtgctc ctgacgacgt 1200

cccccttggg gacatgttgt taccagaaga ggaagttttg ttctctttgt tggttgtttt 1260

tccttaatct ttctcctttc tatctgattt aagcaaaaga gaaaaaaata tctgaaagct 1320

gtcttaaaga gagagagaga gagatagaat ctgcatcacc ctgagagtag ggagccaggg 1380

ggtgctacaa aaatagaatt ctgtacccca gtaatcaact agttttctat taatgtgctt 1440

gtctgttcta agagtaggat taacacaggg gaagtcttga gaaggagttt tgattctttt 1500

atatgttttt aaaaaaaagc ttaagaaaca ttgctttaaa aaggaaggaa aaaaaataca 1560

gcaaaccatt gttaaagtag aagagttttt aggttgagaa atgtactctg ctttgctgaa 1620

aagccacagc ttaggccctc agcctcactc cctggcttgc tcagtgccta cagccctgtt 1680

acctgatacc tgtgctttat cccaggggtg ggcagacctc ttaaccttat agatggtcag 1740

tgcgacctct agtggtctca tggcgtgtgg cacaaccccc ctccccaggg ctcagcttaa 1800

tgtgccctct ccccccaaca acctgcaggt tcacagcacc agccacacag cggtagggat 1860

gaaatagtga cataatatat tctatttttg taaccttcct attttgtagc tctgtttaga 1920

gagatgctgg tttttgcctg aaggccctgc agcctgccca catcaggtta aacccacagc 1980

ttttgtgtgt ggtttgtttt gttgtgtttt ctttctctat gttccaaaac cattccattt 2040

caaagcactt ttggtcagct agctggaggc agtgttgctg gtgtgtgttg gggggagggg 2100

ttctaatgga atggatgggg atgtccacac acgcattcag atggctgtac aacaggttgt 2160

agggctggta gtatgaggtg cttgggaagt tttgttgggt caagaagaga gaactctgtt 2220

ctcgcaccac cgggatctgt cctgcaaagt tgaagggatc ctttggtgcc agctggtgtt 2280

tggaagtagg aaccatgatg gcattacctg gacaaggaga ttggggacaa ctcttaagtc 2340

tcacacagga ggcttttaaa cactaaaatg tctaatttat acttaaggct acagaagagt 2400

atttatggga aaggctgccc atgaccagtg tgactcaaag caatgtgatc tcccttgatt 2460

caaacgcaca cctctgccct gctggagaag gtttagggcc atgtctgaga gattggtctt 2520

tcattgggca acgggggggg ggggggggtc cttaaaaaaa aaaaaccaca aagacagaga 2580

tttggtctgc ttgactttcc caacccaatt ggccccattg gagagccatc caaactgagg 2640

aaaattaggg gactccaaaa gagtttgatt ctggcacatt cttgccgctg cccccaagtt 2700

aacaacagta ggtaatttgc acacctctgg ctctgtgcct ttctattagg actttttggc 2760

agaaggtgga gagcgggagg cttaagaggg gatgtgaggg aagaggtgaa ggtgggacca 2820

catgggacag gccacggctc ctctcatggc gctgctaccg atgactccca ggatcccaga 2880

cgttcagaac cagattctca ttgctttgta tctttcacgt tgttttcgct gctattggag 2940

ggtcagtttt gttttgtttt gttttacaat gtcagactgc catgttcaag ttttaatttc 3000

ctcatagagt gtatttacag atgccctttt ttgtactttt ttttttaatt gtgatctatt 3060

ttggcttaat gtgattaccg ctgtattcca aaaaaaaaaa aaaaacaggt tcctgttcac 3120

aatacctcat gtatcatcta gccatgcacg agcctggcag gcaggtgggc ggtctgcctc 3180

cagggatcct gggaccctga tggcgatcgt cctgtcatgc tgggcccttc atttgatctg 3240

ggacatagca tcacagcagt cagggcacct ggattgttct gttatcgata ttgtttcttg 3300

tagcggcctg ttgtgcatgc caccatgctg ctggcccggg gggatttgct ctgagtctcc 3360

ggtgcatcat ttaatctgtt aggttctagt gttccgtctt gttttgtgtt aattacagca 3420

ttgtgctaat gtaaagactc tgcctttgcg aagccagctg cagtgctgta ggcccccaag 3480

ttccctagca agctgccaaa ccaaaacggg caccaccagc tcagctgagg catcccagcc 3540

aggcaggacc cttgagggcc gctgtatcca tggtgatggg gtgaggtttt ggccaaaagg 3600

ccaaagactg gtggtgggtc cacggaatct gccctgtgac atgaaaggct ttgaggggct 3660

ctggctggtg gccaggttgg ctttttgtat ttctggttga cacaccatgg cgcttcccag 3720

cacagacatg tgaccagcat ggtccaggaa aaaaaaaaag acaaaaaatc tagaaaataa 3780

aattggtaaa atctca 3796

<210> 20

<211> 295

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 20

Met Glu His Gln Leu Leu Cys Cys Glu Val Glu Thr Ile Arg Arg Ala

1 5 10 15

Tyr Pro Asp Thr Asn Leu Leu Asn Asp Arg Val Leu Arg Ala Met Leu

20 25 30

Lys Thr Glu Glu Thr Cys Ala Pro Ser Val Ser Tyr Phe Lys Cys Val

35 40 45

Gln Lys Glu Ile Val Pro Ser Met Arg Lys Ile Val Ala Thr Trp Met

50 55 60

Leu Glu Val Cys Glu Glu Gln Lys Cys Glu Glu Glu Val Phe Pro Leu

65 70 75 80

Ala Met Asn Tyr Leu Asp Arg Phe Leu Ser Leu Glu Pro Leu Lys Lys

85 90 95

Ser Arg Leu Gln Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val Ala Ser Lys

100 105 110

Met Lys Glu Thr Ile Pro Leu Thr Ala Glu Lys Leu Cys Ile Tyr Thr

115 120 125

Asp Asn Ser Ile Arg Pro Glu Glu Leu Leu Gln Met Glu Leu Leu Leu

130 135 140

Val Asn Lys Leu Lys Trp Asn Leu Ala Ala Met Thr Pro His Asp Phe

145 150 155 160

Ile Glu His Phe Leu Ser Lys Met Pro Glu Ala Asp Glu Asn Lys Gln

165 170 175

Thr Ile Arg Lys His Ala Gln Thr Phe Val Ala Leu Cys Ala Thr Asp

180 185 190

Val Lys Phe Ile Ser Asn Pro Pro Ser Met Val Ala Ala Gly Ser Val

195 200 205

Val Ala Ala Met Gln Gly Leu Asn Leu Gly Ser Pro Asn Asn Phe Leu

210 215 220

Ser Cys Tyr Arg Thr Thr His Phe Leu Ser Arg Val Ile Lys Cys Asp

225 230 235 240

Pro Asp Cys Leu Arg Ala Cys Gln Glu Gln Ile Glu Ala Leu Leu Glu

245 250 255

Ser Ser Leu Arg Gln Ala Gln Gln Asn Val Asp Pro Lys Ala Thr Glu

260 265 270

Glu Glu Gly Glu Val Glu Glu Glu Ala Gly Leu Ala Cys Thr Pro Thr

275 280 285

Asp Val Arg Asp Val Asp Ile

290 295

Claims (20)

1.一种组合物在制备治疗心血管疾病或神经疾病的药物中的用途，所述组合物包含：

a)一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)、周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)和周期蛋白B1(CCNB1)的核酸；或

b)一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)和G2混合物的核酸，其中G2混合物包含MK1775和TGF-β抑制剂，所述TGF-β抑制剂选自SB431542或地塞米松。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述用途诱导有丝分裂后细胞的增殖，所述有丝分裂后细胞选自心肌细胞和神经细胞。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述周期蛋白依赖性激酶(CDK)和/或所述周期蛋白由DNA编码。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述核酸是被修饰的mRNA。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述核酸被组成型表达。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述心血管疾病是心肌梗塞(MI)。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述一种或多种核酸施用至有丝分裂后细胞。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述施用通过病毒构建体的方式施用。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述一种或多种核酸施用至有丝分裂后细胞，所述施用通过腺病毒构建体的方式施用。

10.一种分离的增殖性有丝分裂后细胞，其被修饰以过度表达一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)和周期蛋白B1(CCNB1)的核酸。

11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述有丝分裂后细胞选自心肌细胞、神经细胞、胰腺细胞、毛细胞和骨骼肌细胞。

12.增殖性有丝分裂后心肌细胞在制造治疗心血管疾病的药物中的用途，所述增殖性有丝分裂后心肌细胞被修饰以过度表达：一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)和周期蛋白B1(CCNB1)的核酸。

13.增殖性有丝分裂后神经细胞在制造治疗神经疾病的药物中的用途，所述增殖性有丝分裂后神经细胞被修饰以过度表达：一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)和周期蛋白B1(CCNB1)的核酸。

14.一种诱导有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入的体外方法，所述方法包括使所述有丝分裂后细胞与有效量的组合物接触，从而诱导所述有丝分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入，所述组合物包含：

a)一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)、周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)和周期蛋白B1(CCNB1)的核酸；或

b)一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)和G2混合物的核酸，其中G2混合物包含MK1775和TGF-β抑制剂，所述TGF-β抑制剂选自SB431542或地塞米松。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述有丝分裂后细胞选自心肌细胞、神经细胞、胰腺细胞、毛细胞和骨骼肌细胞。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述周期蛋白依赖性激酶(CDK)和/或所述周期蛋白由DNA编码。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸是被修饰的mRNA。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸被组成型表达。

19.一种组合物，其包含：

a)一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)、周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)和周期蛋白B1(CCNB1)的核酸；或

b)一种或多种编码周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白D1(CCND1)和G2混合物的核酸，其中G2混合物包含MK1775和TGF-β抑制剂，所述TGF-β抑制剂选自SB431542或地塞米松。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述组合物：

a)诱导分裂后细胞的增殖和/或细胞周期重新进入；和/或

b)增加CDK4、CCND1、CDK1和CCNB1的表达。

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