MX2012012743A - Composiciones y metodos utiles para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteina. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de ciertos compuestos incluyendo, por ejemplo, ciertos aminoácidos cargados y sus análogos estructurales, para reducir la viscosidad de formulaciones que contiene proteína acuosa. Composiciones de materia asociadas y métodos de uso también se contemplan en la presente invención.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS ÚTILES PARA REDUCIR LA VISCOSIDAD DE FORMULACIONES QUE CONTIENEN PROTEÍNA SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. Número de Serie 61/330,689, presentada en mayo 3, 2010, esta solicitud se incorpora completamente aquí referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al uso de ciertos compuestos, incluyendo por ejemplo, ciertos aminoácidos cargados y sus análogos estructurales, para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteínas acuosas. Composiciones de materia asociadas y métodos de usos también se contemplan dentro de la presente invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia basada en proteínas (incluyendo terapia basada en anticuerpos) usualmente se administra en una base regular y requiere varias dosis de mg/kg por inyección. La inyección subcutánea es una ruta de administración típica de estas terapias. Debido de los pequeños volúmenes empleados para inyección subcutánea (usualmente 1.0 mi-1.2 mi), para terapias de anticuerpo en altas dosis, esta ruta de administración requiere la creación de formulaciones de alta concentración de proteínas (por ejemplo, 50 mg/ml - 300 mg/ml) .

La creación de formulaciones de proteinas altamente concentradas, sin embargo presenta retos referentes a la estabilidad física y química de la proteína, y dificultad con la fabricación, almacenamiento y suministro de la formulación de proteína. Un problema es la tendencia de proteínas para formar partículas durante procesamiento y/o almacenamiento, que hace difícil la manipulación durante adicional procesamiento. Para intentar obviar este problema, se han agregado a las formulaciones de proteínas surfactantes y/o azúcares. Aunque los surfactantes y azúcares pueden reducir el grado de formación de partículas de proteína, no atienden otro problema asociado con manipular y administrar las formulaciones de proteína concentradas, es decir, incrementada viscosidad. De hecho, los azúcares pueden mejorar las interacciones intermoleculares dentro de una proteína o entre proteínas, o pueden crear interacciones entre moléculas de azúcar, e incrementar la viscosidad de la formulación de proteína.

Una incrementada viscosidad de formulaciones de proteínas tiene ramificaciones negativas de procesamiento a través de suministro de fármaco al paciente. Se han realizado diversos intentos para estudiar el efecto de agentes que reducen la viscosidad en formulaciones que contienen proteínas acuosas altamente concentradas (por ejemplo, ver Patente de los E.U.A. Número 6,875,432). No obstante estos intentos, hay necesidad continua en la técnica por identificar agentes que reducen la viscosidad de proteina novedosos y emplear esos agentes para la generación de formulaciones de proteínas de alta concentración con viscosidades convenientemente bajas que son adecuadas para fabricación, de almacenamiento y administración terapéutica, particularmente subcutánea.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el hallazgo novedoso ' de que ciertas moléculas, incluyendo ciertos aminoácidos cargados y derivados, precursores o análogos estructurales de las mismas, son útiles como aditivos a formulaciones que contienen proteína, para el propósito de de reducir la viscosidad de estas formulaciones en forma acuosa.

De acuerdo con esto, en un aspecto, la invención se refiere a una composición de materia que comprende una proteína y un compuesto que es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteína. En una modalidad, la proteína es un anticuerpo. En otra modalidad, el compuesto que es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa, que comprende la proteína se elige del grupo que consiste de arginina (ya sea arginina-HCl o arginina, en la presencia de un contra ión succinato, por ejemplo arginina succinato), arginina dipéptido, arginina tripéptido, poliarginina, homoarginina, ácido 2-amino-3- guanidino-propiónico, guanidina, ornitina, agmatina, ácido guanidobutirico, urea, citrulina, N-hidroxi-L-nor-arginina, nitroarginina metil éster, argininamida, arginina metil éster, arginina etil éster, lisina, lisinamida, lisina metil éster, histidina, histidina metil éster, histamina, alanina, alaninamida, alanina metil éster, putrescina, cadaverina, espermidina, espermina, y metionina. Estos compuestos pueden estar presentes en la formulación a una concentración que es al menos 10 mM, de preferencia al menos 20 mM, más preferiblemente al menos 50 mM, todavía más preferible al menos 100 mM, aún más preferible a una concentración entre aproximadamente 10 mM y 1 M. La composición puede estar ya en forma acuosa o liofilizada. En forma acuosa, la composición de materia puede tener una viscosidad no mayor a aproximadamente 150 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 120 CP, de preferencia no mayor a aproximadamente 100 CP, de preferencia no mayor a aproximadamente 90 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 80 CP, ' de preferencia no mayor a aproximadamente 70 CP, de preferencia no mayor a aproximadamente 60 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 50 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 40 cP. La concentración de proteína total presente en la composición de materia es al menos 50 mg/ml, de preferencia .al menos 75 mg/ml , más preferible al menos 100 mg/ml, más preferible al menos 150 mg/ml, más preferible al menos 200 mg/ml, más preferible al menos 250 mg/ml, más de preferible al menos 300 mg/ml.

Otro aspecto de la presente invención se dirige a un artículo de manufactura que comprende un recipiente que contiene cualquiera de las composiciones de materia aquí descritas.

En otro aspecto, se proporciona un método para reducir la viscosidad de una formulación que contiene proteína, en donde el método comprende la etapa de agregar a la formulación una cantidad reductora en viscosidad de un compuesto que es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteína. En una modalidad, la proteína es un anticuerpo. En otra modalidad, el compuesto que es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteína, se elige del grupo que consiste de arginina (ya sea arginina-HCl o arginina en la presencia de un contra ión succinato, por ejemplo arginina succinato), arginina dipéptido, arginina tripéptido, poliarginina, homoarginina, ácido 2-amino-3-guanidino-propiónico, guanidina, ornitina, agmatina, ácido guanidobutírico, urea, citrulina, N-hidroxi-L-nor-arginina, nitroarginina metil éster, argininamida, arginina metil éster, arginina etil éster, lisina, lisinamida, lisina metil éster, histidina, histidina metil éster, histamina, alanina, alaninamida, alanina metil éster, putrescina, cadaverina, espermidina, espermina y metionina. Estos compuestos pueden agregarse a la formulación para alcanzar una concentración final que es al menos 10 mM, de preferencia al menos 20 rtiM, más preferible al menos 50 mM, todavía más preferible al menos 100 mM, aún más preferible a una concentración entre aproximadamente 10 mM y 1 M. En una modalidad, el método además comprende la etapa de liofilizar la formulación después de que se agrega el compuesto que es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteína. En la forma acuosa, la formulación puede tener una viscosidad no mayor a aproximadamente 150 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 120 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 100 cP, de preferencia no mayor a aproximadaménte 90 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 80 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 70 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 60- cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 50 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 40 cP La concentración de proteína total presente en la formulación es al menos 50 mg/ml, de preferencia al menos 75 mg/ml, más preferible al menos 100 mg/ml, más de preferible al menos 150 mg/ml, más preferible al menos 200 mg/ml, más preferible al menos 250 mg/ml, más preferible al menos 300 mg/ml.

Todavía en otro aspecto, se proporciona un método para preparar una formulación que contiene proteína acuosa, en donde el método comprende la etapa de agregar a la formulación, una cantidad reductora en viscosidad de un compuesto que es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteína. En una modalidad, la proteína es un anticuerpo. En otra modalidad, el compuesto que es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteína, se elige del grupo que consiste de arginina (ya sea arginina-HCl o arginina en la presencia de un contra ión succinato, por ejemplo arginina succinato), arginina dipéptido, arginina tripéptido, poliarginina, homoarginina, ácido 2-amino-3-guanidino-propiónico, guanidina, ornitina, agmatina, ácido guanidobutírico, urea, citrulina, N-hidroxi-L-nor-arginina , nitroarginina metil éster, argininamida , arginina metil éster, arginina etil éster, lisina, lisinamida, lisina metil éster, histidina, histidina metil éster, histamina, alanina, alaninamida, alanina metil éster, putrescina, cadaverina, espermidina, espermina, y metionina. Estos compuestos pueden agregarse a la formulación para alcanzar una concentración final que es al menos 10 mM, de preferencia al menos 20 mM, más preferible al menos 50 mM, todavía más preferible al menos 100 mM, aún más preferible a una concentración entre aproximadamente 10 mM y 1 M. En forma acuosa, la formulación puede tener una viscosidad no mayor a aproximadamente 150 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 120 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 100 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 90 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 80 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 70 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 60 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 50 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 40 cP. La concentración total de proteina presente en la formulación es al menos 50 mg/ml, de preferencia al menos 75 mg/ml, más preferiblemente al menos 100 mg/ml, más preferible al menos 150 mg/ml, más preferible al menos 200 mg/ml, más preferible al menos 250 mg/ml, más preferible al menos 300 mg/ml.

Otras modalidades serán aparentes ante lectura de esta especificación de patente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA La presente invención puede comprenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de modalidades especificas y los Ejemplos aqui incluidos .

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado como se comprende comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la técnica a la cual pertenece está invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos pueden emplearse en la práctica o prueba de la invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones aquí mencionadas se incorporan por referencia en su totalidad.

La presente invención se basa en el hallazgo novedosos de que ciertos compuestos incluyendo, por ejemplo ciertos aminoácidos cargados y sus análogos estructurales, para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteina acuosa. De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente invención describe composiciones de materia que comprende una proteina y un compuesto capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteina. En ciertas modalidades, compuestos aquí identificados como capaces de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende una proteina incluyen por ej emplo : arginina dipéptido arginina tripéptido homoarginina ácido 2-amino-3-guanidino-propiónico guanidina orni aqma ácido guanidobutirico urea N-hidroxi-L-nor-arginina argininamida arginina metil éster arginina etil éster lisina ?? histamina putrescina cadaverina espermidina espermina metionina Los compuestos anteriormente descritos pueden emplearse en forma individual como un agente reductor de viscosidad, o pueden emplearse en combinación con otros agentes reductores de viscosidad. Esos compuestos pueden agregarse a la formulación que contiene proteina para alcanzar una concentración final (ya sea individual o en combinación) que es al menos 10 mM, de preferencia al menos 20 mM, más preferiblemente al menos 50 mM, todavía más preferible al menos 100 mM, aún más preferible a una concentración entre aproximadamente 10 mM y 1 M.

En general, los agentes reductores de viscosidad de la presente invención encuentran uso para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteína, en donde la concentración de proteína en la formulación es al menos aproximadamente 50 mg/ml, de preferencia al menos 75 mg/ml, más preferible al menos 100 mg/ml, más preferible al menos 150 mg/ml, más preferible al menos 200 mg/ml, más preferible al menos 250 mg/ml, más preferible al menos 300 mg/ml.

En forma acuosa, la formulación que contiene proteína (después de adición del compuesto capaz de reducir la viscosidad de una formulación que contiene proteína acuosa) puede tener una viscosidad no mayor a aproximadamente 150 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 120 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 100 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 90 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 80 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 70 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 60 CP, de preferencia no mayor a aproximadamente 50 cP, de preferencia no mayor a aproximadamente 40 cP.

Por "polipéptido" o "proteína" se entiende una secuencia de aminoácidos para los cuales es suficiente la longitud de cadena para producir los superiores niveles de estructura terciaria y/o cuaternaria. De esta manera, se distinguen proteínas de "péptidos", que también son moléculas basadas en aminoácidos que no tienen esta estructura. Típicamente, una proteína una proteína para uso aquí tendrá un peso molecular de al menos aproximadamente 5-20 kD, en forma alterna al menos aproximadamente 15-20 kD, de preferencia al menos aproximadamente 20 kD. "Péptido" se entiende una secuencia de aminoácidos que en generalmente no exhibe un nivel superior de estructura terciaria y/o cuaternaria. Péptidos en general tienen un peso molecular menor a aproximadamente 5 kD.

Ejemplos de polipéptidos abarcados dentro de la definición aquí incluyen proteínas de mamíferos, tales como, por ejemplo renina; una hormona de crecimiento, que incluye hormona de crecimiento humano y hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroides ; hormona de estímulo para tiroides; lipoproteínas; alfa-l-antitripsina; cadena insulina A; cadena insulina B; proinsulina; hormona de estimulo de folículos; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor de tejido y factor de von Willebrands; factores anti-coagulación tales como Proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como uroguinasa u orina humana o activador de plasminógeno de tipo tejido (t-PA) ; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumor-alfa y -beta; encefalinasa; citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en función de su grado de activación (RANTES = Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted) ; proteína inflamatoria macrofago humano (MIP-1-alfa) ; una albúmina de suero tales como albúmina de suero humano; sustancia de inhibición Muelleriana; cadena relaxina A; cadena relaxina B; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNase; IgE; un antígeno asociado a linfocito T citotóxico (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor) ; receptores de hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoide; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de huesos (BDNF = Bone-Derived Neurotrophic Factor) , neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6) , o un factor de crecimiento de nervios tal como NGF-ß; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF = Platelet-Derived Growth Factor) ; factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF = Epidermal Growth Factor) ; factor de crecimiento de transformación (TGF = Transforming Growth Factor) Tal Como TGF-Alfa Y TGF-Beta, Incluyendo TGF-ß?, TGF-^2, TGF-p3, TGF-ß4, o TGF~ 5; factor de crecimiento tipo insulina-I y -II (IGF-I y IGF-II); des ( 1-3 ) -IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de enlace de factor de crecimiento tipo insulina (IGFBPs); proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas ; una proteína morfogénetica de huesos (BMP = Bone Morphogenetic Protein) ; una interferona tal como interferona-alfa, -beta y -gamma; factores de estimulo de colonia (CSFs = Colony Stimulating Factors) , por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (ILs), por ejemplo, IL-1 to IL-10; superóxido dismutasa; receptores de célula T; proteínas de membrana de superficie; factores de aceleración de la degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, porciones de la envolvente de SIDA (AIDS) ; proteínas de transporte; receptores de migración; adresinas; proteínas regulatorias ; integrinas tales como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como CA125 (antígeno de cáncer de ovarios) o receptor de HER2, HER3 o HER4; inmuno adhesinas; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de las proteínas anteriormente citadas así como anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, enlazan cualquiera de las proteínas anteriormente citadas.

La proteína que se formula de preferencia es esencialmente pura y convenientemente homogénea en esencia (es decir, libres de proteínas contaminantes) . Proteína "esencialmente pura" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 90% en peso de la proteína, con base en el peso total de la composición, de preferencia al menos aproximadamente 95% en peso. Proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 99% en peso de proteína, con base en el peso total de la composición.

En ciertas modalidades, la proteína es un anticuerpo. El anticuerpo aquí se dirige contra un "antígeno" de interés. De preferencia, el antígeno es una proteína biológicamente importante y la administración del anticuerpo al mamífero que sufre de una enfermedad o desorden, puede resultar en beneficio terapéutico a ese mamífero. Sin embargo, anticuerpos dirigidos contra antígenos sin proteína (tales como antígenos glicolípidos asociados a tumor; ver Patente de los E.U.A. Número 5,091,178) también se contemplan. Cuando el antígeno es una proteína, puede ser una molécula de transmembrana (por ejemplo, receptor) o ligando tal como factor de crecimiento. Antigenos ejemplares incluyen aquellas proteínas discutidas anteriormente. Objetivos moleculares preferidos para anticuerpos abarcados por la presente invención incluyen polipéptidos CD tales como CD3, CD4, CD8 , CD19, CD20 y CD34; miembros de la familia receptor de HER tales como el receptor EGF (HERI), HER2, receptor HER3 o HER ; moléculas de adhesión celular tal como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICA -1, VCAM y av/b3 integrina incluyendo ya sea las subunidades a o b de las mismas (por ejemplo, anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb) ; factor de crecimiento tales como VEGF; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) ; receptor mpl; CTLA-4; polipéptido C, etc. Antígenos solubles o sus fragmentos opcionalmente conjugados a otras moléculas, pueden emplearse como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas de transmembrana, tales como receptores, fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) pueden emplearse como un inmunógeno. En forma alterna, células que expresan en la molécula de transmembrana pueden emplearse como un inmunógeno. Estas células pueden derivarse de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que se han transformado por técnicas recombinante para expresar la molécula de transmembrana.

Ejemplos de anticuerpos a purificarse aquí incluyen, pero no están limitados a: HER2 anticuerpos incluyendo trastuzumab (HERCEPTIN®) (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), Patente de los E.U.A. Número 5,725,856) y pertuzumab (OMNITARG™) (WO01/00245) ; CD20 anticuerpos (ver a continuación) ; IL-8 anticuerpos (St John et al., Chest, 103:932 (1993), y Publicación Internacional Número WO 95/23865) ; anticuerpos de receptor VEGF o VEGF incluyendo anticuerpos VEGF humanizados y/o madurados por afinidad tales como el anticuerpo VEGF humanizado huA4.6.1 bevacizumab (AVASTIN®) y ranibizumab (LUCENTIS®) (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), Publicación Internacional Número WO 96/30046, y WO 98/45331, publicada en octubre 15, 1998); PSCA anticuerpos (WO01/40309) ; anticuerpos CDlla incluyendo efalizumab (RAPTIVA®) (Patente de los E.U.A. Número 6,037,454, Patente de los E.U.A. Número 5,622,700, WO 98/23761, Stoppa et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), y Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); anticuerpos que ligan a IgE incluyendo omalizumab (XOLAIR®) (Presta et al., J. Immunol . 151:2623-2632 (1993), y Publicación Internacional Número WO 95/19181; Patente de los E.U.A. Número 5,714,338, otorgada en febrero 3, 1998 o Patente de los E.U.A. Número 5,091,313, otorgada en febrero 25, 1992, WO 93/04173 publicada en marzo 4, 1993, o la Solicitud Internacional Número PCT/US98/13410 presentada en junio 30, 1998, Patente de los E.U.A. Número 5,714,338); anticuerpos CD18 (Patente de los E.U.A. Número 5,622,700, otorgada en abril 22, 1997, o en WO 97/26912, publicada en julio 31, 1997); anticuerpos de receptor Apo-2 (WO 98/51793 publicada en noviembre 19, 1998); anticuerpos de Factor de Tejido (TF = Tissue Factor) (Patente Europea Número 0 420 937 Bl otorgada en noviembre 9, · 1994); a4-a7 anticuerpos integrina (WO 98/06248 publicada en febrero 19, 1998); anticuerpos EGFR (por ejemplo, anticuerpo quimerizado o humanizado 225, cetuximab, ERBUTIX as en WO 96/40210 publicado en diciembre 19, 1996); anticuerpos CD3 tales como OKT3 (Patente de los E.U.A. Número 4,515,893 otorgada en mayo 7, 1985); anticuerpos Tac o CD25 tales como CHI-621 (SIMULECT®) y ZENAPAX® (Ver Patente de los E.U.A. Número 5,693,762 otorgada en diciembre 2, 1997); anticuerpos CD4 tal como el anticuerpo cM-7412 (Choy et al., Arthritis Rheum 39(1): 52-56 (1996)); CD52 tal como el anticuerpo CA PATH-1H ( ILEX/Berlex) (Riechmann et «al., Nature 332:323-337 (1988)); anticuerpos de receptor Fe tal como el anticuerpo M22 dirigido contra Fe (RI como en Graziano et al., J. Inmuno1. 155 ( 10 ): 4996-5002 (1995)); anticuerpos de antigeno carcinoembrionico (CEA = carcinoembryonic antigen) tales como hMN-14 (Sharkey et al., Cáncer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)); anticuerpos dirigidos contra células epiteliales de mama incluyendo huBrE-3, hu- c 3 y CHL6 (Ceriani et al., Cáncer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); y Richman et al., Cáncer Res. 55(23 Supp) : 5916s-5920s (1995)); anticuerpos que ligan a células de carcinoma de colon tal como C242 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1) :l-9 (1996)); anticuerpos CD38, por ejemplo, AT 13/5 (Ellis et al., J. Immunol. 155 (2 ): 925-937 (1995)); anticuerpos CD33 tales como Hu M195 (Jurcic et al., Cáncer Res 55(23 Suppl) : 5908s-5910s (1995)) y CMA-676 o CDP771; anticuerpos EpCAM tales como 17-1A (PANOREX®); anticuerpos GpIIb/IIIa tales como abciximab o c7E3 Fab (REOPRO®) ; anticuerpos RSV tales como MEDI-493 (SYNAGIS®) ; anticuerpos CMV tales como PROTOVIR®; anticuerpos HIV tales como PR0542; anticuerpos de hepatitis tales como el anticuerpo Hep B OSTAVIR®; anticuerpo CA125 incluyendo anti-MUC16 (WO2007/001851; Yin, BWT y Lloyd, KO, J. Biol. Chem. 276:27371-27375 (2001)) y OvaRex; anticuerpo de epitopo GD3 idiotipico BEC2; anticuerpo a?ß3 (por ejemplo, VITAXIN®; Medimmune) ; anticuerpo de carcinoma renal humano tal como ch-G250; ING-1; anticuerpo 17-lAn anti-humano (3622W94); anticuerpo de tumor colorectal anti-humano (A33) ; anticuerpo de melanoma anti-humano R24 dirigido contra gangliósido GD3; carcinoma de células escamosas anti-humano (SF-25); anticuerpo de antigeno de leucocitos humano (HLA = Human Leukocyte Antigen) tal como Smart ID10 y el anticuerpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1); anticuerpo CD37 tal como TRU 016 (Trubion) ; anticuerpo IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk) ; anticuerpo de anti células B (Impheron) ; célula B dirigida a MAb (Inmunógeno/Aventis) ; 1D09C3 (Morphosys/GPC) ; LymphoRad 131 (HGS); anticuerpo Lym-1, tal como Lym -1Y-90 (USC) o anti-Lym-1 Oncolym (USC/Peregrine) ; LIF 226 (Enhanced Lifesci.); anticuerpo BAFF (e.g., O 03/33658); anticuerpo receptor de BAFF (ver por' ejemplo, WO 02/24909); anticuerpo BR3; anticuerpo Blys tal como belimumab; LYMPHOSTAT -B™; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); gomilixima (Idee 152; Biogen Idee); anticuerpo receptor IL-6 tal como atlizumab. (ACTEMRA™; Chugai/Roche) ; anticuerpo IL-15 tal como Hu ax-Il-15 (Genmab/Amgen) ; anticuerpo receptor de quimiocina, tal como anticuerpo CC 2 (e.g., MLN1202; Millieneum) ; anticuerpo anti-complemento, tal como anticuerpo C5 (e.g., eculizumab, 5G1.1; Alexion) ; formulación oral de inmunoglobulina humana (e.g., IgPO; Protein Therapeutics ) ; anticuerpo IL-12 tal como ABT-874 (CAT/Abbott) ; Teneliximab (BMS-224818 ; BMS) ; anticuerpos CD40, incluyendo S2C6 y sus variantes humanizadas (WO00/75348) y TNX 100 (Chiron/Tanox) ; anticuerpos TNF-OÍ incluyendo cA2 o infliximab (REMICADE®) , CDP571, MAK-195, adalimumab (HUMIRA™) , fragmento de anticuerpo TNF- pegilado tal como CDP-870 (Celltech) , D2E7 . (Knoll) , anticuerpo policlonal anti-TNF-a (e.g., PassTNF; Verigen) ; anticuerpos CD22 tal como LL2 o epratuzumab (LYMPHOCIDE®; Immunomedics ) , incluyendo epratuzumab Y-90 y epratzumab 1-131, anticuerpo CD22 de Abiogen (Abiogen, Italia), CMC 544 (Wyeth/Celltech) , combotox (UT Soutwestern) , BL22 (NIH) , y LympoScan Tc99 (Immunomedics) .

Ejemplos de anticuerpos CD20 incluyen: "C2B8", que ahora se llama "rituximab" ("RITUXAN®") (Patente de los E.U.A. No. 5,736,137); el anticuerpo murino 2B8 etiquetado con itrio- [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) comercialmente disponible de IDEC Pharmaceuticals, Inc. (Patente de los E.U.A. No. 5,736,137; 2B8 depositado con ATCC bajo el No. de acceso HB11388 en junio 22, 1993); IgG2a murino "Bl", también denominado "Tositumomab" , opcionalmente etiquetado con 131I para generar el anticuerpo "131I-B1" o "tositumomab yodo 1131" (BEXXAR™) comercialmente disponible de Corixa (ver, también la Patente de los E.U.A. No. 5,595,721); anticuerpo monoclonal murino "1F5" (Press et al., Blood 69 (2) : 584-591 (1987)) y sus variantes incluyendo 1F5 humanizado o "parchado en cuadro" (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC depósito HB-96450) ; anticuerpo murino 2H7 y quimérico 2H7 (Patente de los E.U.A. No. 5,677,180); 2H7 humanizado (WO 2004/056312, Lowman et al.,); 2F2 (HuMax-CD20) , un anticuerpo de alta afinidad totalmente humano dirigido a la molécula CD20 en la membrana celular de células B (Genmab, Dinamarca; ver, por ejemplo, Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004 /0167319) ; los anticuerpos monoclonales humanos establecidos en WO 2004/035607 y US2004/0167319 (Teeling et al.,); los anticuerpos que tienen cadenas azúcar ligadas a N-glicósido complejos ligados a la región Fe descritos en US 2004/0093621 (Shitara et al.,); anticuerpos monoclonales y fragmentos de enlace de antigeno que ligan a CD20 (WO 2005/000901, Tedder et al.,) tales como HB20-3, HB20-4, HB20-25, y MB20-11; moléculas de enlace CD20 tales como la serie AME de anticuerpos, e.g., anticuerpos AME 33 como se establece en WO 2004/103404 y US2005/0025764 (Watkins et al., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); moléculas de enlace CD20 tales como aquellas descritas en US 2005/0025764 (Watkins et al.,); anticuerpo A20 o sus variantes tales como anticuerpos A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) o IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics ) ; anticuerpos de enlace CD20, incluyendo Leu-16 agotado en epitopo, 1H4 o 2B8, opcionalmente conjugado con IL-2, como en US 2005/0069545A1 y WO 2005/16969 (Carr et al.,); anticuerpo biespecifico que liga CD22 y CD20, por ejemplo, hLL2xhA20 (WO2005/14618 , Chang et al.,); anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed. , p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma et al., Blood 92:184 (1998)); conjugado de auristatina E anti-CD20 (Seattle Genetics); anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope) ; terapia MAb anti-CD20 (EpiCyte) ; atnticuerpo anti-CD20 TRU 015 (Trubion) .

El término "anticuerpo" como se emplea aquí, comprende anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos de longitud integra que tienen una región Fe de inmunoglobulina ) , composiciones de anticuerpo con especificidades poliepitópica, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) , diacuerpos, pepticuerpos , y moléculas de cadena sencilla, asi como fragmentos de anticuerpo (e.g., Fab, F(ab')2, y Fv) , cualquiera de los cuales puede conjugarse opcionalmente a otro componente, por ejemplo una toxina. El término "inmunoglobulina" (Ig aquí) se emplea en forma intercambiable con "anticuerpo".

La unidad de anticuerpo de 4-cadenas básica es una glicoproteina heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (M) idénticas. Un anticuerpo IgM consiste de 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado una cadena J y contiene 10 sitios de enlace de antigeno, mientras que los anticuerpos IgA comprenden desde 2-5 de las unidades de 4-cadenas básicas que pueden polimerizar para formar ensamblados polivalentes en combinación con la cadena J. En el caso de IgGs, la unidad de 4-cadenas en general es de aproximadamente 150,000 daltons. Cada cadena L se enlaza a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se enlazan entre si por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada H tiene en el extremo N, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) por cada una de las cadenas a y Y y cuatro dominios CH para los isotipos µ y e . Cada cadena L tiene en el extremo N, un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante en su otro extremo. El VL se asigna con VH y CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) . Residuos aminoácidos particulares se considera que forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El apareamiento de VH y VL juntas forma un solo sitio de enlace de antigeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds) , Appleton & Lange, Nor alk, Conn. , 1994, página 71 y Capitulo 6.

La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las clases ? y a se dividen adicionalmente en sub-clases en base a diferencias relativamente menores en la secuencia y función CH, por ejemplo, humano expresa las siguientes subclases: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos. El dominio V media enlace de antigeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de toda la extensión de los dominios variables. Por el contrario, las regiones V consisten de tramos relativamente invariantes denominados regiones marco (FRs) de aproximadamente 15-30 residuos aminoácido separados por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" o en ocasiones "regiones de determinación de complementariedad (CDRs = Complementarity Determining Regions") que tienen cada una aproximadamente 9-12 residuos aminoácidos de longitud. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas cada uno comprenden cuatro FRs, substancialmente adoptando una configuración de hoja ß, conectados por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de estructuras de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad inmediata por las FRs y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antigeno de anticuerpos (ver abat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en enlace de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como participación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .

El término "región hipervariable" (también conocido como "regiones de determinación de complementariedad" o CDRs) cuando se emplean aquí, se refieren a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son (usualmente tres o cuatro regiones cortas de variabilidad de secuencia extrema) dentro del dominio de región V de una inmunoglobulina que forma el sitio de enlace de antigeno y son los determinantes principales de especificidad de antigeno. Hay al menos dos métodos para identificar los residuos CDR: (1) Un enfoque con base en variabilidad de secuencia a través de especies (i.e., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, S 1991); y (2) Un enfoque con base en estudios cristalográficos de complejos de antígeno-anticuerpo (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Sin embargo, en la medida que dos técnicas de identificación de residuo definen regiones de traslape pero no regiones idénticas, pueden combinarse para definir una CDR híbrida.

La expresión "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural y/o modificaciones post-traducción (por ejemplo, isomerizaciones , amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales ) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que se sintetizan por el cultivo de hibridoma, no contaminados por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogénea y no se debe considerar que requiera producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden elaborarse por métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo., Patente de los E.Ü.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" ( inmunoglobulinas ) en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o sub-clase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas con u homologas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o sub-clase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los E.U.A. No. 4, 816, 567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticuerpos quiméricos de interés aquí incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de enlace de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.) y secuencias de región de contenido humano.

Un anticuerpo "intacto" es aquel que comprende un sitio de enlace de antigeno asi como una CL y al menos los dominios de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o sus variantes de secuencia de aminoácidos. De preferencia, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, de preferencia la región variable y/o de enlace de antigeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab' )2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver Patente de los E.U.A. No. 5, 641, 870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062

[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Digestión con papaina de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de .antigeno idénticos denominados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fe" residual, una designación que refleja la capacidad por cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste de toda cadena L junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH) , y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1) . Cada fragmento Fab es monovalente respecto al enlace de antigeno, es decir tiene un solo sitio de enlace de antigeno. Tratamiento con pepsina de. un anticuerpo da por resultado un solo fragmento F(ab')2 grande que corresponde a aproximadamente a dos fragmentos Fab de enlace disulfuro que tiene diferente actividad de enlace de antigeno y es todavía capaz de entrelazar antigeno. Fragmentos Fab1 difieren de los fragmentos Fab al tener unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxi del dominio CH1 incluyendo una o más cisternas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en donde el o los residuos cisterna de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisternas bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también se conocen.

El fragmento Fe comprende las porciones terminales carboxi de ambas cadenas H unidas en conjunto por disulfuro. Las funciones efectoras de anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fe, la región que también se reconoce por receptores Fe (FcR) encontrados en ciertos tipos de Células .

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y una cadena ligera en asociación cerrada, no-covalente . Desde el pliegue de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno para las cadenas H y L) que contribuyen los residuos aminoácido para enlace de antigeno y confieren especificidad de enlace de antigeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv comprende solo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad por reconocer y ligar antígeno, aunque a una menor afinidad que todo el sitio de enlace.

"Fv de cadena sencilla" también abreviados como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una sola cadena polipéptido. De preferencia, el polipéptido sFv además comprende un enlazador polipéptido entre los dominios VH y VL que permite a sFv formar la estructura deseada para enlace de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) .

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo preparados al construir fragmentos sFv (ver párrafo precedente) con residuos cortos enlazadores (aproximadamente 5-10) ) entre los dominios VH y VL tal que se logra apareamiento inter-cadena pero no intra-cadena de los dominios V, de esta manera resultando en un fragmento bivalente, es decir un fragmento que tiene dos sitios de enlace de antigeno. Diacuerpos biespecificos son heterodimeros de dos fragmentos sFv de "cruce" en donde los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipéptido. Se describen diacuerpos con más detalle por ejemplo en EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Los anticuerpos de la invención además pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos.

Formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas inmunoglobulina o sus fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab ' , F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace de antigeno de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en donde residuos de una región de determinación de complementariedad (CDR) del recipiente son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo, que tiene las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias marco. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso o de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado en forma óptima también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácido introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácido no humanos a menudo son referidos como residuos de "importación" que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser realizada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir CDRs de roedor o secuencias CDR por las secuencias correspondientes del anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los E.U.A. Número 4,816,567), en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos roedores.

La selección de dominios variables humanos tanto ligeros como pesados para utilizarse en producir los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir la antigenicidad y respuesta a anticuerpo anti-ratón humano (HAMA = Human Anti-Mouse Antibody) , cuando el anticuerpo se pretende para uso terapéutico humano. De acuerdo con el así denominado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia de dominio V humano que es más cercana a la del roedor se identifica y la región marco humano (FR) en su interior acepta el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede emplearse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).

Además es importante que se humanicen anticuerpos con retención de alta afinidad de enlace para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Programas de computadora están disponibles que ilustran y exhiben probables estructuras de conformación tridimensional de secuencias de inmunoglobulina candidato selectas. La inspección de estas expresiones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para ligar a su antigeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinar de la secuencia del recipiente y de importación, de manera tal que la característica de anticuerpo deseada tal como afinidad incrementada para el o los antígenos objetivo se logra. En general, los residuos de región hípervariable están involucrados en forma directa y más sustancial en influenciar el enlace de antígeno.

Diversas formas de un anticuerpo humanizado se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo tal como un Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos, para generar un inmunocon ugado . En forma alterna, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto tal como un anticuerpo IgGl intacto.

Como una alternativa a humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, ante inmunización, de producir un repertorio íntegro de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos resulta en inhibición completa de la producción de anticuerpo endógena. La transferencia de la matriz de gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en este ratón mutante de línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos ante prueba con antígeno.

Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Imrnuno. 7:33 (1993); Patentes de los E.U.A. Números 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852.

En forma alterna, la tecnología de expresión en fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553

[1990]) puede emplearse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio de anticuerpo V son clonados en-cuadro ya sea en un gen de proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso tal como M13 o fd, y expresan como fragmento de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene¦ una copia de ADN de una sola hebra del genoma fago, selecciones con base en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La expresión en fago puede realizarse en una variedad de formatos, revisado en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen V pueden emplearse para expresión en fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aisló una matriz diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede construirse y anticuerpos a una matriz diversa de antigenos (incluyendo autoantigenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también las Patentes de los E.U.A. Números 5,565,332 y 5,573,905.

Anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vitro (ver Patentes de los E.U.A. Números 5,567,610 y 5,229,275).

Anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tienen especificidad de enlace para al menos dos epitopos diferentes. Anticuerpos biespecificos ejemplares pueden ligar a dos diferentes epitopos de una proteina como se describe aquí. Otros de estos anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace de proteina con un sitio de enlace para otra proteina. En forma alterna, un brazo de anti-proteina puede combinarse con un brazo que liga a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula de receptor de célula T (por ejemplo CD3) (ver, por ejemplo, Baeuerle, et al., Curr. Opin. Mol. Ther. ll(l):22-30 (2009)), o receptores Fe para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64) , FCYRII (CD32) y FCYRIII (CD16), para enfocar y localizar mecanismos de defensa celular a la célula que expresa TAT. Anticuerpos biespecificos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos en células que expresan una proteina objetivo. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace de proteina y un brazo que liga al agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferona-a, vinca alcaloide, cadena ricina A, metotrexato o isótopo radioactivo hapteno) . Anticuerpos biespecificos pueden prepararse como anticuerpos de longitud integra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespeci fieos F(ab')2) .

O 96/16673 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti- FcyRIII biespecifico y la Patente de los E.U.A. Número 5,837,234 describe un anticuerpo anti-ErbB2 /anti-FcyRI biespecifico. Un anticuerpo anti-ErbB2/Fca biespecifico se muestra en WO98/02463. Las Patentes de los E.U.A. Números 5,821,337 y 6,407,213 ilustran anticuerpos anti-ErbB2/anti- CD3 biespecificos . Anticuerpos biespecificos adicionales que ligan a un epitopo en el antigeno CD3 y un segundo epitopo, se han descrito. Ver, por ejemplo la Patente de los E.U.A.

Números 5,078,998 (antigeno de célula de tumor/anti-CD3 ) ; 5,601,819 (anti-CD3/IL-2R; anti-CD3/CD28 ; antÍ-CD3/CD 5 ) ; 6,129,914 (antigeno de célula B maligna/anti-CD3 ) ; 7,112,324 (anti-CD3/CD19) ; 6,723,538 (anti-CD3/CCR5) ; 7,235,641 (anti- CD3/EpCAM) ; 1,262,216 (antígeno de tumor de ovario/anti-CD3) ; y 5,731,168 (anti-CD3/CD4 IgG) .

Métodos para producir anticuerpos biespecífieos se conocen en la técnica. Producción tradicional de anticuerpos biespecífieos de longitud íntegra se basa en la co-expresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. Purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien problemática y los rendimientos de productos son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) .

De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. De preferencia, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH2, y CH3. Se prefiere el tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para unión de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada, de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en una célula hospedera conveniente. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipéptido en modalidades en donde proporciones no iguales de las tres cadenas polipéptido empleadas en la construcción proporcionan ' el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecifico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipéptido en proporciones iguales, resulta en altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen efecto significante en el rendimiento de la combinación de cadena deseada.

En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecificos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena inmunoglobulina indeseada, ya que la presencia de la cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molecular biespecifica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles para generar anticuerpos biespecificos ver, por ejemplo Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986) .

De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de los E.U.A. Número 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede someterse a ingeniería para llevar al máximo el por ciento de heterodimeros que son recuperados del cultivo celular recombinante . La interfase referida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeño de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con más grandes cadenas laterales (por ejemplo, tirosina o triptófano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes son creados en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo, al reemplazar grandes cadenas laterales aminoácido con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros.

Anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconj ugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heterocon ugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Éstos anticuerpos por ejemplo se han propuesto que hacen blanco en células de sistema inmune con células indeseadas (Patente de los E.U.A. Número 4,676,980), y para el tratamiento de infección VIH (HIV) (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Anticuerpos heteroconj ugados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de entrelazamiento convenientes. Agentes de entrelazamiento convenientes son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente de los E.U.A. Número 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento.

Técnicas para generar anticuerpos biespecificos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden o disocian proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Éstos fragmentos se reducen en la presencia de agente complejante ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados después se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab '-TNB después se vuelve a convertir al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab ' -TNB para formar un anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos pueden emplearse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de- E. coli, que puede acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecífica totalmente humanizada F(ab')2. Cada fragmento Fab' fue secretado por separado de E. coli y sometido a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecifico . El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de ligar a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama humana. Diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecificos directamente de cultivo celular recombinante, también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos se han producido utilizando cremalleras leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después volvieron a oxidar para formar los heterodimeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodimeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo biespecificos . Los fragmentos comprenden un VH conectado a una VL por un enlazador que es muy corto para permitir apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, · los dominios VH y VL de un fragmento son forzados para aparear con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, de esta manera formando dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecificos por el uso de dimeros Fv de cadena sencilla (sFv) se ha reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, anticuerpos triespecífieos pueden prepararse. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Anticuerpos heteroconj ugados también están dentro del alcance de la presente invención. Anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente . Éstos anticuerpos por ejemplo se han propuesto para hacer blanco en células del sistema inmune en células indeseadas .[Patente de los E.U.A. Número 4,676,980], y para el tratamiento de infección VIH (HIV) [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que involucran agentes de entrelazamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de sulfur.o o al formar un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos convenientes para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos por ejemplo en la Patente de los E.U.A. Número 4 , 676, 980.

Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual ligan los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes a la clase IgM) con tres o más sitios de enlace de antígeno (por ejemplo anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de enlace de antigeno amino terminales a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido aquí comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero de preferencia cuatro sitios de enlace de antigeno. El anticuerpo multivalente comprende cuando menos una cadena polipéptido (y de preferencia dos cadenas polipéptido) , en donde la o las cadenas polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender VD1- (XI ) n-VD2-(X2)n-Fc, en donde VDl es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender: cadena de región VH-CH1-enlazador flexible-VH-CHl-Fc; o cadena de región VH-CH1-VH-CHl-Fc. El anticuerpo multivalente aquí de preferencia además comprende cuando menos dos (y de preferencia cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente aquí por ejemplo puede comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente además comprenden un dominio CL.

Un anticuerpo que "liga específicamente a" o "es específico para" un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido particular, es aquel que liga a ese polipéptido o epítopo particular en un polipéptido particular sin ligar sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.

El término "fase sólida" describe una matriz no acuosa en la cual el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Ejemplos de fases sólidas aquí abarcadas incluyen aquellas formadas de manera parcial o total de vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo una columna de cromatografía de afinidad) . Este término también incluye una fase discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en la Patente de los E.U.A. Número 4,275,149.

Un "anticuerpo dependiente de especie" por ejemplo un anticuerpo IgE antihumano de mamífero es un anticuerpo que tiene una fuerte afinidad de enlace para un antígeno de una primera especie de mamífero que para un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie liga específicamente "a un antígeno humano" (es decir tiene un valor de afinidad de enlace (Kd) no mayor que aproximadamente lxlO-7 M, en forma alterna no mayor a aproximadamente lxlO-8 M, en forma alterna no mayor aproximadamente lxlO-9 M) pero tiene una afinidad de enlace para un homólogo del antigeno de una segunda especie de mamífero no humano que es de al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de enlace para el antígeno no humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser de cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos como se define anteriormente, pero de preferencia es un anticuerpo humano o humanizado.

"Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas que se atribuyen a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varía con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: citotoxicidad dependiente de complemento y enlace Clq; enlace de receptor Fe; y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación a la baja de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptores de célula B) ; y activación de célula B.

"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en donde Ig secretada ligada en receptores Fe (FcRs) presente en ciertas células citotóxicas (por ejemplo células destructoras naturales ( K) , neutrófilos y raacrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas liguen específicamente a una célula diana que contiene antígeno y subsecuentemente extermina la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y se requieren para exterminar la célula objetivo con este mecanismo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FCYRIII. Expresión Fe en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para estimar actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo in vitro ADCC tales como aquellos descritos en las Patentes de los E.U.A. Números 5,500,362 o 5,821,337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PB C) y células destructoras naturales (NK) . En forma alterna o adicional, actividad ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como el descrito en Clynes et al., PNAS USA 95: 652-656 (1998) .

"Receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que liga la región Fe dé un anticuerpo. FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Aún más, un FcR preferido es aquel que liga a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FCYRIII incluyendo variantes alélicas y formas combinadas de manera alterna de estos receptores, receptores FCYRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición") que tienen similares secuencias de aminoácidos que difieren primordialmente en sus dominios citoplásmicos . FcyRIIA receptor de activación contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM = Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif) en su dominio citoplásmico . FcyRIIB receptor de inhibición contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptora (ITI = Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibition Motif) en su dominio citoplásmico. (Ver M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). FcRs se revisan en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcRs incluyen aquellos a identificarse en el futuro, son abarcados por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal FcRn que es responsable por la transferencia de IgGs maternas al feto. Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994).

"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos FcyRIII y realizan función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células destructoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, con PBMCs y células MNK que se prefieren. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo sangre.

"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en la presencia de complemento. La activación de la ruta de complemento clásica se inicia por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que se ligan a su antigeno cognado. Para estimar actividad de complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

"Aislado (a) " cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos de anticuerpo aqui descritos, significa un polipéptido o anticuerpo que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su ambiente de producción. De preferencia, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los otros componentes de su ambiente de producción. Componentes contaminantes de su ambiente de producción, tales como aquellos que resultan de las células transíectadas recombinantes, son materiales que típicamente interferirán con los usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el polipéptido será purificado (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencias de aminoácidos internas o N-terminales por uso de un secuenciador de copa de centrifugado o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductores utilizando azul Coomassie, o de preferencia tinción de plata. De manera ordinaria sin embargo, un polipéptido o anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica los polipéptidos y anticuerpos aquí, es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en el ambiente en el que se produce. De preferencia, el ácido nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes asociados con el ambiente de producción. Las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos y anticuerpos aquí, están en una forma diferente a en la forma o ámbito en el que se encuentran en la naturaleza. Moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto se distinguen de ácido nucleico que codifica los polipéptidos de anticuerpos aquí existentes en forma natural en las células.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operativamente enlazada en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de enlace de ribosoma. Células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, señales de poliadenilación y mejoradores. Ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o líder secretorio, se enlaza operativamente con ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma está enlazado operativamente con una secuencia de codificación si se ubica para facilitar la traducción. En general "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace- se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los enlazadores o adaptadores oligonucleótidos sintéticos se emplean de acuerdo con la práctica convencional.

La expresión "etiquetado con epitopo" cuando se emplea aquí, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido o anticuerpo aquí descrito fusionado a un "polipéptido etiqueta o marcador". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el cual un anticuerpo puede elaborarse, sin embarqo es suficientemente corto de manera tal que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido etiqueta o marcador de preferencia también es sustancialmente único de manera tal que el anticuerpo no reacciona sustancialmente en forma cruzada con otros epitopos . Adecuados polipéptidos marcadores en general tienen al menos seis residuos aminoácido y usualmente entre 8 y 50 residuos aminoácido aproximadamente (de preferencia, entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácido) .

Como se emplea aquí, el término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combina la especificidad de enlace de una proteina heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina . Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al sitio de enlace y reconocimiento de antigeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2),. IgE, IgD o IgM. Las fusiones de Ig de preferencia incluyen la substitución de un dominio de un polipéptido o anticuerpo aquí descrito en el lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, CH1, regiones CH2 y CH3 de una molécula IgGl. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la Patente de los E.U.A. No. 5,428,130 otorgada en junio 27, 1995.

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permita a la actividad biológica del ingrediente activo ser efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual se administrará la formulación.

Un anticuerpo posee "actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un tiempo determinado está dentro de aproximadamente 10% (dentro de errores del ensayo) de la actividad biológica exhibida al tiempo en que se preparara la formulación farmacéutica, como se determina por la capacidad del anticuerpo in vitro o in vivo para ligar al antigeno y resultar en una respuesta biológica medible.

Una formulación "estable" o "estabilizada" es aquella en la que la proteina esencialmente retiene su estabilidad física y/o química ante almacenamiento. La estabilidad puede medirse a una temperatura selecta por un periodo de tiempo selecto. De preferencia, la formulación es estable a temperatura ambiente (~30 grados C) o a 40 grados C por al menos 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8 grados C por al menos 1 año y de preferencia por al menos 2 años. Por ejemplo, la extensión de agregación durante almacenamiento puede emplearse como un indicador de estabilidad de proteína. De esta manera, una formulación "estable" puede ser aquella en donde menos de aproximadamente 10% y de preferencia menos de aproximadamente 5% de la proteína está presente como un agregado en la formulación. Diversas técnicas analíticas para medir estabilidad de proteína están disponibles en la especialidad y se revisan por ejemplo, en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs . (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993) .

La expresión "solución acuosa" se refiere a una solución en la que el agua es el medio de disolución o solvente. Cuando una substancia se disuelve en un liquido, la mezcla se denomina una solución. La substancia disuelta es el soluto, y el liquido que hace la disolución (en este caso, agua) es el solvente.

La expresión, "agente estabilizante" o "estabilizante" como se emplea aquí, es un producto químico o compuesto que se agrega a una solución o mezcla o suspensión o composición o composición terapéutica para mantenerla en un estado estable o sin cambio; o es aquel que se emplea debido a que produce una reacción que involucra cambios en átomos o moléculas que llevan a estado más estable o sin cambio.

Una "cantidad reductora de viscosidad" de un compuesto que es capaz ' de reducir viscosidad de una formulación que contiene proteína acuosa, es la cantidad que reduce en forma medible la viscosidad de la formulación después de su adición.

Una formulación "isotónica" es aquella que esencialmente tiene la misma presión osmótica que la sangre humana. Formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. El término "hipotónica" describe una formulación con una presión osmótica por debajo de la sangre humana. De manera correspondiente, el término "hipertónica" se emplea para describir una formulación con una presión osmótica sobre la sangre humana. Puede medirse la isotonicidad utilizando un osmómetro de tipo presión de vapor o congelamiento con hielo, por ejemplo.

Una formulación "reconstituida" es aquella que se ha preparado al disolver una proteína liofilizada o formulación de anticuerpo en un diluyente tal que la proteína se disperse en la formulación reconstituida. La formulación reconstituida es adecuada para administración (por ejemplo, administración parenteral) a un paciente que se va a tratar con la proteína de interés y en ciertas modalidades de la invención puede ser aquella que es adecuada para administración subcutánea.

"Surfactantes" son agentes tenso activos que pueden ejercer su efecto en superficies de sólido-sólido, sólido-líquido, líquido-líquido, y líquido-aire debido a su composición química, contienen tanto grupos hidrofílicos como hidrofóbicos . Estos materiales reducen la concentración de proteína en soluciones diluidas en sus interfases aire-agua y/o agua-sólido en donde las proteínas pueden ser adsorbidas y agregadas potencialmente . Surfactantes pueden ligar a interfases hidrofóbicas en formulaciones de proteínas. Proteínas en la superficie del agua se agregaran, particularmente cuando se agitan, debido a desdoblado y subsecuente agregación de la monocapa de proteína.

"Surfactantes" pueden desnaturalizar proteínas, pero también pueden estabilizarlas contra desnaturalización de superficie. En general, surfactantes iónicos pueden desnaturalizar proteínas. Sin embargo, surfactantes no iónicos usualmente no desnaturalizan proteínas incluso a concentraciones relativamente elevadas (1% p/v). La mayoría de los surfactantes no iónicos parenteralmente aceptables provienen ya sea de los grupos polisorbato o poliéter. Polisorbato 20 y 80 son . estabilizantes de surfactantes contemporáneos en formulaciones de proteínas comercializadas. Sin embargo, otros surfactantes utilizan formulaciones de proteínas incluyendo Pluronic F-68 y miembros de la clase "Brij". Surfactantes no iónicos pueden ser basados en azúcar. Surfactantes basados en azúcar pueden ser alquil glicósidos. La estructura general de alquil glicósido es Ri~ 0-(CH2)x-R , en donde R es independientemente CH3 o ciclohexilo (CeHn) y Ri es independientemente glucosa o maltosa. Ejemplares alquil glicósidos incluyen aquellos en donde Ri es glucosa, R es CH3, y x es 5 (n- exil-ß-?-glucopiranósido) , x es 6 (n-heptil- -D-glucopiranósido) , x es 7 (n-octil-p-D-glucopiranósido) , x es 8 (?-????-ß-D-glucopiranósido) , x es 9 (n-decil^-D-glucopiranósido ) , y x es 11 (n-dodecil-p-D-glucopiranósido) . En ocasiones, glucopiranósidos se denominan glucósidos. Alquil glicósidos ejemplares adicionalmente incluyen aquellos en donde Ri es maltosa, R es CH3, y x es 5 (n-hexil-p-D-maltopiranósido) , x es 7 (n-octil-p-D-maltopiranósido) , x es 8 (?-????-ß-D- maltopiranósido) , x es 9 (n-decil-p-D-maltopiranósido) , x es 10 (n-undecil-p-D-maltopiranósido) , x es 11 (n-dodecil-3-D-maltopiranósido) , x es 12 (n-tridecil-p-D-maltopiranósido) , x es 13 (n-tetradecil- -D-maltopiranósido) , y x es 15 (n-hexadecil- -D-maltopiranósido) . En ocasiones maltopiranósidos se denominan maltosidas. Alquil glicósidos ejemplares incluyen aquellos en donde Ri es glucosa, x es 3, y R es ciclohexil (3-ciclohexil-l-propil-3-D-glucósido) ; y en donde Ri es maltosa, x es 4, y R es ciclohexil ( 4-ciclohexil-l-butil^-D-maltósido) .

Un "ácido farmacéutico aceptable" incluye ácidos orgánicos e inorgánicos que no son tóxicos a la concentración y forma en la cual se formulan. Por ejemplo, ácidos inorgánicos convenientes incluyen ácidos clorhídricos, perclórico, bromhidrico, yodhidrico, nítrico, sulfúrico, sulfónico, sulfínico, sulfanílico, fosfórico, carbónico, etc. Ácidos orgánicos convenientes incluyen con alquilo de cadena recta y ramificada, aromáticos, cíclicos, cicloalifáticos , arilalifáticos , heterocíclicos , saturados, insaturados, mono, di- y tri-carboxílicos, incluyendo por ejemplo, fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoroacético, fenilacético, trimetilacético, t-butil acético, antranílico, propanoico, 2-hidroxipropanoico, 2-oxopropanoico, propandioico, ciclopentanpropiónico, ciclopentano propiónico, 3-fenilpropiónico, butanoico, butandioico, benzoico, 3- (4- hidroxibenzoil ) benzoico, 2-acetoxi-benzoico, ascórbico, cinnámico, lauril sulfúrico, esteárico, mucónico, mandélico, succinico, embónico, fumárico, málico, maleico, hidroximaleico, malánico, láctico, cítrico, tartárico, glicólico, glicónico, glucónico, pirúrico, glioxálico, oxálico, mesílico, succinico, salicílico, ftálico, palmoico, palmeico, tiocianico, metansulfónico, etansulfónico, 1,2-etandisulfónico, 2-hidroxietansulfónico, benzensulfónico, 4-clorobenzensulfónico, naftalen-2-sulfónico, p-toluensulfónico, canforsulfónico, 4-metilbiciclo [2.2.2 ] -oct-2-en-l-carboxílico, glucoheptónico, ácido 4 , 4 ' -metilenbis-3-(hidroxi-2-en-l-carboxilico) , hidroxinaptoico .

"Bases farmacéuticas-aceptables" incluyen bases inorgánicas y orgánicas que no son tóxicas a la concentración y manera en la que se formulan. Por ejemplo, bases convenientes incluyen aquellas formadas de metales que forman base inorgánica tales como litio, sodio, potasio, magnesio, calcio, amonio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio, N-metilglucamina, morfolina, piperidina y bases no tóxicas orgánicas incluyendo, amina primaria, secundaria y terciaria, aminas substituidas, aminas cíclicas y resinas de intercambio de iones básicas, [e.g., N(R')4+ (en donde R' es independientemente H o C1-4 alquilo, e.g., amonio, Tris)], por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2- dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaina, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas poliamina y semejantes.

Particularmente, bases no tóxicas orgánicas preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina y cafeína. Ácidos y bases farmacéuticos aceptables adicionales utilizables con la presente invención incluyen aquellos que se derivan de aminoácidos, por ejemplo, histidina, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y asparagina .

Amortiguadores "farmacéuticos aceptables" y sales incluyen aquellos derivados tanto de sales de adición de ácido y base de los ácidos y bases anteriormente indicados. Amortiguadores específicos y/o sales incluyen histidina, succinato y acetato.

Un "lioprotector" es una molécula que cuando se combina con una proteína de interés, significativamente evita o reduce la inestabilidad físico-química de la proteína ante liofilización y subsecuente almacenamiento. Lioprotectores ejemplares incluyen azúcares y sus azúcar alcoholes correspondientes; un aminoácido tal como glutamato monosodio o histidina; una metilamina tal como betaína;' una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como azúcar alcoholes trihidricos o de superior peso molecular, por ejemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y mannitol; propilen glicol; polietilen glicol; Pluronics®; y sus combinaciones. Lioprotectores ejemplares adicionales incluyen glicerina y gelatina, y los azúcares meliobiosa, melezitosa, rafinosa, mannotriosa o estaguiosa. Ejemplos de azúcares reductores incluyen glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, iso-maltulosa y lactulosa. Ejemplos de azúcares no reductoras incluyen glicósidos no reductores de compuestos polihidroxi seleccionados de azúcar alcoholes y otros polialcoholes de cadena recta. Azúcar alcoholes preferidos son monoglicósidos , en especial aguellos compuestos que se obtienen por reducción de disacáridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo secundario glicosidico ya puede ser glucosidico o galactosidico . ¦ Ejemplos adicionales de azúcar alcoholes son glucitol, maltitol, lactitol y iso-maltulosa. Los lioprotectores preferidos son los azúcares no reductores trehalosa o sacarosa .

El lioprotector se agrega a la formulación pre- liofilizada en una "cantidad lioprotectora" que significa que, después de liofilización de la proteina en la presencia de una cantidad lioprotectora del lioprotector, la proteina esencialmente retiene su estabilidad fisico-quimica ante liofilización y almacenamiento.

Un "azúcar farmacéutico aceptable" es una molécula que cuando se combina con una proteina de interés, significativamente evita o reduce inestabilidad fisicoquímica de la proteína ante almacenamiento. Cuando la formulación se pretende liofilizada y después reconstituida, "azúcares farmacéuticos aceptables" también pueden ser conocidos como "lioprotectores" . Azúcares ejemplares y sus azúcar alcoholes correspondientes incluyen: un aminoácido tal como glutamato monosodio o histidina; una metilamina tal como betaina; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como azúcar alcoholes trihídricos o de superior peso molecular, por ejemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y mannitol; propilen glicol; polietilen glicol; Pluronics®; y sus combinaciones. Lioprotectores ejemplares adicionales incluyen glicerina y gelatina, y los azúcares meliobiosa, melezitosa, rafinosa, manotriosa y estaquiosa. Ejemplos de azúcares reductores incluyen glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, iso-maltulosa y lactulosa. Ejemplos de azúcares no-reductores incluyen glicósidos no-reductores de compuestos polihidroxi seleccionados de azúcar alcoholes y otros alcoholes de cadena recta. Azúcar alcoholes preferidos son monoglicósidos , en especial aquellos compuestos que se obtienen por reducción de disacáridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo secundario glicosidico ya puede ser glucosidico o galactosidico . Ejemplos adicionales de azúcar alcoholes son glucitol, maltitol, lactitol e iso-maltulosa . Los azúcares farmacéuticos-aceptables preferidos son los azúcares no reductores trehalosa o sacarosa.

Azúcares farmacéuticamente aceptables se agregan a la formulación en una "cantidad protectora" (por ejemplo, pre-liofilización) lo que significa que la proteina esencialmente retiene su estabilidad fisico-quimica durante almacenamiento (por ejemplo, después de reconstitución y almacenamiento) .

El "diluyente" de interés aquí es aquel que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para administración a un humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida, tal como una formulación reconstituida después de liofilización . Diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacterioestática (BWFI bacteriostatic water for injection) , una solución amortiguada de pH (por ejemplo, salino amortiguador de fosfato) , solución salino estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa. En una modalidad alterna, diluyentes pueden incluir soluciones acuosas de sales y/o amortiguadores .

Un "conservador" es un compuesto que puede agregarse a las formulaciones aquí para reducir actividad bacteriana. La adición de un conservador, por ejemplo puede facilitar la producción de una formulación de múltiples usos (múltiples dosis) . Ejemplos de conservadores potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruro de alquilbencildimetilamonio en donde los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y cloruro de benzetonio. Otros tipos de conservadores incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, butil y bencil alcohol, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol , 3-pentanol y m-cresol . El conservador más preferido aquí es bencil alcohol.

"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas. Aquellos que requieren tratamiento incluyen aquellos que ya están con el desorden asi como aquellos en donde se va a evitar el desorden.

"Mamífero" . para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico para deportes o mascotas, tales como perros, caballos, conejos, ganado, cerdos, hamsters, gerbos, ratones, hurones, ratas, gatos, etc. De preferencia, el mamífero es humano.

Un "desorden" es cualquier condición que se beneficie por el tratamiento con la proteina. Esto incluye desórdenes o enfermedades crónicos y agudos incluyendo aquellas condiciones, patológicas que predisponen al mamífero al desorden en cuestión. Ejemplos no limitantes de desórdenes a tratar aquí incluyen carcinomas e inflamaciones.

Una "cantidad terapéutica efectiva" es al menos la concentración mínima requerida para efectuar una mejora o prevención medible de un desorden particular. Cantidades terapéuticas efectivas de proteínas conocidas son bien conocidas en la especialidad, mientras que las cantidades efectivas de las proteínas a continuación descubiertas pueden ser determinadas por técnicas estándar que son bien conocidas por una persona con destreza en la especialidad tal como un médico ordinario.

"Viscosidad," como se emplea aquí, puede ser "viscosidad absoluta" o "viscosidad cinemática". "Viscosidad absoluta", en ocasiones denominada viscosidad dinámica o simple, es una cantidad que describe la resistencia a fluir de un fluido. "Viscosidad cinemática" es el cociente de viscosidad absoluta y densidad de fluido. La viscosidad cinemática frecuentemente se reporta cuando se caracteriza el flujo resistivo de un fluido utilizando un viscómetro capilar. Cuando dos fluidos de igual volumen se colocan en viscómetros capilares idénticos y se deja que fluyan por gravedad, un fluido viscoso tarda más tiempo que un fluido menos viscoso en fluir a través del capilar. Si un fluido tarda 200 segundos para completar su flujo y otro fluido tarda 400 segundos, el segundo fluido es el doble de viscoso que el primero en una escala de viscosidad cinemática. Si ¦ambos fluidos tienen igual densidad, el segundo fluido es el doble de viscoso que el primero en una escala de viscosidad absoluta. Las dimensiones de viscosidad cinemática son L2/T en donde L representa longitud y T representa tiempo. Las unidades de SI de viscosidad cinemática son m2/s. Comúnmente, la viscosidad cinemática se expresa en centistokes , cSt, que es equivalente a mm2/s. Las dimensiones de viscosidad absoluta son /L/T, en donde M representa masa y L y T represente longitud y tiempo, respectivamente. Las unidades SI de viscosidad absoluta son Pa»s, que son equivalentes a kg/m/s. La viscosidad absoluta se expresa comúnmente en unidades de centiPoise, cP, que es equivalente a milliPascal-segundo, mPa«s.

Métodos para la preparación de anticuerpos (incluyendo anticuerpos que son conjugados a una toxina) y otras proteínas que pueden estar formuladas como se describe aquí, son bien conocidos en la especialidad y se describen en detalle por ejemplo en WO2007/001851.

Anticuerpos y otras proteínas pueden formularse de acuerdo con la presente invención ya sea en forma acuosa o liofilizada, esta última es capaz de ser reconstituida en una forma acuosa.

Las formulaciones aquí descritas pueden ser preparadas como formulaciones liofilizadas reconstituidas. Las proteínas o anticuerpos aquí descritos se liofilizan y después reconstituyen para produce las formulaciones líquidas de la invención. En esta modalidad particular, después de preparación de la proteína de interés como se describe anteriormente, se produce una "formulación liofilizada previamente". La cantidad de proteína presente en la formulación previamente liofilizada, se determina tomando en cuenta el volumen de dosis deseado, el o los modos de administración etc. Por ejemplo, la concentración inicial de un anticuerpo intacto puede ser de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de preferencia de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml y más preferible de aproximadamente 20-30 mg/ml.

La proteína a formularse en general está presente en solución. Por ejemplo, en las formulaciones líquidas de la invención, la proteína puede estar presente en una solución de pH amortiguado a un pH de aproximadamente 4-8, y de preferencia de aproximadamente 5-7. La concentración de amortiguador puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, en forma alterna de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, en forma alterna de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, en forma alterna de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 15 mM, dependiendo por ejemplo, del amortiguador y la tonicidad deseada de la formulación (por ejemplo, de la formulación reconstituida). Amortiguadores ejemplares y/o sales, son aquellos que son farmacéuticos aceptables y pueden ser creados a partir de convenientes ácidos, bases y sales de los mismos, tales como aquellos que se definen bajo ácidos, bases o amortiguadores "farmacéuticos aceptables".

En una modalidad, un lioprotector se agrega a la formulación liofilizada previamente. La cantidad del lioprotector en la formulación liofilizada previamente, en general es tal que, al reconstituir, la formulación resultante será isotónica. Sin embargo, formulaciones reconstituidas hipertónicas puede ser también convenientes. Además, la cantidad de lioprotector no debe de ser muy baja de manera tal que una cantidad inaceptable de degradación/agregación de la proteina ocurra al liofilizar. Sin embargo, concentraciones de lioprotector ejemplares en la formulación liofilizada previa son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 400 mM, en forma alterna de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 300 mM, en forma alterna de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM. Lioprotectores ejemplares incluyen azúcares y azúcar alcoholes tales como sacarosa, mañosa, trehalosa, glucosa, sorbitol, manitol. Sin embargo, ba o circunstancias particulares, ciertos lioprotectores también pueden contribuir a un aumento en viscosidad de la formulación. Como tal, deberá tenerse cuidado en elegir lioprotectores particular que reducen al mínimo o neutralizan este efecto. Lioprotectores adicionales se describen anteriormente bajo la definición de "lioprotectores", también referidos aquí como "azúcares farmacéuticamente aceptables".

La proporción de la proteína a lioprotector puede variar por cada combinación particular de proteína o anticuerpo y lioprotector. En el caso de un anticuerpo como la proteina de selección y un azúcar (por ejemplo, sucrosa o trehalosa) como el lioprotector para generar una formulación reconstituida isotónica con una alta concentración de proteína, la proporción molar de lioprotector a anticuerpo puede ser de aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 moles de lioprotector a 1 mol de anticuerpo, y de preferencia de aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 moles de lioprotector a 1 mol anticuerpo, por ejemplo de aproximadamente 200 a aproximadamente 600 moles de lioprotector a 1 mol anticuerpo.

Una mezcla del lioprotector (tales como sacarosa o trehalosa) y un agente espesante (por ejemplo, manitol o glicina) puede ser emplearse en la preparación de la formulación previamente liofilizada. El agente espesante puede permitir la producción de una torta liofilizada uniforme sin excesivas cavidades, etc. Otros portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticos aceptables tales como aquellos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) pueden incluirse en la formulación previamente liofilizada (y/o la formulación liofilizada y/o la formulación reconstituida) siempre que no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. Portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los recipientes, a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen: agentes amortiguadores adicionales; conservadores; co-solventes ; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteina) ; polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sal tales como sodio.

La formulación presente también puede contener más de una proteína según sea necesario para la indicación particular que se trata, de preferencia aquellas con actividad complementaria que no afectan adversamente la otra proteína. Por ejemplo, puede ser conveniente proporcionar dos o más anticuerpos que ligan al objetivo deseado (por ejemplo, receptor o antígeno) en una sola formulación. Estas proteínas están presentes .convenientemente en combinación, en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben de ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles antes de, o después de liofilización y reconstitución. En forma alterna, la esterilidad de toda la mezcla puede lograrse al someter en autoclave los ingredientes, excepto por proteina, a aproximadamente 120 °C por aproximadamente 30 minutos, por ejemplo.

Después de que la proteina, lioprotector y opcional otros componentes opcionales se mezclan en conjunto, la formulación se liofiliza. Muchos secadores por congelamiento diferentes están disponibles para este propósito tales como secadores por congelamiento Hull50MR (Hull, USA) o GT20MR (Leybold-Heraeus, Alemania) . El secado por congelamiento se logra al congelar la formulación y subsecuentemente sublimar el hielo del contenido congelado a una temperatura adecuada para secado primario. Bajo esta condición, la temperatura de producto está por debajo del punto eutéctico o la temperatura de colapso en la formulación. Típicamente, la temperatura de almacenamiento para el secado primario estará en el intervalo de aproximadamente -30 a 25°C (siempre que el producto permanezca congelado durante el secado primario) a presión conveniente, en el intervalo típicamente de aproximadamente 50 a 250 mTorr. La formulación, tamaño y tipo del recipiente que contiene muestra (por ejemplo, ampolleta de vidrio) y el volumen del liquido primordialmente dictarán el tiempo requerido para secar, que puede estar en el intervalo desde una cuantas horas a varios días (por ejemplo, 40-60 hrs) . Opcionalmente, una etapa de secado secundaria también puede realizarse dependiendo del nivel de humedad residual deseado en el producto. La temperatura a la cual el secado secundario se lleva a cabo, está en el intervalo de aproximadamente 0-40 °C, dependiendo primordialmente del tipo y tamaño del recipiente y el tipo de la proteina empleada. Por ejemplo, la temperatura de almacenamiento a través de toda la fase de eliminación de agua de liofilización puede ser de aproximadamente 15-30°C (por ejemplo, aproximadamente 20°C) . El tiempo y temperatura requeridos para el secado secundario serán aquellos que produzcan una torta liofilizada conveniente, dependiendo por ejemplo, de la temperatura y otros parámetros. El tiempo de secado secundario está dictado por el nivel de humedad residual deseado en el producto y típicamente tarda aproximadamente 5 horas (por ejemplo, 10-15 horas). La presión puede ser la misma que la empleada durante la etapa de secado primario. Condiciones de secado por congelamiento pueden variar dependiendo de la formulación y tamaño de ampolleta.

Antes de administración al paciente, la formulación liofilizada se reconstituye con un diluyente farmacéutico aceptable tal que la concentración de proteina en la formulación reconstituida es al menos aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml, en forma alterna de aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, en forma alterna de aproximadamente 90 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml. Estas altas concentraciones de proteina en la formulación reconstituida, se consideran particularmente útiles en donde el suministro subcutáneo de la formulación reconstituida se pretende. Sin embargo, para otras rutas de administración, tales como administración intravenosa, pueden ser deseables menores concen raciones de la proteina en la formulación reconstituida (por ejemplo de aproximadamente 5-50 mg/ml, o de aproximadamente 10-40 mg/ml de proteina en la formulación reconstituida) . En ciertas modalidades, la concentración de proteina en la formulación reconstituida es significantemente superior a la de la formulación liofilizada previamente. Por ejemplo, la concentración de proteina en la formulación reconstituida puede ser aproximadamente 2-40 veces, en forma alterna 3-10 veces, en forma alterna 3-6 veces (por ejemplo, al menos tres veces o al menos cuatro veces) la de la formulación previamente liofilizada.

La reconstitución en general se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 25 °C para asegurar completa hidratación, aunque pueden emplearse otras temperaturas según se desee. El tiempo requerido para reconstitución dependerá, por ejemplo, en el tipo del diluyente, cantidad de excipiente o excipientes y proteina. Diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWF = Bacteriostatic Water For Injection) , una solución amortiguada en pH (por ejemplo, salino amortiguado con fosfato) , solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa. El diluyente en forma opcional contiene un conservador. Conservadores ejemplares se han descrito anteriormente, con alcoholes aromáticos tales como bencil o fenol alcohol que son los conservadores preferidos. La cantidad del conservador empleado se determina al estimar diferentes concent aciones de conservador para compatibilidad con la proteina y prueba de eficacia del conservador. Por ejemplo, si el conservador es un alcohol aromático (tal como bencil alcohol), puede estar presente en una cantidad desde aproximadamente 0.1-2.0% y de preferencia de aproximadamente 0.5-1.5%, pero más preferible de aproximadamente 1.0-1.2%.

De preferencia, la formulación reconstituida, tiene menos de 6000 partículas por ampolleta que tienen >10 µt en tamaño .

Formulaciones terapéuticas se preparan para almacenamiento al mezclar el ingrediente activo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticos aceptables opcionales (Remington 's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa . 18042

[1990]). Portadores, excipientes o estabilizantes aceptable no son tóxicos a los recipientes, a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores, antioxidantes incluyendo ácido ascórbico, metionina, Vitamina E, metabisulfito de sodio, conservadores, isotónificadores, estabilizantes, complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteína) , y/o agentes quelantes tales como EDTA.

Cuando el agente terapéutico es un fragmento de anticuerpo, se prefiere el fragmento' más pequeño que liga específicamente al dominio de enlace de la proteína objetivo. Por ejemplo, con base en las secuencias de región variable de un anticuerpo, fragmentos de anticuerpo o incluso moléculas de péptido pueden diseñarse que retienen la capacidad para ligar la secuencia proteína objetivo. Estos péptidos puede sintetizarse químicamente y/o producirse por tecnología de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893

[1993]).

Se emplean amortiguadores para controlar el pH en un intervalo que optimiza la efectividad terapéutica, en especial si la estabilidad depende del pH. Amortiguadores de preferencia están presentes a concentraciones en el intervalo desde aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, en forma alterna de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, en forma alterna de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, en forma alterna de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 15 mM. Agentes amortiguadores convenientes para utilizar con la presente invención incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sus sales. Por ejemplo, citrato, fosfato, succinato, tartato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato. En forma adicional, amortiguadores pueden comprender sales histidina y trimetilamina tales como Tris.

Se agregan conservadores para retardar el crecimiento microbiano, y típicamente están presentes en un intervalo de 0.2%-1.0% (p/v) . Conservadores convenientes para utilizar con la presente invención incluyen cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), cloruro de benzetonio; timerosal, fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol .

Agentes de tonicidad, en ocasiones conocidos como "estabilizantes" están presentes para ajusfar o mantener la tonicidad de una composición líquida. Cuando se emplean con grandes biomoléculas cargadas tales como proteínas y anticuerpos, a menudo se denominan "estabilizantes" debido a que pueden interactuar con los grupos cargados de las cadenas laterales de aminoácidos de esta manera reduciendo el potencial para interacciones ínter e intra-molecular . Agentes de tonicidad puede estar presentes en cualquier cantidad entre 0.1% a 25% en peso, de preferencia 1 a 5%, tomando en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes. Agentes de tonicidad preferidos incluyen azúcar alcoholes polihidricos , de preferencia azúcar alcoholes trihídricos o superiores, tales como . glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.

Excipientes adicionales incluyen agentes que pueden servir como uno o más de los siguientes: (1) agente espesantes, (2) mejoradores de solubilidad, (3) estabilizantes y (4) agentes que evitan la desnaturalización o adherencia a la pared del recipiente. Estos excipientes incluyen: azúcar alcoholes polihidricos (citados anteriormente) ; aminoácidos tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutamico, treonina, etc.; azúcares orgánicos o azúcar alcoholes tales como sacarosa, lactosa, lactitol, trehalosa, estachiosa, mañosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioinisitosa, mioinisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol) , polietilen glicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutationa, ácido tioctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, gelatina u otras inmunoglobulinas ; polímeros hidrofilicos tales como polivinilpirrolidona ; monosacáridos (por ejemplo, xilosa, mañosa, fructosa, glucosa; disacáridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sucrosa) ; trisacáridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como dextrina o dextrano.

A fin de que las formulaciones se utilicen para administración in vivo, deben ser estériles. La formulación puede hacerse estéril por filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones terapéuticas aquí en general se colocan en un recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo una ampolleta o bolsa de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración es de acuerdo con métodos conocidos y aceptados tales como, por un solo o múltiples bolos o infusión sobre un periodo prolongado de tiempo en una forma conveniente, por ejemplo, inyección o infusión por rutas subcutánea, intravenosa, intraperitoneal , intramuscular, intra-arterial , intralesión o intra-articular , administración tópica, inhalación o por liberación sostenida o medios de liberación prolongada.

La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre si. En forma alterna o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citosina o agente inhibidor de crecimiento. Estas moléculas convenientemente están presentes en combinación, en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato ) , respectivamente en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences 18th edition, supra.

Pueden elaborarse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas (Patente de los E.U.A. No. 3,773,919), copolimeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolimeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolimeros de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato), y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutírico . La microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación sostenida se ha realizado exitosamente con hormona de crecimiento humano (rhGH) , interferona- ( rhIFN- ) , interleucina-2, y MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polilactide Poliglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; y la Patente de los E.U.A. No. 5,654,010.

Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas pueden desarrollarse utilizando polímero de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio intervalo de propiedades biodegradables . Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico, pueden eliminarse rápidamente en el cuerpo humano. Aún más, la capacidad de degradación de este polímero puede ajustarse de meses a años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled reléase of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker; New York, 1990), M. Chasin and R. Langer (Eds.) pp. 1-41.

Mientras que polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos. Cuando anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregar como resultado de exposición a humedad a 37 grados C, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Estrategias racionales pueden diseñarse para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es una formación de enlace S—S intermolecular a través de intercambio tio-disulfuro, puede lograrse estabilización al modificar residuos sulfhidrilo, liofilizar a partir de soluciones acídicas, controlar el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

Composiciones liposomales o proteinoides también pueden emplearse para formular las proteínas o anticuerpos aquí descritos. Ver Patentes de los E.U.A. Nos. 4,925,673 y 5, 013, 556.

La estabilidad de las proteínas y anticuerpos aquí descritos pueden mejorarse a través del uso de "sales de metales polivalentes solubles en agua" no tóxicas. Ejemplos incluyen Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu+, Sn2+, Sn3+, Al2+ y Al3+. Aniones ejemplares que pueden formar sales solubles en agua con los cationes de metal polivalente anteriores incluyen aquellos formados de ácidos inorgánicos y/o ácidos orgánicos. Estas sales solubles en agua tienen una solubilidad en agua (a 20 grados C) de al menos aproximadamente 20 mg/ml, en forma alterna al menos aproximadamente 100 mg/ml, en forma alterna al menos aproximadamente 200 mg/ml. Ácidos inorgánicos convenientes que pueden emplearse para formar las "sales de metales polivalentes solubles en agua" incluyen ácido clorhídrico, sulfúrico, nítrico, tiociánico y fosfórico. Ácidos orgánicos convenientes que pueden emplearse incluyen ácido carboxílico alifático y ácidos aromáticos. Ácidos alifáticos dentro de esta definición pueden definirse como ácidos carboxílicos C2-9 saturados o insaturados (por ejemplo, ácidos mono-, di- y tri-carboxílicos alifáticos ).. Por ejemplo, ácido monocarboxílicos ejemplares en esta definición incluyen los ácidos monocarboxílicos C2-9 saturados, acético, propiónico, butírico, valérico, caproico, enántico, caprilico pelargonico y capriónico, y ácidos monocarboxílicos C2-9 insaturados ácidos acrílico, propriólico, metacrílico, protónico e isocrotónico . Ácidos dicarboxílieos ejemplares incluyen los ácidos dicarboxílieos C2-9 saturados, malónico, succínico, glutárico, adípico y pimélico, mientras que ácidos dicarboxílieos C2-9 insaturados incluyen ácidos maleico, fumárico, citracónico y mesacónico. Ácidos tricarboxílicos ejemplares incluyen los ácidos tricarboxílicos C2-9 saturados ácido tricarbalílico y, 1 , 2 , 3-butantricarboxílico . En forma adicional, los ácidos carboxílicos de esta definición también pueden contener uno o más grupos hidroxilo para formar ácidos hidroxi carboxílicos. Ácidos hidroxi carboxílicos ejemplares incluyen ácido glicólico, láctico, glicérico, tartrónico, málico, tartárico y cítrico. Ácidos aromáticos en esta definición incluyen ácido benzoico y ácido salicílico.

Sales de metales polivalentes solubles en agua comúnmente empleadas que pueden utilizarse para ayudar en estabilizar los polipéptidos encapsulados de esta invención incluyen, por ejemplo: (1) las sales de metal de ácido inorgánico de haluros (por ejemplo, cloruro de zinc, cloruro de calcio), sulfatos, nitratos, fosfatos y tiocianatos ; (2) las sales de metal de ácido carboxílico alifático (por ejemplo, acetato de calcio, acetato de zinc, propionato de calcio, glicolato de zinc, lactato de calcio, lactato de zinc y tartrato de zinc) ; y (3) las sales de metal de ácido carboxilico aromático de benzoatos (por ejemplo, benzoato de zinc) y salicilatos.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis apropiada de un agente activo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se definió anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, si el agente se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al agente, y la discreción, del médico a cargo. El agente se administra de manera conveniente al paciente en un tiempo o sobre una serie de tratamientos.

El método de la invención puede combinarse con métodos de tratamiento conocidos para un desorden ya sea como etapas de tratamiento combinadas o adicionales o como componentes adicionales de una formulación terapéutica.

Dosis y concentración de fármaco deseada de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden variar dependiendo del uso particular previsto. La determinación de la dosis o ruta apropiada de administración está bien dentro de la destreza de una persona con conocimiento ordinario en la especialidad. Experimentos en animales proporcionan guía confiable para la determinación de dosis efectivas para terapia en humanos. Ajuste en escala ínter especies de dosis efectivas pueden realizarse siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics" , en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46.

Cuando se emplea la administración in vivo de los polipéptidos o anticuerpos aquí descritos, cantidades de dosis normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, de preferencia aproximadamente 1 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. Guía respecto a particulares dosis y métodos de suministro se proporciona en la literatura; ver, por ejemplo las Patentes de los E.U.A. Nos. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Está dentro del alcance de la invención que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes tratamientos y diferentes desórdenes, y que la administración pretendida para tratar un órgano o tejido específicos puede requerir el suministro en una forma diferente a la de otro órgano o tejido. Aún más, dosis pueden ser suministradas por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Para administraciones repetidas sobre varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El avance de esta terapia se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Las formulaciones de la presente invención, incluyendo pero no limitadas a formulaciones reconstituidas, se administran a un mamífero que requiere tratamiento con la proteína, de preferencia un humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica o por inhalación.

En modalidades preferidas, las formulaciones se administran al mamífero por administración subcutánea (es decir, por debajo de la piel) . Para estos propósitos, la formulación puede ser inyectada utilizando una jeringa. Sin embargo, están disponibles _ otros dispositivos para administración de la formulación tales como dispositivos de inyección (por ejemplo, los dispositivos Inject-ease™ y Genject™); plumas inyectoras (tales como GenPen™) ; dispositivos de auto-inyección, dispositivos sin agujas (por ejemplo, MediJector™ y BioJector™) ; y sistemas de suministro de parche subcutáneo.

En una modalidad específica, la presente invención se dirige a equipos para una unidad de administración de dosis única. Estos equipos comprenden un recipiente de una formulación acuosa de proteína o anticuerpo terapéuticos, incluyendo tanto jeringas de llenado previo de una sola o múltiples cámaras. Jeringas de llenado previo ejemplares están disponibles den Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania.

La dosis apropiada ("cantidad terapéutica efectiva") de la proteina dependerá por ejemplo, en la condición a tratar, la severidad y curso de la condición, si la proteina se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta a la proteina, el tipo de proteína empleada, y la discreción del médico a cargo. La proteína convenientemente se administra al paciente en un tiempo o sobre una serie de tratamientos y puede administrarse al paciente en cualquier tiempo a partir de diagnóstico en adelante. La proteína puede administrarse como un único tratamiento o en conjunto con otros fármacos o terapias útiles para tratar la condición en cuestión.

Cuando la proteína de selección es un anticuerpo, de aproximadamente 0.1-20 mg/kg es una dosis candidato inicial para administración al paciente, ya sea por ejemplo, por una o más administraciones separadas. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se supervisa fácilmente por técnicas convencionales.

En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene la formulación y de preferencia proporciona instrucciones para su uso. El articulo de manufactura comprende un recipiente. Recipientes convenientes incluyen, por ejemplo, botellas, ampolletas (por ejemplo, ampolletas de cámaras duales) , jeringas (tales como jeringas de una sola o cámaras duales) y tubos de ensayo. El recipiente puede formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. La etiqueta, que está en, o está asociada con el recipiente que contiene la formulación, puede indicar instrucciones para reconstitución y/o uso. La etiqueta además puede indicar que la formulación es útil o pretendida para administración subcutánea. El recipiente que contiene la formulación puede ser una ampolleta de múltiples usos, que permite administraciones repetidas (por ejemplo, de 2-6 administraciones) de la formulación reconstituida. El articulo de manufactura además puede comprender un segundo recipiente que comprende un diluyente conveniente (por ejemplo, BWFI). Al mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración de proteina final en la formulación reconstituida, en general será al menos 50 mg/ml. El articulo de manufactura además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso.

La invención se comprenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo no habrá de considerarse como limitantes del alcance de la invención, Todas las citas a través de la descripción aquí expresamente se incorporan por referencia.

EJEMPLO 1 - Investigación de Viscosidad de Proteina en Solución Este ejemplo ilustra medidas de viscosidad de diversas formulaciones que contienen anticuerpo.

La viscosidad de diversas formulaciones acuosas de un anticuerpo monoclonal anti-CD4 en solución, se evaluó. Específicamente, en este estudio, soluciones amortiguadas que contienen diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-CD4 (Histidina-succinato 20 mM, pH 6.3) se prepararon y la viscosidad de la solución resultante se determinó. En este aspecto, se midió viscosidad utilizando un reómetro estándar de cono-y-placa (reómetro de tensión TA Instruments AR-G2 que utiliza un cono con diámetro de 20 mm, 1 grado y trampa de solvente agua) a una temperatura de 25 grados C y velocidad de cizalla de 1000 1/s. Al cargar, cada muestra se deja que equilibre por 2 minutos a 25 grados C antes del inicio de la recolección de datos. Los datos se recolectan por un mínimo de 2 minutos para asegurar que se alcanzó el estado estable. Se prepararon soluciones por diálisis y/o adición del excipiente seco en una solución de proteína concentrada para lograr la concentración de excipiente final deseada. Se almacenaron muestras a 2-8 grados C hasta que se llevan a temperatura ambiente antes de carga de la muestra. Mediciones de concentración de proteina de cada muestra se realizaron utilizando espectroscopia de absorbancia UV por dilución gravimétrica . Se midieron muestras dentro de 2 semanas de la preparación (usualmente dentro de 2-3 días) . Los resultados de estos análisis iniciales se muestran en la Tabla I siguiente.

Tabla I EJEMPLO 2 - Investigación del Efecto de Arginina en la Viscosidad de una Formulación que Contiene Anticuerpo Acuoso Este ejemplo ilustra como arginina-HCl y succinato arginina (arginina-S) afecta la viscosidad de una formulación que contiene anticuerpo monoclonal acuoso.

El efecto reductor de viscosidad de arginina-HCl y succinato de arginina en una formulación acuosa de un anticuerpo monoclonal anti-CD4 en solución, se evaluó. Específicamente, en este estudio, soluciones amortiguadas que contienen diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-CD4 (Histidina-succinato 20 mM, pH 6.3) se prepararon en combinación con diversas concentraciones de arginina libre y la viscosidad de la solución resultante se determina como se describió anteriormente. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla II a continuación.

Tabla II Los datos mostrados en la Tabla II demuestran que la formulación acuosa que contiene anticuerpo anti-CD4 amortiguada es altamente viscosa y que la adición de arginina-HCl 30 mM funciona para reducir significativamente la viscosidad de la solución resultante. También, la adición de cantidades crecientes de succinato de arginina tiene un efecto reductor de viscosidad. Por lo tanto, estos datos demuestran que arginina-HCl y arginina con una concentración de succinato, por ejemplo, arginina succinato, sirven como excipientes/aditivos efectivos para uso en reducir la viscosidad de formulaciones que contienen alta concentración de proteina, de esta manera asi en esas formulaciones más susceptibles a administración por la ruta subcutánea.

EJEMPLO 3 - Investigación del Efecto de Diversos Derivados de Arginina, Precursores y Análogos Estructurales en la Viscosidad de una Formulación que Contiene Anticuerpo Acuosa Este ejemplo ilustra como varios derivados de arginina, precursores y análogos estructurales afectan la viscosidad de una formulación que contiene anticuerpo monoclonal acuosa.

Dado que los datos en el Ejemplo 2 demuestran que arginina-HCl y arginina succinato tienen un efecto benéfico para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen anticuerpo en alta concentración, a continuación buscamos determinar el efecto que diversos derivados de arginina, precursores y análogos estructurales diferentes tendrían en estas formulaciones que contiene proteina. Específicamente, en los siguientes estudios, soluciones amortiguadas que contienen diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-CD4 (Histidina-succinato20 mM, pH 6.3) se prepararon en combinación con diversas concentraciones de diferentes derivados, precursores o análogos de arginina y la viscosidad de la solución resultante se determina utilizando un reómetro de cono y placa estándar como se describe anteriormente. En forma más específica, la viscosidad se midió utilizando un reómetro de cono-y-placa estándar (reómetro de esfuerzo TA Instruments AR-G2 TA utilizando un diámetro de 20 mm, cono de 1 grado, y trampa de solvente agua) a una temperatura de 25°C y una velocidad de cizalla de 1000 1/s. Al cargar, cada muestra se dejó que equilibrara por 2 minutos a 25°C antes del inicio de recolección de datos. Datos se recolectaron por un mínimo de 2 minutos para asegurar que estado estable se alcanzara. Se prepararon soluciones por diálisis y/o adición del excipiente seco en una solución de proteína concentrada para lograr la concentración de excipiente final deseada. Muestras se almacenaron a 2-8°C hasta que se lleva a una temperatura ambiente antes de cada muestra. Mediciones de concentración de proteína de cada muestra se hicieron utilizando espectroscopia de absorbancia de UV por dilución gravimétrica .

A. Oligopéptidos de Arginina El efecto de agregar arginina dipéptido, arginina tripéptido o poliarginina a formulaciones de anticuerpo monoclonal anti-CD4 acuosa se determinó como se describió anteriormente. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla III a continuación.

Tabla III B. Longitud de Cadena Lateral de Arginina, Variante El efecto de alterar longitud de cadena lateral del excipiente basada en arginina en formulaciones de anticuerpo monoclonal anti-CD4 acuosas se determinó como se describió anteriormente. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla IV a continuación.

Tabla IV C . Retirar Grupos Funcionales Arginina El efecto retirar diversos grupos funcionales del excipiente basado en arginina en formulaciones de anticuerpo monoclonal anti-CD4 acuosa se determinó como .se describió anteriormente. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla V a continuación.

Tabla V D. Otros Compuestos Relacionados El efecto de otros compuestos relacionados a arginina en la viscosidad de formulación también se analizó y los resultados se muestran en la Tabla VI a continuación.

Tabla VI Tabla VI (cont) E . Compendio Los datos presentados en la Tabla I anterior demuestran que arginina (ya sea arginina-HCl o arginina succinato) es un excipiente que . reduce efectivamente la viscosidad de soluciones que tienen proteina de alta concentración. Con base en estos datos, se realizaron experimentos adicionales para probar el efecto de diversos otros excipientes "relacionados con arginina" en la viscosidad de soluciones que contiene proteina de alta concentración acuosas. Como se muestra en las Tablas II-VI, muchos de los excipientes adicionales probados demostraron un efecto reductor de viscosidad. De manera interesante, otros excipientes .relacionados estructuralmente (por ejemplo, canavanina y dihidrocloruro de NG-NG-dimetil-arginina) actualmente funcionaron para incrementar la viscosidad de la solución que contiene proteina de alta concentración, demostrando que la homología estructural a arginina no es predictiva del efecto que puede tener el compuesto en una solución que contiene proteína.

EJEMPLO 4 - Investigación de la Dependencia de Viscosidad en Concentración de Excipiente Este ejemplo ilustra el efecto de concentración de excipiente variante en la viscosidad de una formulación que contiene anticuerpo monoclonal acuoso.

El efecto reductor de viscosidad de diversas concentraciones diferentes de dos excipientes mostrados en el Ejemplo 3 anterior como capaz de reducir la viscosidad de soluciones que contienen proteína de alta concentración, se evaluó. Específicamente, en este estudio, soluciones amortiguadas que contiene diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-CD4 (Histidina-succinato 20 mM, pH 6.3) se prepararon en combinación con diversas concentraciones diferentes ya sea de agmantina u homoarginina y en la viscosidad de la solución resultante se determinó como se describió con anterioridad. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla VII, en donde las presentadas mediciones de viscosidad representan el promedio de lo obtenido en dos análisis independientes de la misma formulación acuosa.

Tabla VII Los datos presentados en la Tabla VII anterior demuestran que el efecto reductor de viscosidad de excipientes mostrado en el Ejemplo 3 anterior que tiene un efecto reductor de viscosidad, ocurre sobre un amplio intervalo de concentraciones. Más específicamente, es aparente de los datos presentados en la Tabla VII que los efectos reductores de viscosidad en general se vuelven aparentes alrededor de una concentración de aproximadamente 10 mM y se mejoran y mantienen a través de concentraciones que se aproximan 900 mM a 1 M. Dado estos datos, se esperará que excipientes aquí demostrados que tienen un efecto reductor de viscosidad exhibirán ese efecto sobre un amplio rango de concentraciones entre e incluyendo de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M.

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de materia, caracterizada porque comprende una proteina y un compuesto capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteina.

2. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es un anticuerpo.

3. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteina se elige del grupo que consiste de arginina-HCl, arginina succinato, arginina dipéptido, arginina tripéptido, poliarginina, homoarginina, ácido 2-amino-3-guanidino-propiónico, guanidina, ornitina, agmantina, ácido guanidobutírico, urea, citrulina, N-hidroxi-L-nor-arginina, nitroarginina metil éster, argininamida, arginina metil éster, arginina etil éster, lisina, lisinamida, lisina metil éster, histidina, histidina metil éster, histamina, alanina, alaninamida, alanina metil éster, putrescina, cadaverina, espermidina, espermina y metionina.

4. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteína se elige del grupo que consiste de arginina-HCl, arginina succinato, homoarginina, agraantina, nitroarginina metil éster, argininamida, arginina metil éster, arginina etil éster, lisina metii éster, alanina, putrescina, cadaverina, espermidina y espermina.

5. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el compuesto capaz de reducir la viscosidad de la formulación acuosa está presente en una concentración de al menos 10 mM.

6. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el compuesto capaz de reducir la viscosidad de la formulación acuosa está presente en una concentración de al menos 20 mM.

7. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el compuesto capaz de reducir la viscosidad de la formulación acuosa está presente en una concentración de al menos 50 mM.

8. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el compuesto capaz de reducir la viscosidad de la formulación acuosa está presente en una concentración de al menos 100 mM.

9. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el compuesto capaz de reducir la viscosidad de la formulación acuosa está presente en una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M.

10. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque está en una forma acuosa .

11. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque está en forma liofilizada .

12. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de proteina es al menos 100 mg/ml.

13. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la viscosidad no es mayor a 150 cP.

14. Un articulo de manufactura caracterizado porque comprende un recipiente que contiene la composición de materia de conformidad con la reivindicación 1.

15. Un método para reducir la viscosidad de una formulación que contiene proteina, el método se caracterizada porque comprende la etapa de agregar a la formulación una cantidad reductora de viscosidad de un compuesto capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteina.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto es capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteina, se elige del grupo que consiste de arginina-HCl , arginina succinato, arginina dipéptido, arginina tripéptido, poliarginina, homoarginina, ácido 2-amino-3-guanidino- propiónico, guanidina, ornitina, agmantina, ácido guanidobutirico, urea, citrulina, N-hidroxi-L-nor-arginina, nitroarginina metil éster, argininamida, arginina metil éster, arginina etil éster, lisina, lisinamida, lisina metil éster, histidina, histidina metil éster, histamina, alanina, alaninamida, alanina metil éster, putrescina, cadaverina, espermidina, espermina y metionina.

· 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de al menos 10 mM.

18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de al menos 20 mM.

19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de al menos 50 mM.

20. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de al menos 100 mM.

21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 1 M.

22. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proteina es un anticuerpo.

23. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende la etapa de liofilizar la formulación.

24. El método de conformidad con la reivindicación • 15, caracterizado, porque la concentración · de proteina presente en la formulación es al menos 100 mg/ml.

25. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la viscosidad de la formulación no es mayor a 150 cP.

26. Un método para preparar una formulación que contiene proteina acuosa, el método se caracteriza porque comprende la etapa de agregar a una solución que contiene proteina una cantidad reductora de viscosidad de un compuesto capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteina.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto capaz de reducir la viscosidad de una formulación acuosa que comprende la proteina, se elige del grupo que consiste de arginina-HCl , arginina succinato, arginina dipéptido, arginina tripéptido, poliarginina, homoarginina, ácido 2-amino-3-guanidino-propiónico, guanidina, ornitina, agmantina, ácido guanidobutirico, urea, citrulina, N-hidroxi-L-nor-arginina, nitroarginina metil éster, argininamida, arginina metil éster, arginina etil éster, lisina, lisinamida, lisina metil éster, histidina, histidina metil éster, histamina, alanina, alaninamida, alanina metil éster, putrescina, cadaverina, espermidina, espermina y metionina.

28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de al menos 10 mM.

29. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de al menos 20 mM.

30. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de al menos 50 mM.

31. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final de al menos 100 mM.

32. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto se agrega a una concentración final entre ¦ aproximadamente 10 mM y aproximadamente 1 M.

33. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la proteina es un anticuerpo.

34. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la concentración de proteina resente en la formulación es al menos 100 mg/ml.

35. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la viscosidad de la formulación no s mayor a 150 cP.