+

MD3365367T2 - Anticorpi monoclonali împotriva ploşniţelor de pat și procedee de obţinere și utilizare a acestora - Google Patents

Anticorpi monoclonali împotriva ploşniţelor de pat și procedee de obţinere și utilizare a acestora Download PDF

Info

Publication number
MD3365367T2
MD3365367T2 MDE20180844T MDE20180844T MD3365367T2 MD 3365367 T2 MD3365367 T2 MD 3365367T2 MD E20180844 T MDE20180844 T MD E20180844T MD E20180844 T MDE20180844 T MD E20180844T MD 3365367 T2 MD3365367 T2 MD 3365367T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
antigen
bed bug
antibody
monoclonal antibody
binding fragment
Prior art date
Application number
MDE20180844T
Other languages
English (en)
Inventor
William John Hall
Min Wang
Original Assignee
Redcoat Solutions Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Redcoat Solutions Inc filed Critical Redcoat Solutions Inc
Publication of MD3365367T2 publication Critical patent/MD3365367T2/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F1/00—Metallic powder; Treatment of metallic powder, e.g. to facilitate working or to improve properties
    • B22F1/05—Metallic powder characterised by the size or surface area of the particles
    • B22F1/054—Nanosized particles
    • B22F1/0545—Dispersions or suspensions of nanosized particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/0004—Preparation of sols
    • B01J13/0043—Preparation of sols containing elemental metal
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F2301/00—Metallic composition of the powder or its coating
    • B22F2301/25—Noble metals, i.e. Ag Au, Ir, Os, Pd, Pt, Rh, Ru
    • B22F2301/255—Silver or gold
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F2304/00—Physical aspects of the powder
    • B22F2304/05—Submicron size particles
    • B22F2304/054—Particle size between 1 and 100 nm
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F2304/00—Physical aspects of the powder
    • B22F2304/05—Submicron size particles
    • B22F2304/056—Particle size above 100 nm up to 300 nm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/43504—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates
    • G01N2333/43552—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from insects
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Prezenta dezvăluire furnizează anticorpi monoclonali anti-insecte de pat şi fragmente ale acestora de legare la antigen, precum şi compoziţii şi truse care îi cuprind. Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, metode de producere a anticorpilor monoclonali şi a fragmentelor acestora de legare la antigen şi metode de utilizare a acestora pentru a detecta ploşniţele de pat.

Description

DOMENIU
Prezenta dezvăluire se referă la anticorpi monoclonali anti-insecte de pat, compoziţii cuprinzând astfel de anticorpi şi procedee de producere şi utilizare a acestor anticorpi.
FONDUL INVENŢIEI
Amploarea şi numărul infestărilor cu insecte de pat în Statele Unite au crescut de peste un deceniu. Insectele de pat se găsesc în mod obişnuit în locuinţe cu mai multe unităţi, cum ar fi apartamente, cămine, case de bătrâni şi hoteluri, precum şi în locuri publice precum teatre, transport public şi centre comerciale.
Deşi insectele de pat nu sunt vectori cunoscuţi ai niciunui agent patogen, există unele dovezi că insectele de pat ar putea acţiona ca vectori mecanici ai virusului hepatitei B (Blow şi colab., J. Med. Entomol. 38: 694-700 (2001)). Rezistenţa la meticilină a Staphylococcus aureus (MRSA) şi rezistenţa la vancomicină Enterococcus faecium au fost recuperate de la insectele de pat asociate cu o persoană fără adăpost (Lowe şi colab., Emerg. Infect. Dis. 17: 1132-1134 (2011)).
Strategiile de detectare utilizate în prezent includ:
- Detectare vizuală: Verificarea personală a saltelelor şi a cearşafurilor de pat, a tapiţeriei şi a covoarelor pentru ploşniţe, exoschelete sau picături fecale necesită timp şi este adesea complicată de adăposturi criptice, inaccesibile; - Detectare canină: Rezultatele la câinii care adulmecă ploşniţe sunt foarte variabile. Succesul depinde de câine şi dresor şi de tipul de antrenare şi recompensă. Detectarea canină produce un număr inacceptabil de mare de fals pozitiv, iar vizibilitatea sa duce la relaţii publice neplăcute; - Monitoare active sau pasive. Monitoare active - cum ar fi Verifi® de la FMC, CDC3000® de la Stern Environmental sau NightWatch® de la BioSensory, Inc. - se bazează pe amestecuri personalizate de feromoni sau dioxid de carbon, pentru a atrage ploşniţele de pat într-o capcană. Monitoare pasive, cum ar fi ClimbUp® Insect Interceptor, sunt plasate lângă o persoană adormită şi folosesc căldura şi dioxidul de carbon ale acelei persoane pentru a atrage şi a prinde ploşniţele de pat. Eficacitatea monitoarelor active şi pasive depinde de densitatea populaţiei de ploşniţe şi poate rata sau subestima introducerile mici de insecte. Majoritatea monitoarelor au, de asemenea, o amprentă inacceptabil de mare, necesită personal special instruit şi costă prea mult. În plus, ambele strategii implică de fapt gestionarea ploşniţelor moarte, pe care majoritatea oamenilor le consideră neplăcute; Alte abordări ale detectării ploşniţelor includ: - Reacţia în lanţ a multiplex polimerazei (PCR) pentru a distinge ouăle de ploşniţe sau fragmentele de insecte din locuinţele umane. Această tehnică depinde de recuperarea fizică a ouălor sau a fragmentelor de insecte şi de procesarea lor folosind reactivi şi tehnici standard de biologie moleculară (Szalanski şi colab., J. Med. Entomol. 48: 937-940 (2011)); - Microextracţia probelor de aer pentru a identifica doi feromoni volatili bine caracterizaţi, (E)-2-hexenal şi (E)-2-octenal, prin cromatografie în gaz şi spectrometrie de masă (Eom şi colab., Anal Chim Acta 716: 2-10 (2012)); - Utilizarea senzorilor de infraroşu, microfoanelor şi a unui senzor piezoelectric pentru a detecta locomoţia (Mankin şi colab., J. Econ. Entomol. 103: 1636-1646 (2010)); - Detectarea nitroforinei, un antigen salivar specific ploşniţei de pat (brevet U.S. Nr. 7.743.552); - Detectarea antigenelor din sângele uman în excreţiile de ploşniţe (brevet U.S. Nr. 8.460.890); şi - Detectarea antigenelor ploşniţelor de pat de către anticorpi policlonali (publicaţia U.S. Nr. 2015/0064727). Numărul de opţiuni de detectare disponibile este limitat şi este nevoie de o metodă de detectare convenabilă, uşor de utilizat, care detectează rapid, reproductibil, eficient şi direct ploşniţele de pat. Spre deosebire de abordările anterioare, prezenta invenţie furnizează anticorpi monoclonali care satisfac nevoia.
REZUMAT
Prezenta invenţie se referă la un anticorp monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la American Type Culture Collection (ATCC) cu numărul de acces PTA-122644 [BB2], sau un fragment al acestuia de legare la antigen.
Prezenta invenţie se referă la un anticorp monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de Acces PTA-122645 [BB7] sau un fragment al acestuia de legare la antigen.
Prezenta invenţie se referă la un anticorp monoclonal conjugat sau un fragment conjugat de legare la antigen care cuprinde oricare dintre anticorpii monoclonali anti-insecte de pat sau fragmentele de legare la antigen ale invenţiilor de mai sus şi un agent de detectare. În anumite variante de realizare, agentul de detectare este o etichetă enzimatică, o marcare radioactivă, un fluorofor, un cromofor, un agent de imagistică, un metal, un ion metalic, aur coloidal sau nanoparticule de aur. În anumite variante de realizare, anticorpul monoclonal conjugat sau fragmentul de legare la antigen conjugat cuprinde un anticorp monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau un fragment de legare la antigen al acestuia. În anumite variante de realizare, anticorpul monoclonal conjugat sau fragmentul de legare la antigen conjugat cuprinde un anticorp monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122645 [BB7] sau un fragment de legare la antigen al acestuia.
Prezenta invenţie se referă la o compoziţie care cuprinde oricare dintre anticorpii monoclonali anti-insecte de pat sau fragmente de legare la antigen, sau anticorpi conjugaţi sau fragmente conjugate de legare la antigen ale invenţiilor sau realizărilor de mai sus, sau o combinaţie a acestora. În anumite variante de realizare, compoziţia cuprinde un anticorp monoclonal anti-ploşniţă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Număr de acces PTA-122644 [BB2] şi un anticorp monoclonal anti-ploşniţă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Număr de acces PTA-122645 [BB7]. În anumite variante de realizare, compoziţia cuprinde un anticorp monoclonal anti-ploşniţă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de Acces PTA-122644 [BB2] şi un anticorp conjugat care cuprinde anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7] şi un agent de detectare. În anumite variante de realizare, compoziţia cuprinde un anticorp monoclonal anti-ploşniţă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de Acces PTA-122645 [BB7] şi un anticorp conjugat care cuprinde anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] şi un agent de detectare.
Prezenta invenţie se referă la o trusă care cuprinde oricare dintre invenţiile sau variantele de realizare de mai sus, sau o combinaţie a acestora. \tabPrezenta invenţie se referă la un hibridom capabil să producă un anticorp monoclonal anti-insectă de pat, în care hibridomul este depus la ATCC cu numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau în care hibridomul este depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. Prezenta invenţie se referă la o celulă izolată care produce un anticorp monoclonal anti-insectă de pat sau un fragment de legare la antigen din oricare dintre invenţiile de mai sus. Prezenta invenţie se referă la o metodă de producere a unui anticorp monoclonal anti-ploşniţă de pat sau a unui fragment de legare la antigen al oricăreia dintre invenţiile de mai sus, cuprinzând cultivarea unei celule izolate care produce anticorpul monoclonal anti-insectă de pat sau fragmentul de legare la antigen şi izolarea anticorpului sau fragmentului de legare a antigenului din celula cultivată. \tabPrezenta invenţie se referă la o metodă de detectare a ploşniţelor de pat, care cuprinde punerea în contact a unei probe care cuprinde un antigen de ploşniţă de pat cu oricare dintre anticorpii monoclonali anti-ploşniţe, fragmente de legare la antigen, anticorpi conjugaţi sau fragmente de legare la antigen conjugat sau compoziţii din invenţiile sau variantele de mai sus, sau o combinaţie a acestora, şi detectarea legării antigenului de ploşniţă de pat la anticorpul monoclonal anti-insectă de pat sau fragmentul de legare la antigen, anticorpul conjugat sau fragmentul de legare la antigenul conjugat, compoziţia sau combinaţia acestora. În anumite variante de realizare, proba este pusă în contact cu un anticorp monoclonal anti-insecte de pat din oricare dintre invenţiile de mai sus şi un anticorp conjugat din oricare dintre invenţiile sau variantele de mai sus. În anumite variante de realizare, anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat este produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122644 [BB2], iar anticorpul conjugat cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7] şi un agent de detectare. În anumite variante de realizare, anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat este produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122645 [BB7], iar anticorpul conjugat cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] şi un agent de detectare. În anumite variante de realizare, detectarea cuprinde efectuarea unui test de curgere laterală. În anumite variante de realizare, metoda mai cuprinde colectarea unei probe care cuprinde antigenul de ploşniţă cu un dispozitiv de colectare şi extragerea antigenelor din probă. În anumite variante de realizare, dispozitivul de colectare este un tampon.
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
Figura 1 arată rezultatele unui test de captură tip sandwich folosind anticorpii monoclonali anti-ploşniţă de pat BB2 şi BB7. Benzile de nitroceluloză sunt prezentate cu legarea antigenului de ploşniţă indicată prin puncte asociate cu prezenţa anticorpului monoclonal BB2 sau BB7 conjugat cu aur ("Detector Ab"), cu pH-ul anticorpului conjugat cu aur aşa cum este indicat. Benzile de testare sunt indicate prin "ploşniţă de pat" pentru antigen. Benzile de control negative sunt indicate cu "niciunul" pentru antigen, cu PBS adăugat la benzi în loc de antigenul de ploşniţă. Anticorpii de captare asociaţi cu benzile 1-3 au fost anticorpi policlonali de iepure anti-ploşniţă de pat (banda 1), anticorpul monoclonal BB2 (banda 2) şi anticorpul monoclonal BB7 (banda 3).
Figurile 2-7 arată rezultatele unui imunotest cu flux lateral pentru probele de tampon obţinute din nivelurile notate de infestare a ploşniţelor de pat, cu nivelul 0 care nu conţine ploşniţe şi nivelul 8 care conţine cel mai înalt nivel de ploşniţe. Probele de tampon au fost extrase în tampon de extracţie 1 care conţine 1X Tris-HCl (pH 7,6), 0,05 % NaN3, 0,1 % BSA şi 0,1 % Tween-20 şi diluţiile notate au fost aplicate pe benzile de testare. "Tampon" indică o bandă de test de control negativ în care a fost aplicat tamponul 1 în loc de o probă de tampon. Toate benzile conţin o bandă de control pozitiv de anticorp anti-şoarece de capră, care este situat deasupra unei benzi de anticorpi de captare BB7 pentru legarea antigenului de ploşniţă. Dungile devin detectabile vizual numai la legarea anticorpului monoclonal BB2 de şoarece conjugat cu aur la banda de control pozitiv de capră anti-şoarece sau la antigenul imobilizat de ploşniţe capturat de banda BB7. Linia de pe banda "Tampon" şi liniile corespunzătoare de pe benzile de testare sunt controalele pozitive care indică legarea anticorpului de capră anti-şoarece la anticorpul detector BB2 conjugat cu aur. Doar controalele pozitive sunt detectabile în Figura 2 din cauza absenţei antigenului. Liniile de sub liniile de control pozitiv în Figurile 3-7 indică legarea anticorpului BB2 conjugat cu aur la antigenul imobilizat de ploşniţe capturat de banda BB7. Figurile 6-7 arată murdărie şi reziduuri vizibile pentru mostrele mai puţin diluate în partea de jos a benzilor de testare asociate cu nivelurile mai ridicate de infestare a ploşniţelor de pat.
Figurile 8A şi 8B sunt grafice bazate pe măsurători efectuate de cititorul de benzi de testare Axxin a probelor de tampon pentru nivelurile 2, 4 şi 8 extrase în tamponul 1. În Figura 8A, "concentraţia" pe axa x este diluţia asociată cu probele de tampon măsurate, iar axa y este valoarea pentru "aria liniei de testare" furnizată de cititorul de benzi de testare Axxin. În Figura 8B, valoarea obţinută pentru tamponul 1 ca martor negativ (adică "Bo") a fost împărţită singură pentru a produce o valoare normalizată de 1. Citirea controlului negativ (Bo) a fost apoi împărţită la aria liniei de testare (B) pentru fiecare diluare a probei de testat la nivelul, unde valori mai mici sub 1 sugerează cantităţi mai mari de antigen de ploşniţă, iar valorile de peste 1 indică absenţa antigenului de ploşniţă.
Figurile 9-11 arată rezultatele unui imunotest cu flux lateral pentru probele de tampon obţinute din nivelurile notate de infestare a ploşniţelor de pat. Probele de tampon au fost extrase în tampon de extracţie 2 care conţine 1X Tris-HCl (pH 7,6), 0,05 % NaN3, 0,1 % BSA şi 0,2 % Tween-20 şi diluţiile notate au fost aplicate pe benzile de testare. Figura 11 prezintă murdărie vizibilă şi reziduuri pentru probele mai puţin diluate în partea de jos a benzilor de testare asociate cu nivelurile mai ridicate de infestare a ploşniţelor de pat. Etichetarea benzilor şi interpretarea rezultatelor sunt cele descrise pentru Figurile 2-7.
Figurile 12A şi 12B sunt grafice bazate pe măsurători efectuate de cititorul de benzi de testare Axxin a probelor de tampon pentru nivelurile 4, 5 şi 8 extrase în tamponul 2. Etichetarea graficelor este aşa cum este descrisă pentru Figurile 8A şi 8B.
Figurile 13-17 arată rezultatele unui imunotest cu flux lateral pentru probele de tampon obţinute din nivelurile notate de infestare a ploşniţelor de pat. Probele de tampon au fost extrase în tampon de extracţie 3 care conţine 1X Tris-HCl (pH 7,6), 0,05 % NaN3, 0,25 % BSA şi 0,1 % Tween-20 şi diluţiile notate au fost aplicate pe benzile de testare. Figurile 16-17 arată murdărie şi reziduuri vizibile pentru mostrele mai puţin diluate în partea de jos a benzilor de testare asociate cu nivelurile mai ridicate de infestare a ploşniţelor de pat. Etichetarea benzilor şi interpretarea rezultatelor sunt cele descrise pentru Figurile 2-7.
Figurile 18A şi 18B sunt grafice bazate pe măsurători efectuate de cititorul de benzi de testare Axxin a probelor de tampon pentru nivelurile 2, 5 şi 8 extrase în tamponul 3. Etichetarea graficelor este aşa cum este descrisă pentru Figurile 8A şi 8B.
Figurile 19A şi 19B sunt grafice bazate pe măsurători efectuate de cititorul de benzi de testare Axxin care arată o comparaţie a rezultatelor pentru probele de tampon de nivel 8 extrase în tampoanele 1, 2 şi 3. Etichetarea graficelor este aşa cum este descrisă pentru Figurile 8A şi 8B.
Figura 20 este un grafic bazat pe măsurători efectuate de cititorul de benzi de testare Axxin pentru nouă replici ale tamponului de extracţie 1 ca martor negativ şi nouă replici fiecare dintre diluţiile 1/2048, 1/512 şi 1/128 pentru probe de tampon de nivel 7 extrase în tamponul 1. Axa x indică cele nouă replici prin număr de "probă"; axa y este cea descrisă pentru Figura 8A.
DESCRIERE DETALIATĂ
Aici sunt furnizaţi anticorpi monoclonali şi fragmente de legare la antigen ale acestora care se leagă la un antigen de ploşniţă, compoziţii şi truse care cuprind anticorpi şi fragmente de legare la antigen, hibridoame, celule izolate capabile să producă anticorpi şi fragmente de legare la antigen, metode de producere de anticorpi şi fragmente de legare la antigen şi metode de utilizare a anticorpilor şi fragmente de legare a antigenului în detectarea ploşniţelor de pat.
Terminologie
Aşa cum este utilizat aici, termenul "ploşniţă de pat" se referă la oricare specie Cimex sau tulpină a acesteia.
Termenii "anticorp" şi "anticorpi" sunt termeni din domeniu şi pot fi utilizaţi aici interschimbabil pentru a se referi la o moleculă sau molecule cu un situs de legare la antigen care leagă în mod specific un antigen.
Termenul "anticorp monoclonal" se referă la o populaţie omogenă de anticorpi implicată în recunoaşterea specifică şi legarea unui singur determinant antigenic, sau epitop. Acest lucru este în contrast cu anticorpii policlonali care includ în mod tipic anticorpi diferiţi direcţionaţi împotriva diferiţilor determinanţi antigenici. Mai mult, "anticorp monoclonal" se referă la astfel de anticorpi fabricaţi în orice număr de moduri, incluzând, dar fără a se limita la, prin hibridom, selecţie de fagi, expresie recombinată şi animale transgenice.
Termenul "fragment de legare la antigen" se referă la o porţiune a unui anticorp care este capabilă să se lege specific la un antigen. Exemplele de fragmente de anticorpi includ, dar nu se limitează la, fragmente de regiune variabilă de lanţ greu, fragmente de regiune variabilă de lanţ uşor, Fab, Fab', F(ab')2, fragmente scFv, fragmente Fv, anticorpi liniari, anticorpi cu lanţ unic, anticorpi multispecifici, minicorpi, diacorpi, triacorpi şi tetracorpi.
Termenii "regiune variabilă" sau "domeniu variabil" sunt termeni tehnici şi pot fi utilizaţi în mod interschimbabil aici pentru a se referi la o porţiune a unui anticorp care diferă mult ca secvenţă între anticorpi şi este utilizată în legarea şi specificitatea unui anumit anticorp pentru antigenul special al acestuia. Regiunile variabile ale lanţului greu şi uşor constau fiecare din patru regiuni cadru (FR) conectate prin trei regiuni de determinare a complementarităţii (CDR), cunoscute şi ca regiuni hipervariabile. CDR-urile din fiecare lanţ contribuie la formarea situsului de legare la antigen al anticorpilor.
Termenul "se leagă specific" se referă la molecule care se leagă la un antigen (de ex., epitop sau complex imun) ca o astfel de legare este înţeleasă de un specialist în domeniu. De exemplu, o moleculă care se leagă specific la un antigen se poate lega la alte peptide sau polipeptide, în general cu afinitate mai mică, determinată de: de ex., imunoteste, BIAcore®, instrument KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID) sau alte teste cunoscute în domeniu.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "detectare" cuprinde detectarea cantitativă şi calitativă.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "cantitate eficientă" se referă la cantitatea care realizează un efect dorit.
Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii "celulă gazdă" şi "celulă" pot fi utilizaţi interschimbabil şi se pot referi la orice tip de celulă, de ex., o celulă primară, o celulă în cultură sau o celulă dintr-o linie celulară, incluzând un hibridom.
Un anticorp, un fragment de legare la antigen, o celulă gazdă şi o celulă la care se face referire aici include forme "izolate" care au fost separate sau recuperate dintr-o componentă a mediului lor nativ, cum ar fi separarea sau îndepărtarea de contaminanţi care ar interfera cu utilizările anticorp, fragment de legare la antigen, celulă gazdă sau celulă, în care astfel de contaminanţi pot include enzime, hormoni şi alte materiale proteice sau neproteice.
Anticorpi monoclonali, compoziţii, truse, hibridoame, polipeptide, polinucleotide, vectori, celule şi metode de producere
Prezenta invenţie se referă la un anticorp monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la American Type Culture Collection (ATCC) cu numărul de acces PTA-122644, sau un fragment de legare la antigen al acestuia. Anticorpul monoclonal anti-insectă de pat desemnat aici ca BB2 este produs de hibridomul depus la ATCC cu numărul de acces PTA-122644.
Prezenta invenţie se referă la un anticorp monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de Acces PTA-122645, sau un fragment al acestuia de legare la antigen. Anticorpul monoclonal anti-insectă de pat desemnat aici ca BB7 este produs de hibridomul depus la ATCC cu numărul de acces PTA-122645.
Aici sunt dezvăluite un anticorp monoclonal sau un fragment de legare la antigen al acestuia care cuprinde regiunile de determinare a complementarităţii lanţului greu şi lanţului uşor (CDR) ale anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7] (vezi, de ex., discuţia despre CDR-uri în Kabat şi colab., Departamentul de Sănătate şi Servicii Umane din SUA, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983), şi Chothia şi colab., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Metodele pentru determinarea CDR-urilor sunt binecunoscute, inclusiv o abordare bazată pe variabilitatea secvenţei între specii (adică, Kabat şi colab. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (ed. a 5-a, 1991, National Institutes of Health, Bethesda, MD)), şi o abordare bazată pe studii cristalografice ale complecşilor antigen-anticorp (Al-lazikani şi colab., J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)). În plus, combinaţiile acestor două abordări pot fi utilizate pentru a determina CDR-urile. De asemenea, CDR-urile pot fi determinate în conformitate Lefranc M-P şi colab., The Immunologist 7: 132-136 (1999); Lefranc M-P, şi colab., Nucleic Acids Res 27: 209-212 (1999); MacCallum RM şi colab., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996); Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", în Antibody Engineering, Kontermann and Dübel, ed., Capitolul 31, p. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001); şi software-ul de modelare a anticorpilor AbM de la Oxford Molecular (Oxford Molecular Group, Inc.).
În anumite aspecte ale dezvăluirii, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde regiunile variabile ale lanţului greu şi uşor ale anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de Acces PTA-122645 [BB7]. În general, o regiune variabilă este situată la aproximativ 110 până la 120 de aminoacizi amino-terminali în lanţul greu matur şi aproximativ 90 până la 115 aminoacizi în lanţul uşor matur.
În anumite aspecte ale dezvăluirii, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde lanţurile grele şi uşoare ale anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. Fiecare lanţ greu cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu şi o regiune constantă a lanţului greu. Regiunea constantă a lanţului greu cuprinde trei domenii, CH1, CH2 şi CH3. Fiecare lanţ uşor cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor şi o regiune constantă a lanţului uşor. Regiunea constantă a lanţului uşor cuprinde un domeniu (CL1).
Anticorpii monoclonali ai dezvăluirii pot include, dar nu se limitează la, anticorpi produşi recombinant, anticorpi umani, anticorpi umanizaţi, anticorpi himerici, anticorpi multispecifici, cum ar fi anticorpi bispecifici, proteine de fuziune care cuprind o porţiune de determinare a antigenului unui anticorp şi orice alte modificări de moleculă de imunoglobulină cuprinzând un situs de recunoaştere a antigenului atâta timp cât anticorpii prezintă activitatea dorită. Anticorpii pot fi de orice tip (de ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA sau IgY), orice clasă (de ex., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, sau IgA2), sau orice subclasă (de ex., IgG2a sau IgG2b) a moleculei de imunoglobulină. Tehnicile pentru producerea de anticorpi vor fi evidente pentru un specialist în domeniu.
Anticorpii monoclonali pot fi preparaţi, de exemplu, folosind metode de hibridome, cum ar fi cele descrise de Kohler şi Milstein, Nature 256:495 (1975). Folosind metoda hibridomului, un şoarece, hamster sau alt animal gazdă adecvat este imunizat pentru a provoca producerea de către limfocite a anticorpilor care se vor lega în mod specific la un antigen de imunizare. Limfocitele pot fi, de asemenea, imunizate in vitro. După imunizare, limfocitele sunt izolate şi fuzionate cu o linie celulară de mielom adecvată utilizând, de exemplu, polietilenglicol, pentru a forma celule de hibridom care pot fi apoi selectate din limfocitele nefuzionate şi celulele de mielom.
Anticorpii monoclonali pot fi, de asemenea, fabricaţi folosind metode de ADN recombinant aşa cum este descris în brevetul U.S. 4.816.567. Polinucleotidele care codifică un anticorp monoclonal sunt izolate din celule B mature sau celule hibridom, cum ar fi prin RT-PCR utilizând primeri oligonucleotidici care amplifică în mod specific genele care codifică lanţurile grele şi uşoare ale anticorpului, iar secvenţa lor este determinată folosind proceduri convenţionale. Polinucleotidele izolate care codifică lanţurile grele şi uşoare sunt apoi clonate în vectori de expresie adecvaţi, care permit generarea de anticorpi monoclonali atunci când sunt transfectate în celule gazdă, incluzând, dar fără a se limita la, celule de E. coli, celule COS simiene, celule ovariene de hamster chinezesc (CHO) sau celule de mielom. De asemenea, anticorpii monoclonali recombinanţi sau fragmente ale acestora din speciile dorite pot fi izolaţi din bibliotecile de prezentare a fagilor care exprimă CDR-urile speciilor dorite (vezi, de ex., McCafferty şi colab., Nature 348:552-554 (1990); Clackson şi colab., Nature 352:624-628 (1991); şi Marks şi colab., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)).
Fragmentele de legare la antigen ale invenţiei pot fi produse prin orice metodă cunoscută şi includ o porţiune dintr-un anticorp care este capabil să se lege în mod specific la un antigen. Exemplele de fragmente de anticorpi includ, dar nu se limitează la, fragmente de regiune variabilă de lanţ greu, fragmente de regiune variabilă de lanţ uşor, Fab, Fab', F(ab')2, fragmente scFv, fragmente Fv, anticorpi liniari, anticorpi cu un singur lanţ, anticorpi multispecifici, minicorpi, diacorpi, triacorpi şi tetracorpi (vezi, de ex., Hudson şi Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003) şi brevetul U.S. 5.641.870). În mod tradiţional, aceste fragmente sunt derivate prin digestia proteolitică a anticorpilor intacţi (vezi, de ex., Morimoto şi colab., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1993)); Brennan şi colab., Science 229:81 (1985)). În anumite variante de realizare, fragmentele de anticorpi sunt produse recombinant. De exemplu, fragmentele de anticorpi pot fi exprimate în şi secretate din E coli sau alte celule gazdă, permiţând astfel producerea unor cantităţi mari de fragmente. Astfel de fragmente de anticorpi pot fi, de asemenea, izolate din bibliotecile de de anticorpi fagi. Alte tehnici pentru producerea de fragmente de anticorpi vor fi evidente pentru specialistul în domeniu.
În anumite variante de realizare, oricare dintre anticorpii menţionaţi mai sus sau fragmentele acestora de legare la antigen este capabil să se lege la un antigen de ploşniţe de pat într-un lizat de ploşniţe întregi sau un extract de hârtie de colectare care cuprinde material rezidual de ploşniţe de pat. Metodele de producere a lizatelor de ploşniţe întregi şi a extractelor de hârtie de colectare cuprinzând deşeuri de ploşniţe de pat vor fi evidente pentru specialistul în domeniu, pe baza tehnicilor de extracţie cunoscute şi a metodelor dezvăluite în Exemplul 1. Ploşniţele întregi includ nimfe, masculii şi/sau femelele pot fi obţinute dintr-o zonă de infestare sau dintr-o colonie de ploşniţe de pat menţinută experimental sau comercial şi pot include orice specii Cimex sau tulpini, inclusiv, dar fără a se limita la, Cimex lectularius şi tulpina Harlan. Hârtia de colectare care cuprinde deşeurile de ploşniţe de pat poate include excremente de ploşniţe şi/sau ţesuturi, de exemplu, şi poate fi obţinută din surse comerciale, aşa cum s-a discutat în Exemplul 1.
De asemenea, aici este dezvăluit un mutant al anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC cu numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau de anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. Mutanţii pot conţine, de exemplu, mutaţii de substituţie conservatoare, adică substituţia unuia sau mai multor aminoacizi cu aminoacizi similari. De exemplu, substituţia conservatoare se referă la înlocuirea unui aminoacid cu altul din aceeaşi clasă generală, cum ar fi, de exemplu, un aminoacid acid cu un alt aminoacid acid, un aminoacid bazic cu un alt aminoacid bazic sau un aminoacid neutru, de un alt aminoacid neutru. Ceea ce se intenţionează printr-o substituţie conservatoare a aminoacizilor este bine cunoscut în domeniu. Mutaţiile pot include, de asemenea, ştergeri, inserţii, inversări şi repetări. Mutaţiile pot fi introduse prin metode de biologie moleculară generală cunoscute în domeniu, incluzând, dar fără a se limita la, PCR predispusă la erori, mutageneza direcţionată pe oligonucleotide, mutageneza direcţionată pe situs şi amestecarea lanţului greu sau uşor.
De asemenea, aici este dezvăluit un anticorp monoclonal sau un fragment de legare la antigen al acestuia având una sau mai multe caracteristici care sunt în mod substanţial similare cu cele ale anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de către hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. Expresia "substanţial similară" aşa cum este utilizată aici denotă un grad suficient de mare de similitudine între două caracteristici, astfel încât un specialist în domeniu ar considera diferenţa ca fiind mică sau deloc semnificativă biologic şi/sau statistic. În anumite variante de realizare, diferenţa dintre două valori numerice poate fi mai mică de aproximativ 15%, 10%, 5%, 2% sau 1%. Caracteristicile anticorpilor depuşi pot include una sau mai multe proprietăţi, cum ar fi, dar fără a se limita la, specificitatea de legare (de ex., valoarea Kd), determinanţi/epitopi antigenici şi secvenţe de polinucleotide sau polipeptide. În anumite aspecte ale dezvăluirii, anticorpul monoclonal sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are o secvenţă de polinucleotidă sau polipeptidă care este de cel puţin 90%-99%, cel puţin 95%-99%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identică cu secvenţa polinucleotidică sau polipeptidică a anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. În anumite aspecte ale dezvăluirii, anticorpul monoclonal sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are una sau mai multe dintre aceleaşi caracteristici ca şi anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de către hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. În anumite aspecte ale dezvăluirii, anticorpul monoclonal sau fragmentul de legare la antigen al acestuia se leagă la acelaşi determinant/epitop antigenic ca şi anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC cu numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de către hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7].
Termenul "epitop" sau "determinant antigenic" poate fi utilizat aici în mod interschimbabil pentru a se referi la acea porţiune a unui antigen capabilă să fie recunoscută şi legată în mod specific de un anumit anticorp. Un epitop include de obicei cel puţin 3, şi mai uzual, cel puţin 5 sau 8-10 aminoacizi într-o conformaţie spaţială unică. Un epitop poate fi, de exemplu, din aminoacizi contigui ai unei polipeptide (epitop liniar sau contiguu) sau un epitop poate, de exemplu, să vină împreună din două sau mai multe regiuni necontigue ale unei polipeptide sau polipeptide (conformaţionale, neliniare, epitop discontinuu sau necontiguu). Epitopul la care se leagă la un anticorp poate fi determinat, de ex., prin spectroscopie RMN, studii de cristalografie cu difracţie de raze X, teste ELISA, schimb hidrogen/deuteriu cuplat cu spectrometrie de masă (de ex., spectrometrie de masă cu electrospray prin cromatografie lichidă), teste de scanare a oligo-peptidelor bazate pe matrice şi/sau cartografiere a mutagenezei (de ex., cartografierea mutagenezei dirijate pe situs). Pentru cristalografia cu raze X, cristalizarea poate fi realizată folosind oricare dintre metodele cunoscute în domeniu (de ex., Giegé R şi colab., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Anticorp: cristalele de antigen pot fi studiate folosind tehnici bine cunoscute de difracţie cu raze X şi pot fi rafinate folosind software de calculator precum X-PLOR (Yale University, 1992, distribuit de Molecular Simulations, Inc.; vedea, de exemplu., Meth Enzymol (1985) volumele 114 şi 115, eds Wyckoff HW şi colab.; U.S. 2004/0014194), şi BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P şi colab., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Studiile de cartografiere a mutagenezei pot fi realizate folosind orice metodă cunoscută unui specialist în domeniu. Vezi, de ex., Champe M şi colab., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 şi Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 pentru o descriere a tehnicilor de mutageneză, inclusiv tehnicile de mutageneză cu scanare al alaninei.
Prezenta invenţie este direcţionată la un anticorp monoclonal conjugat sau un fragment conjugat de legare la antigen care cuprinde oricare dintre anticorpii monoclonali anti-insecte de pat sau fragmentele de legare la antigen ale invenţiei şi un agent de detectare. Agentul de detectare poate fi conjugat direct sau indirect cu anticorpul monoclonal anti-insectă de pat sau cu fragmentul de legare la antigen. Agentul de detectare poate fi detectabil de la sine sau, în cazul unei etichete enzimatice, poate cataliza alterarea chimică a unui compus sau compoziţie de substrat care este detectabilă. Agentul de detectare include, dar nu este limitat la, un radiomarcator, un fluorofor, un cromofor, un agent de imagistică sau un metal, incluzând un ion metalic. În anumite variante de realizare, agentul de detectare este aur coloidal sau nanoparticule de aur. În anumite variante de realizare, aurul coloidal sau nanoparticulele de aur sunt compuse din particule de aur având o dimensiune de 1-300 nm, 1-250 nm, 10-200 nm, 20-150 nm, 20-100 nm, 20-80 nm, 20-60 nm, 20-50 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, sau 300 nm. În anumite variante de realizare, anticorpul conjugat sau fragmentul de legare la antigenul conjugat cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2], sau un fragment de legare la antigen al acestuia, sau anticorpul monoclonal de insecte de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de Acces PTA-122645 [BB7], sau un fragment al acestuia de legare la antigen.
Prezenta invenţie se referă la o compoziţie care cuprinde oricare dintre anticorpii monoclonali anti-insecte de pat sau fragmente ale acestora de legare la antigen, sau anticorpi conjugaţi sau fragmente conjugate de legare la antigen ale invenţiei, sau o combinaţie a acestora. În anumite variante de realizare, compoziţia cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Număr de acces PTA-122644 [BB2] şi anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Număr de acces PTA-122645 [BB7]. În anumite variante de realizare, compoziţia cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de Acces PTA-122644 [BB2] şi un anticorp conjugat care cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7] şi un agent de detectare. În anumite variante de realizare, compoziţia cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de Acces PTA-122645 [BB7] şi un anticorp conjugat care cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] şi un agent de detectare.
Prezenta invenţie se referă la o trusă care cuprinde oricare dintre anticorpii monoclonali anti-insecte de pat sau fragmente ale acestora de legare la antigen, anticorpi conjugaţi sau fragmente conjugate de legare la antigen, sau compoziţii ale invenţiei sau o combinaţie a acestora. În anumite variante de realizare, o trusă cuprinde cel puţin o componentă într-unul sau mai multe containere. În unele variante de realizare, trusa cuprinde componente necesare şi/sau suficiente pentru a efectua un test de detectare, inclusiv controale, instrucţiuni pentru efectuarea testelor, orice dispozitiv necesar şi/sau software pentru analiza şi prezentarea rezultatelor. Dispozitivele adecvate includ cele dezvăluite în aplicaţia din S.U.A. publicată ca US20170115301 on April 27, 2017, intitulat "Bed Bugs Detection Device", şi cererea neprovizorie din S.U.A. şi cererea internaţională PCT a acesteia depuse la 21 octombrie 2016, precum şi Brevetul U.S. Nr. 7.220.597 şi 7.214.542.
Prezenta invenţie se referă la un hibridom capabil să producă un anticorp monoclonal anti-insectă de pat, în care hibridomul este depus la ATCC cu numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau în care hibridomul este depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7].
Este dezvăluită aici o polipeptidă izolată care cuprinde o secvenţă de aminoacizi cel puţin 90%-99%, cel puţin 95%-99%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%. % sau cel puţin 99% identică cu o secvenţă de aminoacizi a unei regiuni variabile a lanţului greu sau uşor, sau a unui lanţ greu sau uşor, a anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorp produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. În anumite aspecte ale dezvăluirii, polipeptida cuprinde secvenţele de aminoacizi ale CDR-urilor unei regiuni variabile de lanţ greu sau uşor a anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. În anumite aspecte ale dezvăluirii, polipeptida cuprinde secvenţele de aminoacizi ale regiunii variabile ale lanţului greu sau uşor, sau ale lanţului greu sau uşor ale anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7].
Aici este dezvăluită o polinucleotidă izolată care cuprinde o secvenţă de acizi nucleici cel puţin 90%-99%, cel puţin 95%-99%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%. % sau cel puţin 99% identică cu o secvenţă de acid nucleic care codifică o regiune variabilă a lanţului greu sau uşor, sau un lanţ greu sau uşor, a anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorp produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. În anumite aspecte ale dezvăluirii, polinucleotida cuprinde secvenţe de acizi nucleici care codifică CDR-urile unei regiuni variabile de lanţ greu sau uşor a anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de către hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7]. În anumite aspecte ale dezvăluirii, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică regiunea variabilă a lanţului greu sau uşor, sau lanţul greu sau uşor al anticorpului produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau anticorpul produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7].
Aici este dezvăluit un vector care cuprinde una sau mai multe dintre polinucleotidele izolate ale dezvăluirii. În anumite aspecte ale dezvăluirii, vectorul este un vector de expresie.
Prezenta invenţie se referă la o celulă izolată care produce un anticorp monoclonal anti-insectă de pat sau un fragment de legare la antigen al invenţiei. În anumite variante de realizare, celula este un hibridom. În anumite aspecte ale dezvăluirii, celula cuprinde unul sau mai mulţi vectori ai dezvăluirii. În anumite aspecte ale dezvăluirii, celula cuprinde una sau mai multe polinucleotide ale dezvăluirii.
Prezenta invenţie este direcţionată la o metodă de producere a unui anticorp monoclonal anti-ploşniţă de pat sau a unui fragment de legare a antigenului conform invenţiei, cuprinzând cultivarea unei celule izolate care produce anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat sau fragmentul de legare la antigen şi izolarea anticorpului sau fragmentului de legare a antigenului din celula cultivată.
Celulele includ, dar nu sunt limitate la, hibridoame, procariote, drojdie, insecte sau celule eucariote superioare. Hibridoamele care produc anticorpi monoclonali pot fi propagate fie cultură in vitro folosind metode standard (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) sau in vivo ca tumori ascitice la un animal. Procariotele includ organisme gram negative sau gram pozitive, de exemplu E coli sau bacili. Celulele eucariote superioare includ, dar nu sunt limitate la, linii celulare stabilite de origine mamiferă. Exemplele de linii celulare de mamifere adecvate includ linii celulare COS-7, L, C127, 3T3, ovar de hamster chinezesc (CHO), HeLa şi BHK. În anumite variante de realizare, oricare dintre anticorpii monoclonali anti-insecte de pat sau fragmentele de legare la antigen ale invenţiei sunt produse de celule izolate după transfecţia celulelor cu vectori care cuprind polinucleotide care codifică secvenţele anticorpilor monoclonali anti-insecte de pat sau fragmentele de legare la antigen ale invenţiei. Vectorii adecvaţi de clonare şi expresie pentru utilizare cu gazde celulare bacteriene, fungice, drojdie şi mamifere sunt descrişi de Pouwels şi colab. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985). Vectorii de expresie de la mamifere pot cuprinde elemente netranscrise, cum ar fi o origine de replicare, un promotor şi un amplificator adecvat legat de gena care urmează să fie exprimată şi alte secvenţe netranscrise 5' sau 3' de flancare şi secvenţe netranlatate 5' sau 3', cum ar fi situsuri necesare de legare a ribozomilor, un situs de poliadenilare, situsuri donor şi acceptor de îmbinare şi secvenţe de terminare a transcripţiei. Sistemele de baculovirus pentru producerea de proteine heterologe în celulele de insecte sunt revizuite de Luckow şi Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Anticorpii monoclonali anti-insecte de pat sau fragmentele de legare la antigen ale invenţiei pot fi izolaţi din celule sau mediul de cultură sau din fluidul de ascită pentru propagarea in vivo a hibridoamelor. Izolarea anticorpilor monoclonali anti-insecte de pat sau a fragmentelor de legare la antigen poate fi conform oricărei metode adecvate. Astfel de metode standard includ cromatografia (de ex., cromatografia pe coloană cu schimb de ioni, de afinitate şi după dimensiune), centrifugare, solubilitate diferenţială sau prin orice altă tehnică standard pentru purificarea proteinelor. Metodele cunoscute în domeniu pentru purificarea anticorpilor şi a altor proteine includ, de exemplu, cele descrise în publicaţiile de brevet U.S. Nr. 2008/0312425, 2008/0177048, şi 2009/0187005.
Metode de detectare a ploşniţelor de pat
Prezenta invenţie este direcţionată la o metodă de detectare a ploşniţelor de pat, care cuprinde punerea în contact a unei probe care cuprinde un antigen de ploşniţă de pat cu oricare dintre anticorpii monoclonali anti-ploşniţe, fragmente de legare la antigen, anticorpi conjugaţi sau fragmente de legare la antigen conjugat sau compoziţii din invenţie, sau o combinaţie a acestora, şi detectarea legării antigenului de ploşniţă de pat la anticorpul monoclonal anti-insectă de pat sau fragmentul de legare la antigen, anticorpul conjugat sau fragmentul de legare la antigenul conjugat, compoziţia sau combinaţia acestora. "O probă" include, dar nu se limitează la, ploşniţe întregi, părţi de ploşniţe de pat, deşeuri de ploşniţe de pat, lizate sau extracte ale acestora, extrase de hârtie de colectare care cuprind deşeuri de ploşniţe de pat şi fluide care le conţin.
Contactarea poate fi prin orice metodă adecvată. În anumite variante de realizare, punerea în contact se face prin aplicarea unei probe care cuprinde antigenul de ploşniţă de pat la un anticorp monoclonal anti-insectă de pat, fragment de legare a antigenului, anticorp conjugat sau fragment de legare a antigenului conjugat sau compoziţie conform invenţiei sau o combinaţie a acestora care este imobilizată sau situată în alt mod pe o suprafaţă. Orice suprafaţă acceptabilă poate fi utilizată, după cum va fi apreciat de către specialistul în domeniu, incluzând, dar fără a se limita la, o membrană de nitroceluloză sau un tampon compus dintr-un material adecvat, şi poate include un tip sandwich, godeu sau cu curgere laterală. În anumite variante de realizare, proba este pusă în contact cu un anticorp monoclonal anti-insecte de pat conform invenţiei şi un anticorp conjugat conform invenţiei. În anumite variante de realizare, anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat este produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122644 [BB2], iar anticorpul conjugat cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7] şi un agent de detectare. În anumite variante de realizare, anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat este produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122645 [BB7], iar anticorpul conjugat cuprinde anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] şi un agent de detectare. În anumite variante de realizare, punerea în contact mai cuprinde punerea în contact a anticorpului monoclonal anti-insectă de pat, a fragmentului de legare a antigenului, a anticorpului conjugat sau a fragmentului de legare a antigenului conjugat sau a compoziţiei conform invenţiei sau a unei combinaţii a acestora cu o probă martor pentru comparare cu proba de testare.
Detectarea poate fi prin orice metodă adecvată şi poate include detectarea cantitativă sau calitativă. Astfel de metode includ, dar nu se limitează la, teste de legare a antigenului care sunt bine cunoscute în domeniu, cum ar fi testele cu flux lateral, radioimunotestele, ELISA (testul imunosorbent legat de enzime), imunotestele "sandwich", testele de imunoprecipitare, imunotestele fluorescente, imunotestele cu proteina A şi imunohistochimia (IHC). Detectarea poate include analiza vizuală a unei reacţii colorimetrice, fluorescente sau luminiscente, de exemplu, sau poate include utilizarea unui dispozitiv care măsoară astfel de reacţii. Dispozitivele adecvate le includ pe cele dezvăluite în aplicaţia din S.U.A. publicată ca US20170115301 în 27 aprilie, 2017, intitulat "Bed Bugs Detection Device", şi cererea neprovizorie din S.U.A. şi cererea internaţională PCT a acesteia depuse la 21 octombrie 2016, precum şi brevetele U.S. Nr. 7.220.597 şi 7.214.542. În anumite variante de realizare, detectarea cuprinde efectuarea unui test de curgere laterală. În anumite variante de realizare, detectarea are loc în 1-20 minute, 1-15 minute, 1-10 minute, 1-5 minute, 20 minute sau mai puţin, 15 minute sau mai puţin, 10 minute sau mai puţin, 5 minute sau mai puţin, în 20 de minute, în 15 minute, în 10 minute sau în 5 minute.
Cantitatea de anticorp monoclonal anti-insectă de pat, fragment de legare a antigenului, anticorp conjugat sau fragment de legare a antigenului, compoziţia conform invenţiei sau o combinaţie a acestora poate include orice cantitate eficientă, care va fi evidentă pentru un practicant calificat pe baza metodelor de detectare cunoscute şi metodelor dezvăluite în exemple. Proba poate fi diluată sau nediluată.
În anumite variante de realizare, metoda mai cuprinde colectarea unei probe care cuprinde antigenul de ploşniţă cu un dispozitiv de colectare şi extragerea antigenelor din probă. Eşantionul poate fi colectat de pe orice suprafaţă asociată cu infestarea ploşniţelor de pat, inclusiv, dar fără a se limita la, lenjerie de pat, saltele, tapiţerie, carpete, covoare şi mobilier. Dispozitivul de colectare poate fi orice dispozitiv adecvat, incluzând, dar fără a se limita la un tampon, cum ar fi un tampon de bumbac, un aspirant sau orice material care poate fi utilizat pentru colectarea reziduurilor, inclusiv, dar fără a se limita la, un şerveţel, ţesătură sau prosoape. În anumite variante de realizare, dispozitivul de colectare este un tampon. În anumite variante de realizare, extragerea antigenelor din probă cuprinde solubilizarea antigenelor în probă cu un tampon de extracţie. Tampoanele de extracţie adecvate vor fi evidente pentru specialistul în domeniu, având în vedere tampoanele de extracţie bine-cunoscute şi cele dezvăluite în exemple.
EXEMPLE
Exemplele din această secţiune sunt oferite cu titlu de ilustrare şi nu cu titlu de limitare.
Exemplul 1: Generarea de anticorpi monoclonali anti-ploşniţe de pat
Şoarecii au fost imunizaţi cu lizate întregi de ploşniţe şi extracte de hârtie de ploşniţe de pat (adică, extracte din hârtie de colectare a ploşniţelor de pat care conţine material rezidual dintr-o colonie de ploşniţe).
Lizate de ploşniţe de pat întregi au fost produse de la nimfe, masculi şi femele dintr-o colonie de ploşniţe (tulpina Harlan, i2LResearch USA Inc., Baltimore, Maryland, SUA) care au fost congelate şi triturate în soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) 1X. Lizatele au fost clarificate cu un filtru seringă de 0,45 microni. Concentraţia de proteine a fost determinată printr-un test standard al proteinei Bradford. Extractele clarificate, cuantificate au fost împărţite alicote în tuburi Eppendorf de 1,5 ml şi depozitate la -80 °C.
Hârtia de colectare a ploşniţelor de pat (i2LResearch USA Inc., Baltimore, Maryland, SUA) a fost tăiată în bucăţi de aproximativ 1 cm2 şi plasate în tuburi de centrifugă din plastic de 2 ml. Extracţia a fost efectuată prin adăugarea a 1,0 ml de 50 mM PBS (pH 7,4) şi amestecarea tuburilor timp de 30 de minute pe un balansoar tub. După 30 de minute, extractul a fost extras complet prin trecerea amestecului printr-o seringă de 5 ml. Acest extract colectat a fost apoi utilizat pentru a obţine mai mult extract din hârtie de colectare proaspătă prin adăugarea în serie a extractului la hârtia nou tăiată şi repetarea procesului. Extractul final a fost apoi centrifugat la 12.000 rpm timp de 10 minute pentru a îndepărta particulele. Supernatantul a fost îndepărtat şi reţinut, şi materialul granulat a fost aruncat. Concentraţia de proteină a supernatantului a fost determinată prin testul Bradford ca fiind de 0,6 mg/ml. Soluţia finală (adică "extract de hârtie de ploşniţă") a fost depozitată la -20 °C.
Patru şoareci Balb/c în vârstă de 4-5 săptămâni (Harlan Laboratories, Inc., Indianapolis, Indiana, SUA) au fost imunizaţi subcutanat în spate cu 50 µg lizat întreg de ploşniţe amestecat cu 100 µl de adjuvant. Adjuvantul utilizat pentru doi dintre şoareci a fost un adjuvant tradiţional (Freund's Adjuvant, Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, Missouri, SUA), iar adjuvantul utilizat pentru cei doi şoareci rămaşi a fost un adjuvant solubil în apă (ImmuQuik®, KCH Scientific, San Jose, California, SUA).
În ziua 14 după imunizarea iniţială, şoarecii imunizaţi au fost stimulaţi cu 50 µg lizat întreg de ploşniţe amestecat cu 100 µl de adjuvant aşa cum a fost utilizat iniţial pentru fiecare şoarece. În ziua 37, serurile de la şoareci au fost testate la titru folosind un imunotest enzimatic standard, folosind anticorpi conjugaţi cu peroxidază de hrean de capră anti-şoarece ca anticorp secundar/conjugat de enzimă şi 3,3',5,5'-tetrametilbenzidină ca substrat cromogen şi 10 µg/ml lizat întreg de ploşniţe de pat ca sursă de antigen. Cei doi şoareci imunizaţi cu lizat întreg de ploşniţe de pat în adjuvantul solubil în apă au produs titruri mai mari. Cu toate acestea, deoarece titrurile nu au fost puternice în general, toţi cei patru şoareci imunizaţi au fost stimulaţi cu o cantitate dublă de lizat de ploşniţe de pat (adică, 100 µg) în ziua 51 şi apoi din nou în ziua 78. În ziua 107, cei patru şoareci au fost stimulaţi cu 15 µl de extract de hârtie de ploşniţă. În ziua 117, şoarecele cu cel mai mare titru anterior a fost testat la titru folosind lizat întreg de ploşniţe sau extract de hârtie de ploşniţă ca sursă de antigen. S-a observat o reacţie slabă pentru extractul de hârtie de ploşniţe de pat. În ziua 134, toţi cei patru şoareci au fost stimulaţi cu 100 µl de extract de hârtie de ploşniţă de pat folosind ImmuQuik® ca adjuvant. În ziua 151, şoarecii au fost testaţi la titru folosind extract de hârtie de ploşniţă de pat ca sursă de antigen, şi şoarecele cu cel mai mare titru a fost stimulat cu 100 µl extract de hârtie de ploşniţă de pat.
Celulele splinei au fost colectate de la cei doi şoareci cu cel mai mare titru, unul în Ziua 154 şi celălalt în Ziua 216 şi au fost fuzionate cu celule de mielom murin SP 2/0 utilizând polietilenglicol. Celulele fuzionate au fost cultivate în mediu de selecţie timp de 10 zile, urmate de screening cu extract de hârtie de ploşniţă de pat ca sursă de antigen. Aproximativ 41 de clone pozitive au fost identificate din screeningul primar şi aproximativ 25 de clone pozitive au fost confirmate în screeningul secundar. Au fost subclonate linii celulare stabile, au fost produse ascite pentru mai mult de 25 de clone şi anticorpii au fost purificaţi (de ex., în cantităţi de 2-5 mg). Doi anticorpi denumiţi aici anticorpi BB2 şi BB7 au fost determinaţi prin imunotest enzimatic pentru a avea o reacţie puternică cu extractul de hârtie de ploşniţă de pat în comparaţie cu anticorpii din alte clone şi au fost selectaţi pentru studii suplimentare. Hibridoamele producătoare de anticorpi BB2 şi BB7 au fost depuse în conformitate cu Tratatul de la Budapesta la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, la 8 octombrie 2015, şi au primit numărul de acces ATCC PTA-122644 şi Nr. de acces ATCC PTA-122645, respectiv.
Exemplul 2: Testul de captură sandwich a anticorpilor monoclonali anti-plojniţe de pat
Un test de captură tip sandwich a fost efectuat folosind anticorpul BB2 sau BB7 ca anticorp de captură şi fie BB2 conjugat cu aur, fie BB7 conjugat cu aur ca anticorp detector. Extractul de hârtie de ploşniţă de pat aşa cum este descris în Exemplul 1 a fost utilizat ca sursă de antigen de ploşniţă de pat. Un anticorp policlonal anti-ploşniţă de pat de iepure, aşa cum este descris în publicaţia U.S. Nr. 2015-0064727 a fost utilizat ca un anticorp de captură de control pozitiv şi PBS a fost utilizat ca un control negativ pentru antigen.
Anticorpii de captură la concentraţii de 2,0 mg/ml au fost observaţi sub formă de puncte de 0,3 µl pe benzi de hârtie de nitroceluloză. S-a adăugat extract de hârtie de ploşniţă de pat la benzile de testare şi a fost adăugat PBS la benzile de control negativ. Anticorpul BB2 conjugat cu aur (la pH 7 sau 9) sau anticorpul BB7 conjugat cu aur (la pH 9) a fost adăugat ca anticorp detector la benzi aşa cum este prezentat în FIG. 1. Benzile de control negativ au arătat o absenţă a legării de către anticorpii detectori. Benzile de testare au arătat colorarea roşie a punctelor de captură care a indicat legarea anticorpilor detector conjugaţi cu aur la antigenul de ploşniţă de pat imobilizat pe nitroceluloză de către anticorpii de captare. După cum este rezumat în Tabelul 1, s-au observat reacţii puternice cu utilizarea fie a anticorpului BB2, fie a anticorpului BB7 ca anticorp de captură. În contrast, s-au observat reacţii foarte slabe (adică "+") sau incerte (adică "+/-") cu utilizarea anticorpului policlonal anti-ploşniţă de pat de iepure ca anticorp de captură.
Tabelul 1: Intensităţi observate în testul de captare sandwich
Captură anticorp Anticorp detector conjugat cu aur (pH) Anticorp anti-ploşniţă de pat policlonală de iepure BB2 BB7 BB2 (7) + ++++ +++ BB2 (9) + +++ ++ BB7 (9) +/- ++++ +++
Exemplul 3: Imunotest cu flux lateral pentru a detecta antigenele ploşniţelor de pat
Un exemplu de imunotest cu flux lateral a fost conceput pentru a detecta antigenele ploşniţelor de pat din probele prelevate prin tamponarea zonelor cu diferite niveluri de infestare a ploşniţelor de pat. Tampoanele de extracţie au fost pregătite şi testate pentru extracţia eficientă a antigenului ploşniţei de pat din tampoane, flux adecvat pe benzile de testare cu nitroceluloză şi legare nespecifică scăzută până la deloc. Probele de tampon au fost extrase şi diluate în serie pentru a investiga sensibilitatea testului. Precizia testului a fost investigată prin testarea replicilor şi citirea intensităţilor semnalului folosind un cititor de benzi de testare.
Prepararea membranei de nitroceluloză: Membrane de nitroceluloză (CN 140, 25 mm, Sartorius Corp., Bohemia, New York, SUA) au fost pulverizate cu 1,0 mg/ml de anticorp BB7 anti-ploşniţă de pat ca linie de testare şi 0,5 mg/ml anticorp de capră anti-şoarece (Lampire Biological Laboratories, Pipersville, Pennsylvania, SUA) ca linie de control folosind un Biodot Air Jet (Biodot, Irvine, California, SUA) pentru striparea membranelor de nitroceluloză. Tamponul de stripare a fost 1X PBS, 0,2 % zaharoză, pH 7,4. Linia de testare şi linia de control au fost pulverizate la o distanţă de 7 mm, cu linia de testare situată la 10 mm de partea inferioară a membranei. Membranele au fost stropite la o rată de 1,0 µl/cm. Membranele au fost uscate la 37°C timp de 1 oră şi depozitate într-o pungă de folie uscată. Membranele stropite au fost ţinute uscate peste noapte înainte de blocare.
Blocarea membranei de nitroceluloză: După uscare peste noapte, membranele stripate au fost plasate într-o soluţie de blocare (25 mM KPO4, 0,2% cazeină, 0,5% acid boric, 0,02% zaharoză, 0,1% surfactant 10G, 0,5% PVA) cu orientarea liniei de testare în partea inferioară a nitrocelulozei şi a liniei de control pe partea superioară a nitrocelulozei. Soluţia de blocare a fost lăsată să treacă în partea de sus a membranei. Membranele au fost îndepărtate din soluţia de blocare şi plasate într-un suport pentru degete pentru a se usuca la 37°C timp de 1 oră. Membranele blocate au fost păstrate uscate într-o pungă de plastic şi depozitate într-o cameră uscată.
Conjugarea anticorpilor cu aur: O casetă de dializă Slide-A-Lyzer™ (limită a greutăţii moleculare de 10000, Thermo Fisher Scientific Inc., Carlsbad, California, SUA) a fost utilizată pentru a dializa anticorpul BB2 anti-ploşniţe peste noapte în 10 mM KPO4, pH 7,4. Concentraţia finală a anticorpului BB2 după dializare a fost de 0,875 mg/ml. O soluţie de aur coloidal care conţinea particule de 40 nm şi o densitate optică (OD) de 2,28 la 525 nm a fost ajustată la temperatura camerei la pH 8,6 cu 0,1 M K2CO3 proaspăt preparat. Anticorpul BB2 dializat a fost adăugat la soluţia de aur coloidal în timp ce se agita în vortex. Soluţia a fost incubată timp de 30 de minute pe un rotator la temperatura camerei. Conjugatul a fost blocat cu 10 µl (pentru fiecare 1 ml de aur coloidal OD 2) de tampon de blocare conjugat cu aur (25 mM KPO4, 0,2% Bioterge, 6% BSA, 0,3% zaharoză) pe un rotator la temperatura camerei timp de 10 minute. Conjugatul de aur a fost centrifugat la 12000 RPM, 4°C timp de 20 de minute şi supernatantul a fost aruncat. Peletul de conjugat a fost resuspendat cu 0,2 ml (pentru fiecare 1 ml de aur coloidal OD 2) tampon de resuspensie (diluţie 1:5 de tampon de blocare conjugat cu aur în 25 mM KPO4, 0,05% azidă de sodiu). OD-ul anticorpului BB2 conjugat cu aur a fost verificat folosind un spectrofotometru şi ajustat la 10. Anticorpul BB2 conjugat cu aur a fost depozitat la 4°C.
Prepararea tamponului conjugat de aur: S-a folosit o pipetă P-1000 pentru a satura tampoane conjugate din fibră de sticlă Ahlstrom 8950 de 300 mm (Ahlstrom, Helsinki, Finlanda) cu tampon de blocare (25 mM KPO4, 0,2% cazeină, 0,5% acid boric, 0,02% zaharoză, 0,1% surfactant 10G, 0,5% PVA). După 15 minute, tampoanele conjugate saturate au fost transferate pe un prosop de hârtie timp de un minut. Apoi, tampoanele conjugate au fost plasate pe un suport pentru degete pentru a se usuca la 37°C timp de 1 oră. Tampoanele conjugate blocate au fost introduse într-o pungă de plastic cu exicatoare şi depozitate într-o cameră uscată. Anticorpul BB2 conjugat cu aur OD10 a fost preparat prin adăugarea de 10% zaharoză şi 5% trehaloză la conjugat. Anticorpul conjugat cu aur a fost distribuit pe tampoanele conjugate printr-un striper automat (Matrix 160, Kinematic Automation, Inc., Twain Harte, California, SUA) la o rată de distribuire de 10 µl/cm. Tampoanele conjugate au fost uscate la 37°C timp de 1 oră, ambalate într-o pungă de folie uscată şi depozitate într-o cameră uscată.
Laminarea şi tăierea benzilor de testare: Membrana de nitroceluloză stripată cu anticorpul BB7 de test şi anticorpul de capră anti-şoarece de control a fost laminată pe un suport de vinil (G&L Precision Die Cutting, San Jose, California, SUA). Un tampon fitil (30250, EMI Specialty Papers, Redding, Connecticut, SUA) a fost plasat pe partea superioară a suportului, suprapunând membrana cu 2 mm. Un tampon de conjugat de 10 mm a fost suprapus pe membrană cu 2 mm. Un tampon de probă (surewick C048 tampon de celuloză, Millipore, Darmstadt, Germania) a fost plasat deasupra tamponului de conjugat cu o suprapunere de 15 mm din partea de jos a cardului de suport. Cardurile asamblate au fost tăiate în fâşii de 4 mm cu ajutorul unui cuţit (CM4000, Biodot, Irvine, California, SUA).
Extragerea tampoanelor de testare: Probele de tampon au fost obţinute de la locurile de testare cu diferite niveluri de infestare a ploşniţelor de pat, desemnate ca niveluri de 0, 2, 3, 4, 5, 7 şi 8, cu nivelul 0 având cel mai scăzut nivel (adică, fără ploşniţe) şi 8 cel mai înalt nivel. Tampoanele au fost extrase în 350 µl de tampon de extracţie timp de 15 minute la temperatura camerei într-un tub Eppendorf. Au fost testate trei soluţii tampon de extracţie: tampon de extracţie 1 conţine 1X Tris-HCI (pH 7,6), 0,05 % NaN3, 0,1 % BSA şi 0,1 % Tween-20; tamponul de extracţie 2 conţinea 1X Tris-HCI (pH 7,6), 0,05 % NaN3, 0,1 % BSA şi 0,2 % Tween-20; şi tamponul de extracţie 3 a conţinut 1X Tris-HCI (pH 7,6), 0,05 % NaN3, 0,25 % BSA şi 0,1 % Tween-20. Diluţiile în serie ale extractelor de tampon au fost efectuate de la 1/2 la 1/4096.
Metoda de testare a testului: 70 µl de tampon de extracţie (control negativ) sau probă de tampon de ploşniţă de pat în tampon de extracţie au fost pipetate pe tamponul de probă. Intensitatea liniei de testare a fost citită la 15 minute cu ochiul.
Rezultate tampon de extracţie 1: După cum se arată în FIG. 2-7, toate benzile au prezentat linii de control pozitive pentru legarea anticorpului de capră anti-şoarece la anticorpul BB2 conjugat cu aur. Toate benzile au arătat absenţa liniilor de testare pentru banda de control negativ în care s-a adăugat tampon de extracţie în loc de un tampon probă. FIG. 2 arată doar liniile de control pozitive pentru diluţiile probei de tampon de nivel 0, deoarece antigenul de ploşniţă nu a fost prezent. In FIG. 3-7, liniile de control pozitiv sunt liniile superioare şi orice linii de test care arată prezenţa antigenului de ploşniţă sunt sub liniile de control pozitiv. Murdărie sau particule insolubile din tampoane au fost prezente în apropierea fundului membranelor pentru benzile de testare de nivel 3, 5, 7 şi 8. Proba de tampon de nivel 2 (FIG. 3) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/16 la diluţia 1/2. Proba de tampon de nivel 3 (FIG. 4) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/128 la diluţia 1/2. Proba de tampon de nivel 4 (FIG. 5) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/1024 la diluţia 1/2. Proba de tampon de nivel 7 (FIG. 6) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/4096 la diluţia 1/2. Proba de tampon de nivel 8 (FIG. 7) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/2048 la diluţia 1/2. Deşi observate vizual, unele dintre liniile de testare notate nu sunt uşor evidente pentru anumite diluţii din FIG. 3-7 din cauza limitărilor fotografice. Toate liniile de testare au fost fără frotiuri. Intensitatea semnalului la diluţie 1/2 din tamponul de nivel 2 a fost aproximativ egală cu cea a diluţiei 1/32 din tamponul de nivel 3, diluţia 1/64 din tamponul de nivel 4, diluţia 1/1024 din tamponul 7 şi diluţia 1/512 din tamponul de nivel 8. Prin urmare, intensitatea semnalului vizibil la diluţie 1/2 din tamponul de nivel 2 a fost cea mai slabă, în comparaţie cu cea a diluţiei 1/2 de la nivelul tampoanelor 3, 4, 7 şi 8. Semnalul diluţiei 1/2 din tamponul de nivel 8 a fost cel mai puternic.
Intensităţile semnalului au fost, de asemenea, determinate folosind un cititor de benzi de testare Axxin (Axxin, Fairfield, Victoria, Australia) pentru a măsura zonele liniei de testare pentru diferite concentraţii (1/2048 până la 1/2) de nivel 0, 2, 3, 4, 7, şi 8 probe de tampon extrase în 350 µl de tampon 1. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2.
Tabelul 2: Suprafeţele liniei de testare din diferite concentraţii de probe de tampon (tampon 1)
Concentraţie Suprafeţele liniei de testare Nivel 8 Nivel 7 Nivel 4 Nivel 3 Nivel 2 Nivel 0 0 253 397 232 267 237 362 1/2048 654 1187 --- --- --- --- 1/1024 1013 1978 359 --- --- --- 1/512 1936 3291 443 336 297 --- 1/256 3388 5356 681 526 284 --- 1/128 5373 7348 990 526 285 --- 1/64 7662 10522 840 743 326 327 1/32 9341 11385 3024 1199 310 296 1/16 11420 12550 4609 2095 411 265 1/8 12066 8830 7500 3309 392 433 1/4 9793 7765 7980 6161 574 316 1/2 8693 6279 8550 8516 967 448
Pentru fiecare nivel, a fost obţinută o citire pentru tampon ca martor negativ (adică, concentraţia "0"). Citirea controlului negativ (Bo) a fost împărţită singură pentru a produce o valoare normalizată de 1. Citirea controlului negativ (Bo) a fost apoi împărţită la aria liniei de testare (B) pentru fiecare diluţie în nivel, unde valori mai mici sub 1 sugerează cantităţi mai mari de antigen de ploşniţă de pat şi valorile de peste 1 indică absenţa antigenului de ploşniţe de pat. Datele exprimate ca Bo/B sunt furnizate în Tabelul 3.
Tabelul 3: Bo/B calculat din suprafeţele liniei de testare din diferite concentraţii de probe de tampon (tampon 1)
Concentraţie BoB Nivel 8 Nivel 7 Nivel 4 Nivel 3 Nivel 2 Nivel 0 0 1 1 1 1 1 1 [1/2048] 0,3869 0,3345 --- --- --- --- [1/1024] 0,2498 0,2007 0,6462 --- --- --- [1/512] 0,1307 0,1206 0,5237 0,7946 0,798 --- [1/256] 0,0747 0,0741 0,3407 0,5076 0,8345 --- [1/128] 0,0471 0,054 0,2343 0,5076 0,8316 --- [1/64] 0,033 0,0377 0,2762 0,3594 0,727 1,107 [1/32] 0,0271 0,0349 0,0767 0,2227 0,7645 1,223 [1/16] 0,0222 0,0316 0,0503 0,1274 0,5766 1,366 [1/8] 0,021 0,045 0,0309 0,0807 0,6046 0,836 [1/4] 0,0258 0,0511 0,0291 0,0433 0,4129 1,146 [1/2] 0,0291 0,0632 0,0271 0,0314 0,2451 0,808
Tabelele 2-3 şi FIG. 8A arată, în general, că valorile măsurate ale concentraţiilor din tampoanele de nivelul 8 (corespunzând celui mai mare nivel de infestare a ploşniţelor de pat) au fost cele mai mari, iar valorile concentraţiilor de la tampoanele de nivel 2 (corespunzând celui mai mic nivel de infestare a ploşniţelor de pat) au fost cele mai scăzute. Tabelul 2 şi FIG. 8B arată că tampoanele de nivel 8 au produs intensităţi de semnal mai bune decât tampoanele de nivel 2 şi 4. Tabelul 3 sugerează că tampoanele de nivelul 8 au conţinut mai mult antigen de ploşniţe de pat decât alte niveluri.
Rezultate tampon de extracţie 2: După cum se arată în FIG. 9-11, toate benzile au arătat linii de control pozitive pentru legarea anticorpului de capră anti-şoarece la anticorpul BB2 conjugat cu aur. Toate benzile au arătat absenţa liniilor de testare pentru banda de control negativ în care s-a adăugat tampon de extracţie în loc de o probă de tampon. In FIG. 9-11, liniile de control pozitiv sunt liniile superioare şi orice linii de test care arată prezenţa antigenului de ploşniţă de pat sunt sub liniile de control pozitiv. Murdărie sau particule insolubile din tampoane au fost prezente în apropierea fundului membranelor pentru benzile de testare de nivel 4, 5 şi 8. Proba de tampon de nivel 4 (FIG. 9) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/512 la diluţia 1/2. Probele de tampon de nivel 5 şi 8 (FIG. 10 şi, respectiv, 11) au avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/1024 la diluţia 1/2. Deşi observate vizual, unele dintre liniile de testare notate nu sunt uşor evidente pentru anumite diluţii din FIG. 9-11 din cauza limitărilor fotografice. Toate liniile de testare au fost mânjite. Intensitatea semnalului diluţiei 1/16 din tamponul de nivel 4 a fost aproximativ egală cu cea a diluţiei 1/64 din tamponul de nivel 5 şi 8. Intensitatea semnalului a fost cea mai slabă pentru tamponul de nivel 4 şi similară între tampoanele de nivel 5 şi 8.
Intensităţile semnalului au fost, de asemenea, determinate folosind un cititor de benzi de testare Axxin (Axxin, Fairfield, Victoria, Australia) pentru a măsura zonele liniei de testare pentru diferite concentraţii (1/2048 până la 1/2) ale probelor de tampon de nivel 4, 5 şi 8 extrase în 350 µl de tampon 2. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 4.
Tabelul 4: Suprafeţele liniei de testare din diferite concentraţii de probe de tampon (tampon 2)
Concentraţie Suprafeţele liniei de testare Nivel 8 Nivel 5 Nivel 4 0 195 230 217 1/2048 365 --- --- 1/1024 693 542 356 1/512 961 810 446 1/256 1787 1395 527 1/128 3250 2143 959 1/64 5225 4157 1623 1/32 7927 6696 2692 1/16 9306 9766 4413 1/8 10647 10173 6685 1/4 11489 - 8605 1/2 9818 12250 10150
Datele exprimate ca Bo/B calculate din zonele liniei de testare sunt furnizate în Tabelul 5.
Tabelul 5: Bo/B calculat din suprafeţele liniei de testare din diferite concentraţii de probe de tampon (tampon 2)
Concentraţie Bo/B Nivel 8 Nivel 5 Nivel 4 0 1 1 1 [1/2048] 0,5342 --- --- [1/1024] 0,2814 0,4244 0,6096 [1/512] 0,2029 0,2840 0,4865 [1/256] 0,1091 0,1649 0,4118 [1/128] 0,06 0,1073 0,2263 [1/64] 0,0373 0,0553 0,1337 [1/32] 0,0246 0,0343 0,0806 [1/16] 0,0210 0,0236 0,0492 [1/8] 0,0183 0,0226 0,0325 [1/4] 0,0170 --- 0,0252 [1/2] 0,0199 0,0188 0,0214
Tabelele 4-5 şi FIG. 12A arată că, în general, valorile măsurate ale tampoanelor de nivelul 8 au fost cele mai mari, iar valorile tampoanelor de nivelul 4 au fost cele mai scăzute. Deşi vizibilitatea liniilor de testare de la tampoanele de nivelul 5 a fost similară cu tampoanele de nivelul 8 (FIG. 10 şi, respectiv, 11), rezultatele cititorului Axxin în Tabelul 4 şi FIG. 12A arată că tampoanele de nivel 8 au produs intensităţi de semnal mai bune decât tampoanele de nivel 4 şi 5. Tabelul 5 sugerează că tampoanele de nivelul 8 au conţinut mai mult antigen de ploşniţe de pat decât celelalte niveluri.
Rezultate tampon de extracţie 3: După cum se arată în FIG. 13-17, toate benzile au arătat linii de control pozitive pentru legarea anticorpului de capră anti-şoarece la anticorpul BB2 conjugat cu aur. Toate benzile au arătat absenţa liniilor de testare pentru banda de control negativ în care s-a adăugat tampon de extracţie în loc de o probă de tampon. In FIG. 13-17, liniile de control pozitiv sunt liniile superioare şi orice linii de test care arată prezenţa antigenului de ploşniţă de pat sunt sub liniile de control pozitiv. Murdărie sau particule insolubile din tampoane au fost prezente în apropierea fundului membranelor pentru benzile de testare de nivel 3, 5, 7 şi 8. Eşantionul de tampon de nivel 2 (neprezentat) a avut linii de testare vizibile de la diluţia de 1/8 la diluţia de 1/2. Proba de tampon de nivel 3 (FIG. 13) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/128 la diluţia 1/2. Proba de tampon de nivel 4 (FIG. 14) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/1024 la diluţia 1/2. Proba de tampon de nivel 5 (FIG. 15) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/512 la diluţia 1/2. Proba de tampon de nivel 7 (FIG. 16) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/4096 la diluţia 1/2. Proba de tampon de nivel 8 (FIG. 17) a avut linii de testare vizibile de la diluţia 1/2048 la diluţia 1/2. Deşi observate vizual, unele dintre liniile de testare notate nu sunt uşor evidente pentru anumite diluţii din FIG. 13-17 din cauza limitărilor fotografice. Toate liniile de testare au fost mânjite. Intensitatea semnalului la diluţie 1/2 din tamponul de nivel 2 a fost aproximativ egală cu cea a diluţiei 1/64 din tamponul de nivel 3, diluţia 1/64 din tamponul de nivel 4, diluţia 1/64 din tampon 5, diluţia 1/1024 din tamponul de nivel 7 şi diluţia 1/512 din tamponul de nivel 8. Prin urmare, intensitatea semnalului vizibil la diluţie 1/2 din tamponul de nivel 2 a fost cea mai slabă în comparaţie cu cea la diluţii 1/2 de la celelalte niveluri. Semnalul de diluţie 1/2 din tamponul de nivel 8 a fost cel mai puternic.
Intensităţile semnalului au fost, de asemenea, determinate folosind un cititor de benzi de testare Axxin (Axxin, Fairfield, Victoria, Australia) pentru a măsura zonele liniei de testare pentru diferite concentraţii (1/2048 până la 1/2) ale probelor de tampon de nivel 4, 5 şi 8 extrase în 350 µl de tampon 3. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 6.
Tabelul 6: Suprafeţele liniei de testare din diferite concentraţii de probe de tampon (tampon 3)
Concentraţie Suprafeţele liniei de testare Nivel 8 Nivel 7 Nivel 5 Nivel 4 Nivel 3 Nivel 2 0 441 283 263 225 170 231 1/2048 735 781 --- --- --- --- 1/1024 798 1037 270 334 --- --- 1/512 1414 2003 385 574 309 261 1/256 2691 2998 422 1090 403 261 1/128 4741 4665 1026 1439 522 285 1/64 7173 6912 2013 2403 724 276 1/32 9603 8746 5763 4090 1360 269 1/16 10377 9626 5743 5842 2430 271 1/8 11788 11767 7021 8061 3462 340 1/4 10725 8466 7120 9518 5189 406 1/2 8584 6803 9408 10413 6098 752
Datele exprimate ca Bo/B calculate din zonele liniei de testare sunt furnizate în Tabelul 7.
Tabelul 7: Bo/B calculat din suprafeţele liniei de testare din diferite concentraţii de probe de tampon (tampon 3)
Concentraţie BoB Nivel 8 Nivel 7 Nivel 5 Nivel 4 Nivel 3 Nivel 2 0 1 1 1 1 1 1 [1/2048] 0,6 0,3624 --- --- --- --- [1/1024] 0,5526 0,2729 0,9741 0,6737 --- --- [1/512] 0,3119 0,1413 0,6831 0,3920 0,5502 0,8851 [1/256] 0,1639 0,0944 0,6232 0,2064 0,4218 0,8851 [1/128] 0,0930 0,0607 0,2563 0,1564 0,3257 0,8105 [1/64] 0,0615 0,0409 0,1307 0,0936 0,2348 0,8370 [1/32] 0,0459 0,0324 0,0456 0,0550 0,1250 0,8587 [1/16] 0,0425 0,0294 0,0458 0,0385 0,0700 0,8524 [1/8] 0,0374 0,0241 0,0375 0,0279 0,0491 0,6794 [1/4] 0,0411 0,0334 0,0369 0,0236 0,0328 0,5690 [1/2] 0,0514 0,0416 0,0280 0,0216 0,0279 0,3072
Tabelele 6-7 şi FIG. 18A arată că, în general, valorile măsurate ale tampoanelor de nivelul 8 au fost cele mai mari, iar valorile tampoanelor de nivelul 2 au fost cele mai scăzute. Tabelul 7 şi FIG. 18A arată că tampoanele de nivel 8 au produs intensităţi de semnal mai bune decât celelalte niveluri.
Compararea tampoanelor de extracţie: Pentru tamponul de extracţie 1, toate liniile de testare au fost clare şi nu au avut pete, în timp ce tampoanele de extracţie 2 şi 3 au dus la linii de test pătate. Pentru tampoanele de nivelul 4, extracţia cu tampoanele 1 şi 3 a dus la semnale care încep la diluţia 1/1024, dar extracţia cu tamponul 2 a dus la semnale care încep la diluţia 1/512. Cu toate acestea, extracţia nivelului 5 cu tamponul 2 a dat semnal la o concentraţie mai mică (diluţie 1/1024) decât extracţia cu tamponul 3 (diluţie 1/512). Tampoanele 1 şi 3 au dat semnale la aceeaşi concentraţie pentru tampoanele de nivel 3 şi 7. Cu toate acestea, extracţia tampoanelor de nivel 2 cu tampon 1 a dus la un semnal la o concentraţie mai mică (diluţie 1/16) decât extracţia cu tampon 3 (diluţie 1/8). În general, valorile măsurate ale tuturor tampoanelor la nivel de testare au fost mai mari pentru extracţia cu tamponul 1 decât pentru tampoanele 2 şi 3.
Precizia studiului utilizând cititorul Axxin: Au fost preparate nouă replici ale tamponului de extracţie 1 ca martor negativ şi nouă replici la fiecare dintre diluţiile 1/2048, 1/512 şi 1/128 ale tampoanelor de nivel 7 extrase cu tamponul 1 şi au fost măsurate zonele liniei de testare folosind o bandă de testare Axxin cititor (Axxin, Fairfield, Victoria, Australia). Zonele liniei de testare sunt prezentate în Tabelul 8 şi FIG. 20.
Tabelul 8: Rezultatele studiului de precizie ale zonelor replicate ale liniilor de testare
Suprafeţele liniei de testare Proces Tampon 1 Nivel 7 1/2048 Nivel 7 1/512 Nivel 7 1/128 1 250 1415 3299 6163 2 251 1426 2794 6276 3 233 1293 2684 7305 4 289 1238 2810 8079 5 260 1202 2531 8090 6 271 1075 2401 6583 7 260 1283 2260 9109 8 218 1540 2660 8297 9 194 1444 2773 5997 Medie 247,3 1324,0 2690,2 7322,1 STDEV 28,6 144,3 295,3 1120,6 % CV 11,6 10,9 11,0 15,3
Coeficientul procentual de variaţie (% CV) a fost mai mic de 20%, ceea ce este un bun % CV pentru măsurătorile Axxin.

Claims (16)

1. Anticorp monoclonal anti-insectă de pat produs de: (a) un hibridom depus la American Type Culture Collection (ATCC) cu numărul de acces PTA-122644 [BB2], sau un fragment al acestuia de legare la antigen, sau (b) un hibridom depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122645 [BB7] sau un fragment de legare la antigen al acestuia.
2. Anticorp monoclonal conjugat sau fragment de legare a antigenului conjugat, cuprinzând anticorpul monoclonal anti-insecte de pat sau fragmentul de legare la antigen conform revendicării 1 şi un agent de detectare.
3. Anticorpul monoclonal conjugat sau fragmentul de legare a antigenului conjugat conform revendicării 2, în care agentul de detectare este o etichetă enzimatică, o etichetă radioactivă, un fluorofor, un cromofor, un agent de imagistică, un metal, un ion metalic, aur coloidal sau nanoparticule de aur.
4. Anticorpul conjugat sau fragmentul conjugat de legare la antigen conform revendicării 2 sau 3, cuprinzând anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau un fragment de legare la antigen al acestuia.
5. Anticorpul conjugat sau fragmentul conjugat de legare la antigen conform revendicării 2 sau 3, cuprinzând anticorpul monoclonal anti-insectă de pat produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de acces PTA-122645 [BB7] sau un fragment de legare la antigen al acestuia.
6. Compoziţie cuprinzând anticorpul monoclonal anti-insectă de pat sau fragmentul de legare la antigen din revendicarea 1, anticorpul conjugat sau fragmentul de legare la antigenul conjugat din oricare dintre revendicările 2 până la 5, sau o combinaţie a acestora.
7. Compoziţie conform revendicării 6, cuprinzând:
(a)(1) anticorpul monoclonal anti-insectă de pat conform revendicării 1 produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] şi
(2) anticorpul monoclonal anti-insectă de pat conform revendicării 1 produs de hibridomul depus la ATCC sub Numărul de Acces PTA-122645 [BB7] sau anticorpul conjugat conform revendicării 5; sau
(b)(1) anticorpul monoclonal anti-insectă de pat conform revendicării 1 produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7] şi
(2) anticorpul conjugat conform revendicării 4.
8. Trusă cuprinzând anticorpul monoclonal anti-insecte de pat sau fragmentul de legare a antigenului din revendicarea 1, anticorpul conjugat sau fragmentul de legare a antigenului conjugat din oricare dintre revendicările de la 2 până la 5, compoziţia din revendicarea 6 sau 7 sau o combinaţie a acestora.
9. Un hibridom capabil să producă un anticorp monoclonal anti-insectă de pat, în care hibridomul este depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2] sau numărul de acces PTA-122645 [BB7].
10. Celulă izolată care produce anticorpul monoclonal anti-insectă de pat sau fragmentul de legare la antigen din revendicarea 1.
11. Metodă de producere a anticorpului monoclonal anti-insectă de pat sau a fragmentului de legare a antigenului din revendicarea 1, cuprinzând (a) cultivarea celulei din revendicarea 10 şi (b) izolarea anticorpului monoclonal anti-insectă de pat sau a fragmentului de legare la antigen din celula de cultură.
12. Metodă de detectare a insectelor de pat, care cuprinde punerea în contact a unei probe care cuprinde un antigen de ploşniţe de pat cu anticorpul monoclonal anti-ploşniţe sau fragmentul de legare a antigenului din revendicarea 1, anticorpul conjugat sau fragmentul de legare la antigenul conjugat din oricare dintre revendicările 2 până la 5, compoziţia din revendicarea 6 sau 7, sau o combinaţie a acestora şi detectarea legării antigenului ploşniţei de pat la anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat sau fragmentul de legare la antigen, anticorpul conjugat sau fragmentul de legare la antigenul conjugat, compoziţia sau combinaţia acestora, de preferinţă în care detectarea cuprinde efectuarea unui test de curgere laterală.
13. Metodă conform revendicării 12, în care proba este pusă în contact cu un anticorp monoclonal anti-insectă de pat din revendicarea 1 şi un anticorp conjugat din oricare dintre revendicările de la 2 până la 5.
14. Metodă conform revendicării 13, în care:
(a) anticorpul monoclonal anti-insectă de pat este anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat din revendicarea 1 produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122644 [BB2], şi anticorpul conjugat este anticorpul conjugat din revendicarea 5, sau
(b) anticorpul monoclonal anti-insectă de pat este anticorpul monoclonal anti-ploşniţă de pat din revendicarea 1 produs de hibridomul depus la ATCC sub numărul de acces PTA-122645 [BB7], şi anticorpul conjugat este anticorpul conjugat din revendicarea 4.
15. Metodă conform oricăreia dintre revendicările de la 12 până la 14, în care metoda mai cuprinde colectarea probei care cuprinde antigenul de ploşniţă de pat cu un dispozitiv de colectare şi extragerea antigenelor din probă.
16. Metodă conform revendicării 15, în care dispozitivul de colectare este un tampon.
MDE20180844T 2015-10-21 2016-10-21 Anticorpi monoclonali împotriva ploşniţelor de pat și procedee de obţinere și utilizare a acestora MD3365367T2 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562244189P 2015-10-21 2015-10-21
PCT/US2016/058300 WO2017070603A1 (en) 2015-10-21 2016-10-21 Anti-bed bug monoclonal antibodies and methods of making and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3365367T2 true MD3365367T2 (ro) 2024-02-29

Family

ID=58558142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20180844T MD3365367T2 (ro) 2015-10-21 2016-10-21 Anticorpi monoclonali împotriva ploşniţelor de pat și procedee de obţinere și utilizare a acestora

Country Status (14)

Country Link
US (3) US10768172B2 (ro)
EP (2) EP3365367B1 (ro)
AU (2) AU2016342373B2 (ro)
CA (1) CA3041460A1 (ro)
ES (1) ES2953484T3 (ro)
HR (1) HRP20231035T1 (ro)
HU (1) HUE063822T2 (ro)
MA (1) MA45831B1 (ro)
MD (1) MD3365367T2 (ro)
MX (2) MX2018004986A (ro)
PL (1) PL3365367T3 (ro)
RS (1) RS64530B1 (ro)
SM (1) SMT202300278T1 (ro)
WO (1) WO2017070603A1 (ro)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3370515T (lt) 2015-10-21 2022-05-10 Redcoat Solutions, Inc. Patalinių blakių aptikimo įrenginys
EP3365367B1 (en) * 2015-10-21 2023-06-07 Redcoat Solutions, Inc. Anti-bed bug monoclonal antibodies and methods of making and uses thereof
JP7162016B2 (ja) 2017-05-22 2022-10-27 コルテバ アグリサイエンス エルエルシー トコジラミの選択的検出
WO2020106848A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Dow Agrosciences Llc Selective detection of bed bugs

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6319676B1 (en) 1995-05-02 2001-11-20 Carter Wallace, Inc. Diagnostic detection device and method
WO1999064863A1 (en) 1998-06-12 1999-12-16 New Horizons Diagnostics, Inc. Colloidal colorimetric flow through and lateral flow assays utilizing soluble submicron particles
TR200201006T2 (tr) 1999-10-12 2002-11-21 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Dışkıda bulunan aside dirençli mikroorganizmaların tespitine ilişkin geliştirilmiş yöntem.
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
US7220597B2 (en) 2003-01-30 2007-05-22 Zin Benedict L Assay test device and method of making same
US7214542B2 (en) 2003-01-30 2007-05-08 Michael Hutchinson Method of processing assay test results
US7482128B2 (en) 2003-03-27 2009-01-27 Heska Corporation Anti-feline albumin antibodies
KR20070072510A (ko) 2004-08-30 2007-07-04 론자 바이올로직스 피엘씨 항체 정제를 위한 친화도- 및 이온 교환- 크로마토그래피
DE602006015330D1 (de) 2005-07-27 2010-08-19 Cytosignet Inc Nachweis und messung einer blutzuführungsaktivität
US7591099B2 (en) 2005-08-30 2009-09-22 Ecolab Inc. Bed bug monitor
EP2076118A4 (en) 2006-10-23 2010-08-11 Dow Agrosciences Llc METHOD FOR DETECTING, MONITORING AND CHECKING BED TAILS
AU2013200548B2 (en) 2006-10-23 2015-06-18 Ecolab Usa Inc. Bedbug detection, monitoring and control techniques
US20100273177A1 (en) 2006-12-08 2010-10-28 Piasio Roger N Methods and Devices for Testing Saliva
EP1933145B1 (en) 2006-12-11 2011-09-28 AraGen Biotechnology Co. Ltd. Rapid immunochromatographic detection by amplification of the colloidal gold signal
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
AU2008224950B2 (en) 2007-03-13 2013-10-03 National Jewish Medical And Research Center Methods for generation of antibodies
WO2008130680A1 (en) 2007-04-20 2008-10-30 Quidel Corporation Analytical devices with intedrated desiccant
US20090155921A1 (en) 2007-12-12 2009-06-18 Arbor Vita Corporation Method and apparatus for reading test strips
WO2009092014A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Gagnon Peter S Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography
GB0809995D0 (en) 2008-05-31 2008-07-09 Spd Swiss Prec Diagnostics Gmb Assay device
GB0900669D0 (en) 2009-01-16 2009-02-25 Bed Bugs Ltd Pest control
US20100212213A1 (en) 2009-02-25 2010-08-26 Hope Iii Joe Harold Detection device and method for monitoring bed bug infestation
KR20110132352A (ko) 2009-03-13 2011-12-07 에프엠씨 코포레이션 빈대 유인용 조성물
US8577986B2 (en) 2010-04-02 2013-11-05 Microsoft Corporation Mapping RDMA semantics to high speed storage
US20110289824A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Tai-Teh Wu Compounds, methods, and devices for detecting and/or treating insect infestation
FI20115285A0 (fi) 2011-03-24 2011-03-24 Reagena Ltd Oy Menetelmä pikatestin suorittamiseksi
US9458512B2 (en) 2011-07-05 2016-10-04 Ernest Colaizzi Kit for the detection of bed bugs
US10012664B2 (en) 2011-09-25 2018-07-03 Theranos Ip Company, Llc Systems and methods for fluid and component handling
WO2013096817A2 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Abbott Point Of Care Inc Integrated test device for optical detection of microarrays
CA2866084C (en) 2012-02-29 2020-06-30 Sri International Ectoparasite detection
US20130208114A1 (en) 2013-01-25 2013-08-15 Jody Arthur Balsam Digital Bedbug Indicator: A bedbug insect peripheral electronic detection unit device
GB2524307B (en) 2014-03-20 2016-04-20 Rentokil Initial Plc Apparatus
GB2558097B (en) 2014-04-17 2019-03-06 Z Integrated Digital Tech Inc Electronic test device data communication
AU2016315370A1 (en) * 2015-08-31 2018-04-26 Airmid Health Group Limited Novel proteins and detection methods
EP3365367B1 (en) * 2015-10-21 2023-06-07 Redcoat Solutions, Inc. Anti-bed bug monoclonal antibodies and methods of making and uses thereof
LT3370515T (lt) * 2015-10-21 2022-05-10 Redcoat Solutions, Inc. Patalinių blakių aptikimo įrenginys

Also Published As

Publication number Publication date
US20170137501A1 (en) 2017-05-18
MA45831A (fr) 2019-06-12
EP4273235B1 (en) 2025-04-09
US10768172B2 (en) 2020-09-08
CA3041460A1 (en) 2017-04-27
PL3365367T3 (pl) 2023-10-30
EP3365367C0 (en) 2023-06-07
MX2023009584A (es) 2023-08-23
AU2016342373A1 (en) 2018-06-07
WO2017070603A1 (en) 2017-04-27
HRP20231035T1 (hr) 2023-12-22
RS64530B1 (sr) 2023-09-29
EP4273235A3 (en) 2024-01-17
US20250026817A1 (en) 2025-01-23
AU2016342373B2 (en) 2023-09-21
EP3365367A1 (en) 2018-08-29
MA45831B1 (fr) 2023-10-31
US12030933B2 (en) 2024-07-09
EP4273235A2 (en) 2023-11-08
HUE063822T2 (hu) 2024-02-28
AU2023282327A1 (en) 2024-01-18
US20200363405A1 (en) 2020-11-19
WO2017070603A9 (en) 2018-05-17
ES2953484T3 (es) 2023-11-13
SMT202300278T1 (it) 2023-09-06
EP3365367A4 (en) 2019-06-12
EP3365367B1 (en) 2023-06-07
MX2018004986A (es) 2019-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12030933B2 (en) Anti-bed bug monoclonal antibodies and methods of making and uses thereof
US7129053B1 (en) Immuno-chromatographic rapid assay in order to detect acid-resistant microorganisms in the stool
US12174177B2 (en) Bed bugs detection device
WO2009108652A1 (en) Antibodies to clostridium difficile spores and uses thereof
KR20160051816A (ko) B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법
Wonsit et al. Enzyme-linked immunosorbent assay based on monoclonal and polyclonal antibodies for the detection of Entamoeba histolytica antigens in faecal specimens
KR101062437B1 (ko) 간흡충 특이 항원을 포함하는 간흡충증 진단 키트 및 상기간흡충 특이 항원의 생산을 위한 단클론 항체
JP6655302B2 (ja) 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
KR100957675B1 (ko) 폐흡충 특이 항원의 생산을 위한 단클론 항체 및 폐흡충증신속 진단 키트
CN109206510A (zh) 与伪狂犬病病毒gB蛋白结合的单克隆抗体及其应用
JP7558158B2 (ja) 条虫を検出するための方法、デバイス、キット、および組成物
US7368256B2 (en) Antibodies against Stachybotrys chartarum and methods for their use
KR20200059257A (ko) 캄필로박터 속 박테리아를 검출하기 위한 항체 및 검사 디바이스
US7772374B2 (en) Spore specific antibodies
JP2005220044A (ja) 抗ミティスモノクローナル抗体、それを産生する細胞株、抗ミティスモノクローナル抗体の作製方法、およびミティス検出キット
WO2014188763A1 (en) An antibody that binds to leptospiral antigen
点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载