TWI820901B

TWI820901B - 嘧啶並雜環類化合物的晶型及其製備方法

Info

Publication number: TWI820901B
Application number: TW111134200A
Authority: TW
Inventors: 徐洋洋; 孫繼奎; 伍文韜; 張楊; 曙輝陳
Original assignee: 大陸商德昇濟醫藥（無錫）有限公司
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2022-09-08
Publication date: 2023-11-01
Also published as: JP7688447B2; CA3231329A1; CN117957220A; KR20240056582A; AU2022342220A1; US20250129102A1; MX2024003027A; EP4385986A4; TW202313627A; JP2025124698A; WO2023036282A1; EP4385986A1; JP2024535792A; IL311340A

Abstract

本發明公開了一類嘧啶並雜環類化合物的晶型及其製備方法，具體公開了式(II)化合物及其晶型的製備方法和應用。

Description

嘧啶並雜環類化合物的晶型及其製備方法

本發明涉及一類嘧啶並雜環類化合物的晶型及其製備方法，具體涉及式(II)所示化合物及其晶型的製備方法和應用。

RAS癌基因突變是人類癌症中最常見的激活突變，發生在30%的人類腫瘤中。RAS基因家族包括三個亞型(KRAS、HRAS和NRAS)，其中85%的RAS驅動的癌症是由KRAS亞型突變引起的。KRAS突變常見於實體腫瘤中，如：肺腺癌、胰腺導管癌和結直腸癌等。在KRAS突變腫瘤中，80%的致癌突變發生在密碼子12上，最常見的突變包括：p.G12D(41%)、p.G12V(28%)和p.G12C(14%)。

KRAS基因的全名是Kirsten rat sarcoma viraloncogene homolog(Kristen大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)。KRAS在細胞生長的信號調控中起著一個樞紐的作用，上游的EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB2)、ErbB3和ErbB4等細胞表面受體，在接受了外界信號之後，會通過RAS蛋白，把信號傳遞到下游。KRAS蛋白沒有被激活的時候，與GDP(鳥嘌呤核苷酸二磷酸)緊密結合。在被SOS1等鳥嘌呤核苷酸交換因子激活後，與GTP(鳥嘌呤核苷酸三磷酸)結合，變成激酶活性的狀態。 KRAS基因突變後，可以不依賴於上游生長因子受體信號，獨立向下游通路傳輸生長和增殖的信號，造成不受控制的細胞生長和腫瘤進展，同時KRAS基因是否有突變，也是腫瘤預後的一個重要指標。

儘管KRAS是第一個被發現的癌基因，但長期以來被認為是不可成藥靶點。直到2019年，Amgen和Mirati Therapeutics先後公佈了的KRAS小分子抑制劑AMG510和MRTX849的臨床研究結果，首次在臨床上證實了KRAS抑制劑在臨床上治療腫瘤的有效性。AMG 510和MRTX849都屬於不可逆小分抑制劑，通過與KRAS G12C突變蛋白的半胱胺酸殘基形成不可逆共價鍵，從而抑制KRAS活性。

KRAS在細胞生長的信號調控中起著一個樞紐的作用，上游的EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB2)、ErbB3和ErbB4等細胞表面受體，在接受了外界信號之後，會通過RAS蛋白，把信號傳遞到下游。KRAS蛋白在沒有被激活的時候，是與GDP(鳥嘌呤核苷酸二磷酸)緊密結合的，在被SOS1等鳥嘌呤核苷酸交換因子激活後，轉到與GTP(鳥嘌呤核苷酸三磷酸)結合，變成激酶活性的狀態。KRAS是RAS蛋白中的重要一員，KRAS基因突變後，可以不依賴於上游生長因子受體信號，獨立向下游通路傳輸生長和增殖的信號，造成不受控制的細胞生長和腫瘤進展，同時KRAS基因是否有突變，也是腫瘤預後的一個重要指標。

統計結果顯示，肺腺癌有12-36%病人KRAS突變驅動的；27-56%結腸癌病人由KRAS驅動，此外90%的胰腺癌、21%的子宮內膜癌和12-36%的肺腺癌等都是由KRAS驅動的，病人群體巨大；在KRAS的基因突變中，97%是發生在第12位或者第13位的胺基酸殘基發生了突變，其中G12D，G12V和G13D這三種突變，但是這三種突變的成藥較差，KRAS(G12C)突變：12位的甘胺酸被半胱胺酸替換後為共價抑制劑的開發提供了一個很好的方向。

本發明主張如下優先權：

CN202111062619.1，申請日：2021年09月10日；

CN202211034826.0，申請日：2022年08月26日。

本發明提供了式(II)化合物，

其中，n選自0~3。

在本發明的一些方案中，所述n選自0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0。

在本發明的一些方案中，所述n選自0.5、1、1.5、2、2.5和3。

在本發明的一些方案中，所述n選自2。

本發明還提供了式(II)化合物，

其中，n選自0~2。

在本發明的一些方案中，所述n選自0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2。

在本發明的一些方案中，所述n選自0.5、1、1.5和2。

在本發明的一些方案中，所述n選自2。

本發明還提供了式(II)化合物的A晶型，其特徵在於其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：8.514±0.200°、14.689±0.200°、18.122±0.200°。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：6.218±0.200°、8.514±0.200°、12.299±0.200°、14.689±0.200°、16.903±0.200°、18.122±0.200°、18.927±0.200°、25.580±0.200°。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：6.218±0.200°、8.514±0.200°、11.663±0.200°、12.299±0.200°、14.689±0.200°、16.903±0.200°、18.122±0.200°、18.927±0.200°、19.364±0.200°、20.386±0.200°、21.914±0.200°、25.580±0.200°。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：6.218±0.200°、8.514±0.200°、11.663±0.200°、12.299±0.200°、14.689±0.200°、16.903±0.200°、18.122±0.200°、18.927±0.200°、19.364±0.200°、20.386±0.200°、21.914±0.200°、22.640±0.200°、25.580±0.200°、25.988±0.200°、27.147±0.200°、27.715±0.200°。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：6.218°、8.514°、11.663°、12.299°、14.689°、16.903°、18.122°、18.554°、18.927°、19.364°、20.386°、21.914°、22.640°、23.867°、24.553°、24.806°、25.580°、25.988°、27.147°、27.715°、29.135°、31.799°。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：8.514±0.200°、14.689±0.200°，還可以在6.218±0.200°，和/或11.663±0.200°，和/或12.299±0.200°，和/或16.903±0.200°，和/或18.122±0.200°，和/或18.554±0.200°，和/或18.927±0.200°，和/或19.364±0.200°，和/或20.386±0.200°，和/或21.914±0.200°，和/或22.64±0.200°，和/或23.867±0.200°，和/或24.553±0.200°，和/或24.806±0.200°，和/或25.58±0.200°，和/或25.988±0.200°，和/或27.147±0.200°，和/或27.715±0.200°，和/或29.135±0.200°，和/或31.799±0.200°處有特徵繞射峰。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的A晶型，其XRPD圖譜如圖1所示。

本發明的一些方案中，上述A晶型的XRPD圖譜解析數據如表1所示：

在本發明的一些方案中，上述A晶型的差示掃描量熱曲線在115.37℃±3℃處具有吸熱峰的峰值。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的DSC圖譜如圖2所示。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的熱重分析曲線在150.0℃±3℃時失重達5.379%。

在本發明的一些方案中，上述A晶型的TGA圖譜如圖3所示。

本發明還提供式(II)化合物A晶型的製備方法，包括：

(a)將式(I)化合物加入乙醇中攪拌至澄清；

(b)在攪拌下將水緩慢加入到體系中，在20~30℃加入晶種；

(c)20~30℃下攪拌15小時；

(d)20~30℃緩慢將水滴加到反應體系中，繼續攪拌1~3小時。

(e)過濾，收集固體。

本發明還提供了上述化合物和A晶型在製備治療實體瘤藥物中的應用。

在本發明的一些方案中，上述實體瘤為肺癌和直腸癌。

技術效果

本發明化合物對KRASG12C突變的MIA-PA-CA-2細胞系、NCI-H358細胞具有良好的細胞增殖抑制活性，有良好的肝微粒體、肝細胞、血漿、全血穩定性，有良好的PK性質，並且有顯著的抑瘤作用。 A晶型穩定、受光熱影響小，有良好的PK性質。

定義和說明

除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在含有下列含義。一個特定的短語或術語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文出現商品名時，旨在指代其對應的商品或其活性成分。

本發明的中間體化合物可以通過本發明所屬技術領域具通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬技術領域具通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，所述的溶劑須適合於本發明的化學變化及其所需的試劑和物料。為了獲得本發明的化合物，有時需要本發明所屬技術領域具通常知識者在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。

下面會通過實施例具體描述本發明，這些實施例並不意味著對本發明的任何限制。

本發明所使用的所有溶劑是市售的，無需進一步純化即可使用。

本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域具通常知識者所熟知的常規方法來確認結構，如果本發明涉及化合物的絕對構型，則該絕對構型可以通過本領域常規技術手段予以確證。例如單晶X射線繞射法(SXRD)，把培養出的單晶用Bruker D8 venture繞射儀收集繞射強度數據，光源為CuKα輻射，掃描方式：φ/ω掃描，收集相關數據後，進一步採用直接法(Shelxs97)解析晶體結構，便可以確證絕對構型。

化合物依據本領域常規命名原則或者使用ChemDraw®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。

本發明粉末X-射線繞射(X-ray powder diffractometer,XRPD)方法

儀器型號：布魯克Bruker D2 PhaserX-射線繞射儀

測試方法：大約10~20mg樣品用於XRPD檢測。

詳細的XRPD參數如下：

光管：Cu,kα,(λ=1.54184

).

光管電壓：30kV，光管電流：10mA

發散狹縫：0.60mm

探測器狹縫：5.827mm

防散射狹縫：0mm

掃描範圍：3-40deg

步徑：0.02deg

步長：0.2秒

本發明差熱分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)方法

儀器型號：NETZSCH DSC 214 DSC21400A-0958-L

測試方法：取樣品(~4.02mg)置於DSC鋁鍋內進行測試，在50mL/min N₂條件下，以10℃/min的升溫速率，加熱樣品從30℃(室溫)到400℃。

本發明熱重分析(Thermal Gravimetric Analyzer,TGA)方法

儀器型號：TA Discovery TGA 5500熱重分析儀

測試方法：取樣品(2~5mg)置於TGA鉑金鍋內進行測試，在25mL/min N₂條件下，以10℃/min的升溫速率，加熱樣品從室溫到350℃或失重20%。

本發明X-射線單晶繞射方法

儀器型號：Bruker D8 VENTURE CMOS Photon II diffractometer with helios mx multilayer monochrmator.

測試方法：取0.0133g式(II)化合物A晶型在室溫條件下溶解於2mL乙腈中。將樣品溶液置於4mL半密封樣品瓶中，在室溫下緩慢揮發。十天後得到無色塊狀晶體。繞射實驗溫度T=173(2)K。

儀器參數：

Bruker D8 VENTURE CMOS Photon II diffractometer with helios mx multilayer monochrmator.

Cryogenic system: Oxford Cryostream 800 Cu: λ=1.54184Å, 2.5kW,

Distance from the crystal to detector: d=45mm

Tube Voltage: 50kV

Tube Current: 50mA

為讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。

圖1為式(II)化合物A晶型的Cu-Kα輻射的XRPD譜圖；

圖2為式(II)化合物A晶型的DSC譜圖；

圖3為式(II)化合物A晶型的TGA譜圖；

圖4為式(I)化合物不同給藥量隨著時間延長的腫瘤體積變化；

圖5為式(I)化合物不同給藥量隨著時間延長的動物體重變化；

圖6為式(III)化合物的單晶X射線繞射立體結構橢球圖。

為了更好的理解本發明的內容，下面結合具體實施例來做進一步的說明，但具體的實施方式並不是對本發明的內容所做的限制。

實施例1：式(I)化合物的製備

步驟1：化合物1-2的合成

準備好5升三口瓶，將化合物1-1(250g,2.00mol,1eq)和無水碳酸鉀(690.26g,4.99mol,2.5eq)，碘化鉀(331.62g,2.00mol,1eq)加入到N-甲基吡咯烷酮(2.5L)中，然後滴加對甲氧基苯甲基氯(641.36g,4.10mol,557.71mL,2.05eq)，反應液成黃色渾濁，在氮氣保護下置於120℃油浴中攪拌反應5小時。合併6批反應液(250×6)，倒入20升水中，再加入10升甲基第三丁基醚攪拌，分液後收集有機相，水相用甲基第三丁基醚萃取(5L x 1)，合併有機相，飽和食鹽水洗滌(10L x 2)，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得到化合物1-2品。向粗品中加入3升石油醚，打漿過夜。打漿體系成乳白色渾濁，通過布氏漏斗過濾。濾餅用石油醚(500mL x 3)淋洗，得到的濾餅，得到化合物1-2。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=7.23-7.18(m,4H),6.91-6.87(m,1H),6.82-6.76(m,4H),6.65-6.59(m,2H),4.20(s,4H),3.79(s,6H),2.19(s,3H)。LCMS：MS m/z=366.1[M+H]⁺。

步驟2：化合物1-3的合成

將2,2,6,6-四甲基呱啶(2.44kg,17.29mol,2.94L,4eq)加入到無水四氫呋喃(15L)中，降溫至-5-0℃，氮氣置換三次，氮氣保護下滴加正丁基鋰(2.5M,6.92L,4eq)，-5-0℃反應15min，降溫至-60℃，滴加化合物1-2(1.58kg,4.32mol,1eq)的四氫呋喃(1.5L)溶液，滴加完畢後-65~-60℃反應0.5小時，快速加入N,N-二甲基甲醯胺(3.16kg,43.24mol,3.33L,10eq)，-60℃反應10min，向反應液加入20L飽和氯化銨，用5L的甲基第三丁基醚萃取分液，有機相繼續用20L飽和氯化銨洗滌，然後水相用10L的甲基第三丁基醚繼續萃取分液，合併有機相，有機相用飽和食鹽水洗滌(12L x 2)，無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮，粗品用石油醚/甲基第三丁基醚(3/1,3L)打漿5小時，過濾，收集濾餅得到化合物1-3。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=10.43-10.35(m,1H),7.21-7.18(m,5H),6.92-6.81(m,5H),4.25(s,4H),3.80(s,6H),2.23(s,3H)。LCMS：MS m/z=394.2[M+H]⁺。

步驟3：化合物1-4的合成

將化合物1-3(1.17kg,2.83mol,95%純度，1eq)加入到N,N-二甲基甲醯胺(5.7L)中，5℃下分批加入溴代丁二醯亞胺(603.35g,3.39mol,1.2eq)，5-15℃反應1小時，向反應液中，緩慢加入5.7L水，有固體析出，攪拌20min後，繼續緩慢加入11.4L水，繼續攪拌40min，過濾，將濾餅用水(2L x 2)的淋洗。粗品用石油醚：甲基第三丁基醚=10：1的混合溶劑7.7L打漿12小時，過濾，濾餅用石油醚：甲基第三丁基醚=10：1的混合溶劑500mL淋洗後進行真空濃縮後，用氮氣吹12小時，得到化合物1-4。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=10.39(s,1H),7.17(d,J=8.8Hz,4H),6.89(d,J=8.8Hz,1H),6.85-6.82(m,4H),4.22(s,4H),3.79(s,6H),2.28(s,3H)。LCMS：MS m/z=472.1[M+H]⁺，474.1[M+H]⁺。

步驟4：化合物1-6的合成

將化合物1-4(130g,275.22mmol,1eq)，碘化亞酮(104.83g,550.44mmol,2eq)，化合物1-5(264.37g,1.38mol,175.08mL,5eq)溶於DMF(1.3L)中，氮氣保護，在100℃下攪拌4小時。降溫，體系過濾，倒入水(1.3L)中淬滅，甲基第三丁基醚(400mL x 2)萃取，飽和食鹽水洗滌(300mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，收集母液濃縮得到粗品。粗品打漿(石油醚/甲基第三丁基醚=8/1,300mL)得到化合物1-6，收集母液，母液濃縮柱層析(石油醚/乙酸乙酯=100/1~5/1)得到粗品，粗品打漿(石油醚/甲基第三丁基醚=8/1,100mL)得到化合物1-6。兩批次固體用石油醚打漿混合，過濾，收集固體，得到化合物1-6。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=10.37(q,J=4.0Hz,1H),7.18-7.11(m,4H),6.89-6.82(m,4H),6.73(d,J=8.8Hz,1H),4.36(s,4H),3.81(s,6H),2.37-2.29(m,3H)。LCMS：MS m/z=484.0[M+Na]⁺。

步驟5：化合物1-8的合成

將鈉氫(70.21g,1.76mol,60%純度，1.8eq)加入到無水四氫呋喃(4.5L)中，降溫至-5℃，置換氮氣三次，氮氣保護下滴加化合物1-7(203.82g,1.76mol,188.72mL,1.8eq)，-5~0℃反應10min後，滴加正丁基鋰(2.5M,702.14mL,1.8eq)，繼續在氮氣保護下-5-0℃反應10min，降溫至-10℃，滴加化合物1-6(450g,975.19mmol,1eq)的四氫呋喃(450mL)溶液，-10℃下反應10min，將反應液緩慢加入到5L飽和氯化銨中，分液萃取，有機相用4L的飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮，向濃縮後的粗品中加入900mL x 4的石油醚，晃蕩洗滌後，將石油醚上清液傾倒掉，將粗品進行真空濃縮得到化合物1-8。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=7.18-7.15(m,4H),6.90-6.78(m,4H), 6.61(d,J=8.8Hz,1H),5.72-5.57(m,1H),4.31(m,4H),3.81(s,6H)，3.76(s,3H),3.56(s,2H),3.50-3.38(m,1H),2.98-2.93(m,1H),2.38-2.26(m,3H)。LCMS：MS m/z=578.1[M+H]⁺。

步驟6：化合物1-9的合成

將化合物1-8(1.15kg,1.77mol,89%純度，1eq)加入到二氯甲烷(5.7L)中，加入N,N-二甲基甲醯胺二甲基縮醛(337.86g,2.84mol,376.66mL,1.6eq)，25℃反應1小時，降溫至0℃，0-5°C下滴加入三氟化硼乙醚(377.27g,2.66mol,328.06mL,1.5eq)，反應10min。LCMS表明原料消失，出現產物Ms信號。將反應液緩慢加入到10L的半飽和碳酸氫鈉溶液中，分液萃取，有機相用5L的飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮將粗品平均分成六份，每份加入0.83L的甲基第三丁基醚，攪拌20min後析出固體，繼續加入石油醚：甲基第三丁基醚=1：1的混合溶劑0.5L後，打漿過夜16小時，六份一起過濾，將濾餅用石油醚：甲基第三丁基醚=1：1的混合溶劑800mL x 2淋洗後，旋乾，母液經柱層析石油醚：乙酸乙酯=100：0-0：1)得到化合物1-9。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=8.43(d,J=0.8Hz,1H),7.21-7.10(m,4H),6.91-6.81(m,4H),6.70(d,J=8.8Hz,1H),5.93(dd,J=3.2,14.8Hz,1H),4.35(s,4H),3.8(s,3H)，3.81(s,6H),3.38-3.29(m,1H),2.68(dd,J=3.6,16.8Hz,1H),2.39-2.24(m,3H)。LCMS：MS m/z=588.2[M+H]⁺。

步驟7：化合物1-10的合成

將化合物1-9(775g,1.32mol,1eq)加入到四氫呋喃(4L)中，降溫至-60℃，置換氮氣三次，氮氣保護下滴加三第二丁基硼氫化理(1M,1.45L,1.1eq)，-60℃下反應10min。將反應液緩慢加入到3.5L的1M鹽酸溶液中，加入2L的水分液萃取，水相繼續用2L的乙酸乙酯萃取，合併有機相中並繼，續加入1L的乙酸乙酯，用5L飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮，將粗品分為4批，分別加入200mL的甲基第三丁基醚，攪拌10min，緩慢加入200mL的石油醚，攪拌0.5-1小時後析出固體，繼續分批次加入1.6L的石油醚，打漿攪拌12小時，過濾，將濾餅用石油醚：甲基第三丁基醚=10：1的溶劑300mL x 3淋洗，收集固體得到化合物1-10(1.15kg)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=7.167-7.14(m,4H),6.87-6.83(m，4H),6.63(d,J=8.8Hz,1H),5.05-5.00(m,1H),4.61-4.58(m,1H),4.42-4.24(m,5H),3.85-3.73(m,10H)，3.13-3.05(m,1H),2.47-2.38(m,1H),2.35-2.31(m,3H)。LCMS：MS m/z=590.3.[M+H]⁺。

步驟8：化合物1-11的合成

將化合物1-10(310g,525.80mmol,1eq)加入到乙醇(1.55L)中，加入S-甲基異硫脲硫酸鹽(439.11g,1.58mol,3eq)和碳酸鈉(111.46g,1.05mol,2eq)，45~50℃(內溫)氮氣保護下反應16小時。將大部分乙醇濃縮除去，向粗品中加入500毫升水和400毫升乙酸乙酯，攪拌，用500mL 1M鹽酸調節pH=3~4後有灰白色固體析出，再加入600mL石油醚，攪拌，體系中有大量灰白色固體析出。將體系經布氏漏斗過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗(200mL x 2)，得到的濾餅即為產品。將濾餅用2L二氯甲烷溶解，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到化合物1-11。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=7.22-7.14(m,4H),6.91-6.82(m,4H),6.65(dd,J=8.4Hz 1H),5.12-5.08(m,1H),4.97-4.91(m,1H),4.67-4.57(m,1H),4.45-4.22(m,4H),3.88-3.74(m,6H),3.43-3.35(m,1H),2.77-2.72(m,1H),2.59(m,3H),2.40-2.31(m,3H)。LCMS：MS m/z=630.2[M+H]⁺。

步驟9：化合物1-12B的合成

化合物1-11進行SFC拆分，色譜柱：DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*50mm,10μm)；流動相：[0.1%NH₃．H₂O EtOH]；EtOH%：45%-45%,6.3min。得化合物1-12B(出峰時間：1.665min)，化合物1-12A(出峰時間：2.446min)。

步驟10：化合物1-13的合成

將化合物1-12B(2g,3.18mmol,1eq)溶於二氯甲烷(20mL)中，加入N,N-二異丙基乙胺(1.23g,9.53mmol,1.66mL,3eq)，降溫至0~10℃，將三氟甲磺酸酐(1.34g,4.76mmol,786.11μL,1.5eq)緩慢加入到體系中，在此溫度下反應15min。倒入飽和氯化銨水溶液(15mL)，分液，水相用二氯甲烷(15mL x 2)萃取，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得到粗品。粗品經柱層析(石油醚/乙酸乙酯=100/1~0/1)分離得到化合物1-13。LCMS m/z=762.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=7.21-7.11(m,4H),6.90-6.80(m,4H),6.66(d,J=8.4Hz,1H),5.19-5.15(m,1H),5.04-4.93(m,1H),4.77-4.72(m,1H),4.41-4.19(m,4H),3.80(s,6H),3.62-3.54(m,1H),3.11-2.97(m,1H),2.56(s,3H),2.42-2.31(m,3H)。LCMS：MS m/z=762.2[M+H]⁺。

步驟11：化合物1-15的合成

將化合物1-13(147g,186.74mmol,96.767%純度，1eq)溶於N,N-二甲基甲醯胺(1.5L)中，加入N,N-二異丙基乙胺(72.40g,560.23mmol,97.58mL,3eq)，再加入化合物1-14(42.54g,214.76mmol,1.15eq,2HCl)，升溫至50℃攪拌0.5小時。反應液直接用於下一步，得到化合物1-15的N,N-二甲基甲醯胺溶液。

步驟12：化合物1-16的合成

將化合物1-15(137.8g,187.02mmol,1eq)的N,N-二甲基甲醯胺溶液(1.5L)溶液加入到攪拌器中，加入三乙胺(18.92g,187.02mmol,26.03mL,1eq)，將二碳酸二第三丁酯(48.98g,224.42mmol,51.56mL,1.2eq)加到反應液中，18℃攪拌10小時。倒入水中(1.5L)，加入乙酸乙酯(400mL x 3)，飽和氯化銨水溶液(400mL x 4)，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得到化合物1-16。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=7.16(d,J=8.4Hz,4H),6.85(d,J=8.6Hz,4H),6.64(d,J=8.0Hz,1H),5.22(d,J=7.2Hz,1H),4.90-4.68(m,2H),4.61(s,1H),4.41-4.21(m,4H),4.04(s,1H),3.80(s,6H),3.71(s,1H),3.50(d,J=11.0Hz,2H),3.30(s,1H),3.24-3.02(m,2H),2.90(d,J=2.0Hz,1H),2.78-2.58(m,2H),2.55(s,3H),2.34(d,J=4.0Hz,3H),1.51(s,9H)。LCMS m/z=837.2[M+H]⁺。

步驟13：化合物1-17的合成

將化合物1-16(245g,278.10mmol,95%純度，1eq)溶於無水二氯甲烷(2500mL)，降溫至0~10℃，然後將間氯過氧苯甲酸(56.46g,278.10mmol,85%純度，1eq)分批加入，10℃攪拌0.5小時。補加間氯過氧苯甲酸(8.47g,41.71mmol,85%純度，0.15eq)，10℃繼續攪拌0.5小時。將該反應與(化合物1-16 10g批次)合併處理。反應液用飽和碳酸氫鈉洗(1500mL)，5%硫代硫酸鈉洗(1500mL)(濕潤澱粉碘化鉀試紙檢測合格後)，半飽和食鹽水洗(1500mL)，無水硫酸鈉乾燥過濾濃縮。柱層析純化乙酸乙酯：石油醚=10%-15%-20%-30%。得到化合物1-17。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.15(d,J=8.00Hz,4 H),6.85(d,J=8.80Hz,4 H),6.65(d,J=8.80Hz,1 H),5.27(m,1 H),4.78-4.91(m,2 H),4.61(s,1 H),4.24-4.38(m,4 H),3.90-4.18(m,2 H),3.78-3.82(m,6 H),3.42-3.70(m,3 H),3.33(br s,1 H),3.06-3.28(m,2 H),2.90(s,3 H),2.66(m,2 H),2.29-2.41(s,3 H),1.51(s,9 H)。LCMS m/z=853.2[M+H]⁺。

步驟14：化合物1-19的合成

將化合物1-18(18.24g,114.59mmol,1.2eq)溶於無水四氫呋喃(900mL)，降溫至-20℃，然後加入第三丁醇鈉(11.01g,114.59mmol,1.2eq)，攪拌15min。然後加入化合物1-17(90.5g,95.49mmol,90%純度，1eq)的無水四氫呋喃(180mL)，繼續攪拌0.5小時。該反應與(化合物1-18 50g批次)合併處理。向反應液中加入1000mL飽和氯化銨淬滅反應，分液，水相用乙酸乙酯萃取(1000mL)分液，無水硫酸鈉乾燥過濾，濃縮。柱層析純化(乙酸乙酯：石油醚=20%-50%-100%)得白色固體化合物1-19。LCMS m/z=948.4[M+H]⁺。

步驟15：化合物1-20的合成

將化合物1-19(97.00g,97.20mmol,95%純度，1eq)溶於2-甲基四氫呋喃(500mL)，降溫至0℃，然後將鹽酸(8M,614.80mL,50.6eq)滴加到反應液中，升至25℃攪拌2小時。加入正庚烷(200mL)分液，收集水相，加入2-甲基四氫呋喃(300mL)，用碳酸鈉調節pH=8~9，攪拌澄清，分液，收集有機相，水相用2-甲基四氫呋喃(300mL x 2)，收集有機相，飽和食鹽水洗(200mL)，無水硫酸鎂乾燥，過濾，收集有機相，濃縮得到粗品，用二氯甲烷(1000mL)溶解，將三氟乙酸(283.73g,2.49mol,184.24mL,25.6eq)緩慢加入到二氯甲烷中控制溫度在10℃以下，25℃攪拌3小時。將反應液倒入500mL冰水，攪拌至澄清，分液。有機相用水(300mL x 3)萃取。合併兩個批次水相，然後用二氯甲烷(500mL x 4)反萃，棄去有機相。將水相降溫至10℃，向水相在加入500mL2-甲基四氫呋喃(會放熱)，然後用碳酸鈉調pH=9，2-甲基四氫呋喃(400mL x 2)萃取，合併有機相，水洗(300mL x 4)，飽和食鹽水洗(300mL)，無水硫酸鈉乾燥過濾濃縮得灰色固體化合物1-20。LCMS m/z=608.27[M+H]⁺。

步驟16：式(I)化合物的合成

將化合物1-20(58g,84.00mmol,88%純度，1eq)，N,N-二異丙基乙胺(21.71g,168.00mmol,29.26mL,2eq)、2-(7-氮雜苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(38.33g,100.80mmol,1.2eq)溶於DMF(600mL)，然後降溫至0℃，分批加入2-氟丙烯酸(6.81g,75.60mmol,0.9eq)，0℃攪拌10min。將反應液倒入900mL水中，然後乙酸乙酯萃取(200mL x 3)，合併有機相，飽和氯化銨洗(200mL x 3)，飽和碳酸鈉洗(200mL x 3)，飽和食鹽水洗(200mL)，無水硫酸鈉乾燥過濾濃縮。然後用乙腈：水(100mL：150mL)打漿16小時，過濾得到式(I)化合物。SFC分析方法(柱子：Chiralcel OD-3,50×4.6mm I.D.,3μm；流動相：A(CO2)和B(甲醇，含0.05%二異丙胺胺)；梯度：B%=5~50%，3min；流速：3.4mL/min；波長：220nm；壓力：1800psi，光學純度：99.21%，出峰時間：1.840min。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ=6.80-6.68(m,1H),5.73-5.51(m,1H),5.46-5.19(m,3H),5.05-4.90(m,3H),4.74-4.58(m,2H),4.37-4.26(m,1H),4.20-4.06(m,2H),4.05-3.84(m,3H),3.79-3.59(m,2H),3.54-3.43(m,1H),3.42-3.35(m,1H),3.31-3.24(m,1H),3.13-2.89(m,3H),2.82-2.52(m,2H),2.50-2.42(m,1H),2.41-2.30(m,5H),2.29-2.18(m,1H)。

實施例2：式(III)化合物的單晶X-射線繞射檢測分析

取0.0133g式(II)化合物A晶型在室溫條件下溶解於2mL乙腈中。將樣品溶液置於4mL半密封樣品瓶中，在室溫下緩慢揮發。十天後得到無色塊狀晶體。收集晶體，用單晶X射線繞射儀(D8-VENTURE)收集繞射強度數據。式(III)化合物的晶體結構數據見表2，式(III)化合物立體結構橢球圖見附圖6。

實施例3：式(II)化合物A晶型的製備

方法一：將式(I)化合物(0.2g)加入到乙醇(2.4mL)中，加熱至50℃，溶清後將水(0.48mL)緩慢加入到反應液中，在50℃下攪拌72小時，過濾，收集固體得到式(II)化合物A晶型。

方法二：將式(I)化合物(5.0g)加入到乙醇(4V)攪拌至澄清，將水(1V)緩慢加入到體系中，在20~30℃下加入晶種(0.5g)，在此溫度下攪拌15小時，再緩慢滴加水(3V)，繼續攪拌1~3小時。過濾收集濾餅，得到式(II)化合物A晶型。

實施例4：式(II)化合物A晶型的固體穩定性試驗

依據《原料藥與製劑穩定性試驗指導原則》(中國藥典2015版四部通則9001)，考察式(II)化合物A晶型在高溫(60℃，敞口)，高濕(室溫/相對濕度92.5%，敞口)及強光照(5000lx，敞口)條件下的穩定性，以及長期實驗(25±2℃/60±5% RH)，加速實驗(40±2℃/75±5% RH)條件下的晶型穩定性。

秤取式(II)化合物A晶型約20mg，置於玻璃樣品瓶的底部，攤成薄薄一層。高溫及高濕條件下放置的樣品用鋁箔紙封瓶口，並在鋁箔紙上紮些小孔，保證樣品能與環境空氣充分接觸；強光照條件下放置的樣品用鋁箔紙封瓶口，並在鋁箔紙上紮些小孔。不同條件下放置的樣品於第5天，10天取樣檢測(XRPD)，檢測結果與0天的初始檢測結果進行比較，試驗結果見下表3所示。

將式(II)化合物A晶型放入雙層藥用低密度聚乙烯袋中，每份藥用低密度聚乙烯袋分別用紮帶紮緊，再放入單層鋁箔袋中並熱封，最後將樣品儲存在塑料桶中，儲存在穩定性恒溫恒濕箱中。穩定性試驗所用的包裝模擬物料存儲包裝，在紅光下將物料分裝為1.5g/包的穩定性樣品，每份樣都以相同的方式包裝並貼好穩定性樣品標簽，在不同條件下放置的樣品於第3個月，第6個月取樣檢測(XRPD)，檢測結果與0天的初始檢測結果進行比較，試驗結果見下表3所示。

結論：式(II)化合物A晶型在高溫、高濕、強光照條件下，以及長期實驗和加速實驗的條件下具有良好的穩定性。

生物測試數據：

實驗例1：化合物對KRAS^G12C突變的MIA-PA-CA-2細胞增殖抑制作用的測試

1.1 實驗目的

測試化合物對KRAS^G12C突變的MIA-PA-CA-2細胞增殖抑制的IC₅₀。

1.2 試劑

本研究使用的主要試劑包括CellTiter-Glo(Promega，貨號：G7573)。

1.3 儀器

本研究所使用主要儀器為PerkinElmer EnVision多功能酶標儀。

1.4 實驗方法

1)貼壁細胞經胰酶消化處理成細胞懸液，並對細胞懸液進行計數備用。

2)取適量細胞至離心管並用細胞培養液補足至需要體積，鋪至96孔板，終密度為2000細胞/孔，100μL培養液。

3)培養24小時後，將化合物用DMSO配置成10mM，並用DPBS(杜比可磷酸緩衝鹽)以3倍梯度稀釋9個點，每孔加入10μL，兩複孔。實驗對照孔(Con)每孔加入10μL DPBS。

4)同天，取一塊未加藥處理的細胞培養板，加入50μL CellTiter Glo，利用EnVision進行螢光讀值，標記為Day0讀值。

5)加藥處理後的細胞培養72h後，去除培養板，向細胞板中加入50μL CellTiter Glo，利用EnVision進行螢光讀值。

6)數據分析：按下列公式計算各孔對細胞的抑制率：

* F_Day0為未加藥處理的原始細胞數目測試孔的讀值；

F_Con為培養72小時後，Con組的螢光讀值。

F_Cpd為培養72小時後，各化合物孔的螢光讀值。

7)使用GraphPad Prism軟體對化合物的抑制率數據(抑制率%)進行log(agonist)vs.response--Variable slope非線性擬合分析，得到化合物的IC₅₀值，擬合公式為：

Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC₅₀-X)*HillSlope))

1.5 實驗結果

實驗結果顯示式(I)化合物對KRASG12C突變的MIA-PA-CA-2細胞系具有良好的細胞增殖抑制活性。

實驗例2：化合物對KRAS^G12C突變的H358細胞增殖抑制作用的測試

2.1 實驗目的

測試化合物對KRAS^G12C突變的H358細胞增殖抑制的IC₅₀。

2.2 試劑

本研究使用的主要試劑包括RPMI-1640培養基，盤尼西林/鏈黴素抗生素購自維森特，胎牛血清購自Biosera。CellTiter-Glo(細胞活率化學發光檢測試劑)試劑購自Promega。NCI-H358細胞系購自中國科學院細胞庫。

2.3 儀器

本研究所使用主要儀器為Nivo多標記分析儀(PerkinElmer)。

2.4 實驗方法：

1)將NCI-H358細胞種於白色96孔板中，80μL細胞懸液每孔，其中包含4000個NCI-H358細胞。細胞板置於二氧化碳培養箱中過夜培養。

2)將待測化合物用排槍進行5倍稀釋至第9個濃度，即從2mM稀釋至5.12nM，設置雙複孔實驗。向中間板中加入78μL培養基，再按照對應位置，轉移2μL每孔的梯度稀釋化合物至中間板，混勻後轉移20μL每孔到細胞板中。轉移到細胞板中的化合物濃度範圍是10μM至0.0256nM。細胞板置於二氧化碳培養箱中培養5天。另準備一塊細胞板，在加藥當天讀取信號值作為最大值(下面方程式中Max值)參與數據分析。向此細胞板每孔加入25μL細胞活率化學發光檢測試劑，室溫孵育10分鐘使發光信號穩定。採用多標記分析儀讀數。

3)向細胞板中加入每孔25μL的細胞活率化學發光檢測試劑，室溫孵育10分鐘使發光信號穩定。採用多標記分析儀讀數。

數據分析：

利用方程式(Sample-Min)/(Max-Min)*100%將原始數據換算成抑制率，IC₅₀的值即可通過四參數進行曲線擬合得出(GraphPad Prism中"log(inhibitor)vs.response--Variable slope"模式得出)。表5提供了本發明的化合物對NCI-H358細胞增殖的抑制活性。

結論：式(I)化合物對NCI-H358細胞增殖展現出較好的抑制活性。

實驗例3：肝細胞代謝穩定性

實驗目的：評定受試化合物分別在CD-1小鼠、SD大鼠、比格犬、食蟹猴、人肝細胞中的代謝穩定性

實驗操作：準備若干96孔樣品沉澱板，分別命名為T0、T15、T30、T60、T90、T120、T0-MC、T120-MC和空白基質。提前取出復蘇培養液和孵育培養液，放置在37℃水浴鍋中預熱。從液氮罐中取出凍存的肝細胞，立即浸沒到37℃水浴中(約90秒)。待凍存部分溶化鬆動後，分別倒入含有40mL復蘇培養液的離心管中，輕柔的顛倒讓細胞在復蘇培養液中重懸。室溫條件下，100×g離心5分鐘，移除上清液，用適當體積的孵育培養液重懸肝細胞，用台盼藍染色法計算細胞活率。將198μL的肝細胞混懸液(0.51×106cells/mL)加入到已預熱的孵育板中，培養液對照組加入198μL不含肝細胞的孵育培養液至T0-MC和T120-MC 孵育板中，所有孵育板在37℃培養箱中預孵育10分鐘。然後加入2μL供試品和對照化合物工作液，混勻，立即將孵育板放入培養箱內的搖板機中，啟動計時器開始反應。每個化合物的每個時間點準備2個重複樣本。孵育條件為37℃、飽和濕度、含5%CO₂。測試體系中，供試品的終濃度為1μM，對照品的終濃度為3μM，肝細胞的終濃度為0.5×106cells/mL，總有機溶劑的終濃度為0.96%，其中DMSO的終濃度為0.1%。相應時間點孵育結束時，取出孵育板，取出25μL化合物和對照化合物與細胞的混合液加入到含有125μL終止液(含有200ng/mL甲苯磺丁脲和拉貝諾爾的乙腈溶液)的樣品板中。對於Blank樣品板，直接加入25μL不含肝細胞的孵育培養液。所有樣品板封膜後在搖板機上以600rpm搖10分鐘後，3220×g離心20分鐘。供試品和對照品上清液用超純水以1：3的比例稀釋。所有樣品混勻後用LC/MS/MS的方法進行分析。

實驗結果：實驗結果如表6所示。

實驗結論：多種屬肝細胞代謝實驗顯示式(I)化合物具有良好的代謝穩定性。

實驗例4：體外肝微粒體穩定性研究

實驗目的：評定受試化合物分別在CD-1小鼠、SD大鼠、比格犬、食蟹猴、人肝微粒體中的代謝穩定性

實驗操作：準備2塊96孔孵育板，分別命名為T60孵育板和NCF60孵育板。在T60孵育板和NCF60孵育板上分別加入445μL微粒體工作液(肝微粒體蛋白濃度為0.56mg/mL)，然後將上述孵育板放置於37℃水浴鍋中預孵育大約10分鐘。

預孵育結束後，在T60孵育板和NCF60孵育板上分別加入5μL供試品或對照化合物工作液，混勻。在NCF60孵育板上每孔添加50μL磷酸鉀鹽緩衝液啟動反應；在T0終止板中加入180μL的終止液(含200ng/mL甲苯磺丁脲和200ng/mL拉貝洛爾的乙腈溶液)和6uL的NADPH再生體系工作液，從T60孵育板中取出54μL樣品至T0終止板(T0樣品產生)。在T60孵育板上每孔添加44μLNADPH再生體系工作液啟動反應。在Blank板中只添加54μL微粒體工作液、6uL的NADPH再生體系工作液和180μL的終止液。因此，在供試品或對照化合物的樣品中，化合物、睾酮、雙氯芬酸和普羅帕酮的反應終濃度為1μM，肝微粒體的濃度為0.5mg/mL，DMSO和乙腈在反應體系中的終濃度分別為0.01%(v/v)和0.99%(v/v)。孵育適當時間(如5、15、30、45和60分鐘)後，分別在每個終止板的樣品孔中加入180μL的終止液(含200ng/mL甲苯磺丁脲和200ng/mL拉貝洛爾的乙腈溶液)，之後從T60孵育板中取出60μL樣品以終止反應。所有樣品板搖勻並在3220×g離心20分鐘，然後每孔取80μL上清液稀釋到240μL純水中用於液相色譜串聯質譜分析，液相色譜串聯質譜分析所有樣品進樣分析。

實驗結果：實驗結果如表7所示。

實驗結論：肝微粒體代謝穩定性研究顯示式(I)化合物具有良好的代謝穩定性

實驗例5：血漿穩定研究

實驗目的：評定受試化合物分別在CD-1小鼠、人的血漿穩定性

實驗操作：將凍存的血漿解凍10~20分鐘，待血漿完全解凍後，將其置於離心機中以3220×g離心5分鐘，去除其中存在的懸浮物和沉澱物。準備96孔孵育板，分別命名為T0、T10、T30、T60、T120。將孵育板中對應的加入98μL的小鼠、大鼠、犬、猴和人空白血漿，然後加入2μL化合物或對照化合物的工作液加入到對應的孵育板中，每個樣品準備兩個平行孔。所有的樣品在37℃水浴鍋中進行孵育。化合物和對照化合物比沙可啶、馬來酸依那普利、普魯卡因和普魯本辛的最終孵育濃度為2μM，最終有機相含量為2.0%。每一個孵育時間點結束時，取出相應的孵育板，向每個對應的樣品孔中加入400μL含有200ng/mL甲苯磺丁脲和拉貝諾爾的乙腈溶液沉澱蛋白。所有樣品板封膜並搖勻後，3220×g離心20分鐘。取50μL上清液加入100μL超純水稀釋，所有樣品混勻後用LC/MS/MS的方法分析。

實驗結果：實驗結果如表8所示。

實驗結論：式(I)化合物在人和小鼠血漿中的穩定性良好。

實驗例6：全血穩定研究

實驗目的：評定受試化合物分別在評定受試化合物分別在CD-1小鼠、SD大鼠、比格犬、食蟹猴的全血穩定性

實驗操作：在實驗當天或實驗的前一天，採用抗凝劑EDTA-K2採集新鮮的CD-1小鼠、SD大鼠、比格犬、食蟹猴全血。在實驗開始前，將全血與PBS進行1：1(v：v)混合，放置於37℃水浴鍋中預熱10~20分鐘。準備96孔孵育板，分別命名為T0、T30、T60、T240。在對應的孵育板中，包括T0、T30、T60和T240孵育板，將2μL化合物或對照化合物的工作液與98μL的小鼠、大鼠、犬、猴和人空白全血混合，每個樣品準備兩個平行孔。所有的樣品在37℃水浴鍋中進行孵育。化合物的最終孵育濃度為5μM，對照化合物的最終孵育濃度為2μM。每一個時間點孵育結束時，取出相應的孵育板，立即向對應的樣品孔中加入100μL超純水，混勻，然後加入800μL含有200ng/mL甲苯磺丁脲和拉貝諾爾的乙腈溶液沉澱蛋白。樣品板封膜並搖勻後，3220×g離心20分鐘。取150μL上清液用LC/MS/MS的方法分析。

實驗結果：實驗結果如表9所示。

實驗結論：多種屬全血穩定性研究顯示式(I)化合物在全血中的穩定性良好。

實驗例7：蛋白結合率研究

實驗目的：採用平衡透析法測定受試化合物在CD-1小鼠、SD大鼠、比格犬、食蟹猴和人血漿中的蛋白結合率。

實驗操作：採用上述五個物種的血漿分別配製化合物濃度為2μM的血漿樣品，置於96孔平衡透析裝置中，在37±1℃下用磷酸鹽緩衝溶液透析4h。本實驗採用華法林作為對照化合物。血漿和透析緩衝液中待測物的濃度用LC-MS/MS法進行測定。

實驗結果：實驗結果如表10所示。

實驗結論：多種屬血漿結合率研究顯示式(I)化合物在血漿中具有更高的蛋白未結合率。

實驗例8：體內藥代動力學研究

1)SD大鼠口服及靜脈注射受試化合物的藥代動力學研究

受試化合物與5%二甲基亞碸/95%(10%羥丙基-β-環糊精)溶液混合，渦旋並超聲，製備得到1mg/mL澄清溶液，微孔濾膜過濾後備用。選取7至10周齡的雄性SD大鼠，靜脈注射、口服給予候選化合物溶液。收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin軟體(美國Pharsight公司)計算藥代參數。實驗結果如表11所示：

實驗結論：PK研究顯示，式(I)化合物在大鼠中具有較高的非結合血漿暴露量和良好的口服生物利用度。

2)SD大鼠口服式(II)化合物的A晶型的藥代動力學研究

精確稱量109.72mg的受試化合物到玻璃瓶中，加入774uL 0.5%甲基纖維素(400粘度)水溶液，攪拌5分鐘，加入10mL的0.5%甲基纖維素(400粘度)水溶液，攪拌5分鐘，得均勻的不透明的混懸液。選取7至10周齡的雄性SD大鼠，口服給予候選化合物溶液。收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin軟體(美國Pharsight公司)計算藥代參數。實驗結果如表12所示：

實驗結論：PK研究顯示，式(II)化合物A晶型在大鼠中具有高的暴露量

3)CD小鼠口服及靜脈注射受試化合物的藥代動力學研究

受試化合物與5%二甲基亞碸/95%(10%羥丙基-β-環糊精)溶液混合，渦旋並超聲，製備得到1mg/mL澄清溶液，微孔濾膜過濾後備用。選取7至10周齡的雄性CD小鼠，靜脈注射、口服給予候選化合物溶液。收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin軟體(美國Pharsight公司)計算藥代參數。實驗結果如表13所示：

實驗結論：PK研究顯示，式(I)化合物在小鼠中具有較高的非結合血漿暴露量和良好的口服生物利用度。

4)比格犬口服受試化合物的藥代動力學研究

精確稱量680.397mg受試化合物的粉末，加入50mL的0.5%甲基纖維素(400粘度)水溶液，攪拌10min，超聲10min。加入50mL0.5%甲基纖維素(400粘度)水溶液，使用勻漿機均質化10min。加入11mL，超聲5min，攪拌10min，加入358μL 0.5%甲基纖維素(400粘度)水溶液，攪拌2min。選取六個月以上雄性比格犬，口服給予候選化合物溶液。收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin軟體(美國Pharsight公司)計算藥代參數。實驗結果如表14所示：收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin軟體(美國Pharsight公司)計算藥代參數。實驗結果如表14所示：

表14.受試化合物的藥代動力學結果

實驗結論：PK研究顯示，式(II)化合物的A晶型在犬中具有高的暴露量。

實驗例9：體內藥效學研究

人胰腺癌Mia PaCa-2細胞裸小鼠皮下移植腫瘤Balb/c Nude小鼠模型的體內藥效學研究

1.細胞培養和腫瘤組織準備

細胞培養：人胰腺癌Mia PaCa-2細胞(ATCC-CRL-1420)體外單層培養，培養條件為DMEM培養基中加10%胎牛血清，2.5%馬血清，37℃ 5%二氧化碳孵箱培養。一周兩次用胰酶-EDTA進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量到達要求時，收取細胞，計數，重懸於適量PBS中，1：1加入基質膠，獲取細胞密度為25 x 106cells/mL的細胞懸液。

細胞接種：將0.2mL(5×106cells/mouse個)Mia PaCa-2細胞(加基質膠，體積比為1：1)皮下接種於每只小鼠的右後背，腫瘤平均體積達到190mm³時，根據腫瘤體積進行隨機分組，按照表15中的方案開始給藥。

表15.實驗動物分組及給藥方案

2.腫瘤測量和實驗指標

每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V=0.5a×b²，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。

化合物的抑瘤療效用TGI(%)或相對腫瘤增殖率T/C(%)評價。相對腫瘤增殖率T/C(%)=TRTV/CRTV×100%(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對照組RTV)。根據腫瘤測量的結果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計算公式為RTV=Vt/V0，其中V0是分組給藥時(即D0)測量所得平均腫瘤體積，Vt為某一次測量時的平均腫瘤體積，TRTV與CRTV取同一天數據。

TGI(%)，反映腫瘤生長抑制率。TGI(%)=[(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積))/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)]×100%。

3.實驗結果

實驗結果如圖4、5所示。

給藥22天時結果如表16所示

實驗結論：式(I)化合物具有顯著的抑瘤作用，且小鼠各個劑量組的體重平穩，無明顯不耐受現象。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種式(II)化合物，
其中，n選自0.1~2。
根據請求項1所述的化合物，其中n選自0.1、0.5、1、1.5和2。
根據請求項2所述的化合物，其中n選自2。
一種式(II)化合物的A晶型，
其中，n選自1~2，其特徵在於其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：8.514±0.200°、14.689±0.200°、18.122±0.200°。
根據請求項4所述的A晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：6.218±0.200°、8.514±0.200°、12.299±0.200°、 14.689±0.200°、16.903±0.200°、18.122±0.200°、18.927±0.200°、25.580±0.200°。
根據請求項5所述的A晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：6.218±0.200°、8.514±0.200°、11.663±0.200°、12.299±0.200°、14.689±0.200°、16.903±0.200°、18.122±0.200°、18.927±0.200°、19.364±0.200°、20.386±0.200°、21.914±0.200°、25.580±0.200°。
根據請求項6所述的A晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：6.218°、8.514°、11.663°、12.299°、14.689°、16.903°、18.122°、18.554°、18.927°、19.364°、20.386°、21.914°、22.640°、23.867°、24.553°、24.806°、25.580°、25.988°、27.147°、27.715°、29.135°、31.799°。
根據請求項7所述的A晶型，其XRPD圖譜如圖1所示。
根據請求項4~8任意一項所述的A晶型，其差示掃描量熱曲線在115.37℃±3℃處具有吸熱峰的峰值。
根據請求項9所述的A晶型，其DSC圖譜如圖2所示。
根據請求項4~8任意一項所述的A晶型，其熱重分析曲線在150.0℃±3℃時失重達5.379%。
根據請求項11所述的A晶型，其TGA圖譜如圖3所示。
根據請求項4~8任意一項所述的A晶型，其中n選自2。
一種根據請求項1~3任意一項所述的化合物或請求項4~13任意一項所述的A晶型在製備治療實體瘤藥物中的應用。
根據請求項14所述的應用，其中，實體瘤選自肺癌和直腸癌。