TWI811345B - 使用利用紫外線表面激發的顯微鏡術對組織產生組織學層級的三維成像 - Google Patents
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Abstract
本揭示實施例係相關於對生物材料之樣本執行三維(3D)成像操作的系統。在操作期間，該系統獲得生物材料之樣本並對該樣本執行一系列切片操作以相繼移除該樣本的切片。在該系列之切片操作在進行同時，該系統使用利用紫外線表面激發(MUSE)表面加權成像的顯微鏡術對各切片操作後的樣本之暴露區塊面執行成像操作。最後，該系統將由塊面成像操作所產生的影像組合成三維資料集以供查看和分析。
Description
本揭示實施例相關於用於產生生物組織之三維(3D)影像的技術。更明確的，本揭示實施例相關於用於使用利用紫外線表面激發(MUSE)成像系統的顯微鏡術對組織產生組織學層級的三維影像之技術。
諸如核磁共振成像(MRI)等3D醫療成像技術的發展透過使醫療保健專業人員能夠更好地視覺化且診斷各種醫療疾病而徹底改變了醫學的行醫方式。然而，現存的3D成像技術在成本、操作便利性(accessibility)、使用難易度、解析度、可成像組織、以及對比機制等方面存在缺陷。現存醫療成像技術(例如，PET、MRI以及CT)典型上提供有限解析度(約0.1 mm到3 mm)以及有限對比度機制，即使在使用專用染劑時亦是如此。此外，系統成本可以從$500,000美元到上百萬美元不等，且其操作便利性受限於具有適當人員與核心設施之較大型機構。生物發光(bioluminescence)和體內螢光(in-vivo fluorescence)成像系統提供甚至更低的解析度和非常有限的對比機制。習知用於產生3D影像之連續組織學技術是勞動密集且易出現不精準3D登錄。習知冷凍成像(cryo-imaging)技術可在大型樣本(大至大鼠之程度)上進行。然而，解析度受限於光散射。透過使用亦會照明的鑽石刀對組織切片成像來操作刀口顯微鏡術系統(Knife-edge microscopy system)；然而，此等系統需要滾動快門(rolling shutter)組態之照相機精準對準刀之運動與速度，且該系統非常昂貴。其他方法使用多光子成像組態，其為複雜且昂貴的。
許多光學成像模態(例如，光片顯微鏡術)與組織清潔(tissue clearing)相結合，以成像小到小鼠尺寸的樣本。透過添加使整個組織中的折射率均勻化或去除高散射的組分(例如，脂質)的化合物，可以降低散射並且可以使組織透明。此方法普遍用於產生完整器官(例如，腦部組織)的高解析度3D影像。雖然此技術有優點，其亦有限制。大部分協定是耗時的且涉及許多步驟，有些步驟會減少或淬滅螢光，有些步驟會扭曲組織，所有步驟皆可能移除感興趣組分，且無步驟對大型樣本(例如，整隻小鼠)而言是理想的。此外，清潔組織是使用昂貴顯微鏡(例如，光片或2光子顯微鏡)所成像的，並在解析度與視野之間有所折衷。
因此，需要一種新穎技術用於產生組織樣本之高解析度3D影像而無現存技術之上述缺點。
本揭示實施例係相關於對生物材料之樣本執行三維(3D)成像操作的系統。在操作期間，該系統獲得生物材料之樣本並對該樣本執行一系列切片操作以相繼移除該樣本的切片。在該系列的切片操作在進行同時，該系統使用利用紫外線表面激發(MUSE)表面加權成像的顯微鏡術對各切片操作後的樣本之暴露塊面(exposed block face)執行成像操作。最後，該系統將由塊面成像操作所產生的影像組合成三維資料集以供查看和分析。
在若干實施例中，使用下述者執行該系列的切片操作：切片機(microtome)、冷凍切割機(cryotome)、振動切割機(vibratome)、壓縮切割機(compresstome)、鑽石線、或雷射。
在若干實施例中，該系統選擇性保留一或多移除的組織切片以用於下游分析。
在若干實施例中，基於與該組織切片相關之塊面之影像的特徵，將移除的組織切片選擇性保留。
在若干實施例中，該系統在執行成像操作之前將該生物材料之樣本染色。
在若干實施例中，將該樣本染色涉及在執行該系列的切片操作之前將整個樣本染色。
在若干實施例中，將該樣本染色涉及執行逐切片染色操作，該染色操作在各切片操作之後並在對新的塊面進行成像之前對該暴露的新塊面進行染色。
在若干實施例中，各逐切片染色操作涉及使用下述應用技術之一者：透過氣溶膠或液滴噴灑；液體輸送；蒸汽輸送；以及使用含染劑的墊片或其他支撐物轉移染劑。
在若干實施例中，若有必需性則該系統在各染色操作後執行清洗步驟。
在若干實施例中，在染色該樣本同時，該系統利用超音波、微波或其他機械式輔助來輔助組織穿透。
在若干實施例中，將該樣本染色涉及使用染劑、固定劑及/或其他組織調節劑在體內或離體灌注該樣本。
在若干實施例中，將該樣本染色涉及使用下述染劑之一或多者：螢光染劑；免疫染劑；使用抗體的分子靶向染劑(molecularly targeted stain)；肽；具有化學親和力的靶向染劑，其不同於免疫螢光組織染料；溶劑；以及pH調節劑。
在若干實施例中，該系統向該樣本施加對比增強劑(諸如醋酸)以改善組織影像對比度。
在若干實施例中，該成像操作除了MUSE外涉及使用第二成像模態，其中該第二成像模態可包括螢光顯微鏡術或螢光壽命成像(fluorescence lifetime imaging，FLIM)。
在若干實施例中，該系統透過向該樣本施加支持基質(例如丙烯酰胺)以促進膨脹顯微鏡術，其中該支持基質在成像操作之前膨脹並增加該樣本中細胞的尺寸。
在若干實施例中，該樣本是下述一者：新鮮樣本；固定樣本；冷凍樣品；以及嵌入支持基質中的樣本。
以下說明經呈述以使得在該技術領域中具有通常知識者能夠製造和使用本實施例，並且在特定應用及其需求的背景下提供以下說明。對於該技術領域中具有通常知識者而言，對所揭示實施例的各種修改是顯而易見的，並且在不脫離本實施例的精神和範圍之前提下，本文定義的一般原則(general principles)可以應用於其他實施例和應用中。因此，本實施例並不受限制於所示實施例中，而其應符合與本文揭示的原理和特徵一致的最寬範圍。
在本詳細說明中所陳之資料結構與碼典型上是儲存在電腦可讀取儲存媒體上，該電腦可讀取儲存媒體可以是任何可以儲存被電腦系統所使用之碼及/或資料的裝置或媒體。電腦可讀取儲存媒體包括但不限於揮發性記憶體、非揮發性記憶體、磁碟和光學儲存裝置，例如磁碟驅動器，磁帶，CD(光碟)，DVD(數位多功能碟或數位視訊碟)、或能夠儲存現在已知或未來開發的電腦可讀取媒體的其他媒體。
在本實施方式段落中所述方法及處理可實現成碼及/或資料，其可儲存於上述電腦可讀取儲存媒體中。當電腦系統讀取且執行儲存在電腦可讀取儲存媒體上之碼及/或資料時，該電腦系統執行儲存在該電腦可讀取儲存媒體內且實現成資料結構與碼之該方法及處理。此外，下述方法及處理可被包括在硬體模組中。舉例而言，該硬體模組可包括但不限於專用積體電路(ASIC)晶片、現場可程式化閘極陣列(FPGA)以及其他已知或未來開發的可程式化邏輯裝置。當硬體模組經啟動時，該硬體模組會執行包括在該硬體模組內之方法與處理。在本實施方式段落中所述方法及處理可實現成碼及/或資料，其可儲存於上述電腦可讀取儲存媒體中。總體概述
所揭示實施例促進生物組織樣品(specimen)之3D成像。可使用振動切割機、壓縮切割機、冷凍切割機或切片機技術依序將厚樣品切片，其中在每次切片操作之後使用MUSE表面加權成像進行塊面成像(block-face imaging)。此種技術之一優點在於可在幾秒內完成各新的塊面之染色，這代表大組織塊無須在切片開始之前預先深入詳細標記。替代地，樣品可預先被標記，無論離體使用較長的培養(incubation)時間，抑或可在犧牲(sacrifice)前在體內進行標記。此外，該組織可以是活體的，且在3D切片過程期間可監測若干機能態樣。由於各塊面影像相對於先前影像相當好地登錄，取決於發生逐切片組織移動的程度可以創造3D重建，其在軸向方向上基本上是無限的，並且具有由所用切片方法所判定之x-y範圍。因此，可在軟體中將影像組合形成3D影像，以允許定位與探索。
所揭示實施例利用稱作「利用UV表面激發(MUSE)之顯微鏡術」的新成像模態，其提供直覺且不昂貴的成像技術，該成像技術直接且迅速地從新鮮或固定的組織產生具有增強的空間和顏色資訊的診斷品質影像。成像處理是非破壞性的，以允許下游分子分析。(請參見Farzad Fereidouni等人所著之「用於無載玻片組織學和病理學成像的利用UV表面激發(MUSE)之顯微鏡術(Microscopy with UV Surface Excitation (MUSE) for slide-free histology and pathology imaging)」，Proc. SPIE 9318，Optical Biopsy XIII：Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis，93180F，2015年3月11日。)
為了促進MUSE成像，使用常見螢光染料短暫染色樣本，接著進行會產生高度表面加權的影像之280nm的UV光激發，這是因為在該波長下光的穿透深度有限。本技術亦利用「USELESS」(具有長發射斯托克斯位移的UV染色激發)現象，用於產生在可見光範圍內之廣譜影像。應注意即使在單張快照中MUSE亦可完整提供表面拓樸資訊，雖然其並非是完全三維的(3D)，該等影像為易於獲取且易於解譯的以對組織結構提供更高解析性。
本揭示實施例使得執行基於MUSE之3D成像是可行的，其被參照為3D-MUSE。3D-MUSE提供一種強大新的技術，用於對小至大(例如，整隻小鼠)樣品自動執行具有擴充深度的3D組織學品質成像，從而賦能大量生物學與臨床前應用。除了自發螢光之外，該系統可運用自表面施加和灌注的組織學染色、螢光蛋白質(例如，轉基因動物、基因治療和標記的外源細胞)、體內成像劑和成像或治療診斷奈米顆粒所導致之螢光對比度。潛在應用包括組織3D顯微解剖學、小鼠模型表型分析、胚胎細胞譜系追踪、奈米顆粒傳遞監測、轉移性癌症檢測、癌症病理生理學研究、免疫治療、幹細胞、毒理學、臨床前和人體器官疾病過程中的繪圖、以及一系列的動植物基礎生物學研究。
3D-MUSE亦解決成本與產量之問題。在若干研究室中，大部分研究預算分配用於獲取和分析組織學。研究人員經常受到阻礙，因為他們希望通過廣泛的組織學分析進行實驗，但其成本和勞動性是令人望而卻步的。自動化3D-MUSE可透過促進影像引導組織學而大幅降低此等負擔，並且提供形態學引導的分子分析，其可以賦能較快、技術需求較低且較精準之實驗。
當前而言，孤立的2D組織學切片使得幾乎不可能完全理解3D顯微解剖學。透過提供組織學品質的影像，3D-MUSE使得可以輕易獲取3D顯微解剖學。感興趣的正常和患病結構包括：腎單位(腎小球，相關血管和腎小管); 乳房小葉結構和連接導管系統; 腦(血管，腦室，確定的功能區，脈絡叢); 和肝臟(混合血管系統-肝臟和全身血管，膽管)。
在3D-MUSE系統中，成像時間不會如所想像般具限制性。透過以一波長激發且使用彩色照相機成像，使得在單張快照中獲得所有的螢光資料是可能的。考慮在1.8 cm×1.2 cm視野(FOV)上進行4-μm成像之3D-MUSE-cryo，其可以容納大多數胚胎在其側處。以每切片3.5秒而言，可能在23分鐘內獲得4-μm×4-μm×20-μm解析度或在11.5分鐘內獲得4-μm×4-μm×40-μm解析度之組織學品質。透過大型載台的拼貼，可以在一夜之間對40個胚胎進行成像。相較之下，在先前研究中，使用μCT對單一出生後之小鼠進行成像就需要5個小時，以及使用MRI對多個胚胎進行成像即需要6到24個小時。應注意，雖然MRI與CT提供解剖學的影像，惟其不成像報導基因(gene reporters)並使用受限之染劑。
初步結果是有希望的。圖3A-3B和圖4A-4C描繪運用刀切割新鮮或固定組織，放置在具有UV透明藍寶石窗的載台上，並用倒置的MUSE顯微鏡成像所獲得的習知MUSE結果。圖3A-3B描繪由於表面之光穿透降低，故在280nm激發時會如何改善影像品質。更明確地，圖3A描繪當在405nm激發時，曙紅染色的腎組織會如何產生模糊影像。相較之下，圖3B描繪當以280nm激發組織時使用MUSE，由為MUSE之小於10nm之光穿透性，而可以實現之精細細節。
圖4A-4C描繪MUSE與標準H&E之間的極優良對應性。更明確的，圖4A描繪前列腺組織的薄組織切片的影像，其提供了當使用曙紅色、Hoechst和碘化丙啶染色時之色域。圖4B描繪從MUSE影像所計算出之虛擬H&E影像，其顯示經增強的基質細節，該等細節於隨後圖4C所顯示之用H＆E染色的同一載玻片中為不明顯的。應注意，與習知H&E相比，從MUSE所獲得之虛擬H&E提供經改善之細胞定義。
圖5A-5C示出了塊面的MUSE影像，其具有比習知螢光成像所能獲得更好的有效解析度，習知螢光成像在該尺度下受光散射之影響。更具體地說，圖5A-5C提供了E12.5小鼠胚胎(在Engrailed1cre啟動子下的Rosa 26TdTomato)的冷凍成像和3D-MUSE-cryo成像的比較。由於降低之光穿透之緣故，圖5C所描繪之RGB-MUSE影像相較於圖5A所描繪之彩色影像與圖5B所描繪之螢光影像顯示更多細節。應注意，在圖5C之MUSE影像中舌與腦室清晰可見(分別是黃色與藍色箭頭所示)，其在圖5A與5B所描繪之習知影像中是不可視的。
圖6A-6C與圖7A-7B描繪小鼠胚胎的3D-MUSE-cryo影像(Engrailed1cre啟動子下的E12.5 Rosa 26TdTomato)。在圖6A-6C中，高TdTomato表示之區被分段：三叉神經節(洋紅色)和後腦(黃色)。對應於圖6A中的平面的原始影像切片分別經描繪於圖6B和6C中。應注意，皮膚經數位移除因為高表示限制了動態範圍。圖7A提供了小鼠胚胎的3D-MUSE-cryo影像，其在用於研究發育的轉基因胚胎(Engrailed1cre啟動子下的E12.5 Rosa 26TdTomato)中顯示出鮮紅色螢光。應注意，圖7A只有顯示滑鼠胚胎之頂部，圖7B描繪其水平切面。另外，標記的細胞位於由箭頭所標識的位置中：三叉神經節(白色)、後腦(金色)和三叉神經節隆起(藍色)。因此，圖6A-6C與7A-7B中所描繪之結果影像品質與從2D冷凍切片(cryo-section)組織學中獲得者相似。3D 成像系統
圖1描繪一種例示性3D成像系統100，其根據本揭示實施例擷取組織樣本108之影像。更明確地，圖1描繪一種成像裝置，其包含感測器陣列102與接物鏡104。本成像裝置獲取組織樣本108之影像，該樣本固定於諸如切片機110等切片裝置，該切片裝置包括刀片114用於執行一系列的切片操作。切片機110是位於可移動載台112上。(應注意，該切片裝置通常包括可從組織樣本108切片之任何類型裝置，其包括：切片機(microtome)、冷凍切割機(cryotome)、振動切割機(vibratome)、壓縮切割機(compresstome)、鑽石線、或雷射。)
在3D成像系統100操作期間，由接物鏡104與感測器陣列102所組成之成像裝置在相繼切片操作之間獲取一系列組織樣本108之影像。在此依序性成像操作期間，UV LED 106以UV光照明樣本108，該光具有約280 nm之波長以促進MUSE成像。另外，可選染色裝置包含噴霧器115，該噴霧器可用於執行逐切片染色操作，該染色操作在各切片操作之後並在對新的塊面進行成像之前對該暴露的新塊面進行染色。圖1中所描繪之所有組件是由控制器116所操作。
可使用Olympus接物鏡實作3D成像系統100，該接物鏡具有高NA(0.5)，長的運作距離(20 mm)，以及大的前光圈。為了運用接物鏡的全部後光圈並獲得大視野，可以使用較低的放大率(0.63×，NA=0.15)。應注意，Olympus接物鏡具有鏡筒透鏡。理論上，此組合可產生~3.2×放大率且具有＜1 µm之解析度。透過結合 Olympus接物鏡與高品質CMOS彩色照相機(Nikon D850 DSLR 45.7 megapixels)，使得有可能可以實現11.2×7.5 mm視野且具有像素限制之解析度(~2.7 µm)。亦有可能可以使用不同接物鏡，不論是使用單獨的系統或使用鏡頭轉盤來增加視野或解析度。例如，利用Canon EF-S 60 mm鏡頭可以設計出一種在36 mm×24 mm視野範圍內解析度＜10μm的系統。因為280nm之光在商用顯微鏡接物鏡中無法優良的傳輸，故可使用亮LED陣列傾斜照射樣本。可以實作簡單的中繼光學器以獲得均勻的照明。因為3D-MUSE可以同時刺激以不同波長發射的多個螢光團，因此使用彩色相機可以簡化光學設計以及降低成本(因為不需要發射濾光片)，並且可以大幅度加速成像時間。
該系統可經組態以透過調整現存振動刀片切片系統(Compresstome)以容納固定或新鮮的組織，該系統於下文中將稱作「3D-MUSE-vibro」。還可以透過修改現有CryoVizTM
來經組態以提供針對冷凍組織之系統，該系統於下文中將稱作「3D-MUSE-cryo」。該系統還可以進一步組態以提供針對固定於嵌入基質材料(例如，石蠟或樹脂)中的組織之系統，該系統於下文稱為“3D-MUSE-matrix”。各種組態在組織準備、相關成本、組織切片的品質和厚度、視野、影像解析度、影像對比度和建立高品質3D體積的能力之間的有所權衡。
可實作3D-MUSE-cryo系統，其適用於對整隻冷凍小鼠成像且其片內解析度可達2.7μm。這可以透過修改容納在BioInVision系統中的CryoViz來實現，該系統能夠使用安裝在能夠拼貼組織塊面之影像的機器人系統上的顯微鏡進行整個小鼠切片與成像。功能包括全自動的切片與成像並具有狀態簡訊發訊、MUSE成像、彩色成像、多光譜螢光成像、數位控制的切片厚度(2μm-2000μm)、大型樣本尺寸(大到整個大鼠)、自動的影像拼貼、以及遠端影像顯示。為了加速成像，可實作可變厚度成像，其中大部分的切片與成像會發生於200 μm，用5μm厚的散佈組來確定顯微解剖學。透過使用黏性薄膜，使得可以拾取切片以獲得與塊面影像精確匹配的組織學影像。這使得可以執行「影像引導之組織學(image-guided histology)」，其中2D/3D影像經監控以判定感興趣區。接著，暫停切片，並且蒐集一切片以用於附加處理(例如，抗體與雷射擷取解剖)。這使得可以在3D-MUSE體積內包括所有類型之分子資料，這對於疾病、治療和發展的研究有令人振奮的可能性。
3D-MUSE-matrix系統可經組態以促進嵌入於任意適當剛性基質中的樣本之3D-MUSE成像。這可以使用由BioInVision Inc.所建立的台式室溫數位切片機系統來實現，該系統配備有如上所述的顯微鏡和照明。為求簡潔性，本發明可允許以白光照明之顏色與MUSE。近乎所有針對3D-MUSE-cryo識別的系統功能可被包括在本系統上，因為其將具有標準BioInVision介面。本系統將提供優良解析度，具有1-μm石蠟切片和添加到石蠟中的吸收劑，以進一步降低紫外線穿透。亦有可能可以增加控制以促進達成拼貼。
可以使用振動切片機(Compresstome VF-300)實現3D-MUSE-vibro系統，該振動切片機針對3D-MUSE成像進行了修改。該壓縮切割機可以切片透過低熔點洋菜醣穩定的新鮮或固定組織。本系統之優點包括：組織塊面染色；快速組織準備；以及可變切片寬度(3-2000 µm)。在初步手動實驗中，染色與成像操作經展現為具有對塊面的重複10-μm切片以及對影像的良好登錄並且沒有明顯的組織切割人工產物(artifact)。亦有可能可以包括自動噴霧系統以用於將該組織塊面染色。在本系統中，切片與影像操作可經由LabView介面所控制的。影像亦可被儲存於BioInVision格式(具有元檔案之TIFF檔)中，使得可以使用現存視覺化與分析軟體。擷取及處理影像
圖2呈現用於根據本揭示實施例執行基於MUSE的3D成像之處理的流程圖。在操作期間，該系統獲得生物材料之樣本(步驟202)並對該樣本執行一系列切片操作以相繼移除該樣本的切片(步驟204)。在該系列之切片操作在進行同時，該系統使用利用紫外線表面激發(MUSE)表面加權成像的顯微鏡術對各切片操作後的樣本之暴露區塊面執行成像操作(步驟206)。最後，該系統將由塊面成像操作所產生的影像組合成三維資料集以供查看和分析(步驟208)。
對於該技術領域中具有通常知識者而言，對所揭示實施例的各種修改是顯而易見的，並且在不脫離本發明的精神和範圍之前提下，本文定義的一般原則可以應用於其他實施例和應用中。因此，本發明並不受限制於所示實施例中，而其應符合與本文揭示的原理和特徵一致的最寬範圍。
已僅為了說明及描述之目的而呈現前文對實施例的敘述。其目的不在於係窮舉性的或用以限制本說明於所揭露之形式。據此，許多修改和變化對於本領域技術人員而言是顯而易見的。額外地，以上揭示目的不在於限制本說明。本說明書之範圍是由所附申請專利範圍所界定。
100‧‧‧3D成像系統
102‧‧‧感測器陣列
104‧‧‧接物鏡
106‧‧‧UV LED
108‧‧‧組織
110‧‧‧切片機
112‧‧‧載台
114‧‧‧刀片
115‧‧‧噴霧器
116‧‧‧控制器
202‧‧‧步驟
204‧‧‧步驟
206‧‧‧步驟
208‧‧‧步驟
本專利或申請案包含至少一彩色圖式。具有(一或多)彩色圖式的本專利或專利申請公開案的副本將被要求時且支付必要費用後由本局提供。
圖1描繪根據本揭示實施例之3D成像系統。
圖2呈現用於根據本揭示實施例執行基於MUSE的3D成像之處理的流程圖。
圖3A描繪根據本揭示實施例在405nm激發的曙紅染色的腎臟組織。
圖3B描繪根據本揭示實施例在280nm激發的曙紅染色的腎臟組織。
圖4A描繪根據本揭示實施例前列腺組織的薄組織切片之MUSE影像。
圖4B描繪根據本揭示實施例從MUSE影像計算的虛擬蘇木精和曙紅(H＆E)影像。
圖4C描繪根據本揭示實施例的實際H＆E影像。
圖5A描繪根據本揭示實施例的小鼠胚胎的彩色冷凍影像。
圖5B描繪根據本揭示實施例的小鼠胚胎的螢光冷凍影像。
圖5C描繪根據本揭示實施例的小鼠胚胎的RGB-MUSE冷凍影像。
圖6A描繪根據本揭示實施例的腦部3D影像，其包括三叉神經節和後腦。
圖6B描繪根據本揭示實施例的穿過三叉神經節的影像切片。
圖6C描繪根據本揭示實施例的穿過後腦的影像切片。
圖7A描繪根據本揭示實施例的小鼠胚胎的3D-MUSE冷凍影像。
圖7B描繪根據本揭示實施例的穿過小鼠胚胎的水平切割平面。
100‧‧‧3D成像系統
102‧‧‧感測器陣列
104‧‧‧接物鏡
106‧‧‧UV LED
108‧‧‧組織
110‧‧‧切片機
112‧‧‧載台
114‧‧‧刀片
115‧‧‧噴霧器
116‧‧‧控制器
Claims (26)
- 一種對生物材料之樣本執行三維(3D)成像操作的方法，其包含：獲得該生物材料之樣本；對該樣本執行一系列切片操作以相繼移除該樣本的切片，其中各切片操作包含：對該樣本的暴露塊面進行染色；以及使用利用紫外線表面激發(MUSE)表面加權成像的顯微鏡術對該樣本之暴露塊面執行成像操作以產生一系列的連續影像切片；以及將由該塊面成像操作所產生的該系列的連續影像切片組合成三維資料集以供查看和分析。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該系列切片操作是使用下述者之一所執行：切片機；冷凍切割機；振動切割機；壓縮切割機；鑽石線；以及雷射。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該方法進一 步包含選擇性保留一或多移除的組織切片以用於下游分析。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中基於與該組織切片相關之塊面之影像的特徵，將移除的組織切片選擇性保留。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中各逐切片染色操作涉及使用以下應用技術之一者：透過氣溶膠或液滴噴灑；液體輸送；蒸汽輸送；以及使用含染劑的墊片或其他支撐物轉移染劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在各染色操作之後，若有需求則該方法進一步包含執行清洗步驟。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在染色該樣本的該暴露塊面同時，利用超音波、微波或其他機械式輔助來輔助組織穿透。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中將該樣本的該暴露塊面染色涉及使用染劑、固定劑及/或其他組織調節劑在體內或離體灌注該樣本。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中將該樣本的該暴露塊面染色涉及使用以下染劑之一或多者：螢光染劑；免疫染劑；使用抗體的分子靶向染劑；肽；具有化學親和力的靶向染劑，其不同於免疫螢光組織染料；溶劑；以及pH調節劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該方法進一步包含向該樣本施加諸如醋酸的對比增強劑以改善組織影像對比度。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中執行該成像操作除了MUSE外涉及使用第二成像模態，其中該第二成像模態可包括螢光顯微鏡術或螢光壽命成像(fluorescence lifetime imaging，FLIM)。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該方法進一步包含透過向該樣本施加例如丙烯酰胺的支持基質以促進膨脹顯微鏡術，其中該支持基質在該成像操作之前膨脹並 增加該樣本中細胞的尺寸。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該樣本是下述之一者：新鮮樣本；固定樣本；冷凍樣品；以及嵌入支持基質中的樣本。
- 一種對生物材料之樣本執行三維(3D)成像的系統，其包含：用於固持該樣本之載台；切片裝置，其對該樣本執行一系列切片操作以相繼移除該樣本的切片；用於照明該樣本之光源，其中該光源產生具有波長在230nm到300nm之範圍中的紫外線光，用以促進利用紫外線表面激發(MUSE)成像之顯微鏡術；染色機構；成像裝置，其包含：接物鏡，其放大該照明之樣本，以及感測器陣列，其擷取該放大樣本之影像；控制器，其針對各切片操作控制該切片裝置，該染色機構以及該成像裝置用以：使用該染色機構染色該樣本的暴露塊面；以及 使用該成像裝置使用MUSE表面加權成像對該樣本之該暴露塊面執行成像操作以產生一系列的連續影像切片；以及影像處理系統，其將由該成像操作所產生的該系列的連續影像切片組合成三維資料集以供查看和分析。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該切片裝置包含下述之一者：切片機；冷凍切割機；振動切割機；壓縮切割機；鑽石線；以及雷射。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該系統附加地包括保留機構(retaining mechanism)，其選擇性保留一或多移除的組織切片以用於下游分析。
- 如申請專利範圍第16項所述之系統，其中基於與該組織切片相關之塊面之影像的特徵，將移除的組織切片選擇性保留。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中各逐切片染 色操作涉及使用以下應用技術之一者：透過氣溶膠或液滴噴灑；液體輸送；蒸汽輸送；以及使用含染劑的墊片或其他支撐物轉移染劑。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中在各染色操作之後，若有需求則該染色機構執行清洗步驟。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該染色機構利用超音波、微波或其他機械式輔助來輔助組織穿透。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該染色機構促進使用染劑、固定劑及/或其他組織調節劑在體內或離體灌注該樣本。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該染色機構使用以下染劑之一或多者：螢光染劑；免疫染劑；使用抗體的分子靶向染劑；肽；具有化學親和力的靶向染劑，其不同於免疫螢光組織染料； 溶劑；以及pH調節劑。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該系統附加地向該樣本的該暴露塊面施加諸如醋酸的對比增強劑以改善組織影像對比度。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該成像裝置除了MUSE外使用第二成像模態，其中該第二成像模態可包括螢光顯微鏡術或螢光壽命成像(fluorescence lifetime imaging，FLIM)。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該系統透過向該樣本施加例如丙烯酰胺的支持基質以促進膨脹顯微鏡術，其中該支持基質在該成像操作之前膨脹並增加該樣本中細胞的尺寸。
- 如申請專利範圍第14項所述之系統，其中該樣本是下述之一者：新鮮樣本；固定樣本；冷凍樣品；以及嵌入支持基質中的樣本。
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