TW201836647A - 抗－ｐｒｌｒ抗體藥物軛合物（ａｄｃ）及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了結合PRLR、具體地人類PRLR的抗體藥物軛合物、其製備方法、及其用途。
Description
本申請尤其涉及抗催乳素受體（PRLR）抗體藥物軛合物（conjugate）（ADC）、包括ADC之組成物、製備ADC之方法、及其用途。
癌症療法包括大範圍的治療方法，該等方法包括外科手術、放射和化學療法。雖然通常的補充方法允許醫師有廣泛的選擇可用來治療癌症，但是現存的療法具有許多缺點，如缺乏越過正常的健康細胞靶向癌細胞的選擇性、以及癌症對治療的抗性的發展。
與非靶向治療（如輻射治療）相比，基於靶向療法（如抗體）的治療癌症的最新方法已導致化療方案具有較少副作用。用於增強抗體的抗腫瘤效能的一種有效方法涉及將細胞毒性藥物或毒素連接到能夠被靶細胞內化的單株抗體上。該等藥劑被稱為抗體藥物軛合物（ADC）。當給予至患者時，ADC經由它們的抗體部分結合到靶細胞上並且變成被內化的，從而允許該等藥物或毒素發揮它們的作用（參見，例如美國專利申請公開案號US 2005/0180972和US 2005/0123536）。
催乳素受體（PRLR）係單跨膜1類細胞介素受體，與細胞介素超家族成員的受體（如IL2、IL3、IL4、IL6、IL7、促紅細胞生成素和GM-CSF）同源。PRLR涉及包括細胞生長、分化、發育、泌乳和繁殖的多種生物學功能。它沒有內在的酪胺酸激酶活性；然而，已顯示配位基結合導致受體二聚化、Jak2的交叉磷酸化和下游信號傳導。人類催乳素受體cDNA最初從肝癌和乳癌文庫中分離（Boutin等人，Molec. Endocr. [分子內分泌學] 3: 1455-1461，1989）。核苷酸序列預測了598個胺基酸的成熟蛋白質，該蛋白質具有比大鼠肝PRL受體長得多的細胞質結構域。催乳素受體基因位於與生長激素受體基因相同的染色體區域，其已被定位到5;13-p12（Arden, K. C.等人，Cytogenet. Cell Gene [細胞遺傳學和細胞基因] 53: 161-165，1990；Arden, K. C.等人，（摘要）AM. J. Hum. Genet. [美國人類遺傳學雜誌] 45（增刊）：僅A129，1989）。生長激素也結合催乳素受體並啟動該受體。
PRLR以許多不同的同功型存在，該等同功型的細胞質結構域長度不同。已經在人類皮下腹部脂肪組織和乳房脂肪組織中鑒定了四種PRLR mRNA同功型（L、I、S1a、和S1b）（Ling, C.等人，J. Clin. Endocr. Metab. [臨床內分泌學和代謝雜誌] 88: 1804-1808，2003）。此外，使用免疫印跡分析已經在人類皮下腹部脂肪組織和乳房脂肪組織中檢測到L-PRLR和I-PRLR兩者的表現。最近的報導已經表明PRLR在人類乳癌組織和前列腺癌組織中被表現和啟動（Li等人，Cancer Res. [癌症研究]，64:4774-4782，2004；Gill等人，J Clin Pathol. [臨床病理學雜誌]，54:956-960，2001；Touraine等人，J Clin Endocrinol Metab. [臨床內分泌學與代謝雜誌]，83:667-674，1998）。據報導，Stat5啟動和PRLR表現與54%的前列腺癌標本中的高組織學等級相關（Li等人，同上）。其他報導表明原發乳癌標本在菌落形成測定中對PRL有響應，並且血漿PRL濃度與乳癌風險相關（Tworoger等人，Cancer Res. [癌症研究]，64:6814-6819，2004；Tworoger等人，Cancer Res. [癌症研究]，66:2476-2482，2006）。在另一個報導中，PRL轉基因小鼠發展了惡性乳癌或前列腺增生（Wennbo等人，J Clin Invest. [臨床研究雜誌]，100:2744-2751，1997；Wennbo等人，Endocrinology [內分泌學]，138:4410-4415，1997）。PRLR信號傳導的阻斷可以是用於治療乳癌和前列腺癌的手段。（參見，例如，Damiano和Wasserman，2013年4月，Clin. Cancer Res. [臨床癌症研究]19(7):1644-1650）。
因此，本領域需要新穎的PRLR拮抗劑用於治療與有害的PRLR活性相關的癌症和其他障礙。
本發明提供了包含藉由接頭與抗PRLR抗體連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑之抗體藥物軛合物（ADC）、包含本發明的ADC的組成物、製備本發明的ADC的方法、以及治療癌症之方法，該方法包括向患有癌症的受試者給予本發明的ADC。如在實例中更詳細地描述的，並且同時不意圖受任何具體的操作理論束縛，本文中包括的數據證明包含特定的接頭和特定的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑（即，吡咯并苯并二氮呯（PBD）彈頭）的抗PRLR ADC發揮有效的抗腫瘤活性。此外，本發明的抗PRLR ADC的特徵在於低的藥物與抗體比率（DAR），其中低藥物載入令人驚訝地提供高度有效的ADC。
因此，在一個方面，本揭露提供了特異性結合PRLR（並且特別是人類PRLR（huPRLR））之ADC。
在一個方面，本發明提供了包含藉由接頭與抗體連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑的抗體藥物軛合物（ADC），其中該抗體藥物軛合物係根據結構式 (I) 之化合物： [D-L-XY]n-Ab (I)， 或其鹽，其中D包含吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體；L係接頭；Ab係抗催乳素受體（PRLR）抗體，該抗催乳素受體抗體包含 (i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列（包含SEQ ID NO: 3）、CDRH2序列（包含SEQ ID NO: 4）、和CDRH3序列（包含SEQ ID NO: 5）；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列（包含SEQ ID NO: 8）、CDRL2序列（包含SEQ ID NO: 9）、和CDRL3序列（包含SEQ ID NO: 10）；以及 (iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；XY代表接頭L與抗體Ab連接的共價鍵；並且n係任何整數。在一個實施方式中，n係2或4。在一個實施方式中，n係2。在較佳的實施方式中，n係約2。在某些實施方式中，XY係與抗體Ab上的巰基基團形成的鍵。在一個實施方式中，XY係馬來醯亞胺-巰基鍵。在某些實施方式中，L包含如在式 III、IV、V、VI、VII、VIII、或 IX 中描述的接頭。在較佳的實施方式中，L包含如在式 IX 中描述的接頭。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
在另一個方面，本發明提供了包含藉由接頭與抗體連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑的抗體藥物軛合物（ADC），其中該抗體藥物軛合物係根據結構式 (I) 之化合物： [D-L-XY]n-Ab (I)， 或其鹽，其中D包含吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體；L係接頭；Ab係抗催乳素受體（PRLR）抗體，該抗催乳素受體抗體包含 (i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 7；以及 (iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；XY代表接頭L與抗體Ab連接的共價鍵；並且n係任何整數。在一個實施方式中，n係2或4。在一個實施方式中，n係2。在較佳的實施方式中，n係約2。在某些實施方式中，XY係與抗體Ab上的巰基基團形成的鍵。在一個實施方式中，XY係馬來醯亞胺-巰基鍵。在某些實施方式中，L包含如在式 III、IV、V、VI、VII、VIII、或 IX 中描述的接頭。在較佳的實施方式中，L包含如在式 IX 中描述的接頭。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
在另一個方面，本發明提供了包含藉由接頭與抗體連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑之抗體藥物軛合物（ADC），其中該抗體藥物軛合物係根據結構式 (I) 之化合物： [D-L-XY]n-Ab (I)， 或其鹽，其中D包含吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體；L係接頭；Ab係抗催乳素受體（PRLR）抗體，該抗催乳素受體抗體包含 (i.) 重鏈，該重鏈包含列於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列，(ii.) 輕鏈，該輕鏈包含列於SEQ ID NO: 6中的胺基酸序列；XY代表接頭L與抗體Ab連接的共價鍵；並且n係任何整數。在一個實施方式中，n係2或4。在一個實施方式中，n係2。在較佳的實施方式中，n係約2。在某些實施方式中，XY係與抗體Ab上的巰基基團形成的鍵。在一個實施方式中，XY係馬來醯亞胺-巰基鍵。在某些實施方式中，L包含如在式 III、IV、V、VI、VII、VIII、或 IX 中描述的接頭。在較佳的實施方式中，L包含如在式 IX 中描述的接頭。在一個實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
在另一個方面，本發明的特徵在於包含式 (X) 之結構的ADC(X)， 或其鹽，其中Ab包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含：(i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列（包含SEQ ID NO: 3）、CDRH2序列（包含SEQ ID NO: 4）、和CDRH3序列（包含SEQ ID NO: 5）；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列（包含SEQ ID NO: 8）、CDRL2序列（包含SEQ ID NO: 9）、和CDRL3序列（包含SEQ ID NO: 10）；(iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；以及 (iv.) 其中n係2或約2。在一個實施方式中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 7。在一個實施方式中，ADC包含完整的重鏈（包含SEQ ID NO: 1）和完整的輕鏈（包含SEQ ID NO: 6）。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
在另一個方面，本發明的特徵在於包含式 (X) 之結構的ADC(X)， 或其鹽，其中Ab包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含：(i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 7；(iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；以及 (iv.) 其中n係2或約2。在一個實施方式中，ADC包含完整的重鏈（包含SEQ ID NO: 1）和完整的輕鏈（包含SEQ ID NO: 6）。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
在另一個方面，本發明的特徵在於包含式 (X) 之結構的ADC(X)， 或其鹽，其中Ab包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含重鏈（包含SEQ ID NO: 1）和輕鏈（包含SEQ ID NO: 6），其中n係2或約2。
在一個方面，本發明提供如下組成物，該組成物包含本文所描述的ADC和賦形劑、載體、和/或稀釋劑。在一個實施方式中，該組成物係藥物組成物。在一個實施方式中，本發明的組成物被配製用於人類中的藥物用途。
在另外的方面，本發明提供如下套組（kit），該套組包含根據本揭露的任何方面的至少一個劑量的ADC以及至少一個劑量的至少一種另外的治療劑，其中該至少一種另外的治療劑視情況與藥物組成物組合。
在甚至另外的方面，本發明提供製備ADC之方法，該方法包括在合成子使合成子與抗體共價連接的條件下，使抗PRLR抗體與根據結構式 (Ia) D‑L‑R x
的合成子接觸（其中D係能夠穿過細胞膜的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑，L係能夠被溶酶體酶切割的接頭，並且R x
包含能夠將合成子與抗體連接的官能基），其中D係PBD二聚體，並且其中該抗體包含重鏈（包含列於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列）和輕鏈（包含列於SEQ ID NO: 6中的胺基酸序列）。
在甚至另外的方面，本發明提供製備ADC之方法，該方法包括在合成子使合成子與抗體共價連接的條件下，使抗PRLR抗體與根據結構式 (Ia) D‑L‑R x
的合成子接觸（其中D係能夠穿過細胞膜的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑，L係能夠被溶酶體酶切割的接頭，並且R x
包含能夠將合成子與抗體連接的官能基），其中D係PBD二聚體，並且其中該抗體包含 (i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列（包含SEQ ID NO: 3）、CDRH2序列（包含SEQ ID NO: 4）、和CDRH3序列（包含SEQ ID NO: 5）；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列（包含SEQ ID NO: 8）、CDRL2序列（包含SEQ ID NO: 9）、和CDRL3序列（包含SEQ ID NO: 10）；以及 (iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係根據Kabat。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
在甚至另外的方面，本發明提供製備ADC之方法，該方法包括在合成子使合成子與抗體共價連接的條件下，使抗PRLR抗體與根據結構式 (Ia) D‑L‑R x
的合成子接觸（其中D係能夠穿過細胞膜的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑，L係能夠被溶酶體酶切割的接頭，並且R x
包含能夠將合成子與抗體連接的官能基），其中D係PBD二聚體，並且其中該抗體包含 (i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列（包含SEQ ID NO: 3）、CDRH2序列（包含SEQ ID NO: 4）、和CDRH3序列（包含SEQ ID NO: 5）；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列（包含SEQ ID NO: 8）、CDRL2序列（包含SEQ ID NO: 9）、和CDRL3序列（包含SEQ ID NO: 10）；以及 (iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；並且其中R x
係巰基基團或馬來醯亞胺-巰基基團。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
在甚至另外的方面，本發明提供製備ADC之方法，該方法包括在合成子使合成子與抗體共價連接的條件下，使抗PRLR抗體與根據結構式 (Ia) D‑L‑R x
的合成子接觸（其中D係能夠穿過細胞膜的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑，L係能夠被溶酶體酶切割的接頭，並且R x
包含能夠將合成子與抗體連接的官能基），其中D係PBD二聚體；其中L包含如在式 III、IV、V、VI、VII、VIII、或 IX 中描述的接頭；並且其中該抗體包含 (i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列（包含SEQ ID NO: 3）、CDRH2序列（包含SEQ ID NO: 4）、和CDRH3序列（包含SEQ ID NO: 5）；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列（包含SEQ ID NO: 8）、CDRL2序列（包含SEQ ID NO: 9）、和CDRL3序列（包含SEQ ID NO: 10）；以及 (iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；並且其中R x
係巰基基團或馬來醯亞胺-巰基基團。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
在甚至另外的方面，本發明提供製備ADC之方法，該方法包括在合成子使合成子與抗體共價連接的條件下，使抗PRLR抗體與根據結構式 (Ia) D‑L‑R x
的合成子接觸（其中D係能夠穿過細胞膜的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑，L係能夠被溶酶體酶切割的接頭，並且R x
包含能夠將合成子與抗體連接的官能基），其中D係PBD二聚體；其中L包含如在式 IX 中描述的接頭；並且其中該抗體包含 (i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列（包含SEQ ID NO: 3）、CDRH2序列（包含SEQ ID NO: 4）、和CDRH3序列（包含SEQ ID NO: 5）；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列（包含SEQ ID NO: 8）、CDRL2序列（包含SEQ ID NO: 9）、和CDRL3序列（包含SEQ ID NO: 10）；以及 (iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；並且其中R x
係巰基基團或馬來醯亞胺-巰基基團。在某些實施方式中，抗PRLR抗體包含IgG1同種型。在某些實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。在示例性實施方式中，抗PRLR抗體係人源化抗體。
本申請要求於2017年4月6日提交的美國臨時專利申請序號62/482,640之優先權，該申請之揭露內容以其全文藉由引用特此結合。
本發明涉及靶向催乳素受體（PRLR）的抗體藥物軛合物（ADC）及其用途。本發明的ADC具有超過先前技術中揭露的ADC的提供明顯優勢的有利屬性。例如，本發明的ADC (1
) 在各種條件下是穩定的（參見，例如，以下實例5）；(2
) 比基於澳瑞他汀（auristatin）的ADC（使用基本上相同的抗體骨架）顯著更有效（參見，例如，以下實例3-4）；(3
) 與同樣具有S239C突變的相似抗體不同，相對於親本抗體展示很少至不減少的對PRLR的結合親和力（參見，例如，以下實例6和圖 10
）；並且 (4
) 具有令人驚訝的約2（例如1.89、1.96）的低藥物與抗體比率（DAR）（參見以下實例3）。本發明的此類ADC含有吡咯并苯并二氮呯（PBD）彈頭，其藉由例如如本文所揭露的式 (IX) 中描述的接頭附接至抗PRLR抗體。示例性實施方式包括ADC，該ADC包含如本文所揭露的式 (X)。示例性抗PRLR抗體包括例如h16f (S239C)。
因此，本發明涉及抗體藥物軛合物（ADC），該抗體藥物軛合物包含藉由接頭與抗催乳素受體（PRLR）抗體連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑（例如PBD）；包含本發明的ADC之組成物；製備本發明的ADC之方法；以及使用ADC來治療與PRLR的異常表現相關的癌症（例如乳癌）之方法。
在某些實施方式中，本發明的特徵在於包含式 (X) 之結構的ADC(X)， 或其鹽，其中Ab包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含：(i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列（包含SEQ ID NO: 3）、CDRH2序列（包含SEQ ID NO: 4）、和CDRH3序列（包含SEQ ID NO: 5）；(ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列（包含SEQ ID NO: 8）、CDRL2序列（包含SEQ ID NO: 9）、和CDRL3序列（包含SEQ ID NO: 10）；(iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；以及 (iv.) 其中n係2或約2。
在某些實施方式中，本發明的特徵在於包含式 (X) 之結構的ADC(X)， 或其鹽，其中Ab包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含：(i.) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2； (ii.) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 7；(iii.) 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係按照Kabat；以及 (iv.) 其中n係2或約2。
在某些實施方式中，本發明的特徵在於包含式 (X) 之結構的ADC(X)， 或其鹽，其中Ab包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含重鏈（包含SEQ ID NO: 1）和輕鏈（包含SEQ ID NO: 6），其中n係2或約2。
在某些實施方式中，本發明的特徵在於ADC，該ADC包含藉由接頭與抗PRLR抗體連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑，其中該ADC係根據結構式 (I) 之化合物： [D- L-XY] n
Ab (I)， 或其鹽，其中D包含吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體；L係接頭；Ab係抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含重鏈（包含SEQ ID NO: 1）和輕鏈（包含SEQ ID NO: 6）；XY代表接頭L與抗體Ab連接的共價鍵；並且n係任何整數。具體地，包含本文所描述的特定接頭和特定細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑（例如吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體）的抗PRLR ADC令人驚訝地發揮有效的抗腫瘤活性，特別是當與包含與澳瑞他汀連接的基本上相同抗體的ADC相比時。此外，本發明的抗PRLR ADC的特徵在於低的藥物與抗體比率（DAR），其中低藥物載入令人驚訝地導致ADC在例如治療與異常的PRLR表現水平的相關的癌症中高度有效。如本文的實例中所描述的，h16f (S239C)-PBD係比h16f-澳瑞他汀ADC更有效的ADC軛合物，並且保留與未突變的h16f相似的對PRLR的結合特異性。本揭露涉及特異性結合人類PRLR的抗體藥物軛合物、包含ADC的組成物、可以構成ADC的抗huPRLR抗體；編碼構成ADC的抗huPRLR抗體的多核苷酸；能夠產生抗體的宿主細胞；以及可用於製備抗體的方法和組成物；以及使用ADC的各種方法。
如熟習該項技術者將理解的，抗體本質上是“模組化”的。貫穿整個揭露，描述了包含抗體的各種“模組”的各種具體實施方式。作為具體的非限制性實例，描述了可變重鏈（VH
）CDR、VH
鏈、可變輕鏈（VL
）CDR和VL
鏈的各種具體實施方式。
本文所揭露的ADC在本質上也是“模組化”的。貫穿整個揭露，描述了包含ADC的各種“模組”的各種具體實施方式。作為具體的非限制性實例，描述了可以構成ADC的抗體、接頭和細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑的具體實施方式。
本文所揭露的ADC可以是處於鹽的形式，並且在一些具體實施方式中為藥學上可接受的鹽。具有足夠酸性的基團、足夠鹼性的基團或兩種官能基的本發明的ADC可以與任何數量的酸或鹼（有機的或無機的）反應形成鹽。
除非本文中另外定義，否則結合本揭露使用的科學與技術術語應具有熟習該項技術者通常理解的含義。
如本文所使用的，術語“人類PRLR”和“人類PRLR野生型”（本文縮寫為hPRLR、hPRLRwt）係指單跨膜1類細胞介素受體。人類PRLR包括結合催乳素的胞外區、跨膜區、和胞質區。術語人類PRLR旨在包括重組人類PRLR（rhPRLR），其可以藉由標準重組表現方法製備。表 1
提供人類PRLR的胺基酸序列（即，SEQ ID NO. 12）及其細胞外結構域的胺基酸序列（即，SEQ ID NO: 13），其在本領域中是已知的。此外，hPRLR的各種同功型係本領域已知的並且列於以下表 1
中。表 1
：人類PRLR的胺基酸序列表1
如本文所使用的，術語“抗體”（Ab）係指與特定抗原（即hPRLR）特異性結合或免疫反應的免疫球蛋白分子。抗體包含在輕鏈和重鏈可變結構域兩者中的互補決定區（CDR），也稱為高變區。可變結構域的更高度保守的部分稱為框架區（FR）。如本領域已知的，描繪抗體的高變區的胺基酸位置/邊界可以取決於上下文和本領域已知的各種定義而變化。可變結構域內的一些位置可以被視為雜合高變位置，因為該等位置可以被認為係在一組標準下的高變區之內，同時被認為在不同組的標準下的高變區之外。該等位置中的一個或多個也可以在延伸的高變區中找到。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區，這四個FR區大體上採用β-片層組態，藉由三個CDR連接，這三個CDR形成連接β-片層結構的環並且在一些情況下形成β-片層結構的一部分。每條鏈中的CDR藉由FR區緊密靠近在一起，並且與來自另一條鏈的CDR一起促成抗體的抗原結合位點的形成。參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學感興趣的蛋白質序列]（National Institute of Health [國家衛生研究院]，貝塞斯達，馬里蘭州，1987）。如本文所使用的，除非另有說明，根據Kabat等人的免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統進行免疫球蛋白胺基酸殘基的編號。
如本文所使用的，術語“單株抗體”不限於藉由雜交瘤技術產生的抗體。單株抗體藉由本領域可用或已知的任何手段衍生自單個殖株，包括任何真核生物、原核生物或噬菌體殖株。可以使用本領域中已知的各種技術製備可用於本揭露的單株抗體，此類技術包括使用雜交瘤、重組及噬菌體展示技術或其組合。在本揭露的很多用途中，包括ADC（包括抗‑huPRLR抗體）在人類中的體內用途，可以適當地使用嵌合抗體、靈長化抗體、人源化抗體、或人類抗體。在示例性實施方式中，本發明的抗huPRLR抗體係人源化的，例如h16f (S239C)。
非人類（例如，鼠類）抗體的“人源化”形式係含有從非人類免疫球蛋白衍生的最小序列的嵌合免疫球蛋白。通常，人源化抗體將包含至少一個、並且典型地兩個可變結構域的基本上全部，其中CDR區的全部或基本上全部對應於非人類免疫球蛋白的那些，並且FR區的全部或基本上全部是人類免疫球蛋白序列的那些。本發明的示例性人源化抗體係h16f (S239C)。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區（Fc）的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白共有序列的一部分。抗體人源化的方法係本領域已知的。
本發明的抗hPRLR ADC可以包含能夠特異性結合huPRLR的全長（完整的）抗體分子。在一個實施方式中，本發明的ADC包含全長h16f (S239C) 抗體。
如本文所使用的，術語“細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑”意指已知抑制細胞的生長和/或複製、和/或殺死細胞的任何藥劑或藥物。在一個實施方式中，細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑係滲透細胞的DNA小溝結合劑，如吡咯并苯并二氮呯（“PBD”）和PBD二聚體。
術語“抗體藥物軛合物”或“ADC”係指與一種或多種細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑化學連接的抗體。在一個實施方式中，ADC包括抗體、細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑、和能夠使藥物與抗體附接或軛合的接頭。本發明的ADC典型地具有在任何地方與抗體軛合的從1個至3個的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑，包括1個、2個或3個載藥種類。
術語“藥物與抗體比率”或“DAR”係指與ADC的抗體附接的藥物（細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑）（例如PBD）的數量。ADC的DAR可以在從1至3的範圍內，儘管取決於抗體上的連接位點的數量也可能有更高的載入。術語DAR可以用於指載入到單個抗體上的藥物的數量，或者可以用於指一組ADC的平均（average或mean）DAR。在一個實施方式中，本發明的ADC具有約2的DAR。在此上下文中，術語“約”意指在實際值的± 7.5%內的量。即，“約2”意指1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99、2.00、2.01、2.02、2.03、2.04、2.05、2.06、2.07、2.08、2.09、2.10、2.11、2.12、2.13、2.14、2.15、和任何介於中間的範圍。
在具體的示例性實施方式中，本發明的ADC包含具有約2的DAR的抗PRLR抗體（例如h16f (S239C) 抗PRLR抗體）。
在一個方面，本發明的ADC包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含重鏈可變區（包含如列於SEQ ID NO: 3、4和5中的CDR組（CDRH1、CDRH2和CDRH3））、以及輕鏈可變區（包含如列於SEQ ID NO: 8、9和10中的CDR組（CDRL1、CDRL2和CDRL3）。較佳的是，抗PRLR抗體係IgG1同種型，該IgG1同種型具有半胱胺酸突變被工程改造來為PBD提供軛合位點的重鏈恒定區。在一個實施方式中，該半胱胺酸突變係在重鏈的位置239處。較佳的是，該突變係S239C，根據Kabat編號。如本文所描述的，抗PRLR抗體“h16f (S239C)”具有包含如分別列於SEQ ID NO: 3、4和5中的CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區、和包含如分別列於SEQ ID NO: 8、9和10中的CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗PRLR抗體缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。
在另一個方面，本發明的ADC包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含重鏈可變區（包含SEQ ID NO: 2）和輕鏈可變區（包含SEQ ID NO: 7）。較佳的是，抗PRLR抗體係IgG1同種型，該IgG1同種型具有半胱胺酸突變被工程改造來為PBD提供軛合位點的重鏈恒定區。在一個實施方式中，該半胱胺酸突變係在重鏈的位置239處。較佳的是，該突變係S239C，根據Kabat編號。如本文所描述的，抗PRLR抗體“h16f (S239C)”具有重鏈可變區（包含SEQ ID NO: 2）和輕鏈可變區（包含SEQ ID NO: 7）。在一些實施方式中，抗PRLR抗體缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。
在另一個方面，本發明的ADC包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含重鏈（包含SEQ ID NO: 1）和輕鏈（包含SEQ ID NO: 6）。如本文所描述的抗PRLR抗體“h16f (S239C)”具有包含列於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列的重鏈和包含列於SEQ ID NO: 6中的胺基酸序列的輕鏈。SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 11的區別僅僅是SEQ ID NO: 1含有S239C突變。參見以下表 9
。如本文所描述的，該S239C突變對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸殘基編號242。在一些實施方式中，抗PRLR抗體缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。
本文所描述的抗PRLR ADC的抗體可以是其序列已被修飾以改變至少一個恒定區介導的生物效應子功能的抗體。例如，在一些實施方式中，抗PRLR抗體可以被修飾以相對於未修飾的抗體減少至少一個恒定區介導的生物效應子功能，例如與Fc受體（FcγR）的結合減少。可以藉由在FcγR相互作用所需的特定區域對抗體的免疫球蛋白恒定區片段進行突變來減少FcγR結合（參見，例如Canfϊeld和Morrison，1991，J. Exp. Med. [實驗醫學雜誌] 173:1483-1491；和Lund等人，1991，J. Immunol. [免疫學雜誌] 147:2657-2662）。減少FcγR結合還可能減少依賴於FcγR相互作用的其他效應子功能，如調理作用、吞噬作用和抗原依賴性細胞毒性（“ADCC”）。
包括在抗‑PRLR ADC中的抗體可以具有低水平的岩藻糖或缺乏岩藻糖。抗體缺乏岩藻糖與增強的ADCC活性相關，特別是在低劑量的抗體的情況下。參見Shields等人，2002，J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 277:26733-26740；Shinkawa等人，2003，J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 278:3466-73。製備無岩藻糖的抗體的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0細胞（ATCC CRL 1662）中生長。YB2/0表現低水平的FUT8 mRNA，其編碼α-1,6-岩藻糖轉移酶，該α-1,6-岩藻糖轉移酶係多肽岩藻糖化所必需的酶。
包括在抗PRLR ADC中的抗體可能包括增加或減少其與新生兒Fc受體（FcRn）的結合親和力的修飾，例如，藉由在參與FcRn相互作用的特定區域對免疫球蛋白恒定區片段進行突變（參見，例如WO 2005/123780）。抗PRLR抗體可以具有一個或多個插入其一個或多個高變區中的胺基酸，例如如在以下文獻中所描述的：Jung和Plückthun，1997，Protein Engineering [蛋白質工程] 10:9，959-966；Yazaki等人，2004，Protein Eng. Des Sel. [蛋白質工程、設計與選擇]17(5):481-9；以及美國專利申請案號2007/0280931。
可以藉由許多技術中的任何一種產生抗體，如例如在國際公開案號WO 2014/105810中描述的，以其全文藉由引用結合。
對PRLR（例如人類PRLR）具有高親和力的抗PRLR抗體對於治療用途可能是令人希望的。因此，本揭露考慮了包含對PRLR（並且特別是人類PRLR）具有高結合親和力的抗PRLR抗體的ADC。在具體實施方式中，該等抗體以至少約100 nM的親和力結合PRLR，但可能表現出更高的親和力，例如，至少約90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM、或甚至更高。在一些實施方式中，抗體以在約1 pM至約100 nM的範圍的親和力（或範圍在任何前述值之間的親和力）結合PRLR。
可以使用本領域熟知的技術或本文所描述的技術確定抗體對PRLR的親和力，如例如但不作為限定：ELISA、等溫滴定量熱法（ITC）、表面電漿共振、流式細胞術或螢光偏振分析。
可以藉由使用本領域已知的標準重組DNA方法在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因來製備抗PRLR抗體，如在以下文獻所描述的那些：Molecular Cloning; A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊]，第二版（Sambrook、Fritsch和Maniatis編，冷泉港實驗室，紐約，1989）。例如，將編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表現載體中，使得該等基因可操作地連接至轉錄和翻譯控制序列並轉化到宿主細胞中。可以將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入單獨的載體中，或者更典型地，將兩種基因插入相同的表現載體中，藉由本領域已知的方法來完成。也可以藉由化學合成來生產抗體（例如，藉由在以下文獻中描述的方法：Solid Phase Peptide Synthesis [固相肽合成]，第2版，1984，皮爾斯化工有限公司（The Pierce Chemical Co.），羅克福德（Rockford），伊利諾州）。
本發明的抗PRLR ADC通常包含抗PRLR抗體（例如h16f (S239C)），該抗PRLR抗體具有藉由一個或多個接頭（其可以是相同的或不同的）與其連接的一種或多種細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑（其也可以是相同的或不同的）。在具體實施方式中，該抗PRLR ADC係根據結構式 (I) 之化合物： [D-L-XY] n
-Ab (I) 或其鹽，其中每個“D”相互獨立地代表細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑（“藥物”，例如PBD二聚體）；每個“L”相互獨立地代表接頭；“Ab”代表抗PRLR抗體；每個“XY”代表在接頭上的官能基R x
與在抗原結合部分上的“互補”官能基R y
之間形成的鍵；並且n
代表與Ab連接的藥物的數量，或ADC的藥物與抗體比率（DAR）。上文描述了可以構成根據結構式 (I) 之ADC的各種抗PRLR抗體的具體實施方式。
在具有結構式 (I) 之ADC或鹽的一些具體實施方式中，每個D係相同的和/或每個L係相同的。
在下面更詳細地描述可以構成抗PRLR ADC的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑（D）和接頭（L）的具體實施方式、以及與抗PRLR ADC連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑的數量。
在某些實施方式中，ADC具有式 (I) 之結構、或其鹽，其中D包含吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體；L係接頭；Ab係包含SEQ ID NO: 1的抗體；XY代表接頭L與抗體Ab連接的共價鍵；並且n係任何整數。ADC的DAR等同於式 I 中所提及的“n”。在一個實施方式中，n係2或4。在較佳的實施方式中，n係約2。在此上下文中，術語“約”意指在實際值的± 7.5%內的量。即，“約2”意指1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99、2.00、2.01、2.02、2.03、2.04、2.05、2.06、2.07、2.08、2.09、2.10、2.11、2.12、2.13、2.14、2.15、和任何介於中間的範圍。在示例性實施方式中，n係約1.89或約1.96。下面描述了關於可以用於本發明的ADC中的藥物（式 I 的D）和接頭（式 I 的L）以及可替代的ADC結構的另外的細節。在一個實施方式中，該細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑係吡咯并苯并二氮呯（PBD），例如PBD二聚體。
可以例如在美國專利申請公開案號2013/0028917和2013/0028919、以及在WO 2011/130598 A1（其每一個藉由引用以其全文結合在此）中找到PBD的結構。PBD的通用結構在下面作為式 (II) 提供。(II)
PBD在其芳香族A環和吡咯并C環中的取代基的數量、類型和位置以及C環的飽和度方面都不同。在B環中，通常在N10-C11位置上具有亞胺（N=C）、甲醇胺（NH-CH(OH)）、或甲醇胺甲基醚（NH-CH(OMe)），該位置係負責將DNA烷基化的親電子中心。所有已知的天然產物在手性C11a位置處具有(S
)-組態，當從C環向A環看時，該(S
)-組態提供了右旋扭曲。本文提供的PBD實例可以軛合至本發明的抗PRLR抗體。可以例如在美國專利申請公開案號2013/0028917 A1和2013/0028919 A1中、在美國專利案號7,741,319 B2中、以及在WO 2011/130598 A1和WO 2006/111759 A1中（其每一個藉由引用以其全文結合在此）找到可以與本發明的抗PRLR抗體軛合的PBD的另外的實例。
在本文所描述的抗‑huPRLR ADC中，細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑藉由接頭連接至抗體。該等接頭可以是短的、長的、疏水的、親水的、柔性的或剛性的，或者可以由各自獨立地具有一種或多種上述性質的區段組成，這樣使得接頭可以包括具有不同性質的區段。接頭可以是多價的，這樣使得它們將多於一種藥劑共價連接至抗體上的單個位點，或者可以是單價的，這樣使得它們將單一試劑共價連接至抗體上的單個位點。
在某些實施方式中，所選擇的接頭在體內係可切割的。可切割的接頭可以包括化學或酶促不穩定或可降解的鍵。可切割的接頭通常依賴於細胞內部的過程來釋放藥物，如在細胞質中還原、在溶酶體中暴露於酸性條件下、或在細胞內被特定蛋白酶或其他酶切割。可切割的接頭通常包含一個或多個化學鍵，當接頭的其餘部分不可切割時該化學鍵係可化學切割或可酶促切割的。在某些實施方式中，接頭包含化學不穩定基團，如腙和/或二硫化物基團。包含化學不穩定基團的接頭利用在血漿與一些細胞質隔室之間的差異性質。促進含腙接頭的藥物釋放的細胞內條件係核內體和溶酶體的酸性環境，而含二硫化物的接頭在含有高巰基濃度（例如谷胱甘肽）的細胞溶質中被還原。在某些實施方式中，可以藉由使用靠近化學不穩定基團的取代基引入空間位阻來增加包含化學不穩定基團的接頭的血漿穩定性。
在血液的中性pH環境（pH 7.3-7.5）中，酸不穩定基團（如腙）在體循環過程中保持完整，並且一旦ADC在細胞的弱酸性內體（pH 5.0-6.5）和溶酶體（pH 4.5-5.0）隔室中被內化就經受水解並釋放藥物。這種pH依賴性釋放機制與藥物的非特異性釋放相關。為了增加接頭的腙基團的穩定性，可以藉由化學修飾（例如取代）改變接頭，從而允許調諧以實現溶酶體中更有效的釋放，同時使循環中的損失最小化。
含腙接頭可以含有另外的切割位點，例如另外的酸不穩定切割位點和/或酶促不穩定切割位點。包括示例性含腙接頭的ADC包括以下式 (III)、(IV)、和 (V) 之結構：
或其鹽，其中D和Ab分別代表細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑（藥物）和抗體，並且n代表與抗體連接的藥物接頭的數量。在某些接頭（如式 (III) 之接頭）中，接頭包含兩個可切割基團-二硫化物和腙部分。對於此類接頭，未修飾的游離藥物的有效釋放需要酸性pH或二硫化物還原和酸性pH。已經表明如式 (IV) 和 (V) 之那些接頭對於單個腙切割位點係有效的。
可能包含在接頭中的其他酸不穩定基團包括含順式-烏頭基（aconityl）的接頭。順式-烏頭基化學過程使用與醯胺鍵並置的羧酸加速在酸性條件下的醯胺水解。
可切割的接頭也可以包括二硫基。二硫化物在生理pH下是熱力學穩定的，並被設計為在細胞內部內化時釋放藥物，其中與細胞外環境相比細胞溶質提供更顯著的還原環境。二硫鍵的斷裂通常需要存在細胞質硫醇輔因子，如（還原的）谷胱甘肽（GSH），這樣使得含二硫化物的接頭在循環中合理穩定，選擇性釋放藥物到細胞溶質中。細胞內酶蛋白二硫化物異構酶或能夠切割二硫鍵的類似酶也可以促成細胞內二硫鍵的優先切割。據報導，與顯著較低濃度的GSH或半胱胺酸相比（最豐富的低分子量硫醇在循環中為約5 µM），GSH以0.5-10 mM的濃度範圍存在於細胞中。不規則血流導致缺氧狀態的腫瘤細胞導致還原酶活性增強，並因此導致甚至更高的谷胱甘肽濃度。在某些實施方式中，含二硫化物的接頭的體內穩定性可以藉由接頭的化學修飾來增強，例如使用鄰近二硫鍵的空間位阻。
包括示例性含二硫化物的接頭的ADC包括以下式 (VI)、(VII)、和 (VIII) 之結構：
或其鹽，其中D和Ab分別代表藥物和抗體，n代表與抗體連接的藥物接頭的數量，並且在每次出現時R獨立地選自例如氫或烷基。在某些實施方式中，增加鄰近二硫鍵的空間位阻增加了接頭的穩定性。當一個或多個R基團選自低級烷基（如甲基）時，結構如 (VI) 和 (VIII) 顯示增加的體內穩定性。
可以使用的另一種類型的可切割接頭係被酶特異性切割的接頭。此類接頭典型地是基於肽的或包括充當酶的底物的肽區域。基於肽的接頭比化學不穩定的接頭在血漿和細胞外環境中趨於更穩定。肽鍵通常具有良好的血清穩定性，因為與溶酶體相比，由於內源性抑制劑以及在血液中不利的高pH值，溶酶體蛋白水解酶在血液中具有非常低的活性。特別地，由於溶酶體蛋白酶（例如組織蛋白酶和纖溶酶）的作用而發生藥物從抗體的釋放。該等蛋白酶可能在某些腫瘤細胞中以升高的水平存在。
在示例性實施方式中，可切割肽選自四肽，如Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu；或二肽，如Val-Cit、Val-Ala、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、Phe-Lys、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Me3Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys。在某些實施方式中，由於較長肽的疏水性，二肽優於較長多肽。
已經描述了用於將藥物（如阿黴素（doxorubicin）、絲裂黴素（mitomycin）、喜樹鹼（campotothecin）、他利黴素（tallysomycin）和澳瑞他汀/澳瑞他汀家族成員）與抗體連接的各種基於二肽的可切割接頭（參見Dubowchik等人，1998，J. Org. Chem.
[有機化學雜誌] 67:1866-1872，Dubowchik等人，1998，Bioorg. Med. Chem. Lett.
[生物有機化學與醫藥化學通訊] 8(21):3341-3346；Walker等人，2002，Bioorg. Med. Chem. Lett.
[生物有機化學與醫藥化學通訊] 12:217-219；Walker等人，2004，Bioorg. Med. Chem. Lett.
[生物有機化學與醫藥化學通訊] 14:4323-4327；和Francisco等人，2003，Blood
[血液] 102:1458-1465，Dornina等人，2008，Bioconjugate Chemistry [生物共軛化學] 19:1960-1963，其每一個藉由引用結合在此）。所有該等二肽接頭或該等二肽接頭的修飾形式都可以用於本文所述的ADC中。可以使用的其他二肽接頭包括在ADC中發現的那些，如西雅圖遺傳學公司（Seattle Genetics）的Brentuximab Vendotin SGN-35（Adcetris™）、西雅圖遺傳學公司SGN-75（抗CD-70，Val-Cit-MMAF）、Celldex Therapeutics公司的格萊木單抗（glembatumumab）（CDX-011）（抗NMB，Val-Cit-MMAE）、和Cytogen公司的PSMA-ADC（PSMA-ADC-1301）（抗PSMA，Val-Cit-MMAE）。
酶促可切割的接頭可以包括自消間隔物（self-immolative spacer）以在空間上將藥物與酶促切割位點分開。藥物與肽接頭的直接附接可以導致藥物的胺基酸加合物的蛋白水解釋放，從而削弱其活性。自消間隔物的使用允許在醯胺鍵水解後消除完全活性的、未經化學修飾的藥物。
一個自消間隔物係雙官能對胺基苄醇基團，其藉由胺基基團與肽連接形成醯胺鍵，而含胺的藥物可以藉由胺基甲酸酯官能基附接至接頭的苄基羥基基團上（PABC）。所得的前藥在蛋白酶介導的切割後被啟動，導致1,6-消除反應釋放未修飾的藥物、二氧化碳和接頭基團的殘留物。以下方案描述了對胺基苄醚的片段化和藥物的釋放：其中X-D代表未修飾的藥物。
還描述了這種自消基團的雜環變體。參見例如US 7,989,434，藉由引用結合在此。
在一些實施方式中，酶促可切割接頭係基於ß-葡糖醛酸的接頭。藉由溶酶體酶ß-葡糖醛酸酶切割ß-葡糖苷酸糖苷鍵可以實現藥物的靈活釋放。這種酶在溶酶體內大量存在，並且在一些腫瘤類型中過表現，而細胞外的酶活性很低。由於ß-葡糖苷酸的親水性質，基於ß-葡糖醛酸的接頭可以用於規避ADC發生聚集的趨勢。在一些實施方式中，基於ß-葡糖醛酸的接頭較佳的是作為用於將ADC連接至疏水性藥物的接頭。以下方案描述了藥物從含有基於ß-葡糖醛酸的接頭的ADC的釋放：
已經描述了用於將藥物（如澳瑞他汀、喜樹鹼和阿黴素類似物、CBI小溝結合劑和psymberin）連接至抗體的各種可切割的基於ß-葡糖醛酸的接頭（參見例如Nolting，第5章“Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates [在抗體藥物軛合物中的接頭技術]”在： Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology
[抗體藥物軛合物：分子生物學中的方法]，第1045卷，第71-100頁，Laurent Ducry編輯，Springer Science & Business Medica, LLC [斯普林科學與商業媒體出版社]，2013；Jeffrey等人，2006，Bioconjug. Chem.
[生物共軛化學] 17:831-840；Jeffrey等人，2007，Bioorg. Med. Chem. Lett.
[生物有機化學與醫藥化學通訊] 17:2278-2280；和Jiang等人，2005，J. Am. Chem. Soc.
[美國化學學會雜誌] 127:11254-11255，其每一個藉由引用結合在此）。所有該等基於ß-葡糖醛酸的接頭均可以用於本文描述的抗PRLR ADC中。
在一個實施方式中，在本發明的ADC中使用的接頭顯示在式 (IX) 中，其中Y係Val，Z係Ala，D係藥物（例如PBD二聚體），並且q係1、2、3、4、5、6、7或8：(IX), 或其鹽。在示例性實施方式中，q係5。
在一個方面，本發明描述了ADC，該ADC包含藉由接頭與抗體連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑，其中該抗體藥物軛合物係根據結構式 (I) 之化合物，或其鹽，其中D包含吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體；L係接頭；Ab係包含SEQ ID NO: 1的抗體；XY代表接頭L與抗體Ab連接的共價鍵；並且n係任何整數。在一個實施方式中，XY代表將接頭L與抗體Ab連接的共價鍵，其中XY係與抗體Ab上的巰基基團形成的鍵。在另一個實施方式中，XY係馬來醯亞胺-巰基鍵。
在某些實施方式中，本發明的ADC包含式 (X) 之結構：(X)， 或其鹽，其中Ab係抗體，該抗體包含重鏈可變區（包含如分別列於SEQ ID NO: 3、4和5中的CDR組（CDRH1、CDRH2和CDRH3））以及輕鏈可變區（包含如分別列於SEQ ID NO: 8、9和10中的CDR組（CDRL1、CDRL2和CDRL3）），並且n係約2至約4。較佳的是，抗PRLR抗體係IgG1同種型，該IgG1同種型具有被工程改造以為PBD提供軛合位點的半胱胺酸突變的恒定區。在一個實施方式中，該半胱胺酸突變係在重鏈的位置239處。較佳的是，該突變係S239C，其中編號係根據Kabat。在一個實施方式中，n係約2或約4。在較佳的實施方式中，n係約2。在一個實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。
在某些實施方式中，本發明的ADC包含式 (X) 之結構：(X)， 或其鹽，其中Ab係抗體，該抗體包含重鏈可變區（包含SEQ ID NO: 2）和輕鏈可變區（包含SEQ ID NO: 7），並且n係約2至約4。較佳的是，抗PRLR抗體係IgG1同種型，該IgG1同種型具有被工程改造以為PBD提供軛合位點的半胱胺酸突變的恒定區。在一個實施方式中，該半胱胺酸突變係在重鏈的位置239處。較佳的是，該突變係S239C，其中編號係根據Kabat。在一個實施方式中，n係約2或約4。在較佳的實施方式中，n係約2。在一個實施方式中，抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。
在某些實施方式中，本發明的ADC包含式 (X) 之結構：(X)， 或其鹽，其中Ab係抗體，該抗體包含重鏈（包含列於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列）和輕鏈（包含列於SEQ ID NO: 6中的胺基酸序列）。在一個實施方式中，n係約2至約4。在一個實施方式中，n係約2或約4。在較佳的實施方式中，n係約2。
本文所描述的ADC可以使用本領域熟知的化學過程合成。所選擇的化學過程尤其依賴於一種或多種細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑的身份、接頭和用於將接頭附接至抗體的基團。通常，可以根據以下方案製備根據式 (I) 之ADC：D-L-R x
+Ab‑R y
→ [D-L-XY] n
-Ab (Ia) (Ib) (I) 其中D、L、Ab、XY和n
係如先前在上文所定義的，並且如上文所描述的，R x
和R y
代表能夠彼此形成共價鍵的互補基團。
基團R x
和R y
的身份將取決於用於將合成子D‑L‑R x
與抗體連接的化學過程。通常，所使用的化學過程不應改變抗體的完整性，例如其結合其靶標的能力。較佳的是，軛合的抗體的結合特性將非常類似於未軛合抗體的結合特性。用於將分子軛合至生物分子（如抗體）的各種化學過程和技術係本領域已知的，並且特別是軛合至抗體的各種化學過程和技術係眾所周知的。參見，例如，Amon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy [癌症治療中用於免疫靶向藥物的單株抗體],”在:Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy
[單株抗體和癌症治療]中，Reisfeld等人，編輯，艾倫利斯有限公司（Alan R. Liss, Inc.），1985；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery [用於藥物遞送的抗體]”，在:Controlled Drug Delivery
[控釋藥物遞送]中，Robinson等人，編輯，馬塞爾德克有限公司（Marcel Dekker, Inc.），第2版，1987；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review [癌症治療中細胞毒性劑的抗體載體：綜述]”，在:Monoclonal Antibodies ' 84: Biological And Clinical Applications
[單株抗體'84：生物和臨床應用]中，Pinchera等人，編輯，1985；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy [癌症治療中放射性標記的抗體的治療用途的分析、結果、以及未來前景]”，在:Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy
[用於癌症檢測和治療的單株抗體]，Baldwin等人，編輯，Academic Press [學術出版社]，1985；Thorpe等人，1982，Immunol. Rev.
[免疫學評論] 62:119-58；PCT公開WO 89/12624。該等化學過程的任一種都可以用來將合成子連接到抗體上。
用於將合成子連接至可接近的賴胺酸殘基的許多官能基R x
和化學過程係已知的，並且藉由舉例的方式包括但不限於NHS-酯和異硫氰酸酯。
用於將合成子連接至半胱胺酸殘基的可接近的游離巰基基團的許多官能基R x
和化學過程係已知的，並且藉由舉例的方式包括但不限於鹵代乙醯基和馬來醯亞胺。
然而，軛合化學過程不限於可用的側鏈基團。藉由將合適的小分子連接到胺上，可以將側鏈（如胺）轉化成其他有用的基團，如羥基。該策略可以用於藉由將多功能小分子軛合至抗體可接近胺基酸殘基的側鏈來增加抗體上可用的連接位點的數量。然後將適合用於將合成子與該等“轉化的”官能基共價連接的官能基R x
包括在合成子中。
還可以將抗體工程改造以包含用於軛合的胺基酸殘基。Axup等人，2012，Proc Natl Acad Sci U S A.
[美國科學院院報] 109(40):16101-16106描述了在ADC的上下文中用於工程改造抗體以包括可用於軛合藥物的非遺傳編碼的胺基酸殘基的方法，而且還描述了用於將合成子與非編碼的胺基酸連接的化學過程和官能基。
典型地，合成子與抗體的胺基酸殘基的側鏈連接，該胺基酸殘基的側鏈包括例如可接近的賴胺酸殘基的一級胺基基團或可接近的半胱胺酸殘基的巰基基團。游離的巰基基團可以藉由還原鏈間二硫鍵獲得。
對於其中R y
係巰基基團（例如，當R x
係馬來醯亞胺時）的鍵，通常首先將抗體完全或部分還原以破壞半胱胺酸殘基之間的鏈間二硫鍵。如果存在於抗體重鏈中，則特定的半胱胺酸殘基和鏈間二硫鍵可以被還原用於將藥物-接頭合成子（包括適合用於軛合的基團）附接至巰基基團，並且藉由舉例的方式包括但不限於：在人類IgG1
重鏈上的殘基C233、C239、和C242（Kabat編號系統；對應於殘基C220、C226、和C229 Eu編號）、和在人類Igκ輕鏈上的殘基C214（Kabat編號系統）。然而，在抗體重鏈在附接位點不含有半胱胺酸殘基的情況下，抗體可以被工程改造以在給定位置（例如位置239）處含有半胱胺酸。
可以藉由對一個或多個密碼子進行突變而在抗體中工程改造不參與二硫鍵的用於合成子附接的半胱胺酸殘基。還原該等不配對的半胱胺酸產生適合用於軛合的巰基基團。併入工程改造的半胱胺酸殘基的較佳的位置藉由舉例的方式包括但不限於在人類IgG1
重鏈上的位置S112C、S113C、A114C、S115C、A176C、S180C、S239C、S252C、V286C、V292C、S357C、A359C、S398C、S428C（Kabat編號），以及在人類Igκ輕鏈上的位置V110C、S114C、S121C、S127C、S168C、V205C（Kabat編號）（參見，例如，美國專利案號7,521,541、美國專利案號7,855,275和美國專利案號8,455,622）。在一個實施方式中，將殘基S239（Kabat編號系統）突變為半胱胺酸以允許PBD彈頭與抗PRLR抗體（例如抗體h16f）軛合。此突變在本文中被稱為“S239C”。
在某些實施方式中，本發明的ADC經由工程改造的半胱胺酸具有約2的DAR。在此上下文中，術語“約”意指在實際值的± 7.5%內的量。即，“約2”意指1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99、2.00、2.01、2.02、2.03、2.04、2.05、2.06、2.07、2.08、2.09、2.10、2.11、2.12、2.13、2.14、2.15、和任何介於中間的範圍。例如，在某些示例性實施方式中，本發明的ADC經由工程改造的半胱胺酸具有1.89或1.96的DAR。
在某些實施方式中，本發明的特徵在於製備ADC之方法，該方法包括在其中合成子使合成子與抗體共價連接的條件下，使分別列於SEQ ID NO: 1和6中的抗體重鏈和輕鏈與根據結構式 (Ia) 之合成子接觸（其中D係細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑能夠穿過細胞膜，L係能夠被溶酶體酶切割的接頭，並且R x
包含能夠將合成子與抗體共價連接的官能基），其中D係例如PBD二聚體。
如熟習該項技術者將理解的是，與抗體分子連接的細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑的數量可以變化，這樣使得ADC製劑在本質上可以是異質的，其中製劑中的一些抗體含有一個連接的藥劑、一些兩個、一些三個等等（還有一些沒有）。異質性程度將尤其取決於用於連接細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑的化學過程。例如，在抗體被還原以產生用於附接的巰基基團的情況下，經常產生每個分子具有0、2個、4個、6個或8個連接藥劑的抗體異質混合物。此外，藉由限制附接化合物的莫耳比，經常產生每個分子具有0、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個連接藥劑的抗體。因此，應當理解，取決於上下文，所述的藥物抗體比率（DAR）可以是許多抗體的平均值。例如，“DAR4”係指ADC製劑，該ADC製劑尚未經過純化以分離特定的DAR峰並且包含每個抗體具有不同數量的細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑附接（例如，每個抗體0、2個、4個、6個或8個藥劑）的ADC分子異質混合物，但是平均的藥物與抗體比率為4。
可以例如藉由疏水性相互作用層析法（“HIC”）處理異質ADC製劑以產生富集具有特定的感興趣的DAR（或兩種或更多種特定DAR的混合物）的ADC的製劑。此類富集的製劑在本文中被定名為“EX”，其中“E”表示ADC製劑已經被處理並且富集具有特定DAR的ADC，並且“X”表示每個ADC分子連接的細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑的數量。富含具有兩種特定DAR的ADC混合物的製劑被定名為“EX/EY”，三種特定的DAR“EX/EY/EZ”等等，其中“E”表示ADC製劑已經被處理以富集特定的DAR，並且“X”、“Y”和“Z”代表所富集的DAR。作為具體實例，“E2”係指已被富集以主要含有每個ADC分子連接有兩個細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑的ADC的ADC製劑。“E4”係指已被富集以主要含有每個ADC分子連接有四個細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑的ADC的ADC製劑。“E2/E4”係指已被富集以主要含有兩種ADC群體的ADC製劑，一種ADC群體的每個ADC分子連接有兩個細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑，另一種ADC群體的每個ADC分子連接有四個細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑。
如本文所使用的，雖然較高水平的純度（如至少約85%、90%、95%、98%或甚至更高的純度）可以是可獲得和令人希望的，但所述的DAR ADC中所富集的“E”製劑將通常是至少約80%純的。例如，在每個ADC分子連接有X個細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑的ADC中，“EX”製劑將通常是至少約80%純的。對於“更高階的”富集製劑，如例如“EX/EY”製劑，每個ADC分子連接有X和Y個細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑的ADC的總和通常將包含在製劑中總ADC的至少約80%。類似地，在富集的“EX/EY/EZ”製劑中，每個ADC分子連接有X、Y和Z個細胞生長抑制劑和/或細胞毒性劑的ADC的總和將包含製劑中總ADC的至少約80%。
如在本領域已知的，可以藉由各種方法評估純度。作為具體的實例，可以經由HPLC或其他層析法來分析ADC製劑，並藉由分析所得峰的曲線下面積來評估純度。
在一個實施方式中，本發明包含異質組成物，該異質組成物包含具有2的DAR（DAR E2）的h16f (S239C)-PBD ADC，其中該DAR E2種類在組成物中以所有ADC的＞80%（＞80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）存在。在一個實施方式中，本發明包含異質組成物，該異質組成物包含具有2的DAR（DAR E2）的h16f (S239C)-PBD ADC，其中該DAR E2種類在組成物中以所有ADC的＞90%（＞90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）存在。
在某些實施方式中，本發明的ADC的DAR係約2或約4。在另外的實施方式中，本發明的ADC的DAR係2。
本文所描述的ADC可能是處於藥物組成物之形式，該藥物組成物包含ADC和一種或多種載體、賦形劑和/或稀釋劑。該組成物可以被配製用於特定用途，如用於獸醫用途或人類中之藥物用途。 [序列簡述]
以其整體藉由引用結合在此的是標題為Sequence_Listing_12367、包含SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 31的序列表，該序列表包括本文所揭露的核酸和/或胺基酸序列。該序列表已經以ASCII文本格式提交。本序列表首次創建於2018年3月26日，並且具有56千位組大小。 [實例]
處於說明而非限制的目的，提供以下實例，該等實例強調抗PRLR ADC的示例性實施方式的某些特徵和性質。
應該注意的是，除非另有說明，在以下實例中所描述的PBD ADC的近似DAR係約2；參見，例如，實例3（1.89和1.96的DAR，被認為係約2）。實例 1. 抗 PRLR h16f (S239C) 的產生
抗體h16f係最初由鼠親本抗PRLR抗體產生的人源化抗體，該鼠親本抗PRLR抗體在例如細胞增殖測定中從具有抑制活性的抗PRLR抗體的篩選中鑒定出。h16f的輕鏈胺基酸序列描述在SEQ ID NO: 6中，可變區描述在SEQ ID NO: 7中，並且3個CDR描述在SEQ ID NO: 8至10中。h16f的重鏈胺基酸序列描述在SEQ ID NO: 11中，可變區描述在SEQ ID NO: 2中，並且3個CDR描述在SEQ ID NO: 3至5中。
確定抗體h16f具有與抗PRLR抗體LFA-102（諾華公司（Novartis））不同的特性。例如，確定抗體h16f相對於抗體LFA-102具有對PRLR較慢的解離速率，即6.23 x 10-4
s-1
的kd
和4.6 x 10-10
M的Kd
（h16f）相對於1.10 x 10-3
s-1
的Kd
和1.3 x 10-9
M的Kd
（LFA-102）。此外，使用X射線晶體學確定與PRLR結合的h16f和LFA-102抗PRLR抗體Fab片段的結構以確定每一者的表位。比較抗體h16f和LFA-102的緊密接觸區，並確定抗體h16f結合PRL配位基結合結構域，這係來自LFA-102的大體上非重疊的表位。因此，抗體h16f和LFA-102不具有相同的表位。
將許多人源化抗PRLR抗體（包括抗體h16f）軛合至澳瑞他汀以形成ADC，並評價其抑制表現不同PRLR水平的多種乳癌細胞系的生長的能力。然後評價最有效的ADC候選者針對BT-474人類乳腺腫瘤細胞系的抗腫瘤活性。BT-474每個細胞具有約10,000個PRLR受體，其低於介導有效的ADC殺死通常所需的數量，表明有效的內化可能是PRLR ADC活性的關鍵組分。因此，該腫瘤細胞系用作ADC內化特性的替代測量。基於該等結果，h16f抗體被鑒定為具有最有效的抑制活性。抗PRLR ADC的IC50
值描述在下面表 2
和圖 6
中。Ab-05係識別破傷風毒素的人類IgG1
對照，其不存在於使用的模型中。表 2
. 用人源化抗PRLR ADC抑制BT-474細胞的體外增殖。
* 在DAR 8的情況下將mAb軛合至MMAF。 ** 從每個起始鼠mAb產生多個人源化候選者。
PRLR序列同源性在人類和靈長類動物之間非常保守（＞95%），並且在人類和大鼠或小鼠之間不佳（＜85%）。h16f抗體以與人類和食蟹猴相似的親和力結合。如表 3
中所描述的，h16f抗體與大鼠或小鼠PRLR的結合顯著低於（＞1,000倍）人類PRLR。表 3
. 物種交叉反應性：同源性和Biacore。
注意：ECD = 細胞外結構域；KD
= 解離常數；PRLR = 催乳素受體
鑒定抗PRLR抗體h16f後，對抗體進行修飾以便工程改造彈頭PBD的位點特異性軛合位點。具體地，產生工程改造的半胱胺酸抗體（C239）以便允許PBD二聚體以約2的DAR進行位點特異性軛合。這種突變的抗體在本文中被稱為h16f (S239C)並且包括h16f輕鏈和經修飾的h16f (C239)重鏈序列。h16f (S239C)的重鏈胺基酸序列描述在下面SEQ ID NO: 1中。CDR（CDR1、CDR2和CDR3）（SEQ ID NO: 3至5）係加底線的，並且可變區（SEQ ID NO: 2）係斜體的。
h16f (S239C)的重鏈恒定區含有相對於其親本抗體的經修飾的殘基。具體地，相對於h16f的重鏈，殘基239（Kabat編號）從S突變為C。此殘基在上面SEQ ID NO: 1中是加底線的/粗體的。應該注意的是，S239C（Kabat編號）對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸殘基編號242（S242C）。
下面提供了h16f (S239C)的輕鏈胺基酸序列（SEQ ID NO: 6），其中CDR1、CDR2和CDR3（SEQ ID NO: 8-10）係加底線的，並且可變區（SEQ ID NO: 7）係斜體的。
如在下面實例中所描述的，將h16f (S239C)進一步軛合至PBD二聚體並測試為ADC。實例 2. PBD 軛合物的產生和理化特性
h16f (S239C)-PBD由兩個PBD藥物-接頭分子構成，該PBD藥物-接頭分子與Cys工程改造的抗PRLR抗體h16f軛合。圖 1
中描述了PBD和接頭的結構。圖 1
還描述了製備h16f (S239C)-PBD的過程。軛合過程由還原鏈間二硫鍵、定量氧化和與過量的PBD藥物接頭軛合組成。軛合過程由工程改造的和鏈間二硫化物的定量還原組成。然後純化還原混合物以除去過量的試劑及其副產物，接著定量氧化鏈間二硫化物，並然後與過量的PBD藥物-接頭軛合。在淬滅後，將反應混合物純化並交換緩衝液以產生具有＞80% DAR2藥物載入的h16f (S239C)-PBD，如圖 2
中所描述的。純化後h16f (S239C)-PBD ADC的總產率係大約80%。軛合過程需要使用大約4% wt載入（約3.5 g）的PBD藥物接頭。實例 3. h16f (S239C)-PBD ADC 與 h16f-MMAE ADC 的體內比較
評價h16f-MMAE和h16f (S239C)-PBD軛合物抑制表現不同PRLR水平的一組25種乳癌細胞系的生長的能力。該比較分析的結果描述在下面表 4
和圖 7
中。在本研究中使用的h16f (S239C)-PBD軛合物具有1.89或1.96的的DAR。表 4
和圖 7
中顯示了6天增殖測定IC50
（nM）結果。表 4
.用h16f (S239C)-PBD、h16f-MMAE和對照抗體（Ab）095 ADC的乳癌細胞系PRLR表現和增殖測定總結。
* 乳癌細胞系敏感（粗體，＞50%最大抑制）、部分敏感（加底線）和耐藥性（普通類型）。在以3 µg/mL的濃度開始的細胞殺死滴定測定中確定IC50
值。 ** +表示HER2+細胞系；對於所選擇的細胞系顯示了藉由基於FACS的抗原結合確定的PRLR/細胞。 *** 基於微陣列分析的相對RNA表現。 **** PBD軛合物相對於MMAE軛合物的活性增加顯示為藉由IC50
值的比率確定的效力倍增。
如在表 4
中所描述的，顯示對h16f (S239C)-PBD治療敏感（＞50% 最大抑制）的乳癌細胞系係：T47D（26,000）、MDAMB361、HCC1428、BT474.FP2（10,000）、MDAMB134VI、CAMA1、MCF7（8,000）、HCC1500、ZR751、MDAMB415、SKBR3、HCC70、HCC1143、MDAMB468、BT549、和HCC1187。顯示對h16f MMAE治療敏感（＞ 50%最大抑制）的乳癌細胞系係：T47D（26,000）、MDAMB361、HCC1428、BT474.FP2（10,000）、MDAMB134VI、CAMA1、HCC1500、ZR751。顯示對h16f (S239C)-PBD治療部分敏感的乳癌細胞系係：MDAMB175VII、HCC38、UACC812和MDAMB436.FP9（4,000）。顯示對h16f MMAE-PBD治療部分敏感的乳癌細胞系係：MCF7（8,000）和SKBR3。
PBD軛合物相對於MMAE軛合物的活性增加顯示為如藉由IC50
值的比率確定的效力倍增。如在表 6
中所顯示的，與抗體（h16f）的MMAE軛合物相比，PBD軛合物顯示效力增加。
測量該等腫瘤細胞上的PRLR受體密度允許評估在受體表現和對ADC介導的殺死的敏感性之間的相關性。在表 4
和圖 7
中所描述的結果表明，細胞系對藉由ADC殺死的細胞系敏感性與PRLR mRNA和蛋白質表現相關。PRLR在HER2+和HER2-腫瘤中過表現。對藉由h16f-MMAE ADC的殺死敏感的每種腫瘤細胞系對藉由h16f (S239C)-PBD的殺死具有驚人相同的或更多的敏感性。此外，具有較低PRLR水平的若干種腫瘤細胞系對藉由PBD軛合物的殺死敏感，但對h16f-MMAE大體上不敏感。該等結果表明h16f (S239C)-PBD比h16f-MMAE更有效並且可以為敏感腫瘤提供另外的治療選擇。
BT-474具有約10,000 PRLR/細胞，這低於其他受體（如ERBB2、MET和EGFR）介導有效的ADC殺死通常所需的表現，但是與其他靶標（如組織因子和LGR5）所見的水平類似。BT-474對PRLR ADC介導的細胞殺死的敏感性表明，有效的內化和/或內部加工係ADC活性的關鍵組分。免疫螢光和彈頭量化研究證實了ADC的快速內化。
由於PRLR/PRL軸涉及其他組織（包括生殖組織和前列腺）（Martei等人，(2015)Breast Cancer
[乳癌] 7:337-343；Damiano等人，(2013)Clin Cancer Res
[臨床癌症研究] 19:1644-1650），如在表 5
和圖 8
中所描述的，評價了h16f-MMAE和-PBD軛合物抑制非乳房來源的腫瘤細胞系的生長的能力。儘管在該等細胞系中PRLR RNA的水平通常遠低於許多乳癌細胞系觀察到的水平，但若干種細胞系對藉由h16f (S239C)-PBD而不是h16f-MMAE的殺死敏感。該等結果表明h16f (S239C)-PBD可以有效治療除乳癌以外的腫瘤類型。表 5
.用h16f-PBD、h16f-MMAE和對照（Ab095）ADC的PRLR表現和增殖測定數據
* 腫瘤細胞系敏感性：（粗體（SMOV2（2300）、ES2.LMC、AN3CA、22Rv1、SW403、LS174T、HuH7、HEK293/人類PRLR）；＞50%最大抑制）；部分敏感（加底線的（HepG2、Hep3B、NCI-H1048））和耐藥性（普通）。在以3 µg/mL的濃度開始的細胞殺死滴定測定中確定IC50
值。 ** 對於所選擇的細胞系顯示了藉由基於FACS的抗原結合確定的PRLR/細胞。 *** 基於微陣列分析的相對RNA表現。 **** PBD軛合物相對於MMAE軛合物的活性增加顯示為藉由IC50
值的比率確定的效力倍增。
PBD軛合物相對於MMAE軛合物的活性增加顯示為如藉由IC50
值的比率確定的效力倍增。如在表 5
中所顯示的，與h16f的MMAE軛合物相比，h16f (S239C)-PBD軛合物顯示效力增加。實例 4.PRLR ADC 的體內特性
使用h16f軛合的澳瑞他汀有效載入和PBD有效載入兩者進行了在小鼠受試者中使用BT-474異種移植物模型的體內研究，以便比較在實質上相同的抗體的背景下兩種彈頭的活性。
BT-474係表現約10,000 PRLR受體/細胞的ER+、黃體酮受體(PR)-、HER2+乳癌細胞系，並且h16f (S239C)-PBD（0.27 nM）的體內功效與h16f-MMAE ADC（0.56 nM）相似（參見表 5
）。相反並且令人驚訝的是，如圖 3A
中所描述的，與以3 mg/kg的h16f-MMAE的單劑量（QDx1）劑量方案相比，0.5 mg/kg的h16f (S239C)-PBD的體內功效顯著改善。在隨後的Q7Dx3研究中（其中小鼠每7天給予，持續3周；Q7Dx3），如在圖 3B
中所描述的，0.3 mg/kg和0.2 mg/kg劑量的h16f (S239C)-PBD優於3 mg/kg劑量的h16f-MMAE。
為了進一步評估h16f (S239C)-PBD的抗腫瘤活性，在15個乳癌患者衍生的異種移植物（PDX）（主要但不限於三陰性乳癌（TNB））腫瘤模型（可從Champions Oncology公司商購的）中進行“n = 3”的靶向研究，該腫瘤模型表現範圍從弱到中等的PRLR。研究和結果描述在表 8
中。此表中的PRLR密度反映為與在MCF7腫瘤細胞系上的PRLR數目（8,000個受體/細胞，參見表 4
）的比較。如在表 6
和圖 9
中所總結的，結果令人驚訝地表明，在已經評價的大多數PDX模型中，h16f (S239C)-PBD比h16f-MMAE更有活性。所評價的一個另外的TNB PDX模型（BR-0851）對h16f (S239C)-PBD不敏感。表 6
. 具有h16f (S239C)-PBD與h16f-MMAE ADC的人類乳癌PDX模型 a.
使用人類患者衍生的異種移植物模型進行所有體內功效研究，所述異種移植物模型在小鼠側翼皮下生長為異種移植物。PRLR表現水平相對於作為基準的低表現腫瘤（培養物中約8000個受體/細胞）MCF7表示。TGI = 相對於對照組的最大腫瘤生長抑制。功效被分類為：低 = 25%-50% TGI、中等 = 50%-75% TGI、或高＞ 75% TGI。
對於來自在表 6
中所描述的篩選中的選擇的PDX模型的腫瘤生長抑制顯示在圖 4A
和圖 4B
中。CTG-0012係TNB腫瘤模型的實例，其中h16f (S239C)-PBD和h16 MMAE顯示出令人驚訝的相似功效，儘管PBD軛合物的給予濃度比MMAE軛合物低10倍，而CTG-0670係TNB腫瘤模型的實例，其中低10倍劑量的h16f (S239C)-PBD比h16f-MMAE更有效。來自使用CTG-0012、CTG-0670、和CTG-0869模型的對比研究的結果分別描述在圖 4A
、圖 4B
、和圖 4C
中。與來自體外測定的結果一致（表 5
），該等數據表明h16f (S239C)-PBD係比基於澳瑞他汀的ADC更有效的ADC軛合物，並且其活性可以延伸至表現較低PRLR的腫瘤。實例 5. 體外血漿穩定性
在來自小鼠、大鼠、食蟹猴和人類的血漿中以及在緩衝液中在37°C在體外持續6天評價螢光標記的h16f (S239C)抗體和h16f (S239C)-PBD DAR2的穩定性。藉由尺寸排阻層析法（SEC）測量蛋白質聚集和片段化；藉由液相層析-質譜（LC/MS/MS）測定未軛合的PBD。對於緩衝液和血漿，h16f (S239C) mAb在t0時顯示2%-4%的初始聚集物，以及最小百分比增加/天（＜
0.7%）。在所有測試的矩陣中，抗體在t0具有0%的初始片段和最小%增加/天（＜
0.3%）。在緩衝液和血漿中，h16f (S239C)-PBD DAR2 ADC在t0時顯示可變的初始聚集物（0-4%）和片段（0-1.4%）。與緩衝液相比，ADC在血漿中具有更高百分比聚集物增加/天（0.4%-4%），其中人類＞食蟹猴＞大鼠-小鼠血漿。如在圖 5A
和圖 5B
中所描述的，在所有矩陣中，百分比片段增加/天為最小（＜
0.2%）。PBD彈頭本身經過測試，併發現在所有物種中在37°C的血漿中穩定6天。從h16f (S239C)-PBD DAR2釋放的非軛合彈頭低於在所有時間點和在所有矩陣中的定量水平。這對應於給予的彈頭當量的＜ 0.7%。總體上，h16f (S239C) mAb和h16f (S239C)-PBD DAR2的體外血漿穩定性與h16f和h16f-vcMMAE DAR3p相似（如果不是更好的話）。
該等結果支持令人驚訝且出乎意料的發現，即本發明的h16f (S239C)-PBD ADC具有低的藥物與抗體比率（DAR），令人驚訝地提供了高度有效的ADC。總之，本發明描述了ADC h16f (S239C)-PBD，其係比基於澳瑞他汀的ADC（使用基本上相同的抗體骨架）更有效的ADC軛合物。實例 6. S239C 突變體之間與 PRLR 特異性結合的比較
在FACS滴定實驗中，在對照和表現PRLR的HEK-293細胞上比較了親本和S239C突變體抗體。四種測試的抗體係h16f、h16e、h16f (S239C)、和h16e (S239C)。結果顯示在圖 10
中。簡言之，h16f (S239C) mAb具有與h16f相似的對表現PRLR的HEK-293細胞的結合。然而，令人驚訝的是，與其親本（h16e）相比，h16e (S239C) mAb顯示結合親和力降低7倍。因此，比較地，S239C突變不影響h16f (S239C) 之結合親和力，但顯著影響h16e (S239C)的結合親和力。對於h16f、h16f (S239C)、h16e和h16e (S239C)之間的序列之間的比較，參見以下表 7
和8
。該等結果支持令人驚訝和出乎意料的發現，即與h16e不同，h16f (S239C)對PRLR的親和力相對於親本h16f不具有降低的結合親和力。
考慮到先前上文的實例中的發現，ADC構建體h16f (S239C)-PBD因此 (1
) 在各種條件下是穩定的（參見實例5）；(2
) 比使用基本上相同的抗體骨架的基於澳瑞他汀的ADC有效得多（參見實例3-4，體外和體內兩者）；(3
) 與具有S239C突變的類似抗體不同，相對於其親本抗體展示很少至不降低的對PRLR的結合親和力（參見實例6和圖 10
）；並且 (4
) 具有令人驚訝的約2（例如1.89、1.96）的低藥物與抗體比率（DAR）（參見實例3）。抗體序列表： 表 7
.抗PRLR抗體h16f和h16f (S239C) 之胺基酸序列
注意：h16f (S239C) 和h16f在輕鏈和重鏈中含有相同的胺基酸序列，除了在重鏈的恒定區的單個胺基酸改變（S239C），如上文所描述的。表 8.
抗PRLR抗體h16e和h16e (S239C) 之胺基酸序列
注意：h16e (S239C) 和h16e在輕鏈和重鏈中含有相同的胺基酸序列，除了在重鏈的恒定區的單個胺基酸改變（S239C），如上文所描述的。
出於所有目的本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請和其他檔藉由引用以其全文特此結合，其程度如同出於所有目的每個單獨的出版物、專利、專利申請或其他文件單獨地指明藉由引用結合一樣。
儘管已經說明和描述了各種具體實施方式，但應該理解，在不脫離一個或多個發明的精神和範圍的情況下可以進行各種改變。
[ 圖 1]
顯示h16f (S239C)-PBD之製備。如實例2中所描述的，軛合過程由鏈間二硫化物的還原、定量氧化和與過量PBD藥物接頭的軛合組成。
[ 圖 2]
係顯示h16f (S239C)-PBD的疏水性相互作用層析法（HIC）之曲線圖。如實例2中所顯示，鑒別反應參數以提供具有＞80% DAR2藥物載入量的軛合物。
[ 圖 3A]
係顯示使用BT-474異種移植物模型對h16f (S239C)-PBD和h16f-MMAE的體內功效進行比較之曲線圖。向小鼠給予僅載體、Ab-095 MMAE（3 mkd（mg/kg/天））、h16f MMAE（3 mkd）、Ab-095PBD（0.5 mkd）或h16f（0.5 mkd）。以mm3
測量平均腫瘤體積。x軸上的箭頭表示給予時間點。Ab-05係識別破傷風毒素的人類IgG1
對照，其不存在於所使用的模型中。如實例4中所顯示和描述的，用單劑量（QDx1）的劑量方案，與3 mg/kg的h16f-MMAE相比，0.5 mg/kg的h16f (S239C)-PBD的體內功效顯著改善。
[ 圖 3B]
係顯示在BT-474異種移植物模型中對以QD7x3給予（B）的h16f (S239C)-PBD和h16f-MMAE的體內功效進行比較之曲線圖。向小鼠給予僅載體、Ab-095 MMAE（3 mkd（mg/kg/天））、h16f MMAE（3 mkd）、Ab-095 PBD（0.3 mkd）、h16f PBD（0.3 mkd）或h16f PBD（0.2 mkd）。以mm3
測量平均腫瘤體積。如在實例4中所顯示和描述的，0.3 mg/kg和0.2 mg/kg劑量的h16f (S239C)-PBD優於3 mg/kg劑量的h16f-MMAE。
[ 圖 4A]
係顯示用三陰性乳癌（TNB）CTG-0012腫瘤模型在患者衍生的異種移植物（PDX）篩選中h16f (S239C)-PBD的體內功效之曲線圖。向小鼠給予Ab-095裸抗體、Ab-095 PBD、h16f PBD、Ab-095 MMAE、或h16f MMAE。如在實例4中所顯示和描述的，h16f (S239C)-PBD係比基於澳瑞他汀（auristatin）的ADC更有效的ADC軛合物，並且其活性可以延伸至表現較低PRLR的腫瘤。
[ 圖 4B]
係顯示用TNB CTG-0670腫瘤模型的情況下h16f (S239C)-PBD的體內功效之曲線圖。向小鼠給予Ab-095裸抗體、Ab-095 PBD、h16f PBD、Ab-095 MMAE、或h16f MMAE。如在實例4中所顯示和描述的，h16f (S239C)-PBD係比基於澳瑞他汀（auristatin）的ADC更有效的ADC軛合物，並且其活性可以延伸至表現較低PRLR的腫瘤。
[ 圖 4C]
係顯示用TNBC CTG-0869模型的情況下h16f (S239C)-PBD的體內功效之曲線圖。向小鼠給予Ab-095裸抗體、Ab-095 PBD、h16f PBD、Ab-095 MMAE、或h16f MMAE。注意，對於圖 4A
、圖 4B
、和圖 4C
，術語“h16f-PBD”係指h16f (S239C)-PBD。如在實例4中所顯示和描述的，h16f (S239C)-PBD係比基於澳瑞他汀（auristatin）的ADC更有效的ADC軛合物，並且其活性可以延伸至表現較低PRLR的腫瘤。
[ 圖 5A]
係顯示h16f (S239C)的蛋白質聚集和片段化之曲線圖。在時間“0”（t0）顯示聚集物百分比（%）和片段%，以及每天片段百分比增加和每天聚集物百分比增加。如在實例5中所顯示和描述的，h16f (S239C) mAb和h16f (S239C)-PBD DAR2的體外血漿穩定性與h16f和h16f-vcMMAE DAR3p相似（如果不是更好的話）。
[ 圖 5B]
係顯示h16f (S239C)-PBD DAR2的蛋白質聚集和片段化之曲線圖。在時間“0”（t0）顯示聚集物百分比（%）和片段%，以及每天片段百分比增加和每天聚集物百分比增加。如在實例5中所顯示和描述的，h16f (S239C) mAb和h16f (S239C)-PBD DAR2的體外血漿穩定性與h16f和h16f-vcMMAE DAR3p相似（如果不是更好的話）。
[ 圖 6]
提供了描述用人源化PRLR ADC候選者抑制BT-474細胞的體外增殖之表。如在實例1中所顯示和描述的，在含有抗PRLR抗體的不同ADC中，利用h16f的ADC在體外表現出最有效的抑制活性。
[ 圖 7]
提供了描述用h16f (S239C)-PBD、h16f-MMAE和對照Ab095 ADC的情況下的乳癌細胞系PRLR表現和增殖測定總結之表。用箭頭顯示示例性深粉色值。淺粉色用“^”表示。如在實例3中所顯示和描述的，與抗體h16f的MMAE軛合物相比，PBD軛合物顯示效力增加。
[ 圖 8]
提供了用h16f-PBD、h16f-MMAE和對照（Ab095）ADC的情況下的PRLR表現和增殖測定數據之表。用箭頭顯示示例性深粉色值。淺粉色用“^”表示。如在實例3中所顯示和描述的，與h16f的MMAE軛合物相比，h16f (S239C)-PBD軛合物顯示效力增加。
[ 圖 9]
提供了描述用h16f ADC的情況下的人類乳癌PDX模型之表。如在實例4中所顯示和描述的，在大多數所評價的PDX模型中，h16f (S239C)-PBD比h16f-MMAE更具活性。
[ 圖 10]
提供了在h16f、h16f (S239C) 突變體、h19e和h19e (S239C) 突變體之間與對照（左）和表現PRLR的HEK-293細胞（右）特異性結合（nM）的比較。如實例6中所顯示和描述的，結果表明，與h16f-S239C相比，h16e-S239C突變體對PRLR的親和力降低了7倍，而h16f-S239C突變體與親本h16f抗體對PRLR具有相似的親和力。所計算的EC50（nM）值顯示在最右邊。
Claims (17)
- 一種抗體藥物軛合物（ADC），該抗體藥物軛合物包含式 (X) 之結構（X)，或其鹽， 其中Ab包含抗PRLR抗體，該抗PRLR抗體包含： i. 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列、CDRH2序列和CDRH3序列，該CDRH1序列包含SEQ ID NO: 3，該CDRH2序列包含SEQ ID NO: 4，該CDRH3序列包含SEQ ID NO: 5； ii. 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列、CDRL2序列和CDRL3序列，該CDRL1序列包含SEQ ID NO: 8，該CDRL2序列包含SEQ ID NO: 9，該CDRL3序列包含SEQ ID NO: 10； iii. 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係根據Kabat；以及 iv. 其中n係約2。
- 如申請專利範圍第1項所述之ADC，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 7。
- 如申請專利範圍第1項所述之ADC，該ADC包含完整的重鏈和完整的輕鏈，該完整的重鏈包含SEQ ID NO: 1，該完整的輕鏈包含SEQ ID NO: 6。
- 如申請專利範圍第1項所述之ADC，其中該抗PRLR抗體包含IgG1同種型。
- 如申請專利範圍第1項所述之ADC，其中該抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之ADC，其中 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2，並且 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 7。
- 如申請專利範圍第6項所述之ADC，該ADC包含完整的重鏈和完整的輕鏈，該完整的重鏈包含SEQ ID NO: 1，該完整的輕鏈包含SEQ ID NO: 6。
- 如申請專利範圍第6項所述之ADC，其中該抗PRLR抗體包含IgG1同種型。
- 如申請專利範圍第6項所述之ADC，其中該抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之ADC，其中該重鏈包含SEQ ID NO: 1，並且該輕鏈包含SEQ ID NO: 6。
- 如申請專利範圍第10項所述之ADC，其中該抗PRLR抗體係人源化抗體。
- 一種抗體藥物軛合物（ADC），該抗體藥物軛合物包含式 (IX) 之結構(IX) 或其鹽，其中D包含吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體；Ab係抗催乳素受體（PRLR）抗體，Y係Val，Z係Ala，並且q係1、2、3、4、5、6、7或8，並且其中該抗PRLR抗體包含： i. 重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1序列、CDRH2序列和CDRH3序列，該CDRH1序列包含SEQ ID NO: 3，該CDRH2序列包含SEQ ID NO: 4，該CDRH3序列包含SEQ ID NO: 5； ii. 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1序列、CDRL2序列和CDRL3序列，該CDRL1序列包含SEQ ID NO: 8，該CDRL2序列包含SEQ ID NO: 9，該CDRL3序列包含SEQ ID NO: 10； iii. 在重鏈恒定區中包含S239C的突變，其中編號係根據Kabat；以及 iv. 其中n係約2。
- 如申請專利範圍第12項所述之ADC，其中q係5。
- 如申請專利範圍第12項所述之ADC，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 7。
- 如申請專利範圍第14項所述之ADC，其中該重鏈包含SEQ ID NO: 1，並且該輕鏈包含SEQ ID NO: 6。
- 如申請專利範圍第12項所述之ADC，其中該抗PRLR抗體包含IgG1同種型。
- 如申請專利範圍第12項所述之ADC，其中該抗PRLR抗體的重鏈恒定區缺乏C-末端賴胺酸或者在重鏈恒定區的C-末端包含除賴胺酸以外的胺基酸。
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