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TW201138821A - Bispecific antibodies - Google Patents

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TW201138821A
TW201138821A TW100109958A TW100109958A TW201138821A TW 201138821 A TW201138821 A TW 201138821A TW 100109958 A TW100109958 A TW 100109958A TW 100109958 A TW100109958 A TW 100109958A TW 201138821 A TW201138821 A TW 201138821A
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TW100109958A
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Ulrich Brinkmann
Rebecca Croasdale
Wilma Lau
Harald Duerr
Christian Klein
Erhard Kopetzki
Joerg Thomas Regula
Juergen Michael Schanzer
Pablo Umana
Katharina Wartha
Original Assignee
Roche Glycart Ag
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Description

201138821 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於雙特異性抗體、其製造方法、含有該等抗 體之醫藥組合物，及其用途。 【先前技術】 不久前已藉由融合例如IgG抗體型式與單鏈域開發出多 種多特異性重組抗體型式’例如四價雙特異性抗體（參看 例如 Coloma，M.J.等人，Nature Biotech 15 (1997) 159-163; 0 WO 2001/077342 ;及 Morrison，S.L.，Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234)。 亦已開發出若干其他新型式，其中不再保留抗體核心結 構（IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，諸如雙功能抗體、三功 能抗體或四功能抗體、微型抗體、若干單鏈型式（scFv、 雙scFv)，其能夠結合兩種或兩種以上抗原（Holliger，Ρ·等 人，Nature Biotech 23 (2005) 1 126-1 136 ; Fischer, Ν.， L6ger 0.，Pathobiology 74 (2007) 3-14 ; Shen，J.等人， 〇 Journal of Immunological Methods 3 18 (2007) 65-74 ; Wu, C.等人，Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。 所有此等型式均使用連接子以使抗體核心（IgA、IgD、 IgE、IgG或IgM)與另一結合蛋白（例如scFv)融合或使例如 兩個 Fab片段或者scFv融合（Fischer N.，L6ger Ο., Pathobiology 74 (2007) 3-14)。必須記住，可藉由維持與天然存在之抗 體的高相似度來保留經由Fc受體結合介導之效應功能，諸 如補體依賴性細胞毒性（CDC)或抗體依賴性細胞毒性 154378.doc 201138821 (ADCC)。 在WO 2007/024715中報導雙可變域免疫球蛋白作為工程 改造之多價及多特異性結合蛋白。US 6,897,(M4中報導製 備具生物活性抗體之二聚體之方法。US 7，129,330中報導 具有至少四個可變域經由肽連接子彼此連接之多價Fv抗體 構築體。US 2005/0079170中報導二聚及多聚抗原結合結 構。US 6,51 1,663中報導包含三或四個Fab片段由連接結構 彼此共價結合之三或四價單特異性抗原結合蛋白，該蛋白 質不為天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報導可有效 表現於原核及真核細胞中且適用於治療及診斷方法之四價 雙特異性抗體。US 2005/0163782中報導分離或優先合成 經由二聚體之至少一個鏈間二硫鍵連接、不經由包含兩種 類型多肽二聚體之混合物之至少一個鏈間二硫鍵連接的二 聚體之方法。1；8 5,959,083中報導雙特異性四價受體。\¥〇 2001/077342中報導具有三個或三個以上功能性抗原結合 位點之工程改造抗體。 WO 1997/0015 80中報導多特異性及多價抗原結合多肽。 WO 1992/004053報導藉由合成交聯來共價連接通常自結合 同一抗原決定子之IgG類別之單株抗體製備的均接合物 (homoconjugate)。在WO 1991/06305中報導對抗原具有高 親合力之寡聚單株抗體，藉此分泌具有兩個或兩個以上免 疫球蛋白單體締合在一起形成四價或六價IgG分子的通常 為IgG類別之募聚物。在US 6,350,860中報導來源於綿羊之 抗體及工程改造之抗體構築體，其可用以治療由干擾素γ 154378.doc 201138821 活性引起之疾病。在US 2005/0100543中報導為雙特異性 抗體之多價載體的可靶向構築體，亦即可靶向構築體之各 分子可充當兩種或兩種以上雙特異性抗體之載體。 在WO 1995/009917中報導遺傳工程改造之雙特異性四價 抗體。在WO 2007/109254中報導由穩定化scFv組成或包含 穩定化scFv之穩定化結合分子。 由以下文獻獲知針對EGFR及IGF-1R之雙特異性抗體：
Lu, D.等人，Biochemical and Biophysical Research O Communications 3 1 8 (2004) 5 07-5 13 ; Lu，D.等人，j. Biol Chem·，279 (2004) 2856-2865 ;及 Lu, D_ 等人，j. Bi〇1 Chem. 280 (2005) 19665-72 ° US 2007/0274985係關於包含亦可締合成二聚體之單鏈 Fab(scFab)蛋白的合成抗體分子，包括異質抗體，其中至 少兩個單鏈抗體分子締合。 WO 2009/080253係關於雙特異性二價抗體。 然而，鑒於多特異性抗體之不同問題及態樣（例如藥物 〇 動力學及生物特性、穩定性、聚集 '表現量、副產物）， 需要其他替代性多特異性抗體型式。 【發明内容】 在一個態樣中，本發明係關於包含以下之雙特異性抗 體： a) 特異性結合第一抗原之第一全長抗體之重鏈及輕 鏈； b) 特異性結合第二抗原之第二全長抗體之重鏈及輕 154378.doc 201138821 鏈’其中重鏈之N端經由肽連接子連接至輕鏈之c 端。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體進一步 特徵在於： a) 之全長抗體之重鏈的CH3域與b)之全長抗體之重鏈 的CH3域各在抗體CH3域之間的原始界面中包含改變的 界面會合； 其中i)在一條重鏈之CH3域中 一胺基酸殘基經一具有較大侧鏈體積之胺基酸殘基置 換’藉此在一條重鏈之CH3域的界面内產生隆凸，其可 位於另一條重鏈之CH3域的界面内之空腔中 且其中 ii)在另一條重鏈之CH3域中 一胺基酸殘基經一具有較小側鍵體積之胺基酸殘基置 換’藉此在第二CH3域之界面内產生空腔，第一 CH3域 之界面内之隆凸可位於該空腔中。 在另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵在於： 兩個CH3域藉由在各CH3域之相應位置引入半胱胺 酸（C)胺基酸以使得兩個CH3域之間可形成二硫橋來進 一步改變。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： b) 之第二全長抗體的重鏈及輕鏈之抗體重鏈可變域 (VH)及抗體輕鏈可變域（VL)藉由在以下位置之間引入二 154378.doc 201138821 硫鍵來經二硫鍵穩定： i) 重鏈可變域位置44與輕鏈可變域位置100， ii) 重鏈可變域位置105與輕鏈可變域位置43，或 iii) 重鏈可變域位置101與輕鏈可變域位置100。 * 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 ， 在於： a) 第一全長抗體特異性結合IGF-1R且包含具有SEQ ID NO: 1胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 2胺基 〇 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合EGFR且包含重鏈經由肽連 接子連接至該輕鏈，其中該肽連接之重鏈與輕鏈具 有SEQ ID NO: 3胺基酸序列。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合IGF-1R且包含具有SEQ ID NO: 1胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 2胺基 ❹ 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合EGFR且包含重鏈經由肽連 '· 接子連接至該輕鏈，其中該肽連接之重鏈與輕鏈具 ·- 有SEQ ID NO: 4胺基酸序列。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a)第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 154378.doc 201138821 酸序列的輕鏈，及 b)第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由月太 連接子連接至該輕鏈，其中該肽連接之重鏈與輕鍵 具有SEQ ID NO: 7胺基酸序列。 在本發明之另一態樣中’本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ m N〇: 6胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF_1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該肽連接之重鏈與輕鏈 具有SEQ ID NO: 8胺基酸序列。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於抗體包含IgGl之恆定區。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於.該抗體在Asn297經糖鏈糖基化，其中糖鏈内海藻糖 之量為65%或65%以下。 本發明之其他態樣為包含該雙特異性抗體之醫藥組合 物、冶療癌症之該組合物、該雙特異性抗體製造用於治療 癌症之藥物的用途、藉由對需要此治療之患者投與該雙特 異性抗體來治療罹患癌症之患者的方法。 本發明之另一態樣為編碼本發明之雙特異性抗體之鏈的 核酸分子。 本發月進步提供含有本發明之該核酸且能夠在原核或 154378.doc 201138821 真核宿主細胞中表現該核酸的表現載體，及含有重組產生 本發明之雙特異性抗體之此等載體的宿主細胞。 本發明進一步包含包括本發明之載體的原核或真核宿主 細胞。 本發明進一步包含一種製造本發明之雙特異性抗體的方 法，其特徵在於在原核或真核宿主細胞中表現本發明之核 酉文，及自該細胞或細胞培養物上清液中回收該雙特異性抗 體。本發明進一步包含藉由製造雙特異性抗體之此方法獲 得的抗體。 本發明之另-態樣為-種製備本發明之雙特異性抗體的 方法，其包含以下步驟： a)用包含編碼以下之核酸分子的載體轉型宿主細胞： 叫特異性結合第—抗原之第—全長抗體之重鏈及輕 鏈；及
輕 之 ab)特異性結合第二抗原之 鏈，其中重鏈之N端經 C端；及 第一全長抗體之重鏈及 由肽連接子連接至輕鏈 W在允許合成該抗體分子之條件下培養宿主細胞；及 c)自該培養物回收該抗體分子。 現已發現本發明之雙特異性抗體具有有價值之特徵諸 ^在如HEK293細胞及CH〇細胞之哺乳動物細胞中之良好 現量、穩疋性、生物或藥理學活 々带主予活性、樂物動力學特性。 其可例如用於治療諸如癌症 之疾病。包含3條多肽鏈之本 毛明之此等雙特異性抗體在 用孔動物細胞中表現期間尤其 154378.doc 201138821 具有有價值之副產物型態。 【實施方式】 在一個態樣中，本發明係關於包含以下之雙特異性抗 體： a) 特異性結合第一抗原之第一全長抗體之重鏈及輕 鏈； b) 特異性結合第二抗原之第二全長抗體之重鏈及輕 鏈，其中重鏈之N端經由肽連接子連接至輕鏈之C 端。 術語「全長抗體」表示由兩條「全長抗體重鏈」及兩條 「全長抗體輕鍵」組成之抗體（參看圖1)。「全長抗體重 鏈」為在N端至C端方向上由抗體重鏈可變域（VH)、抗體 恆定重鏈域1(CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定域 2(CH2)及抗體重鏈恆定域3(CH3)組成之多肽，縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;在子類IgE之抗體的情況下視情況存 在抗體重鏈恆定域4(CH4)。較佳地，「全長抗體重鏈」為 在N端至C端方向上由VH、CHI、HR、CH2及CH3組成之 多肽。「全長抗體輕鏈」為在N端至C端方向上由抗體輕 鏈可變域（VL)及抗體輕鏈恒定域（CL)組成之多肽，縮寫為 VL-CL 〇抗體輕鏈恆定域（CL)可為κ或λ。兩條全長抗體鏈 經由CL域與CH1域之間及全長抗體重鏈之鉸鏈i之間的多 肽間二硫鍵連接在一起。典型全長抗體之實例為天然抗 體，如 IgG(例如 IgGl 及 IgG2)、IgM、IgA、IgD及 IgE。本 發明之全長抗體可來自單一物種（例如人類），或其可為嵌 154378.doc -10- 201138821 合或人類化抗體。本發明之全長抗體包含各由一對^11與 VL形成之兩個抗原結合位點，其均特異性結合同一广 原。該全長抗體之重鏈或輕鏈之C端表示該重鏈或輕鍵之 C端的最後胺基酸。該全長抗體之重鏈或輕鏈端表示 該重鏈或輕鏈之N端的最後胺基酸。 如本發明中所用’術語「肽連接子」表示較佳源於合成 的具有胺基酸序列之肽。本發明之此等肽係用以經由肽連 接子將第二全長抗體（特異性結合第二抗原）的輕鏈之〇端 連接至重鏈之N端。第二全長抗體重鏈及輕鏈内之肽連接 子為具有長度為至少30個胺基酸、較佳長度為至少32至5〇 個胺基酸之胺基酸序列的肽。在一個實施例中，肽連接子 為具有長度為32至40個胺基酸之胺基酸序列的肽。在一個 實施例中，該連接子為（GxS)n，其中G=甘胺酸、S=絲胺 酸（x=3，n=8、9或 10且 m=0、1、2或 3)或（x=4且 n=6、7 或 8 且m=0、1、2或3)，較佳其中x=4，n=6或7且m=0、1、2或 3，更佳其中x=4、n=7且m=2。在一個實施例中，該連接 子為（G4S)eG2。本發明之雙特異性抗體的CH3域較佳可藉 由「杵入臼（knob-into-hole)」技術改變，該技術在例如以 下文獻中以若干實例詳述：WO 96/02701 1、Ridgway J.B. 等人，Protein Eng 9 (1996) 617-621 ;及 Merchant，A.Μ·等 人，Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681。在此方法中，改變 兩個CH3域之相互作用表面以增大含有此兩個CH3域之兩 條重鏈的雜二聚化。（兩條重鏈之）兩個CH3域各可為 「杵」，而另一者為「臼」。引入二硫橋穩定雜二聚體 154378.doc 11 201138821 (Merchant, A.Μ等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell, S.等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)且提高產 率。 在本發明之一個態樣中，本發明之雙特異性抗體的其他 特徵在於： 一條重鏈之CH3域及另一條重鏈之CH3域各在包含抗體 CH3域之間的原始界面之界面會合； 其中該界面經改變以促進形成雙特異性抗體，其中改變 之特徵在於： a) —條重鏈之CH3域經改變， 使得在雙特異性抗體内會合另一條重鏈之CH3之原始界 面的一條重鍵之CH3域之原始界面内’ 一胺基酸殘基經一具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置 換，藉此在一條重鏈之CH3域的界面内產生隆凸，其可位 於另一條重鏈之CH3域的界面内之空腔中 及 b) 另一條重鏈之CH3域經改變， 使得在雙特異性抗體内會合第一 CH3域之原始界面的第 二CH3域之原始界面内， 一胺基酸殘基經一具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置 換，藉此在第二CH3域之界面内產生空腔，第一 CH3域之 界面内之隆凸可位於該空腔中。 因此，本發明之抗體較佳特徵在於： a)之全長抗體之重鏈的CH3域與b)之全長抗體之重鏈 154378.doc -12- 201138821 的CH3域各在抗體CH3域之間的原始界面中包含改變的 界面會合； 其中i)在一條重鏈之CH3域中 一胺基酸殘基經一具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置 • 換，藉此在一條重鏈之CH3域的界面内產生隆凸，其可 - 位於另一條重鏈之CH3域的界面内之空腔中 且其中 ii)在另一條重鏈之CH3域中 ^ 一胺基酸殘基經一具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置 換，藉此在第二CH3域之界面内產生空腔，第一 CH3域 之界面内之隆凸可位於該空腔中。 具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基較佳選自由精胺酸 (R)、苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸（W)組成之群。 具有較小側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由丙胺酸 (A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)組成之群。 在本發明之一個態樣中，兩個CH3域藉由在各CH3域之 ❹ 相應位置引入半胱胺酸（C)胺基酸以使得兩個CH3域之間可 形成二硫橋來進一步改變。 ' 在一個實施例中，雙特異性抗體在「杵鏈（knobs chain)」之CH3域中包含T366W突變且在「臼鏈（hole chain)」之CH3域中包含T366S、L368A、Y407V突變。亦 可使用CH3域之間的其他鏈間二硫橋（Merchant, A_M等人, Nature Biotech 16 (1998) 677-681)，例如藉由將Y349C 突 變引入「杵鏈」之CH3域且將E356C突變或S354C突變引入 154378.doc -13- 201138821 「臼鏈」之CH3域。 在另一實施例中，本發明之雙特異性抗體在兩個CH3域 之一者中包含Y349C、T366W突變，在兩個CH3域之另一 者中包含E356C、T366S、L3 68A、Y407V突變。在另一較 佳實施例中，雙特異性抗體包含兩個CH3域之一者中之 Y349C、T366W突變及兩個CH3域之另一者中之S354C、 T366S、L368A、Y407V 突變（一個 CH3 域中之其他 Y349C 突變及另一 CH3域中之其他E356C或S354C突變形成鏈間二 硫橋）（始終根據Kabat之EU索引編號）。而且可或者或另外 使用如EP 1870459A1所述之其他杵入臼技術。因此’雙特 異性抗體之另一實例為「杵鏈」之CH3域中之R409D ; K370E突變，及「臼鏈」之CH3域中之D399K ; E357K突變 (始終根據Kabat之EU索引編號）。 在另一實施例中，雙特異性抗體包含「杵鏈」之CH3域 中之T366W突變，及「臼鏈」之CH3域中之T366S、 L368A、Y407V突變；及另外，「杵鏈」之CH3域中之 R409D ; K370E突變及「臼鏈」之CH3域中之D399K ; E357K突變。 在另一實施例中，雙特異性抗體包含兩個CH3域之一者 中之Y349C、T366W突變及兩個CH3域之另一者中之 S3 54C、T366S、L3 68A、Y407V突變，或該三價雙特異性 抗體包含兩個CH3域之一者中之Y349C、T366W突變’及 兩個 CH3 域之另一者中之 S354C、T366S、L368A、Y407V 突變，及另外，「杵鏈」之CH3域中之R409D ; K370E突 154378.doc -14- 201138821 變’及「臼鍵」之CH3域中之D399K ; E357K突變。 在一個實施例中，第二全長抗體（特異性結合第二抗原） 之重鏈及輕鏈的抗體重鏈可變域（VH)及抗體輕鏈可變域 (VL)藉由在以下位置之間引入二硫鍵來用二硫鍵穩定： i) 重鏈可變域位置44與輕鏈可變域位置1〇〇， 11)重鏈可變域位置1〇5與輕鏈可變域位置43，或 in)重鏈可變域位置1〇1與輕鏈可變域位置1〇〇(始終根據 Kabat之EU索引編號）。 〇 在一個實施例中，第二全長抗體（特異性結合第二抗原） 之重鏈及輕鏈的抗體重鏈可變域（VH)及抗體輕鏈可變域 (VL)藉由在以下位置之間引入二硫鍵來用二硫鍵穩定：重 鏈可變域位置44與輕鏈可變域位置1〇〇。 此進一步用二硫鍵穩定係藉由在第二全長抗體重鏈及輕 鏈之可變域VH與VL之間引入二硫鍵來達成。引入非天然 一硫橋以穩定單鏈Fv之技術描述於例如WO 94/029350, Q Rajag〇Pa1，V.等人，pr〇t. Engin. 10 (1997) 1453-59 ; bayashi, Η.專人，Nuclear Medicine & Biology,第 25卷， ()387 393，或 Schmidt, M.等人，Oncogene (1999) 1 8, 1711-1 721中。在一個實施例中，第二全長抗體重鏈及輕 鏈之可變域之間視情況存在的二硫鍵在重鏈可變域位置44 與輕鏈可變域位置1〇〇之間。在一個實施例中，可變域之 間視it況存在的二硫鍵在重鏈可變域位置1〇5與輕鏈可變 域位置43之間（始終根據Kabat之EU索引編號）。 在一個實施例中，在第二全長抗體重鏈及輕鏈之可變域 154378.doc 15 201138821 VH與VL之間具有該視情況存在之二硫鍵穩定的本發明之 雙特異性抗體為較佳。 在一個實施例中，在第二全長抗體重鏈及輕鏈之可變域 VH與VL之間不具有該視情況存在之二硫鍵穩定的本發明 之雙特異性抗體為較佳。 本發明之雙特異性抗體的兩個部分均包含抗原結合位點 (第一全長抗體重鏈及輕鏈包含一個抗原結合位點，且第 二全長抗體重鏈及輕鏈包含一個抗原結合位點）。如本文 所用，術語「結合位點」或「抗原結合位點」表示個別抗 原實際所結合的本發明之該雙特異性抗體之區。第一全長 抗體重鏈及輕鏈及第二全長抗體重鏈及輕鏈中之抗原結合 位點各由一對抗體輕鏈可變域（VL)與抗體重鏈可變域（VH) 形成。 結合所需抗原（例如EGFR)之抗原結合位點可源自a)針對 該抗原之已知抗體（例如抗EGFR抗體）或b)藉由尤其使用抗 原蛋白或核酸或其片段之重新免疫法（de novo immunization method)，或者藉由噬菌體呈現獲得之新抗體或抗體片 段。 本發明之抗體的抗原結合位點含有六個互補決定區 (CDR)，其以不同程度促成結合位點對抗原之親和力。存 在三個重鏈可變域CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及三個 輕鏈可變域CDR(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。CDR及構架 區（FR)之範圍係藉由與已根據序列間可變性界定彼等區的 已編譯胺基酸序列資料庫相比來確定。 154378.doc -16- 201138821 抗體特異性係指抗體對抗原之特定抗原決定基的選擇性 識別。天然抗體例如為單特異性抗體。如本文所用，術語 「雙特異性」抗體表示具有兩個或兩個以上抗原結合位點 且結合兩種不同抗原或同一抗原之兩個不同抗原決定基的 抗體。本發明之「雙特異性抗體」為具有兩種不同抗原結 合特異性之抗體。在一個實施例中，本發明之抗體對兩種 不同抗原（亦即VEGF作為第一抗原且ANG-2作為第二抗 原，或例如EGFR作為第一抗原且IGF-1R作為第二抗原， 或反之亦然）具有雙特異性。 如本文所用，術語「單特異性」抗體表示具有各結合同 一抗原之同一抗原決定基的一或多個結合位點之抗體。 如本申請案中所用，術語「價」表示抗體分子中‘存在規 定數目之結合位點。因此，術語「三價」、「四價」、 「五價」及「六價」分別表示在抗體分子中存在三個結合 位點、四個結合位點、五個結合位點及六個結合位點。例 如天然抗體或本發明之雙特異性抗體具有兩個結合位點且 為二價。 如本文所用，術語「EGFR」係指人類表皮生長因子受 體（亦稱為 HER-1 或 Erb-Bl，SEQ ID NO: 13)為由 c-erbB 原 癌基因編碼之1 70 kDa跨膜受體，且顯示内源性酪胺酸激 酶活性（Modjtahedi, H.等人，61".】.〇311。6犷 73 (1996) 228-235 ; Herbst，R.S.及81^11,0.]^.，〇311〇6犷 94 (2002) 1593-1611)。SwissProt資料庫條目P00533提供EGFR之序列。亦 存在EGFR之同功異型物及變異體（例如替代性RNA轉錄 154378.doc -17- 201138821 物、截短型式、多態現象等），包括（但不限於）由Swissprot 資料庫條目編號 P00533-1、P00533-2、P00533-3 及 P00533-4所鑑別者。已知EGFR結合配位體，包括表皮生長因子 (EGF)、轉型生長因子-a(TGf-a)、雙調蛋白、肝素結合 EGF(hb-EGF)、β細胞調節素及表皮調節素（Herbst，R.S.及 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611 ； Mendelsohn, J. 及 Baselga, J·，Oncogene 19 (2000) 6550-6565)。EGFR經由 酪胺酸-激酶介導之信號轉導路徑來調節眾多細胞過程， 包括（但不限於）活化控制細胞增殖、分化、細胞存活、細 胞凋亡、血管生成、致有絲分裂及轉移之信號轉導路徑 (Atalay, G.等人，Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363 ； Tsao, A.S.及 Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9 ; Herbst， R.S.及 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-161 1 ；
Modjtahedi, H.等人，Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235)。 如本文所用，術語「IGF-1R」係指人類類胰島素生長因 子I受體（IGF-IR、CD 221抗原；SEQ ID NO: 14)屬於跨膜 蛋白酷胺酸激酶家族（LeRoith, D.等人，Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163 ;及 Adams，Τ·Ε·等人，Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。SwissProt 資料庫條目 P08069 提供 IGF-1R之序列。IGF-IR以高親和力結合IGF-I且起始活體 内對此配位體之生理反應。IGF-IR亦結合IGF-II，然而親 和力略低。IGF-IR過度表現促進細胞之贅生性轉型，且有 證據表明IGF-IR涉及於細胞惡性轉型中，且IGF-IR因此為 開發用於治療癌症之治療劑的有用目標（Adams, T.E.等人， 154378.doc •18- 201138821
Cell. Mol. Life Sci_ 57 (2000) 1050-1063)。 在本發明之一較佳態樣中，本發明之雙特異性抗體特異 性結合人類IGF-1R以及人類EGFR(亦即本發明之雙特異性 抗體為雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體）。雙特異性抗體係 基於人類 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587 ; WO 2005/005 635，縮寫為 <IGF-1R> 純系 18 或 <IGF-1R>AK1 8) 及人類化 <EGFR>ICR62(WO 2006/082515 ，縮寫為 <EGFR>ICR62)之抗原結合位點。此等雙特異性二價抗體 之相關輕鏈及重鏈胺基酸序列如下：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 ' SEQ ID NO: 3(OA-Akl 8-scFab-GA201) ； SEQ ID NO: 5 ' SEQ ID NO: 6 ' SEQ ID NO: 7(OA-GA201-scFab-Akl8) ； SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4(OA-Akl8-scFab-GA201_WT)，及 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8(OA-GA201-scFab-Akl8_WT)。 本發明之雙特異性<EGFR-IGF-1R>抗體對於需要EGFR 及IGF-1R靶向療法之人類患者顯示益處。本發明之抗體具 有高度有償值之特性，其對於罹患此疾病，尤其罹患癌症 之患者產生益處。較之單特異性親本<IGF-1R>抗體，本發 明之雙特異性<EGFR-IGF-1R>抗體顯示例如IGF-1R受體之 内化減少。此外，其顯示良好乾向表現抗原EGFR與IGF-1R之腫瘤細胞，此為對罹患表現抗原EGFR與IGF-1R之癌 症的患者關於功效/毒性比的益處。 因此，在本發明之一個態樣中，本發明之雙特異性抗體 的特徵在於： 154378.doc -19- 201138821 a) 第一全長抗體特異性結合IGF-1R且包含具有SEQ ID NO: 1胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 2胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合EGFR且包含重鏈經由肽連 接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具有 SEQ ID NO: 3胺基酸序列。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合IGF-1R且包含具有SEQ ID NO: 1胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 2胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合EGFR且包含重鏈經由肽連 接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具有 SEQ ID NO: 4胺基酸序列。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具 有SEQ ID NO: 7胺基酸序列。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： 154378.doc -20- 201138821 a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具 有SEQ ID NO: 8胺基酸序列。 因此，在本發明之一個實施例中，雙特異性抗體為抗 IGF-1R/抗EGFR抗體且特徵在於包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3胺基酸序列。因此，本發明之一 個態樣為特異性結合人類IGF-1R及人類EGFR之雙特異性 抗體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及 SEQ ID NO: 3胺基酸序列。 因此，在本發明之一個實施例中，雙特異性抗體為抗 IGF-1R/抗EGFR抗體且特徵在於包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 4胺基酸序列。因此，本發明之一 個態樣為特異性結合人類IGF-1R及人類EGFR之雙特異性 抗體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及 SEQ ID NO: 4胺基酸序列。 因此，在本發明之一個實施例中，雙特異性抗體為抗 IGF-1R/抗EGFR抗體且特徵在於包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7胺基酸序列。因此，本發明之一 個態樣為特異性結合人類IGF-1R及人類EGFR之雙特異性 抗體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及 SEQ ID NO: 7胺基酸序列。 154378.doc •21 · 201138821 因此，在本發明之一個實施例中，雙特異性抗體為抗 IGF-1R/抗EGFR抗體且特徵在於包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 8胺基酸序列。因此，本發明之一 個態樣為特異性結合人類IGF-1R及人類EGFR之雙特異性 抗體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及 SEQ ID NO: 8胺基酸序列。 在本發明之一個實施例中，雙特異性抗體為抗IGF-1R/ 抗EGFR抗體且特徵在於 a) 包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 及 SEQ ID NO: 3 胺 基酸序列。 b) 包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及 SEQ ID NO: 4胺 基酸序列。 c) 包含 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6 及 SEQ ID NO: 7 胺 基酸序列，或 d) 包含 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6 及 SEQ ID NO: 8 胺 基酸序列。 在本發明之一個實施例中，該雙特異性抗體抗ZGF-IR/ 抗EGFR抗體之特徵在於具有一或多種以下特性（如在實例 4及5中所述之檢測中測定）： -抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞上IGF-1R 磷酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM或2 nM 以下）；
-雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞 上EGFR磷酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM 154378.doc •22- 201138821 或2 nM以下）； -較之抗 IGF-1R 抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587)，雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體使IGF-1R下調減小50%或50%以上。 在本發明之另一態樣甲，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 〇 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具 有在CDR中具有不超過1個胺基酸殘基取代的SEQ ID NO: 7胺基酸序列，且其中當與未突變之SEQ ID NO: 7胺基酸序列之結合親和力KD值相比時，結合親和力 KD值與其相等或較其減小至大於1/4。 ^ 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 〇 在於： a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具 有在CDR中具有不超過1個胺基酸殘基取代的SEQ ID NO: 8胺基酸序列，且其中當與未突變之SEQ ID NO: 154378.doc -23- 201138821 8胺基酸序列之結合親和力KD值相比時，結合親和力 KD值與其相等或較其減小至大於1/4。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具 有在CDR3H中具有不超過1個胺基酸殘基取代的SEQ ID NO: 7胺基酸序列，且其中當與未突變之SEQ ID NO: 7胺基酸序列之結合親和力KD值相比時，結合親 和力KD值與其相等或較其減小至大於1/4。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鍵具 有在CDR3H中具有不超過1個胺基酸殘基取代的SEQ ID NO: 8胺基酸序列，且其中當與未突變之SEQ ID NO: 8胺基酸序列之結合親和力KD值相比時，結合親 和力KD值與其相等或較其減小至大於1/4。 154378.doc -24- 201138821 在本發明之另一態樣中’本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈’及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，及
b) 第二全長抗體特異性結合1GF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具 有在CDR中具有不超過1個胺基酸殘基取代的SEQ ID 〇 NO: 7胺基酸序列，且其中當與未突變2SEQ ID N0: 7胺基酸序列之結合親和力KD值相比時’結合親和力 KD值與其相等或較其減小至大於1/4 ; 且具有一或多種以下特性（如在實例4及5中所述之檢測中 測定）： -抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞上IGF-1R 磷酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM或2 nM 以下） -雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞 上EGFR磷酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM 或2 nM以下） -較之抗 IGF-1R 抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587)，雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體使IGF-1R下調減小50%或50%以上。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： 154378.doc -25- 201138821 a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具有 在CDR中具有不超過1個胺基酸殘基取代的SEQ ID NO: 8胺基酸序列，且其中當與未突變之SEQ ID NO: 8胺基酸序列之結合親和力KD值相比時，結合親和力 KD值與其相等或較其減小至大於1/4 ; 且具有一或多種以下特性（如在實例4及5中所述之檢測中 測定）： -抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞上IGF-1R 磷酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM或2 nM 以下） -雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞 上EGFR磷酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM 或2 nM以下） -較之抗 IGF-1R 抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587)，雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體使IGF-1R下調減小50%或50%以上。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a)第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 154378.doc -26- 201138821 酸序列的輕鏈，及 b)第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具 有在CDR3H中具有不超過1個胺基酸殘基取代的SEQ ID NO: 7胺基酸序列，且其中當與未突變之SEQ ID NO: 7胺基酸序列之結合親和力KD值相比時，結合親 和力KD值與其相等或較其減小至大於1/4 ; 且具有一或多種以下特性（如在實例4及5中所述之檢測中 測定）： 抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞上IGF-1R 磷酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM或2 nM 以下） -雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞 上EGFR填酸化之IC50為5nM或5nM以下（較佳為2nM 或2 nM以下） -較之抗 IGF-1R 抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587)，雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體使IGF-1R下 調減小50%或50%以上。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a) 第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 154378.doc -27- 201138821 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具 有在CDR3H中具有不超過1個胺基酸殘基取代的SEQ ID NO: 8胺基酸序列，且其中當與未突變之SEQ ID NO: 8胺基酸序列之結合親和力KD值相比時，結合親 和力KD值與其相等或較其減小至大於1 /4 ; 且具有一或多種以下特性（如在實例4及5中所述之檢測中 測定）： -抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞上IGF-1R磷 酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM或2 nM以下） -雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體抑制H322M腫瘤細胞上 EGFR磷酸化之IC50為5 nM或5 nM以下（較佳為2 nM或2 nM以下） -較之抗 IGF-1R 抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587)，雙特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗體使IGF-1R下調 減小50%或50%以上。 例如在 EP10166860.6 中描述 SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO: 8之CDR3H中胺基酸殘基取代的實例，其中當與未突變胺 基酸序列之結合親和力KD值相比時，結合親和力KD值與 其相等或較其減小至大於1/4。 如本文所用，術語「VEGF」係指人類血管内皮生長因 子（VEGF/VEGF-A)(SEQ ID No: 15)，其例如描述於Leung, D.W.等人，Science 246 (1989) 1306-9; Keck, P.J.等人， Science 246 (1989) 1309-12 及 Connolly，D.T.等人，J. Biol. Chem. 264 (1989) 2001 7-24中。VEGF涉及於調節正常及異 154378.doc ·28· 201138821 常血管生成與腫瘤及眼内病症相關之新血管生成中 (Ferrara，N.等人，Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25 ; Berkman， R.A.等人，J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159 ; Brown，L.F· 等人，Human Pathol· 26 (1995) 86-91 ; Brown, L.F.等人， Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735 ; Mattern，J.等人，Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934 ;及 Dvorak，H.等人，入111.】· Pathol. 146 (1995) 1029-1039)。VEGF為自若干來源分離 之均二聚醣蛋白。VEGF對内皮細胞顯示高度特異性細胞 分裂活性。 如本文所用，術語「ANG-2」係指人類血管生成素-2 (ANG-2)(或者縮寫為 ANGPT2 或 ANG2)(SEQ ID Nck 16)， 其描述於 Maisonpierre，P.C.等人，Science 277 (1997) 55-60 及 Cheung，A.Η·等人，Genomics 48 (1998) 389-91 中。發現 血管生成素-1及血管生成素-2及ANG-2為在血管内皮内選 擇性表現之酷胺酸激酶家族Tie之配位體。Yancopoulos， G.D.等人，Nature 407 (2000) 242-48。血管生成素家族現 存在四個確定成員。血管生成素-3及血管生成素-4(Ang-3 及Ang-4)可代表小鼠及人類中同一基因座之大不相同的對 應物。Kim，I.等人，FEBS Let，443 (1999) 353-56 ; Kim，I· 等人，J Biol Chem 274 (1999) 26523-28。ANG-1 及 ANG-2 最初在組織培養實驗中分別鑑別為促效劑及拮抗劑（關於 ANG-1 參看：Davis，S.等人，Cell 87 (1996) 1 161-69 ;且關 於 ANG-2 參看：Maisonpierre, P.C.等人，Science 277 (1997) 55-60)。所有已知血管生成素均主要結合Tie2，且 154378.doc -29- 201138821
Ang-l與Ang-2結合Tie2之親和力均為3 nM(Kd)。 Maisonpierre, P.C·等人，Science 277 (1997) 55-60。 在一較佳實施例中’本發明之雙特異性抗體特異性結合 人類VEGF以及人類ANG-2(亦即本發明之雙特異性抗體為 雙特異性抗-VEGF/抗ANG-2抗體）。雙特異性抗體較佳基 於抗- VEGF抗體貝伐單抗（bevacizumab)及ANG2i-LC06(其 描述於\^〇 2010/040508(?(：1'申請案第？(：1：/丑？2009/007182 號）中且經由噬菌體呈現獲得）之抗原結合位點。此等雙特 異性二價抗體之相關輕鏈及重鏈胺基酸序列如下：SEQ ID NO: 9 ' SEQ ID NO: 10 ' SEQ ID NO: ll(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS) ’ 及 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06) ° 因此，在本發明之一個態樣中，本發明之雙特異性抗體 的特徵在於： a) 第一全長抗體特異性結合VEGF且包含具有SEQ ID NO: 9胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 10胺基 酸序列的輕鏈，及 b) 第二全長抗體特異性結合ANG·2且包含重鏈經由肽連 接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具有 SEQ ID NO: 11胺基酸序列。 在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性抗體的特徵 在於： a)第一全長抗體特異性結合VEGF且包含具有SEQ ID NO: 9胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 10胺基 154378.doc -30- 201138821 酸序列的輕鏈，及 b)第二全長抗體特異性結合ANG-2且包含重鏈經由肽連 接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具有 SEQ ID NO: 12胺基酸序列。 因此，在本發明之一個實施例中，雙特異性抗體為抗 VEGF/抗ANG-2抗體且特徵在於包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11胺基酸序列。 因此，在本發明之一個實施例中，雙特異性抗體為抗 VEGF/抗ANG-2抗體且特徵在於包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 12胺基酸序列。 本發明之全長抗體包含一或多個免疫球蛋白類別之免疫 球蛋白恒定區。免疫球蛋白類別包括IgG、IgM、IgA、 IgD及IgE同型且在IgG及IgA之情況下包括其亞型。在一較 佳實施例中，本發明之全長抗體具有IgG型抗體之恆定域 結構。 如本文所用，術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」 係指具有單一胺基酸組成之抗體分子製劑。 術語「嵌合抗體」係指包含來自一個來源或物種之可變 區（亦即結合區）及至少一部分源自不同來源或物種之恆定 區的抗體，其通常藉由重組DNA技術製備。包含鼠類可變 區及人類恆定區之嵌合抗體為較佳。本發明涵蓋之「嵌合 抗體」的其他較佳形式為恆定區與原始抗體之恆定區相比 已經修飾或改變以產生本發明之特性（尤其關於C1 q結合及/ 或Fc受體（FcR)結合之特性）的形式。此等嵌合抗體亦稱作 154378.doc -31 · 201138821 「類別轉換抗體」。嵌合抗體為包含編碼免疫球蛋白可變 區之DNA區段及編碼免疫球蛋白恒定區之dnA區段的經表 現免疫球蛋白基因之產物。製造嵌合抗體之方法包括此項 技術中熟知之習知重組DNA及基因轉染技術。參看例如
Morrison，S.L.等人，Pr〇c. Natl· Acad. Sci· USA 81 (1984) 6851-6855 ; US 5,202,238及 US 5,204,244。 術語「人類化抗體」係指構架或「互補決定區」（CDr) 已經修飾以包含與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性之 免疫球蛋白之CDR的抗體。在一較佳實施例中，將鼠類 CDR移植於人類抗體之構架區中以製備「人類化抗體」。 參看例如 Riechmann，L·等人，Nature 332 (1988) 323-327 ; 及 Neuberger，M.S.等人，Nature 314 (1985) 268-270。尤其 較佳之CDR對應於代表識別上文對於嵌合抗體所述之抗原 的序列之CDR。本發明涵蓋之r人類化抗體」的其他較佳 形式為怪定區與原始抗體之恆定區相比已經另外修飾或改 變以產生本發明之特性（尤其關於Ciq結合及/或！^受體 (FcR)結合之特性）的形式。 如本文中所用’術語「人類抗體」意欲包括具有源自人 類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。目前 技術中熟知人類抗體（van Dijk, M.A.及van de Winkel，J.G.,
Curr· 〇pm_ Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。人類抗體亦可 在能夠在免疫後產生完整譜系或選定譜系範圍之人類抗體 而不產生内源性免疫球蛋白之轉殖基因動物（例如小鼠）中 產生。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等生殖 154378.doc •32- 201138821 系突變型小鼠中將使得在抗原攻毒後產生人類抗體（參看 例如 Jakobovits, A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555 ; Jakobovits，A.等人，Nature 362 (1993) 255-258 ; Bruggemann，M.等人，Year Immunol· 7 (1993) 33-40)。人類抗體亦可在嗤菌體呈現文庫中產生（Hoogenboom, H.R.及 Winter, G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ; Marks，J.D.等人，J. Mol. Biol· 222 (1991) 581-597)。Cole 等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體 (Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,第 77頁（1985);及Boerner，P.等人，J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。如已針對本發明之嵌合及人類化抗體 所提及，如本文所用之術語「人類抗體」亦包含在恆定區 中例如藉由「類別轉換」（亦即Fc部分改變或突變（例如自 IgGl至IgG4及/或IgGl/IgG4突變））而修飾以產生本發明特 性，尤其關於Clq結合及/或FcR結合之特性的抗體。 如本文所用，術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組 方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如自諸 如NS0或CHO細胞之宿主細胞或自轉殖有人類免疫球蛋白 基因之動物（例如小鼠）分離之抗體，或使用轉染至宿主細 胞中之重組表現載體表現之抗體。此等重組人類抗體具有 重排形式之可變區及恆定區。本發明之重組人類抗體已經 歷活體内體細胞超突變。因此，重組抗體之VH及VL區之 胺基酸序列為儘管自人類生殖系VH及VL序列產生且與其 有關，但可能不天然存在於活體内人類抗體生殖系譜中的 154378.doc -33- 201138821 序列。 可變域」（輕鍵可變域（VL)、重鏈可變 區（H))表示直接涉及於抗體與抗原結合之各對輕鏈及重 鍵。可變人類輕鏈及重鏈之結構域具有相同通用結構且各 域包3由二個「高變區」（或互補決定區，CDR)連接且序 列廣泛保守之四個構架(間區。構架區採用β片構形且 CDR可形成連接β片結構之環。各鏈中之由構架區保 持其三維結構’且與來自另—條鏈之CDR—起形成抗原結 合位點。抗體重鏈及輕鏈CDR3區在本發明之抗體的結合 特異性/親和力中起到尤其重要的作用且因此提供本發明 之另一目標。 術語「高變區」或「抗體之抗原結合部分」在本文中使 用時係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區包含 「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「構架」或 「FR」區為除如本文所定義之高變區殘基外之彼等可變域 區。因此’抗體之輕鏈及重鏈自N端至C端包含域FR1、
CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。各鏈上之 CDR 由此等構架胺基酸隔開。特定言之，重鏈之CDR3為對抗 原結合起最大作用之區。根據Kabat等人，Sequences 〇f
Proteins of Immun〇i〇gical interest，第 5版，public Health
Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 之標準定義來確定CDR及FR區。 如本文所用，術語「結合」或「特異性結合」係指在使 用純化野生型抗原之活體外檢測中，較佳在電漿子共振檢 154378.doc • 34· 201138821 測（BIAcore，GE-Healthcare Uppsala,瑞典）中，抗體與抗 原之抗原決定基的結合。結合親和力係由術語ka(抗體/抗 原複合物之抗體締合的速率常數）、kD(解離常數）及 KD(kD/ka)定義。在一個實施例中，結合或特異性結合意謂 結合親和力（KD)為1〇8 或1〇-8 m〇i/i以下，較佳ι〇·9 Μ 至l〇w mol/ι。因此，本發明之雙特異性抗體較佳以1〇_8 mol/1或ΙΟ.8 mol/1以下，較佳1〇-9 Μμ〇.13之結合親 和力（KD)特異性結合其具有特異性之各抗原。 抗體與FcyRIII之結合可藉由BIAc〇re檢測
Uppsala，瑞典）來研究。締合親和力係由術語(抗體/抗原 複σ物之抗體締合的速率常數）、k〇(解離常數）及KD(kD/ka) 定義。 術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合抗體之任何多 肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子 之化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺 醯基，且在某些實施例中，其可具有特定三維結構特徵及 或特定電荷特徵。抗原決定基為抗體所結合的抗原區。 在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或大分子之複雜 此合物中優先識別其目標抗原時，該抗體稱為特異性結合 抗原。 本申叫案中所用之術語「恆定區」表示除可變區外之抗 體域的、”悤和。怪定區不直接涉及於抗原結合中，但顯示多 種效應功能。視其重鏈恆定區之胺基酸序列而定，抗體分 為以下類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干種 154378.doc -35- 201138821 可進一步分為諸如IgGl、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及
IgA2之子類。對應於不同類別抗體之重鏈恆定區分別稱作 α、δ、ε、γ及μ ^可見於所有五個抗體類別中之輕鏈恆定 區（CL)稱作κ及λ。 如本申請案中所用，術語「源自人類來源之恆定區」表 示子類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4之人類抗體之恆定重鏈區 及/或怪定輕鏈κ或λ區。此等怪定區在目前技術中熟知且 例如由Kabat，Ε.Α.(參看例如Johnson，〇及Wu Τ Τ
Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ; Kabat E A 等人
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788)描述。 術語「補體依賴性細胞毒性（CDC)」表示由補體因子 Clq與大多數IgG抗體子類之Fc部分結合起始的過程。C1q 與抗體結合係由在所謂結合位點之規定蛋白質_蛋白胃才目 互作用引起。目前技術中已知此等Fc部分結合位點（參看 上文）。此專F c部分結合位點之特徵在於例如胺基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 及 P3 29(根據Kabat之EU索引編號）。IgGl、IgG2及lgG3子類 之抗體通常顯示補體活化作用，包括Clq及C3結合，而 IgG4不活化補體系統且不結合Clq及/或C3。 儘管IgG4子類抗體顯示Fc受體（FcyRIIIa)結合減小，但 其他IgG子類抗體顯示強結合。然而，Pro238、Asp265、 Asp270、Asn297(失去Fc碳水化合物）、Pro329、Leu234、 Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、 Thr3 07、Gln31 1、Asn434及His435為若改變貝丨J提供亦減小 154378.doc -36- 201138821 之Fc受體結合的殘基（Shields, R丄·等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Lund, J.等人，FASEB J. 9 (1995) 1 15-119 ; Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ; EP 0 307 434) ° 在一個實施例中，本發明之抗體與IgGl抗體相比FcR結 合減小，且全長親本抗體係關於在S228、L234、L235及/ 或D265中具有突變及/或含有PVA236突變之IgG4子類或 IgGl或IgG2子類之FcR結合。在一個實施例中，全長親本 抗體之突變為S228P、L234A、L235A、L235E及/或 PVA236。在另一實施例中，全長親本抗體之突變在IgG4 S228P 及 L235E 中，以及在 IgGlL234A 及 L235A 中。 在另一實施例中，本發明之雙特異性抗體的特徵在於該 全長抗體為人類IgGl子類。 術語「抗體依賴性細胞毒性（ADCC)」係指在效應細胞 存在下由本發明抗體溶解人類目標細胞。較佳如下量測 ADCC :在諸如自白血球層新鮮分離之PBMC或純化效應 細胞的效應細胞（如單核細胞或自然殺手（NK)細胞或永久 生長之NK細胞株）存在下用本發明之抗體處理EGFR及IGF-1R表現細胞之製劑。 術語「補體依賴性細胞毒性（CDC)」表示由補體因子 Clq與大多數IgG抗體子類之Fc部分結合起始的過程。Clq 與抗體結合係由在所謂結合位點之規定蛋白質-蛋白質相 互作用引起。目前技術中已知此等Fc部分結合位點（參看 酸 基 胺 如 例 於 在 徵 特 之 ¾ 3·· 位 合 結 分 部 C F 等 此 〇 文 上 154378.doc -37- 201138821 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 及 P329(根據Kabat之EU索引編號）。IgGl、IgG2及IgG3子類 之抗體通常顯示補體活化作用，包括Clq及C3結合，而 IgG4不活化補體系統且不結合Clq及/或C3。 抗體恆定區直接涉及於ADCC(抗體依賴性細胞介導之細 胞毒性）及CDC(補體依賴性細胞毒性）中。補體活化（CDC) 由補體因子Clq與大多數IgG抗體子類之恆定區結合來起 始。Clq與抗體結合係由在所謂結合位點之規定蛋白質-蛋 白質相互作用引起。此等恆定區結合位點在目前技術中已 知且例如由以下描述：Lukas，T.J·等人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ; Brunhouse，R.及 Cebra，J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ; Burton, D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen，J.E.等人，Mol· Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie，E.E.等人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M.等人，J. Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;及EP 0 3 07 434。此等恆定區結合位點之特徵在 於例如胺基酸L234、L23 5、D270、N297、E3 18、K3 20、 K322、P331及P329(根據Kabat之EU索引編號）。 在一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包含IgGl或 IgG3子類（較佳為IgGl子類）之恆定區，其較佳源自人類來 源。在一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包含IgGl或 IgG3子類（較佳為IgGl子類）之Fc部分’其較佳源自人類來 源。 154378.doc •38- 201138821 單株抗體之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)可 藉由如 Umana，P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及US 6,602,684中所述工程改造其寡醣組分來增強。最 常用之治療抗體IgGl型抗體為在各CH2域之Asn297具有保 • 守N-連接糖基化位點之醣蛋白。連接至Asn297之兩個複合 . 雙觸寡醣埋在CH2域之間，從而與多肽主鏈形成廣泛接 觸，且其存在對抗體介導諸如抗體依賴性細胞毒性（ADCC) 之效應功能為必需的（Lifely，M.R.等人，Glycobiology 5 ❸ （1995) 813_822 ; Jefferis，R.等人，Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76 ; Wright, A.及Morrison，S.L.，Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。Umana, P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及WO 99/154342顯示催化形成對分募醣之 糖基轉移酶β(1，4)-Ν-乙醯基葡糖胺基轉移酶III (「GnTIII」）在中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中之過度表現顯 著提高抗體之活體外ADCC活性。Asn297碳水化合物之組 成變化或其消除亦影響與FcyR及Clq之結合（Umana，P.等 〇 人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ; Davies，J.等人， Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294 ; Mimura, Υ·等人， J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547 ; Radaev，S·等人，J. Biol· Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L.等人， J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Shields，R.L.等人， J. Biol. Chem· 277 (2002) 26733-26740 ; Simmons, L.C.等 人，J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147) o 藉由減少海藻糖之量來增強單株抗體之細胞介導之效應 154378.doc -39- 201138821 功能的方法描述於例如WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700 ' WO 2004/065540 ' WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894 ' WO 2003/035835、WO 2000/061739、Niwa，R.等人，J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 ; Shinkawa, T.等人， J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473 ; WO 03/055993 或 US 2005/0249722 t 。 當核心海藻糖基化雙觸複合寡醣糖基化以至多兩個Gal 殘基終止時，在Asn297發生人類IgGl或IgG3糖基化。IgGl 或IgG3子類之人類恆定重鏈區由以下詳細報導：Kabat， Ε·Α.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health， Bethesda, MD. (1991)，及 Briiggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ; Love, T.W.等人，Methods Enzymol. 178 (1989) 5 15-527。視末端 Gal殘基之量而定， 此等結構指定為GO、Gl(a-1,6-或α-1，3-)或G2聚糖殘基 (Raju，T.S·，Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53)。抗體 Fc 部分 之 CHO型糖基化例如由 Routier，F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207描述。於非糖基修飾之CHO宿主細胞中重 組表現的抗體通常以至少85°/。之量在Asn297海藻糖基化。 全長親本抗體之經修飾寡醣可為雜合物或複合物。對分、 還原/未海藻糖基化之寡醣較佳為雜合物。在另一實施例 中，對分、還原/未海藻糖基化之寡醣較佳為複合物。 154378.doc -40- 201138821 根據本發明，「海藻糖之量」意謂在Asn297處之糖鏈内 該糖相對於連接至Asn297之所有糖結構（例如複合物、雜 合物及高甘露糖結構）之和的量，其藉由MALDI-T0F質譜 分析量測且計算為平均值。海藻糖相對量為依據MALDI-TOF(參看實例1 〇)，含海藻糖之結構相對於N-醣苷酶F處理 之樣本中鑑別之所有糖結構（例如分別為複合物、雜合物 及寡甘露糖及高甘露糖結構）的百分比。 與親本<EGFR>&/或<IGF-1R>抗體相比，本發明之雙特 〇 異性<EGFR-IGF-1R>抗體顯示EGFR及IGF-1R受體内化減 小。因此，在本發明之一個較佳實施例中’雙特異性 <EGFR-IGF-1R>抗體在Asn297經糖鏈糖基化（IgGl或IgG3 子類，較佳為IgGl子類），其中該糖鏈内海藻糖之量為65% 或65%以下（根據Kabat編號）。在另一實施例中，該糖鏈内 海藻糖之量在5%與65%之間，較佳在20%與40%之間。本 發明之「Asn297」意謂位於Fc區中約位置297處之胺基酸 _ 天冬醯胺。基於抗體之微小序列變化，Asn297亦可位於位 〇 置297上游或下游之若干胺基酸（通常不超過±3個胺基酸） 處，亦即在位置294與300之間。此等糖基工程改造之抗體 在本文中亦稱作非海藻糖基化抗體。
本發明之非海藻糖基化雙特異性抗體可於經糖基修飾之 宿主細胞中表現，該經糖基修飾之宿主細胞經工程改造成 以足以部分海藻糖基化Fc區中之寡醣的量來表現至少一種 編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸。在一個實施例中，具 有GnTIII活性之多肽為融合多肽。或者，可根據US 154378.doc -41 · 201138821 6,946,292來降低或消除宿主細胞之al，6-海藻糖基轉移酶 活性以產生經糖基修飾之宿主細胞。抗體海藻糖基化之量 可例如由醱酵條件（例如醱酵時間）或藉由至少兩種具有不 同海藻糖基化量之抗體之組合來預先確定。此等非海藻糖 基化抗體及各別糖基工程改造方法描述於WO 2005/044859、 WO 2004/065540、WO 2007/031875、Umana，Ρ.等人， Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、WO 99/154342、 WO 2005/018572、WO 2006/1 16260、WO 2006/1 14700、 WO 2005/01 1735、WO 2005/027966、WO 97/028267、US Γ 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894 ' WO 2003/035835、WO 2000/061739中。此等糖基工程改造之 抗體之ADCC增加。得到本發明之非海藻糖基化抗體的其 他糖基工程改造方法描述於例如Niwa，R.等人，J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 ; Shinkawa, Τ·等人，J Biol
Chem，278 (2003) 3466-3473 ; WO 03/055993 或 US 一------- 2005/0249722t ° 一個實施例為使用以下所述之程序製備IgGl或IgG3子類 之雙特異性抗體的方法，該雙特異性抗體在Asn297經糖鏈 糖基化，其中該糖鏈内海藻糖之量為65%或65%以下：WO 2005/044859、WO 2004/065540、WO 2007/031875、 Umana，P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、
WO 99/154342、WO 2005/018572、WO 2006/1 16260、WO 2006/1 14700、WO 2005/01 1735、WO 2005/027966、WO 97/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 154378.doc -42- 201138821 2005/0152894、WO 2003/035835 或 WO 2000/061739。 一個實施例為使用以下所述之程序製備IgGl或IgG3子類 之雙特異性抗體的方法，該雙特異性抗體在Asn297經糖鏈 糖基化，其中該糖鏈内海藻糖之量為65%或65%以下：
Niwa, R.等人，J. Immunol· Methods 306 (2005) 151-160 ；
Shinkawa, T.等人，J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473 ； WO 03/055993 或 US 2005/0249722 ° 本發明之抗體係藉由重組方式製得。因此，本發明之一 〇 個態樣為編碼本發明之抗體的核酸且另一態樣為包含編碼 本發明之抗體之該核酸的細胞。重組製造法在目前技術中 廣泛已知且包含在原核及真核細胞中表現蛋白質，隨後分 離抗體且通常純化至醫藥學上可接受之純度。為在宿主細 胞中表現上述抗體’藉由標準方法將編碼各別經修飾輕鏈 及重鏈之核酸插入表現載體中。在適當原核或真核宿主細 胞（如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、 COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌（E.coli)細胞）中 〇 ^ 進行表現，自細胞（上清液或溶解後之細胞）中回收抗 體。重組製造抗體之通用方法在目前技術中熟知且描述於 例如以下之評論文章中：Makrides，S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ; Geisse，S.等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ; Kaufman，R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ； Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 。 本發明之雙·特異性抗體係藉由習知免疫球蛋白純化程 154378.doc -43 - 201138821 序’諸如蛋白質A-瓊脂糖、經填灰石層析、凝膠電泳、透 析或親和層析與培養基適當分離。使用習知程序容易分離 及定序編碼皁株抗體之DNA及RNA。融合瘤細胞可充當此 DNA及RNA之來源^ DNA—經分離即可插入表現載體中， 接著轉染至不以其他方式產生免疫球蛋白蛋白質之宿主細 胞（諸如HEK293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞）中以便在宿 主細胞中合成重組單株抗體。 雙特異性抗體之胺基酸序列變異體（或突變體）係藉由將 適當核苷酸變化引入抗體DNA中或藉由核苷酸合成來製 備。然而此等修飾僅可在極有限範圍中進行。舉例而言， 該等修飾不改變上述抗體特徵，諸如IgG同型及抗原結 合，而且可改良重組製造產率、蛋白質穩定性或有助於純 化。 如本申請案中所用，術語「宿主細胞」表示可經工程改 造以產生本發明抗體之任何種類細胞系統。在一個實施例 中，HEK293細胞及CHO細胞用作宿主細胞。 如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養 物」可互換使用且所有此等名稱均包括子代。因此，措詞 「轉型體」及「經轉型細胞」包括原代標的細胞及由此得 到之培養物，與轉移次數無關。亦應瞭解所有子代可能由 於有意或無意突變而在DNA含量方面不精確一致。包括具 有與在最初轉型之細胞中所篩選相同之功能或生物活性的 變異子代。當意指不同名稱時，根據上下文將顯而易見。 例如 Barnes，L.M·等人，Cyt〇techn〇1〇gy 32 (2〇〇〇) ι〇9_ 154378.doc -44 * 201138821 123 ; Barnes，L_M.等人，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270描述在NSO細胞中之表現。例如Durocher，Y_等人， Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9描述短暫表現。Orlandi，R. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter, P.等人，Proc. Nath Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ；及 Norderhaug, L.等人，J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87描述可變域選殖。Schlaeger，E.-J.及Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83&Schlaeger，E.-J.，J· Immunol. Methods 194 (1996) 191-199描述較佳短暫表現系 統（HEK 293)。 適用於原核細胞之控制序列例如包括啟動子、視情況選 用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動 子、強化子及聚腺苷酸化信號。 當使核酸與另一核酸序列成功能關係時，其經「可操作 地連接」。舉例而言，若前序列或分泌性前導序列之DNA 表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其可操作地連接於該多 肽之DNA ;若啟動子或強化子影響序列轉錄，則其可操作 地連接於該編碼序列；或若核糖體結合位點經定位以便有 助於轉譯，則其可操作地連接於編碼序列。一般而言， 「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列為相鄰的，且在 分泌性前導序列之情況下相鄰且在閱讀框架中。然而，強 化子不必相鄰。連接係藉由在適宜限制性位點接合來實 現。若此等位點不存在，則根據習知規範使用合成寡核苷 酸接附子或連接子。 154378.doc • 45· 201138821 藉由標準技術（包括鹼性/SDS處理、CsCl分帶（CsCl banding)、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知 之其他技術）進行抗體純化以消除細胞組分或其他污染物 (例如其他細胞核酸或蛋白質）。參看Ausubel，F.等人編. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience，New York (1987)。不同方法已充 分確立且廣泛用於蛋白質純化，諸如微生物蛋白質之親和 層析（例如蛋白質A或蛋白質G親和層析）、離子交換層析 (例如陽離子交換（羧甲基樹脂）、陰離子交換（胺基乙基樹 脂）及混合模式交換）、喜硫吸附（例如用^巯基乙醇及其他 SH配位體）、疏水相互作用或芳族吸附層析（例如用苯基_ 瓊月日糖、氮雜-親砂性樹脂（aza_aren〇phiiic resin)或間胺基 苯基關酸）、金屬螯合劑親和層析（例如用Ni(n)_及Cu(n)_ 親和力材料）、尺寸排阻層析法，及電泳法（諸如凝膠電 泳、毛細電泳）(VijayalakShmi，M.A. Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。 如本文中所用，術語「轉型」係指將載體/核酸轉移至 宿主細胞中之過程。若將無強大細胞壁障壁之細胞用作宿 主細胞’則例如藉由Graham，F.L.及varl der Eb，a.j.， Virology 52 (1973) 456及其後内容所述之磷酸鈣沈澱法進 饤轉染。然而，亦可使用諸如藉由核注射或藉由原生質體 融合將DNA引入細胞中之其他方法。若使用原核細胞或含 有實質細胞壁構造之細胞，則例如一種轉染方法為如 Cohen, F.N等人，PNAS. 69 (1972) 71 10及其後内容所述之 154378.doc -46 - 201138821 使用氯化約進行妈處理。 如本文中所用，「表現」係指將核酸轉錄成mRNA之過 程及/或隨後將經轉錄之mRNA(亦稱作轉錄物）轉譯成肽、 多肽或蛋白質之過程。轉錄物及經編碼多肽統稱基因產 物。若聚核苷酸源自基因組DNA，則在真核細胞中表現可 包括mRNA拼接。 「載體」為將所插入之核酸分子轉移至宿主細胞中及/ 或宿主細胞之間的核酸分子，尤其為自我複製型核酸分 子。該術語包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中（例如 染色體整合）之載體、複製主要用於複製DNA或RNA之載 體，及用於轉錄及/或轉譯DNA或RNA之表現載體。亦包 括提供一種以上所述功能之載體。 「表現載體」為在引入適當宿主細胞中時可轉錄及轉譯 為多肽的聚核苷酸。「表現系統」通常係指包含可用以產 生所要表現產物之表現載體的適合宿主細胞。 現已發現本發明之雙特異性抗體具有有價值之特徵，諸 如°甫乳動物細胞中之良好表現量、穩定性、生物或藥理學 活性、藥物動力學特性或毒性。其可例如用於治療諸如癌 症之疾病。本發明之抗體，尤其雙特異性<IGF-1R-EGFR> 抗體顯示高度有價值之特性，如抑制表現IGF-1R與EGFR 兩種受體之癌細胞的生長，及對罹患癌症之患者產生益處 的抗腫瘤功效。在表現IGF-1R與EGFR兩種受體之癌細胞 上，當與其親本單特異性<IGF-1R>及<£0?11>抗體相比 時，本發明之雙特異性<IGF-1R-EGFR>^；L體顯示IGF-1R與 154378.doc -47- 201138821 EGFR兩種受體之内化均減小。 本發明之一個態樣為包含本發明之抗體的醫藥組合物。 本發明之另一態樣為本發明之抗體用於製造醫藥組合物之 用，β本發明之另一態樣為一種製造包含本發明之抗體之 醫藥組合物的方法。在另_態樣中’本發明提供—種組合 物例如醫藥組合物，其含有本發明之抗體，連同醫藥載 劑一起調配。 本發明之一個實施例為用於治療録的本發明之雙特里 性抗體。 ~ 本發明之另一 本發明之另一 用之藥物的用途 態樣為用於治療癌症之該醫藥組合物。 態樣為本發明之抗體用於製造供治療癌症 二發I::'態樣為藉由對需要此治療之患者投與本發 杬體來治療惟患癌症之患者的方法。 如本文所用，「醫藥載劑」包括生理學上相容之任何及 所有溶劑、分散介曾、t把 質衣枓、杬細菌劑及抗真菌劑、等張 及吸收延遲劑及其類似物。載劑較佳適於靜脈内、肌肉 ^、。皮W脊椎或表皮吻W注射或輸 …，組合物可藉由在此項技術中已知之各種方法名 /、如熟習此項技術者將瞭解，投筚途 ' 所需結果而變。為藉…投藥途；或模式將朝 物，可能'必需將化合物塗以發日月之化合 物與其共投與。舉 Θ或將該化合 化口物可在適當載劑（例如脂 154378.doc -48- 201138821 質體或稀釋劑）中投與個體。醫藥風 诸樂予上可接受之稀釋劑包 括生理食鹽水及緩衝水溶液。醫遂截愈丨^ 收醫樂載劑包括滅菌水性溶液 或分散液及用於臨時製備滅菌可、、*如 减圉可/主射溶液或分散液之滅菌 粉末。在此項技術中已知此箄介暂好叫… 寻彡丨貝及试劑用於醫藥學活性 物質的用途。 μ 如本文所用’片語「非經腸将蘊 立 非、&腸技樂」忍謂不同於經腸及局 部投藥通常藉由注射進行之投藥媪★ _._ 仅樂模式，且包括（但不限於） 靜脈内、肌肉内、動脈内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、 皮内、腹膜内、經氣管、皮下、角質下、關節内、囊下、 蛛網膜下、脊椎内、硬膜外及胸骨内注射及輸注。 如本文所用，術語癌症係指增生性疾病，諸如淋巴瘤、 淋巴細胞白血症、肺癌、非小細胞肺（1^8(：：1〇癌、細支氣管 肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或 眼内黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃 癌（stomach cancer)、胃癌（gastric cancer)、結腸癌、乳 。癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、陰道 癌、外陰癌、霍奇金病（Hodgkin's Disease)、食道癌、小 腸癌、内分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺 癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、 腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞 癌、膽管癌、中枢神經系統（CNS)贅瘤、脊椎軸腫瘤、腦 幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、許旺 細胞瘤（schwanomas)、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜 瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤因氏瘤（Ewings 154378.doc •49· 201138821 sarcoma)，包括任何上述癌症之難治型式 述癌症之組合 此等組合物亦可含有諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分 散劑之佐劑。可藉由滅菌程序（同上文）及藉由包括例如對 經基苯甲酸醋、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物之各種 抗細菌劑及抗真菌劑來確保防止存在微生物。亦可能需要 在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化納及其類似物。另 外，可藉由包括延遲吸收之藥劑（諸如單硬脂酸鋁及明膠 來實現可注射醫藥形式之延長吸收。 不論所選投藥途徑如何’均可藉由熟習此項技術者已知 之習知方法將本發明化合物(其可以適合水合形式使用)及/ 或本發明之醫藥組合物調配成醫藥學上可接受之劑型。 、本發：之醫藥組合物中活性成分之實際劑量濃度可變化 以便獲仔有效達成對特定患者、組合物及投藥模式之所需 治療反應 ^而對患者無毒的活性成分之量。所選劑量濃度 將視多種藥物動力+ 動力予因素而定，該等因素包括所用之本發 之疋、且口物的活性、投藥途徑、投藥時間、所用特定 世速率、治療持續期間、與所用特定組合物組 3使用之其他孳物、乂 齡、性別、體# 匕5物及/或物質、所治療患者之年 醫療技亦中狀、一般健康狀況及先前病史，及在 j療技術中所熟知之類似因素。 的==減菌且為達到組合物可由注射器傳遞之程度 涪。 矛' 之外，載劑較佳為等張緩衝生理食鹽水溶 «1^. 154378.doc •50- 201138821 可例如藉由使用諸如卵磷脂之衣料、在分散液情況下藉 由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動 性。在許多情況下，較佳於組合物中包括等張劑，例如 糖、多元醇（諸如甘露糖醇或山梨糖醇）及氯化鈉。 胺基酸序列之描述 SEQ ID NO: 1 <IGF-1R> 重鏈，OA-Akl8-scFab-GA201 (+WT) SEQ ID NO: 2 <IGF-1R> 輕鏈，OA-Akl8-scFab-GA201 Ο
(+WT) SEQ ID NO: 3 <EGFR>肽連接之重鏈與輕鏈，具有二硫 鍵穩定 VH 44/VL100，OA-Akl8-scFab- GA201 SEQ ID NO: 4 <EGFR>肽連接之重鏈與輕鏈，OA-Akl8-
scFab-GA201_WT SEQ ID NO: 5 <EGFR>重鏈，OA-GA201-scFab-Akl8(+WT) SEQ ID NO: 6 <EGFR>輕鏈，OA-GA201-scFab-Akl8(+WT) SEQ ID NO: 7 <IGF-1R>肽連接之重鏈與輕鏈，具有二 硫鍵穩定 VH 44/VL100，OA-GA201-scFab-Akl 8 SEQ ID NO: 8 <IGF-1R>肽連接之重鏈與輕鏈，OA_
GA201-scFab-Akl8_WT SEQ ID NO: 9 <VEGF> 重鏈，Ang2-VEGF OA-Ava-N- scFabLC06(+SS) SEQ ID NO: 10 <VEGF> 輕鏈 > Ang2-VEGF OA-Ava-N- 154378.doc -51- 201138821 scFabLC06(+SS) SEQ ID NO: 11 <ANG-2>肽連接之重鏈與輕鏈，具有二
硫鍵穩定 VH 44/VL100，Ang2-VEGF
OA-Ava-N-scFabLC06SS SEQ ID NO: 12 <ANG-2>肽連接之重鏈與輕鏈，Ang2-
VEGF OA-Ava-N-scFabLC06 SEQ ID NO: 13 人類 EGFR SEQ ID NO: 14 人類 IGF-1R SEQ ID NO: 15 人類 VEGF SEQ ID NO: 16 人類 ANG-2 提供以下實例、序列表及圖以助於瞭解本發明，其真實 範疇闡述於隨附申請專利範圍中。應瞭解，可在不脫離本 發明精神之情況下下對所述程序進行修改。 實驗程序 實例 材料及方法 重組DNA技術 如 Sambrook，J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所述，使用標準方法來操縱 DNA。根據製造商說明書使用分子生物學試劑。 DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理
Kabat, E.A.等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，NIH公開號 91-3242 中提供 I54378.doc -52- 201138821 關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資 訊。根據 EU 編號（Edelman，G_M. 等人，PNAS 63 (1969) 78-85 ; Kabat，Ε·Α.等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，NIH公開號 91-3242)對抗體 鏈之胺基酸編號。使用 GCG's(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)套裝軟體 10·2 版及 Infomax’s Vector NTI Advance套組8.0版來進行序列產生、定位、分析、註 解及說明。 〇 DNA定序 藉由在 SequiServe(Vaterstetten，德國）及 Geneart AG (Regensburg,德國）進行雙股定序來測定DNA序列。 基因合成 藉由Geneart AG(Regensburg，德國），自合成性寡核苷 酸及PCR產物，藉由自動化基因合成法製備所需基因區 段。該基因區段可編碼在CH3域中攜帶S354C及T366W突 變之「杵入臼」抗體重鏈及攜帶Y349C、T366S、L368A及
Q Y407V突變之「杵入臼」重鏈與未經修飾之VH域或scFab 抗體片段之組合並在抗體輕鏈上側接單數個限制性核酸内 切酶裂解位點（BamHI-Xbal或BamHI-Kpnl)，並選殖至 pGA18(ampR)質體中。自經轉型細菌中純化質體DNA，且 藉由UV光譜法測定濃度。藉由DNA定序確證次選殖基因 片段之DNA序列。所有構築體均設計成具有編碼前導肽 (MGWSCIILFLVATATGVHS)之5'端DNA序列（其靶向在真 核細胞中分泌之蛋白質）。 154378.doc -53- 201138821 構築表現質體 使用Roche表現載體來構築編碼所有「杵入臼」重鏈以 及抗體輕鏈之表現質體。載體包含以下元件： -作為選擇標記之潮黴素抗性基因（hygromycin resistance gene)， -艾伯斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus ; EBV)之複製 起點oriP， -容許此質體在大腸桿菌中複製之來自載體PUC18之複 製起點， -賦予大腸桿菌安比西林（ampicillin)抗性之β-内酿胺酶 基因， -來自人類細胞巨大病毒（HCMV)之極早期強化子及啟 動子； -人類1-免疫球蛋白聚腺苷酸化（「聚A」）信號序列， 及 -獨特B amHI及Xbal限制性位點。 藉由基因合成法製備包含具有未經修飾VH域之「杵入 臼」重鏈或scFab片段以及未經修飾輕鏈的免疫球蛋白基 因，且選殖至如所述之pGAl 8(ampR)質體中。以BamHI及 Xbal 或 BamHI 及 ΚρηΙ 限制酶（Roche Molecular Biochemicals) 分解攜帶已合成之DNA區段及Roche表現載體之 pG18(ampR)質體，且進行瓊脂糖凝膠電泳。接著將經純化 之「杵入臼」重鏈及未經修飾輕鏈之編碼DNA區段接合至 經分離之Roche表現載體BamHI/Xbal或BamHI/ΚρηΙ片段， 154378.doc -54- 201138821 產生最終表現載體。將最終表現載體轉型至大腸桿菌細胞 中，分離表現質體DNA(Miniprep)且進行限制酶分析及 DNA定序。使正確純系於150 ml LB-Amp培養基中生長， 再次分離質體DNA(Maxiprep)，且藉由DNA定序，確證序 列完整性。 雙特異性抗髏於HEK293細胞中之短暫表現 藉由使用FreeStyleTM 293表現系統，根據製造商說明書 (Invitrogen, USA)短暫轉染人類胚腎293-F細胞，來表現重 組雙特異性抗體。簡言之，在37°C/8% C02下，在 FreeStyle™ 293表現培養基中培養懸浮Freestyle™ 293-F細 胞，且在轉染當天，將細胞以1-2χ106個活細胞/毫升之密 度接種於新鮮培養基中。使用325 μΐ 293fectinTM(Invitrogen， 德國）及250 pg「杵入臼」重鏈1及2及輕鏈質體DNA以 1:1:1或1:2:1莫耳比，250 ml最終轉染體積），在Opti-MEM® I培養基（Invitrogen，USA)中製備「杵入臼」DNA-293fectin複合物。在轉染後7日，在14000 g下離心30分 鐘，收集含有抗體之細胞培養物上清液，且經由滅菌過濾 器（0.22 μιη)過濾。在-20°C下儲存上清液直至進行純化為 止。 純化雙特異性抗體
藉由親和層析法，使用蛋白質A-SepharoseTM(GE Healthcare,瑞典）及Superdex200尺寸排阻層析法，自細胞 培養物上清液純化雙特異性抗體。簡言之，將滅菌過濾之 細胞培養物上清液施加於經過PBS緩衝液（10 mM 154378.doc -55- 201138821
Na2HP04、1 mM ΚΗ2Ρ〇4、137 mM NaCl及 2.7 mM KCl(pH 7.4))平衡之出1^3卩？1'(^6丨11八1^(5 1111)管柱上。以平衡緩衝 液洗掉未結合之蛋白質。以0.1 M檸檬酸鹽緩衝液（pH 2.8) 溶離抗體及抗體變異體，且以0.1 ml 1 M Tris(pH 8.5)中和 含有蛋白質之溶離份。接著，彙集溶離之蛋白質溶離份， 以 Amicon Ultra離心過濾裝置（MWCO: 30 K，Millipore)濃 縮至3 ml之體積，且加載於經過20 mM Histidin、140 mM NaCl(pH 6.0)平衡之 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 凝膠 過濾管柱（GE Healthcare，瑞典）上。彙集含有經純化之雙 特異性抗體與低於5%高分子量聚集體之溶離份，且以1 _0 mg/ml等分試樣形式儲存於-80°C下。 分析經純化之蛋白質 使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數，在280 nm下 量測光學密度（OD)來測定純化蛋白質樣本之蛋白質濃度。 藉由SDS-PAGE在還原劑（5 mM 1,4-二硫蘇糖醇）存在及不 存在下且以考馬斯亮藍（Coomassie brilliant blue)染色來分 析雙特異性抗體及對照抗體之純度及分子量。根據製造商 說明書（4-20% Tris-甘胺酸凝膠）使用NuPAGE® Pre-Cast凝 膠系統（Invitrogen, USA)。藉由高效能SEC，使用Superdex 200分析性尺寸排阻管柱（GE Healthcare，瑞典），於200 mM KH2P〇4、250 mM KCl(pH 7.0)操作缓衝液中在 25°C 下 分析雙特異性抗體及對照抗體之聚集體含量。以〇·5 mL/min流動速率將25 pg蛋白質注於管柱上且等度溶離50 分鐘。對於穩定性分析，在4°C及40°C下培育1 mg/ml濃度 154378.doc -56- 201138821 之純化蛋白質7日，接著藉由高效能SEC評估。在藉由以 肽-N-醣芽酶 F(Roche Molecular Biochemicals)酶處理來移 除N-聚糖之後，藉由NanoElectrospray Q-TOF質譜分析來 驗證經還原雙特異性抗體輕鏈及重鏈之胺基酸主鏈的完整 性。 表面電漿子共振 用標準結合檢測，諸如表面電漿子共振技術（BIAcore®， GE-Healthcare Uppsala,瑞典）在25 °C下測定結合親和力。 對於親和力量測，在SPR儀器（Biacore T100)上藉由標準胺 偶合及封端化學使30 pg/ml抗Fey抗體（得自山羊，Jackson Immuno Research)與CM-5感應晶片表面偶合。接合之後， 在25 °C下以5 pL/min流動速率注射單特異性或雙特異性 Her3/cMet抗體，接著以30 pL/min注射人類HER3或c-Met ECD之連續稀釋液（0 nM至1000 nM)。使用PBS/0.1% BSA 作為結合實驗之操作緩衝液。接著用10 mM甘胺酸-HCl(pH 2.0)溶液之60秒脈動使晶片再生。 EGFR/IGF-1R表面電漿子共振
使用 Biacore T100儀器（GE Healthcare Biosciences AB， Uppsala,瑞典）進行SPR實驗。使用標準胺偶合化學將 IGF-1R或EGFR固定於CM5生物感應晶片表面上。使用固 定精靈程序（immobilization wizard procedure)，以1 pg/ml 注射於乙酸鈉（pH 5.0)中之IGF-1R或EGFR，達成200 RU(IGF-IR)或100 RU(EGFR)之目標。以相同方式，但僅 用媒劑緩衝液處理參照對照流槽。將抗體於1 xPBS(pH 154378.doc -57· 201138821 7.4)、0.05% Tween20(Roche Diagnostics GmbH)中稀釋且 以3.125 11]\/1與5〇11^1之間的遞增濃度以3〇01/111丨11之流動速 率注射。接觸時間（締合階段）為3分鐘（EGFR結合）及5分鐘 (IGF-1R結合），解離時間為10分鐘（EGFR)及3分鐘（IGF-1R)。以5 μΐ/min之流動速率注射0.85%磷酸30秒使EGFR結 合再生。以5 μΐ/min之流動速率注射4 Μ氯化鎂1分鐘使 IGF-1R結合再生。藉由使用Biaevaluation軟體内之1:1朗谬 爾結合模型（Langmuir binding model)來計算動力學速率常 數及平衡解離常數。 為證明同時結合，將雙特異性抗體以25 nM注射於EGFR 表面上歷時1分鐘，流動速率為5 μΐ/min。將抗體捕捉於 EGFR表面之後，以2.5 nM與80 nM之間的遞增濃度下以30 μΐ/min之流動速率注射IGF-1R。以5 μΐ/min之流動速率注 射0.85%鱗酸30秒使表面再生。藉由使用Biaevaluation軟 體内之1:1朗繆爾結合模型來計算動力學速率常數及平衡 解離常數。 ANG-2結合表面電漿子共振（Biacore) 藉由表面電漿子共振，使用BIACORE T100儀器（GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala,瑞典）來研究抗體與 例如人類ANG-2之抗原的結合。簡言之，對於親和力量 測，經由胺偶合將山羊<hIgG-FcY>多株抗體固定於CM5晶 片上以便呈現針對人類ANG-2之抗體（圖6B)。在25°C下在 HBS 緩衝液（HBS-P(l〇 mM HEPES、150 mM NaC 卜 0.005% Tween 20(pH 7·4)))中量測結合。以 6.25 nM 與 200 nM 之間 154378.doc -58 - 201138821 的各種濃度之溶液形式添加經純化ANG-2-His(R&D systems或經内部純化）。藉由ANG-2注射3分鐘來量測締 合；藉由以HBS緩衝液洗滌晶片表面3分鐘來量測解離， 且使用1:1朗繆耳結合模型估算KD值。由於ANG-2製劑之 不均勻性（heterogenity)，因此不能觀察到1:1結合；因此 KD值僅為相對估算值。樣本曲線減去陰性對照數據（例如 緩衝液曲線），以便校正系統固有之基線漂移及減少雜訊 信號。使用Biacore T100評估軟體1·1·1版分析感測器圖譜 及計算親和力數據。或者，可經由PentaHis抗體（PentaHis-Ab，無 BSA, Qiagen 第 34660號）以 2000-1700 RU 之捕捉程 度捕捉Ang-2，該抗體已經由胺偶合固定於CM5晶片上（無 BSA)(參看下文）。 VEGF結合表面電漿子共振（Biacore) 使用表面電漿子共振技術，在Biacore T100儀器上，根 據以下方案來分析雙特異性<VEGF-Ang-2>抗體之VEGF結 合，且使用T100套裝軟體加以分析：簡言之，經由與山羊 抗人類IgG(JIR 109-005-098)結合將<VEGF>抗體捕捉於 CM5晶片上。使用如下標準胺基偶合藉由胺基偶合固定捕 捉抗體：HBS-N緩衝液充當操作緩衝液，用EDC/NHS混合 物進行活化，達成700 RU配位體密度之目標。將捕捉抗體 於偶合緩衝液（NaAc，pH 5.0，c=2 pg/mL)中稀釋，藉由注 射1 Μ乙醇胺阻斷最終仍具活性之羧基。以5 pL/min之流 速及c(Mab<VEGF>)= 10 nM進行mAb <VEGF>抗體捕捉， 以操作緩衝液+ 1 mg/mL BSA稀釋；應達成約30 RU之捕捉 154378.doc -59· 201138821 程度。rhVEGF(rhVEGF，R&D-Systems目錄號 293-VE)用作 分析物。在37°C下在作為操作緩衝液之PBS + 0.005%(v/v) Tween20中進行VEGF與<VEGF>抗體結合的動力學表徵。 以50 pL/min之流速注射樣本且締合時間為80秒且解離時 間為1200秒，rhVEGF之濃度系列為300-0.29 nM。用10 mM甘胺酸（pH 1.5)進行游離捕捉抗體表面之再生且接觸時 間為各分析物循環之後60秒。藉由使用常用之雙參照法 (對照參照：rhVEGF與捕捉分子山羊抗人類IgG結合，量 測流槽之空白樣本，rhVEGF濃度「0」，模型：朗繆爾結 合1:1 (因為捕捉分子結合，所以Rmax設置為局部））計算動 力學常數。 產生HEK293-Tie2細胞株 為測定血管生成素-2抗體對細胞上ANG2刺激之Tie2磷 酸化及ANG2與Tie2結合的干擾，產生重組HEK293-Tie細 胞株。簡言之’使用 Fugene(Roche Applied Science)作為 轉染試劑將在CMV啟動子及新黴素抗性標記控制下編碼全 長人類Tie2(SEQ ID 108)的基於pcDNA3之質體（RB22-pcDNA3 Topo hTie2)轉染至HEK293 細胞（ATCC)中，且在 DMEM 10% FCS、500 gg/mi G418中選擇抗性細胞。經由 選殖柱（cloning cylinder)分離個別純系，隨後藉由FACS分 析Tie2表現。純系22經鑑別為即便在〇41 8不存在下亦具有 高且穩定之Tie2表現的純系（HEK293-Tie2純系22)。隨後 使用HEK293-Tie2純系22進行細胞檢測：ANG2誘導之Tie2 磷酸化及ANG2細胞配位體結合檢測。 154378.doc ，60 - 201138821 VEGF誘導之HUVEC增殖檢測 選擇VEGF誘導之HUVEC(人類臍靜脈内皮細胞， Promocell #012200)增殖來量測VEGF抗體之細胞功能。 簡言之，將每96孔5000個HUVEC細胞（低繼代次數，55次 • 繼代）在膠原蛋白I塗佈之BD Biocoat膠原蛋白I 96孔微量滴 . 定板（BD #354407/35640)中之100 μΐ饑餓培養基（EBM-2内 皮細胞基礎培養基 2(Promocell # C-2221 1)、0.5% FCS、盤 尼西林（Penicilline)/鏈黴素（Streptomycine))中培育隔夜。 〇 使不同濃度之抗體與rhVEGF(30 ngl/ml最終濃度，BD # 354107)混合，且在室溫下預培育15分鐘。隨後，將混合 物添加至HUVEC細胞中，且將其在37°C、5% C02下培育 72小時。在分析當天，使板平衡至室溫歷時30分鐘，且使 用CellTiter-GloTM發光細胞生存力檢測套組根據手冊 (Promega, # G75 71/2/3)來測定細胞生存力/增殖。以分光 光度計測定發光。 ANG2誘導之Tie2磷酸化檢測 〇 根據以下檢測原則量測雙特異性<ANG2-VEGF>抗體對 ANG2誘導之Tie2磷酸化之抑制。在<ANG2-VEGF>抗體不 存在或存在下以ANG2刺激HEK293-Tie2純系22歷時5分鐘 . 且藉由夾層ELISA定量P-Tie2。簡言之，使每孔2xl〇5個 HEK293-Tie2純系22細胞在聚D-離胺酸塗佈之96孔微量滴 定板上，在 100 μΐ DMEM、10% FCS、5 00 pg/ml遺傳黴素 (Geneticin)中生長隔夜。次曰，在微量滴定板中製備 <ANG2-VEGF>抗體之滴定列（濃縮4倍，75 μΐ最終體積/ 154378.doc •61 - 201138821 孔，一式兩份）且與 75 μΐ ANGPT2(R&D Systems # 623-AN) 稀釋液（3 _2 pg/ml ’作為濃縮4倍之溶液）混合。在室溫下預 培育抗體及ANG2歷時1 5分鐘。將100 μΐ混合物添加至 HEK293-Tie2純系 22細胞（與 1 mM NaV3〇4(sigma #S6508) 預培育5分鐘）中，且在37°C下培育5分鐘。隨後，每孔以 200 μΐ冰冷PBS + 1 mM NaV3〇4洗滌細胞，且藉由每孔添 加 120 μΐ 溶解缓衝液（20 mM Tris(pH 8.0)、137 mM NaCl、 1% NP-40、10%甘油、2 mM EDTA、1 mM NaV3〇4、1 mM PMSF及10 pg/ml抑肽酶（Aprotinin))在冰上溶解。在 4°C下在微量滴定板震蘯器上溶解細胞30分鐘，且在未預 先離心及測定總蛋白質之情況下將100 μΐ溶解物直接轉移 至p-Tie2 ELISA微量滴定板（R&D Systems，R&D #DY990) 中。根據製造商說明書定量p_Tie2量，且使用Excel插入式 XLfit4分析（一位點劑量反應，205型）測定抑制之IC50值。 細胞效價發光檢測 使用細胞效價發光檢測（Promega)定量細胞生存力及增 殖。根據製造商說明書進行檢測。簡言之，以100 μί之總 體積在9 6孔板中培養細胞歷時所需時段。對於增殖檢測， 自培育箱移除細胞且置於室溫下30分鐘。添加1 〇〇 pL細胞 效價發光試劑且將多孔板置於迴轉式震盪器上2分鐘。在 微板讀取器（Tecan)上1 5分鐘之後定量發光。 實例la 表現及砘化雙特異性二價體分子 根據上述材料及方法中所述之程序’表現及純化雙特異 154378.doc -62- 201138821 性二價 <VEGF-ANG-2>抗體分子 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS及Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06。<VEGF> 部分之VH及VL係基於貝伐單抗。<ANG2>部分之VH及VL係 基於 ANG2i-LC06(其描述於 PCT 申請案第 PCT/EP2009/007182 號中且經由噬菌體呈現獲得）之VH及VL序列。此等雙特異 性二價抗體之有關輕鏈及重鏈胺基酸序列如下：SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: ll(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS)及 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06)。 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS 及 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06之表現係藉由西方墨點法（Western blot) 確證。Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS 及 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06之純化得到以下產率。 純系 上清液 蛋白質A SEC 產率 單體 產率 單艎 OA-Ava-N-scFabLC06 0.5 L 42.5 mg 77% 27.0 mg 94.8% OA-Ava-N-scFabLC06SS 1.5 L 160 mg 85% 93 mg >99% 質譜：未偵測到同價同作用重鏈二聚體 如所述測定結合及其他特性。 實例lb 表現及純化雙特異性二價<10[-111-£0『11>抗體分子 154378.doc -63- 201138821 表：雙特異性二價<16『-111-£0?11>抗體分子之概述 構築體 序列 scFab VH44-VL100 二硫鍵 OA-Akl8-scFab-GA201_WT SEQ ID NO: 4(重鏈 1) SEQ ID NO: 1(重鏈2) SEQ ID NO: 2(輕鏈） 二 OA-Akl8-scFab-GA201 SEQ ID NO: 3(重鏈 1) SEQ ID NO: 1(重鏈2) SEQ ID NO: 2(輕鏈） 土 OA-GA201-scFab-Akl8_WT SEQ ID NO: 8(重鏈 1) SEQ ID NO: 5(重鏈2) SEQ ID NO: 6(輕鏈） 二 OA-GA20X-scFab-Akl8 SEQ ID NO: 7(重鏈 1) SEQ ID NO: 5(重鏈2) SEQ ID NO: 6(輕鏈） 土 根據上述材料及方法中所述之程序，以1:1:1質體比表現 雙特異性二價 <IGF-1R-EGFR>抗體分子 OA-Akl8-scFab-GA201及OA-GA201-scFab-Akl8且純化。雙特異性抗體係 基於 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587 ; WO 2005/ 005635 ;縮寫為 <IGF-1R>純系 18或 <IGF-1R>AK18)及人類 t<EGFR>ICR62(WO 2006/082515，縮寫為 <EGFR>ICR62) 之抗原結合位點。此等雙特異性二價抗體之有關輕鏈及重 鏈胺基酸序列如下· SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3(OA-Akl8-scFab-GA201)及 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7(OA-GA201-scFab-Akl8)。OA-Akl8-scFab-GA201 及 OA-GA201-scFab-Akl8 之表現係藉由 西方墨點法確證。對細胞培養物上清液進行蛋白質A純化 之後，兩種構築體均顯示50%至58%之預期分子量為約148 kDa(如藉由分析性SEC偵測）雙特異性抗體及大量分子量為 154378.doc -64- 201138821
100 kDa之半抗體。SEC純化之後’兩種構築體均展示86% 至90%之分子量為148 kDa之均質單體及1〇〇 kDa之殘餘副 產物。0八-0八201-3〇?&1)-入1<;18亦以1:2:1質體比表現且進行 Prot A及SEC純化。與1:1:1表現比相比，pr〇t a之後的半 抗體量自30%減少至6%，1:2:1表現量如藉由BioanalyZer (Caliper analysis)偵測。SEC純化蛋白質之質譜分析確證藉 由改變轉染時之質體比來有效移除半重鏈1人類化 <EGFR>ICR62抗體。在HEK293細胞中表現時，用丄·2· 1質 體比使〇八-0八201-3〇?&1>-八]<;18純化產率提高4〇〇/{)。
雙特異性二價<IGF-1R-EGFR>抗體分子〇a-GA201-scFab-Akl8_WT(具有 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8之有關輕鏈及重鏈胺基酸序列）係以^^及^] 質體比表現且類似純化。 1:2:1質體比之結果： 純化構築體 蛋白質A SEC OA-GA201-scFab-Akl8_WT(9.9 L) 產率 283.5 mg 單體__ 85.0%(分析性 SEC) 86.0%(BioAnalyzer) 產率 204.1 mg __ 98·0%(分析性 SEC) 9 5. 〇%(Bio Analyzer^ 具有僅3個質體之〇A -scFab構築體較之使用杵入臼技術 產生具有4個表現質體之雙特異性分子之類似雜二聚方法 (參看例如WO 2009/080253)具有有價值之副產物型態的優 勢。本發明之抗體顯示完全不存在錯誤配對之輕鏈或缺乏 輕鏈之抗體（資料未圖示）。 顯示所述1:2:1方法得到具有高純度及半抗體明確減少之 154378.doc -65· 201138821 雙特異性分子，且完全不存在錯誤配對之輕鏈或缺乏輕鏈 之抗體（資料未圖示）。 如所述測定結合及其他特性。 可類似表現及純化雙特異性二價<IGF-1R-EGFR>抗體分 子 OA-Akl8-scFab-GA201_WT(具有 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4(OA-Akl8-scFab-GA201—WT)之 有關輕鏈及重鏈胺基酸序列）。 實例2 雙特異性抗體（同時）結合兩種抗原 將不同雙特異性抗體型式之結合與產生結合模組及雙特 異性抗體之『野生型』IgG之結合相比。此等分析藉由應 用如上所述之表面電聚子共振（Biacore)進行。可偵測到雙 特異性抗體0八-0人201-8〇?&1>-八1<:18_\^丁同時結合10[-111與 EGFR兩者。 儀器：Biacore T100(GE Healthcare)、T200敏感性增強型 軟體：T200 Control 1.0版 軟體：T200 Evaluation 1.0版 晶片：CM5晶片 檢測 根據製造商說明書之流槽1至4上之標準胺偶合：操作緩 衝液：HBS-N緩衝液，藉由EDC/NHS混合物活化’以配位 體密度為目標。將EGFR於偶合緩衝液（NaAc ’ pH 4.5， c=15 pg/mL)中稀釋；藉由注射1 Μ乙醇胺阻斷最終保持活 性之羧基。 154378.doc -66 - 201138821 流槽1上之胺偶合EGFR用作校正可能存在之緩衝液效應 或非特異性結合之參照對照表面。 在25°C下以30 pL/min之流動速率量測同時結合。以 c=10 nM之濃度注射雙特異性Ab 2分鐘，接著立即連續注 • 射人類或cyno IGF1R(締合時間：2分鐘，解離時間：3分 - 鐘，c=150 nM)。 所有樣本均以操作缓衝液+ 1 mg/mL BSA稀釋。 各循環之後，使用15 mM NaOH、1分鐘接觸時間、30 〇 pL/min流動速率進行再生。陰性對照物：替代IGF1R，注 射稀釋缓衝液作為陰性對照物。 結果 雙特異性Ab : OA-GA201-scFab-Akl8_WT顯示同時結合 胺偶合人類EGFR與人類IGF1R(參看圖9感測器圖譜）。 實例3a ANG2-VEGF-Mab Tie2磷酸化抑制 根據上述檢測原則量測雙特異性<ANG2-VEGF>抗體對 ❹ VEGF誘導之HUVEC增殖之抑制。結果示於圖5中。 實例3b ANG2-VEGF-Mab Tie2磷酸化抑制 • 根據上述檢測原則量測雙特異性<ANG2-VEGF>抗體對 ANG2誘導之Tie2磷酸化之抑制。結果示於圖6中。 實例4 雙特異性<£0[11-10罗111>抗體引起IGF-1R内化/下調
人類抗 IGF-1R抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 154378.doc -67- 201138821 2587)抑制IGF-1R信號傳導且誘導IGF-1R内化及隨後下 調。為評估雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體之可能抑制活 性，分析IGF-1R之下調程度。 為偵測本發明之抗體對腫瘤細胞中IGF-1受體（IGF-1R) 量的影響，用IGF-1R及EGFR特異性抗體進行時程實驗及 隨後之ELISA分析。 人類H322M腫瘤細胞（獲自NCI)在96孔板（lxlO4個細胞/ 孔）中，在37。(：及5% C02下，在補充有10%胎牛血清、2 mM L-麵醢胺酸及1 % PenStrep之RPMI培養基中培養隔 夜。 謹慎移除培養基且更換為於RPMI培養基中稀釋之總體 積為100 μΐ之雙特異性〈EGFR-IGFIR：^^體溶液。在37。(： 及5% C02下培育細胞至少3小時但不超過24小時。 藉由抽吸謹慎移除培養基且以120微升/孔冷MES-溶解緩 衝液（25 mM MES(pH 6.5)、2% Triton X-100、60 nM 辛基 糖苦、150 mM NaCl、10 mM Na3V〇4 及 Complete®蛋白酶 抑制劑）溶解細胞。將板儲存在-20°C下直至作其他分析為 止。 IGF-1R偵測 將PBS、3% BSA及0.2% Tween®20中1:200稀釋之最終濃 度為2.4 pg/ml之AKla生物素標記之抗體（WO 2004/087756, Roche，德國中所述之<IGF-1R>HUMAB純系 la(DSM ACC 2586))添加至抗生蛋白鏈菌素塗佈之MTP(Roche ID編號： 1 1 965891001)的各孔中。在室溫下攪動抗生蛋白鏈菌素- 154378.doc -68- 201138821 MTP歷時1小時，接著以200微升/孔含有0·1% Tween®20之 PBS洗滌三次。 移除PBS/Tween溶液之後，將100 μΐ細胞溶解物添加至 抗體塗佈之抗生蛋白鏈菌素-ΜΤΡ之各孔中。 接著在室溫下在攪動下再培育ΜΤΡ —小時隨後以含有 0.1% Tween®20之 PBS洗滌 3 次。 使用於 PBS、3% BSA及 0.2% Tween®20 中 1:750稀釋之 IGF-1RP兔抗體（200 pg/ml，Santa Cruz Biotechnology，目 錄號sc-713)來偵測捕捉抗體AK1 a結合之IGF-1R。每孔添 加100 μΐ且在室温下在攪動下培育1小時。隨後移除溶液且 以200 μΐ含有0.1% Tween®20之PBS洗滌該等孔三次。過氧 化酶標記之抗兔IgG-HRP(Cell signaling目錄號7074)用作 二級偵測抗體，於PBS、3% BSA及0.2% Tween®20中 1:4000稀釋。將100 μΐ上述抗體添加至各孔中且在室溫下 在攪動下培育1小時。接著以含有0.1% Tween®20溶液之 PBS洗滌該板六次。每孔添加1〇〇 μΐ過氧化酶受質3,3’-5,5匕 四甲基聯苯胺（3,3’-5,5'-Tetramethylbenzidin)(Roche，ΒΜ-Blue ID編號1 1484581)且在室溫下在攪動下培育20分鐘。 藉由每孔添加25 μΐ 1 M H2SO4來停止生色反應 (。〇1〇111^611丨(：犷6 3。1；丨〇11)且在室溫下再培育5分鐘。在450 11111 下量測吸光度。 雙特異性〈EGFR-IGF1R〉抗體 〇A-GA201-scFab-Akl8_WT較之人類抗IGF-1R抗體 <IGF-1R>HUMAB純系 18 誘導較小之下調。與<IGF-1R>HUMAB純系18相比，OA- 154378.doc •69· 201138821 GA201-scFab-Akl8_WT 引起之下調減小 >50%。 實例5 雙特異抗體對EGFR以及IGF-1R信號傳 導路徑之抑制 人類抗 IGF-1R抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587)抑制IGF-1R信號傳導且人類化大鼠抗EGFR抗體 ICR62抑制EGFR信號傳導。為評估雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體之可能抑制活性，分析對兩種路徑之信號傳 導的抑制程度。 將補充有10%胎牛血清、2 mM L-麩醯胺酸及1% PenStrep之RPMI培養基中之人類腫瘤細胞（H322M，3 X 104 個細胞/孔）接種於96孔微量滴定板中，且在37°C及5% C02 下培養隔夜。 謹慎移除培養基且更換為1〇〇 μΐ無血清DMEM培養基（補 充有 1 mg/ml RSA、10 mM Hepes、1% PenStrep)，且在 3 7°C及5% C02下培育至少2.5小時。 再次謹慎移除培養基且更換為雙特異性抗體及對照抗體 (<IGF-1R>HUMAB純系 18及<EGFR>ICR62，最終濃度〇.〇1 mg/ml)於無血清DMEM培養基中總體積為50 μΐ的稀釋液， 接著在37°C及5% C02下培育30分鐘。藉由添加50 μΐ IGF-1(10 ηΜ)或EGF(20 ng/ml)(於無血清DMEM培養基中稀釋） 來刺激細胞且在37°C及5% C02下培育1〇分鐘。 謹慎移除培養基且以100微升/孔冰冷PBS洗滌細胞一 次。藉由添加100微升/孔BioRad細胞溶解緩衝液（Bi〇Rad 154378.doc -70· 201138821 細胞溶解套組（BioRad Cell Lysis Kit)(BioRad 目錄號 171-304012))來溶解細胞。將板儲存在-20°C下直至作進一步分 析為止。 藉由將細胞溶解物經由Multiscreen HTS濾、板過濾、，藉由 在500 g下離心5分鐘來移除細胞碎片。如下分析經過濾細 胞溶解物中之EGFR及IGF-1R鱗酸化：用Luminex系統，使 用P-EGFR(Tyr)珠粒套組（Millipore目錄號46-603)來分析 EGFR磷酸化，用P-IGF-lR(Tyrll31)珠粒套組（BioRad目錄 號171V27343)來分析IGF-1R磷酸化。如BioPlex磷蛋白偵 測手冊（BioPlex Phosphoprotein Detection manual)(BioRad Bulletin # 2903)中所述，使用磷蛋白偵測試劑套組 (BioRad 目錄號 171-304004)進行 Luminex 檢測。 雙特異性 <EGFR-IGF1R>抗體 OA-GA201-scFab-Akl8_WT 有效抑制H322M腫瘤細胞上之IGF-1R磷酸化（IC50 ·· 1 nM，最大抑制·· >70%)及EGFR磷酸化（IC50 : 1 nM，最大 抑制：>90%)。 實例6 雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體對3D培養物中NCI-H322M H322M腫瘤細胞之生長抑制 人類抗 IGF-1R抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587)抑制表現IGF-1R之腫瘤細胞株的生長（W0 2005/005635)。以類似之方式，已顯示人類化大鼠抗EGFR 抗體<EGFR>ICR62抑制表現EGFR之腫瘤細胞株的生長 (WO 2006/082515)。為評估腫瘤細胞株生長檢測中雙特異 154378.doc 71 · 201138821 性<ΕΘΡΙΙ-ΙΟΡ1ΙΙΗλ體之可能抑制活性，分析表現EGFR以 及IGF-1R之H322M細胞中之抑制程度。 在補充有 10% FBS(PAA)、1 mM丙酮酸納（Gibco, Darmstadt， 德國）、非必需胺基酸（Gibco)及2 mM L-楚醯胺酸（Sigma， Steinheim,德國）之 RPMI 1640 培養基（PAA，Pasching， Austria)中培養H322M肺癌細胞（NCI)。將25000個細胞/孔 接種於含有培養基之96孔聚HEMA(聚（2-羥乙基曱基丙烯 酸醋）(Polysciences，Warrington, PA, USA))塗佈板中。同 時，添加不同濃度之雙特異性抗體且培育7日。使用 CellTiterGlo®(Promega , Madison, WI，USA)檢測，根據製 造商說明書藉由量測細胞之ATP含量來偵測細胞生存力。 結果示於圖8中。雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體0入-GA201-scFab-Akl8_WT以劑量依賴性方式抑制H322M細胞 增殖。當與親本單特異性抗體<IGF-1R>HUMAB純系18或 <EGFR>ICR62相比時，在1000 nM劑量下，雙特異性 <EGFR-IGF1R> 抗體 OA-GA201-scFab-Akl8_WT 顯示對增 殖之抑制改良。 實例7 雙特異抗體在表現EGFR及IGF-1R之皮 下異種移植模型中之活體内功效 人類抗 IGF-1R抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18(DSM ACC 2587)抑制表現IGF-1R之腫瘤細胞株的生長（WO 2005/00563 5)。以類似之方式，已顯示人類化大鼠抗EGFR 抗體<EGFR>ICR62抑制表現EGFR之腫瘤細胞株的生長 154378.doc • 72- 201138821 (WO 2006/082515)。為評估雙特異性 <EGFR-IGF1R> 抗體 對活體内腫瘤生長之可能抑制活性，使用特徵在於表現 EGFR以及IGF-1R之皮下異種移植模型BxPC-3。 在補充有 10%胎牛血清（Sera Plus; PANTM Biotech GmbH) 及 2 mM L-麩醯胺酸（PANTM Biotech GmbH)之 RPMI 1640 培 養基（PAN™ Biotech GmbH)中在37°C下在水飽和氛圍中在 5% C02下培養人類胰腺癌細胞株BxPC-3之細胞（獲自 ATCC)。在接種當天，自培養瓶收集BxPC-3腫瘤細胞（lx 胰蛋白酶-EDTA，Roche Diagnostics)，且轉移至培養基 中，離心，洗滌一次，再懸浮於PBS中。為注射細胞，將 最終效價調節至lxl〇8個細胞/毫升。隨後，將100 μΐ此懸 浮液（對應於lxlO7個細胞）皮下注入雌性SCID灰棕色小鼠 之右側腹。在形成腫瘤且已達到150-250 mm3之平均尺寸 後開始以媒劑、<EGFR-IGFlR：MiL體及對照抗體（<IGF-1R>HUMAB純系18&<EGFR>ICR62)處理。一週兩次量測 腫瘤體積且平行監測動物體重。將單次處理及單一抗體之 組合與雙特異性抗體療法相比。 雙特異性 <EGFR-IGF1R>抗體 OA-GA201-scFab-Akl8—WT 在s.c BxPC3異種移植模型（資料未圖示）中顯示強抗腫瘤功 效。 實例8 製備雙特異性<egfr-igfir>抗體之糖基工程改造衍生物 雙特異性 <丑0?11-10?111>抗體之糖基工程改造衍生物係 藉由使用磷酸鈣轉染法共轉染HEK293-EBNA細胞與哺乳 154378.doc -73- 201138821 動物抗體重鏈與輕鏈表現載體來製得。藉由磷酸奶法轉染 指數式生長之HEK293-EBNA細胞。為產生未經修飾之抗* 體，僅用抗體重鏈及輕鏈表現載體以1:1比率轉染該等細 胞。為產生糖基工程改造之抗體’用四種質體（兩種用於 抗體表現、一種用於融合GnTIII多肽表現，一種用於甘露 糖苷酶II表現）以相應4:4:1:1之比率共轉染該等細胞。使用 補充有10% FCS之DMEM培養基使細胞於T燒瓶中生長成* 附著單層培養物，且當其達到50至80%匯合度時轉染、細 胞。為轉染T75燒瓶，在轉染前24小時，將750(至800)萬 個細胞接種於約14 ml補充有FCS(最終10% V/V)(最終250 pg/ml新黴素）之DMEM培養基中，且將細胞置於37°C下、 於具有5% C02氛圍之培育箱中隔夜。對於待轉染之各T75 燒瓶，藉由混合在輕鏈與重鏈表現載體之間等分之47 總質體載體DNA、23 5 μΐ 1 M CaCl2溶液，且將添加水達 到469 μΐ之最終體積來製備DNA、CaCl2及水之溶液。向此 溶液中添加 469 μΐ 5 0 mM HEPES、280 mM NaCl、1-5 mM Na2HP04溶液（pH 7.05)，立即混合10秒且保持在室溫下靜 置20秒。以約12 ml補充有2% FCS之DMEM稀釋懸浮液， 且添加至T75中以替代現有培養基。在37°C、5% C02下培 育細胞約17至20小時，接著以約12 ml DMEM、10% FCS 更換培養基。轉染後5至7曰收集改良性培養基、在2 10-300 *g下離心5分鐘、經由0.22 μιη過濾器滅菌過濾（或替代 性地，在1200 rpm下離心5分鐘，接著在4000 rpm下第二 次離心10分鐘）且保持在4°C下。 154378.doc •74· 201138821 藉由蛋白質A親和層析，最終在Superdex 200管柱 (Amersham Pharmacia)上之尺寸排阻層析步驟’將緩衝液 換為磷酸鹽緩衝生理食鹽水並收集純單體IgGl抗體來純化 所分泌之抗體。使用分光光度計，自280 nm下之吸光度估 算抗體濃度。將該等抗體調配於25 mM磷酸鉀、125 mM氣 化鈉、100 mM甘胺酸溶液（pH 6.7)中。 藉由共轉染抗體表現載體以及GnT-III糖基轉移酶表現 載體或以及GnT-III表現載體加高基甘露糖苷酶Π表現載體 (Golgi mannosidase II expression vector)來製造雙特異性抗 體之糖基工程改造變異體。如上文對非糖基工程改造抗體 所述來純化及調配糖基工程改造抗體。藉由如下所述之 MALDI/TOF-MS測定海藻糖之量來分析連接至抗體之Fc區 的寡醣。 純化糖基工程改造構築體 蛋白質A SEC 產率 單體 產率 單體 OA-GA201 -scFab-Akl 8_WT GE GE(4.2 L) 87.3 mg 92.0% 〔分析性SEC) 65.1 mg 100.0% (分析性SEC) 寡醣係藉由PNGaseF消化自抗體酶促釋放，其中該等抗 體固定於PVDF膜上或呈溶液形式。 製備含有所釋放募醣之所得消化溶液直接用於 MALDI/TOF-MS分析或以EndoH醣苷酶進一步消化上述溶 液，隨後製備樣本以進行MALDI/TOF-MS分析。對於所有 本發明之抗體，GE均意謂經糖基工程改造。 實例9 154378.doc -75· 201138821 雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體與FcgRIIIa之結合及ADCC 能力 既定抗體介導ADCC之程度不僅視所結合之抗原而定， 而且視恆定區對FcgRIIIa(稱為觸發ADCC反應之Fc受體）之 親和力而定。為分析雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體與FcgRIIIa 之結合，應用Biacore技術。藉由此技術，評定雙特異性 <EGFR-IGF1R>抗體與重組產生之FcgRIIIa域的結合。 所有表面電漿子共振量測均在BIAcore 3000儀器（GE Healthcare Biosciences AB，瑞典）上在25°C 下進行。操作 緩衝液及稀釋緩衝液為PBS(1 mM KH2P〇4、10 mM Na2HP04、137 mM NaCl、2.7 mM KCl)(pH 6.0)、0.005% (v/v)Tween20。將可溶性人類FcgRIIIa於10 mM乙酸納（pH 5.0)中稀釋且使用標準胺偶合套組（GE Healthcare Biosciences AB,瑞典）固定於CM5生物感測晶片上以獲得 約1000 RU之FcgRIIIa表面密度。在固定期間將HBS-P( 10 mM HEPES(pH 7.4)、150 mM NaCl、0.005%界面活性劑 P20; GE Healthcare Biosciences AB，瑞典）用作操作緩衝 液。以PBS、0.005%(v/v)Tween20(pH 6_0)將 XGFR雙特異 性抗體稀釋至450 nM之濃度，且以30微升/分鐘之流動速 率經 3 分鐘注射。接著，以 PBS(pH 8.0)、0.005%(v/v)Tween20 使感應晶片再生1分鐘。用BIAevaluation軟體（BIAcore,瑞 典）進行數據分析。 分析雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體對FcgRIIIa之結合能 力至何程度亦體現為對腫瘤細胞之活體外ADCC活性，在 154378.doc -76- 201138821 細胞檢測中測定adcc能力。對於此等檢測，製備雙特異 性<EGFR-IGF1R>抗體之經糖基修飾之衍生物（參看上文） 且在如下所述之BIAcore ADCC能力檢測型式以及活體外 ADCC檢測中加以測試。 人類周邊血液單核細胞（PBMC)用作效應細胞且使用 Histopaque-1077(Greiner Leucosep # 227288) ’ 基本上按照 製造商說明書來製備。簡言之，用肝素化注射器自健康志 願者取靜脈血。以？63(不含有€3++或]^8++)將血液1:0.75-1.3稀釋且層加於Histopaque-1077上。在室溫（RT)下在 80〇xg下不間斷離心梯度歷時30分鐘。收集含有PBMC之中 間相且以PBS(每來自兩個梯度之細胞50 ml)洗滌，且藉由 在室溫下在40〇xg下離心10分鐘來收集。以PBS再懸浮集 結塊之後，計數PBMC且藉由在室溫下在40〇xg下離心10分 鐘進行第二次洗滌。接著將細胞再懸浮於隨後程序之適當 培養基中。 用於ADCC檢測之效應物與目標之比對於PBMC為25:1。 在AIM-V培養基中以適當濃度製備效應細胞以便每圓底96 孔板孔添加50微升。目標細胞為於含有10% FCS之DMEM 中生長的人類EGFR/IGFR表現細胞（例如H322M、A549或 MCF-7)。 在PB S中洗蘇目標細胞，計數且調節為1 X 10E6個細胞/毫 升。在 37°C/5% C02下以 Calcein ΑΜ(10 μΜ)標記細胞 30分 鐘。標記之後，細胞於PBS中洗滌兩次且以5000個細胞/孔 接種於96孔圓底板中50 μ1(ΑΙΜ-Υ培養基）中。將抗體於 154378.doc -77- 201138821 AIM-V中稀釋，以5〇 μι添加於中預塗之目標細胞。接著添 加效應細胞且在37°C下在含有5% C〇2之含濕氣氛圍中培育 該板4小時。在培育期之後，將板在2〇〇 g下離心1〇分鐘且 將80 μΐ上清液轉移至底部透明之黑色螢光板中，且用
Tecan Infinite讀取器量測螢光（Εχ 485 nm/Em 535 nm)。 檢測中包括以下對照物： -背景：50 μΐ上清液_在標記細胞之後等分+〗〇〇 μ1培養基 -自發溶解：50 μΐ目標細胞懸浮液+丨〇〇 μ1培養基 _最大溶解：50 μΐ目標細胞懸浮液+ 100 μΐ培養基/1,5% Triton Χ-100
-不含抗體之溶解對照物：5〇 μ1目標細胞懸浮液+5〇…培 養基+50 μΐ PBL 如下計算抗體依賴性細胞毒性％ : ADCC %=χ-自發釋放/最大溶解-自發溶解X 1 〇〇 實例10 分析雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體之糖結構 為測定含海藻糖之寡醣結構與含非海藻糖（n〇n_fuc〇se/a_ fucose)之养醣結構的相對比率，藉由MALDI_T〇f質譜法分 析經純化抗體物質所釋放之聚糖。為此，將抗體樣本（約 50 Kg)與 5 mU N-醋苷酶 F(Prozyme# GKE-5010B)在 37。(：下 於〇_1 Μ磷酸鈉緩衝液（pH 6_〇)中一起培育隔夜，以自蛋白 貝主鏈釋放寡醣。隨後，分離釋放之聚糖結構且使用 NUTiP-Carb〇n吸移管尖（獲自 Glygen: NuTipl l〇 ^，目錄 號NT1CAR)脫鹽。作為第一步，NuTipCarb〇n吸移管尖藉 154378.doc -78- 201138821 由用3 μί 1 M NaOH，接著用20 pL純水（例如來自Baker之 HPLC梯度級，#4218)、3 pL 3 0% v/v乙酸及再次用20 μΐ純 水洗滌來準備用於結合寡醣。為此，將各別溶液加載於 NuTip-Carbon吸移管尖中之層析材料的頂部且迫使通過該 層析材料。之後，藉由將上述N-醣苷酶F消化物上下牵拉 四至五次，使對應於10 pg抗體之聚糖結構結合至NuTip-Carbon吸管尖中之物質。以如上所述之方式以20 pL純水 洗滌結合至NuTip-Carbon吸移管尖中之物質之聚糖且分別 以0.5 μί 10%及2.0 μί 20%乙腈逐步溶離。對於此步驟， 將溶離溶液填充於0.5 mL反應小瓶中且上下牽拉各四至五 次。對於藉由MALDI-Tof質譜法分析，合併兩種溶離液。 對於此量測，在MALDI目標上混合0.4 pL經合併之溶離液 與1.6 μί SDHB基質溶液（溶解於20%乙醇/5 mM NaCl中之 2.5-二羥基苯甲酸/2-羥基-5-甲氧基苯曱酸[Bruker Daltonics #209813]，5 mg/ml)，且用經適當調整之Bruker Ultraflex TOF/TOF儀器加以分析。通常，記錄50-300次注 射且總計達單一實驗。藉由撓曲分析軟體（Bruker Daltonics) 評估所得光譜且確定偵測到之各峰之質量。隨後，藉由比 較各別結構（例如分別具有或不具有海藻糖之複合物、雜 合物及寡或高甘露糖）經計算之質量與理論上預期之質 量，將峰指定為含海藻糖或非海藻糖之糖結構。 為測定雜合物結構之比率，以N-醣苷酶F及内切醣苷酶 Η同時消化抗體樣本，N-醣苷酶F自蛋白質主鏈釋放所有 Ν-連接聚糖結構（複合物、雜合物及募甘露糖及高甘露糖 154378.doc •79- 201138821 結構），而内切醣苷酶Η裂解另外在兩個在聚糖還原端之 GlcNAc殘基之間的所有雜合物型聚糖。隨後藉由MALDI-Tof質譜法，以與上文對N-醣苷酶F消化樣本所述相同之方 式處理及分析此消化物。藉由比較由N-糖普酶F消化物所 得之圖案與由經合併N-醣苷酶F/内切Η消化物所得之圖 案，使用特異性糖結構之信號的減小程度來估算雜合物結 構之相對含量。 由個別糖結構之峰高與偵測到之所有糖結構之峰高之和 的比率計算各糖結構之相對量。海藻糖之量為關於含海藻 糖之結構相對於在Ν-醣苷酶F處理之樣本（例如分別為複合 物、雜合物及寡甘露糖及高甘露糖結構）中鑑別之所有糖 結構的百分比。非海藻糖基化之量為缺乏海藻糖之結構相 對於在Ν-醣苷酶F處理之樣本（例如分別為複合物、雜合物 及寡甘露糖及高甘露糖結構）中鑑別之所有糖結構的百分 比。 對OA-GA201-scFab-Akl8_WT測定之海藻糖之量在25% 與40%之間。 實例11
雙特異性<£0卩11-10卩111>抗體與具有不同EGFR及IGF-1R 表現之細胞的結合 人類抗 IGF-1R抗體 <IGF-1R>HUMAB 純系 18 (DSM ACC 2587)結合表現IGF-1R之細胞且人類化大鼠抗EGFR抗體 ICR62結合在表面上表現EGFR之細胞。為評估雙特異性 <EGFR-IGF 1 R>抗體較之單特異性二價抗體對EGFR及IGF- 154378.doc -80 - 201138821 1R之結合特性’對具有不同IGF-1R/EGFR表現比之細胞進 行競爭結合檢測。 將於冰冷緩衝液（PBS + 2% FCS，Gibco)中稀釋之人類腫 瘤細胞（例如 A549、TC-71、MDA-MB-23 1，2χ105個細胞 / 孔）添加至96孔微量滴定板中經標記單特異性抗體（HUMAB 純系18或人類化大鼠抗EGFR抗體ICR62)(最終濃度為1 pg/ml)與不同濃度之未標記<EGFR-IGF1R>抗體或未標記 單特異性抗體或Fab片段（作為對照物）（最終滴定範圍為1 〇〇 Ο 至0.002 pg/ml)之混合物中。在冰上培育混合物45分鐘。 藉由添加150-200 μΐ緩衝液（PBS + 2% FCS)洗務細胞2次’ 隨後離心（3 00 g ; 5分鐘，4°C )。接著將細胞再懸浮於含有 6.25 μΐ/ml 7-AAD(BD #559925)之 200 μΐ 固定缓衝液（lx CellFix, BD#3 40181)中且在冰上培育10-20分鐘以使死細胞 中之7-AAD固定及滲透。藉由FACS分析樣本之螢光信號 且計算IC50值。 相對於<IGF-1R>HUMAB純系18之競爭結合分析之結果 〇 (IC50值）示於表X中。可能由於雙特異性抗體同時結合 IGF-1R與EGFR兩者之能力（親合力效應），在表現IGF-1R 與EGFR兩者之A549腫瘤細胞上，雙特異性〈EGFR-IGF1R>抗體 OA-GA201-scFab-Akl8_WT之結合優於 <IGF-1R>HUMAB純系 18(約 3倍）且優於 <IGF-1R>HUMAB 純系 18 Fab片段（約30倍）。在表現IGF-1R而不表現EGFR之TC-71 腫瘤細胞上，<EGFR-IGF1R> 抗體 OA-GA201-scFab· Akl8_WT之結合與<IGF-1R>HUMAB純系18 Fab片段相 154378.doc • 81 - 201138821 當。在此背景中，若僅表現IGF-1R而不表現EGFR，則 OA-GA201-scFab-Akl8_WT僅能以一個結合臂結合IGF-1R。 可利用雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體較強地結合表現 IGF-1R及EGFR之細胞的此能力以便較之單特異性IGF-1R 及EGFR靶向抗體實現對腫瘤組織之優良靶向且可能產生 有利安全概況及PK特性。 細胞株 測試化合物(未標記） 競爭化合物(經標 記） 1號實驗 IC50 fnMl 2號實驗 IC50 fnMl A549 <IGF-1 R>HUM AB 純系 18 <IGF-1R>HUMAB 純系18 1.6 1.5 A549 <IGF-1R>HUMAB 純系 18 Fab片段 <IGF-1R>HUMAB 純系18 21.1 19.3 A549 <EGFR-IGF 1 R>抗體 0 A-GA201-scFab-Akl8 WT <IGF-1R>HUMAB 純系18 0.6 0.6 TC-71 <IGF-1R>HUMAB 純系 18 <IGF-1R>HUMAB 純系18 1.4 1.5 TC-71 <IGF-1 R>HUMAB 純系 18 Fab片段 <IGF-1R>HUMAB 純系18 24.6 26.2 TC-71 <EGFR-IGF 1 R>抗體0八-GA201-scFab-Akl8 WT <IGF-1R>HUMAB 純系18 24.3 24.9 【圖式簡單說明】 圖1特異性結合第一抗原1，具有包含典型順序之可變域 及恆定域之兩對重鏈及輕鍵，無CH4域的全長抗體之示意 性結構。 圖2本發明之雙特異性抗體的示意性結構。 圖3a及3b包括杵入臼修飾之CH3域的本發明之雙特異性 抗體之示意性結構。 圖4a及4b包括杵入臼修飾之CH3域及第二抗體重鏈及輕 154378.doc -82- 201138821 鏈之VH及VL域之二硫鍵穩定的本發明之雙特異性抗體的 示意性結構。 圖5本發明之雙特異性抗體Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06對HUVEC增殖之抑制。 圖6本發明之雙特異性抗體Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06對Tie2構酸化之抑制。 圖 7 OA-Akl8-scFab-GA201(圖 7a)及 OA-GA201-scFab-Akl8(圖7b)之西方墨點（還原）。 囷 8 雙特異性〈EGFR-IGF1R〉抗體 OA-GA201-scFab-Akl8_WT(劑量依賴性）較之親本單特異性抗體<IGF-1R>HUMAB純系18或<EGFR>ICR62對H322M癌細胞生長 的抑制。 囷9 Biacore(表面電漿子共振）-感測器圖譜：雙特異性抗 體OA-GA201-scFab-Akl8_WT顯示同時結合胺偶合人類 EGFR與人類.IGFlR(x轴：反應，y軸：時間）。 【主要元件符號說明】 101 抗原1 102 hr(绞鍵區） 103 重鏈（HC) 104 VH 105 CH1 106 CH2 107 CH3 108 輕鏈（LC) 154378.doc 201138821 109 VL 110 CL 201 第一 抗原 202 VH 203 CHI 204 CH2 205 CH3 206 VL 207 CL 208 第二 抗原 209 肽連接子 301 第一 抗原 302 VH 303 CHI 304 CH2 305 「臼 」-C 306 VL 307 CL 308 第二 抗原 309 肽連接子 310 「杵 j -C 401 第一 抗原 402 VH 403 CH1 154378.doc 84 201138821 Ο Ο 404 CH2 405 「臼」-CH3 406 VL 407 CL 408 第二抗原 409 VH-VL二硫橋 410 肽連接子 411 「杵」-CH3 154378.doc -85- 201138821 序列表 <110〉瑞士商羅齊克雷雅公司 〈12〇>雙特異性抗體
<130〉 26643 FT <140〉 100109958 <141〉 2011-03-23 <150> 10003270.5 〈151> 2010-03-26 <160〉 16 <170> Patentln version 3.5
<211〉 448 <212> PRT <213〉人工 <220> <223〉<IGF-1R>重鏈，OA-Akl8-scFab-GA201(+WT) <400> 1
Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15 ❹
Ser Gin Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala lie lie Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 154378-序列表.doc 201138821
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110
Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 250 255 2- 】54378-序列表.doc 201138821
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
O
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Cys Thr Leu 340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365
O
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 154378-序列表 _doc 201138821
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210〉 2 <211〉 215 <212〉 PRT 〈213〉 人工 <220〉 <223〉<IGF-1R>輕鏈，OA-Akl8-scFab-GA201(+WT) <400〉 2
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 1S4378-序列表.doc 201138821 115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140
Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160
Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 3 <211〉 695 <212> PRT <213〉 人工 〈220〉
<223〉<EGFR>肽連接之重鏈與輕鏈，具有二硫鍵穩定VH 44/VL100， OA-Ald8-scFab-GA201 <400〉 3
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Asn Asn Tyr 20 25 30 154378-序列表.doc 201138821
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu He 35 40 45
Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 154378-序列表.doc 201138821
Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val 245 250 255
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe 260 265 270
O
Thr Phe Thr Asp Tyr Lys lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin 275 280 285
Cys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr 290 295 300
Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser 305 310 315 320
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 325 330 335
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met 340 345 350
Asp Ala Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 355 360 365
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 370 375 380 154378-序列表.doc 201138821
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 385 390 395 400
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 405 410 415
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 420 425 430
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys 435 440 445
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 450 455 460
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 465 470 475 480
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 485 490 495
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 500 505 510
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 515 520 525
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 530 535 540
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 545 550 555 560 154378·序列表.doc 201138821
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 565 570 575
Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 580 585 590
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 595 600 605
Asn Gin Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 610 615 620
lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 625 630 635 640
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 645 650 655
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 675 680 685
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 690 695 <210> 4 <211> 695 <212> PRT <213〉人工 <220> -9- 154378·序列表.doc 201138821
<223〉<EGFRW：k連接之重鏈與輕鏈，〇A-Akl8-scFab-GA201_WT <400〉 4
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Asn Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160 10· 154378-序列表.doc 201138821
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val 245 250 255
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe 260 265 270
Thr Phe Thr Asp Tyr Lys lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin 275 280 285
G
Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr 290 295 300
Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser 305 310 315 320
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 325 330 335 -11 - 154378-序列表.doc 201138821
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met 340 345 350
Asp Ala Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 355 360 365
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O
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O
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Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 675 680 685
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 690 695 700
Gly Lys 705 <210〉 12 <211> 706 <212〉 PRT <213〉 人工 <220〉
<223〉<ANG·2>肽連接之重鏈與輕鏈，Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06 <400〉 12
Gin Pro Gly Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15 -35- 154378-序列表.doc 201138821
Thr Ala Arg lie Thr Cys Gly Gly Asn Asn He Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30
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Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala 245 250 255 ❹
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 260 265 270
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 275 280 285
Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly 290 295 300
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Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp 325 330 335
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O
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O
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O
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Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu lie 20 25 30
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Leu Leu He Val Gly Gly Leu Val lie Met Leu Tyr Val Phe His Arg 945 950 955 960
Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val 965 970 975
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<400〉 15
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Gin Thr Ser Glu lie Asn Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190
Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His He He Gin Leu Gin Ser 195 200 205 lie Lys Glu Glu Lys Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Asn 210 215 220 -57- 154378·序列表.doc 201138821
Ser lie lie Glu Glu Leu Glu Lys Lys lie Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240
Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270
Val Ala Lys Glu Glu Gin lie Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 275 280 285
Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly lie Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300
Ser Thr Glu Glu lie Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320
Gly Trp Thr lie lie Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gin 325 330 335
Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn Gin Gin Arg 355 360 365
Tyr Val Leu Lys lie His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380
Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 58- 154378·序列表.doc 201138821 lie His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys lie Ser Ser lie 405 410 415
Ser Gin Pro Gly Asa Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 420 425 430
Cys lie Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tvr Pro Gin Arg Gin 450 455 460 〇
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly lie Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480
Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met lie Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495
Ser Gly His His His His His His 500
O -59- 154378-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201138821 七、申請專利範圍： 1. 一種雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合第一抗原之第一全長抗體的重鏈及輕鏈； b) 特異性結合第二抗原之第二全長抗體的重鏈及輕鏈， 其中該重鏈之N端經由肽連接子連接至該輕鏈之c 端。 2. 如請求項1之雙特異性抗體，其特徵在於 a)之全長抗體之重鏈的CH3域與b)之全長抗體之重鏈 的CH3域各在該等抗體CH3域之間的原始界面中包含改 變的界面會合； 其中i)在一條重鏈之CH3域中 一個胺基酸殘基被一個具有較大側鏈體積之胺基酸殘 基置換’藉此在一條重鏈之CH3域的界面内產生隆凸， 其可位於另一條重鏈之CH3域的界面内之空腔中 且其中 ii)在另一條重鏈之CH3域中 一個胺基酸殘基被一個具有較小側鏈體積之胺基酸殘 基置換，藉.此在第二CH3域之界面内產生空腔，第一 CH3域之界面内之隆凸可位於該空腔中。 3. 如請求項2之雙特異性抗體，其特徵在於 具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基係選自由精胺酸 (R)、苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸（W)組成之群，且 具有較小側鏈體積之該胺基酸殘基係選自由丙胺酸 (a)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)組成之群。 154378.doc 201138821 4. 如請求項2或3之雙特異性抗體，其特徵在於 兩個CH3域係藉由在各CH3域之相應位置中引入半胱 胺酸（C)胺基酸，使得兩個CH3域之間可形成二硫橋而進 一步改變。 5. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其特徵在於 b)之第二全長抗體之重鏈及輕鏈的抗體重鏈可變域 (VH)及抗體輕鏈可變域（VL)係藉由在以下位置之間引入 二硫鍵來用二硫鍵穩定： i) 重鏈可變域位置44與輕鏈可變域位置100之間， ii) 重鏈可憂域位置1〇5與輕鍵可變域位置43之間，或 111)重鏈可變域位置1〇1與輕鏈可變域位置之間。 6·如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體包 含IgGl之恒定區。 7.如請求項1之雙特異性抗體，其特徵在於 a) °亥苐 全長抗體特異性結合IGF-1R且包含具有seq ID N〇: 1胺基酸序列的重鏈’及具有SEQ ID NO: 2胺 基酸序列的輕鏈，且 b) 該第二全長抗體特異性結合EGFR且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該肽連接之重鏈與輕鏈具 有SEQ id N〇: 3胺基酸序列。 8·如请求項1之雙特異性抗體，其特徵在於 )S第 王長抗體特異性結合IGF-1R且包含具有 ID N〇: 1胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 2胺 基酸序列的輕鏈，且 154378.doc 201138821 b)該第二全長抗體特異性結合EGFR且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該肽連接之重鏈與輕鏈具 有SEQ ID NO: 4胺基酸序列。 9. 如請求項1之雙特異性抗體，其特徵在於 a) 該第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，且 b) 該第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該肽連接之重鏈與輕鏈具 有SEQ ID NO: 7胺基酸序列。 10. 如請求項1之雙特異性抗體，其特徵在於 a) 該第一全長抗體特異性結合EGFR且包含具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 6胺基 酸序列的輕鏈，且 b) 該第二全長抗體特異性結合IGF-1R且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該肽連接之重鏈與輕鏈具 有SEQ ID NO: 8胺基酸序列。 11. 如請求項1之雙特異性抗體，其特徵在於 a) 該第一全長抗體特異性結合VEGF且包含具有SEQ ID NO: 9胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 10胺基 酸序列的輕鏈，且 b) 該第二全長抗體特異性結合ANG-2且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具有 SEQ ID NO: 11胺基酸序列。 154378.doc 201138821 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 如請求項1之雙特異性抗體，其特徵在於 a) 該第一全長抗體特異性結合vegf且包含具有SEQ ID NO: 9胺基酸序列的重鏈，及具有犯卩id NO: 10胺基 酸序列的輕鏈，且 b) 該第二全長抗體特異性結合anG_2且包含重鏈經由肽 連接子連接至該輕鏈，其中該連接之重鏈與輕鏈具有 SEQ ID NO: 12胺基酸序列。 如請求項6之雙特異性抗體，其中該抗體在Asn297經糖 鏈糖基化，其中該糖鏈内海藻糖之量為65%或65%以 下。 如請求項7至1〇中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體 在Asn297經糖鏈糖基化，其中該糖鏈内海藻糖之量為 6 5 %或6 5 %以下。 一種醫藥組合物，其包含如請求項丨至14中任一項之抗 體。 如請求項1至3及7至12中任一項之雙特異性抗體’其係 用於治療癌症。 一種如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體的用途， 其係用於製備供治療癌症用之藥物。 一種核酸分子，其編碼如請求項i至14中任一項之雙特 異性抗體之鏈。 ^ 一種含有如請求項18之核酸的表現載體，其能夠在原核 或真核宿主細胞中表現該核酸。 一種原核或真核宿主細胞，其包含如請求項19之载體。 154378.doc 201138821 21. —種製備如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體的方 法， 其包含以下步驟： a) 以包含編碼以下物質之核酸分子的載體轉型宿主細 胞： aa) 特異性結合第一抗原之第一全長抗體的重鏈及輕 鏈；及 ab) 特異性結合第二抗原之第二全長抗體的重鏈及輕 鏈，其中該重鏈之N端經由肽連接子連接至輕鍵 之C端；及 b) 在允許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞；及 c) 自該培養物回收該抗體分子。 22. —種特異性結合人類IGF-1R及人類EGFR之雙特異性抗 體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及 SEQ ID NO: 3胺基酸序列。 23· —種特異性結合人類IGF-1R及人類EGFR之雙特異性抗 體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及 SEQ ID NO: 4胺基酸序列。 24. —種特異性結合人類IGF-1R及人類EGFR之雙特異性抗 體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及 SEQ ID NO: 7胺基酸序列。 25. —種特異性結合人類IGF-1R及人類EGFR之雙特異性抗 體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及 SEQ ID NO: 8胺基酸序列。 154378.doc 201138821 26. 如請求項22至25中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體 在Asn297經糖鏈糖基化，其中該糖鏈内海藻糖之量為 65%或65%以下。 27. —種特異性結合人類VEGF及人類ANG-2之雙特異性抗 體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 11胺基酸序列。 28. —種特異性結合人類VEGF及人類ANG-2之雙特異性抗 體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 12胺基酸序列。 154378.doc
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