RU2642589C2 - Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia by determination of adenosine triphosphate concentrations in mitochondria - Google Patents
Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia by determination of adenosine triphosphate concentrations in mitochondria Download PDFInfo
- Publication number
- RU2642589C2 RU2642589C2 RU2016124213A RU2016124213A RU2642589C2 RU 2642589 C2 RU2642589 C2 RU 2642589C2 RU 2016124213 A RU2016124213 A RU 2016124213A RU 2016124213 A RU2016124213 A RU 2016124213A RU 2642589 C2 RU2642589 C2 RU 2642589C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chemotherapy
- mitochondria
- cell
- biomarker
- children
- Prior art date
Links
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 title claims abstract description 14
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 23
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 title claims description 20
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 9
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims 1
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 claims 1
- 240000001090 Papaver somniferum Species 0.000 claims 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000599862 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 3 Proteins 0.000 description 3
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биофизики, а именно к медицинской физике, и описывает способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), в частности, прогнозирования рисков возникновения лекарственной резистентности при проведении химиотерапии у пациентов с ОЛЛ с помощью исследования свойств биологических жидкостей физическими методами. Способ включает в себя определение и оценку количественных уровней концентрации аденозинтрифосфата (АТФ), в клетках крови, методом лазерной конфокальной микроскопии, после получения курса химиотерапии пациентом. Изобретение может быть использовано в онкологии, в клинической лабораторной практике для индивидуального прогнозирования эффективности химиотерапии при лечении острых лимфобластных лейкозов у детей.The invention relates to the field of biophysics, namely to medical physics, and describes a method for predicting the effectiveness of chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL), in particular, predicting the risks of drug resistance during chemotherapy in patients with ALL by studying the properties of biological fluids physical methods. The method includes determining and evaluating quantitative levels of adenosine triphosphate (ATP) concentration in blood cells by laser confocal microscopy after receiving a course of chemotherapy by a patient. The invention can be used in oncology, in clinical laboratory practice for individual prediction of the effectiveness of chemotherapy in the treatment of acute lymphoblastic leukemia in children.
Известно изобретение «Способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей» (патент РФ №2542505, 2013 г., G01N 33/49), содержащее сходный с используемым в заявляемом способе принцип выбора молекулярных маркеров химиочувствительности новообразований.The invention is known "A method for predicting the effectiveness of chemotherapy in patients with malignant neoplasms of epithelial tissues" (RF patent No. 2542505, 2013, G01N 33/49), containing the principle of choosing molecular markers of chemosensitivity of neoplasms used in the claimed method.
Недостатком этого способа является то, что с его помощью не представляется возможным производить работу с флуоресцентными маркерами, а именно обеспечивать их использование для определения концентраций АТФ в митохондриях клеток крови, что позволит производить оценку степени гепатотоксических эффектов и степени лекарственной резистентности, необходимых для индивидуализации химиотерапии (и ее эффективности) у пациентов.The disadvantage of this method is that with its help it is not possible to work with fluorescent markers, namely, to ensure their use for determining the concentrations of ATP in the mitochondria of blood cells, which will make it possible to assess the degree of hepatotoxic effects and the degree of drug resistance necessary for individualizing chemotherapy ( and its effectiveness) in patients.
За прототип изобретения выбран способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными опухолями эпителиальных тканей, включающий в себя исследование крови до и после лечения с количественным определением содержания CD50+ антигена (Алясова А.В. Клинико-неврологические и клинико-иммунологические характеристики рака молочной железы: Автореф. дис. д.м.н., Иваново, 2004, 43 с.).For the prototype of the invention, a method for predicting the effectiveness of chemotherapy in patients with malignant tumors of epithelial tissues was selected, including a blood test before and after treatment with a quantitative determination of the content of CD50 + antigen (Alyasova A.V. Clinical and neurological and clinical and immunological characteristics of breast cancer: Abstract of thesis, MD, Ivanovo, 2004, 43 pp.).
Описанный в прототипе способ осуществляется следующим образом: иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводят с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции. Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови гепаринизированную кровь, разведенную на 1/3 средой 199, наслаивают на градиент фиколл-верографина (9 объемов крови на 3 объема градиента) и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 40 минут при 20°С. Мононуклеарные клетки собирают из интерфазы, а затем трижды отмывают средой 199. При этом центрифугируют в течение 20 минут при 1200 об/мин.The method described in the prototype is as follows: immunophenotyping of peripheral blood mononuclear cells is carried out using the indirect immunofluorescence method. To isolate peripheral blood mononuclear cells, heparinized blood diluted 1/3 with medium 199 is layered on a ficoll-verographin gradient (9 blood volumes per 3 gradient volumes) and centrifuged at 1700 rpm for 40 minutes at 20 ° C. Mononuclear cells are harvested from interphase and then washed three times with 199 medium. At the same time, they are centrifuged for 20 minutes at 1200 rpm.
На обезжиренное предметное стекло, предварительно покрытое парафилмом фирмы American Can Company, имеющим круглые перфорации диаметром 7 мм, наносят по 20-50 мкл поли-L-лизина Serva в концентрации 50 мкг/мл. Предметное стекло помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°С. Затем его отмывают физиологическим раствором, забуференным 0,01 молярным фосфатным буфером рН 7,4. Суспензию клеток в концентрации 2-106 кл/мл наносят по 40 мкл в лунки на предметное стекло. Предметное стекло выдерживают 30 минут при 37°С во влажной камере. Затем не прикрепившиеся к стеклу клетки отсасывают пипеткой и наносят в лунки раствор моноклональных антител (МКА) объемом 40 мкл. В контрольных образцах клетки обрабатывают физиологическим раствором взамен МКА.A 20-50 μl Serva poly-L-lysine at a concentration of 50 μg / ml is applied to a fat-free glass slide, previously coated with paraffilim of the American Can Company, having round perforations with a diameter of 7 mm. A glass slide is placed for 30 minutes in a thermostat at a temperature of 37 ° C. Then it is washed with physiological saline, buffered with 0.01 molar phosphate buffer pH 7.4. A suspension of cells at a concentration of 2-10 6 cells / ml is applied to 40 μl per well on a glass slide. The slide is kept for 30 minutes at 37 ° C in a humid chamber. Then the cells that are not attached to the glass are aspirated with a pipette and a solution of monoclonal antibodies (MCA) of 40 μl is applied to the wells. In control samples, cells are treated with saline instead of MCA.
Вновь инкубируют стекла при 37°С во влажной камере в течение 30 минут, после чего отмывают их в пяти порциях физиологического раствора с фосфатным буфером рН 7,4. На отмытые клетки наслаивают по 40 мкл ФИТЦ-меченных фрагментов козьих антител против мышиных иммуноглобулинов производства НПК Препарат и стекла инкубируют на льду во влажной камере в течение 30 минут. Затем стекла промывают в пяти порциях физиологического раствора с фосфатным буфером рН 7,4, заливают 50%-ным глицерином в физиологическом растворе и препарат закрывают предметными стеклами. Просмотр препаратов проводят с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И2. Учитывают свечение при увеличении объектива × 40-100, окуляра × 2,5-10. Люминесценцию клеточной поверхности регистрируют визуально. В препарате просчитывали 200-300 клеток. Учитывают общее количество клеток и антиген-положительных клеток. Затем подсчитывают относительное содержание антиген-положительных клеток.The glasses were again incubated at 37 ° C in a humid chamber for 30 minutes, after which they were washed in five portions of physiological saline with phosphate buffer pH 7.4. 40 μl of FITC-labeled goat antibody fragments against mouse immunoglobulins produced by NPK are layered onto washed cells. The preparation and glasses are incubated on ice in a humid chamber for 30 minutes. Then the glasses are washed in five portions of physiological saline with phosphate buffer pH 7.4, pour 50% glycerol in saline and the drug is closed with glass slides. Viewing drugs is carried out using a luminescent microscope LUMAM-I2. Take into account the glow with an increase in the lens × 40-100, eyepiece × 2.5-10. Cell surface luminescence is recorded visually. 200-300 cells were counted in the preparation. Take into account the total number of cells and antigen-positive cells. Then calculate the relative content of antigen-positive cells.
В результате проведенных исследований было показано, что изменение содержания CD50+ клеток является устойчивым признаком, позволяющим прогнозировать исход заболевания. Снижение уровня этой популяции по окончании лечения не менее чем в 1,2-1,6 раза, по сравнению с ее содержанием перед 1 курсом ПХТ, особенно на фоне угнетения иммунологической реактивности, свидетельствует о неэффективности проводимой терапии, возможности развития рецидива заболевания в ближайшие 4-5 месяцев или прогрессирования процесса на фоне введения цитостатиков. Напротив, в случаях повышения в процессе лечения исходно сниженного количества CD50+ клеток отмечалось развитие стойкой ремиссии болезни.As a result of the studies, it was shown that a change in the content of CD50 + cells is a stable sign that allows to predict the outcome of the disease. A decrease in the level of this population at the end of treatment by at least 1.2-1.6 times, compared with its content before the first course of PCT, especially against the background of suppression of immunological reactivity, indicates the ineffectiveness of the therapy, the possibility of a relapse in the next 4 -5 months or the progression of the process against the background of the introduction of cytostatics. On the contrary, in cases of an increase in the treatment process of the initially reduced number of CD50 + cells, the development of persistent remission of the disease was noted.
Несовершенство этого способа заключается в недостаточной его автоматизации, а именно, в осуществлении ручным способом подсчета клеток и антиген-положительных клеток, что может приводить к ошибкам в интерпретации результатов эксперимента. Другим недостатком способа является невозможность непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.The imperfection of this method lies in its insufficient automation, namely, in the manual method of counting cells and antigen-positive cells, which can lead to errors in interpreting the results of the experiment. Another disadvantage of this method is the inability to directly monitor the risks of hepatotoxicity and drug resistance in patients.
Задачей предлагаемого изобретения является создание флуоресцентного способа прогнозирования эффективности химиотерапии у больных с острыми лимфобластными лейкозами, обладающего высокой степенью автоматизации ключевых этапов эксперимента, а также обеспечение возможности непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.The objective of the invention is the creation of a fluorescent method for predicting the effectiveness of chemotherapy in patients with acute lymphoblastic leukemia, with a high degree of automation of key stages of the experiment, as well as providing the ability to directly monitor the risks of hepatotoxicity and drug resistance in patients.
Поставленная задача решается тем, что во флуоресцентном способе прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, путем определения концентраций аденозинтрифосфата в митохондриях, при котором производят забор крови до и после химиотерапии, выделяют флуоресцентный макро-биомаркер эффективности химиотерапии, согласно изобретению макро-биомаркером является концентрация аденозинтрифосфата в митохондриях клеток крови, которую определяют автоматизировано, с помощью лазерного конфокального микроскопа, путем регистрации интенсивности флуоресценции макро-биомаркера для непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.The problem is solved in that in the fluorescent method for predicting the effectiveness of chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia by determining the concentration of adenosine triphosphate in mitochondria, in which blood is taken before and after chemotherapy, a fluorescent macro-biomarker of chemotherapy effectiveness is isolated according to the invention, a macro-biomarker of chemotherapy effectiveness is the concentration of adenosine triphosphate in the mitochondria of blood cells, which is determined automatically using a laser confocal mic roscope, by recording the fluorescence intensity of the macro-biomarker for direct monitoring of the risks of hepatotoxicity and drug resistance in patients.
Заявленный способ основан на использовании определения концентрации АТФ методом лазерной конфокальной микроскопии, который начинается с обработки образца после формирования кровяного сгустка (не ранее чем через 30 минут и не более 3 часов после забора крови). Для максимального разделения сыворотки и клеточного осадка используется режим центрифугирования 2000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре.The claimed method is based on the use of determining the concentration of ATP by laser confocal microscopy, which begins with the processing of the sample after the formation of a blood clot (no earlier than 30 minutes and no more than 3 hours after blood sampling). For maximum separation of serum and cell sediment, a centrifugation mode of 2000 rpm is used for 10 minutes at room temperature.
Сыворотка отбирается по 1 мл в криовиалы объемом (1,0-2,0) мл. Пробы хранятся в штативах с крышками, при -80°С до выполнения анализа. При заданном температурном режиме хранения количество жизнеспособных мононуклеарных клеток превышает 25 млн.Serum is taken 1 ml in cryovials with a volume of (1.0-2.0) ml. Samples are stored in tripods with covers at -80 ° C until analysis. At a given storage temperature, the number of viable mononuclear cells exceeds 25 million.
При выполнении анализа образцы размораживаются при комнатной температуре. В ламинарном шкафу, при помощи 0,5 мл и 1-мл механических пипеток периферической крови образцы переносятся в маркированные пробирки типа Фалькон объемом 10 мл.When performing the analysis, the samples are thawed at room temperature. In a laminar cabinet, using 0.5 ml and 1-ml mechanical pipettes of peripheral blood, the samples are transferred into 10 ml labeled Falcon tubes.
Проба разводится стерильным 0,2 молярным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) из расчета 5:1. Уровень рН доводится до 7,8. Образцы центрифугируются на скорости 4000 оборотов в минуту в течение 10 минут при температуре 4°С. Аккуратно удаляется жидкая фаза пипеткой и добавляется 5 мл ФСБ к осадку. Пипеткой объемом 1 мл, осадок разводится в ФСБ и доливается буфер до 5 мл, далее смесь перемешивается. Далее следует дважды повторить процедуру отмывки (центрифугирование образца, удаление жидкой фазы, добавление буфера) при указанных параметрах.The sample is diluted with sterile 0.2 molar phosphate-saline buffer (FSB) at a rate of 5: 1. The pH is adjusted to 7.8. Samples are centrifuged at a speed of 4000 rpm for 10 minutes at a temperature of 4 ° C. The liquid phase is carefully removed with a pipette and 5 ml of FSB is added to the precipitate. With a 1 ml pipette, the precipitate is diluted in FSB and the buffer is added to 5 ml, then the mixture is mixed. Then, the washing procedure should be repeated twice (centrifuging the sample, removing the liquid phase, adding a buffer) at the indicated parameters.
Для выделения митохондрий необходимо выполнить следующую последовательность действий:To isolate mitochondria, you must perform the following sequence of actions:
1) Выделить МНК на феколе клетки для культивирования, затем произвести лизис эритроцитов в течение 15 минут в пропорции 1 к 10 в натрий-фосфатном буфере PBS, затем произвести одну отмывку клеток, для чего произвести центрифугирование в течение 10 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту.1) Isolate the MNCs on the cell culture cell, then red blood cells are lysed for 15 minutes in a ratio of 1 to 10 in PBS sodium phosphate buffer, then one cell washing is performed, for which centrifugation is performed for 10 minutes at a speed of 1500 rpm .
2) Произвести окрашивание митотрекером красным (MitoTracker Red 580). Использовать на 10 мл - 40 мкл красителя, далее инкубировать 20 минут при 37 градусах в CO2 инкубаторе, после инкубации произвести центрифугирование и 1 отмывку в PBS в течение 10 мин на скорости 1500 оборотов в минуту.2) Stain with Mitotracker Red (MitoTracker Red 580). Use 10 ml - 40 μl of the dye, then incubate for 20 minutes at 37 degrees in a CO 2 incubator, after incubation, centrifuge and 1 wash in PBS for 10 minutes at a speed of 1500 rpm.
3) Произвести выделение митохондрий, для чего осадок МНК суспендировать в гипотонической среде (10 MMTrisHCl, рН 7,6) в течение 7 мин; осмотический шок останавливать добавлением 0,25 М сахарозы. Суспензию центрифугировать 10 мин при 600 об/мин, супернатант сохранить, а осадок вторично подвергнуть осмотическому шоку и снова центрифугировать. Супернатанты объединить и центрифугировать 20 мин при 12000 об/мин для осаждения митохондрий. Осадок митохондрий суспендировать в среде, содержащей 0,25 М сахарозу, 2 мМ ЭДТА, KCl 10 мМ, MgCl2, 1 мМ цистеин 0,05%, рН 7,4.3) Produce mitochondria, for which the precipitate of MNCs is suspended in a hypotonic medium (10 MMTrisHCl, pH 7.6) for 7 min; stop the osmotic shock by adding 0.25 M sucrose. Centrifuge the suspension for 10 min at 600 rpm, keep the supernatant, and subject the sediment to osmotic shock again and centrifuge again. Combine supernatants and centrifuge for 20 min at 12,000 rpm to precipitate mitochondria. The sediment of mitochondria is suspended in a medium containing 0.25 M sucrose, 2 mM EDTA, KCl 10 mM, MgCl2, 1 mM cysteine 0.05%, pH 7.4.
4) Произвести инкубацию с клетками (1,2,3 сутки), для чего использовать 500 мл суспензии митохондрий на 3 мл культивируемой среды (1 млн клеток на 1 мл). Далее лизировать образцы (суспензии митохондрий) в течение двух часов при температуре - 80°С. Пробу (суспензии митохондрий) разморозить при комнатной температуре, добавить до 5 мл ФСБ и центрифугировать на скорости 4000 об/мин в течение 4 минут при комнатной температуре. Удалить жидкую фазу пипеткой. Для количественного определения АТФ в клетках использовать ATPBioluminescentAssayKit (BAK). Пипеткой добавить в лунки 96-и луночного плоскодонного культурального планшета ТРР по 0,1 мл исследуемого образца, маркировать лунки планшета. Согласно инструкции производителя BAK подготовить люминицентный реагент, и в объеме 0,1 мл смешать с образцом в лунке. Для каждой серии эксперимента приготовить контрольный образец (смесь стандарта АТФ из BAK и ATPAssayMix из BAK в пропорции 1:1 объемом 0,1 мкл), а также образцы калибровочных кривых согласно инструкции BAK.4) Incubate with cells (1.2.3 days), for which use 500 ml of a suspension of mitochondria per 3 ml of cultured medium (1 million cells per 1 ml). Next, lyse samples (mitochondrial suspensions) for two hours at a temperature of -80 ° C. Thaw the sample (suspension of mitochondria) at room temperature, add up to 5 ml of FSB and centrifuge at 4000 rpm for 4 minutes at room temperature. Remove the liquid phase with a pipette. To quantify ATP in cells, use ATPBioluminescentAssayKit (BAK). Add pipette to the wells of a 96-well flat-bottomed TPR culture plate of 0.1 ml of the test sample, mark the wells of the tablet. According to the manufacturer's instructions, BAK prepare a luminescent reagent, and in a volume of 0.1 ml mix with the sample in the well. For each series of experiments, prepare a control sample (a mixture of ATP standard from BAK and ATPAssayMix from BAK in a 1: 1 ratio with a volume of 0.1 μl), as well as calibration curve samples according to the BAK instructions.
После подготовительных процедур используется 96-и луночный плоскодонный культуральный планшет ТРР. Механической пипеткой подготовленные образцы помещаются в лунки планшета в объеме 0,1 мл, и делается отметка соответствия об их размещении в лабораторном журнале. Согласно инструкции BAK готовится люминесцентный реагент, который в объеме 0,1 мл смешивается с образцом в лунке. Для каждой серии эксперимента подготавливается контрольный образец (смесь стандарта АТФ из BAK и ATPAssayMix из BAK в пропорции 1:1 объемом 0,1 мкл), а также образцы для построения калибровочной кривой, согласно инструкции BAK. Далее значение интенсивности люминесценции регистрируется с помощью детектора конфокального микроскопа. Детекция проводится в спектре свечения люцеферина желтого (в видимом диапазоне ~ 500-700 нм) с ожидаемым максимумом около 536 нм. Для анализа каждой лунки данные снимаются в нескольких точках. Для построения калибровочной кривой используются стандарты в разной степени разведения и без него. После построения калибровочных кривых берутся пробы пациентов с тяжелыми клиническими проявлениями НПР, где проводятся измерения степени интенсивности люминесценции АТФ с помощью лазерного конфокального микроскопа. На основании полученных спектральных данных о пиковой средней величине интенсивности рассчитывалась концентрация АТФ (мг/мл) по формуле:After preparatory procedures, a 96-well flat-bottomed TPP culture plate is used. Using a mechanical pipette, the prepared samples are placed in the wells of a tablet in a volume of 0.1 ml, and a mark of compliance is made about their placement in the laboratory journal. According to BAK instructions, a luminescent reagent is prepared, which in a volume of 0.1 ml is mixed with the sample in the well. For each series of experiments, a control sample is prepared (a mixture of ATP standard from BAK and ATPAssayMix from BAK in a 1: 1 ratio with a volume of 0.1 μl), as well as samples for constructing a calibration curve, according to the BAK instructions. Further, the luminescence intensity value is recorded using a confocal microscope detector. Detection is carried out in the spectrum of luminous yellow Luciferin (in the visible range of ~ 500-700 nm) with an expected maximum of about 536 nm. For the analysis of each well, data are taken at several points. To build a calibration curve, standards are used with varying degrees of dilution and without it. After the construction of the calibration curves, samples are taken of patients with severe clinical manifestations of CPD, where the degree of ATP luminescence intensity is measured using a laser confocal microscope. Based on the obtained spectral data on the peak average intensity value, the ATP concentration (mg / ml) was calculated by the formula:
Где Inexp - интенсивность свечения образца, Inst - интенсивность свечения стандарта, [АТФ]st - концентрация АТФ в стандарте бралась равной 0.1 мг/млWhere In exp is the luminescence intensity of the sample, In st is the luminescence intensity of the standard, [ATP] st is the concentration of ATP in the standard was taken equal to 0.1 mg / ml
По результатам подсчитанной концентрации АТФ делается прогностический вывод об эффективности проводимой химиотерапии посредством взятия нормы концентрации АТФ для здоровой функционирующей клетки (1,04±0.14 мг/мл), при которой осуществляется лекарственный транспорт и не наблюдается риска развития гепатотоксических эффектов в данный момент терапии. Концентрация АТФ в клетке более (0,8±0,112) сигнализирует о наступлении апоптоза клетки. Потери АТФ в клетке более 70% (0,312±0,042) сигнализируют о некрозе клеток.Based on the results of the calculated ATP concentration, a predictive conclusion is made on the effectiveness of chemotherapy by taking the norm of ATP concentration for a healthy functioning cell (1.04 ± 0.14 mg / ml), in which drug transport is carried out and there is no risk of hepatotoxic effects at the moment of therapy. ATP concentration in the cell over (0.8 ± 0.112) indicates the onset of cell apoptosis. ATP loss in the cell of more than 70% (0.312 ± 0.042) indicates cell necrosis.
Таким образом, в заявляемом способе, включающем исследование крови до и после лечения, определяют и используют значение концентрации макро-биологического маркера - АТФ в митохондриях клеток крови пациентов, что позволяет произвести прогноз риска возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности пациентов, оценив, таким образом, эффективность проводимой химиотерапии в нужный момент времени.Thus, in the inventive method, including a blood test before and after treatment, the concentration of a macrobiological marker, ATP, in the mitochondria of blood cells of patients is determined and used, which makes it possible to predict the risk of hepatotoxicity and drug resistance of patients, thus evaluating the effectiveness chemotherapy at the right time.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016124213A RU2642589C2 (en) | 2016-06-17 | 2016-06-17 | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia by determination of adenosine triphosphate concentrations in mitochondria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016124213A RU2642589C2 (en) | 2016-06-17 | 2016-06-17 | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia by determination of adenosine triphosphate concentrations in mitochondria |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016124213A RU2016124213A (en) | 2017-12-21 |
| RU2642589C2 true RU2642589C2 (en) | 2018-01-25 |
Family
ID=60762847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016124213A RU2642589C2 (en) | 2016-06-17 | 2016-06-17 | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia by determination of adenosine triphosphate concentrations in mitochondria |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2642589C2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030224422A1 (en) * | 2002-04-08 | 2003-12-04 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Pre-and post therapy gene expression profiling to identify drug targets |
| US20070105165A1 (en) * | 2005-11-04 | 2007-05-10 | Charles Goolsby | Composite profiles of cell antigens and target signal transduction proteins for analysis and clinical management of hematologic cancers |
-
2016
- 2016-06-17 RU RU2016124213A patent/RU2642589C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030224422A1 (en) * | 2002-04-08 | 2003-12-04 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Pre-and post therapy gene expression profiling to identify drug targets |
| US20070105165A1 (en) * | 2005-11-04 | 2007-05-10 | Charles Goolsby | Composite profiles of cell antigens and target signal transduction proteins for analysis and clinical management of hematologic cancers |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JAMROZIAK K., et al., Do polymorphisms in ABC transporter genes influence risk of childhood acute lymphoblastic leukemia? Leuk Res. 2008 Aug;32(8):1173-5. doi: 10.1016/j.leukres.2008.01.009. Epub 2008 Feb 21. * |
| WESOLOWSKA-ANDERSEN A., et al., Genomic profiling of thousands of candidate polymorphisms predicts risk of relapse in 778 Danish and German childhood acute lymphoblastic leukemia patients.Leukemia. 2015 Feb;29(2):297-303. doi: 10.1038/leu.2014.205. Epub 2014 Jul 3. * |
| WESOLOWSKA-ANDERSEN A., et al., Genomic profiling of thousands of candidate polymorphisms predicts risk of relapse in 778 Danish and German childhood acute lymphoblastic leukemia patients.Leukemia. 2015 Feb;29(2):297-303. doi: 10.1038/leu.2014.205. Epub 2014 Jul 3. JAMROZIAK K., et al., Do polymorphisms in ABC transporter genes influence risk of childhood acute lymphoblastic leukemia? Leuk Res. 2008 Aug;32(8):1173-5. doi: 10.1016/j.leukres.2008.01.009. Epub 2008 Feb 21. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016124213A (en) | 2017-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Catenacci et al. | Acquisition of portal venous circulating tumor cells from patients with pancreaticobiliary cancers by endoscopic ultrasound | |
| US20190128870A1 (en) | Diagnostic Methods For Patient Specific Therapeutic Decision Making In Cancer Care | |
| US20150160193A1 (en) | Tumor cell isolation/purification process and methods for use thereof | |
| US20190078153A1 (en) | Method of analyzing genetically abnormal cells | |
| US20230184744A1 (en) | INTERTUMORAL HOMOGENEITY DETERMINED BY MiCK ASSAY | |
| CN108572255A (en) | application of reagent for detecting PD-L1 + circulating tumor cells in screening cancer risk individuals and in prognosis of cancer patients | |
| KR20130061128A (en) | System and method for anticancer drug candidate evaluation | |
| CN105087775A (en) | Method and related kit for detecting c-MET/CEP7 gene status based on rare cells | |
| SA111330026B1 (en) | Kit for diagnosis of a carcinoma and uses thereof | |
| RU2642589C2 (en) | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia by determination of adenosine triphosphate concentrations in mitochondria | |
| RU2647834C2 (en) | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia | |
| WO2016181912A1 (en) | Method for creating equation for computing prognosis in lung adenocarcinoma using immune factors as indexes, and method for predicting prognosis therein | |
| US20140273016A1 (en) | Device and method for the detection and diagnosis of aggressive and metastatic cancer and cancer stem cells employing podocalyxin and tra biomarkers | |
| WO2011058509A1 (en) | Method and kit for the prevention and/or the monitoring of chemioresistance of leukaemia forms | |
| CA3086794A1 (en) | Methods based on the detection of rad51 foci in tumor cells | |
| RU2707083C1 (en) | Method for detecting or recovering/producing a circulating tumor cell using a cell proliferation technique | |
| RU2697395C1 (en) | Method for prediction of idiopathic infertility of men | |
| US20140275292A1 (en) | Systems and methods employing human stem cell markers for detection, diagnosis and treatment of circulating tumor cells | |
| Sung et al. | Success of tumorsphere isolation from WHO grade IV gliomas does not correlate with the weight of fresh tumor specimens: an immunohistochemical characterization of tumorsphere differentiation | |
| JP5574522B2 (en) | Cancer marker and cancer cell testing method | |
| JP7368678B1 (en) | Methods for measuring the relative abundance of specific cell subpopulations in a CD4+ T cell population | |
| US20140274773A1 (en) | Systems and methods for employing podocalyxin and tra human stem cell markers as prognostic markers for aggressive and metastatic cancer | |
| RU2581925C2 (en) | Method for assessing allogenic immune response in short-term mixed mononuclear culture of unrelated donors | |
| Niu | Monitoring and Targeting Metastasis Through Circulating Tumor Cells: From Molecular Profiling to Natural Killer Cell-Based Therapeutics | |
| KR20120059894A (en) | Diagnostic marker and kit for squamous cell carcinoma |