RU2018101730A - Новые ферменты и системы crispr - Google Patents

Claims (104)

1. Способ модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем способ включает доставку к указанному локусу не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где по меньшей мере один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, являются сконструированными способами инженерии, и эффекторный белок образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом-мишенью эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени, где эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V включает C2c1p или C2c3p.

2. Способ по п.1, где представляющий интерес локус-мишень включает ДНК.

3. Способ по п.1 или 2, где модификация представляющего интерес локуса-мишени включает разрыв цепи.

4. Способ по п.1, 2 или 3, где эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-B.

5. Способ по п.1, 2 или 3, где эффекторный белок включает C2c1p.

6. Способ по п.1, 2 или 3, где эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-C.

7. Способ по п.1, 2 или 3, где эффекторный белок включает C2c3p.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где представляющий интерес локус-мишень содержится в молекуле ДНК in vitro.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где представляющий интерес локус-мишень содержится в ДНК в клетке.

10. Способ по п.9, где клетка включает прокариотическую клетку.

11. Способ по п.9, где клетка включает эукариотическую клетку.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где представляющий интерес локус-мишень включает представляющий интерес геномный локус.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где в комплексе с эффекторным белком компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, способен осуществлять или осуществляет специфическое для последовательности связывание комплекса с последовательностью-мишенью представляющего интерес локуса-мишени.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, включает предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и/или предполагаемую последовательность трансактивирующей РНК CRISPR (tracr-РНК).

15. Способ по любому из пп.1-13, где компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, включает предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и не включает никакую последовательность трансактивирующей РНК CRISPR (tracr-РНК).

16. Способ по любому из пп.2-15, где разрыв цепи включает одноцепочечный разрыв цепи.

17. Способ по любому из пп.2-15, где разрыв цепи включает двухцепочечный разрыв цепи.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где эффекторный белок и компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, предоставляются посредством одной или более полинуклеотидных молекул, кодирующих полипептид и/или компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, и где одна или более полинуклеотидных молекул функционально организованы таким образом, чтобы происходила экспрессия полипептидов и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой.

19. Способ по п.18, где одна или более полинуклеотидных молекул содержат один или более регуляторных элементов, функционально организованных таким образом, чтобы происходила экспрессия полипептидов и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой, необязательно где один или более регуляторных элементов включают индуцибельные промоторы.

20. Способ по п.18 или 19, где одна или более полинуклеотидных молекул содержатся в одном или более векторах.

21. Способ по любому из пп.18-20, где одна или более полинуклеотидных молекул содержатся в системе доставки, или способ по п.20, где один или более векторов содержатся в системе доставки.

22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию доставляют посредством носителя для доставки, включающего липосому(ы), частицу(ы), экзосому(ы), микровезикулу(ы), генную пушку или один или более вирусных векторов.

23. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, имеющая характеристики не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, как определено в любом из предшествующих пунктов

24. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, включающая эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, по меньшей мере один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, являются сконструированными способами инженерии и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом-мишенью эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени, где эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V включает C2c1p или C2c3p.

25. Композиция по п.24, где представляющий интерес локус-мишень включает ДНК.

26. Композиция по п.24 или 25, где модификация представляющего интерес локуса-мишени включает разрыв цепи.

27. Композиция по п.24, 25 или 26, где эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-B.

28. Композиция по пп.24, 25 или 26, где эффекторный белок включает C2c1p.

29. Композиция по п.24, 25 или 26, где эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-C.

30. Композиция по п.24, 25 или 26, где эффекторный белок включает C2c3p.

31. Композиция по любому из пп.24-30, где представляющий интерес локус-мишень содержится в молекуле ДНК in vitro.

32. Композиция по любому из пп.24-30, где представляющий интерес локус-мишень содержится в ДНК в клетке.

33. Композиция по п.32, где клетка включает прокариотическую клетку.

34. Композиция по п.32, где клетка включает эукариотическую клетку.

35. Композиция по любому из пп.24-34, где представляющий интерес локус-мишень включает представляющий интерес геномный локус.

36. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где в комплексе с эффекторным белком компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, способен осуществлять или осуществляет специфическое для последовательности связывание комплекса с последовательностью-мишенью представляющего интерес локуса-мишени.

37. Композиция по любому из пп.24-36, где компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, включает предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и/или предполагаемую последовательность трансактивирующей РНК CRISPR (tracr-РНК).

38. Композиция по любому из пп.24-36, где компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, включает предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и не включает никакую последовательность трансактивирующей РНК CRISPR (tracr-РНК).

39. Композиция по любому из пп.25-38, где разрыв цепи включает одноцепочечный разрыв цепи.

40. Композиция по любому из пп.25-38, где разрыв цепи включает двухцепочечный разрыв цепи.

41. Композиция по любому из пп.24-40, где эффекторный белок и компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, предоставляются посредством одной или более полинуклеотидных молекул, кодирующих полипептид и/или компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, и где одна или более полинуклеотидных молекул функционально организованы таким образом, чтобы происходила экспрессия полипептидов и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой.

42. Композиция по п.41, где одна или более полинуклеотидных молекул содержат один или более регуляторных элементов, функционально организованных таким образом, чтобы происходила экспрессия полипептидов и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой, необязательно где один или более регуляторных элементов включают индуцибельные промоторы.

43. Композиция по п.41 или 42, где одна или более полинуклеотидных молекул содержатся в одном или более векторах.

44. Композиция по любому из пп.41-43, где одна или более полинуклеотидных молекул содержатся в системе доставки, или композиция по п.43, где один или более векторов содержатся в системе доставки.

45. Композиция по любому из пп.24-45, где не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию доставляют посредством носителя для доставки, включающего липосому(ы), частицу(ы), экзосому(ы), микровезикулу(ы), генную пушку или один или более вирусных векторов.

46. Векторная система, включающая один или более векторов, причем один или более векторов включают одну или более полинуклеотидных молекул, кодирующих компоненты не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, имеющую характеристики, как определено в любом из пп.1-45.

47. Система доставки, один или более векторов или одну или более полинуклеотидных молекул, причем один или более векторов или полипептидных молекул включают одну или более полинуклеотидных молекул, кодирующих компоненты не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, имеющую характеристики, как определено в любом из пп.1-45.

48. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки по любому из предшествующих пунктов для применения в терапевтическом способе лечения.

49. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки по п.48, где указанный терапевтический способ лечения включает редактирование гена или генома или генную терапию.

50. Эукариотическая клетка, содержащая модифицированный представляющий локус-мишень, где представляющий интерес локус-мишень модифицирован способом или посредством применения композиции по любому из предшествующих пунктов

51. Эукариотическая клетка по п.50, где модификация представляющего интерес локуса-мишени приводит к:

эукариотической клетке, имеющий измененную экспрессию по меньшей мере одного продукта гена;

эукариотической клетке, имеющей измененную экспрессию по меньшей мере одного продукта гена, где экспрессия по меньшей мере одного продукта гена увеличена;

эукариотической клетке, имеющей измененную экспрессию по меньшей мере одного продукта гена, где экспрессия по меньшей мере одного продукта гена снижена; или

эукариотической клетке, имеющей отредактированный геном.

52. Эукариотическая клетка по п.50 или 51, где эукариотическая клетка включает клетку млекопитающего.

53. Эукариотическая клетка по п.52, где клетка млекопитающего включает клетку человека.

54. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки по любому из предшествующих пунктов для применения в:

сайт-специфическом нокауте гена;

сайт-специфическом редактировании генома;

специфической для последовательности ДНК-интерференции; или

мультиплексной модификации способами инженерии генома.

55. Клеточная линия клетки по любому из пп.50-53 или содержащая клетку по любому из пп.50-53, или их потомство.

56. Многоклеточный организм, содержащий одну или более клеток по любому из пп.50-53.

57. Модель на растениях или животных, включающая одну или более клеток по любому из пп.50-53.

58. Продукт гена из клетки по любому из пп.50-53, или клеточной линии по п.55, или организма по п.56, или модели на растениях или животных по п.57.

59. Продукт гена по п.58, где количество экспрессированного продукта гена превышает или является меньшим, чем количество продукта гена из клетки, не имеющей измененной экспрессии или отредактированного генома.

60. Продукт гена по п.58, где продукт гена изменен по сравнению с продуктом гена из клетки, не имеющей измененной экспрессии или отредактированного генома.

61. Клетка, измененная в соответствии со способом или модифицированная способами инженерии таким образом, чтобы она содержала или экспрессировала композицию или ее компонент по любому из предшествующих пунктов.

62. Сконструированная способами инженерии, не встречающаяся в природе система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR)-CRISPR-ассоциированного белка (Cas) (CRISPR-Cas), включающая

a. одну или более полинуклеотидных последовательностей CRISPR-Cas типа V, включающих направляющую РНК (гРНК), которая содержит направляющую последовательность, соединенную с последовательностью прямого повтора, где направляющая последовательность способна гибридизоваться с последовательностью-мишенью, или одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или более последовательностей CRISPR-Cas типа V; и

b. эффекторный белок C2c1 или C2c3, или одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих эффекторный белок C2c1 или C2c3;

где одна или более направляющих последовательностей гибридизуются с указанной последовательностью-мишенью, указанная последовательность-мишень находится с 3'-стороны от прилегающего к протоспэйсеру мотива (PAM), и указанная направляющая РНК образует комплекс с эффекторным белком C2c1 или C2c3.

63. Сконструированная способами инженерии, не встречающаяся в природе векторная система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR)-CRISPR-ассоциированного белка (Cas) (CRISPR-Cas), включающая один или более векторов, содержащих

a. первый регуляторный элемент, функционально связанный с одной или более нуклеотидными последовательностями, кодирующими одну или более полинуклеотидных последовательностей CRISPR-Cas типа V, включающих направляющую РНК, которая содержит направляющую последовательность, соединенную с последовательностью прямого повтора, где направляющая последовательность способна гибридизоваться с последовательностью-мишенью;

b. второй регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей эффекторный белок C2c1 или C2c3;

где компоненты (a) и (b) находятся на одном и том же или различных векторах системы,

где при транскрипции одна или более направляющих последовательностей гибридизуются с указанной последовательностью-мишенью, последовательность-мишень находится с 3'-стороны от прилегающего к протоспэйсеру мотива (PAM), и указанная направляющая РНК образует комплекс с эффекторным белком C2c1 или C2c3.

64. Система по п.62 или 63, где последовательность-мишень находится в клетке.

65. Система по п.62 или 63, где клетка включает эукариотическую клетку.

66. Система по п.62 или 63, где при транскрипции одна или более направляющих последовательностей гибридизуются с последовательностью-мишенью, и направляющая РНК образует комплекс с эффекторным белком C2c1 или C2c3, что вызывает расщепление дистальнее последовательности-мишени.

67. Система по п.66, где указанное расщепление образует ступенчатый двухцепочечный разрыв с 5'-выступающим концом из 4 или 5 нуклеотидов.

68. Система по п.62 или 63, где PAM содержит 5'-тимин-богатый мотив.

69. Система по п.62 или 63, где эффекторный белок представляет собой эффекторный белок C2c1, полученный из видов бактерий, отобранных из группы, состоящей из Alicyclobacillus acidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacillus contaminans (например, DSM 171975), Desulfovibrio inopinaius (например, DSM 10711), Desulfonatronum ihiodismutans (например, штамм MLF-1), бактерий Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (например, DSM 17572), Bacillus thermoamyiovorans (например, линия B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (например, DSM 187134), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM 13609), Citrobacier freundii (например, ATCC 8090), Brevibacilius agri (например, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (например, ORS 2060).

70. Система по п.69, где PAM-последовательность представляет собой TTN, где N представляет собой A/C/G или T, а эффекторный белок являет собой AacC2c1, или где PAM-последовательность представляет собой TTTV, где V представляет собой A/С или G, а эффекторный белок являет собой AacC2c1.

71. Система по п.62 или 63, где эффекторный белок C2c1 или C2c3 содержит один или более сигналов ядерной локализации.

72. Система по п.62 или 63, где последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие эффекторный белок C2c1 или C2c3, являются кодон-оптимизированными для экспрессии в эукариотической клетке.

73. Система по п.62 или 63, где компоненты (a) и (b) или нуклеотидные последовательности расположены на одном векторе.

74. Способ получения растения, имеющего модифицированный представляющий интерес признак, кодируемый представляющим интерес геном, причем указанный способ включает приведение клетки растения в контакт с системой по п.62 или 63 или воздействие на клетку растения способом по п.1, тем самым либо модифицируя, либо внося указанный представляющий интерес ген, и регенерацию растения из указанной клетки растения.

75. Способ идентификации представляющего интерес признака в растении, где указанный представляющий интерес признак кодируется представляющим интерес геном; причем указанный способ включает приведение клетки растения в контакт с системой по п.62 или 63 или воздействие на клетку растения способа по п.1, тем самым идентифицируя представляющий интерес ген.

76. Способ по п.75, дополнительно включающий внесение идентифицированного представляющего интерес гена в клетку растения, или линию клеток растения, или зародышевую плазму растения, и получение растения из них, в результате чего растение содержит представляющий интерес ген.

77. Способ по п.76, где растение имеет представляющий интерес признак.

78. Частица, содержащая систему по п.62 или 63.

79. Частица по п.78, где частица содержит эффекторный белок C2c1 или C2c3 в комплексе с направляющей РНК.

80. Система или способ по п.1, 62 или 63, где комплекс, направляющая РНК или белок конъюгированы по меньшей мере с одной сахарной частью, необязательно с N-ацетилгалактозамином (GalNAc), в частности, с трехантенным GalNAc.

81. Сконструированная способами инженерии не встречающаяся в природе композиция, содержащая систему CRISPR-Cas, причем указанная система содержит функциональный эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V и направляющую РНК (гРНК):

где гРНК содержит нефункциональную мертвую направляющую последовательность;

где гРНК способна гибридизоваться с последовательностью-мишенью;

где система CRISPR-Cas направлена на последовательность-мишень с уменьшенной инсерционно-делеционной активностью, происходящей из нуклеазной активности немутантного эффекторного белка локусов CRISPR-Cas типа V системы; и

где фунциональный эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V представляет собой C2c1p или C2c3p.

82. Способ ингибирования роста клеток, причем способ включает доставку в клетку не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей функциональный эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V и направляющую РНК (гРНК):

где гРНК способна гибридизоваться с последовательностью ДНК-мишени клетки;

где система CRISPR-Cas направлена на последовательность ДНК-мишень с уменьшенной инсерционно-делеционной активностью, происходящей из нуклеазной активности немутантного эффекторного белка локусов CRISPR-Cas типа V системы; и

где фунциональный эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V представляет собой C2c1p или C2c3p.