PL210451B1 - Szczepionka DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV) - Google Patents
Szczepionka DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV)Info
- Publication number
- PL210451B1 PL210451B1 PL352212A PL35221200A PL210451B1 PL 210451 B1 PL210451 B1 PL 210451B1 PL 352212 A PL352212 A PL 352212A PL 35221200 A PL35221200 A PL 35221200A PL 210451 B1 PL210451 B1 PL 210451B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- encoding
- nucleotide sequence
- plasmid
- dna
- gene
- Prior art date
Links
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 title claims description 75
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 title claims description 75
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 125
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 101
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 101
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 90
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 90
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 52
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 196
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 92
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 claims description 65
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 36
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 25
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 22
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 17
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 11
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 6
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 claims description 5
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 5
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 3
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 25
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000004224 protection Effects 0.000 abstract description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 abstract description 5
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 abstract description 4
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 abstract description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 abstract description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 151
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 122
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 122
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 55
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 241000701081 Equid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 38
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 31
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 31
- 241000701089 Equid alphaherpesvirus 4 Species 0.000 description 29
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 28
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 28
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 28
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 28
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 24
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 23
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 23
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 20
- 101150029683 gB gene Proteins 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 19
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 18
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 101150002378 gC gene Proteins 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 15
- 101150036031 gD gene Proteins 0.000 description 15
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 15
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 11
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 11
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 9
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 8
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 7
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 7
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108010015149 Equid herpesvirus 4 glycoprotein D Proteins 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 5
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 5
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 5
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241000700587 Alphaherpesvirinae Species 0.000 description 4
- 101000746316 Canis lupus familiaris Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010012716 Felid herpesvirus 1 glycoprotein B Proteins 0.000 description 4
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 3
- 108010070778 Felid herpesvirus 1 glycoprotein C Proteins 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 3
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 2
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000680578 Canid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 2
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 2
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 2
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000701925 Feline parvovirus Species 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 1
- YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trichloro-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 208000029483 Acquired immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010002942 Apathy Diseases 0.000 description 1
- 101100380241 Caenorhabditis elegans arx-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010066310 Canid herpesvirus 1 glycoprotein B Proteins 0.000 description 1
- 108010037810 Canid herpesvirus 1 glycoprotein D Proteins 0.000 description 1
- 241001353878 Canine parainfluenza virus Species 0.000 description 1
- 241000282467 Canis sp. Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 241000710945 Eastern equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N Lycoperodine 1 Natural products N1C2=CC=CC=C2C2=C1CN[C@H](C(=O)O)C2 FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001135960 Murine rotavirus Species 0.000 description 1
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- TWOFBVMVSYSAFW-UFUGHDFUSA-N N'-(3-aminopropyl)butane-1,4-diamine (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol guanidine Chemical compound NC(N)=N.NC(N)=N.NCCCCNCCCN.C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 TWOFBVMVSYSAFW-UFUGHDFUSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000906384 Rattus norvegicus Glutathione S-transferase Mu 7 Proteins 0.000 description 1
- 240000005578 Rivina humilis Species 0.000 description 1
- 108700012261 Rotavirus VP7 Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000710951 Western equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 101150092805 actc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150002418 cpi-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- RDYMFSUJUZBWLH-UHFFFAOYSA-N endosulfan Chemical compound C12COS(=O)OCC2C2(Cl)C(Cl)=C(Cl)C1(Cl)C2(Cl)Cl RDYMFSUJUZBWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- OHZZTXYKLXZFSZ-UHFFFAOYSA-I manganese(3+) 5,10,15-tris(1-methylpyridin-1-ium-4-yl)-20-(1-methylpyridin-4-ylidene)porphyrin-22-ide pentachloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Mn+3].C1=CN(C)C=CC1=C1C(C=C2)=NC2=C(C=2C=C[N+](C)=CC=2)C([N-]2)=CC=C2C(C=2C=C[N+](C)=CC=2)=C(C=C2)N=C2C(C=2C=C[N+](C)=CC=2)=C2N=C1C=C2 OHZZTXYKLXZFSZ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylethylamine Chemical compound CCN(C)C DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical group CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018299 prostration Diseases 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
- A61K39/265—Infectious rhinotracheitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- A61K39/175—Canine distemper virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
- A61K39/27—Equine rhinopneumonitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
- C12N2760/18334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
- C12N2760/18634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy ulepszonych szczepionek DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV). Stosowanie cząsteczek kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) do szczepienia jest znane od początku lat 90. (Wold i wsp. Science 1990). 247. 1465-1468). Ta technika szczepień indukuje odporność komórkową i humoralną po transfekcji in vitro komórek szczepionego osobnika przez cząsteczki DNA lub RNA kodujące i wyrażające białka immunologicznie czynne.
Szczepionka DNA składa się przynajmniej z jednego plazmidu, który może ulec ekspresji przez maszynerię komórkową szczepionego osobnika i nośnika lub zaróbki dopuszczalnych farmaceutycznie. Sekwencja nukleotydów tego plazmidu koduje i wyraża, między innymi, jeden lub kilka immunogenów, takich jak białka lub glikoproteiny zdolne do indukowania u szczepionego osobnika komórkowej (mobilizacja limfocytów T) i humoralnej (stymulacja produkcji przeciwciał specyficznie skierowanych przeciwko immunogenowi) odpowiedzi odpornościowej (Davis H.L. Current Opinion Biotech. 1997, 8, 635-640).
Wszystkie immunogeny pochodzące od patogenu nie są antygenami dostatecznie naturalnie skutecznymi aby indukować odpowiedź odpornościową ochronną optymalną u szczepionego zwierzęcia. Jest więc konieczne polepszenie odpowiedzi odpornościowej.
Każda droga podania zawiera swoje własne ograniczenia i trudności, tak więc szczepionka DNA skuteczna przy jednej drodze podania może być nieskuteczna przy innej.
Wybór drogi podania musi uwzględniać potrzeby praktyków i hodowców, trudności związane z unieruchomieniem zwierzą t lub naturą produktu.
Choć może być stosowana droga domięśniowa, droga podskórna jest bardzo interesująca do szczepienia zwierząt domowych szczególnie zwierząt małych i trudnych przy manipulacji.
Szczepionki DNA powinny więc być ulepszone tak aby umożliwić ich skuteczne podawanie na różnej drodze.
Szczepionki DNA były już stosowane eksperymentalnie w szczególności szczepionka DNA kodująca hemaglutyninę (HA) wirusa różyczki (Etchart i wsp. J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577-1580), którego podawanie donosowe u myszy okazało się być bardziej skuteczne niż podawanie doustne. Innym przykładem jest szczepionka DNA kodująca białko otoczki (Env) ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), której podanie podskórne nie było skuteczne w porównaniu z podawaniem drogą domięśniową (Ishii i wsp. AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421-1428).
Szczepionki DNA były też stosowane eksperymentalnie przeciwko wirusom zwierzęcym, szczególnie przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV - choroby Carre'go). Znane są niektóre immunogeny CDV, w szczególności białko nukleokapsydu (N), białko matrycy (M), białko fuzji (F) i hemaglutynina (HA) (WO-A-9741236). Jednak podanie podskórne szczepionki DNA kodującej hemaglutyninę i białko fuzji CDV nie pozwoliło na wykrycie produkcji przeciwciał u myszy i zaledwie słabą produkcję przeciwciał po podaniu domięśniowym tej szczepionki DNA (Sixt i wsp. J. Virol. 1998. 72. 8472-8476).
Indukcja odpowiedzi odpornościowej i zależności między różnymi elementami układu odpornościowego biorące udział w tej odpowiedzi mogą być różne u różnych gatunków zwierząt. Liczne informacje pochodzące z doświadczeń na modelu mysim pozwoliły na lepsze zrozumienie funkcjonowania odpowiedzi odpornościowej u myszy, ale tych informacji nie można bezpośrednio przenieść na inne gatunki szczególnie dlatego, że jest łatwiej indukować odpowiedź odpornościową u myszy niż u innych gatunków (van Drunen Little-van den Hurk i wsp. J. Gen. Virol. 1998. 79. 831-839; Bohm i wsp. Vaccine 1998. 16. 949-954).
Proponowane były różne drogi podawania szczepionki DNA (dootrzewnowa, dożylna, domięśniowa, podskórna, śródskórna, do śluzówek itd.). Proponowano różne drogi podawania, a w szczególności cząsteczki złota otoczone DNA i wstrzeliwane do komórek skóry szczepionego osobnika (Tang i wsp. Nature 1992. 356. 152-154) i iniekcje za pomocą wstrzeliwanego strumienia płynu pozwalające na transfekcję naraz komórek skóry i leżących pod nimi komórek (Furth i wsp. Analytical Bioch. 1992. 205. 365-368).
Do transfekcji DNA in vitro stosowano związki chemiczne:
A) Lipidy kationowe
Lipidy kationowe są podzielone na cztery podgrupy
1) lipidy kationowe zawierające czwartorzędowe sole amonowe jak, na przykład, DOTMA (dioleiloksypropylotrimetyloamon, produkowany przez Gibco pod nazwą Lipofektyna), DOTAP (trimetylo-2-3-(oktadeka-9-enooiloksy)-1-propanoamon; Gregoriadis i wsp. FEBS Letters 1997. 402. 107PL 210 451 B1
110), DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanamon; WO-A-9634109), DLRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(dodecyloksy)-1-propanoamon (Felgner i wsp. Ann. N Y Acad. Sci. 1995. 772. 126-139). Te lipidy kationowe zawierające sole amonu czwartorzędowego mogą być zasocjowane, lub nie, z dodatkowym obojętnym lipidem, takim jak DOPC (dioleilofosfatydylocholina) lub DOPE (dioleilo-fosfatydylo-etanolamina) (J.P. Behr, Bioconjugate Chemistry 1994. 5. 382-389).
2) lipoaminy jak, na przykład, DOGS (dioktadecyloamidoglicylospermina, produkowana przez Promega pod nazwą Transfectam; Abdallah i wsp. Biol. Cell. 1995. 85. 1-7), DC-Chol (dimetyloaminoetanokarbamoilo-cholesterol; Gao i Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. 179, 280-285), BGSC (bis-guanidyno-spermidyno-cholesterol), BGTC (bis-guanidyno-tren-cholesterol) (Vigneron i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93. 9682-9686).
3) lipidy kationowe zawierające czwartorzędowe sole amonu i lipoaminy jak, na przykład, DOSPA (N,N-dimetylo-N-(2-(sperminokarboksyamido)etylo)-2,3-bis(dioleiloksy)-1-propanimidupięciochlorek, sprzedawany przez Gibco pod nazwą LipofectAmine®; Hawley-Nelson i wsp., Focus 1993. 15. 73-79), GAP-DLRIE (N-(3-aminopropylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(dodecloksy)-1-propanoamina; Wheeler i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1996. 93. 11454-11459; Norman i wsp. Vacine 1997. 15. 801-803.
4) lipidy zawierające sole amidyny jak, na przykład, ADPDE, ADODE (Ruysschaert i wsp. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. 203. 1622-1628).
B) polimery jak, na przykład, SuperFectTM (cząsteczki aktywowanych dendrymerów), produkowane przez Qiagen; Xu i wsp. Mol. Genet. Metab. 1998. 64. 193-197) i
C) czynniki biochemiczne jak, na przykład, toksyny, w szczególności toksyny cholery.
Niektóre z tych związków były też stosowane do formułowania szczepionek DNA z wynikami dość umiarkowanymi. Wiedza o transfekcji in vitro nie jest do przeniesienia na szczepienie DNA gdzie ostatecznym celem jest zapewnienie ochronnej reakcji odpornościowej. Efekty negatywne na indukcję skutecznej ochrony immunologicznej były nawet stwierdzane ze związkami, o których wiadomo, że sprzyjają transfekcji in vitro. Niektóre formulacje związków chemicznych są w wysokich dawkach toksyczne dla komórek transfekowanych.
W pracach Etcharta (Etchart i wsp. J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577-1580), stosowanie DOTAP nie miało efektu adiuwantu podczas podawania szczepionki DNA drogą donosową, podczas gdy posiadało go na drodze podawania ustnej. DOTAP był też stosowany na modelu mysim w szczepionkach DNA kodujących hemaglutyninę (HA) wirusa grypy podawanych drogą donosową (Ban i wsp. Vaccine 1997. 15. 811-813), ale dodatek DOTAP hamował odpowiedź odpornościową. Stosowanie DC-Chol lub DOTAP/DOPE na modelu mysim w szczepionkach DNA kodujących białko powierzchniowe (S) wirusa zapalenia wątroby typu B podawanego drogą domięśniową pozwoliło na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał podczas gdy stosowanie lipofektyny (lub DOTMA) nie zwiększyło tej odpowiedzi (Gregoriadis i wsp. FEBS Letters 1997. 402. 107-110). DC-Chol/DOPE był też stosowany w szczepionkach DNA przeciw ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV, białko Env), na modelu mysim, którego podanie na drodze domięśniowej zaindukowało bardziej skuteczną odpowiedź odpornościową, podczas gdy podanie drogą podskórną lub doskórną jej nie zwiększyło (Ishii i wsp. AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421-1428).
Podobnie publikacja WO-A-98 40499 proponuje wytworzenie kompleksów kwas nukleinowy + lipidy kationowe do transfekcji nabł onka ś luzówki ssaków dla terapii genowej lub ekspresji antygenu przeznaczonego do indukcji odpowiedzi odpornościowej. Ten dokument celuje w drogę przez śluzówki poprzez inhalację, na przykład, przez nabłonek płuc. Precyzuje, że jego wyniki są inne niż uprzednich prac. Dodaje, że dla drogi domięśniowej (pozajelitowej) nagi DNA jest bardziej skuteczny niż mieszanina DNA + lipid.
Dodatek pewnych cytokin, w szczególności interleukin lub interferonów może umożliwić wzmocnienie odpowiedzi odpornościowej indukowanej w szczególności przez szczepionki DNA. Każda cytokina wywołuje reakcję, która jest dla niej specyficzna i w mniejszym lub większym stopniu orientuje odpowiedź odpornościową w stronę odpowiedzi komórkowej lub w stronę odpowiedzi humoralnej (Pasquini i wsp. Immunol. Cell. Biol. 1997. 75. 397-401; Kim i wsp. J. Interferon Cytokine Res. 1999. 19. 77-84). Efekty adiuwantowe cytokiny pochodzącej z jednego gatunku niekoniecznie są te same w odmiennym kontekście odpornościowym, w szczególności jeśli ta cytokina jest podana innemu gatunkowi, a więc do heterologicznego systemu odpornościowego. Dodatek cytokiny może również nie mieć żadnego efektu adiuwanta lub dać odwrócenie pożądanego efektu, to znaczy zmniejszenie lub hamowanie odpowiedzi odpornościowej. Tak więc szczepionka DNA kodująca prosty łań4
PL 210 451 B1 cuch immunoglobuliny w formie fuzji z GM-CSF nie zwiększa odpowiedzi odpornościowej, podczas gdy podanie bezpośrednie u myszy tej fuzji białkowej jest skuteczne, tak jak jest podanie fuzji białkowej złożonej z Fv i cytokiny IL-1beta lub podanie szczepionki DNA kodującej tę ostatnią fuzję białka (Hakim i wsp. J. Immunol. 1996. 157. 5503-5511). Użycie plazmidów koeksprymujących cytokinę IL-2 i biał ko otoczki wirusa zapalenia wą troby typu B w konformacji fuzji lub bez fuzji daje w efekcie zwię kszenie humoralnych i komórkowych odpowiedzi immunologicznych (Chow i wsp. J. Virol. 1997. 71. 169-78). Jednak stosowanie plazmidu bicistronowego kodującego glikoproteinę gp120 wirusa ludzkiego nabytego niedoboru odporności (HIV-1) i cytokinę IL-2 indukowało specyficzną odpowiedź odpornościową anty-gp120 słabszą niż uzyskaną przez stosowanie plazmidu monocistronowego kodującego tylko gpl20 (Barouch i wsp. J. Immunol. 1998. 161. 1875-1882). Koiniekcja u myszy dwóch wektorów ekspresyjnych, z których jeden koduje glikoproteinę G wirusa wścieklizny a drugi mysi GM-CSF stymuluje aktywność limfocytów B i T podczas gdy koiniekcja plazmidu kodującego interferon gamma (zamiast mysiego GM-CSF) daje w efekcie zmniejszenie odpowiedzi odpornościowej (Xiang i wsp. Immunity. 1995. 2. 129-135).
Pewne modyfikacje na poziomie antygenów takie jak delecje części sekwencji nukleotydów kodujących antygen, insercja fragmentu DNA w sekwencji nukleotydów kodującej antygen lub w regionach nie ulegających translacji powyżej lub poniżej mogą też polepszyć skuteczność szczepionki DNA, w szczególności poprawiając poziom ekspresji antygenu lub jego prezentację.
Ale w praktyce manipulacje na poziomie sekwencji nukleotydów kodującej antygen mogą pociągnąć za sobą zmniejszenie lub utratę pierwotnej aktywności odpornościowej. Tak więc delecja domeny transbłonowej w genie kodującym antygen G wirusa wścieklizny zmniejszyła poziom ochrony indukowany w modelu mysim po podaniu drogą domięśniową szczepionki DNA kodującej ten zmodyfikowany antygen (Xiang i wsp. Virol 1995. 209. 569). Delecja domeny transbłonowej w genie kodującym glikoproteinę gD wirusa opryszczki bydlęcej (BHV) nie pozwoliła na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał i zaindukowała tylko ochronę częściową u gatunków bydląt szczepionych drogą domięśniową (van Drunen Little-van den Hurk i wsp. J. Gen. Virol. 1998. 79. 831-839). Odpowiedzi odpornościowe humoralne i komórkowe i ochrona nadawana są identyczne u świnek morskich badanych po immunizacji za pomocą albo szczepionki DNA kodującej glikoproteinę GP wirusa Ebola, albo szczepionki DNA kodującej tę glikoproteinę GP, ale w postaci wydzielanej (Xu i wsp. Nature Medicine 1998. 4. 37-42).
Wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (ang. human tissue plasminogen activator lub human tPA) do genu kodującego antygen Pf322 malarii nie pozwoliła na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał u myszy szczepionej na drodze domięśniowej (Haddad i wsp. FEMS 1997. 18, 193-202). Dodatek w fazie sekwencji tPA do genu koduj ą cego antygen VP7 mysiego rotawirusa także nie pozwolił na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał u myszy szczepionej drogą doskórną podczas gdy fuzja białkowa wytworzona z antygenu VP4 i tPA pozwoliła na ten przyrost, ale bez indukcji skutecznej ochrony (Choi i wsp. Virology 1998. 250. 230-240).
Modyfikacje przeprowadzone na sekwencji nukleotydów antygenu nie mogą na ogół być bezpośrednio przeniesione na inny antygen, jako że antygeny nie zawsze mają te same uwarunkowania strukturalne.
Celem wynalazku jest polepszenie skuteczności szczepienia DNA. Celem jest w szczególności uzyskanie lepszej odpowiedzi odpornościowej, a zwłaszcza skutecznej ochrony u zwierząt domowych i sportowych, w szczególnoś ci u psów, przez szczepienie DNA, przez róż ne drogi podania w szczególności drogę podskórną.
Celem zgłaszającego jest opracowanie szczepionek DNA ulepszonych indukujących skuteczną i ochronną odpowiedź odpornoś ciową przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV) (chorobie Carre'go).
Szczepionka DNA jest ulepszona albo przez swoje formułowanie, albo przez dodanie GM-CSF albo przez optymalizację antygenu lub antygenów, albo przez kombinacje tych propozycji.
Korzystnie szczepionka DNA jest ulepszona albo przez dodanie GM-CSF albo przez optymalizację antygenu lub antygenów, albo przez dodanie GM-CSF i przez optymalizację antygenu lub antygenów.
Z definicji szczepionka DNA zawiera jako czynnik aktywny plazmid koduj ą cy i wyraż ają cy gen lub fragment genu. Określenie plazmid obejmuje jednostkę transkrypcji DNA zawierającą sekwencję polinukleotydów zawierającą sekwencję genu, który ma być wyrażany i elementy potrzebne do jego ekspresji in vivo. Korzystna jest forma kolistego plazmidu, superzwinięta lub nie. Forma liniowa także wchodzi w zakres wynalazku.
PL 210 451 B1
Każdy plazmid zawiera promotor zdolny do zapewnienia w komórkach gospodarza ekspresji wstawionego genu pod jego kontrolą. Chodzi na ogół o silny promotor eukariotyczny, a w szczególności o wczesny promotor cytomegalowirusa CMV-IE, pochodzenia ludzkiego lub mysiego lub ewentualnie z innego źródła takiego jak szczur, świnka morska. W bardziej ogólny sposób promotor jest albo pochodzenia wirusowego albo pochodzenia komórkowego. Jako promotor wirusowy inny niż CMV-IE można podać wczesny lub późny promotor wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Może też chodzić o promotor wirusa, z którego pochodzi gen, na przykład, własny promotor genu. Jako promotor komórkowy można podać promotor genu cytoszkieletu taki jak, na przykład, promotor desminy lub promotor aktyny. Gdy szereg genów jest obecnych w tym samym plazmidzie mogą one być prezentowane w tej samej jednostce transkrypcyjnej lub w dwóch różnych jednostkach.
Szczepionki DNA są formułowane przez dodanie jako adiuwanta lipidów kationowych zawierających sól czwartorzędową amonu, w szczególności DMRIE, który korzystnie jest zasocjowany z obojętnym lipidem w szczególności DOPE, by stworzyć DMRIE-DOPE.
Wynalazek dotyczy szczepionki DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV), obejmującej plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen CDV oraz elementy konieczne dla jego ekspresji in vivo, kationowy lipid (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanoamon (DMRIE), i dioleilo-fosfatydylo-etanolaminę (DOPE), która to szczepionka gdy jest podawana domięśniowo lub podskórnie indukuje wydajną odpowiedź immunologiczną lub zabezpieczającą u psów przeciw CDV. Szczepionka korzystnie ponadto obejmuje białko GM-CSF psa. Szczepionka korzystnie ponadto obejmuje wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą białko GM-CSF psa w warunkach umożliwiających wyrażanie takiej sekwencji in vivo, korzystniej wektorem ekspresyjnym jest plazmid. W korzystnej szczepionce sekwencja nukleotydowa kodująca immunogen CDV jest sekwencją genu, z którego wydeletowano część kodującą domenę transbłonową.
W korzystnej szczepionce plazmid zawierają cy sekwencję nukleotydową kodują c ą immunogen CDV ponadto obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tPA. W innej korzystnej szczepionce plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen CDV ponadto obejmuje stabilizujący intron, którym korzystnie jest intron II genu beta-globiny królika. W równie korzystnej szczepionce plazmid zawiera sekwencję nukleotydową kodującą antygen HA z CDV, korzystniej sekwencja nukleotydowa kodująca antygen HA jest zoptymalizowana przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy HA przez sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tPA, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową HA, przez wstawienie intronu powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej HA lub przez kombinację takich modyfikacji. W korzystnej szczepionce plazmid zawiera sekwencję nukleotydową kodującą antygen F z CDV, korzystniej sekwencja nukleotydowa kodująca antygen F jest zoptymalizowana przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy F, przez sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tPA, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową F, przez wstawienie intronu powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej F lub przez kombinację takich modyfikacji. W korzystnej szczepionce sygnałowy tPA jest ludzkim sygnałowym tPA. W równie korzystnej szczepionce intronem jest infron II genu beta-globiny królika. Korzystna szczepionka ponadto obejmuje na tym samym lub na innym plazmidzie sekwencję nukleotydową kodującą białko M lub białko N z CDV. Równie korzystna szczepionka obejmuje pierwszy plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodująca antygen HA z CDV zoptymalizowaną przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy HA przez sekwencję nukleotydową kodującą ludzki sygnałowy tPA, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową HA i przez wstawienie infronu II beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej HA, i drugi plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą antygen F z CDV zoptymalizowaną przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową F i przez wstawienie intronu II beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej F, korzystniej ponadto obejmuje plazmid ekspresyjny kodujący GMCSF psa.
Szczepionki DNA są formułowane przez dodanie jako adiuwantów lipidów kationowych zawierających sól czwartorzędową amonu o wzorze:
PL 210 451 B1 ch3 ®
R1 - O - CH2 - CH - CH2 - N-R2 - X
OR, CH3 w której R1 jest liniową resztą alifatyczną nasyconą lub nienasyconą, mając ą 12 do 18 atomów węgla, R2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą 2 do 3 atomów węgla, a X jest grupą hydroksylową lub aminową.
Takim adiuwantem jest DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanoamon; (WO-A-9634109), korzystnie DMRIE jest połączony z obojętnym lipidem jakim jest DOPE (dioleilo-fosfatydylo-etanolamina) aby wytworzyć DMRIE-DOPE.
Korzystnie, zrekombinowany wektor miesza się z tym adiuwantem bezpośrednio przed użyciem i jest korzystne, aby przed podaniem zwierzęciu tak przygotowanej mieszaniny, była ona pozostawiona w celu wytworzenia kompleksów, na przykład, na okres od 10 do 60 minut, w szczególności na 30 minut.
Stosunek molarny DMRIE : DOPE jest korzystnie od 95 : 5 do 5 : 95, a korzystniej 1 : 1.
Stosunek wagowy plazmid : adiuwant DMRIE lub DMRIE : DOPE może mianowicie być od 50 : 1 do 1 : 10, szczególnie od 10 : 1 do 1 : 5, korzystnie od 1 : 1 do 1 : 2.
Według innego wykonania, dodaje się do szczepionki GM-CSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów ang. granulocyte macrophage - colony stimulating factor; Clark S.C. i wsp. Science 1987. 230. 1229; Grant S.M. i wsp. Drugs 1992. 53. 516), co może być zrobione przez włączenie białka GM-CSF bezpośrednio do kompozycji szczepionki lub korzystnie przez wstawienie sekwencji kodującej GM-CSF do wektora ekspresyjnego w warunkach pozwalających na jego ekspresję in vivo. Jako wektor ekspresyjny korzystnie stosuje się plazmid, na przykład, plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą interesujący antygen lub antygeny lub inny plazmid. Wybór GMCSF przeprowadza się zależnie od zwierzęcia, które ma być szczepione, tak więc dla psów stosowany jest GM-CSF psa. Według kolejnego wykonania sekwencja (lub sekwencje) nukleotydowa kodująca immunogen jest w postaci zoptymalizowanej. Przez optymalizację należy rozumieć każdą modyfikację sekwencji nukleotydów, w szczególności taką, której efektem będzie przynajmniej wyższy poziom ekspresji tej sekwencji nukleotydów przez zwiększenie stabilności mRNA kodującego ten antygen, przez indukowaną sekrecję pozakomórkową tego antygenu, której bezpośrednią lub pośrednią konsekwencją będzie zwiększenie indukowanej odpowiedzi odpornościowej. W niniejszym wynalazku optymalizacja interesującego antygenu składa się korzystnie z delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową interesującego antygenu (przez delecję rozumie się całkowite usunięcie lub częściową delecję wystarczającą aby domena transbłonową nie była już, lub zasadniczo już, funkcjonalna) i/lub oprócz dodania w ramce odczytu sekwencji nukleotydów kodującej sygnał tPA (ang. tissue plasminogen activator Montgomery i wsp. Cell. Mol. Biol. 1997. 43. 285-292; Harris i wsp. Mol. Biol. Med. 1986. 3. 279-292) i/lub wstawienie intronu stabilizującego powyżej genu do wrażania. Delecja fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową interesującego antygenu sprzyja sekrecji do podłoża zewnątrzkomórkowego tak obciętych antygenów i w ten sposób zwiększa ich możliwości kontaktu z komórkami systemu odpornościowego. Wstawienie sekwencji nukleotydów kodującej sygnał tPA (sygnałowy tPA) ułatwia translację informacyjnego RNA, do którego jest przyłączony sygnałowy tPA i zwiększa w ten sposób poziom ekspresji tego informacyjnego RNA, a przez to produkcję antygenów. Sygnał tPA odgrywa też rolę w sekrecji syntetyzowanego antygenu. Insercja intronu stabilizującego w genie kodującym interesujący antygen pozwala na uniknięcie wadliwego składania swego informacyjnego RNA i utrzymuje jego fizyczną integralność.
Korzystnie sygnałowy tPA jest pochodzenia ludzkiego. Sekwencja nukleotydów ludzkiego sygnałowego tPA jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu NM_000930. Korzystnie, intron jest intronem II genu beta-globiny królika (van Ooyen i wsp. Science 1979. 206. 337-344), którego sekwencja nukleotydów jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu V00882 i ma odnośniki pod intronem nr 2.
PL 210 451 B1
Celem obecnego wynalazku jest ulepszona szczepionka DNA zdolna do indukcji odpowiedzi odpornościowej i ochronnej u psa przeciwko wirusowi nosówki psów wywołującego nosówkę psa zwaną też chorobą Carre'go (ang. Canine Distemper Virus lub CDV).
Wirus nosówki psa jest morbiliwirusem, członkiem rodziny Paramyxoviridae. Ten wirus zakaża gatunek psa, ale także dzikie koty (Harder i wsp; J. Gen. Virol. 1996. 77. 397-405).
Obecny wynalazek pozwala na uzyskanie skutecznej i ochronnej szczepionki DNA przeciwko wirusowi nosówki psów, w szczególności na drodze podskórnego podania, która jak dotąd pozostawała drogą indukującą śladowy poziom ochrony (Sixt i wsp. J. Virol. 1998. 72. 8472-8476).
Według wynalazku szczepionka DNA przeciwko CDV jest ulepszona przez swoje formułowanie z adiuwantem DMRIE-DOPE. Taka szczepionka moż e być ulepszana przez łączenie z GM-CSF psa (Nash i wsp. Blood 1991. 78. 50-56) albo optymalizowana przez optymalizację przynajmniej jednego antygenu CDV, a w końcu przez dodanie GM-CSF psa i optymalizację przynajmniej jednego antygenu CDV.
Sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF psa jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu S49738.
Dodanie GM-CSF psa można przeprowadzić przez włączenie polipeptydu GM-CSF psa do kompozycji szczepionki korzystnie przez wstawienie sekwencji nukleotydów kodującej GM-CSF psa do wektora ekspresyjnego in vivo, korzystnie do plazmidu. Korzystnie, sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF psa jest wstawiona do drugiego plazmidu ekspresyjnego, odmiennego od tego (lub tych), w którym wstawiony jest gen lub geny kodujące antygen/y CDV.
Optymalizacja antygenów pochodzących od CDV jest przeprowadzana przez podstawienie sekwencji „sygnałowej” w szczególności tej sygnałowego tPA pochodzenia ludzkiego (GenBank numer dostępu NM_000930), sekwencji peptydu sygnałowego hemaglutyniny (HA) i/lub białka fuzji (F), przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową HA i/lub F i/lub przez wstawienie intronu, szczególnie intronu genu beta-globiny królika (którego sekwencja nukleotydów określona jako intron nr 2 jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu V00882) powyżej sekwencji nukleotydów kodującej HA i/lub F. Szczepionka DNA przeciwko CDV według wynalazku może więc kodować i wyrażać jeden pojedynczy optymalizowany antygen CDV (HA lub F) lub oba, to znaczy optymalizowany HA i optymalizowany F.
Ewentualnie sekwencja kodująca białko matrycy (M) CDV w swojej formie natywnej (bez modyfikacji) i/lub sekwencja nukleotydowa kodująca nukleoproteinę (N) CDV w swojej formie natywnej (bez modyfikacji) mogą być wstawione i wyrażane w plazmidzie i kombinowane z plazmidami zawierającymi optymalizowany HA i/lub optymalizowany F.
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny CDV stosowane w tym wynalazku oraz różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są zilustrowane w obecnym wynalazku i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych podane są w załączonych przykładach i w WO-A-9803199, w szczególności w jego przykładach 8 i 9 i na fig. 2 i 3.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CDV ze względu na podanie drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pNS024, fig. 4) kodującego antygen HA CDV optymalizowanego przez podstawienie sekwencji sygnałowej HA przez sekwencję ludzkiego peptydu sygnałowego tPA, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową HA i przez wstawienie intronu II genu betaglobiny królika powyżej genu HA oraz drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pNS021, fig. 3) kodującego antygen F CDV optymalizowanego przez delecję domeny transbłonowej i przez wstawienie intronu II genu betaglobiny królika powyżej genu F.
Korzystnie według wynalazku szczepionka DNA przeciwko CDV ze względu na podanie drogą podskórną jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego kodującego GMCSF psa i dwóch plazmidów zdefiniowanych uprzednio (na przykład, pNS024 i pNS021).
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u psa przeciwko kompleksowi oddechowemu albo kaszlowi kennelowemu (wirus paragrypy-2 psa lub CPI-2).
Wirus CPI-2 jest Paramyksowirusem, także członkiem rodziny Paramyxoviridae (Bittle i wsp., J. Am. Vet. Med. Assoc. 1970. 156. 1771-1773; Moloney i wsp. Aust Vet J. 1985. 62. 285-286).
Szczepionka DNA przeciwko CPI-2 może być korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona z dodatkiem
PL 210 451 B1
GM-CSF psa lub optymalizowanym przynajmniej jednym antygenem CPI-2 lub dodatkiem GM-CSF psa i optymalizowanym przynajmniej jednym antygenem CPI-2.
Dodatek GM-CSF psa można wprowadzić tak jak jest to opisane dla CDV.
Optymalizację antygenów pochodzących z CPI-2 przeprowadza się przez substytucję za pomocą jednej sekwencji sygnałowej w szczególności tPA pochodzenia ludzkiego, sekwencji sygnałowej hemaglutyniny-neuraminidazy (HN) CPI-2 i/lub białka fuzji (F) CPI-2 i/lub przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową HN i/lub F i/lub przez wstawienie intronu, w szczególności intronu II genu beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydów kodującej HN i/lub F. Szczepionka DNA przeciwko CPI-2 może więc kodować i wyrażać jeden optymalizowany antygen CPI-2 (HN lub F) lub dwa (HN i F).
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny CPI-2 możliwe do użycia i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CPI-2 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB034, fig. 6) kodującego antygen HN CPI-2 optymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA na miejsce sekwencji sygnałowej HN, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów HN kodującego domenę transbłonową i przez wstawienie intronu II genu beta globiny królika powyżej HN i z drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB032, fig. 5) kodującego antygen F CPI-2 optymalizowanego przez delecję sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową F i przez wstawienie intronu II genu beta-globiny królika powyżej genu F.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CPI-2 ze względu na podanie drogą podskórną jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM-CSF psa i dwóch plazmidów zdefiniowanych uprzednio (na przykład, pSB034 i pSB032).
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u psa przeciwko wirusowi opryszczki psa typu 1 (CHV-1).
Wirus CHV-1 jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae. Ten wirus jest odpowiedzialny za wirusowy nieżyt nosa i tchawicy u psa. Sekwencje nukleotydów kodujące glikoproteiny gB, gC i gD są znane (Limbach i wsp., J. Gen. Virol. 1994. 75. 2029-2039).
Szczepionka DNA przeciwko CHV-1 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GM-CSF psa lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu CHV-1 lub dodatkiem GM-CSF psa i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu CHV-1.
Dodatek GM-CSF psa można wprowadzić tak jak jest to opisane dla CDV.
Optymalizację antygenów pochodzących z CHV-1 przeprowadza się przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny gB i/lub glikoproteiny gC i/lub glikoproteiny gD CHV-1. Ulepszona szczepionka DNA przeciwko CHV-1 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen CHV-1 (gB, gC lub gD) lub dwa z nich lub trzy.
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny CHV-1 do wykorzystania w szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach oraz w WO-A-98/03199, w szczególności w jego przykładach 7 i 8 i na fig. 13 i 14.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CHV-1 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB016, fig. 7) kodującego antygen gB CHV-1 optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB019, fig. 8) kodującego antygen gC CHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB017, fig. 9) kodującego antygen gD CHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CHV-1 ze względu na podanie drogą podskórną jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM-CSF psa i trzech plazmidów zdefiniowanych uprzednio (na przykład, pSB016, pSB019 i pSB017).
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u kota przeciwko wirusowi opryszczki kota typu 1 (FHV-1).
PL 210 451 B1
Wirus FHV-1 jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae, wirus ten jest odpowiedzialny za wirusowy nieżyt nosa i tchawicy u kota (Fargeaud i wsp., Arch. Virol. 1984. 80. 69-82).
Szczepionka DNA przeciwko FHV-1 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GMCSF kota lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu FHV-1 lub dodatkiem GM-CSF kota i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu FHV-1.
Dodatek GM-CSF kota można wprowadzić przez włączenie polipeptydu GM-CSF kota do kompozycji szczepionki korzystnie przez wstawienie sekwencji nukleotydów kodującej GM-CSF kota (na przykład, dostępnej w bazie danych GenBank pod numerem dostępu AF053007) do wektora ekspresyjnego in vivo, korzystnie do plazmidu. Korzystnie, sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF kota jest wstawiona do drugiego plazmidu ekspresyjnego, odmiennego od tego (lub tych), w którym wstawiony jest gen lub geny kodujące antygeny FHV-1.
Optymalizację antygenów pochodzących z FHV-1 przeprowadza się przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny gB i/lub glikoproteiny gC i/lub glikoproteiny gD FHV-1. Ulepszona szczepionka DNA przeciwko FHV-1 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen FHV-1 (gB, gC lub gD) lub dwa z nich lub trzy.
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny FHV-1 do wykorzystania w szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach i w WO-A-98/03660, w szczególnoś ci w jego przyk ł adach 14 i 15 i fig. 11 i 12.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko FHV-1 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB021, fig. 10) kodującego antygen gB FHV-1 optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB023, fig. 11) kodującego antygen gC FHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB024, fig. 12) kodującego antygen gD FHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko FHV-1 pod kątem podania drogą podskórną jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM-CSF kota i trzech uprzednio zdefiniowanych plazmidów (na przykład, pSB021, pSB023 i pSB024).
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u konia przeciwko wirusowi opryszczki konia typu 1 (EHV-1).
Wirus EHV-1 jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae, wirus ten jest odpowiedzialny za wirusowe poronienie u konia (Crabb i wsp., Virus Res. 1995. 45. 153-190). Ustalono całkowitą sekwencje genomu tego wirusa (Telford i wsp. Virology 1992. 189. 304-316).
Szczepionka DNA przeciwko EHV-1 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GM-CSF konia lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu EHV-1 lub w końcu dodatkiem GMCSF konia i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu EHV-1.
Dodatek GM-CSF konia można wprowadzić przez włączenie polipeptydu GM-CSF konia do kompozycji szczepionki korzystnie przez wstawienie sekwencji nukleotydów (SEQ ID N° 69, fig. 26) kodującej GM-CSF konia do wektora ekspresyjnego in vivo, korzystnie do plazmidu. Korzystnie sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF konia jest wstawiona do drugiego plazmidu ekspresyjnego, odmiennego od tego (lub tych), w którym wstawiony jest gen lub geny kodujące antygeny EHV-1.
Optymalizację antygenów pochodzących z EHV-1 przeprowadza się przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny gB i/lub glikoproteiny gC i/lub glikoproteiny gD EHV-1. Ulepszona szczepionka DNA przeciwko EHV-1 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen EHV-1 (gB, gC lub gD) lub dwa z nich lub trzy.
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny EHV-1 do wykorzystania w szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach i w WO-A-98/03198, w szczególnoś ci w jego przyk ł adach 8 i 10 i fig. 2 i 4.
Droga domięśniowa jest korzystna u konia. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko EHV-1 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB028, fig. 13) kodującego antygen gB EHV-1 optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową, drugiego plazmidu ekspre10
PL 210 451 B1 syjnego (na przykład, pSB029, fig. 14) kodującego antygen gC EHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB030, fig. 15) kodującego antygen gD EHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową.
Można jednak stosować drogę podskórną. W tym przypadku szczepionka DNA przeciwko EHV-1 jest korzystnie formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego kodującego GMCSF konia i trzech uprzednio zdefiniowanych plazmidów (na przykład, pSB028, pSB029 i pSB030).
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u konia przeciwko wirusowi opryszczki konia typu 4 (EHV-4).
Wirus EHV-4 jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae. Wirus EHV-4 jest odpowiedzialny za zapalenie płuc i nieżyt nosa u konia (Crabb i wsp., Adv. Virus Res. 1995. 45. 153-190). Ustalono całkowitą sekwencje genomu tego wirusa (Telford i wsp. J. Gen. Virol. 1998. 79. 1197-1203).
Szczepionka DNA przeciwko EHV-4 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GM-CSF konia lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu EHV-4 lub dodatkiem GM-CSF konia i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu EHV-4.
Dodatek GM-CSF konia można wprowadzić tak jak opisano dla EHV-1.
Optymalizację antygenów pochodzących z EHV-4 przeprowadza się przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny gB i/lub glikoproteiny gC i/lub glikoproteiny gD EHV-4. Ulepszona szczepionka DNA przeciwko EHV-4 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen EHV-4 (gB, gC lub gD) lub dwa z nich lub trzy.
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny EHV-4 do wykorzystania w szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach i w WO-A-98/03198, w szczególnoś ci w jego przyk ł adach 9 i 11 i na fig. 3 i 5.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko EHV-4 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB025, fig. 16) kodującego antygen gB EHV-4 optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB026, fig. 17) kodującego antygen gC EHV-4 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodujący domenę transbłonową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB027, fig. 18) kodującego antygen gD EHV-4 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową.
Do drogi podskórnej szczepionka DNA przeciwko EHV-4 jest korzystnie formułowana z DMRIEDOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM-CSF konia i trzech uprzednio zdefiniowanych plazmidów (na przykład, pSB025, pSB026 i pSB027). Chociaż wynalazek opisany jest w odniesieniu do konkretnych szczepionek DNA, to może być on zastosowany także do szczepionek DNA skierowanych przeciwko innym patogenom tych gatunków zwierząt. Tak więc różne walencje opisane przez to zgłoszenie mogą stanowić cel ulepszonej szczepionki w szczególności przez dodanie adiuwantów lub GM-CSF, lub ewentualnie optymalizacji genu lub kombinacji tych propozycji, jak to jest tu opisane szczegółowo dla niektórych walencji.
W tym samym zamyś le opisane szczepionki mogą być dla okreś lonego gatunku zwierzę cia kombinowane między sobą i/lub ze szczepionkami DNA skierowanymi przeciwko innym patogenom tego samego gatunku.
Tak więc opisane rozwiązania umożliwiają wytworzenie ulepszonej multiwalentnej szczepionki DNA pozwalające na uzyskanie skutecznej ochrony u psa przeciwko przynajmniej dwóm patogenom psa wybranym z grupy złożonej z: CDV, CPI-2, CHV-1, wirusa wścieklizny (rabdrowirus), parwowirusa psa (CPV), koronawirusa psa (CCV), Borrelia burgdorferi.
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej multiwalentnej szczepionki DNA pozwalającej na uzyskanie skutecznej ochrony u kota przeciwko przynajmniej dwóm patogenom kota wybranym z grupy złożonej z: FHV-1, kaliciwirusa kota (FCV) wirusa wścieklizny (rabdowirus), parwowirusa kota (FPV), wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kota (FIPV), wirusa białaczki kota (FeLV), wirusa nabytego niedoboru odporności kota (FIV).
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonych multiwalentnych szczepionek DNA pozwalających na uzyskanie skutecznej ochrony u konia przeciwko przynajmPL 210 451 B1 niej dwóm patogenom konia wybranym z grupy złożonej z: EHV-1, EHV-4, wirusa grypy konia, wirusa wschodniego zapalenia mózgu konia, wirusa zachodniego zapalenia mózgu konia, wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu konia, wirusa wścieklizny, Clostridium tetani, Borrelia burgdorferi.
Multiwalentne szczepionki DNA mogą być ulepszone przez ich formułowanie z adiuwantem, w szczególnoś ci DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Moż e on też być fakultatywnie łączony z dodatkiem GM-CSF jak to było poprzednio opisane lub z optymalizacją przynajmniej jednego interesującego antygenu jak to uprzednio opisano, w końcu z dodaniem GM-CSF i optymalizacją przynajmniej jednego interesującego antygenu.
Ulepszone multiwalentne szczepionki DNA są złożone z jednego lub więcej plazmidów ekspresyjnych tak że te szczepionki prowadzą do ekspresji in vivo przynajmniej jednego immunogenu pierwszego patogenu i przynajmniej jednego immunogenu przynajmniej innego patogenu zakażającego ten sam gatunek zwierzęcia. Przynajmniej jeden z tych immunogenów jest korzystnie wybrany wśród członków następującej grupy:
- F CDV, HA CDV, F CPI-2, HN CPI-2, gB CHV-1, gC CHV-1 i gD CHV-1 dla psów,
- gB FHV-1, gC FHV-1 i gD FHV-1 dla kotów, i
- gB EHV-1, gC EHV-1, gD EHV-1, gB EHV-4, gC EHV-4 i gD EHV-4 dla koni.
Ulepszone szczepionki DNA monowalentne lub multiwalentne mogą być także połączone z przynajmniej jedną szczepionką klasyczną (nieaktywną, żywą atenuowaną , podjednostkową) lub szczepionką rekombinowaną stosując wektor ekspresyjny in vivo (na przykład, wirus krowianki, adenowirus, wirus opryszczki) skierowaną przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi w szczególności innemu zakażającemu ten sam gatunek.
Specjalista może odnieść się do WO-A-9803198 dla metod konstrukcji plazmidów zawierających te walencje dla koni, WO-A-9803660 dla walencji kotów i WO-A-9803199 dla walencji psów.
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również prowadzenie sposobu szczepienia zwierząt domowych lub sportowych w szczególności psów, kotów lub koni. Ten sposób szczepienia obejmuje podanie jednej z tych ulepszonych szczepionek DNA monowalentnych lub multiwalentnych takich jak opisano uprzednio. Ten sposób szczepienia obejmuje podanie jednej lub więcej dawek ulepszonej szczepionki DNA.
Ilość DNA stosowana w tych szczepionkach jest zawarta między około 10 μg i około 1000 μg, a korzystnie miedzy około 50 μg i około 500 μg dla danego plazmidu. Specjalista w dziedzinie posiada potrzebne kompetencje, aby dokładnie określić skuteczną dawkę DNA do stosowania w każdym protokole szczepienia.
Objętości dawki mogą być korzystnie między 0,5 i 5 ml, a korzystniej między 1 i 3 ml.
Ulepszone szczepionki DNA mogą być podawane w ramach tego sposobu szczepienia poprzez różne drogi podawania, proponowane w uprzednim stanie wiedzy dla szczepień polinukleotydowych i za pomocą znanych technik szczepienia.
Według dwóch korzystnych opisanych sposobów prowadzenia szczepienia, sposoby szczepienia obejmują podanie na drodze domięśniowej lub na drodze podskórnej ulepszonych szczepionek DNA.
Wynalazek będzie niżej opisany za pomocą sposobów jego wykonania przedstawionych jako nieograniczające przykłady, które odnoszą się do załączonych figur rysunku, na których:
Fig. 1: Plazmid pAB 110,
Fig. 2: Plazmid pVR1012,
Fig. 3: Plazmid pNS021,
Fig. 4: Plazmid pNS024,
Fig. 5: Plazmid pSB032,
Fig. 6: Plazmid pSB034,
Fig. 7: Plazmid pSB016,
Fig. 8: Plazmid pSB019,
Fig. 9: Plazmid pSB017,
Fig. 10: Plazmid pSB021,
Fig. 11: Plazmid pSB023,
Fig. 12: Plazmid pSB024,
Fig. 13: Plazmid pSB028,
Fig. 14: Plazmid pSB029,
Fig. 15: Plazmid pSB030,
PL 210 451 B1
Fig. 16: Plazmid pSB025,
Fig. 17: Plazmid pSB026,
Fig. 18: Plazmid pSB027,
Fig. 19: Plazmid pJP084,
Fig. 20: sekwencja genu GM-CSF psa,
Fig. 21: Plazmid pJP089,
Fig. 22: sekwencja genu GM-CSF 3R3,
Fig. 23: Plazmid pJP090,
Fig. 24: sekwencja genu GM-CSF kota 3R4, Fig. 25: Plazmid pJP097,
Fig. 26: sekwencja genu GM-CSF konia, Fig. 27: sekwencja genu CPI-2 F, a Fig. 28: sekwencja genu CPI-2 HN.
Lista sekwencji:
SEQ ID N° 1 SEQ ID N° 2 SEQ ID N° 3 SEQ ID N° 4 SEQ ID N° 5 SEQ ID N° 6 SEQ ID N° 7 SEQ ID N° 8 SEQ ID N° 9 SEQ ID N° 10 SEQ ID N° 11 SEQ ID N° 12 SEQ ID N° 13 SEQ ID N° 14 SEQ ID N° 15 SEQ ID N° 16 SEQ ID N° 17 SEQ ID N° 18 SEQ ID N° 19 SEQ ID N° 20 SEQ ID N° 21 SEQ ID N° 22 SEQ ID N° 23 SEQ ID N° 24 SEQ ID N° 25 SEQ ID N° 26 SEQ ID N° 27 SEQ ID N° 28 SEQ ID N° 29 SEQ ID N° 30 SEQ ID N° 31 SEQ ID N° 32 SEQ ID N° 33 SEQ ID N° 34 SEQ ID N° 35 SEQ ID N° 36 SEQ ID N° 37 SEQ ID N° 38 SEQ ID N° 39 SEQ ID N° 40 SEQ ID N° 41 SEQ ID N° 42 oligonukleotyd NS030 oligonukleotyd NS031 oligonukleotyd NS034 oligonukleotyd NS035 oligonukleotyd NS036 oligonukleotyd NS037 oligonukleotyd SB090 oligonukleotyd SB091 oligonukleotyd PB326 oligonukleotyd PB329 oligonukleotyd PB381 oligonukleotyd PB382 oligonukleotyd PB383 oligonukleotyd PB384 oligonukleotyd SB101 oligonukleotyd SB102 oligonukleotyd SB103 oligonukleotyd SB104 oligonukleotyd SB105 oligonukleotyd SB106 oligonukleotyd SB107 oligonukleotyd SB108 oligonukleotyd SB109 oligonukleotyd SB110 oligonukleotyd SB111 oligonukleotyd SB112 oligonukleotyd SB113 oligonukleotyd SB114 oligonukleotyd SB115 oligonukleotyd SB116 oligonukleotyd SB117 oligonukleotyd SB118 oligonukleotyd AB325 oligonukleotyd AB326 oligonukleotyd AB327 oligonukleotyd AB328 oligonukleotyd AB329 oligonukleotyd AB330 oligonukleotyd NS003 oligonukleotyd NS004 oligonukleotyd NS005 oligonukleotyd NS006
PL 210 451 B1
SEQ ID N° 43 SEQ ID N° 44 SEQ ID N° 45 SEQ ID N° 46 SEQ ID N° 47 SEQ ID N° 48 SEQ ID N° 49 SEQ ID N° 50 SEQ ID N° 51 SEQ ID N° 52 SEQ ID N° 53 SEQ ID N° 54 SEQ ID N° 55 SEQ ID N° 56 SEQ ID N° 57 SEQ ID N° 58 SEQ ID N° 59 SEQ ID N° 60 SEQ ID N° 61 SEQ ID N° 62 SEQ ID N° 63 SEQ ID N° 64 SEQ ID N° 65 SEQ ID N° 66 SEQ ID N° 67 SEQ ID N° 68 SEQ ID N° 69 SEQ ID N° 70 SEQ ID N° 71 SEQ ID N° 72 SEQ ID N° 73 oligonukleotyd NS007 oligonukleotyd NS008 oligonukleotyd SB119 oligonukleotyd SB120 oligonukleotyd SB121 oligonukleotyd SB122 oligonukleotyd SB123 oligonukleotyd SB124 oligonukleotyd SB125 oligonukleotyd SB126 oligonukleotyd SB127 oligonukleotyd SB128 oligonukleotyd SB129 oligonukleotyd SB130 oligonukleotyd SB131 oligonukleotyd SB132 oligonukleotyd SB133 oligonukleotyd SB134 oligonukleotyd SB135 oligonukleotyd SB136 oligonukleotyd SB137 oligonukleotyd JP578 oligonukleotyd JP579 sekwencja genu GM-CSF psa (patrz fig. 20) sekwencja genu GM-CSF kota 3R3 (patrz fig. 22) sekwencja genu GM-CSF kota 3R4 (patrz fig. 24) sekwencja genu GM-CSF konia (patrz fig. 26) oligonukleotyd JP734 oligonukleotyd JP735 sekwencja genu CPI-2 F (patrz fig. 27) sekwencja genu CPI-2 HN (patrz fig. 28)
Przykłady
Dla każdego z rozważanych patogenów każdy gen kodujący główne antygeny powierzchniowe (forma natywna i forma zmodyfikowana) był celem odpowiedniej konstrukcji w eukariotycznym plazmidzie ekspresyjnym. Formy wydzielane antygenów powierzchniowych uzyskano przez delecję fragmentów genów kodujących domeny transbłonowe i cytoplazmatyczne. We wszystkich przypadkach domeny transbłonowe glikoprotein zidentyfikowano na podstawie profili hydropatii odpowiednich sekwencji białek. Tabela podana w przykładzie 11 podsumowuje rozmiary białek typu dzikiego (w aminokwasach) pozycje zidentyfikowane domen transbłonowych, wielkości skróconych białek jak i nazwy odpowiednich plazmidów ekspresyjnych.
P r z y k ł a d 1: Podstawowe konstrukcje plazmidów
Eukariotyczny plazmid ekspresyjny pVR1020 (C.J. Luke i wsp. J. of Infectious Diseases 1997, 175: 95-97) pochodna plazmidu pVR1012 (fig. 1, przykład 7 WO-A-9803199, ponownie przedstawiony na fig. 2 obecnego zgłoszenia), zawiera ramkę kodującą sekwencję sygnałową ludzkiego aktywatora tkankowego plazminogenu (tPA). Plazmid pVR1020 został zmodyfikowany przez trawienie BamHlBglll i wstawienie sekwencji kodującej kilka miejsc klonowania (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, Pmll, Pstl, Bglll) wynikającej z parowania następujących oligonukleotydów:
PB326 (40 mer) (SEQ ID N° 9)
5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' i PB329 (40 mer) (SEQ ID N° 10)
5' GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'.
Powstały wektor, pAB110 (fig. 1) był stosowany do konstrukcji plazmidów zawierających formy skrócone genów kodujących hemaglutyninę (HA) wirusa nosówki psa (CDV) i dla hemaglutyninyneuraminidazy (HN) wirusa paragrypy typu 2 (CPI-2).
Intron II genu β-globiny królika sklonowano w wektorze pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) po uzyskaniu fragmentu DNA odpowiadającego PCR za pomocą następujących oligonukleotydów:
PL 210 451 B1
SB090 (20 mer) (SEQ ID N° 7)
5' TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' i SB091 (21 mer) (SEQ ID N° 8)
5' CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3' stosując jako matrycę genomowy DNA komórek krwi obwodowej królika.
Powstały plazmid określono jako pNS050.
P r z y k ł a d 2. Plazmidy kodujące różne postacie antygenów CDV
Geny kodujące białko fuzji (F) i hemaglutyninę (HA) CDV szczepu Snyder Hill (SH) uzyskano za pomocą RT-PCR z RNA wirusowego szczepu SH (uzyskany z depozytu kolekcji szczepów American Tissue Culture Collection pod numerem ATCC VR-526).
2.1 Plazmidy kodujące różne formy CDV-F
2.1.1. pPB229: gen F (forma natywna) sklonowany w wektorze z pVR1012 cDNA genu F CDV syntetyzowano za pomocą startera PB383 i amplifikowano za pomocą reakcji PCR stosując następującą parę oligonukleotydów:
PB383 (26 mer) (SEQ ID N° 13)
5' TTTCTAGACAGCCGAGCCCCATGCAC 3' i PB384 (30 mer) (SEQ ID N° 14)
5' TTGGATCCGATATATGACCAGAATACTTCA 3'.
Produkt PCR strawiono BamHI i Xbal i sklonowano w wektorze ekspresyjnym pVR1012 (przykład 1) uprzednio strawionym BamHI i Xbal uzyskując plazmid pPB229 (6925 par zasad lub bp). Gen F typu dzikiego CDV koduje białko o 662 reszt aminokwasów.
2.1.2. pNS021: gen F (forma β-globina F ΔΤΜ) sklonowany w wektorze pVR1012
Plazmid pNS013 (6735 bp) zawiera gen F skrócony o domenę transbłonową i C-końcową i został uzyskany przez ligację fragmentu Bsu36I-BamHI (6593 bp) pochodzącego z plazmidu pPB229 (przykład 2.1.1.) i fragmentu 142 bp otrzymanego z matrycy pPB229 za pomocą następujących oligonukleotydów:
NS030 (21 mer) (SEQ ID N° 1)
5' ATGAGCCCACTCTTACAACAA 3' i NS031 (35 mer) (SEQ ID N° 2)
5' TTTCGCGGATCCATTAAAGGAAGAGCGCCTAACCG 3' i strawionego Bsu361-BamHI. Skrócony gen F CDV koduje białko z 605 reszt.
W drugim etapie wstawiono sekwencję odpowiadającą intronowi II genu β-globiny królika powyżej sekwencji kodującej skróconego genu F, w miejscu SalI plazmidu pNS013. Fragment DNA odpowiadający intronowi (573 bp) uzyskano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
NS036 (34 mer) (SEQ ID N° 5)
5' TTTACGCGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' i NS037 (36 mer) (SEQ ID N° 6)
5' TTTACGCGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAAGGCAT 3' na matrycy pNS050 (przykład 1) po której nastąpiło trawienie SalI aby uwolnić końce pasujące do SalI. Pochodną plazmidu pSN013 zawierając intron II genu β-globiny królika nazwano pNS021 (fig. 3).
2.2. Plazmidy kodujące różne formy CDV-HA
2.2.1. pNS018: Gen HA (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu HA CDV zsyntetyzowano za pomocą startera PB381 i zamplifikowano za pomocą reakcji PCR stosując następującą parę nukleotydów:
PB381 (30 mer) (SEQ ID N° 11)
5' TTCTGCAGATGCTCTCCTACCAAGAYAAGG 3' i PB382 (28 mer) (SEQ ID N° 12)
5' TTGTCGACATGTGTATCATCATMCTGTC 3'.
Produkt sklonowano w wektorze pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) uzyskując plazmid pPB235. Fragment Pstl-Sall o wielkości 1846 bp plazmidu pPB235 zawierający gen HA następnie sklonowano w wektorze ekspresyjnym pVR1012 (przykład 1) strawionym Pstl-Sall uzyskując plazmid pNS018 (6748 bp). Dziki gen HA CDV koduje białko z 607 reszt.
2.2.2. pNS024: gen HA (forma β-globina F ΔTM HA) sklonowany w wektorze pVR1012
Formę skróconą genu HA CDV uzyskano przez delecję fragmentu DNA kodującego 60 pierwszych reszt białka HA. Jako że sekwencje sygnałowe i transbłonowe tego białka są pomieszane, sekrecja skróconego produktu jest zapewniania przez uzyskanie fuzji w fazie między sekwencją sygnaPL 210 451 B1 łową ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) i skróconego genu HA. Plazmid pNS019, pochodna pNS018 kodująca produkt fuzji z sygnałem tPA, został otrzymany za pomocą ligacji 3 następujących fragmentów DNA:
- fragment A otrzymano przez trawienie BamHI-EcoRV pAB 110 (przykład 1),
- fragment B otrzymano za pomocą reakcji PCR na matrycy pNS018 (przykład 2.2.1) za pomocą następujących oligonukleotydów:
NS034 (30 mer) (SEQ ID N° 3)
5' TTTCGCGGATCCCACAAAGTATCAACTAGC 3' i NS035 (23 mer) (SEQ ID N° 4)
5' GGGATTTGCTGCCGATGCAATAG 3', a następnie trawienie BamHI-SapI produktu PCR.
- fragment C jest fragmentem trawienia SapI-EcoRV pNS018.
Gen hybrydowy tPA ΔTM HA koduje białko z 574 reszt (1725 bp).
Intron II genu β-globiny królika (przykład 2.1.2) wstawiono powyżej ramki kodującej genu HA w miejsce SalI pNS019 aby uzyskać plazmid pNS024 (fig. 4).
P r z y k ł a d 3: plazmidy kodujące różne formy antygenów wirusa paragrypy psa typu 2 (CPI-2)
Geny F i HN CPI-2 szczepu D008 (MERIAL) uzyskano za pomocą RT-PCR z RNA wirusowego.
3.1. Plazmidy kodujące różne formy CPI-2 F
3.1.1. pAB115: gen F (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu F CPI-2 syntetyzowano i amplifikowano za pomocą RT-PCR stosując następującą parę oligonukleotydów:
SB131 (38 mer) (SEQ IDN° 57)
5' AAAAACGCGTCGACATGGGTACTATAATTCAATTTCTG 3'
SB132 (38 mer) (SEQ ID N° 58)
5' TTTTCTAGTCTAGATTATTTATGATAAACAAAATTCTC 3'.
Produkt PCR strawiono SalI i Xbal, generując fragment 1594 bp i sklonowano w wektorze ekspresyjnym pVR1012 (przykład 1) uprzednio strawionym tymi samymi enzymami uzyskując plazmid pAB115 (6479 bp). Gen F typu dzikiego CPI-2 (SEQ ID N° 72) (fig. 27) sklonowany na tym plazmidzie koduje białko z 529 reszt.
3.1.2. pSB032: gen F (forma β-globina F ΔΤΜ) sklonowany w wektorze pVR1012
Plazmid pSB031 zawiera gen F skrócony o domenę transbłonową i C-końcową cytoplazmatyczną otrzymano w sposób następujący. Przeprowadzono reakcję PCR na matrycy pAB115 (przykład 3.1.1) za pomocą następujących oligonukleotydów:
SB131 (SEQ IDN°57) et
SB133 (41 mer) (SEQ ID N° 59)
5' TTTTCTAGTCTAGATTAGTATGTGTCACTTTGTGCTAAGTG 3', aby wygenerować fragment PCR około 1450 bp. Ten fragment strawiono za pomocą SalI i Xbal aby wyizolować fragment restrykcyjny Sall-Xbal 1436 bp. Ten fragment zligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) uprzednio strawionym SalI i Xbal aby uzyskać plazmid pSB031. Skrócony gen F CPI-2 koduje białko z 473 reszt.
W drugim etapie wstawiono sekwencję odpowiadającą intronowi II genu β-globiny królika powyżej sekwencji kodującej skróconego genu F CPI-2, w miejscu SalI plazmidu pSB031. Fragment DNA odpowiadający intronowi (573 bp) uzyskano za pomocą PCR stosując oligonukleotydy NS036 (SEQ ID N° 5) i NS037 (SEQ ID N° 6) na matrycy pNS050 (przykład 1), a następnie trawiono SalI aby uwolnić końce pasujące do SalI. Ten fragment restrykcyjny Sall-Sall zligowano z plazmidem pSB031 uprzednio strawionym SalI, a następnie defosforylowanym, aby uzyskać plazmid pSB032 (6884 bp) (fig. 5).
3.2 Plazmidy kodujące różne formy CPI-2 HN
3.2.1. pAB114: gen HN (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA HN genu CPI-2 zsyntetyzowano i zamplifikowano stosując następujące oligonukleotydy: SB134 (41 mer) (SEQ ID N° 60)
5' AAAAACGCGTCGACATGGTTGCAGAAGATGCCCCTGTTAGG 3'
SB135 (35 mer) (SEQ ID N° 61)
5' TTTTGGAAGATCTTTAGGATAGTGTCACCTGACGG 3', aby uzyskać fragment PCR około 1720 bp. Ten fragment strawiono SalI i Bglll aby wyizolować fragment Sall-Bglll o wielkości 1704 bp. Ten fragment następnie zligowano z wektorem pVR1012 (przy16
PL 210 451 B1 kład 1) uprzednio strawionym SalI i Bglll, aby uzyskać plazmid pAB114 (6566 bp). Gen HN typu dzikiego CPI-2 (SEQ ID N° 73) (fig. 28) sklonowany w tym plazmidzie koduje białko złożone z 565 reszt.
3.2.2. pSB034: gen HN (forma β-globina HN tPA ΔΤΜ) sklonowany w wektorze pVR1012
Formę skróconą genu HN CPI-2 uzyskano przez delecję fragmentu DNA kodującego 40 pierwszych reszt białka HN. Jako że sekwencje sygnałowe i transbłonowe tego białka są pomieszane, sekrecja skróconego produktu jest zapewniania przez uzyskanie fuzji w fazie między sekwencją sygnałową ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) i skróconego genu HN. Plazmid pSB033, pochodna pAB114 (przykład 3.2.1) kodujący produkt fuzji z tPA uzyskano za pomocą ligacji fragmentu EcoRI-Pmll pAB110 (przykład 1), pochodnej pVR1012 zawierającej otwartą ramkę odczytu kodującą sekwencję sygnałową tPA i fragmentu (1599 bp) otrzymanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB136 (37 mer) (SEQ ID N° 62)
5' TTAAAAGAATTCGACCCAAAAGCAAATCATGAGCCAC 3'
SB137 (33 mer) (SEQ ID N° 63)
5' TTAAAAGGCCTTTAGGATAGTGTCACCTGACGG 3' na matrycy pAB114 i trawienie EcoRI i EcoRV.
Intron II genu β-globiny królika wstawiono powyżej fazy kodującej genu HN w miejsce Sali pBS033, aby uzyskać plazmid pSB034 (fig. 6). Fragment SalI zawierający intron uzyskano za pomocą PCR stosując oligonukleotydy NS036 (SEQ ID N° 5) i NS037 (SEQ ID N° 6) na matrycy pNS050 (przykład 1).
P r z y k ł a d 4: Plazmidy kodujące różne formy glikoprotein wirusa CHV-1
Geny kodujące glikoproteiny gB, gC i gD szczepu Carmichael wirusa opryszczki psa typu 1 (CHV-1) wyizolowano za pomocą PCR wychodząc z genomu wirusa. Klonowanie genów kodujących gB i gD w wektorze pVR1012 było uprzednio opisane w zgłoszeniu patentowym WO-A-9803199 (plazmidy pAB037 i pAB038, odpowiednio na fig. 7 i 8 i w przykładach 13 i 14). Natomiast klonowanie genu kodującego gC jest opisane w tym dokumencie.
4.1. Plazmid kodujący skróconą formę CHV-gB
4.1.1. pSB016: gen gB (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gB CHV-1 (878 aminokwasów) jest umieszczona między resztami 702 i 769. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gB otrzymano przez ligację trzech następujących fragmentów DNA: (a) wektora pVR1012 (przykład 1) linearyzowanego za pomocą podwójnego trawienia Pstl-Xbal; (b) fragmentu 1997 bp uzyskanego przez trawienie Pstl-Nsil pAB037 (przykład 4) i (c) fragmentu 225 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB101 (22 mer) (SEQ ID N° 15)
5' TATATTGAAGGACAACTTGGGG 3' i
SB102 (36 mer) (SEQ ID N° 16)
5' CTAGTCTAGATTAATTATTATCAACTTTTACAACAC 3' stosując plazmid pAB037 jako matrycę i trawienie Nsil i Xbal. Powstały plazmid pSB016 (6983 bp) (fig. 7) zawiera skrócony gen gB kodujący białko z 701 reszt.
4.2. Plazmidy kodujące różne formy CHV - gC
4.2.1. pSB018: gen gC (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012.
Fragment DNA zawierający otwartą ramkę odczytu genu gC CHV-1 otrzymano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB105 (32 mer) (SEQ ID N° 19)
5' AAAACTGCAGATGAGTTTTAAAAATTTTTATC 3' i SB106 (30 mer) (SEQ ID N° 20)
5' CTAGTCTAGATTAGATCTTATTATTTTTTG 3' stosując DNA wirusa jako matrycę. Ten produkt PCR strawiono Pstl i Xbal generując fragment 1400 bp, który następnie zligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) zlinearyzowanym za pomocą tego samego podwójnego trawienia. Powstały plazmid pSB018 (6253 bp) zawiera gen kodujący glikoproteinę gC z 459 reszt.
4.2.2. pSB019: gen gC (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gC jest zawarta między resztami 422 i 452. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gD uzyskano za pomocą ligacji trzech następujących fragmentów DNA: (a) wektora pVR1012 (przykład 1) linearyzowanego za pomocą poPL 210 451 B1 dwójnego trawienia Pstl-Xbal; (b) fragmentu 934 bp uzyskanego przez trawienie Pstl-Stul pSB018 (poprzedni przykład) i (c) fragmentu 335 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB107 (24 mer) (SEQ ID N° 21)
5' TGGATTGACGGTCTTATAACACGC 3' i
SB108 (37 mer) (SEQ ID N° 22)
5' CTAGTCTAGATTAATTTTCATCCGATGCATCAAACAC 3' i stosując plazmid pSB018 jako matrycę i trawienie Stul i Xbal. Powstały plazmid pSB019 (6139 bp) (fig. 8) zawiera skrócony gen gC kodujący białko z 421 reszt.
4.3. Plazmid kodujący formę skróconą CHV-gD
4.3.1. pSB017: gen gD (forma ΔΤΜ) sklonowany w wektorze pVR1012
Domena transbłonowa białka gD CHV-1 (345 aminokwasów) jest zawarta między aminokwasami 310 i 328. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gD uzyskano przez ligację trzech następujących fragmentów DNA: (a) wektora pVR1012 (przykład 1) linearyzowanego za pomocą podwójnego trawienia Pstl-Notl; (b) fragmentu 663 bp uzyskanego przez trawienie PstI-AvaII pAB038 (przykład 4) i (c) fragmentu 415 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB103 (25 mer) (SEQ ID N° 17)
5' CGAGAAACTTGTTATTTTTCTAAAG 3' i SB104 (51 mer) (SEQ ID N° 18)
5' ATAAGAATGCGGCCGCAAAGGCTATATATTTTTTGGGGTATTATTTATTGG 3' i stosując plazmid pAB038 jako matrycę i trawienie AvaII i NotI. Powstały plazmid pSB017 (5819 bp) (fig. 9) zawiera skrócony gen gD kodujący białko z 309 reszt.
P r z y k ł a d 5: Plazmidy kodujące różne formy glikoprotein FHV-1
Geny kodujące glikoproteiny gB, gC i gD szczepu CO wirusa opryszczki kota typu 1 (FHV-1) izolowano za pomocą PCR na podstawie genomu wirusa. W przypadku genu kodującego gD, którego sekwencja nukleotydów jest identyczna do odpowiedniej sekwencji szczepu C-27 zastosowaliśmy plazmid pAB029 pochodną pVR1012 zawierającą odpowiadający gen sklonowany na podstawie szczepu C-27 i opisany w zgłoszeniu patentowym WO-A-9803660 (plazmid pAB029, fig. 12 i przykład 15).
5.1. Plazmidy kodujące różne formy FHV-gB
5.1.1. pSB020: gen gB (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Fragment DNA zawierający otwartą ramkę odczytu genu gB FHV-1 uzyskano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB113 (34 mer) (SEQ ID N° 27),
5' TTTTCTGCAGATGTCCACTCGTGGCGATCTTGGG 3' i SB114 (40 mer) (SEQ ID N° 28)
5' ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAAGATTTGTTTCAGTATC 3' stosując DNA wirusa jako matrycę. Produkt PCR strawiono Pstl i Notl uzyskując fragment 2849 bp, który następnie ligowano w wektorze pVR1012 (przykład 1) linearyzowanym za pomocą tego samego podwójnego trawienia. Powstały fragment pSB020 (7728 bp) zawiera gen kodujący glikoproteinę gB z 949 reszt.
5.1.2. pSB021: gen gB (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012.
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gB FHV-1 jest umieszczona między resztami 761 i 834. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gB otrzymano przez ligację trzech następujących fragmentów DNA: (a) wektora pVR1012 (przykład 1) linearyzowanego za pomocą podwójnego trawienia Pstl-Notl; (b) fragmentu 1839 bp uzyskanego przez trawienie Pstl-Hindll pSB020 (poprzedni przykład) i (c) fragmentu 447 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB109 (24 mer) (SEQ ID N° 23)
5' CTGTGGACAGAGACCCTAAAACTC 3' i SB110 (50 mer) (SEQ ID N° 24)
5' TTTCCTTTTGCGGCCGCTTATATGCTGTCTATATCATAAAATTTTAAGGC 3' stosując plazmid pSB020 jako matrycę i trawienie Hindll i Notl. Powstały plazmid pSB021 (7164 bp) (fig. 10) zawiera skrócony gen gB kodujący białko o długości 760 reszt.
PL 210 451 B1
5.2. Plazmidy kodujące różne formy FHV-gC
5.2.1. pSB022: gen gC (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Fragment DNA zawierający otwartą ramkę odczytu genu gC FHV-1 uzyskano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB115 (34 mer) (SEQ ID N° 29)
5' TTTTCTGCAGATGAGACGATATAGGATGGGACGC 3' i SB116 (34 mer) (SEO ID N° 30)
5' AGTTTAGCGGCCGCTTATAATCGCCGGGGATGAG 3' stosując DNA wirusowy jako matrycę. Ten produkt PCR strawiono Pstl i Notl generując fragment 1605 bp, który następnie ligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) linearyzowanym za pomocą tego samego podwójnego trawienia. Powstały plazmid pSB022 (6483 bp) zawiera gen kodujący glikoproteinę gC z 534 reszt.
5.2.2. pSB023: gen gC (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gC FHV-1 jest umieszczona między resztami 495 i 526. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gC otrzymano przez ligację dwóch następujących fragmentów DNA: (a) fragmentu 6198 bp uzyskanego przez trawienie pSB022 BclI-Notl (poprzedni przykład) i (b) fragmentu 168 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB117 (24 mer) (SEQ ID N° 31)
5' GTTAAATGTGTACCACGGGACGGG 3' i SB118 (41 mer) (SEQ ID N° 32)
5' AGTTTAGCGGCCGCTTATTCAGGGGACGCGTCGTAGACTTG 3' stosując plazmid pSB022 jako matrycę i trawienie Bcll i Notl. Powstały plazmid, pSB023 (6366 bp) (fig. 11) zawiera skrócony gen gC kodujący białko z 494 reszt.
5.3. Plazmid kodujący formę skróconą FHV-gD
5.3.1. pSB024: gen gD (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Domena transbłonowa białka gD FHV-1 (374 aminokwasy) jest zawarta między resztami 328 i 353. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gD uzyskano przez ligację dwóch następujących fragmentów DNA: (a) fragmentu 5712 bp uzyskanego przez trawienie pAB029 XbaI-BglII (przykład 5) i (b) fragmentu 129 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB111 (24 mer) (SEQ ID N° 25)
5' GATCGTCCCGCCATACCGTCTGGG 3' et
SB112 (39 mer) (SEQ ID N° 26)
5' TTTGGAAGATCTTTACTGATTATTCATGCCCTTGGGAGG 3' stosując plazmid pAB029 jako matrycę i trawienie Xbal i Bglll. Powstały plazmid, pSB024 (5841 bp) (fig. 12) zawiera skrócony gen gD kodujący białko z 327 reszt.
P r z y k ł a d 6: Plazmidy kodujące różne formy glikoprotein EHV-1.
Geny kodujące glikoproteiny gB, gC i gD szczepu 2234/88-2 EHV-1 wyizolowano za pomocą PCR na podstawie oczyszczonego DNA wirusa.
6.1. Plazmidy kodujące różne formy EHV-1 gB
6.1.1. pAB127: gen gB (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Ramkę kodującą genu gB EHV-1 zamplifikowano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
NS003 (30 mer) (SEQ ID N° 39)
5' TTCTGCAGATGTCCTCTGGTTGCCGTTCGT 3' i NS004 (30 mer) (SEQ ID N° 40)
5' TTTCTAGATTAAACCATTTTTTCATTTTCC 3', uzyskany fragment DNA strawiono Pstl i Xbal i zligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) linearyzowanym Pstl i Xbal generując plazmid pAB127 (7818 bp). Gen gB koduje białko z 980 aminokwasów.
6.1.2. pSB028: gen gB (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gB EHV-1 jest umieszczona między resztami 801 i 875. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gB otrzymano przez ligację dwóch następujących fragmentów DNA: (a) plazmidu pAB127 (przykład 6.1.1.) strawionego Afel i Xbal i (b) fragmentu 276 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB125 (24 mer) (SEQ ID N° 51)
PL 210 451 B1
5' AACAACAGAGGGTCGATAGAAGGC 3' i SB126 (39 mer) (SED ID N° 52)
5' AATTTTTCTAGATTACACGTTGACCACGCTGTCGATGTC 3' stosując plazmid pAB127 jako matrycę i trawienie Afel i Xbal. Powstały plazmid, pSB028 (7279 bp) zawiera skrócony gen gB EHV-1 kodujący białko z 800 reszt.
6.2. Plazmidy kodujące różne formy EHV-1 gC
6.2.1. pAB129: gen gC (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Fragment DNA zawierający otwartą ramkę odczytu kodującą gC EHV-1 zamplifikowano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
NS005 (31 mer) (SEQ ID N° 41)
5' TTGTCGACATGTGGTTGCCTAATCTCGTGAG 3' i NS006 (33 mer) (SEQ ID N° 42)
5' TTGGATCCCTAAAAGTCAGACTTCTTGTACGGC 3'.
Uzyskany produkt PCR strawiono SalI i BamHI uzyskując fragment 1412 bp, który następnie zligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) linearyzowanym tym samym podwójnym trawieniem. Powstały plazmid pAB129 (6281 bp) zawiera gen kodujący białko gC EHV-1 o wielkości 468 reszt.
6.2.2. pSB029: gen gC (forma ΔΤΜ) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gC EHV-1 jest umieszczona między resztami 429 i 455. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gC otrzymano przez ligację dwóch następujących fragmentów DNA: (a) plazmidu pAB129 (przykład 6.2.1.) linearyzowanego przez podwójne trawienie Aspl i BamHI i (b) fragmentu 287 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB127 (24 mer) (SEQ ID N° 53)
5' GATCCGGAGGAGGAATACACACCC 3' i SB128 (39 mer) (SEQ ID N° 54)
5' AATTTTGGATCCCTAAACCGGCCTGTCCTCAACAATCGG 3' stosując plazmid pAB129 jako matrycę i trawienie Aspl i BamHI. Powstały plazmid, pSB029 (6161 bp) zawiera skrócony gen gC EHV-1 kodujący białko z 428 reszt.
6.3. Plazmidy kodujące różne formy EHV-1 gD
6.3.1. pAB131: gen gD (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Fragment DNA zawierający otwartą ramkę odczytu kodującą gD EHV-1 zamplifikowano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
NS007 (33 mer) (SEQ ID N° 43)
5' TTGTCGACATGTCTACCTTCAAGCTTATGATGG 3' i NS008 (32 mer) (SEQ ID N° 44)
5' TTGGATCCTTACGGAAGCTGGGTATATTTAAC 3'.
Ten produkt PCR strawiono SalI i BamHI uzyskując fragment 1214 bp, który następnie zligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) linearyzowanym za pomocą tego samego podwójnego trawienia. Powstały plazmid pAB138 (6083 bp) zawiera gen kodujący białko gD z 402 reszt.
6.3.2. pSB030: gen gD (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gD EHV-1 jest umieszczona między resztami 348 i 371. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gD otrzymano przez ligację trzech następujących fragmentów DNA: (a) plazmidu pVR1012 (przykład 1) linearyzowanego za pomocą podwójnego trawienia Sall-BamHI, (b) fragmentu 825 bp pochodzącego z trawienia pAB131 (przykład 6.3.1.) SalI i BsmI i (c) fragmentu 239 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB129 (24 mer) (SEQ ID N° 55)
5' CGGTTTCTTGGTGAATTCAACTTC 3' i SB130 (42 mer) (SEQ ID N° 56)
5' AATTTTGGATCCTTACGTAGAGTTGCTCTTAGACGTTTTTGG 3' stosując plazmid pAB131 jako matrycę i trawienie BsmI i BamHI. Powstały plazmid, pSB030 (5921 bp) zawiera skrócony gen gD EHV-1 kodujący białko z 347 reszt.
P r z y k ł a d 7: Plazmidy kodujące różne formy glikoprotein EHV-4.
Geny kodujące glikoproteiny gB, gC i gD szczepu KYT445/2 EHV-4 wyizolowano za pomocą PCR wychodząc z oczyszczonego DNA wirusa.
PL 210 451 B1
7.1. Plazmidy kodujące różne formy EHV-4 gB
7.1.1. pAB136: gen gB (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Ramkę kodującą genu gB EHV-4 zamplifikowano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
AB325 (35 mer) (SEQ ID N° 33)
5' TTTCTGCAGATGTCCACTTGTTGCCGTGCTATTTG 3' i AB326 (31 mer) (SEQ ID N° 34)
5' TTTTCTAGATTAAACCATTTTTTCGCTTTCC 3', uzyskany fragment DNA strawiono Pstl i Xbal i zligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) linearyzowanym Pstl i Xbal generując plazmid pAB136 (7801 bp). Gen gB EHV-4 koduje białko z 975 aminokwasów.
7.1.2. pSB025: gen gB (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gB EHV-4 jest umieszczona między resztami 797 i 867. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gB otrzymano przez ligację dwóch następujących fragmentów DNA: (a) plazmidu pAB136 (przykład 7.1.1.) strawionego SplI i Xbal i (b) fragmentu 231 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB119 (36 mer) (SEQ ID N° 45)
5' TTTTGGTCTAGATTAGTCCACGTTGACAACGCTGTC 3' i SB120 (23 mer) (SEQ ID N° 46)
5' CGCAAGCTTATCGAGCCGTGCGC 3' stosując plazmid pAB136 jako matrycę i trawienie SplI i Xbal. Powstały plazmid, pSB025 (7264 bp) zawiera skrócony gen gB EHV-4 kodujący białko z 796 reszt.
7.2. Plazmidy kodujące różne formy EHV-4 gC
7.2.1. pAB137: gen gC (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Fragment DNA zawierający otwartą ramkę odczytu kodującą gC EHV-4 zamplifikowano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
AB327 (32 mer) (SEQ ID N° 35)
5' TTTGTCGACATGGGTTTGGTAAATATAATGCG 3' i AB328 (33 mer) (SEQ ID N° 36)
5' TTTGGATCCTTAGAAGTCTGCTTTCTTGTAGGG 3'.
Ten produkt PCR strawiono SalI i BamHI uzyskując fragment 1463 bp, który następnie zligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) linearyzowanym tym samym podwójnym trawieniem. Powstały plazmid pAB137 (6330 bp) zawiera gen kodujący glikoproteinę gC z 485 reszt.
7.2.2. pSB026: gen gC (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gC EHV-4 jest umieszczona między resztami 425 i 472. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gC otrzymano przez ligację dwóch następujących fragmentów DNA: (a) plazmidu pAB137 (przykład 7.2.1.) linearyzowanego przez podwójne trawienie AclI-BamHI i (b) fragmentu 237 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB121 (24 mer) (SEQ ID N° 47)
5' GTATCAATCCCAGCTGACCCCGAC 3' i SB122 (41 mer) (SEQ ID N° 48)
5' AATTTTGGATCCTTAGCCGTCCGGGTAACCCTCTATGATGC 3' stosując plazmid pAB137 jako matrycę i trawienie AclI i BamHI. Powstały plazmid, pSB026 (6147 bp) zawiera skrócony gen gC kodujący białko z 424 reszt.
7.3. Plazmidy kodujące różne formy EHV-4 gD
7.3.1. pAB138: gen gD (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Fragment DNA zawierający otwartą ramkę odczytu kodującą gD EHV-4 uzyskano za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
AB329 (33 mer) (SEQ ID N° 37)
5' TTTGTCGACATGTCTACCTTCAAGCCTATGATG 3' i AB330 (33 mer) (SEQ ID N° 38)
5' TTTGGATCCTTACGGAAGCTGAGTATATTTGAC 3'.
Ten produkt PCR strawiono SalI i BamHI uzyskując fragment 1214 bp, który następnie zligowano z wektorem pVR1012 (przykład 1) linearyzowanym za pomocą tego samego podwójnego trawienia. Powstały plazmid pAB138 (6081 bp) zawiera gen kodujący białko gD z 402 reszt.
PL 210 451 B1
7.3.2. pSB027: gen gD (forma ΔTM) sklonowany w wektorze pVR1012
Według profilu hydropatii domena transbłonowa białka gD EHV-4 jest umieszczona między resztami 348 i 371. Plazmid zawierający formę skróconą genu kodującego gD otrzymano przez ligację dwóch następujących fragmentów DNA: (a) plazmidu pAB138 (przykład 7.3.1.) linearyzowanego za pomocą podwójnego trawienia EcoRI-BamHI i (b) fragmentu 310 bp uzyskanego za pomocą PCR stosując następujące oligonukleotydy:
SB123 (24 mer) (SEQ ID N° 49)
5' TTTTCCGTAACAATTCCGAGCAGC 3' i SB124 (39 mer) (SEQ ID N° 50)
5' AATTTTGGATCCTTACGTAGAGTTGCTATTAGACGCTGG 3' stosując plazmid pAB138 jako matrycę i trawienie EcoRI i BamHI. Powstały plazmid, pSB027 (5919 bp) zawiera skrócony gen gD kodujący białko z 347 reszt.
P r z y k ł a d 8: Plazmid kodujący GM-CSF psa
8.1. Przygotowanie całkowitego RNA z limfocytów psa stymulowanych mitogenami in vitro
Krew psa zebrano w probówce zawierającej EDTA za pomocą pobrania krwi od suki rasy Beagle. Komórki jednojądrowe zebrano za pomocą wirowania na gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Komórki jednojądrowe psa następnie stymulowano konkanawaliną A (conA) (stężenie końcowe około 4 μg/ml) i fitohemaglutyniną A (stężenie końcowe około 10 μg/ml). Po stymulacji limfocyty „ConA” i „PHA” zebrano przez zdrapanie szalek hodowlanych i całkowity RNA tych komórek ekstrahowano stosując zestaw „mRNA isolation kit for White Blood Cells” (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325).
8.2. Izolacja genu kodującego GM-CSF psa i konstrukcja plazmidu pJP074
Całkowity RNA wyekstrahowany z limfoblastów psa stymulowanych ConA lub PHA (przykład 8.1) posłużył jako matryca do syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA. Tę pierwszą nić komplementarnego DNA zsyntetyzowano przez elongację oligonukleotydu p(dT)15 (Boehringer Mannheim Cat # 814 270). DNA komplementarny jednoniciowy następnie stosowano jako matrycę do reakcji PCR z następującymi oligonukleotydami:
JP578 (SEQ ID N° 64) (33 mer)
5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' i JP579 (SEQ ID N° 65) (36 mer)
5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3' aby zamplifikować fragment PCR około 450 par zasad (bp). Ten fragment oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym a następnie zligowano z wektorem pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aby uzyskać plazmid pJP074. Sekwencja genu GM-CSF psa sklonowanego w pJP074 okazała się równoważna z sekwencją GM-CSF psa dostępną w GenBank (numer dostępu S49738).
8.3. Konstrukcja plazmidu pJP084 i sekwencja GM-CSF psa
Plazmid pJP074 (przykład 8.2) strawiono Notl aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment Notl-Notl o wielkości około 450 bp zawierający gen GM-CSF psa. Ten fragment zligowano z plazmidem pVR1012 (przykład 1). Klon zawierający sekwencję GM-CSF psa (SEQ ID N° 66, fig. 20) w dobrej orientacji względem promotora hCMV/IE nazwano pJP084. Plazmid ten ma wielkość 5364 bp (fig. 19).
P r z y k ł a d 9: Plazmid kodujący GM-CSF kota
9.1. Przygotowanie całkowitego RNA z limfocytów kota stymulowanych mitogenami in vitro
Krew kota zebrano w probówce zawierającej EDTA za pomocą pobrania krwi. Komórki jednojądrowe zebrano za pomocą wirowania na gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Komórki jednojądrowe kota następnie stymulowano konkanawaliną A (conA) (stężenie końcowe około 4 μg/ml) i fitohemaglutyniną A (stężenie końcowe około 10 μg/ml). Po stymulacji limfocyty „ConA” i „PHA” zebrano przez zdrapanie szalek hodowlanych i całkowity RNA tych komórek ekstrahowano stosując zestaw „mRNA isolation kit for White Blood Cells” (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325).
9.2. Izolacja genu kodującego GM-CSF kota i konstrukcja plazmidów pJP089 i pJP090
Całkowity RNA wyekstrahowany z limfoblastów kota stymulowanych ConA i PHA (przykład 9.1) posłużył jako matryca do syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA. Tę pierwszą nić komplementarnego DNA zsyntetyzowano przez elongację oligonukleotydu p(dT)15 (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 814 270). DNA komplementarny jednoniciowy następnie stosowano jako matrycę do reakcji PCK z następującymi oligonukleotydami:
PL 210 451 B1
JP578 (SEQ ID N° 64) (33 mer)
5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' i JP579 (SEQ ID N° 65) (36 mer)
5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3' aby zamplifikować fragment PCR około 450 par zasad (bp). Ten fragment strawiono Notl aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment Notl-Notl 450 bp. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pVR1012 (przykład 1). Zidentyfikowano dwa klony zawierające sekwencję GMCSF kota (SEQ ID N° 67 i SEQ ID N° 68) w dobrej orientacji pod względem promotora hCMV/IE odpowiednio pJP089 i pJP90. Te dwa plazmidy mają wielkość 5364 bp (fig. 21 i 23).
Sekwencja genu GM-CSF kota sklonowana w plazmidzie pJP089 zawiera 13 różnic na poziomie nukleotydów od sekwencji GM-CSF kota dostępnej w GenBank (numer dostępu AF053007). Najważniejszą zmianą jest zmiana C > T, która pociąga za sobą zmianę leucyna > fenyloalanina dla aminokwasu (pierwsza zasada kodonu dla aminokwasu # 107; fig. 22). Sekwencja genu GM-CSF kota sklonowana w plazmidzie pJP090 jest ekwiwalentna do tej zawartej w plazmidzie pJP089 poza tym, że zmiana leucyna > fenyloalanina nie jest obecna dla aminokwasie # 107 (fig. 24). Sprawdzenie sekwencji 3' genu GM-CSF kota za pomocą zestawu 3' RACE wykazała, że w tej pozycji 107 może być obecny u tego samego kota aminokwas leucyna lub aminokwas fenyloalanina.
P r z y k ł a d 10: Plazmid kodujący GM-CSF konia
10.1. Przygotowanie całkowitego RNA z limfocytów konia stymulowanych in vitro mitogenami
Krew konia zebrano w probówce zawierającej EDTA za pomocą pobrania krwi z żyły szyjnej. Komórki jednojądrowe zebrano za pomocą wirowania na gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Komórki jednojądrowe konia stymulowano konkanawaliną A (ConA) (stężenie końcowe około 5 μg/ml) i fitohemaglutyniną A (stężenie końcowe około 10 μg/ml). Po stymulacji limfoblasty „ConA” i „PHA” zebrano przez zdrapanie z szalek hodowlanych i całkowity RNA tych komórek ekstrahowano stosując zestaw „mRNA isolation kit for White Blood Cells” (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325).
10.2. Izolacja genu kodującego GM-CSF konia
Całkowity RNA wyekstrahowany z limfoblastów konia stymulowanych ConA lub PHA (przykład 10.1) posłużył jako matryca do syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA. Tę pierwszą nić komplementarnego DNA zsyntetyzowano przez elongację oligonukleotydu p(dT)15 (Boehringer Mannheim Cat # 814 270). DNA komplementarny jednoniciowy następnie stosowano jako matrycę do reakcji PCR z następującymi oligonukleotydami:
JP734 (SEQ ID N° 70) (44 mer)
5' CATCATCATGTCGACGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCT 3' i JP735 (SEQ ID N° 71) (41 mer)
5' CATCATCATGCGGCCGCTACTTCTGGGCTGCTGGCTTCCAG 3' aby zamplifikować fragment PCR około 500 par zasad (bp). Ten fragment oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
10.3. Konstrukcja plazmidu pJP097 i sekwencja GM-CSF konia
Oczyszczony fragment PCR uzyskany w przykładzie 10.2 strawiono Notl aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment Notl-Notl o wielkości około 450 bp zawierający gen GMCSF konia. Ten fragment zligowano z plazmidem pVR1012 (przykład 1). Klon zawierający sekwencję GM-CSF konia (SEQ ID N° 69, fig. 26) w dobrej orientacji względem promotora hCMV/IE nazwano pJP097. Plazmid ten ma wielkość 5334 bp (fig. 25).
P r z y k ł a d 11: Tabela zbiorcza plazmidów
| Patogen | Antygen | Liczba reszt w formie natywnej | Domena TM | Liczba reszt w formie skróconej | Plazmidy ekspresyjne |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| CDV | F | 662 | 606-626 | 605 | pPB229 i pNS021* |
| HA | 607 | 1-60** | 574 | pNS018 i pNS024* | |
| CPI-2 | F | 529 | 474-517 | 473 | pAB115 i pSB032* |
| HN | 565 | 1-40** | 557 | pAB114 i pSB034 |
PL 210 451 B1 cd. przykładu
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| CHV-1 | gB | 878 | 702-769 | 701 | pAB037 i pSB016* |
| gC | 459 | 422-452 | 421 | pSB018 i pSB019* | |
| gD | 345 | 310-328 | 309 | pAB038 i pSB017* | |
| FHV-1 | gB | 949 | 761-834 | 760 | pSB020 i pSB021* |
| gC | 534 | 495-526 | 494 | pSB022 i pSB023* | |
| gD | 374 | 328-353 | 327 | pAB029 i pSB024* | |
| EHV-1 | gB | 980 | 801-875 | 800 | pAB127 i pSB028* |
| gC | 468 | 429-455 | 428 | pAB129 i pSB029* | |
| gD | 402 | 348-371 | 347 | pAB131 i pSB030* | |
| EHV-4 | gB | 975 | 797-867 | 796 | pAB136 i pSB025* |
| gC | 485 | 425-472 | 424 | pAB137 i pSB026* | |
| gD | 402 | 348-371 | 347 | pAB138 i pSB027* |
* Plazmidy kodujące formy skrócone antygenów ** Szczególny przypadek genów HA CDV i HN CPI-2: zachodząca sekwencja transbłonowa i sygnałowa
P r z y k ł a d 12: Metody biologii molekularnej
Hodowla i oczyszczanie wirusa
Wirusy hodowano na odpowiednich systemach komórkowych aż do wywołania efektu cytopatycznego. Systemy komórkowe do stosowania dla każdego wirusa są dobrze znane specjaliście. Pokrótce odpowiednie komórki zakażano szczepem badanego wirusa z wielokrotnością zakażenia 1 oraz inkubowano w temperaturze 37°C w czasie potrzebnym do wywołania efektu cytopatycznego (średnio 36 godzin).
Dla wirusów DNA po hodowli supernatant i komórki lizowane zebrano i odrzucono resztki komórek za pomocą wirowania przy 1000 g w 4°C przez 10 minut. Cząsteczki wirusa zebrano przez ultrawirowanie przy 400000 g i 4°C podczas 1 godziny. Osady zawieszono w minimalnej ilości buforu (Tris 10 mM, EDTA 1 mM).
Wirusy RNA oczyszczono za pomocą standardowych technik oczyszczania dobrze znanych specjaliście.
Ekstrakcja genomowego DNA wirusa
Zatężone zawiesiny wirusów poddano działaniu proteinazy K (końcowe 100 mg/ml) w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS) (końcowe 0,5%) podczas 2 godzin w 37°C. DNA wirusowy następnie wyekstrahowano za pomocą mieszaniny fenol/chloroform, a następnie strącono dwiema objętościami absolutnego etanolu w -20°C podczas 16 godzin i następnie wirowano przy 10000 g przez 15 minut przy 4°C. Osady DNA wysuszono, a następnie zawieszono w minimalnej objętości ultraczystej sterylnej wody.
Ekstrakcja genomowego RNA wirusa
RNA genomowy każdego wirusa ekstrahowano stosując technikę „rodanek guanidyny-fenolchloroform”, którą opisali P. Chomczynski i N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987. 162. 156-159).
Techniki biologii molekularnej
Wszystkie konstrukcje plazmidów przeprowadzono stosując standardowe techniki biologii molekularnej opisane przez Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne stosowane do tego wynalazku wyizolowano za pomocą zestawu „Geneclean” (BIO101 Inc., La Jolla, CA). Dla tych wszystkich konstrukcji, sklonowane fragmenty DNA jak i styki z wektorami ekspresyjnymi sekwencjonowano metodą Sangera (Sambrook i wsp., 1989).
PCR i RT-PCR
Specyficzne oligonukleotydy dla genów i fragmenty sklonowanych genów syntetyzowano, niektóre z nich zawierają w pewnych przypadkach na swoich końcach 5' miejsca restrykcyjne ułatwiające klonowanie zamplifikowanych fragmentów. Reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przeprowadzono stosując standardowe techniki (Sambrook i wsp., 1989).
Oczyszczanie plazmidów na dużą skalę
Produkcję na skalę dziesiątków mg oczyszczonych plazmidów wchodzących w kompozycje szczepionek przeprowadzono metodą gradientu chlorku cezu - bromku etydyny (Sambrook i wsp., 1989).
PL 210 451 B1
P r z y k ł a d 13: Formułowanie plazmidów do szczepionek
Roztwór DNA zawierający jeden lub kilka plazmidów według przykładów 2 do 10 zatężano za pomocą strącenia etanolem jak opisano w Sambrook i wsp. (1989). Osad DNA zawieszano w roztworze 0,9% NaCl tak aby uzyskać stężenie 1 mg/ml. Roztwór 0,75 mM DMRIE-DOPE przygotowano przez zawieszenie liofilizatu DMRIE-DOPE w odpowiedniej objętości sterylnej H2O.
Tworzenie kompleksów DNA plazmidowy-lipid przeprowadza się przez rozcieńczenie w równych częściach 0,75 mM roztworu DMRIE-DOPE roztworem DNA 1 mg/ml. Roztwór DNA wprowadza się stopniowo za pomocą sterylnej igły 26G wzdłuż ściany butelki zawierającej roztwór kationowego lipidu aby uniknąć wytwarzania piany. Następnie miesza się łagodnie od momentu gdy dwa roztwory zmieszają się. Wówczas otrzymuje się końcowo kompozycję zawierającą 0,375 mM DMRIE-DOPE i 500 μ g/ml DNA.
Jest korzystne, aby całość stosowanych roztworów była w temperaturze pokojowej dla operacji opisanych powyżej. Pozwala się na zachodzenie kompleksowania DNA/DMRIE-DOPE w temperaturze pokojowej w czasie 30 minut przed immunizacją zwierząt.
P r z y k ł a d 14. Immunizacją psów przeciwko CDV
Zastrzyk 2 ml drogą podskórną lub domięśniową powtórzony po 28 dniach. Masa całkowita plazmidów stosowanych w czasie każdej immunizacji wynosi 100, 500, 1000 lub 2000 μg w zależności od szczepionki. Specjalista ma potrzebną wiedzę, aby przystosować objętość lub stężenie w zależności od wymaganej dawki plazmidu.
14.1. Test wirulencji
Szczep stosowany do testu odpowiada homogenatowi śledziony pobranej od psa zakażonego wirusem nosówki psa, szczep Snyder-Hill i rozcieńczonej sto razy buforem PBS. Rozcieńczenie przetrzymuje się na tłuczonym lodzie aż do użycia.
Po ogólnym znieczuleniu podaje się testowy szczep rozcieńczony sto razy drogą doczaszkową w objętości 0,5 ml, 49 dni po pierwszym zastrzyku.
14.2. Oznaki kliniczne po teście
Badania kliniczne przeprowadzono podczas 21 dni po teście i obejmowały dla każdego psa badanie kliniczne, aby wykryć ewentualne oznaki kliniczne nosówki psa (choroby Carre'go) i mierzenie temperatury w odbycie.
Badanie kliniczne obejmuje:
- Obserwację stanu ogólnego zwierzęcia według skali o 4 poziomach: „dobry” z wartością 0, „apatia” z wartością 1, „depresja” z wartością 2 i „prostracja” z wartością 3. Śmierć zwierzęcia oznacza wartość kliniczną 10.
- Ocena objawów oczno-nosowych (poszukiwanie wycieku surowiczego lub zapalnego, zapalenia nosa i/lub zapalenia spojówek). Zapalenie spojówek/nosa z surowiczym wyciekiem z nosa odpowiada wartości 1, z wyciekiem zapalnym z nosa odpowiada wartości 2.
- Ocena objawów związanych z trawieniem (poszukiwanie oznak zapalenia żołądka i jelit). Lekkie zapalenia żołądka i jelit odpowiada wartości 1, ostre wartości 2.
- Poszukiwanie objawów układu nerwowego (poszukiwanie mioklonii, konwulsji i/lub paraliżu). Mioklonia odpowiada wartości 1, konwulsja wartości 2, a paraliż wartości 3.
- Badanie temperatury ciała zwierzęcia.
Temperatura mniejsza lub równa 37,5°C odpowiada wartości 3, temperatura zawarta pomiędzy 37,5°C i 39,5°C odpowiada wartości 0, temperatura równa 39,5°C lub zawarta między 39,5°C i 40°C odpowiada wartości 1, temperatura równa 40°C lub zawarta między 40°C i 40,5°C odpowiada wartości 2 i w końcu temperatura wyższa od 40,5°C odpowiada wartości 3.
Od zwierząt, które padły w teście pobierano śledzionę, aby wykazać wirusa nosówki psa za pomocą immunofluorescencji.
Wyliczono ogólną wartość kliniczną w następujący sposób: dla każdego objawu klinicznego uzyskano średnią wartość dla grupy zwierząt w okresie obserwacji i całkowita wartość jest sumą wartości średnich dla pięciu rozważanych objawów klinicznych.
PL 210 451 B1
Wyniki doświadczeń po próbach immunizacji psów na drodze domięśniowej:
| Plazmid | Formuła | Antygeny | Dawka | Cytokina | Śmiertel- ność | Wartość kliniczna | Odpowiedź przeciwciał* |
| Kontrola | - | - | - | - | 4/4 | 26,1 | 0,3 +/- 0,3 |
| pNS018 pPB229 | - | HA natywny F natywny | 50 μ g 50 μα | - | 4/5 | 21,6 | 0,3 +/- 0,2 |
| pNS018 pPB229 | DMRIE- DOPE | HA natywny F natywny | 50 μα 50 μα | - | 1/5 | 7,8 | 0,8 +/- 0,3 |
| pNS024 pNS021 | DMRIE- DOPE | HA optymalizowany F optymalizowany | 50 μα 50 μα | - | 1/5 | 7,2 | 1,9+/-0,8 |
| pNS024 pNS021 | DMRIE- DOPE | HA optymalizowany F optymalizowany | 500 μα 500 μα | - | 0/5 | 0,6 | 1,5+/-0,3 |
* wartość średnia +/- odchylenie standardowe
| Plazmid | Formuła | Antyαeny | Dawka | Cytokina | Śmier- telność | Wartość kliniczna | Odpowiedź przeciwciał* |
| Kontrola | - | - | - | - | 4/4 | 25,0 | 0,2 +/- 0,0 |
| pNS018 pPB229 | DMRIE- DOPE | HA natywny F natywny | 50 μα 50 μα | - | 5/5 | 24,4 | 0,2 +/- 0,0 |
| pNS018 pPB229 | DMRIE- DOPE | HA natywny F natywny | 500 μα 500 μα | - | 3/5 | 19,0 | 0,4+/-0,2 |
| pNS024 pNS021 | DMRIE- DOPE | HA optymalizowany F optymalizowany | 500 μα 500 μα | - | 1/5 | 9,2 | 0,6 +/- 0,7 |
| pNS024 pNS021 pJP084 | DMRIE- DOPE | HA optymalizowany F optymalizowany | 500 μα 500 μα 200 μα | GM- CSF | 0/5 | 2,4 | 1,7+/- 0,9 |
| pNS024 | DMRIE- DOPE | HA optymalizowany | 500 μα | - | 0/5 | 0,8 | 1,4+/-1,0 |
| pNS024 pNS021 pNS016 pNS017 | DMRIE- DOPE | HA optymalizowany F optymalizowany M natywny N natywny | 500 μα 500 μα 500 μα 500 μα | 0/5 | 5 | 1,4+/-1,3 |
* wartość średnia +/- odchylenie standardowe
Plazmidy pNS016 i pNS017 wstawiają odpowiednio gen natywny M i gen natywny N, były skonstruowane w ten sam sposób jak plazmid pNS018.
Jest zadziwiające stwierdzenie, że wynik ochrony uzyskanej z samym HA optymalizowanym jest lepszy lub równy wynikom uzyskanym z optymalizowanymi HA i F lub z optymalizowanymi HA i F + natywne M i N.
Należy mieć na uwadze, że wynalazek określony przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do poszczególnych sposobów wykonania wskazanych w powyższym opisie, ale obejmuje warianty, które nie wykraczają poza zakres ani zamysł niniejszego wynalazku.
PL 210 451 B1
Lisia sekwencji
| <110> | MERIAL | |||
| <120> | Ulepszona szczepionka | dla | zwierząt | domowych |
| <130> | Ulepszona szczepionka | dla | zwierząt | domowych |
| <140> <141> | numer zgłoszenia data zgłoszenia | |||
| <160> | 73 | |||
| <no> | Patentln Ver. 2.1 | |||
| <210> <211> <212> <213> | 1 21 DNA Sekwencja Syntetyczna | |||
| <220> <223> | Opis Sekwencji Syntetyczn | ej : |
oligonukieotyd <4C0> 1 atgagcccac tcttacaaca a 21 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukieotyd <400> 2 tttcgcggat ccattaaagg aagagcgcct aaccg 35 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukieotyd <400> 3 tttcgcggat cccacaaagt atcaaccagc 30 <210> 4 <21^> 23 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej:
PL 210 451 B1 oligonukleotyd <400> 4 gggatttgct gccgatgcaa tag <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 5 tttacgcgtc gacttgggga cccttgattg ttc <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <223>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <403> 6 tttacgcgtc gacctgtagg aaaaagaaga aggcat <210> 7 <211> 20 <212> DNA ' <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej oligonukleotyd <400> 7 ttggggaccc ttgattgttc <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <223>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej oligonukleotyd <400> 8 ctgtaggaaa aagaagaagg c <210> 9 <2i 1> 40 <212> DNA
PL 210 451 B1 <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 9 gatctgcagc acgtgtctag aggatatcga attcgcggcc 40 <210 10 <210 40 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 10 gatccgcggc cgcgaattcg atatccteta gacacgtgct 40
| <210> | 11 | |
| <210 | 30 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | Sekwencja Synt | etyczna |
| <220> | ||
| <223> | Opis Sekwencji oligonukleotyd | Syntetycznej |
| <4C0> | 11 |
ttctgcagat gctctcctac caagayaagg 30 <210> 12 <210 28 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400 12 ttgtcgacat gtgtatcatc atmctgtc 28 <210 13 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetyczne]: oligonukleotyd <400> 13 tttczagaca gccgagcccc atgcac 26
PL 210 451 B1 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <22C>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 14 ttggatccga tatatgacca gaatacttca 30 <210> lb <2il> 22 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 15 tatattgaag gacaacttgg gg 22 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 16 ctagtctaga ttaattatta tcaactttta caacac 36 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Op.i s Sekwencji Syntetycznej: ol:gonukleotyd <400> 17 cgagaaacttgttatttttctaaag 25 <210> 18 <211> 51 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetyczne]:
oligonukleotyd
PL 210 451 B1
| <400 ataags | 13 latgc ggccgcaaag gctatatatt ttttggggca ttatttattg g | 51 |
| <210> | 19 | |
| <210 | 32 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | Sekwencja Syntetyczna | |
| <220> | ||
| <223> | Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd | |
| < 4 0 0 > | 19 |
aaaactgcag atgagtttta aaaattctta tc <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligcnukleotyd <400> 20 ctagtctaga ctagatctta ttattttttg 30 <210> 21 <210 24 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <40C> 21 tggattgacg gtcttataac accc 24 <210 22 <210 37 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400 22 ctagtctaga ttaattttca tccgatgcat caaacac <210> 23 <210 24 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna
PL 210 451 B1 <220>
<223>
Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 23 ctgtggacag agaccctaaa actc <210> 24 <211> 50 <212> ONA <21 3> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 24 tttccttttg cggccgctta tatgctgtct atatcataaa attttaaggc 50 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400>
<400> 25 .
gatcgtcccg ccataccgtc tggg <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 26 tttggaagat ctttactgat tattcatgcc cttgggagg 39 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej:
oligonukleotyd <400> 27 ttttctgcag atgtccactc gtggcgatct tggg
PL 210 451 B1 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 28 atagtttagc ggccgcttag acaagatttg tttcagtatc 40 <210> 29 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 29 ttttctgcaę atgagacgat ataggatggg acgc 34 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 30 agttcagcgg ccgcttataa tcgccgggga tgag 34 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <4C0> 31 gttaaatgtg taccacggga cggg 24 <210> 32 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej:
oligonukleotyd
PL 210 451 B1 <4 00> 32 agtttagcgg ccgcttattc agcggacgcg tcgtagaczfc g <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <40C> 33 cttctgcaga tytccacttg tcgccgtgct atttg < 210 > 34 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna < 2 2 0 >' <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: o1 i gonu kle o t y d <400> 34 ttctctagat taaaccattt tttcgctttc c
| <210> | 35 |
| <211> | 32 |
| <212> | DNA |
| <2.1 3> | y £5 kw· |
| <220> | |
| <223> | Oc i s |
oligonukleotyd <40 0 > 35
| ttt. gtc | cgaca cgggtttggt aaatataatg cg | 32 |
| <210> | 36 | |
| <21i> | 33 | |
| <212> | DNA | |
| <21 3> | Sekwencja Syntetyczna | |
| <220> | ||
| <223> | Opis Sekwencji Syntetycznej: | |
| oligonukleotyd | ||
| <400> | 36 |
Lct.ggatcct ragaagtctg ccttcttgta ggg <210> 3<
<21 1> 33 <212> DNA <21 3> Sekwencja Syntetyczna
PL 210 451 B1 <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukieotyd <400> 37 tttgtcgaca tgtctaccct caagcctatg atg <210> 38 <210 33 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220
Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukieotyd <400> 38 ttcggatcct tacggaagct gagtatattt gac
| <210> | 39 | |
| <211> | 30 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | Sekwencja Synte | tyczna |
| <220> | ||
| <223> | Opis Sekwencji oligonukieotyd | Syntetycznej |
<400> 39 ttctgcagat gtcctctggt tgccgttcgt <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleocyd < 4 O O > 4 0 tttctagatt aaaccatttt ttcatttccc <210 41 <210 31 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oiigonukleotyc <400 41 ttgtcgacat gtggtcgcct aatctcgtga g <210 4 2
PL 210 451 B1 <211> 33 <21?> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 42 ttggatocct aaaagtcaga cttcttgtac ggc < 21 (I > 4 3 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 43 ttgtcgacat gtctaccttc aagcttatga tgg <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <4 00> 44 ttggatcctt acggaagctg ggtatattta ac
| <210> | 4 5 | |
| <211> | 36 | |
| < 212 > | DNA | |
| <213> | Sekwencja Syntc | tyczna |
| <220 | ||
| <223> | Opis Sekwencji oligonukleotyd | Syntetycznej |
<400> 45 ttttggtcta gattagtcca cgttgacaac gctgtc
| <210 | 46 |
| <2 11 > | 23 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja Syntetyczna |
| <220> | |
| <223> | Opis Sekwencji Syntec oligonukleotyd |
| <400 | 46 |
PL 210 451 B1 cgcaagctta tcgagccgtg cgc <210> 47 <210 24 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna < 2 2 0 >
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej:
oligonukleotyd <400> 47 gtatcaatcc cagctgaccc cgac <21 0> 48 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 48 aattttggat ccttagccgt ccgggtaacc ctctatgatg c 41 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <2±3> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 49 ttttccgtaa caattccgag cage <210> 50 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 50 aattttggat ccttacgtag agttgctatt agacgctgg 39 <210> 51 < 2 1 1 > 2 4 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
PL 210 451 B1 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 51 aacaacacag ggtcgaraga aggc 24 <210> 52 <210 39 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <4 00 52 aatttttcta gattacacgt tgac.cacgot gtcgatgtc 39 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Synr.etycz.nej : oligonukleotyd <400> 53 gatccggagg aggaatacac accc 24 <210 54 ' <210 39 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400 54 aattttggat cccLaaaccg gcctgtcctc aacaatcgg 39 <210 55 <210 24 <212> DNA <21 3> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400 55 cggtttcttg gtgaattcaa cttc 24 <210> 50· <211> 42
PL 210 451 B1 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 56 aattttggat ccttacgtag agttgctctt agacgttttt gg 42 <210 57 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 57 aaaaacgcgt cgacatgggt actataattc aatttctg 38 <210> 58 <210 38 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400 58 ttttctagtc tagattattt atgataaaca aaattctc 38 <210> 59 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 59 ttttctagtc tagattagta tgtgtcactt zgtgctaagt g 41 <210> 60 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 60 aaaaacgcgt cgacatggtt gcagaagatg cccctgttag g 41
PL 210 451 B1 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 61 ttttggaaga tctttaggat agtgtcacct gacgg <21 0> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 62 ttaaaagaat tcgacccaaa agcaaatcat gagccac <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <403> 63 ttaaaaggcc tttaggatag tgtcacctga cgg <213> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <22 0>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 64 tatgcggccg ccaccatgtg gctgcagaac ctg <210> 65 <21 1> 36 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej
PL 210 451 B1 oligonukleotyd < 4 0 0 > 6 5 tatgcggccg ctacgtatca cutcttgact ggtttc 36 <210> 66 <211> 435 <212> DNA <213> Canis sp.
<400> 66
| atgtggctgc | agaacctgct | tttcctgggc | actgtggtct | gcagcatctc | tgcacccacc | 60 |
| cgctcaccca | cccttgtcac | tcggccctct | cagcacgtgg | atgccatcca | ggaagccctg | 120 |
| agccttttga | acaacagtaa | tgacgtgact | gctgtgatga | ataaagcagt | aaaagtggtc | 180 |
| tctgaagtgt | ttgaccctga | ggggccaaca | tgcctggaga | cccgcctaca | gctgtacaag | 240 |
| gagggcctgc | agggcagcct | caccagcctc | aagaatccct | taaccatgat | ggccaatcac | 300 |
| tataagcagc | actgtccccc | taccccggaa | tctccctgtg | caacccagaa | tattaacrtc | 360 |
| aaaagtttca | aagagaacct | gaaggatttt. | ctgtttaaca | tcccctttga | ctgctggaaa | 420 |
| ccagtcaaga | agtga | 435 |
| <21C> 67 <211> 435 <212> DNA <213> Felii | a catus | |||||
| <400> 67 atgtggctgc | agaacccgct | tttcctgggc | actgtggtct | gcagcatctc | tgcacccacc | 60 |
| agttcaccca | gctctgtcac | tcggccctgg | caacacgtgg | atgccatcaa | ggaggctctg | 120 |
| agccttctga | acaacagtag | tgaaataact | gctgtgafega | atgaagcagt | agaagtcgtc | 180 |
| tctgaaatgt | ttgaccctga | ggagccgaaa | tgcctgcaga | ctcacctaaa | gctgtacgag | 240 |
| cagggcct ac | ggggcagcct | catcagcctc | aacgagcctc | tgagaatgat | ggccaaccat | 300 |
| tacaagcagc | actgcccctt | tactccggaa | acgccctgtg | dddCCCSęSC | t a Ł c a c e 11 c | 360 |
| aaaaatttca | aagagaatct | gaaggatttt | ctgtttaaca | tcccctttga | ctgctggaaa | 420 |
| ccagtcaaga | agtga | 435 |
| <210> 68 <211> 435 <212> DNA <213> Felis | catus | |||||
| < 4 C 0 > 68 atgtggctgc | agaacctgct | tttcctgggc | actgtggtct | gcagcatctc | tgcacccacc | 60 |
| agttcaccca | getergtcac | tcggccctgg | caacacgtgg | atgccatcaa | ggaggctctg | 120 |
| agccttctga | acaacagtag | tgaaataact | gctgtgatga | atgaagcagt | agaagtcgtc | 180 |
| tctgaaatgt | ttgaccctga | ggagccgaaa | tgcctgcaga | ctcacctaaa | gctgtacgag | 240 |
| cagggcctac | ggggcagcct | catcagcctc | aaggagcctc | tgagaatgat | ggccaaccat | 300 |
| Cacaagcagc | actgccccct | tactccggaa | acgccctgtg | aaacccagac | tatcaccttc | 360 |
| aaaaatttca | aagagaatct | gaaggatttt | ctgtrtaaca | tcccctttga | ctgctggaaa | 420 |
| ccagtcaaga | agtga | 435 |
| <210> | 69 | |
| <211> | 435 | |
| <212> | DNA | |
| <21 3> | F.guus | i sp. |
| <4 00> | 6 9 | |
| atgrggctgc | agaacctgct tcttctgggc actgtggttt acagcatgcc cgcacccacc 60 |
PL 210 451 B1 cgccaaccca agccttctga tctgaaacgt cagggcttgc tacaagcagc aaaagtttca ccagcccaga gccctgtcac acaacagtag -tgacgccga ggggcagcct actgcccccc aaaagaacct agtaa tcggccctgg tgacactgct ggagctgaca catcaagctc caccctggaa gaaggatttt cagcatgtgg gctatcatca tccctgcaga gaaggcccct acttcctgtg ctgtttgaga
| atgccatcaa | ggaggccctg | 120 |
| atgaaacagt | agaagt.cgtc | 180 |
| ctcgcctgaa | gctgtacaaa | 240 |
| tgaccacgat | ggccagccac | 300 |
| caacccagat | gatcaccttc | 360 |
| tcccgtttga | ctgctggaag | 420 435 |
<210 70 <210 44 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220 <223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <400> 70 catcatcatg tcgacgccac catgtggctg cagaacc.tgc ttet 44 <210> 71 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja Syntetyczna <220>
<223> Opis Sekwencji Syntetycznej: oligonukleotyd <4C0> 71 catcatcatg cggccgctac tcctgggctg ctggcttcca g 41 <210> 72 <210 1590 <212> DNA <213> wirus paragrypy psa <400 72 atgggtacta gatetageag tatactgagg attagtggao cagccgatcg cgccggtttg gtcactgccg aaaaatgcaa ctaggaacgg acagcagcca accgagttga at Lcaagctt aatacccaga ggattagatt caacctgcaa gtcatggccc gcat cgcaat eteteagatg gtggttggga aggtcgaigt taattcaatt ccctcatgca cctcatcagc gtaatataac gtgagaattz caggggtggt cagtagcacz
Cccaaaaaac cagttcaagc attgtaaggc caactatctt taaggatcct taagfegeage tgacctatat cccagatcat a a 11 a c c a a c gcactattac atacgatggc gctttctcac tatgcaagtg tcoggtggtc aa ccggtgtc atteattgtt atcaatttca ggaaacgatt. gat.tggatta agtaaaggca aaatacagca agttcaagat ccaagatgct ccacaatcaa actggggagt rgagcttctc gcagatggtc agatctggcc acgtgttatt acccaacacL ttgcctccaa tcgattcgtg catgcagcct tcctgtctat attccaacaa gtgaagttaa agctataatg aggaaccagt getgeattag aataaaaatg gttgcagatg cacataaaca ateattggee attacaaacc accttgccga tcatcagggt ataaaaattg accatttctg gtgactggca gtgtactgta ggtaacttga ctgttcgatg gctgctgcga tggcaggagc atgtccggca tgcctacaat caacagtgac tgattccaac gagtagctac ctgcggctat tggtccaggc gtgtggtaag caatcctcaa ctgcattgag ctgtggtcga tattgacagg agctgccaac cattcattaa gettga tcca ggtataatga caagatgcac gaatagtcta tcctacagcc aggeageett acttatgtat tgactcgccg aaaactccta teggaggaga tgccgcacag actcaatctc cacacaatca tccagcaatc tctctatttg tcctattaca aaaatctttc ccagattgtg tttaactgta caatcaagaa agcctatccc tgcccaagta cttctctcca tgcaaattgc gagttcatcc
120 180 24 0 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200
PL 210 451 B1 cctgtaactg accatcactc atcttgccta agtgatgcac acgactacaa ataatcttgc agaatggaga tcattgacat aattggccaa ttgatccgtt tacaacactt gtgtattatc tcagtgtagt attttgttta gtacaaatgt tgtaacctac ggatatatcc agcacaaagt cataatggca tgtgtggaag tcataaataa gtgagtctgc aatagcacca cagaatctag gacacatacc atctgtcttg ttattgacca agcttgacaa tcaagcttga ctgcggtgaa tttctgcaat gatcgttagg ttgtcactgc tctcagattc aacatcccag taagagtcta cacatcagct tttaatatta taatcgaaat
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1590 <210> 73 <211> 1698 <212> DNA <213> wirus paragrypy psa <400> 73 atggttgcag ttaatttttc acccaaaagc atcactgatc gtcgctctac cttcaaacca aatagataca acacttggcc tgcaccagga atcctgaatg gaacccactt ggggtcaatc tttgtctcta attattataa ctagatgtat gtgctctttc aataaatact gtccaaaatg gggatcctgg tctaatgatc tattactacc acattcacta cctagacctg ggagtgtatg gaagcaacct tatatcgcga gcagcat ata tatattattg caggtgacac aagatgcccc tatgcacact aaatcatgag ttcttaataa ctctacaatt gtgacaagct ttaatggcat cacttcttaa tcccatcatt gatgccagga ctgccgggtt gtaagagctg ctcaaccaga tgtactataa gggcaacatt caatatatgg ttatccccca ctaagtcatc catgtcctct aggtgcttat aaagaagcac atggtcagcc ggacaggagg ctgatgcctg tcactggttc acaacacaca gccacacaac aattgtcctc tatcctaa tgttaggggc actagcatta ccacgcaggc tattctctct ggacactctt agaacagaac caatcagttc tatacctagt ctcgctcacc tcatgtatcc tccatccttt ctctatcagt gagggatgac tgatacaatc gaccccagga cggcgtgatt gatggttgct atactatagc tca.acaggat gggtgctgaa tagttggtgg atctgctata ctgctctgca gttactgacc ttatctcaac gat cataagc ttgttttagg atctctctta acttgccgag agcatctcta tcaactggat gtcgcaaatc gaatcaacac tgctcgtggg tatttctcaa ttcattccaa aagacacact tcaaatcaat cgaaccctaa acagttccgg tacttttcta gtggagcgca acaggaagcg aaagatacga gctctctgct agctggtttg ctaaccaatg gggagattat cctatgacca tcagctcaga acaaatagat aacccttcgt gcagcaactc tcacagcaat gacacaggct ggacaatttc tattatttcg tcctttatga ctaattctag agattatata tccttacagc gtgctgcact ttgctgaggg ctgccacgac ggtgttatac ttgtttccat agactctata ggggttgtat ccgctcctcc taattaatcc gggtatatta gtttatggaa cacaaaacca gcaatcgaat agtgtttagt acatgtatgg tgctgtataa atgtgcccac gtcccggttt ctaccagtac agcgtatcaa ttggatcaag ctgttatggt agattgtccc aacaacaact gagtttaata attaggaagt taactctgca cattaagtct gattaataat tcgcaatctg accagagggc acacaatgtt gggaatcatt tctcagcgat gatgtactgt agaacaacga acccggggta tttaggttgg taatcaagca ggcaactcaa gattcagtct tctgcccttt tgactcggtg ggtaaccata acagcaggtc ttgcttgaaa atttggatca tccgacgatg cggtcaagaa atactgtatc att tatccgt
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1698
PL 210 451 B1
Claims (17)
1. Szczepionka DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV), obejmująca plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen CDV oraz elementy konieczne dla jego ekspresji in vivo, kationowy lipid (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekolloksy)-1-propanoamon (DMRIE), i dioleilo-fosfatydylo-etanolaminę (DOPE), przy czym szczepionka DNA gdy jest podawana domięśniowo lub podskórnie indukuje wydajną odpowiedź immunologiczną lub zabezpieczającą u psów przeciw CDV.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto obejmuje białko GM-CSF psa.
3. Szczepionka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że ponadto obejmuje wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą białko GM-CSF psa w warunkach umożliwiających wyrażanie takiej sekwencji in vivo.
4. Szczepionka według zastrz. 3, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest plazmid.
5. Szczepionka według zastrz. 1-4, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca immunogen CDV jest sekwencją genu, z którego wydeletowano część kodującą domenę transbłonową.
6. Szczepionka według zastrz. 1-5, znamienna tym, że plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen CDV ponadto obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tPA.
7. Szczepionka według zastrz. 1-6, znamienna tym, że plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen CDV ponadto obejmuje stabilizujący intron.
8. Szczepionka według zastrz. 7, znamienna tym, że stabilizującym intronem jest intron II genu beta-globiny królika.
9. Szczepionka według zastrz. 1-8, znamienna tym, że plazmid zawiera sekwencję nukleotydową kodującą antygen HA z CDV.
10. Szczepionka według zastrz. 9, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca antygen HA jest zoptymalizowana przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy HA przez sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tPA, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową HA, przez wstawienie intronu powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej HA lub przez kombinację takich modyfikacji.
11. Szczepionka według zastrz. 1-8, znamienna tym, że plazmid zawiera sekwencję nukleotydową kodującą antygen F z CDV.
12. Szczepionka według zastrz. 11 znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca antygen F jest zoptymalizowana przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy F, przez sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tPA, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową F, przez wstawienie intronu powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej F lub przez kombinację takich modyfikacji.
13. Szczepionka według zastrz. 10 albo 12, znamienna tym, że sygnałowy tPA jest ludzkim sygnałowym tPA.
14. Szczepionka według zastrz. 10 albo 12, znamienna tym, że intronem jest intron II genu beta-globiny królika.
15. Szczepionka według zastrz. 9-14, znamienna tym, że ponadto obejmuje na tym samym lub na innym plazmidzie sekwencję nukleotydową kodującą białko M lub białko N z CDV.
16. Szczepionka według zastrz. 9-15, znamienna tym, że obejmuje pierwszy plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą antygen HA z CDV zoptymalizowaną przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy HA przez sekwencję nukleotydową kodującą ludzki sygnałowy tPA, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową HA i przez wstawienie intronu II beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej HA, i drugi plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą antygen F z CDV zoptymalizowaną przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową F i przez wstawienie intronu II beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej F.
17. Szczepionka według zastrz. 16, znamienna tym, że ponadto obejmuje plazmid ekspresyjny kodujący GM-CSF psa.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9907604A FR2794648B1 (fr) | 1999-06-10 | 1999-06-10 | Vaccins adn pour animaux de compagnie et de sport |
| US14449099P | 1999-07-19 | 1999-07-19 | |
| PCT/FR2000/001592 WO2000077043A2 (fr) | 1999-06-10 | 2000-06-08 | Vaccins adn pour animaux de compagnie et de sport |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL352212A1 PL352212A1 (en) | 2003-08-11 |
| PL210451B1 true PL210451B1 (pl) | 2012-01-31 |
Family
ID=26234993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL352212A PL210451B1 (pl) | 1999-06-10 | 2000-06-08 | Szczepionka DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV) |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1185662B1 (pl) |
| JP (1) | JP2003502345A (pl) |
| KR (1) | KR100768114B1 (pl) |
| AR (1) | AR024334A1 (pl) |
| AU (1) | AU782154C (pl) |
| BR (1) | BR0011732B1 (pl) |
| CA (1) | CA2375320C (pl) |
| CZ (1) | CZ20014392A3 (pl) |
| NZ (1) | NZ515993A (pl) |
| PL (1) | PL210451B1 (pl) |
| WO (1) | WO2000077043A2 (pl) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2804028B1 (fr) * | 2000-01-21 | 2004-06-04 | Merial Sas | Vaccins adn ameliores pour animaux de rente |
| FR2823222B1 (fr) | 2001-04-06 | 2004-02-06 | Merial Sas | Vaccin contre le virus de la fievre du nil |
| FR2825280B1 (fr) * | 2001-06-01 | 2005-04-15 | Merial Sas | Vaccination contre le virus de l'immunodeficience feline |
| CA2545886A1 (en) | 2003-11-13 | 2005-06-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods of characterizing infectious bursal disease virus |
| RS51324B (sr) | 2005-04-25 | 2010-12-31 | Merial Ltd. | Vakcine protiv nipah virusa |
| EP1954308B1 (en) * | 2005-09-16 | 2011-09-07 | Merial Ltd. | Stabilizers for freeze-dried vaccines |
| US7682619B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-03-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine influenza virus |
| US7862821B2 (en) | 2006-06-01 | 2011-01-04 | Merial Limited | Recombinant vaccine against bluetongue virus |
| US8877206B2 (en) | 2007-03-22 | 2014-11-04 | Pds Biotechnology Corporation | Stimulation of an immune response by cationic lipids |
| JP5971945B2 (ja) | 2008-04-17 | 2016-08-17 | ピーディーエス バイオテクノロジー コーポレイションＰｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | カチオン性脂質の鏡像異性体による免疫応答の刺激 |
| EP2432504B1 (en) * | 2009-05-22 | 2019-05-01 | Genocea Biosciences, Inc. | Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
| US20130197612A1 (en) * | 2010-02-26 | 2013-08-01 | Jack W. Lasersohn | Electromagnetic Radiation Therapy |
| EP2643014A4 (en) | 2010-11-24 | 2015-11-11 | Genocea Biosciences Inc | HERPES SIMPLEX TYPE 2 VIRUS VACCINES: COMPOSITIONS AND METHODS FOR STIMULATING AN IMMUNE RESPONSE |
| US9624273B2 (en) | 2011-11-23 | 2017-04-18 | Genocea Biosciences, Inc. | Nucleic acid vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
| AU2013274235B2 (en) * | 2012-06-15 | 2018-01-18 | Samir N. Khleif | Cationic lipid vaccine compositions and methods of use |
| WO2014047533A1 (en) | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Frank Bedu-Addo | Improved vaccine compositions and methods of use |
| CN104164409A (zh) * | 2014-07-18 | 2014-11-26 | 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 | 含有犬gmcsf基因的重组犬瘟热病毒及其制备方法 |
| CN104958283A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-10-07 | 北京盛大康成医疗技术有限公司 | 弱碱性皮肤粘膜清洗消毒组合物及其制造方法和用途 |
| EP4092112A1 (en) | 2015-11-13 | 2022-11-23 | PDS Biotechnology Corporation | Lipids as synthetic vectors to enhance antigen processing and presentation ex-vivo in dendritic cell therapy |
| KR101694676B1 (ko) | 2015-12-10 | 2017-01-10 | 우진 비앤지 주식회사 | 말 선역 질병원인 국내 분리 스트렙토코커스 이콰이 균주 및 이를 포함하는 백신 |
| EP3519427A4 (en) | 2016-09-28 | 2020-03-11 | Genocea Biosciences Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF HERPES |
| WO2020142778A1 (en) | 2019-01-04 | 2020-07-09 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Attenuated bordetella bronchiseptica strains, oral vaccines containing the attenuated strains, and methods of making & use thereof |
| MX2022004384A (es) * | 2019-10-09 | 2022-08-08 | Mayo Found Medical Education & Res | Polipéptidos de fusión y de hemaglutinina de virus de moquillo canino. |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5338683A (en) * | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| WO1994027435A1 (en) * | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Life Technologies, Inc. | Genetic immunization with cationic lipids |
| AU683557B2 (en) * | 1994-03-30 | 1997-11-13 | Virogenetics Corporation | Nucleotide and amino acid sequences of canine herpesvirus GB, GC and GD and uses therefor |
| EP0826063A1 (en) * | 1995-04-25 | 1998-03-04 | Vical Incorporated | Single-vial formulations of dna/lipid complexes |
| ES2109189B1 (es) * | 1996-03-14 | 1998-05-16 | Iberica Cyanamid | Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas. |
| WO1997041236A1 (en) * | 1996-04-29 | 1997-11-06 | Andreas Zurbriggen | Polynucleotide vaccine against canine distemper |
| FR2751226B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies du cheval |
| FR2751223B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-12-04 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique felin |
| FR2751227B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies canines, notamment les pathologies respiratoires et digestives |
| AU1987197A (en) * | 1997-03-10 | 1998-09-29 | Heather Lynn Davis | Gene delivery to mucosal epithelium for immunization or therapeutic purpose |
| AU1131200A (en) * | 1998-10-23 | 2000-05-15 | Heska Corporation | Cationic lipid-mediated enhancement of nucleic acid immunization of cats |
-
2000
- 2000-06-08 PL PL352212A patent/PL210451B1/pl unknown
- 2000-06-08 BR BRPI0011732-3A patent/BR0011732B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-06-08 WO PCT/FR2000/001592 patent/WO2000077043A2/fr active IP Right Grant
- 2000-06-08 CZ CZ20014392A patent/CZ20014392A3/cs unknown
- 2000-06-08 EP EP00940474A patent/EP1185662B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-08 NZ NZ515993A patent/NZ515993A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-08 JP JP2001503899A patent/JP2003502345A/ja active Pending
- 2000-06-08 KR KR1020017015911A patent/KR100768114B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-08 AU AU55405/00A patent/AU782154C/en not_active Expired
- 2000-06-08 CA CA2375320A patent/CA2375320C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-12 AR ARP000102879A patent/AR024334A1/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU782154C (en) | 2006-02-09 |
| WO2000077043A3 (fr) | 2001-07-19 |
| PL352212A1 (en) | 2003-08-11 |
| NZ515993A (en) | 2004-04-30 |
| CA2375320C (en) | 2013-02-19 |
| BR0011732B1 (pt) | 2014-02-04 |
| KR20020012271A (ko) | 2002-02-15 |
| BR0011732A (pt) | 2002-03-05 |
| KR100768114B1 (ko) | 2007-10-17 |
| AU5540500A (en) | 2001-01-02 |
| EP1185662A2 (fr) | 2002-03-13 |
| WO2000077043A2 (fr) | 2000-12-21 |
| AR024334A1 (es) | 2002-10-02 |
| AU782154B2 (en) | 2005-07-07 |
| CZ20014392A3 (cs) | 2002-06-12 |
| CA2375320A1 (en) | 2000-12-21 |
| JP2003502345A (ja) | 2003-01-21 |
| EP1185662B1 (fr) | 2011-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL210451B1 (pl) | Szczepionka DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV) | |
| US6852705B2 (en) | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines | |
| JP2003502345A5 (pl) | ||
| PL191551B1 (pl) | Kompozycje immunogenne, plazmidy, zastosowania plazmidów, zestawy oraz szczepionki | |
| JP2009149608A (ja) | 鳥類用ポリヌクレオチドワクチン製剤 | |
| CZ15899A3 (cs) | Formulace vakciny proti patogenům psů | |
| US20060122142A1 (en) | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines | |
| US7163926B1 (en) | Adjuvant-containing vaccines | |
| WO1998022145A9 (en) | Immunization of infants | |
| EP0946200A1 (en) | Immunization of infants | |
| US7250161B2 (en) | Equine GM-CSF | |
| ES2277913T3 (es) | Vacunas de adn mejoradas para los bovinos. | |
| AU2005202233B2 (en) | DNA vaccines for pets and sport animals | |
| ES2362347T3 (es) | Vacuna de adn para perros. | |
| US20040002472A1 (en) | Vaccination or immunization using a prime-boost regimen | |
| AU2003215835B2 (en) | Vaccination or immunization using a prime-boost regimen against BRSV, BHV-1, BVDV, BPI-3 |