PL199645B1 - Kwas nukleinowy, polipeptyd fuzyjny, kompozycja, wektor, wektor ekspresyjny, układ gospodarz wektor, sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, kwas nukleinowy i sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego - Google Patents

Abstract

Ujawniono nowe ligandy b ed ace polipeptydami fuzyjnymi oraz sposoby przygotowywania takich ligandów b ed acych polipeptydami fuzyjnymi w postaci aktywnej biologicznie. Ujawniono tak ze m.in. kwasy nukleinowe koduj ace te ligandy b ed ace polipeptydami fuzyjnymi zdolne do wytwarzania biolo- gicznie aktywnych ligandów b ed acych polipeptydami fuzyjnymi. Sposób wytwarzania kwasów nukle- inowych i ligandów b ed acych polipeptydami fuzyjnymi ma szerokie mo zliwo sci zastosowania do, ogól- nie rzecz bior ac, wytwarzania ligandów polipeptydowych, w wyniku czego uzyskuje si e lepsze powi- nowactwo i podwy zszon a aktywnosc ligandu w porównaniu z jego natywn a postaci a. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy, polipeptyd fuzyjny, kompozycja, wektor, wektor ekspresyjny, układ gospodarz wektor, sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, kwas nukleinowy i sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego. Niniejszy wynalazek zapewnia nowe sposoby wytwarzania nowych ligandów będących fuzyjnymi polipeptydami, które posiadają wzmocnioną aktywność biologiczną w porównaniu z ligandami polipeptydowymi w ich natywnej postaci. Wynalazek zapewnia również kwasy nukleinowe użyteczne w wytwarzaniu biologicznie aktywnych ligandów będących polipeptydami fuzyjnymi oraz same ligandy będące polipeptydami fuzyjnymi.

W zdolnoś ci ligandów polipeptydowych do wią zania z komórkami, i w ten sposób wywoł ywania odpowiedzi fenotypowej, takiej jak wzrost, utrzymanie się przy życiu lub różnicowanie, często pośredniczą transbłonowe kinazy tyrozynowe. Zewnątrzkomórkowa część każdej receptorowej kinazy tyrozynowej (RTK) jest generalnie najbardziej wyróżniającą częścią cząsteczki i zapewnia ona cechy warunkujące rozpoznawanie ligandów przez białko. Wynikiem wiązania liganda z domeną zewnątrzkomórkową jest przekazywanie sygnałów poprzez wewnątrzkomórkową domenę katalityczną kinazy tyrozynowej, która przekazuje sygnał biologiczny wewnątrzkomórkowym białkom biologicznym. Określony układ motywów sekwencyjnych tej cytoplazmatycznej domeny katalitycznej determinuje jej dostęp do potencjalnych substratów kinazy (Mohammadi i in., 1990, Mol. Cell. Biol., 11: 5068-5078; Fantl i in., 1992, Cell, 69: 413-413).

Okazało się, że w następstwie związania liganda RTK ulegają dimeryzacji lub pewnej zbliżonej zmianie konformacyjnej (Schlessinger, J., 1988, Trends Biochem. Sci. 13: 443-447; Ullrich i Schlessinger, 1990, Cell, 61: 203-212; Schlessinger i Ullrich, 1992, Neuron, 9: 383-391; molekularne oddziaływania pomiędzy tworzącymi dimery domenami cytoplazmatycznymi prowadzą do aktywacji działania kinazy. W niektórych przypadkach, takich jak płytkopochodny czynnik wzrostowy (PDGF), ligand jest dimerem, wiążącym dwie cząsteczki receptora (Hart i in., 1988, Science, 240: 1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905-8912), podczas gdy na przykład w przypadku EGF, ligand jest monomerem (Weber i in., 1984, J. Biol. Chem., 259: 14631-14636).

W historii przemysłu biotechnologicznego wiele nowych genów i związanych z nimi białek zidentyfikowano na podstawie ich homologii sekwencyjnej ze znanymi genami. Wiele takich białek jest przypuszczalnie receptorami, ale ponieważ dotąd nie zidentyfikowano właściwych im ligandów, określa się je jako receptory „sieroce”. Przeszukiwanie wielu z tych receptorów „sierocych” często prowadzi do identyfikacji ligandów, które są zdolne do wiązania z receptorem, chociaż wiązaniu temu często nie towarzyszy aktywacja żadnych kinaz wewnątrzkomórkowych ani żadna inna zmiana fenotypowa. Tak było w przypadku rodziny receptorów Eph. Dla wyjaśnienia, autorzy zgłoszenia włączyli do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy list cytowany jako Eph Nomenclature Committee, 1997, opublikowany w Cell, tom 90: 403-403 (1997), który przedstawia nomenklaturę dla rodzin receptorów Eph i ligandów Eph.

Przed odkryciem przedstawionym w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 747 033, wydanym 5 maja 1998 r., w odpowiedzi na wią zanie liganda z receptorem z rodziny Eph obserwowano niewielką, jeśli w ogóle, aktywność biologiczną. Ten opis patentowy opisuje koncepcję „tworzenia aglomeratów”, zgodnie z którą rozpuszczalne domeny ligandów łączono z utworzeniem multimerów zdolnych do aktywacji właściwych receptorów. Autorzy zgłoszenia rozszerzyli teraz koncepcję tworzenia aglomeratów na dodatkowe ligandy spoza rodziny Eph, np. ligandy receptorów Tie-2, znane jako angiopoetyny, oraz odkryli także, że ten sposób wytwarzania homogennych postaci aglomeratów ligandów może być szeroko stosowany do poprawy powinowactwa i/lub zwiększania aktywności liganda w porównaniu z jego postacią natywną. Angiopoetyna 1 (Ang) jest jednym z dwóch znanych ligandów receptora Tie-2 i wykazano, że jest agonistą Tie-2 (Davis i in., Cell 87: 1161-1169), podczas gdy dla drugiego znanego liganda, angiopoetyny 2, wykazano, że jest naturalnie występującym antagonistą receptora Tie-2 (Maisonpierre i in., 1997, Science 277: 55-60). Angl* jest zmutowaną formą angiopoetyny 1, która obejmuje N-końcową domenę angiopoetyny 2 poddaną fuzji z domeną superhelikalną i domeną fibrnogenową angiopoetyny 1 posiadającej mutację podstawienia Cys na Ser w 245 pozycji. Wykazano, ż e Ang1* jest silnym agonistą receptora Tie-2.

Doświadczenia z mutantami angiopoetyny 1 i angiopoetyny 2 wykazały, że domenami wiążącymi receptor są domeny fibrynogenowe (FD), oraz że dimeryczne wersje, na przykład, Ang-1-FD-Fc (tj. domeny fibrynogenowej Ang-1 poddanej fuzji z domeną Fc), mogą wiązać się z receptorem Tie-2 ze znacznie wyższym powinowactwem, niż monomeryczna Ang-1-FD (dimeryzacja następuje w wyniku

PL 199 645 B1 oddziaływań pomiędzy składowymi Fc sąsiadujących cząsteczek). Jednakże, Ang-1-FD-Fc nie jest zdolna do indukcji fosforylacji (aktywacji) receptora Tie-2 na komórkach śródbłonkowych, o ile nie zwiększono stopnia aglomeracji przez zastosowanie kozich przeciwciał skierowanych przeciw Fc człowieka (Jackson Immunoresearch). Z tego powodu, zaprojektowano zmutowane wersje Ang-1-FD i Ang-2-FD (tj. domeny fibrynogenowej Ang-2), które są w postaci znacznie bardziej złożonych aglomeratów.

WO 96/37621 ujawnia multimeryczne proteiny kodowane przez sekwencję DNA zawierającą pierwszą i drugą domenę funkcjonalną i pierwszą i drugą sekwencję wiążącą i urządzenie do multimeryzacji o długości nie więcej niż 110 aminokwasów i które jest zdolne do samo-składania się w trimer lub wyższy oligomer. Urządzenie do multimeryzacji zawiera zwłaszcza co najmniej część ludzkiego p53, PF4, TSP-4, COMP, trombospondynę, dTAFII42, dTAFTII31, drAFII62, dTAFII80, histon 3 lub histon 4.

WO 92/03569 ujawnia poliligandy białkowe złączone z stałym białkowym rdzeniem. Są one dostarczane przez przygotowywanie białek fuzyjnych zawierających ligand przy jednym zakończeniu i podjednostkę lub multimeryczną jednostkę białkową przy drugim zakończeniu, gdzie to białko fuzyjne jest zdolne do złożenia się dostarczając poliligand. W szczególnej postaci podjednostką jest łańcuch immunoglobuliny μ.

Przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy kodujący polipeptyd fuzyjny, charakteryzujący się tym, że polipeptyd fuzyjny zawiera pierwszą podjednostkę zawierającą co najmniej jedną kopię domeny fibrynogenowej angiopeptyny 1 lub angiopeptyny 2, przy czym pierwszą podjednostkę poddano fuzji z końcem N składnika multimeryzującego, a koniec C skł adnika multimeryzującego poddano fuzji z drugą podjednostką, przy czym druga podjednostką obejmuje co najmniej jedną kopię wiążącej receptor domeny fibrynogenowej angiopeptyny 1 lub angiopeptyny 2.

Korzystnie kwas nukleinowy według wynalazku ma składnik multimeryzujący zawierający domenę pochodzącą z immunoglobuliny. Domenę pochodzącą od immunoglobuliny wybiera się z grupy składającej się z domeny Fc IgG, ciężkiego łańcucha IgG i lekkiego łańcucha IgG.

Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd fuzyjny kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera multimer polipeptydu fuzyjnego kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, kompozycja ta jako multimer zawiera dimer.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor, który zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest połączona w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kontrolującą ekspresję.

Następnie przedmiotem wynalazku jest także układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, charakteryzujący się tym, że obejmuje taki wektor ekspresyjny w odpowiedniej komórce gospodarza. Korzystnie w układzie gospodarz-wektor według wynalazku odpowiednią komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, komórka drożdżowa, komórka owadzia lub komórka ssacza. Odpowiednią komórką gospodarza jest korzystnie E. coli, ewentualnie komórka COS, lub także korzystnie, komórka CHO.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, charakteryzujący się tym, że obejmuje namnażanie komórek układu gospodarz-wektor według wynalazku, w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu fuzyjnego, oraz odzyskiwanie tak wytworzonego polipeptydu.

Kolejno przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy kodujący polipeptyd fuzyjny, który to polipeptyd fuzyjny obejmuje więcej niż jedną kopie domeny fibrynogenowej angiopoetyny 1 lub angiopoetyny 2 w postaci tandemu, i albo koniec N, albo koniec C domeny wiążącej receptor poddany jest również fuzji ze składnikiem multimeryzującym.

Korzystnie kwas nukleinowy charakteryzuje się tym, że domeny wiążące receptor poddaje się fuzji w taki sposób, aby ze sobą sąsiadowały.

Korzystnie w kwasie nukleinowym według wynalazku składnik multimeryzujący zawiera domenę pochodzącą z immunoglobuliny, a bardziej korzystnie domenę pochodzącą od immunoglobuliny wybiera się z grupy składającej się z domeny Fc IgG, ciężkiego łańcucha IgG i lekkiego łańcucha IgG.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd fuzyjny, kodowany jest przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, która zawiera multimer polipeptydu fuzyjnego według wynalazku jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie kompozycja ta jako multimer zawiera dimer.

PL 199 645 B1

Przedmiotem wynalazku jest również wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd fuzyjny, który to polipeptyd fuzyjny obejmuje więcej niż jedną kopię domeny fibrynogenowej angiopoetyny 1 lub angiopoetyny 2 w postaci tandemu, i albo koniec N, albo koniec C domeny wiążącej receptor poddany jest również fuzji ze składnikiem multimeryzującym.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny zawierający taką cząsteczkę kwasu nukleinowego, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest połączona w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kontrolującą ekspresję.

Przedmiotem wynalazku jest również układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, charakteryzujący się tym, że obejmuje wektor ekspresyjny powyżej opisany w odpowiedniej komórce gospodarza. Korzystnie, odpowiednią komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, komórka drożdżowa, komórka owadzia lub komórka ssacza, ewentualnie odpowiednią komórką gospodarza może być E. coli, ewentualnie odpowiednią komórką gospodarza może być komórka COS lub komórka CHO.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, polegający na tym, że obejmuje namnażanie komórek układu gospodarz-wektor według wynalazku, w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu fuzyjnego, oraz odzyskiwanie tak wytworzonego polipeptydu.

Zatem niniejszy wynalazek zapewnia nowe, biologicznie aktywne, rozpuszczalne postacie ligandów polipeptydowych, które wiążą się z receptorami na komórkach. Takie ligandy polipeptydowe są użyteczne w pobudzaniu różnych funkcji i/lub wpływaniu na cechy fenotypowe, takie jak wzrost i/lub proliferacja, komórek niosących receptor. Wynalazek zapewnia również kwasy nukleinowe kodujące takie ligandy polipeptydowe oraz zarówno prokariotyczne, jak i eukariotyczne układy ekspresyjne do wytwarzania takich ligandów polipeptydowych. Zgodnie z wynalazkiem, rozpuszczalne postacie opisywanych tu ligandów polipeptydowych można stosować do pobudzania odpowiedzi biologicznych w komórkach, w których zachodzi ekspresja receptorów. W szczególności, opisano tu ogólny sposób wytwarzania ligandów będących polipeptydami fuzyjnymi, które można następnie łączyć w aglomeraty, który to sposób czyni, w innym przypadku' nieaktywne, rozpuszczalne ligandy polipeptydowe aktywnymi biologicznie, lub który wzmacnia aktywność biologiczną ligandów polipeptydowych, która przy braku takiego tworzenia aglomeratów, mogłaby być niższa. Sposób ten można stosować do łączenia w aglomerat wielu (więcej niż jednej) domen wiążących receptor jakiegokolwiek liganda, który posiada ulepszone powinowactwo i/lub zwiększoną aktywność (tj. zdolność do przekazywania sygnałów) po utworzeniu aglomeratu w porównaniu z natywną postacią liganda.

Wynalazek został zilustrowany na rysunkach na których przedstawiono odpowiednio na figurach:

Figury 1A-1E - Sekwencja kwasu nukleinowego i przewidywana sekwencja aminokwasowa Ang-1-FD-FD-Fc.

Figury 2A-2E - Sekwencja kwasu nukleinowego i przewidywana sekwencja aminokwasowa Ang-2-FD-FD-Fc.

Figury 3A-3E - Sekwencja kwasu nukleinowego i przewidywana sekwencja aminokwasowa Ang-1-FD-Fc-FD.

Figury 4A-4E - Sekwencja kwasu nukleinowego i przewidywana sekwencja aminokwasowa Ang-2-FD-Fc-FD.

Figura 5 - Analiza masy cząsteczkowej białka Ang-1-FD-Fc-FD. W obrazie żelu z analizy SDS-PAGE widoczny jest prążek migrujący przy około 210 kD w warunkach nieredukujących (ścieżka 3) i prążek migrują cy przy okoł o 85 kD w warunkach redukuj ą cych (ś cież ka 7).

Figura 6 - Analiza metodą rozpraszania światła dla potwierdzenia masy cząsteczkowej Ang-1-FD-Fc-FD oraz określenia, czy białko jest homogenne, czy nie. Rozpraszanie światła jest funkcją masy i stężenia makrocząsteczki. W celu określenia masy cząsteczkowej, próbk ę białka wstrzykuje się na kolumnę do sączenia molekularnego i eluat monitoruje się w przyłączonym detektorze rozpraszania światła oraz detektorze współczynnika załamania i/lub UV. Przyłączony detektor współczynnika załamania lub detektor UV służą do pomiaru stężenia białka. Do obliczania stężenia białka stosuje się oprogramowanie Astra 4.7 (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) . Następnie oblicza się masę cząsteczkową białka na podstawie zależności kątowej rozpraszania światła. Okazało się, że masa cząsteczkowa dimerycznego białka wynosi około 200 kD, a występowanie pojedynczego piku oznacza, że roztwór białka jest homogenny.

Figura 7 - Analiza masy cząsteczkowej białka Ang-2-FD-Fc-FD. W obrazie żelu z analizy SDS-PAGE widoczny jest prążek migrujący przy około 200 kD w warunkach nieredukujących (ścieżki 7 i 8) i prążek migrują cy przy okoł o 88 kD w warunkach redukuj ących (ś cież ki 3 i 4).

PL 199 645 B1

Figura 8 - Analiza metodą rozpraszania światła dla potwierdzenia masy cząsteczkowej Ang-2-FD-Fc-FD oraz określenia, czy białko jest homogenne, czy nie. Rozpraszanie światła jest funkcją masy i stężenia makrocząsteczki. W celu określenia masy cząsteczkowej, próbkę białka wstrzykuje się na kolumnę do sączenia molekularnego i eluat monitoruje się w przyłączonym detektorze rozpraszania światła oraz detektorze współczynnika załamania i/lub UV. Przyłączony detektor współczynnika załamania lub detektor UV służą do pomiaru stężenia białka. Do obliczania stężenia białka stosuje się oprogramowanie Astra 4.7 (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA). Następnie oblicza się masę cząsteczkową białka na podstawie zależności kątowej rozpraszania światła. Okazało się, że masa cząsteczkowa dimerycznego białka wynosi około 171 kD, a występowanie pojedynczego piku oznacza, że roztwór białka jest homogenny.

Figura 9 - Porównanie fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Ang1* i Ang-1-FD-Fc-FD w komórkach EAhy926. Standardowe oznaczenie fosforylacji ujawniło, że Ang-1-Fd-Fc-FD była równoważna Ang1* pod względem zdolności do stymulacji fosforylacji receptora Tie-2 w EAhy926.

Figura 10 - Zdolność Ang-2-FD-Fc-FD do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Ang1* w komórkach EAhy926. W standardowym oznaczeniu fosforylacji Ang-2-FD-Fc-FD jest zdolna do blokowania stymulacji receptora Tie-2 przez Ang1*, jeśli występuje w co najmniej 10-15 nadmiarze molowym wobec Ang1*.

Figura 11 - Zdolność angiopoetyny 2 do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 Ang1* w komórkach EAhy926. W standardowym oznaczeniu fosforylacji, przy 20-krotnym nadmiarze molowym, angiopoetyna 2 nie jest zdolna do zmniejszania poziomu fosforylacji pod wpływem Ang1* do 50%. Wynik ten, łącznie z wynikami opisanymi na fig. 10, oznacza, że Ang-2-FD-Fc-FD jest silniejszym inhibitorem fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Ang1*, niż angiopoetyna 2.

Figura 12 - Zdolność Ang-2-FD-Fc-FD do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem angiopoetyny-1 w komórkach EAhy926. Wykazano, że w standardowym oznaczeniu fosforylacji chociaż w tych komórkach występuje tendencja do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem angiopoetyny-1, Ang-2-FD-Fc-FD wydaje się być bardziej skuteczna w blokowaniu fosforylacji Tie-2 pod wpływem Ang1*, co przedstawiono na fig. 10.

Figura 13 - Zdolność angiopoetyny 2 do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem angiopoetyny-1 w komórkach EAhy926. Wykazano, że w standardowym oznaczeniu fosforylacji w komórkach tych występuje tendencja do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem angiopoetyny-1, ale, podobnie jak Ang-2-FD-Fc-FD, angiopoetyna 2 wydaje się być bardziej skuteczna w blokowaniu fosforylacji Tie-2 pod wpływem Ang1*, co przedstawiono na fig. 11.

Figura 14 - Porównanie fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Ang1* i pod wpływem pochodzącej ze stabilnych klonów CHO Ang-1-FD-Fc-FD w komórkach EAhy926. Komórki EAhy926 stymulowano 0,4 μg/ml Ang1* lub 0,2 μg/ml bądź 0,4 μg/ml pochodzącego ze stabilnego klonu CHO białka Ang-1-FD-Fc-FD. Standardowe oznaczenie fosforylacji ujawniło, że pochodząca ze stabilnego klonu CHO Anh-1-FD-Fc-FD była równoważna Ang1* pod względem zdolności do stymulacji fosforylacji receptora Tie-2 w komórkach EAhy926.

Figura 15 - Zdolność pochodzącej ze stabilnego klonu CHO Ang-2-FD-Fc-FD do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem pochodzącej ze stabilnych klonów CHO Ang-1-FD-Fc-FD w komórkach EAhy926. Komórki EAhy926 traktowano 0,2 μg/ml agonisty Tie-2, Ang-1-FD-Fc-FD oraz 2 μg/ml, 4 μg/ml, 8 μg/ml lub 16 μg/ml pochodzącej ze stabilnego klonu CHO Ang-2-FD-Fc-FD. Ang-2-FD-Fc-FD jest zdolna do blokowania stymulacji receptora Thie-2 przez pochodzącą ze stabilnego klonu CHO Ang-1-FD-Fc-Fd, gdy występuje w co najmniej 40-krotnym nadmiarze molowym wobec pochodzącej ze stabilnego klonu CHO Ang-1-FD-Fc-Fd.

Jak opisano bardziej szczegółowo poniżej, autorzy zgłoszenia opracowali sposób „tworzenia aglomeratów” ligandów polipeptydowych, który to sposób czyni, w innym przypadku nieaktywne, rozpuszczalne ligandy polipeptydowe aktywnymi biologicznie, lub który wzmacnia aktywność biologiczną ligandów polipeptydowych, która przy braku takiego tworzenia aglomeratów, mogłaby być niższa. Sposób ten można stosować do łączenia w aglomerat wielu (więcej niż jednej) domen wiążących receptor jakiegokolwiek liganda, który posiada ulepszone powinowactwo i/lub zwiększoną aktywność (tj. zdolność do przekazywania sygnałów) po utworzeniu aglomeratu w porównaniu z natywną postacią liganda.

Niniejszy wynalazek zapewnia kwas nukleinowy kodujący polipeptyd fuzyjny, przy czym polipeptyd fuzyjny zawiera pierwszą podjednostkę zawierającą co najmniej jedną kopię domeny fibrynogenowej angiopeptyny 1 lub angiopeptyny 2, przy czym pierwszą podjednostkę poddano fuzji z końcem N składnika multimeryzującego, a koniec C składnika multimeryzującego poddano fuzji z drugą podje6

PL 199 645 B1 dnostką, przy czym druga podjednostka obejmuje co najmniej jedną kopię wiążącej receptor domeny fibrynogenowej angiopeptyny 1 lub angiopeptyny 2.

Przez „domenę wiążącą receptor” należy rozumieć najmniejszą część liganda, która jest konieczna do wiązania jego receptora.

W korzystnych rozwiązaniach wynalazku, składnik multimeryzujący obejmuje domenę pochodzącą z immunoglobuliny. Bardziej szczegółowo, domenę pochodzącą z immunoglobuliny można wybierać z grupy składają cej się z domeny Fc IgG, ciężkiego łań cucha IgG oraz lekkiego ł ańcucha IgG. W innym rozwiązaniu, składnikiem multimeryzującym może być domena Fc, z której usunięto pierwszych pięć aminokwasów (włącznie z cysteiną) tworząc składnik multimeryzujący określany jako Fc^CI).

Niniejszy wynalazek zapewnia również polipeptydy fuzyjne kodowane przez cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku. Korzystnie, polipeptydy fuzyjne mają postać multimeryczną w wyniku działania składnika multimeryzującego. W korzystnym rozwiązaniu, multimerem jest dimer. Odpowiednie składniki multimeryzujące opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym ZymoGenetics, Inc., publikacja numer EP 0 721 983, opublikowanym 17 lipca 1996 r., i obejmują zdolną do ulegania represji kwaśną fosfatazę S. cerevisiae (Mizunaga i in., 1988, J. Biochem. (Tokyo) 103: 321-326); preprotoksynę killer typu 1 S. cerevisiae (Sturley i in., 1986, EMBO J. 5: 3381-3390); alfa-galaktozydaza (melibiaza) S. calsbergensis (Sumner-Smith i in., 1985, Gene 36: 333-340) oraz dekarboksylazę ornitynową Neurospora crassa (Digangi i in., 1987, J. Biol. Chem. 262: 7889-7893). Sekwencje kodujące region zawiasowy ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (Takahashi i in., 1982, Cell 29: 671-679); gen SUC2 S. cerevisiae (Carlson i in., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 439-447; sekwencje genów immunoglobulin i ich części. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, jako sekwencje kodujące składnik multimeryzujący stosuje się sekwencje genów immunoglobulin, szczególnie te kodujące domenę Fc.

Niniejszy wynalazek rozważa również wektor, który zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, jak opisano w niniejszym opisie.

Zapewnia się również wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, jak opisano w niniejszym opisie, w którym cząsteczka kwasu nukleinowego połączona jest w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kontrolującą ekspresję. Zapewnia się również układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, który obejmuje wektor ekspresyjny według wynalazku, który wprowadzono do komórki gospodarza odpowiedniej do ekspresji polipeptydu fuzyjnego. Odpowiednią komórką gospodarza może być komórka bakteryjna, taka jak E. coli, komórka drożdżowa, taka jak Pichia pastoris, komórka owada, takiego jak Spodoptera fungiperda, bądź komórka ssacza, taka jak komórka COS lub CHO.

Niniejszy wynalazek zapewnia również sposoby wytwarzania fuzyjnych polipeptydów według wynalazku poprzez namnażanie komórek opisanego w niniejszym opisie układu gospodarz-wektor w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu fuzyjnego oraz odzyskiwanie tak utworzonego polipeptydu fuzyjnego.

Polipeptydy fuzyjne użyteczne do wykorzystywania w praktyce niniejszego wynalazku można przygotowywać poprzez ekspresję w prokariotycznym lub eukariotycznym układzie ekspresyjnym. Ekspresję zrekombinowanego genu i oczyszczanie polipeptydu można prowadzić wykorzystując wiele metod. Gen można zsubklonować w bakteryjnym wektorze ekspresyjnym, takim jak, na przykład, ale nie ograniczając się do, pCP110.

Polipeptydy fuzyjne można oczyszczać jakąkolwiek techniką, która umożliwia późniejsze tworzenie stabilnego, aktywnego biologicznie białka. Na przykład, ale bez żadnych ograniczeń, czynniki można odzyskiwać z komórek jako rozpuszczalne białka lub ciała inkluzyjne, z których można je ilościowo ekstrahować 8 M chlorowodorkiem guanidyny i dializować. W celu dalszego oczyszczenia czynników można stosować konwencjonalną chromatografię jonowymienną, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię z odwróconymi fazami lub filtrację żelową.

Niniejszy wynalazek zapewnia również kwas nukleinowy kodujący polipeptyd fuzyjny, przy czym polipeptyd fuzyjny obejmuje więcej niż jedną kopię wiążącej fibrynogen domeny angiopeptyny-1 lub angiopeptyny-2 w postaci tandemu, i w którym albo koniec N, albo koniec C domeny wiążącej receptor poddany jest również fuzji ze składnikiem multimeryzującym. W jednym rozwiązaniu wynalazku domeny wiążące receptor są poddane fuzji w taki sposób aby sąsiadowały z sobą.

Przez „domenę-wiążącą receptor” należy rozumieć najmniejszą część liganda, która jest konieczna do wiązania jego receptora.

W korzystnych rozwiązaniach wynalazku, składnik multimeryzujący stanowi domena pochodząca z immunoglobuliny. Bardziej szczegółowo, domenę pochodzącą z immunoglobuliny można wybierać z grupy

PL 199 645 B1 składającej się z domeny Fc IgG, łańcucha ciężkiego IgG oraz łańcucha lekkiego IgG. W innym rozwiązaniu, składnikiem multimeryzującym może być domena Fc, z której usunięto pierwszych pięć aminokwasów (włącznie z cysteiną) tworząc składnik multimeryzujący określany jako Fc^CI).

Niniejszy wynalazek zapewnia również polipeptydy fuzyjne kodowane przez cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku. Korzystnie, polipeptydy fuzyjne mają postać multimeryczną w wyniku działania składnika multimeryzującego. W korzystnym rozwiązaniu, multimerem jest dimer. Odpowiednie składniki multimeryzujące opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym ZymoGenetics, Inc., publikacja numer EP 0 721 983, opublikowana 17 lipca 1996 r., i obejmują zdolną do ulegania ekspresji kwaśną fosfatazę S. cerevisiae (Mizunaga i in., 1988, J. Biochem. (Tokyo) 103: 321-326); preprotoksynę killer typu 1 S. cerevisiae (Sturley i in., 1986, EMBO J. 5: 3381-3390); alfa-galaktozydazę (melibiazę) S. calsbergensis (Sumner-Smith i in., 1985, Gene 36: 333-340) oraz dekarboksylazę ornitynową Neurospora crassa (Digangi i in., 1987, J. Biol. Chem. 262: 7889-7893). Sekwencje kodujące region zawiasowy ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (Takahashi i in., 1982, Cell 29: 671-679); gen SUC2 S. cerevisiae (Carlson i in., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 439-447; sekwencje genów immunoglobulin i ich części. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, jako sekwencje kodujące składnik multimeryzujący stosuje się sekwencje genów immunoglobulin, szczególnie te kodujące domenę Fc.

W niniejszym wynalazku rozważa się również wektor, który obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, jak opisano w niniejszym opisie.

Zapewnia się również wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, jak opisano w niniejszym opisie, w którym cząsteczka kwasu jest połączona w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kontrolującą ekspresję. Zapewnia się również układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, który obejmuje wektor ekspresyjny według wynalazku, który wpro-wadzono do komórki gospodarza odpowiedniej do ekspresji polipeptydu fuzyjnego. Odpowiednią komórką gospodarza może być komórka bakteryjna, taka jak E. coli, komórka drożdżowa, taka jak Pichia pastoris, komórka owada, takiego jak Spodoptera fungiperda, bądź komórka ssacza, taka jak komórka COS lub CHO.

Niniejszy wynalazek zapewnia również sposoby wytwarzania fuzyjnych polipeptydów według wynalazku poprzez namnażanie komórek opisanego w niniejszym opisie układu gospodarz-wektor w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu fuzyjnego oraz odzyskiwanie tak utworzonego polipeptydu fuzyjnego.

Polipeptydy fuzyjne użyteczne do wykorzystywania w praktyce niniejszego wynalazku można przygotowywać poprzez ekspresję w prokariotycznym lub eukariotycznym układzie ekspresyjnym. Ekspresję zrekombinowanego genu i oczyszczanie polipeptydu można prowadzić wykorzystując wiele metod. Gen można zsubklonować w bakteryjnym wektorze ekspresyjnym, takim jak, na przykład, ale nie ograniczając się do, pCP110.

Polipeptydy fuzyjne można oczyszczać jakąkolwiek techniką, która umożliwia późniejsze tworzenie stabilnego, aktywnego biologicznie białka. Na przykład, ale bez żadnych ograniczeń, czynniki można odzyskiwać z komórek jako rozpuszczalne białka lub ciała inkluzyjne, z których można je ilościowo ekstrahować 8 M chlorowodorkiem guanidyny i dializować. W celu dalszego oczyszczenia czynników można stosować konwencjonalną chromatografię jonowymienną, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię z odwróconymi fazami lub filtrację żelową.

Przykłady opisują przygotowywanie nowych ligandów polipeptydowych, które obejmują wiążącą receptor domenę przedstawiciela rodziny ligandów angiopoetyn, które mogą wiązać się z receptorem Tie-2.

Jak donoszono uprzednio, odkryto i nazwano angiopoetynami rodzinę ligandów receptora Tie-2. Rodzinę tę, składającą się z liganda 1 TIE-2 (Ang-1), liganda 2 TIE-2 (Ang-2), liganda 3 TIE (Ang 3) oraz liganda 4 TIE (Ang-4) obszernie scharakteryzowano. Odnośnie opisu klonowania, sekwencjonowania i charakteryzowania angiopoetyn, jak również ich przygotowywania i stosowania, włącznie z wytwarzaniem i charakteryzowaniem ich zmodyfikowanych i chimerycznych ligandów, autorzy odwołują się do następujących publikacji: opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 521 073, wydany 28 maja 1996 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 643 755, wydany 1 lipca 1997 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 650 490, wydany 22 lipca 1997 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 814 464, wydany 29 września 1998 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 879 672, wydany 9 marca 1999 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 851 797, wydany 22 grudnia 1998 r., międzynarodowe zgłoszenie PCT zatytułowane „TIE-2 Ligands Methods of Making and Uses Thereof”, opubliko8

PL 199 645 B1 wane jako światowy opis patentowy numer 96/11269 18 kwietnia 1996 r. w imieniu Regeneron Pharmaceuticals, Inc., międzynarodowe zgłoszenie PCT zatytułowane „TIE-2 Ligands Methods of Making and Uses Thereof”, opublikowane jako światowy opis patentowy numer 96/31598 10 października 1996 r. w imieniu Regeneron Phar-maceuticals, Inc., międzynarodowe zgłoszenie PCT zatytułowane „TIE-2 Receptor Ligands (TIE Ligand-3; TIE Ligand 4) And Their Uses”, opublikowane jako światowy opis patentowy numer 97/48804 24 grudnia 1997 r. w imieniu Regeneron Phar-maceuticals, Inc. oraz międzynarodowe zgłoszenie PCT zatytułowane „Modified TIE-2 Receptor Ligands”, opublikowane jako światowy opis patentowy numer 98/05779 12 lutego 1998 r. w imieniu Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

W znaczeniu tu stosowanym, polipeptyd fuzyjny obejmuje funkcjonalnie równoważne cząsteczki, w których reszty aminokwasowe w sekwencji podstawia się resztami, które dają zmianę milczącą lub konserwatywną. Na przykład, jedną lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji można podstawić innym aminokwasem o podobnej polarności, który działa jako równoważnik funkcjonalny, czego wynikiem jest zmiana milcząca lub konserwatywna. Podstawniki aminokwasu w sekwencji aminokwasowej można wybierać spośród innych przedstawicieli klasy, do której aminokwas należy. Na przykład, aminokwasy niepolarne (hydrofobowe) obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne aminokwasy obojętne obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Aminokwasy naładowane dodatnio (zasadowe) obejmują argininę, lizynę i histydynę. Aminokwasy naładowane ujemnie (kwaśne) obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Zakres wynalazku obejmuje również białka lub ich fragmenty bądź pochodne, które zmodyfikowano w sposób zróżnicowany podczas lub po translacji, np. przez glikozylację, rozszczepienie proteolityczne, połączenie z cząsteczką przeciwciała lub innym ligandem komórkowym itp.

Komórki, w których zachodzi ekspresja fuzyjnych polipeptydów według wynalazku utworzono technikami inżynierii genetycznej przez, na przykład, transfekcję, transdukcję, elektroporację lub mikroiniekcję.

Niniejszy wynalazek obejmuje sekwencje kwasów nukleinowych kodujące fuzyjne polipeptydy według wynalazku, jak również sekwencje, które hybrydyzują w surowych warunkach z sekwencjami kwasów nukleinowych, które są komplementarne do sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku. Surowe warunki przedstawiono w, na przykład, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. 2, tom 1, str. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Ponadto, niniejszy wynalazek obejmuje sekwencje kwasów nukleinowych, które różnią się od sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku, ale które mimo to kodują polipeptydy według wynalazku z powodu degeneracji kodu genetycznego.

Ponadto, w niniejszym wynalazku rozważa się stosowanie opisywanych tu polipeptydów fuzyjnych w postaciach wyznakowanych.

Do wstawiania fragmentów DNA do wektora w celu skonstruowania wektorów ekspresyjnych kodujących polipeptydy fuzyjne według wynalazku można stosować jakiekolwiek metody znane specjaliście w tej dziedzinie z zastosowaniem odpowiednich sygnałów kontroli transkrypcyjnej/translacyjnej i sekwencji kodujących białko. Metody te mogą obejmować techniki rekombinacji DNA in vitro i syntetyczne oraz rekombinacje in vivo (rekombinacja genetyczna). Ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptydy fuzyjne według wynalazku może regulować druga sekwencja kwasu nukleinowego, tak że polipeptyd fuzyjny ulega ekspresji w gospodarzu stransformowanym zrekombinowaną cząsteczką DNA. Na przykład, ekspresję opisywanych tu polipeptydów fuzyjnych może kontrolować jakikolwiek element promotorowy/wzmacniający znany w tej dziedzinie. Promotory, które można stosować do kontrolowania ekspresji polipeptydu fuzyjnego obejmują, ale nie ograniczają się do długich powtórzeń terminalnych opisanych w Squinto i in. (1991, Cell 65: 1-21), wczesnego regionu promotorowego ,SV40 (Bernoist i Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), promotora CMV, 5'-końcowego powtórzenia M-MuLV, promotora zawartego w 3'-końcowym długim powtórzeniu terminalnym wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto i in., 1980, Cell 22; 787-797), promotora kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (Wagner i in., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144-1445), sekwencji regulujących genu metalotioneiny (Brinster i in., 1982, Nature 296: 39-42), prokariotycznych wektorów ekspresyjnych, takich jak promotor blaktamazy (Villa-Kamaroff i in., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731) lub promotora tac (DeBoer i in., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80; 21-25), patrz także „Useful proteins from recombinant bacteria” w Scientific American, 1980, 242, 74-94, elementów promotorowych z drożdży i innych grzybów, takich jak promotor Gal 4, promotor ADH (dehydrogenazy alkoholowej), promotor PGK (kinazy fosfoglicerolowej), promotor fosfatazy alkalicznej, oraz następujących zwierzęcych regionów kontroli transkrypcji, które wykazują specyficzność tkankową i które wykorzystywano w zwierzęPL 199 645 B1 tach transgenicznych: regionu kontrolującego genu elastazy I, który jest aktywny w trzustkowych komórkach pęcherzyka gruczołowego (Swift i in., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz i in., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515), regionu kontrolującego genu insuliny, który jest aktywny w trzustkowych komórkach beta (Hanahan, 1985, Nature 315; 115-122), regionu kontrolującego genu immunoglobuliny, który jest aktywny w limfocytach (Grosschedl i in., 1984, Cell 38: 647-658; Adames i in., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander i in., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), regionu kontrolującego mysiego wirusa raka sutka, który jest aktywny w komórkach jądrowych, sutka, limfocytach i komórkach tucznych (Leder i in., 1986, Cell 45: 485-495), regionu kontrolującego genu albuminy, który jest aktywny w wątrobie (Pinkert i in., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276); regionu kontrolującego genu alfafetoproteiny, który jest aktywny w wątrobie (Krumlauf i in., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer i in., 1987, Science 235: 53-58), regionu kontrolującego genu alfa-1 antytrypsyny, który jest aktywny w wątrobie (Kelsey i in., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), regionu kontrolującego genu beta-globiny, który jest aktywny w komórkach szpikowych (Morgam i in., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias i in., 1986, Cell 46; 89-94), regionu kontrolującego genu mielinowego białka zasadowego, który jest aktywny w komórkach oligodendrocytów w mózgu (Readhead i in., 1987, Cell 48: 703-712), regionu kontrolują cego genu lekkiego łań cucha 2 miozyny, który jest aktywny w mięśniach szkieletowych (Shani, 1985, Nature 314: 283-286) oraz regionu kontrolującego genu hormonu uwalniającego gonadotropiny, który jest aktywny w podwzgórzu (Mason i in., 1986, Science 234: 1372-1378).

A zatem, zgodnie z wynalazkiem, wektory ekspresyjne zdolne do ulegania replikacji w gospodarzu bakteryjnym lub eukariotycznym, zawierające polipeptyd fuzyjny angiopoetyny, takie jak opisano w niniejszym opisie, stosuje się do transfekcji komórki gospodarza i dzię ki temu do kierowania ekspresją takiego kwasu nukleinowego w celu wytwarzania polipeptydów fuzyjnych, które można następnie odzyskiwać w postaci aktywnej biologicznie. W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, postać aktywna biologicznie obejmuje postać zdolną do wiązania z odpowiednim receptorem i powodowania zróżnicowanych funkcji i/lub wpływania na fenotyp komórki, w której zachodzi ekspresja receptora. Takie postacie aktywne biologicznie mogą, na przykład, indukować fosforylację domeny kinazy tyrozynowej receptora Tie2, bądź stymulować syntezę komórkowego DNA.

Wektory ekspresyjne zawierające wstawki kwasów nukleinowych można identyfikować przy zastosowaniu trzech ogólnych podejść: (a) hybrydyzacji DNA-DNA, (b) obecności lub nieobecności funkcji genów „markerowych”, oraz (c) ekspresji wstawionych sekwencji. W pierwszym podejściu, obecność obcych kwasów nukleinowych wstawionych do wektora ekspresyjnego można wykrywać przez hybrydyzację DNA-DNA z zastosowaniem sond zawierających sekwencje, które są homologiczne do wstawianych sekwencji kwasów nukleinowych. W drugim podejściu, układ zrekombinowany wektor/gospodarz można identyfikować i selekcjonować w oparciu o obecność lub nieobecność funkcji pewnych genów „markerowych” (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, fenotypu transformacji, tworzenia ciał inkluzyjnych w bakulowirusach) powodowaną przez wstawienie obcych sekwencji kwasów nukleinowych do wektora. Na przykład, jeśli do sekwencji genu markerowego wektora wstawiono sekwencję kwasu nukleinowego liganda z rodziny Eph, rekombinanty zawierające wstawkę można identyfikować na podstawie nieobecności funkcji genu markerowego. W trzecim podejściu, zrekombinowane wektory ekspresyjne można identyfikować przez oznaczanie produktu obcego kwasu nukleinowego, ulegającego ekspresji w rekombinancie. Takie oznaczenia mogą być oparte, na przykład, na fizycznych lub funkcjonalnych właściwościach produktu kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład na wiązaniu liganda z receptorem lub jego częścią, które mogą być wyznakowane, na przykład, wykrywalnym przeciwciałem lub jego częścią, bądź wiązaniu z przeciwciałami wytworzonymi przeciw białku będącemu przedmiotem zainteresowania lub jego części.

W komórkach według niniejszego wynalazku może zachodzić krótkotrwała lub, korzystnie, konstytutywna i ciągła ekspresja polipeptydów fuzyjnych angiopoetyny, jak opisano w niniejszym opisie.

Wynalazek ten zapewnia ponadto opracowanie polipeptydu fuzyjnego, jako czynnika terapeutycznego do leczenia pacjentów cierpiących na zaburzenia obejmujące komórki, tkanki lub narządy, w których zachodzi ekspresja receptora TIE-2. Takie cząsteczki można stosować w sposobie leczenia organizmu człowieka lub zwierzęcia, bądź w sposobie diagnozowania.

Ponieważ receptor TIE-2 zidentyfikowano w związku z komórkami śródbłonkowymi oraz, jak wykazano uprzednio, blokowanie agonistów receptora, takich jak ligand 1 TIE-2 (Ang-1), zapobiega tworzeniu naczyń, autorzy zgłoszenia oczekują, że polipeptydy fuzyjne agonistów TIE-2 według wynalazku mogą być użyteczne w indukcji tworzenia naczyń w chorobach lub zaburzeniach, w których takie

PL 199 645 B1 tworzenie naczyń jest wskazane. Takie choroby lub zaburzenia mogą obejmować gojenie ran, niedokrwienia i cukrzycę. Ligandy można testować w modelach zwierzęcych i stosować terapeutycznie jak opisano dla innych czynników, takich jak czynnik wzrostowy śródbłonka naczyniowego (VEGF), inny czynnik specyficzny wobec komórek śródbłonkowych, który jest naczyniotwórczy. Ferrara i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 332 671, wydany 26 lipca 1994 r. Praca Ferrara, jak również inne prace, opisują badania in vitro i in vivo, które można zastosować do wykazania wpływu czynnika naczyniotwórczego we wzmacnianiu dopływu krwi do niedokrwionego mięśnia sercowego, wzmacnianiu gojenia ran i innych przypadkach terapeutycznych, w których pożądana jest neoangiogeneza. [patrz Sudo i in., europejskie zgłoszenie patentowe numer 0 550 296 A2, opublikowane 7 lipca 1993 r.; Banai i in., Circulation 89: 2183-2189 (1994); Unger i in., Am. J. Physiol. 266: H1588-H1595 (1994); Lazarous i in., Circulation 91: 145-153 (1995)]. Zgodnie z wynalazkiem, polipeptydy fuzyjne agonistów można stosować same lub w kombinacji z jednym lub więcej dodatkowych związków aktywnych farmaceutycznie, takich jak VEGF lub zasadowy czynnik wzrostowy fibroblastów (bFGF).

W przeciwieństwie, wykazano, że antagoniści receptora TIE-2, tacy jak przeciwciała skierowane przeciw receptorowi TIE-2 lub ligand 2 TIE-2 (Ang-2), jak opisano w przykładzie 9 w międzynarodowej publikacji numer WO 96/31598, opublikowanej 10 października 1996 r., zapobiegają lub osłabiają tworzenie naczyń, a zatem oczekuje się, .że będą użyteczne w zapobieganiu lub osłabianiu, na przykład, wzrostu nowotworów. Podobnie więc, polipeptydy fuzyjne antagonistów TIE-2 według wynalazku mogą być również użyteczne do tych celów. Tych antagonistów można stosować oddzielnie lub w kombinacji z innymi kompozycjami, takimi jak przeciwciała skierowane przeciw VEGF, co do których wykazano, że są użyteczne w leczeniu stanów, w których celem terapeutycznym jest zablokowanie angiogenezy.

Na przykład, autorzy zgłoszenia stwierdzili, że ligandy TIE-2 ulegają ekspresji w komórkach w obrębie, bądź bardzo blisko nowotworów. Na przykład, ligand 2 TIE-2 (Ang-2) okazał się być ściśle związany z nowotworowymi komórkami śródbłonkowymi. Zgodnie z tym, polipeptydy fuzyjne antagonistów TIE-2 według wynalazku mogą również być użyteczne w zapobieganiu lub osłabianiu, na przykład, wzrostu nowotworów.

W innych rozwiązaniach, opisane w niniejszym opisie polipeptydy fuzyjne agonistów TIE-2 według wynalazku można stosować jako czynniki krwiotwórcze. W proliferacji i/lub różnicowaniu i/lub migracji różnych rodzajów komórek zawartych we krwi uczestniczy szereg różnorodnych czynników krwiotwórczych i ich receptorów. Ponieważ receptory TIE-2 ulegają ekspresji we wczesnych komórkach krwiotwórczych, oczekuje się, że ligandy TIE-2 odgrywają porównywalną rolę w proliferacji lub różnicowaniu lub migracji tych komórek. A zatem, na przykład, kompozycje polipeptydów fuzyjnych agonistów TIE-2 możną przygotowywać, oznaczać, sprawdzać w układach biologicznych in vitro i in vivo oraz stosować terapeutycznie jak opisano w którejkolwiek z poniższych prac: Sousa, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 810 643, Lee i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4360-4364 (1985), Wong i in., Science, 228: 810-814 (1985), Yokota i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 1070 (1984); Bosselman i in., światowy opis patentowy numer 9105795, opublikowany 2 maja 1991 r., zatytułowany „Stem Cell Factor”, oraz Kirkness i in., światowy opis patentowy numer 27 lipca 1995 r., zatytułowany „Haemopoietic Maturation Factor”. A zatem, polipeptydy fuzyjne można stosować do diagnozowania lub leczenia stanów, w których normalne procesy kriotwórcze są zahamowane, obejmujących, ale nie ograniczających się do anemii, małopłytkowości, leukopenii i granulocytopenii. W korzystnym rozwiązaniu, polipeptydy fuzyjne można stosować do stymulacji różnicowania komórek prekursorowych krwi w sytuacjach, w których pacjent cierpi na chorobę, taką jak nabyty zespół niewydolności immunologicznej (AIDS), która spowodowała obniżenie normalnych poziomów krwinek, bądź w stanach klinicznych, w których pożądane jest wzmocnienie populacji krwiotwórczej, takich jak związanych z przeszczepem szpiku kostnego, bąd ź w leczeniu aplazji lub supresji szpiku kostnego spowodowanych przez napromieniowanie, leczenie chemiczne lub chemioterapię.

Polipeptydy fuzyjne według niniejszego wynalazku można stosować same lub w kombinacji z innymi czynnikami aktywnymi farmaceutycznie, takimi jak, na przykład, cytokiny, neutrofiny, interleukiny itp. W korzystnym rozwiązaniu, polipeptydy fuzyjne można stosować w połączeniu z dowolną liczbą czynników, o których wiadomo, że indukują proliferację komórki macierzystej układu krwiotwórczego lub innego prekursora układu krwiotwórczego, bądź czynników działających na późniejsze komórki na szlaku hematopoezy, obejmujących, ale nie ograniczających się do czynnika dojrzewania układu krwiotwórczego, trombopoetyny, czynnika komórek macierzystych układu krwiotwórczego, erytropoetyny, G-CSF, GM-CSF itp.

PL 199 645 B1

W alternatywnym rozwią zaniu, fuzyjne polipeptydy antagonistów receptora TIE-2 stosuje się do diagnozowania lub leczenia pacjentów, u których pożądanym wynikiem jest hamowanie szlaku hemopoezy, tak jak do leczenia zaburzeń mieloproliferacyjnych lub innych zaburzeń proliferacji narządów krwiotwórczych, takich jak trombocytoza, czerwienica i białaczka. W takich rozwiązaniach, leczenie może obejmować stosowanie terapeutycznie skutecznej ilości opisywanych tu polipeptydów fuzyjnych.

Skuteczne dawki użyteczne do leczenia tych i innych chorób lub zaburzeń można określać stosując metody znane specjaliście w tej dziedzinie [patrz, na przykład, Fingl i in., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman i Gilman, red., Macmillan Publishing Co., Nowy Jork, str. 1-46 (1975)]. Kompozycje farmaceutyczne do stosowania zgodnie z wynalazkiem obejmują opisane powyżej polipeptydy fuzyjne w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku płynnym, stałym lub półstałym, przed podawaniem in vivo połączone z cząsteczką nośnikową lub kierującą (np. przeciwciałem, hormonem, czynnikiem wzrostowym itp.) i/lub wprowadzone do liposomów, mikrokapsułek oraz preparatu o kontrolowanym uwalnianiu. Na przykład, kompozycja farmaceutyczna może zawierać polipeptyd fuzyjny w roztworze wodnym, takim jak jałowa woda, sól fizjologiczna, bufor fosforanowy lub roztwór dekstrozy. Alternatywnie, czynniki aktywne mogą być zawarte w postaci stałej (np. wosku) lub półstałej (np. żelatynowej), którą można wszczepiać pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia. Drogą podawania może być dowolna droga podawania znana w tej dziedzinie, obejmująca, ale nie ograniczająca się do podawania dożylnego, dooponowego, podskórnego, przez iniekcję do zajętej tkanki, dotętniczego, donosowego, doustnego lub poprzez wszczep.

Wynikiem podawania może być dystrybucja czynnika aktywnego według wynalazku w całym organizmie lub w ograniczonym obszarze. Na przykład, w pewnych stanach, które obejmują odległe regiony układu nerwowego, może być pożądane dożylne lub dooponowe podawanie czynnika. W niektórych sytuacjach w/lub pobliżu uszkodzonych obszarów można umieszczać wszczep zawierający czynnik aktywny. Odpowiednie wszczepy obejmują, ale nie ograniczają się do wszczepów opartych na żelu piankowym, wosku lub mikrocząstkach.

Niniejszy wynalazek zapewnia także kompozycje farmaceutyczne zawierające opisywane tu polipeptydy w farmaceutycznie dopuszczalnym podłożu. Kompozycje można podawać ogólnoustrojowo lub miejscowo. Można stosować jakikolwiek odpowiedni sposób znany w tej dziedzinie, obejmujący, ale nie ograniczający się do dożylnego, dooponowego, dotętniczego, donosowego, doustnego, podskórnego, dootrzewnowego bądź poprzez miejscowe iniekcje lub wszczep chirurgiczny. Zapewnia się również postacie o przedłużonym uwalnianiu.

Opisane w niniejszym opisie szczegółowe rozwiązania nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku. Faktycznie, różne modyfikacje wynalazku, poza tymi opisanymi w niniejszym opisie, staną się oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie na podstawie powyższego opisu i dołączonych figur. Takie modyfikacje w zamierzeniu pozostają w zakresie załączonych zastrzeżeń.

P r z y k ł a d y

Ligandy angiopoetynowe

Jak opisano supra, doświadczenia z mutantami Ang-1 i Ang-2 wykazały, że domenami wiążącymi receptor są domeny fibrynogenowe (FD) oraz że wersje w postaci dimerów (dimeryzacja występuje w wyniku oddziaływania pomię dzy składowymi Fc sąsiadujących cząsteczek), na przykł ad Ang-1-FD-Fc, mogą wiązać się z receptorem Tie-2 ze znacznie wyższym powinowactwem, niż monomeryczna Ang-1-FD. Jednakże, Ang-1-FD-Fc nie jest zdolna do indukcji fosforylacji (aktywowania) receptora Tie-2 na komórkach śródbłonkowych, o ile nie zwiększono stopnia aglomeracji przez zastosowanie kozich przeciwciał skierowanych przeciw Fc człowieka (Jackson Immunoresearch). Z tego powodu, zaprojektowano zmutowane wersje Ang-1-FD i Ang-2-FD, które są w postaci znacznie bardziej złożonych aglomeratów.

Skonstruowano dwa ogólne typy cząsteczek kwasów nukleinowych. Pierwszy typ składał się z dwóch tandemowych kopii Ang-1-FD, poddanych fuzji ze znacznikiem Fc, co prowadziło zatem do wydzielanej cząsteczki polipeptydowej, która jest dimeryczna w odniesieniu do znacznika Fc, ale tetrameryczna w odniesieniu do Ang-1-FD. Podobnie, wersję angiopoetyny tego typu konstruktu stanowiły dwie tandemowe kopie Ang-2-FD poddane fuzji ze znacznikiem Fc. Cząsteczki te oznaczono odpowiednio Ang-1-FD-FD-Fc oraz Ang-2-FD-FD-Fc.

W drugim typie skonstruowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, dwie kopie Ang-1-FD połączono poprzez znacznik Fc, tworząc zatem strukturę Ang-1-FD-Fc-FD, która nadal jest dimeryczna w odniesieniu do Fc, jak również tetrameryczna w odniesieniu do Ang-1-FD. Skonstruowano równie ż wersję angiopoetyny 2 i te dwie cząsteczki oznaczono odpowiednio Ang-1-FD-Fc-FD i Ang-2-FD-Fc-FD.

PL 199 645 B1

Dla konstruktów każdego z typów obserwowano podobne właściwości: w przeciwieństwie do dimerycznej Ang-1-FD-Fc, która nie mogła aktywować Tie-2 w komórkach śródbłonkowych, zarówno Ang-1-FD-FD-Fc, jak i Ang-1-FD-Fc-FD mogły łatwo aktywować Tie-2 w komórkach śródbłonkowych, z siłą porównywalną do siły natywnego liganda. Również, podobnie .jak natywna angiopoetyna 2, Ang-2-FD-Fc-FD może wykazywać aktywność antagonistyczną wobec aktywności angiopoetyny 1 z siłą, która jest porównywalna do siły natywnej angiopoetyny 2, a ze znacznie większą siłą, niż dimer Ang-2-FD-Fc o nieznacznie antagonistycznej aktywności.

Konstruowanie cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących angiopoetyny

Wszystkie z poniższych cząsteczek kwasów nukleinowych skonstruowano standardowymi technikami rekombinacji DNA (patrz np. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), Current Protocols in Molecular Biology (red. Ausubel i in., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), ich sekwencje zweryfikowano standardowymi technikami stosując sekwenator DNA ABI 373A oraz Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) oraz zsubklonowano je w ssaczym wektorze ekspresyjnym pMT21 (Genetics Institute, Inc.) z sekwencji Kozak (Kozak, M., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 8125-8148) na końcu 5' do pobudzania translacji białka. Opisane infra sekwencje łącznikowe wprowadzono dla zapewnienia dogodnych miejsc restrykcyjnych oraz dla zapewnienia elastyczności połączeń pomiędzy domenami, ale brak jest wskazań co do krytycznego charakteru tych sekwencji łącznikowych (chociaż zróżnicowanie długości łącznika w niektórych z tych konstruktów prowadziło do pewnego zróżnicowania ilości wytwarzanego białka).

P r z y k ł a d 1

Konstruowanie cząsteczek kwasów nukleinowych Ang-1-FD-FD-Fc, Ang-2-FD-FD-Fc, Ang-1-FD-Fc-FD i Ang-2-FD-Fc-FD

Ang-1-FD-FD-Fc:

Ang-1-FD-FD-Fc składa się z sekwencji sygnałowej trypsyny na końcu aminowym dla umożliwienia wydzielania (zasady 1-45 na fig. 1A), po której następuje domena fibrynogenowa (FD) angiopoetyny 1 (zasady 46-690 na fig. 1A - fig. 1B), krótka sekwencja łącznikowa, składająca się z aminokwasów Gly-Pro Ala-Pro (zasady 691-702 na fig. 1B), druga FD angiopoetyny 1 (zasady 703-1750) na fig. 1B fig. 1D), następna sekwencja łącznikowa, składająca się z aminokwasów Gly-Pro-Gly (zasady 1351-1359 na fig. 1D) oraz sekwencja kodująca część Fc ludzkiej IgG1 (zasady 1360-2058 na fig. 1D - fig. 1E).

Ang-2-FD-FD-Fc:

podobnie skonstruowano cząsteczkę kwasu nukleinowego Ang-2-FD-FD-Fc. Składa się ona z sekwencji sygnałowej trypsyny (zasady 1-45 na fig. 2A), FD angiopoetyny 2 (zasady 46-690 na fig. 2A fig. 2B), łącznikowej sekwencji aminokwasowej Gly-Gly-Pro-Ala-Pro (zasady 691-705 na fig. 2B), drugiej FD angiopoetyny 2 (zasady 706-1353 na fig. 2B - fig. 2D), następnej sekwencji łącznikowej, aminokwasowej Gly-Pro-Gly (zasady 1354-1362 na fig. 2D) oraz sekwencji kodującej część Fc ludzkiej IgG1 (zasady 1363-2061 na fig. 2D - fig. 2E).

Ang-1-FD-Fc-FD:

Ang-1-FD-Fc-FD składa się z sekwencji sygnałowej trypsyny (zasady 1-45 na fig. 3A), FD angiopoetyny 1 (zasady 46-690 na fig. 3A - fig. 3B), łącznikowej sekwencji aminokwasowej Gly-Pro-Gly (zasady 691-699 na fig. 3B), sekwencji kodującej część Fc ludzkiej IgG1 (zasady 700-1395 fig. 3B fig. 3D), następnej łącznikowej sekwencji aminokwasowej Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Pro (zasady 1396-1419 na fig. 3D) oraz drugiej FD angiopoetyny 1 (zasady 1420-2067 na fig. 3D - fig. 3E).

Ang-2-FD-Fc-FD:

Cząsteczka kwasu nukleinowego Ang-2-FD-Fc-FD składa się z sekwencji sygnałowej trypsyny (zasady 1-45 na fig. 4A), FD angiopoetyny 2 (zasady 46-690 na fig. 4A - fig. 4B), łącznikowej sekwencji aminokwasowej Gly-Gly-Pro-Gly (zasady 691-702 na fig. 4B), sekwencji kodującej część Fc ludzkiej IgG1 (zasady 703-1398 fig. 4B - fig. 4D), łącznikowej sekwencji aminokwasowej Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Pro (zasady 1399-1422 na fig. 4D) oraz drugiej FD angiopoetyny 2 (zasady 1423-2067 na fig. 4D - fig. 4E).

P r z y k ł a d 2

Charakteryzowanie białka Ang-1 FD-Fc-FD

Analiza masy cząsteczkowej:

Przewidywaną masę cząsteczkową białka Ang-1-FD-Fc-FD określono stosując program MacVector (Kodak, Scientific Imaging Systems, New Haven, CT). Postać monomeryczna (w odniesieniu do Fc) posiada przewidywaną masę 76 349. Ponadto, istnieją trzy przewidywane miejsca N-glikoPL 199 645 B1 zylacji, około 2500 Da/miejsce, które potencjalnie mogą zwiększać masę cząsteczkową monomerycznego białka do 83 849. Z powodu oddziaływania pomiędzy składowymi Fc sąsiadujących cząsteczek, białko w rzeczywistości istnieje w postaci dimeru, o przewidywanej masie cząsteczkowej, po uwzględnieniu możliwej N-glikozylacji, wynoszącej 167 698. Późniejsze analizy SDS-PAGE opisanego infra białka pochodzącego z komórek COS potwierdziły te przybliżone masy cząsteczkowe; obserwowano prążek białka migrującego przy około 210 kD w warunkach nieredukujących i prążek białka migrujący przy około 86 kD w warunkach redukujących (fig. 5). W celu dalszego potwierdzenia masy cząsteczkowej oraz, co ważniejsze, określenia, czy białko jest homogenne, czy nie, przeprowadzono analizę rozpraszania światła. Rozpraszanie światła jest funkcją masy i stężenia makrocząsteczki. Dla określenia masy cząsteczkowej, próbkę białka wstrzykiwano na kolumnę do sączenia molekularnego i eluat monitorowano stosując przyłączony detektor rozpraszania światła oraz detektor współczynnika załamania i/lub UV. Detektorem rozpraszania światła jest laserowy detektor MiniDawn firmy Wyatt Technology Corporation (Santa Barbara, CA). Aparat ten mierzy światło statyczne pod trzema różnymi kątami. Przyłączony detektor współczynnika załamania lub detektor UV służy do pomiaru stężenia białka. Do obliczania stężenia białka stosowano oprogramowanie Astra 4.7 (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) oparte na albo dn/dc (dn = zmiana współczynnika załamania; dc = stężenie), albo współczynniku ekstynkcji białka. Masę cząsteczkową białka oblicza się następnie na podstawie kątowej zależności rozpraszania światła. Figura 6 przedstawia wyniki tej analizy z zastosowaniem białka pochodzącego z komórek COS. Masa cząsteczkowa dimerycznego białka okazała się wynosić około 200 kD, a występowanie pojedynczego piku oznacza, że roztwór białka rzeczywiście jest homogenny.

Poziom ekspresji w komórkach COS:

Zawierający zrekombinowane białko Ang-1-FD-Fc-FD supernatant komórek COS utworzono przez krótkotrwałą transfekcję komórek COS opisanym supra konstruktem DNA Ang-1-FD-Fc-FD. Wszystkie transfekcje prowadzono stosując znane w tej dziedzinie standardowe techniki. Supernatant komórek COS analizowano stosując technikę Biacore (Pharmacia, Inc.) do oceny ilości białka Ang-1-FD-Fc-FD obecnego w supernatancie. Wynikiem tej analizy była wartość RU wynosząca 765, która jest równoważna 0,9 mg zrekombinowanego białka/litr supernatantu komórek COS. Wartości te odpowiadają bardzo wysokim poziomom ekspresji.

Oczyszczanie supernatantów COS:

Ponieważ białko Ang-1-FD-Fc-FD zawiera domenę Fc, oczyszczanie jest stosunkowo proste i łatwe z zastosowaniem standardowej chromatografii kolumnowej na białku A (Pharmacia, Inc), a następnie standardowej chromatografii sączenia molekularnego (Pharmacia, Inc.). W rzeczywistości, względna łatwość oczyszczania białka Ang-1-FD-Fc-FD daje mu przewagę nad białkiem macierzystym, angiopoetyną 1, od którego ono pochodzi, oraz zmutowaną wersją angiopoetyny 1, nazwaną Ang1*, która składa się z końca N angiopoetyny 2 poddanego fuzji z domeną superhelisy i domeną fibrynogenową angiopoetyny 1, oraz która posiada mutację Cys na Ser w pozycji aminokwasowej 245. (Patrz międzynarodowe zgłoszenie PCT zatytułowane „Modified TIE-2 Receptor Ligands”, opublikowane jako światowy opis patentowy numer 98/05779 12 lutego 1998 r. w imieniu Regeneron Pharmaceuticals, Inc., zwłaszcza fig. 27, które włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy).

Zarówno angiopoetyna 1, jak i Ang1* wymagają skomplikowanych, kosztownych i laboratoryjnie pracochłonnych procedur oczyszczania, których wynikiem jest stosunkowo niska wydajność zrekombinowanego białka. Potrzeba wydajnych ekonomicznie, prostych procedur oczyszczania związków biologicznych przeznaczonych do stosowania klinicznego nie może być bez istotnego znaczenia.

Supernatant komórek COS oczyszczono w sposób opisany supra i uzyskano około 1 mg oczyszczonego białka Ang-1-FD-Fc-FD, które zastosowano w opisanych infra badaniach do dalszego scharakteryzowania białka.

Sekwencjonowanie końca N pochodzącego z komórek COS białka Ang-1-FD-Fc-FD:

Oczyszczone białko Ang-1-FD-Fc-FD poddano standardowej analizie sekwencji końca N w celu stwierdzenia, czy tworzone były jakiekolwiek skrócone cząsteczki białka. Było to przedmiotem zainteresowania, ponieważ w przeszłości stwierdzano, że zmutowana cząsteczka, Ang1* zawierała pomiędzy 10 a 20% skróconych cząsteczek. Analiza ujawniła tylko jedną sekwencję N-końcową, Arg-Asp-X-Ala-Asp, gdzie X jest Cys. Sekwencję tę można znaleźć w pozycjach aminokwasowych 16-20 na fig. 3A, i występuje ona bezpośrednio po sekwencji sygnałowej białka, odpowiadającej aminokwasom 1-15 na fig. 3A.

Analiza wiązania pochodzącej z komórek COS Ang-1-FD-Fc-FD z receptorem:

Uprzednie badania pozwoliły ustalić, że domena fibrynogenowa (FD) cząsteczek angiopoetyn jest konieczna do oddziaływań ligand/receptor. Ponadto, aby występowały wysokie powinowactwa wią14

PL 199 645 B1 zania z receptorem Tie-2, natywna angiopoetyna 1, angiopoetyna 2 i zmutowana Ang1* muszą tworzyć co najmniej tetrameryczne, a być może wyższego rzędu, multimery. W celu określenia, czy pochodzące z komórek COS białko Ang-1-FD-Fc-FD, które jest tetrameryczne w odniesieniu do domeny FD, może wiązać się z Tie-2 z wysokim powinowactwem, przeprowadzono standardową analizę Biacore. Krótko, białko receptorowe Tie-2-Fc, które jest białkiem fuzyjnym zawierającym domenę zewnętrzną Tie-2 poddaną fuzji z domeną Fc ludzkiej IgG1, immobilizowano na chipie Biacore. Na chipem przepuszczano roztwór zawierający Ang-1-FD-Fc-FD i umożliwiano zachodzenie wiązania pomiędzy domeną zewnętrzną Tie-2 i Ang-1-FD-Fc-FD. Po etapie wiązania następowało przemywanie solą o wysokim stężeniu - 0,5 M NaCl. Przemywanie solą o wysokim stężeniu nie było w stanie znieść oddziaływań pomiędzy białkiem Ang-1-FD-Fc-FD i domeną zewnętrzną receptora Tie-2, co oznacza, że występuje silne oddziaływanie pomiędzy zmutowanym ligandem a receptorem. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi wynikami uzyskanymi w analizach Biacore, w których wykazano, że zarówno cząsteczka macierzysta Ang-1-FD-Fc-FD, angiopoetyna 1, jak i zmutowana cząsteczka Ang1* silnie oddziałują z receptorem Tie-2-Fc, oraz, że wysokie stężenie soli nie znoszą tego oddziaływania. W przeciwieństwie, kilka zmutowanych cząsteczek pochodzących od macierzystej cząsteczki angiopoetyny 1 łatwo dysocjuje od receptora Tie-2-Fc, jeśli podziała się na nie wysokim stężeniem soli. Zmutowane cząsteczki, oznaczone Ang-1/FD (monomer w odniesieniu do FD), Ang-1/FD-Fc (także monomer w odniesieniu do FD, który jest jednak zdolny do tworzenia dimeru w obecności domeny Fc) oraz Ang-1/C/FD (monomer w odniesieniu do FD, który zawiera jednak również domenę superhelisy angiopoetyny 1) nie występują w multimerycznych postaciach odpowiednich do wiązania z wysokim powinowactwem receptora Tie-2.

P r z y k ł a d 3

Charakteryzowanie pochodzącego z komórek COS białka Ang-2-FD-Fc-FD

Analiza masy cząsteczkowej:

Jak opisano supra dla Ang-1-FD-Fc-FD, przewidywaną masę cząsteczkową białka Ang-2-FD-Fc-FD określono stosując program MacVector (Kodak, Scientific Imaging Systems, New Haven, CT). Postać monomeryczna Ang-2-FD-Fc-FD posiada przewidywaną masę 76 052. Ponadto, istnieją trzy przewidywane miejsca N-glikozylacji, około 2500 Da/miejsce, które potencjalnie mogą zwiększać masę cząsteczkową monomerycznego białka do 83 849, z trzema miejscami N-glikozylacji, które mogą potencjalnie zwiększyć masę cząsteczkową monomerycznego białka do 83 552. Podobnie jak Ang-1-FD-Fc-FD, białko istnieje w postaci dimeru, o przewidywanej masie cząsteczkowej, po uwzględnieniu możliwej N-glikozylacji, wynoszącej 167 104. Analizy SDS-PAGE białka pochodzącego z komórek COS potwierdziły te przybliżone masy cząsteczkowe; obserwowano prążek białka migrującego przy około 200 kD w warunkach nieredukujących i prążek białka migrujący przy około 88 kD w warunkach redukujących (fig. 7). Analiza rozpraszania światła potwierdziła masę cząsteczkową (171 kD) i ujawniła, że białko Ang-2-FD-Fc-FD, podobnie jak Ang-1-FD-Fc-FD, występuje w postaci homogennej.

Poziom ekspresji w komórkach COS:

Zawierający zrekombinowane białko Ang-2-FD-Fc-FD supernatant komórek COS utworzono przez krótkotrwałą transfekcję komórek COS opisanym supra konstruktem DNA Ang-2-FD-Fc-FD. Supernatant komórek COS analizowano stosując technikę Biacore do oceny ilości białka Ang-2-FD-Fc obecnego w supernatancie. Wynikiem tej analizy była wartość RU wynosząca 606, która jest równoważna 0,7 mg zrekombinowanego białka/litr supernatantu komórek COS. Wartości te odpowiadają stosunkowo wysokim poziomom ekspresji.

Oczyszczanie supernatantów COS:

Jak w przypadku Ang-1-FD-Fc-FD, białko Ang-2-FD-Fc-FD zawiera domenę Fc, a zatem oczyszczanie jest stosunkowo proste i łatwe z zastosowaniem standardowej chromatografii kolumnowej na białku A, a następnie standardowej chromatografii sączenia molekularnego. Supernatant komórek COS oczyszczono jak dla Ang-1-FD-Fc-FD supra i otrzymano około 2 mg oczyszczonego białka Ang-2-FD-Fc-FD, które zastosowano w opisanych infra badaniach do dalszego scharakteryzowania białka.

Sekwencjonowanie końca N:

Oczyszczone, pochodzące z komórek COS białko Ang-2-FD-Fc-FD poddano standardowej analizie sekwencji końca N w celu stwierdzenia, czy tworzone były jakiekolwiek skrócone cząsteczki białka. Analiza ujawniła tylko jedną sekwencję N-końcową, Arg-Asp-X-Ala-Glu, w której X jest Cys. Sekwencję tę można znaleźć w pozycjach aminokwasowych 16-20 na fig. 4A, i występuje ona bezpośrednio po sekwencji sygnałowej białka, odpowiadającej aminokwasom 1-15 na fig. 4A.

PL 199 645 B1

Analiza wiązania białka pochodzącego z komórek COS z receptorem:

W celu określenia, czy pochodzące z komórek COS białko Ang-2-FD-Fc-FD może wiązać się z receptorem Tie-2, przeprowadzono standardową analizę Biacore, jak opisano supra dla Ang-1-FD-Fc-FD. Tak jak w przypadku Ang-1-FD-Fc-FD, przemywanie solą o wysokim stężeniu nie było w stanie znieść oddziaływania pomiędzy białkiem Ang-2-FD-Fc-FD i receptorem Tie-2, co znów oznacza, że występuje silne oddziaływanie pomiędzy zmutowanym ligandem a receptorem

P r z y k ł a d 4

Wpływy pochodzących z komórek COS Ang-1-FD-Fc-FD i Ang-2-FD-Fc-FD na fosforylację receptora Tie-2 w komórkach EAhy926

Ponieważ Ang-1-FD-Fc-FD jest zmutowaną cząsteczką pochodzącą od agonisty, angiopoetyny 1, a Ang-2-FD-Fc-FD jest zmutowaną cząsteczką pochodzącą od antagonisty, angiopoetyny 2, chcieliśmy stwierdzić, czy te dwie zmutowane cząsteczki mogą zachować aktywność związaną z cząsteczkami macierzystym, od których pochodziły, czy też nie.

Układ oznaczenia:

We wszystkich doświadczeniach opisanych infra wykorzystywano linię komórkową EAhy926 (Edgell, C.J. i in., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3734-3737) oraz standardowe oznaczenia fosforylacji i odczynniki, znane specjalistom w tej dziedzinie.

(A) Porównanie fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Ang1* i pod wpływem Ang-1-FD-Fc-FD w komórkach EAhy926:

Komórki EAhy926 stymulowano 0,1 μg/ml, 0,2 μg/ml lub 0,8 μg/ml, albo białka Ang-1-FD-Fc-FD, albo białka Ang-2-FD-Fc-FD. Standardowe oznaczenie fosforylacji ujawniło, że białko Ang-1-FD-Fc-FD było równoważna Ang1* pod względem zdolności do stymulacji fosforylacji receptora Tie-2 w komórkach EAhy926 (fig. 9).

B) Zdolność Ang-2-FD-Fc-FD do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Ang1* w komórkach EAhy926:

Komórki EAhy926 traktowano 0,4 Lig/ml agonisty Tie-2, Ang1*, oraz 1 Lig/ml, 2 μg/ml, 4 Lig/ml, 6 μg/ml lub 8 Lg/ml Ang-2-FD-Fc-FD. Jak przedstawiono na fig. 10, Ang-2-FD-Fc-FD jest zdolna do blokowania stymulacji receptora Tie-2 przez Ang1*, gdy była obecna w co najmniej 10-15-krotnym nadmiarze molowym wobec Ang1*.

(C) Zdolność angiopoetyny 2 do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Ang1* w komórkach EAhy926:

W celu porównania blokujących wpływów naturalnie występującego antagonisty, angiopoetyny 2, z tym Ang-2-FD-Fc-FD, przeprowadzono takie samo doświadczenie, jak w (B) supra, Ang-2-FD-Fc-FD zastępując angiopoetyna 2. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 11. Przy 20-krotnym nadmiarze molowym angiopoetyną 2 nie obniżała poziomu fosforylacji do 50%. Wynik ten, w połączeniu z wynikiem opisanym w (B) supra, oznacza, że Ang-2-FD-Fc-FD jest silniejszym inhibitorem fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Ang-1*, niż angiopoetyna 2.

(D) Zdolność Ang-2-FD-Fc-FD do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem angiopoetyny 1 w komórkach EAhy926:

Komórki EAhy926 traktowano 0,2 L g/ml naturalnie występującego agonisty Tie-2, angiopoetyny 1, oraz 1 L g/ml, 2 L g/ml, 4 L g/ml, 6 L g/ml lub 8 L g/ml Ang-2-FD-Fc-FD. Wyniki tego doświadczenia, przedstawione na fig. 12, pokazują, że o ile występuje tendencja do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem angiopoetyny 1 w tych komórkach, Ang-2-FD-Fc-FD wydaje się być bardziej skuteczna pod względem blokowania fosforylacji Tie-2 pod wpływem Ang1*, co pokazano na fig. 10 i opisano w (B) supra.

(E) Zdolność angiopoetyny 2 do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem angiopoetyny 1 w komórkach EAhy926:

Komórki EAhy926 traktowano 0,2 L g/ml angiopoetyny 1 oraz 1 L g/ml, 2 L g/ml, 4 L g/ml, 6 L g/ml lub 8 L g/ml angiopoetyny 2. Wyniki tego doświadczenia, przedstawione na fig. 13, pokazują, że występuje tendencja do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem angiopoetyny 1 w tych komórkach, ale, podobnie jak Ang-2-FD-Fc-FD, angiopoetyna 2 wydaje się być bardziej skuteczna pod względem blokowania fosforylacji Tie-2 pod wpływem Ang1*, co pokazano na fig. 11 i opisano w (C) supra.

P r z y k ł a d 5

Konstruowanie wektora do ekspresji Ang-1-FD-Fc-FD w komórkach CHO, pRG763/Ang-1-FD-Fc-FD

Wektor do ekspresji w komórkach CHO, pRG763/Ang-1-FD-Fc-FD, skonstruowano przez wyizolowanie z plazmidu pCDNA3.1/Ang1-FD-Fc-FD fragmentu EcoRI-Notl o długości 2115 par zasad,

PL 199 645 B1 zawierającego Ang1-FD-Fc-FD, oraz ligację tego fragmentu ze strawionym EcoRI i Notl wektorem pRG763. Hodowlę na dużą skalę (2 litry) komórek E. coli DH10B zawierających plazmid pRG763/Ang-1-FD-Fc-FD, namnażano przez noc w TB + ampicylina i plazmidowy DNA ekstrahowano stosując Promega Wizard Plus Maxiprep Kit zgodnie z protokołem producenta. Stężenie oczyszczonego plazmidowego DNA oznaczano w spektrofotometrze UV i fluorymetrze. Plazmidowy DNA zweryfikowano przez strawienie próbki enzymami restrykcyjnymi Ncol i HincII. Wszystkie fragmenty produktu trawienia enzymami restrykcyjnymi odpowiadały przewidywanym wielkościom w 1% żelu agarozowym.

P r z y k ł a d 6

Ekspresja Ang-1-FD-Fc-FD w komórkach CHO

Czterdzieści szalek Petri'ego o średnicy 15 cm posiano komórkami CHO-K1/E1A z gęstością 4 x 10⁶ komórek/szalkę. Wysiewano na podłoże Gibco Hama F-12 w/10% płodowa surowica bydlęca (FBS) Hyclone + penicylina/streptomycyna, uzupełnione glutaminą. Następnego dnia każdą szalkę poddano transfekcji 6 μg pRG763/Ang-1-FD-Fc-FD stosując Optimem Gibco i Lipofectamine Gibco w objętości 12 ml, zgodnie z protokołem producenta. Po czterech godzinach od dodania mieszaniny transfekującej do komórek dodawano 12 ml/szalkę Optimem w/10% FBS. Szalki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Następnego dnia z każdej szalki usuwano podłoże i dodawano 25 ml podłoża do ekspresji (Gibco CHO-S-SFM II w/glutamina + 1 mM maślan sodowy). Szalki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 3 dni. Po trzech dniach inkubacji podłoże usuwano przez aspirację z każdej szalki i odwirowano przy 400 obrotach na minutę stosując rotor z kubełkami wychylnymi w celu osadzenia komórek. Supernatant zdekantowano do jałowych butelek o pojemności 1 litra i oczyszczano w sposób opisany infra.

P r z y k ł a d 7

Konstruowanie wektora do ekspresji Ang-2-FD-Fc-FD w komórkach CHO, pRG763/Ang-2-FD-Fc-FD

Plazmid pRG763/Ang-2-FD-Fc-FD, skonstruowano przez wyizolowanie z plazmidu pCDNA3.1/Ang-2-FD-Fc-FD fragmentu EcoRI-Notl o długości 2097 par zasad, zawierającego Ang-2-FD-Fc-FD, oraz ligację tego fragmentu ze strawionym EcoRI i Notl wektorem pRG763. Hodowlę na dużą skalę (1 litr) komórek E. coli DH10B zawierających plazmid pRG763/Ang-2-FD-Fc-FD namnażano przez noc w TB + ampicylina i plazmidowy DNA ekstrahowano stosując Promega Wizard Plus Maxiprep Kit zgodnie z protokołem producenta. Stężenie oczyszczonego plazmidowego DNA oznaczano w spektrofotometrze UV i fluorymetrze. Plazmidowy DNA zweryfikowano również przez strawienie próbki enzymami restrykcyjnymi Ncol i Ppu10l. Wszystkie fragmenty produktu trawienia enzymami restrykcyjnymi odpowiadały przewidywanym wielkościom w 1% żelu agarozowym.

P r z y k ł a d 8

Ekspresja Ang-2-FD-Fc-FD w komórkach CHO

Czterdzieści szalek Petri'ego o średnicy 15 cm posiano komórkami CHO-K1/E1A z gęstością 4 x 10⁶ komórek/szalkę. Wysiewano na podłoże Gibco Hama F-12 w/10% płodowa surowica bydlęca (FBS) Hyclone + penicylina/streptomycyna, uzupełnione glutaminą. Następnego dnia każdą szalkę poddano transfekcji 6 μg pRG763/Ang-2-FD-Fc-FD stosując Optimem Gibco i Lipofectamine Gibco w objętości 12 ml, zgodnie z protokołem producenta. Po czterech godzinach od dodania mieszaniny transfekującej do komórek dodawano 12 ml/szalkę Optimem w/10% FBS. Szalki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Następnego dnia z każdej szalki usuwano podłoże i dodawano 25 ml podłoża do ekspresji (Gibco CHO-S-SFM II w/glutamina + 1 mM maślan sodowy). Szalki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 3 dni. Po trzech dniach inkubacji podłoże usuwano przez aspirację z każdej szalki i odwirowano przy 400 obrotach na minutę stosując rotor z kubełkami wychylnymi w celu osadzenia komórek. Supernatant zdekantowano do jałowych butelek o pojemności 1 litra i oczyszczano w sposób opisany infra.

P r z y k ł a d 9

Charakteryzowanie pochodzącego ze stabilnego klonu CHO białka Ang-1-FD-Fc-FD

Analiza masy cząsteczkowej:

Przewidywaną masę cząsteczkową pochodzącego ze stabilnego klonu CHO białka Ang-1-FD-Fc-FD określono stosując program MacVector (Kodak, Scientific Imaging Systems, New Haven, CT). Postać monomeryczna (w odniesieniu do Fc) posiada przewidywaną masę 76 349, z trzema miejscami N-glikozylacji, około 2500 Da/miejsce, które potencjalnie mogą zwiększyć masę cząsteczkową monomerycznego białka do 83 849. Z powodu oddziaływania pomiędzy składowymi Fc sąsiadujących cząsteczek, białko w rzeczywistości występuje jako dimer o przewidywanej masie cząsteczkowej, po uwzględnieniu możliwej N-glikozylacji, wynoszącej 167 698. Późniejsze analizy SDS-PAGE potwierPL 199 645 B1 dziły te przypuszczalne masy cząsteczkowe; obserwowano prążek białka migrującego przy około 210 kD w warunkach nieredukujących i prążek białka migrującego przy około 85 kD w warunkach redukujących (fig. 7). W celu dalszego potwierdzenia masy cząsteczkowej oraz, co ważniejsze, określenia, czy białko jest homogenne czy nie, przeprowadzono analizę rozpraszania światła. Rozpraszanie światła jest funkcją masy i stężenia makrocząsteczki. Dla określenia masy cząsteczkowej, próbkę białka wstrzykiwano na kolumnę do sączenia molekularnego i eluat monitorowano stosując przyłączony detektor rozpraszania światła oraz detektor współczynnika załamania i/lub UV. Detektorem rozpraszania światła jest laserowy detektor MiniDawn firmy Wyatt Technology Corporation (Santa Barbara, CA). Aparat ten mierzy światło statyczne pod trzema różnymi kątami. Przyłączony detektor współczynnika załamania lub detektor UV służy do pomiaru stężenia białka. Do obliczania stężenia białka stosowano oprogramowanie Astra 4.7 (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) oparte na albo dn/dc (dn = zmiana współczynnika załamania; dc = stężenie), albo współczynniku ekstynkcji białka. Masę cząsteczkową białka oblicza się następnie na podstawie kątowej zależności rozpraszania światła. Wyniki tej analizy wykazały, że masa cząsteczkowa dimerycznego białka okazała się wynosić około 173,9 kD, a występowanie pojedynczego piku oznacza, że roztwór białka rzeczywiście jest homogenny.

Poziom ekspresji Ang-1-FD-Fc-FD w stabilnych klonach CHO:

Zawierający zrekombinowane białko Ang-1-FD-Fc-FD supernatant komórek CHO utworzono przez stabilną transfekcję komórek CHO opisanym supra konstruktem DNA Ang-1-FD-Fc-FD. Supernatant komórek CHO analizowano stosując standardowy test ELISA, wykorzystując przeciwciało skierowane przeciw ludzkim IgG jako przeciwciało wychwytujące oraz skoniugowane z alkaliczną fosfatazą przeciwciało skierowane przeciw ludzkim IgG jako przeciwciało dające sygnał do oceny ilości białka Ang-1-FD-Fc-FD obecnego w supernatancie. Analiza ta ujawniła poziomy ekspresji wynoszące 2-3 pg/komórkę/dzień.

Oczyszczanie białka Ang-1-FD-Fc-FD pochodzącego z supernatantów stabilnych klonów CHO:

Ponieważ białko Ang-1-FD-Fc-FD zawiera domenę Fc, oczyszczanie jest stosunkowo proste i łatwe z zastosowaniem standardowej chromatografii kolumnowej na białku A (Pharmacia, Inc.), a następnie standardowej chromatografii sączenia molekularnego (Pharmacia, Inc.). Supernatant komórek CHO oczyszczono jak opisano supra i oczyszczone białko Ang-2-FD-Fc-FD zastosowano w opisanych infra badaniach do dalszego scharakteryzowania białka.

Sekwencjonowanie końca N pochodzącego ze stabilnego klonu CHO białka Ang-1-FD-Fc-FD:

Oczyszczone białko Ang-1-FD-Fc-FD poddano standardowej analizie sekwencji końca N w celu stwierdzenia, czy tworzone były jakiekolwiek skrócone cząsteczki białka. Analiza ujawniła tylko jedną sekwencję N-końcową, Arg-Asp-X-Ala-Asp, w której X jest Cys. Sekwencję tę można znaleźć w pozycjach aminokwasowych 16-20 na fig. 3A, i występuje ona bezpośrednio po sekwencji sygnałowej białka, odpowiadającej aminokwasom 1-15 na fig. 3A.

P r z y k ł a d 10

Charakteryzowanie pochodzącego ze stabilnego klonu CHO białka Ang-2-FD-Fc-FD

Analiza masy cząsteczkowej:

Jak opisano supra dla Ang-1-FD-Fc-FD pochodzącej ze stabilnego klonu CHO, przewidywaną masę cząsteczkową pochodzącego ze stabilnego klonu CHO białka Ang-2-FD-Fc-FD określono stosując program MacVector (Kodak, Scientific Imaging Systems, New Haven, CT). Monomeryczna postać Ang-2-FD-Fc-FD posiada przewidywaną masę 76 052, z trzema przewidywanymi miejscami N-glikozylacji, które potencjalnie mogą zwiększać masę cząsteczkową monomerycznego białka do 83 552. Podobnie jak Ang-1-FD-Fc-FD, białko występuje jako dimer o przewidywanej masie cząsteczkowej, po uwzględnieniu możliwej N-glikozylacji, wynoszącej 167 698. Analizy SDS-PAGE potwierdziły te przypuszczalne masy cząsteczkowe; obserwowano prążek białka migrującego przy około 200 kD w warunkach nieredukujących i prążek białka migrującego przy około 85 kD w warunkach redukujących. Analiza rozproszenia światła potwierdziła masę cząsteczkową (176,6 kD) i ujawniła, że pochodzące ze stabilnego klonu CHO białko Ang-2-FD-Fc-FD, podobnie jak pochodzące ze stabilnego klonu Ang-1-FD-Fc-FD, występuje w postaci homogennej.

Poziom ekspresji Ang-2-FD-Fc-FD pochodzącej ze stabilnych klonów CHO:

Zawierający zrekombinowane białko Ang-2-FD-Fc-FD supernatant komórek CHO utworzono przez stabilną transfekcję komórek CHO opisanym supra konstruktem DNA Ang-2-FD-Fc-FD. Supernatant komórek CHO analizowano stosując standardowy test ELISA, wykorzystując przeciwciało skierowane przeciw ludzkim IgG jako przeciwciało wychwytujące oraz skoniugowane z alkaliczną fosfatazą przeciwciało skierowane przeciw ludzkim IgG jako przeciwciało dające sygnał do oceny ilości białka

PL 199 645 B1

Ang-2-FD-Fc-FD obecnego w supernatancie. Analiza ta ujawniła poziomy ekspresji wynoszące około 1-2 pg/komórkę/dzień.

Oczyszczanie pochodzącego ze stabilnych klonów CHO białka Ang-2-FD-Fc-FD z supernatantów komórkowych:

Jak w przypadku Ang-1-FD-Fc-FD, białko Ang-2-FD-Fc-FD zawiera domenę Fc, a zatem oczyszczanie jest stosunkowo proste i łatwe, z zastosowaniem standardowej chromatografii kolumnowej na białku A, a następnie standardowej chromatografii sączenia molekularnego. Supernatant komórek CHO oczyszczono jak dla pochodzącego ze stabilnych klonów CHO Ang-1-FD-Fc-FD supra i zastosowano w opisanych infra badaniach do dalszego scharakteryzowania białka.

Sekwencjonowanie końca N pochodzącego ze stabilnych klonów CHO białka Ang-2-FD-Fc-FD:

Oczyszczone, pochodzące ze stabilnych klonów CHO białko Ang-2-FD-Fc-FD poddano standardowej analizie sekwencji końca N w celu stwierdzenia, czy tworzone były jakiekolwiek skrócone cząsteczki białka. Analiza ujawniła tylko jedną sekwencję N-końcową, Asp-X-Ala-Glu-vAL, w której X jest Cys. Sekwencję tę można znaleźć w pozycjach aminokwasowych 17-21 na fig. 4A, i występuje ona bezpośrednio po sekwencji sygnałowej białka, odpowiadającej aminokwasom 1-15 na fig. 4A.

P r z y k ł a d 11

Wpływy pochodzących ze stabilnych klonów CHO Ang-1-FD-Fc-FD i Ang-2-FD-Fc-FD na fosforylację receptora Tie-2 w komórkach EAhy926

Układ oznaczenia:

We wszystkich doświadczeniach opisanych infra wykorzystywano linię komórkową EAhy926 (Edgell, C.J. i in., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3734-3737) oraz standardowe oznaczenia fosforylacji i odczynniki, znane specjalistom w tej dziedzinie.

(A) Porównanie fosforylacji receptora Tie-2 pod wpływem Angl* i pod wpływem pochodzącego ze stabilnych klonów CHO Ang-1-FD-Fc-FD w komórkach EAhy926:

Komórki EAhy926 stymulowano 0,4 μg/ml Ang1* lub 0,2 μg/ml bądź 0,4 pg/ml pochodzącego ze stabilnych klonów CHO białka Ang-1-FD-Fc-FD. Standardowe oznaczenie fosforylacji ujawniło, że białko Ang-1-FD-Fc-FD było równoważne Ang1* pod względem zdolności do stymulacji fosforylacji receptora Tie-2 w komórkach EAhy926 (fig. 14).

(B) Zdolność pochodzącej ze stabilnych klonów CHO Ang-2-FD-Fc-FD do blokowania fosforylacji receptora Tie-2 w komórkach EAhy926 pod wpływem pochodzącego ze stabilnych klonów CHO Ang-1-FD-Fc-FD:

Komórki EAhy926 traktowano 0,2 pg/ml agonisty Tie-2, Ang1*, oraz 2 pg/ml, 4 pg/ml, 6 pg/ml, 8 pg/ml lub 16 pg/ml pochodzącej ze stabilnych klonów CHO Ang-2-FD-Fc-FD. Jak przedstawiono na fig. 15, Ang-2-FD-Fc-FD jest zdolna do blokowania stymulacji receptora Tie-2 przez pochodzącą ze stabilnych klonów CHO Ang-1-FD-Fc-FD, gdy była obecna w co najmniej 40-krotnym nadmiarze molowym wobec pochodzącej ze stabilnych klonów CHO Ang-1-FD-Fc-FD.

Claims (29)

1. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd fuzyjny, znamienny tym, że polipeptyd fuzyjny zawiera pierwszą podjednostkę zawierającą co najmniej jedną kopię domeny fibrynogenowej angiopeptyny 1 lub angiopeptyny 2, przy czym pierwsza podjednostka jest poddana fuzji z końcem N składnika multimeryzującego, a koniec C składnika multimeryzującego jest poddany fuzji z drugą podjednostką, przy czym druga podjednostka obejmuje co najmniej jedną kopię wiążącej receptor domeny fibrynogenowej angiopeptyny 1 lub angiopeptyny 2.

2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że składnik multimeryzujący zawiera domenę pochodzącą z immunoglobuliny.

3. Kwas nukleinowy według zastrz. 2, znamienny tym, że domenę pochodzącą od immunoglobuliny wybiera się z grupy składającej się z domeny Fc IgG, ciężkiego łańcucha IgG i lekkiego łańcucha IgG.

4. Polipeptyd fuzyjny kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1.

5. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera multimer polipeptydu fuzyjnego jak zdefiniowano w zastrz. 4.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że jako multimer zawiera dimer.

7. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1.

PL 199 645 B1

8. Wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest połączona w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kontrolującą ekspresję.

9. Układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje wektor ekspresyjny jak zdefiniowano w zastrz. 8 w odpowiedniej komórce gospodarza.

10. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, komórka drożdżowa, komórka owadzia lub komórka ssacza.

11. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest E. coli.

12. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest komórka COS.

13. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest komórka CHO.

14. Sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje namnażanie komórek układu gospodarz-wektor jak zdefiniowano w zastrz. 9, w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu fuzyjnego, oraz odzyskiwanie tak wytworzonego polipeptydu.

15. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd fuzyjny, znamienny tym, że polipeptyd fuzyjny obejmuje więcej niż jedną kopię domeny wiążącej fibrynogen angiopoetyny 1 lub angiopoetyny 2 w postaci tandemu, i albo koniec N, albo koniec C domeny wiążącej receptor poddany jest również fuzji ze składnikiem multimeryzującym.

16. Kwas nukleinowy według zastrz. 15, znamienny tym, że domeny wiążące receptor poddaje się fuzji w taki sposób, aby ze sobą sąsiadowały.

17. Kwas nukleinowy według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że składnik multimeryzujący zawiera domenę pochodzącą z immunoglobuliny.

18. Kwas nukleinowy według zastrz. 17, znamienny tym, że domenę pochodzącą od immunoglobuliny wybiera się z grupy składającej się z domeny Fc IgG, ciężkiego łańcucha IgG i lekkiego łańcucha IgG.

19. Polipeptyd fuzyjny, znamienny tym, że kodowany jest przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 15.

20. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera multimer polipeptydu fuzyjnego jak zdefiniowano w zastrz. 19.

21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że jako multimerem zawiera dimer.

22. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 15.

23. Wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 15, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest połączona w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kontrolującą ekspresję.

24. Układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje wektor ekspresyjny jak zdefiniowano w zastrz. 23 w odpowiedniej komórce gospodarza.

25. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 24, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, komórka drożdżowa, komórka owadzia lub komórka ssacza.

26. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 24, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest E. coli.

27. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 24, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest komórka COS.

28. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 24, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest komórka CHO.

29. Sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje namnażanie komórek układu gospodarz-wektor jak zdefiniowano w zastrz. 24, w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu fuzyjnego, oraz odzyskiwanie tak wytworzonego polipeptydu.