KR102525855B1

KR102525855B1 - 고효율 석유 분해 세균 tdyn1t 및 그 응용

Info

Publication number: KR102525855B1
Application number: KR1020217001927A
Authority: KR
Inventors: 관위 첸; 레이 즈홍; 징난 티엔; 슈 티엔; 유루 선; 웬주 우; 웬차오 마
Original assignee: 톈진 유니버시티
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2023-04-26
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: US20230286026A1; CN110724650B; AU2019460845B2; WO2021077531A1; KR20210049776A; CN110724650A; EP4050094A4; EP4050094B1; EP4050094A1; AU2019460845A1

Abstract

본 발명은 Falsochrobactrum sp.로 분류되고, 중국미생물균종보존관리위원회 일반미생물센터에 기탁되어 있으며, 보존 번호는CGMCC No.18061 인 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T를 개시한다. 본 발명의 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T를 사용하여 석유가 함유된 토양을 분해하면 분해 효과가 우수하며, 특히 30±1°C, pH 7-7.4 조건에서 석유를 분해할 경우 분해 효율이 높다.

Description

고효율 석유 분해 세균 TDYN1T 및 그 응용

본 발명은 미생물 정화 기술 분야에 관한 것으로, 특히 고효율 석유 분해 세균 TDYN1^T 및 그 응용에 관한 것이다.

석유는 인류의 가장 주요한 에너지의 하나이며, 그 소비량은 사회의 발전과 사람들의 생활 수준의 향상에 따라 날이 갈수록 증가하며, 채굴 규모는 끊임없이 확대되고 있다. 그러나 석유의 채굴, 운송 및 사용 과정에서 빈번한 기름 유출 사고가 자주 발생하여 생태 환경과 인류 건강에 심각한 해를 끼치고 있다. 특히 석유 채굴 과정에 발생하는 원유는 토양 오염의 주된 원인이 되었다. 통계에 의하면, 2005년부터 현재까지 매년 세계 석유 총생산량은 약 3×10¹⁰톤이며, 약 800만톤의 석유 오염 물질이 환경으로 유입되고, 대부분이 토양으로 유입된다.

석유 탄화수소가 토양으로 유입된 후의 위험은 주로 세가지 측면에 있다.1) 대량으로 생성되는 석유 슬러지는 물리 화학적 성질이 안정하여 제거하기 어렵고 잔류 시간이 길어 토양의 이화학적 성질과 유기질 구조를 변화시키고 토양 구조 및 토양 미생물과 식물의 생존 환경을 파괴하며; 2)일부 이동성이 강한 석유 탄화수소(예를 들어, 벤젠, 톨루엔, 자일렌 등)는 토양에 유입되면 토양 수분을 따라 지하 대수층에 도달하여 지하수를 오염시키며; 3) 일부 휘발성이 강한 석유 탄화수소가 토양에 유입되면 공기 중으로 휘발하여 확산되어 공기질에 영향을 미치고, 한층 더 나아가, 토양, 물, 대기 환경을 통해 건강에 영향을 미친다.

현재에 기름으로 오염된 토양을 처리하는 방법은 주로 물리적, 화학적, 생물학적 정화 기술이 있다. 물리적 정화 기술은 주로 석유 탄화수소 오염 물질의 물리적 이동을 통해 토양을 정화하는 목적을 달성하는 것이며, 기름 슬러지와 같은 심하게 오염된 토양에서 널리 사용되며; 왕 전궈 등은 토양증기추출법을 적용하여 석유 탄화수소의 제거율을 88%에 도달시켰으며,그 정화 효과가 우수하고 2차 오염이 없지만, 정화 비용이 높으며 주로 오염이 심한 토양에 적합하다. 화학적 정화 기술은 토양에 화학 산화제를 주입하여 그 산화성을 이용하여 기름으로 오염된 토양을 정화하는 것이며; Lu 등은 H2O2와 Fe3+-EDTA 복합체를 이용하여 석유로 오염된 토양을 처리하여 토양 중 오일의 질량비를 14,800mg/kg에서 2,300mg/kg으로 낮추어 정화 효과가 뛰어나고 비용도 저렴하지만, 화학 약품에 의한 2차 오염이 발생하기 쉽다.

최근 미생물 기술의 발전에 따라 원위치의 토양을 이용하여 고효율 분해 균주를 선별하여 석유 탄화수소 오염을 정화하는 기술이 점차 대두되고 있으며, 정화 효율이 높고 비용이 저렴하며 환경친화적인 특징으로 미래 토양 정화업계의 발전 추세가 되고 있다. 석유를 분해하는 것으로 알려진 미생물은 총 70속 200여 종으로, 그 중 박테리아 28개 속은 슈도모나스속, 아시네토박터속, 아크로모박터속 등을 포함하고, 곰팡이 30개 속은 페니실리움속, 아스페르길루스속, 푸사리움속 등을 포함하며, 효모 12개 속은 칸디다속, 로도토룰라속 등을 포함한다. 현재, 기존의 석유 분해 세균의 분해율은 대부분 60~80%로서 정화 효율이 높지 않아 이 기술의 진일보한 발전과 응용의 기술적 병목이 되고 있으며; 따라서, 새로운 고효율 석유 탄화수소 분해 세균을 발굴하는 것은 미생물 토양 복원의 전망을 개선하는데 큰 의미가 있다.

본 발명의 목적은 기존 기술에 존재하는 석유 분해 세균의 분해율이 높지 못한 단점을 극복할 수 있는 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T의 응용을 제공하는 것이다.

본 발명의 기술적 해결책은 다음과 같이 요약된다.

Falsochrobactrum sp.로 분류되고, 중국미생물균종보존관리위원회 일반미생물센터에 기탁되어 있으며, 보존 번호는CGMCC No.18061인 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T을 제공한다.

토양 중의 석유를 분해함에 있어서 상기 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T의 응용을 제공한다.

상기 응용은 바람직하게, 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T 보존 번호 CGMCC No.18061의 대수 성장기 세균액을 초탄분말로 고정하여 세균 밀도가 10⁸개/g인 미생물 정화제를 얻고, 미생물 정화제를 3%의 질량으로 첨가하여 오일 함유 토양 10kg과 혼합하며, 30 ± 1℃ 및 pH 7-7.4조건에서 반응시킨다.

본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다.

본 발명의 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T를 사용하여 석유가 함유된 토양을 분해하면 분해 효과가 우수하며, 특히 30±1°C, pH 7-7.4 조건에서 석유를 분해할 경우 분해 효율이 높다.

도 1은 균주의 형태를 나타낸 도면이다.
도 2는 균주의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 3은 균주 Falsochrobactrum sp. TDYN1^T 의 온도에 따른 분해곡선이다.
도 4는 균주 Falsochrobactrum sp. TDYN1^T의 시간에 따른 분해곡선이다.
도 5는 균주 Falsochrobactrum sp. TDYN1^T의 pH에 따른 분해곡선이다.
도 6은 석유 분해 성능 테스트 실험의 석유 표준 곡선을 나타낸 도면이다.

톈진시의 오일 함유 토양의 오염 상황에 대비하여 톈진따강유전의 토양에서 고효율 석유 분해 세균을 한개 선별하여 그 분해능력을 진일보 연구하여 석유 오염 토양에 응용하고자 한다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 방법을 설명한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 기술적 수단은 모두 당업자에게 잘 알려져 있는 방법이다. 또한, 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 예시적인 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 사상과 범위는 청구 범위에 의해서만 정의된다. 당업자가 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이들 실시예에 대한 다양한 변경 또는 수정도 본 발명의 보호 범위에 속한다.

실시예 1

1. 재료 준비

톈진따강유전의 모처에서 오일을 함유한 토양 샘플을 채취하여 4℃로 보관하고 실험실로 운반한다.

2. 실험용 배지

무기염 배지: KH₂PO₄ 1g, K₂HPO₄ 0.5g, NaCl 10g, (NH₄)₂SO₄ 1.5g, 무수CaCl₂ 0.1g, FeSO₄*7H₂O 0.01g, MgSO₄ 0.2g를 첨가하고, 증류수를 1000mL까지 넣으며, pH 7.0-7.4,121℃에서 20분 동안 살균한다.

LB(Luria-Bertani) 액체 배지: 소고기 육즙 3g, 펩톤 10g, NaCl 5g를 첨가하고, 증류수를 1000mL까지 넣으며, pH 7.0-7.4, 121°C에서 20분 동안 살균한다.

사면 배지 및 LB 고체 평판 배지: 소고기 육즙 5g, 펩톤 10g, NaCl 5g, 한천 20g 를 첨가하고, 증류수를 1000mL까지 넣으며, pH 7.0-7.4, 121°C에서 20분 동안 살균하고, 70-80℃에서 꺼낸다.

3. 실험기기 및 장비

항온 발진기

전열 항온 배양기

고압 멸균 냄비

자외선-가시광선 분광 광도계

클린 벤치

4.균주의 분리, 선별 및 가축화

단계 1 의 오일 함유 토양 10g을 취해 LB 액체 배지 100mL가 들어 있는 삼각 플라스크에 넣고 30±1°C 및 180rpm에서 항온 쉐이커를 사용하여 흔들어 진동하고, 24시간 동안 농화배양하며;

24시간 후 배양액 2mL를 취하여 스프레더를 이용하여 LB고체 평판 배지에 도포하고, 30±1℃의 항온기에 넣어 7 일간 뒤집어 배양하며;

콜로니가 자란 후 콜로니의 형태를 관찰하며, 멸균 접종 루프를 이용하여 상기 LB 고체 평판 배지에서 형태 차이가 큰 콜로니를 선별하여 획선도말배양법(=획선평판법, streak plate method)으로 LB 고체 평판 배지에 접종하고 항온 배양기에 넣어 30±1℃에서 24시간 동안 뒤집어 배양하며, 콜로니가 자란 후 단일 콜로니를 선별하여 같은 방법으로 LB 고체 평판 배지에 접종한다. 하나의 단일 형태의 정제된 콜로니가 형성될 때까지, 상기 획선도말배양 과정을 반복한다. 나중에 사용할 수 있도록 단일 콜로니를 사면 배지에 4°C로 보관한다. 사용하기 전에 반드시 LB 액체 배지에서 활성화시켜야 한다.

상기 정제된 콜로니에 대해 석유 분해 시험을 하며, 즉: 균액 3ml을 취해 0.1g 의 원유를 함유한 무기염 배지 100ml 에 접종하고, 30℃, 180rmp, pH 7.2 조건에서 7일 동안 분해하며, 석유 에테르로 남은 원유를 추출하고, 상층액을 취하여 희석하며, 자외선 분광 광도법으로 그 흡광도를 측정하고 표준 곡선(단계 5 참조)에 대조하여 균주의 분해율을 판단한다. 실험 과정에 고효율 석유 분해 세균 Falsochrobactrum sp. TDYN1^T 을 선택하여 그 분해 조건을 측정한다. 상세한 내용은 단계 5 를 참조할 수 있다.

5. 고효율 석유 분해 세균 Falsochrobactrum sp. TDYN1^T의 석유 분해 성능 측정 실험

재료: 원유, 석유 에테르(추출제), LB 액체 배지, 무기염 배지

방법: 자외선 분광 광도법

단계:

1) 석유 표준 곡선 작성

석유 0.1g를 석유 에테르 용액으로 100mL 부피 플라스크에 넣고 여러번 희석하여 석유-석유 에테르 용액 25mg/L을 배합하고, 해당 농도에서 최대 흡수 파장 256nm를 확인한다. 동시에, 농도가 10mg/L, 20mg/L, 30mg/L, 40mg/L, 50mg/L, 60mg/L, 70mg/L, 80mg/L, 90mg/L, 100mg/L인 석유-석유 에테르 표준 용액을 배합하며, 최대 흡수 파장 위치에서 흡광도를 측정하고 표준 곡선을 작성한다. (도 6 참조)

2) 석유 분해

서로 다른 온도에서 균주의 분해 효과

활성화된 세균 용액 3mL를 0.1g의 석유를 함유한 무기염 배지 100mL에 접종하고, 상기 과정은 무균 환경에서 진행되며, 접종한 용액을 각각 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃조건에서, 180 rmp로 7일 동안 항온 진동한다. 동시에 3개 그룹을 설정하여 반복하여 측정한다.

온도(℃)	10	15	20	25	30	35	40	45	50
분해율(%)	2	10	40	60	90	85	80	50	10

도 3 참조. Ii.서로 다른 시간에서 균주의 분해 효과

활성화된 석유 분해 세균 3mL를 0.1g의 석유를 함유한 무기염 배지 100mL에 접종하고, 상기 과정은 무균 환경에서 진행되며, 접종한 용액을 30℃조건에서, 180rmp로 각각 5 일, 10 일, 15 일, 20 일, 25 일, 30일 동안 항온 진동한다. 동시에 3개 그룹을 설정하여 반복하여 측정한다.

시간(d)	5	10	15	20	25	30
분해율(%)	50	90	70	-10	40	90

도 4 참조.Iii. 활성화된 석유 분해 세균 3mL을 0.1g의 석유를 함유한 무기염 배지 100mL에 접종하고, 무기염 배지는 살균하기 전에 pH를 각각 1, 3, 5, 7, 9, 11로 조절하고 상기 과정은 모두 무균 환경에서 진행되며, 접종한 용액을 180rmp, 30℃에서 7일 동안 항온 진동한다. 동시에 3개 그룹을 설정하여 반복하여 측정한다.

pH	1	3	5	7	9	11
분해율(%)	2	4	20	90	70	50

도 5 참조.석유 분해율의 측정

분해된 용액은 석유 에테르 10mL로 2회 추출하며, 총 상층액을 취해 흡광도를 측정하고 표준 곡선과 비교하여 분해율을 확인한다.

6. 균주 형태는 도 1를 참조할 수 있다.

7. 균주의 주사 전자 현미경 사진은 도 2를 참조할 수 있다.

8. 균주의 동정

16S rDNA 유전자 서열 분석 방법을 사용하여 분리 및 선별된 Falsochrobactrum sp. 균주TDYN1^T의 속과 종을 확인한다. 16S rDNA 유전자 서열(SEQ ID NO.1)은 NCBI 데이터베이스 중의 Falsochrobactrum sp.형 균주 HN4 서열과 98%의 상동성을 가지며, 중국미생물균종보존관리위원회 일반미생물센터에 생화학적 동정을 의뢰한 결과, 생화학적 특징이 Falsochrobactrum sp.형 균주 HN4와 비교적 일치하다. 분자 생물학 및 생화학적 동정 결과를 종합하여 Falsochrobactrum sp. TDYN1^T를 Falsochrobactrum sp로 동정한다.

Falsochrobactrum sp. TDYN1^T 유전자의 전체 서열: (SEQ ID NO.1)

TGCAGTCGACGAGCCCTTCGGGGTTAGTGGCAGACGGGTGAGTAATGCATGGGAATCTACCGTTCTCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATACGCCCTTTTGGGGAAAGATTTATCGGGGAACGATGAGCCCATGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGATTGGTCAGTTAGGGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTAATACTGCCAGTCTTGAGTATGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAATGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGATGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACTATGAATGTTAGCCGTCGGGGGGTTTACCTTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATACCGGTCGCGGATCGAGAGATCGATCTTTCAGTTCGGCTGGACCGGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAACCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCTAGAAGGCGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCGACCACG

9. 결론: 본 발명은 전통적인 방법으로 석유 분해 세균을 분리하여 가축화하였으며, 톈진따강유전의 토양에서 선별한 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T는 짧은 막대 모양을 나타냈고, 7일 동안 석유 분해를 수행한 결과, 분해율이 90%이상에 도달했다.

10. 균주의 보존:

고효율 석유 분해 세균TDYN1^T 균주는 Falsochrobactrum sp.로 분류되고 비포자 형성되며, 그람 음성 및 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)이다.

보존일: 2019년 7월 2일

보존 기관: 중국미생물균종보존관리위원회 일반미생물센터에 보존

보존 주소: 베이징시 조양구 북진서로 1호원 3호, 중국과학원 미생물연구소

보존번호: CGMCC No.18061. 생존 상태임.

실시예 2

고효율 석유 분해 세균TDYN1^T의 특징:

1.콜로니 특징: LB 고체 평판 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양하며, 콜로니는 유백색이고, 매끈하고 평평하고, 가장자리가 가지런하며; 그람은 음성이고 몸체는 짧은 막대 모양을 나타낸다. 도 1, 도 2 참조.

2.산화효소 활성: 깨끗한 페트리 접시 위에 여과지를 놓고, 동일한 양의 1%의 디메틸 p- 페닐 렌 디아민 염산염 수용액과 1%의 a-페놀프탈레인 알코올(95%) 용액을 떨어뜨린다(균일하게 혼합). 떨어뜨리는 양은 여과지가 젖어지는 양으로 적당하고, 백금 와이어 접종 루프(니켈-크롬 와이어는 사용해서는 안됨)로 18-24시간 배양된 소량의 세균 잔디를 취해 여과지에 도포한다. (10초 이내에 도포된 세균 잔디가 빨간 장미색 또는 파란색을 나타내면 양성이고; 10초 내지 60초에서 발색되면 지연 반응이고; 60초 후에 발색되면 음성으로 처리한다.)

시험 관찰: 15 초에 발색 반응이 나타났으며, 양성을 나타낸다.

3. 카탈라아제 활성:

시약 준비: 3% -10% 과산화 수소

접종 및 결과 관찰: 24시간 배양된 경사면 균주를 백금 와이어 접종 루프로 작은 고리만큼 취해 3%의 과산화 수소를 떨어뜨린 유리 슬라이드에 도포하여 1-3 분 동안 정치하여 관찰하며, 기포가 발생하면 양성이고, 기포가 발생하지 않으면 음성이다. 시험 관찰: 기포가 발생하고, 양성 반응을 나타낸다.

4. 당 발효 시험: 세균이 당을 분해하고 활용하는 능력의 차이에 따라, 산과 가스를 발생하는지 여부를 확인하는 근거로 한다. 구체적으로, 당 발효 배지에 지시약인 브로모 메틸 바이올렛(B.C.P지시약으로 pH 5.2 이하에서는 노란색, pH 6.8 이상에서는 보라색을 나타냄)을 첨가하여 배양한 후 지시약의 색상 변화에 따라 판단한다. 가스 발생 여부는 다람발효관을 발효 배지에 거꾸로 넣어 관찰할 수 있다.

1) 당 발효 배지 제조: 펩톤 2g과 NaCl 5g을 달아 뜨거운 물에 용해하고, pH를 7.4로 조절하고, K₂HPO₄ 0.2g을 첨가하고, 증류수를 1000ml로 첨가하고, 브로모티몰 블루 1% 수용액 3ml (먼저 소량의 95% 에탄올을 사용하여 용해한 후, 물을 첨가하여 1% 수용액을 배합)를 첨가한다. 상기 제조 용액 2부를 취해 각각 포도당과 유당을 첨가하고, 4-5cm의 높이로 시험관에 나누어 담고, 다람발효관(입구를 아래쪽으로 향하게 하고, 튜브에 배양액을 가득 채움)에 부어 넣으며, 115℃의 조건에서 20분 동안 습열 멸균한다. 멸균할 때는 끓는 시간을 적절히 늘리고, 차가운 공기를 최대한 배출하여 다람발효관에 기포가 남아 있지 않도록 주의해야 한다.

2) 시험관 표시: 각 당 발효에 대해 모두 공백 대조군을 표시한다.

3) 접종 배양 : 소량의 세균 잔디를 각 해당 시험관에 무균 접종하고 각 당 발효의 공백 대조군에는 세균을 접종하지 않는다. 다람발효관을 시험관에 거꾸로 넣고 30°C에서 항온 배양하며, 24 시간, 36 시간 및 72 시간 후에 각각 결과를 관찰한다.

4) 관찰 기록: 대조군 시험관과 비교하여 접종 시험관의 배양액이 원래의 색을 유지하고 반응결과가 음성이면, 해당 세균이 해당 종류의 당을 사용할 수 없음을 나타내며, 기록은 "-"로 표시하며; 만약 배양액이 노란색을 나타내고 반응 결과가 양성이면, 해당 세균이 해당 종류의 당을 분해하여 산을 생성할 수 있다는 것을 나타내며, 기록은 "+"로 표시한다. 배양액 중의 다람발효관에 기포가 발생하면 양성 반응으로, 해당 세균이 해당 종류의 당을 분해하여 산 및 가스를 생성한다는 것을 나타내고, 기록은 "+"로 표시하며, 다람발효관에 기포가 발생하지 않으면 음성 반응으로, 기록은" -"로 표시한다.

실험 관찰: 이 세균은 포도당과 유당을 사용할 수 있으며, 모두 산은 생성하지만 가스는 생성되지 않는다.

5. 암모니아 생산 시험:

1) 암모니아 생산 배지 제조: 펩톤 5g을 첨가하고, 증류수를 1000ml까지 첨가하고, pH 7.2로 조절하고, 시험관에 나누어 담고, 121°C에서 15-20 분 동안 살균한다.

2) 시약 조제: 요오드화 칼륨 20g을 물 50ml에 용해시키고, 용액이 포화될 때까지(약 32g) 요오드화 수은 과립을 첨가한 다음, 다시 물 460ml과 수산화칼륨 134g을 첨가하고, 나중에 사용할 수 있도록 상층액을 어두운 병에 보관한다.

3) 접종: 신선한 균주를 접종하고 적절한 온도에서 1, 3, 5 일 동안 배양한다. 4) 결과 관찰: 소량의 배양액을 취하고 시약을 몇방울 추가하여 황갈색 침전이 발생하면 양성이다.

시험 관찰: 황갈색 침전이 발생하며, 양성 반응을 나타낸다.

6. 인돌 시험:

1) 인돌 배지 제조: 펩톤 10g, NaCl 5g을 첨가하고, 증류수를 1000ml까지 첨가하고, pH 7.2-7.4로 조절하고, 121 ℃로 20 분간 습열 살균한다.

2) 인돌 시약 준비: P-자일렌 아미노 벤즈알데히드 8g, 에탄올(95%) 760ml, 진한 HCl 160ml.

3) 시험관 표시: 인돌 배지를 해당 시험관에 넣고 공백 대조군을 표시한다.

4) 접종 배양 : 소량의 세균 잔디를 각 해당 시험관에 무균 접종하고, 30°C의 항온기에 넣어 24 - 48 시간 동안 배양하며, 시험관 하나를 남겨 두어 접종하지 않고 공백 대조군으로 사용한다.

5) 관찰 기록: 배양액을 취하고, 관벽을 따라 인돌 시약 3-5ml을 천천히 배양액 표면에 첨가하며, 액체층 경계면에서 붉은색이 나타나면 양성 반응이다. 색이 분명하지 않은 경우에는 배양액에 에테르를 4 ~ 5 방울 넣고 흔들어 에테르를 액체에 분산시킨 후, 배양액을 잠시 정치하여 에테르가 표면에 떠오른 후 인돌 시약을 첨가한다. 배양액에 인돌이 있으면 에테르층에서 인돌을 추출할 수 있고, 농축된 인돌이 시약과 반응하면 색상이 분명해진다. 인돌이 존재하면 에테르는 빨간 장미색을 나타내는데, 이는 인돌 시험 양성 반응이며, 기록에 "+"로 표시하며; 인돌이 존재하지 않으면 에테르가 원래 색상을 나타내는데, 이는 인돌 시험 음성 반응이며, 기록을 "-"로 표시한다.

시험 관찰: 인터페이스에 붉은색이 나타나며, 양성 반응을 나타낸다.

고효율 분해 세균TDYN1^T의 특징을 정리하면 다음 표와 같다.

실험 유형			성질
산화효소			“+”
카탈라아제			“+”
	포도당	산 생성	“+”
당 발효		가스 생성	“-”
	유당	산 생성	“+”
		가스 생성	“-”
암모니아 생성			“+”
인돌			“+”

실시예 3

토양 중의 석유를 분해함에 있어서 고효율 석유 분해 세균TDYN1^T의 응용

고효율 석유 분해 세균TDYN1^T 보존 번호 CGMCC No.18061의 대수 성장기 세균액을 초탄분말로 고정하여 세균 밀도가 10⁸개/g인 미생물 정화제를 얻고, 미생물 정화제를 3%의 질량으로 첨가하여 오일 함유 토양(톈진따강유전의 토양) 10kg과 혼합하며, 30℃ 및 pH 7.2 조건에서 10일 동안 반응시키고, 석유 분해율은 81%이다.

실시예 4

고효율 석유 분해 세균TDYN1^T 보존 번호 CGMCC No.18061의 대수 성장기 세균액을 초탄분말로 고정하여 세균 밀도가 10⁸개/g인 미생물 정화제를 얻고, 미생물 정화제를 3%의 질량으로 첨가하여 10kg의 오일 함유 토양(톈진따강유전의 토양)과 혼합하며, 29℃ 및 pH 7 조건에서 15일 동안 반응시키며, 석유 분해율은 85%이다.

실시예 5

토양 중의 석유를 분해함에 있어서 고효율 석유 분해 세균 TDYN1T의 응용

고효율 석유 분해 세균TDYN1^T 보존 번호 CGMCC No.18061의 대수 성장기 세균액을 초탄분말로 고정하여 세균 밀도가 10⁸개/g인 미생물 정화제를 얻고, 미생물 정화제를 3%의 질량으로 첨가하여 오일 함유 토양(톈진따강유전의 토양) 10kg과 혼합하며, 31℃ 및 pH 7.4 조건에서 12일 동안 반응시키고, 석유 분해율은 83%이다.

SEQUENCE LISTING <110> TIANJIN UNIVERSITY <120> HIGH-EFFICIENCY PETROLEUM DEGRADING BACTERIUM TDYN1T AND USE THEREOF <160> 1 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 1357 <212> DNA <213> None(Falsochrobactrum sp) <400> 1 tgcagtcgac gagcccttcg gggttagtgg cagacgggtg agtaatgcat gggaatctac 60 cgttctctac ggaataactc agggaaactt gtgctaatac cgtatacgcc cttttgggga 120 aagatttatc ggggaacgat gagcccatgt tggattagct agttggtggg gtaaaggccc 180 accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca 240 cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 300 tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt caccggtgaa 360 gataatgacg gtaaccggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 420 acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gcggattggt 480 cagttagggg tgaaatccca gggctcaacc ctggaactgc ctttaatact gccagtcttg 540 agtatggaag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg 600 aacaccagtg gcgaatgcgg ctcactggtc cattactgac gctgaggtgc gaaagcgtga 660 tgagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aactatgaat gttagccgtc 720 ggggggttta cctttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg gggagtacgg 780 tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 840 ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agcccttgac ataccggtcg cggatcgaga 900 gatcgatctt tcagttcggc tggaccggat acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 960 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccctta gttgccagca 1020 ttcagttggg cactctaagg ggactgccgg tgataagccg agaggaaggt ggggatgacg 1080 tcaagtcctc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg 1140 ggcagcgagc acgcgagtgt gagctaatct ccaaaaacca tctcagttcg gattgcactc 1200 tgcaactcga gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1260 atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagttggt tttacctaga 1320 aggcgctgtg ctaaccgcaa ggaggcaggc gaccacg 1357

Claims

Falsochrobactrum sp.로 분류되고, 중국미생물균종보존관리위원회 일반미생물센터에 기탁되어 있으며, 보존 번호는CGMCC No.18061 인 석유 분해 세균TDYN1^T.
제1항에 따른 석유 분해 세균TDYN1^T 를 사용하여 토양 중의 석유를 분해하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 석유 분해 세균TDYN1^T 보존 번호 CGMCC No.18061의 대수 성장기 세균액을 초탄분말로 고정하여 세균 밀도가 10⁸개/g인 미생물 정화제를 얻고, 미생물 정화제를 3%의 질량으로 첨가하여 오일 함유 토양 10kg과 혼합하며, 30±1℃ 및 pH 7-7.4조건에서 반응시키는 단계를 포함하는 토양 중의 석유를 분해하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 석유 분해 세균TDYN1^T의 16S 의 DNA서열은 SEQ ID No.1에 표시한 서열과 같은 것을 특징으로 하는 석유 분해 세균.