+

KR102077058B1 - 대사체 프로파일링을 이용한 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트 - Google Patents

대사체 프로파일링을 이용한 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR102077058B1
KR102077058B1 KR1020170122091A KR20170122091A KR102077058B1 KR 102077058 B1 KR102077058 B1 KR 102077058B1 KR 1020170122091 A KR1020170122091 A KR 1020170122091A KR 20170122091 A KR20170122091 A KR 20170122091A KR 102077058 B1 KR102077058 B1 KR 102077058B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
acid
prostaglandin
breast cancer
lysopc
phenylalanine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020170122091A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190033382A (ko
Inventor
이종호
지선하
김민주
유혜진
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to KR1020170122091A priority Critical patent/KR102077058B1/ko
Publication of KR20190033382A publication Critical patent/KR20190033382A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102077058B1 publication Critical patent/KR102077058B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8818—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

본 발명은 특정 바이오마커에 기반하여 유방암 관련 위험도를 평가하는 진단 방법에 관한 것으로, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에서 류신(leucine), 티로신(tyrosine), 아라키돈산(arachidonic acid), 프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2) 및 감마리놀렌산(γ-linolenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계;를 포함하는 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

Description

대사체 프로파일링을 이용한 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트{A METHOD AND KIT FOR ASSESSING RISK OF BREAST CANCER USING METABOLITE PROFILING}
본 발명은 특정 바이오마커의 농도를 측정하여 유방암 발병 위험도를 평가하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
암은 보통 종양이라고 하며 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리를 의미한다. 암이 발생하면, 세포주기가 조절되지 않아 계속 세포분열을 하고, 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협한다.
암이 유방의 유관 및 소엽에서 발생하는 것을 유방암이라고 한다. 유방암은 전 세계 여성에게 발생되는 암 중에서 사망률이 높은 암 중 하나이다.
2012년 통계 조사에 의하면, 산업발전에 따른 생활환경의 변화로 인해 여성의 유방암 발병률이 증가하고 있다. 유방암의 원인은 명확하게 밝혀지지 않았지만, 호르몬의 과다 분비, 서구화된 식습관, 출산의 유무, 유전적 원인 등의 다양한 인자들이 거론되고 있다.
유방암을 비롯한 대부분의 암은 조기 진단에 따라 치료 가능성이 현저히 증대된다. 일반적으로 암의 진단은 x-ray, CAT 스캔, NMR 등으로 얻어지는 진단적 정보에 의존한다. 그러나 이러한 방법은 진단 비용이 비싸고 인체에 침습적인 문제가 있다.
한편, 암을 조기에 진단하는 방법으로서 신규 바이오마커에 대한 연구가 진행되고 있다. 바이오마커는 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 바이오마커를 활용하면 대상체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다.
상기 바이오마커는 특정 질병의 내적 표현형이라고 불리며, 특정 질병의 원인을 찾거나 발병 위험도를 측정하는데 이용될 수 있다. 세포 내의 대사물질과 대사회로를 총체적으로 분석하는 대사체학(metabolomics)은 질병의 바이오마커를 검출하는데 널리 사용되고 있다.
암 발병 시기에 특이적으로 다량 또는 소량으로 존재하는 대사체를 암 특이적 마커로 사용할 수 있으며, 암이 발병되었는지 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 채취하여 암 특이적 마커의 변화 양상을 관찰함으로써 암의 유무를 예측할 수 있다.
본 발명자들은 유방암과 관련된 다양한 대사체를 동정하고 유방암 발병과의 상관 관계를 규명하여 유방암의 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 특정 대사체의 수준을 측정하여 유방암의 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에서 류신(leucine), 티로신(tyrosine), 아라키돈산(arachidonic acid), 프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2) 및 감마리놀렌산(γ-linolenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계;를 포함하는 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법에서 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 스테아리돈산(Stearidonic acid), 프로스타글란딘 F2α(prostaglandin F2α) 및 레티놀산(retinoic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법에서 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), lysoPC(lysophosphatidylcholine) 18:3, lysoPC 20:3, lysoPC 20:4 및 lysoPC 20:5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법은 기준시점으로부터 7년 이후 유방암의 발병 가능성을 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 류신(leucine), 티로신(tyrosine), 아라키돈산(arachidonic acid), 프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2) 및 감마리놀렌산(γ-linolenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 유방암 발병 위험도 진단용 키트가 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 유방암 발병 위험도 진단용 키트는 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 스테아리돈산(Stearidonic acid), 프로스타글란딘 F2α(prostaglandin F2α) 및 레티놀산(retinoic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 유방암 발병 위험도 진단용 키트는 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), lysoPC(lysophosphatidylcholine) 18:3, lysoPC 20:3, lysoPC 20:4 및 lysoPC 20:5으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 혈청 내 특정 대사체의 농도를 측정함으로써, 유방암의 발병 가능성을 효과적으로 예측할 수 있다.
특히, 상기 방법은 기준시점으로부터 평균 7년 이후의 유방암 발병가능성에 관한 정보와 함께 선제적인 대응 가능성을 제공한다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정한 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 대조군(Control group, n=88)과 유방암군(Breast cancer group, n=84) 사이 혈장 대사체를 비교한 것이다. OPLS-DA 모델로부터 얻은 양이온 모드(a)와 음이온 모드(b)의 스코어 플롯과, OPLS-DA 모델로부터 얻은 양이온 모드(c)와 음이온 모드(d)의 공변인 [p] 및 신뢰도 관계(reliability correlation) [p(corr)]에 대한 S-플롯을 나타낸다.
도 2는 인리치먼트(enrichment) 분석(y축) 및 토폴로지(topology) 분석 (x축)에 기반한 스코어에 따라 배열된 경로를 나타내는 대사 경로 분석 결과이다. 각 원의 색상과 크기는 각각 P-값 및 경로 영향력 값(pathway impact value)을 나타낸다.
도 3은 대조군(control group)과 유방암군(Breast cancer group)에서의 나이, 무게 및 주요 대사체들 간의 상관관계를 나타낸 매트릭스다. 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)를 사용하여 상관관계를 도출하였으며, 빨강색은 양의 상관관계를, 파란색은 음의 상관관계를 나타낸다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에서 류신(leucine), 티로신(tyrosine), 아라키돈산(arachidonic acid), 프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2) 및 감마리놀렌산(γ-linolenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계;를 포함하는 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.
상기 대상체(subject)는 진단 대상으로서 인간일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 유방암 관련 질환의 위험성을 평가하고자 하는 상기 대상체에서 분리된 시료로서, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 복막액, 활막액, 타액, 소변, 대변 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있으며, 구체적으로 혈액에서 분리된 혈청일 수 있다.
상기 정상 대조군은 평균 7년 동안 암에 걸리지 않거나 암에 걸린 기록이 없는 대상으로 인간일 수 있다.
또한, 상기 대사체 각각을 개별적으로 분석하여 유방암의 예후 또는 위험성 여부를 진단할 수 있으나, 상기 관련 대사체의 수준을 전체적으로 분석함으로써 진단의 정확성을 향상시킬 수 있다.
상기 대사체는 대사체학을 통하여 유방암의 병리학적 경로를 연구함으로써 결정할 수 있다. 상기 “대사체학”이란 세포내의 대사물질과 대사회로를 총체적으로 분석 및 연구하는 생물학 분야 중 하나이다.
상기 “대사체”는 주로 혈액 등에서 분류가 가능한 세포 과정(cellular process) 중 발생하는 소분자의 대사산물 전체(metabolome)를 말하며, 상기 대사체학은 혈액에서 추출된 상기 대사체를 분석하는 것이 기본이며, 그 응용은 주로 대사관련 질병을 연구하는 것이다.
기관의 기능 및 병리학적 조건에 의해 결정되는 생리학적 아미노산 농도는 각 대사를 변화시킬 수 있다. 암세포는 핵산과 단백질을 합성하기 위해 더 많은 아미노산을 필요로 한다. 그러한 이유로, 암은 특정 대사체가 증가한 대사증후군으로 간주된다.
최근 연구에 의하면, 발린, 페닐알라닌, 이소류신 및 류신을 포함한 15가지 아미노산 중 8가지가 건강한 대조군에 비해 유방암 환자에서 높게 측정되었다(Poschke et al.). 또한, 폐경전 일본 여성에서 혈장 아미노산 프로파일이 유리 테스토스테론을 포함한 유방암 위험 바이오마커와 관련이 있다고 보고된 바 있다(Nagata et al.).
상기 “류신(leucine)”은 단백질 합성의 단백질 동화 과정, 이화 과정 및 회전율의 비율에 따라 조절된다. 류신을 포함하는 측쇄 아미노산은 비만과도 관련되어 있다. 또한, 상기 “티로신(tyrosine)”은 방향족 아미노산의 일종으로 아드레날린(부신피질 호르몬), 티록신(갑상선 호르몬) 등 호르몬 생합성에 중요한 역할을 한다.
본 발명의 연구에서 혈장 류신 및 티로신의 수준이 대조군(기준시점 및 7년간 유방암에 걸리지 않음)에 비해 유방암군(기준시점 암에 걸리지 않았으나 7년간 유방암이 발병함)에서 현저히 높게 측정되었다.
상기 “아라키돈산(arachidonic acid)”은 20개의 탄소로 구성된 불포화 오메가6 지방산(polyunsaturated omega-6 fatty acid)이다. 상기 “감마리놀렌산(γ-linolenic acid)”은 리놀렌산의 불포화 산물이다.
본 발명의 연구에서 감마리놀렌산의 수준이 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 높게 측정되었다. 반면, 아라키돈산의 수준이 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 낮게 측정되었다.
상기 “프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2)” 및 상기 “프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2)”는 아라키돈산 대사와 관련이 있다.
프로스타글란딘 E2는 프로스타노이드(prostanoid)로 알려진 지질 매개체의 하위그룹이다. 종래의 연구에 의하면, 프로스타글란딘 E2를 포함하는 프로스타노이드는 유방암 발명의 위험을 증가시킬 수 있다고 보고된 바 있다.
본 발명의 연구에서 혈장 아라키돈산의 수준은 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 낮게 측정되었지만, 혈장 프로스타글란딘 J2 및 프로스타글란딘 E2의 수준은 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 높게 측정되었다.
따라서 상기 (c) 단계에서 류신(leucine), 티로신(tyrosine), 프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2) 및 감마리놀렌산(γ-linolenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 대사체의 농도가 상기 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 높은 경우 상기 대상체의 유방암 발병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있고, 아라키돈산(arachidonic acid)의 농도가 낮은 경우 상기 대상체의 유방암의 발병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.
한편, 상기 (b) 단계에서 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 스테아리돈산(Stearidonic acid), 프로스타글란딘 F2α(prostaglandin F2α) 및 레티놀산(retinoic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정 할 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계에서 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), lysoPC(lysophosphatidylcholine) 18:3, lysoPC 20:3, lysoPC 20:4 및 lysoPC 20:5으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정 할 수 있다.
상기 대사체들의 수준을 추가적으로 분석하고 상기 정상 대조군과 비교함으로써 진단의 신뢰도를 더욱 개선할 수 있다.
본 발명의 연구에서 혈장 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine)의 수준이 대조군(기준시점 및 7년간 유방암에 걸리지 않음)에 비해 유방암군(기준시점 암에 걸리지 않았으나 7년간 유방암이 발병함)에서 현저히 높게 측정되었다.
또한, 본 발명의 연구에서 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 포함하는 혈장 아미노산 및 체중과의 상관관계가 유방암군에서 발견되었으나 대조군에서는 발견되지 않았다.
상기 스테아리돈산(Stearidonic acid)은 알파리놀렌산(α-linolenic acid)의 불포화 산물이다. 본 발명의 연구에서 혈장 스테아리돈산의 수준이 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 높게 측정되었다.
상기 프로스타글란딘 F2α(prostaglandin F2α)는 산화 스트레스의 마커이다. 발명의 연구에서 혈장 프로스타글란딘 F2α의 수준이 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 높게 측정되었다.
또한, 발명의 연구에서 혈장 레티놀산의 수준이 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 높게 측정되었다.
본 발명의 연구에서 혈장 에이코사펜타엔산, 도코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산의 수준이 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 낮게 측정되었다.
또한, 본 발명의 연구에서 혈장 lysoPC 18:3, lysoPC 20:3, lysoPC 20:4 및 lysoPC 20:5의 수준이 대조군에 비해 유방암군에서 현저히 낮게 측정되었다.
상기 LysoPC는 리소포스포리파제에 의해 대사되고, 지방산과 콜린으로 더 대사된다. 상기 LysoPC들의 낮은 수치는 유방암 환자에서 신진 대사율이 높다는 것을 시사한다.
따라서, 상기 (c) 단계에서 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 스테아리돈산(Stearidonic acid), 프로스타글란딘 F2α(prostaglandin F2α) 및 레티놀산(retinoic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 대사체의 농도가 상기 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 높은 경우 상기 대상체의 유방암 발병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.
또한, 상기 (c) 단계에서 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), lysoPC(lysophosphatidylcholine) 18:3, lysoPC 20:3, lysoPC 20:4 및 lysoPC 20:5으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 대사체의 농도가 상기 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 낮은 경우 상기 대상체는 유방암의 발병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.
한편, 상기 방법은 기준시점으로부터 7년 이후 유방암의 발병 가능성을 판단할 수 있다. 상기 “기준시점”은, 대사체 프로파일링, 즉 상기 대사체의 농도 측정을 수행한 특정 시점을 의미한다.
한편, 본 발명의 다른 측면은 류신(leucine), 티로신(tyrosine), 아라키돈산(arachidonic acid), 프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2) 및 감마리놀렌산(γ-linolenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 유방암 발병 위험도 진단용 키트를 제공한다.
상기 정량장치는 상기 각 대사체의 농도를 측정하기 위한 것으로, 크로마토그래피, 질량분석기 등을 예시할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 액체 크로마토그래피(LC), 액체-고체 크로마토그래피(LSC), 종이 크로마토그래피(PC), 박층 크로마토그래피(TLC), 기체-고체 크로마토그래피(GSC), 액체-액체 크로마토그래피(LLC), 포말 크로마토그래피(FC), 유화 크로마토그래피(EC), 기체-액체 크로마토그래피(GLC), 이온 크로마토그래피(IC), 겔 여과 크로마토그래피(GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)일 수 있고, 바람직하게는 액체 크로마토그래피, 더 바람직하게는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC, ultra-performance liquid chromatography)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 질량분석기는 푸리에 변환 질량분석기(FTMS, Fourier transform mass spectrometer)를 사용할 수 있고, 구체적으로 LTQ-Orbitrap-XL 질량분석기를 사용할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 분자마다 상이한 이동성을 이용하여 각 대사체를 분리할 수 있고, 상기 질량분석기는 상기 분석 대상의 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보를 통해 대사체를 식별할 수 있다.
상기 진단 키트는 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 스테아리돈산(Stearidonic acid), 프로스타글란딘 F2α(prostaglandin F2α) 및 레티놀산(retinoic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 진단 키트는 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), lysoPC(lysophosphatidylcholine) 18:3, lysoPC 20:3, lysoPC 20:4 및 lysoPC 20:5으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.
실험방법
실험대상
본 발명의 연구 대상자는 한국인 암 예방연구-Ⅱ(Korean Cancer Prevention Study-Ⅱ; KCPS-Ⅱ) 바이오뱅크 코호트에서 확인된 유방암 환자 및 건강한 지원자를 대상으로 하였다.
KCPS-Ⅱ 바이오뱅크는 대규모 혈액 기반 코호트 연구로서, 사망률 및 입원 기록이 있는 한국 전역의 건강증진센터에서 일상적으로 실시되는 전국적 건강 검진의 독특한 연계를 통해 장기 추적 관찰을 하였다.
상기 코호트는 정기적인 건강 검진을 하고, 혈액 표본을 제공하고, 장기간의 추후 추적 관찰을 위해 정보 제공에 동의한 156,701명의 참가자(94,840명의 남성 및 61,861명의 여성)로 구성되었다.
혈액 샘플의 제공을 동의한 여성 참가자 61,861명 중, 84명의 유방암 환자(유방암군)과 88명의 건강한 지원자(정상 대조군)을 선발하였다.
본 발명의 연구는 연세대의 생명윤리위원회(Yonsei University Institutional Review Board)와 참여한 모든 건강증진센터에서 승인하였다.
설문 및 인체측정
선발된 상기 모든 실험 대상자는 흡연(흡연 미경험자, 흡연 유경험자, 현재 흡연자) 및 음주 이력과 같은 세부 정보에 대한 설문조사를 수행하였다.
모든 대상자의 가벼운 복장에 따른 키 및 몸무게를 측정하였고, 체중(kg)을 신장 제곱(m2)으로 나누어 체질량 지수(BMI)를 계산하였다.
최소 15분 동안의 휴식 후 수축기 및 이완기 혈압을 측정하였고, 늑골 하단 및 장골능 사이의 허리 둘레를 측정하였다.
혈액 수집 및 생화학적 분석
임상 화학적 분석을 위해, 12시간 이상의 공복 후 각 참가자로부터 말초 정맥 혈액에서 분리된 혈청을 수득하고, 분석 때까지 -70°C에서 보관하였다.
공복 혈당, 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 저밀도 지질단백질-콜레스테롤(LDL-cholesterol), 고밀도 지질단백질-콜레스테롤(HDL-cholesterol), AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransaminase) 및 hs-CRP(Serum high-sensitivity C-reactive protein)는 COBAS INTEGRA 800 및 Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.
산화 저밀도 지질단백질(ox-LDL)은 효소 면역 측정법(Mercodia AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 측정하였다. 반응 색의 결과는 450nm에서 Wallac 1420 Victor2 multilabel counter (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, USA)를 이용하여 모니터링 하였다.
각각의 측정은 Korean Association of Laboratory Quality Control이 요구하는 내부 및 외부적 품질 관리 절차에 따라 수행되었다.
개별 병원 사이 각각의 바이오 마커에 대한 일치도는 높았다(상관 계수는 0.96 ~ 0.99 범위).
유방암 진단
유방암 발병률에 대한 데이터는 National Cancer Registry의 기록과 대상자가 치료를 받은 병원으로부터 제공받았다. National Cancer Registry에 보고되지 않은 자료는 대상자의 병원 입원 기록을 참고하였다.
전반적(비표적화) 혈청 대사체 프로파일링
샘플 준비
혈청 샘플은 다음 준비 절차에 따라 준비하였다.
각 샘플의 100㎕ 분취량을 아세토니트릴(acetonitrile) 800㎕과 혼합하고, 4℃에 10분간 보관 후, 4℃ 10,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다.
남은 820㎕의 상등액을 질소 가스로 건조하고, 펠릿을 10% 메탄올에 녹여 혼합한 후, 4℃ 10,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 최종적으로 생성된 상등액 85㎕를 바이알에 준비하였다.
UPLC-LTQ-Orbitrap XL MS 분석
Thermo UPLC 시스템(Ultimate 3000 BioRS, Dionex-Thermo Fischer Scienrific, Bremen, Germany)에 설치된 Acquity UPLC-BEH-C18 컬럼(2.1 x 50 ㎜, 1.7 ㎛; Waters Milford, MA, USA)에 각 혈청 추출물 샘플(5㎕)를 주입하였다.
양이온 모드에서 0.1%의 포름산을 포함하는 LC-MS grade water(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)인 용액 A와 0.1%의 포름산을 포함하는 LC-MS grade methanol(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)인 용액 B를 이용하여 각 샘플을 22분 동안 측정하였다.
음이온 모드에서 모드는 6.5 mM 탄화수소 암모늄(ammonium bicarbonate)을 포함하는 LC-MS grade water(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)인 용액 A와 6.5 mM 탄화수소 암모늄(ammonium bicarbonate)을 포함하는 용리된 95% methanol인 용액 B를 이용하여 각 샘플을 24분 동안 측정하였다.
이 과정에서 용액 A 및 용액 B의 유속은 0.4 mL/min (양이온 모드; ES+) 및 0.35 mL/min(음이온 모드; ES-)으로 고정하고, 용액 B의 농도를 시간이 지남에 따라 다음과 같이 변경하였다.
양이온 모드(ESI+): 0 분 때 용액 B 0%; 1 분 때 용액 B 0%; 16 분 때 용액 B 100%; 17 분 때 용액 B 100%; 20 분 때 용액 B 100%; 22 분 때 용액 B 0%.
음이온 모드(ESI-): 0 분 때 용액 B 0%; 2 분 때 용액 B 0%; 17 분 때 용액 B 100%; 22 분 때 용액 B 100%; 24 분 때 용액 B 0%.
대사체는 푸리에 변환 MS에 대해 각 이온모드 및 풀 스캔 모드로 작동되는 LTQ-Orbitrap-MS(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 보냈다. 질량 분해능은 60,000이고, 스프레이 전압은 5.0 kV(ES+) 또는 4.0kV(ES-)이다. 질소(nitrogen sheath) 가스 및 보조 가스의 유속은 각각 50 및 5(arbitrary units)이다.
모세관 전압, 튜브-렌즈 전압, 및 모세관 온도는 각각 35 V, 100 V, 및 360℃로 일정하게 유지하였다. MS 데이터는 m/z 50 내지 1,000 범위에서 수집하였다. 품질 관리를 위해, 통합 제어 샘플은 각 샘플과 혼합하여 준비하였으며, 5번째마다 샘플을 주입하였다. 대사체의 MS/MS 스펙트럼은 20 내지 50%에서의 충돌 에너지 램프를 통해 획득하였다.
데이터 처리 및 대사체 동정
유지시간, m/z비, 및 이온 강도를 포함하는 모든 관련 데이터는 SIEVE 2.2 데이터 분석 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 수집하였다.
분석 파라미터는 하기와 같다: m/z 범위 50-1,000 m/z; 폭 5 ppm; 및 유지시간 폭 2.5분.
대사체는 하기 데이터베이스를 이용하여 검색하였다: Human Metabolome(www.hmdb.ca); Lipid MAPS(www.lipidmaps.org); KEGG(www.genome.jp/kegg); MassBank(www.massbank.jp); 및 ChemSpider(www.chemspider.com).
MS/MS를 통해 잠재적 대사체를 확인하였다. MS/MS 스펙트럼은 Xcalibur 2.1 software (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 MassFrontier software (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 송출하였다. 그 후 스펙트럼을 Mass Frontier software database, Human Metabolome, Lipid MAPS, mzCloud 및 MassBank MS/MS spectra databases와 비교하여 잠재적 대사체를 동정하였다.
통계적 분석
통계적 분석은 SPSS v. 24.0(IBM / SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 왜곡된 변수들은 대수적으로(logarithmically) 변환하였다. 평균값은 변환되지 않은 값으로 표시하였다. 결과는 평균±표준오차(SE)로 표현하였다. 두 그룹 간의 파라미터들을 비교하기 위해 독립 t-검정을 사용하였다. 양측 P-검정값(two-tailed P-value)<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
다수의 대사체를 여러 번 비교하기 위해, R 패키지 'fdrtool'을 이용하여 오류 발견률(FDR, False discovery rate-corrected)을 보정한 q-값을 산출하였고, 0.05 미만의 q-값이 유의성을 가지는 것으로 간주하였다.
또한, 연구 집단에서 대사체와 생화학적 특징 간의 관계를 평가하기 위해 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)를 사용하였다.
연구 집단에서 대사체와 생화학적 특징 간의 관계를 시각화하고 평가하기 위해 Multiple Experiment Viewer(MeV) version 4.9.0(http://www.tm4.org)을 사용하여 히트 맵을 생성하였다. 관리된 계층적 클러스터링은 평균 연계와 Spearman의 순위 상관 거리 메트릭스를 사용하여 평가하였다.
유방암 발병의 주요 독립 예측 인자를 동정하기 위하여 단계적 회귀분석(stepwise regression analysis)을 수행하였다.
또한, 대사 경로 분석은 MetaboAnalyst 3.0(http://metaboanalyst.ca)을 이용하였다.
스펙트라 데이터는 다변수 통계 분석(multivariate analysis)을 위해 SIMCA-P+ 14.0(Umetrics, Umea, Sweden)으로 이출되었다. 다변수 통계 분석에 앞서, 파레토 스케일링(Pareto scaling)을 모든 데이터에 적용하였다.
직교 부분 최소 자승 판별 분석(Orthogonal partial least squares discriminant analysis; OPLS-DA)을 이용하여 모델들을 비교하였다. 모델의 유효성은 R2Y 및 Q2Y의 파라미터와, 교차검증 분산분석(cross-validation analysis of variance; CV-ANOVA)을 통해 평가하였다.
실험결과
실험예 1 : 기준시점의 임상적 특징
평균 7년 동안, 156,701명의 지원자 중 84명의 여성 대상자에서 유방암이 발병하였다. 유방암으로 입원한 84명의 환자와 암에 걸리지 않고 BMI가 매칭되는 88명의 지원자를 유방암군과 정상 대조군으로 분류하였다.
연령, 흡연 및 음주 상태를 보정한 후, 유방암군은 대조군에 비해 혈당이 높았고, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, AST 및 hs-CRP의 혈중 농도가 낮았다(표 1).
구분 대조군(n=88) 유방암군 (n=84) P a P b
연령(년) 43.4±0.74 45.7±0.86 0.039 -
현 흡연자 n, (%) 1 (1.4) 2 (3.2) 0.483 -
음주자 n, (%) 45 (56.3) 29 (43.3) 0.117 -
체중(kg) 56.4±0.72 56.9±0.85 0.642 0.883
신장(cm) 73.8±0.73 75.1±0.88 0.242 0.283
BMI(kg/m2) 22.4±0.27 22.7±0.31 0.433 0.832
수축기혈압(mmHg) 112.2±1.51 117.0±1.60 0.030 0.054
이완기혈압(mmHg) 70.9±0.99 71.7±1.15 0.601 0.460
포도당(mg/dL)∮ 84.2±0.90 89.5±1.45 0.002 0.024
트리글리세라이드(mg/dL)∮ 106.7±6.82 109.2±9.75 0.829 0.969
총 콜레스테롤(mg/dL)∮ 191.4±3.05 181.6±3.58 0.038 0.005
HDL-콜레스테롤(mg/dL)∮ 55.0±0.94 57.7±1.40 0.111 0.179
LDL-콜레스테롤(mg/dL)∮ 116.2±3.08 104.0±3.38 0.009 <0.001
AST(IU/L)∮ 21.0±0.56 19.3±0.60 0.037 0.020
ALT(IU/L)∮ 17.4±0.90 16.7±0.89 0.578 0.556
GGT(U/L)∮ 19.0±1.37 19.9±2.06 0.730 0.626
백혈구 수(x103/μL)∮ 5.45±0.16 5.65±0.18 0.398 0.527
hs-CRP(mg/L)∮ 0.54±0.53 0.10±0.02 0.469 0.016
각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ∮은 로그 변환으로 검사한 값이다. 독립적인 t-test로 파생된 P a -값. 나이, 음주 및 흡연에 대한 보정 후 독립적인 t-test로 파생된 P b -값.
실험예 2 : UPLC-LTQ-orbitrap MS를 이용한 혈청 대사체 프로파일링
기준시점에서 얻은 혈청 대사체에 대한 총 이온 크로마토그래피 데이터(양이온 및 음이온 모드)를 OPLS-DA 스코어 플롯을 사용하여 분석하였다.
특히, OPLS-DA는 양이온 모드에서 대조군(기준시점 및 7년간 암에 걸리지 않음; n=88) 및 유방암군(기준시점 암에 걸리지 않았으나 7년간 유방암이 발병함; n=84) 간 기준시점의 대사체를 비교하였다(도 1a).
OPLS-DA의 품질은 모델의 적합성 및 각 모델의 예측력을 평가하는 R2 및 Q2 값을 사용하여 시험하였다.
도 1을 참조하면, 상기 모델은 적합도(goodness of fit)가 80.8%(R2Y=0.808), 예측력이 70.6%(Q2Y=0.706)로 나타났다. 상기 결과는 OPLS-DA 모델의 접합도가 높고 수용 가능한 예측력을 가지고 있음을 시사한다.
또한, OPLS-DA는 음이온 모드에서 적합도R2Y=0.762 및 예측력 Q2Y=0.575의 통계적 파라미터로 대조군 및 유방암군 간 기준시점의 대사체를 비교하였다(도 1b).
상기 결과는 대사체의 존재도의 차이를 기반으로 두 그룹을 구별할 수 있음을 시사한다.
확인된 차이에 기여하는 잠재적 변수를 추출하기 위해, 양이온 모드(도 1c)와 음이온 모드(도 1d)에서 파레토 스케일링(Pareto scaling)을 이용하여 OPLS-DA 모델로부터 공변인 p(1) 및 신뢰도 관계 p(corr) (1)의 S-플롯을 생성하였다.
상기 대사체가 높거나 낮은 p(corr) 값을 가질 때, 두 그룹을 구별함에 있어 더 높은 관련성을 가진다.
실험예 3 : 혈청 대사체의 동정
각 군의 구분에 중요한 역할을 하는 변수(대사체)를 변수중요도척도(Variable Important in the Projection; VIP) 파라미터에 따라 선별하였다. VIP 값이 1.0를 초과할 때 샘플 군들 간의 차이에 높은 관련성이 있음을 의미한다.
대조군과 유방암군 간의 기준시점 대사체 수준의 비교에서 총 535개의 대사체(양이온 및 음이온 모드 모두)가 종래에 확인된 바 있으며, 나머지는 신규였다.
표 2 및 3은 대조군과 유방암군에서 혈청 대사체를 나타낸다. 대조군과 비교하여, 유방암군은 20가지 대사체의 수준이 현저히 높았고(표 2), 22개의 대사체의 수준이 현저히 낮았다(표 3).
대조군과 유방암군에서 상향 조절된 혈청 대사체의 동정
m/z
[M+H]†
[M-H] ‡ 		화학식 대사체 VIP t -Test Cohen's d
P q
132.102 C6H13NO2 L-Leucine† 5.130 <0.001 9.404.E-05 0.684
143.107 C8H16O2 Caprylic acid‡ 1.162 <0.001 1.844.E-04 0.735
166.086 C9H11NO2 L-Phenylalanine† 2.639 0.192 0.090 0.200
182.081 C9H11NO3 L-Tyrosine† 2.564 <0.001 3.366.E-04 0.604
201.112 C10H16O4 cis-4-Decenedioic acid† 1.665 <0.001 1.358.E-06 1.132
205.097 C11H12N2O2 L-Tryptophan† 1.925 0.402 0.140 0.129
217.179 C12H24O3 3-Hydroxydodecanoic acid† 1.299 0.032 0.026 0.331
219.122 C10H18O5 3-Hydroxysebacic acid† 1.116 <0.001 4.418.E-04 0.784
247.154 C12H22O5 3-Hydroxydodecanedioic acid† 1.934 0.002 0.002 0.699
255.232 C16H32O2 Palmitic acid‡ 5.647 0.863 0.254 0.026
275.185 C14H26O5 3-Hydroxytetradecanedioic acid† 2.014 0.016 0.015 0.545
277.216 C18H28O2 Stearidonic acid† 1.751 0.005 0.005 0.563
279.232 C18H30O2 γ-Linolenic acid† 3.037 0.002 0.003 0.553
281.247 C18H34O2 Elaidic acid‡ 1.177 0.003 0.004 0.457
282.279 C18H35NO Oleamide† 1.146 0.038 0.029 0.455
295.226 C18H30O3 9-HOTE† 2.494 0.003 0.003 0.563
295.227 C18H32O3 13S-Hydroxyoctadecadienoic acid‡ 3.917 0.002 0.002 0.591
301.216 C20H28O2 All-trans-Retinoic acid† 1.954 0.027 0.022 0.373
313.155 C18H20N2O3 Phenylalanylphenylalanine† 1.870 0.001 0.002 0.537
317.211 C20H30O3 9-HEPE‡ 2.008 0.120 0.066 0.271
319.227 C20H32O3 12-HETE‡ 3.646 0.028 0.023 0.409
321.242 C20H34O3 15(S)-Hydroxyeicosatrienoic acid‡ 2.040 0.001 0.002 0.656
333.206 C20H30O4 Prostaglandin J2‡ 1.555 0.133 0.071 0.232
335.221 C20H32O4 8,15-DiHETE‡ 2.103 0.113 0.063 0.256
343.227 C22H32O3 17-HDoHE‡ 4.067 0.066 0.045 0.346
351.216 C20H32O5 Prostaglandin E2‡ 1.034 0.213 0.096 0.193
353.232 C20H34O5 8-Isoprostaglandin F2α‡ 1.204 0.001 0.002 0.580
375.216 C22H32O5 Resolvin D1‡ 1.238 0.406 0.141 0.129
518.322 C26H48NO7P LysoPC(18:3)† 2.355 0.249 0.105 0.178
546.355 C28H52NO7P LysoPC(20:3)† 1.579 0.104 0.060 0.259
†는 ESI-양이온 모드(M/Z [M+H])에서 얻은 대사체, ‡는 ESI-음이온 모드(M/Z [M-H])에서 얻은 대사체이다. VIP는 변수중요도척도이다. P-값은 대조군(n=88) 및 유방암군(n=84) 간의 독립 t-검정으로부터 도출되었다. q-값은 오류 발견률(FDR)을 보정한 P-값이다. Cohen's d는 합동표준편차(pooled standard deviation)에 의해 분할된 양 평균 간 차이 비교에 대한 영향력 크기이다. d=0.20이면 “작은“, d=0.50이면 “중간의”, d=0.80이면 “큰”으로 영향력의 크기를 정의한다.
대조군과 유방암군에서 하향 조절된 혈청 대사체의 동정
m/z
[M+H]†
[M-H] ‡ 		화학식 대사체 VIP t -Test Cohen's d
P q
227.201 C14H28O2 Myristic acid‡ 1.466 0.979 0.279 -0.004
253.216 C16H30O2 Palmitoleic acid‡ 2.837 0.443 0.151 -0.117
271.227 C16H32O3 3-Hydroxyhexadecanoic acid‡ 1.350 0.002 0.003 -0.478
279.232 C18H32O2 Linoleic acid‡ 5.202 0.328 0.122 -0.150
301.216 C20H30O2 Eicosapentaenoic acid‡ 3.869 0.006 0.006 -0.428
303.232 C20H32O2 Arachidonic acid‡ 8.133 <0.001 1.051.E-05 -0.752
305.247 C20H34O2 8,11,14-Eicosatrienoic acid‡ 3.368 0.003 0.003 -0.467
327.232 C22H32O2 Docosahexaenoic acid‡ 9.506 <0.001 1.831.E-06 -0.833
329.247 C22H34O2 Docosapentaenoic acid‡ 3.292 <0.001 9.613.E-05 -0.649
367.157 C19H28O5S Dehydroepiandrosterone sulfate‡ 1.314 0.065 0.044 -0.283
369.172 C19H30O5S Androsterone sulfate‡ 1.070 0.068 0.045 -0.281
468.307 C22H46NO7P LysoPC(14:0)† 1.575 0.026 0.022 -0.343
480.345 C24H50NO6P LysoPC(P-16:0)† 2.448 <0.001 2.913.E-04 -0.597
481.234 C25H39O7P 1-(Docosahexaenoyl)-glycero-3-phosphate‡ 1.291 0.008 0.008 -0.413
482.323 C23H48NO7P LysoPC(15:0)† 1.595 0.003 0.004 -0.455
494.322 C24H48NO7P LysoPC(16:1)† 2.092 0.036 0.028 -0.323
496.338 C24H50NO7P LysoPC(16:0)† 7.701 0.030 0.024 -0.335
506.359 C26H52NO6P LysoPC(P-18:1)† 1.161 <0.001 0.001 -0.561
510.355 C25H52NO7P LysoPC(17:0)† 2.444 <0.001 0.001 -0.561
520.339 C26H50NO7P LysoPC(18:2)† 3.546 0.025 0.021 -0.352
522.355 C26H52NO7P LysoPC(18:1)† 4.281 <0.001 2.122.E-05 -0.715
538.386 C27H56NO7P LysoPE(22:0)† 1.037 0.022 0.019 -0.353
542.322 C28H48NO7P LysoPC(20:5)† 1.461 0.994 0.282 -0.001
544.340 C28H50NO7P LysoPC(20:4)† 1.327 0.221 0.098 -0.192
548.370 C28H54NO7P LysoPC(20:2)† 1.342 <0.001 1.913.E-09 -1.094
568.337 C30H50NO7P LysoPC(22:6)† 3.962 <0.001 2.828.E-09 -1.066
570.354 C30H52NO7P LysoPC(22:5)† 2.259 <0.001 1.880.E-10 -1.171
†는 ESI-양이온 모드(M/Z [M+H])에서 얻은 대사체, ‡는 ESI-음이온 모드(M/Z [M-H])에서 얻은 대사체이다. VIP는 변수중요도척도이다.
P-값은 대조군(n=88) 및 유방암군(n=84) 간의 독립 t-검정으로부터 도출되었다. q-값은 오류 발견률(FDR)을 보정한 P-값이다. Cohen's d는 합동표준편차(pooled standard deviation)에 의해 분할된 양 평균 간 차이 비교에 대한 영향력 크기이다. d=0.20이면 “작은“, d=0.50이면 “중간의”, d=0.80이면 “큰”으로 영향력의 크기를 정의한다.
실험예 4 : 대상자에서 유방암 발병과 관련된 대사 경로
선별된 대사체에서 가장 관련성이 높은 경로를 동정하고자, 웹-기반 분석 모듈인 MetaboAnalyst 3.0을 이용하여 대사 경로 분석(Metabolic pathway analysis)을 수행하였다(도 2).
유방암이 발생한 또는 발생하지 않은 모든 대상자는 기준시점에서 발린, 류신 및 이소류신 분해; 발린, 류신 및 이소류신 생합성; 티로신 대사; 아라키돈산 대사; 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생합성; 페닐알라닌 대사; 트립토판 대사; 지방산 대사; 리놀레산 대사 및 레티놀 대사가 연관되었다(표 4)
대사 경로 분석
대사 경로 Hits P FDR Impact
Valine, leucine and isoleucine degradation L-Leucine 1.216E-09 1.216E-08 0.022
Valine, leucine and isoleucine biosynthesis L-Leucine 1.216E-09 1.216E-08 0.013
Tyrosine metabolism L-Leucine 8.353E-09 3.341E-08 0.047
Arachidonic acid metabolism Arachidonic acid 1.420E-05 4.057E-05 0.260
Prostaglandin J2
Prostaglandin E2
Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis L-Tyrosine 1.890E-05 4.199E-05 0.008
L-Phenylalanine
L-Tryptophan
Phenylalanine metabolism L-Tyrosine 2.501E-05 5.001E-05 0.119
L-Phenylalanine
Tryptophan metabolism L-Tryptophan 3.075E-04 5.125E-04 0.109
Fatty acid metabolism Palmitic acid 4.674E-04 6.678E-04 0.030
Linoleic acid metabolism 13S-Hydroxyoctadecadienoic acid 0.007 0.008 0.656
γ-Linolenic acid
Linoleic acid
Retinol metabolism Retinoic acid 0.036 0.040 0.175
Hits는 MetaboAnalyst에 업로드된 대사체와 실제로 일치하는 것이다. FDR은 오류 발견률(False Discovery Rate)을 보정한 P-값이다. Impact는 경로 토폴로지(topology) 분석으로부터 계산된 경로 영향력 값(pathway impact value)이다.
발린, 류신 및 이소류신의 분해 및 생합성은 모두 류신과 연관되었고, 대사 경로 분석 기반의 영향력 계수는 각각 0.022 및 0.013으로 나타났다.
대사 경로 분석은 티로신이 티로신 대사에 속해 있음을 밝혀냈고, 영향력 계수는 0.047로 나타났다.
아라키돈산(C20:4n-6), 프로스타글란딘 J2 및 프로스타글란딘 E2는 아라키돈산 대사와 연관되었고, 영향력 계수는 0.260으로 나타났다.
페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생합성은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판과 연관되었고, 영향력 계수는 0.008로 나타났다. 페닐알라닌 대사는 티로신 및 페닐알라닌과 연관되었고, 대사 경로 분석 기반의 영향력 계수는 0.119로 나타났다.
팔미틱산은 지방산 대사와 연관되었고, 영향력 계수는 0.030으로 나타났다. 리놀레산 대사는 13S-히드록시옥타데카디엔산, 감마리놀렌산(C18:3n-6) 및 리놀레산(C18:2n-6)과 연관되었고, 영향력 계수는 0.656으로 나타났다. 레티놀 대사는 레티놀산과 연관되었고, 영향력 계수는 0.175로 나타났다.
실험예 5 : 유방암 발병 빈도에 따른 양상과 주요 대사체 간의 연관성
유방암의 발병률에 따라 연령, 체중 및 주요 대사체(주요 대사체)를 포함하는 상관관계 매트릭스를 도 3에 나타냈다.
유방암의 발병에 대해 상이한 변수의 독립적인 영향을 분석하고자, 다음의 변수에 대한 단계적 회귀분석(stepwise regression analysis)을 수행하였다: 체중, 류신, 티로신, 아라키돈산, 프로스타글란딘 J2, 프로스타글란딘 E2, 페닐알라닌, 트립토판, 팔미틱산, 13S-히드록시옥타데카디엔산, 감마리놀렌산, 리놀레산 및 레티놀산을 포함한 12가지 대사체(주요 대사체).
모든 대상자의 유방암 발병률은 류신, 티로신, 아라키돈산, 프로스타글란딘 J2, 프로스타글란딘 E2 및 감마리놀렌산에 의해 독립적으로 영향을 받았다.
상기 결과는 발린, 류신 및 이소류신 분해; 발린, 류신 및 이소류신 생합성; 티로신 대사; 아라키돈산 대사; 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생합성; 페닐알라닌 대사; 트립토판 대사; 지방산 대사; 리놀레산 대사 및 레티놀 대사의 임상적 관련성을 시사한다. 상기 결과는 상기 대사 과정의 조절 장애가 유방암 발병의 핵심 기작임을 시사한다.
또한, 상기 결과는 류신, 티로신, 아라키돈산, 프로스타글란딘 J2, 프로스타글란딘 E2 및 감마리놀렌산이 유방암 발병률의 독립적인 영향 인자임을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계;
    (b) 상기 생물학적 시료에서 류신(leucine), 프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2) 및 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2)의 대사체 농도를 측정하는 단계; 및
    (c) 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 스테아리돈산(Stearidonic acid), 프로스타글란딘 F2α(prostaglandin F2α) 및 레티놀산(retinoic acid)의 대사체 농도를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 측정된 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계;를 포함하는 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법으로서,
    상기 (b) 및 (c) 단계의 대사체의 수준이 상향조절되는 경우, 상기 측정시점으로부터 7년간 유방암 발생 위험이 높은 것으로 평가하는 것인, 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), lysoPC(lysophosphatidylcholine) 18:3, lysoPC 20:3, lysoPC 20:4 및 lysoPC 20:5으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정하는 방법.
  4. 삭제
  5. 류신(leucine), 프로스타글란딘 J2(prostaglandin J2), 및 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2), 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 스테아리돈산(Stearidonic acid), 프로스타글란딘 F2α(prostaglandin F2α) 및 레티놀산(retinoic acid)의 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 유방암 발병 위험도 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 정량장치는 크로마토그래피 및 질량분석기인 키트.
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), lysoPC(lysophosphatidylcholine) 18:3, lysoPC 20:3, lysoPC 20:4 및 lysoPC 20:5으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함하는 키트.
KR1020170122091A 2017-09-21 2017-09-21 대사체 프로파일링을 이용한 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트 Active KR102077058B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170122091A KR102077058B1 (ko) 2017-09-21 2017-09-21 대사체 프로파일링을 이용한 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170122091A KR102077058B1 (ko) 2017-09-21 2017-09-21 대사체 프로파일링을 이용한 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190033382A KR20190033382A (ko) 2019-03-29
KR102077058B1 true KR102077058B1 (ko) 2020-02-13

Family

ID=65898765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170122091A Active KR102077058B1 (ko) 2017-09-21 2017-09-21 대사체 프로파일링을 이용한 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102077058B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113484518B (zh) * 2021-07-08 2023-11-03 天津中医药大学 一种区分肺部疾病的诊断生物标志物
CN114705782B (zh) * 2022-04-07 2023-12-01 中国人民解放军总医院第一医学中心 用于诊断或监测结直肠癌的血浆代谢标志物组合及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110123976A1 (en) 2009-10-13 2011-05-26 Purdue Research Foundation Biomarkers and identification methods for the early detection and recurrence prediction of breast cancer using NMR
CN102893157A (zh) 2009-12-22 2013-01-23 密执安大学评议会 前列腺癌的代谢特征
US20140162903A1 (en) * 2012-10-31 2014-06-12 Purdue Research Foundation Metabolite Biomarkers For Forecasting The Outcome of Preoperative Chemotherapy For Breast Cancer Treatment
US20150299797A1 (en) 2012-08-24 2015-10-22 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods relating to blood-based biomarkers of breast cancer
WO2016038157A1 (en) * 2014-09-10 2016-03-17 Idcgs Clínica De Diagnósticos Médicos Ltda Biomarkers for assessing breast cancer

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110123976A1 (en) 2009-10-13 2011-05-26 Purdue Research Foundation Biomarkers and identification methods for the early detection and recurrence prediction of breast cancer using NMR
CN102893157A (zh) 2009-12-22 2013-01-23 密执安大学评议会 前列腺癌的代谢特征
US20150299797A1 (en) 2012-08-24 2015-10-22 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods relating to blood-based biomarkers of breast cancer
US20140162903A1 (en) * 2012-10-31 2014-06-12 Purdue Research Foundation Metabolite Biomarkers For Forecasting The Outcome of Preoperative Chemotherapy For Breast Cancer Treatment
WO2016038157A1 (en) * 2014-09-10 2016-03-17 Idcgs Clínica De Diagnósticos Médicos Ltda Biomarkers for assessing breast cancer

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190033382A (ko) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ban et al. Metabolomic analysis identifies potential diagnostic biomarkers for aspirin‐exacerbated respiratory disease
CN110196335A (zh) 与肾功能相关的生物标记及其使用方法
JP6251718B2 (ja) 健康的な老化に関するバイオマーカーとしてのヒドロキシスフィンゴミエリン２２：１
Wang et al. Simplified plasma essential amino acid-based profiling provides metabolic information and prognostic value additive to traditional risk factors in heart failure
US20170199203A1 (en) Metabolite panel for improved screening and diagnostic testing of cystic fibrosis
EP2828669A1 (en) Phenylacetylglutamine as biomarker for healthy ageing
EP2828666B1 (en) P-cresol sulphate as biomarker for healthy ageing
La Frano et al. Impact of post-collection freezing delay on the reliability of serum metabolomics in samples reflecting the California mid-term pregnancy biobank
Morris et al. Modulation of the lipidomic profile due to a lipid challenge and fitness level: a postprandial study
EP2828667A1 (en) 9-oxo-octadecadienoic acid (9-oxo-hode) as as biomarker for healthy ageing
Feng et al. Identification of biomarkers and the mechanisms of multiple trauma complicated with sepsis using metabolomics
KR101594515B1 (ko) 혈장 대사체를 이용한 제2형 당뇨병 진단 키트
Tsai et al. Identification of traumatic acid as a potential plasma biomarker for sarcopenia using a metabolomics‐based approach
US9341615B2 (en) PC-O 40:1 as a biomarker for healthy aging
Setoyama et al. Personality classification enhances blood metabolome analysis and biotyping for major depressive disorders: two-species investigation
Ding et al. Identification of metabolomics-based prognostic prediction models for ICU septic patients
KR102077058B1 (ko) 대사체 프로파일링을 이용한 유방암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트
Zhou et al. Clinical lipidomics analysis reveals biomarkers of lipid peroxidation in serum from patients with rheumatoid arthritis
Al Ashmar et al. Metabolomic profiling reveals key metabolites associated with hypertension progression
KR101965698B1 (ko) 대사체 프로파일링을 이용한 간암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트
KR20160124596A (ko) 혈장 대사체를 이용한 당뇨병 및 심혈관질환의 조기 진단
JP7650375B2 (ja) アシルカルニチン代謝体を含む口腔癌診断用のバイオマーカー組成物
KR101565889B1 (ko) 혈장 대사체를 이용한 혈관경직도 예측 또는 진단 방법
CN115308419A (zh) 一组用于结直肠癌诊断的血液氨基酸、脂肪酸生物标志物及其应用
Creech et al. Mass spectrometry-based approaches for clinical biomarker discovery in traumatic brain injury

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20170921

PA0201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20181119

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20190528

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20191126

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20190528

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

Patent event date: 20181119

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20191126

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20190726

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20190121

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20200113

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20191227

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20191126

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20190726

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20190121

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20200207

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20200210

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230208

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20231218

Start annual number: 5

End annual number: 5

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载