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KR101971741B1 - 표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산을 사용하는 게놈 편집 - Google Patents

표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산을 사용하는 게놈 편집 Download PDF

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시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 세포 내 특정 염색체 서열을 편집하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 특히, 염색체 서열을 편집하기 위하여 표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산이 사용된다.

Description

표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산을 사용하는 게놈 편집{GENOME EDITING USING TARGETING ENDONUCLEASES AND SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACIDS}
관련출원과의 상호참조
본 출원은 2010년 11월 4일 출원된 미국 가특허출원 제61/410,124호, 2010년 9월 15일 출원된 미국 가특허출원 제61/382,965호, 및 2010년 7월 23일 출원된 미국 가특허출원 제61/367,022호의 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 특이적 염색체 서열을 편집하기 위한 표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산의 사용에 관한 것이다.
합리적 게놈 유전자조작은 기초 연구, 약물 발견, 및 세포-기반 약품에 걸쳐 거대한 가능성을 가진다. 표적화된 유전자 녹-아웃, 돌연변이유발, 또는 통합에 대한 다수의 존재하는 방법은 상동성 재조합에 의존한다. 그러나 다수의 세포에서 자발적 재조합의 낮은 비율뿐만 아니라 스크리닝 노력의 규모 및 표적화 사건을 분리하기 위해 필요한 시간은 본 분야의 진전을 방해하였다. 따라서, 높은 속도, 효율, 및 정확성으로 편집하는 표적화된 게놈을 빠르게 달성할 수 있는 기술에 대한 필요가 존재한다.
본 명세서의 다양한 양태 중에 세포 내 적어도 하나의 내인성 염색체 서열의 편집 방법이 제공된다. 해당 방법은 (i) 적어도 하나의 표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산(해당 표적화 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내 표적화된 절단 부위에서 이중-가닥 파손을 도입할 수 있음), 및 (ii) 표적화된 절단 부위의 적어도 하나의 측면 상에서 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 가지는 제1부분을 포함하는 적어도 하나의 단일-가닥 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 해당 방법은 추가로 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중-가닥 파손이 상동성-관련 과정에 의해 보수되는 조건 하에서 세포를 유지하여 염색체 서열이 단일-가닥 핵산의 서열로 교환되고, 이에 의해 염색체 서열을 편집하는 단계를 포함한다.
추가 양태는 세포 내 염색체 서열을 편집하기 위한 키트를 제공한다. 해당 키트는 (a) 적어도 하나의 표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산(해당 표적화 엔도뉴클레아제는 염색채 서열 내 표적화된 절단 부위에서 이중-가닥 파손을 도입할 수 있음), 및 (b) 표적화된 절단 부위의 적어도 한 측면 상에서 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 가지는 제1부분을 포함하는 적어도 하나의 단일-가닥 핵산을 포함한다.
본 명세서의 다른 양태 및 특징은 이하에 더욱 철저하게 기재된다.
컬러 도면에 대한 참조
본 출원 파일은 컬러로 실현된 적어도 하나의 사진을 포함한다. 컬러 사진을 갖는 본 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 납입 시 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 RSK2 키나제 좌위를 변형하기 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드 설계의 제시. RSK2 키나제 야생형 게놈 서열은 표시된 ZFN 결합 부위와 함께 상단에 제시된다. 특이적 돌연변이를 은닉하는 올리고뉴클레오타이드 서열은 하단에 제시된다.
도 2는 RSK2 키나제 좌위 내로 BamHI 부의의 통합을 기록. 세포 풀은 BamHI와 함께 분해되었고, 단편은 겔 전기영동에 의해 분해되었다.
도 3은 RSK2 좌위에서 BamHI 부위를 은닉하는 단일 분리 세포 클론을 도시. 개개 클론 내 RSK2 좌위를 PCR 증폭시키고 BamHI와 함께 분해시켰다.
도 4는 AAVS1 좌위의 변경에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 설계의 다이아그램. AAVS1 야생형 게놈 서열은 표시된 ZFN 결합 부위와 함께 상단에 제시된다. 부위를 포함하는 센스 및 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 하단에 나타낸다.
도 5는 AAVS1 좌위 내로 HindIII 부위의 통합을 도시. 상단 패널은 ZFN 및 올리고뉴클레오타이드와 접촉된 세포를 도시하며, 하단 패널은 올리고뉴클레오타이드 단독으로 접촉된 세포를 도시한다. 세포 풀은 HindIII과 함께 분해시켰고, 단편은 겔 전기영동에 의해 분해시켰다.
도 6은 AAVS1 좌위에서 HindIII을 은닉하는 단일 분리 세포 클론을 도시. 개개의 클론 내 AAVS1 좌위는 PCR 증폭되었고 HindIII과 함께 분해시켰다.
도 7은 상이한 길이의 센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 AAVS1 좌위 내 HindIII 부위의 통합을 도시. 세포의 풀로부터 게놈 DNA를 PCR 증폭시켰고, HindIII과 함께 분해시켰다. 상단을 따라가는 숫자는 각 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 길이를 지칭한다. M은 마커를 상징하고, G는 GFP를 상징하며(즉 ZFN 대조군 없음), Z는 ZFN을 상징한다.
도 8은 상이한 길이의 안티-센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 AAVS1 좌위 내 HindIII 부위의 통합을 도시. 세포 풀로부터 게놈 DNA를 PCR 증폭시켰고 HindIII과 함께 분해시켰다. 상단을 따라가는 숫자는 각 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 길이를 지칭한다. M은 마커를 상징하고, G는 GFP를 상징하며(즉 ZFN 대조군 없음), Z는 ZFN을 상징한다.
도 9는 ZFN이 상이한 길이의 올리고뉴클레오타이드와 조합되어 mRNA 또는 DNA로서 전달될 때 AAVS1 좌위 내로 HindIII 부위의 통합을 도시. 세포 풀로부터 게놈 DNA를 PCR 증폭시켰고, HindIII과 함께 분해시켰다. 상단을 따라가는 숫자는 각 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 길이를 지칭한다. R은 RNA를 상징하고, D는 DNA를 상징하며, M은 마커를 상징하고, G는 GFP를 상징하며(즉 ZFN 대조군 없음), Z는 ZFN을 상징한다.
도 10은 AAVS1 좌위에서 HindIII 부위를 포함하는 세포의 Cel-1 분석을 도시. 상단을 따라가는 숫자는 각 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 길이를 지칭한다. M은 마커를 상징하고, G는 GFP를 상징하며(즉 ZFN 대조군 없음), Z는 ZFN을 상징한다.
도 11은 AAVS1 좌위에서 HindIII 부위의 통합을 위한 상동성 대 비상동성 올리고뉴클레오타이드의 사용을 도시. 1, 8 = 센스, 단일-가닥; 2, 9, = 안티-센스, 단일-가닥; 3, 10 = 센스 + 안티-센스; 4 = 센스, 단일-가닥(2x); 5, 11 = 이중-가닥(사전-어닐링); 6, 12 = 올리고뉴클레오타이드 단독(ZFN 없음), 및 7 = 야생형.
도 12는 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드(single-stranded DNA oligonucleotide, ssODN) 및 ZFN을 가지는 특정 좌위에서 0.1-100 kb 게놈 DNA의 표적화된 결실을 도시. 도 12A는 ZFN 절단 부위에 대해 5'인 결실을 도시. 도 12B는 ZFN 절단 부위에 대해 3'인 결실을 도시. 염색체 서열 내 원위 결실 말단 지점 영역은 I로 지정되며, 표적화된 절단 부위 근처의 ZFN 결합 부위는 II로 지정된다. ssODN 공여체는 표적화된 원위 결실 말단 지점 영역과 서열 동일성을 가지는 영역(I'으로 지정됨) 및 절단 부위 근처의 ZFN 결합 부위와 서열 동일성을 가지는 영역(II로 지정됨)을 포함한다.
도 13은 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN을 갖는 K562 내 AAVS1 좌위에서 표적화된 게놈 DNA 결실의 PCR 확인을 도시. "1"로 라벨링된 레인은 올리고뉴클레오타이드와 ZFN 둘 다에 노출된 K562 세포를 사용하였고, 따라서 PCR 단편은 결실 대립유전자로부터 유래되었다. "2"로 라벨링된 레인은 ZFN 없이 올리고뉴클레오타이드에만 노출된 K562 세포를 사용하였지만, 얻어진 PCR 단편은 야생형 대립유전자(결실 없음)를 가진다. "3"으로 라벨링된 레인은 ZFN에만 노출된 K562 세포를 사용하였으며, 따라서 PCR 생성물은 야생형 대립유전자의 단편도 나타내었다. 야생형 대립유전자 PCR 단편의 기대된 크기 및 결실 대립유전자 PCR 단편은 도 13의 레인의 각 그룹을 상부에 제시하며, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN을 사용하는 약 0.1kb, 0.5kb, 1.0kb, 1.5kb, 2kb, 2.5kb, 3.0kb, 3.5kb, 4.0kb, 4.5kb, 5.0kb, 10.0kb, 10.2kb, 20.0kb, 20.2kb, 50 kb 및 100 kb의 표적화된 게놈 DNA 결실을 제시하였고, 확인하였다. 레인의 그룹 중에서, 별표 "*" 그룹은 ZFN 절단 부위의 3' 결실을 표시하며; 별표 "*"가 없는 그룹은 ZFN 절단 부위의 5' 결실을 표시하고; 이중 별표 "**"를 갖는 한 그룹은 ZFN 절단 부위의 5'과 3' 결실을 둘 다 표시한다. "M"은 DNA 마커를 상징한다.
도 14는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN을 갖는 상이한 세포 내 AAVS1 좌위에서 표적화된 5 kb 게놈 DNA 결실의 PCR 확인을 제시. K562, HCT116, U2OS, A549, HEK293, HepG2 및 MCF7 세포를 포함하는 모든 세포 샘플 내 대립유전자 PCR 단편의 결실은 303 bp의 예상된 크기를 가진다. "1"은 "올리고뉴클레오타이드 + ZFN"을 상징하고; "2"는 "올리고뉴클레오타이드만"을 상징하며; "3"은 "ZFN 만"을 상징하고; "M"은 DNA 마커를 상징한다. 예상된 야생형 대립유전자 PCR 단편은 5303 bp이며, 예상된 결실 대립유전자 PCR 단편은 303 bp이다.
도 15는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN을 갖는 K562 내 IRK4, RSK2 및 RSK4 좌위에서 표적화된 게놈 DNA 결실의 PCR 확인을 도시. 모든 세포 샘플 내 결실 대립유전자 PCR 단편은 각각 IRAK4 좌위에 대해 334 bp, RSK2 좌위에 대해 281 bp, 및 RSK4 좌위에 대해 190 bp의 예상된 크기를 가진다. "1"은 "올리고뉴클레오타이드 + ZFN"을 상징하며; "2"는 "올리고뉴클레오타이드만"을 상징하고; "3"은 "ZFN만"을 상징하며; "M"은 DNA 마커를 상징한다.
도 16은 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN을 갖는 세포 내 동시 표적화된 게놈 결실 및 삽입을 이루기 위한 대표적인 계획을 도시. 원위 결실 말단 지점 영역은 I로 지정되며, 표적화된 절단 부위 근처의 ZFN 결합 부위는 II로 지정된다. ssODN 공여체는 원위 결실과 서열 동일성을 가지는 영역(I'로 지정됨), 표적화된 절단 부위 근처의 ZFN 결합 부위와 서열 동일성을 가지는 영역(II로 지정됨), 및 loxP 서열(III으로 지정됨)을 포함한다. 정방향 프라이머(A) 및 역방향 프라이머(B) 옆의 영역 I 및 II는 표적화된 결실을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 프라이머 C는 ZFN 오른쪽의 결합 암(arm) 및 이웃하는 게놈 DNA에 대한 접합 부위에서 뉴클레오타이드를 포함하며, 정방향 프라이머(A) 및 역방향 프라이머 C는 표적화된 삽입을 확인하기 위하여 사용될 수 있다.
도 17은 도 16에 표시된 프라이머 A 및 B를 사용하는 결실 대립유전자(레인 6: AAVS1-ZFN 및 AAVS1-5kb ssODN)로부터 예상된 303 bp PCR 단편을 만든 5 kb 게놈 서열의 표적화된 결실의 PCR 확인을 도시. loxP 부위의 표적화된 삽입의 PCR 확인을 프라이머 A 및 C를 사용하여 레인 10에서 예상된 크기를 갖는 PCR 단편으로 도시하였다. 레인 1 및 레인 2는 DNA 마커를 표시하며; 레인 3은 GFP를 표시하고; 레인 4는 AAVS1 ZFN(mRNA) 만을 표시하며; 레인 5는 올리고뉴클레오타이드 공여체 만을 표시하고; 레인 6은 AAVS1 ZFN + 올리고뉴클레오타이드 공여체를 표시하며; 레인 7은 GFP를 표시하고; 레인 8은 AAVS1 ZFN(mRNA)을 표시하며; 레인 9는 올리고뉴클레오타이드 공여체만을 표시하고; 레인 10은 AAVS1 ZFN + 올리고뉴클레오타이드 공여체를 표시한다.
도 18은 5' 접합 서열(서열번호 29) 및 5' 접합에서 공여체 서열의 통합을 확인하는 서열 분석을 제시. 강조된 녹색의 서열은 PCR 증폭을 위해 사용한 프라이머를 나타내며(소문자는 시퀀싱 결과로부터 나오지 않음), 검정색 글자의 서열은 올리고뉴클레오타이드 공여체 내 존재하지 않은 마우스 Rosa26 플라스미드 서열을 나타내고; 파란색 글자의 서열은 올리고뉴클레오타이드 공여체 내 마우스 Rosa26 플라스미드 서열을 나타내며; 적색 글자의 서열은 올리고뉴클레오타이드 공여체 내 AAVS1 서열을 나타내고; 분홍색 글자의 서열은 올리고뉴클레오타이드 공여체 내 존재하지 않은 AAVS1 서열을 나타낸다.
도 19는 3' 접합 서열(서열번호 30) 및 3' 접합에서 공여체 서열의 통합을 확인하는 서열 분석을 제시. 강조된 녹색의 서열은 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머를 나타내며(소문자는 시퀀싱 결과로부터 나오지 않음), 검정색 글자의 서열은 올리고뉴클레오타이드 공여체 내 존재하지 않은 마우스 Rosa26 플라스미드 서열을 나타내고; 파란색 글자의 서열은 올리고뉴클레오타이드 공여체 내 마우스 Rosa26 플라스미드 서열을 나타내며; 적색 글자의 서열은 올리고뉴클레오타이드 공여체 내 AAVS1 서열을 나타내고; 분홍색 글자의 서열은 올리고뉴클레오타이드 공여체 내 존재하지 않은 AAVS1 서열을 나타낸다.
도 20은 공여체 서열 통합을 표시하는 크기 390 bp의 5' 접합 부위 PCR 단편(도 20a) 및 크기 309 bp의 3' 접합 부위 PCR 단편(도 20b)을 포함하는 2개의 ZFN(Z), 2개의 올리고뉴클레오타이드 공여체(O), 및 플라스미드 공여체(D)에 노출된 클론(Z+O+D)만을 도시.
도 21은 올리고뉴클레오타이드 서열 동일성(표적화된 서열을 가짐)과 10 kb 게놈 서열의 올리고-매개 표적화된 결실 효율의 관계를 도시. 10 kb 결실의 효율은 SYBR 그린 실시간 PCR로 측정되었다. 1 = 100% 동일성; 2=98% 동일성; 3=90% 동일성; 4=50% 동일성; 5= 음성 대조군.
도 22는 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN으로 매개되는 보편적 플라스미드 삽입 방법의 계획을 제시. ZFN은 이중-가닥 파손(double-strand break, DSB)을 만든다. 그 다음에 2개의 올리고뉴클레오타이드 공여체는 ZFN 절단 부위에 상보적인 부문을 사용하여 DSB 말단에 결합된다. 플라스미드 백본 서열에 대한 2개의 올리고뉴클레오타이드 공여체의 5' 말단 상에서 상동성은 (보편적이든 아니든) 원하는 플라스미드 서열의 말단 중 하나에서 플라스미드 공여체 내에 침입을 야기한다. DSB가 공여체 플라스미드를 사용하여 분해될 때, 공여체 플라스미드로부터 원하는 서열이 도입되며 ZFN 절단 부위에 삽입된다.
본 명세서는 표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산을 사용하는 내인성 염색체 서열의 편집 방법을 제공한다. 특히, 표적화 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내 표적화된 부위에서 이중-가닥 파손을 도입할 수 있고, 단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위의 적어도 한 측면 상에서 염색체 서열에 실질적인 서열 동일성을 가지는 영역을 포함한다. 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중-가닥 파손은 단일-가닥 핵산을 사용하는 상동성-관련 보수에 의해 보수되어, 해당 염색체 서열은 단일-가닥 핵산의 서열과 교환되고, 이에 의해 해당 염색체 서열을 편집한다. 편집된 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에 개시된 방법을 사용하는 염색체 서열 편집을 위한 적절한 시약을 포함하는 키트가 제공된다.
(I) 염색체 서열 편집 방법
본 명세서의 한 양태는 세포 내 적어도 하나의 내인성 염색체 서열의 편집 방법을 제공한다. 해당 방법은 (a) 적어도 하나의 표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산(해당 표적화 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내 표적화된 절단 부위에서 이중-가닥 파손을 도입할 수 있음), 및 (b) 표적화된 절단 부위의 적어도 한 측면 상에서 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 적어도 하나의 단일-가닥 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 해당 방법은 추가로 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중-가닥 파손이 상동성-관련 과정에 의해 보수되는 조건 하에서 세포를 유지하여 염색체 서열이 단일-가닥 핵산의 서열로 교환되고, 이에 의해 염색체 서열을 편집하는 단계를 포함한다. 해당 방법의 성분은 이하에 상세하게 설명한다.
(a) 표적화 엔도뉴클레아제
해당 방법은 적어도 하나의 표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 해당 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 표적화 엔도뉴클레아제는 특이적 이중-가닥 염색체 DNA 서열을 인식하고 결합하며, 염색체 서열 내 표적화된 절단 부위에서 이중-가닥 파손을 도입하는 독립체이다. 표적화 엔도뉴클레아제는 자연적으로 발생하는 단백질 또는 유전자조작된 단백질일 수 있다. 대안적으로, 해당 표적화 엔도뉴클레아제는 단백질(예를 들어, 인공 표적화된 DNA 이중가닥 파손 유발제)을 함유하지 않을 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제의 유형을 다를 수 있고, 다를 것이다. 일부 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제일 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제 또는 호밍 엔도뉴클레아제일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 전사 활성자-유사 효과기(transcription activator-like effector, TALE)-뉴클레아제일 수 있다. 추가 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 부위-특이적 뉴클레아제일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 파손 유발제일 수 있다.
(i) 아연 핑거 뉴클레아제
한 실시형태에서, 세포 내로 도입된 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease, ZFN)일 수 있다. 전형적으로 아연 핑거 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인(즉, 아연 핑거) 및 절단 도메인(즉, 뉴클레아제)을 포함하며, 이들은 둘 다 이하에 기재된다.
아연 핑거 결합 도메인. 아연 핑거 결합 도메인은 유전자조작되어 선택의 임의의 핵산 서열을 인식하고 결합할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141 ; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 및 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814]을 참조할 수 있다. 유전자조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연적으로 발생하는 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 유전자조작 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 합리적 설계 및 다양한 선택 유형을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어 이중선, 삼중선, 및/또는 사중선 뉴클레오타이드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하는데, 이들 각각의 이중선, 삼중선 또는 사중선 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중선 또는 사중선 서열과 결합되는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하며, 이들 명세서는 그들의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 예를 들어, 미국특허 제6,453,242호에 기재된 알고리즘은 사전선택된 서열을 표적화하는 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위하여 사용될 수 있다. 대안적 방법, 예컨대 비축퇴성 인식 암호표를 사용하는 합리적 설계가 또한 특이적 서열을 표적화하는 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위하여 사용될 수 있다(Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081). DNA 서열 내 잠재적 표적 부위를 확인하고 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위하여 공공연하게 이용가능한 웹-기반 툴은 각각 http://www.zincfingertools.org 및 http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/에서 발견될 수 있다(Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605).
아연 핑거 결합 도메인은 길이로 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 21개의 뉴클레오타이드, 또는 바람직하게는 길이로 약 9개의 뉴클레오타이드 내지 약 18개의 뉴클레오타이드의 범위에 있는 DNA 서열과 결합하고 인식하도록 설계될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 아연 핑거 뉴클레아제의 아연 핑거 결합 도메인은 적어도 3개의 아연 핑거 인식 영역(즉, 아연 핑거)을 포함한다. 한 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 4개의 아연 핑거 인식 영역을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 5개의 아연 핑거 인식 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 6개의 아연 핑거 인식 영역을 포함할 수 있다. 아연 핑거 결합 도메인은 임의의 적합한 표적 DNA 서열에 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 6,607,882호; 제6,534,261호 및 제6,453,242호를 참조하며, 이들 명세서는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로 포함된다.
아연 핑거 인식 영역의 대표적인 선택 방법은 파지 디스플레이 및 2개의-혼성 시스템을 포함할 수 있으며, 이는 미국특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되며, 이들은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 추가로, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 WO 02/077227에 기재되었다.
아연 핑거 결합 도메인 및 설계 방법 및 융합 단백질(및 이것을 암호화하는 폴리펩타이드)의 구성은 당업계에 공지되어 있으며, 미국특허 출원 공개번호 제20050064474호 및 제20060188987호에서 상세하게 기재되고, 이것들 각각은 그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 아연 핑거 인식 영역 및/또는 복수-핑거 아연 영역 단백질은, 예를 들어 길이로 5개 이상의 아미노산의 링커를 포함하는 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 길이로 6개 이상의 링커 서열의 비-제한적 예에 대해, 미국특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조하며, 이들의 명세서는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 본 명세서에 기재된 아연 핑거 결합 도메인은 단백질의 개개의 아연 핑거 사이에 적합한 링커의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 핵 국한 신호 또는 서열(nuclear localization signal 또는 sequence, NLS)을 추가로 포함할 수 있다. NLS는 염색체 내 표적 서열에서 이중 가닥 파손을 도입하기 위하여 핵 내로 아연 핑거 뉴클레아제 단백질의 표적화를 용이하게 하는 아미노산 서열이다. 핵 국한 신호는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027]을 참조한다.
절단 도메인 . 아연 핑거 뉴클레아제는 또한 절단 도메인을 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인 일부는 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인으로부터 유래될 수 있는 엔도뉴클레아제의 비제한적 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[2002-2003 Catalog, New England Biolabs, Beverly, Mass.; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388] 또는 www.neb.com을 참조할 수 있다. DNA를 절단하는 추가적인 효소는 공지되어 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코컬(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). 또한 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993]을 참조한다. 이들 효소(또는 이들의 기능적 단편) 중 하나 이상은 절단 도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
절단 도메인은 또한 절단 활성에 대한 다이머화에 필요한 상기 기재한 바와 같은 효소 또는 이들의 일부로부터 유래될 수 있다. 2개의 아연 핑거 뉴클레아제는 절단에 필요할 수 있는데, 각각의 뉴클레아제가 활성 효소 다이머의 모노머를 포함하기 때문이다. 대안적으로, 단일 아연 핑거 뉴클레아제는 활성 효소 다이머를 만들기 위하여 모노머를 둘 다 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "활성 효소 다이머"는 핵산 분자를 절단할 수 있는 효소 다이머이다. 2개의 절단 모노머는 동일 엔도뉴클레아제(또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있으며, 또는 각각의 모노머는 상이한 엔도뉴클레아제(또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다.
2개의 절단 모노머가 사용되어 활성 효소 다이머를 형성할 때, 각각의 인식 부위에 대한 2개의 아연 핑거 뉴클레아제의 결합이, 예를 들어 다이머화에 의해 절단 모노머가 활성 효소 다이머를 형성하도록 하는 서로에 대한 공간적 배향에 절단 모노머를 위치시키도록 2개의 아연 핑거 뉴클레아제에 대한 인식 부위가 바람직하게 배치된다. 결과로서, 인식 부위의 근처 에지는 약 5 내지 약 18개의 뉴클레오타이드로 분리될 수 있다. 예를 들어, 근처 에지는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오타이드로 분리될 수 있다. 그러나 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍의 임의의 정수는 2개의 인식 부위(예를 들어, 약 2 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 쌍 또는 그 이상)에 있을 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어 본 명세서에서 상세하게 기재되는 것과 같은 아연 핑거 뉴클레아제의 인식 부위의 근처 에지는 6개의 뉴클레오타이드로 분리될 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 인식 부위 사이에 놓여있다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에 존재하며, (인식 부위에서) DNA에 서열-특이적 결합을 할 수 있으며, 결합 부위에서 또는 결합 부위 근처에서 DNA를 절단한다. 특정 제한 효소(예를 들어 유형 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 FokI는 하나의 가닥 상에서 그것의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오타이드에서 및 나머지 가닥 상에서 그것의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호;뿐만 아니라 문헌[Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31, 978-31, 982]을 참조할 수 있다. 따라서, 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터 유래된 절단 도메인 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 이는 유전자조작될 수도 있고 아닐 수도 있다. 대표적인 유형 IIS 제한 효소는 국제특허 공개 WO 07/014,275에 기재되며, 이 명세서는 그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 추가적인 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하며, 이들은 또한 본 명세서에 의해 고려된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]를 참조할 수 있다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 대표적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이 특정 효소는 다이머로서 활성이다(Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575).
따라서, 본 명세서의 목적을 위하여, 아연 핑거 뉴클레아제에 사용된 FokI 효소의 일부는 절단 모노머로 생각된다. 따라서, FokI 절단 도메인을 사용하는 표적화된 이중-가닥 절단에 대해, 2개의 아연 핑거 뉴클레아제(각각은 FokI 절단 모노머를 포함함)는 활성 효소 다이머를 재구성하기 위하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 모노머를 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자가 또한 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 해당 절단 도메인은, 예를 들어 각각 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 미국특허 공개번호 20050064474호, 20060188987호, 및 20080131962호에서 기재되는 바와 같은 호모다이머화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 유전자조작된 절단 모노머를 포함할 수 있다. 비제한적 예의 방법으로서, FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서 아미노산 잔기는 FokI 절단 절반-도메인의 다이머화에 영향을 미치는 모든 표적이다. 절대 헤테로다이머를 형성하는 FokI의 대표적인 유전자조작 절단 모노머는 제1 절단 모노머가 FokI의 아미노산 잔기 위치 490 및 538에서 돌연변이를 포함하고 제2 절단 모노머가 아미노산 잔기 위치 486 및 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시형태에서, 아미노산 위치 490에서 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)으로 대체하며; 아미노산 잔기 538에서 돌연변이는 Iso(I)을 Lys(K)으로 대체하고; 아미노산 잔기 486에서 돌연변이는 Gln(Q)을 Glu(E)으로 대체하며; 위치 499에서 돌연변이는 Iso(I)을 Lys(K)으로 대체한다. 구체적으로는, 유전자조작된 절단 모노머는 "E490K:I538K"로 표기되는 유전자조작된 절단 모노머를 생성하기 위하여 하나의 절단 모노머 내 위치 490에서 E를 K로 및 위치 538에서 I를 K로 돌연변이시키고, "Q486E:I499L"로 표기되는 유전자조작된 절단 모노머를 생성하기 위하여 다른 절단 모노머 내 위치 486에서 Q를 E로 및 위치 499에서 I를 L로 돌연변이시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 기재한 유전자조작된 절단 모노머는 비정상적 절단이 최소화되거나 없어지는 절대 헤테로다이머 돌연변이이다. 유전자조작된 절단 모노머는 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국특허 공개번호 20050064474호에 기재된 것과 같은 야생형 절단 모노머(FokI)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
( ii ) 다른 표적화 엔도뉴클레아제
다른 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제는 거대 인식 부위를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이며, 즉 인식 부위는 일반적으로 약 12개의 염기쌍 내지 약 40개의 염기쌍의 범위에 있다. 이 필요조건의 결과로서, 해당 인식 부위는 일반적으로 임의의 주어진 게놈 내에서만 1회 생긴다. 메가뉴클레아제 중에서 호밍 엔도뉴클레아제의 LAGLIDADG 패밀리는 게놈 및 게놈 유전자조작 연구를 위한 가치있는 도구가 되었다. 메가뉴클레아제는 당업자에게 잘 공지된 기법을 사용하여 그것의 인식 서열을 변형함으로써 특정 염색체 서열에 대해 표적화될 수 있다.
추가 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 전사 활성자-유사 효과기(TALE) 뉴클레아제일 수 있다. TALE는 새로운 DNA 표적에 결합하기 위하여 용이하게 유전자조작될 수 있는 식물 병원체 산토모나스(Xanthomonas)로부터 유래된 전사 인자이다. TALE 또는 이것의 절단된 형태는 FokI와 같은 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인에 연결되어 TALE 뉴클레아제 또는 TALEN으로 불리는 표적화 엔도뉴클레아제를 만들 수 있다.
또한 다른 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 부위-특이적 뉴클레아제일 수 있다. 특히, 부위-특이적 뉴클레아제는 인식 서열이 게놈 내에서 드물게 생기는 "래어-커터(rare-cutter)" 엔도뉴클레아제일 수 있다. 바람직하게는, 부위-특이적 뉴클레아제의 인식 서열은 단지 게놈 내에서 1회 생긴다.
또 다른 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 파손 유발제(또한 인간 제한 DNA 커터로 불림)일 수 있다. 예를 들어, 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 파손 유발제는 표적화된 절단 부위에 상보적인 DNA 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드를 절단하는 금속/킬레이터 복합체를 포함할 수 있다. 따라서 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 파손 유발제는 임의의 단백질을 함유하지 않는다. 금속/킬레이터 복합체의 금속은 세륨, 카드뮴, 코발트, 크롬, 구리, 철, 마그네슘, 망간, 아연 등일 수 있다. 금속/킬레이터 복합체의 킬레이터는 EDTA, EGTA, BAPTA 등일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 금속/킬레이터 복합체는 Ce(IV)/EGTA일 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 파손 유발제는 Ce(IV)/EGTA 및 2가닥의 가짜-상보적 펩타이드 핵산(pseudo-complementary peptide nucleic acid, PNA)의 복합체를 포함할 수 있다(Katada et al., Current Gene Therapy, 2011, 11 (1):38-45).
( iii ) 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산
일부 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 핵산으로서 세포 내에 도입될 수 있되, 그 다음에 세포는 표적화 엔도뉴클레아제를 발현하고 생성한다. 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. RNA는 전령 RNA일 수 있으며, 해당 mRNA는 5' 캡핑되고, 폴리아데닐화되며, 또는 둘 다일 수 있다. 일반적으로, 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산은 프로모터 제어 영역에 작동가능하게 연결될 것이다. 대조군 영역은 구성적 또는 유도성일 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산(및 그것의 연결된 제어 영역)은 플라스미드 등과 같은 벡터로서 세포 내에 도입될 수 있다. 대안적으로, 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산(및 그것의 연결된 제어 영역)은 선형 분자로서 세포 내에 도입될 수 있다.
(b) 단일-가닥 핵산
(i) 일반적 특성
본 방법은 표적화된 절단 부위의 적어도 한 측면 상에서 염색체 서열과 실직적인 서열 동일성을 가지는 영역을 포함하는 적어도 하나의 단일-가닥 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나의 단일-가닥 핵산이 세포 내로 도입된다. 다른 실시형태에서, 2개의 단일-가닥 핵산이 세포 내로 도입된다. 추가 실시형태에서, 3개 이상의 단일-가닥 핵산이 세포 내로 도입된다.
어구 "실질적 서열 동일성"은 올리고뉴클레오타이드가 표적화된 염색체 서열과 적어도 약 75% 서열 동일성을 가지는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적화된 염색체 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 추가적으로, 단일-가닥 핵산은 일반적으로 표적화된 절단 부위의 적어도 한 측면 상에서 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드와 실질적인 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위의 적어도 한 측면 상에서 약 15개 뉴클레오타이드, 약 20개 뉴클레오타이드, 약 25개 뉴클레오타이드, 30개 뉴클레오타이드, 40개 뉴클레오타이드, 50개 뉴클레오타이드, 100개 뉴클레오타이드, 100개 초과의 뉴클레오타이드에 대해 실질적인 서열 동일성을 가질 수 있다.
세포 내에 도입된 단일-가닥 핵산의 길이는 다를 수 있고, 다를 것이다. 예를 들어, 단일-가닥 핵산은 길이로 약 20개 뉴클레오타이드 내지 길이로 약 200,000개 뉴클레오타이드의 범위에 있을 수 있다. 다양한 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 길이로 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 길이로 약 100개 뉴클레오타이드 내지 약 1000 뉴클레오타이드, 길이로 약 1000개 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개 뉴클레오타이드, 길이로 약 10,000개 뉴클레오타이드 내지 약 100,000개 뉴클레오타이드, 길이로 약 100,000개 뉴클레오타이드 내지 약 200,000개 뉴클레오타이드의 범위에 있을 수 있다.
일부 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 선형일 수 있다. 다른 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 원형일 수 있다(예를 들어 당업자에게 공지된 파지 방법으로 제조됨). 단일-가닥 핵산은 관심의 염색체 서열에 대해 센스 또는 안티-센스일 수 있다.
단일-가닥 핵산의 조성은 다를 수 있고, 다를 것이다. 핵산의 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합일 수 있다. 뉴클레오타이드는 표준 뉴클레오타이드(즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘 및 유리딘) 또는 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 리보스 모이어티를 가지는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 뉴클레오타이드 유사체는 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드(예를 들어, 이노신) 또는 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드일 수 있다. 뉴클레오타이드의 당 또는 염기 모이어티 상에서 변형의 비제한적 예는 아세틸기, 아미노기, 카복실기, 카복시메틸기, 하이드록실기, 메틸기, 포스포릴기, 및 티올기의 첨가(또는 제거)뿐만 아니라 염기의 탄소 및 질소 원자의 다른 원자로 치환(예를 들어, 7-데아자 퓨린)을 포함한다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 다이데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA), 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 및 모폴리노를 포함한다. 단일-가닥 핵산의 뉴클레오타이드는 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트, 포스포르아미다이트, 포스포로다이아미데이트 결합, 또는 이들의 조합에 의해 연결될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다.
( ii ) 바람직한 단일-가닥 핵산
한 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 자리의 상류측면에서 염색체 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1영역 및 표적화된 절단 부위의 하류측면에서 염색체 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2영역을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 1 및 도 4). 이 실시형태의 다양한 반복에서, 단일-가닥 핵산은 염색체 서열에 대해 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변화를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 핵산은 일반적으로 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는 이들의 조합을 포함할 것이다. 다양한 반복에서, 단일-가닥 핵산은 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 변화를 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오타이드 변화의 결과로서, 편집된 염색체 서열은 변경된 서열 또는 소 돌연변이를 포함할 수 있어서, 변형된 유전자 생성물이 생성되고, 유전자 생성물 등은 생성되지 않는다.
대안의 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위의 측면 중 하나와 실질적인 서열 동일성을 가지는 제1 및 제2영역에 연접한 (flanked) 외인성 서열을 포함할 수 있다(상기 기재한 바와 같음). 결과적으로, 편집된 염색체 서열은 통합된 외인성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "외인성"은 염색체 위치에 정상적으로 위치되지 않은 어떤 서열을 지칭한다. 예를 들어, 외인성 서열은 다른 유기체로부터의 "유전자", 동일 유기체로부터의 "유전자"의 추가적인 복제물, 인공적 서열, 리포터 분자를 암호화하는 서열 등일 수 있다.
다른 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위의 한 측면 상에서 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1영역 및 표적화된 절단 부위에 대해 원위인 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2영역을 포함할 수 있다(도 12 참조). 원위 염색체 서열은 표적화된 절단 부위의 상류 또는 하류일 수 있고; 원위 염색체 서열은 표적화된 절단 부위로부터 약 20개 염기쌍 내지 약 1,000,000개 염기쌍으로 떨어져서 위치될 수 있다. 예를 들어, 원위 염색체 서열은 표적화된 절단 부위의 (상류 또는 하류의) 약 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 또는 1,000 킬로 염기쌍일 수 있다. 결과로서, 편집된 염색체 서열은 약 1,000,000개까지의 염기쌍의 결실을 포함할 수 있다. 이 실시형태의 한 반복에서, 단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위의 하류에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1영역 및 표적화된 절단 부위의 상류에 위치된 원위 염색체 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2영역을 포함할 수 있되, 해당 편집된 염색체는 표적화된 절단 부위에 대해 상류(또는 5') 결실을 포함할 수 있다. 이 실시형태의 다른 반복에서, 단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위의 상류 측면과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1영역 및 표적화된 절단 부위의 하류에 위치된 원위 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2영역을 포함할 수 있되, 해당 편집된 염색체는 표적화된 절단 부위에 대해 하류의(또는 3') 결실을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위의 한 측면 상에서 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1영역 및 표적화된 절단 부위에 대한 원위인 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2영역에 연접한 외인성 서열을 포함할 수 있다(상기 기재한 바와 같음). 이 실시형태에서, 편집된 염색체 서열은 표적화된 절단 부위에서 결실뿐만 아니라 외인성 서열의 통합을 포함할 수 있다(도 16 참조). 외인성 서열의 동일성은 다를 수 있고, 다를 것이다. 예를 들어, 외인성 서열은 다른 유기체로부터의 "유전자", 동일 유기체로부터의 "유전자"의 추가적인 복제물, 리포터 분자 등일 수 있다.
(c) 선택적인 공여체 폴리뉴클레오타이드
특정 실시형태에서, 해당 방법은 세포에 적어도 하나의 공여체 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 공여체 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 절단 부위에서 염색체 서열 내로 통합을 위한 서열을 포함하되, 통합을 위한 서열은 제1서열 및 제2서열 옆에 있고, 이들 각각은 단일-가닥 핵산의 일부와 실질적인 서열 동일성을 가진다. 따라서, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 제1단일-가닥 핵산 및 제2단일-가닥 핵산(및 적어도 하나의 표적화 엔도뉴클레아제)과 함께 도입된다. 제1단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위의 상류와 실질적인 서열 동일성을 가지는 제1부분, 및 공여체 폴리뉴클레오타이드 내 제1서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2부분을 포함한다. 제2단일-가닥 핵산은 표적화된 절단 부위 하류 측면과 실질적인 서열 동일성을 가지는 제1부분, 및 공여체 폴리뉴클레오타이드 내 제2서열과 실질적인 서열 동일성을 가지는 제2부분을 포함한다.
공여체 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체 등을 포함할 수 있다. 게다가, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 원형 또는 선형일 수 있다. 전형적으로, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 DNA일 것이다. 예를 들어, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome, BAC), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome, YAC), 바이러스 벡터 등일 수 있다. 공여체 폴리뉴클레오타이드는 복제원점, 선택 마커, 복수의 클로닝 부위 등을 추가로 포함할 수 있다. 공여체 폴리뉴클레오타이드의 크기는 다를 수 있고, 다를 것이다. 예를 들어, 공여체 뉴클레오타이드는 약 1 킬로염기(kilobase, kb) 내지 약 200kb의 범위에 있을 수 있다. 한 실시형태에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 관심의 단백질을 암호화하는 인간 DNA 서열의 엑손 및 인트론 서열의 약 100kb를 포함할 수 있다.
(d) 세포
해당 방법은 세포 내에 상기 기재한 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 및 핵산(들)을 도입하는 단계를 포함한다. 다양한 세포가 해당 방법에서 사용에 적합하다. 일반적으로, 세포는 진핵 세포 또는 단세포 진핵 유기체일 것이다. 일부 예에서, 세포는 배양된 세포, 1차 세포, 불멸 세포일 수 있다. 적합한 세포는 진균 또는 효모, 예컨대 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces); 곤충 세포, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터의 SF9 세포 또는 노랑초파리(Drosophila melanogaster)로부터의 S2 세포; 및 동물 세포, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 비-인간 영장류, 또는 인간 세포일 수 있다. 대표적인 세포는 포유류이다. 포유류 세포는 1차 세포일 수 있다. 일반적으로, 이중가닥 파손에 민감한 임의의 1차 세포가 사용될 수 있다. 세포는 다양한 세포 유형, 예를 들어 섬유아세포, 근원세포, T 또는 B 세포, 대식세포, 상피세포 등을 가질 수 있다.
포유류 세포주가 사용될 때, 세포주는 임의의 확립된 세포주 또는 아직 기재되지 않은 1차 세포주일 수 있다. 세포주는 인접 또는 비인접일 수 있고, 또는 세포주는 당업자에게 공지된 표준 기법을 사용하여 인접, 비인접 또는 기관형( organotypic) 성장을 조장하는 조건 하의 성장일 수 있다. 적합한 포유류 세포주의 비제한적 예는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 계통(COS7), 인간 배아 신장 계통 293, 새끼 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney cell, BHK), 마우스 세르톨리세포(TM4), 원숭이 신장 세포(CVI-76), 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO), 인간 자궁경부암 세포(HeLa), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 신장 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양 세포(MMT), 래트 간암세포(hepatoma cell, HTC), HIH/3T3 세포, 인간 U2-OS 골육종 세포, 인간 A549 세포, 인간 K562 세포, 인간 HEK293 세포, 인간 HEK293T 세포, 인간 HCT116 세포, 인간 MCF-7 세포, 및 TRI 세포를 포함한다. 포유류 세포주의 광범위한 목록에 대해, 당업자는 미국종균협회 카탈로그(American Type Culture Collection, 버지니아주 마마사스에 소재한 ATCC(등록상표))를 지칭할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 세포는 줄기 세포일 수 있다. 적합한 줄기 세포는 배아 줄기 세포, ES-유사 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중복성 줄기 세포, 소기능(oligopotent) 줄기 세포, 및 단일분화성(unipotent) 줄기 세포일 수 있다.
추가 실시형태에서, 세포는 단세포 배아일 수 있다. 배아는 척추동물 또는 무척추동물일 수 있다. 적합한 척추동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류 및 어류를 포함한다. 적합한 포유류의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 설치류, 반려 동물, 가축 및 비-영장류를 포함한다. 설치류의 비-제한적 예는 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 및 기니아 피그를 포함한다. 적합한 반려 동물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 고양이, 개, 토끼, 고슴도치 및 페럿을 포함한다. 가축의 비제한적 예는 말, 염소, 양, 백조, 소, 라마 및 알파카를 포함한다. 적합한 비-영장류는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 꼬리감기원숭이, 침팬지, 여우원숭이, 마카크, 마모셋원숭이, 타마린, 거미원숭이, 다람쥐원숭이, 및 버빗원숭이를 포함한다. 조류의 비제한적 예는 닭, 칠면조, 오리, 및 거위를 포함한다. 대안적으로, 동물은 곤충, 선형동물 등과 같은 무척추동물일 수 있다. 곤충의 비제한적 예는 초파리 및 모기를 포함한다.
(e) 세포에의 전달
상기 기재된 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 및 핵산(들)은 다양한 수단에 의해 세포 내에 도입될 수 있다. 적합한 전달 수단은 미세주사법, 전기천공법, 초음파천공, 유전자총, 인산칼슘-매개 트랜스펙션, 양이온성 트랜스펙션, 리포좀 트랜스펙션, 덴드리머 트랜스펙션, 열 충격 트랜스펙션, 뉴클레오펙션 트랜스펙션, 마그네토펙션, 리포펙션, 임팔레펙션, 광학 트랜스펙션, 등록상표 작용제-핵산의 향상된 섭취, 및 리포좀을 통한 전달, 면역리포좀, 바이로좀, 또는 인공 비리온을 포함한다. 한 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 및 핵산(들)은 뉴클레오펙션에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 및 핵산(들)은 미세주사법에 의해 세포(예를 들어 단세포 배아) 내로 도입될 수 있다. 표적화 엔도뉴크렐아제 분자(들) 및 핵산(들)은 세포의 핵 또는 세포질 내로 미세주사될 수 있다.
하나 이상의 표적화 엔도뉴클레아제 분자 및 하나 이상의 단일-가닥 핵산이 세포 내로 도입되는 실시형태에서, 분자는 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 표적화된 절단 부위에 각각 특이적인 표적화 엔도뉴클레아제 분자뿐만 아니라 대응하는 단일-가닥 핵산(들)은 동시에 도입될 수 있다. 대안적으로, 각 표적화 엔도뉴클레아제 분자뿐만 아니라 대응하는 단일-가닥 핵산(들)은 순차적으로 도입될 수 있다. 선택적 공여체 폴리뉴클레오타이드는 유사하게 도입될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 대 단일-가닥 핵산(들)의 비는 다를 수 있고, 다를 것이다. 일반적으로, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 대 핵산(들)의 비는 약 1:10 내지 약 10:1의 범위에 있을 수 있다. 다양한 실시형태에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 대 핵산(들)의 비는 약 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1일 수 있다. 한 실시형태에서, 비는 약 1:1일 수 있다.
(f) 세포의 배양
해당 방법은 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중-가닥 파손이 염색체 서열이 편집되도록 단일-가닥 핵산(들)을 사용하는 상동성-관련 과정에 의해 보수될 수 있는 적합한 조건 하에 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산(들)이 세포 내로 도입되는 실시형태에서, 해당 방법은 세포가 표적화 엔도뉴클레아제를 발현시키기에 적합한 조건 하에 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 세포는 세포에 적합한 조건 하에서 유지될 것이다. 적합한 세포 배양 조건은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; 및 Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306]에 기재되어 있다. 당업자는 세포를 배양하기 위한 방법이 당업계에 공지되어 있고 세포 유형에 따라서 다를 것이라는 것을 인식한다. 일상적인 최적화가 모든 경우에 사용되어 특정 세포 유형에 대한 최상의 기법을 결정할 수 있다.
세포가 단세포인 실시형태에서, 배아는 시험관내에서(예를 들어, 세포 배양물 내) 배양될 수 있다. 전형적으로 배아는 적절한 온도에서 및 이중-가닥 파손을 보수하고 배아를 발생시키는데 필요한 O2/CO2 비를 갖는 적절한 배지 내에서 배양된다. 배지의 적합한 비-제한적 예는 M2, M16, KSOM, BMOC, 및 HTF 배지를 포함한다. 당업자는 배양 조건이 배아 종에 따라서 다를 수 있고 다를 것이라는 것을 인식할 것이다. 일상적인 최적화가 모든 경우에 사용되어 특정 배아 종에 대한 최상의 배양 조건을 결정할 수 있다. 일부 예에서, 배아는 또한 암컷 숙주의 자궁 내로 배아를 전달함으로써 생체 내에서 배양될 수 있다. 일반적으로 말해서, 암컷 숙주는 배아와 동일 또는 유사한 종으로부터 유래된다. 바람직하게는, 암컷 숙주는 거짓-임신이다. 거짓-임신 암컷 숙주의 제조방법은 당업계에 알려져 있다. 추가적으로 암컷 숙주 내로 배아를 전달하는 방법은 공지되어 있다. 생체내 배아의 배양은 배아가 발생되도록 하며 배아로부터 유래된 동물의 정상출산을 초래할 수 있다.
과정의 이런 단계 동안, 표적화 엔도뉴클레아제(일부 경우에 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 도입된 핵산으로부터 발현됨)는 염색체 서열 내 표적화된 절단 부위에서 이중-가닥 파손을 인식하고, 결합하며 만든다. 염색체 서열 내 이중-가닥 파손은 단일-가닥 핵산에 의한 상동성 재조합을 통해 보수되어, 핵산 서열은 염색체 서열로 교환된다. 핵산 서열은 물리적으로 통합될 수 있고, 또는 대안적으로 핵산 서열은 염색체 서열의 편집을 초래하는 파손의 보수를 위한 주형으로 사용될 수 있다.
염색체 서열의 표적화된 편집 빈도는 다양한 인자에 따라서 다를 수 있고, 다를 것이다. 일부 실시형태에서, 편집 빈도는 약 0.01%, 0.03%, 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10%, 또는 30% 초과일 수 있다. 편집된 염색체 서열을 포함하는 단일 세포 클론은 당업계에 잘 공지된 기법을 사용하여 분리될 수 있다. 당업자는 편집된 염색체 서열에 대해 동형 접합적인 세포를 만드는 방법에 익숙하다. 다른 방법으로 언급하면, 세포는 편집된 염색체 서열에 이형 접합적 또는 동형 접합적일 수 있다.
편집된 염색체 서열은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나의 뉴클레오타이드는 다른 뉴클레오타이드로 치환됨), 하나 이상의 결실 및/또는 하나 이상의 삽입을 포함할 수 있다. 점 돌연변이는 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 또는 잠재 돌연변이일 수 있다. 결실은 약 1개의 염기쌍 내지 약 500 킬로염기 쌍의 범위에 있을 수 있고, 삽입은 약 1개의 염기쌍 내지 약 200 킬로염기 쌍의 범위에 있을 수 있다.
따라서, 편집된 염색체 서열은 변형된 유전자 생성물(즉, 단백질 또는 비-암호화 RNA)을 생기게 할 수 있다. 예를 들어, 편집된 염색체 서열이 단백질 암호화 영역 내에 놓여 있는 실시형태에서, 얻어진 단백질은 적어도 하나의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 변형된 염색체 서열은 변형된 비-암호화 RNA를 생기게 할 수 있고, 또는 변형된 염색체 서열은 변경된 조절 기능을 가질 수 있다.
대안적으로, 편집된 염색체 서열은 비활성화되어 기능적 유전자 생성물이 생성되지 않을 수 있다(또는 조절 영역의 기능이 제거될 수 있다). 예를 들어, 편집된 염색체 서열이 단백질 암호화 영역 내에 놓여 있는 실시형태에서, 점 돌연변이(들), 결실(들), 및/또는 삽입(들)은 조숙 정지 코돈, 분할-자리 접합 돌연변이, 및/또는 틀 이동 돌연변이를 도입하여 기능적 단백질이 생성되지 않도록 할 수 있다.
편집 염색체 서열이 삽입을 포함하는 실시형태에서, 삽입된 서열은 펩타이드, 단백질, 단백질 도메인, 단백질 단편, 단백질 서브유닛, 단백질 태그 등을 암호화할 수 있다. 대안적으로, 삽입된 서열은 제한 엔도뉴클레아제 인식 측면을 제공하고, 비-암호화 RNA를 암호화하며, 마이크로RNA 결합 자리를 포함하고, 또는 전사 대조군 요소로 작용할 수 있다.
( II ) 적어도 하나의 편집된 염색체 서열을 포함하는 세포
본 명세서의 다른 양태는 적어도 하나의 편집된 염색체 서열을 포함하는 세포를 제공하되, 해당 염색체 서열은 부문 (I)에서 상기 기재한 방법으로 편집된다. 적합한 세포는 부문 (I)(d)에서 상기 기재된다.
( III ) 키트
추가 양태는 세포 내 염색체 서열을 편집하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 (a) 적어도 하나의 표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제(해당 표적화 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내 표적화된 절단 부위에서 이중-가닥 파손을 도입할 수 있음), 및 (b) 표적화된 절단 부위의 적어도 한 측면 상에서 염색체 서열에 실질적인 서열 동일성을 가지는 제1부분을 포함하는 적어도 하나의 단일-가닥 핵산을 암호화하는 핵산을 포함한다. 따라서, 키트는 상기 부문 (I)에 기재한 방법을 사용하여 염색체 서열을 편집하는 수단을 제공한다.
키트는 표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산을 사용하는 게놈 편집을 위한 개시된 방법을 실행하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 하나 이상의 별개의 조성물로서 또는, 선택적으로 시약의 호환성이 허용되는 혼합물로서 시약을 보유하는 하나 이상의 용기를 갖는 포장을 포함한다. 또한 키트는 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질(들), 예컨대 완충제(들), 희석제(들), 배양배지/배지들, 표준(들), 및/또는 게놈 편집 방법의 임의의 단계를 처리하거나 수행하는데 유용한 임의의 다른 물질을 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 키트는 바람직하게는 부문 (I)에서 상기 기재된 것과 같은 염색체 서열을 편집하기 위한 설명서를 포함한다. 키트 내에 포함된 설명서는 재료를 포장하기 위해 고정될 수 있고, 또는 포장 삽입물로 포함될 수 있다. 설명서는 전형적으로 기록 또는 인쇄된 재료이지만, 그것들은 이것으로 제한되지 않는다. 이러한 설명서를 저장할 수 있고 그것을 마지막 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 명세서에 의해 생각된다. 이러한 매체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "설명서"는 설명서를 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
( IV ) 용도
본 명세서에 개시된 염색체 서열의 편집 방법은 다양한 용도를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 관심의 단백질 내로 표적화된 돌연변이를 도입할 연구 목적을 위하여 사용될 수 있고 변형된 단백질 기능이 시험될 수 있다. 해당 방법은 또한 단백질이 생성되지 않도록 단백질 암호화 서열을 비활성화하기 위하여 사용될 수 있되, 세포의 표현형 또는 세포를 포함하는 유기체가 시험될 수 있다. 추가적으로, 해당 방법은 연구 목적을 위하여 RNA 암호화 영역 또는 전사 제어 영역을 변형하거나 비활성화하기 위하여 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 염색체 서열의 거대 영역을 결실시키기 위하여/시키거나 외인성 핵산 서열을 통합하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 임상적 또는 치료적 목적을 위하여 사용될 수 있다. 즉, 해당 방법은 질병-원인 유전자 또는 염색체 서열을 보수하거나 수정하기 위하여 사용될 수 있다. 예로서, 겸상 적혈구병은 단일 뉴클레오타이드 변화(즉, β-글로빈 내 A에서 T 변화는 β-글로빈 단백질 내 글루타메이트에서 발린으로 변화를 초래함)에 의해 야기될 수 있다. 따라서, 본 명세서의 방법은 겸상 적혈구 체질 또는 겸상 적혈구병을 가지는 개체의 세포 내 β-글로빈 유전자에서 SNP를 수정하기 위하여 사용될 수 있다. 유사하게, 방법은 특정 질병 또는 질병 상태에서 중요한 역할을 하는 다른 유전자 또는 염색체 서열 내 스플라이스 접합 돌연변이, 결실, 삽입 등을 수정하기 위하여 사용될 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명에서 사용되는 다수 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본 명세서에 사용되는 다음의 용어는 달리 특정되지 않는다면 그것들에 속하는 의미를 가진다.
본 명세서 또는 이것의 바람직한 실시형태(들)의 구성요소를 도입할 때, 단수의 관사 및 "상기"는 하나 이상의 구성요소가 있다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는", "포함하는", "가지는"은 포괄적인 것으로 의도되며, 열거된 구성요소 이외의 추가적인 구성요소를 가질 수 있는 것을 의미한다.
용어 "편집" 또는 "게놈 편집"은 특이적 염색체 서열이 변경되는 과정을 언급한다. 편집된 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환을 포함할 수 있다. 편집된 변형 염색체 서열은 변형된 유전자 생성물(예를 들어, 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 변경된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-암호화 RNA 등)을 암호화할 수 있으며, 변형된 기능(예를 들어, 변경된 프로모터 기능, 변경된 인핸서 기능 등)을 제공하고, 유전자 생성물이 생기지 못하게 할 수 있으며(즉, 서열이 전사되지 않고/않거나 기능성 생성물이 만들어지지 않음), 조절 기능을 제공하지 못하고, 외인성 서열을 암호화하거나, 새로운 기능을 제공한다(즉, 조절 프로모터, 유도성 프로모터, 마이크로RNA 결합 부위 등으로서).
본 명세서에서 사용되는 용어 "내인성"은 세포에 본래 있는 염색체 서열을 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "외인성"은 특정 염색체 위치에서 보통 위치되지 않는 핵산 서열을 언급한다. 외인성 서열은 다른 유기체로부터 유래될 수 있고, 인공일 수 있으며, 또는 다른 염색체 위치에 존재하는 핵산 서열의 2중 복제물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자"는 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접하든 아니든, 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역(엑손 및 인트론을 포함)뿐만 아니라 유전자 생성물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을 언급한다. 따라서, 유전자는, 필수적으로 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 유입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 구성요소, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위, 및 좌위 제어 영역을 포함한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 선형 또는 원형 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 폴리머를 지칭한다. 본 명세서의 목적을 위하여, 이들 용어는 폴리머의 길이에 대한 제한으로서 이해되어서는 안 된다. 해당 용어는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(예를 들어 포스포로티오에이트 백본) 내 변형된 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가지며; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍일 것이다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호호환적으로 사용되어 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "표적 자리" 또는 "표적 서열"은 편집되는 염색체 서열의 일부를 정하며, 결합에 충분한 조건이 존재한다면 인식하고 결합하기 위하여 아연 핑거 뉴클레아제가 유전자조작되는 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "상류" 및 "하류"는 고정된 위치에 대한 핵산 서열 내 위치를 지칭한다. 상류는 위치에 대해 5'(즉 가닥의 5' 말단 근처)인 영역을 말하며, 하류는 위치에 3'(즉, 가닥의 3' 말단 근처)인 영역을 말한다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성의 결정 기법은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기법은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열 결정 단계 및/또는 이에 의한 암호화된 아미노산 서열의 결정 단계, 및 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 이들 서열을 비교하는 단계를 포함한다. 게놈 서열은 또한 이런 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 각각 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 아미노산-대-아미노산 대응을 말한다. 2 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 그것의 동일성%를 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산이든 아미노산 서열이든 두 서열의 동일성%는 2개의 일직선으로 된 서열 간의 정확한 매치 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한다. 핵산 서열에 대한 대략의 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 문헌[Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358], 미국 워싱턴 D.C.에 소재한 국립 생명의학 연구재단(National Biomedical Research Foundation)에 의해 개발된 스코어링 매트릭스를 사용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있고, 문헌[Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 정상화될 수 있다. 서열의 동일성%를 결정하기 위한 이 알고리즘의 대표적인 보충은 "BestFit" 유틸리티 적용에서 Genetics Computer Group(위스콘신주 매디슨에 소재)에 의해 제공된다. 서열 간의 동일성 또는 유사성%를 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어 다른 정렬 프로그램은 BLAST이며, 디폴트 변수와 함께 사용된다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 다음의 디폴트 변수를 사용하여 이용될 수 있다: 유전자 암호=표준; 필터=없음; 가닥=둘 다; 컷오프=60; 예상치=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50개 서열; 정렬=HIGH SCORE; 데이터베이스=비-다중, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+Swiss 단백질+Spupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 GenBank 웹사이트에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열에 대해, 서열 동일성의 원하는 정도의 범위는 대략 80% 내지 100% 및 그 사이에 있는 임의의 정수 값이다. 전형적으로 서열 간 동일성%는 적어도 70 내지 75%, 바람직하게는 80 내지 82%, 더 바람직하게는 85 내지 90%, 훨씬 더 바람직하게는 92%, 더욱 더 바람직하게는 95%, 및 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.
대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 동일성 정도는 서열 동일성 정도를 공유하는 영역 사이의 안정한 듀플렉스를 형성시키는 조건 하에 폴리뉴클레오타이드의 혼성화에 의한 다음, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제(들)에 의한 분해, 및 분해된 단편의 크기 결정으로 결정될 수 있다. 상기 방법을 사용하여 결정되는 바와 같이, 서열이 분자의 정해진 길이를 통해 적어도 약 70% 내지 75%, 바람직하게는 80% 내지 82%, 더 바람직하게는 85% 내지 90%, 훨씬 더 바람직하게는 92%, 더욱 더 바람직하게는 95%, 및 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성을 나타낼 때, 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은 서로 실질적으로 유사하다. 본 명세서에서 사용되는 실질적으로 유사한이란 또한 특정된 DNA 또는 폴리펩타이드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 지칭한다. 실질적으로 유사한 DNA 서열은 특정 시스템에 대해 정의되는 바와 같이, 예를 들어 엄격 조건 하에 사우던 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정하는 것은 당업자의 기술 내에 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 상기 참조; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press]를 참조할 수 있다.
2개의 핵산 단편의 선택적 혼성화는 다음과 같이 결정될 수 있다. 2개 핵산 분자 사이의 서열 동일성 정도는 이러한 분자 사이의 혼성화 사건의 효율 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자와 완전히 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로 억제할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화 억제는 당업계에 잘 공지된 혼성화 분석을 사용하여 평가될 수 있다(예를 들어, 사우던(DNA) 블롯, 노던(RNA) 블롯, 용액 혼성화 등, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조). 이러한 분석은 다양한 선택도를 사용하여, 예를 들어 낮은 내지 높은 엄격도로 다른 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 낮은 엄격 조건이 사용된다면, 비-특이적 결합의 부재는 서열 동일성의 부분적 정도조차 결여하는 2차 프로브(예를 들어, 표적 분자와 약 30% 미만의 서열 동일성을 가지는 프로브)를 사용하여 평가될 수 있으며, 비-특이적 결합 사건의 부재에서, 2차 프로브는 표적에 혼성화되지 않을 것이다.
혼성화-기반 검출 시스템을 이용할 때, 핵산 프로브는 기준 핵산 서열에 상보적으로 선택된 다음, 적절한 조건의 선택에 의해 프로브가 선택되고, 기준 서열을 서로 선택적으로 혼성화되거나 결합되어 듀플렉스 분자를 형성한다. 적당히 엄격한 혼성화 조건 하에 기준 서열에 대한 선택성을 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 대략 70% 서열 동일성을 가지는 길이로 적어도 약 10 내지 14개의 뉴클레오타이드의 표적 핵산 서열을 검출하는 조건 하에 전형적으로 혼성화한다. 엄격한 혼성화 조건은 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90 내지 95% 초과의 서열 동일성을 가지는 길이로 적어도 약 10 내지 14개의 뉴클레오타이드의 표적 핵산 서열을 검출하도록 한다. 프로브 및 기준 서열이 특정 정도의 서열 동일성을 가지는 경우 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 당업계에 공지된 바와 같이 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press]를 참조). 혼성화 조건은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
혼성화 엄격함은 혼성화 조건이 미스매치된 뉴클레오타이드를 함유하는 혼성체의 형성을 선호하지 않는 정도를 말하며, 더 높은 엄격함은 미스매치된 혼성체에 대한 더 낮은 용인과 관련된다. 혼성화의 엄격함에 영향을 미치는 인자는 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 온도, pH, 이온 강도, 및 예를 들어 포름아마이드 및 다이메틸설폭사이드와 같은 유기 용매의 농도를 포함한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 혼성화 엄격함은 더 높은 온도, 더 낮은 이온 강도 및 더 낮은 용매 농도에 의해 증가된다. 혼성화에 대한 엄격 조건에 대해서, 수많은 동등한 조건이 사용되어 다양한, 예를 들어 다음의 인자에 의해 특정 엄격함을 확립할 수 있다는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다: 서열의 길이 및 특성, 다양한 서열의 염기 조성, 염의 농도 및 다른 혼성화 용액 성분, 혼성화 용액 내 차단제의 존재 또는 부재(예를 들어, 덱스트란 설페이트, 및 폴리에틸렌 글라이콜), 혼성화 반응 온도 및 시간 변수뿐만 아니라 다양한 세척 조건. 혼성화 조건의 특정 설정은 당업계에서 다음의 표준 방법을 선택할 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
실시예
이하의 실시예가 본 발명을 설명하기 위하여 포함된다.
실시예 1: RSK2 키나제의 변형
다음의 실시예는 RSK2 키나제 좌위의 변형을 상세히 설명한다. 올리고뉴클레오타이드(125 nt)를 설계하여 RSK2 키나제 염색체 서열 내에 3개의 별개의 돌연변이를 포함시켰다. 올리고뉴클레오타이드는 하기를 포함하였다: (1) 비-상동성 말단-결합(non-homologous end-joining, NHEJ)을 방지하기 위한 ZFN 결합 부위 내 2개의 점 돌연변이, (2) Cys에서 Val으로 변환하기 위해 TGC에서 GTT로 변화, 및 (3) 클론 스크리닝을 위해 독특한 BamHI 부위를 만들기 위해 잠재성 C에서 A로 변화(도 1). 표준 합성 방법(예를 들어 화학적 변형이 아님)을 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 만들었고, PAGE를 정제하였다. 아연 핑거 뉴클레아제 쌍(ZFN)을 설계하여 RSK2 키나제 좌위를 표적화하였다. 하나의 ZFN을 설계하여 서열 5'-GTATACATAAAGCTA-3'(서열번호 6; 도 1에 표시된 왼쪽 결합 부위)에 결합시켰고, 다른 ZFN을 설계하여 서열 5'-GGAGTTTGCAGTGAAGGTA-3'(서열번호 7; 도 1에 표시된 오른쪽 결합 부위)에 결합시켰다.
인간 K562 세포를 ZFN을 암호화하는 8 ㎍의 mRNA 및 0.3 n㏖의 올리고뉴클레오타이드로 뉴클레오펙션시켰다. 인큐베이션의 2일 후, 세포의 풀을 BamH1 부위의 존재에 대해 분석하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드와 ZFN 둘 다에 노출된 세포는 BamH1 부위를 은닉한 반면, 올리고뉴클레오타이드 단독의 도입은 효과가 없었다. 빈도 통합은 약 20-30%의 범위에 있었다.
단일 세포 클론을 분리하였고, qPCR을 사용하여 스크리닝하여 BamH1 부위를 은닉하는 것을 확인하였다(도 3 참조). 대략 750개의 클론을 스크리닝하였고, 약 40개의 포지티브 클론을 확인하였다. 포지티브 클론을 후속하여 표적화된 염색체 위치 주변으로 PCR 증폭시켰고, BamHI와 함께 분해하여 RSK2 키나제 염색체 좌위의 편집을 확인한다. 시퀀싱 데이터는 BamHI 포지티브 클론이 원하는 Cys에서 Val으로 코돈 변화에 긍정적이라는 것을 나타내었다.
실시예 2: AAVS1 좌위의 변형
다음의 실시예는 AAVS1 좌위에 HindIII 부위를 도입하기 위한 올리고뉴클레오타이드의 사용을 기재한다. 도 4는 AAVS1 좌위의 야생형 서열, 및 HindIII 부위를 포함하는 센스 및 안티-센스 올리고뉴클레오타이드(108 nt)의 서열을 제시한다. 올리고뉴클레오타이드를 표준 방법(예를 들어, 화학적 변형이 아님)을 사용하여 만들었고, PAGE 정제하였다.
AAVS1 좌위를 표적화하기 위하여 ZFN 쌍을 설계하였다. 하나의 ZFN을 서열 5'-ACCCCACAGTGG-3'(서열번호 8; 도 4에서 표시한 왼쪽 결합 부위)에 결합하도록 설계하였고, 다른 ZFN을 서열 5'-TAGGGACAGGAT-3'(서열번호 9; 도 4에서 표시한 오른쪽 결합 부위)에 결합하도록 설계하였다. ZFN을 암호화하는 캡핑된 폴리아데닐화된 mRNA를 표준 방법을 사용하여 제조하였다. ZFN mRNA 및 HindIII 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 K562, HCT116, U2OS, A549, HEK293, HepG2, 또는 MSF7 세포 내로 뉴클레오펙션시켰다. 인큐베이션 기간 후, 세포 풀을 HindIII 부위의 존재에 대해 분석하였다. 올리고뉴클레오타이드와 ZFN 둘 다에 노출된 세포는 HindIII 부위를 함유하되, 올리고뉴클레오타이드 단독으로 처리한 것은 HindIII 단편을 가지지 않았다(도 5).
단일 세포 A549 클론을 분리하였고 qPCR 분석을 사용하여 스크리닝하여 HindIII 부위를 은닉하는 것을 확인하였다(도 6). 대략 933개 클론을 스크리닝하였고, 308개를 포지티브로 확인하였다. 따라서, HindIII 부위의 전달 빈도는 약 33%이었다. 포지티브 클론을 후속하여 표적화된 염색체 위치 주변에서 PCR 증폭하였고, HindIII과 함께 분해하여 올리고뉴클레오타이드 서열의 삽입을 확인하였다. 모 PCR 생성물의 위치에서 희미한 밴드를 나타내는 클론을 시퀀싱하였고 HindIII 부위를 함유하는 것을 확인하였다(도 6 참조). 모 PCR 생성물의 위치 주변에서 다수의 강한 밴드를 나타내는 클론을 작은 NHEJ-유래 삽입을 함유하도록 가설을 세웠다.
실시예 3: AAVS1 좌위의 변형 - 올리고뉴클레오타이드의 길이
더 짧은 올리고뉴클레오타이드가 AAVS1 좌위에 HindIII 부위를 전달하기 위하여 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 36 내지 106 nt 길이 범위에 있는 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다. 예를 들어, 106 nt 올리고뉴클레오타이드는 ZFN 절단 부위의 측면 중 하나 상에서 50 nt로 서열 동일성을 가지고(즉, 50 nt의 상동성 암(arm)을 가짐), 상동성 암 사이에 HindIII 부위(6 nt)를 가졌다. 올리고뉴클레오타이드 서열을 이하의 표 1에서 제시한다.
Figure 112013012241996-pct00001
각각 AAVS1-관련 ZFN(전체 5 ㎍) 및 3㎕의 100μM 올리고뉴클레오타이드 저장액(센스 또는 안티-센스 중 하나)의 2.5㎍의 플라스미드 DNA 암호화로 K562 세포를 뉴클레오펙션하였다. 세포를 뉴클레오펙션 후 2일에 채취하였다. 게놈 DNA를 PCR 증폭하였고, HindIII과 함께 분해시켰다. 도 7은 다양한 길이의 센스 가닥 AAVS1-HindIII 올리고뉴클레오타이드의 통합을 제시한다. ZFN 및 임의의 올리고뉴클레오타이드의 전달은 통합을 초래하였다. 그러나, 40개 이상의 nt를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 더 양호한 통합을 초래하는 것으로 나타났다. 다양한 길이의 안티-센스 가닥 AAVS1-HindIII 올리고뉴클레오타이드의 통합은 도 8에 나타낸다. 상기와 같이, 임의의 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN에 노출은 통합을 초래하였다. 이들 데이터는 센스 또는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 중 하나가 사용될 수 있고, 30 nt만큼 짧은 올리고뉴클레오타이드가 통합된다는 것을 나타낸다.
ZFN을 암호화하는 핵산의 유형이 삽입 비율에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위하여, K562 세포를 각각 ZFN을 암호화하는 2.5㎍ DNA 또는 2.0㎍의 mRNA(각각 전체 5㎍ 또는 4㎍) 및 3㎕의 100μM AAVS1-HindIII 올리고뉴클레오타이드(즉, 50, 60 또는 100 nt)로 뉴클레오펙션시켰다. 세포를 뉴클레오펙션 후 2일에 채취하였다. 게놈 DNA를 PCR 증폭시켰고, HindIII과 함께 분해시켰다. 도 9에 나타낸 바와 같이, RNA로서 ZFN의 전달은 상이한 길이를 가지는 올리고뉴클레오타이드의 더 양호한 통합을 초래하였다.
추정 NHEJ 단편을 검출하기 위하여, ZFN/올리고뉴클레오타이드-처리 세포에 Cel-1 분석을 실시하였다. Cel-1 분석은 ZFN-유발 DNA 이중 가닥 파손의 NHEJ-매개 불완전 보수 및/또는 추가적인 뉴클레오타이드의 삽입의 결과로서 야생형으로부터 일탈한 표적 좌위의 대립유전자를 검출한다. ZFN-처리 세포의 풀로부터 표적화된 영역의 PCR 증폭은 WT와 돌연변이체 앰플리콘의 혼합물을 만들어낸다. 이 혼합물의 용융 및 재어닐링은 WT와 돌연변이체 대립유전자의 헤테로듀플렉스 사이의 미스매치 형성을 초래한다. 미스매치 부위에서 형성된 DNA "버블"은 서베이어 뉴클레아제 Cel-1에 의해 절단되고, 절단 생성물은 겔 전기영동에 의해 분해될 수 있다. 모 밴드와 비교하여 절단 생성물의 상대적 강도는 헤테로듀플렉스의 Cel-1 절단 수준의 측정이다. 이를 위해, ZFN/올리고뉴클레오타이드-처리 세포의 풀을 PCR 증폭시켰고, 2개의 샘플로 나누었다. 하나의 샘플을 미처리로 남겨두었고, 다른 샘플을 1㎕ Cel-1 효소 및 1㎕의 인핸서로 30분 동안 42℃에서 처리하였다. 결과를 도 10에 제시한다. Cel-1 단편 및 추정 NHEJ-유래 미스매치 단편을 Cel-1 처리 세포 중에서 검출하였다.
실시예 4: 상동성은 올리고뉴클레오타이드 -매개 통합에 필요하다
A549 세포를 4㎍의 mRNA 암호화 AAVS1 - 표적화된 ZFN 및 AAVS1-HindIII 올리고뉴클레오타이드 또는 CNR1-HindIII 올리고뉴클레오타이드 중 하나로 뉴클레오펙션시켰다. 올리고뉴클레오타이드의 각 유형에 대해, 다음의 형태를 시험하였다: a) 센스, 단일-가닥; b) 안티-센스 단일-가닥; c) 센스 + 안티센스; d) 센스 단일-가닥 (2X); e) 이중-가닥(사전-어닐링). 2일의 인큐베이션 후, 세포를 채취하였고, 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 다음, HindIII과 함께 분해시켰다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 상동성 AAVS1-HindIII 올리고뉴클레오타이드에 노출된 세포만 AAVS1 좌위 내 HindIII 부위를 가졌다.
실시예 5: ssDNA 올리고 및 ZFN 에 의한 세포 내 게놈 결실
단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드(ssODN, 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드)가 K562 세포 내 AAVS1에서 0.1 kb-100 kb의 표적화된 게놈 서열을 결실하는데 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 다수의 ssODN을 제조하였다. 5kb, 10 kb 및 100 kb의 표적화된 AAVS1 게놈 서열을 결실시키기 위하여 설계된 ssODN을 표 2에서 제시한다. 각 올리고뉴클레오타이드는 ZFN 절단 부위로부터 특정된 거리에 위치한 게놈 영역(즉, 원위 결실 경계 또는 결실 말단 지점 영역)과 서열 동일성을 갖는 영역(도 12에서 I'로 지정) 및 ZFN 절단 부위 근처의 적절한 ZFN 결합 부위에 대응하는 영역(도 12에서 II로 지정)을 함유하였다. 올리고뉴클레오타이드를 표준 합성 방법(예를 들어, 화학적 변형 없음)을 사용하여 만들었고, PAGE 정제하였다.
Figure 112013012241996-pct00002
상기 표 2에서 제시한 대표적인 ssODN 서열에서, 밑줄은 ZFN 결합 부위를 포함하는 좌위의 핵산이다(도 12A에서 II로 지정한 영역). 밑줄과 볼드체를 둘 다 갖는 핵산은 AAVS1 ZFN의 오른편 결합 부위에 대해 인식 뉴클레오타이드이다. 볼드-이탤릭체이지만 밑줄이 없는 핵산은 원위 결실 말단 지점에 상보적이다(도 12A에서 I로 지정된 영역). 도 12A는 ZFN 절단 부위에 대해 결실 5'을 설명한다. 도 12B는 ZFN 절단 부위에 대해 결실 3'을 설명한다.
단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN 을 갖는 K562 내 AAVS1 좌위에서 상이한 크기의 표적화된 게놈 DNA 결실. K562 세포를 AAVS1-관련 ZFN(전체 8㎍) 및 3㎕의 100μM ssODN 공여체를 암호화하는 4㎍의 mRNA로 뉴클레오펙션시켰다: AAVS1-0.1kb, AAVS1-0.5kb, AAVS1-1kb, AAVS1-1.5kb, AAVS1-2kb, AAVS1-2.5kb, AAVS1-3kb, AAVS1-3.5kb, AAVS1-4kb, AAVS1-4.5kb, AAVS1-5kb, AAVS1-10kb, AAVS1-10.2kb, AAVS1-19.9kb, AAVS1-20kb, AAVS1-50kb, AAVS1-100 kb. ssODN 만으로, 또는 ZFN 만으로 뉴클레오펙션시킨 K562 세포를 대조군으로 사용하였다. K562 세포를 뉴클레오펙션 2일 후에 채취하였다. 도 12A에 나타낸 바와 같이 게놈 DNA를 원위 결실 말단 지점의 5' 말단 상류의 정방향 프라이머, 및 ZFN의 오른쪽 결합 부위의 3' 말단 하류의 역방향 프라이머로 PCR 증폭시켰다. 유사하게, 도 12B 내 ZFN 절단 부위의 3' 결실 계획에 대해 기준 지점으로서 ZFN 절단 부위를 사용하여, 정방향 프라이머는 ZFN 결합 부위의 5' 말단 상류에 있고, 역방향 프라이머는 원위 결실 말단 지점의 3' 말단 하류에 있다.
도 13에서, "2"로 라벨링된 레인은 PCR 증폭을 위한 주형으로서 ZFN 없이 올리고뉴클레오타이드에 대해서만 노출된 K562 세포를 사용하였다. 따라서 PCR 단편은 야생형 대립유전자(결실 없음)로부터 유래된 표시된 크기를 가지는 것으로 예상되었다. "3"으로 라벨링된 레인은 ZFN에 대해서만 노출된 K562 세포를 사용하였고, 따라서, PCR 생성물은 야생형 대립유전자(또는 NHEJ 생성물)로부터 유래된 것으로 표시하는 길이를 가지는 것으로 예상되었다. "1"로 라벨링된 레인은 올리고뉴클레오타이드와 ZFN 둘 다에 노출된 K562 세포를 사용하였고, 따라서 PCR 단편은 결실 대립유전자로부터 증폭되는 것으로 기대되었으며, 따라서 결실되도록 설계된 염기쌍의 수에 의해 야생형 대립유전자보다 크기가 더 작다. 세포 내 의도된 결실 길이에 의존하여, 레인 1은 또한 야생형 대립유전자로부터 증폭된 PCR 단편을 포함할 수 있다. 야생형 대립유전자 PCR 단편 및 결실 대립유전자 PCR 단편의 예상된 크기를 도 13의 상부의 레인의 각 그룹으로 제시하였다. PCR 단편은 모든 예상된 크기를 가졌고, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN을 사용하여 약 0.1kb, 0.5kb, 1.0kb, 1.5kb, 2kb, 2.5kb, 3.0kb, 3.5kb, 4.0kb, 4.5kb, 5.0kb, 10.0kb, 10.2kb, 19.9kb, 20kb, 50 kb 및 100kb의 표적화된 게놈 DNA 결실이 성공적으로 수행되었음을 나타내었다.
기준 지점으로서 ZFN 절단 자리를 사용하여, 표적화된 게놈 결실 영역에 대해 상류(3' 결실에 대해) 및/또는 하류(5' 결실) ZFN 절단 부위(들)의 선택에 따라서, 안티센스 및/또는 센스 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 표적화된 게놈 결실, 구체적으로는 상류의 ZFN 절단 부위를 매개하기 위하여 사용하였다. 도 13에서, 레인의 그룹 중에서, 별표 "*"를 갖는 그룹은 ZFN 절단 부위의 3' 결실을 표시하였고; 별표 "*"가 없는 그룹은 ZFN 절단 부위의 5' 결실을 표시하였으며; 이중 별표 "**"를 갖는 하나의 그룹은 ZFN 절단 부위의 5'과 3' 둘 다의 결실을 표시하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 각 유형의 그룹은 예상된 크기를 갖는 PCR 생성물을 가지는 것으로 나타났다.
단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN 을 갖는 상이한 세포 유형 내 AAVS1 좌위에서 표적화된 5 kb 게놈 DNA 결실 . 상이한 세포 내 AAVS1 좌위에서 표적화된 게놈 DNA결실을 시험하기 위하여, 각각의 K562, HCT116, U2OS, A549, HEK293, HepG2 및 MCF7 세포 풀을 AA VS1-관련 ZFN(전체 8㎍)을 암호화하는 4㎍의 mRNA 및 3㎕의 100μM ssODN 공여체: AAVS1 -5kb로 뉴클레오펙션시켰다. ssODN 만으로, 또는 ZFN 만으로 뉴클레오펙션시킨 각각의 세포 풀을 대조군으로 사용하였다. 뉴클레오펙션 2일 후 세포를 채취하였다. 게놈 DNA를 표적화된 결실의 5' 말단 상류의 정방향 프라이머 및 표적화된 결실의 3' 말단 하류의 역방향 프라이머로 PCR 증폭시켰다. "1"로 라벨링된 레인을 PCR 주형으로서 올리고뉴클레오타이드와 ZFN 둘 다에 노출된 세포로부터 DNA를 사용하였고, PCR 단편은 야생형 대립유전자 PCR 단편(5303 bp)보다 5kb 더 작은 크기를 갖는 결실 대립유전자로부터 증폭되는 것으로 예상하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 모든 세포 샘플 내 결실 대립유전자 PCR 단편은 303 bp의 예상된 크기를 가졌다.
단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN 을 갖는 K562 내 상이한 좌위에서 표 적화된 게놈 DNA 결실 . K562 세포 내 상이한 좌위에서 표적화된 게놈 DNA 결실을 시험하기 위하여, K562 세포를 각각의 (1) 6 kb 결실을 위해 IRAK4-관련 ZFN 및 ssODN 공여체(3㎕의 100μM)를 암호화하는 mRNA(전체 8 ㎍); (2) 5.2 kb 결실을 위해 RSK2-관련 ZFN 및 ssODN 공여체(3㎕의 100μM)을 암호화하는 mRNA(전체 8㎍); 및 (3) 5.0 kb 결실을 위해 RSK4-관련 ZFN 및 ssODN 공여체(3㎕의 100μM)을 암호화하는 mRNA(전체 8㎍). ssODN 만으로, 또는 ZFN 만으로 뉴클레오펙션한 각각의 세포 풀 샘플을 대조군으로 사용하였다. 세포를 뉴클레오펙션 2일 후에 채취하였고, 게놈 DNA를 분리하였다. 게놈 DNA를 표적화된 결실의 5' 말단 상류의 정방향 프라이머, 및 표적화된 결실의 3' 말단 하류의 역방향 프라이머로 PCR 증폭시켰다. "1"로 라벨링한 레인을 PCR 주형으로서 올리고뉴클레오타이드와 ZFN 둘 다에 노출된 세포로부터 DNA를 사용하였고, PCR 단편은 결실 대립유전자로부터 증폭되는 것으로 예상하였다. 도 15에서, 모든 세포 샘플 내 결실 대립유전자 PCR 단편은 IRAK4 좌위에 대해 각각 334 bp, RSK2 좌위에 대해 281 bp, 및 RSK4 좌위에 대해 190 bp의 예상된 크기를 가졌다.
단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN 에 의한 K562 내 AAVS1 좌위에서 표 적화된 게놈 DNA 결실의 정밀성 평가 . 게놈 DNA 풀 클론의 DNA 서열 분석을 수행하여 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN에 의해 매개되는 표적화된 결실의 정밀성 수준을 평가하였다. 게놈 DNA 풀을 설계된 ZFN 및 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 노출된 K562 세포로부터 분리하여 AAVS1 좌위에서 ZFN 절단 부위 5'의 표적화된 100 bp를 결실시켰다. 40% 약간 초과의 클론은 표적화된 100 bp의 정확한 결실을 지니는 대립유전자; 55% 약간 초과의 클론은 야생형 대립유전자(결실, 파손 또는 보수 없음) 또는 비상동성 말단-결합(NHEJ)의 결과로서 대립유전자를 가졌고; 부정확한 결실을 지니는 대립유전자를 가지는 클론(즉, 의도된 5' 결실 경계를 결실한 추가적인 81 bp)는 5% 미만이었다(데이터 미제시).
다른 사건에서, K562 세포가 AAVS1 좌위에서 ZFN 절단 부위 3'을 벗어나 표적화된 100 bp를 결실시키도록 설계된 ZFN 및 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 노출된 후 분리된 게놈 DNA 풀의 클론에 DNA 시퀀싱 분석을 실시하였다. 50% 약간 초과의 클론은 표적화된 100 bp의 정확한 결실을 갖는 대립유전자를 가졌고; 50% 약간 미만의 클론은 야생형 대립유전자(결실, 파손 또는 보수 없음) 또는 비-상동성 말단-결합(NHEJ)의 결과로서 대립유전자를 포함하였으며; 부정확한 결실을 지니는 대립유전자를 가지는 클론은 없었다(데이터 미제시).
또 다른 사건에서, K562 세포가 결실을 위한 표적화된 영역을 가로지르는 ZFN 및 AAVS1 좌위에서 ZFN 절단 부위의 5'과 3' 둘 다로부터 표적화된 100 bp를 결실시키도록 설계된 2 세트의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 노출된 후 분리된 게놈 DNA 풀의 클론에 DNA 서열 분석을 실시하였다. 20% 이상의 클론은 ZFN 절단 부위 5'의 표적화된 100bp의 정확한 결실을 지니는 대립유전자를 가지며; 30% 약간 미만의 클론은 ZFN 절단 부위 3'의 표적화된 100 bp의 정확한 결실을 가지고; 50% 약간 미만의 클론은 야생형 대립유전자(결실, 파손 또는 보수가 없음) 또는 비-상동성 말단 결합(NHEJ)의 결과로서 대립유전자를 포함하였으며; ZFN 절단 부위의 5' 또는 3' 결실 중 하나에 대해 부정확한 결실을 지니는 대립유전자를 가지는 클론은 없었다(데이터 미제시).
K562 내 AAVS1 좌위에서 표적화된 게놈 DNA 결실 및 이것의 분석의 단일 세포 클로닝 . 분리된 단일 세포 클론을 표적화된 게놈 DNA 결실이 일어나는 좌위에서 대립유전자 조성을 결정하기 위한 겔 분석을 통해 제노타이핑하였다. K562 세포가 각각 5kb, 10 kb 및 100 kb 게놈 서열을 결정하도록 설계된 ZFN 및 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 노출된 후 단일 세포 클론을 분리하였다. 동형 접합적 결실 클론은 클론 내 2개의 결실 대립유전자로부터 유래된 하나의 크기의 PCR 단편을 가지는 것으로 예상되었다. 이형 접합적 결실 클론은 결실 대립유전자 및 야생형 비-결실 대립유전자를 가지는 것으로 예상되었다. 야생형 비-결실 대립유전자를 각각 2개의 결실 경계에 연접한 프라이머 쌍에 의한 접합 PCR에 의해 검출하였다. 표 3은 단일 클론 제노타이핑의 결과를 요약한다.
Figure 112013012241996-pct00003
실시예 6: 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN 에 의한 동시 표적화 된 게놈 결실 및 삽입
도 16은 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드(ssODN) 및 ZFN에 의한 세포 내 동시 표적화된 게놈 결실 및 삽입을 달성하기 위한 대표적인 계획을 도시한다. 표적화된 결실 및 삽입을 위한 ssODN 서열은 3개의 영역을 가진다: 원위 결실 말단 지점에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 영역 I'(도 16에서 I로 지정된 영역); ZFN 결합 부위 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 영역 II(도 16에서 II로 지정된 영역); 및 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 영역 III. 구체적으로는, 올리고뉴클레오타이드 SM271을 5 kb의 동시 표적화된 결실 및 loxP 부위의 삽입에 대해 지정하였으며:
Figure 112013012241996-pct00004
, 소문자 뉴클레오타이드 서열로 표시되는 loxP 부위, 밑줄과 볼드체인 ZFN의 오른쪽 결합 부위에 대한 인식 뉴클레오타이드, 및 볼드-이탤릭체이지만 밑줄이 없는 원위 결실 말단 지점에 상보적인 서열을 가진다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 영역 I 및 II에 연접한 PCR 정방향 프라이머 A 및 역방향 프라이머 B를 표적화된 결실을 확인하기 위하여 사용하였고; PCR 정방향 프라이머 A 및 역방향 프라이머 C를 표적화된 삽입을 확인하기 위하여 사용하였으며, 프라이머 C는 ZFN 오른쪽 결합 암 및 이웃하는 게놈 DNA에 대한 접합 부위에서 뉴클레오타이드를 포함한다. 도 17은 5kb 서열의 표적화된 결실의 PCR 확인을 나타내었으며, 프라이머 A 및 B를 사용하여 결실 대립유전자(레인 6: AAVS1-ZFN 및 AAVS1-5kb ssODN)로부터 기대된 303 bp PCR 단편을 만들었다. loxP 부위의 표적화된 삽입을 프라이머 A 및 C를 사용하는 PCR 단편에 의해 확인하였다(도 17, 레인 10 참조).
실시예 7: 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN 에 의해 매개된 보편적 플라스미드 삽입 방법.
다음의 실시예는 공여체 플라스미드로부터 관심의 서열을 AAVS1 좌위 내로 도입하기 위한 올리고뉴클레오타이드 및 ZFN의 사용을 기재한다. 일반적으로, 1 또는 2개의 ZFN, 2개의 올리고뉴클레오타이드 공여체, 및 플라스미드 공여체가 이 방법에 수반된다. ZFN은 이중-가닥 파손(DSB)을 만든다. 그 다음에 ZFN 절단 부위에 상보적인 부문을 사용하여 2개의 올리고뉴클레오타이드 공여체를 DSB 말단에 결합시킨다. 2개의 올리고뉴클레오타이드 공여체의 각 5' 말단은 공여체 플라스미드 내 영역에 대해 상동성이다(보편적 또는 보편적이 아님). 올리고뉴클레오타이드 공여체 5' 말단 상의 상동성은 플라스미드 공여체 내로 침입을 야기한다. DSB가 공여체 플라스미드를 사용하여 분해될 때, 공여체 플라스미드로부터 원하는 서열을 도입하였고, ZFN 절단 부위에 삽입하였다(도 22).
계획을 확인하기 위하여, 2개의 AAVS1 ZFN(Z), 2개의 올리고뉴클레오타이드 공여체(O), 및 마우스 Rosa26 플라스미드 공여체(D)(Z+O+D)로 트랜스펙션시켰다. ZFN만(Z), 올리고뉴클레오타이드 공여체만(O), 플라스미드 공여체만(D), ZFN과 올리고뉴클레오타이드 공여체만(Z+O), ZFN과 플라스미드 공여체만(Z+D), 올리고뉴클레오타이드 공여체와 플라스미드 공여체만(O+D)으로 트랜스펙션한 세포를 대조군으로 사용하였다. 그 다음에 트랜스펙션된 세포를 배양하였고, 채취하였으며, 개개의 세포 클론을 분석하였다. 접합 PCR을 수행하여 플라스미드 공여체로부터의 공여체 DNA가 AAVS1 좌위 내로 통합되는 것을 확인하였다. 5' 접합에 연접한 프라이머 AAVS1 Cel-F2(5' TTCGGGTCACCTCTCACTCC 3'; 서열번호 25) 및 SM373.Junc.R1(5' ACCTCGAGACCGGTGGATCCGA 3'; 서열번호 26)을 5' 접합 확인을 위해 사용하였고; 3' 접합에 연접한 프라이머 SM373.Junc.F2(5' GCGGTCTGAATTCGGATCCACCG 3'; 서열번호 27) 및 AAVS1 Cel-R2(5' GGCTCCATCGTAAGCAAACC 3'; 서열번호 28)를 3' 접합 확인을 위해 사용하였다.
5' 접합 및 3' 접합에서 서열 분석으로 플라스미드 공여체로부터 공여체 서열이 세포 내 AAVS1 좌위 내로 통합되는 것을 확인하였다. 5' 접합에서 확인된 통합을 도 18에서 제시되는 서열로 나타낸다(서열번호 29). 3' 접합에서 확인된 통합은 도 19의 서열로 나타낸다(서열번호 30). 도 20은 2개의 ZFN, 2개의 올리고뉴클레오타이드 공여체, 및 플라스미드 공여체(Z+O+D)에 노출된 클론이 공여체 서열 통합을 표시하는 크기 390 bp의 5' 접합 부위 PCR 단편(도 20a) 및 크기 309 bp의 3' 접합 부위 PCR 단편(도 20b)을 포함한다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 표적화된 10 kb 게놈 DNA 결실의 올리고- 매개된 게놈 변형 상에서 올리고뉴클레오타이드 서열 동일성의 효과
게놈 서열 상의 상동성 부위에 대한 올리고뉴클레오타이드 DNA의 서열 동일성이 표적화된 게놈 서열 결실의 효율에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위하여, 올리고뉴클레오타이드 서열을 AAVS1 ZFN 절단 부위로부터 원위 결실 경계 10 kb에 대응하는 절편 상에서 변경하였으며, 100% 동일성, 98% 서열 동일성, 90% 서열 동일성, 50% 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다. 그 다음에 10 kb 결실의 효율을 SYBR 그린 실시간 PCR로 측정하였다(도 21). 100% 동일성과 98% 동일성 사이의 ΔCt는 0.4이었고; 100% 동일성과 90% 동일성 사이의 ΔCt는 5이었으며; 100% 동일성과 50% 동일성 사이의 ΔCt는 7이었다. 결실 효율은 100% 동일성을 가지는 올리고뉴클레오타이드와 98% 서열 동일성을 가지는 올리고뉴클레오타이드 사이에 비슷하다. 서열 동일성이 90%로 낮춰질 때 결실 효율은 감소되었고, 효율은 서열 동일성이 50% 또는 그 미만일 때 상당히 더 낮았다.
SEQUENCE LISTING <110> SIGMA-ALDRICH CO. CHEN, Fuqiang PRUETT-MILLER, Shondra M. DAVIS, Gregory D. <120> GENOME EDITING USING TARGETING ENDONUCLEASES AND SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACIDS <130> 047497-428894 <150> US 61/367,022 <151> 2010-07-23 <150> US 61/382,965 <151> 2010-09-15 <150> US 61/410,124 <151> 2010-11-04 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 125 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggatatgaag taaaagaaga tattggagtt ggctcctact ctgtttgcaa gagatgtata 60 cataaagcta caaacatgga gtttgcagtg aaggtaaatt ttttttattt aaaatgcaat 120 tcata 125 <210> 2 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 ggatatgaag taaaagaaga tattggagtt ggatcctact ctgttgttaa gagatgtata 60 cataaagcaa caaacatgga atttgcagtg aaggtaaatt ttttttattt aaaatgcaat 120 tcata 125 <210> 3 <211> 98 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctggttctgg gtacttttat ctgtcccctc caccccacag tggggccact agggacagga 60 ttggtgacag aaaagcccca tccttaggcc tcctcctt 98 <210> 4 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 4 ctggttctgg gtacttttat ctgtcccctc 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agccacagac 60 ctagggacag gattggtgac agaaaagccc catccttagg 100 <210> 24 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 24 atccacaaaa gtataaaatt gactcttctg tcctgtgtgt aacttcgtat agcatacatt 60 atacgaagtt atctagggac aggattggtg acagaaaagc cccatcctta 110 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 25 ttcgggtcac ctctcactcc 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 26 acctcgagac cggtggatcc ga 22 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 27 gcggtctgaa ttcggatcca ccg 23 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 28 ggctccatcg taagcaaacc 20 <210> 29 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 29 tctcactcct ttcatttggg cagctcccct acccccctta cctctctagt ctgtgctagc 60 tcttccagcc ccctgtcatg gcatcttcca ggggtccgag agctcagcta gtcttcttcc 120 tccaacccgg gcccctatgt ccacttcagg acagcatgtt tgctgcctcc agggatcctg 180 tgtccccgag ctgggaccac cttatattcc cagggccggt taatgtggct ctggttctgg 240 gtacttttat ctgtcccctc caccccacag tgggtcaatt cccctgcagg acaacgccca 300 cacaccaggt tagcctttaa gcctgcccag aagactcccg cccaccgcgg tctgaattcg 360 gat 363 <210> 30 <211> 310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 30 gcggtctgaa ttcggatcca ccggtctcga ggtttaaacg tcgactctcc cgggagaaag 60 actggagttg cagatcacga gggaagaggg ggaagggatt ctcccaggcc cagggcggtc 120 cctcagaagc tagggacagg attggtgaca gaaaagcccc atccttaggc ctcctccttc 180 ctagtctcct gatattgggt ctaaccccca cctcctgtta aggcagattc cttatctggt 240 gacacacccc catttcctgg agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta 300 cgatggagcc 310

Claims (36)

  1. 다음 단계를 포함하는, 세포 내 적어도 하나의 염색체 서열 안으로 외인성 서열을 통합시키는 방법:
    a) 적어도 하나의 표적화(targeting) 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산, 그리고, 적어도 하나의 단일-가닥 핵산을 세포 안으로 도입시키는 단계,
    이 때 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 염색체 서열에 있는 표적화된 절단 부위로 이중-가닥 브레이크(break)를 도입시킬 수 있으며,
    이 때 상기 적어도 하나의 단일-가닥 핵산은
    (i) 상기 표적화된 절단 부위의 한 측면 상의 염색체 서열에 서열 동일성을 가지는 15 내지 50개 뉴클레오티드로 구성된 제 1 영역,
    (ii) 상기 표적화된 절단 부위의 또다른 측면 상의 염색체 서열에 서열 상동성을 가지는 15 내지 50개 뉴클레오티드로 구성된 제 2 영역, 및
    (iii) 상기 제 1 영역 및 제 2 영역에 연접한 (flanked) 외인성 서열을 포함하고;
    그리고
    b) 상기 세포를 상기 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입되는 상기 이중-가닥 브레이크가 상동성-지향된 복구 과정(homology-directed repair process)에 의해 복구되는 조건 하에서 유지시킴으로써, 상기 외인성 서열이 표적화된 절단 부위에서 염색체 서열 안에 통합되는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제의 쌍인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 외인성 서열을 포함하는 공여체 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터의 일부인, 방법.
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