KR101970025B1

KR101970025B1 - Ｂ7-ｈ1 및 ｐｄ-1과 결합하는 항체 및 다른 분자들

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Publication number: KR101970025B1
Application number: KR1020137030691A
Authority: KR
Inventors: 솔로몬 랭거먼; 린다 리우; 섀넌 마셜; 솅 야오
Original assignee: 메디뮨 엘엘씨
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2019-04-17
Anticipated expiration: 2032-04-19
Also published as: CA2833636A1; RU2013151455A; US9205148B2; DK2699264T3; SI2699264T1; SMT201800294T1; EP3403672A1; ES2669310T3; US20160130348A1; JP6072771B2; HRP20180893T1; CN103608040A; RS57324B1; WO2012145493A1; AU2012245477C1; JP2014523401A; JP2017101042A; EP2699264A4; MX2013012088A; RU2625034C2

Abstract

본 발명은 B7-H1 또는 PD-1과 면역 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 이들의 항원-결합 단편 및 다른 분자들에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이러한 분자들은 추가로 PD-1과 결합하는 B7-H1 또는 B7-DC의 능력을 조정할 수 있거나, 또는 B7-H1 또는 PD-1의 신호화 활성에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명은 추가로 암 및 다른 질환의 진단 및 치료에서 이러한 분자들의 사용에 관한 것이다.

Description

Ｂ7-Ｈ1 및 ＰＤ-1과 결합하는 항체 및 다른 분자들{ANTIBODIES AND OTHER MOLECULES THAT BIND B7-H1 AND PD-1}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 미국 특허출원 제61/477,414호(2011년 4월 20일 제출, 계류중)의 우선권을 주장하며, 이것은 그 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.

서열목록

본 출원은 37 C.F.R.1.821에 따라서 하나 이상의 서열목록을 포함하며, 이들은 서면으로도 컴퓨터 판독 매체로도 개시되고, 서면 및 컴퓨터 판독 개시 내용은 그 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.

기술분야

본 발명은 B7-H1 또는 PD-1에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 항체들 및 이들의 항원-결합 단편 및 다른 분자들에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이러한 분자들은 추가로 B7-H1 또는 B7-DC가 PD-1에 결합하는 능력을 조정할 수 있거나, 또는 B7-H1 또는 PD-1의 신호화 활성에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명은 또한 암 및 다른 질환들의 진단 및 치료에서 이러한 분자들의 사용에 관한 것이다.

A. 세포 매개 면역 반응

사람 및 그외 포유류의 면역계는 감염 및 질환에 대한 보호를 제공하는 것을 담당한다. 이러한 보호는 체액성 면역 반응 및 세포-매개 면역 반응에 의해서 모두 제공된다. 체액성 반응은 외래 표적(항원)을 인식하고 중화할 수 있는 항체 및 다른 생물분자들의 생성을 가져온다. 반면에 세포-매개 면역 반응은 T 세포에 의한 대식세포, 자연 사멸 세포(NK) 및 항원-특이적 세포독성 T 림프구의 활성화, 및 항원의 인식에 반응하여 다양한 사이토카인의 방출을 수반한다(Dong, A. et al. (2003) "Immune Regulation by N'ovel Costimulatory Molecules " Immunolog. Res. 28(l):39-48).

항원에 대한 면역 반응을 최적화하여 매개하는 T 세포의 능력은 두 가지 다른 신호화 상호작용을 필요로 한다(Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation" Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Check point Blockade in Cancer Immunotherapy " Adv. Immunol. 90:297-339). 먼저, 항원-표출 세포(APC)의 표면에 어레이된 항원은 항원-특이적 순수(naive) CD4+ T 세포에 표출될 수 있다. 이러한 표출은 T 세포가 면역 반응을 개시하도록 시키는 T 세포 수용체(TCR)를 통해서 신호를 송달하며, 이 면역 반응은 표출되는 항원에 특이적일 것이다. 둘째, APC와 별개의 T 세포 표면 분자 간 상호작용을 통해 매개되는 일련의 공-자극성 및 저해성 신호는 먼저 T 세포의 활성화 및 증식을 촉발하며, 궁극적으로는 이들의 저해를 촉발한다. 따라서, 제1 신호는 면역 반응에 특이성을 부여하고, 제2 신호는 면역 반응의 성질, 크기 및 기간을 결정하는 작용을 한다.

면역계는 공-자극성 및 공-저해성 리간드와 수용체에 의해 엄격히 제어된다. 이들 분자는 T 세포 활성화를 위한 제2 신호를 제공하고, 양성 신호와 음성 신호의 균형을 이룬 네트워크를 제공하여 자기 면역성을 제한하면서 감염에 대한 면역 반응을 최대화한다(Wang, L. et al. (March 7, 2011) "VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T Cell Responses" J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:l-16; Lepenies, B. et al. (2008) "The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections" Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). 특히, 항원 표출 세포의 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86) 리간드와 CD4+ T-림프구의 CD28 및 CTLA-4 수용체 사이의 결합이 중요하다(Sharpe, A.H. et al.(2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules" Immunolog. Res. 28(l):39-48; Lindley, P.S. et al.(2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation" Immunol. Rev. 229:307-321). B7.1 또는 B7.2와 CD28의 결합은 T 세포 활성화를 자극하고, B7.1 또는 B7.2와 CTLA-4의 결합은 이러한 활성화를 저해한다(Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules" Immunolog. Res. 28 (l):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation" Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited" Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28은 T 세포의 표면에서 구성적으로 발현되고(Gross, J. et al. (1992) "Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse" J. Immunol. 149:380-388), CTLA4 발현은 T 세포 활성화 후 빠르게 상향 조절된다(Linsley, P. et al. (1996) "Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement" Immunity 4:535-543). CTLA4는 친화성이 더 높은 수용체이므로(Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2:116-126), 결합은 먼저 T 세포 증식(CD28을 통해)을 개시한 다음 그것을 저해하고(CTLA4의 초기 발현을 통해), 이로써 증식이 더 이상 필요하지 않을 때는 그 효과를 감축시킨다.

CD28 수용체의 리간드에 대한 추가의 조사로서 일단의 관련된 B7 분자들("B7 수퍼패밀리")의 확인 및 특성화가 이루어졌다(Coyle, A.J. et al.(2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function," Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al.(2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al.(2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al.(2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al.(2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells." Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al.(2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al.(2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al.(2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance," Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al.(1996) "CD28/B7 System of T Cell Costimulation," Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al.(2004) "Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses," Microbes Infect. 6:759-766). 현재 패밀리의 몇몇 구성원이 알려져 있는데, B7.1(CD80), B7.2(CD86), 유도성 공-자극제 리간드(ICOS-L), 프로그램드 데스-1 리간드(PD-Ll; B7-H1), 프로그램드 데스-2 리간드(PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 및 B7-H6이 알려져 있다(Collins, M. et al.(2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al.(2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2).

B. B7-H1/PD1 상호작용

1. B7-H1

B7-H1(PD-L1, CD274)은 B7 수퍼패밀리의 특히 중요한 일원이며, 이것은 종양에 대한 면역 반응을 조성하는데 중추적으로 연관된다(Flies, D.B. et al.(2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30 (3):251-260; 미국특허 6,803,192; 7,794,710; 미국 특허출원 공개 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT 공개 WO01/39722; WO 02/086083). B7-H1은 대략 33kDa의 타입 1 경막 단백질이다. 이것은 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질환 및 간염과 같은 다른 질환 상태와 같은 특정한 사건 동안 면연계를 억제하는데 있어서 중요한 역할을 한다고 추측된다.

B7-H1은 상이한 사람 및 마우스 조직에서 광범위하게 발현되는데, 예를 들어 심장, 태반, 근육, 태아 간, 비장, 림프절 및 흉선은 두 종에 모두 해당되고, 간, 폐 및 신장은 마우스에만 해당된다(Martin-Orozco, N. et al.(2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). 사람에서 B7-H1 단백질 발현은 사람 내피세포(Chen, Y. et al.(2005) "Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells," Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al.(2005) "Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1 Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al.(2002) "B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T Cell Cytokine Synthesis," J. Immunol. 169:3581-3588), 심근(Brown, J.A. et al.(2003) "Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T Cell Activation And Cytokine Production," J. Immunol. 170:1257-1266), 합포영양모세포(Petroff, M.G. et al.(2002) "B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface," Placenta 23:S95-S101), 일부 조직의 거주 대식세포, 또는 인터페론(IFN)-γ 또는 종양괴사인자(TNF)-α로 활성화된 대식세포(Latchman, Y. et al.(2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation," Nat. Immunol 2:261-268), 및 종양(Dong, H.(2003) "B7-HI Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity," J. Mol. Med. 81:281-287)에서 발견된다. 마우스에서 B7-H1 단백질 발현은 심장 내피, 췌장 소섬 세포, 소장, 및 태반에서 발견된다(Martin-Orozco, N. et al.(2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).

2. PD-1

프로그램드 데스-1("PD-1")는 B7-H1과 B7-DC의 수용체이다. PD-1은 T 세포 조절제의 확장된 CD28/CTLA4 패밀리의 약 31kD 타입 I 막 단백질 멤버이다(Ishida, Y. et al.(1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immuno-globulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; 미국 특허출원 공개 Nos. 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; 미국 특허출원 Nos. 6,808,710; 7,101,550; 7,488,802; 7,635,757; 7,722,868; PCT 공개 No. WO 01/14557). CTLA4와 비교하면 PD-1은 면역 반응을 더욱 광범위하게 음성적으로 조절한다.

PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 단구에서 발현되고(Agata, Y. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. et al.(2002) "Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T Cells And APC," J. Immunol. 169:5538-5545), 또한 자연 살해(NK) T 세포에서는 낮은 수준으로 발현된다(Nishimura, H. et al(2000) "Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-l-Deficient Mice," J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. et al.(2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).

PD-1의 세포외 영역은 CTLA4의 동등한 도메인과 23% 동일한 단일 면역글로불린(Ig)V 도메인으로 구성된다(Martin-Orozco, N. et al.(2007) "Inhibitory Co-stimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). 세포외 IgV 도메인 다음에 경막 영역과 세포내 테일이 뒤따른다. 세포내 테일은 면역수용체 티로신계 저해성 모티프와 면역수용체 티로신계 스위치 모티프에 위치된 두 인산화 부위를 함유하며, 이것은 PD-1이 TCR 신호를 음성적으로 조절한다는 것을 시사한다(Ishida, Y. et al.(1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11 :3887-3895; Blank, C. et al.(Epub 2006 Dec 29) "Contribution Of The PD-Ll/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer," Immunol. Immunother. 56(5):739-745).

뮤린 PD-1과 면역 특이적으로 결합할 수 있는 항체들이 보고되었다(예를 들어, Agata, T. et al.(1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772 참조).

C. B7-H1과 PD-1의 상호작용

B7-H1과 PD-1의 상호작용은 T 세포 및 B 세포에 상당히 음성적인 공-자극성 신호를 제공하는 것으로 판명되었으며(Martin-Orozco, N. et al.(2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298), 세포 죽음 유도제로서 기능한다(Ishida, Y. et al.(1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11 :3887-3895; Subudhi, S.K. et al.(2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition," J. Molec. Med. 83:193 -202).

저 농도의 PD-1 수용체와 B7-H1 리간드의 상호작용은 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 강력히 저해하는 저해성 신호의 전송을 가져온다. 고 농도에서는 PD-1과의 상호작용이 T 세포 증식을 저해하지 못하지만, 여러 사이토카인의 생산을 현저히 감소시킨다(Sharpe, A.H. et al.(2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). 휴지중인 상태와 이미 활성화된 CD4 및 CD8 T 세포는 물론 심지어 제대혈로부터의 순수한 T 세포에 의한 T 세포 증식 및 사이토카인 생산이 가용성 B7-H1-Fc 융합 단백질에 의해서 저해되는 것으로 판명되었다(Freeman, G.J. et al.(2000) "Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation" J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al.(2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation," Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al.(2002) "PD-l.PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2," Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al.(2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126).

B7-H1 - PD-1 상호작용은 G0-G1에서 세포 주기 정지를 초래하지만, 세포 죽음을 증가시키지는 않는다(Latchman, Y. et al.(2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation," Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al.(2002) "PD-l.PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2," Eur. J. Immunol. 32(3):634-643). 따라서, B7-H1 - PD-1 복합체화는 항원성 자극이 약하거나 제한적일 때 B7-CD28 신호를 길항하는 능력을 가지며, T 세포 반응의 하향 조절에서 핵심적인 역할을 한다.

B7-H1 및 PD-1에 의해서 매개되는 신호 전달은 복잡하다. 두 분자는 모두 다른 단백질들과도 추가로 결합한다. B7-H1은 B7-1과 결합할 수 있다(Butte, M.J. et al.(2008) "Interaction ofPD-Ll and B7-1," Molecular Immunol. 45:3567-3572). PD-1은 B7-DC(PD-L2)와 결합할 수 있다(Lazar-Molnar, E. et al.(2008) "Crystal Structure Of The Complex Between Programmed Death-1(PD-1) And Its Ligand PD-L2," Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 105(30):10483-10488). B7-1은 CD28과 상호작용하여 T-세포를 위한 공-자극성 신호를 송달하는데, 이것은 면역 반응의 조기 단계에서 중요하다(Elloso, M.M. et al.(1999) "Expression and Contribution of B7-1(CD80) and B7-2(CD86)i n the Early Immune Response to Leishmania major Infection," J. Immunol. 162:6708-6715). B7-DC는 T 세포의 강항 자극제로서, T 세포 증식과 IFN-γ 생산을 증진시킨다. 또한, 이것은 PD-1과의 상호작용을 통해서 면역 반응에 대한 저해성 효과를 나타낸다(Ishiwata, K. et al.(epub January 10, 2010) "Costimulator Responses Induced by Nippostrongylus brasiliensis," J. Immunol. 184:2086-2094). 미생물 및 종양은 면역계에 의해 박멸되는 것을 피하기 위해서 PD-1 및 B7-H1을 이용하는 것으로 보인다. PD-1 및 B7-H1과 상호작용하는 다양한 수용체와 리간드에 대한 결합 친화성의 차이는 질환 모델에서 PD-1 및 B7-H1의 봉쇄에 뚜렷이 다른 기능적 성과를 제공한다고 제안되었다(Butte, M.J. et al.(2008) "Interaction of PD-Ll and B7-1," Molecular Immunol. 45:3567-3572). 또한, PD-1 경로는 만성 감염 동안 면역 기능의 손상에서 핵심적인 역할을 함으로써 연루되었는데("T 세포 고갈"), PD-1 기능의 봉쇄가 많은 T 세포 기능을 회복시킬 수 있다(November 19, 2010) "Expression OfPD-Ll And PD-L2 On Human Macrophages Is Up-Regulated By HIV-1 And Differentially Modulated By IL-IO," J. Leukocyte Biol. 89: doi: 10.1189/jlb.0610327:1-9).

T 세포 활성화 및 증식을 저해하는데 있어서 B7-H1과 PD-1의 역할은 이들 생체분자들이 염증 및 암의 치료를 위한 치료 표적으로서 소용될 수 있다는 것을 제시했다. 감염 및 종양을 치료하고 후천성 면역 반응을 상향 조정하기 위한 항-PD1 항체의 사용이 제안되었다(미국 특허출원 공개 Nos. 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401; 미국특허 Nos. 7,521,051; 7,563,869; 7,595,048; PCT 공개 Nos. WO 2004/056875; WO 2008/083174 참조). 반대로, PD-1과 B7-H1의 상호작용을 조정하는 제제는 이 면역 반응을 상향 또는 하향 조정하는데 활용도를 갖는다는 것이 제시되었다(미국특허 Nos. 7,029,674; 7,488,802; 미국 특허출원 공개 Nos. 2007/0122378; 2009/0076250; 2009/0110667; 2009/0263865; 2009/0297518; PCT 공개 No. WO 2006/133396). 마찬가지로, 감염 및 종양을 치료하고 후천성 면역 반응을 상향 조정하기 위한 항-B7-H1 항체의 사용이 제안되었다(미국 특허출원 공개 Nos. 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0317368; 미국특허 Nos. 6,803,192; 7,794,710; PCT 공보 Nos. WO 01/39722; WO 02/086083).

그러나 모든 이러한 장점에도 불구하고 B7-H1과 PD1 사이의 상호작용을 조정할 수 있는 조성물이 여전히 필요하다. 본 발명은 이러한 조성물 및 암과 다른 질환 및 상태를 치료하기 위한 이들의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 항체 및 이들의 항원-결합 단편, 그리고 B7-H1 또는 PD-1과 면역 특이적으로 결합할 수 있는 다른 분자들에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이러한 분자는 추가로 PD-1과 결합하는 B7-B1의 능력을 조정할 수 있거나, 또는 B7-H1 또는 PD-1의 신호화 활성에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명은 추가로 암 및 다른 질환의 진단 및 치료에서 이러한 분자의 사용에 관한 것이다.

상세히 말하면, 본 발명은 B7-H1 또는 PD-1, 특히 사람 B7-H1 또는 사람 PD-1과, 바람직하게는 내인성 또는 형질감염된 농도로 살아 있는 세포의 표면에서 발현된 것과 면역 특이적으로 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 분자를 제공한다. 본 발명은 특히 항원-결합 단편이 B7-B1과 결합하고, 살아 있는 세포가 종양 세포, 병원균-감염된 세포 또는 항원 표출 세포인 이러한 분자의 구체예, 및 항원-결합 단편이 PD-1과 결합하고, 살아 있는 세포가 T 세포인 이러한 분자의 구체예에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 분자가 단클론 항체, 사람 항체, 키메라 항체 또는 사람화된 항체인 이러한 분자의 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 항체가 1가-특이적, 2가-특이적, 3가-특이적 또는 다가-특이적인 구체예들을 포함한다.

또한, 본 발명은 B7-H1과 결합하는 이러한 분자 또는 항체로서, 이들의 항원-결합 단편이 6개 CDR을 포함하며, CDR은 항-B7-H1 항체인 1E12, 1F4, 2G11, 3B6 및 3D10의 CDR의 적어도 하나의 공통(consensus) CDR을 포함하고, 모든 나머지 CDR은 다음으로부터 선택되는 구체예에 관한 것이다:

(A) 항-B7-H1 항체 1E12의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR;

(B) 항-B7-H1 항체 1F4의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR;

(C) 항-B7-H1 항체 2G11의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR;

(D) 항-B7-H1 항체 3B6의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR; 또는

(E) 항-B7-H1 항체 3D10의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR

또한, 본 발명은 B7-H1과 결합하는 이러한 분자 또는 항체에서, 이들의 항원-결합 단편이 6개 CDR을 포함하고, 6개 CDR이 다음과 같은 구체예에 관한 것이다:

(A) 항-B7-H1 항체 1E12의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR;

(B) 항-B7-H1 항체 1F4의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR;

(C) 항-B7-H1 항체 2G11의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR;

(D) 항-B7-H1 항체 3B6의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR; 또는

(E) 항-B7-H1 항체 3D10의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR

또한, 본 발명은 항체가 B7-H1과 결합하고, 항체 h3D10 Var 1, h3D10 Var 2, h3D10 Var 3, h3D10 Var 4, h3D10 Var 5, h3D10 Var 6, h3D10 Var 7, h3D10 Var 8, h3D10 Var 9, h3D10 Var 10, h3D10 Var 11, h3D10 Var 12, h3D10 Var 13, 또는 h3D10 Var 14의 가변 도메인을 포함하는 항체의 구체예에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 설명된 분자 또는 항체로서, 분자 또는 항체가 PD-1과 결합하고, 항원-결합 단편이 6개 CDR을 포함하며, CDR은 항-PD-1 항체인 1E3, 1E8 및 1H3의 CDR의 적어도 하나의 공통 CDR을 포함하고, 모든 나머지 CDR은 다음으로부터 선택되는 구체예에 관한 것이다:

(A) 항-PD-1 항체 1E3의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR;

(B) 항-PD-1 항체 1E8의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR; 또는

(C) 항-PD-1 항체 1H3의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR

또한, 본 발명은 6개 CDR이 다음과 같은 구체예에 관한 것이다:

(A) 항-PD-1 항체 1E3의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR;

(B) 항-PD-1 항체 1E8의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR; 또는

(C) 항-PD-1 항체 1H3의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR

또한, 본 발명은 항체가 PD-1과 결합하고, 항체 h1H3 Var 1, h1H3 Var 2, h1H3 Var 3, h1H3 Var 4, h1H3 Var 5, h1H3 Var 6, h1H3 Var 7, h1H3 Var 8, h1H3 Var 9, h1H3 Var 10, h1H3 Var 11, h1H3 Var 12, h1H3 Var 13, 또는 h1H3 Var 14의 가변 도메인을 포함하는 항체의 구체예에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 설명된 분자 또는 항체로서, 분자 또는 항체가 검출이 가능하게 표지되거나, 또는 콘쥬게이트된 독소, 약물, 수용체, 효소, 수용체 리간드를 포함하는 구체예에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 설명된 분자 또는 항체로서, 분자 또는 항체가 다음과 같은 구체예에 관한 것이다:

(A) B7-H1 또는 PD-1에 의해서 매개되는 신호 전달을 조정한다;

(B) B7-H1 수용체와 결합하는 B7-H1의 능력을 약화시키거나, 또는 PD-1 리간드와 결합하는 PD-1의 능력을 약화시킨다;

(C) B7-H1 또는 PD-1 매개된 신호 전달을 항진한다:

(D) T 세포 증식을 매개한다; 또는

(E) IFN-γ 생산을 증진시킨다.

또한, 본 발명은 상기 설명된 분자 또는 항체 중 어느 것의 치료적 유효량과 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암, 자가면역 질환, 감염성 질환, 또는 T 세포 수나 건강에 영향을 미치는 질환의 치료에서 이러한 제약 조성물의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료가 예방적 치료이고, 암, 자가면역 질환, 감염성 질환, 또는 T 세포 수나 건강에 영향을 미치는 질환의 어느 증상에 앞서서, 또는 이식에 따르는 상태의 치료를 위해서 제공되는 이러한 제약 조성물의 사용에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 B7-H1 또는 PD-1과 결합하는 능력에 대해 대상의 세포를 분석함으로써 상기 대상에서 암, 자가면역 질환(특히 이식편 대 숙주 질환), 감염성 질환(특히 만성 바이러스성 질환), 또는 T 세포 수나 건강에 영향을 미치는 질환을 진단하기 위한 상기 설명된 분자 또는 항체 중 어느 것의 사용에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 B7-H1이 사람 B7-H1이고, PD-1이 사람 PD-1인 이러한 분자, 항체 및 조성물의 구체예에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 상기 설명된 B7-H1 결합 분자 중 어느 것과 결합하는 능력에 대해서 대상의 세포를 분석하는 단계를 포함하는 대상에서 질환(특히 암)을 진단하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 대상에서 질환의 존재를 진단하기 위한 세포학적 분석을 제공한다.

추가로, 본 발명은 상기 설명된 PD-1 결합 분자와 결합하는 능력에 대해서 대상의 세포를 분석하는 단계를 포함하는 대상에서 질환(특히 T 세포 수 및/또는 건강에 영향을 미치는 질환)을 진단하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 대상에서 질환의 존재 및/또는 진행을 진단하거나, 또는 치료에 대한 대상의 반응을 평가하기 위한 세포학적 분석을 제공한다.

도 1은 B7-H1과 결합하는 항체에 대해서 시험된 하이브리도마 상청액의 결합을 도시한다. 양성 대조군(PC): 하이브리도마 생성에 사용된 마우스의 1:1000 희석된 혈청; 음성 대조군(NC): 5% 밀크/PBS. 데이터는 B7-H1-Fc에 대한 결합에 대해 도시되며, 검출은 항-마우스 IgG를 사용한다.
도 2는 분리된 항-B7-H1 항체가 B7-H1과 PD-1의 결합을 조정할 수 있는지를 결정하기 위한 실험 결과를 도시한다. 양성 대조군: 클론 MIH-1 및 29E.2A3(모두 항-사람 CD274(B7-H1); 두 음성 대조군: 관련 없는 하이브리도마(랜덤 Ab)의 컨디셔닝 배지 및 벡터 대조군(VC).
도 3은 CHO-hB7-H1에 대한 결합에 대해 시험된 항-B7-H1 항체의 중간 형광 강도(MFI)를 도시한다. 시험된 클론 중 어느 것도 모 CHO 계통과 교차반응하지 않은 것으로 판명되었고, 이는 발현된 항체가 사람 B7-H1에 면역 특이적이었음을 지적한다.
도 4는 선택된 항-사람 B7-H1 항체의 사람 B7-H1-발현 CHO 세포 결합 분석의 중간 형광 강도(MFI) 결과를 도시한다.
도 5는 항-사람 B7-H1 항체 5H1과 1E12의 사람 B7-H1-발현 CHO 세포 결합 분석의 중간 형광 강도(MFI) 결과를 비교한다.
도 6은 분리된 항-사람 PD-1 항체의 항원 결합 및 이소타입을 도시한다.
도 7a-7b는 분리된 하이브리도마 중 일부가 중화 항-사람 PD-1 항체를 발현했던 것을 지적하는 실험 결과를 도시한다.
도 8은 CHO-hPD-1에 대한 결합에 대해 시험된 항-PD-1 항체의 중간 형광 강도(MFI)를 도시한다. 시험된 클론 중 어느 것도 모 CHO 계통과 교차반응하지 않은 것으로 판명되었고, 이는 발현된 항체가 사람 PD-1에 면역 특이적이었음을 지적한다.
도 9는 선택된 항-사람 PD-1 항체의 사람 PD-1-발현 CHO 세포 결합 분석의 중간 형광 강도(MFI)를 도시한다. 양성 대조군: EH12(BioLegend로부터 상업적으로 입수가능한 항-사람 PD-1 항체; mlgGl: 뮤린 IgG 음성 대조군.
도 10은 항-사람 PD-1 항체의 다양한 농도에서 세포-기반 경쟁 분석의 중간 형광 강도(MFI) 결과를 도시한다.
도 11은 20μg/ml 항-사람 PD-1 항체의 농도에서 세포-기반 경쟁 분석의 중간 형광 강도(MFI) 결과를 도시한다.
도 12는 사람 전장 PD-1으로 형질감염된 CHO 세포를 바이오틴-표지된 hB7-Hl-FC 또는 hB7-DC mlg로 염색하기 전에 항-사람 PD-1 단클론성 항체(mAb) 또는 대조군 Ig의 포화 용량과 함께 예비 인큐베이션했던 실험 결과를 도시한다.
도 13의 패널 A-B는 (A) 상업적으로 입수가능한 항-PD-1 항체 EH12와 (B) 키메라("ch") 뮤린 항-사람 PD-1 Fab 영역과 사람 IgG1 Fc 영역을 지닌 뮤린 단클론성 항체의 결합을 비교한 것을 도시한다.
도 14의 패널 A-B는 PD-1에 대한 바이오틴화된 B-H1-Fc 및 바이오틴화된 B7-DC-Fc 결합에 대해 차단 효과를 발휘하는 본 발명의 항-PD-1 항체의 능력을 도시한다.
도 15는 항-hlg 항체에 의해서 검출된바, CHO.hPD-1 세포와 1H3 항-사람 PD-1 키메라 항체의 결합 곡선을 도시한다.
도 16a-16b는 음성 대조군 항체(팔리비쥬맙; SYNAGIS®, Medimmune, Inc.)에 비해서 사람 일차 T 세포 CD8+(도 16a) 및 CD4+(도 16b)과 결합하는 1H3 항-사람 PD-1 키메라 항체의 능력에 대한 연구 결과를 도시한다.
도 17은 파상풍 독소(TT) 리콜시 CFSE 희석에 의해서 측정된바 항원 특이적 T 세포 반응을 증진시키는 본 발명의 항체의 능력을 도시한다.
도 18a-18d는 CHO.hPDl 세포와 결합하는 사람화된 1H3 변이체(h1H3 Var 1 - h1H3 Var 14)의 능력을 나타낸다.
도 19a-19b는 B7-H1(도 19a) 또는 B7-DC(도 19b)를 발현하는 HEK293 세포와 hPD-l-Fc 간의 상호작용을 차단하는 사람화된 항-PD-1 항체의 능력을 나타낸다.
도 20은 h1H3 Var 1 - h1H3 Var 6에 대한 결합 곡선을 도시한다.

본 발명은 항체 및 이들의 항원-결합 단편 그리고 B7-H1 또는 PD-1과 면역 특이적으로 결합할 수 있는 다른 분자에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이러한 분자는 추가로 PD-1과 결합하는 B7-H1 또는 B7-DC의 능력을 조절할 수 있거나, 또는 B7-H1 또는 PD-1의 신호화 활성에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명은 추가로 암 및 다른 질환의 치료에서 이러한 분자의 사용에 관한 것이다.

분자가 제2 분자와 "면역 특이적으로 결합"할 수 있다는 것은 이러한 결합이 그것의 동족 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화성을 나타낼 때를 말한다. 항체가 항원(특히 항원 B7-H1 또는 PD-1)의 표적 영역 또는 입체형태("에피토프")와 "면역 특이적으로 결합"할 수 있다는 것은 이러한 결합이 면역글로불린 분자의 항원 인식 부위를 포함하는 때를 말한다. 특정 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체는 더 낮은 친화성으로 다른 항원과 결합할 수 있으며, 다른 항원은, 예를 들어 면역분석, BIACORE® 분석 또는 본 분야에 공지된 다른 분석에 의해서 결정된바 항원 인식 부위에 의해서 인식되는 일부 서열 또는 입체형태 유사성을 갖지만 전체적으로는 관련 없는 항원과는 결합하지 않을 것이다. 그러나, 바람직하게 항체(및 이들의 항원-결합 단편)는 다른 항원과 교차반응하지 않을 것이다. 또한, 항체는 면역 특이적이 아닌 방식으로 다른 분자, 예를 들어 FcR 수용체와 다른 영역의 결합 도메인/Fc 영역과 같은 항원 인식 부위를 포함하지 않는 분자의 도메인을 통해서 결합할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "조정하다"는 효과 또는 결과를 변경할 수 있는 능력을 말한다. 특히, 본 발명은 B7-H1과 PD-1 사이의 결합을 조정하고 및/또는 B7-H1 - PD-1 결합의 결과로서 발생하는 신호 전달을 조정할 수 있는 분자(특히, 사람 B7-H1 또는 사람 PD-1와 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 이들의 항원-결합 단편)에 관한 것이다. 이러한 조정은 PD-1과 결합하는 B7-H1의 능력을 약화시키거나 완전히 차단할 수 있다. 추가의 구체예에서, 이러한 조정은 신호 전달을 매개하는 B7-H1 또는 PD-1의 능력을 약화시키거나 완전히 중화할 수 있다. 추가의 구체예에서, 이러한 조정은 i) B7-H1과 PD-1 간의 상호작용을 증진시키고 B7-H1 - PD-1 결합을 촉진하는 것, 또는 ii) B7-H1 및 PD-1에 직접 결합하여 내인성 리간드의 활성을 의태하는 것 등에 의해서 B7-H1 또는 PD-1을 통한 신호 전달을 증진시키거나 항진할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이러한 조정은 B7-H1과 PD-1 간의 상호작용의 성질을 변경함으로써 도출되는 신호 전달의 성질을 변경할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 분자는 B7-H1 또는 PD-1과 결합함으로써 다른 리간드 및 수용체와 결합하는 이러한 분자의 능역을 변경할 수 있으며(예를 들어, B7-DC와 결합하는 PD-1의 능력 또는 B7-1(CD80)과 결합하는 B7-H1의 능력에 영향을 미침으로써), 이로써 이들의 전체적인 활성을 변경할 수 있다. 바람직하게, 이러한 조정은 측정가능한 면역계 활성의 적어도 10% 변화, 더 바람직하게 이러한 활성의 적어도 50% 변화, 또는 이러한 활성의 적어도 2-배, 5-배, 10-배 또는 더욱더 바람직하게 적어도 100-배 변화를 제공할 것이다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 "가변 영역" 항원 인식 부위를 지닌 면역글로불린 분자를 표시하기 위해서 사용된다. 용어 "가변 영역"은 항체에 의해서 광범위하게 공유되는 도메인(예를 들어, 항체 Fc 도메인)으로부터 면역글로불린의 이러한 도메인을 구별하기 위해서 사용된다. 가변 영역은 잔기들이 항원 결합을 담당하는 "초가변 영역"을 포함한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 전형적으로 경쇄 가변 도메인의 대략 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3)과 중쇄 가변 도메인의 대략 잔기 27-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3)과 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia, C. et al.(1987) "Canonical Structures For The Hyper variable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917)를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 여기 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기들이다. 용어 항체는 단클론성 항체, 다가-특이적 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화된 항체(예를 들어, Muylder mans et al, 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230;Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25; 국제공개 Nos. WO 94/04678 및 WO 94/25591; 미국특허 No. 6,005,079 참조), 단쇄 Fvs(scFv)(예를 들어, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994) 참조), 단쇄 항체, 이황화-결합된 Fvs(sdFv), 인트라바디, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 및 항-항-Id를 포함한다)를 포함한다. 특히, 이러한 항체는 어느 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, Igd, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi and IgA2) 또는 하위부류를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편"은 항체의 상보성 결정 영역("CDR")과 선택적으로 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위를 포함하는 프레임워크 잔기를 함유하는 항체의 하나 이상의 부분을 말하며, 항원과 면역 특이적으로 결합하는 능력을 나타낸다. 이러한 단편은 Fab', F(ab')2, Fv, 단쇄(ScFv), 및 이들의 돌연변이, 자연 발생 변이체, 및 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위와 이종성 단백질(예를 들어, 독소, 상이한 항원에 대한 항원 인식 부위, 효소, 수용체 또는 수용체 리간드 등)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "단편"은 적어도 5 연속 아미노산 잔기, 적어도 10 연속 아미노산 잔기, 적어도 15 연속 아미노산 잔기, 적어도 20 연속 아미노산 잔기, 적어도 25 연속 아미노산 잔기, 적어도 40 연속 아미노산 잔기, 적어도 50 연속 아미노산 잔기, 적어도 60 연속 아미노산 잔기, 적어도 70 연속 아미노산 잔기, 적어도 80 연속 아미노산 잔기, 적어도 90 연속 아미노산 잔기, 적어도 100 연속 아미노산 잔기, 적어도 125 연속 아미노산 잔기, 적어도 150 연속 아미노산 잔기, 적어도 175 연속 아미노산 잔기, 적어도 200 연속 아미노산 잔기, 또는 적어도 250 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 말한다.

사람, 키메라 또는 사람화된 항체는 사람에서의 생체내 용도에 특히 바람직하지만, 뮤린 항체나 다른 종들의 항체는 많은 용도에 유익하게 사용될 수 있다(예를 들어, 시험관내 또는 인시튜 검출 분석, 급성 생체내 사용 등). 완전한 사람 항체는 사람 대상의 치료적 치료에 특히 바람직하다.

사람 항체는 사람 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 상기 설명된 파지 디스플레이 방법을 포함하는 본 분야에 공지된 여러 방법에 의해서 제조될 수 있다(미국특허 Nos. 4,444,887 및 4,716,111; 및 국제공개 Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 참조). 사람 항체는 기능적 내인성 면역글로불린은 발현할 수 없지만 사람 면역글로불린 유전자는 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 사람 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체가 마우스 배아줄기세포에 무작위로 또는 동종성 재조합에 의해서 도입될 수 있다. 또는 달리, 사람 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역이 사람 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 마우스 배아줄기세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 동종성 재조합에 의한 사람 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 동시에 비-기능화될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아줄기세포를 확장시켜 배반포에 미소 주사하여 키메라 마우스를 생산할 수 있다. 다음에, 키메라 마우스를 길러서 사람 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생산한다. 트랜스제닉 마우스는 종래의 방법을 사용하여 선택된 항원으로, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 면역화된다. 해당 항원에 대해 지정된 단클론성 항체가 종래의 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻어질 수 있다(예를 들어, 미국특허 No. 5,916,771 참조). 트랜스제닉 마우스에 은닉된 사람 면역글로불린 트랜스젠은 B 세포 분화 동안 재배열되고, 계속해서 종류 변환 및 체세포 돌연변이를 거친다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 제조하는 것이 가능하다. 사람 항체를 제조하는 이 기술에 대한 개략적인 내용은 Lonberg and Huszar(1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93를 참조하며, 이것은 그 전체가 본원에 참고자료로 포함된다. 사람 항체 및 사람 단클론성 항체를 제조하는 이 기술과 이러한 항체를 제조하는 프로토콜에 대한 상세한 논의 내용은, 예를 들어 국제공개 Nos. WO 98/24893, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국특허 Nos. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 및 5,939,598을 참조하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고자료로 포함된다. 이에 더하여, Abgenix, Inc.(캘리포니아 프레몬트) 및 Medarex(뉴저지 프린스톤)와 같은 회사가 상기 설명된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대해 지정된 사람 항체를 제조하기 위하여 힘쓰고 있다.

"키메라 항체"는 항체에서 상이한 부분들이 비-사람 항체로부터 유래된 가변 영역 및 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체와 같은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래된 분자이다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 공지이다. 예를 들어, Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al, 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; 및 미국특허 Nos. 6,311,415, 5,807,715, 4,816,567, 및 4,816,397을 참조한다. 비-사람 종의 하나 이상의 CDR과 사람 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역을 포함하는 키메라 항체는 본 분야에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 이들은 예를 들어 CDR-접목(EP 239,400; 국제공개 No. WO 91/09967; 및 미국특허 Nos. 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089), 베니어링 또는 리서페이싱(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al, 1994, Protein Engineering 7:805; 및 Roguska et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :969), 및 체인 셔플링(미국특허 No. 5,565,332)을 포함한다.

특히, 본 발명은 "사람화된 항체"에 관한 것이다(예를 들어, 유럽특허 Nos. EP 239,400, EP 592,106 및 EP 519,596; 국제공개 Nos. WO 91/09967 및 WO 93/ 17105; 미국특허 Nos. 5,225,539, 5,530,101, 5,565,332, 5,585,089, 5,766,886 및 6,407,213; 및 Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al, 1994, PNAS 91:969-973; Tan et al, 2002, J. Immunol. 169:1119-25; Caldas et al, 2000, Protein Eng. 13:353-60; Morea et al, 2000, Methods 20:267-79; Baca et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84; Roguska et al, 1996, Protein Eng. 9:895-904; Couto et al, 1995, Cancer Res. 55(23 Supp):5973s-5977s; Couto et al, 1995, Cancer Res. 55:1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersen et al, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73; Jones et al, 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al, 1988, Nature 332:323-329; 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 참조). 본원에서 사용된 용어 "사람화된 항체"는 사람 프레임워크 영역과 비-사람(일반적으로 마우스 또는 래트) 면역글로불린의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린을 말한다. CDR을 제공하는 비-사람 면역글로불린은 "도너"라고 불리고, 프레임워크를 제공하는 사람 면역글로불린은 "어셉터"라고 불린다. 불변 영역은 존재할 필요가 없지만, 존재한다면 사람 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일해야 하는데, 즉 적어도 약 85-90%, 바람직하게 약 95% 또는 그 이상 동일해야 한다. 이로써, 아마도 CDR을 제외한 사람화된 면역글로불린의 모든 부분은 천연 사람 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 사람화된 항체는 사람화된 경쇄와 사람화된 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 사람화된 항체는 전형적인 키메라 항체는 포괄하지 않을 텐데, 왜냐하면 예를 들어 키메라 항체의 전체 가변 영역은 사람의 것이 아니기 때문이다. 도너 항체가 "사람화" 과정에서 "사람화"되었다면 결과의 사람화된 항체는 CDR을 제공한 도너 항체와 동일한 항원에 결합할 것으로 예상된다. 대부분의 경우, 사람화된 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-사람 영장류와 같은 비-사람 종들(도너 항체)의 초가변 영역 잔기로 치환된 사람 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 사람 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비-사람 잔기로 치환된다. 또한, 사람화된 항체는 수용자 항체나 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 정비하기 위해서 이루어진다. 일반적으로, 사람화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로 두 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 초가변 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-사람 면역글로불린의 것들에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 사람 면역글로불린 서열의 것들이다. 또한, 사람화된 항체는 선택적으로, 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가(즉, 돌연변이)의 도입에 의해 변경된 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 FcγRIIB와 면역 특이적으로 결합하는 사람 면역글로불린의 것을 포함할 것이다.

본 발명의 방법에서 사용되는 항체는 1가-특이적일 수 있다. 또한, 2가-특이적, 3가-특이적 항체 또는 B7-H1 또는 PD-1에 더하여 상이한 표적들에 대해 특이성을 나타내는 더 많은 다가-특이성을 가진 항체도 관심의 대상이다. 바람직한 구체예에서, 이러한 다가-특이적 항체는 상이한 면역 세포 표적(들)에 대해 특이성을 나타낼 것이다. 예를 들어, 이러한 항체는 B7-H1과 B7-DC에 모두 결합할 수 있고, 따라서 양쪽의 PD-1 의존적 반응을 조정할 수 있다. 반면에, 이러한 항체는 PD-1과 B7-1에 모두 결합할 수 있고, 양쪽의 B7-H1 의존적 반응을 방해할 수 있다. 다른 구체예에서, 다가-특이적 항체는 CTLA4, TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, B7-H4, LIGHT 또는 LAG3와 같은 선택적인 면역조정 경로에 수반되는 분자들(수용체 또는 리간드)에 결합하며, 이로써 면역조정 효과를 증진시킬 수 있다. 또한, 다가-특이적 항체는 사이토카인(예를 들어, IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-베타, IL-10, IL-17, IFNg, Flt3, BLys) 및 케모카인(예를 들어, CCL21)과 같은 이펙터 분자들에 결합할 수 있으며, 이들은 급성과 만성 면역 반응을 모두 조정하기 위한 것과 특히 관련될 수 있다.

추가로, 다가-특이적 항체는 항체를 특정 세포 타입 또는 종류에 표적화하기 위한 중요한 항원과 결합할 수 있다. 예를 들어, PD-1과 CD27(또는 B7-H1과 CD27)에 모두 결합하는 이러한 항체는 활성화된 메모리 B-세포(mBAct)와 항원 표출 세포(APC)를 같이 국소화하는 것을 도울 수 있으며, 이로써 이러한 APC에 의해서 어레이된 PD-1이 mBAct B 세포의 표면에 있는 리간드와 상호작용하여 mBAct B 세포의 생존을 촉진할 수 있다. mBAct B 세포의 손실은 HIV 감염에서 AIDS로의 진행에서 어떤 촉발 요인이므로(Titanji, K. et al.(2010) Acute Depletion Of Activated Memory B Cells Involves The PD-1 Pathway In Rapidly Progressing SIV-Infected Macaques," J. Clin. Invest. 120(11):3878-3890), PD-1과 CD27에 모두 결합하는 항체는 HIV 감염의 치료와 AIDS 개시의 예방 또는 지연에서 활용도를 가진다. 상기 논의된 대로, PD-1 경로는 만성 HIV 감염 동안 면역 기능의 손상에서 핵심적인 역할을 함으로써 연루된다("T 세포 고갈")(Khaitan, A. et al.(2011) "Revisiting Immune Exhaustion During HIV Infection," Curr. HIV/AIDS Rep. 8:4-11; Rodri quez-Garcia, M. et al.(November 19, 2010) "Expression Of PD-L1 And PD-L2 On Human Macrophages Is Up-Regulated By HIV-1 And Differentially Modulated By IL-10," J. Leukocyte Biol. 89:doi:10.1189/jlb.0610327:1-9; Grabmeier-Pfister shammer, K. et al.(2011) "Identification of PD-I as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on Treatment," J Acquir. Immune Defic. Syndr. 56(2):118-124). 대식세포는 HIV 감염의 초기 단계에 상당히 기여하는 것으로 밝혀졌다(Carter, C. A. et al.(2008) "Cell Biology Of HIV-1 Infection Of Macrophages," Ann. Rev. Microbiol. 62:425-443; Nours adeghi, M. et al.(2006) "HIV-1 Infection Of Mononuclear Phagocytic Cells: The Case For Bacterial Innate Immune Deficiency In AIDS," Lancet Infect. Dis. 6:794-804). 따라서, PD-1과 결합하고 대식세포-특이적 마커(CD14, CD68, CD163, TLR2 등과 같은)와 결합하는 항체(특히 독소와 콘쥬게이트된)는 HIV 감염을 예방하는데 있어서 활용도를 가진다. 추가로, T 세포 고갈의 여러 마커(예를 들어, PD-1 및 CTLA4, TIM3, TIM4 또는 LAG-3 중 어느 것이나 전부)는 면역 반응성의 치료 또는 진단에서 활용도를 가진다. 관심 있는 다른 표적 항원은 암 세포 마커를 포함한다.

추가로, PD-1+ CD8+ 세포는 항-HIV 활성을 갖는 것으로 판명되었다(Killian, M.S. et al.(2011) "Natural Suppression of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication Is Mediated by Memory CD8+ T Cells," J. Virol. 85(4):1696-1705). 따라서, PD-1과 CD8에 모두 결합하는 항체는, 예를 들어 환자의 HIV 감염 및 AIDS의 치료에서 궁극적인 사용을 위해 이러한 세포의 부화된 집단을 분리하고 생산하기 위한 생체외 수단에서 활용도를 가진다.

이러한 항-PD-1 또는 항-B7-H1 2가-특이적, 3가-특이적 또는 다가-특이적 항체에서 사용될 수 있는 다른 마커들은 CD4, CD8, CD25 및 CTLA-4를 포함한다(De Keersmaecker, B. et al.(2011)("Fighting with the Enemy 's Weapons - The Role of Costimulatory Molecules in HIV," Curr. Molec. Med. 566-5240/11:1-25; 및 Sarikonda, G.(2011) "Immunosuppressive Mechanisms During Viral Infectious Diseases:" Methods in Molec. Biol. 677:431-447을 참조하며, 이들은 모두 본원에 참고자료로 포함된다).

유사하게, CD4 T 세포는 M. tuberculosis의 성장 및 전파를 늦추는데 필요하며, PD-1-매개 저해도 CD4+ T 세포가 중증 질환을 촉진시키는 것을 방지하는데 필요하다(Barber, D.L. et al.(2011) "CD4 T Cells Promote Rather than Control Tuberculosis in the Absence of PD-l-Mediated Inhibition," J. Immunol. 186: 1598-1607; Sakai, S. et al.(2010) "PD-1 - PD-L1 pathway impairs Th1 immune response in the late stage of infection with Mycobacterium bovis bacillus Calmette-G rin," Int1. Immunol. 22(12):915-925; Lazar-Molnar, E. et al.(2010) "Programmed Death-1(PD-l)-Deficient Mice Are Extraordinarily Sensitive To Tuberculosis," Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 107(30):13402-13407). 따라서, CD4 및 PD-1과 결합하는 항체는 결핵의 치료와 결핵의 개시를 예방하거나 지연시키는데서 활용도를 가진다.

바람직한 사람 어셉터 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA 서열은, 제한은 아니지만 사람 점라인 VH 세그먼트 VH1-18 및 JH6과 사람 점라인 VL 세그먼트 VK-A26 및 JK4로부터의 FR 세그먼트들을 포함한다. 특정 구체예에서, CDR 중 하나 이상이 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여 프레임워크 영역 안에 삽입된다. 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 공통 프레임워크 영역, 바람직하게 사람 프레임워크 영역일 수 있다(예를 들어, 사람 프레임워크 영역의 목록에 대해서 Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479 참조).

본 발명의 사람화된 또는 키메라 항체는 적어도 하나의, 전형적으로 두 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 수 있으며, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-사람 면역글로불린(즉, 도너 항체)의 것들에 상응하고, 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 사람 면역글로불린 공통 서열의 것들에 상응한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를, 전형적으로 사람 면역글로불린의 것을 포함한다. 본 발명의 항체의 불변 도메인은 항체의 제안된 기능, 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능과 관련하여 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체의 불변 도메인은 사람 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인이다(또는 포함한다). 특정 구체예에서, 본 발명의 사람화된 항체가 치료적 사용을 목적으로 하며, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성과 같은 항체 이펙터 기능이 요구되는 경우, 사람 IgG 불변 도메인, 특히 IgG1 및 IgG3 이소타입의 것이 사용된다. 예를 들어, PD-1은 T 세포뿐만 아니라 혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AITL)과 같은 희귀한 말초 T 세포 림프종에서 고도로 발현된다. ADCC 또는 CDC 활성을 지닌 항-PD-1 항체가 이러한 암을 치료하기 위한 치료제로서 특히 관련이 있다. 대안의 구체예에서, IgG2 및 IgG4 이소타입은 본 발명의 항체가 치료적 목적을 위한 것이고, 항체 이펙터 기능은 요구되지 않는 경우 사용된다. 예를 들어, T 세포의 표면에 PD-1을 표적화함으로써 T 세포의 활성을 증가시키고자 한다면 T 세포를 죽이는 이펙터 기능은 바람직하지 않을 수 있다. 본 발명은 미국 특허출원 공개 Nos. 2005/0037000 및 2005/0064514에 개시된 것들과 같은 항체 이펙터 기능을 변경하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 Fc 불변 도메인을 포괄한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄는 물론 적어도 중쇄의 가변 도메인을 모두 함유한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 면역글로불린의 어느 부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 어느 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 도메인은 보체 고정 불변 도메인이며, 이 경우 항체는 세포독성 활성을 나타내고, 부류는 전형적으로 IgG1인 것이 바람직하다. 다른 구체예에서, 이러한 세포독성 활성이 바람직하지 않은 경우, 불변 도메인은 IgG2 부류일 수 있다. 본 발명의 항체는 둘 이상의 부류 또는 이소타입의 서열을 포함할 수 있으며, 원하는 이펙터 기능을 최적화하기 위해 특정한 불변 도메인을 선택하는 것은 본 발명의 통상의 기술 범위이다.

사람화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 모 서열, 예를 들어 도너 CDR에 정확히 상응할 필요는 없고, 또는 해당 부위에서 CDR 또는 프레임워크 잔기가 공통 또는 도너 항체에 상응하지 않도록 공통 프레임워크가 적어도 하나의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해서 돌연변이될 수 있다. 그러나, 이러한 돌연변이는 확장되지 않는 것이 바람직하다. 일반적으로, 사람화된 항체 잔기의 적어도 75%가 모 프레임워크 영역(FR) 및 CDR 서열에 상응할 것이며, 더 대체로 90%, 가장 바람직하게 95%를 초과하여 상응할 것이다. 사람화된 항체는 본 분야에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 이들은 제한은 아니지만 CDR-접목(유럽특허 No. EP 239,400; 국제공개 No. WO 91/09967; 및 미국특허 Nos. 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089), 베니어링 또는 리서페이싱(유럽특허 Nos. EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; 및 Roguska et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973), 체인 셔플링(미국특허 No. 5,565,332), 및 예를 들어 미국특허 Nos. 6,407,213, 5,766,886, 5,585,089, 국제공개 No. WO 9317105, Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea et al, 2000, Methods 20:267-79, Baca et al, 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678-84, Roguska et al, 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto et al, 1995, Cancer Res. 55(23 Supp):5973s-5977s, Couto et al, 1995, Cancer Res. 55: 1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen et al, 1994, J. Mol. Biol. 235: 959-73, Jones et al, 1986, Nature 321:522-525, Riechmann et al, 1988, Nature 332:323, 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596에 개시된 기술을 포함한다. 주로 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항체 결합을 변경하기 위해서, 바람직하게 개선하기 위해서 CDR 도너 항체의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해서, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 통례를 벗어난 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해서 확인된다(예를 들어, Queen et al, 미국특허 No. 5,585,089; 미국 특허출원 공개 Nos. 2004/0049014 및 2003/0229208; 미국특허 Nos. 6,350,861; 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 및 5,530,101 및 Riechmann et al, 1988, Nature 332:323 참조).

본 발명의 항체는 폴리펩티드의 제조에 유용한 본 분야에 공지된 어느 방법에 의해, 예를 들어 시험관내 합성, 재조합 DNA 생산 등으로 제조될 수 있다. 바람직하게, 사람화된 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 본 발명의 항체는 재조합 면역글로불린 발현 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 사람화된 항체를 포함하는 면역글로불린 분자의 재조합 생산은 미국특허 No. 4,816,397(Boss et al.), 미국특허 Nos. 6,331,415 및 4,816,567(모두 Cabilly et al.의 발명), 영국특허 GB 2,188,638(Winter et al.), 및 영국특허 GB 2,209,757에 설명된다. 사람화된 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린의 재조합 발현을 위한 기술은 또한 Goeddel et al, Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press (1991) 및 Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman(1992)에서 찾을 수 있다. 재조합 항체의 생성, 설계 및 발현에 관한 추가 정보는 Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego(1993).에서 찾을 수 있다.

본 발명의 재조합 키메라 항체의 제조를 위한 예시적인 과정은 다음의 단계를 포함할 수 있다: a) 종래의 분자생물학 방법에 의해서 뮤린 항-B7-H1(또는 항-PD-1) 단클론성 항체의 CDR 및 가변 영역이 사람 면역글로불린으로부터 유래된 Fc 영역에 융합된 항체 중쇄를 암호화하고 발현하는 발현 벡터를 구성함으로써 키메라 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 제조하는 단계; b) 종래의 분자생물학 방법에 의해서 뮤린 항-B7-H1(또는 항-PD-1) 단클론성 항체의 항체 경쇄를 암호화하고 발현하는 발현 벡터를 구성함으로써 키메라 항체 경쇄의 발현을 위한 벡터를 제조하는 단계; c) 종래의 분자생물학 방법에 의해서 발현 벡터를 숙주 세포에 전달하여 키메라 항체의 발현을 위한 형질감염된 숙주 세포를 생산하는 단계; 및 d) 종래의 세포 배양 기술에 의해서 형질감염된 세포를 배양하여 키메라 항체를 생산하는 단계.

본 발명의 재조합 사람화된 항체의 제조를 위한 예시적인 과정은 다음의 단계를 포함할 수 있다: a) 종래의 분자생물학 방법에 의해서 도너 항체 결합 특이성을 보유하기 위해서 필요한 가변 영역 프레임워크의 최소 부분 및 CDR이 뮤린 항-B7-H1(또는 항-PD-1) 단클론성 항체와 같은 비-사람 면역글로불린으로부터 유래되고, 항체의 나머지 부분은 사람 면역글로불린으로부터 유래된 항체 중쇄를 암호화하고 발현하는 발현 벡터를 구성함으로써 사람화된 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 제조하는 단계; b) 종래의 분자생물학 방법에 의해서 도너 항체 결합 특이성을 보유하기 위해서 필요한 가변 영역 프레임워크의 최소 부분 및 CDR이 뮤린 항-B7-H1(또는 항-PD-1) 단클론성 항체와 같은 비-사람 면역글로불린으로부터 유래되고, 항체의 나머지 부분은 사람 면역글로불린으로부터 유래된 항체 경쇄를 암호화하고 발현하는 발현 벡터를 구성함으로써 사람화된 항체 경쇄의 발현을 위한 벡터를 제조하는 단계; c) 종래의 분자생물학 방법에 의해서 발현 벡터를 숙주 세포에 전달하여 사람화된 항체의 발현을 위한 형질감염된 숙주 세포를 생산하는 단계; 및 d) 종래의 세포 배양 기술에 의해서 형질감염된 세포를 배양하여 사람화된 항체를 생산하는 단계.

어느 예시적인 방법과 관련해서든, 상이한 선택성 마커를 함유할 수 있지만 중쇄 및 경쇄 코딩 서열을 제외하고는 바람직하게는 동일한 이러한 발현 벡터들로 공-형질감염될 수 있다. 이 과정은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 제공한다. 또는 달리, 중쇄와 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 본 발명의 재조합 항체를 발현하는데 사용된 숙주 세포는 Escherichia coli와 같은 박테리아 세포, 또는 더 바람직하게는 진핵생물 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 HEK-293 세포)일 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 세포의 선택에 의존하며, 선택된 숙주 세포에서 원하는 발현 및 조절 특성을 갖도록 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 셀라인은, 제한은 아니지만 CHO-K1, NSO 및 PER.C6(Crucell, 네덜란드 레이덴)을 포함한다. 또한, 종 특이적 코돈 용법 편차를 고려하여 단백질 발현이 증진되도록 숙주 세포가 선택되었을 때 코돈 용법이 최적화될 수 있다. 예를 들어, CHO 발현 세포의 경우 항체를 암호화하는 DNA는 Cricetulus griseus(이로부터 차이니즈 햄스터 난소 세포가 유래된다)에 의해서 우선적으로 사용된 코돈을 통합할 수 있다. 코돈 최적화 방법은 원하는 숙주 세포에 의한 개선된 발현을 촉진하기 위해서 사용될 수 있다(예를 들어, Wohlgemuth, I. et al.(2011) "Evolutionary Optimization Of Speed And Accuracy Of Decoding On The Ribosome," Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 366(1580):2979-2986; Jestin, J.L. et al.(2009) "Optimization Models And The Structure Of The Genetic Code," J. Mol. Evol. 69(5):452-457; Bollenbach, T. et al.(2007) "Evolution And Multilevel Optimization Of The Genetic Code," Genome Res. 17 (4):401-404; Kurland, C.G. et al(1984) "Optimization Of Translation Accuracy" Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 31:191-219; Grosjean, H. et al.(1982) "Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes," Gene 18(3):199-209 참조).

상기 설명된 항체들 중 어느 것은 당업자에게 잘 공지된 기술을 이용하여 항-이디오타입 항체를 생성하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Greenspan, N.S. et al.(1989) "Idiotypes: Structure And Immunogenicity," FASEB J. 7:437-444; 및 Nisinoff, A.(1991) "Idiotypes: Concepts And Applications," J. Immunol. 147 (8):2429-2438 참조).

상기 항체들 중 어느 것의 결합 특성은 원한다면 이러한 원하는 특성을 나타내는 변이체에 대한 스크리닝에 의해서 더 개선될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 본 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서는 기능 항체 도메인이 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지닌 파지 입자의 표면에 전시된다. 특정 구체예에서, 이러한 파지를 이용하여 총목록 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 사람 또는 뮤린)로부터 발현된, Fab 및 Fv 또는 이황화 결합 안정화된 Fv와 같은 항원 결합 도메인을 전시할 수 있다. 관심의 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는, 예를 들어 라벨부착 항원 또는 고체 표면이나 비드에 결합되거나 포착된 항원을 사용하여, 항원을 가지고 선택되거나 확인될 수 있다. 이들 방법에 사용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 사상형 파지이다. 항원 결합 도메인은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 어느 하나에 재조합 융합된 단백질로서 발현된다. 본 발명의 면역글로불린 또는 그것의 단편을 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예들은 Brinkman, U. et al.(1995) "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments," J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995; Ames, R.S. et al.(1995) "Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins," J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough, C.A. et al.(1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments " Eur. J. Immunol., 24:952-958, 1994; Persic, L. et al.(1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries," Gene, 187:9-18; Burton, D.R. et al. (1994) "Human Antibodies From Combinatorial Libraries," Adv. Immunol. 57:191-280; PCT 공개 공보 WO 92/001047; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국특허 No. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108에 개시된 것들을 포함한다.

상기 참고자료에 설명된 대로, 파지 선택 후, 파지로부터 항체 코딩 영역이 분리될 수 있고, 그것을 사용하여 사람화된 항체를 포함하는 전체 항체, 또는 어떤 다른 원하는 단편을 생성할 수 있으며, 예를 들어 하기 상세히 설명된 대로, 이들은 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함하는 어떤 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합 생성하는 기술이 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 또한 이용될 수 있으며, 예를 들어 PCT 공개 공보 WO 92/22324; Mullinax, R.L. et al.(1992) "Expression Of A Heterodimeric Fab Antibody Protein In One Cloning Step," BioTechniques, 12 (6):864-869; Sawai et al(1995) "Direct Production Of The Fab Fragment Derived From The Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction And cDNA Expression Vectors," Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34; 및 Better, M. et al. (1988) "Escherichia coli Secretion Of An Active Chimeric Antibody Fragment," Science 240:1041-1043에 개시된 것들이 있다. 단쇄 Fvs 및 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 기술의 예들은 미국특허 No. 4,946,778 및 5,258,498; Huston, J.S. et al.(1991) Protein Engineering Of Single-Chain Fv Analogs And Fusion Proteins," Methods in Enzymology 203:46-88; Shu, L. et al, "Secretion Of A Single-Gene-Encoded Immunoglobulin From Myeloma Cells," Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 90:7995-7999; 및 Skerra. A. et al.(1988) "Assembly Of A Functional Immunoglobulin Fv Fragment In Escherichia coli," Science 240:1038-1040에 설명된 것들을 포함한다.

파지 디스플레이 기술은 B7-H1 및/또는 PD-1에 대한 본 발명의 항체의 친화성을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 이 기술은 본 발명의 조합 방법에 사용될 수 있는 고 친화성 항체를 얻는데 유용하다. 이 기술은 친화성 성숙이라고 하는데, 돌연변이유발이나 CDR 워킹 및 재선택을 이용하며, 이러한 수용체 또는 리간드(또는 이들의 세포외 도메인) 또는 이들의 항원성 단편을 사용하여 초기 항체 또는 모 항체와 비교했을 때 항원에 더 높은 친화성으로 결합하는 항체를 확인한다(예를 들어, Glaser, S. M. et al.(1992) "Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System," J. Immunol. 149:3903-3913 참조). 단일 뉴클레오티드가 아니라 돌연변이 유발한 전체 코돈이 아미노산 돌연변이의 반-무작위 총목록을 가져온다. 서로 단일 CDR에서 단일 아미노산 변경만 차이가 있고, 각 CDR 잔기에 대한 각 가능한 아미노산 치환인 변이체를 함유하는 변이체 클론들의 집합으로 구성된 라이브러리가 구성될 수 있다. 고정된 돌연변이체를 표지된 항원과 접촉시킴으로써 항원에 대한 결합 친화성이 증가한 돌연변이체가 스크리닝될 수 있다. 항원에 대한 결합활성이 증가한 돌연변이 항체를 확인하기 위하여 본 분야에 공지된 어느 스크리닝 방법이든 사용될 수 있다(예를 들어, ELISA)(예를 들어, Wu, H. et al.(1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab" Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(ll):6037-6042; Yelton, D.E. et al.(1995) "Affinity Maturation Of The BR96 Anticarcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis" J. Immunol. 155:1994-2004 참조). 경쇄를 무작위화하는 CDR 워킹을 사용하는 것도 가능하다(Schier et al.(1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. Mol. Biol. 263:551-567 참조).

따라서, 본 발명은 개선된 CDR 및/또는 가변 영역을 확인하기 위해 파지 디스플레이 방법과 협력한 무작위 돌연변이유발의 사용을 고찰한다. 또는 달리, 파지 디스플레이 기술은 직접 돌연변이유발에 의해서 CDR 친화성을 증가(또는 감소)시키기 위하여 사용될 수 있다(예를 들어, 친화성 성숙 또는 "CDR-워킹"). 이 기술은 표적 항원 또는 그것의 항원성 단편을 사용하여 초기 항체 또는 모 항체와 비교했을 때 항원에 더 높은(또는 더 낮은) 친화성으로 결합하는 CDR을 가진 항체를 확인한다(예를 들어, Glaser, S.M. et al.(1992) "Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System" J. Immunol. 149:3903-3913 참조). 단일 뉴클레오티드가 아니라 돌연변이 유발한 전체 코돈이 아미노산 돌연변이의 반-무작위 총목록을 가져온다. 서로 단일 CDR에서 단일 아미노산 변경만 차이가 있고, 각 CDR 잔기에 대한 각 가능한 아미노산 치환인 변이체를 함유하는 변이체 클론들의 집합으로 구성된 라이브러리가 구성될 수 있다. 고정된 돌연변이체를 표지된 항원과 접촉시킴으로써 항원에 대한 결합 친화성이 증가한(또는 감소한) 돌연변이체가 스크리닝될 수 있다. 항원에 대한 결합활성이 증가한(또는 감소한) 돌연변이 항체를 확인하기 위하여 본 분야에 공지된 어느 스크리닝 방법이든 사용될 수 있다(예를 들어, ELISA)(Wu, H. et al.(1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab" Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 95(11):6037-6042; Yelton, D.E. et al.(1995) "Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma 항체 By Codon-Based Mutagenesis," J. Immunol. 155:1994-2004 참조). 경쇄를 무작위화하는 CDR 워킹을 사용하는 것도 가능하다(Schier et al.(1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The 항체 Binding Site," J. Mol. Biol. 263:551-567 참조).

이러한 친화성 성숙을 달성하기 위한 방법들은, 예를 들어 Krause, J.C. et al.(2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, CT. et al(2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas" Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al.(2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes" J. Mol. Biol. 401(l):84-96; Montgomery, D.L. et al(2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-I gp41," MAbs l(5):462-474; Gustchina, E. et al.(2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification of the CDR-H2 Loop of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-I Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al.(2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al.(2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. et al.(2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol. Immunol. 46(1):135-144; 및 Barderas, R. et al(2008) "Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling," Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 105(26):9029-9034에 설명된다.

본 발명은 특히 상기 설명된 항체 및 이들의 항원-결합 단편 중 어느 것의 "유도체들"의 제조 및 사용을 고려한다. 용어 "유도체"는 항원에 면역 특이적으로 결합하지만, "모"(또는 야생형) 분자에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 변형을 포함하는 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 말한다. 이러한 아미노산 치환 또는 부가는 자연 발생(즉, DNA-암호화) 또는 비-자연 발생 아미노산 잔기를 도입할 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는 글리코실화(예를 들어, 만노오스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토오스, 푸코오스, 글루코오스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리코뉴라민산 등의 함량 변경), 아세틸화, 페그화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 절단, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 변경된 탄수화물 변형은 다음 중 하나 이상을 조정한다: 항체의 가용화, 항체의 아세포성 수송 및 분비의 용이성, 항체 조립의 촉진, 입체형태적 완전성 및 항체-매개 이펙터 기능. 특정 구체예에서, 변경된 탄수화물 변형은 해당 탄수화물 변형을 결여하는 항체에 비해서 항체-매개 이펙터 기능을 증진시킨다. 변경된 항체-매개 이펙터 기능을 가져오는 탄수화물 변형은 본 분야에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Shields, R.L. et al.(2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity" J. Biol. Chem. 277(30):26733-26740; Davies J. et al.(2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII," Biotechnology & Bioengineering 74(4):288-294 참조). 탄수화물 함량을 변경하기 위한 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들어 Wallick, S.C. et al.(1988) "Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha(1-6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen," J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M.H. et al.(1989) "Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region" J. Immunol. 143(8):2595-2601; Routledge, E.G. et al.(1995) "The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody," Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S.(2003) "Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glyco engineering," Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R.L. et al.(2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity," J. Biol. Chem. 277(30):26733-26740를 참조한다.

일부 구체예에서, 사람화된 항체는 유도체이다. 이러한 사람화된 항체는 하나 이상의 비-사람 CDR에 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 사람화된 항체 유도체는 비-유도체 사람화된 항체와 비교했을 때 실질적으로 동일한 결합, 개선된 결합, 또는 악화된 결합을 가질 수 있다. 특정 구체예에서, CDR의 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가되었다(즉, 돌연변이됨).

유도체 항체 또는 항체 단편은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 화학적 변형에 의해서 변형될 수 있으며, 이들은 제한은 아니지만 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 제제화, 투니카마이신의 대사 합성 등을 포함한다. 한 구체예에서, 항체 유도체는 모 항체와 유사한 또는 동일한 기능을 지닐 것이다. 다른 구체예에서, 항체 유도체는 모 항체에 비해서 변경된 활성을 나타낼 것이다. 예를 들어, 유도체 항체(또는 그것의 단편)는 그것의 에피토프에 더 강하게 결합할 수 있거나, 또는 모 항체보다 단백질 가수분해에 더 내성일 수 있다.

유도체화된 항체에서 치환, 부가 또는 결실은 항체의 Fc 영역에 있을 수 있으며, 이로써 하나 이상의 FcγR에 대한 항체의 결합 친화성을 변형하는 작용을 할 수 있다. 하나 이상의 FcγR에 대한 결합이 변형되도록 항체를 변형하는 방법은 본 분야에 공지이며, 예를 들어 PCT 공개 공보 No. WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089 및 미국특허 No. 5,843,597 및 5,642,821을 참조한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 활성화 FcγR, 예를 들어 FcγIIIA에 대한 친화성이 변경된 항체들을 포괄한다. 바람직하게, 이러한 변형은 또한 변경된 Fc-매개 이펙터 기능을 가진다. Fc-매개 이펙터 기능에 영향을 미치는 변형은 본 분야에 공지이다(미국특허 No. 6,194,551, 및 WO 00/42072 참조). 한 특정 구체예에서, Fc 영역의 변형은 변경된 항체-매개 이펙터 기능, 다른 Fc 수용체(예를 들어, Fc 활성화 수용체)에 대한 변경된 결합, 변경된 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성, 변경된 C1q 결합 활성, 변경된 보체-의존성 세포독성 활성(CDC), 포식세포성 활성 또는 이들의 어떤 조합을 갖는 항체를 가져온다.

유도체화된 항체는 포유류, 바람직하게 사람에서 모 항체의 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 변경하기 위하여 사용될 수 있다. 바람직하게, 이러한 변경은 15일 초과, 바람직하게 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과, 또는 5개월 초과의 반감기를 가져올 것이다. 포유류, 바람직하게 사람에서 본 발명의 사람화된 항체 또는 그것의 단편의 증가된 반감기는 포유류에서 상기 항체 또는 항체 단편의 더 높은 혈청 역가를 가져오며, 따라서 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도가 감소하고 및/또는 투여되는 상기 항체 또는 항체 단편의 농도가 감소한다. 증가한 생체내 반감기를 갖는 항체 또는 그것의 단편은 당업자에게 공지된 기술에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들어, 생체내 반감기가 증가한 항체 또는 그것의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 수반된다고 확인된 아미노산 잔기를 변형함으로써(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가) 생성될 수 있다. 본 발명의 사람화된 항체는 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여 조작될 수 있다(예를 들어, 미국특허 No. 6,277,375 참조). 예를 들어, 본 발명의 사람화된 항체는 증가된 생체내 또는 혈청 반감기를 갖도록 Fc-힌지 도메인에서 조작될 수 있다.

생체내 반감기가 증가한 항체 또는 그것의 단편은 상기 항체 또는 항체 단편 중합체 분자에, 예를 들어 고 분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 부착함으로써 생성될 수 있다. PEG는 상기 항체 또는 항체 단편에 그대로 또는 다가 링커를 통해서 부착될 수 있으며, 어느 경우든 상기 항체 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 콘쥬게이션을 통해서나 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통해서 이루어진다. 생물학적 활성이 최소한 손실되는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 항체에 대한 PEG 분자의 적절한 콘쥬게이션을 보장하기 위하여 콘쥬게이션 정도가 SDS-PAGE 및 질량분광법에 의해서 면밀히 모니터될 것이다. 미반응 PEG는, 예를 들어 크기 배재 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해서 항체-PEG 콘쥬게이트로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 실질적으로 면역 반응 없이 포유류 순환계에 주사될 수 있는 조성물을 제공하기 위하여 Davis et al.(미국특허 No. 4,179,337 참조)에 의해 설명된 방법 및 커플링제에 의해서 변형될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 사람화된 항체의 프레임워크 잔기의 변형을 포괄한다. 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경하기 위하여, 바람직하게는 개선하기 위하여 CDR 도너 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 이들 프레임워크 치환은 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해서, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용 모델링 및 특정 위치에서 통례를 벗어난 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해서 확인된다. 예를 들어, 미국특허 No. 5,585,089; 및 Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327를 참조한다.

또한, 본 발명은 이종성 분자(즉, 관련 없는 분자)에 재조합 융합되거나 화학적 콘쥬게이트된(공유 및 비공유 콘쥬게이션을 모두 포함한다) 항-사람 B7-H1 및 항-사람 PD-1 항체(및 더 바람직하게는 사람화된 항체)와 이들의 항원-결합 단편을 포괄한다. 융합은 반드시 직접 이루어질 필요는 없고, 링커 서열을 통해서 일어날 수도 있다.

융합 단백질의 Fc 부분은 동형이나 아강에 의해서 변화될 수 있으며, 키메라 또는 혼성체일 수 있으며, 및/또는 예를 들어 이펙터 기능 개선, 반감기 제어, 조직 접근성 개선, 안정성과 같은 생물물리학적 특성 증강, 및 생산 효율(및 비용 절감) 개선을 위하여 변형될 수 있다. 개시된 융합 단백질의 구성에 유용한 많은 변형 및 이들을 제조하는 방법은 본 분야에 공지이며, 예를 들어 Mueller, J.P. et al(1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric Igg2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells" Mol. Immun. 34(6):441-452, Swann, P.G.(2008) "Considerations For The Development Of Therapeutic Monoclonal Antibodies," Curr. Opin. Immun. 20:493-499(2008), Presta, LG.(2008) "Molecular Engineering And Design Of Therapeutic Antibodies," Curr. Opin. Immun. 20:460-470을 참조한다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 자생 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 혼성체이며, 예를 들어 IgG2/IgG4 Fc 불변 영역으로 구성된 키메라이다. Fc 영역에 대한 변형은, 제한은 아니지만 Fc 감마 수용체 및 보체에 대한 결합을 방지하도록 변형된 IgG4, 하나 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 개선하도록 변형된 IgG1, 이펙터 기능이 최소화되도록 변형된 IgG1(아미노산 변화), 글리칸이 없거나 변형된 IgG1(전형적으로 발현 숙주를 변화시킴으로써), 및 FcRn에 대한 pH-의존성 결합이 변경된 IgG1을 포함한다. Fc 영역은 전체 힌지 영역, 또는 전체 힌지 영역 미만을 포함할 수 있다.

비호지킨 림프종 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증에 대해 리툭시맙(CD20에 대한 키메라 마우스/사람 IgG1 단클론 항체)으로 치료된 환자에서 치료 성과는 사람 IgG1의 Fc 도메인에 대해 뚜렷한 고유한 친화성을 가진 Fcγ 수용체의 대립형질 변이체의 개체별 발현과 상관된다. 특히, 저 친화성 활성화 Fc 수용체 CD16A (FcγRIIIA)의 고 친화성 대립형질을 가진 환자는 더 높은 반응 속도를 보였고, 비호지킨 림프종의 경우 무진행 생존기간(progression-free survival)이 개선되었다. 다른 구체예에서, Fc 도메인은 저 친화성 저해성 Fc 수용체 CD32B(FcγRIIB)에 대한 결합을 감소시키고, 저 친화성 활성화 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)에 대한 결합의 야생형 수준을 보유하거나 결합을 증진시키는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유할 수 있다.

다른 구체예는 IgG2-4 혼성체 및 IgG4 돌연변이체를 포함하는데, 이들은 FcR에 대한 결합이 감소하여 반감기가 증가한다. 대표적인 IG2-4 혼성체 및 IgG4 돌연변이체는 Angal, S. et al.(1993) "A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of Chimeric Mouse/Human(IgG4) 항체," Molec. Immunol. 30(1): 105-108; Mueller, J.P. et al.(1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells," Mol. Immun. 34(6):441-452; 및 미국특허 No. 6,982,323에 설명된다. 일부 구체예에서, 예를 들어 IgG1 및/또는 IgG2 도메인이 결실되며, Angal et al.은 세린 241이 프롤린으로 치환된 IgG1 및 IgG2를 설명한다.

바람직한 구체예에서, Fc 도메인은 CD16A에 대한 결합을 증진시키는 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유한다. 사람 IgG1의 Fc 도메인에서 CD16A와의 결합을 증가시키고 CD32B에 대한 결합을 감소시키는 많은 수의 치환체가 본 분야에 공지되어 있으며, Stavenhagen, J.B. et al.(2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors" Cancer Res. 57(18):8882-8890을 참조한다. CD32B에 대한 결합이 감소되고 및/또는 CD16A에 대한 결합이 증가된 사람 IgG1 Fc 도메인의 예시적인 변이체들은 F243L, R929P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 함유한다. 이들 아미노산 치환은 어떤 조합으로든 사람 IgG1 Fc 도메인에 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 사람 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R929P 및 Y300L 치환을 함유한다. 다른 구체예에서, 사람 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R929P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 함유한다. 다른 구체예에서, 사람 IgG1 Fc 도메인 변이체는 N297Q 치환을 함유하며, 이 돌연변이는 FcR 결합을 파기한다.

한 구체예에서, 이러한 이종성 분자들은 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 또는 달리, 이러한 이종성 분자들은 효소, 호르몬, 세포 표면 수용체, 약물 부분, 예를 들어 톡신(아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신(즉, PE-40), 디프테리아 톡신, 리신, 겔로닌, 또는 미국자리공 항바이러스 단백질 등), 단백질(종양괴사인자, 인터페론(예를 들어, α-인터페론, β-인터페론 등), 신경성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 또는 세포자멸제(예를 들어, 종양괴사인자-α, 종양괴사인자-β) 등), 생물학적 반응 변형제(예를 들어, 림포카인(예를 들어, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6")), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극인자("G-CSF"), 또는 대식세포 콜로니 자극인자("M-CSF"), 또는 성장인자(예를 들어, 성장 호르몬("GH")), 세포독소(예를 들어, 세포증식억제제 또는 살세포제, 예를 들어 파클리탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파놀롤, 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF), 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE; 예를 들어, 베도틴) 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 상동체), 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, BiCNU®(카뮤스틴; BSNU) 및 로뮤스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스디클로로디아민 플래티늄(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생물질(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 또는 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)일 수 있다.

이러한 치료적 부분을 항체에 콘쥬게이트하는 기술은 공지이다: 예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld et al.(eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.; Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in CONTROLLED DRUG DELIVERY(2nd Ed.), Robinson et al.(eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera et al.(eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin et al.(eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; Thorpe et al.(1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62: 119-158; Carter, P.J. et al.(2008) "Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy," Cancer J. 14(3): 154-169; Alley, S.C. et al.(2010) "Antibody-Drug Conjugates: Targeted Drug Delivery For Cancer," Curr. Opin. Chem. Biol. 14(4):529-537; Carter, P. et al.(2005) "Designer Antibody-Based Therapeutics For Oncology," Amer. Assoc. Cancer Res. Educ. Book. 2005(1): 147-154; Carter, P.J. et al.(2008) "Antibody-Drug Conjugates For Cancer Therapy," Cancer J. 14(3): 154-169; Chari, R.V.J.(2008) "Targeted Cancer Therapy: Conferring Specificity To Cytotoxic Drugs," Acc. Chem Res. 41(1):98-107; Doronina, S.O. et al.(2003) "Development Of Potent Monoclonal 항체 Auristatin Conjugates For Cancer Therapy," Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; Ducry, L. et al.(2010) "Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads To Monoclonal Antibodies," Bioconjug Chem. 21(1):5-13; Senter, P.D.(2009) "Potent Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy," Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244; and Teicher, B.A.(2009) "Antibody-Drug Conjugate Targets," Curr Cancer Drug Targets. 9(8):982-1004를 참조한다.

본 발명의 분자 중 어느 것은 정제를 촉진하기 위해서 펩티드와 같은 마커 서열과 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 헥사 히스티딘 펩티드, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 "HA" 택(Wilson, LA. et al.(1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein," Cell, 37:767-778) 및 "플랙" 택(Knappik, A. et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments," Biotechniques 17(4):754-761)이다.

본 발명은 또한 진단 또는 치료제 또는 혈청 반감기가 증가되는 것이 바람직한 어느 다른 분자에 콘쥬게이트된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 포괄한다. 항체는, 예를 들어 주어진 치료 섭생의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 과정의 일부로서, 예를 들어 질환, 장애 또는 감염의 발생이나 진행을 모니터하기 위해서 진단적으로(생체내, 인시튜 또는 시험관내) 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출가능한 물질과 연결함으로써 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예들은 다양한 효소, 인공적 기, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 포지트론 방출 금속, 및 비-방사성 상자기 금속 이온을 포함한다. 검출가능한 물질은 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 항체에 직접, 또는 중간체(예를 들어, 본 분야에 공지된 링커와 같은)를 통해서 간접적으로 연결되거나 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 진단제로서 사용하기 위한 항체에 콘쥬게이트될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국특허 No. 4,741,900을 참조한다. 이러한 진단 및 검출은, 제한은 아니지만 검출가능한 물질에 항체를 연결함으로써 달성될 수 있으며, 이들은 제한은 아니지만 양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리성 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하는 다양한 효소; 제한은 아니지만 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴과 같은 인공적 기 복합체; 제한은 아니지만 움베릴페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린과 같은 형광 물질; 제한은 아니지만 루미놀과 같은 발광 물질; 제한은 아니지만 루시페라제, 루시페린 및 에쿠오린과 같은 생물발광 물질; 제한은 아니지만 비스무스(213Bi), 탄소(14C), 크롬(51Cr), 코발트(57Co), 플루오린(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 갈륨(68Ga, 67Ga), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, mIn), 요오딘(131I, 125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브데늄(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루테늄(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), 스트론튬(85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113 Sn, 117Sn), 트리늄(3H), 제논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y), 아연(65Zn)과 같은 방사성 물질; 다양한 포지트론 방출 토모그래피를 사용한 포지트론 방출 금속; 및 비-방사성 상자성 금속 이온을 포함한다.

본 발명의 분자는 미국특허 No. 4,676,980에서 Segal에 의해서 설명된 항체 이종콘쥬게이트를 형성하기 위해서 제2 항체와 콘쥬게이트될 수 있다. 이러한 이종콘쥬게이트 항체는 추가로 헵텐(예를 들어, 플루오레세인 등) 또는 세포성 마커(예를 들어, 4-1-BB, B7-H4, CD4, CD8, CD14, CD25, CD27, CD40, CD68, CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT, ICOS, B7-H3, B7-H7, B7-H7CR, CD70, CD47 등) 또는 사이토카인(예를 들어, IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-베타, IL-10, IL-17, IKNγ, Flt3, BLys) 또는 케모카인(예를 들어, CCL21) 등과 결합할 수 있다.

본 발명의 분자는 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이것은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편과의 결합을 통해서 지지체에 고정된 표적 항원 또는 표적 항원과 결합할 수 있는 다른 분자의 면역분석이나 정제에 특히 유용하다. 이러한 고체 지지체는, 제한은 아니지만 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함한다.

추가로, 본 발명은 어느 이러한 항체, 융합 단백질 또는 단편을 암호화하는 핵산 분자(DNA 또는 RNA), 및 이러한 핵산 분자를 전달하거나 복제할 수 있는 벡터 분자(플라스미드와 같은)를 포함한다. 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥일 수 있으며, 단일-가닥과 이중-가닥 부분을 모두 함유할 수 있다.

A. 본 발명의 바람직한 조정제 조성물

본 발명은 특히 B7-Hl 또는 PD-1과 면역 특이적으로 결합하고, 및/또는 대상에서 PD-1과 결합하는 B7-H1의 능력을 조정하는 항체에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "대상"은 바람직하게 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류(예를 들어, 원숭이 및 사람)와 같은 포유류이고, 사람인 것이 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명은 특히 사람 B7-H1 또는 사람 PD-1과 면역 특이적으로 결합하여 사람 또는 사람 조직(인시튜 또는 생체외)에서 PD-1과 결합하는 B7-H1의 능력을 조정하는 사람화된 항체, 및 그것의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

가장 바람직하게, 이러한 항체 및 항원-결합 단편은 이러한 대상의 T 세포의 표면에 어레이된 PD-1(특히 내인성 농도로 발현된) PD-1과 결합하는 대상의 APC의 표면에 어레이된 B7-H1(특히 내인성 농도로 발현된)의 능력을 조정할 수 있는 충분한 결합활성을 지닐 것이며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 용어 "내인성 농도"는 내인성 분자가 정상, 암 또는 감염된 세포에서 자생적으로 발현되는 수준을 말한다(즉, 발현 벡터 또는 재조합 프로모터 없이).

한 구체예에서, 이러한 조정은 이러한(바람직하게는 내인성 발현되고) 어레이된 B7-H1과 이러한(바람직하게는 내인성 발현되고) 어레이된 PD-1의 결합을 저해하거나 또는 방해하는 것을 포함할 것이다. 대안의 구체예에서, 이러한 조정은 내인성 발현되고 어레이된 B7-H1과 내인성 발현되고 어레이된 PD-1의 결합을 증진시키거나 또는 촉진하는 것을 포함할 것이다. 또 다른 구체예에서, 이러한 조정은 항-B7-H1 또는 항-PD-1의 결합이 상응하는 수용체를 통해서 신호 전달을 촉발하는 직접적 항진작용(agonism)을 포함한다.

(1) 바람직한 항-사람 B7-H1 항체 및 이들의 CDRs

본 발명에 따라서, 이러한 분자는 사람 B7-H1에 면역 특이적인 항체를 생산하는 것들에 대해서 하이브리도마 라인을 스크리닝하고, 이어서 선택적으로 이러한 라인들 중에서 조정 활성(예를 들어, 중화 활성, 항진 활성, 변경된 신호 전달 활성 등)을 나타내는 것들에 대해서 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 본 발명은 특히 항-사람 B7-H1 클론인 1E12, 1F4, 2G11, 3B6, 및 3D10을 제공한다.

항-사람 B7-H1 클론에 의해서 발현된 항체는 이들의 가변 도메인이 드러나도록 서열화되었다. CDR 서열은 굵은 글씨체에 밑줄로 표시된다:

(2) 바람직한 항-사람 PD-1 항체 및 이들의 CDRs

또는 달리, 이러한 항체는 사람 PD-1에 면역 특이적인 항체를 생산하는 것들에 대해서 하이브리도마 라인을 스크리닝하고, 이어서 이러한 라인들 중에서 조정 활성(예를 들어, 중화 활성, 항진 활성, 변경된 신호 전달 활성 등)을 나타내는 것들에 대해서 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 본 발명은 특히 항-사람 PD-1 클론인 1E3, 1E8, 및 1H3을 제공한다.

항-사람 PD-1 클론에 의해서 발현된 항체는 이들의 가변 도메인이 드러나도록 서열화되었다. CDR 서열은 굵은 글씨체에 밑줄로 표시된다:

(3) 본 발명의 항-사람 B7-H1 및 항 사람 PD-1 항체의 공통 CDR

공통 CDR 서열과 유사한 결합 속성을 제공할 것 같은 가능한 변이체 CDR 서열을 확인하기 위해 확인된 항체의 CDR의 분석이 수행되었다. 이러한 변이체 CDR은 표 1에 따라서 Blosum62.iij 분석을 사용하여 산출되었다. Blosum62.iij 치환 점수가 표 1에 제시된다. 점수가 높을수록 치환이 더 보존성이며, 따라서 해당 치환이 기능에 영향을 미치지 않을 가능성이 더 많다.

본 발명은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 변이체 CDR을 가진 신규 항체 및 항원-결합 단편의 형성을 허락한다. 본 발명의 방법은 상이한 CDR의 실질적인 수를 확인했기 때문에, 본 발명은 특정한 확인된 CDR의 어느 변이체에 필요할 수 있는 CDR 잔기의 인식이 가능하다. 이러한 잔기들은 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5에 굵은 글씨로 표시된다. 비교된 CDR 중에서 변할 수 있다고 판명된 잔기들에 대해서, 표 1의 치환 점수는 허락된 치환이 무엇인지 결정하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 특정한 CDR의 특정한 잔기가 R 또는 S로 변할 수 있다고 판명된 경우, R 및 S는 -1의 치환 점수를 가지며, -1 이상의 치환 점수를 갖는 R 또는 S의 치환은 관찰된 변이체(R 또는 S)만큼 가능성이 있어서(또는 R 또는 S보다 더 가능성이 있다), 상기 특정한 CDR의 것과 충분히 유사한 결합 속성을 가진 변이체 CDR이 생성되고, 기능적 항-B7-H1 또는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 단편을 형성하는데 이 변이체 CDR이 대신 사용될 수 있다. 각 위치에 대해서, 더 높은 치환 점수를 갖는 잔기의 선택은 낮은 치환 점수를 갖는 잔기의 선택보다 바람직하다.

표 2는 항-B7-H1 항체의 경쇄 CDR의 분석을 제시하며, 본 발명의 관찰된 그리고 바람직한 변이체 경쇄 항-B7-H1 CDR의 공통 서열을 제공한다.

표 3은 항-B7-H1 항체의 중쇄 CDR의 분석을 제시하며, 본 발명의 관찰된 그리고 바람직한 변이체 항-B7-H1 중쇄 CDR의 공통 서열을 제공한다.

따라서, 항-B7-H1 항체의 CDR, 즉 1E12, 1F4, 2G11, 3B6 및 3D10을 지닌 항체 및 항원-결합 단편에 더하여, 본 발명은 추가로 상기 설명된 경쇄 및/또는 중쇄 공통 서열을 갖는 CDR을 가진 항체 및 항원-결합 단편을 제공한다.

표 4는 항-PD-1 항체의 경쇄 CDR의 분석을 제시하며, 본 발명의 관찰된 그리고 바람직한 변이체 경쇄 항-PD-1 CDR의 공통 서열을 제공한다.

표 5는 항-PD-1 항체의 중쇄 CDR의 분석을 제시하며, 본 발명의 관찰된 그리고 바람직한 변이체 항-PD-1 중쇄 CDR의 공통 서열을 제공한다.

따라서, 항-PD-1 항체의 CDR, 즉 1E3, 1E8 및 1H3을 지닌 항체 및 항원-결합 단편에 더하여, 본 발명은 추가로 상기 설명된 경쇄 및/또는 중쇄 공통 서열을 갖는 CDR을 가진 항체 및 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 상기 클론 중 어느 것에 의해서 생산된 마우스 단클로성 항체의 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그것의 단편을 포괄하며, 이들은 B7-H1 또는 PD-1에 대해 면역 특이적 결합을 나타낸다. 본 발명은 또한 상기 열거된 클론의 CDR의 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 CDR을 포함하는 항체 또는 그것의 단편을 포괄하며, 이들은 B7-H1 또는 PD-1에 대해 면역 특이적 결합을 나타낸다. 두 아미노산 서열의 동일성 퍼센트의 결정은 BLAST 단백질 비교에 의해서 결정될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 상기 설명된 바람직한 항체의 CDR의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 더 바람직하게 여섯 전부를 포함할 것이며, 사람 B7-H1 또는 PD-1과 결합하는 능력을 나타낼 것이다.

B. 본 발명의 바람직한 조성물의 치료적 및 예방적 사용

본 발명은 특히 사람 B7-H1 또는 사람 PD-1과 면역 특이적으로 결합하고, 및/또는 분자(B7-H1 또는 PD-1)가 대상(예를 들어, 사람 환자)에서 내인성 발현되어 어레이됨에 따라 B7-H1과 PD-1 사이의 결합을 조정할 수 있고 및/또는 PD-1 또는 B7-H1을 통해서 신호화를 조정할 수 있는 분자(특히 항체 또는 그것의 항원-결합 단편)의 치료적 및/또는 예방적 사용에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "치료한다", "치료하는", "치료" 및 "치료적 사용"은 B7-H1과 PD-1의 상호작용에 의해서 악화되는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 제거, 감소 또는 개선을 말한다. 본원에서 사용된 "치료적 유효량"은 이러한 증상의 임상적으로 유의한 제거, 감소 또는 개선을 매개할 수 있는 충분한 치료제의 양을 말한다. 효과는 그것의 크기가 수용자 환자의 건강이나 예후에 영향을 미칠 수 있을 만큼 충분하다면 임상적으로 유의하다. 치료적 유효량은 질환의 개시를 지연시키거나 최소화할 수 있는, 즉 암의 전파를 지연시키거나 최소화할 수 있는 충분한 치료제의 양을 말할 수 있다. 또한, 치료적 유효량은 질환의 치료 또는 관리에서 치료적 유익을 제공하는 치료제의 양을 말할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료제와 관련하여 치료적 유효량은 질환의 치료 또는 관리에서 치료적 유익을 제공하는, 예를 들어 질환을 치료하거나 관리할 수 있는 충분한 치료적 항체의 치료적 효능을 증진시킬 수 있는 충분한 치료제만의, 또는 다른 치료법과 조합된 양을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "예방제"는 장애 또는 질환의 어느 증상의 검출 전에 이러한 장애 또는 질환의 예방에서 사용될 수 있는 제제를 말한다. "예방적 유효량"은 이러한 보호를 매개할 수 있는 충분한 예방제의 양이다. 또한, 예방적 유효량은 질환의 예방에서 예방적 유익을 제공하는 예방제의 양을 말할 수 있다. 또한, 본 발명의 예방제와 관련하여 예방적 유효량은 질환의 예방에서 예방적 유익을 제공하는 예방제만의, 또는 다른 제제와 조합된 양을 의미한다.

여기 제공된 투여의 투약량 및 빈도는 용어 '치료적으로 효과적인' 및 '예방적으로 효과적인' 의해 포함된다. 투약량 및 빈도는 또한 전형적으로 투여되는 구체적인 치료제 또는 예방제, 암의 종류 및 중증도, 투여 경로 및 환자의 연령, 체중, 반응 및 과거 의료 이력에 따라서 각 환자에 대해 특정된 요인들에 따라서 변할 것이다. 이러한 요인들을 고려하고, 예를 들어 문헌에 보고되고 Physician's Desk Reference(56th ed., 2002)에 권고된 투약량을 따름으로써 적합한 섭생이 당업자에 의해서 선택될 수 있다.

1. 면역계의 상향 조정제의 사용

바람직한 구체예에서, 이러한 항체 및 단편은 B7-H1 - PD-1 결합 부위 근처에서 B7-H1 또는 PD-1에 하나 이상의 부위에서 이들 항원과 결합하고 이들을 파괴한다. 상기 논의된 대로, PD-1과 B7-H1 사이의 상호작용은 T 세포의 증식을 저해사고, 여러 사이토카인의 생산을 감소시킨다(Sharpe, A.H. et al.(2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2: 116-126 참조). 따라서, 바람직한 구체예에서, 대상에 본 발명의 분자의 투여는 B7-H1 - PD-1 결합을 길항함으로써 대상의 면역계를 상향 조정한다. 다른 구체예에서, 항-PD-1 항체의 결합활성 및/또는 친화성은 그것이 매우 높은 수준의 PD-1을 발현하는 T 세포에만 결합하는(B7-H1 결합은 차단한다) 정도일 수 있으며, 이들은 고갈된 또는 기능부전성 T 세포이고, 따라서 이 세포 집단의 특이적 표적화를 허용한다. 따라서, 본 발명은 IFN-γ의 증가된 생산을 매개하기 위한 본 발명의 항체의 사용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 IFN-γ로 치료될 수 있는 질환 및 상태, 예를 들어 난소암 및 다른 형태의 암, 만성 육아종 질환, 골석화증, 프레드리히 운동실조증 등의 치료에서 이러한 항체의 사용에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 특히 증가된 T 세포 증식을 매개하기 위한 본 발명의 항체의 사용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 T 세포를 증가시킴으로써 치료할 수 있는 질환 및 상태, 예를 들어 AIDS; 중증 복합 면역결핍증(SCID); 오멘 증후군; 연골-모발 형성부전증; 장기 또는 조직 이식 또는 화학치료에 따른 T 세포 손실 또는 소모; 저감마글로불린혈정; X-결합 무감마글로불린혈증; 일시적 저감마글로불린혈증; 이상감마글로불린혈증; IgA 결핍; TgG 결핍; TgM 결핍; 과 IgM 증후군; 비스코트-알드리히 증후군; 과 IgE 증후군; 공통 가변 면역결핍증; ICF 증후군; 흉선형성부전증(예를 들어, 디 죠지 증후군; 네젤로프 증후군; 모세혈관확장성 운동실조증); 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 결핍; 아데노신 데아미나아제 결핍; ZAP70 결핍; 무표지 림프구 증후군; 백혈구감소증; 림프구감소증(예를 들어, 특발성 CD4+ 림프구감소증); 또는 보체 결핍의 치료에서 이러한 항체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 특히 IFN-γ의 증가된 생산과 증가된 T 세포 증식을 모두 매개하기 위한 본 발명의 항체의 사용에 관한 것이다.

면역계의 상향 조절은 특히 암 및 만성 감염의 치료에서 바람직하며, 따라서 본 발명은 이러한 장애에서 활용도를 가진다. PD-1과 B7-H1은 HIV 감염시 과발현된다(Xu, Huanbin et al.(2010) "Increased B7 -HI Expression on Dendritic Cells Correlates with Programmed Death I Expression on T Cells in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques and May Contribute to T Cell Dysfunction and Disease Progression," J. Immunol. 185:7340-7348; Grabmeier-Pfistershammer, K. et al.(2011) "Identification of PD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV- 1 -Infected Patients on Treatment," J Acquir. Immune Defic. Syndr. 56(2): 118-124). 따라서, 이러한 세포에서 B7-H1의 발현은 사람에서 HIV를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-PD-1 및 항-B7-H1 항체는 HIV 감염 및 AIDS 치료를 위한 치료제로서 특정한 활용도를 가진다. 본원에서 사용된 용어 "암"은 세포의 비정상적인 조절되지 않는 성장으로 인해 생긴 신생물 또는 종양을 말한다. 본원에서 사용된 암은 백혈병과 림프종을 분명히 포함한다. 용어 "암"은 먼 부위까지 전이할 수 있는 가능성을 가진 세포를 수반하는 질환을 말하며, 비-암세포의 것들과는 다른 표현형적 특징, 예를 들어 연 한천과 같은 3차원 기판에서 콜로니의 형성 또는 3차원 기저막 또는 세포외 바탕질 제제에서 관형 망구조 또는 웹 모양 바탕질의 형성을 나타낸다. 비-암세포는 연 한천에서 콜로니를 형성하지 않고, 3차원 기저막이나 세포외 바탕질 제제에서 뚜렷한 구체 모양 구조를 형성한다.

본 발명의 방법 및 조성물에 의해서 치료 또는 예방될 수 있는 암 및 관련 장애들은, 제한은 아니지만 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 예를 들어 골수모구성, 전골수성, 골수단구성, 단구성, 적백혈병 백혈병 및 골수형성이상 증후군, 만성 백혈병, 제한은 아니지만 예를 들어 만성 골수성(과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 모양 세포 백혈병을 포함하는 백혈병; 적혈구증가증; 제한은 아니지만 호지킨병 또는 비호지킨병 림프종과 같은 림프종(예를 들어, 확산성 미분화성 림프종 키나아제(ALK) 음성, 거대 B 세포 림프종(DLBCL); 확산성 미분화성 림프종 키나아제(ALK) 양성, 거대 B 세포 림프종(DLBCL); 미분화성 림프종 키나아제(ALK) 양성, ALK+ 미분화성 대세포 림프종(ALCL), 급성 골수성 림프종(AML)); 제한은 아니지만 무증상 다발성 골수종, 비분비성 골수종, 골경화성 골수종, 형질세포 백혈병, 고립성 형질세포종 및 골수외 형질세포종과 같은 다발성 골수종; 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증; 불분명한 징후의 단클론성 감마글로불린병증; 양성 단클론성 감마글로불린병증; 중쇄 질환; 제한은 아니지만 뼈 육종, 골육종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 거대세포 종양, 뼈의 섬유육종, 척삭종, 골막성 육종, 연조직 육종, 혈관육종, 섬유육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 신경초종, 횡문근육종, 활막육종과 같은 뼈 및 결합조직 육종; 제한은 아니지만 신경교종, 성상세포종, 뇌줄기신경교종, 상의세포종, 핍지교종, 비신경교성 종양, 청신경초종, 두개인두종, 수모세포종, 뇌수막종, 송과체세포종, 송과체모세포종, 원발성 뇌 림프종을 포함하는 뇌종양; 제한은 아니지만 선암종, 소엽성(소세포) 암종, 선관내 암종, 수질성 유방암, 점액소성 유방암, 관 유방암, 유두 유방암, 파제트병 및 염증성 유방암을 포함하는 유방암; 제한은 아니지만 크롬친화세포종 및 부신피질 암종을 포함하는 부신암; 제한은 아니지만 유두성 또는 여포성 갑상선암, 수질성 갑상선암 및 미분화성 갑상선암을 포함하는 갑상선암; 제한은 아니지만 인슐린종, 가스트린종, 글루카곤종, 비포마, 소마토스타틴-분비성 종양 및 유암종 또는 섬세포 종양을 포함하는 췌장암; 제한은 아니지만 쿠싱병, 프로락틴-분비성 종양, 말단비대증 및 요붕증을 포함하는 뇌하수체암; 제한은 아니지만 홍채 흑색종, 맥락막 흑색종, 및 섬모체 흑색종과 같은 안구 흑색종 및 망막모세포종을 포함하는 안암; 제한은 아니지만 편평세포 암종, 선암종 및 흑색종을 포함하는 질암; 제한은 아니지만 편평세포 암종, 흑색종, 선암종, 기저세포 암종, 육종 및 파제트병을 포함하는 외음부암; 제한은 아니지만 편평세포 암종 및 선암종을 포함하는 자궁경부암; 제한은 아니지만 자궁내막 암종 및 자궁 육종을 포함하는 자궁암; 제한은 아니지만 난소 상피 암종, 경계선상 종양, 생식세포 종양 및 기질성 종양을 포함하는 난소암; 제한은 아니지만 편평암, 선암종, 선양낭포 암종, 점막표피양 암종, 선편평 암종, 육종, 흑색종, 형질세포종, 우상 암종 및 연맥세포(소세포) 암종을 포함하는 식도암; 제한은 아니지만 선암종, 돌출성(용종), 궤양성, 표재 전파성, 확산 전파성, 악성 림프종, 지방육종, 섬유육종 및 암육종을 포함하는 위암; 결장암; 직장암; 제한은 아니지만 간세포성 암종 및 간모세포종을 포함하는 간암; 제한은 아니지만 선암종을 포함하는 담낭암; 제한은 아니지만 유두성, 결절성 및 확산성을 포함하는 쓸개관암종; 제한은 아니지만 비-소세포 폐암, 편평세포 암종(표피양 암종), 선암종, 대세포 암종 및 소세포 폐암을 포함하는 폐암; 제한은 아니지만 생식 종양, 정낭피종, 미분화성, 고전적인(전형적인), 정모세포성, 비정낭피종, 배아 암종, 기형암종, 융모암(난황난 종양)을 포함하는 고환암; 제한은 아니지만 선암종, 평활근육종, 횡문근육종을 포함하는 전립선암; 형벌적 암들; 제한은 아니지만 편평세포 암종을 포함하는 구강암; 기저암; 제한은 아니지만 선암종, 점막표피양 암종 및 선양낭성 암종을 포함하는 침샘암; 제한은 아니지만 편평세포암 및 우상암을 포함하는 인두암; 제한은 아니지만 기저세포 암종, 편평세포 암종 및 흑색종, 표재 전파성 흑색종, 결절성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종을 포함하는 피부암; 제한은 아니지만 신장세포암, 선암종, 부신종, 섬유육종, 이행세포암(신우 및/또는 요관)을 포함하는 신장암; 윌름스 종양; 제한은 아니지만 이행 세포 암종, 편평 세포 암종, 선암종, 암육종을 포함하는 방광암을 포함하며, 이들에 제한되는 것은 아니다. 이에 더하여, 암들은 점액육종, 골원성 육종, 내피육종, 림프관내피육종, 중피종, 활막종, 혈관모세포종, 상피암종, 낭종암, 기관지 암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종 및 유두 선암종을 포함한다(이러한 장애들에 대해서는 Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et ah, 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books USA, Inc., United States of America 참조).

따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 여러 암 또는 다른 비정상적 증식 질환의 치료 또는 예방에 유용하며, 이들은 (제한은 아니지만) 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 피부의 암종, 편평세포 암종을 포함하는 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 버킷 림프종을 포함하는 림프양 계통의 조혈성 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수성 백혈병을 포함하는 골수양 계통의 조혈성 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 간엽 기원의 종양; 흑색종, 정낭피종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경교종을 포함하는 다른 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소건피증, 각화극세포종, 정낭피종, 갑상선 여포성 암 및 기형암종을 포함한다. 또한, 세포자멸의 이상에 의해서 야기되는 암도 본 발명의 방법 및 조성물에 의해서 치료될 것이라고 생각된다. 이러한 암들은, 제한은 아니지만 여포성 림프종, p53 돌연변이를 가진 암종, 유방, 전립선 및 난소의 호르몬 의존성 종양, 및 가족성 대장 용종증 및 골수형성이상 증후군과 같은 전암성 병소를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 난소, 방광, 유방, 결장, 폐, 피부, 췌장 또는 자궁의 악성 및 이상증식성 변화(변질형성 및 형성이상과 같은), 또는 과증식성 장애가 본 발명의 방법 및 조성물에 의해서 치료 또는 예방된다. 다른 특정 구체예에서, 육종, 흑색종 또는 백혈병이 본 발명의 방법 및 조성물에 의해서 치료 또는 예방된다.

암 세포는 이들의 발생 동안 메커니즘은 다양하지만 특징적인 일단의 기능적 능력들을 취득한다. 이러한 능력들은 세포자멸의 회피, 성장 신호의 자족성, 항-성장 신호에 대한 무감각성, 조직 침입/전이, 한없이 확장하는 가능성, 및 지속적 혈관형성을 포함한다. 용어 "암 세포"는 전-악성 및 악성 암 세포를 모두 포괄하는 의미이다. 일부 구체예에서, 암은 국소화되어 유지된 양성 종양을 말한다. 다른 구체예에서, 암은 이웃 신체 구조에 침입하여 파괴하고 먼 부위까지 전파된 악성 종양을 말한다. 또 다른 구체예에서, 암은 특정한 암 항원(예를 들어, 범-암종 항원(KS 1/4), 난소 암종 항원(CA125), 전립선 특이적 항원(PSA), 암배 항원(CEA), CD19, CD20, HER2/neu 등)과 관련된다.

본 발명의 항체 및 항체 단편은 비정상적으로 높은 수준의 PD-1을 발현하는 세포(예를 들어, 고갈된 T 세포, B 세포, 단구 등)와 관련된 암의 치료에 특히 유용하다(Youngblood, B.(2011) "Chronic Virus Infection Enforces Demethylation Of The Locus That Encodes PD-1 In Antigen-Specific CD8(+) T Cells," Immunity 35(3):400-412; Spahn, J. et al.(2011) "Ineffective CD8(+) T-Cell Immunity To Adeno-Associated Virus Can Result In Prolonged Liver Injury And Fibrogenesis" Amer. J. Pathol. 179(5):2370-2381; Wang, C. et al.(2011) "Phenotype, Effector Function, And Tissue Localization Of PD-1-Expressing Human Follicular Helper T Cell Subsets," BMC Immunol. 12:53, 1-15; Eichbaum, Q.(2011) "PD-1 Signaling In HIV And Chronic Viral Infection Potential For Therapeutic Intervention?" Curr. Med. Chem. 18(26):3971-3980; Hallett, W.H. et al.(2011) "Immunosupprive Effects Of Multiple Myeloma Are Overcome By PD-L1 Blockade," Biol Blood Marrow Transplant. 17(8):1133-1145; Ni, L. et al.(2010) "PD-1 Modulates Regulatory T Cell And Suppresses T-Cell Responses In HCV-Associated Lymphoma" Immunol. Cell. Biol. 89(4):535-539; Inozume, T. et al.(2010) "Selection Of CD8+PD-1+ Lymphocytes In Fresh Human Melanomas Enriches For Tumor-Reactive T Cells," J. Immunother. 33(9):956-964; 및 Jin, H.T. et al.(2010) "Cooperation Of Tim-3 And PD-1 In CD8 T-Cell Exhaustion During Chronic Viral Infection," Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 107(33):14733-14738).

상기 논의된 종양들에 대한 용도와 유사하게, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 단독으로, 또는 애쥬번트로서 백신 또는 항미생물제와 조합되어 사용될 수 있으며, 이로써 독소 또는 자기 항원에 대한, 또는 병원균(예를 들어, 바이러스, 예를 들어, HIV, HTLV, 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 우두 바이러스, 광견병 바이러스; 박테리아, 예를 들어 미코박테리아(Mycobacteria), 스타필로코시(Staphylococci), 스트렙토코시(Streptococci), 뉴모노코시(Pneumonococci), 메닝고코시(Meningococci), 코노코시(Conococci), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 레지오넬라(Legionella), 코리네박테리아(Corynebacteria), 살모넬라(Salmonella), 비브리오(Vibrio), 클로스트리디아(Clostridia), 바실리(Bacilli), 파스테우렐라(Pasteurella), 렙토스피로시스(Leptospirosis), 보르다텔라(Bordatella)의 것들, 및 콜레라, 파상풍, 보툴리넘 식중독, 탄저병, 페스트 및 라임병과 관련된 이러한 병원균; 또는 진균 또는 기생성 병원균, 예를 들어 칸디다(Candida)(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 아스페르길루스(Aspergillus)(주미가투스(jumigatus), 니거(niger) 등), 뮤코랄레스(Mucorales) 속(뮤코(mucor), 앱시디아(absidia), 리조푸스(rhizophus), 스포로트릭스(Sporothrix)(션키(schenkii)), 블라스토미세스(Blastomyces)(더마티티디스(dermatitidis)), 파라코시디오이데스(Paracoccidioides)(브라실리엔시스(brasiliensis)), 코시디오이데스(Coccidioides)(이미티스(immitis)) 및 히스토플라스마(Histoplasma)(캡슐라툼(capsulatum)), 엔타모에바(Entamoeba), 히스톨리티카(histolytica), 발란티듐 콜리(Balantidium coli), 내글레리아 파울레리(Naegleria fowleri), 아칸타모에바(Acanthamoeba sp.), 지아디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리듐(Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondi) 등), 스포로트릭스(Sporothrix), 블라스토미세스(Blastomyces), 파라코시디오이데스(Paracoccidioides), 코시디오이데스(Coccidioides), 히스토플라스마(Histoplasma), 엔타모에바(Entamoeba), 히스톨리티카(Histolytica), 발란티듐(Balantidium), 내글레리아(Naegleria), 아칸타모에바(Acanthamoeba), 지아디아(Giardia), 크립토스포리듐(Cryptosporidium), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 플라스모듐(Plasmodium), 바베시아(Babesia), 또는 트리파노소마(Trypanosoma) 등)에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 감염성 질환의 치료에서 활용도를 가진다.

2. 면역계의 하향 조절제의 사용

대안의 구체예에서, 본 발명의 항-B7-H1 또는 항-PD-1 항체는 B7-H1나 PD-1의 항-이디오타입 펩티드 또는 항체(Wallmann, J. (2010) "Anti-Ids in Allergy: Timeliness of a Classic Concept," World Allergy Organiz. J. 3(6):195-201; Nardi, M. et al.(2000) "Antiidiotype Antibody Against Platelet Anti-Gpiiia Contributes To The Regulation Of Thrombocytopenia In HIV-1-ITP Patients," J. Exp. Med. 191(12):2093-2100) 또는 의태체(Zang, Y.C. et al.(2003) "Human Anti-idiotypic T Cells Induced By TCR Peptides Corresponding To A Common CDR3 Sequence Motif In Myelin Basic Protein-Reactive T Cells," Int. Immunol. 15 (9):1073-1080; Loiarro, M. (Epub 2010 Apr 8) "Targeting TLRJIL-IR Signalling In Human Diseases," Mediators Inflamm. 2010:674363)를 생산하기 위해서 사용된다. 이러한 분자들은 B7-H1나 PD-1의 대용물로서 소용되며, 따라서 대상에게 이들의 투여는 B7-H1 - PD-1 결합을 의태하거나 촉진함으로써 이러한 대상의 면역계를 하향 조정한다. 이러한 분자들은 이식편 대 숙주 질환의 치료에서 활용도를 가진다. 유사하게, i) 이러한 항체와 이러한 수용체/리간드의 결합을 증진시키거나, 또는 ii) B7-H1 또는 PD-1에 직접 결합되었을 때 신호 전달을 촉발하는 항진성 항체는 B7-H1 - PD-1 신호화의 항진제(agonist)로서 활용도를 가지며, 따라서 수용체 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 항진함으로써 염증 및 자가면역 질환의 치료에서 활용도를 가진다.

PD-1과 B7-H1에 모두 면역 특이적 결합을 나타내는 2가-특이적 항체는 APC와 T 세포에 모두 결합할 수 있으며, 따라서 APC와 T 세포의 동시 국소화를 촉진한다. 이러한 동시 국소화는 항체와 복합체화되지 않은 B7-H1 및 PD-1 분자를 통하여, 또는 공-저해성 분자에 의해서 함께 결합하는 이러한 세포의 능력을 촉진한다. 이러한 결합은 수용자의 면역계의 하향 조절을 제공한다.

면역계의 하향 조절은 염증성 질환과 자가면역 질환, 및 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 치료에서 바람직하다. 본 발명의 항체를 투여함으로써 치료될 수 있는 자가면역 장애의 예들은, 제한은 아니지만 원형탈모, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루-피부염, 만성피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 저온응집소병, 크론병, 원판성 루푸스, 필수 혼성 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소증 자반증(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼성 결합조직 질환, 다발성 경화증, 시신경 척추염(NMO), 타입 1 또는 면역-매개 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선 증후군, 류마티스성 다발근육통, 다발근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경병증, 건선, 건선성 관절염, 레이놀드 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 관절염, 유육종증, 강피증, 쇼그렌 증후군, 강직 인간 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 타카야수 관절염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 횡단성 척추염, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염, 예를 들어 포진성 피부염 맥관염, 백반증, 및 베게너 육아종증을 포함한다.

본 발명의 방법에 따라서 예방, 치료 또는 관리될 수 있는 염증성 장애의 예들은, 제한은 아니지만 천식, 뇌염, 염증성 장질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 알레르기성 장애, 폐혈성 쇼크, 폐 섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스성 또는 세균성 감염으로 인한 만성 염증을 포함한다.

따라서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료에서 활용도를 가진다.

C. 투여 방법

다양한 송달 시스템이 공지되어 있으며, 본 발명의 치료적 또는 예방적 조성물을 투여하기 위해서 사용될 수 있는데, 예를 들어 리포솜 내 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포내이입(예를 들어, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구성 등이 있다.

본 발명의 사람화된 항체를 투여하는 방법은, 제한은 아니지만 비경구 투여에 의한 주사(예를 들어, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막, 및 점막(예를 들어, 비내 및 경구 경로)를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 근육내, 정맥내 또는 피하 투여된다. 조성물은 어느 편리한 경로에 의해서, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막피부 내막(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해서 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 이에 더하여, 폐 투여가, 예를 들어 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제를 가진 제제의 사용에 의해서 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 Nos. 6,019,968; 5,985, 20; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; 및 4,880,078; 및 PCT 공개 Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903을 참조한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 제약 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이것은 제한하려는 것은 아니며, 단지 예를 들어 국소 주입, 주사 또는 이식물에 의해서 달성될 수 있고, 상기 이식물은 실라스틱 멤브레인과 같은 막, 또는 섬유를 포함하는 다공질, 비-다공질 또는 젤라틴성 물질이다. 바람직하게, 본 발명의 항체를 투여할 때는 항체 또는 융합 단백질을 흡수하지 않는 물질을 사용하도록 주의를 기울여야 한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 사람화된 또는 키메라 항체는 본 발명의 항체의 표적화된 송달을 위해 리포솜으로 조제된다. 리포솜은 수성 상을 캡슐화하는 동심 정렬된 인지질 이중층으로 이루어진 소포이다. 리포솜은 전형적으로 다양한 종류의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제를 포함한다. 리포솜의 성분들은 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열된다. 리포솜은 부분적으로 이들의 생체적합성, 낮은 면역성 및 낮은 독성으로 인하여 송달 비히클로서 특히 바람직하다. 리포솜의 제조 방법은 본 분야에 공지이며, 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, Epstein et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688; Hwang et al, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4; 미국특허 Nos. 4,485,045 및 4,544,545를 참조한다.

또한, 본 발명은 연장된 혈청 반감기, 즉 증진된 순환 시간을 가진 리포솜, 예를 들어 미국특허 No. 5,013,556에 개시된 것들의 제조 방법을 포괄한다. 본 발명의 방법에서 사용되는 바람직한 리포솜은 순환계로부터 빠르게 청소되지 않는데, 즉 단핵식세포계(MPS)에 흡수되지 않는다. 본 발명은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 사용하여 제조된 입체구조적으로 안정화된 리포솜을 포괄한다. 특정 작용 메커니즘에 결부시키고자 함은 아니지만, 입체구조적으로 안정화된 리포솜은 벌키하고 매우 유연한 친수성 부분을 가진 지질 성분을 함유하며, 이것은 리포솜과 혈청 단백질의 원치 않는 반응을 감소시키고, 혈청 성분과의 옵소닌화를 감소시키고, MPS에 의한 인식을 감소시킨다. 입체구조적으로 안정화된 리포솜은 바람직하게 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 제조된다. 리포솜 및 입체구조적으로 안정화된 리포솜의 제조에 대해서, 예를 들어 Bendas et al, 2001 BioDrugs, 15(4):215-224; Allen et al, 1987 FEBS Lett. 223:42-6; Klibanov et al, 1990 FEBS Lett., 268:235-7; Blum et al, 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029:91-7; Torchilin et al, 1996, J. Liposome Res. 6:99-116; Litzinger et al, 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190:99-107; Maruyama et al, 1991, Chem. Pharm. Bull, 39:1620-2; Klibanov et al, 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8; Allen et al, 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13:285-309를 참조한다. 또한, 본 발명은 특정 장기 표적화(예를 들어 미국특허 No. 4,544,545 참조), 또는 특정 세포 표적화(예를 들어, 미국 특허출원 공개 No. 2005/0074403 참조)를 위해서 적합하게 된 리포솜을 포괄한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 가지고 역상 증발 방법에 의해서 생성될 수 있다. 리포솜은 원하는 직경의 리포솜을 얻기 위하여 한정된 기공 크기의 필터를 통해서 압출된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체의 단편, 예를 들어 F(ab')가 이미 설명된 방법을 사용하여 리포솜에 콘쥬게이트될 수 있으며, 예를 들어 Martin et al, 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288을 참조한다.

또한, 본 발명의 사람화된 또는 키메라 항체는 면역리포솜으로서 조제될 수도 있다. 면역리포솜은 본 발명의 항체 또는 그것의 단편이 리포솜 표면에 공유 또는 비-공유 연결된 리포솜 조성물을 말한다. 항체와 리포솜 표면을 연결하는 화학은 본 분야에 공지이며, 본 발명의 범위에 포괄되고, 예를 들어 미국특허 No. 6,787,153; Allen et al, 1995, Stealth Liposomes, Boca Rotan: CRC Press, 233-44; Hansen et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239:133-144를 참조한다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 면역리포솜은 입체구조적으로 더 안정화된다. 바람직하게, 본 발명의 사람화된 항체는 리포솜의 지질 이중층에 안정하게 고정된 소수성 앵커에 공유 또는 비-공유 연결된다. 소수성 앵커의 예들은, 제한은 아니지만 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜이노시톨(PI)과 같은 인지질을 포함한다. 항체와 소수성 앵커 간의 공유 결합을 달성하기 위해서, 본 분야에 공지된 생화학적 전략 중 어느 것이 사용될 수 있으며, 예를 들어 J. Thomas August, ed, 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA, p. 399-435를 참조한다. 예를 들어, 항체 분자 상의 관능기가 리포솜 결합된 소수성 앵커 상의 활성기와 반응할 수 있으며, 예를 들어 항체의 리신 측쇄의 아미노기가 수용성 카르보디이미드로 활성화된 리포솜 결합된 N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민에 연결될 수 있거나, 또는 환원된 항체의 티올기가 티올 반응성 앵커, 예를 들어 피리딜티오프로피오닐포스파티딜에탄올아민을 통해서 리포솜에 연결될 수 있다. 예를 들어, Dietrich et al., 1996, Biochemistry, 35:1100-1105; Loughrey et al., 1987, Biochim. Biophys. Acta, 901:157-160; Martin et al, 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288; Martin et al., 1981, Biochemistry, 20:4429-38을 참조한다. 특정 작용 메커니즘에 결부시키고자 함은 아니지만, 본 발명의 항체를 포함하는 면역리포솜 제제는 이들이 표적 세포, 즉 항체가 결합하는 수용체를 포함하는 세포의 세포질에 항체를 송달하기 때문에 치료제로서 특히 효과적이다. 면역리포솜은 바람직하게 혈액, 구체적으로 표적 세포에서 증가된 반감기를 가지며, 표적 세포의 세포질에 내재화될 수 있어서, 리소좀내(endolysosomal) 경로에 의한 치료제의 손실이나 분해를 피할 수 있다.

본 발명의 면역리포솜 조성물은 하나 이상의 소포 형성 지질, 본 발명의 항체 또는 그것의 단편 또는 유도체, 및 선택적으로 친수성 중합체를 포함한다. 소포 형성 지질은 바람직하게 2개의 탄화수소 사슬, 예를 들어 아실 사슬과 극성 머리기를 가진 지질이다. 소포 형성 지질의 예들은 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 및 당지질, 예를 들어 세레브로사이드, 강글리오사이드를 포함한다. 본 발명의 제제에 유용한 추가의 지질은 당업자에게 알려져 있으며, 본 발명의 범위에 포함된다. 일부 구체예에서, 면역리포솜 조성물은 친수성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 및 강글리오사이드 GM1을 더 포함하며, 이들은 리포솜의 혈청 반감기를 증가시킨다. 친수성 중합체를 리포솜에 콘쥬게이트하는 방법은 본 분야에 공지이며, 본 발명의 범위에 포함된다. 면역리포솜 및 이들의 제조 방법에 대한 리뷰는, 예를 들어 미국 특허출원 공개 No. 2003/0044407; PCT 국제공개 No. WO 97/38731, Vingerhoeads et al., 1994, Immunomethods, 4:259-72; Maruyama, 2000, Biol. Pharm. Bull. 23(7):791-799; Abra et al., 2002, Journal of Liposome Research, 12(1&2):1-3; Park, 2002, Bioscience Reports, 22(2):267-281; Bendas et al, 2001 BioDrugs, 14(4):215-224, J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA, p. 399-435를 참조한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 사람화된 또는 키메라 항체가 항체의 양을 표시한 앰풀 또는 샤세와 같은 밀폐 밀봉된 용기에 포장된 것을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 밀폐 밀봉된 용기에 담긴 건조 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되며, 예를 들어 물이나 식염수로 대상에 투여하기 위한 적절한 농도로 복원될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 적어도 5mg, 더 바람직하게 적어도 10mg, 적어도 15mg, 적어도 25mg, 적어도 35mg, 적어도 45mg, 적어도 50mg, 또는 적어도 75mg의 단위 투약량으로 밀폐 밀봉된 용기에 담긴 건조 멸균 동결건조 분말로서 공급된다. 본 발명의 동결건조된 항체는 그것의 원래 용기에 2℃ 내지 8℃에서 보관되어야 하며, 항체는 복원 후 12 시간 이내, 바람직하게 6 시간 이내, 5 시간 이내, 3 시간 이내 또는 1 시간 이내에 투여되어야 한다. 대안의 구체예에서, 본 발명의 항체는 항체, 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자의 농도 및 양을 표시한 밀폐 밀봉된 용기에 담긴 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 항체의 액체 형태는 적어도 1mg/ml, 더 바람직하게 적어도 2.5mg/ml, 적어도 5mg/ml, 적어도 8mg/ml, 적어도 10mg/ml, 적어도 15mg/ml, 적어도 25mg/ml, 적어도 50mg/ml, 적어도 100mg/ml, 적어도 150mg/ml, 적어도 200mg/ml 항체로 밀폐 밀봉된 용기에 공급된다.

또한, 제제에 사용될 수 있는 정확한 용량은 투여 경로, 및 상태의 중증도에 의존할 것이며, 전문가의 판단과 각 환자의 상황에 따라서 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 본 발명에 의해서 포괄되는 항체의 경우, 환자에 투여되는 투약량은 전형적으로 환자의 체중을 기준으로 0.01mg/kg 내지 100mg/kg이다. 바람직하게, 환자에 투여되는 투약량은 환자 체중 기준으로 0.01mg/kg 내지 20mg/kg, 0.01mg/kg 내지 10mg/kg, 0.01mg/kg 내지 5mg/kg, 0.01 내지 2mg/kg, 0.01 내지 1mg/kg, 0.01mg/kg 내지 0.75mg/kg, 0.01mg/kg 내지 0.5mg/kg, 0.01mg/kg 내지 0.25mg/kg, 0.01 내지 0.15mg/kg, 0.01 내지 0.10mg/kg, 0.01 내지 0.05mg/kg 또는 0.01 내지 0.025mg/kg이다. 특히, 본 발명은 환자에 투여되는 투약량이 0.2mg/kg, 0.3mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg, 6mg/kg 또는 10mg/kg인 것을 고려한다. 0.01mg/kg 정도의 낮은 용량도 주목할만한 약역학적 효과를 나타낼 것이라고 예상된다. 0.10 - 1mg/kg의 용량 수준이 가장 적절하다고 예상된다. 또한, 더 높은 용량(예를 들어, 1-30mg/kg)도 활성일 것으로 예상된다. 일반적으로, 사람 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인하여 다른 종들의 항체보다 인체 내에서 더 긴 반감기를 가진다. 따라서, 사람 항체는 주로 더 낮은 투약량과 덜 빈번한 투여가 가능하다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그것의 단편의 투여의 투약량 및 빈도는, 예를 들어 지질화와 같은 변형에 의해서 항체의 흡수 및 조직 투과를 증진시킴으로써 감소될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 조성물은 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 송달될 수 있다. 당업자에게 공지된 어느 기술을 사용하여 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 No. 4,526,938; PCT 공개 WO 91/05548; PCT 공개 WO 96/20698; Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel" Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Phar maceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al, 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760를 참조한다. 한 구체예에서, 펌프가 제어 방출 시스템에서 사용될 수 있다(Langer, 상동; Sefton 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al, 1980, Surgery 88:507; 및 Saudek et al, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 다른 구체예에서, 중합체 물질을 사용하여 항체 제어 방출을 달성할 수 있다(예를 들어, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley, New York(1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 참조; 또한, Levy et al, 1985, Science 228:190; During et al, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조; 미국특허 No. 5,679,377; 미국특허 Nos. 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; 5,128,326; PCT 공개 No. WO 99/15154; 및 PCT 공개 No. WO 99/20253 참조). 지속 방출 제제에 사용되는 중합체의 예들은, 제한은 아니지만 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리안하이드라이드, 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜라이드) (PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적(예를 들어, 폐) 부근에 위치될 수 있으며, 이로써 전신 용량의 일부만 필요하게 된다(예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138(1984) 참조). 다른 구체예에서, 제어 방출 이식물로서 유용한 중합체 조성물이 Dunn et al.에 따라서 사용될 수 있다(미국특허 No. 5,945,155 참조). 이 특정한 방법은 중합체 시스템으로부터 생물활성 물질의 인시튜 제어 방출의 치료적 효과에 기초한다. 이식은 일반적으로 치료적 치료가 필요한 환자의 신체의 어디서나 일어날 수 있다. 다른 구체예에서, 비-중합체 지속 송달 시스템이 사용되며, 이 경우 대상의 신체에 비-중합체 이식물이 약물 송달 시스템으로서 사용된다. 신체 이식시, 이식물의 유기 용매가 조성물로부터 주변 조직으로 소산, 분산 또는 누출될 것이며, 비-중합체 물질이 점진적으로 응고하거나 침전하여 고체 미소다공질 매트릭스를 형성할 것이다(미국특허 No. 5,888,533 참조). 제어 방출 시스템은 Langer의 리뷰에서 논의된다(1990, Science 249:1527-1533). 당업자에게 공지된 어느 기술을 사용하여 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 No. 4,526,938; 국제공개 Nos. WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al, 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al, 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al, 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al, 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760을 참조한다.

본 발명의 치료적 또는 예방적 조성물이 본 발명의 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산인 특정 구체예에서, 상기 핵산은 그것의 암호화된 항체의 발현을 촉진하기 위해서 생체내 투여될 수 있는데, 이것은 핵산을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고, 예를 들어 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해서 그것이 세포내 상태가 되도록 투여하는 것(미국특허 No. 4,980,286 참조), 또는 직접 주사, 또는 미세입자 포격(예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont)의 사용, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염제 코팅, 또는 핵 안으로 진입한다고 알려진 호메오박스-유사 펩티드에 연결된 상태로 투여하는 것(예를 들어, Joliot et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868) 등에 의해서 행해질 수 있다. 또는 달리, 핵산은 상동성 재조합에 의해 발현을 위한 숙주 세포 DNA 안에 세포내 도입되어 통합될 수 있다.

본 발명의 항체의 치료적 또는 예방적 유효량에 의한 대상의 치료는 1회 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.

D. 제약 조성물

본 발명의 조성물은 단위 제형의 제조에 사용될 수 있는 제약 조성물(즉, 대상 또는 환자에 투여하기 적합한 조성물)의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 여기 개시된 예방 및/또는 치료제 또는 이들 제제의 조합의 예방적 또는 치료적 유효량과 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 본 발명의 사람화된 항체의 예방적 또는 치료적 유효량과 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

특정 구체예에서, 용어 "제약학적으로 허용되는"은 연방정부나 주정부의 규제 당국에 의해서 승인된 것, 또는 미국 약전이나 동물, 더 구체적으로 사람에 대해 사용되는 다른 일반적으로 인정된 약전에 등재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 희석제, 애쥬번트(예를 들어, 프레운드 애쥬번트(완전 및 불완전), 부형제, 계면활성제, 동결보호제 또는 치료제와 함께 투여되는 비히클을 말한다. 이러한 제약학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물 및 오일일 수 있으며, 오일은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함하고, 예를 들어 낙화생유, 대두유, 광물유, 참깨씨유 등이 있다. 제약 조성물이 정맥내 투여되는 경우 물이 바람직한 담체이다. 식염수 용액과 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액도 액체 담체로서 사용될 수 있으며, 특히 주사가능한 용액에 사용될 수 있다. 적합한 제약학적 부형제는 녹말, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올, 폴리소르베이트-80 등을 포함한다. 원한다면 조성물은 또한 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 조성물의 성분은 별도로 또는 단위 제형으로 함께 혼합되어, 예를 들어 활성제의 양을 표시한 앰풀 또는 샤세와 같은 밀폐 밀봉된 용기에 담긴 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해서 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균 제약등급수 또는 식염수가 담긴 주입 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해서 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있으며, 성분들은 투여 전에 혼합될 수 있다.

본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 조제될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염은, 제한은 아니지만 염화수소산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것들과 같은 음이온과 함께 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철 수산화물, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온과 함께 형성된 것들을 포함한다.

E. 키트

본 발명은 본 발명의 사람화된 항체로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트를 제공한다. 추가로, 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방 또는 치료제가 제약 팩 또는 키트에 또한 포함될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 제약 조성물의 성분들 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로, 이러한 용기(들)과 관련된 내용이 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해서 규정된 형태로 통지될 수 있으며, 이러한 통지는 인체 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 당국에 의한 승인을 반영한다.

본 발명은 상기 방법에서 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 본 발명의 하나 이상의 사람화된 항체를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기에 암의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방 또는 치료제를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 암과 관련된 하나 이상의 암 항원과 결합하는 하나 이상의 세포독성 항체를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 다른 예방 또는 치료제는 화학치료제이다. 다른 구체예에서, 예방 또는 치료제는 생물학적 또는 체액성 치료제이다.

F. 진단 방법

본 발명의 항체 및 이들의 항원-결합 단편은 B7-H1 또는 PD-1 발현과 관련된 질환, 장애 또는 감염을 검출, 진단 또는 모니터하는 것과 같은 진단 목적을 위해서 사용될 수 있다. 본 발명은 질환, 장애 또는 감염, 특히 자가면역 질환의 검출이나 진단을 제공하며, (a) 이러한 항원에 면역 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체(또는 그것의 단편)를 사용하여 대상의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H1 또는 PD-1의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) 항원의 수준을 대조군 수준, 예를 들어 정상 조직 샘플의 수준 또는 치료 전의 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 항원의 대조군 수준과 비교하여 항원의 분석된 수준의 증가 또는 감소는 질환, 장애 또는 감염이나, 또는 치료에 대한 대상의 반응을 나타낸다. 또한, 본 발명은 질환, 장애 또는 감염의 진행의 모니터링을 제공하며, 이것은 (a) 이러한 항원에 면역 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체(또는 그것의 단편)을 사용하여 하나의 시간 지점에서 대상의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H1 또는 PD-1의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) 다른 시간 지점에서 또는 시간 과정에 걸쳐서 대상의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H1 또는 PD-1의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 항원의 분석된 수준의 증가 또는 감소는 질환, 장애 또는 감염의 진행을 나타낸다. 추가로, 본 발명은 치료에 대한 반응의 모니터링을 제공하며, 이것은 (a) 이러한 항원에 면역 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체(또는 그것의 단편)로 치료하기 전에 대상의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H1 또는 PD-1의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) 치료 후 하나 이상의 시간 지점에서 대상의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H1 또는 PD-1의 발현 수준을 분석하고, 시간에 따라서 항원의 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 항원의 전-치료 수준과 비교하여 항원의 분석된 수준의 증가 또는 감소는 치료에 대한 반응을 나타낸다. 이러한 항체 및 단편은 바람직하게 면역분석에서, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성면역분석(RIA) 및 형광-활성화 세포 정렬(FACS)에서 사용된다.

본 발명의 한 양태는 시험관내 또는 인시튜 조직 샘플 또는 생체내에서 세포에서 IHC 분석을 위한 시약으로서 이러한 항체 및 단편, 특히 사람 B7-H1과 결합하는 이러한 항체 및 단편의 사용에 관한 것이다. 예를 들어, B7-H1은 암 세포에 의해서 발현되지만 정상 조직에 의해서는 발현되지 않으므로(Dong, H.(2003) "B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity," J. Mol. Med. 81:281-287), 이러한 항체 또는 단편에 대한 이러한 세포의 결합에 의해 세포 상에서 그것의 존재의 검출은 암 세포를 나타내며 진단한다. 따라서, 본 발명은 대상에서 암의 존재를 진단하기 위한 세포학적 분석을 제공한다.

종양 세포 상에 B7-H1의 존재는 종양에 반응하는 T 세포의 세포자멸을 증진시키는 것으로 판명되었다(미국특허 No. 7,794,710). 따라서, 암 환자의 종양 세포가 그 표면에 B7-H1을 나타내는 범위나 정도를 결정함으로써 본 발명은 암의 임상적 유의성, 및 그것이 면역 반응에 불응할 것 같은 정도를 결정하는 수단을 제공한다.

유사하게, B7-H1은 림프양 및 점막 수지상 세포(모두 골수성 및 형질세포양 수지상 세포)에서 발현되며, 그것의 발현은 SIV 감염 후에 상당히 증가한다(Xu, Huanbin et al(2010) "Increased B7-H1 Expression on Dendritic Cells Correlates with Programmed Death I Expression on T Cells in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques and May Contribute to T Cell Dysfunction and Disease Progression," J. Immunol. 185:7340-7348). 따라서, 이러한 세포에서 B7-H1의 발현은 사람에서 HIV를 진단하는데 사용될 수 있다. 추가로, CD8+ 세포에서 PD-1 발현도 HIV 감염과 관련하여 증가된다는 것이 판명되었다(Killian, M.S. et al(2011) "Natural Suppression of Human Immunodeficiency Virus Type I Replication Is Mediated by Memory CD8+ T Cells," J. Virol. 85(4):1696-1705). 따라서, PD-1과 CD8에 모두 결합하는 항체는 HIV 감염 및 AIDS 진행의 진단에서 특정한 활용도를 가진다.

본 발명의 추가의 양태는 이러한 항체 및 단편, 특히 사람 PD-1과 결합하는 이러한 항체 및 단편의 사용에 관한 것이다. PD-1은 만성 면역 활성화 및 T 세포 고갈의 마커로서 특정한 활용도를 가진다. 그것의 발현은 바이러스 혈증 HIV-감염 환자의 T 세포에서 증진되며, 이들 환자의 바이러스 부하와 상호관련된다(Khaitan, A. et al.(2011) "Revisiting Immune Exhaustion During HIV Infection," Curr. HIV/AIDS Rep 8:4-11; Grabmeier-Pfistershammer, K. et al(2011) "Identification of PD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV1-Infected Patients on Treatment," J Acquir. Immune Defic. Syndr. 56(2):118-124). 따라서, PD-1은 HIV 진행의 마커로서 특정한 활용도를 가진다. 가장 바람직하게, PD-1 발현은 유세포계수법을 사용하여 평가될 것이다. 이러한 항체 및 단편의 사용을 통해서 T 세포(PD-1을 발현하는)는 이종성 조제물에 존재함에도 불구하고 여러 변수들에 대해 분석될 수 있다(예를 들어, 세포 수, 세포 크기, 표현형 및 세포 건강 등). 따라서, PD-1에 대한 항체 및 이들의 항원-결합 단편과 협력하여, 이러한 방법은 AIDS, 백혈병, 및 T 세포 수와 건강에 영향을 미치는 다른 질환의 정도 또는 중증도를 진단하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 목적에 적합할 수 있는 유세포계수법의 방법은 Peters, J.M. et al.(2011) "Multiparameter Flow Cytometry In The Diagnosis And Management Of Acute Leukemia," Arch. Pathol. Lab. Med. 135 (1):44-54; Meyerson, H.J.(2010) "A Practical Approach To The Flow Cytometric Detection And Diagnosis Of T-Cell Lymphoproliferative Disorders," Lab. Hematol. 16(3):32-52; Vandewoestyne, M. et al.(Epub 2010 Aug 3) "Laser Capture Micro dissection In Forensic Research: A Review," Int. J. Legal. Med. 124(6):513-521; Ornatsky, O. et al.(Epub 2010 Jul 21) "Highly Multiparametric Analysis By Mass Cytometry," J. Immunol. Meth. 361(1-2):1-20; Mach, W.J. et al.(Epub 2010 Jul 13) "Flow Cytometry And Laser Scanning Cytometry, A Comparison Of Techniques," J. Clin. Monit. Comput. 24(4):251-259; 및 Chattopadhyay, P.K. et al.(2010)" Good Cell, Bad Cell: Flow Cytometry Reveals T-Cell Subsets Important In HIV Disease," Cytometry A. 77(7):614-622; 및 미국특허 Nos. 7,876,436; 7,847,923; 7,842,244; 7,746,466; 7,590,500; 7,527,978; 7,507,548; 7,491,502; 7,486,387; 7,479,630; 7,465,543; 7,354,773; 6,794,152 및 6,784,981에 개시된다.

따라서, 본 발명의 항체 및 단편은 사람의 질환, 장애 또는 감염의 검출 및 진단에서 활용도를 가진다. 한 구체예에서, 이러한 진단은 a) B7-H1 또는 PD-1와 면역 특이적으로 결합하는 표지된 항체 또는 항원-결합 단편의 유효량을 대상에 투여하는(예를 들어, 비경구, 피하 또는 복강내) 단계; b) 표지된 분자가 B7-H1 또는 PD-1이 발현되는 대상의 부위에 우선적으로 농축되도록(그리고 미결합된 표지된 분자는 바탕값 수준으로 청소되도록) 하기 위해 투여 후 시간 간격 동안 대기하는 단계; c) 바탕값 수준을 결정하는 단계; 및 d) 대상에서 표지된 항체를 검출하는 단계를 포함하며, 바탕값 수준 이상의 표지된 항체의 검출은 대상이 질환, 장애 또는 감염을 갖는다는 것을 나타낸다. 이 구체예에 따라서, 항체는 당업자에게 알려진 영상 시스템을 사용하여 검출될 수 있는 영상화 부분으로 표지된다. 바탕값 수준은 검출된 표지된 분자의 양을 특정 시스템에 대해 미리 결정된 표준 값과 비교하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해서 결정될 수 있다.

대상 및 사용된 영상 시스템의 규모가 진단 영상을 생성하는데 필요한 영상화 부분의 양을 결정할 것이라는 게 본 분야에서 이해될 것이다. 생체내 종양 영상은 S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments"(Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc.(1982)에 설명된다.

사용된 표지의 종류 및 투여 방식을 포함하는 몇 가지 변수에 따라서, 표지된 분자가 대상의 부위에 우선적으로 농축되고, 미결합된 표지 분자는 바탕값 수준으로 청소되는 것을 허용하는 투여 후 시간 간격은 6 내지 48 시간 또는 6 내지 24 시간 또는 6 내지 12 시간이다. 다른 구체예에서, 투여 후 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.

한 구체예에서, 질환, 장애 또는 감염의 모니터링은 질환, 장애 또는 감염을 진단하는 방법을 반복함으로써, 예를 들어 초기 진단 후 1개월, 초기 진단 후 6개월, 초기 진단 후 1년 등에 반복함으로써 수행된다.

표지된 분자의 존재는 생체내 스캔을 위한 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 대상에서 검출될 수 있다. 이들 방법은 사용된 표지의 종류에 따른다. 당업자는 특정한 표지를 검출하기 위한 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에서 사용될 수 있는 방법 및 장치는, 제한은 아니지만 컴퓨터 단층촬영(CT), 포지트론 방출 토모그래피(PET)와 같은 전신 스캔, 자기공명영상(MRI), 및 소노그래피를 포함한다.

특정 구체예에서, 분자는 방사성동위원소로 표지되고, 복사 반응 수술 기기를 사용하여 환자에서 검출된다(Thurston et al., 미국특허 No. 5,441,050). 다른 구체예에서, 분자는 형광 화합물로 표지되고, 형광 반응 스캔 기기를 사용하여 환자에서 검출된다. 다른 구체예에서, 분자는 포지트론 방출 금속으로 표지되고, 포지트론 방출 토모그래피를 사용하여 환자에서 검출된다. 또 다른 구체예에서, 분자는 상자성 표지로 표지되고, 자기공명영상(MRI)을 사용하여 환자에서 검출된다.

지금까지 본 발명은 일반적으로 설명되었으며, 본 발명은 예시를 위해서 제공되며 특정되지 않는 한 본 발명을 제한하지 않는 다음의 실시예들을 참조하여 더 쉽게 이해될 것이다.

실시예 1

항-사람 B7- H1 항체의 분리 및 특성화

고 친화성 중화 항-사람 B7-H1 항체를 분리하기 위해서 마우스를 먼저 면역화하고, 이어서 사람 B7-H1-Fc로 부스트했다. 항-B7-H1 양성 동물의 비장 세포를 표준 프로토콜에 따라서 골수종 세포와 융합시켰다. 결과의 뮤린 하이브리도마를 B7-H1-면역반응 단클론성 항체를 발현하는 것들에 대해 스크리닝했다. IgG 항체인지 IgM 항체인지 결정하기 위하여 항체를 추가로 평가했다. 따라서, B7-H1-Fc 또는 음성 대조군을 고체 지지체에 고정했다. 다음에, 하이브리도마 상청액을 지지체와 접촉하게 두고, 항-B7-H1 항체의 존재를 표지된 항-마우스 IgG 또는 항-마우스 IgM을 사용하여 결정했다. 도 1은 시험된 하이브리도마 상청액의 결과를 도시하며, 사람 B7-H1과 면역반응하는 항체를 발현하는 다수의 하이브리도마 계통의 분리를 나타낸다.

발현된 항체가 중화 항체인지, 그리고 B7-1과 PD-1 사이의 결합을 차단할 수 있는지 결정하기 위해서 확인된 하이브리도마를 스크리닝했다. PD-1-Fc를 고체 지지체에 고정하고, 이후 바이오틴화된 B7-H1-Fc를 함유하는 희석된 컨디셔닝 배지의 존재하에 인큐베이션했다. 고체 지지체에 대한 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제(SA-HRP)의 결합에 대해 분석함으로써 B7-H1과 PD-1의 서로 결합하는 능력을 검출했다. 따라서, PD-1에 대한 B7-H1의 결합을 조정할 수 있는 항-B7-H1 항체는 이 분석에서 SA-HAS 결합의 감소를 매개한다. 실험 결과는 도 2에 도시되며, 분리된 하이브리도마 중 일부가 사람 B7-H1 중화 항체를 발현했음을 나타낸다. 항체 MIH-1(항-사람 CD274(B7-H1)(Chen, Y. et al.(Epub 2005 Nov 11) Expression Of B7-H1 In Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells," Nephron. Exp. Nephrol. 102(3-4):e81-e92)가 양성 대조군으로 사용되었다. 29E.2AE는 항-PD-1 항체이지만 이 분석에서 비-중화 항체인 것으로 나타났다. 관련 없는 하이브리도마(rand Ab)와 벡터 대조군(VC)로부터의 컨디셔닝 배지가 음성 대조군으로 사용되었다.

발현된 중화 항체가 세포의 표면에 어레이된 B7-H1에 대해 결합할 수 있는지 결정하기 위해서 세포 결합 분석을 수행했다. 각 하이브리도마 클론으로부터의 상청액을 1:4로 희석하고, 모 CHO 세포와 전장 사람 B7-H1을 과발현한 클론 CHO 계통의 존재하에 인큐베이션했다. 결합이 일어나도록 한 후, 세포를 세척하고, 잔류한 세포-결합된 항-B7-H1 항체의 존재를 형광 표지된 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 검출했다. CHO-hB7-H1과의 결합에 대한 중간 형광 강도(MFI)가 도 3에 도시된다. 시험된 클론 중 어느 것도 모 CHO 계통과 교차반응하지 않는 것으로 판명되었으며, 이는 발현된 항체가 사람 B7-H1에 특이적이었음을 나타낸다.

추가의 평가로서, 3개 클론의 상이한 농도를 항-B7-H1 항체 MTH-1과 비교했다. 항체를 단백질 G를 사용하여 정제하고, APC의 표면에 어레이된 상태로 내인성 수준으로 존재할 때 B7-H1과 결합하는 능력에 대해 평가했다. 사람 B7-H1을 발현한 CHO 세포를 다양한 농도(10, 1 또는 0.1μg/ml)의 항-B7-H1 항체와 함께 인큐베이션하고, 계속해서 APC-콘쥬게이트된 당나귀 항-마우스 항체와 함께 인큐베이션했다. 중간 형광 강도를 측정함으로써 결합을 기록했다. 결과는 시험된 항체가 대조군 항체(MIH1)(도 4)보다 B7-H1를 향해 더 큰 결합활성을 나타냈다는 것과 항체 IE12가 대조군 항-B7-H1 항체(5H1)(Dong, H. et al.(2002) Tumor-Associated B7-H1 Promotes T-Cell Apoptosis: A Potential Mechanism Of Immune Evasion," Nature Med. 8(8):793-800)보다 B7-H1을 향해 더 큰 결합활성을 나타냈다는 것을 보여준다(도 5).

요약하면, 이 데이터는 다수의 항-사람 B7-H1-발현 하이브리도마가 얻어졌음을 보여준다. 모든 클론이 B7-H1-Fc를 인식하는 IgG 항체이다. 클론 1B3, 1D11, 1E2, 1E4, 1E10, 2A6, 2E12, 2F2, 2F5, 2F11, 3A4 및 3B1은 스크리닝 결합 분석에서 약하게 나타난다. 낮은 신호는 낮은 발현 수준 및/또는 약한 친화성으로 인한 것일 수 있다.

유의한 점은 일부 클론(예를 들어, 클론: 1D5, 1E12, 1F4, 2A7, 2G11, 3B6, 3D10)은 강한 중화 활성을 나타냈다는 것이다. 모두 시험된 전 농도에서 중화 활성이며, 항원과 잘 결합하는 것 같다. CHO-B7-H1 세포와의 결합에 대한 MFI는 다음과 같다: 1D5 = 50,821; 1E12 = 56,152; 1F4 = 62,015; 2A7 = 49,008; 2G11 = 55,947; 3B6 = 59,638; 3D10 = 53,114.

실시예 2

항-사람 PD -1 항체의 분리 및 특성화

고 친화성 중화 항-사람 PD-1 항체를 분리하기 위해서 마우스를 먼저 면역화하고, 이어서 사람 PD-1-Fc로 부스트했다. 항-PD-1 양성 동물의 비장 세포를 표준 프로토콜에 따라서 골수종 세포와 융합시켰다. 결과의 뮤린 하이브리도마를 고 친화성 사람 PD-1-면역반응 단클론성 항체를 발현하는 것들에 대해 스크리닝했다. IgG 항체인지 IgM 항체인지 결정하기 위하여 항체를 추가로 평가했다. 따라서, PD-1-Fc 또는 음성 대조군(B7-H4-Fc)을 고체 지지체에 고정했다. 다음에, 하이브리도마 상청액을 지지체와 접촉하게 두고, 항-PD-1 항체의 존재를 표지된 항-마우스 IgG 또는 항-마우스 IgM을 사용하여 결정했다. 도 6은 분리된 항 사람 PD-1 항체의 항원 결합 및 이소타입을 도시하며, 사람 PD-1과 면역반응하는 항체를 발현하는 다수의 하이브리도마 계통의 분리를 나타낸다.

발현된 항체가 중화 항체인지, 그리고 B7-DC와 PD-1 사이의 결합을 차단할 수 있는지 결정하기 위해서 확인된 하이브리도마를 스크리닝했다. PD-1과 결합하는 융합 단백질인 B7-DC-Fc를 고체 지지체에 고정하고, 이후 바이오틴화된 PD-1-Fc를 함유하는 희석된 컨디셔닝 배지의 존재하에 인큐베이션했다. 고체 지지체에 대한 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제(SA-HRP)의 결합에 대해 분석함으로써 B7-DC와 PD-1의 서로 결합하는 능력을 검출했다. 따라서, PD-1에 대한 B7-DC의 결합을 차단할 수 있는 항-PD-1 항체는 이 분석에서 SA-HAS 결합의 감소를 매개한다. 실험 결과는 도 7a 및 7b에 도시되며, 분리된 하이브리도마 중 일부가 사람 PD-1 중화 항체를 발현했음을 나타낸다(도 7b는 도 7a와 규모만 다른 동일한 그래프를 도시한다).

발현된 중화 항체가 세포의 표면에 어레이된 PD-1에 대해 결합할 수 있는지 결정하기 위해서 세포 결합 분석을 수행했다. 각 하이브리도마 클론으로부터의 상청액을 1:4로 희석하고, 모 CHO 세포와 전장 사람 PD-1을 과발현한 클론 CHO 계통의 존재하에 인큐베이션했다. 결합이 일어나도록 한 후, 세포를 세척하고, 잔류한 세포-결합된 항-PD-1 항체의 존재를 형광 표지된 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 검출했다. CHO-hPD-1과의 결합에 대한 중간 형광 강도(MFI)가 도 8에 도시된다. 결과는 항체 1E3, 1E8 및 1H3이 세포 표면에서 발현된 사람 PD-1과 특히 결합할 수 있었던 것을 증명한다. 시험된 클론 중 어느 것도 모 CHO 계통과 교차반응하지 않는 것으로 판명되었으며, 이는 발현된 항체가 사람 PD-1에 특이적이었음을 나타낸다. J116은 상업적으로 입수가능한 항-사람 PD-1 대조군 항체(eBioscience, Inc.)이다. 이소타이핑은 1E3, 1E8, 1H3이 IgG1/카파인 것을 드러냈다.

추가의 연구를 위해서 2개 클론(1E3 및 1H3)을 선택했다. 추가의 평가로서, 2개 클론의 상이한 농도를 항-PD-1 항체 M3 및 EH-12와 비교했다. 항체를 단백질 G를 사용하여 정제하고, CHO 세포의 표면에서 발현된 PD-1과 결합하는 능력에 대해 평가했다. CHO-hPD1 세포를 표지되지 않은 항-PD-1 항체(10, 1 및 0.1μg/ml)와 APC-콘쥬게이트된 당나귀 항-마우스 항체로 차례로 염색하고, 중간 형광 강도를 기록했다. 분석 결과는 표 9에 기록된다. 음성 대조군은 뮤린 IgG(mIgG1)이고, 양성 대조군은 M3(사람 PD-1에 대한 중화 단클론성 항체(Wu, K. et al(2009) Kupffer Cell Suppression of CD8+ T Cell in Human Hepatocellular Carcinoma Is Mediated by B7-H1/Programmed Death-1 Interactions," Cancer Res 69(20):8067-8075) 및 항-PD-1 항체 EH12(Dorfman, D.M. et al.(2006) "Programmed Death-1(PD-1) Is A Marker Of Germinal Center-Associated T Cells And Angioimmunoblastic T-Cell Lymphoma," Am. J. Surg. Pathol. 30(7):802-810)이다.

항-PD-1 항체(0-0.1mg/ml 범위의 농도로 존재)와 30분 동안 50,000 CHO-hPD1 세포를 인큐베이션했다. 다음에, 10μg/ml의 APC-표지된 B7-DC-Fc를 가하고, 30분 더 인큐베이션을 계속한 후, 결합된 B7-DC-Fc의 형광을 측정했다. 중간 형광 강도는 도 10에 도시된다. 20μg/mL의 고정된 항체 농도에서 경쟁 분석을 반복했다(도 11).

요약하면, 결과는 클론 1E3, 1E8 및 1H3이 중화 활성을 나타내며, 항원을 잘 인식한다는 것을 보여준다. 클론 1E6은 중화시키지 않고 PD-1과 교차결합할 수 있으며, 이로써 증진된 결합을 제공한다. 그러나, 이 클론은 세포 표면에서는 PD-1과 결합하지 않는 것 같다.

실시예 3

사람화된 항체의 생산: 일반적 방법

상기 나타낸 대로, 특정 목적을 위해서, 예를 들어 사람 질환의 생체내 치료에서의 사용을 포함하는 목적을 위해서, 상기 설명된 항-사람 B7-H1 및/또는 항-사람 PD-1 항체의 사람화된 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.

이러한 유도체를 형성하기 위하여, 3D10 또는 1H3 항체의 프레임워크 서열("모" 서열)을 먼저 일단의 "어셉터" 사람 항체의 프레임워크 서열과 정렬하여 프레임워크 서열의 차이를 확인했다. 사람화는 모 서열과 어셉터 서열 사이의 일치하지 않는 프레임워크 잔기를 치환함으로써 달성되었다. Vernier 구역, VH/VL 사슬간 경계 또는 CDR 정규 부류 결정 위치에서의 것들과 같은 잠재적으로 중요한 위치에서의 치환은 향후의 역 돌연변이에 대해서 분석되었다(Foote, J. et al.(1992) "Antibody Framework Residues Affecting The Conformation Of The Hypervariable Loops," J. Molec. Biol. 224:487-499 참조). 총 14개의 사람화된 변이체 서열이 확인되었다.

보존성 도메인 데이터베이스(COD)(Marchler-Bauer, et al.(2011) "COD: A Conserved domain Database For The Functional Annotation Of Proteins," Nucleic Acids Res. 39:D225-D229)를 사용하여 각 아미노산 사슬의 도메인 함량과 각 도메인의 대략적 경계선을 결정했다. 가변 도메인 경계선은 몇 개의 통상 사용되는 정의에 따라 상보성-결정 영역(CDR)의 경계선과 함께 정확히 결정되었고(Kabat, E.A. et al.(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Edition. NIH 공개 No. 91-3242; Chothia, C. et al.(1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. 196:901-917); Honegger, A. et al.(2001) "Yet Another Numbering Scheme For Immunoglobulin Variable domains: An Automatic Modeling And Analysis Tool," J. Molec. Biol. 309(3): 657-670; Chothia's CDR definition(Chothia, C. et al.(1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917), 이러한 사람화된 서열과 관련하여 아래 사용될 것이다.

마우스 및 사람 점라인 서열에 대한 모 서열의 다중 정렬을 MAFFT를 사용하여 생성했고(Katoh, K. et al.(2002) "MAFFT: A Novel Method For Rapid Multiple Sequence Alignment Based On Fast Fourier Transform," Nucleic Acids Res. 30: 3059-3066), 각 정렬의 엔트리는 모 서열에 대한 서열 동일성에 따라서 순서를 결정했다. 100% 서열 동일성에서 클러스터링하고, 불필요한 엔트리를 배제함으로써 유일한 세트의 서열로 기준 세트를 감축시켰다.

최적 어셉터 프레임워크 선택은 두 사슬의 프레임워크 전체에서 어셉터에 대한 전체 모 항체 서열 동일성에 기초했으며, VH/VL 사슬 간 경계를 구성하는 위치들이 특히 관심의 대상이다. 추가로, 점라인 프레임워크가 둘 다 동일한 경계 잔기를 가졌는지 그리고 유사한 CDR-루프 입체형태를 지지한다고 알려졌는지를 결정하기 위하여, CDR의 5'에 대해 정의된 정규 구조들의 별도의 세트를 담당하는 CDR-루프 길이 및 CDR 위치(Chothia, C. et al.(1987) Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917; Martin, A.C. et al.(1996) "Structural Families In Loops Of Homologous Proteins: Automatic Classification, Modelling And Application To Antibodies," J. Molec. Biol 263:800-815; Al-Laziniki, B. et al.(1997) "Standard Conformations For The Canonical Structures Of Immunoglobulins," J. Molec. Biol. 273:927-948)를 점라인과 비교했다. 표 6 및 표 7은 VH/VL 경계 내에 보존된 위치 및 CDR 정규 부류(각각)를 결정하는 위치를 를 나타내며, 넘버링은 Chothia의 정의를 따른다.

사람 점라인에 대한 모 항체의 서열 정렬에 기초하여, 가장 밀접히 일치하는 엔트리를 확인했다. 바람직한 사람 점라인의 선택은 다음 순서의 기준들을 기초로 했다: (1) 프레임워크 전체의 서열 동일성;(2) 동일한 또는 호환성인 사슬 간 경계 잔기; (3) 모 CDR 정규 입체형태를 가진 지지 루프; (4) 발현된 항체에서 발견된 중쇄 및 경쇄 점라인의 조합; 및 (5) 제거되어야 하는 N-글리코실화 부위의 존재

항체 1H3'의 Fv 영역의 구조 모델을 생성했다. 표적에 대한 서열 동일성 및 옹스트롬(Å) 단위의 해상도와 같은 주형 구조의 정성적 결정학적 척도에 기초하여 항체 데이터베이스로부터 프레임워크(FR)와 상보성-결정 영역(CDR)은 물론 전체 Fv에 대해 후보 구조 주형 단편들의 점수를 기록하고 순위를 정해서 선택했다.

FR 주형에 대해 CDR을 구조적으로 정렬하기 위하여, CDR의 어느 한쪽의 5개의 잔기를 CDR 주형에 포함시켰다. 생성된 중복 세그먼트와 구조 서열 정렬에 기초하여 단편들의 정렬을 생성했다. 정렬과 함께 주형 단편들을 MODELLER로 프로세싱했다(Sali, A. et al.(1993) "Comparative Protein Modelling By Satisfaction Of Spatial Restraints," J. Molec. Biol. 234:779-815). 이 프로토콜은 일단의 정렬된 구조 주형들로부터 유래된 입체형태적 구속을 생성한다. 콘쥬게이트 구배 및 모사된 아닐링 최적화 과정에 의해서 이 구속을 만족한 구조들의 앙상블을 생성했다. 단백질 구조 점수 및 입체형태적 구조 만족으로부터 유도된 에너지 점수에 기초하여 이 앙상블로부터 모델 구조를 선택했다. 모델을 조사하고, 표적과 주형 사이에 차이가 있는 위치들의 측쇄를 측쇄 최적화 알고리즘을 사용하여 최적화하고 에너지를 최소화했다. 일단의 시각화 및 컴퓨터 도구를 사용하여 CDR 입체형태 변동성, 국소 패킹 및 표분 분석을 평가하여 하나 이상의 바람직한 모델을 선택했다.

모 항체의 구조 모델을 구성하고, 불량한 원자 패킹, 결합 길이 스트레인, 결합각 또는 이면각과 같은 결함에 대해서 조사했다. 이들 결함은 항체의 구조적 안정성과 함께 잠재적 문제를 나타낼 수 있다. 모델링 프로토콜은 이러한 결함의 최소화를 추구한다. 사람화된 Fv의 초기 구조 모델은 안전한 치환(즉, 결합 친화성이나 안정성에 영향을 미치지 않는 치환)과 신중한 치환(즉, 위치 치환이 이루어지지만 해당 위치는 결합 친화성에 중요할 수 있다)을 모두 함유한다. 감소된 결합 친화성 또는 감소된 안정성의 위험과 관련된다고 생각되는 위치의 치환은 변경되지 않는다. 모 주형의 밀접히 일치하는 변이체 모델이 아니라 좋은 단독 모델을 만들기 위해서 주형 탐색 및 선택을 모 주형 탐색과 별도로 수행했다. 가능한 치환의 평가를 수행했고, 바람직한 치환 및 역 돌연변이의 효과를 반영하여 모델을 업데이트했다.

실시예 4

사람화된 항-사람 B7- H1 항체의 생산

이러한 사람화된 유도체의 생산을 예시하기 위하여, 상기 설명된 과정에 따라서 항-사람 B7-H1 항체 3D10의 사람화된 유도체를 생산했다.

3D10 경쇄 가변 도메인을 사람 점라인과 비교한 서열 정렬을 다음을 사용하여 생성했다: IGKV3 경쇄 점라인(IGKV3-11 *01, IGKV3-11 *02, IGKV3-NL5*01, IGKV3D-11 *01, IGKV3-NL4*01, IGKV3D-7*01, IGKV3D-20*01, IGKV3-20*01, IGKV3-20*02, 및 IGKV3-15*01), IGKV1 경쇄 점라인(IGKV1-9*01, IGKV1-39*01, IGKV1D-13*01, IGKV1-16*01, IGKV1-8*01, IGKV1-13*02, IGKV1-NL1 *01, IGKV1D-43*01, IGKV1-27*01, 및 IGKV1-12*01) 및 IGKJ 경쇄 점라인(IGKJ4*01, IGKJ2*02, IGKJ2*01, IGKJ2*04, IGKJ2*03, IGKJ5*01, IGKJl *01, 및 IGKJ3*01).

3D10 중쇄 가변 도메인을 사람 점라인과 비교한 서열 정렬을 다음을 사용하여 생성했다: IGHV1 중쇄 점라인(IGHVl-2*02, IGHV1-2*04, IGHV1-P01, IGHV1-48*01, IGHVl-2*03, IGHV1-2*01, IGHVl-46*02, IGHV1-2*05, IGHV1-3*01, 및 IGHV1-8*01), IGHV3 중쇄 점라인(IGHV3-49*04, IGHV3-49*01, IGHV3-49*02, IGHV3-49*03, IGHV3-64*01, IGHV3-64*02, IGHV3-72*01, IGHV3-66*01, 및 IGHV3-23*01), 및 IGHJ 중쇄 점라인(IGHJ3*02, IGHJ6*01, IGHJ3*01, IGHJ6*03, IGHJ5*02, IGHJ5*01, IGHJ4*01, IGHJ1 *01, IGHJ6*04, 및 IGHJ2*01).

(A) 경쇄의 사람화

상기 기준에 기초하여, 항체 3D10의 경쇄는 점라인 IGKV3-11 *01(SEQ ID NO: 78):

및 IGKV1-9*01(SEQ ID NO: 79):

의 경쇄와 가장 유사한 것으로 판명되었으며, 표 8에 나타낸 대로 IGKV3-11 *01이 바람직하다(항체 3D10의 CDR 잔기는 이탤릭체로 표시되고, 동일한 정렬된 잔기는 밑줄로 표시된다).

J-세그먼트 유전자를 FR4에 대해 모 서열과 비교했고, 경쇄로서 J-세그먼트 IGKJ4*01(SEQ ID NO: 80: LTFGGGTKVEIK)를 선택했다.

상기 나타낸 대로, 항체 3D10의 경쇄는 정규 부류 1 루프와 유사한 짧은 10개 잔기 CDR L1을 가진다. 사람 점라인은 이러한 짧은 CDR L1을 갖지 않는다. 선택된 점라인 IGKV3-11 *01과 IGKV1-9 *01는 각각 이 종류의 루프를 지지할 수 있는 정확한 프레임워크 잔기를 함유하는 더 짧은 L1 루프를 가진다. 어셉터 프레임워크와 모 서열 사이에 우수한 전체 서열 유사성이 관찰되지만, 경계 위치 Y33과 P45에서는 중요한 차이가 관찰된다. 잔기 Y33은 CDR L1 안에 있지만, 두 선택된 어셉터 패밀리는 다른 점라인 서열들이 그런 대로 이 위치에 티로신을 함유하지 않는다. 위치 P45에서 어셉터 프레임워크와 모 서열의 차이는 어느 사람 점라인과도 유사하지 않은 FR2의 모 점라인을 프로세싱한 결과이다. 결과적으로, 이 영역의 변화는 선택된 어셉터 프레임워크와 무관한 것으로 제안되었으며, 따라서 IGKV3-11 *01 및 IGKV1-9 *01이 어셉터 프레임워크로서 진행되었다.

두 바람직한 어셉터 프레임워크 IGKV3-11 *01 및 IGKV1-9* 01의 각각에 대해서 3개의 사람화된 사슬을 만들었다. 3개의 LC1 사슬은 IGKV3-11 *01로부터 유래되고, 3개의 LC2 사슬은 IGKV1-9 *01로부터 유래된다. 각 어셉터 프레임워크의 제1 사람화된 사슬은 가능하다고 생각된 모든 사람화 치환을 함유했고, 3개 사슬 중 가장 사람에 가깝다. 각 어셉터 프레임워크의 제2 사람화된 사슬은 전하를 변형하는, 잠재적으로 코어 패킹을 방해하거나, 또는 CDR의 입체형태에 영향을 미치는 위치에 몇 개의 역 돌연변이를 함유했다. 각 어셉터 프레임워크의 각각에 대해, 제3 서열은 가장 많은 역 돌연변이를 함유했으며, 이들은 전하를 변경하고, 잠재적으로 결합 친화성을 변경하는 치환을 포함한다. 이들 6개 사람화된 사슬의 서열을 하기 나타낸다:

이들 6개 사람화된 사슬의 서열을 표 9에 나타내며, 모 3D10 경쇄에 대한 차이는 굵은 글씨로 써서 밑줄로 표시한다.

(B) 중쇄의 사람화

상기 논의된 기준에 비추어, 두 후보 점라인 어셉터 프레임워크 IGHVl-2*02(IGHV1 점라인) 및 IGHV3-49*04(IGHV3 점라인)을 항체 3D10의 중쇄의 사람화를 위해서 선택했다.

어셉터 프레임워크 IGHV 1-2*02는 모 서열과의 서열 유사성 및 그것이 해당 도메인의 코어 패킹에 수반되는 매우 유사한 잔기들을 함유한다는 사실로 인해 선택되었다. 어셉터 프레임워크 IGHV3-49*04는 IGHV 1-2*02와 유사한 다른 점라인 서열들의 고려 및 거부 후 선택되었다. 어셉터 프레임워크 IGHV3-49*04는 IGHV 1-2*02보다 모 서열과 약간 더 다르고, 더 많은 수의 치환이 필요했지만, 이 점라인 어셉터 프레임워크는 모 CDR을 지지할 수 있다. 어셉터 프레임워크 IGHV 1-2*02 및 어셉터 프레임워크 IGHV3-49*04의 서열을 아래 나타낸다:

표 10은 이들 서열과 항체 3D10의 중쇄의 정렬을 나타낸다(항체 3D10의 CDR 잔기는 이탤릭체로 표시되고, 동일한 정렬된 잔기는 밑줄로 표시된다).

J-세그먼트 유전자를 FR4에 대해 모 서열과 비교했고, J-세그먼트 IGHJ3*02 (SEQ ID NO: 89: DAFDIWGQGTMVTVSS)를 중쇄를 위해서 선택했다.

두 바람직한 어셉터 프레임워크 IGHVl-2*02 및 IGHV3-49*04의 각각에 대해서 3개의 사람화된 사슬을 만들었다. 3개의 HC1 사슬은 IGHVl-2*02로부터 유래되고, 3개의 HC2 사슬은 IGHV3-49*04로부터 유래된다. 각 어셉터 프레임워크의 제1 사람화된 사슬은 가능하다고 생각된 모든 사람화 치환을 함유했고, 3개 사슬 중 가장 사람에 가깝다. 각 어셉터 프레임워크의 제2 사람화된 사슬은 전하를 변형하는, 잠재적으로 코어 패킹을 방해하거나, 또는 CDR의 입체형태에 영향을 미치는 위치에 몇 개의 역 돌연변이를 함유했다. 각 어셉터 프레임워크의 각각에 대해, 제3 서열은 가장 많은 역 돌연변이를 함유했으며, 이들은 전하를 변경하고, 잠재적으로 결합 친화성을 변경하는 치환을 포함한다. 이들 6개 사람화된 사슬의 서열을 하기 나타낸다:

이들 6개 사람화된 사슬의 서열을 표 11에 나타내며, 모 3D10 중쇄에 대한 차이는 굵은 글씨로 써서 밑줄로 표시한다.

(C) 항체 3D10의 사람화된 유도체

IGKV3-11*01과 IGHVl-2*02의 쌍과 유사한 점라인의 조합을 가진 항체가 존재했음을 조사에서 확인했다. 이 쌍을 어셉터 1로 표지한다. 추가로, IGKV 1-9*01과 IGHV3-49*04의 쌍과 유사한 점라인의 조합을 가진 항체가 발견되었다. 이 쌍을 어셉터 2로 표지한다.

상기 설명된 사람화된 경쇄 및 중쇄를 조합하여 14개의 변이체 사람화된 항체를 만들었으며, 이들의 서열이 표 12에 설명된다.

실시예 5

사람화된 항-사람 PD -1 항체의 생산

이러한 사람화된 유도체의 생산을 예시하기 위하여, 상기 설명된 과정에 따라서 항-사람 PD-1 항체 1H3의 사람화된 유도체를 생산했다(1H3의 가변 영역과 사람 IgG1 Fc 영역을 통합한 키메라 항체가 모 항체로 사용되었다).

1H3 경쇄 가변 도메인을 사람 점라인과 비교한 서열 정렬을 다음을 사용하여 생성했다: IGKV3 경쇄 점라인(IGKV3-11*01, IGKV3-11*02, IGKV3D-11*01, IGKV3D-20*01, IGKV3-NL4*01, IGKV3D-7*01, IGKV3-20*01, IGKV3-NL5*01, IGKV3- 15*01, IGKV3-NL1 *01, IGKV3-20*01, IGKV3-NL2*01, IGKV3-NL3*01), IGKVl 경쇄 점라인(IGKV1-9*01, IGKV1D-43*01, IGKV1-39*01, IGKV1D-13*02, IGKV1-8*01, IGKV1D-13*01, IGKV1-12*01, IGKV1D-16*01, IGKV1-5*01, 및 IGKV1-NL1*01) 및 IGKJ 경쇄 점라인(IGKJ2*02, IGKJ2*01, IGKJ2*04, IGKJ2*03, IGKJ5*01, IGKJ4*01, IGKJ3*01, 및 IGKJ1*01).

1H3 중쇄 가변 도메인을 사람 점라인과 비교한 서열 정렬을 다음을 사용하여 생성했다: IGHV3 중쇄 점라인(IGHV3-48*01, IGHV3-48*02, IGHV3-48*03, IGHV3-11*01, IGHV3-21*01, IGHV3-11*03, IGHV3-30*03, IGHV3-9*01, IGHV3-7*01, 및 IGHV3-30*10), IGHV1 중쇄 점라인(IGHV1-3*01, IGHVl-69*08, IGHV1-69* 11, IGHV1-46*01, IGHVl-69*05, IGHVl-69*06, IGHV1-69*01, IGHVl-46*02, IGHVl-69*02, 및 IGHV1-69*10), 및 IGHJ 중쇄 점라인(IGHJ6*01, IGHJ6*03, IGHJ4*01, IGHJ6*04, IGHJ5*02, IGHJ3*02, IGHJ5*01, IGHJ3*01, IGHJ2*01, 및 IGHJ1*01).

전체적인 서열 동일성, 일치하는 경계 위치 및 유사하게 분류된 CDR 정규 위치에 기초하여, 가능한 어셉터 프레임워크로서 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 두 점라인 패밀리를 확인했다(경쇄에 대해 IGKV3 및 IGKV1, 중쇄에 대해 1GHV3 및 IGHV1). 항체 1H3이 경쇄 점라인 1GKV3-11*01 및 중쇄 점라인 IGHV3-48*01과 가장 유사한 것으로 판명되었다. 전체적인 서열 동일성, 일치하는 경계 위치 및 유사하게 분류된 CDR 정규 위치에 기초하여, 가능한 어셉터 프레임워크로서 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 두 점라인 패밀리를 확인했다(경쇄에 대해 IGKV3 및 IGKV1, 중쇄에 대해 1GHV3 및 IGHV1).

(A) 경쇄의 사람화

항체 1H3은 짧은 10개 잔기 CDR L1을 가지며, 이것은 정규 부류 I에 속한다. 사람 점라인은 이러한 짧은 CDR L1을 갖지 않지만, 각 선택된 패밀리에서 가장 밀접한 점라인(IGKV3-II*01 및 IGKV1-9*01)은 짧은 L1 루프를 가지며, 부류 I L1 루프를 지지할 수 있는 정확한 프레임워크 잔기를 함유한다. 두 어셉터 프레임워크에 대해서 전체적인 서열 유사성은 우수했지만, 두 경계 위치(Y33과 P45)에는 차이가 있다. Y33은 CDR L1 안에 있지만, 두 선택된 어셉터 패밀리는 다른 가능한 어셉터 패밀리가 그런 대로 이 위치에 티로신을 함유하지 않는다. P45에서의 차이는 모 경쇄의 FR2에 있는 다수의 다른 차이와 결부된다. 간단히 말해서, 모 점라인은 사람 점라인에 있는 어떤 것과도 유사하지 않은 FR2를 가진 마우스 점라인 패밀리에 속한다.

점라인 1GKV3-11*01 및 IGKV 1-9*01을 경쇄 어셉터 프레임워크로서 선택했다. 1GKV3-11*01 및 IGKV 1-9*01의 경쇄의 서열은 각각 SEQ ID NO:78 및 SEQ ID NO:79로서 상기 나타낸다. 이들 서열과 항체 1H3의 경쇄의 정렬은 표 13에 나타낸다(항체 13H의 CDR 잔기는 이탤릭체로 표시되고, 동일한 정렬된 잔기는 밑줄로 표시된다).

J-세그먼트 유전자를 FR4에 대해 모 서열과 비교했고, IGKJ2*02(SEQ ID NO: 96: CTFGQGTKLEIK)를 경쇄를 위해서 선택했다.

두 바람직한 어셉터 프레임워크 IGKV3-11*01 및 IGKV1-9*01의 각각에 대해서 2개의 사람화된 사슬을 만들었다. 2개의 LC1 사슬은 IGKV3-11*01로부터 유래되고, 2개의 LC2 사슬은 IGKV 1-9*01로부터 유래된다. 각 어셉터 프레임워크의 제1 사람화된 사슬은 가능하다고 생각된 모든 사람화 치환을 함유했고, 3개 사슬 중 가장 사람에 가깝다. 각 어셉터 프레임워크의 제2 사람화된 사슬은 전하를 변형하는, 잠재적으로 코어 패킹을 방해하거나, 또는 CDR의 입체형태에 영향을 미치는 위치에 몇 개의 역 돌연변이를 함유했다. 이들 4개 사람화된 사슬의 서열을 하기 나타낸다:

이들 4개 사람화된 사슬의 서열을 표 14에 나타내며, 모 1H3 Var1 경쇄에 대한 차이는 굵은 글씨로 써서 밑줄로 표시한다.

(B) 중쇄의 사람화

상기 논의된 기준에 비추어, 두 후보 점라인 어셉터 프레임워크 IGHV3-48*01(IGHV3 점라인) 및 IGHV1-3*01(IGHV1 점라인)을 항체 1H3 Varl의 중쇄의 사람화를 위해서 선택했다.

어셉터 프레임워크 1GHV3-48*01는 전체적인 서열 유사성으로 인해 일차 중쇄 어셉터 프레임워크로 선택되었다. 경계 잔기는 H35를 제외하고 일치하는데, 이 위치에서는 어떤 변화가 허용되며, CDR H1의 정규 부류를 결정하기 위한 정확한 잔기를 함유한다. CDR H2는 위치 56에 티로신으로 인하여 어느 서열-기반 정규 부류에도 속하지 않는다. 제2 중쇄 어셉터 프레임워크의 선택은 IGHV3-48*01와 밀접히 관련된 어느 점라인을 제거한 후에 이루어졌다. 가장 밀접한 점라인은 IGHV1-3*01이 되었다. 생각할 수 있는 차이의 수는 낮은 코어의 패킹 차이에 따라 더 많아지지만, 점라인은 CDR을 지지해야 하고, 적합한 어셉터 프레임워크로 기능해야 한다. 모 서열은 보존된 위치 60에 시스테인을 함유하지만, 모든 사람 점라인은 티로신을 가진다는 것이 주지되었다. 어셉터 프레임워크 1GHV3-48*01 및 어셉터 프레임워크 IGHV1-3*01의 서열을 아래 나타낸다:

표 15는 이들 서열과 항체 1H3의 중쇄의 정렬을 나타낸다(항체 1H3의 CDR 잔기는 이탤릭체로 표시되고, 동일한 정렬된 잔기는 밑줄로 표시된다).

J-세그먼트 유전자를 FR4에 대해 모 서열과 비교했고, J-세그먼트 IGHJ6*01 (SEQ ID NO: 103: WGQGTTVTV)를 중쇄를 위해서 선택했다.

두 바람직한 어셉터 프레임워크 IGHV3-48*01 및 IGHV1-3*01의 각각에 대해서 3개의 사람화된 사슬을 만들었다. 3개의 HC1 사슬은 IGHV3-48*01로부터 유래되고, 3개의 HC2 사슬은 IGHV1-3*01로부터 유래된다. 각 어셉터 프레임워크의 제1 사람화된 사슬은 가능하다고 생각된 모든 사람화 치환을 함유했고, 3개 사슬 중 가장 사람에 가깝다. 각 어셉터 프레임워크의 제2 사람화된 사슬은 전하를 변형하는, 잠재적으로 코어 패킹을 방해하거나, 또는 CDR의 입체형태에 영향을 미치는 위치에 몇 개의 역 돌연변이를 함유했다. 각 어셉터 프레임워크의 각각에 대해, 제3 서열은 가장 많은 역 돌연변이를 함유했으며, 이들은 전하를 변경하고, 잠재적으로 결합 친화성을 변경하는 치환을 포함한다. 이들 6개 사람화된 사슬의 서열을 하기 나타낸다:

이들 6개 사람화된 사슬의 서열을 표 16에 나타내며, 모 1H3 중쇄에 대한 차이는 굵은 글씨로 써서 밑줄로 표시한다.

(C) 항체 1H3의 사람화된 유도체

IGKV3-11*01와 중쇄 IGHV3-48*01의 쌍과 유사한 점라인의 조합을 가진 항체가 존재함을 조사에서 확인했다. 이 쌍을 어셉터 1로 표지한다. 이어서, IGKVI-9*01과 IGHVI-3*01과 유사한 쌍을 가진 항체가 발견되었다. 이 쌍을 어셉터 2로 표지한다.

상기 설명된 사람화된 경쇄 및 중쇄를 조합하여 14개의 변이체 사람화된 항체를 만들었으며, 이들의 서열이 표 17에 설명된다.

실시예 6

1 H3 항-사람 PD -1 항체의 특성화

본 발명의 항-PD-1 항체의 특성을 평가하기 위하여 항체 1H3의 키메라("ch") 뮤린 항-사람 PD-1 Fab 영역과 사람 IgG1 Fc 영역을 지닌 구성물을 제조했다(1H3 구성물). 이 구성물을 사람 PD-1과 결합하는 능력에 대해 시험했다.

도 12는 실험 결과를 도시하며, 이 실험에서는 사람 전장 PD-1로 형질감염된 CHO 세포가 바이오틴-표지된 항-hB7-H1-Fc 또는 항-hB7-DC mFc로 염색되기 전에 포화된 용량의 PD-1 mAb와 함께 예비 인큐베이션되었다. 도 12는 항체 1H3의 키메라("ch") 뮤린 항-사람 PD-1 Fab 영역과 사람 IgG1 Fc 영역을 지닌 뮤린 단클론성 항체 구성물이 세포에 대한 항체 결합의 결과로서 사람 PD-1을 발현하는 세포에 대한 B7-Hl-Fc 및 B7-DC-Fc의 결합을 차단한다는 것을 보여준다. Ml, m3 및 1E8은 모두 양성 대조군 항-PD-1 항체이다. 비-환원 겔에서 이 구성물은 대략 200MW의 단일 밴드로 이동했으며, 환원 조건에서는 이 밴드가 대략 52MW의 밴드로 치환되었다.

1H3 구성물은 2.19nM의 친화성 K_D, 0.734 x 10^-5 /Ms의 "온 레이트" Ka, 및 1.61 x 10^-4 /s의 "오프 레이트" Kd를 나타냈다. 이 구성물의 EC50은 75ng인 것으로 판명되었다. 도 13은 이 구성물을 사용하여 얻어진 결합과 상업적으로 입수가능한 항-PD-1 항체인 EH12의 결합을 비교한다. 이 구성물은 도 14에 도시된 대로 B7-Hl-Fc 또는 B7-DC-Fc와 결합하는 hPD-1(CHO 세포에 의해서 발현된)의 능력을 완전히 차단할 수 있는 것으로 판명되었다. 도 15는 키메라 1H3 구성물이 hPD-l-Fc와는 결합하고, CHO 세포에 의해서 발현된 이러한 hPD-1-Fc와 hB7-H1의 결합은 차단할 수 있었던 것을 보여준다.

사람 일차 T 세포와 결합하는 1H3 구성물의 능력을 대조군 항체(팔리비주맙; SYNAGIS®, Medimmune, Inc.)과 비교하여 평가했다. 1H3은 CD8 및 CD4 세포 모두에 대해 증진된 결합을 나타냈다(도 16a-16b).

본 발명의 항체들의 기능적 특성을 예시하기 위하여, T 세포 활성을 증진시키는 구성물 1H3, 및 항체 1H3("1H3 구성물"), 1E3("1E3 구성물") 및 항체 3D10 ("3D10 구성물")의 FAB 영역을 갖는 키메라 항체 구성물의 능력을 평가했다. 미성숙 수지상 세포(DC)를 2일 동안 TNFα 및 PGE2에 노출시켰다(세포를 성숙화 2일째에 하룻밤 50μg/ml 파상풍 독소(TT)의 존재하에 인큐베이션했다). 결과의 세포는 이들이 획득한 B7-H1 및 B7-DC를 발현하는 능력에 의해서 결정된바 성숙한 DC가 된 것으로 판명되었다. 다음에, 성숙된 DC 세포를 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)-표지된 자가 T 세포와 100ng/ml TT와 상기 설명된 항체 구성물의 존재하에 2주 동안 인큐베이션했다. 도 17에 도시된 대로, 본 발명의 항체는 항원-특이적 기억 T 세포의 확장에 의해서 측정된바 B7-H1-PD-1 상호작용을 차단할 수 있었다. 7일째에 세포 상청액에 존재하는 사이토카인의 분석을 수행했다(표 18).

표 18에 나타낸 대로, 항-hPD-1 항체 구성물은 둘 다 Th1 및 Th2 반응을 모두 촉진시켰다. 매우 적은 양의 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10 및 G-CSF가 상청액에서 발견되었다. 모든 mAb는 0.01EU/mg 미만의 매우 낮은 내독소를 가진다. 추가로, DC 및 T 세포는 혈청 무함유 배지에서 유지되었다. 7일차 세포의 세포내 IFN-γ 염색은 대조군 세포는 단지 0.15%만 IFN-γ+였지만, 1H3 구성물과 함께 인큐베이션된 세포의 1.9%, 1E3 구성물과 함께 인큐베이션된 세포의 0.91%, 그리고 3D10 구성물과 함께 인큐베이션된 세포의 3.2%가 IFN-γ+였다.

따라서, 종합하면 1H3 구성물은 T 세포 증식의 대략 7배 증가와 세포당 IFN-γ 생산의 대략 12배 증가를 매개하는 것으로 판명되었다. 이러한 작용의 누적 효과는 IFN-γ 분비의 대략 100배 증가이다.

추가의 기능적 특성화로서, 단구-유래 DC를 TNFα 및 PGE2와 함께 인큐베이션하여 성숙시켰다. 다음에, 혼합된 부류 I과 부류 II 제한 CEF 펩티드들(즉, 시토메갈로바이러스, 엡스타인-바 바이러스 및 인플루엔자 바이러스)이 혼합된 풀의 존재하에 세포를 2시간 동안 펄스하고, CFSE-표지된 자가 T 세포(LD 칼럼, 95% 순도)와 함께 2주 동안 인큐베이션했다. 다음에, 처리된 세포를 CFSE-표지된 자가 T 세포(LD 칼럼, 95% 순도) 및 상기 설명된 항체 구성물의 존재하에 2주 동안 인큐베이션했다. 7일째에 CFSE-희석된 T 세포의 퍼센트는 대조군 항체와 함께 인큐베이션된 세포에서 40%, 1H3 구성물과 함께 인큐베이션된 세포에서 37%, 3D10 구성물과 함께 인큐베이션된 세포에서 50%, 그리고 항체 CA-18C3(항-IL-1α-특이적 단클론성 항체)과 함께 인큐베이션된 세포에서 57%인 것으로 판명되었다. 11일째 CFSE-희석된 T 세포의 퍼센트를 다시 평가했다. CFSE-희석된 T 세포의 퍼센트는 대조군 항체와 함께 인큐베이션된 세포에서 17%이고 1H3 구성물과 함께 인큐베이션된 세포에서 38%인 것으로 판명되었다. CFSE-희석된 T 세포의 퍼센트는 항체 CA-18C3와 함께 인큐베이션된 세포에서 27%인 것으로 판명되었다.

또한, 7일째에 처리된 세포의 상청액을 IL-2 및 IFN-γ 사이토카인에 대해서 분석했다(표 19).

또한, 11일째에 처리된 세포의 상청액을 IFN-γ, TNFα 및 GM-CSF에 대해서 분석했다. 1H3 구성물은 대조군 항체에 비해서 모든 3개 사이토카인의 증진을 매개하는 것을 판명되었다(표 20).

추가의 기능적 특성화로서, 단구-유래 DC(HLA-A2 양성 도너 PBMC로부터 얻어진)를 TNFα 및 PGE2에 노출시켜 성숙시키고, 성숙된 DC를 2시간 동안 HLA-A2 제한된 MART-1 및 Flu M1 펩티드로 펄스했다. 이후, 세포를 CFSE-표지된 자가 T 세포(LD 칼럼, 95% 순도) 및 상기 설명된 1FB 구성물 또는 3D10 구성물의 존재하에 2주 동안 인큐베이션했다. 사이토카인 생산에 대한 MART-1 및 M1 펩티드의 효과를 표 21에 나타낸다.

실시예 7

사람화된 항- PD -1 항체의 특성화

사람 PD-1과 결합하는 능력 및 치료 능력을 확인하기 위하여 상기 설명된 사람화된 lFB var 1 -lFB var 14 항체(표 17 참조)를 평가했다. 이 항체들을 암호화하는 폴리펩티드를 CHO 세포에서 발현시키고, 기능적 항체의 역가를 ELISA에 의해서 결정했다(표 22).

결합이 사람 PD-1에 특이적이었음을 보장하기 위하여, 결합을 사람 PD-1을 발현하도록 형질감염된 CHO 세포를 사용하여 평가했다. 이러한 결합 실험을 결과를 도 18a-18d에 도시한다. 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 또는 3000ng의 h1H3 변이체의 존재하에 이러한 결합 실험을 반복함으로써 PD-1과 결합하는 이러한 사람화된 항체의 능력은 모든 경우에 항체 농도에 의존적이었음이 판명되었다.

PD-1과 그것의 천연 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 본 발명의 사람화된 항-PD-1 항체의 능력을 증명하기 위하여, PD-1-발현 HEK293 세포를 B7-H1(또는 B7-DC) 및 선택된 h1H3 변이체의 존재하에 인큐베이션했다. h1H3 변이체 항체는 B7-H1과 HEK293 세포의 결합을 차단할 수 있는 것으로 판명되었다(도 19a(B7-H1); 도 19b(B7-DC)(Ctl = 시나지스, WT = 키메라 1H3).

표 23은 500ml 규모의 일시 발현 및 정제 과정에서 얻어진 결과를 제공한다. 비-환원 겔은 발현된 항체들이 대략 160kD의 단일 밴드로서 주도적으로 이동했음을 보여주었다. 환원 겔에서 분석했을 때는 이 밴드는 대략 60kD와 30kD의 밴드로 치환되었다. 결과는 어셉터 1 h1H3 변이체들인 h1H3 Varl, h1H3 Var3, h1H3 Var4 및 h1H3 Var6은 사람 PD-1에 대해 우수한 결합 활성을 나타냈지만, 어셉터 2 h1H3 변이체들인 h1H3 Var7 - h1H3 Varl 4는 사람 PD-1에 대해 불량한 결합을 나타냈음을 보여준다. 따라서, 어셉터 1 h1H3 변이체들인 h1H3 Varl - h1H3 Var6의 경쇄 및 중쇄를 이중 유전자 벡터(DGV; Lonza Biologies, Berkshire, UK; Bebbington, C.R. et al.(1992) "High-Level Expression Of A Recombinant Antibody From Myeloma Cells Using A Glutamine Synthetase Gene As An Amplifiable Selectable Marker," Biotechnology(NY) 10(2):169-175)에 클로닝하고 CHO세포에 형질감염시켜 안정한 항체-생산 셀라인을 생산했다.

0.5, 1.5, 5, 15, 50, 150 및 500ng/ml 뿐만 아니라 1.5, 5, 15 및 50μg/ml의 항체 농도에서 결합 분석은 결합이 농도 의존적임을 드러냈다. 변이체들의 PD-1-특이적 결합 활성을 0 내지 약 350nM 범위의 항체 농도에서 결정했다. 도 20은 h1H3 Var 1 - h1H3 Var 6에 대한 결과 곡선을 도시하며, 이들 항체가 PD-1과 결합한다는 것을 나타낸다. 항체 h1H3 Var 1 및 h1H3 Var 4는 모 항체에 비해서 감소된 결합을 나타낸다. 반면에, h1H3 Var 2, h1H3 Var 3, h1H3 Var 5 및 h1H3 Var 6은 모 항체와 비슷한 결합을 나타냈다. 이들 항체에 대한 EC50 데이터를 표 23에 나타낸다.

본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별 공보 또는 특허출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 그 전체가 참고자료로 포함된다고 주지된 것과 마찬가지로 동일한 정도까지 본원에 참고자료로 포함된다. 본 발명은 구체적인 실시형태와 관련하여 설명되었지만, 추가의 변형이 있을 수 있으며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따라서 본 발명의 어느 변형, 사용 또는 개조를 모두 아우르며, 본 명세서로부터의 이러한 벗어남을 포함하도록 의도되고, 본 발명이 속한 분야에서 공지된 또는 통상의 실시 범위로서, 앞서 제시된 필수적인 특징들에 적용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Amplimmune, Inc. Langermann, Solomon Liu, Linda Marshall, Shannon Yao, Sheng <120> Antibodies and Other Molecules That Bind B7-H1 and PD-1 <130> 1000.0001I <150> US 61/147,414 <151> 2011-04-20 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro 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Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Tyr Thr Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Met His 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Ser Leu 1 5 10 15 Ala <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human B7-H1 Light Chain CDR1 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> R, S or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> R, N, D, Q, E, H, K, M, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> SLLYSS or Absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Absent or N or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> A, Q, E, L, K, M, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Any Amino Acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> R, N, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> A, R, N, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> I, L, M, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> A, R, N, Q, E, H, I, K, M, F, S, T, or Y <400> 22 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Ser Leu Leu Tyr Ser Ser 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Asp Thr Ser Lys Leu Thr Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human B7-H1 Light Chain CDR2 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Any Amino Acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> A, C, G, S, T, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> A, C, H, I, L, M, F, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> R, N, D, Q, E, K, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> A, R, Q, L, K, M, S, T, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A, R, N, D, Q, E, G, H, K, M, F, P, S, T, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> A, N, S, or T <400> 29 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Gln Gln Asp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Gln Gln Asp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human B7-H1 Light Chain CDR3 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> R, N, Q, E, or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Any Amino Acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> A, R, N, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> N, G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> A, R, N, D, Q, E, G, H, K, M, P, S, T, or Y <400> 35 Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Gly Tyr Thr Phe Pro Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Gly Tyr Ser Ile Ile Ser Asp Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human B7-H1 Heavy Chain CDR1 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Y or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> T or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> I, L, M, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> N, D, Q, E, K, P, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> A, R, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, or V <400> 41 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 1 5 10 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Asp Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Trp Ile Phe Pro Arg Asp Asn Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Val Met Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Ser Asn Ser Val Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human B7-H1 Heavy Chain CDR2 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Any Amino Acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> I, L, M, F, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Any Amino Acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> P or Absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> A, R, N, Q, E, H, K, M, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, K, M, F, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> N, G, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> N, G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> A, R, N, Q, E, H, K, M, S, T, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> A, R, N, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> A, D, Q, E, K, P, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> I, L, M, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> A, G or S <400> 47 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 48 <400> 48 000 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Glu Asn Trp Val Gly Asp Phe 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Tyr Gly Gly Trp Leu Ser Pro Phe 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Arg Gly Gly Trp Leu Leu Pro Phe 1 5 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Tyr Tyr Gly Asn Ser Pro Tyr Tyr Ala Ile 1 5 10 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human B7-H1 Heavy Chain CDR3 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> A, R, N, Q, E, H, K, M, S, T, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, K, M, F, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Q, G, H, T, or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(7) <223> Any Amino Acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> AI or Absent <400> 53 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Met Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human PD-1 Light Chain CDR1 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N, Q, E, K, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> N, D, Q, E, K, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> N, D, Q, E, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A, C, I, L, M, F, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, K, M, F, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> N, S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> A, R, N, D, Q, E, G, H, K, M, P, S, T, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> I, L, M, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> A, R, N, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, S, T, Y, or V <400> 57 Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Ser 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human PD-1 Light Chain CDR2 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> A, R, C, Q, I, L, K, M, F, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> A, S, T, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> A, R, N, Q, E, H, K, M, S, T, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> A, R, N, Q, L, K, M, S, T, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A, R, C, Q, I, L, K, M, F, S, T, Y, or V <400> 61 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 64 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human PD-1 Light Chain CDR3 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> A, R, N, Q, L, K, M, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> N, D, Q, E, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> N, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A, R, N, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> F, W, or Y <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 65 Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 66 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 67 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 68 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human PD-1 Heavy Chain CDR1 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> F or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> N or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> A, R, C, Q, E, G, H, K, M, F, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> N or H <400> 69 Gly Xaa Thr Phe Xaa Xaa Tyr Xaa Met Xaa 1 5 10 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 70 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Tyr Thr Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 Asn Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72 His Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human PD-1 Heavy Chain CDR2 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> A, R, N, Q, E, H, K, M, S, T, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> A, D, Q, E, K, P, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, K, M, F, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> A, C, I, L, M, T, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> A, R, N, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> N, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> N, D, Q, E, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> R, N, D, Q, E, K, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> I, L, M, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> N, D, G, or S <400> 73 Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 74 Arg Gly Tyr Gly Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Gly Arg Ile Tyr Asp Gly Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 Glu Asp Tyr Asp Val Asp Tyr 1 5 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human PD-1 Heavy Chain CDR3 Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> A, R, N, D, Q, E, G, H, K, P, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> A, R, N, D, Q, E, G, H, K, P, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> I, L, M, F, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, K, M, F, P, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A, R, N, D, C, Q, E, G, H, K, M, F, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> A, R, N, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, S, T, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> A, R, N, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> YYF or Absent <400> 77 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 1 5 10 <210> 78 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95 <210> 79 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser 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Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 90 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human B7-H1 Heavy Chain HC1_1 <400> 90 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 91 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human B7-H1 Heavy Chain HC1_2 <400> 91 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val 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Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 105 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human PD-1 Heavy Chain HC1_2 <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 106 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human PD-1 Heavy Chain HC1_3 <400> 106 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 107 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human PD-1 Heavy Chain HC2_1 <400> 107 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Ala Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 108 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human PD-1 Heavy Chain HC2_2 <400> 108 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Ala Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 109 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human PD-1 Heavy Chain HC2_3 <400> 109 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Ala Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120

Claims

PD-1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
i. 서열 SASSSVSYMY를 갖는 제1 경쇄 CDR
서열 LTSNRAT를 갖는 제2 경쇄 CDR, 및
서열 QQWSSNPFT를 갖는 제3 경쇄 CDR; 및
ii. 서열 GFTFSDYGMH를 갖는 제1 중쇄 CDR,
서열 YISSGSYTIYSADSVKG를 갖는 제2 중쇄 CDR, 및
서열 RGYGSFYEYYFDY를 갖는 제3 중쇄 CDR
을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, SEQ ID NO: 98의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 결합된 PD-1이, 내인성 또는 형질감염된 농도로, 살아 있는 세포의 표면에서 발현되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제3항에 있어서, 살아 있는 세포가 T 세포인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, PD-1이 사람 PD-1인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서,
(A) PD-1에 결합하는 PD-1의 리간드의 능력을 약화시키거나,
(B) PD-1 매개 신호 전달을 길항하거나,
(C) T 세포 증식을 증가시키거나,
(D) IFN-γ 생산을 증진하거나,
(E) 이들의 조합인,
항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역(Fc)으로부터의 하나 이상의 불변 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제7항에 있어서, 상기 불변 도메인이 사람 불변 도메인인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제8항에 있어서, 상기 사람 불변 도메인이 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제9항에 있어서, 상기 사람 IgG 불변 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 도메인인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 검출이 가능하게 표지되거나, 또는 콘쥬게이트된 독소, 약물, 수용체, 효소, 또는 수용체 리간드를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, 또는 단쇄 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 2중 특이적, 3중 특이적, 또는 다중 특이적 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제13항에 있어서, 상기 항체가 2중 특이적 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하며, 면역 반응의 증가를 필요로 하는 대상에서 면역 반응을 증가시키기 위한 제약 조성물.
제15항에 있어서, 상기 대상이 암 또는 감염성 질환을 갖고 있는 것인 제약 조성물.
제16항에 있어서, 암 또는 감염성 질환의 임의의 증상에 앞서 치료가 제공되는 것인 제약 조성물.
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