KR101388320B1

KR101388320B1 - 양이온성 올리고뉴클레오티드, 이를 제조하기 위한 자동화방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101388320B1
Application number: KR1020087017193A
Authority: KR
Inventors: 쟝-폴 베어; 미츠하루 고테라; 베네딕트 퐁; 에밀 부아렝; 쟝-세르지 레미
Original assignee: 뽈리쁠뤼스-트랑스펙씨옹; 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2014-04-22
Anticipated expiration: 2026-12-14
Also published as: CN101370817A; JP2009519317A; HK1127360A1; US9676798B2; EP1973927A2; IL192158A0; WO2007069092B1; US9090648B2; CA2633065C; RU2008128853A; EP1973927B1; CN101370817B; US20090069262A1; RU2451022C2; AU2006325054A1; ES2435420T3; AU2006325054B2; JP5346585B2; US20160280728A1; WO2007069092A2

Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오티드 부분 A_i 및 올리고양이온 부분 B_j를 가지는, 자동화 포스포아미다이트 화학법에 의해 합성될 수 있는 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자 A_iB_jH에 관한 것으로, 여기서 A_i는 i량체(i-mer) 올리고뉴클레오티드 잔기(i는 5∼50임)이고, 이때 뉴클레오티드 A는 자연 또는 비자연 발생 핵염기 및/또는 펜타푸라노실 기 및/또는 고유 포스포디에스테르 결합을 가지는 올리고머이고, 예를 들어 데옥시리보, 리보, 잠금(LNA) 뉴클레오티드 및 이들의 화학적 변형체 또는 치환체, 예컨대 포스포로티오에이트, 2'-플루오로, 2'-O-알킬, 또는 형광제와 같은 마커 기를 포함하는 군으로부터 선택되며, B_j는 j량체 유기 올리고양이온 부분(j는 1∼50임)이고, 이때 B는 ㆍ-HPO₃-R¹-(X-R² _n)_n1-X-R³-O-(이때, 동일하거나 상이한 R¹, R², n 및 R³은 저급 알킬렌이고, X는 NH 또는 NC(NH₂)₂이고, n은 1∼5이고, n1은 2∼20임), ㆍ-HPO₃-R⁴-CH(R⁵X¹)-R⁶-O-(이때, R⁴는 저급 알킬렌이고, 동일하거나 상이한 R⁵ 및 R⁶은 저급 알킬렌이고, X¹은 푸트레신, 스퍼미딘 또는 스퍼민 잔기임), ㆍ-HPO₃-R⁷-(aa)_n2-R⁸-O-(이때, R⁷은 저급 알킬렌이고, R⁸은 저급 알킬렌, 세린, 천연 아미노알코올이고, (aa)_n2는 양이온성 측쇄를 가지는 천연 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 오르니틴, 히스티딘, 디아미노프로피온산을 포함하는 펩티드이고, n2는 2∼20임)를 포함하는 군으로부터 선택된다.

Description

양이온성 올리고뉴클레오티드, 이를 제조하기 위한 자동화 방법 및 이의 용도{CATIONIC OLIGONUCLEOTIDES, AUTOMATED METHODS FOR PREPARING SAME AND THEIR USES}

본 발명은 올리고뉴클레오티드 합성기에서 단계적으로 합성할 수 있는 양이온성 올리고뉴클레오티드, 즉, 또한 상세한 설명에서 (이들의 전체 전하와 상관없이) 양이온성 올리고뉴클레오티드라고도 하는 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 분자 생물학, 진단 및 치료 분야에서의 그 용도에 관한 것이다.

올리고뉴클레오티드는 분자 생물학 및 진단학에서 매우 많은 용도에 사용되며, 광범위한 질병의 치료를 위한 매우 선택적인 약물류가 될 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 다른 다가 음이온성 핵산이 보유하는 상보적인 서열에 하이브리드화한 후에 그들의 특이적 활성을 발휘하는 다가 음이온이다.

이들은 또한 약물 후보 물질로서, 음이온성 세포막을 관통할 수 있다.

단순한 정전기적 고려사항은, 하이브리드화 에너지 및 세포 결합이 올리고뉴클레오티드 구조에 양이온 기를 첨가하는 것에서 이익을 얻을 수 있음을 의미한다.

이 목적을 위해, 암모늄 또는 구아니디늄 잔기를 올리고뉴클레오티드에 도입 하기 위한 여러 합성법, 예를 들어 포스페이트 골격 치환, 리보스 또는 핵산 염기 변형, 및 다가 양이온의 말단 접합이 검토되었다. 하지만, 하이브리드화 특이성, 핵산 처리 효소 활성뿐 아니라 대사 산물 독성은 최선의 해법으로서 다가 양이온을 다른 천연 올리고뉴클레오티드에 부착하는 블록법의 모든 점에 관계되어 있다. 안타깝게도, 올리고뉴클레오티드-양이온성 펩티드 접합체의 단계적 자동화 합성은 아직 일상적이지 않다. 반면에, 미리 형성한 대형 블럭 사이의 접합 화학, 특히 ≪수퍼≫양성 이온이 대처가 어려운 용해도, 정제 및 특성화 문제를 일으키는 물 중에서의 접합 화학은 용이하지 않다. 더욱이, 분자 생물학 및 진단 분야는 임의의 유기 양이온 길이에 연결된 임의의 주어진 염기 서열의 빠르고 용이한 합성을 요구한다.

본 발명자들은 4개의 천연 염기의 바이알 외에도 적당히 활성화 및 보호된 올리고양이온성 유도체를 함유하는 바이알을 올리고뉴클레오티드 합성기에 충전(plug)함으로써 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자의 온라인, 컴퓨터 구동 합성이 가능하다는 것을 발견했다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 새로운 양이온성 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 양이온성 올리고뉴클레오티드의 고수율의 자동화 합성법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적에서, 본 발명은 특히 분자 생물학, 진단학 및 치료학 분야에서의 상기 양이온성 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 자동화 포스포아미다이트(phosphoramidite) 화학, 즉 폴리포스포디에스테르에 의해 합성될 수 있는 혼합 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자에 관한 것이다.

더욱 특히, 본 발명의 양이온성 올리고뉴클레오티드 A_iB_jH는 올리고뉴클레오티드 부분 A_i 및 올리고양이온 부분 B_j를 가지며, 이때

ㆍA_i는 자연 또는 비자연 발생 핵염기(nucleobase) 및/또는 펜타푸라노실 기 및/또는 고유(native) 포스포디에스테르 결합을 가지는 i량체(i-mer) 올리고뉴클레오티드 잔기(i는 5∼50임)이고,

ㆍB_j는 j량체 유기 올리고양이온 부분(j는 1∼50임)이고, 이때 B는

ㆍ-HPO₃-R¹-(X-R² _n)_n1-X-R³-O-(이때, 동일하거나 상이한 R¹, R² _n및 R³은 저급 알킬렌이고, X는 NH 또는 NC(NH₂)₂이고, n은 1∼5이고, n1은 2∼20임),

ㆍ-HPO₃-R⁴-CH(R⁵X¹)-R⁶-O-(이때, R⁴는 저급 알킬렌이고, 동일하거나 상이한 R⁵ 및 R⁶은 저급 알킬렌이고, X¹은 푸트레신, 스퍼미딘 또는 스퍼민 잔기임),

ㆍ-HPO₃-R⁷-(aa)_n2-R⁸-O-(이때, R⁷은 저급 알킬렌이고, R⁸은 저급 알킬렌, 세린, 천연 아미노산의 환원에 의해 얻어진 아미노알코올이고, (aa)_n2는 양이온성 측쇄를 가지는 천연 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 오르니틴, 히스티딘, 디아미노프로피온산을 포함하는 펩티드이고, n2는 2∼20임)

를 포함하는 군으로부터 선택된다.

상세한 설명 및 청구범위에서 사용된 "저급 알킬" 및 "저급 알킬렌"은 각각, 바람직하게는 경우에 따라 치환된 C1∼C5 선형 또는 분지형 알킬 또는 알킬렌 라디칼을 가리킨다.

A는 예를 들어 데옥시리보, 리보, 잠금(LNA) 뉴클레오티드뿐 아니라, 이들의 화학적 변형체 또는 치환체, 예컨대 포스포로티오에이트(티오포스페이트라고도 함), 2'-플루오로, 2'-O-알킬 또는 형광제와 같은 마커 기를 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 혼합 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자는 ^3'A^5'―B 서열을 가진다.

본 발명의 다른 분자는 B―^3'A^5' 서열을 가진다.

본 발명의 또 다른 분자는 B―^3'A^5'―B 또는 ^3'A^5'―B―^3'A^5' 서열을 가진다.

이러한 서열은 하기 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드-스퍼민 분자에 의해 실시예에서 예시된다:

(식 중, A, i 및 j는 앞서 정의한 바와 같다).

A가 포스포로티오에이트 뉴클레오티드인 분자는 이들의 생물학적 용도의 관점에서 특히 이로운데, 이는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 생물학적 유체에서 가수분해되지 않기 때문이다.

앞서 정의한 양이온성 올리고뉴클레오티드는, 실시예에서 예시된 바와 같이, 가닥 치환 환경 및 심지어 플라스미드 가닥 침입(invasion) 환경에서 이들의 상보적인 서열과 빠르고 안정한 복합체를 형성한다.

말단 접합으로 인해, 서열 선택성은 천연 뉴클레오티드에 대해서와 같이 높게 유지된다.

따라서, 본 발명의 양이온성 올리고뉴클레오티드는 분자 생물학, 연구용 시약 및 진단 분야, 예컨대 PCR, 실시간 PCR, 유전자형 검사, 인 시추(in situ) 하이브리드화 및 DNA 칩에 있어서 대단한 관심의 대상이다.

또한, 이러한 분야들은 본 발명의 범주에 포함되며, 앞서 정의한 바와 같은 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자의 사용을 포함한다.

음이온성 올리고뉴클레오티드와 반대로, 본 발명의 양이온성 올리고뉴클레오티드는 실시예에서, 살아있는 세포의 핵 및 세포질에 자발적으로 들어가는 것으로 보여진다.

이들의 향상된 하이브리드화 및 세포 침투성을 고려할 때, 그것들은 또한 메신저 RNA의 안티센스 및 siRNA 분해에 의해, 메신저 RNA 성숙 시 엑손 건너뛰기에 의해, 염색질과의 삼중 나선 형성에 의해, 염색질 가닥 침입(유전자 보정) 등에 의해 매개되는 것들과 같은 치료적 접근법에 유용하다.

따라서, 본 발명은 또한 앞서 정의한 바와 같은 유효량의 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자를 약학적 허용 담체와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 앞서 정의한 바와 같은 유효량의 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자를 약학적 허용 담체와 함께 사용하는 단계를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.

앞서 정의한 혼합 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자는

- 앞서 정의한 바와 같은 올리고뉴클레오티드 A의 바이알에 더하여, 활성화 및 보호된 올리고양이온 B를 함유하는 바이알을 올리고뉴클레오티드 합성기에 충전하거나 또는 그 반대로 충전하는 단계,

- 목적하는 길이를 얻으면 합성을 중단하는 단계,

- 고체 지지체로부터 올리고머를 절단하는 단계, 및

- 보호기를 제거하는 단계

를 포함하는 방법에 따라, 포스포아미다이트 경로를 통해 올리고뉴클레오티드 합성기에서 단계적으로 용이하게 합성된다.

본 발명은 올리고양이온이 반복된 블럭 B의 구성을 위한 자동화 합성에 사용되는 포스포아미다이트 반응물에 밀접하게 관련되어 있다. 이 목적을 위해 하기의 포스포아미다이트 반응물을 사용할 수 있다:

ㆍP(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R¹-(X-R² _n)_n1-X-R³-O-Prot(이때, R¹, R², R³, n 및 n1은 앞서 정의한 바와 같고, X는 적절하게 보호된 NH 또는 NC(NH₂)₂이고, R⁹는 -CH₂CH₂CN 또는 저급 알킬이고, R¹⁰은 저급 알킬이거나, 또는 -N(R¹⁰)₂는 피롤리디노, 피페리디노 또는 모폴리노 기이고, Prot는 DMT, MMT와 같은, 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 보호기임);

ㆍP(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R⁴-CH(R⁵X¹)-R⁶-O-Prot(이때, R⁴, R⁵, R⁶은 저급 알킬렌이고, X¹은 적절하게 보호된 푸트레신, 스퍼미딘 또는 스퍼민이고, R⁹ 및 R¹⁰은 앞서 정의한 바와 같음);

ㆍP(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R⁷-(aa)_n2-R⁸-0-Prot(이때, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, n2 및 Prot는 앞서 정의한 바와 같고, (aa)_n2는 적절하게 보호된 양이온성 측쇄를 가지는 천연 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 오르니틴, 히스티딘, 디아미노프로피온산을 포함하는 펩티드이고, n2는 2∼20임).

적절하게 보호된 NH 또는 NC(NH₂)₂는, 보호기가 아미노 또는 구아니딘 잔기에 각각 존재하여, 반응물이 노출되는 화학 반응 조건에 대해 상기 잔기들의 작용성이 비활성이 되도록 하는 것을 의미한다.

이러한 보호기는 예를 들어 프탈이미드(PHTH), 트리플루오로아세테이트, 알릴옥시카보닐(Alloc), 벤질옥시카보닐(CBZ), 클로로벤질옥시카보닐, t-부틸옥시카보닐(Boc), 플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 및 이소니코티닐옥시(i-Noc) 기이다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 올리고뉴클레오티드 서열의 단계적 합성 후에 올리고양이온 부분의 단계적 합성을 수행하여 서열 (^3'A^5'―B)를 가지는 화합물을 얻는다.

다른 구체예에 따르면, 역순으로, 올리고양이온 부분의 단계적 합성 후에 올리고뉴클레오티드 서열의 단계적 합성을 수행하여 (B―^3'A^5') 서열의 화합물을 얻는다.

또 다른 구체예에 따르면, 혼합 서열이 합성된다.

특히, 양쪽 말단이 캡핑된 올리고뉴클레오티드 서열(B―^3'A^5'―B)은 생물학적 유체에서 엑소뉴클레아제를 견딜 수 있고, 양이온 개재 서열(^3'A^5'―B―^3'A^5')은 인접한 핵산 서열의 표적화를 허용한다.

스퍼민과 같은 자연 발생 아민, 또는 올리고아르기닌과 같은 펩티드를 사용함으로써, 대사 산물의 잠재적인 독성을 피한다. 스퍼민은 실제로 세포 내에서 밀리몰(millimolar) 농도로 존재하고, 그것의 말단 알킬화는 무해하다. 또한, 여러 핵 단백질 중에는 염기성 펩티드 서열이 존재한다.

활성화 및 보호된 올리고양이온 B는 폴리아민의 아미노기를 보호한 후, α,ω-비스 히드록시알킬화를 수행하여 올리고뉴클레오티드 합성과 상용성인 디올을 형성함으로써 용이하게 수득한다.

전형적인 DMT 및 포스포아미다이트 신장 화학 반응은 염기에 불안정한 TFA 보호기와 함께 이롭게 수행한다.

화학적으로 보호된 디올은 새로운 생성물로서, 본 발명의 범주에 들어간다.

본 발명은 특히

ㆍP(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R¹-(X-R² _n)_n1-XR³-O-Prot(이때, R¹, R², R³, n 및 n1은 앞서 정의한 바와 같고, X는 적절하게 보호된 NH 또는 NC(NH₂)₂이고, R⁹는 -CH₂CH₂CN 또는 저급 알킬이고, R¹⁰은 저급 알킬이거나, 또는 -N(R¹⁰)₂는 피롤리디노, 피페리디노 또는 모폴리노 기이고, Prot는 DMT, MMT와 같은, 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 보호기임);

ㆍP(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R⁷-(aa)_n2-R⁸-O-Prot(이때, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, n2, 및 Prot는 앞서 정의한 바와 같고, (aa)_n2는 적절하게 보호된 양이온성 측쇄를 가지는 천연 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 오르니틴, 히스티딘, 디아미노프로피온산을 포함하는 펩티드이고, n2는 2∼20임)

를 포함하는 군으로부터 선택된 중간체에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 다른 특징 및 이점을 제시한다. 특히, 스퍼민(S)을 가진 데카머(10량체) 올리고뉴클레오티드 서열(A₁₀)(이하, A₁₀S_n로 표시)의 합성을 실례를 들어 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다. 실시예에서는 도 1∼14를 참조하며, 도 1∼14는 각각 이하를 나타낸다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 역상 칼럼 상에서의 양이온성 올리고뉴클레오티드 N₁₀S_n(n=1∼2)의 HPLC 분석이고,

도 2는 음이온 교환 칼럼 상에서의 정제한 올리고뉴클레오티드 N₁₀S_n(n=1∼6)의 HPLC 분석이고,

도 3은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 N₁₀S_n(n=1∼6) 전기이동도의 분석이고,

도 4는 다양한 온도에서의 N₁₀ㆍC₁₀과 N₁₀의 자발적 교환을 도시하고,

도 5는 폴리아미드 겔 전기영동에 의해 확인되는 N₁₀과 N₁₀S_n 사이의 가닥 교환을 도시하고,

도 6은 N₁₀S_nㆍC₁₀ 이중체(duplex)의 융점(이때 C는 N에 상보적인 뉴클레오티드임)을 도시하고,

도 7은 N₁₀S_n(n=0∼6)과 ^5'GTGGCATCGC^3', 및 N₁₀S_n(n=0∼6)과 ^5'GTGGCGTCGC^3'에 의해 형성된 이중체의 융점의 비교 결과이고,

도 8은 정제한 N₁₀S_n(n=1∼6) 올리고뉴클레오티드의 ES-MS 분석이고,

도 9는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 N₁₂S₁₁F(도 9A) 및 N₁₂S₂F(도 9B)의 HPLC 결과이고,

도 10은 N₁₂S₂F(도 10A) 및 N₁₂S₁₁F(도 10B)의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이고,

도 11은 각각 N₁₄S₄F(도 11A) 및 N₂₀S₅F(도 11B)의 HPLC 결과이고,

도 12는 N₁₄S₄F(도 12A) 및 N₂₀S₅F(도 12B)의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이고,

도 13은 N₁₄S_nF(도 13A) 및 N₂₀S_nF(도 13B)에 의한 pGL2 및 pGL3 플라스미드의 가닥 침입을 도시하고,

도 14A 및 14B는 HeLa 세포로의 양이온성 올리고뉴클레오티드 F-S₁₈N₁₉의 침투를 도시한다.

실시예 1 : 포스포아미다이트 스퍼 민 신톤의 합성

스퍼민 계류(tethered) 포스포아미다이트 1을 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 스퍼민으로부터 합성하였다:

(Mes = 2,4,6-트리메틸페닐; TBDMS = t-부틸디메틸실릴; TFA = CF₃CO-; DMT = 4,4'-디메톡시트리틸)

스퍼민으로부터 제조한 테트라키스(메시틸설포닐)스퍼민(2)을 화합물(3)으로 비스-알킬화하였다. 산성 조건에서 화합물(3)의 완전한 탈보호 후에, 미정제 비스(C4-OH)스퍼민 테트라히드로브로마이드(4)를 피리딘 중 무수 트리플루오로아세트산으로 완전히 보호하고, 그 다음 화합물(5)의 2개 말단 에스테르기를 중성 조건에서 디올(6)로 가수분해하였다. 1 몰 당량의 DMTCl 반응물을 사용한 통계적인 방법으로 화합물(5)의 모노 트리틸화를 수행하여 43% 수율로 화합물(7)을 수득하였다. 미반응 디올(6) 및 비스-트리틸 화합물(8)을 회수하고, 약산성 조건(디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산)에서 재평형화하여 화합물(7)을 수득하였다. 화합물(7)을 포스피틸화하여 목적하는 포스포아미다이트(1)을 수득하였다.

N¹,N⁴,N⁹,N¹²-테트라키스(메시틸설포닐)스퍼민(2): 이 화합물을 문헌[Bergeron et al. J. Med. Chem. 2001, 44, 232-244]에 따라 제조하였다.

N¹,N¹²-비스[4-(t-부틸디메틸실릴옥시)부틸]-N¹,N⁴,N⁹,N¹²-테트라키스(메시틸설포닐)-스퍼민(3): 0℃에서 N₂ 하에 교반하면서 수소화나트륨(60%, 1.0 g, 25 mmol)을 일부분씩 DMF(20 ㎖) 중 화합물(2)(9.31 g, 10.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분간 교반 후, t-부틸(4-요오도부톡시)디메틸실란(7.86 g, 25 mmol)을 한꺼번에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, H₂O-CH₂Cl₂(100 ㎖/100 ㎖) 사이에서 분배하였다. 유기층을 분리하고, 수층을 CH₂Cl₂(50 ㎖)로 3차례 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO₃(1 M) 용액으로 세척한 후, MgSO₄ 상에서 건조하였다. 증발 후, 페이스트상 잔여물을 1:4의 AcOEt:시클로헥산을 용리액으로 사용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물(3)을 함유하는 분획을 증발시켜 페이스트상 오일을 얻고, 이것을 차가운 펜탄으로 추가 세척하여 빠르게 이동하는 불순물을 제거한 다음, 진공 펌핑하여 9.97 g(76%)의 화합물(3)을 오일로서 수득하였다: TLC (AcOEt/시클로헥산 1:4): R_f = 0.28. - IR(KRS-5): 2937, 1604, 1471, 1320, 1151, 1101, 838, 777, 657, 578 ㎝^-1. - ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = -0.01 (s, 12 H), 0.85 (s, 18 H), 1.20-1.45 (m, 12 H), 1.62 (m, 4 H), 2.28 (s, 6 H), 2.29 (s, 6 H), 2.53 (s, 12 H), 2.54 (s, 12 H), 2.90-3.10 (m, 16 H), 3.42 (t, J= 6.1 Hz, 4 H), 6.91 (s, 4 H), 6.92 (s, 4 H). - ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ = 4.7, 18.9, 21.6, 23.4, 23.5, 24.1, 24.9, 25.7, 26.6, 30.4, 43.5, 43.6, 45.6, 45.7, 62.9, 132.59, 132.64, 133.8, 140.7, 143.0, 143.1 - MS-ESI (MeOH): m/z = 1325.85 [M + Na]⁺, 1303.83 [M + H]⁺. - C₆₆H₁₁₀N₄O₁₀S₄Si₂ (Mw = 1304.03) 계산치 C 60.79, H 8.50, N 4.30, S 9.84; 실측치 C 60.74, H 8.55, N 4.21, S 9.63.

N¹,N¹²-비스(4-히드록시부틸)스퍼민 테트라히드로브로마이드(4): CH₂Cl₂(80 ㎖) 중 화합물(3)(9.87 g, 7.57 mmol) 및 페놀(29.0 g, 0.31 mol, 40 당량)의 용액에 아세트산 중 브롬화수소(33 중량% 용액, 80 ㎖, 1.4 mol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 얼음 배스로 냉각 시, 교반하면서 냉수(100 ㎖)를 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 물(20 ㎖)로 3차례 추출하였다. 합한 수층을 CH₂Cl₂(30 ㎖)로 5차례 세척하고, 증발시켜 건조하였다. 생성된 함습 고체 잔여물을 에테르에 현탁시키고, 스파출라로 가루화하고, 에테르 상청액을 버렸다. 이러한 작업을 고체 현탁물을 얻을 때까지 반복하였다(5차례). 증발 및 진공 건조 후, 고체로서 화합물(4)를 얻었다(5.32 g). 이 미정제 물질을 추가 정제 없이 사용하였 다: ¹H NMR (300 MHz, D₂O): δ = 1.75-2.10 (m, 12 H), 2.27 (m, 4 H), 3.15-3.35 (m, 16 H), 3.76 (t, J = 12.2 Hz, 4 H). - ¹³C NMR (75 MHz, D₂O): δ = 22.9, 23.2, 23.4, 29.0, 45.0, 45.2, 47.7, 48.3, 61.5. - MS-ESI (MeOH): m/z = 347.39 [M + H]⁺.

N¹,N¹²-비스(4-(트리플루오로아세톡시)부틸)-N¹,N⁴,N⁹,N¹²-테트라키스(트리플루오로아세틸)스퍼민(5)(TFA₂O/NEt₃를 사용하여 화합물(4)로부터): CH₂Cl₂(50 ㎖) 중 화합물(4)(5.3 g, 7.6 mmol)의 현탁액에, 트리에틸아민(11.5 g, 114 mmol, 15 당량)을 한꺼번에 첨가하였다. 이 혼합물을 얼음 배스에서 냉각시키고, N₂ 하에 교반하면서 무수 트리플루오로아세트산(19.1 g, 90.9 mmol, 12 당량)을 적가하였다. 혼합물을 3.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 얼음 배스에서 냉각 후, 생성된 용액을 냉수(20 ㎖)로 3차례 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조한 후 증발시켜 이 반응의 부산물, 즉 (TFA)₂C=CH-NEt₂를 함유하는 유성 잔여물(11.7 g)을 수득하였다(참고문헌: Schreber, S. L., Tetrahedron Lett. 1980, 21, 1027). 이 잔여물을 2회의 연속적인 플래시 크로마토그래피에 의해 제거하여(용리액 1:1∼60:40 AcOEt:시클로헥산 및 그 다음 5∼10% Et₂O/CH₂Cl₂), 오일로서 화합물(5)(5.59 g, 81%)를 수득하였다: TLC (AcOEt/시클로헥산 1:1): R_f = 0.25. - IR (KRS-5): 2955, 1789, 1690, 1467, 1352, 1197, 1147, 759, 731, 692 cm^-1. - ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 1.52-2.06 (m, 16 H), 3.33-3.49 (m, 16 H), 3.38 (m, 4 H). - ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): 이 스펙트럼은 4개의 아미드 기의 회전 이성질 현상으로 인해 복잡하다. 단지 고강도의 공명 신호만을 하기와 같이 기재한다: δ = 23.3, 23.9, 24.1, 24.8, 25.3, 25.6, 26.0, 26.55, 26.61, 44.4, 44.8, 45.7, 46.1, 46.4, 47.3, 48.0, 56.6, 67.3, 67.5, 116.6 (q, J = 288 Hz), 156.9, 157.4, 157.8, 158.6.

N¹,N¹²-비스(4-히드록시부틸)-N¹,N⁴,N⁹,N¹²-테트라키스(트리플루오로아세틸)스퍼민(6): MeOH(50 ㎖) 중 5(5.39 g, 5.84 mmol)의 용액에, NaHCO₃(0.1 g, 고체)를 한꺼번에 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 증발 후, 유성 잔여물을 CH₂Cl₂에 용해시키고(약간의 섬유상 NaHCO₃의 현탁액을 수득), 5∼10% MeOH/CH₂Cl₂로 용리시키는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 3.61 g(85%)의 화합물(6)을 오일로서 수득하였다: TLC (MeOH 5%/CH₂Cl₂): R_f = 0.14. (MeOH 10%/CH₂Cl₂): R_f = 0.45. - ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 1.51-2.02 (m, 18 H), 3.33-3.51 (m, 16 H), 3.68 (m, 4 H). - MS-ESI (MeOH): m/z = 753.33 [M + Na]⁺. - C₂₆H₃₈F₁₂N₄O₆ㆍH₂O (Mw = 748.60) 계산치 C 41.72, H 5.39, N 7.48, F 30.45; 실측치 C 41.97, H 5.26, N 7.37, F 30.14.

화합물(4)로부터 화합물(6)의 제조(TFA₂O/피리딘, 그 후 NaHCO₃ 사용): 얼음 배스에서 냉각하고 N₂ 하에 교반하면서 CH₂Cl₂(100 ㎖) 및 피리딘(44 ㎖, 0.54 mol) 중 화합물(4)(15.3 g, 22.8 mmol)의 현탁액에 무수 트리플루오로아세트산(46 ㎖, 0.33 mol)을 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 얼음 배스에서 냉각하면서 냉수(100 ㎖)를 첨가하여 과잉의 무수 트리플루오로아세트산을 분해시킨 후, 생성된 용액을 CH₂Cl₂로 추출하였다(4차례 100 ㎖ + 50 ㎖ + 25 ㎖ x 2). 합한 추출액을 냉수로 세척하고(50 ㎖ x 3), MgSO₄ 상에서 건조하고, 증발시켜 미정제 화합물(5)(19.4 g, 92%)를 오일로서 수득하였다. 이 오일을 MeOH(100 ㎖)에 용해시켰다. NaHCO₃(고체, 0.1 g)를 넣고, 이 현탁액을 밤새 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 그 잔여물을 5∼7% MeOH:CH₂Cl₂를 용리액으로서 사용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 10.1 g(61 %)의 화합물(6)을 오일로서 수득하였다.

N¹-[4-(디메톡시트리틸옥시)부틸]-N¹²-(4-히드록시부틸)-N¹,N⁴,N⁹,N¹²-테트라키스(트리플루오로아세틸)스퍼민(7): 피리딘(3 ㎖) 중 화합물(6)(1.46 g, 2.00 mmol)의 용액에, 1 ㎖의 피리딘으로 세정하면서 DMTCl(757 mg, 2.23 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 N₂ 하에 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 톨루엔과 동시증발시켜 피리딘을 반복해서 제거하였다. 잔여물을 2회의 연속적인 크로마토그래피로 정제하여(용리액 2∼5% MeOH/CH₂Cl₂ → 10-15% 아세톤/CH₂Cl₂), 발포체로서 화합 물(7)(879 mg, 43%) 및 비스-DMT 유도체(8)(648 mg, 24%)을 수득하였다. 출발 물질인 디올(6)을 또한 회수하였다(350 mg, 24%). 화합물(7)의 데이터: TLC (아세톤/CH₂Cl₂ 1:9): R_f = 0.20. - ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 1.51-2.03 (m, 17 H), 3.11 (m, 2 H), 3.32-3.51 (m, 16 H), 3.71 (m, 2 H), 3.81 (s, 6H), 6.84 (m, 4 H), 7.19-7.46 (m, 9 H). - MS-ESI (MeOH): m/z = 1055.52 [M + Na]⁺. - C₄₇H₅₆F₁₂N₄O₈ (Mw = 1032.95) 계산치 C 54.65, H 5.46, N 5.42, F 22.07; 실측치 C 54.46, H 5.58, N 5.37, F 21.63.

디올(6) 및 비스-DMT 유도체(8)으로부터 화합물(7): CH₂Cl₂ 중 화합물(6)(1.4 g, 1.9 mmol) 및 화합물(8)(2.5 g, 1.9 mmol)의 용액에, 트리플루오로아세트산(50 ㎕, 0.6 mmol)을 넣고 30분간 실온에서 교반하였다. 이 용액을 1 M Na₂CO₃ 용액으로 3차례 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조하고 증발시켰다. 5% AcOEt/CH₂Cl₂(750 ㎖), 33% AcOEt/CH₂Cl₂(500 ㎖), 7% MeOH/CH₂Cl₂(500 ㎖) 및 10% MeOH/CH₂Cl₂(500 ㎖)를 순차적으로 사용한 플래시 크로마토그래피(칼럼 직경: 50 mm, SiO₂ 높이: 15 cm)에 의해 잔여물을 분리하여 화합물(8)(1.1 g), 화합물(7)(1.2 g) 및 화합물(6)(1.3 g)을 수득하였다.

스퍼민 계류 포스포아미다이트(1): CH₂Cl₂(4 ㎖) 중 화합물(7)(844 mg, 817 μmol) 및 트리에틸아민(230 ㎕, 1.65 mmol, 2 당량)의 용액에, 2-시아노에틸- (N,N-디이소프로필아미노)클로로포스파이트(205 ㎕, 0.92 mmol, 1.1 당량)를 넣고, 이 혼합물을 N₂ 하에 실온에서 40분간 교반하였다. 이 반응 혼합물을 CH₂Cl₂:시클로헥산(1:2) 중 1% NEt₃(125 ㎖) 및 CH₂Cl₂:시클로헥산(1:1) 중1% NEt₃100 ㎖를 사용하여 NEt₃(CH₂Cl₂:시클로헥산(1:2) 중 1% NEt₃; 400 ㎖)로 포화시킨 SiO₂ 칼럼(직경: 20 mm, 높이: 15 cm)에 통과시켜 화합물(1)(735 mg, 73%)을 오일로서 수득하였다: ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 1.13-1.35 (m, 12 H), 1.51-2.06 (m, 16 H), 2.66 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.11 (m, 2 H), 3.32-3.98 (m, 20 H), 3.81 (s, 6H), 6.84 (m, 4 H), 7.15-7.51 (m, 9 H). - ³¹P NMR (81 MHz, CDCl₃): 148.06, 148.13, 148.19, 148.3 (아미드 회전 이성질 현상으로 인한 분열).

실시예 2: 하기 화학식을 가지는 데카머 올리고뉴클레오티드의 합성, 정제 및 특성화

이하, 상기 올리고뉴클레오티드를 N₁₀S_n(N₁₀은 올리고뉴클레오티드 부분이고; S는 스퍼민 잔기이고, n은 1∼6임)으로 표시한다.

자동화 합성: 부착되는 스퍼민 잔기 S의 수를 증가시키면서 동일한 서열 N₁₀ = ^3'CACCGTAGCG^5'의일련의 데카머 올리고뉴클레오티드를, 하기의 반응식에 따라 Expedite DNA 합성기에서 표준 고상 시아노에틸 포스포아미다이트 화학법을 이용하여 합성하였다:

마지막 N 부분은 전통적인 올리고뉴클레오티드 합성에 따라 뉴클레오시드가 된다.

자동화 DNA 합성에 사용한 시약은 글렌 리서치(유로젠텍)로부터 구입하였다.

자동화 합성 시, 표준 1 μmol의 커플링 사이클을 이용하였으나, 단, 스퍼민 포스포아미다이트(1)의 커플링의 경우, 커플링 시간을 연장(15분)하여 약간 더 농축된 포스포아미다이트 용액(1 ㎖ 아세토니트릴 중 90 mg 아미다이트)을 사용하여 수행하였다.

트리틸 분획을 모아서, 희석하고 분광 광도계에서 분석하여 단계적 커플링 수율을 측정하였다.

4개의 천연 뉴클레오티드의 커플링 수율은 97%를 넘는 한편, 스퍼민 포스포아미다이트 커플링의 수율은 상기 커플링 조건에서 90∼96%였다.

모든 경우에, 정제 및 확인을 목적으로 올리고머 상에 5'-말단 DMT 기를 비절단 상태로 유지한 채로 DMT-ON(ON=올리고뉴클레오티드) 모드를 이용하였다.

합성 후 처리: 자동화 합성 후, 표준 조건을 이용하여 고체 지지체로부터의 절단 및 올리고머의 완전한 탈보호를 행하였다(절단을 위해 실온에서 90분간 진한 암모니아수로 처리한 후, 탈보호를 위해 밤새 55℃에서 처리).

정제: 우선, 20 mM 암모늄 아세테이트 용액(pH 7) 중 아세토니트릴(20분간 5∼35%)의 직선 구배를 이용한 역상 nucleosil C-18 칼럼(Macherey-Nagel 10 x 250 mm)에서 표준 HPLC법으로 DMT-on 상태로 2개의 음이온성 올리고뉴클레오티드 N₁₀S₁ 및 N₁₀S₂를 최초로 정제하였다. 그 다음, 정제한 올리고뉴클레오티드를 실온에서 20분간 AcOH/H₂O = 4/1(500 ㎖)로 처리하여 탈트리틸화하였다. 물(5 ㎖)로 희석 후, DMT-OH를 에테르 추출에 의해 제거하고(3 x 2 ㎖), 수층을 농축시켜 올리고머를 수득하였다.

20 mM 암모늄 아세테이트 용액(pH 7) 중 아세토니트릴(20분간 5∼35%)의 직선 구배를 이용한 역상 nucleosil C-18 칼럼(Macherey-Nagel 4.6 x 250 mm) 상에서 의 올리고뉴클레오티드 N₁₀S₁ 및 N₁₀S₂의 HPLC 분석 결과를 도 1에 나타낸다: a) N₁₀S₁, 미정제, DMT-ON; b) N₁₀S₁, 정제; c) N₁₀S₂, 미정제, DMT-ON; d) N₁₀S₂, 정제. ^*벤즈아미드; ^**절두된 서열.

중성 올리고머 N₁₀S₃ 및 양이온성 올리고머 N₁₀S₄, N_1OS₅ 및 N₁₀S₆(DMT 기 포함 또는 불포함)은, 아세토니트릴/진한 암모니아 수용액/물(20:4:80)을 사용하여 행한 최종 올리고뉴클레오티드 용리를 제외하고는, 제조자가 제공한 설명서에 따라 Poly-Pak II^TM(글렌 리서치/유로젠텍) 칼럼을 사용하여 정제하였다. 올리고뉴클레오티드를 함유하는 분획은 TLC 플레이트를 사용하여 드러낼 수 있었다. 분획을 모은 후, 동결 건조에 의해 용매를 제거하였다. 이렇게 얻은 올리고머는 일반적으로 벤즈아미드로 오염되었다. 묽은 암모니아 수용액(50 mM)에 용해시킨 후 에테르로 추출하여(3차례) 벤즈아미드를 제거하였다. 정제한 올리고뉴클레오티드를 묽은 암모니아 수용액(50 mM)에 용해시키고, 하기 흡광 계수(260 nm, mol^-1dm³cm^-1)를 이용하여 이들의 농도를 측정하였다:

ε = (15.4N_A + 11.5N_G + 7.4N_C + 8.7N_T ) x 0.9 x 10³.

정제한 올리고뉴클레오티드의 HPLC 분석 결과는 도 2에 나타낸다: NaCl(10분간 100∼350 mM)/NaOH 25 mM(pH 12.4)의 직선 구배를 사용한 음이온 교환 칼 럼(Dionex PA-100, 9 x 250 mm): a) N₁₀S₁, b) N₁₀S₂, c) N₁₀S₃, d) N₁₀S₄, e) N₁₀S₅, f) N₁₀S₆.

이용된 접합 화학법으로 인해, 각각의 폴리아민은 포스페이트 기에 부수되어, 순(net) 부가 양이온 전하에 기여한다. 따라서, 완전히 이온화될 때 전체 전하가 -9, -6, -3, 0, +3, +6, +9인 7개의 올리고뉴클레오티드[(N₁₀S_n)^3n-9 n=0...6]가 얻어지며, 이것은 80∼250 nM 범위의 양으로 이용 가능하다.

전기이동도:

pH 7에서 전기장 내 이들의 이동은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 조사하고, 은 거울 염색으로 확인하였다. 10 ㎕ 로딩 완충액(1O mM HEPES pH 7.4, 15O mM NaCl, 글리세롤) 중 화합물(0.5 nmol)을 비변성 폴리아크릴아미드 겔(TAE 중 15%, pH 7)에 로딩하였다. 전기영동은 4℃에서 17시간 동안 5 V/cm로 하였다. 은 염색은 문헌[Rabilloud et al, Electrophoresis, 1987,9, 288-291]에 따라 수행하였다. 이 결과들을 도 3에서 나타내고 있다. 스퍼민이 없는 올리고뉴클레오티드 N₁₀(1 레인)은 애노드를 향해 빠르게 이동하였고, 폴리아민 함유 올리고뉴클레오티드가 확인되는 조건에서 단지 희미한 음 염색을 나타내었다.

N ₁₀ 과 N ₁₀ ㆍ C ₁₀ 의 자발적 교환

올리고뉴클레오티드 C₁₀(이때, C는 N에 상보적인 뉴클레오티드임)(50 pmol 또는 500 pmol)을 형광성 N₁₀ㆍC₁₀ ^* 이중체 용액(HEPES 1O mM 중 50 pmol, pH 7.4, NaCl 15O mM)에 첨가하였다. 혼합물을 37℃, 2O℃ 또는 10℃에서 4시간 동안 항온처리하고, 비변성 폴리아크릴아미드 겔(TAE 중 15%, pH 7)에 로딩하였다. 4℃에서 17 시간 동안 5 V/cm로 전기영동을 수행하였다. Typhoon 8600 Imager를 사용하여 겔을 스캐닝함으로써 C₁₀ ^* 형광을 검출하였다. 도 4에 나타낸 결과와 같이, N₁₀과N₁₀ㆍC₁₀의 자발적 교환은 10℃에서 유의적이지 않다.

N ₁₀ 과 N ₁₀ ㆍ S _n 사이의 가닥 교환

천연 이중체 N₁₀ㆍC₁₀을 향한 N₁₀S_n의 가닥 치환능을 생리적 염 조건에서 테스트하였다.

스퍼민 접합체 N₁₀S_n(50 또는 500 pmol)을 형광성 N₁₀ㆍC₁₀ ^* 이중체 용액(10 mM HEPES 중 50 pmol, pH 7.4, 15O mM NaCl)에 첨가하였다. 혼합물을 10℃에서 4시간 동안 항온처리하고, 비변성 폴리아크릴아미드 겔(TAE 중 15%, pH 7) 상에 로딩하였다. 4℃에서 17 시간 동안 5 V/cm로 전기영동을 수행하였다. Typhoon 8600 Imager를 사용하여 겔을 스캐닝함으로써 형광을 검출하였다.

스퍼민 접합은 도 5에 나타낸 바와 같이 가닥 교환 반응에 대해 현저한 효과를 보였다. 경쟁 N₁₀S_n의 스퍼민 잔기 수가 증가함에 따라 더 천천히 움직이고 덜 음이온성인 N₁₀S_nㆍC₁₀ ^* 복합체 쪽으로 향하면서 N₁₀ㆍC₁₀ ^*에 상응하는 밴드는 더 약해졌다. 이 효과는 N₁₀S₃, 즉, 더 이상 형식 음전하를 보유하지 않는 접합체에 대하여 특히 두드러진다. 실제로, 스퍼민은 소홈에 NH₂ ⁺ 두 자리 수소 결합의 가닥간 네트워크를 형성하여 이중체 DNA 구조를 절단함으로써, N₁₀에 비해 N₁₀S_n 결합을 선호한다. 그러나, 미리 형성된 (N₁₀S_n)^3n-9/(N₁₀ㆍC₁₀)^18- 정전기적 복합체에서 가닥 교환이 발생할 때 부가적인선호되는 역학 인자가 작용할 수 있고, 이는 n>3인 경우일 수 있다.

N ₁₀ S _n ㆍ C ₁₀ 이중체의 융점

이중 가닥 핵산의 안정성을 이들의 융점, 즉 상보적인 가닥이 협조적으로 분리되는 온도를 측정함으로써 비교하였다. N₁₀S_nㆍC₁₀ 용액의 온도 T에 대한 흡광도(O.D.)는 260 nm에서 기록하였다.

융점 T_m은 HEPES 10 mM pH 7.4(검정선, 마름모꼴) 및 HEPES 10 mM pH 7.4 + 150 mM NaCl(회색선, 원형)에서 측정하였다. 모든 이중체의 융해 프로파일(1 ㎖ 완충액 중 3.75 nmol)은 시료를 점차 가열하면서(1℃/분) 260 nm에서 그들의 흡광도를 기록함으로써 온도 조절 장치가 구비된 CARY 4000 분광 광도계를 이용하여 얻었다. 이중체 융해는 고색소성 이동을 유발하고, T_m은 제1 도함수 곡선 dO.D./dT = f(T)가 그것의 최고점에 도달할 때의 온도이다. 이 결과들은 도 5에 나타낸다.

천연 이중체는 10 mM HEPES(pH 7.4) 중에서 T_m = 30℃에서 융해했다(도 5). 스퍼민의 수를 증가시킨 접합은 주목할만한 T_m 증가를 유도했다. N₁₀S₆ㆍC₁₀은 천연 이중체보다 45℃ 정도 더 높은 T_m = 75.2℃에서 융해했다. T_m = f(n) 곡선은 중성 N₁₀S₃ 올리고뉴클레오티드에 대한 굴곡을 가진 S자 형태를 나타내었다.

융점은 생리적 염 조건에서도 기록하였다. T_m = f(n) 곡선은 훨씬 가라앉은 것으로 나타났고, N₁₀S₃에 대한 이전 곡선을 두드러지게 교차하였다. 따라서 n<3인 경우, N₁₀S_n 및 C₁₀ 올리고뉴클레오티드 둘 다 음이온성이고, 이중체에서 서로 반발하며; 용액 염 농도를 증가시키면 반발력을 은폐하여 T_m을 증가시킨다. n>3인 경우, N₁₀S_n은 양이온성이 되고, C₁₀을 끌어당기며; 이때 염 유도 정전기적 은폐는 안정성을 감소시킨다.

중성 N₁₀S₃에 있어서, 이중체 안정성은 염 농도와 관계가 없다.

N ₁₀ S _n (n=0∼6)과 ^5' GTGGC A TCGC ^3' 및 N ₁₀ S _n (n=0∼6)과 ^5' GTGGC G TCGC ^3' 에 의해 형성된 이중체의 융점 비교

올리고뉴클레오티드-스퍼민 접합체의 단일 염기쌍 부정합 구별을 테스트하였다. C₁₀ = ^5'GTGGCATCGC^3'의 서열 환경 내에서, 문헌 데이터는 중심에 위치한 A에서 G 로의 전환을 가장 엄격한 테스트로 제시하였다.

융점 T_m을 HEPES 10 mM(pH 7.4) + NaCl 150 mM에서 측정하였다. 시료를 점차 가열하면서(1℃/분) 260 nm에서 그들의 흡광도를 기록함으로써 온도 조절 장치가 구비된 CARY 4000 분광 광도계를 이용하여 모든 이중체의 융해 프로파일(1 ㎖ 완충액 중 3.75 nmol)을 얻었다. T_m은 1차 도함수 곡선 dO.D./dT = f(T)가 그것의 최고점에 도달하는 온도이다. 이 결과들은 도 7에 나타낸다(마름모꼴은 ^5'GTGGCATCGC^3'에 해당하고, 삼각형은 ^5'GTGGCGTCGC^3'에 해당함).

150 mM NaCl 중 천연 N₁₀ㆍC₁₀ 이중체의 전이 온도는 부정합이 존재할 때 50.6℃에서 42.9℃로 떨어지며, 즉 DT_m이 7.7℃이다. 원칙적으로, 비특이적인 말단 접한 정전기력에 기인한 안정성 증가는 △△G로 표현되는 염기쌍 특이성을 손상시키지 않아야 한다. 상보성의 부정합 표적 올리고뉴클레오티드가 평균 △T_m이 7.9℃인 준평행(quasi-parallel) T_m = f(n) 곡선을 나타내었기 때문에, 이것이 실제로 관찰되는 것이다.

정제한 N ₁₀ S _n 올리고뉴클레오티드의 ES - MS 분석

올리고뉴클레오티드를 최종 농도 5×10^-5 M로 1% 트리에틸아민을 함유하는 50%(v/v) 아세토니트릴 수용액에 용해시켰다. 100 ㎖ 분취량을 Biosystems Mariner 5155 질량 분광계의 이온 공급원에 5 ㎖/분의 유속으로 도입하였다. 이 결과들은 도 8에 나타낸다(인세트: 디콘볼류션 스펙트럼): a) N₁₀S₁, b) N₁₀S₂, c) N₁₀S₃, d) N₁₀S₄, e) N₁₀S₅, f) N₁₀S₆. 중성 및 양이온성 올리고머 N₁₀S₃ _-6의 이온화는 더 어려워졌고, 수용할만한 신호 대 노이즈 비율을 얻기 위해 몇몇 스펙트럼을 축적하는 것이 필요했다.

실시예 3 : 하기의 식을 가지는 12량체 티오포스페이트 올리고뉴클레오티드의 합성, 정제 및 특성화

이하, 상기 올리고뉴클레오티드를 N₁₂S_nF(N은 12량체 올리고뉴클레오티드 티오포스포네이트 부분이고; S는 스퍼민 잔기이고, n은 2 또는 11이고; F는 티민에 접합된 플루오레세인임)로 표시한다.

자동화 합성: 2개 또는 11개의 스퍼민 잔기 S가 부착된 서열 N₁₂ = ^3'GCGACTCATGAA^5'의 12량체 티오포스페이트 올리고뉴클레오티드를 Expedite DNA 합성기에서 고체상 시아노에틸 포스포아미다이트 화학을 이용하여 합성하였다. 후처리 동안 올리고머 절단을 피하기 위해, Ultramild CE 포스포아미다이트 및 ultramild 지지체(글렌 리서치/유로젠텍)를 사용하였다. 12량체 올리고뉴클레오티드 부분에서 포스포로티오에이트 결합을 발생시키기 위해 표준 황화 시약(글렌 리서치/유로젠텍)을 사용하였다. 5'-말단 표지화를 위해 플루오레세인-dT 포스포아미다이트(글렌 리서치/유로젠텍)를 사용하였다. 실시예 2에서 기술한 커플링 프로토콜을 사용하여 스퍼민 포스포아미다이트 커플링을 수행하였다.

트리틸 분획을 수집하여, 희석하고, 분광 광도계로 분석하여 단계적 커플링 수율을 측정하였다.

모든 경우에, 정제 및 확인을 목적으로 올리고머에서 5'-말단 DMT 기가 절단되지 않게 유지하면서 DMT-ON 모드를 이용하였다.

합성 후 처리: 자동화 합성 후, 고체 지지체로부터의 절단 및 올리고머의 완전한 탈보호는 실온에서 밤새 진한 암모니아수로 처리함으로써 수행하였다.

정제: DMT-ON 화합물 N₁₂S₂F 및 N₁₂S₁₁F를 제조사의 설명서에 따라 Poly-Pak II^TM 칼럼(글렌 리서치/유로젠텍)을 이용하여 정제하였다.

정제한 올리고뉴클레오티드 N₁₂S_nF(n = 2, 11)를 NaCl 구배(20분에 0.75∼2.5 M)를 이용하여 염기 수용액 조건(100 mM 암모니아, pH 11)으로 음이온 교환 칼럼(SAX1000-8)에서 분석하였다. HPLC 결과를 도 9에 나타낸다(A: N₁₂S₁₁F, B: N₁₂S₂F).

정제한 올리고뉴클레오티드의 MALDI - TOF MS 분석

올리고뉴클레오티드를 탈이온수 500 ㎕에 용해시켰다. 시료 및 HPA 메트릭스를 플레이트 상에서 함께 혼합하였다. 결정화한 후, 시료를 BRUKER Ultraflex MS 장치로 분석하였다. 결과들을 도 10A: N₁₂S₂F 계산치 5460, 실측치 5459(상부) 및 도 10B: N₁₂S₁₁F 계산치: 9135 실측치: 9125(하부)에 나타낸다.

실시예 4: 14량체 및 20량체 형광성 올리고뉴클레오티드에 의한 플라스미드 DNA 가닥 침입

이하, 위에 나타낸 화합물을 N₁₄S_nF(N은 올리고뉴클레오티드 부분이고; S는 n이 2∼4인 스퍼민 잔기이고; F는 플루오레세인 잔기임) 및 N₂₀S_nF(N은 올리고뉴클레오티드 부분이고; S는 n이 3∼5인 스퍼민 잔기이고; F는 플루오레세인 잔기임)로 표시한다.

이들 형광성 올리고뉴클레오티드는 실시예 2에서 기술한 방법에 따라 합성하였다. 5'-말단 표지화를 위해 5'-플루오레세인 포스포아미다이트(글렌 리서치/유로젠텍)를 사용하였다. 가장 많이 치환된 N₁₄S₄F 및 N₂₀S₅F 화합물에 대한 분석 HPLC 결과 및 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 각각 순도 및 구조(N₁₄S₄F 계산치 6470, 실측치 6478; N₂₀S₅F 계산치 8813, 실측치 8815)의 증거로서 도 11 및 12에 나타낸다.

N₁₄S_nF 및 N₂₀S_nF의 올리고뉴클레오티드 서열을 pGL3 대조구 플라스미드(프로 메가)의 루시퍼라제 유전자 서열 내에서 선택했다. 가닥 침입의 서열 특이성을 평가하기 위해, pGL2 대조구 플라스미드(프로메가)를 사용하였다. GL2 루시퍼라제 서열은 GL3과 95% 동일하고, N₁₄S_nF 및 N₂₀S_nF에 의해 표적화되는 서열은 각각 하나 및 둘의 부정합을 포함한다.

pGL2 플라스미드가 아닌 pGL3 플라스미드에 가닥 침입하는 N₁₄S_nF 및 N₂₀S_nF의 능력을 생리적 염 및 온도 조건에서 테스트하였다.

형광성 접합체 N₁₄S_nF 및 N₂₀S_nF(8.65 pmol)를 플라스미드 용액(1.5 μg, 10 mM HEPES 중 0.43 pmol(pH 7.4), 150 mM NaCl)에 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 항온처리하고, 아가로스 겔(TAE 중 1.3%, pH 7.4) 상에 로딩하였다. 실온에서 45분간 전기영동을 수행한 후, Typhoon 8600 Imager를 이용하여 겔을 스캐닝함으로써 플루오레세인 녹색 방출을 검출하였다. 에티디움 브로마이드 용액에서 15분간 항온처리한 후, 겔의 적색 플루오레세인 사진을 UV 투영기에서 찍었다. 이 결과들은 도 13에 나타낸다.

적색 및 녹색 형광은 각각 이중 가닥 플라스미드 DNA 및 형광 올리고뉴클레오티드의 증거이다. 따라서, pGL2가 아닌 pGL3에 의한 그들의 공존은 가닥 침입의 증거이다. 화합물 N₁₄S₃F 및 N_2OS_nF는 pGL2가 아닌 pGL3와 함께 항온처리할 때 플라스미드와 관련한 옅은 녹색 형광 밴드를 나타내었다.

실시예 5: 양이온성 올리고뉴클레오티드의 세포 내로의 침투

10%(v/v) 우태 혈청 함유 MEM 배지에서 배양한 Hela 세포를, 실험 1일 전에 4웰 챔버의 보로실리케이트 Lab-Tek 디쉬로 웰당 50∼60 x 10³ 세포로 분주하였다. 완전한 배지를 0.5 ㎖ 혈청 무함유 MEM 배지로 대체하였다. 5'-양이온성 플루오레세인 접합 올리고뉴클레오티드 F-S₁₈N₁₉(이때 N₁₉는 TCGAAGTACTCAGCGTAAG) 제형을 멸균 PBS에서 제조하였다. 그것을 세포에 첨가하여 최종 농도를 2 μM로 하였다. 4시간 후에, 배지를 1 ㎖의 새로운 혈청 함유 배지로 대체하였다. 첫번째 사진은 FITC 필터가 구비된 Zeiss axiovert 25 형광 현미경으로 찍었다(도 14A, 좌측). 모든 세포들이 형광을 띠었고, 약간의 형광이 세포내 액포에 위치하였으며, 가장 중요하게는 또한 세포질 및 핵에 전반적으로 퍼져 있었다. 24시간 후, 배지를 1 ㎖의 페놀 레드 무함유 MEM 배지로 대체하였다. 프로피디움 요오다이드(물 중 1 mM)를 첨가하여 최종 농도를 10 μM로 하였다. 10분 후, 여전히 형광을 띠는 프로피디움이 없는 건강한 다수의 세포를 보여주는 두번째 사진을 찍었다(도 14B, 우측). F-N19 올리고뉴클레오티드와 유사한 조건에서 항온처리한 대조구 세포들은 형광을 띠지 않았다.

따라서, 본 발명은, 가닥 침입 환경에서조차 상보적인 서열과 빠르고 안정한 복합체를 형성하는, 다용도의 자동화된 양이온 올리고뉴클레오티드 합성법을 제공한다. 말단 접합으로 인해, 서열 선택성이 천연 올리고뉴클레오티드만큼 높게 유지된다. 더욱이, 그들의 양이온 특성 덕분에, 세포내 전달이 양이온 운반체 분자와의 복합체 형성을 요구하지 않는다. 종합해 보면, 이들 특성들로 인해 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 접합체는 분자 생물학, 진단학뿐 아니라 치료학 분야에 있어서 올리고뉴클레오티드에 대한 대용물로서 매력이 있다.

SEQUENCE LISTING <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) POLYPLUS TRANSFECTION <120> CATIONIC OLIGONUCLEOTIDES, AUTOMATED METHODS FOR PREPARING SAME AND THEIR USES <130> CP/BB 61802-2665 <140> PCT/IB2006/004085 <141> 2006-12-14 <150> US 60/750 346 <151> 2005-12-15 <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 gtggcatcgc 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 gtggcgtcgc 10 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 caccgtagcg 10 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 gcgactcatg aa 12 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 tcgccaaggt agaa 14 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 aggtcgccaa ggtagaaggt 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 tcgaagtact cagcgtaag 19

Claims

올리고뉴클레오티드 부분 A_i 및 올리고양이온 부분 B_j를 가지고, 자동화 포스포아미다이트 화학법에 의해 합성되는, A_iB_jH 서열, 또는 ^3'A^5' _i-B_j 서열, B_j-^3'A^5' _i 서열, B_j-^3'A^5' _i-B_j 서열, ^3'A^5' _i-B_j-^3'A^5' _i 서열 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자로서,

ㆍ A_i는 i량체(i-mer) 올리고뉴클레오티드 잔기(i는 5∼50임)이고, 여기서 뉴클레오티드 A는, 핵염기(nucleobase) 또는 펜타푸라노실 기 또는 고유(native) 포스포디에스테르 결합을 가지거나, 핵염기 또는 펜타푸라노실 기 또는 포스포디에스테르 결합의 포스포로티오에이트 변형체 또는 치환체를 가지거나, 핵염기 또는 펜타푸라노실 기 또는 포스포디에스테르 결합의 2'-플루오로 변형체 또는 치환체를 가지거나, 또는 핵염기 또는 펜타푸라노실 기 또는 포스포디에스테르 결합의 2'-O-알킬 변형체 또는 치환체를 가지는 올리고뉴클레오티드이며,

ㆍ B_j는 j량체 유기 올리고양이온 부분(j는 1∼50임)이고, 여기서 B는

ㆍ -HPO₃-R¹-(X-R² _n)_n1-X-R³-O-(여기서, R¹, R² _n 및 R³은 동일하거나 상이하고 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, X는 보호된 NH 또는 NC(NH₂)₂이고, n은 1∼5이고, n1은 2∼20임),

ㆍ -HPO₃-R⁴-CH(R⁵X¹)-R⁶-O-(여기서, R⁴는 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, R⁵ 및 R⁶은 동일하거나 상이하고 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이며, X¹은 보호된 푸트레신, 스퍼미딘 또는 스퍼민 잔기임), 및

ㆍ -HPO₃-R⁷-(aa)_n2-R⁸-O-(여기서, R⁷은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, R⁸은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기, 세린 또는 아미노알코올이며, (aa)_n2는 양이온성 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 펩티드이고, n2는 2∼20임)

로 이루어진 군으로부터 선택되며,

A_i는 포스포디에스테르 결합을 통해 B_j에 연결되는 것인 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자.
제1항에 있어서, A_i 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및 잠금(LNA) 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 분자.
제2항에 있어서, A_i 또는 B_j가 마커를 추가로 포함하는 것인 분자.
제3항에 있어서, 상기 마커가 형광제인 분자.
제1항에 있어서, ^3'A^5' _i-B_j 서열을 가지는 분자.
제1항에 있어서, B_j-^3'A^5' _i 서열을 가지는 분자.
제1항에 있어서, B_j-^3'A^5' _i-B_j 서열 또는 ^3'A^5' _i-B_j-^3'A^5' _i 서열 또는 이들의 조합을 가지는 분자.
(i) 활성화 및 보호된 올리고양이온 B를 함유하는 바이알을 올리고뉴클레오티드 합성기에 충전하고, 그 후 올리고뉴클레오티드 A의 바이알을 충전하거나, 또는 올리고뉴클레오티드 A의 바이알을 올리고뉴클레오티드 합성기에 충전하고, 그 후 활성화 및 보호된 올리고양이온 B를 함유하는 바이알을 충전하는 단계,

(ii) 목적하는 길이가 얻어질 경우, 합성을 중단하는 단계,

(iii) 고체 지지체로부터 올리고머를 절단하는 단계, 및

(iv) 보호기를 제거하는 단계

를 포함하는, 포스포아미다이트 경로를 통한, 올리고뉴클레오티드 합성기에서의 단계적 합성을 이용함으로써, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자를 얻는 방법.
제8항에 있어서, 포스포아미다이트 반응물은

ㆍ P(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R¹-(X-R² _n)_n1-X-R³-O-Prot(여기서, R¹, R², R³은 동일하거나 상이하고 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, X는 보호된 NH 또는 NC(NH₂)₂이고, R⁹는 -CH₂CH₂CN, 또는 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이며, R¹⁰은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이거나, 또는 -N(R¹⁰)₂는 피롤리디노, 피페리디노 또는 모폴리노 기이고, Prot는 4,4-디메톡시트리틸 및 메틸시클로펜타디에닐 망간 트리카보닐을 포함하는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 보호기이며, n은 1∼5이고, n1은 2∼20임);

ㆍ P(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R⁴-CH(R⁵X¹)-R⁶-O-Prot(여기서, R⁴, R⁵, R⁶은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, X¹은 보호된 푸트레신, 스퍼미딘 또는 스퍼민이고, R⁹는 -CH₂CH₂CN, 또는 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이며, R¹⁰은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이고, Prot는 4,4-디메톡시트리틸 및 메틸시클로펜타디에닐 망간 트리카보닐을 포함하는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 보호기임); 및

ㆍ P(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R⁷-(aa)_n2-R⁸-O-Prot(여기서, R⁷은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, R⁸은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기, 세린 또는 아미노 알코올이며, R⁹는 -CH₂CH₂CN, 또는 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이고, R¹⁰은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이며, (aa)_n2는 아르기닌, 리신, 오르니틴, 히스티딘 및 디아미노프로피온산을 포함하는 군으로부터 선택되는 양이온 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 펩티드이고, n2는 2∼20이며, Prot는 4,4-디메톡시트리틸 및 메틸시클로펜타디에닐 망간 트리카보닐을 포함하는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 보호기임)

을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열의 단계적 합성에 이어 올리고양이온 부분의 단계적 합성을 수행하여 서열 (^3'A^5' _i-B_j)를 갖는 화합물을 얻는 것인 방법.
제8항에 있어서, 올리고양이온 부분의 단계적 합성에 이어 올리고뉴클레오티드 서열의 단계적 합성을 수행하여 서열 (B_j-^3'A^5' _i)를 갖는 화합물을 얻는 것인 방법.
제8항에 있어서, 혼합 서열의 합성을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 양쪽 말단이 캡핑된 올리고뉴클레오티드 서열(B_j-^3'A^5' _i-B_j) 또는 양이온 개재 올리고뉴클레오티드 서열(^3'A^5' _i-B_j-^3'A^5' _i)의 합성을 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 폴리아민의 아미노기를 보호하고, 이어서 α,ω-비스 히드록시알킬화를 수행하여 올리고뉴클레오티드 합성과 상용성인 디올을 형성함으로써, 활성화 및 보호된 올리고양이온 B를 얻는 것인 방법.
하기 화학식의 포스포아미다이트 반응물을 포함하는 중간체 화합물:

ㆍ P(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R¹-(X-R² _n)_n1-X-R³-O-Prot(여기서, R¹, R², R³은 동일하거나 상이하고 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, X는 보호된 NH 또는 NC(NH₂)₂이고, R⁹는 -CH₂CH₂CN, 또는 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이며, R¹⁰은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이거나, 또는 -N(R¹⁰)₂는 피롤리디노, 피페리디노 또는 모폴리노 기이고, Prot는 4,4-디메톡시트리틸 및 메틸시클로펜타디에닐 망간 트리카보닐을 포함하는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 보호기이며, n은 1∼5이고, n1은 2∼20임);

ㆍ P(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R⁴-CH(R⁵X¹)-R⁶-O-Prot(여기서, R⁴, R⁵, R⁶은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, X¹은 보호된 푸트레신, 스퍼미딘 또는 스퍼민이고, R⁹는 -CH₂CH₂CN, 또는 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이며, R¹⁰은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이고, Prot는 4,4-디메톡시트리틸 및 메틸시클로펜타디에닐 망간 트리카보닐을 포함하는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 보호기임); 또는

ㆍ P(OR⁹)(N(R¹⁰)₂)-O-R⁷-(aa)_n2-R⁸-O-Prot(여기서, R⁷은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기이고, R⁸은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬렌 기, 세린 또는 아미노 알코올이며, R⁹는 -CH₂CH₂CN, 또는 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이고, R¹⁰은 선형 또는 분지형의 C1∼C5 알킬 기이며, (aa)_n2는 아르기닌, 리신, 오르니틴, 히스티딘 및 디아미노프로피온산을 포함하는 군으로부터 선택되는 양이온 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 펩티드이고, n2는 2∼20이며, Prot는 4,4-디메톡시트리틸 및 메틸시클로펜타디에닐 망간 트리카보닐을 포함하는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 보호기임).
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자를 포함하는, PCR, 실시간 PCR, 유전자형 검사, 인 시추(in situ) 하이브리드화 또는 DNA 칩의 제조에 사용하기 위한 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드-올리고양이온 분자를 포함하는 조성물.
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