KR101188527B1

KR101188527B1 - 다능성 줄기세포를 증식할 수 있는 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101188527B1
Application number: KR1020097013988A
Authority: KR
Inventors: 칼 트리그베이슨; 안나 도모가츠카야; 세르게이 로딘
Original assignee: 칼 트리그베이슨; 세르게이 로딘; 안나 도모가츠카야
Priority date: 2007-01-04
Filing date: 2008-01-04
Publication date: 2012-10-05
Anticipated expiration: 2028-01-04
Also published as: DK2137295T3; EP2137295B1; WO2008084401A3; CN101605885B; CN101605885A; US8722405B2; WO2008084401A2; KR20090091800A; EP2137295A2; US20080213885A1

Abstract

본 발명은 시험관내에서 줄기세포를 미분화된 상태로 배양하기 위한 세포외 매트릭스와 같은 조성물의 개발 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 이와 관련하여, 다능성 마우스 및 인간 배아 줄기 세포가 재조합 라미닌-10(라미닌-51 1) 또는 라미닌-5(라미닌-322), 또는 그 기능성 도메인으로 코팅된 플레이트 위에서 배양될 때, 상기 배아 줄기 세포는 증식하고 그 다능성을 유지하는 것으로 나타났다.

Description

다능성 줄기세포를 증식할 수 있는 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR ENABLING PROLIFERATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS}

관련 출원에 대한 전후 참조

본 출원은 인용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되는 2007년 1월 4일자로 출원된 미국 가출원 제60/883,406에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은, 다양한 예시 구현예에서, 일반적으로 시험관내에서 다능성 또는 미분화된 줄기 세포의 부착, 증식 및 자가재생(self-renewal)을 유지할 수 있는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이러한 줄기 세포는 설치류 또는 인간의 배아 줄기 세포 및 골수 줄기 세포를 포함한다.

줄기 세포는 분화된 세포가 순차적으로 유래되는 미분화된 세포이다. 배아 줄기 세포는 3가지 모든 배엽의 세포로 분화하는 능력을 갖는 넓은 자가재생 능력 및 다능성을 갖는다. 이들은 치료 목적에 유용하며, 조직 대체 치료, 약물 스크리닝, 기능 유전체학 및 프로테오믹스용 세포의 무제한적 공급원으로 제공될 수 있다(Skottman, H., Dilber, M.S., and Hovatta, O. (2006); The derivation of clinical-grade human embryonic stem cell lines; FEBS Lett 580, 2875-2878).

설치류의 다능성 배아 세포는 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF)의 존재 하에 시험관내 세포 배양 조건에서 다능성 상태로 유지될 수 있다(Williams RL, Hilton DJ, Pease S, Willson TA, Stewart CL, Gearing DP, Wagner EF, Metcalf D, Nicola NA, Gough NM (1988); Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells, Nature 1988 Dec 15; 336(6200): 684-7).

추가로, 설치류 다능성 배아 세포는 피더 세포(feeder cell)인 마우스 배아 섬유아세포 위에서 시험관내에서 배양될 때 다능성 상태를 유지할 수 있다. 인간 배아 세포 또한 시험관내에서 다능성 상태를 유지하기 위해서는 피더 세포 또는 노긴(Noggin)과 같은 분화 억제제 및/또는 Matrigel™ 위에서 배양될 때에는 높은 도스(dose)의 염기성 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF)를 필요로 한다(리뷰를 위하여, Skottman, H., Dilber, M.S., and Hovatta, O. (2006); The derivation of clinical-grade human embryonic stem cell lines; FEBS Lett 580, 2875-2878 참조). 그러나, 피더 세포를 사용하는 것은 다수의 결점을 갖는다. 예를 들면, 피더 세포는 줄기 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스와 같은 병원체(pathogen)를 포함할 수 있다(Hovatta, O., and Skottman, H. (2005); Feeder-free derivation of human embryonic stem-cell lines; Lancet 365, 1601-1603; Skottman, H., Dilber, M.S., and Hovatta, O. (2006); The derivation of clinical-grade human embryonic stem cell lines; FEBS Lett 580, 2875-2878).

인간 배아 줄기 세포의 자가재생을 지지하는 피더-부재 시스템은 ⅰ) Matrigel™(Richards, M., Fong, C.Y., Chan, W.K., Wong, P.C.., and Bongso, A. (2002); Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells; Nat Biotechnol 20, 933-936); (Xu, C., Inokuma, M.S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J.D., and Carpenter, M.K. (2001); Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells; Nat Biotechnol 19, 971-974); (Xu, R.H., Peck, R.M., Li, D.S., Feng, X., Ludwig, T., and Thomson, J.A. (2005); Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells; Nat Methods 2, 185-190); 또는 ⅱ) 마우스 피더-유래의 세포외 매트릭스(Klimanskaya, I., Chung, Y., Meisner, L., Johnson, J., West, M.D., and Lanza, R. (2005); Human embryonic stem cells derived without feeder cells; Lancet 365, 1636-1641) 중 하나를 부착성 기질로 필요로 한다. 그러나, 이들 코팅은 이종성(xenogenic) 기원이고, 따라서 FDA 요건에 따라 임상에서 사용될 수 없다(Hovatta, O., and Skottman, H. (2005); Feeder-free derivation of human embryonic stem-cell lines; Lancet 365, 1601-1603). 이들 코팅은 또한 정의된 시스템 및 비면역원성의 기준을 충족시키지 못하며, 이들의 중요성은 (Hovatta, O., and Skottman, H. (2005); Feeder-free derivation of human embryonic stem-cell lines; Lancet 365, 1601-1603; Skottman, H., Dilber, M.S., and Hovatta, O. (2006); The derivation of clinical-grade human embryonic stem cell lines; FEBS Lett 580, 2875-2878)에 개시되어 있다.

포유동물의 배아 발생 동안에, 수정된 난모세포는 먼저 2개의 세포로 분할되며, 이후 다시 세포가 복제되어 4 세포의 배아를 생성한다. 상기 4 세포기에서, 배아 세포는 세포막 단백질 및 새로운 결합 조직의 분자(세포외 매트릭스)의 도움으로 함께 붙어 있다. 첫 번째 나타난 세포외 매트릭스 분자는 라미닌 및 프로테오글리칸과 같은 기저막(basement membrane) 단백질이다(Cooper, A.R., and MacQueen, H.A. (1983); Subunits of laminin are differentially synthesized in mouse eggs and early embryos; Dev Biol 96, 467-471)(Dziadek, M., and Timpl, R. (1985); Expression of nidogen and laminin in basement membranes during mouse embryogenesis and in teratocarcinoma cells; Dev Biol 111, 372-382). 순차적으로, 상기 배아 세포는 3가지 배엽인 외배엽, 내배엽 및 중배엽 세포로 분화하기 시작하여 형태형성(morphogenesis)을 개시한다. 라미닌과 같은 상기 세포외 매트릭스 분자는 세포 표면 수용체와 상호작용하는 역할을 하고, 따라서 부착, 증식, 이동 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하며(Colognato, H., and Yurchenco, P.D. (2000); Form and function: the laminin family of heterotrimers; Dev Dyn 218, 213-234), 반면 타입 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 또는 Ⅳ 콜라겐과 같은 다른 세포외 매트릭스 성분은 1차적으로 기계적인 지지 기능을 한다(Aumailley, M., and Gayraud, B. (1998); Structure and biological activity of the extracellular matrix; J Mol Med 76, 253-265).

설치류 섬유아세포로부터 유래된 세포외 매트릭스는 가용성 분화 억제제와 조합하여 피더 세포에 대한 적절한 대체물이 될 수 있으며(Klimanskaya, I., Chung, Y., Meisner, L., Johnson, J., West, M.D., and Lanza, R. (2005); Human embryonic stem cells derived without feeder cells; Lancet 365, 1636-1641), 이는 세포외 기질 분자의 중요한 역할을 보여주는 것이다. 라미닌은 알파, 베타 및 감마 사슬로 이루어진 큰 삼량체(trimeric) 세포외 매트릭스 단백질이다. 마우스에는 5개의 다른 알파 사슬, 3개의 베타 사슬 및 3개의 감마 사슬이 존재하며, 인간 조직에서는 적어도 15개의 상이한 조합이 발견되었다(Colognato, H., and Yurchenco, P.D. (2000); Form and function: the laminin family of heterotrimers; Dev Dyn 218, 213-234); (Aumailley, M., Bruckner-Tuderman, L., Carter, W.G., Deutzmann, R., Edgar, D., Ekblom, P., Engel, J., Engvall, E., Hohenester, E., Jones, J.C., et al. (2005); A simplified laminin nomenclature; Matrix Biol 24, 326-332). 이들 분자는 그 역사적인 발견에 기초하여 라미닌-1 내지 라미닌-15로 불리지만, 다른 명명법에서는 예컨대 알파-1, 베타-1 및 감마-1 사슬을 포함하는 라미닌-111(라미닌-1)과 같이 그 사슬의 조성에 기초하여 이소폼(isoform)을 기재한다(Laminin nomenclature: (Aumailley, M., Bruckner-Tuderman, L., Carter, W.G., Deutzmann, R., Edgar, D., Ekblom, P., Engel, J., Engvall, E., Jones, J.C., et al. (2005); A simplified laminin nome nclature; Matrix Biol 24, 326-332)).

상기에도 불구하고, 배아 줄기 세포의 배양 및 성장을 위한 조성물 및 방법의 제공이 계속적으로 요구되고 있다. 이와 관련하여, LIF 또는 피더 세포와 같은 분화 억제제의 사용 없이 시험관내에서 다능성 줄기 세포를 증식 및 생존시킬 수 있는 조성물 및 방법을 제공하는 것은 이점이 있을 것이다.

발명의 요약

본 발명은 시험관내에서 줄기 세포를 미분화된 상태로 배양하기 위한 세포외 매트릭스와 같은 조성물 및 이를 이용한 방법의 개발에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 줄기 세포는 설치류 또는 인간 배아 줄기 세포와 같은 배아 줄기 세포이다. 그러나, 본 발명은 또한 골수 줄기 세포를 사용하는 것도 포함한다.

특정 라미닌이 시험관내에서 미분화된 마우스 및 인간 배아 줄기 세포를 성장 및 증식시키기 위한 정의되고 적합한 세포외 매트릭스를 제공하는 것으로 나타났다. 이것은 어떠한 피더 세포 및/또는 분화 억제제도 존재하지 않는다. 예를 들면, 다능성 마우스 배아 줄기 세포가 재조합 라미닌-10(라미닌-511) 또는 라미닌-5(라미닌-332)로 코팅된 플레이트 위에서 배양될 때, 상기 배아 줄기 세포는 분화 억제제 없이도 증식하고 그 다능성을 유지하는 것으로 나타났다.

또한, 다능성 인간 배아 줄기 세포가 mTeSR1의 동족체와 같은 화학적으로 정의된 배지에서 재조합 라미닌-10(라미닌-511)으로 코팅된 플레이트 위에서 배양될 때, 상기 세포는 분화 억제제 없이도 증식하고 그 다능성을 유지할 수 있다.

이들 및 다른 비제한적인 본 발명의 특성들이 이하 보다 상세히 개시된다.

상세한 설명

다능성 마우스 배아 줄기 세포가 마이토젠성(mitogenic) 인자 bFGF의 존재 하(10 ng/㎖) 및 어떠한 분화 억제제도 없이 재조합 인간 라미닌-5(라미닌-332) 또는 라미닌-10(라미닌-511)으로 코팅된 플레이트 위에서 배양될 때, 상기 세포는 적어도 140일간(23 계대) 증식하고 그 다능성을 유지하는 것으로 나타났다(도 1a, 도 6). Oct4, TERT, Sox2, Nanog 및 UTF1과 같은 다능성 마커의 발현(도 2, 도 3a 내지 도 3d, 도 4) 및 증식 속도(도 1a) 또한 안정하게 유지되었다. 아울러, 라미닌-5 또는 라미닌-10 분자에 대한 배아 세포의 부착은 후자가 배아 세포의 세포 자가재생을 유지하기 위한 능력과 연관이 있는 것으로 나타났다(도 5a 내지 도 5c).

반대로, 마우스 배아 줄기 세포가 동일한 조건 하에 마우스(EHS) 라미닌-1(라미닌-111), 라미닌-8(라미닌-411), Matrigel™ 또는 젤라틴으로 코팅된 플레이트 위에서 배양될 때, 상기 다능성 세포는 1-2주 후 증식을 멈추었다(도 1b). 이들은 분화되거나, 떨어지거나, 또는 죽었다. 추가로, 이들 조건 하에 라미닌-111 또는 Matrigel™ 위에서 배양된 세포는 콜라겐 Ⅳ 및 브라키우리(brachyury)와 같은 분화 마커를 발현하기 시작하며, 다능성 마커인 Oct4, Sox2, Nanog 또는 UTF1의 발현을 멈춘다(도 2, 도 3a 내지 도 3d).

또한, 다능성 인간 배아 줄기 세포가 화학적으로 정의된 배지에서 재조합 인간 라미닌-10(라미닌-511)으로 코팅된 플레이트 위에서 배양될 때, 상기 세포는 적어도 105일간(20 계대) 증식하고 그 다능성을 유지한다(도 7 내지 도 9). Oct4, Sox2 및 Nanog와 같은 다능성 마커의 발현 및 증식 속도 또한 안정하게 남아 있었다.

다음은 도면의 간단한 설명으로서, 본 명세서에 개시된 예시 구현예를 설명하기 위한 목적으로 제공되며, 이를 제한할 목적은 아니다.

도 1a는 라미닌(LN), Matrigel™(MG), 젤라틴(GEL) 및 폴리-D-라이신(PL) 위의 마우스 배아 줄기 세포의 증식을 보여주는 그래프이다. 세포는 LN-332 및 LN-511 위에서 적어도 169일까지 확장하며, 그 동안에 세포 수에서 약 150 더블링(doubling)이 일어났다. 대조적으로, 상기 세포는 LN-111, LN-411, 젤라틴 또는 폴리-D-라이신 위에서는 자가재생되지 않았다. 도 1b는 도 1a에서 1 내지 20일의 확대를 보여주는 그래프로서, 세포가 LN-111, LN-411, Matrigel™ 및 젤라틴 위에서는 어느 한계까지 증식하지만, 1-2주 내에 증식이 멈춘다는 것을 보여준다. 상기 세포는 폴리-D-라이신에는 약하게 부착한다.

도 2는 어떠한 분화 인자 및 분화 억제제도 없이 145일까지 라미닌-111, -312, -411, -511, Matrigel™, 젤라틴 및 폴리-D-라이신 위에서 배양된 마우스 배아 줄기 세포에서 다능성 마커(Sox2, Oct4), 증식 마커(Tert) 및 분화 마커(알파-페토프로틴, 브라키우리, 네스틴 및 비멘틴)의 발현을 보여주는 RT-PCR 사진이다.

도 3a 내지 도 3d는 일련의 컬러 현미경사진에 관한 것으로서(면역형광(×40)), 라미닌-322 및 -511에 대한 마우스 배아 줄기 세포 자가재생 효과를 보여준다. 도 3a는 다능성 마커인 Oct4 및 Sox2에 대한 면역형광 염색의 현미경사진을 나타낸다. LIF의 존재 하에 배양된 배아 줄기 세포(대조군+LIF)는 다능성 마커인 Oct4 및 Sox2(대조군)를 발현한다. LIF 또는 어떠한 다른 분화 억제제도 없이 라미닌-322 또는 라미닌-511 위에서 169일간 배양한 후, 배아 줄기 세포는 계속적으로 Oct4 및 Sox2를 발현한다. 라미닌-111 또는 Matrigel™ 위에서 단지 11일간 배양한 후에는 배아 줄기 세포가 Oct4 및 Sox2의 발현을 멈춘 것은 주목할 만하다. 도 3b는 다능성 마커인 Nanog에 대한 면역형광 염색과 유사한 데이터를 보여주는 현미경사진에 관한 것이다. 도 3c는 다능성 마커인 UTF1에 대한 면역형광 염색과 유사한 데이터를 보여준다. 도 3d는 다능성 마커인 Oct4 및 분화 마커인 콜라겐 Ⅳ에 대한 면역형광 염색의 현미경사진을 나타낸다.

도 4는 LIF 또는 어떠한 다른 분화 억제제도 없이 라미닌-511 위에서 배양될 때 마우스 배아 줄기 세포의 다능성 유지 메카니즘을 보여주는 일련의 컬러 현미경사진이다(면역형광(×40)). 분화 억제제 없이 80일간 라미닌-511 위에서 배양된 배아 줄기 세포를 180 세포/㎟의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 현미경사진은 1시간, 3시간, 1일, 2일 및 3일의 간격으로 찍었다. 다능성 마커인 Sox2는 처음 2일간에 걸쳐 동일한 레벨로 발현된다. 배아 줄기 세포는 서로 접촉하고 있지 않으며, 단지 라미닌-511만 접촉하고 있다.

도 5a는 라미닌-111(LN-111), 라미닌-332(LN-332), 라미닌-411(LN-411), 라미닌-511(LN-511), 마트리젤(MG), 젤라틴(GEL) 및 폴리-D-라이신(PL)의 상이한 코팅 표면에 대한 다능성 마우스 배아 줄기 세포의 부착을 보여주는 그래프이다. 값들은 부착된 세포±표준편차(STD)의 백분율을 보여준다. 도 5b는 상이한 코팅 표 면에 부착된 다능성 ESC가 전파되는 것을 보여주는 그래프이다. 특정 코팅에 부착된 세포의 면적은 전파 효능을 측정함으로써 계산되었다. 상기 면적은 평균 상대 면적±표준편차(STD)로 나타낸다. 도 5c는 1시간의 배양 후 상이한 라미닌에 부착된 배아 줄기 세포를 보여주는 일련의 4개의 현미경사진이다. 크리스털 바이올렛 염색, 배율(×5/×40). 나타낸 바와 같이, 라미닌-332 및 -511은 라미닌-111 또는 -411과는 달리 배아 줄기 세포에 대해 부착성이 높다.

도 6은 피더 및 어떠한 분화 억제제도 없이 라미닌-511 위에서 3개월간 배양된 마우스 배아 줄기 세포로부터 유래된 키메라(chimera) 마우스의 사진이다.

도 7은 피더가 없는 화학적으로 정의된 배지에서 105일간 배양한 후 재조합 라미닌-10(라미닌-511)으로 코팅된 플레이트 위의 인간 배아 줄기 세포의 현미경사진(위상차)이다.

도 8은 화학적으로 정의된 배지에서 105일간 라미닌-10(라미닌-511) 위(LN-511, 20 계대) 및 종래의 배지에서 인간 포피 섬유아세포(대조군) 위에서 배양된 인간 배아 줄기 세포에서의 다능성 마커(Oct4, Nanog), 내부 대조군(GAPDH) 및 분화 마커(알파-페토프로틴, 브라키우리, Sox1 및 Pax6)의 발현을 보여주는 RT-PCR 사진이다. 여기서, hGADPH, hOct4, hNanog, hBrach, hAFP, hSox1 및 hPax6은 각각 GAPDH, Oct4, Nanog, 브라키우리, 알파-페토프로틴, Sox1 및 Pax6을 나타낸다.

도 9는 라미닌-511에 대한 인간 배아 줄기 세포의 자가재생 효과를 나타내는 일련의 컬러 현미경사진(면역형광)을 함유한다. 화학적으로 정의된 배지에서 105일간(20 계대) 라미닌-511 위에서 배양한 후, 인간 배아 줄기 세포는 계속적으로 다능성 마커인 Oct4(녹색) 및 Sox2(붉은색)를 발현한다(LN-511, 20 계대). 종래 배지에서 인간 포피 섬유아세포 위에서 배양된 인간 배아 줄기 세포 또한 다능성 마커인 Oct4 및 Sox2를 발현한다(대조군).

본 발명은 하기 비제한적 실용(working) 실시예에서 추가로 설명할 것이나, 이들 실시예는 예시만을 위한 의도로서, 그 개시가 본 명세서에서 언급된 물질, 조건, 공정 파라미터 등을 제한할 의도가 아님이 이해될 것이다. 모든 비율은 달리 언급하지 않는 한 중량에 의한 것이다.

방법

세포 배양

마우스 배아 줄기 세포(2가지 라인이 사용되었음: 129SvJ 마우스로부터 유도되고 Uppsala University Transgenic Facility에 의해 제공된 GSI-1 라인 및 RW4 라인)를 글루타맥스-I 및 4.5 g/ℓ 글루코오스, 20% 배아 세포 등급의(qualified) 태아 혈청, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신, 10 mM 헤페스(Hepes) 버퍼, 1 mM 나트륨 피루베이트, 비필수 아미노산(모두 인비트로젠에서 제공됨), 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올(Sigma) 및 10 ng/㎖ 베타 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(Chemicon)를 함유하는 80% 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) 를 함유하는 배지에서 37℃, 5% CO₂에서 세포외 매트릭스 코팅 위에서 배양하였다. 배아 세포는 300 세포/㎟의 초기 밀도로 세포외 매트릭스 코팅 위에 플레이팅하였다. 0.05% 트립신-EDTA 용액에 의해 4-6일 마다 세포를 떼어내고, 180 세포/㎟의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 배아 세포는 각 코팅에 대해 2개의 별도 라인으로 배양하였다. 세포는 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 각 계대 동안 계수하였다.

인간 배아 줄기 세포(HS420 및 HS207의 2가지 라인이 사용되었고, 모두 Karolinska University Hospital Huddinge, Karolinska Institute, Sweden의 Hovatta 교수에 의해 호의적으로 제공되었음)는 화학적으로 정의된 배지에서 mTeSR1의 동족체인 재조합 라미닌-10(라미닌-511)으로 코팅된 플레이트 위에서 배양하였다. 상기 배지는 몇 가지를 제외하고 (Ludwig, T.E., Bergendahl, V., Levenstein, M.E., Yu, J., Probasco M.D., 및 Thomson, J.A. (2006); Feeder-independent culture of human embryonic stem cells; Nat Methods 8, 637-646)에 개시되어 있는 대로 준비하였다. 첫 번째로, zbFGF 대신 재조합 인간 FGF(R@DSystems)를 사용하였고, BSA 분획 Ⅴ 대신 소 혈청 유래의 알부민(SIGMA-Aldrich, B4287)을 사용하였다. 두 번째로, 미리 제조된 배지에 첨가된 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물(Invitrogen)을 상기 문헌에 개시되어 있는 방법 대신 성분들의 공급원으로 사용하였다. 상기 인간 배아 줄기 세포는 TrypLE™ Express(GIBCO)에 노출하여 4-6일의 간격으로 덩어리(clump)로 계대되었다. 상기 세포는 실온에서 2분간 효소를 처리한 후, 상기 배지로 2회 세척하였고, 부드럽게 긁어서 수집하였다. 큰 덩어리의 세포는 부드럽게 피펫팅하여 부수었고, 1:3으로 계대하였다.

대조군 인간 배아 줄기 세포는 (Inzunzaa, J., Gertow, K., Stromberg, M.A., Matilainen, E., Blennow, E., Skottman, H., Wolbank, S., Ahrlund-Richter, L., and Hovatta, O. (2005); Derivation of Human Embryonic Stem Cell Lines in Serum Replacement Medium Using Postnatal Human Fibroblasts as Feeder Cells. Stem Cells 2005; 23; 544-549)에 개시되어 있는 바와 같이 종래 배지에서 인간 포피 섬유아세포 위에서 유지하였다. 상기 세포는 입체현미경 하에서 외과용 메스(scalpel)를 이용하여 8 조각으로 콜로니(colony)를 잘라냄으로써 기계적으로 계대하였다. 기계적인 분리는 6일 간격으로 수행하였다. 미분화된 세포는 형태(morphology)에 의해 판정하였으며, 각각의 추가 계대용으로 선택하였다.

플레이트 코팅

96-웰 조직 세포 배양 플레이트(Sarstedt)는 세포외 매트릭스 단백질인 각각 30 ㎍/㎖(5 ㎍/㎟)의 설치류 라미닌-111(Invitrogen), 인간 재조합 라미닌-332, 인간 재조합 라미닌-411(Kortesmaa, J., Yurchenco, P., and Tryggvason, K. (2000); Recombinant laminin-8 (alpha(4)beta(1)gamma(1)). Production, purification, and interactions with integrins. J Biol Chem 275, 14853-14859, 미국 특허 6,638,907), 인간 재조합 라미닌-511(Doi, M., Thyboll, J., Kortesmaa, J., Jansson, K., livanainen, A., Parvardeh, M., Timpl, R., Hedin, U., Swedenborg, J., and Tryggvason, K. (2002); Recombinant human laminin-10(alpha5beta1gamma1); Production, purification, and migration-promoting activity on vascular endothelial cells. J Biol Chem 277, 12741-12748; 미국 특허 6,933,273), 성장 인자-결핍 Matrigel™(1:30)(BD Biosciences), 1 ㎎/㎖의 소 젤라틴(Sigma), 0.1 ㎎/㎖의 폴리-D-라이신(Sigma)의 멸균 용액으로 4℃에서 밤새 코팅하였다

세포 부착 분석

부착 분석은 ([Extracellular Matrix Protocols, 2000)에 개시된 대로 수행하였다. 간략히, MaxiSorp 96-웰 플레이트(Nunc)를 전술한 세포외 매트릭스 단백질에 의해 코팅하고, 1% 열-변성 BSA 용액에 의해 블로킹하였다. 미분화된 배아 세포는 세포외 매트릭스가 코팅된 플레이트 위에 800 세포/㎟의 세포 밀도로 플레이팅하고, 37℃에서 1시간동안 부착하도록 방치하였다. 미부착된 세포는 세척해 내었으며, 부착된 세포는 5% 글루타르알데히드로 20분간 고정하고, 0.1% 크리스털 바이올렛으로 염색하였다.

RT - PCR :

마우스 및 인간 샘플 모두로부터 제조사의 지침에 따라 Absolutely RNA Microprep Kit(Stratagene)을 이용하여 총 RNA를 단리하였다. cDNA는 제조사의 지침에 따라 올리고(dT)12-18 프라이머 및 수퍼스크립트 Ⅱ 역전사효소(Invitrogen)를 함유하는 20 ㎕의 반응 혼합물에서 0.2 ㎍의 총 RNA를 이용하여 합성하였다. 다양한 cDNA 수율을 보정하기 위하여, 각 PCR 반응을 위한 cDNA 양은 표준으로 하 우스키핑(housekeeping) 유전자인 GADPH의 발현 레벨을 이용하여 조정하였다. GADPH PCR 산물(20 사이클, 데이터 미제시)과 동등한 양을 산출하는 cDNA 양을 이후의 PCR 반응에 사용하였다. cDNA는 마우스 샘플에 대해서는 표 1의 프라이머를, 인간 샘플에 대해서는 표 2의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 모든 PCR 반응은 30 사이클로 구동하였으며(사진에 나타난 GADPH PCR의 경우도 포함), 1 U의 Taq DNA Polymerase Recombinant(Invitrogen)를 이용하여 표준 조건 하에서 20 ㎕로 수행하였다. PCR 산물은 에티디움 브로마이드를 함유하는 1.5% 아가로즈 겔 위에서 분석하였다.

각각의 RNA 샘플에 대하여, 게놈 DNA가 단리되지 않았음을 확인하기 위해 역전사효소 없이 RT-PCR을 수행하였다.

[표 1] RT-PCR용 프라이머(마우스 샘플)

[표 2] RT-PCR용 프라이머(인간 샘플)

면역형광 :

면역형광을 위하여, 배아 세포는 96-웰 플레이트의 웰에서 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.1% 트리톤-X로 투과시켰으며, 0.1% 트윈-20(Sigma) PBS 내의 10% 소 태아 혈청(Invitrogen)으로 1시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체와의 배양은 실온에서 1.5시간 동안 수행하였다. 하기 마우스 항원에 대한 1차 항체를 사용하였다: Oct4(BD Biosciences 제품), Sox2, UTF, Nanog, 콜라겐 Ⅳ(모두 Millipore 제품). 하기 인간 항원에 대한 1차 항체를 사용하였다: Oct4 및 Sox2(모두 R@DSystems 제품). DAPI(Molecular probes)를 갖는 2차 항체(Alexa-488- 및 Alexa 546-표지됨, Molecular probes)와의 배양을 40분간 수행하였다. 배양 사이에, 검체(specimen)는 PBS 내의 0.1% 트윈-20으로 3회 내지 5회, 매번 10분씩 세척하였다. 검체는 형광 마운팅(mounting) 배지(Dako)에서 보존하였고, 형광현미경(Leica) 하에 관찰하였다.

키메라 마우스:

라미닌-511 및 라미닌-332 위에서 95일간(17 계대) 배양한 후, 마우스 배아 줄기 세포는 LIF의 존재 하에 마우스 배아 섬유아세포 위에서 확장시켰고, C57BI 마우스 배반포 내로 주입하였다(절차는 Karolinska Center for Transgene Technoligies, Karolinska institute, Stockholm에서 수행하였음). 실험동물 연구소에 대한 지역(local) 윤리 위원회에 의해 2005년 9월 29일자로 트리그베이슨 칼에게 윤리 승인 #246/05가 허용되었다.

결과

A. 라미닌 -511 또는 -332 위에서 배양된 마우스 배아 줄기 세포는 피더 또는 LIF 또는 어떠한 다른 분화 억제제 없이도 증식하고 다능성을 유지한다.

라미닌-511 및 라미닌-332 위에서, 마우스 배아 줄기 세포는 LIF 또는 어떠한 다른 분화 억제제 없이도 적어도 140일간 다능성을 유지하는 것으로 나타났다. 도 1 참조.

증식: LIF/MEF 없이 라미닌-332 및 -511 위에서 배양된 마우스 배아 줄기 세포의 증식 속도는 전체 실험 기간 동안 안정하고 동일하게(높게) 남아 있었다. 도 1a 및 도 1b 참조. 40일부터 80일까지 더블링 시간은 1.2일로 동일하다.

RT - PCR 마커: 다능성 마커인 Sox2, Oct4와 증식 마커인 Tert는, LIF 위에서 배양된 다능성 배아 줄기 세포와 마찬가지로, LIF 없이 라미닌-332 및 -511 위에서 배양된 마우스 배아 줄기 세포에 의해 145일간 동일한 정도로 발현되었다. 도 2 참조.

면역형광: 배아 줄기 세포는 LIF의 존재 하에 키운 배아 줄기 세포와 동일한 정도로 Oct4, Sox2, UTF1 및 Nanog와 같은 다능성 마커를 발현하였다. 도 3a 내지 도 3d 참조.

형태: 라미닌-332 및 -511 위에서 배양된 배아 줄기 세포의 형태는 LIF의 존재 하에 MEF 또는 젤라틴 위에서 배양된 배아 줄기 세포와 현저하게 달렸다. LIF의 존재 하에 MEF 또는 젤라틴 위에서 배양된 배아 줄기 세포는 뚜렷하고 정의된 경계를 갖는 치밀한 클러스터를 형성하였다. 그러나, 라미닌-332 및 -511 위에서 배양된 배아 줄기 세포는 먼저 세포외 매트릭스 코팅 위로 퍼져나가서 단층을 형성 하고, 이후에만 층들을 형성하기 시작하였다. 그럼에도 불구하고, 다능성 마커인 Oct4 및 Sox2의 발현은 감소되지 않는다. 도 4 참조.

생체내 ( 키메라 마우스): 피더 세포 또는 LIF 또는 어떠한 다른 분화 억제제도 없이 라미닌-332 및 라미닌-511 위에서 배양된지 95일(17 계대) 후의 마우스 배아 줄기 세포(GSI-1 라인)는 키메라 마우스를 형성할 수 있었다. 피더 세포 또는 분화 억제제 없이 라미닌-511 또는 라미닌-332 위에서 배양된 마우스 배아 줄기 세포가 다능성인지를 확인하기 위하여, 95일(17 계대)간 유지된 세포를 마우스 배반포 내로 주입하고, 순차적으로 가임신된 마우스 내로 이식하였다. 이것은 키메라 마우스(도 6)를 생성하였으며, 이는 상기 세포가 실제로 다능성임을 나타낸다. 마우스 배아 줄기 세포(RW4 라인) 또한 피더 세포 또는 분화 억제제 없이 라미닌-511 또는 라미닌-332 위에서 11 계대 후에 키메라 마우스를 생성하였다.

B. 부착은 마우스 배아 줄기 자가재생과 관련이 있다.

마우스 배아 줄기 세포의 자가재생을 지지하기 위한 특정 세포외 매트릭스 성분의 능력은 부착과 관련이 있는 것으로 나타났다. 미분화된 배아 줄기 세포는 라미닌-332 및 라미닌-511에 강하게 부착한다(도 5a 및 도 5c). 상기 라미닌들 위에 부착된 배아 줄기 세포의 평균 표면적은 약하게 부착된 배아 줄기 세포의 경우보다 2.7배 높다(도 5b). 라미닌-111, Matrigel™, 젤라틴에 대한 배아 줄기 세포의 부착은 강하지 않다. 라미닌-411, 폴리-D-라이신에 대한 배아 줄기 세포의 부착은 약하거나 없는 것이 관찰되었다. 스튜던트 투-테일 검사 결과 라미닌-511 및 라미닌-332에 대한 부착 및 표면적 사이의 차이는 다른 모든 코팅과 통계적으로 차 이가 있다(p-값이 5% 이하).

C. 라미닌 -511 위에서 배양된 인간 배아 줄기 세포는 피더 없이 화학적으로 정의된 배지에서 증식하고 다능성을 유지한다.

라미닌-511 위에서, 인간 배아 줄기 세포는 화학적으로 정의된 배지에서 적어도 105알간(20 계대) 다능성을 유지하는 것으로 나타났다.

형태: 라미닌-511 위에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 형태는 Matrigel™(Bendall, S.C., Stewart, M.H., Menendez, P., George, D., Vijayaragavan, K., Werbowetski-Ogilvie, T., Ramos-Mejia, V., Rouleau, A., Yang, J., Bosse, M., Lajoie, G. and Bhatia, M. (2007); IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature, 2007 Aug 30;448(7157):1015-21) 또는 세포외 매트릭스 코팅된 플레이트(Klimanskaya, I., Chung, Y., Meisner, L., Johnson, J., West, M.D. and Lanza, R. (2005); Human embryonic stem cells derived without feeder cells. Lancet. 2005 May 7-13;365(9471):1601-1603) 위에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 경우에 나타난 것과 매우 유사하였다. 도 7 참조. 그러나, 전술한 2가지 코팅과는 달리, 재조합 인간 라미닌-511은 이종(xeno)-부재의 정의된 비면역원성 화합물로 FDA 요건에 따라 제조되고, 순차적으로 임상에 사용될 수 있다.

RT - PCR 마커: 다능성 마커인 Oct4 및 Nanog는 종래 배지에서 인간 섬유아세포 포피 위에서 배양된 다능성 배아 줄기 세포와 마찬가지로 화학적으로 정의된 배지에서 라미닌-551 위에서 배양된 인간 배아 줄기 세포와 동일한 정도로 105일간 발현하였다. 도 8 참조.

면역형광: 인간 배아 줄기 세포는 Oct4 및 Sox2와 같은 다능성 마커를 종래 환경에서 키운 배아 줄기 세포와 동일한 정도로 발현하였다. 도 9 참조.

특정한 구현예가 개시되었지만, 현재 예측되지 않거나 않을 수 있는 대체물, 변형, 변경, 개선 및 실질적인 동등물이 출원인 또는 기술분야의 다른 당업자에게 나타날 수 있다. 따라서, 출원된 대로의 및 보정될 수 있는 대로의 첨부된 청구항은 이러한 모든 대체물, 변형, 변경, 개선 및 실질적인 동등물을 포괄하기 위한 의도이다.

<110> Tryggvason, Karl Domogatskaya, Anna Rodin, Sergey <120> COMPOSITION AND METHOD FOR ENABLING PROLIFERATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS <130> 2009-FPA-3552 <150> US 60/883,406 <151> 2007-01-04 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 aggcccggaa gagaaagcga acta 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 tgggggcaga ggaaaggata cagc 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 gtggaaactt ttgtccgaga cc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 tggagtggga ggaagaggta ac 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 ctgcgtgtgc gtgctctgga c 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 cacctcagca aacagcttgt tctc 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 gtggagattg ttgccatcaa cgacc 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 ggctaagcag ttggtggtgc agga 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 caagggtgag tagagagttc ggg 23 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 tataacactg ttaggaaaga gggtc 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 cggcccacgc atcccccatc c 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 cagcggcctt ccaatctctg ttcc 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 gctcatcgga acagctctcc aacc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 ggagaaccag aagacgagga cgtg 24 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 gttttctgag ggatgaaacc tatgcc 26 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 cgcccaaagc atcacgagtt ttgg 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 ggcccctcat taagcctcag cgc 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 gcaggacctg ctggcgtctt agat 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cgaccatctg ccgctttgag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ccccctgtcc cccattccta 20 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 agcatccgac tgtaaagaat cttcac 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 cggccagttg tttttctgcc acct 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gaaggtgaag gtcggagtca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ttcacaccca tgacgaacat 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 aacagacaca gccctcacaa ac 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 cgggaacttg aactggaact gac 23 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ctttgggctg ctcgctatga 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 tggcttggaa agttcgggtc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gaaggtggat ctcaggtagc 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 catctcattg gtgagctcct t 21 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 ctcactttcc tccgcgttgc ttcc 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 tgccctggtc tttgtccttc atcc 24

Claims

라미닌 511(라미닌-10)을 포함하는, 시험관내에서 다능성(pluripotent) 줄기 세포를 증식할 수 있는 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 성장 인자를 추가로 포함하는 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 어떠한 분화 억제제도 결여되어 있는 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포인 조성물.
청구항 4에 있어서,

상기 배아 줄기 세포는 설치류 배아 줄기 세포인 조성물.
청구항 4에 있어서,

상기 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포인 조성물.
삭제
라미닌 511(라미닌-10)을 포함하는 세포외 매트릭스 위에 시험관내에서 다능성(pluripotent) 줄기 세포를 코팅한 후, 상기 다능성 줄기 세포를 증식시키는 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 세포외 매트릭스는 성장 인자를 추가로 포함하는 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 세포외 매트릭스는 어떠한 분화 억제제도 결여되어 있는 방법.
삭제
청구항 8에 있어서,

상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포인 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 배아 줄기 세포는 설치류 배아 줄기 세포인 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포인 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
라미닌 511(라미닌-10)의 층을 포함하는, 시험관내에서 14일 이상 다능성(pluripotent) 줄기 세포를 증식할 수 있는 조성물.