KR101171381B1 - 암세포에 특이적인 활성을 갖는 신규 펩타이드 항암제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 하기 일반식(I)의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
(I) APKAMX¹LLX²LLX¹LQKKGI
여기에서, X¹은 R 또는 K이고; 및 X²는 RR 또는 KK이다.

Description

암세포에 특이적인 활성을 갖는 신규 펩타이드 항암제{Novel anti-cancer agents comprising peptides with cancer-specific toxicity}

본 발명은 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 하기 일반식(I)의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

(I) APKAMX¹LLX²LLX¹LQKKGI

여기에서, X¹은 R 또는 K이고; 및 X²는 RR 또는 KK이다.

본 발명은 항암 활성을 갖는 펩타이드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 피부암, 자궁경부암, 폐암, 직장암, 및 전립선암을 비롯한 다양한 암종(carcinoma) 뿐만 아니라, 혈액암에도 높은 항암 활성을 가지는 펩타이드에 관한 것이다.

현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 화학요법에 의해 개발된 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고(The pharmacological Basis of therapeutics,18:1202, 1986), 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타났기 때문에 암 치료시 문제점으로 지적되고 있다(Wonkwang Medical Sci.3:13-34, 1987). 또한 항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하기도 하지만, 때로는 정상조직에도 침투하여 정상조직, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수기능저하, 위장장애, 탈모증을 유발하기도 하고 암세포가 성장, 증식과 전이를 일으키는 과정에서 변이되면서 항암제에 대한 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점으로 대두되고 있다. 따라서 항암제가 지니는 정상세포에 대한 독성과 암세포의 저항성의 심각한 문제를 해결할 수 있는 효과적인 항암제의 개발이 반드시 필요하다.

항생 펩타이드를 이용한 항암제의 경우 기존의 항암제들과 목표물질이 다르며 또한 다른 항암제의 세포내 전달을 높여주고 효과를 높여줄 수 있다는 의미에서 다른 항암제와 함께 사용하는데 유용하다. 현재 항암제 시장은 연간 63억 달러를 넘고 있으며 이에 대한 연구비도 연간 15억 달러에 이르고 있다. 제약업계 분석 전문 기관인 데이터 모니터에 따르면 2010년 치료용 펩타이드/단백질 분야는 연간 매출 규모가 590억 달러에 달할 전망인데 이는 2001년의 두 배에 달하는 것이다. 이러한 긍정적인 전망에도 불구하고 항균 펩타이드를 이용한 항암제는 아직 연구단계로 제품화된 것이 없으므로 이를 빨리 개발할 경우 새로운 항암제시장을 선점할 수 있는 것으로 예상된다.

최근 들어, 항균 펩타이드의 생체 내에서의 역할이 미생물의 침입에 대한 방어수단으로서만이 아니라, 다른 여러 가지 역할도 수행하고 있음이 밝혀지고 있다. 특히, BMAP-28, HNP-1(β-defensin), 락토페리신 B(Lactoferricin B), LL-37, 마가이닌2(Magainin2), 멜리틴(Melittin), 타치플레신 I(Tachyplesin I)의 세포막과 관련한 항암 활성에 대한 보고가 많이 되었으며, 국내에서는 개구린 5, 개구린 6, 카이신 I, 카이신 II 등의 항균 펩타이드가 생체 내에서 암세포의 성장을 억제하는 역할을 수행한다고 연구된 바 있다. 그러나 현재까지는 보고된 바에 의하면, 암세포가 성장하고 있는 생물에 항균 펩타이드를 주입할 경우, 암세포와 정상세포를 명확히 구별하지 못한다는 치명적인 문제점이 있었다. 작은 크기를 가지면서도, 항암활성이 우수한 항균 펩타이드를 항암제로서 사용할 수 있다면, 항암제의 개발에 큰 전기를 마련할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 따라서 암세포와 정상세포를 선별하여, 암세포에만 작용할 수 있는 항균 펩타이드를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되고 있다.

본 발명자들은 대한민국 등록특허 제0836596호에서 그램 양성균과 음성균 및 곰팡이균에 이르는 넓은 범위의 미생물에 대하여 높은 염 농도에서도 항균활성을 유지하고, 그 항균활성 정도가 종래의 항균 펩타이드들 보다 우수한 항균 펩타이드를 개발한 바 있으며, 이들 항균 펩타이드 유도체 중 암세포와 정상세포를 선별하여 정상 포유동물의 세포에는 영향을 미치지 않고, 암세포에만 선별적으로 작용하는 펩타이드를 규명하였다. 구체적으로 피부암, 자궁경부암, 폐암, 직장암, 전립선암을 비롯한 다양한 암종(carcinoma) 뿐만 아니라, 혈액암에도 뛰어난 항암 활성을 나타내는 펩타이드를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것으로서, 상세하게는 하기 일반식(I)의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

(I) APKAMX¹LLX²LLX¹LQKKGI

여기에서, X¹은 R 또는 K이고; 및 X²는 RR 또는 KK이다.

하나의 양태로서 본 발명은 하기 일반식(I)의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

(I) APKAMX¹LLX²LLX¹LQKKGI

여기에서, X¹은 R 또는 K이고; 및 X²는 RR 또는 KK이다.

본 발명에서 용어, “펩타이드(peptide)”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 암세포에 대해 높은 선별력을 지니고, 강력한 항암활성을 나타내는 펩타이드를 의미한다. 바람직하게 본 발명의 항암 펩타이드는 상기 일반식(I)을 가지며, 이때 X¹은 염기성 아미노산인 R 또는 K이고 X²는 2개의 염기성 아미노산인 RR 또는 KK이다. 상기 일반식(I)은 X-LL-X인 모티프를 포함하는데, 이는 α-helix 구조를 이루는 기본 골조가 되는 모티프이며, X¹LLX²LLX¹은 이 모티프가 반복되는 확장된 α-helix 구조에 해당한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 항암 펩타이드는 아미노산 서열이 APKAMKLLKKLLKLQKKGI-amide인 서열번호 1로 나타내는 펩타이드 또는 아미노산 서열이 APKAMRLLRRLLRLQKKGI-amide인 서열번호 2로 나타내는 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 추가의 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 이펙터(effectors), 약물, 프로드럭, 독소, 펩타이드, 전달 분자 등의 커플링 파트너와 연결될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 상세하게는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로 산을 첨가함으로써 염을 형성할 수 있고, 예를 들어 무기산(예: 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산), 및 산성 당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성 폴리사카리드(예: 히알우론산, 콘드로이틴 술페이트, 아르기닌산), 콘드로이틴 술페이트와 같은 술폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 술폰산(예: 메탄 술폰산, p-톨루엔 술폰산) 등을 첨가하여 염을 형성할 수 있다.

본 발명의 암 예방 또는 치료용 조성물에 포함되는 상기 펩타이드는 N-말단과 C-말단에 캡핑 모티브(capping motif)로 고농도의 염에서도 안정적인 활성을 유지하는 조성물일 수 있다.

서열번호 1과 서열번호 2로 나타내는 본 발명의 항암 펩타이드는 N-말단과 C-말단 쪽에 일정한 서열을 갖는 N-말단 단편과 C-말단 단편을 포함함으로써, 전체 펩타이드의 이차구조가 염 농도에 상관없이 구조적 안정화를 꾀할 수 있다. 이러한 특징은 항균 펩타이드가 생체 내에서 와해되기 쉽다는 구조적 취약점을 보완할 수 있어, 펩타이드의 약리 활성을 이용한 제제화에 매우 유리한 점으로 평가된다. 이에, 본 발명자들은 지속적인 연구를 통하여 뛰어난 항암 활성을 나타내며 정상세포에는 활성을 나타내지 않는 신규 항암 펩타이드로서의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내는 펩타이드를 발견하였고, 본 발명에서 각각 NKC, NRC로 명명하였다.

본 발명에서 "암"은 폐암, 방광암, 유방암, 장암, 신장암, 직장암, 간암, 뇌암, 식도암, 쓸개암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암, 피부(편평상피세포 암종 포함)암, 및 혈액암과 같은 암종; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간충직 발원의 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소건피증, 각화극세포증, 갑상선 여포상암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양일 수 있고, 바람직하게는 피부암, 자궁경부암, 폐암, 직장암, 전립선암, 또는 혈액암일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여로 암이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 인간에 사용하는 것이 바람직하나, 염증 질환 또는 암이 발생되고 본 발명의 펩타이드 투여에 의해 암이 억제 또는 감소될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 또는 고양이 등의 가축에게도 사용될 수 있다.

상기 발명의 조성물은 하기 일반식(I)의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드를 하나 이상 포함할 수 있다.

(I) APKAMX¹LLX²LLX¹LQKKGI

여기에서, X¹은 R 또는 K이고; 및 X²는 RR 또는 KK이다.

상기 펩타이드는 당 사슬 화합물, 지질 화합물, 핵산 화합물, 다른 종류의 펩타이드 또는 단백질 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 화합물에는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일올레일포스파티딜글리세롤(POPG), 포스파티딜글리세롤(PG), C18 포화 지방산, C16 불포화 지방산, C18 불포화 지방산 등이 있다.

구체적인 일 구현예에 따르면, NKC, NRC가 실험실 조건(in vitro)에서 정상세포에 미치는 독성을 MTT 어세이를 실시하여 확인해본 결과, 이미 항암 활성이 보고된 바 있는 펩타이드인 부포린IIb(buforinIIb)가 정상 세포에 독성을 나타내는 반면 NKC와 NRC는 정상세포에 독성이 거의 없음을 확인하였고(도 1a), NKC, NRC가 실험실 조건(in vitro)에서 다양한 암세포에 미치는 항암활성을 MTT 어세이를 실시하여 확인해본 결과, NKC와 NRC가 실험실 조건에서 피부암세포, 자궁경부암세포, 폐암세포, 직장암세포, 전립선암세포, 혈액암세포 등의 다양한 암세포 조직에서 매우 높은 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 1b). 따라서 NKC 또는 NRC를 포함하는 조성물이 항암제의 효과적인 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물일 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 활성 물질을 약5mg/kg/일 내지 10mg/kg/일의 용량으로 투여할 수 있다. 경구 투여하는 경우, 5 내지 10mg/kg의 범위가 적합할 수 있으며 1일 1회 이상 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제, 또는 희석제를 말한다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 조성물을 투여하는 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트 등이 있다.

상세하게는 본 발명의 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구투여용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 펩타이드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르빅산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물의 펩타이드는 세포내에서 펩타이드가 생성되도록, 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 허용되는 약제학적 담체와 함께 적절한 제제로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 항암 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 암세포주에만 뛰어난 선별력을 가지고 작용하므로, 항암제의 효과적인 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 NKC와 NRC를 처리했을 때 인간의 섬유아세포와 각질형성세포, 적혈구 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 1b는 암세포주에서 NKC, NRC의 항암활성을 나타낸 그래프이다.
도2는 항암 펩타이드 NKC, NRC 세포 내 작용 위치를 나타낸 도이다.
도 3a는 항암 펩타이드 NKC, NRC의 양이 인간의 정상세포에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 항암 펩타이드 NKC, NRC의 양이 인간의 암세포에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 강글리오시드에 의한 NKC, NRC의 세포 표면에의 결합과 침투에 따른 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 강글리오시드에 의한 NKC, NRC의 침투 저해를 유세포 분석기로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: NKC , NRC 가 실험실 조건에서 정상세포에 미치는 무독성

실험실 조건에서 NKC와 NRC가 정상세포에는 독성을 보이지 않는다는 것을 확인하기 위하여 배양한 인간의 섬유아세포(human embryo fibroblast, FSF), 인간의 각질형성세포(human keratinocyte, HaCat) 정상 세포주와 인간의 적혈구세포(human erythrocyte)의 생존율을 측정하였다. 항암 활성이 보고된 바 있는 펩타이드인 부포린IIb(buforinIIb)와 정상세포에 미치는 독성이 보고되지 않은 마가이닌2(Magainin2)를 대조군으로 적용하였다.

도 1a의 A,B는 NKC와 NRC를 처리했을 때 인간의 섬유아세포와 각질형성세포의 생존율을 나타낸 그래프이다. 인간의 섬유아세포주와 각질형성 세포주를 각각 배양하고, 각각의 배양한 세포 10⁴cell을 96웰 플레이트(96 well plate)에 분주한 후, 다시 24시간동안 배양하였다. 이어, 각 웰에 부포린IIb와 NKC, NRC, 마가이닌2의 농도를 달리하여 첨가하고, 4일 동안 배양한 후, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol -2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 첨가하고 발색되는 정도를 분광기(spectrophotometer)로 검출하여 살아있는 세포의 수를 측정하여, 각 세포의 생존율을 확인하였다(도 1a의 A, B).

도 1a의 C는 NKC와 NRC를 처리했을 때 인간의 적혈구 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다. 채혈 후 적혈구를 분리하여 PBS를 이용하여 10³배로 희석하여 농도가 다른 부포린IIb와 NKC, NRC, 마가이닌2를 처리하고 30분 후 적혈구가 파괴되는 정도를 분광광도법(spectrometry)을 이용한 흡광도의 차이로 측정하였다(도 1a의 C).

도 1a에서, (●)은 NKC 및 (▲)는 NRC, (■)은 부포린 IIb, (▼)는 마가이닌2, (◆)는 PBS를 나타낸다. 도 1a에서 보듯이, NKC, NRC는 200㎍/ml 이상의 농도에서도 인간의 섬유아세포, 각질형성세포의 정상 세포주와 인간의 적혈구세포의 생존에 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: NKC , NRC 가 실험실 조건에서 여러 가지 암세포에 미치는 항암활성

실험실 조건에서 NKC와 NRC의 항암활성을 측정하기 위하여 인간의 피부암 세포주(SK-MEL-5), 인간의 자궁경부암 세포주(HeLa), 인간의 대장암 세포주(HCT-116), 인간의 폐암 세포주(NCI-H23), 인간의 혈액암 세포주(K-562)와 인간의 전립선암 세포주(PC3)를 각각 배양하고, 각각의 배양한 세포 10⁴cell을 96웰 플레이트(96 well plate)에 분주한 후, 다시 24시간동안 배양하였다. 이어, 각 웰에 부포린IIb와 NKC, NRC, 마가이닌2의 농도를 달리하여 첨가하고, 4일 동안 배양한 후, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 첨가하고 발색되는 정도를 분광기(spectrophotometer)로 검출하여 살아있는 세포의 수를 측정하여, 각 세포의 생존율을 확인하였다(도 1b). 도 1b에서, (●)은 NKC 및 (▲)는 NRC, (■)은 부포린 IIb, (▼)는 마가이닌II, (◆)는 PBS를 나타낸다. 도 1b에서 보듯이, 인간의 피부암 세포주(SK-MEL-5), 인간의 자궁경부암 세포주(HeLa), 인간의 대장암 세포주(HCT-116), 인간의 폐암 세포주(NCI-H23), 인간의 혈액암 세포주(K-562)와 인간의 전립선암 세포주(PC3)의 IC₅₀ 5~40㎍/ml의 농도에서 모두 사멸되는 것을 확인할 수 있었다(도1b).

실시예 3: 항암 펩타이드 NKC , NRC 세포 내 작용 위치

세포 내 펩타이드의 작용 위치를 확인하기 위해, 글라스 커버슬립(glass cover slip)상의 인간의 정상세포에 해당하는 인간의 섬유아세포주(fibroblast)와 각질형성 세포주(HaCat cell), 인간의 암세포에 해당하는 인간의 피부암 세포주 (SM-MEL-5), 자궁암 세포주(HeLa), 대장암 세포주(HCT-116)를 각각 2x10⁵개씩 37℃에서 하룻밤 배양 후, FITC로 라벨링한 펩타이드 NKC, NRC, 부포린IIb와 마가이닌2를 20ug/ml의 농도로 1시간 동안 추가로 배양하였다. 펩타이드와 함께 배양한 세포를 PBS로 5번 씻어낸 후 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하는 과정 없이, 커버 슬립을 덮어 관찰하였다. 실험결과에서 NKC와 NRC는 암세포 선별력이 없는 펩타이드 마가이닌2나 선별력이 약한 부포린IIb와 달리 피부암, 자궁암, 대장암 세포주의 세포벽만 선별적으로 통과하여 막뿐만 아니라 세포내 분자를 주 목표물질로 함을 알 수 있다. 정상세포(non-transformed human fibroblasts, HaCaT cell)의 경우, NKC와 NRC는 정상세포를 투과하지 않았다(도 2).

실시예 4: 항암 펩타이드 NKC , NRC 가 처리된 암세포의 FACS 분석

항암 펩타이드 NKC와 NRC가 작용하는 양에 따라 인간의 정상세포 혹은 암세포에 작용하는 정도를 확인하기 위하여, 항암 펩타이드의 양을 달리하여 유세포 분석기(flow cytomerty)로 분석하였다. 인간의 섬유아 세포주(fibroblast) 1x10⁵cell과 인간의 암세포에 해당하는 인간의 혈액암 세포주인 K-562 1x10⁵cell을 각각 24시간 배양하고, FITC로 라벨링한 펩타이드 NKC와 NRC, 부포린IIb를 10ug/ml과 20ug/ml의 농도로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 도 3a와 도 3b에서 보듯이 혈액암 세포주 K-562의 경우 NKC와 NRC가 농도가 2배로 진해짐에 따라 암세포와의 반응이 더욱 강해지는 것을 확인할 수 있었던 반면, 정상 인간의 섬유아세포주(fibroblast)에서는 NKC와 NRC가 농도에 거의 상관없이 반응하지 않았다(도 3a, 도 3b).

실시예 5: NKC , NRC 와 세포 표면 성분과의 반응

세포표면 물질과 NKC, NRC 사이의 반응을 연구하기 위해서 다양한 농도의 헤파린, 강글리오시드(ganglioside)와 암세포를 가지고 경합결합측정법(competitive binding assay)을 수행하였다. 혈액암 세포주(K-562)를 완전배지가 들어있는 96-well plate(10⁴cells/well)에서 배양한 뒤 1-50ug/ml의 강글리오시드와 포스파티딜세린(phosphatidylserine)과 헤파린(heparine)을 항암 펩타이드 NKC와 NRC 10ug/ml와 함께 암세포에 처리하고 48시간 배양 후, 세포 생존율을 MTT분석법으로 측정하고, 펩타이드와 강글리오시드, 포스파티딜세린, 헤파린을 처리하지 않은 세포와 생존율을 비교하였다. 암세포 표면에 존재하는 물질 중 NKC 혹은 NRC와 결합하는 물질을 추가적으로 확인하기 위해 강글리오시드와 시알산(sialic acids)이 없는 세포를 만들고, 세포 표면에서 강글리오시드를 제거하기 위하여 완전배지에서 키운 암세포에 강글리오시드 생합성 저해제인 PMPP(1-phenyl-2-palmitoylamino-3-morpholino-1-propanol)를 0.625에서 5uM의 농도로 처리하고 이틀간 배양한 뒤 K-562 세포에 대해서는 10ug/ml 농도로 펩타이드를 처리하고 48시간 배양 후 세포 생존도와 생존율을 앞에서의 방법과 같이 측정하였다. 항암 펩타이드 NKC나 NRC가 암세포에 침투하기 위해 세포막에서 결합하는 물질을 찾기 위해, 외부 강글리오시드, 포스파티딜세린, 헤파린이 NKC, NRC의 항암성에 끼치는 영향을 분석하였다. 도 4a에서, (●)은 NKC 및 (▲)은 NRC, (■)은 부포린IIb, (▼)은 마가이닌II, (◆)은 PBS를 나타낸다. 배지 속 강글리오시드가 NKC와 NRC가 암세포에 침투하는 것을 크게 저해함을 알 수 있고, 포스파티딜세린이나 헤파린의 경우, 농도에 따른 NKC와 NRC는 강글리오시드 보다는 항암력에 큰 영향을 미치지는 않았다. NKC와 NRC의 결합과 침투에 있어 강글리오시드의 역할을 추가적으로 확인하기 위해 강글리오시드 합성 저해제인 PPMP를 처리한 암세포에서 NKC나 NRC의 세포 독성을 분석하였다. 이 경우 PPMP를 처리하지 않았을 때의 생존율 50%보다 약80%정도의 훨씬 높은 생존율을 보였다(도 4a).

강글리오시드에 의한 NKC와 NRC의 침투저해를 유세포 분석기(flow cytomerty)로 확인하였다. FITC-표지된 항암 펩타이드의 농도에 따라 처리된 세포의 형광 세기가 반비례하였다(도 4b).

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Claims (5)

1. 삭제
2. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 펩타이드는 N-말단과 C-말단에 캡핑 모티브(capping motif)로 고농도의 염에서도 안정적인 활성을 유지하는 펩타이드인 조성물.
   
4. 제 2항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
   
5. 제 2항에 있어서, 상기 암은 피부암, 자궁경부암, 폐암, 직장암, 전립선암, 또는 혈액암인 조성물.

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