KR100587447B1 - 바실러스 서브틸리스 ｅｂ120 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는방법 - Google Patents
바실러스 서브틸리스 ｅｂ120 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고추 잎으로부터 분리된 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) EB120 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 보리 흰가루병, 오이 흰가루병, 고추 탄저병, 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타내므로 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
도 1은 트립틱 소이 한천 배지에서 배양된 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 사진이다.
도 2는 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 오이 흰가루병에 대한 방제활성을 나타낸 것이다.
도 3은 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 벼 도열병균에 대한 균사 성장 억제정도를 나타낸 것이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액의 온도에 대한 안정성을 관찰하여 나타낸 것이다.
도 5는 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액의 부탄올 추출물의 온도에 대한 안정성을 관찰하여 나타낸 것이다.
본 발명은 식물병에 대해 길항적인 활성을 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) EB120 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법에 관한 것이다.
농작물 경작시 농약을 사용하지 않을 경우 30%에서 최고 100%까지의 수확량 감소가 야기되는 문제가 있어 수확량의 증가를 위해서는 농약의 사용이 불가피하다. 그러나, 농약 중 다수를 차지하는 합성농약의 오남용으로 인해 토양, 수질 및 농산물 오염, 독성, 생태계 교란, 저항성 균주들의 출현 등 여러 가지 문제점이 제기되고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방편 중의 하나인 길항 미생물을 이용한 생물농약 (Biopesticide) 개발에 대한 연구가 최근 전세계적으로 활발하게 진행되고 있다. 생물농약은 크게 식물, 미생물, 천적, 천연 생리활성물질 및 유전자 조작 생명체 (GMO) 등으로 나뉘어진다.
생물농약 중 특히 미생물 살균제 개발에 대한 연구는 지난 70여년간 식물병리학의 주요 분야로서 꾸준히 진행되어 왔으며, 지난 10년간 40여개 이상의 제품들이 개발된 바 있다.
그람양성 세균인 바실러스 속 세균은 슈도모나스 (Pseudomonas)속 다음으로 널리 연구되고 상용화된 세균으로서 토양 내에 많은 수로 존재하고 생물학적 활성이 있는 다양한 2차 대사산물을 생산하며, 열에 안정하고 열악한 환경에 저항성인 내생포자 (endospore)를 형성하는 특징을 가진다. 이러한 특징을 갖는 바실러스 서브틸리스 균주는 1994년 구스타프손 (Gustafson)사가 코디악 (Kodiak)이라는 상품명으로 목화와 땅콩의 종자 및 밭고랑 처리제로서 개발된 바 있다 (Backman 등, Improving Plant Productivity with Rhizosphere Bacteria, pp. 3-8). 또한, 2001년에는 바실러스 서브틸리스균과 바실러스 아밀로리퀴페시언스 (Bacillus amyloliquefaciens) 균을 섞어 바이오일드 (BioYield)라는 미생물 살균제를 출시하였다. 중국에서는 바실러스 속의 많은 균들을 수확량 증진을 위한 세균이라 하여 널리 사용하고 있으며, 독일 바이엘 (Bayer)사에서는 바실러스 FZB 24균을 사용하는 토양전염병 방제제를 개발한 바 있다. 또한 미국 탠사 (Taensa)에서는 동일한 균을 이용한 미생물 살균제를 출시하였다.
한편, 미국 아그라퀘스트 (AgraQuest)사는 세레나데 (Serenade)라는 바실러스 서브틸리스 QST713 균주를 이용한 미생물 살균제를 개발하였다. 이 미생물 살균제는 상기 바실러스 균을 이용한 제품들과는 달리 주로 엽면에 발병하는 공기 전염병을 효과적으로 방제하는 살균제로서 잿빛곰팡이병, 모잘록병 및 흰가루병 등 40가지 이상의 식물병을 방제하는 것으로 알려져 있다. 이 길항 미생물은 경쟁, 기생, 항생작용 및 유도저항성 발현 등의 다양한 기작에 의해 다양한 식물병을 방제하는 것으로 알려져 있는데, 항생물질로는 30가지 이상의 리포펩타이드 (lipopeptide)를 생산하며, 이들에는 이투린 (iturins), 플리파스틴 (plipastins) 및 서팩틴 (surfactins) 등의 세 가지 그룹의 물질이 포함되어 있다 (Ritter, Chemical & Engineering News, 81, 30-35 (2003)).
국내에서는 1970년대 초반부터 인삼 뿌리썩음병의 생물학적 방제 연구를 시작으로 고추 역병, 오이 및 딸기 시들음병, 참깨 모잘록병과 잿빛곰팡이병의 생물학적 방제에 관한 연구를 하고 있으나, 효과의 불안정성, 제제화의 미흡, 비경제성 등으로 인해 큰 진전은 없는 상황이다. 지금까지 바실러스 속의 미생물을 이용한 미생물 살균제로서 (주)그린바이오텍에서 출시한 '탑시드'라는 제품이 개발된 바 있으나, 이는 오직 흰가루병에만 효과를 나타내어 그 사용에 있어 많은 제한이 따른다.
이에 본 발명자들은 고추에서 분리한 식물 내생세균인 바실러스 서브틸리스 EB120 균주가 보리 흰가루병과 오이 흰가루병을 비롯하여 고추 탄저병, 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병 등 여러 가지의 식물병에 대해 길항작용이 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 식물병에 대해 길항작용을 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 식물병에 대해 길항작용을 갖는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) EB120 균주 (KCTC 10578BP)를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 균주 또는 이로부터 유래된 물질을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 분리한 균주는 고추의 잎으로부터 분리된 것으로, 균주의 형태적 특성, 생화학적 특성 및 16S rDNA의 염기서열 분석결과 바실러스 서브틸리스로 확인되었는 바, 이를 바실러스 서브틸리스 EB120으로 명명하고 2004년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 10578BP 호로서 기탁하였다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 다음과 같은 형태학적 및 생화학적 특징을 갖는다.
즉, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 트립틱 소이 한천 배지 (Tryptic soy agar) 상에서 얇게 퍼져 자라며, 단일 콜로니의 경우 작은 눈꽃 모양을 띤다 (도 1). 또한 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 그람 염색반응과 수산화칼륨 시험 (KOH test)에서 양성을 나타내는 간균으로서 카탈라제 시험 (Catalase test) 및 옥시다제 시험 (Oxidase test)에서 양성반응을 나타내며 내생포자를 형성하며, 전분과 카제인 (Casein)을 가수분해하는 특성을 갖는다. 또한 GN2 마이크로플레이트(Microplate)를 이용하여 당이용성을 조사한 결과 대조균주인 바실러스 서브틸리스 subsp. 서브틸리스 ATCC 6051 균주와 비교할 때 말토트리오스 (maltotriose)를 제외한 모든 당에 대한 이용성이 일치하는 것으로 나타났다.
또한, 16S rDNA의 염기서열 (서열번호: 1) 분석 결과 본 발명의 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 바실러스 서브틸리스와 99%정도의 상동성을 나타낸다.
이러한 특성을 갖는 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 보리 흰가루병, 오이 흰가루병, 고추 탄저병, 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 등과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타낸다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 균주 자체, 또는 균주의 배양액, 추출물 또는 포자 단독으로 담체와 혼합하여 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 식물병 방제용 미생물 제제로서 사용할 수 있으며, 상기 담체로는 물, 화이트 카르본, 카올린 등을 사용할 수 있다.
제형화된 미생물 제제는 식물이 생장하고 있는 토양 또는 성장 중인 식물 표면에 처리함으로써 식물병에 의한 식물 성장의 억제 및 이로 인한 고사를 방제할 수 있다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 대상식물에 대해 1.0 × 104 cells/㎖ 내지 1.0 × 1010 cells/㎖, 바람직하게는 1.0 × 106 cells/㎖ 내지 1.0 × 109 cells/㎖의 양으로 처리될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 분리
건전한 고추 잎 5 g을 0.1% 트윈 (Tween) 20이 첨가된 2% NaOCl에 10초간 침지시킴으로써 고추 잎 표면을 살균시키고 45 ㎖의 멸균수를 가한 다음, 막자사발로 갈고 1 ㎖을 취해 1/10, 1/100 및 1/1000로 희석하였다. 각 희석액을 200 ㎕씩 취하여 40 ㎍/㎖의 시클로헥시미드 (Cycloheximide)를 포함하는 트립틱 소이 한천배지 (Tryptic soy agar)에 도말한 다음 30℃에서 배양한 후 세균 콜로니가 나타나면 영양한천배지 (Nutrient agar)에서 3-4회 계대배양하여 단일콜로니를 분리하였다.
실시예 2: 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 동정
실시예 1에서 분리된 균주의 동정은 균주의 형태학적 및 생화학적 특성, 및 16S rDNA 염기서열 분석을 이용하여 수행하였다.
(1) 형태적 및 생화학적 특성
상기 실시예 1에서 분리된 균주는 트립틱 소이 한천배지 상에서 얇게 퍼져 자라며, 단일 콜로니의 경우 작은 눈꽃 모양을 띤다 (도 1). 그람 염색반응과 수산화칼륨 시험 (KOH test)에서는 양성반응을 나타내었으며, 간균(Bacillus)이었다. 또한, 카탈라제 시험 (Catalase test) 및 옥시다제 시험 (Oxidase test)에서는 양 성반응을 보였고 내생포자를 형성하였으며, 전분과 카제인 (Casein)을 가수 분해하였다.
또한,GN2 마이크로플레이트 (구입처: 미국 Biolog사)를 이용하여 당이용성을 조사하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 비교 균주로는 바실러스 서브틸리스 subsp. 서브틸리스 (Bacillus subtilis subsp. subtilis) ATCC6051 균주 (구입처: 한국생명공학연구원 유전자은행)를 사용하였다.
| 당 | EB120균주 | ATCC6051균주 |
| L-아라비노스 | - | - |
| 아라비톨 | - | - |
| 알부틴 | + | + |
| 셀로비오스 | + | + |
| D-프럭토스 | + | + |
| L-프럭토스 | - | - |
| D-갈라투로닌산 (D-Galaturonic acid) | - | - |
| α-D-글루코스 | + | - |
| α-D-락토스 | - | - |
| 말토트리오스 | - | + |
| D-만니톨 | + | + |
| D-만노스 | + | + |
| D-멜레지토스(D-Melezitose) | - | - |
| D-멜리비오스(D-Melibiose) | - | - |
| α-메틸-D-갈락토시드 | - | - |
| β-메틸-D-갈락토시드 | - | - |
| α-메틸-D-만노시드 | - | - |
| D-프사이코스 | + | + |
| L-람노스(L-Rhamnose) | - | - |
| 세도헵툴로산(Sedoheptulosan) | - | - |
| 스타키오스(Stachyose) | - | - |
| 슈크로즈 | + | + |
| D-타가토스(D-Tagatose) | - | - |
| D-트레할로스(D-Trehalose) | + | + |
| 자일리톨(Xylitol) | - | - |
| D-자일로스(D-Xylose) | - | - |
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 당 이 용성은 말토트리오스 (maltotriose)를 제외한 나머지 당에 대해서는 바실러스 서브틸리스 subsp. 서브틸리스 ATCC6051 균주와 모두 일치하는 것으로 나타났다. 즉, 두 균주는 모두 알부틴 (arbutin), 셀로비오스 (cellobiose), D-프럭토스 (D-fructose), α-D-글루코스 (α-D-glucose), D-만니톨 (D-mannitol), D-만노스 (D-mannose), D-프사이코스 (D-psicose), 슈크로즈 (sucrose), D-트레할로스 (D-trehalose) 등의 당을 이용하였다. 그러나, 말토트리오스 (maltotriose)의 경우에는 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 이용하지 못한 반면, 바실러스 서브틸리스 subsp. 서브틸리스 ATCC6051 균주는 이용하는 것을 알 수 있었다.
(2) 16S rDNA의 염기서열 분석
균주의 16S rDNA의 염기서열 (서열번호: 1)을 분석한 결과, 본 균주는 바실러스 서브틸리스와 99% 정도의 상동성을 나타냄을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터 본 발명에서 수득된 균주는 바실러스 서브틸리스 균주로서 동정되었으며, 상기 균주를 바실러스 서브틸리스 EB120으로 명명하고 한국 생명공학연구원 유전자은행에 2004년 1월 6일자로 기탁번호 제 KCTC 10578BP 호로서 기탁하였다.
실시예 3: 식물병에 대한 균주들의 방제활성 검정
바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 오이 탄저병 및 보리 흰가루병의 4가지 식물병에 대한 방제활성을 조사하기 위하여, 바 실러스 서브틸리스 EB120 균주를 대상 식물인 토마토, 보리 및 오이에 각각 처리하고, 1일 경과 후 병원균을 접종하여 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 병방제 활성을 조사하였다.
즉, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주를 멸균한 200 ㎖의 트립틱 소이 액체배지 (Tryptic soy broth, 구입처: Becton and Dickinson사)에 접종한 다음 30℃에서 3일간 150 rpm으로 진탕배양하였다. 배양액 및 배양액을 3배 및 9배로 희석한 희석용액 30 ㎖에 각각 100 ㎍/㎖의 잔탄 검을 첨가한 후 대상 식물인 토마토, 보리 및 오이에 각각 처리하고 풍건한 다음 실온에서 1일 동안 방치하였다. 대상식물은 원예용 상토가 70% 정도 담긴 플라스틱 포트에서 온실 (25±5℃) 조건하에 1주 내지 3주정도 키운 2엽기 토마토, 1엽기 보리 및 2엽기 오이를 사용하였다.
이어서 병원균의 발병 유도는 다음과 같이 수행하였다. 즉, 토마토 역병 및 잿빛곰팡이병은 역병균 (Phytophthora infestans; 입수처: 강릉대학교)의 유주자낭 (5×104 유주자낭/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액 및 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea; 입수처: 한국화학연구원)의 포자 현탁액 (5×105 포자/㎖)을 각각 2엽기 토마토 유묘의 잎에 분무처리하고 20℃ 습실상에서 발병을 유도하였으며, 오이 탄저병은 2엽기 오이 유묘의 잎에 탄저병균 (Colletotrichum orbiculare; 입수처: 농업과학기술원)의 포자 현탁액 (106 포자/㎖)을 처리한 후 2일간 습실상에서 발병을 유도한 다음, 25℃ 항온항습실에서 3일 동안 발병시켰다. 보리 흰가루병은 1엽기 보리 유묘의 잎에 숙주식물에서 계대 배양된 흰가루병균 (Blumeria graminis f. sp. hordei; 입수처: 한국화학연구원)의 포자를 접종한 후 20℃ 항온실에서 발병시켰다.
대조군으로서는 균주 배양액을 함유하지 않는 잔탄 검 용액 (100 ㎍/㎖) 30 ㎖을 처리하여 사용하였으며, 비교군으로서는 각 해당 병원균에 대해 방제효과를 갖는 화학물질인 클로탈로닐 (Chlrothalonil) (구입처: 성보화학), 디티아논 (Dithianon) (구입처: 한국삼공), 디클로플루아니드 (Dichlofluanid) (구입처: 동부한농) 및 베노밀 (Benomyl) (구입처: 동양화학)을 처리한 군을 사용하였다.
각 보리 흰가루병, 오이 탄저병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병의 발병정도는 각 병원균을 접종한 지 7일, 5일, 3일 및 4일 후에 병반 면적율 (%)로서 조사하였다. 병방제 효과 (방제가)는 하기 수학식 1에 따라 산술하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 토마토 역병, 잿빛곰팡이병 및 보리 흰가루병에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 식물병에 대한 우수한 길항활성을 나타내는 최적배지 선발
바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 방제활성 물질 생산을 위한 최적배지를 선발하기 위하여, 여러 가지 배양배지를 대상으로 균주의 배양실험을 수행하였다.
즉, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주를 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 6가지 액체 배지에 접종한 후 3일 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕배양한 다음 각 배양액 을 3배 및 9배로 희석하였다. 각 희석용액에 잔탄 검을 100 ㎍/㎖ 수준으로 첨가한 후 실시예 3에 기재된 방법에 따라 보리 흰가루병을 유발시키고 병방제 효과를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
| 배지 | 방제가 (%) | |
| 3배 희석용액 | 9배 희석용액 | |
| 영양 액체배지 (Nutrient broth) | 10 | 10 |
| 트립틱 소이 액체배지 | 70 | 52 |
| 감자즙액배지 (Potato dextrose broth) | 46 | 0 |
| 프로테오스 펩톤 글루코스 슈크로스 액체배지 (Proteose peptone glucose sucrose broth) | 40 | 20 |
| 글루코스 스타치 액체배지 (Glucose starch broth) | 52 | 10 |
| 글루코스 펩톤 액체배지 (Glucose peptone broth) | 40 | 20 |
| M523 액체배지 | 30 | 10 |
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 보리 흰가루병에 대한 방제활성은 여러 배지들 중 특히 트립틱 소이 액체배지에서 최적인 것으로 나타났다.
실시예 5: 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 오이 흰가루병에 대한 방제 효과
바실러스 서브틸리스 EB120 균주를 트립틱 소이 액체배지에 접종한 다음 3일 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕배양하고 이를 10배, 25배, 50배, 100배 및 200배로 희석한 희석용액에 250 ㎍/㎖의 트윈 20을 첨가한 후 7엽기 오이의 엽면에 분무처리하였다.
비교군으로서 시판되고 있는 흰가루병 방제용 미생물 살균제인 '탑시드' (구입처: (주)그린바이오텍)를 10배, 25배, 50배, 100배 및 200배로 희석시킨 희석용액 및 살균제로서 알려진 플루실라졸 (Flusilazole)을 대상 오이에 처리하여 사용하였으며, 대조군으로서는 무처리군을 사용하였다.
상기 분무처리 후 1주일 후 균주 배양액의 희석용액 및 비교군의 시료를 대상 오이에 2차 처리하였으며, 2차 처리 7일 후에 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라 흰가루병에 대한 병방제 효과를 측정하였다. 흰가루병은 인위적인 접종이 아닌 온실에 존재하는 병원균 (Sphaerotheca fuligenea)에 의해 자연적으로 발생시켰다.
상기 실험과정은 2회 수행하였으며 각 1회 및 2회 실험의 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액의 모든 희석용액이 오이 흰가루병에 대해 우수한 방제효과를 나타내었으며, 특히 200배로 희석된 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 희석용액을 처리한 경우에도 유의한 정도의 방제 활성을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 기존의 흰가루병 방제용 미생물 살균제인 탑시드와 비교할 때, 희석배수가 50배이하의 희석용액 처리군에서는 탑시드 처리군과 동등 이상의 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 도 2는 바실러스 서브틸리스 EB120 균주의 오이 흰가루병에 대한 방제활성을 나타낸 것으로서, 무처리군인 대조군의 경우 흰가루병의 병징이 많이 나타난 반면, 균주의 배양액을 처리한 실험군의 오이 잎에서는 병징을 거의 찾아볼 수 없었다.
실시예 6: 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액, 이의 에틸아세테이트 및 부탄올 추출물의 식물병에 대한 방제활성 검정
바실러스 서브틸리스 EB120 균주가 생산하는 물질의 방제활성을 측정하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액, 이의 에틸아세테이트 및 부탄올 추출물의 식물병에 대한 방제효과를 관찰하였다.
즉, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주를 트립틱 소이 액체배지에 접종한 다음 30℃에서 150 rpm으로 3일간 진탕배양하고 9,000 rpm으로 12분간 원심분리하였다. 상층액을 상층액과 동량의 에틸아세테이트로 2회 추출한 에틸아세테이트 추출물을 얻고, 상층액을 동량의 부탄올로 2회 추출함으로써 수득한 부탄올 추출물을 각각 감압 농축하였다. 추출물 중에서 배양액 40 ㎖에 해당하는 분량을 취하여 에틸아 세테이트 추출물은 4 ㎖의 아세톤으로 용해하였고, 부탄올 추출물은 2 ㎖의 메탄올로 용해하였다.
이어서, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액, 및 상기에서 수득된 균주 배양액의 에틸아세테이트 및 부탄올 추출물 시료 40 ㎖에 250 ㎍/ml의 트윈 20을 첨가한 후 대상 식물인 고추, 벼, 토마토, 밀 및 보리에 처리하고, 1일 경과 후 병원균인 고추 탄저병 (PAN), 벼 도열병 (RCB), 벼 잎집무늬마름병 (RSB), 토마토 잿빛곰팡이병 (TGM), 토마토 역병 (TLB), 밀 붉은녹병 (WLR) 및 보리 흰가루병 (BPM)을 접종하여 병방제 효과를 조사하였다.
각 병원균의 발병 유도에 있어서, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병 및 보리 흰가루병은 상기 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라 수행하였다.
한편, 고추 탄저병은 최아 (催芽)된 고추 종자를 지름 7.0 cm의 포트에 파종한 후 8엽기까지 온실에서 키운 고추에 고추 탄저병원균 (Colletotrichum coccodes, 입수처: 고려대학교)의 포자현탁액 (5 × 105 spores/㎖)을 분무 처리한 다음, 습실상에서 2일간 처리한 후 25℃ 항온항습실에서 2일간 배양하여 유도하였다.
벼 도열병은 2엽기 유묘에 벼 도열병원균 (Magnaporthe gisea, 입수처: 서울대학교)의 포자 현탁액 (5×105 포자/㎖)을 분무하여 접종한 후 25℃ 습실상에서 하루 동안 방치한 다음, 25℃ 항온실에 5일간 배양하여 유도하였다.
벼 잎집무늬마름병은 3엽기 유묘에 벼 입집무늬마름병원균 (Thanatephorus
cucumeris, 입수처: 한국화학연구원)이 7일 동안 배양된 배지 (밀기울 90 g, 왕겨 15 g, 증류수 100 ㎖)를 접종하고 25℃ 습실상에서 4일간 처리한 다음, 25℃ 항온실에서 4일간 배양하여 유도하였다.
밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물 기생균 (Puccinia recondita, 한국화학연구원)의 포자를 트윈 20 용액 (250 ㎍/㎖)에 0.67 g 포자/ℓ농도로 현탁한 포자 현탁액을 분무 처리하여 하루 동안 20℃ 습실상에서 처리한 다음 항온실로 옮겨 배양하여 유도하였다.
고추 탄저병에 대해서는 병원균을 접종한지 4일 후에, 벼 도열병에 대해서는 병원균을 접종한지 5일 후에, 밀 붉은녹병 및 벼 잎집무늬마름병에 대해서는 병원균을 접종한지 7일 후에 병반 면적율 (%)를 조사하였으며, 실시예 3의 방법에 따라 병방제 효과 (방제가)를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
| 시료 | 방제가 (%) | ||||||
| PAN | RCB | RSB | TGM | TLB | WLR | BPM | |
| 배양액 | 93 | 83 | 0 | 94 | 94 | 90 | 92 |
| 배양액의 에틸아세테이트 추출물 | 0 | 70 | 0 | 0 | 0 | 53 | 0 |
| 배양액의 부탄올 추출물 | 96 | 98 | 60 | 94 | 95 | 83 | 93 |
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액의 에틸아세테이트 추출물은 식물병에 대하여 거의 효과가 없었으나, 이의 부탄올 추출물은 균주 배양액과 마찬가지로 보리 흰가루병, 고추 탄저병, 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병의 모든 식물병에 대하여 균주 배양액의 것과 동등 이상의 높은 방제활성을 나타내었다. 이로부터 본 발명의 바실러스 서 브틸리스 EB120 균주가 생산하는 방제활성 물질은 비교적 극성이 높은 물질임을 알 수 있었다.
실시예 7: 바실러스 서브틸리스 EB120 균주가 생산하는 방제활성 물질의 온도에 대한 안정성 조사
바실러스 서브틸리스 EB120 균주가 생산하는 물질의 온도에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 균주 배양액과 이의 부탄올 추출물을 여러 온도, 즉, 4℃ 상온, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 100℃ 및 121℃에서 미리 처리한 다음 병원균을 접종하여 병원균주의 균사 성장 억제정도를 조사하였다.
즉, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액과 상기 실시예 6에서 수득된 부탄올 추출물을 4℃ 및 상온에서는 24시간, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃ 및 70℃에서는 5시간, 100℃ 및 121℃에서는 15분간 동안 미리 처리한 다음, 균주 배양액은 2배 희석하고 부탄올 추출물은 메탄올에 200 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 각 시료 50 ㎕를 지름 8 mm의 종이 조각 (paper disk)에 분주하고 건조시킨 다음, 벼 도열병균(Magnaporthe gisea, 입수처: 서울대학교)이 주입 평판법 (Pour-plating method)으로 접종된 감자한천배지 위에 옮긴 후 3일간 25℃에 배양하였다. 이어서, 종이 조각의 지름을 포함하여 억제된 원의 지름을 측정함으로써 균사 성장 억제 효과를 관찰하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 벼 도열병균에서 바실러스 서브틸리스 EB120 균주가 생산하는 물질에 대해 세 가지 양상으로 영향을 받는 부위가 나타남을 알 수 있 었다. 즉, 완전히 균사 생육이 억제되는 부위 (완전 억제 부위)와 공중균사는 못 자라나고 배지 속으로 균사가 자라나는 부위 (부분 억제 부위) 및 공중균사가 자라나 공중균사가 배지에 흡착한 듯이 보이는 부위 (공중균사 영향 부위)의 세 가지 부위이다. 이러한 결과로부터 바실러스 서브틸리스 EB120 균주는 적어도 세 가지 이상의 방제활성 물질을 생산함을 알 수 있다.
또한, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주가 생산하는 방제활성 물질에 대해 벼 도열병 균주에서 나타나는 세 가지 양상에 있어서 균주 배양액의 열처리에 따른 변화를 관찰한 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주가 생산하는 방제활성 물질은 온도에 상관없이 거의 균일한 정도의 균주 성장 억제효과를 나타내는 것을 볼 수 있었으며, 이로부터 바실러스 서브틸리스 EB120 균주가 생산하는 방제활성 물질은 열에 비교적 안정하다는 것을 알 수 있다. 도 4에서 검은색 막대는 완전 억제 부위를 나타내며, 회색 막대는 부분 억제 부위를 나타내며, 흰색 막대는 공중 균사 영향 부위를 나타낸다.
한편, 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 배양액의 부탄올 추출물의 열처리에 따른 벼 도열병균주의 성장 억제 정도를 관찰한 결과, 배양액의 부탄올 추출물에 대해서는 균주 배양액과는 달리 공중 균사 영향 부위는 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터 공중 균사 영향 부위의 양상을 나타내는 방제활성 물질은 다른 두 가지 양상을 보이는 방제활성 물질보다 비극성이라는 것을 알 수 있다. 그리고 도 5에서 보는 바와 같이 부탄올 추출물도 열처리 온도에 상관없이 균일한 균사성장억제 활성을 보였다.
이상과 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) EB120 균주는 보리 흰가루병, 오이 흰가루병, 고추 탄저병, 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타내므로 이를 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다.
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Claims (6)
- 삭제
- 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) EB120 균주 (KCTC 10578BP) 또는 이의 배양액, 추출물 또는 포자를 유효성분으로 함유하는, 보리 흰가루병, 오이 흰가루병, 벼 도열병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병으로 이루어진 군에서 선택된 식물병 의 방제용 미생물 제제.
- 삭제
- 삭제
- 바실러스 서브틸리스 EB120 균주 (KCTC 10578BP) 또는 이의 배양액, 추출물 또는 포자를 포함하는 미생물 제제를 식물에 처리하는 것을 포함하는, 보리 흰가루병, 오이 흰가루병, 벼 도열병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병으로 이루어진 군에서 선택된 식물병의 방제 방법.
- 제 5 항에 있어서,식물병이 보리 흰가루병, 오이 흰가루병, 고추 탄저병, 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병 또는 밀 붉은녹병인 것을 특징으로 하는 방법.
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