JPS6033474B2 - 新規なヒアルロニダ−ゼｂｍｐ−８２３１およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は新規なヒアルロニダーゼＢＭ円−８２３１お
よびその製造法に関するものである。

ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸を分解する能力を有す
る酵素の総称であり、ある種のものは例えば皮下注射に
おける薬剤の吸収拡散促進剤としてまた研究用試薬とし
て使用されている。従来、ヒァルロニダーゼは動物組織
およびある種の微生物の培養物中にその存在が認められ
ており、そしてさらにストレプトマイセス・ヒアルロリ
テイカス・ノブ・エス・ピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓＮ０Ｖ．ＳＰ．）がヒ
アルロニダーゼを生産することも知られている（例えば
、侍公昭４６一１１９５号公報参照）。

この発明者等は種々研究の結果、従来のヒアルロニダー
ゼとは種々の点で性質の異なる新規なヒアルロニダーゼ
（ＢＭＰ−８２３１）をある種の菌が生産するという新
知見を得、さらに鋭意研究の結果、この発明を完成した
。１ ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１の生化学的性
質について：この発明のヒアルロニダーゼＢＭＰ一８２
３１は次のような生化学的性質を有する。

御 作用 エンドＢーヘキソサミニダーゼ ‘ｂー 基質特異性 ヒアルロン酸を分解し、コンドロィチン硫酸Ａ、コンド
ロィチン硫酸Ｃおよびコンドロィチンを分解せず。

‘ｃ｝ 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 （ィー 至通ｐＨ：ｐＨ４．桃付近 ・各種ｐＨにおけるヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１
の酵素活性を下記測定法で測定した結果を第１図（ｐＨ
活性曲線）に示す。

測定法：０．１５％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液０．
１肌にヒアルロニダーゼＢＭ円−８２３１の水溶液（ヒ
アルロニダーゼ濃度：４仏夕／机上）０．１私および各
種所定のｐＨのべロナール緩衝液０．８ｍ‘を加え、６
０ｑ○で３０分間反応させる。

反応終了後直ちに水冷し上言己血清溶液４の‘を加え、
よくかく拝し、３０分間室温に放置した後、６４仇ｈｒ
における濁度を測定する。

｛ｏ｝ 安定ｐＨ：ＰＨ４．０〜ＰＨＩｌ．３ヒアルロ
ニダーゼＢＭＰ−８２３１を下記の各種緩衝液中３７０
で１筋寺間放置した後、後記測定法１（反応温度：３７
０）に従い、その残存酵素活性を測定した。その結果を
第２図（ｐＨ安定曲線）に示す。

ＰＨ２．１〜６．０：クラークーラブス緩衝液ｐＨ５．
９〜７．９：りん酸２水素カリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液ｐＨ７．９〜１０．０：ほう酸−塩化カリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液ＰＨＩＯ．５〜１１．３：塩酸
−炭酸ナトリウム緩衝液風 作用適温の範囲：．至適温
度：６０ｏｏ附近。

ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１をくえん酸緩衝液（
ｐＨ６．０）中で各所定の温度で３０分間反応させた後
酵素活性を後記測定法ローこ従い測定した。

その結果を第３図（温度活性曲線）に示す。

‘ｅ’温度安定性： ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１をりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）中各所定温度で３０分間放置した後、後記測
定法１（反応温度：３７０）に従い残存酵素活性を測定
した。

その結果を第４図（温度安定曲線）に示す。川 失活の
条件： ‘ィ｝ ＰＨ３のクラークーラブス緩衝液中３７ｑ０で
１斑時間放置することにより約３０％失活する。

‘ｏー ｐＨ７のりん酸緩衝液中６５℃で３０分間加溢
することにより約３０％失活する。

（ｇ） 蛋白分解酵素に対する安定性： ヒアルロニダーゼＢＭＰ一８２３１、２０仏夕に所定量
の蛋白分解酵素、プロナーゼＥ（商標、科研化学株式会
社製）をりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）中３７ｑ０で一定
時間反応させた後、酵素活性を後記測定法０（反応温度
：３７０）に従い測定した。

その結果を第５図に示す。別に対照として市販のヒアル
ロニダーゼ 「アマノ」（商標、天野製薬株式会社製、ストレプトマ
イセス・ヒアルロリテイカス・ノフ・ェス・ピーの生産
するヒアルロニダ−ゼ）１０山夕を使用して上記と同様
に処理した。

その結果を第６図に示す。第５図および第６図中、・−
・はプロナーゼＥ５００仏タ処理を、△−△はプロナー
ゼＥ２００仏タ処理を、０一〇はプロナーゼＥ無処理を
それぞれ示す。上記の結果から、ヒアルロニダーゼ「ア
マノ」は蛋白分解酵素処理により、その酵素活性が著し
く低下するのに対しこの発明のヒアルロニダーゼＢＭＰ
−８２３１の酵素活性はほとんど低下しないことは明ら
かである。

（ｈ） 抗血清との反応性および酵素活性に対する抗血
清の影響【ィ’抗血清の調製 ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１ １．５雌をりん酸
緩衝液（ｐＨ７．０）１の‘に溶解して調製した溶液と
コンブリート・アジュバント（ディフコ社製）１の上と
から調製した乳滋液の全量を、うさぎの四肢の足蹴部に
皮内注射し，２週間後に、同機に調整した乳濁液をその
うさぎの背部皮内に投与する。

さらに、１ケ月経過後、そのうさぎから採血し、血べし
、を除去するために１夜室温に放置後遠心分離（１０，
００仇ｐｍ×１時間）してヒアルロニダーゼＢＭＰ−８
２３１抗血清を得る。

｛ｏ）ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１抗血清とこの
発明のヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１および市販の
ヒアルロニダーゼとの各沈降反応結果 ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１抗血清はヒアルロニ
ダーゼＢＭ円−８２３１とは反応するが、ヒアルロニダ
ーゼ「アマノ」とは全く反応しない。

また、非免疫うさぎの血清とは上記両酵素とも全く反応
しない。

し一 ヒアルロニダーゼＢＭＰ一８２３１抗血清がこの
発明のヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１および市販の
ヒアルロニダーゼの酵素活性に及ぼす影響について ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１抗血清はヒァルロニ
ダーゼＢＭ円−８２３１の酵素活性を阻害するが、ヒア
ルロニダーゼ「アマノＪの酵素活性を阻害しない。

また、非免疫うさぎの血清によっては上記両酵素ともそ
の酵素活性が阻害されなかった。

（ｉ） ヒアルロニダーゼの活性測定法 測定法１ ‘ィーヮ′レポール緩衝液の調製 酢酸カリウム１４夕および氷酢酸２０．５の‘を水に溶
解し、全量を１れこする。

【〇１ りん酸緩衝液の調製 りん酸二水素ナトリウム２．５夕、無水りん酸水素２ナ
トリウム１．０夕および塩化ナトリウム８．２夕を水に
熔解し、全量を１そにする。

し一 血清溶液の調製 仔牛血清１００の‘に上言己ヮルポール緩衝液９００Ｍ
を加えて、塩酸でｐＨ３．１に調整する。

この血清溶液を４℃で保存しておき、使用時に、この保
存血清溶液を上記ワルポール緩衝液で４倍に希釈する。

９ ヒアルロン酸溶液の調製 ５００ムタ／叫の濃度となるようにヒアルロン酸のナト
リウム塩（シグマ社製）を水に溶解する。

得られた水溶液を上託りん酸緩衝液で２倍に希釈する。

的 反応および測定 上記ヒアルロン酸溶液０．５泌に所定のヒアルロニダー
ゼを上託りん酸緩衝液に熔解‐ して調製した酵素液０
．５の‘を加え、３７ｑ０（または６０００）で３び分
間反応させた後、反応液を直ちに水冷し、上記血清溶液
４の‘を加え、よくかく拝し、３０分間室温に放置した
後、６４０の山における濁度を装定する。

測定法ロ｛ィ１ ヒアルロン酸溶液の調製 ヒアルロン酸のナトリウム塩（シグマ社 製）をくれ磯衝液（ＰＨ６‐ｏ）（誌Ｍくえん酸ナトリ
ウム水溶液と瀞水酸化ナトリウム水溶液を６：４の割合
で混合して調製したもの）に１側／肌の割合で溶解する
。

‘ｏ｝ 炭酸ナトリウムーシアン化カリウム水溶液の調
製炭酸ナトリウム５．３夕およびシアン化カリウム０．
６５夕を水に溶解して全量を１〆とする。

し一 第二鉄イオン水溶液の調製 硫酸第二鉄アンモニウム１．５夕および界面活性剤、デ
ュポノール（商標、ェ・ア ィ・デュポン社製）１夕を０．０州硫酸に溶解し、全量
を１夕とする。

８ 反応および測定 上記ヒアルロン酸溶液０．５肌に所定のヒアルロニダー
ゼを上記測定法１の（口｝のりん酸緩衝液に溶解して調
製した酵素溶液０．１の‘を加え、３７０（または６０
℃）で３び分間反応させた後直ちに沸とう水浴中に２分
間放置して、反応を停止させる。

水冷後、反応液に上記炭酸ナトリウムーシアン化カリウ
ム水溶液０．３の‘および０．０５％フェリシアン化カ
リウム水溶液０．３叫を加え、再び凝とう水浴中にて９
分間加熱する。

水冷後、得られた混液にＩＮ塩酸０．１の‘を加え、さ
らに上記第二鉄イオン水溶液１の上を加えて、１５分間
放置した後、６６０の仏における吸光度を測定する。

（ｊ） 分子量 約１０方（狼山定法：１０％ポリアクリルアミドゲルー
ＳＤＳ電気泳動法）なお、ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８
２３１は高分子物質で結晶化することが困難であるため
、元素分析値および結晶構造を決定することができない
。

このような諸性質よりヒアルロニダーゼ ＢＭＰ−８２３１について、この出願前公知のヒニルロ
ニダーゼと比較検討した結果、この発明のヒアルロニダ
ーゼＢＭＰ−８２３１は従来より公知の動物由来および
細菌由釆のヒアルロニダーゼとは種々の点で質的に相異
し、さらにはストレプトマイセス・ヒアルロリテイカス
・ノブ・エス・ピーの生産するヒアルロニダーゼとは前
記のように種々の点で相異する。

以上の検討結果から、この発明のヒアルロニダーゼは新
規な酵素であることが確認されるので、この酵素をヒア
ルロニダーゼＢＭ円−８２３１と命名した。

ロ ヒァルロニダ−ゼＢＭＰ−８２３１の製造方法につ
いて：この発明のヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１は
例えばヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１生産菌を培地
に培養し、得られる培養物からヒアルロニダーゼＢＭＰ
−８２３１を分離、採取することにより製造される。

ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１生産菌のうち、この
発明者等が東京都小金井市で採取した土壌から新たに分
離した菌株（Ｎｏ．８２３１と番号を付す）は次の菌学
的性質を有する。

（１） 形態学的性質 シュークロース・硝酸塩寒天、グリセリ ン・アスパラギン寒天、イースト・麦芽寒天、オートミ
ル寒天およびスターチ・無機塩寒天の各平板培養基上で
Ｎｏ．８２３１株を２８ｏＣ、１０日間培養した後、顕
微鏡下で観察した結果は次のとおりである。

‘１｝ 胞子形成菌糸の分枝法 単純分枝 ｛２１ 胞子形成菌糸の形態 大部分がらせん状であり、短い菌糸では まつすぐに伸びているものもある。

糊 胞子の表面構造及び大きさ 平滑（Ｓｍｏｏｔｈ）、０．２〜０．９×１．０〜１．
５山｛４）胞子の数１０〜３川固。

■ 鞭毛胞子の有無 認められない。

（６｝ 胞子のうの有無 認められない。

‘７’ 胞子柄の着生位置 気菌糸上 ■ 栄養菌糸の分断 認められない。

【９｝ 菌核の有無 認められない。

（ｎ） 各種培地における生育状態 下記各種塔地における生育状態は、２８℃、１０〜１４
日間培養後の観察結果である。

（ｍ） 生理学的性質 ‘１｝ 生育温度範囲〔ベネット（段ｎｎｅｔｔｓ）寒
天培地上〕１５〜４０ｏｏ、最適生育温度２８ｏｏ■
ゼラチンの液化（グルコース・ベプトン・ゼラチン培養
地） 液化する。

糊 スタ−チの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地上
）加水分解する。

■ 脱脂牛乳の凝固およびべプトン化 凝固しない、ベプトン化しない。

‘５ー メラニン様物質の生産（チロシン寒天、ｔベプ
トン・イースト．鉄寒天およびトリプトン・イースト・
ブロス）生産しない。

‘６’各種炭素源の利用性（プリドハム・ゴットリーブ
寒天培地上）Ｌーアラビノース 十 セノレロ‐−ス Ｄーフラクトース ＋ Ｄーグルコース 十 Ｄ−ガラクトース ＋ イノシトール ＋ Ｄーマンノース 十 Ｄーマンニトール ＋ マ′レトース ＋ Ｌーラムノース ＋ ラフイノース ＋ シユークロース ＋ サリシン Ｄーキシロース ＋ （十：よく利用する。

−：利用しない。）以上のような繭学的性質を有する菌
殊について、／ゞ−ジエイズ・マニアル・オブ・デイタ
ミナテイブ・バクテリオロジー（母ｒ鉾ｙｓＭａｎｕａ
ｌｏｆＤｅｔｅ皿ｉｎｍｔｉｖｅ母ｃｔｅｒｉｏｌｃ期
）第８版（１９７４年）、ィー・ビー・シヤーリングお
よびデー・コットリーブ（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇａ
ｎｄＤ．仇ｔｔｌｉｅｂ）著のＩＳＰ（ｌｎｔｅｍａｔ
ｊｏｎａＩ ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＰｒｏｊｅｃｔ
）報告｛インターナショナル・ジャーナル・オプ・シス
テマティック・バクテリオロジー第１袋筈第６９頁およ
び第２７９頁（１９粥年）、同第１９巻第３９１頁（１
９６乎王）および同第２２巻第２６５頁（１９７２手）
｝等の文献をもとに検索を行なった。

その結果、Ｎｏ．８２３１株に比較的近緑している菌種
として、ストレプトマイセス・バストウス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓｖａｓｔ船）、ストレプトマイセス・カ
ナリウム（Ｓ口ｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｎａｒｉｕｓ）
およびストレプトマイセス・ニゲラス（Ｓｔｒｅｐｂｍ
ｙｃｅｓｎｉｇｅｌｌｕｓ）が挙げられる。しかしなが
ら、Ｎｏ．８２３１株とこれらの菌種とは例えば以下の
諸点において異なる。

ストレフ。

トマイセス・／ゞストウスストレプトマイセス・／ゞス
トウスはイースト・麦芽寒天およびオートミール寒天上
でも気菌糸を形成する。

コロニ−の裏面の色について、ィースト・麦芽寒天上で
灰緑色でありまたオートミル寒天およびスターチ・無機
塩寒天上で薄青色である。ストレプトマイセス・カナリ
ウス ストレプトマイセス・カナリウスはイースト・麦芽寒天
およびオートミル寒天上でも気菌糸を形成する。

黄色〜黄緑色の拡散性色素を生産する。ストレプトマイ
セス・ニゲラスストレプトマイセス・ニゲラスは、イー
スト・麦芽寒天およびオートミル寒天上でも気菌糸を形
成する。

菌叢表面の色は灰色から褐灰色である。以上の諸相異点
からみて、Ｎｏ．８２３１株は上記の３菌種とは繭種が
異なる。なお、Ｎｏ．８２３１株とヒアルロニダーゼ生
産菌として知られているストレプトマイセス・ヒアルロ
リテイカス（Ｓにｒｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙａｌｕｒｏｌ
ｙｔｉｃｕｓ）（特公昭４６−１１９５公報参照）とは
気菌糸の形態が全く異なり、クロモジェネシティー（ｃ
ｈｒｏｍｏ鱒ｎｅｃｉｔｙ）の点でも相反しており、全
く菌種が異なる。これらの結果から、Ｎｏ．８２３１株
はストレプトマィセス属の新種であると認められるので
、これをストレプトマイセス・コガネイエンシス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＫｏｇａｎｅｉｅｎｓｉｓ）Ｎｏ
．８２３１と命名した。

このストレフ。

トマイセス・コガネイエンシスＮｏ．８２３１は工業技
術院微生物工業技術研究所に微生物保管委託申請書受理
番号第４４８び号として寄託されており、またアメリカ
ン・タイプ・カルチユア・コレクション（ＡＴＣＣ）に
ＡＴＣＣ３１３９４として寄託されている。ヒァルロニ
ダーゼＢＭＰ−８２３１生産菌は例えば、紫外線、Ｘ線
等の照射処理、ＮーメチルーＮ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（ＮＴＧ）、５−フロモウラシル、２−ア
ミノプリン等の薬剤による処理、形質転換、形質導入、
接合等の通常用いられる菌株変異処理方法によって、ヒ
アルロニダーゼＢＭＰ−８２３１の生産能を高めること
ができる。

ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１生産菌の培養方法は
原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液
体培地による深部培養法が有利である。

培養に用いられる培地としては、ヒアルロニダーゼＢＭ
Ｐ−８２３１生産菌が利用する栄養源を含有する培地で
あればよい。すなわち、合成培地、半合成培地あるいは
天然塔地が用いられ、培地の組成は通常の培地そのまま
を使用できる。

すなわち、炭素源としては例えばグルコース、マンノー
ス、グリセリン、糖密、でん粉、液化でん粉等が用いら
れ、窒素源としては肉エキス、カゼイン加水分解物、ベ
プトン、グルテンミール、コーンミール、棉美粕、大豆
粉、コーンスチープリカー、乾燥酵母、りん酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、尿素等が用いられる。また例
えばりん酸水素２ナトリウム、りん酸２水素カリウム、
炭酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸
鋼、硫酸亜鉛、塩化マンガン、塩化マグネシウム等の金
属のりん酸塩、塩化物等の無機塩も必要に応じて添加さ
れる。また，培養中発泡の著しい時には、例えば大豆油
、亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール等の高級アル
コール類、シリコン化合物等の消泡剤を適宜添加すれば
よい。培養温度は３０ｏｏ前後が適当である。

培養容量の増大に従って適宜種培養を行なうと好結果が
得られることが多い。本培養の培養時間は５０〜１００
時間位が適当である。以上述べた培養条件は使用生産菌
株の特性に応じてそれぞれ最適の条件を選択して適用さ
れる。

このようにして、培養物中に蓄積されたヒアルロニダー
ゼＢＭＰ−８２３１は主に培養液中に含有されているの
で、ろ過、遠０分離等の手段により、培養物を菌体と培
養ろ液に分離し、培養ろ液かり、一般酵素の精製法によ
りヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１を精製すればよい
。すなわち、減圧濃縮、凍結乾燥、透析、硫安分別、限
外ろ過、超遠心分離例えばＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ
−セルロース等のイオン交換体を使用するクロマトグラ
フによる処理、例えばセフアデックス処理等のゲルろ過
、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、アセ
トン等の有機溶媒を使用する溶媒沈でん等の酵素の分離
、精製手段を単独あるいは任意の順序に組み合め、また
反復して用いることによって培養ろ液からヒアルロニダ
ーゼＢＭＰ−８２３１が分離、精製、採取される。次に
この発明の実施例を示す。

実施例 １ でん粉３％、綿美粧１％、グルテンミール１％、乾燥酵
母１％、りん酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム（７水化物）０．１％および消泡剤、アデカノール
（商標、旭電化社製）０．４％の組成の培地を５００の
‘容坂口フラスコ３本にそれぞれ８０の‘ずつ分注し、
１２００○で２０分間滅菌する。

これらの培地にストレプトマィセス・コガネィェンシス
Ｎｏ．８２３１の斜面培養物を１白金耳ずつ接種し、３
０ｑ０で３日間振とう培養する。別に、上記と同じ組成
の培地２０夕を３０と客ジャーフア−メンターに入れ、
１２０００で２０分間滅菌する。これに上言己で得られ
た培養物の全量を接種し３０ｏ○で２独時間培養｛かく
拝３０仇ｐｍ、通気１：１（ＶノＶ）｝する。さらに、
上記と同じ組成の培地１５０そを２００〆容ジャーファ
ーメンタ−に入れ、１２０００で２０分間滅菌する。こ
れに上記で得られた３０ク客ジャーファーメンターの培
養物のうち、５そを接種した後、３０００で３日間培養
｛かく梓３０仇ｐｍ、通気１：１（Ｖ／Ｖ）｝する。培
養終了後、培養物にマナし、藻士をろ過助剤として添加
してろ過し、ろ液を２０夕まで減圧濃縮した後、濃縮液
にアセトンを４０％濃度になるように加えて生成する次
でんをろ去し、ろ液にさらにアセトンを６０％濃度にな
るまで加えて生成する枕でんをろ取する。

この沈でんを少量の水に熔解し、水で１夜透析したのち
ＤＥＡＥ−セルロース（Ｐ，型）を充てんしたカラムに
吸着させる。このカラムを水洗した後、０．２８ Ｍの
塩化ナトリウムを含有する左。Ｍりん酸緩衝液（ＰＨ７
‐０）で目的物質を溶出する。目的物質を含む画分を集
め３００の‘まで減圧濃縮した後セフアデックスＧ−２
５（商標、ファルマシア社製）を充てんしたカラムで脱
塩処理する。処理液をＣＭ−セルロース（Ｎａ＋型）を
充てんしたカラムに吸着させ、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０
）でクラジェント・ェリューション（濃度勾配：０．０
０９Ｍ−０．１Ｍ）を行なう。

目的物質を含む画分を集め３０の‘まで減圧濃縮し、セ
フアデックスＧ−５０（商標、ファルマシア社製）を充
てんしたカラムに通過させて目的物質を含む画分を集め
て凍結乾燥して、粉末状のヒアルロニダーゼＢＭ円−８
２３１２５０の９を得る。この粉末の羊のこう丸より得
られたヒアルロニダーゼ（１．１００ＮＦｕ／の９、シ
グマ社製）との相対活性比を上記測定法１により求めた
結果、この粉末のヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２３１酵
素力価は４０，０００ＮＦｕ／雌であった。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図および第４図はこの発明のヒア
ルロニダーゼＢＭＰ−８２３１のｐＨ活性曲線、ｐＨ安
定曲線、温度活・性曲線をおよび温度安定曲線をそれぞ
れ示す。 第５図および第６図は蛋白分解酵素処理後のヒアルロニ
ダーゼＢＭ『一８２３１の酵素活性曲線およびヒアルロ
ニダーゼ「アマノ」の酵素活性曲線をそれぞれ示す。第
１図 第２図 第３図 第４図 第５図′ 第６図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の生化学的性質を有するヒアルロニダーゼＢＭ
   Ｐ−８２３１（ａ） 作用： エンドβ−ヘキソサミニダーゼ （ｂ） 基質特異性： ヒアルロン酸を分解し、コンドロイチン硫酸Ａ、コンド
   ロイチン硫酸Ｃおよびコンドロイチンを分解せず。 （ｃ） 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨ：ｐＨ４．０附近 安定ｐＨ：ｐＨ４．０〜ｐＨ１１．３ （ｄ） 作用適温の範囲： 至適温度：６０℃附近 （ｅ） 温度安定性 ０〜６０℃で安定〔りん酸緩衝液（ｐＨ７．０）〕（ｆ
   ） 蛋白分解酵素に対する安定性蛋白分解酵素プロナー
   ゼＥ（商標、科研化学株式会社製）の作用によりその酵
   素活性は影響を受けない。 （ｇ） 失活の条件 ・ｐＨ３のクラークーラブス緩衝液中３７℃で１６時間
   放置することにより約３０％失活する。 ・ｐＨ７のりん酸緩衝液中６５℃で３０分間加温するこ
   とにより約３０％失活する。 （ｈ） 分子量 約１０万（測定法：１０％ポリアクリルアミドゲル−Ｓ
   ＤＳ電気泳動法）２ ストレプトマイセス属に属するヒ
   アルロニダーゼＢＭＰ−８２３１生産菌を培地に培養し
   、得られる培養物から、ヒアルロニダーゼＢＭＰ−８２
   ３１を分離、採取することを特徴とするヒアルロニダー
   ゼＢＭＰ−８２３１の製造法。