JPH06507398A

JPH06507398A - Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体

Info

Publication number: JPH06507398A
Application number: JP4510961A
Authority: JP
Inventors: ヒギンズ　ポール　ジェイ; ポッツ　バーバラ　ジェイ
Original assignee: リプリジェン　コーポレーション
Priority date: 1991-05-14
Filing date: 1992-04-29
Publication date: 1994-08-25
Also published as: WO1992020373A1; EP0586505A1; CA2102511A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ＨＩＶ感染治療のための異種複合抗体発明の背景本発明はヒトの免疫不全ウィルス感染の治療に関する。ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体で、一種のレトロウィルスで、１４９２８球及び単球／マクロファージ系のＣＤ４　細胞を含む一定の免疫系細胞に感染する。効果的な治療を行わないとＡＩＤＳ＠者の死亡率はほぼ１００９６である（Ｆｕｃ　ｉ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：６１７．　１９８８）。優に１００を越えるＨＩＶの変種が確認されている。ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０のアミノ酸配列は殊に変化し易い、そのアミノ酸は１つの種から次の種へと２０−２５％も変化することがある。種から種への変化に加えて、逆転写酵素の高いエラー率に起因するゲノム配列におけるさらに微妙な変化もある。誤った組込みをする率は、１転写サイクル当たり、１ゲノムにつき１エラーを導入する程十分に高い。従って、特定のウィルスとして分離されたものは、いずれにせよ、類傭種の一団である。さらに、類似種の多様性と数は、１つのＨＩＶ変種から次へと異なっているようである。これらの類似種はｉｎ　ｖｉ’Ｖｏ　で進化するという十分な証拠がある。例えば、感染した個人から連続的に分離されたウィルスは、多様な類似種の比率に相当な一時的変動のあることを顕示している（Ｍｅｙｅｈａｎｓ、Ｃｅ／／　５８：９０１．　１９８９）、また、中和耐性ＨＩＶ変種はＨＩＶが中和抗体の存在下に生育する時に、ｇｐ１２０をコードするウィルス配列における単一塩基の変化によって生じ得るという証拠もある（Ｒｅｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ。、Ｃｅ／／　５４＋５７．　１９８８）。感染した個人は、最初、ＨＩＶに対して体液性及び細胞性免疫応答を開始する。感染した個人の免疫応答が実際ウィルスの蔓延及びより耐性の高い変種の発生を促すと信じるべき理由がある（ＭｃＣｕｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、ｒｅツノ　６４：３５１．、１９９１）。ヒトＨＩＶ蛋白質に対するヒトモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ形成とＥｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　ウィルスの形質転換によって生成された（Ｂａｎａｐｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ、、１．　／ｍｍｕｎｏ／、　１３９：４０２７．　１９８７；　Ａｍａｄｏｃｉ　ｅｔ　ａｔ、、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　１ｔｙｄ　ＨｕｍＪ／７　Ｒｅｔｒｏｙｉｒｕｓｅｓ　５ニア３．　１９８９）。さらに最近になって、ＣＤ４受容体の一部に融合された細胞毒からなる細胞毒性ハイブリッド蛋白質が、ＨＩＶにコードされている蛋白質を発現している細胞を破壊するための１手段として提唱されている。このアプローチは、ＨＩＶエンベロープ蛋白質、ｇｐ１２０が、１４９２８球及び単球／マクロファージ系のある種の細胞上に存在するＣＤ４受容体を認識するという事実に依存するものである。このようにして、ＣＤ４の可溶性誘導体は表面ｇｐ’１２０を発現しているＨＩＶ感染細胞を標的としてサイトトキシンを向けるために利用できるがもしれない。Ｃｈａｕｄｈａｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　３３５：３６９゜１９８８）は、ＣＤ４−シュードモナス外毒素ハイブリッド蛋白質をＨＩＶに慢性感染しているリンパ球に投与すると全般的蛋白質合成に減少を起こすことを発見した。Ｔｉ１ｌ　ｅｔ　ａｌ、（Ｓｃｉｅｔｙｃｅ　２４２：１１６６、１９８８）は、ＣＤ４−リシンＡ融合蛋白質が、慢性感染のＨ９細胞培養においてＤＮＡ合成を低減することを見いたした。この戦略の変法において、（：ａｐｏｎｅｔ　ａｌ、ＣＮｚ１ｕｒｅ　３３７：５２９．　１９８９）は、可溶性ＣＤ４とある抗体の定常領域から成るハイブリッド蛋白質を立案した。この分子は免疫系応答をｇｐ１２０に向けるために立案されたものである。この一般型の他の分子は、補体を活性化することが示されている（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９ニア８．　１９８９）。２つの共有結合した抗体、あるいは抗体が細胞に、あるいはウィルスに仕向けられた蛋白質に共有結合した抗体から成る異種複合分子が、細胞毒性細胞及び腫瘍細胞やウィルス感染細胞に仕向ける手段として提唱されている。Ｓｅｇａ　１ｅｔ　ａｌ、（米国特許第４，６７６．９８０号）は、架橋異種抗体を免疫系細胞を好ましくない、あるいはを害な細胞に仕向けるために、架橋異種抗体を用いることを提案している。Ｆａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（ＰＣＴ　公開　ＷＯ９１２・００３６０）は、この様な異種複合体をＡＩＤＳの治療に対して提案１７ている。特に、Ｆ　ａ　ｘｉ　ｇ　ｅ　ｒらは、ＣＤ４　（あるいはｇｐ１２０のＣＤ４結合ドメイン）に融合された高親和性Ｆｃγ受容体特異抗体をＡＩＤＳの治療に用いることを提唱１−５ている。Ｆａｎｇｅｒらは、また、抗ｇｐ１．２０抗体のようなＨＩ　Ｖ特異抗体に遊合された高親和性Ｆｅγ受容体特異抗体から成る異種複合体をＡＩＤＳ冶吟に使用することを示唆している。Ｚａｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（ＥＰ公開番号０３０８９．３６）は、ＨＩＶ感染細胞に発現されたＨＩＶ抗原に特異的な抗体で、末梢血液のエフェクター細胞に特異的で、ＨＩＶ感染細胞を殺す能力のある第二抗体に架橋されたものから成る異種複合体抗体について述べている。発明の概要一般に、本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶＭＮあるいはＨＩＶ　ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質の■３ループ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ− ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低下させる。ここで、エフェクター細胞は、第一、第二混合細胞培養においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は、感染後１（月」目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は、第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養は１００−１．　ＯＯＯ単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。好適な態様において、第一細胞培養の逆転写酵素活性は、第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて９［〕％以上減少する。他の好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株に感染さ第１たＣＥＭ−ｓｓｌｉＢ胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２００ｎｇ／’ｍｌの異種複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩ　Ｖ株に感染した当該ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くとも５０％低下させる９゜ここで、第一、第二混合細胞培養において、エフェクター＝細胞は当該ＣＥＭ−ｓＳ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０ＥコＩＩに測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８時間にて添加され。第一、第二細胞培養はＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株の１００−１０００感染単位で感染された。なお別の好適な態様において、異種複合抗体はＨＩＶ＝ＭＮ以外のＨＩ　Ｖ株のＶ３ループに結合する。他の好適な態様において、エフェクター細胞は細胞毒性Ｔリンパ球、好中球、単球／マクロファージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択される。そしてエフェクター細胞表面に存在する抗原はＣＤ３である。もう１つの好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＩＩＩＢに感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０日ｇ／ｍ＋の異種複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶＢ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くとも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養において、エフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位の旧Ｖ−ＩＩＩＢで感染される。なお別の好適な態様において、エフェクター細胞と、ＨＩＶ株の一つ（Ａｌａｂａｍａ、Ｄｕｋｅ６５８７−５、Ｄｕｋｅ６５８７−７、Ｄｕｋｅ７８８７−７、ＳＦ２．　ＷＭＪ　２．及びＩＩＩＢ）に感染したＣＥＭ　ｓｓ細胞を含む３種またはそれ以上の混合培養細胞において、２０日ｇ／ｍｌの異種複合抗体は、各々の混合細胞培養の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞及び同じＨＩＶ株に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一・の混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くとも８０？６低ｒさせる。ここで、第一、第二混合細胞培養においてエフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０！１［１に測定され、異種ｉ（合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１．０００感染単位のＨＩＶ株で感染される。関連する態様において本発明は、共有結合

【また第−及び第二蛋白質を含む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあルイｌ！ＨＩ　Ｖ−ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のｖ３ループ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度１０ｎｇ／口〕ｌの異ｆ！複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低丁させる。ここで、エフェクター細胞は、第一、第二混合細胞培養においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は、感染後１０日［１にＭ１定され、異ｆ！複合抗体及びエフェクター細胞は、第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ−ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ル− プ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩ　Ｖ−ＭＮ感染ＣＩＩＪｆ−ｓｓ細胞を３む第一混合細胞培養において、初期濃度５ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨ［Ｖ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０９６低下させる。ここで、エフェクター細胞は、第一、第二混合細胞培養においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は、第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養は１００− １０００中位のＨＩＶ−ＭＮて感染される。他の関連する態様において本発明は、共有結合（７た第一・及び第一蛋白質を八む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあルＬ”ｌ；ｉＨＩ　Ｖ−ＭＮ変ｍのｇｐ１２０エンベロープ蛋白質〕Ｖ３ループ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩ　Ｖ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期１度１ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓ５細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較し、て少なくとも８０％低下させる。ここで、エフェクター細胞は、第一、第二混合細胞培養においてＣＥｈ４−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は、感染後１０ＥＥ目にＭ１定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は、第一混合細胞培養に感染後１８時間ｊ７て加えられ、第一・、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＸＶ−ＭＮで感染される。関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はアミノ酸配列ＧＰＧＲＡＦに対する抗体を含んでいる。好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓｓｍ胞を含む第一混合細胞培養において、２　（，１ｎ　ｇ／ｍ　ｌの異種複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、細胞きＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ −ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くとも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養において、エフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の′３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感象後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ −ＭＮで感染される。関連する態様において本発明は、共存結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、第一の抗体部分はアミノ酸配列ＩＸＩＧＰＧＲに対する抗体を含んでいる。ここで、Ｘはいかなるアミノ酸でもよい。好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くとも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養においてエフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はアミノ酸配列ＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧ　ＩＷＧＣ５ＧＫＬ　ＩＣに対する抗体を含んでいる。好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くとも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養においてエフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。他の好適な態様において、エフェクター細胞は細胞毒性１９２６球、好中球、単球／マクロファージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択される。そしてエフェクター細胞表面に存在する抗原はＣＤ３である。その他の好適な態様において本発明は、薬理学的に効果的な量の上述の異種複合抗体を含む、薬理学的に許容できる混成物に関する。関連する態様において本発明は、ＨＩＶに感染した患者の治療法に関し、この方法には、上述の薬理学的に許容できる混成物の患者への投与を含む。その他の態様において本発明は、（ａ）細胞表面抗原を発現するエフェクター細胞、及び（ｂ）上述の異種複合抗体を含む、ＨＩＶを標的とするエフェクター細胞に関する。関連する態様において本発明は、ＨＩＶに感染した患者の治療法に関し、この方法には、上述のＨＩＶを標的とするエフェクター細胞の患者への投与を含む。ＭＮ基本型ウィルスは、ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のｖ３ループ領域中、位置ＡＩ　’１７における特定のアミノ酸サブ配列に−Ｒ−に−Ｒ−１−Ｈ−１− Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋにより定義される。（アミノ酸配列は標準的な一文字表記で示す。）ＭＮウィルス変種は、上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と位置Ａ７〜Ａ１、のアミノ酸残基１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒが完全に一致し、残り１２アミノ酸が上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と最低３６％の相同性を有するものである。 “に対する°とは、指示された抗原に結合する抗体を意味する。ｇｐ１２０のＶ３ループは、Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７．１９８５）のｇｌ）１２０番号付けによるアミノ酸３０３〜３３８の３６アミノ酸領域として定義される。本発明の異種複合抗体は非常に効果的である。逆転写酵素アッセイにより示される通り、低濃度においてもウィルス復製をほぼ完全に阻害する。好適な異種複合抗体は、一つ以上の株に効果的なものである。本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載する好適な実施例及び特許請求の範囲から明確である。発明の詳細な説明４、【図面の簡単な説明】図１は、細胞毒性１９２８球存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（黒菱形）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。図２は、細胞毒性１９２８球存在下でのＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（黒菱形）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。図３は、細胞毒性Ｔリンパ球非存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（白丸）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（黒丸）の効果を示したグラフである。細胞毒性１９２６球のみ存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓｌ［胞の逆転写酵素活性（黒三角）；ＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞のみの逆転写酵素活性（白玉角）；及び感染していないＣＥＭ−ｓｓ細胞のみの逆転写酵素活性（黒画角）も併せて示している。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０ μｌ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している（抗体を添加しない場合を除く）。図４は、１μｇ／’ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体存在下での、逆転写酵素活性に対する細胞毒性１９２６球とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の比率の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、ＯＥＭ−ｓｓ細胞に対する細胞毒性リンパ球の関数で示している（　ｌ　ｏ　ｇ　１０スケール）。図５は、ＨＩＶ−ＭＮ（パネルＡ）　、ＨＩＶ−Ａｌａｂａｍａ　（パネルＢ）、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ７８８７−７　（パネルＣ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ６５８７ −５（パネルＤ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ６５８７−７　（パネルＥ）　、ＨＩＶ −Ｉ　Ｉ　ＩＢ（パネルＦ）　、ＨＩＶ−５Ｆ２　（パネルＧ）、及びＨＩＶ− ＷＭＪ２（パネルＨ）に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、細胞毒性１９２６球と０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）及び０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（黒三角）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、感染後の日数の関数で示している。図６は、ＨＩＶ−１１１８感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、複合０ＫＴ３抗体と６Ｃ５抗体の混合物（白丸）及び０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体（黒丸）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。ＡＩＤＳ治療に対する異種複合抗体本発明の分子は、ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェクター細胞表面に存在する抗原に対する第一の抗体を、ＨＩＶ感染細胞の表面に存在するＨＩＶ抗原に対する第二の抗体に結合することにより作製した異種複合抗体である。本発明の異種複合抗体は非常に効力が高い。これらの異種複合抗体は、低濃度でも、ＨＩＶに感染した細胞とエフェクター細胞の混合細胞培養物中のＨＩＶ活性を十分に低下させることができる。最も好適な異種複合抗体は、高い効力と広範囲の反応性の両方を兼ね備えたものである。広範囲の反応性を有する異種複合抗体とは、一つ以上のＨＩＶ株に対して効果的であるものを指す。例えば、広範囲の反応性を有する異種複合抗体は、ＨＩＶ−ＭＮとＨＩＶ−３Ｆ２またはＩＩＶ −ＭＮとＨＩＶ−ＷＭＪ２まりｌ！ＨＩ　Ｖ−ＭＮとＨＩＶ−１１１Ｂｌ：対して効果的である。ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェクター細胞に対する異種複合抗体の一部は、細胞毒性１９２６球、単球／マクロファージ、大型顆粒リンパ球（細胞とＮＫ細胞を含む）及び好中球のような細胞の表面に存在する抗原を認識する。細胞毒性免疫エフェクター細胞に対する抗体はエフェクター細胞表面上の抗原に結合し、細胞溶解活性を誘発することが好ましい。例えば、認識された抗原はＣＤ３受容体またはＣＤ１６　（Ｆｃ）受容体である。細胞溶解活性を誘発するために複数のシグナルを必要とする受容体（例えば、ＣＤ２及びＣＤ２８受容体）に対する抗体はあまり好ましくない。ＨＩＶに感染した細胞表面に存在する抗原に対する異種複合抗体の一部は、（１）ＨＩＶ−１のＭＮ基本型（ＨＩ　Ｖ−ＭＮ）のｇｌ）１２０エンベロープ蛋白質のｖ３ループ配列中のエピトープ、（２）ＨＩＶ−１のＭＮ基本型のウィルス変種のｇｌ）１２０エンベロープ蛋白質のｖ３ループ配列中のエピトープ、（３）アミノ酸５８４〜６１１の間にあるｇｐ４１の一部の中のエピトープを認識することが好ましい。ｇｐ１２０の■３ループは、Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７．１９８５）のｇｌ）１２０番号付けによるアミノ酸３０３〜３３８の３６アミノ酸領域である。ＭＮ基本型ウィルスは、ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質の中のアミノ酸サブ配列に−Ｒ−に−Ｒ−１−Ｈ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋ　（Ａ’　−Ａ’）により定義される。ＭＮウィルス変種は、上述の旧Ｖ−ＭＮ配列と位置Ａ７〜Ａ１１のアミノ酸残基１−Ｇ−Ｐ−Ｇ− Ｒが完全に一致し、残り１２アミノ酸が上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と最低３６％の相同性を有するものである。上述の、ＨＩＶに対する抗体は、非常に効力の高い異種複合抗体を作製するための良い候補である。しかし、作製された異種複合抗体の効力が高くない場合もある。最終的には本発明の異種複合抗体の作製における、ＨＩＶに対する特定の抗体の有用性を評価するには、異種複合抗体を作製するしかない。例えば、）Ｉｔ ■に対する抗体を抗ＣＤ３抗体に共有結合させ、適切なアッセイ法により異種複合抗体の効力を評価するなどである。一度、ＨＩＶに対する特定の抗体の異種複合抗体作製における有用性が示されれば、その抗体を他のエフェクター細胞抗原に対する抗体に共有結合させることにより、他の異種複合抗体を作製するのに使用することができる。上述の通り、最も好適な異種複合抗体は、効力の高さと共に広範囲の反応性を兼ね備えたものである。（１）Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆの配列を有するエピトープ、（２）Ｉ−Ｘ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（ここでＸはいかなるアミノ酸でもよ０）の配列を有するエピトープ、または（３）ｇｐ４１のアミノ酸５８４〜６１１（Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、５ｕｔｙｒｓの番号付けζこよる）部分の中（こあるエピトープ、を認識するＨＩＶに対する抗体は、効力が高く広範囲の反応性を有する異種複合抗体の作製に有用であると思われる。これは、ＨＩＶ−ＭＮのｖ３ループ、ＨＩＶ−ＭＮウィルス変種のｖ３ループ、またはｇｐ４１中のエピトープを認識する抗体を、効力が高く広範囲の反応性を有する異種複合抗体の作製；こ使用することができないことを示すものではない。異種複合抗体の調製にＹ−１用なＨＩＶに対する抗体を作製及びスクリーニング技術、異種複合抗体の調製法、及び異種複合抗体の効力及び反応性の広さの評価法を以下に記載する。広範囲の反応性を有する異種複合抗体を作製するためには、広範囲の１（ＩＭ株を認識する、ＨＩＶに対する抗体（すなわち、株に特異的ではない抗体）を選択するのが効果的である。アミノ酸配列Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ。アミノ酸配列１−Ｘ−［−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（ここでＸはいかなるアミノ酸でもよい）、またはｇｐ４１のアミノ酸５８４〜アミノ酸６１１部分の中にあるエピトープに対する抗体を選択するのも効果的である。これらの抗体は、以下に記載する標準的なエピトープマソビング技術を用いて同定することができる。一般的に、有用な、ＨＩＶに対する抗体の作製及び選択過程には以下が含まれる。（１）ハイブリドーマの作製及び反応性を有する抗体を生産するハイブリドーマの選択、（２）ＨｒＶエンベロープ蛋白質を発現する細胞への結合能を有する抗体を生産するハイブリドーマの選択、（３）選択されたモノクローナル抗体の増幅及び精製、（４）ｇｐ１２０　Ｖ３ループペプチドまたはｇｐ４１由来のペプチドを用いた、抗体の反応性の解析、（５）エピトープマツピング。上述の通り、これらの工程のすべてが必須なわけではない。１〜３の工程を簡略にし、異種複合抗体を調製するのに精製された抗体を使用することができる。なお、この異種複合抗体の効力及び反応性の広さは、以下に記載する逆転写酵素アッセイにより解析することができる。本発明の異種複合抗体を作製するために、精製された、ＨＩＶに対する抗体を、免疫エフェクター細胞に対する抗体に共有結合させる。異種複合抗体の効力及び反応性の範囲は、エフェクター細胞とＨＩＶに感染した細胞の混合細胞培養物中で逆転写酵素アッセイを用いて測定することができる。異種複合抗体は、いかなる架橋法によっても形成することができる。適切な架橋法には、５ＰＤＰＳＳＰＤＰとＳＭＣＣ，及びビオチン−アビジンが含まれる。Ｓｅｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、（米国特許第４，６７６．９８０号）は、多くの架橋技術について記述している。その他の方法として、ハイブリッド−ハイブリドーマを経て２つの特異性を有する抗体を作製することにより（Ｓｕｒｅｓｈ　ｅｔａｌ、、Ａｆｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１２１°２１０．　１９８６）　、または遺伝子工学により抗体を結合することができる。）１１Ｖに対する抗体の調製本発明の異種複合抗体分子の調製に有用な抗体は、以下に記載する通りに作製及びスクリーニングすることができる。ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＭＮのウィルス変種のＶ３ループに対する抗体の調製及び解析も、１９９１年３月６日に出願された米国特許出願第０７／６６５，３０６号（本発明の参考文献に取り入れられている）に記載されている。免疫原の調製異種複合抗体分子の作製に有用な、ＨＩＶに対する抗体の１群は、ＨＩ　Ｖ−ＭＮまたはＨＩ　Ｖ−ＭＮのウィルス変種のｖ３ループ中の配列を認識する。従って、これらの抗体の作製に使用する免疫原には、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、Ｖ３Ｊレープの全体または一部を含むｇｐ１２０またはｇｐ１６０、またはｖ３ループの全体または一部を含む合成ペプチドが含まれる。すべての場合において、Ｖ３／レープ配列はＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＭＮのウィルス変種のものである。Ｖ３）レープに対する抗体の作製に好適な免疫原には、閉鎖的なループ中に形成されるＲＰ７０ペプチドが含まれる（以下に記載）。異種複合抗体分子の作製に有用な、ＨＩＶに対する抗体の他の群は、ｇｐ４１中のアミノ酸５８４〜６１１領域中の配列を認識する。これらの抗体の作製１ご使用する免疫原には、ｇｐ　１６０、ｇｐ４１、Ｖ３ループの全体または一部を含むｇｐ４１のアミノ酸５８４〜６１１の間にある配列、すなわちＱ−Ａ−Ｒ−１ −Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｅ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−に−Ｄ−Ｑ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−１−Ｗ−Ｇ−Ｃ −８−Ｇ−に−Ｌ−１−Ｃ，の全体または一部を含むｇｐ１６０またはｇｐ４１の断片が含まれる。免疫化するペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質は、直鎖状である力）、また鑑よ■３ループ配列末端のシスティン残基の間に形成されるジスルフィド結合Ｉこより閉鎖的なループとなる■３ループを有することもある。免疫されるペプチド力（一つ以上のＶ３ループを存する場合、各ループはジスルフィド結合を介して別々のループを形成することもある。目的の配列を有する合成ペプチドは、自動化ペプチド合成機を用いて合成することができる。無傷の組み換えｇｐ１６０エンベローブポリベブチドは、本発明と同一の譲渡人に譲渡されているＲｕ５ｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許出願第０９１．４８１号（１９８７年８月３１日に出願され、本発明の参考文献に取り入れられている）に記載されている通り、バキュロウィルス発現系を用も）で昆虫細胞中で生産し、精製することができる。免疫原として使用する合成ペプチドまたは蛋白質断片は複合していなくても、または、以下のように、例えば、スクシニルマレイミドメチルシクロへキサニルカルボキシルレー）（ＳＭＣＣ）を複合媒体としてｋｅｙｈｏｌｅ　ＩＬｍｐｅｔヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミンのような免疫原性担体と複合させることもできる（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、）、Ｂ　ｉ　ｏ　ｃｈ　ｅｍ。９２：１４１３．　１９８２）。簡単に記載すると、ジメチルホルムアミド５０μｌに溶解した１ｍｇのＳＭＣＣを５ｍｇの担体（０，１Ｍ　ＮａＰＯ、ｐＨ６，５中１０−２０ｍｇ／ｍ１の濃度）に添加し、室温で０．　５時間インキュベートする。次（１で溶液をセファデクスＧ−２５カラムに通して過剰な未反応ＳＭＣＣを除去し、２ｍｇのペプチドを添加する（１０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１．Ｍ　ＮａＰＣ）４　、ｐＨ８，１ｍＭ　ＥＤＴＡの脱気溶液中に懸濁）。溶液をＮ２　ガスと混合し、４℃で一部インキユベートする。次いで、沈殿物が溶けるまで試料を６Ｍ尿素、０．１ＭＮａＰＯ、ｐＨ７で透析する。次いで試料を、６Ｍ尿素、Ｏ，ＩＭ　ＮａＰ０　で平衡化したＢｉｏＧｅｌ　Ｐ−１０カラムに通す。溶出した蛋白質を回収し、蒸留水で透析する。免疫原に有用な数種のペプチド（ＲＰ１４２．ＲＰ７０．ＲＰ３４２．ＲＰＩｏｏ、ＲＰ１０２．ＲＰ１０８．ＲＰ１２３ｃ、ＲＰ１７４ｃ）の配列を表１（こ示す。この一覧はすべてを網羅しているわけではない。免疫原として使用することができるペプチドの極一部を示したにすぎない。（以下余白）表１：免疫原として有用なペプチドの例ＲＰ１４２　ＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩ　ＩＧ（Ｃ）ＲＰ３４２　１ＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＲＰ７０　１ＮＣＴＲＰＮＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ　１１　ＧＴ　Ｉ　ＲＱＡＨＣＮ　Ｉ　５ＲＰ１００　（ＳＧＧ）ＴＲＫＧ　ＩＨＩＧＰＧＲＡＩＹ　（ＧＧＳＣ）ＲＰ１０２　（ＳＧＧ）ＴＲＫＳ　Ｉ　Ｓ　ＩＧＰＧＲＡＦ　（ＧＧＳＣ）ＲＰ１０８　（ＳＧＧ）ＨＩＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧ　（ＧＧＳＣ）ＲＰ１２３ｃ　（Ｃ）ＨＩＧＰＧＲＡＦ　（Ｃ）ＲＰ１３５（［１１Ｂ）ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ（Ｃ）ＲＰ１７４ｃ　（Ｃ）ＮＮＴＲＫＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ（Ｃ）ＲＰ３３９　（ＲＦ）　ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹ　（Ｃ）注：カッコ内のアミノ酸は、単離ペプチドの天然配列ではないペプチドＲＰ７０．ＲＰ１２３ｃ、ＲＰ１７４ｃは、アミノ酸配列末端に近し１２つのシスティン残基の間に形成されるジスルフィド結合によりル−プを形成することができる。このような結合の形成方法は、Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（５’ｔ’ｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ　２７＋３７８５．１９８８）に記載されている。ペプチドを、定法に従いフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュ７くンド中１；乳化して免疫化用に調製した（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）。）１１Ｖに対する抗体の作製ＨＩＶに対する抗体は、マウスの系（Ｂａ　ｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６．Ａ、ＳＷ、　ＢＩＯ，ＢＲ，またはＢＩＯ，Ａ、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ、、ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ）の腹腔内において、マウス１匹につき１０〜５０μｇの環状化ＲＰ７０　（表１）または組み換えｇｐ１６０を用いて免疫化することにより調製した。免疫原を最初の投与の後２〜４週間の間隔で２〜３回、フロイント不完全アジュバント中に乳化した、または可溶化した形で、マウスに追加投与した。マウスから採血し、免疫原との反応性を有する抗体の有無について血清を調べた。血清学的に強い反応性を示すマウスに追加抗原投与し、その３〜５日後にこれらのマウスのひ臓細胞を、重鎖及び軽鎖イムノグロブリンの両方を分泌することのできないＮ５−１　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＴｌＢ１８）　、５Ｐ２− ０　（Ａ、　Ｔ。Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＣＲＬ８２８７．ＣＲＬ８００６）またはＰ３．Ｘ６３．ＡＣ３゜６５３骨髄腫細飽に、Ｋｏｈ　ｌ　ｅ　ｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に基づいた定法ＣＮ１ｆｕｒｅ　２５６：４９５．１９７５）に従って融合させた（Ｋｅａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ／、１２３：１５４８，１９７９）。融合後６〜２１日後に出現したハイブリドーマの上清について、以下の通りＥＬＩＳＡスクリーニングアンセグアより抗体の生産をスクリーニングした。ＲＰ７０により生産されたハイブリドーマにはＲＰ７０ペプチドを用い、ｇｐ１６０により生産されたハイブリドーマにはｇｐ４１の残基５６７〜６４７のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた。各ウェルにつき最終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌのペプチドを含む５０μｌのＰＢＳ溶液を用いて、９６ウエルＣｏ５ｔａｒ平底マイクロタイタープレートにペプチドをコーティングした。ペプチド溶液を吸引し、ＰＢＳ＋０．５％　ＢＳＡと置換した。インキュベーション後、ウェルを吸引、洗浄し、５０μｍのハイブリドーマ上演を添加した。インキュベーション後、ＰＢＳを用いて細胞を３回洗浄し、適切に希釈したヤギ抗マウス　イムノグロブリン−西洋ワサビパーオキシダーゼ護合体（ＨＲＰ、Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）５０．ｃａｌとともにインキュベートした。ＰＢＳを用いてウェルを再度３回洗浄し、ＨＲＰの基質である１ｍＭ　ＡＢＴＳ　（０，１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ）１４．２中の２，２ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ　（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄに１：１０ＯＯ希釈のＨ２Ｏ２を添加したもの）５０μｍを添加して、結合している抗体を検出した。ＨＲＰ活性は４１０ｎｍの吸収を測定することによりモニターした。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で陽性のハイブリドーマについて、ＨＩＶエンベロープ蛋白質を発現する細胞への結合能を試験することができる。このようなアッセイの一例では、特定のＨＩＶ株のｅｎＶ遺伝子を発現する組み換えワクシニアウィルスをＣＤ４＋ヒトＴ−リンパ腫系、ＣＥＭ−ｓｓ　（ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ｃａｔａｌｏｇ　＃７７６）の細胞に感染させる。ハイブリドーマ上清（または精製抗体）を感染細胞と共にインキュベートし、二次抗体及び蛍光活性化細胞ソータを用いて間接的免疫蛍光により抗体の結合を検出する。対照実験として、ｅｔｙｒ’遺伝子を発現しないこと以外は同一の細胞への結合を測定する。 θ〃ト・を発現する細胞に結合するがｅｎｐ遺伝子を発現しない細胞には結合しない抗体を生産するハイブリドーマについて、さらに解析を行なう。ＨＩＶ株のｅ〃に遺伝子を発現する細胞は、以下に記載する通りに調製することができる。ある場合（抗体の中和において）、シンシチウム形成阻害アッセイにより、ＨＩＶに対する抗体を評価することができる。このアッセイにおいては、ＨＩＶ感染細胞と非感染細胞の混合物にに抗体を添加し、巨大細胞の形成をモニターする。このアッセイの詳細は、１９９１年３月６日に出願された米国特許出願第０７／６６５、’３０６号（本発明の参考文献に取り入れられている）に記載されている。組み換えワクシニアウィルスを用いたＨＩＶ　ｅｎｔｙを発現する細胞の調製ＨＩＶ　ｅｎｙ遺伝子を発現する細胞への結合アッセイには、実際にＨＩＶに感染した細胞よりもむしろ、ＨＩＶ　ｅｎｙ遺伝子を発現するワクシニアウィルスに感染した細胞を使用する。ワクシニアウィルスプロモータにより全ｉＨＩ　Ｖエンベロープ遺伝子を発現することができる組み換えワクシニアウィルスの構築は、ＥＰ　公告番号０　２４３　０２９（本発明の参考文献に取り入れられている）に記載されている。ＨＩＶ　ｅｎｙ遺伝子と、第二のワクシニアウィルスプロモータにより発現される大腸菌の／ｉｃＺ遺伝子、及びそれに隣接してチミジンキナーゼ（丁Ｋ）をコードするワクシニアウィルス配列を有する組み換えベクターｐＳＣ２５を用いて組み換えウィルスを作製した。ＨＩＶ−ＭＮ変種の特異性を有するエンベロープ遺伝子をコードするＤＮＡをている）を除去し、ＨＩＶ−ＭＮ　ｅｎｙ遺伝子由来の相似の３７１１１断片と置換することにより調製した。その結果得られるプラスミドｐｓｃＲ２５０２は、ベロープ遺伝子を有する。上述の１８０アミノ酸の置換の代わりに、ＨＩＶ−ＭＮ　ｇｐ１６０蛋白質の小さめの領域を使用することができる。例えば、いずれがのＨＩＶ株由来の３６他の方法として、全長ＨＩＶ−ＭＮ　ｅｎｙ遺伝子を有する組み換え体を使用することができる。複数のＨＩＶエンベロープを発現する株は、抗体の特異性を評価する上で有用である。無傷のＴＫ遺伝子を有するワクシニアウィルスにあらがじめ感染したＣＶ−１宿主細胞に、組み換えベクターｐｓｃＲ２５０２を感染させた。ＨＩＶエンベロープ遺伝子は、ベクター上のＴＫ配列とウィルスゲノム中のＴＫ配列の間の相同組み換えによりウィルスＤＮＡ中に組み込まれる。ＨＩＶエンベロープ遺伝子を６する組み換え体は、ＴＫ欠損株細胞に感染させ、ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）とＸ−ｇａｌを含む培地上にまくことにより選択した。ＢＵｄＲはＴＫ“ 細胞に対して毒性を示すので、ＴＫ−組み換え体を選択する。Ｘ−ｇａｌは１ｚｃ２遺伝子産物により分解される発色基質であり、ｊｚｃ２遺伝子が発現するとプラークが青（なり、ＨＩＶ−ｅｎｖ遺伝子も併せ持つ組み換えウィルスを同定することができる。抗体の精製及び増幅ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにおいて、ペプチド結合性を有することが示されたハイブリドーマを、限定希釈法によりサブクローニングした。ハイブリドーマ細胞と、免疫化していない同系マウス由来の放射線照射したび臓細胞を混合しくそれぞれ、最終濃度５細胞／ｍ＋と２．５Ｘ１０６細胞／ｍｌ）、混合懸濁液２００μ ＋をマイクロタイターウェルに入れ、各ウェルにつき１個のハイブリドーマ細胞となるようにした。７〜１４日後に出現したサブクローンについて、再度上述のＥＬＩＳＡ法により評価した。代表的な陽性クローンをもう一部サブクローニングした。５種の主要なマウス　イムノグロブリン　アイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＧ１゜１　ｇＧ２Ａ、Ｉ　ｇＧ２Ｂ、Ｉ　ｇＧ３）にそれぞれ対応するヤギ抗マウス−ＨＲＰ調製物を用いたＥＬＩＳＡ法により、抗体のアイソタイプを決定した。ＥＬＩＳＡおよびシンシチウム阻害アッセイで陽性であることが繰り返し確認されたハイブリドーマサブクローンをｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ同系マウスの腹腔内に注入することにより、精製抗体を調製した。注入の２〜３週間後に腹水を回収し、各抗体アイソタイプに応じた方法でモノクローナル抗体を以下に記載する通りに精製した。溶出後、すべてのＩｇＧ抗体は、ＰＢＳに対して透析した。ＩｇＭ抗体は、対応するハイブリドーマ細胞を注入したマウスの腹水を５０％ＮＨ２ＳＯ４沈殿により精製し、次いで沈殿物を４ｘＰＢＳに対して透析した。次いで、透析した抗体を、４ｘＰＢＳであらかじめ平衡化したＵｌ　ｔ　ｒａｇｅ　ＩＡ−６カラム（Ｂ　ｉｏ　ｔ　ｅｃｈｎ　ｉ　ｃｓ、Ｖｆ　Ｉ　１ｅｎｅｕｖｅ−Ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に通した。ＥＬＩＳＡにより抗体を含をする画分を同定した。ＩｇＧ１抗体を含有する腹水は、４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３ＭＮａＣ１，ｐＨ８，９により希釈し、同じＴｒｉｓ−ＮａＣＩ緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティ力ラムに通すことにより単離した。０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ６，０を用いて抗体を溶出した。Ｉ　ｇＧ２抗体を含有する腹水は、２倍量のＰＢＳにより希釈し、ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティカラムに結合させた。次いで、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ３，０によりカラムから溶出した。溶出後、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　２　ＨＣＯ３を添加することにより抗体を迅速に中和した。ＩｇＧ３抗体を含有する腹水は、４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３ＭＮａＣ１，ｐＨ８，９により希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティカラムに適し、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ酢酸により抗体を溶出した。その他の方法として、すべてのＩｇＧサブクラスは、以下の方法により精製することができる。腹水を４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３Ｍ　ＮａＣ１゜ｐＨ８，９により希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティ力ラムに通し、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，１Ｍ酢酸、ｐＨ３，０により溶出する。抗体の特異性の決定以下に記載するアッセイは、ＨＩＶに対する抗体の株特異性を決定し、ＨＩＶに対する抗体により認識されるエピトープをマツプするのに使用することができる。これらのアッセイの一部またはすべては、異種複合抗体を生産するためのＨＩＶに対する抗体を選択するのに使用することができる。上述のＨＩＶ　ｅｎｙ遺伝子を発現する細胞への結合アッセイも、抗体の特異性の評価に使用することができる。Ｖ３に対する抗体により認識されるエピトープは、標準的なＥＬＩＳＡアッセイまたは以下に記載する競合的ＥＬＩＳＡアッセイによりマツプすることができる。ＥＬ　Ｉ　ＳＡアンセイにａｍなペプチドには、（１）多様なＨＩＶ変種由来のｖ３ループ配列（表２）を代表する２４〜２５ｍｅｒの配列、（２）ＭＮ　Ｖ３ルーブチンブ配列（Ｃ）−に−Ｒ−１−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−（Ｃ）に対応する１２ｍｅｒの配列を含み、それぞれ最初のアルギニン（Ｒ）残基からチロシン（Ｙ）残基までの１つのアミノ酸がアラニン残基に置換されているＭＮ置換配列を含む。置換配列においては、天然ではアラニンであるところがグリシンに置換されている。抗体の、ＭＮ配列中に含まれるエピトープ認識は、アラニンが置換されたペプチドに抗体が結合しにくくなることから示される。アラニン置換により結合は阻害される。競合的ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイは、標準的なＥＬＩ　ＳＡアッセイを以下のように修正し０行なった。抗体をプレートにアプライする前に、１０ＭＭ−０，００４５μＭの濃度の、先に列記した試験ペプチドの１つと共に抗体をインキュベートした。抗体と結合する上で、試験ペプチドが固定化免疫原と競合する場合、抗体がプレートにほとんどまたはまったく結合しないことがＥＬＩ　ＳＡにより示される。ｇｐ４１に対する抗体により認識されるエピトープは、ｇｐ４１配列の全体または一部に基づくアラニン置換配列を用いて類似の方法でマツプすることができる。ｇｐ４１の一部に対応する配列を有するペプチドを使用することも可能である。ｖ３ループに対する抗体ＨＩＶ−ＭＮ　ｇｐ１２０のｖ３ループ中の配列を認識し、異種複合抗体の作製に使用することのできる抗体を以下に記載する。ＢＡＬＢ／ＣマウスをＲＰ７０　（表１）免疫原により免疫化して、ハイブリドーマＦ５９及びＦ８３を作製した。Ｆ５９／Ｐ５Ｂ３　（５９，１）及びＦ８３／Ｐ６Ｆ１２　（８３，１）と命名した抗体は、株特異的ではない抗体として同定された。５９．１抗体との結合においてＲＰ７０と競合するアラニン置換ペプチドは、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ配列中にアラニン置換を含まない。同様に、Ｇ −Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ配列を有するペプチドは５９．１抗体との結合においてＲＰ７０と競合することができるが、この配列を有しないペプチド（すなわち、ＲＰＩ２９及びＲＰ１７５）は競合することができない。これらの結果は、５９．１抗体がＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆエピトープを認識することを示唆している。この配列は広範囲にわたるＨＩＶ変種中に存在する。５９．１の株特異性は、上述の技術を用いて解析した。これらのアッセイにより、５９．１がＨＩ　Ｖ−１ｖＩＮＳＨＩＶ−３Ｆ２、旧Ｖ−ＷＭＪ２及び旧Ｖ−１１１ＢのＶ３ループを認識すルコとが示された。ＥＬＩＳＡアッセイにより、８３．１抗体がｌ−Ｘ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒエピトープ（Ｘはいかなるアミノ酸でもよい）を認識することが実証された。８３゜１抗体の株特異性は、上述の技術を用いて解析した。これらのアッセイにより、８３．１がＨＩＶ−ＭＮ、ＨＩＶ−Ａｌａｂａｍａ、ＨＩＶ−８Ｆ２、ＨＩＶ−ＷＭＪ２及びＨＩＶ−Ｄｕｋｅ　７８８７−７のｖ３ループを認識することが示された。このように我々は、多くのＨＩＶ株を認識する抗体２種を同定した。８３．１抗体はｌ−Ｘ−１〜Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒエピトープ（Ｘはいがなるアミノ酸でもよい）を認識する。一方、５９．１はＧＰＧＲＡＦエピトープを認識する。５９．１抗体を用いて、５ｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、（７，Ｉｍｍｕｔｙｏｌｏｚｙ　１４０：８．１９８８）により異種複合抗体を作製した。ｇｐ４１に対する抗体組み換えｇｐ１６０を用いて、根本的には以下に記載する通りにモノクローナル抗体を作製した。ＥＬＩ　ＳＡアッセイにより、これらの抗体の一種、６ｃ５がｇｐ４１の一部分（アミノ酸５８４〜６１１）を認識することが示された。ｇｐ４１のこの部分は、ＨＩＶ株の間で大きく異なることはない。従って、この領域に対する抗体は株特異的ではないと予想される。この抗体を用いて、５ｃｏｔｔｅｔ　ａｌ、（）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｚｙ　１４０：８，１９８８）により異種複合抗体を作製、精製した。０ＫＴ３１５９．１及び０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体以下に記載する実験は、種々のＨＩＶ株に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞（Ａｍｅｒｔｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、ＣＣＬ１１９）に対する２種の異種複合抗体、０ＫＴ３１５９．１及び０ＫＴ３／６Ｃ５の影響を示したものである。０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、０ＫＴ３をＨＩＶ−ＭＮのｇｐ１２０サブユニットのｖ３領域中のエピトープに対する二番目のモノクローナル抗体、５９．１に共有結合により架橋して作製した。０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体は、０ＫＴ３をＨＩＶ−ＭＮのｇｐ４１サブユニットの残基５８４〜６１１　（Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７．１９８５の番号付けによる）中のエピトープに対するモノクローナル抗体、６Ｃ５に共有結合により架橋して作製した。ＣＤ３は、抗原に対するＴ細胞受容体（Ｔ　ＣＲ）と非常に関連性の高い受容体である。ＣＤ３受容体を発現する細胞毒性１９２８球の存在下で感染細胞を培養した場合、本発明の異種複合抗体は、ウィルスの逆転写酵素活性により測定される通り、ウィルスの複製を画期的に減少させる。逆転写酵素活性は、ＨＩＶ活性の感度のよい指標であるため、これらの結果はウィルスに感染した細胞が急激に減少することを示している。異種複合抗体が、Ｔリンパ球を感染細胞に作用させることにより感染細胞の死滅を促進することが、特定の理論に縛られることなく示された。ＣＴＬの作製異種複合抗体の活性の試験に使用するＣＴＬ細胞系（ＩＦ８）は、５ｃｏｔｔｅｔ　ａｌ、（）、Ｉｍｍｕｎｏｊｏｆｙ　１４０：８，１９８８）の方法を修正した方法により調製した。簡単に記載すると、大量の供与体ＰＢＬ培養物を同種異系の、ＥＢＶによりトランスフオームされたリンパ芽球細胞系（ステイミュレータ細胞）と共に２０％　ＦＢＳ　（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）　、ＰＨＡに刺激されたＰＢＬ由来の上清及び１００Ｕ／ｍｌの組み換えインターロイキン２を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地中で７日間インキュベートした。次いで、Ｕ底トレー中で限定希釈する（１細胞／ウエル）ことにより細胞をクローニングした。支持細胞層には放射線照射した自系ＰＢＬとステイミュレータ細胞を使用した。クローンをＣＴＬ活性（ステイミュレータ細胞の溶解により評価した）及びＮＫ活性（Ｋ５６２細胞の溶解：ＣＣＬ　２４３゜Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）についてスクリーニングした。ＣＴＬ活性を示すがＮＫ活性ヲ示さないクローン１Ｆ８を選択した。るウィルス複製の減少か逆転写酵素活性の測定により示された特記しない限り、ＣＥＭ−ｓｓ細胞（９６ウエルプレート中１５，０００細胞／ウエル）は、６４感染単位（ＩＵ）のＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１Ｂに感染させた。感染の１８時間後、エフェクタ細胞（ＩＦ８細胞、４５，０００／ウエル）を種々の濃度の０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体または等量の複合していない抗体と共に感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞に添加した。ＣＴＬを１０％　ＦＢＳ（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ／ＢＲＬ）を含むＲＰＦ、１１　１６４０中で生育させ、新鮮な培地で洗浄した後、抗体を添加した。７８後無細胞培養上清を回収し、ｗｔｔ＋ｅｙｅｔ　ａｌ、（）、Ｖｌｒｏ／、６２：１３９，１９８８）の方法により逆転写酵素活性を測定した。図１及び図２の通り、０．５日ｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（黒菱形）は、ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＩＩＩＢのいずれかに感染したＣＥＭ− ｓｓ細胞中の逆転写酵素活性を事実上除去した。０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（白四角）は、２，０００ｎｇ／ｍｌの場合でさえも逆転写酵素活性に影響を及はさなかった。図３では、別の実験を行ない、ＣＴＬ細胞細胞性存在下丸）では０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体は逆転写酵素活性に影響を及ぼさないことを実証した。同様に、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体非存在下（黒三角）ではＣＴＬはＨＩＶ−１目８感染細胞の逆転写酵素活性に事実上影響を及ぼさなかった。ＣＴＬ細胞細胞性存在下複合していない抗体（白丸）及びＣＴＬのみ（白三角）は感染細胞の逆転写酵素活性に事実上影響を及はさなかった。非感染細胞（黒四角）の逆転写酵素活性は検出されなかった。すべての場合、ＣＴＬ及び／または抗体は、感染の１８時間後に添加した。長時間のウィルス復製及びこれによるウィルスの蔓延が異種複合分子の効力に影響を及はすかどうかを決定するために、抗体及びＣＴＬの添加に先立つＨｒＶ感染時間を変化させた。抗体及びＣＴＬを添加する前に、ＣＥＭ−ｓｓ細胞をＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１Ｂ（６４１Ｕ）と共に６．１８．４８または７２時間インキュベートした。逆転写酵素活性は、感染の７日後に測定した。０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体及びＣＴＬを添加する前に、６．１８または４８時間感染させた場合、逆転写酵素活性を完全に除去するには０．５日ｇ／ｍｌの異種複合抗体で十分であった。同一条件下で、逆転写酵素活性を除去するためには、２，０００ｎｇ／ｍ１以上の０ＫＴ３抗体及び５９．１抗体の複合していない混合物が必要であった。抗体及びＣＴＬを添加する前に、７２時間感染させた場合、逆転写酵素活性を除去するにはｌｎｇ／ｍｌのＯＫＴ’３１５９．１が必要であった。この時点では、逆転写酵素活性を除去するためには、２．ＯＯＯｎｇ５／ｍ１以上の複合していない抗体か必要であった。さらに、抗体の濃度を一定にし、ＣＴＬのＣＥＭ−ｓｓ細胞に対する比率を変化させた実験を行ない、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体のｉｎ　ｖｊｔ’ｒｏにおける効勾を解析した。この実験におい°Ｃは、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体の濃度（１Ｕｇ／ｍｌ）　、ＣＥＭ−ｓ　ｓ細胞の数（１５，０００／ウエル）及びＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１の感染用量（６４，ＩｔＪ）を一定に１２、培長物に添加するＣＴＬの数を変化させた。ＣＴＬ及び／または異種複合抗体は感染の１８時間後に添加Ｌ、感染７日］」に逆転写酵素活性を測定］７た。図４にお（翫て、逆転写酵素活性は、ＣＴＬ　：　ＣＥＭ−ｓ　ｓ比が０１１の場合完全に除去され、ＣＴＬ　：　ＣＥＭ−ｓ　ｓ比か（’１．００６旨のように低い場合でも時部分的に（≧６０９６）除去された。この結果は、ｌ’　Ｉ）　Ｊ’　／’　Ｖθで見られる条件のように標的細胞（ＣＥＭ−ｓ　ｓ　）の数がエフ−フタ−細胞の数よりも非常に多（Ｘ場合にも０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体が効果的であることを実証している。０ＫＴ３．１５９．１は多くのＨＩＶ株に対して効用的である０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体が種々のＨＩ　Ｖ株に対して効果的である力覧否かを試験するために、ＣＥＭ−ｓｓ１！１胞（２４ウェルプレート中１５０．０００７７′ウエル）ｉ：ｘｏｏ〜１０００　１ＵのＨ［Ｖを感染させた。感染時１こｌよ、３倍量のＣＴＬ　（４５０，０００／ウエル）及び’］、ｚｚｇ／ｒｎｌの０ＫＴ３１５９．１異種Ｎ合抗体（またはｌｌＪｇ／ｍｌの単量体抗体）を培養物に添加［、た。培養物は、週に−う回分側し、４〜５［１毎に培養上清を回収して逆転写酵素活性を測定した。抗体は、一度添加した後は追加添加しなかった。このため、培養物を分割することにより抗体濃度及び標的細胞と１フエクター細胞の絶対数は減少する。文■照実験Ｊし７て、ウィルスのみと共にＣＥＭ−ｓｓ細胞を培養【７た。ＨＩ　Ｖ単離物を試験し、それらのＶ３配列を表２に示した。表２：Ｖ３ループ配列Ａｌａｂａｍａ　−ＫＳ−−−−−−−−−−Ｈ−−ＲＤｕｋｅ　６５８７−５　Ｖ−Ｎ　−−−一−−−−−−−Ｈ−−−３Ｆ２　Ｔ−−３−Ｙ−−−−−− −Ｈ−−ＧＷＭＪ２　Ｉ−Ｒ３ＬＳ−−−−−−ｍ＝−Ｒ，−ＲＥ１１　Ｉ　ＢＫＳ　Ｉ　−ＱＲ−一−−−−−Ｖ−Ｉ　ＧＤＵＫＥ　６５８７−７　Ｔ　−− Ｇ　−−−−−−−−−１−Ａ−ＧＤＵＫＥ７８８７−７ＴＳＲＧ−Ｒ−−−− −−ＩＬＡ−Ｅこの表において、−”はぞの位置のアミノ酸がλ４Ｎと同一・であることを示している。保存されたＧＰＧＲＡＦモチーフは下線で示している。図６において、ＨＩＶ単離物がＧＰＧＲＡＦ配列を有する場合はずべて（ＭＮ。Ａｌａｂａｍａ、、Ｄｕｋｅ　６５８７−５、ＩＮＩＢ、ＳＦ２、ＷＭＪ２．それぞれパネルＡＳＢ、、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）　、０ＫＴ３１５９．１　（白四角）は、逆転写酵素活性を抗体またはＣＴＬを添加ｔ、ないＣＥＭＳ８（黒丸）と比較し２て９５９６以上阻害した。ＧＰＧＲＡＩモチーフを有する２種の単離物、ＤＵＫＥ　６５８７−７　（パネルＥ）　、ＤＵＫＥ　７Ｂ８７−７　（パネルＣ）を試験したところ、１つ（ＤＵＫＥ　６５８７−７）は１１．［ｌ害した。０ＫＴ３と５９．１の複合していない混合物（黒三角）は効果を示さなかった。０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体は感染細胞中で逆転写酵素活性を阻害する０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体の、ＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞中の逆転写酵素活性を阻害する能力を試験した。簡単に記載すると、ＣＥＭ−’５ｓ（９６ウエルプレート中１５，０００細胞／つｘル）を６４　１ＵのＨＩＶ−ＩＩＩＢに表出した。１８時間後、ＣＴＬ　（４５，０００細胞／ウエル）及び種々の濃度の０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体を添加した。７日後、上述の通りに逆転写酵素活性を測定した。図６において、０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体（白丸）は０．５ｎｇ／ｍｌのような低濃度でも逆転写酵素活性を事実上除去した。これに対して、０ＫＴ３と６Ｃ５の複合していない混合物は、逆転写酵素活性に対して特に影響を示さながった。０ＫＴ３１５９．１及び０ＫＴ３／６Ｃ５はＣＴＬ存在下で細胞毒性を有する異種複合抗体の細胞毒性活性を試験するために、まず初めに我々は組み換えワクシニアウィルスに感染したＣＶＩ細胞を使用したモデル系中での５Ｉｃｒ放出アツセイを行なった。ＨＩＶ−ＩＩＩＢ　ｅｎｖ遺伝子（ＶＰＥ１６）または旧Ｖ　 −ＭＮ　（ＶＭＮ）ｅｎｙ遺伝子のいずれかを発現する組み換えワクシニアウィルスによりＣＶＩ細胞を感染させた。ＨＩＶ　θｎＶ遺伝子を発現しない組み換えワクシニアウィルス（ｖ　ｓ　Ｃ８）を負の対照として用いた。細胞培養混合物は根本的には逆転写酵素アッセイの場合と同様に準備した。エフェクター細胞としてＩＦ８細胞を使用した。この細胞自体はＣＶ１細胞またはワクシニアウィルスに感染したＣＶＩ細胞に対して細胞毒性を示さない。表３において、１０μｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体は５８％のＶＰＥ１６感染ＣＶＩ細胞及び６２％のＶＭＮ感染ＣＶＩ細胞を溶解した。非感染細胞の溶解は非常に少なかった。１１１量体抗体を添加した場合にも細胞溶解は同じくらい少なかった（データ示さず）。０ＫＴ３１５９．１を使用した場合の溶解率が１００９６ではなく最大６０％なのは、恐らく、ワクシニアウィルスによるＣＶＩ細胞への感染が不完全であったためであろう（ＣＶＩ細胞の限定希釈によるシンシチウム形成アッセイにより、細胞の５０〜６０％がｇｐ１６０を発現することを示した）。ｇｐ１２０のカルボキシル末端のエピトープを認識し、ＨＩＶ　ｅｎｖを発現する（ＦＡＣ３により評価）細胞に結合する２種の抗体、ＩＣ１または７Ｃ６を用いて形成した異種複合抗体は、ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＩＩＩＢ　ｅ／７Ｖ蛋白質のいずれかを発現するワクシニアウィルスに感染した細胞の溶解には相対的に効果的ではなかった。細胞表面結合は、ある所定の抗体が細胞毒性異種複合抗体を作製できるかどうか決定するのに必要だが十分な特性ではないことは明白である。表３：異種複合抗体による細胞溶解０ＫＴ３１５９．１　６　５８　６２０ＫＴ３／７Ｃ６９１７Ｎ、Ｄ。０ＫＴ３／ＩＣ１１１８Ｎ、Ｄ。以下に記載するアッセイは、本発明の異種複合抗体の効力を決定するのに使用するものである。種々のＨＩＶ株を使用することにより、所定の異種複合抗体の反応性の広さも併せて決定することができる。本発明の異種複合抗体の効力を正確に決定するためには、慎重に制御された条件下で、ＨＩＶ感染細胞に対する異種複合抗体の効果を測定することが重要である。好適なアッセイを以下に記載する。１００〜１０００感染単位（ＩＵ）の目的Ｈ夏■株によりＣＥＭ−ｓｓ細胞（２４ウエルマイクロタイタープレート、ウェル容Ｊｉ２ｍｌ中、１５０，０００細胞／ウエル）を感染させる。感染の１８時間後、目的の初期濃度を達成するのに十分な量の異種複合抗体と共に４５０，０００エフエクター細胞を添加する。樟準的な条件下で細胞を培養し、３日毎に分割する。異種複合抗体は追加添加しないため、培養物を分割する度に異種複合抗体濃度は半分になる。異種複合抗体を添加しない以外は全く同一の条件の培養を対照実験とする。感染１０日１に、Ｗｉｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、（）、Ｖｊｒｏ１０！、）’　６２：１３９；１９８８）の方法により、両方の培養物の逆転写酵素活性を測定する。ウィルス生産がピークに達するのに感染後１４０以上要するＨＩＶ株については、逆転写酵素活性を感染１０日後に測定すべきてはない。代わりに、ウィルス生産が最大に近い時点で逆転写酵素活性を測定すべきである。感染単位はＫｉｂｅｒ法により決定する。ウィルスのタイターは保存中に低下するため、ウィルス保存液のタイターは使用直前に測定することが重要である。ウィルス保存液は不完全なウィルス粒子を少なくするよう慎重に調製すべきである。例えば、調製したウィルス保存液の感染の多重度は０．００１が望ましく、細胞は対数増殖するような条件で培養すべきであり、また、ウィルスはウィルス生産が最大の時点（逆転写酵素活性またはｐ２４発現が最大であることで判断する）で回収すべきである。組み換え異種複合抗体モノクローナル抗体は大部分の場合ヒト以外の種の中で生産されるため、ヒトに対して免疫原性を示すことが多い。ヒトの治療において異種複合抗体を効果的に使用するために、抗原結合部分（可変領域）はある種に由来し、構造的安定性及び生物学的機能に関与する部分（一定領域）はヒト抗体に由来するキメラ抗体分子を作製する必要があるかもしれない。可変領域がある種に由来し一定領域が他の種に由来するキメラ抗体の作製法は、当業者に熟知されている。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＣＴ　公開　ＷＯ３６１０１５３３、優先口１９８４年９月３日；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、ＥＰ公開番号０，１７３．４９４、優先臼１９８４年８月２７日参照のこと。その他の方法として、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のみを、望ましい抗原特異性を有するイムノグロブリン由来のＣＤＲ５と置換する方法がＷｉｎｔｅｒ（ＧＢ公開番号２゜１８８．６３８、優先８１９８６年３月２７日）により記載されている。ヒトＦＣ部分を有する抗体を作製することによりマウスモノクローナルをヒトの治療に適合するようにすることもできるＣＭｏｒｒｔｓｏｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２．１９８５）。単一ポリペプチド鎖抗体も、組み換え法により従来の抗体よりも簡便に作製することができる。単一ポリペプチド鎖抗体の作製方法はＬａｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（米国特許第４．９４６，７７８号）により記載されており、これらの方法は異種複合抗体の作製に応用することができる。′このようなハイブリッドモノクローナル抗体の構築、発現及び精製方法は確立している。二重の特異性を有する抗体の作製にクアドローマを使用することができる（Ｒｅａｄｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４，４７４．８９３及び４，７１４．６８１）。使用法本発明の抗体は、静脈注射または筋肉注射のいずれかの経路により非経口的に投与することができる。典型的な治療法は、約１週間〜約６か月間にわたって効果的な量の抗体を投与するものである。患者の疾患を制御するために必要な治療回数は、疾患の重さや進行段階及び患者の特性により各患者ごとに異なる。各治療に必要な総用量は数回に分けても、−回で投与してもよい。ヒトモノクローナル抗体は、単独で投与しても、また、患者の疾患を制御するためにＡＺＴのような他のＨＩＶ治療と連動して投与してもよい。異種複合抗体の薬理学的混成物は目的の投与モードに従って、リポソーム、溶液、懸濁剤及び微粒子などの形状に作製する。ある場合には、異種複合抗体を適切なエフェクター細胞と共に投与することが望ましい（Ｎｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、１ｈｅ　１ａｎｃｅｔ　３３５：３６８゜１９９０）。例えば、ＨＩＶ感染の治療が必要な患者（または適合する提供者）から抹消血液リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を回収し、異種複合抗体と共にインキュベートしてから細胞を再注入する。ある場合、ＰＢＬは培養物中に広がる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｔｙｃｅ　２３３：１３１８，１９８６）ｏＰＢＬはインターロイキン、インターフェロンまたは他のイムノモジュレータと共にインキュベートしてもよい。さらに、細胞は、エフェクター細胞の細胞溶解活性を刺激する受容体特異的抗体（Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｚｙ　１１４：３７０．１９８８）のような分子と共にインキュベートしてもよい。請求の範囲：配列表（２）配列番号：コ（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：　６ＣＢ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号：１の配列：Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　ｃｌｙ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｐｈａ（２）配列番号：２（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：　７（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号：２の配列：１１＠　Ｘａａ工ｌ＠　（ｉｌｙ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ａｒｇ（２）配列番号・３（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２８（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号：３の配列：Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ａｒｇ　ＸＬｍ　Ｌ＠ＬＩ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙ−＾−ｐ　（ｉｎｎ　Ｇｉｎ　Ｌａ■ Ｓ　！ＯｉｓＬ＊ｕ　Ｇｌｙ　Ｘｌ・τｒｐ　Ｇｌｙ　ＣＹ＠　Ｓ＠ｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｌ４Ｌｌ工Ｘ＠Ｃｙｓ（２）配列番号：４（ｉ）配列の特徴。（Ａ）配列の長さ＝１７（Ｂ）配列の型・　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（Ｘｌ）配列番号＝４の配列：Ｌｙｅ（２）配列番号：５（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：　５（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号：５の配列：ＸＬｍ　ＧＬＹ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ（２）配列番号＝６（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝２４（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号二６の配列：Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　入ｒｇ　Ｘｉ・　１１１ｇ　ＸＬｍ　Ｇｌｙ　１ｌｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒ９　ＡＬａ　Ｐｈ・　’pｒＳ　１０　ｉｓ τｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙ＠　Ａｓｎ　！ｌｅ　！ｌｅ　ＧＬｙ　Ｃ１ｍ２゜（２）配列番号ニア（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝１１（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号ニアの配列：Ｘｉｓ　１１Ｌｍ　ＸＬｍ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈａ　Ｔｙｒτ■（２）配列番号：８（ｉ）配列の特？ｊｉ：（Ａ）配列の長さ＝４０（ｘｉ）配列番号：８の配列：！ｉ＠Ａｓｎ　ＣＹ＃　Ｔｈｘ　ｋｇ　Ｐｅａ＾−ｎ？ｙｒ＾−ｎ　ＬＦ　ＪＬｒｇ　ＬＦ　ｈｘｑ　ＸＬｍ　ＢＬｍ　！ｌｅＳ　１０　１ｓＧＩＹ　Ｐｒｏ　ａｌｙ　Ａｒ９　ＡＬａ　Ｐｈ＠Ｔｙｔ　Ｔｈｒ　テｈｒ　Ｌｙ−Ａｓｎ　ＸＬｍ　！ｌｅ　３１ｙ　Ｔｈｒ　Ｘｌ・＾ｒｑ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ＸＬｍ　Ｃｙ−＾ｍＩ′１　工１ｍ　Ｂ＠ｒ３％　４０（２）配列番号；９（ｉ）配列の特徴；（Ａ）配列の長さ：２１（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号：９の配列：Ｓ＠３？　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌ）ｎ　Ｏｌｙ　Ｈ＠Ｍｉ・Ｘｉｓ　ｃｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ＾ｌａ　！ｌ＠Ｓ　１０　１５？ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｏｌｙ　ＳＱＬ　ｃｙｓ（２）配列番号＝ｌＯ（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝２０（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｌ）配列番号＝１０の配列：ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　ｃｘｙ　Ｔｈｒ　Ａｒ９　ＬＹ＠　ＳＱＬ”　ＸＬ拳Ｓ社ＸＬ＠　Ｏｌｙ　ｐｒｏ　０１７　社ｇ＾ｌａ　Ｐｈｓ５　１０　１ｓＧｌｙ　Ｏｌｙ　ａ＠ｒ　Ｃｙｓ（２）配列番号：１１（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝１９（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘ　ｉ）配列番号＝１１の配列：ＳＱＬ　Ｃ：Ｌｙ　Ｏｌｙ　Ｈ１ｓエエ＠　Ｏｌｙ　Ｐｒｏ　Ｏｌｙ　Ａｒｇ＾Ｌａ　Ｐｈ＠Ｔｙｔ＾ｌａ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ（２）配列番号：１２（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０ＣＢ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号：１２の配列：Ｃｙｓ　１ｌｌｓ　Ｘｉｓ　Ｇｌｙ　！’ｒｏＧｌｙ　ｋｇ＾ｌａ　Ｐｈｓ　ＣｙｓＳ　ユ０（２）配列番号；１３（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝２５（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｌ）配列番号＝１３の配列：＾−ｎ　＾−ｎ　ｒｈｒ　＾ｘｑ　Ｌｙｓ　ｌｉ＠ｒ　Ｘｉｓ　Ａｒｇ　工１＠　ｃｔｎ　Ａ１９　ｓｔｙ　ｐｒｏ　Ｇｌｙ　＾ｘｑ　Ａ１■ 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Ｓ　１０　ｉｓＩＹ（２）配列番号：２３（ｉ）配列の特徴・（Ａ）配列の長さ：１７（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｉ）配列番号：２３の配列：Ｔｈｅ　入ｒｇ　ＬＹ＃　Ｇｌｙ　Ｘｌｅ　１ｌｉｓ　Ｘ１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　工↓ｓ　Ｔｙｒ　入Ｌａ　Ｔｈ■ （２）配列番号：２４（ｉ）配列の特ｉｊｉ：（Ａ）配列の長さ＝１７（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　直鎖状（ｘｌ）配列番号：２４の配列・丁ｈｒ　ｓ＠ｒ　＾ｔｑ　Ｏｌｙ　Ｘｌｅ　＾ｒ９　工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｌ：ｏ　ＯＬｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｘｌｅ　Ｉａ＠ｕ　入１ａ　Ｔ■■ Ｓ　１０　ｘｓＧ↓υ （ｌｎ　Ｑｌ／ＬＬｌｄ：））峯穀危ＹＩ班（Ｉｎ　０＋／ＬＬＩ（１：’）峯ａ九）班（ＬＬＩｄり）　峯！Ｉ危）研感染後の日数一◆−十対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）−→−ＣＴＬ十単量体感染後の口数＋　ＣＴ　Ｌ＋異種複合体　図５（１）感染後の日数一心−ＣＴＬ十異［複合体図５（Ｃ）０　２　４　６　８　ｔｏ　１２感染後の日数図５（Ｄ）感染後の１１数 −４−４一対照（ＣＴ　Ｌ、または抗体非仔在「）−１−ＣＴ　Ｌ　＋　ｆｉｔ二体 −Ｏ−ＣＴ　ｉ、十異種複合体図５（Ｅ）感染後の日数一◆−十対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）感染ｉその日数ｍ＝１−　十対照（ＣＴ　Ｌまたは抗、体非存在下）感染後の日数一→−（一対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）−一〇−−ＭＯＮ　０ＫＴ３＋６Ｃ −一◆−−ＨＣ０ＫＴ３／６Ｇ５図６補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１、国際出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ９２１０３６１６２、発明の名称ＨＩＶ感染治療のための異種複合抗体３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国　マサチューセッツ州　ケンブリッジビルディング　７００　ワン　ケンダル　スフウェア名　称　リブリジェン　コーポレーション国　籍　アメリカ合衆国５、補正書の提出年月日１９９３年　７月１４日６、添付書類の目録（１）補正書の写しく翻訳文）　１通く原文第１３頁の翻訳文〉１Ｈｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体存在下での、逆転写酵素活性に対する細胞毒性１９２８球とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の比率の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、ＣＥＭ−ｓｓ細胞に対する細胞毒性リンパ球の関数で示している（１Ｇｇｌｏスケール）。図５　（Ａ）　〜５　（Ｈ）は、ＨＩＶ−ＭＮ　（５Ａ）　、ＨＩＶ−Ａｌ　ａｂａｍａ（５Ｂ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ７８８７−７　（５Ｃ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ６５８７５　（５Ｄ）　、ＨＩ　Ｖ　Ｄｕｋ　ｅ６５８７　７　（５Ｅ）　、ＨＩＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｓ　（５Ｆ）　、ＨＩＶ−３Ｆ２　（５Ｇ）　、及びＨＩＶ−ＷＭＪ２　（５Ｈ）に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、細胞毒性１９２８球と０ＫＴ３１５９゜１異種複合抗体（白四角）及び０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（黒二角）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ）は、感染後の日数の関数で示している。図６は、ＨＩＶ−Ｉ１１８感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、複合０ＫＴ３抗体と６Ｇ５抗体の混合物（白丸）及び０ＫＴ３／６Ｇ５異種複合抗体（黒丸）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎ　ｇ／ｍ　１　）の関数で示している。ＡＩＤＳ治療に対する異種複合抗体本発明の分子は、ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェクター細胞表面に存在する抗原に対する第一の抗体を、ＨＩＶ感染細胞の表面に存在するＨＩＶ抗原に対する第二の抗体に結合することにより作製した異種複合抗体である。く原文第３２頁の翻訳文〉表２：ｖ３ループ配列Ａ　ｌ　ａ　ｂ　ａｍａ　−ＫＳ　−−−−−−−−−−Ｈ−−ＲＤｕｋｅ　６５８７−５　Ｖ−Ｎ　−−−−−−−−−−Ｈ−−−８Ｆ２　”ｒ−−ｓ−ｙ− −−−−一−１（−−ｃＷＭＪ２　Ｖ−Ｒ８ＬＳ−−−−−−−Ｒ−ＲＥｌ　１１　ＢＫＳ　ｌ　−−ＱＲ−−−−−−Ｖ−Ｉ　ＧＤＵＫＥ　６５８７−７　Ｔ −−Ｇ−−−−−−−−１−Ａ−ＧＤＵＫＥ　７８８７−７　ＴＳＲＧ−Ｒ−− −−−−ＩＬＡ−Ｅこの表において、°−１はその位置のアミノ酸がＭＮと同一であることを示している。保存されたＧＰＧＲＡＦモチーフは下線で示している。図５（Ａ）〜５（Ｈ）において、ＨＩＶ単離物がＧＰＧＲＡＦ配列を有する場合はすべて（ＭＮ、Ａ１ａｔ＋ａｍａ、Ｄｕｋｅ　６５８７−５、ＩＩＩＢ、ＳＦ２、ＷＭＪ２　；＋ｔ’Ｌｆｔ’Ｌ図５Ａ、ＢＳＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）　、０ＫＴ３１５９．１（白四角）は、逆転写酵素活性を抗体またはＣＴＬを添加しないＣＥＭ−ｓｓ（黒丸）と比較して９５９６以上阻害した。ＧＰＧＲＡＩモチーフを有する２Ｎの単離物、ＤＵＫＥ　６５８７−７　（図５Ｅ）　、ＤＵＫＥ　７８８７−７　（図５Ｃ）を試験しタトコロ、１つ（ＤＵＫＥ　６５８７−７）　は１ｌＪ１害した。０ＫＴ３と５９．１の複合していない混合物（黒三角）は効果を示さなかった。０ＫＴ３／６Ｇ５異種複合抗体は感染細胞中で逆転写酵素活性を阻害するＯＫＴ　３／６　Ｃ５，ｆｌＦ！複合抗体の、ＨＩＶ−１１１感染ＣＥＦｖ１−ｓｓ細胞中の逆転写酵素活性を阻害する能力を試験した。簡単に記載すると、ＣＥＭ− ｓｓ（９６ウエルプレート中１５，０００細胞／ウエル）を６４　１ＵのＨＩ　Ｖ−１目、に表出１〜た。１８時間後、ＣＴＬ　（４５，０００細胞／ウエル）及び種々の濃度の０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体を添加した。７日後、上述の通りに逆転写酵素活性を測定した。フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０１５／１３　ＺＮＡＣ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶｒＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨｌＶ−ＭＮで感染される。
２．前記第一細胞培養の前記逆転写酵素活性を、前記第二の細胞培養と比較して９０％以上低下させることを特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体。
３．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度１０ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剩にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。
４．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度５ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。
５．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度１ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。
６．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記第二の抗体部分はアミノ酸配列ＧＰＧＲＡＦに対する抗体を含んでいる。
７．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記第二の抗体部分はアミノ酸配列ＩＸＩＧＰＧＲに対する抗体を含んでいる、ここで、Ｘはいかなるアミノ酸でもよい。
８．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低下させることを特徴とする請求項６または７に記載の異種複合抗体、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。
９．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＩＩＩＢ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＩＩＩＢ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低下させることを特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＩＩＩＢで感染される。
１０．前記エフェクター細胞と、Ａｌａｂａｍａ，Ｄｕｋｅ６５８７−５、Ｄｕｋｅ６５８７−７，Ｄｕｋｅ７８８７−７，ＳＦ２，ＷＭＪ２，及びＩＩＩＢからなるＨＩＶ株の一つに感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む３種またはそれ以上の混合培養細胞において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記エフェクター細胞及び同じ前記ＨＩＶ株に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の混合細胞培養の逆転写酸素活性に比べて少くとも８０％低下させることを特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体、ここで、前記第一、第二混合細胞培養において前記エフェクター細胞は前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位の前記ＨＩＶ株で感染される。
１１．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記第二の抗体部分はアミノ酸配列ＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣに対する抗体を含んでいる。
１２．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％低下させることを特徴とする請求項１１に記載の異種複合抗体、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。
１３．前記エフェクター細胞が細胞毒性Ｔリンパ球、好中球、単球／マクロファージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体。
１４．前記エフェクター細胞表面に存在する抗原がＣＤ３であることを特徴とする請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体。
１５．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２００ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも５０％低下させることを特徴とする請求項６または７に記載の累積複合抗体、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株で感染される。
１６．異種複合抗体がＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株のＶ３ループに結合することを特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体。
１７．薬理学的に効果的な量の請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体を含む薬理学的に許容できる混成物。
１８．（ａ）細胞表面抗原を発現するエフェクター細胞と、（ｂ）請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体と、を含むＨＩＶを標的とするエフェクター細胞。