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JP2025526427A - 抗ｒｏｒ１抗体及びその用途 - Google Patents

抗ｒｏｒ１抗体及びその用途

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JP2025526427A JP2025504611A JP2025504611A JP2025526427A JP 2025526427 A JP2025526427 A JP 2025526427A JP 2025504611 A JP2025504611 A JP 2025504611A JP 2025504611 A JP2025504611 A JP 2025504611A JP 2025526427 A JP2025526427 A JP 2025526427A
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ミンヨン ユ
ジウォン キム
ジョンビン キム
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Abstract

本発明は、抗ＲＯＲ１（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、前記核酸を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重／多重特異的抗体、免疫細胞エンゲージング二重／多重特異的抗体、前記抗体又はその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）、前記抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインの抗原結合部位として含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、前記抗体又はその抗原結合断片を含む併用治療用組成物、癌の予防又は治療用組成物、癌の予防又は治療方法に関する。

Description

本発明は、抗ＲＯＲ１（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、前記核酸を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、前記抗体のｓｃＦｖ及び免疫細胞活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む第２結合ドメインで構成されたｓｃＦｖを含む免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）二重特異的又は多重特異的抗体、前記抗体又はその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）、前記抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインの抗原結合部位として含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、前記抗体又はその抗原結合断片、又は前記免疫細胞を含む併用治療用組成物、癌の予防又は治療用組成物、癌の予防又は治療方法に関する。
ＲＯＲ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、細胞活動全般にわたって多様な影響を及ぼす膜電位ＲＴＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ）受容体の代表的なグループである。ＲＯＲファミリーは、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２からなっており、二つのタンパク質のアミノ酸配列類似性は約６０％に達する。ＲＯＲファミリーは、細胞外的にはＩｇ、システインリッチ（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ）及びクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインで構成され、内的にはチロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒリッチ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ－ｒｉｃｈ）及びプロリンリッチ（Ｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ）ドメインで構成されている。
ＲＯＲ１は、胚芽形成過程で発現され、多様な初期細胞活動に影響を及ぼすが、成体組織形成の進行と共に漸進的に発現が減少する。また、ＲＯＲ１は、正常Ｂ細胞成熟過程の中間段階で発現されることもあるが、成熟したＢ及びＴ細胞と単核細胞などでは発現されない。しかし、多様な腫瘍細胞でＲＯＲ１が過剰発現されている事実が知られながら、悪性腫瘍の胎児性遺伝子として見なされている。ＲＯＲ１がＷｎｔ５ａの受容体として作用することによって非標準的Ｗｎｔ信号を活性化させ、癌細胞増殖及び転移をもたらすことが報告されている。これによって、ＲＯＲ１は、抗癌抗体治療剤の代表的なターゲットとして浮び上がり始めた。具体的には、ＲＯＲ１が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に過剰発現されている事実が明らかにされながら、多様な癌腫でのＲＯＲ１過剰発現の有無を確認する研究が活発に進められた（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １９４；１６２５）。結果的に、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）以外の多様な血液癌（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ））のみならず、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び脳癌などの固形癌でもＲＯＲ１過剰発現が確認された。
初期に、ＲＯＲ１が偽キナーゼ（ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ）に分類され、過小評価された面もあったが、上述した各癌腫におけるＲＯＲ１の過剰発現は、癌患者の生存及び癌転移と密接な関連性を有することで知られており、それによる効果的な治療剤開発の必要性が台頭している。国際特許ＷＯ２０１６／１７２７２６ Ａ１は、抗ＲＯＲ１単クローン抗体及びその用途を明示した。これは、ＲＯＲ１特異的な特性を示し、ＲＯＲ１が過剰発現されているＣＬＬ細胞に結合し、ＣＬＬ細胞を死滅させることによって、ＲＯＲ１を選択的に認識する抗体ベースの治療剤開発の潜在性を示唆する。
抗ＲＯＲ１抗体は、それぞれ異なる特性を有しているので、抗原が発現されている癌腫に合わせて多様な抗癌抗体に開発可能であり、ＣＬＬのように再発頻度数が高い癌腫を標的とすることによって、抗癌抗体の未充足需要を満足させることができる（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２２，９５１－９５９）。ＲＯＲ１の癌特異的発現は、単純な癌細胞のみならず、癌幹細胞や幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）でも現れ、これは、腫瘍性転移或いは再発を抑制させるのに役立つ。このように多様な癌関連細胞での発現を考慮すると、既存の抗体をベースにして多様な治療剤への開発可能性が無数にある。
このような技術的背景下で、ＲＯＲ１に特異的な抗体を発掘するだけでなく、特に、患者由来の細胞表面のＲＯＲ１をさらに選択的に認識する抗体を選別し、既存に知られている開発中の治療剤より優れた抗癌効能及び目標精度を有する抗体を確認することによって、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ＲＯＲ １（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）に対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記核酸を含む組換え発現ベクター又は前記組換え発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重／多重特異的抗体又は免疫細胞エンゲージング二重／多重特異的抗体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインの抗原結合部位とし て含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、前記免疫細胞を含む併用治療用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片、前記二重又は多重特異的抗体、前記抗体－薬物接合体、前記キメラ抗原受容体又は前記免疫細胞を含む癌の予防又は治療用組成物、又は癌の予防又は治療方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、癌の予防又は治療のための前記抗体又はその抗原結合断片、前記二重又は多重特異的抗体、前記抗体－薬物接合体、前記キメラ抗原受容体又は前記免疫細胞の用途を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、癌の予防又は治療用薬剤の製造のための前記抗体又はその抗原結合断片、前記二重又は多重特異的抗体、前記抗体－薬物接合体、前記キメラ抗原受容体又は前記免疫細胞の使用を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、次を含むＲＯＲ１（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する：
配列番号１～配列番号１６で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１７～配列番号４１、配列番号１８４及び配列番号１８５で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４２～配列番号６５で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６６～配列番号８６で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号８７～配列番号１０２、配列番号１８６及び配列番号１８７で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０３～配列番号１２１で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
また、本発明は、前記核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
また、本発明は、前記組換え発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
また、本発明は、宿主細胞を培養し、抗体を生成する段階；及び生成された抗体を分離及び精製する段階；を含む、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する。
また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重／多重特異的抗体又は免疫細胞エンゲージング二重／多重特異的抗体を提供する。
また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）を提供する。
また、本発明は、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメイン及び細胞内信号伝逹ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、前記抗体のｓｃＦｖであることを特徴とするキメラ抗原受容体を提供する。
また、本発明は、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞を提供する。
また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片、前記二重又は多重特異的抗体、前記抗体－薬物接合体、前記キメラ抗原受容体又は前記免疫細胞を含む、癌の予防又は治療用組成物を提供する。
また、本発明は、癌の予防又は治療のための前記抗体又はその抗原結合断片、前記二重又は多重特異的抗体、前記抗体－薬物接合体、前記キメラ抗原受容体又は前記免疫細胞の用途を提供する。
また、本発明は、癌の予防又は治療用薬剤の製造のための前記抗体又はその抗原結合断片、前記二重又は多重特異的抗体、前記抗体－薬物接合体、前記キメラ抗原受容体又は前記免疫細胞の使用を提供する。
ＥＬＩＳＡを通じてクローンによってＲＯＲ１結合特性を分析した結果を示した図である。
抗ＲＯＲ１抗体がヒト（ｈｕｍａｎ）ＲＯＲ１とマウス（ｍｏｕｓｅ）ＲＯＲ１に交差結合することを確認した結果を示した図である。
ＥＬＩＳＡを通じて各ドメインに結合する抗ＲＯＲ１抗体クローンを分析した結果を示した図である。
本発明の実施例で使用された各細胞のＲＯＲ１発現度を測定した結果を示した図である。
本発明の実施例で使用された各抗体のＡＭＢ－ＬＣ－０００３Ｔ肺癌患者由来の細胞で発現するＲＯＲ１抗原との結合能分析結果を示した図である。
本発明の実施例で使用された各抗体のＪｅｋｏ－１細胞株で発現するＲＯＲ１抗原との結合能分析結果を示した図である。
本発明の実施例で使用された抗体の細胞内在化分析結果を示した図である。
抗ＲＯＲ１抗体－薬物接合体の構造を示した図である。
本発明の実施例で使用された抗体－薬物接合体の純度分析結果を示した図である。
本発明の実施例で使用された抗体－薬物接合体の抗体分子当たりの薬物分子の平均接合数分析結果を示した図である。
本発明の実施例で使用された抗体－薬物接合体のＲＯＲ１結合に対するＥＬＩＳＡ分析結果を示した図である。
本発明の実施例で使用された抗体－薬物接合体の患者由来の細胞に対する試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）毒性評価結果を示した図である。
本発明の実施例で使用された抗体－薬物接合体の患者由来の細胞に対する試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）毒性評価結果を示した図であって、既存の抗体－薬物接合体に比べて著しく増加した効能を示すことを確認した図である。
別の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
抗ＲＯＲ１抗体
本発明は、一観点において、配列番号１～配列番号１６で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１７～配列番号４１、配列番号１８４及び配列番号１８５で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号４２～配列番号６５で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号６６～配列番号８６で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号８７～配列番号１０２、配列番号１８６及び配列番号１８７で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号１０３～配列番号１２１で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含むＲＯＲ１（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。
本明細書で使用された「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗ＲＯＲ１抗体を意味する。本発明の範囲には、ＲＯＲ１に特異的に結合する完全な抗体形態のみならず、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であって、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。
本明細書で使用される「重鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長の重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で使用される「軽鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長の軽鎖及びその断片を全て意味する。
前記全体の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）を含み、特に、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。重鎖の定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の１番目の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端で一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ－ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと相違する。Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。
Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域のみを有している最小の抗体断片に該当する。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ｓｃＦｖ）は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、又はＣ－末端で直ぐ連結されており、二重鎖Ｆｖのようにダイマーなどの構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いるか（例えば、完全な形態の抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２を得ることができる。）、遺伝子組換え技術を用いて製作することができる。
「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖の可変ドメインと１個の軽鎖の可変ドメインとが結合された二量体である。
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般に、Ｆａｂ’断片のＣ－末端に存在するヒンジ領域のシステインによって共有的に連結された一対のＦａｂ’断片を含む。
「単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む単一ポリペプチド鎖からなる構造体である。ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含むことができる。
一つの実施例において、本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド－結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又は前記各抗体のエピトープ－結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。
前記重鎖の定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）のうちいずれか一つのイソタイプから選ばれ得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖の定常領域は、カッパ又はラムダ型であり得る。
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異を除いては、同一であるものを称する。単一クローン抗体は高度に特異的であるので、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に相違する決定因子（エピトープ）に対して相違する抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体とは対照的に、それぞれの単一クローン抗体は、抗原上の単一決定因子に対して指示される。
「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗体が特異的に結合できるタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、通常、化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴のみならず、特定の電荷特性を有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失するが、後者に対しては消失しない点で区別される。
前記「ヒト化」形態の非ヒト（例：マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の超可変領域からの残基を、目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与体抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域からの残基に代替させたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。
前記「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域及び構造領域を含む抗体を構成するアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されていることを意味する。
重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来するか、特別な抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一であるか、これと相同性である一方で、残りの鎖はさらに他の種から由来するか、さらに他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一であるか、これと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）のみならず、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
本発明で使用された抗体の「可変領域」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分を意味する。ＶＨは重鎖の可変ドメインを意味し、ＶＬは軽鎖の可変ドメインを意味する。
「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは、典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号６６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号６８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号６９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９４の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９６の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１００の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８５の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８６の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、又は
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８５の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域、配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域。
「骨格領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４個のＦＲを有する。
抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１に対する結合親和性は、１０－５Ｍ～１０－１２Ｍの範囲内にある。例えば、抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１に対する結合親和性は、１０－６Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－５Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－６Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－１０Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－５Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－６Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－５Ｍ～１０－９Ｍ、１０－６Ｍ～１０－９Ｍ、１０－７Ｍ～１０－９Ｍ、１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－５Ｍ～１０－８Ｍ、１０－６Ｍ～１０－８Ｍ、１０－７Ｍ～１０－８Ｍ、１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、１０－６Ｍ～１０－７Ｍ又は１０－５Ｍ～１０－６Ｍである。
前記ＲＯＲ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１２２～配列番号１５２、及び配列番号１８８～配列番号１９３で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域を含むことができる。また、前記ＲＯＲ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５３～配列番号１８３、及び配列番号１９４～配列番号１９９で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域を含むことができる。
本発明に係る具体的な実施例において、次を含むことができる：
配列番号１２２の重鎖の可変領域及び配列番号１５３の軽鎖の可変領域；
配列番号１２３の重鎖の可変領域及び配列番号１５４の軽鎖の可変領域；
配列番号１２４の重鎖の可変領域及び配列番号１５５の軽鎖の可変領域；
配列番号１２５の重鎖の可変領域及び配列番号１５６の軽鎖の可変領域；
配列番号１２６の重鎖の可変領域及び配列番号１５７の軽鎖の可変領域；
配列番号１２７の重鎖の可変領域及び配列番号１５８の軽鎖の可変領域；
配列番号１２８の重鎖の可変領域及び配列番号１５９の軽鎖の可変領域；
配列番号１２９の重鎖の可変領域及び配列番号１６０の軽鎖の可変領域；
配列番号１３０の重鎖の可変領域及び配列番号１６１の軽鎖の可変領域；
配列番号１３１の重鎖の可変領域及び配列番号１６２の軽鎖の可変領域；
配列番号１３２の重鎖の可変領域及び配列番号１６３の軽鎖の可変領域；
配列番号１３３の重鎖の可変領域及び配列番号１６４の軽鎖の可変領域；
配列番号１３４の重鎖の可変領域及び配列番号１６５の軽鎖の可変領域；
配列番号１３５の重鎖の可変領域及び配列番号１６６の軽鎖の可変領域；
配列番号１３６の重鎖の可変領域及び配列番号１６７の軽鎖の可変領域；
配列番号１３７の重鎖の可変領域及び配列番号１６８の軽鎖の可変領域；
配列番号１３８の重鎖の可変領域及び配列番号１６９の軽鎖の可変領域；
配列番号１３９の重鎖の可変領域及び配列番号１７０の軽鎖の可変領域；
配列番号１４０の重鎖の可変領域及び配列番号１７１の軽鎖の可変領域；
配列番号１４１の重鎖の可変領域及び配列番号１７２の軽鎖の可変領域；
配列番号１４２の重鎖の可変領域及び配列番号１７３の軽鎖の可変領域；
配列番号１４３の重鎖の可変領域及び配列番号１７４の軽鎖の可変領域；
配列番号１４４の重鎖の可変領域及び配列番号１７５の軽鎖の可変領域；
配列番号１４５の重鎖の可変領域及び配列番号１７６の軽鎖の可変領域；
配列番号１４６の重鎖の可変領域及び配列番号１７７の軽鎖の可変領域；
配列番号１４７の重鎖の可変領域及び配列番号１７８の軽鎖の可変領域；
配列番号１４８の重鎖の可変領域及び配列番号１７９の軽鎖の可変領域；
配列番号１４９の重鎖の可変領域及び配列番号１８０の軽鎖の可変領域；
配列番号１５０の重鎖の可変領域及び配列番号１８１の軽鎖の可変領域；
配列番号１５１の重鎖の可変領域及び配列番号１８２の軽鎖の可変領域；
配列番号１５２の重鎖の可変領域及び配列番号１８３の軽鎖の可変領域；
配列番号１８８の重鎖の可変領域及び配列番号１９４の軽鎖の可変領域；
配列番号１８９の重鎖の可変領域及び配列番号１９５の軽鎖の可変領域；
配列番号１９０の重鎖の可変領域及び配列番号１９６の軽鎖の可変領域；
配列番号１９１の重鎖の可変領域及び配列番号１９７の軽鎖の可変領域；
配列番号１９２の重鎖の可変領域及び配列番号１９８の軽鎖の可変領域；又は
配列番号１９３の重鎖の可変領域及び配列番号１９９の軽鎖の可変領域。
ｓｃＦｖ
ｓｃＦｖは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む単一ポリペプチド鎖からなる構造体であって、抗体断片である。ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含むことができる。
一つの実施例において、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）で、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーを介して連結され得る。配列番号１２２～配列番号１５２、及び配列番号１８８～配列番号１９３で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域は、リンカーを介して配列番号１５３～配列番号１８３、及び配列番号１９４～配列番号１９９で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域と連結され得る。
本発明に係る具体的な実施例において、次を含むことができる：
配列番号１２２の重鎖の可変領域及び配列番号１５３の軽鎖の可変領域；
配列番号１２３の重鎖の可変領域及び配列番号１５４の軽鎖の可変領域；
配列番号１２４の重鎖の可変領域及び配列番号１５５の軽鎖の可変領域；
配列番号１２５の重鎖の可変領域及び配列番号１５６の軽鎖の可変領域；
配列番号１２６の重鎖の可変領域及び配列番号１５７の軽鎖の可変領域；
配列番号１２７の重鎖の可変領域及び配列番号１５８の軽鎖の可変領域；
配列番号１２８の重鎖の可変領域及び配列番号１５９の軽鎖の可変領域；
配列番号１２９の重鎖の可変領域及び配列番号１６０の軽鎖の可変領域；
配列番号１３０の重鎖の可変領域及び配列番号１６１の軽鎖の可変領域；
配列番号１３１の重鎖の可変領域及び配列番号１６２の軽鎖の可変領域；
配列番号１３２の重鎖の可変領域及び配列番号１６３の軽鎖の可変領域；
配列番号１３３の重鎖の可変領域及び配列番号１６４の軽鎖の可変領域；
配列番号１３４の重鎖の可変領域及び配列番号１６５の軽鎖の可変領域；
配列番号１３５の重鎖の可変領域及び配列番号１６６の軽鎖の可変領域；
配列番号１３６の重鎖の可変領域及び配列番号１６７の軽鎖の可変領域；
配列番号１３７の重鎖の可変領域及び配列番号１６８の軽鎖の可変領域；
配列番号１３８の重鎖の可変領域及び配列番号１６９の軽鎖の可変領域；
配列番号１３９の重鎖の可変領域及び配列番号１７０の軽鎖の可変領域；
配列番号１４０の重鎖の可変領域及び配列番号１７１の軽鎖の可変領域；
配列番号１４１の重鎖の可変領域及び配列番号１７２の軽鎖の可変領域；
配列番号１４２の重鎖の可変領域及び配列番号１７３の軽鎖の可変領域；
配列番号１４３の重鎖の可変領域及び配列番号１７４の軽鎖の可変領域；
配列番号１４４の重鎖の可変領域及び配列番号１７５の軽鎖の可変領域；
配列番号１４５の重鎖の可変領域及び配列番号１７６の軽鎖の可変領域；
配列番号１４６の重鎖の可変領域及び配列番号１７７の軽鎖の可変領域；
配列番号１４７の重鎖の可変領域及び配列番号１７８の軽鎖の可変領域；
配列番号１４８の重鎖の可変領域及び配列番号１７９の軽鎖の可変領域；
配列番号１４９の重鎖の可変領域及び配列番号１８０の軽鎖の可変領域；
配列番号１５０の重鎖の可変領域及び配列番号１８１の軽鎖の可変領域；
配列番号１５１の重鎖の可変領域及び配列番号１８２の軽鎖の可変領域；
配列番号１５２の重鎖の可変領域及び配列番号１８３の軽鎖の可変領域；
配列番号１８８の重鎖の可変領域及び配列番号１９４の軽鎖の可変領域；
配列番号１８９の重鎖の可変領域及び配列番号１９５の軽鎖の可変領域；
配列番号１９０の重鎖の可変領域及び配列番号１９６の軽鎖の可変領域；
配列番号１９１の重鎖の可変領域及び配列番号１９７の軽鎖の可変領域；
配列番号１９２の重鎖の可変領域及び配列番号１９８の軽鎖の可変領域；又は
配列番号１９３の重鎖の可変領域及び配列番号１９９の軽鎖の可変領域。
前記リンカーは、ペプチドリンカーであり得、約１０ａａ～２５ａａの長さを有することができる。例えば、前記リンカーには、グリシン及び／又はセリンなどの親水性アミノ酸が含まれ得るが、これに制限されることはない。
具体的には、前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ又は（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含み得るが、前記リンカーは、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であり得る。具体的には、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳを含むことができ、例えば、３回繰り返された配列番号２００のＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得る。
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば、繊維状ファージ粒子の表面上に外被タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速且つ効率的に分類できるという事実にある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を有するポリペプチドを調べるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに使用されてきた。
ファージディスプレイ技術は、特定のリガンド（例：抗原）と結合する新規タンパク質を生成及び選別するための強力な道具を提供した。ファージディスプレイ技術を用いてタンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外被タンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を、遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた一価のファージディスプレイシステムが開発された。一価のファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現され、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現されることによって粒子感染性が維持される。
繊維状ファージ表面上でのペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質での機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発するにおいて重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、数多くの方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法、又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的とする特徴を伴う抗体又は抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。
ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を有する抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べていくつかの利点を有している。このような技術は、動物を使用しなくても、短い時間に多様な配列を有する大きい抗体ライブラリーを生成できるようにする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間を必要とすることができる。また、免疫が全く要求されないので、ファージ抗体ライブラリーは、毒性であるか、抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。また、ファージ抗体ライブラリーを用いて、新規な治療的抗体を生成及び確認することができる。
ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫又は非免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を使用することができる。各種リンパ系組織を用いて、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離できる技術は、治療用新規抗体の分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞での生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーの大きさは、抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞での発現は、抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／定常界面の表面や選別されたＣＤＲ残基での残基を相互に突然変異させることによって改善することができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞で抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。
高親和性抗体分離において、抗体又は抗原結合性タンパク質の多様なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、度々抗原結合に参加することが明らかになった。重鎖上のＣＤＲ３領域は、大きさ、配列及び構造的立体形態面で相当多様であるので、これを用いて多様なライブラリーを製造することができる。
また、各位置において、２０個のアミノ酸を全て用いて可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すると、多様性が大きい変異体抗体配列が生成され、新規な抗体を確認する機会が増加し得る。
本発明の抗体又は抗体断片は、ＲＯＲ１を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗ＲＯＲ１抗体の配列のみならず、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性をさらに改善するために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて構成される。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンは、いずれも正電荷を帯びた残基で；アラニン、グリシン及びセリンは、類似する大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、類似する形状を有することが分かる。よって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、生物学的に機能均等物であると言える。
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列とを最大限対応させるようにアラインし、当業界で通常のアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合、最小９０％の相同性、最も好ましくは、最小９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知となっている。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、ＮＢＣＩなどで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘなどの配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＡＳＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
これに基づいて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体に比べて、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知となった方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、受動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。
本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離し、抗体又はその抗原結合断片を組み換えで生産することができる。
「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドのみならず、糖又は塩基部位が変形した類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする核酸の配列は変形し得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。
前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の分子生物学的手法を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成することができ、核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入することによって追加的にクローニングするか（ＤＮＡの増幅）、又は追加的に発現させる。これに基づいて、本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含む組換え発現ベクターに関する。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターなどを含む。ベクターの成分としては、一般に、次のうち一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上の抗生剤耐性マーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、転写終決配列、抗体をコードする核酸は、プロモーター及び転写終決配列などのように作動的に連結されている。
「作動的に連結」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
原核細胞を宿主とする場合は、転写を進行できる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終決配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用可能であり、転写終決配列として、一般にポリアデニル化配列を有する。
場合によって、ベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されることもある。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などを含む。
前記ベクターは、選択標識として当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。
本発明は、さらに他の観点において、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使用された宿主細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されるものではない。
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｎｓｉｓ）などのバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））などの原核宿主細胞を用いることができる。
但し、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例としては、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０があり得るが、これに制限されるものではない。
本発明は、さらに他の観点において、前記宿主細胞を培養し、抗体を生成する段階；及び生成された抗体を分離及び精製する段階；を含む、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。
前記宿主細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地は、制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知となっているその他の全ての必須補充物が適当な濃度で含まれることもある。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは、当業者にとって明白であろう。
前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果物を、例えば、親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加的なその他の精製技術、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどが使用され得る。
二重又は多重特異的抗体
本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体に関する。
二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、一つ以上のターゲットに結合能又は拮抗能を有する抗体を意味し、２個の互いに異なるターゲットに対する結合能又は拮抗能を有する抗体が結合された形態、又は一つのターゲットに対する結合能を有する抗体と他のターゲットに対する拮抗能を有する物質とが結合されている抗体を意味する。
多重特異的（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、少なくとも３以上の相違する抗原に対して結合特異性を有する抗体を意味する。多重特異的抗体は、三重特異的（Ｔｒｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）以上の抗体、例えば、三重特異的（Ｔｒｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、四重特異的（Ｔｅｔｒａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体又はそれ以上のターゲットを標的とする抗体を含むことができる。
二重特異的又は多重特異的抗体に属する各抗体は、ｓｃＦｖベースの抗体、Ｆａｂベースの抗体及びＩｇＧベースの抗体などに区分することができる。二重特異的又は多重特異的抗体の場合、２個以上の信号を同時に抑制又は増幅できるので、一つの信号を抑制／増幅する場合よりもさらに効果的であり得ると共に、それぞれの信号をそれぞれの信号抑制剤で処理した場合に比べると、低用量投薬が可能であり、同一の時間及び空間での２個以上の信号を抑制／増幅させることができる。
二重特異的又は多重特異的抗体の製造方法は、広く公知となっている。伝統的には、二重特異的抗体の組換え生産は、二つ以上の重鎖が相違する特異性を有するという条件下で二つ以上の免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共同発現をベースにする。
ｓｃＦｖをベースにする二重特異的又は多重特異的抗体の場合、相違するｓｃＦｖのＶＬとＶＨをそれぞれ互いに組み合わせ、混成ｓｃＦｖをヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ）形態で製造することによってダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）を作ることができ、相違するｓｃＦｖを互いに連結することによってタンデム（ｔａｎｄｅｍ）ＳｃＦｖを製造することができ、ＦａｂのＣＨ１とＣＬをそれぞれのｓｃＦｖの末端に発現させることによってヘテロ二量体のミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）を製造することができ、Ｆｃのホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ）ドメインであるＣＨ３ドメインの一部のアミノ酸を置換し、「ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ」形態のヘテロ二量体構造に変更させ、これらの変更されたＣＨ３ドメインを相違するそれぞれのｓｃＦｖ末端に発現させることによって、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ形態のミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を製造することができる。
Ｆａｂをベースにする二重特異的又は多重特異的抗体の場合、特定の抗原に対する個別Ｆａｂ’を二硫化結合又は媒介体を用いて互いに組み合わせることによってヘテロ二量体形態で製造することができ、特定のＦａｂの重鎖又は軽鎖の末端に相違する抗原に対するｓｃＦｖを発現させることによって抗原結合価（ｖａｌｅｎｃｙ）を２個有するか、ＦａｂとｓｃＦｖとの間にヒンジ部位（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を置くことによってホモ二量体形態で４個の抗原結合価を有するように製造することができる。また、Ｆａｂの軽鎖末端と重鎖末端に相違する抗原に対するｓｃＦｖを融合させることによって抗原に対する結合価を３個有する二重標的バイボディー（ｂｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂの軽鎖末端と重鎖末端に相違するｓｃＦｖをそれぞれ融合させることによって抗原に対する結合価を３個有する三重標的バイボディー、相違する３個のＦａｂを化学的に接合させることによって収得することができる。
ＩｇＧをベースにする二重特異的又は多重特異的抗体の場合、トリオンファーマ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）社によってマウスとラットハイブリドーマを再度交雑することによって、ハイブリッドハイブリドーマ、いわゆるクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ）を製造し、二重特異的抗体を生産する方法が知られている。また、軽鎖部分は共有しながら、相違する重鎖に対してＦｃのＣＨ３ホモ二量体ドメインの一部のアミノ酸を変形させることによってヘテロ二量体の形態で製作した、いわゆる「Ｈｏｌｅｓ ａｎｄ Ｋｎｏｂ」形態で二重特異的抗体を製造することができる。ヘテロ二量体形態の二重特異的抗体以外に、相違する２種のｓｃＦｖをＩｇＧの軽鎖と重鎖の可変ドメインの代わりに定常ドメインにそれぞれ融合発現させ、ホモ二量体形態の（ｓｃＦｖ）４－ＩｇＧに製造することができる。また、イムクローン（ＩｍＣｌｏｎｅ）社は、ヒトＶＥＧＦＲ－２に対するキメリック単クローン抗体であるＩＭＣ－１Ｃ１１をベースにして、この抗体の軽鎖アミノ末端にマウス血小板誘導成長因子受容体－アルファ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）に対する単一可変ドメイン（ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）のみを融合させ、二重特異的抗体を製作して報告した。また、タンパク質キナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ、ＰＫＡ）Ｒサブユニットの二量体化及びドッキングドメイン（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ、ＤＤＤ）とＰＫＡのアンカリングドメイン（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を用いた、いわゆる「ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）」方法を通じてＣＤ２０に対する多数の抗原結合価を有する抗体に製作することができる。
非常に多様な組換え抗体フォーマット、例えば、２価以上、３価以上又は４価以上の二重特異的又は多重特異的抗体が開発された。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００１／０７７３４２号、第ＷＯ２００９／０８０２５１号、第ＷＯ２００９／０８０２５２号、第ＷＯ２００９／０８０２５３号、第ＷＯ２００９／０８０２５４号、第ＷＯ２０１０／１１２１９３号、第ＷＯ２０１０／１１５５８９号、第ＷＯ２０１０／１３６１７２号、第ＷＯ２０１０／１４５７９２号、第ＷＯ２０１０／１４５７９３号及び第ＷＯ２０１１／１１７３３０号に記載の２価以上、３価以上又は４価以上の抗体も含む。２価以上、３価以上又は４価以上の抗体は、それぞれ２個以上の結合ドメイン、３個以上の結合ドメイン又は４個以上の結合ドメインが抗体分子に存在することを表示する。
具体的な実施例において、本発明に係る二重又は多重特異的抗体は、前記抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合断片を、具体的にはＩｇＧ完全な抗体又はその断片形態、例えば、単一鎖ＦＶ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２の形態で含むことができる。
また、前記ＲＯＲ１をターゲットとする抗体と異なるターゲットに結合する抗体、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１、及びＭＡＲＣＯで構成された群から選ばれた一つ以上をターゲットとする抗体、具体的にはＩｇＧ完全な抗体又はその断片形態、例えば、単一鎖ＦＶ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２の形態で含むことができる。
本発明に係る二重又は多重特異的抗体を通じて、ＲＯＲ１以外に、他のターゲットによって誘導又は媒介された追加的な結合特異性を確保することができる。
例えば、本発明に係る二重特異的抗体は、ＲＯＲ１と、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１、及びＭＡＲＣＯで構成された群から選ばれた一つ以上とを同時にターゲットとすることができる。
例えば、本発明に係る多重特異的抗体は、ＲＯＲ１と、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１、及びＭＡＲＣＯで構成された群から選ばれた２つ以上とを同時にターゲットとすることができる。
免疫細胞エンゲージング二重特異的又は多重特異的抗体
本発明は、さらに他の観点において、抗体のｓｃＦｖ及び免疫細胞活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む第２結合ドメインで構成されたｓｃＦｖを含む、免疫細胞エンゲージング二重特異的又は多重特異的抗体に関する。
前記免疫細胞エンゲージング二重特異的又は多重特異的抗体を通じて細胞毒性Ｔ細胞と癌ターゲット細胞との間の細胞溶解性シナプスを一時的に誘導し、毒素を放出させる。
一つの実施例において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導殺害細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ）、活性化細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、マクロファージ、腫瘍組織内浸透Ｔ細胞（Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、及び樹状細胞で構成された群から選ばれた一つ以上であり得る。
一つの実施例において、前記免疫細胞活性化抗原は、例えば、次から選択可能であり、これに結合する抗体は、免疫細胞エンゲージャーとしての役割をすることができる：
Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲξ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、又はＣＤ２２６で；
ＮＫ細胞活性化抗原は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ｅ．ｇ．，ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４又は２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、又はＣＤ１６０で；
Ｂ細胞活性化抗原は、ＯＸ４０、ＣＤ４０又はＣＤ７０で；
大食細胞活性化抗原は、ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＴＣＲ（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、ＣＤ４７、ＳＴＩＮＧ、又はＯＸ４０Ｌで；又は
樹状細胞活性化抗原は、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ４７アゴニスト、又はＳＴＩＮＧアゴニストである。
免疫細胞エンゲージャー（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）は、米国特許出願公開第２０１７／０３６８１６９号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入され得る。
具体的には、前記免疫細胞エンゲージング二重特異的又は多重特異的抗体は、直列ｓｃＦｖを含み、次の抗原及び癌細胞上の表面抗原に結合することができる。前記癌細胞上の表面抗原は、本発明に係る抗体が標的とするＲＯＲ１である：
ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲξ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、又はＣＤ２２６；
ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ｅ．ｇ．，ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４又は２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、又はＣＤ１６０；
ＯＸ４０、ＣＤ４０、又はＣＤ７０；
ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＴＣＲ（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、ＣＤ４７、ＳＴＩＮＧ、又はＯＸ４０Ｌ；又は
ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ４７アゴニスト、又はＳＴＩＮＧアゴニスト。
前記免疫細胞エンゲージング二重特異的又は多重特異的抗体は、例えば、ＶＬ（ＲＯＲ１）－ＶＨ（ＲＯＲ１）－ＶＨ（ＣＤ３又はＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＣＤ３又はＣＤ１６Ａ）、ＶＨ（ＲＯＲ１）－ＶＬ（ＲＯＲ１）－ＶＨ（ＣＤ３又はＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＣＤ３又はＣＤ１６Ａ）、ＶＨ（ＣＤ３又はＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＣＤ３又はＣＤ１６Ａ）－ＶＨ（ＲＯＲ１）－ＶＬ（ＲＯＲ１）又はＶＨ（ＣＤ３又はＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＣＤ３又はＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＲＯＲ１）－ＶＨ（ＲＯＲ１）形態の構造を含むことができる。
前記ｓｃＦｖは、例えば、配列番号１２２～配列番号１５２、及び配列番号１８８～配列番号１９３で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域と、配列番号１５３～配列番号１８３、及び配列番号１９４～配列番号１９９で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域とを含み、前記重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域はリンカーで連結され得る。
前記リンカーは、ペプチドリンカーであり得、約１０ａａ～２５ａａの長さを有することができる。例えば、前記リンカーには、グリシン及び／又はセリンなどの親水性アミノ酸が含まれ得る。
前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ又は（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含み得るが、前記リンカーは、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であり得る。具体的には、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳを含むことができ、例えば、３回繰り返された配列番号２００のＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得る。
前記免疫細胞エンゲージング二重特異的又は多重特異的抗体の例示として、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合するブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（Ａｍｇｅｎ）；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭに結合するソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）（Ａｍｇｅｎ）；ＣＤ３及びＣＥＡに結合するＭＥＤＩ ５６５（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、Ａｍｇｅｎ）；及びＣＤ３及びＰＳＭＡに結合するＢＡＹ２０１０１１２（Ｂａｙｅｒ、Ａｍｇｅｎ）を含む。例示的なＤＡＲＴは、ＣＤ３及びＣＤ１２３に結合するＭＧＤ００６（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）；及びＣＤ３及びｇｐＡ３３に結合するＭＧＤ００７（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）を含む。例示的なＴａｎｄＡｂｓは、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合するＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；及びＣＤ３０及びＣＤ１６Ａに結合するＡＦＭ１３（Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を含むことができる。
抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）
本発明は、さらに他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）に関する。
抗体－薬物接合体は、ターゲット癌細胞に抗癌薬物を伝達する前まで抗癌薬物が抗体に安定的に結合されていなければならない。ターゲットに伝達された薬物は、抗体から遊離され、ターゲット細胞の死滅を誘導しなければならない。このためには、薬物が抗体に安定的に結合すると同時に、ターゲット細胞から遊離されるときは、ターゲット細胞の死滅を誘導する十分な細胞毒性を有さなければならない。
一つの実施例において、前記抗体は、リンカーを介して薬物に結合され得る。前記リンカーは、抗ＲＯＲ１抗体と薬物との間を連結する部位であって、細胞内条件下で切断可能な形態、すなわち、細胞内環境で抗体から薬物が放出され得るようにし、抗体の長い半減期を反映して、抗体が全身循環中には安定しており、リンカーと薬物との結合が抗体の安定性及び薬物動態に影響を与えてはならない。
前記リンカーは、例えば、切断性リンカー又は非切断性リンカーを含むことができる。切断性リンカーの場合、ペプチドリンカーのように、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えば、リソソーム又はエンドソームプロテアーゼによって切断され得ると共に、非切断性リンカーの場合、例えば、チオエーテルリンカーにおいては、抗体が細胞内加水分解によって非選択的に分解された後で薬物が放出され得る。
一つの実施例において、前記切断性リンカーは、ペプチドリンカーを含むことができる。前記ペプチドリンカーは、少なくとも２個以上のアミノ酸の長さを有する。例えば、前記切断性リンカーには、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｃｉｔのジペプチド、Ｐｈｅ－Ｌｅｕ又はＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙが含まれ得る。リンカーの例示は、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０１０９５７号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入され得る。
前記抗体－薬物接合体は、標的癌細胞の抗原にＡＤＣの抗体領域が結合することによってＡＤＣ－抗原複合体を形成した後、エンドソーム－リソソーム経路で癌細胞の内部に内包化される。この場合、細胞毒性薬物の細胞内放出は、エンドソーム／リソソームの内部環境によって調節される。
一つの実施例において、前記切断性リンカーは、ｐＨ敏感性であって、特定のｐＨ値で加水分解に敏感であり得る。一般に、ｐＨ敏感性リンカーは、酸性条件下で加水分解され得ることを示す。例えば、リソソームで加水分解され得る酸性不安定リンカー、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ－アコニットアミド（ｃｉｓ－ａｃｏｎｉｔｉｃ ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、ケタールなどであり得る。
他の実施例において、前記リンカーは、還元条件下で切断されることもあり、例えば、二硫化リンカーがこれに該当し得る。ＳＡＴＡ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＰＤＰ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）及びＳＭＰＴ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－ａｌｐｈａ－ｍｅｔｈｙｌ－ａｌｐｈａ－（２－ｐｙｒｉｄｙｌ－ｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）を用いて多様な二硫化結合が形成され得る。このような二硫化リンカーは、細胞内グルタチオンのチオールとの二硫化交換によって分解され得る。
前記薬物及び／又は薬物－リンカーは、抗体のリシンを通じて無作為に接合されるか、二硫化結合鎖を還元したときに露出するシステインを介して接合され得る。場合によって、遺伝工学的に製作されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質に存在するシステインを介してリンカー－薬物が結合され得る。前記遺伝工学的に製作されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質は、例えば、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識され得るアミノ酸モチーフを含むことができる。前記ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端で欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有するか、ペプチド又はタンパク質のカルボキシル（Ｃ）末端にスペーサーユニットの共有結合を通じた付加を有する。
前記ペプチド又はタンパク質は、アミノ酸モチーフと直ぐ共有結合されるか、スペーサーユニットと共有結合されることによってアミノ酸モチーフと連結され得る。前記アミノ酸スペーサーユニットは、１個～２０個のアミノ酸で構成され、そのうち、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）ユニットが好ましい。
前記イソプレノイドトランスフェラーゼは、例えば、ファルネシルプロテイントランスフェラーゼ（ＦＴａｓｅ、ｆａｒｎｅｓｙｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）又はゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ、ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であり得る。また、ＦＴａｓｅ及びＧＧＴａｓｅ Ｉは、上述した化学式１のうちＣＡＡＸモチーフを認識することができ、ＧＧＴａｓｅ ＩＩは、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣ又はＣＸＸモチーフ（ここで、Ｃはシステインで、Ａは脂肪族アミノ酸で、Ｘは、イソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸である。）を認識することができる。
さらに他の実施例において、前記リンカーは、リソソームで多数存在するか、又はいくつかの腫瘍細胞で過剰発現されるβ－グルクロニダーゼ（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）によって認識されて加水分解されるβ－グルクロナイドリンカーを含むことができる。ペプチドリンカーとは異なり、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が大きいので、疎水性の性質が高い薬物との結合時、抗体－薬物複合体の溶解度を増加できるという長所を有する。
これと関連して、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１８２９８４号に開示されたβ－グルクロナイドリンカー、例えば、自己－犠牲基（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）を含むβ－グルクロナイドリンカーを使用することができ、上記の文献は参照として導入される。
場合によって、前記リンカーは、例えば、非切断性リンカーであり得、細胞内での抗体加水分解段階のみを通じて薬物が放出され、例えば、アミノ酸－リンカー－薬物複合体を生産する。このような類型のリンカーは、チオエーテル基又はマレイミドカプロイル基（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）であり得、血液内安定性を維持することができる。
本発明の一実施例によると、抗体の二硫化結合鎖を還元したときに露出するシステインを通じてリンカー－薬物が無作為に結合されるか、又は、配列ＧＧＧＧＧＧＧＣＶＩＭを有する抗体末端結合ペプチドを導入することによってリンカー－薬物が結合され得る。
前記薬物（化学式（１）のＤを含む）は、薬理学的効果を示す製剤であって、抗体に結合可能であり、具体的には、化学療法剤、毒素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は放射性同位元素であり得る。前記化学療法剤は、例えば、細胞毒性製剤又は免疫抑制剤であり得る。具体的には、マイクロチューブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、又はＤＮＡインターカレーターとして機能し得る化学療法剤を含むことができる。また、免疫調節化合物、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤、駆虫剤又はこれらの組み合わせを含むことができる。
このような薬物には、例えば、メイタンシノイド、アウリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦを含む）、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロリド酢酸塩（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、サラミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ぺプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素、及び細菌や動植物由来の毒素で構成された群から選ばれた一つ以上であり得るが、これに限定されるものではない。
場合によって、前記薬物は、リンカー及びリンカー試薬上の求電子性基との共有結合を形成するために反応し得るアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基で構成された群から選ばれた一つ以上の求核基を含むことができる。
本発明に係る具体的な実施例において、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢリンカーを介して、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を薬物、例えば、アウリスタチン（ＭＭＡＥ）と連結したＡＤＣを製作した。このようなＡＤＣは、目的とする細胞毒性を示すことを確認した。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、他の観点において、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメイン及び細胞内信号伝逹ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、前記抗体のｓｃＦｖであることを特徴とするキメラ抗原受容体に関する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的抗原及び当該抗原を発現する細胞に対して免疫反応を誘導できるように設計された合成コンストラクトである。ＣＡＲは、細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメイン及び細胞内信号伝逹ドメインを含む。癌細胞の表面に特異的に発現される癌細胞表面抗原を認識する受容体をコードする遺伝子を免疫細胞に導入し、癌細胞を死滅させることができる。癌細胞で特異的に発現する抗原と結合する受容体を含む免疫細胞を通じて、癌細胞のみを標的として免疫反応を起こし得る。前記ＣＡＲは、本発明に係る抗ＲＯＲ１抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインの抗原認識部位として含む。
１世代ＣＡＲでは、癌細胞で特異的に発現する抗原認識部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメイン及び細胞内信号伝逹ドメインを含み、信号伝逹ドメインとしてＣＤ３ζのみを用いたが、癌に対する治療効果が微々たるものであり、持続時間が短いという問題があった。このような１世代ＣＡＲは、米国登録特許第６，３１９，４９４号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
免疫細胞に対する反応性向上のために補助刺激ドメイン（ＣＤ２８又はＣＤ１３７／４－１ＢＢ）とＣＤ３ζとを結合した２世代ＣＡＲが製造されたが、１世代ＣＡＲに比べて、体内に残存するＣＡＲを含む免疫細胞の数が著しく増加した。２世代ＣＡＲは一つの補助刺激ドメインを用いたのに反して、３世代ＣＡＲでは二つ以上の補助刺激ドメインを用いた。生体内ＣＡＲを含む免疫細胞の拡張及び持続性達成のために、補助刺激ドメインを４－１ＢＢ、ＣＤ２８又はＯＸ４０などと結合させることができる。２世代ＣＡＲは、米国登録特許第７，７４１，４６５号、第７，４４６，１９０号又は第９，２１２，２２９号に具体的に記載されており、３世代ＣＡＲは、米国登録特許第８，８２２，６４７号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
４世代ＣＡＲでは、ＩＬ－１２又はＩＬ－１５などのサイトカインを暗号化する追加遺伝子を含み、サイトカインのＣＡＲベースの免疫タンパク質が追加的に発現できるようにし、５世代ＣＡＲは、免疫細胞強化のためにインターロイキンレセプターチェーン、例えば、ＩＬ－２Ｒβをさらに含む。４世代ＣＡＲは、米国登録特許第１０，３１６，１０２号に記載されており、５世代ＣＡＲは、米国登録特許第１０，３３６，８１０号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
一つの実施例において、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は抗体のｓｃＦｖである。抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むｓｃＦｖにおいて、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーを介して連結され得る。配列番号１２２～配列番号１５２、及び配列番号１８８～配列番号１９３で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域は、リンカーを介して配列番号１５３～配列番号１８３、及び配列番号１９４～配列番号１９９で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域と連結され得る。
前記リンカーは、ペプチドリンカーであり得、約１０ａａ～２５ａａの長さを有することができる。例えば、前記リンカーには、グリシン及び／又はセリンなどの親水性アミノ酸が含まれ得る。
前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ又は（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含み得るが、前記リンカーは、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であり得る。具体的には、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳを含むことができ、例えば、３回繰り返された配列番号２００のＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得る。
前記トランスメンブレンドメインは、天然又は合成供給源から由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合されたタンパク質又はトランスメンブレンタンパク質から由来し得る。前記トランスメンブレンドメインは、Ｔ－細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳのアルファ、ベータ又はゼータ鎖を含むことができる。前記トランスメンブレンドメインを合成する場合、ロイシンとバリンなどの疎水性残基を含むか、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンを含むペプチドを各末端に含むことができる。２個～１０個のアミノ酸の長さである短いオリゴ－又はポリペプチドリンカーがトランスメンブレンドメインとＣＡＲの細胞質信号伝逹ドメインとの間に結合を形成することができる。グリシン－セリンペプチドをリンカーとして用いることができる。
前記信号伝達ドメインは、ＣＡＲが位置した免疫細胞の正常エフェクター機能に対する活性化を誘導することができる。例えば、サイトカインの分泌を通じて、細胞溶解活性化又はヘルパー活性化を誘導することができる。前記信号伝達ドメインは、エフェクター機能信号を形質導入するのに十分な細胞内信号伝逹ドメインの切断された断片を含むことができる。
前記信号伝達ドメインには、抗原受容体の関与後、信号伝達を開始するために協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び共同受容体の細胞質が含まれ得る。
ＴＣＲ単独を通じて生成された信号は、Ｔ細胞の完全な活性化のためには不十分であり、共刺激信号が必要であることも知られている。よって、Ｔ細胞活性化にＴＣＲを通じて抗原依存性一次活性化を開始すること、及び二次又は共刺激信号を提供するように抗原依存性方式で作用することに関与し得る。一次細胞質信号伝逹配列は、刺激性方式又は抑制性方式でＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性方式で作用する一次細胞質信号伝逹配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして公知となった信号伝逹モチーフを含有することができる。一次細胞質信号伝逹配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄを含むことができる。
場合によって、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分及び共刺激信号伝逹領域を含むことができる。共刺激信号伝逹領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を意味する。例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれ得る。ＣＡＲの細胞質信号伝逹部分内の細胞質信号伝逹配列は、２個～１０個のアミノ酸、例えば、グリシン－セリンを含むペプチドリンカーを介して連結され得る。
本発明は、他の観点において、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された免疫細胞に関する。
前記免疫細胞は、免疫を誘導し、目的とする癌治療効果を誘発できるものであって、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導殺害細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ）、活性化細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、マクロファージ、腫瘍組織内浸透Ｔ細胞（Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、及び樹状細胞で構成された群から選ばれ得るが、これに制限されるものではない。
前記抗体以外の抗体は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１、及びＭＡＲＣＯで構成された群から選ばれた一つ以上をターゲットとする抗体又はその抗原結合断片であり得る。
治療用組成物
本発明は、さらに他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含む癌の予防又は治療用組成物に関する。
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＲＯＲ１に対する抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。また、本発明は、本発明に係るＲＯＲ１に対する抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を癌患者に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法であり得る。
「予防」は、本発明に係る組成物の投与で癌の成長を抑制させるか、進行を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」は、癌発展の抑制、腫瘍の軽減又は癌の除去を意味する。
前記癌は、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞リンパ腫、有毛細胞白血病）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、又は急性リンパ性白血病を含む。
前記癌は、例えば、卵巣癌、直腸癌、胃癌、精巣癌、肛門癌、子宮癌、結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌腫、肝癌、肺の非小細胞癌腫、小腸癌、食道癌、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内悪性黒色腫、子宮癌、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺癌、類表皮癌、子宮頸部扁平細胞癌の癌腫、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、膣癌腫、軟部肉腫、尿道癌、外陰部癌腫、陰茎癌、膀胱癌、腎臓癌又は尿管癌、腎盂癌腫、脊椎腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、前記各癌の転移病巣、又は前記癌の組み合わせを含む。
前記癌は、例えば、膠母細胞腫、肺癌、膀胱癌、口腔癌、頭頸部扁平細胞癌、胆嚢癌又は子宮頸部癌であり得る。
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、前記各成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与することができ、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、皮内投与及び直腸内投与などで投与することができる。
経口投与時、タンパク質又はペプチドは消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動し得る任意の装置によって投与され得る。
本発明に係る組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの各要因によって多様であり、普通に熟練した医者であれば、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において、「薬剤学的有効量」という用語は、癌又は自己免疫疾患の予防又は治療に十分な量を意味する。
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位用量の形態で製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造され得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤を追加的に含むことができる。
治療方法
本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、抗体－薬物接合体、キメラ抗原受容体又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含む、癌治療用組成物に関する。
また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、抗体－薬物接合体、キメラ抗原受容体又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を投与する段階を含む癌治療方法に関する。
本発明は、さらに他の観点において、癌の予防又は治療のための前記抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、抗体－薬物接合体、キメラ抗原受容体又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞の用途に関する。
本発明は、さらに他の観点において、癌の予防又は治療用薬剤を製造するための前記抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、抗体－薬物接合体、キメラ抗原受容体又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞の使用に関する。
併用治療
本発明は、免疫細胞及び抗ＲＯＲ１抗体以外の薬物を含む併用治療用組成に関する。
一つの実施例において、前記抗ＲＯＲ１抗体以外の薬物は、化学療法剤又は抗ＲＯＲ１抗体以外の抗体を含むことができる。
前記薬物は、メイタンシノイド、アウリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦを含む）、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トトレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロリド酢酸塩（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバルミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、サラミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ぺプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素及び細菌や動植物由来の毒素で構成された群から選ばれた一つ以上であり得る。
一つの実施例において、前記抗ＲＯＲ１抗体以外の抗体は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１、及びＭＡＲＣＯで構成された群から選ばれた一つ以上をターゲットとする抗体又はその抗原結合断片であり得る。
本発明は、抗体又はその抗原結合断片と、次のように構成された群から選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物に関する。
（ｉ）免疫細胞；
（ｉｉ）抗ＲＯＲ１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖを細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞；及び
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
また、本発明は、前記免疫細胞エンゲージング二重特異的又は多重特異的抗体、及び次で構成された群から選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物に関する：
（ｉ）免疫細胞；
（ｉｉ）抗ＲＯＲ１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖ断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞；及び
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
前記免疫細胞は、免疫治療、例えば、免疫を誘導し、目的とする癌治療効果を誘発できるものであって、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導殺害細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ）、活性化細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、マクロファージ、腫瘍組織内浸透Ｔ細胞（Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、及び樹状細胞で構成された群から選ばれ得るが、これに制限されるものではない。
前記抗ＲＯＲ１抗体以外の抗体は、ＲＯＲ１以外の標的をターゲットとする抗体であって、例えば、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１、又はＭＡＲＣＯに結合する抗体又はその抗原結合断片であり得るが、これに制限されるものではない。
前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）と免疫細胞、例えば、Ｔ細胞とが出合う部位でＴ細胞抑制信号を遮断し、Ｔ細胞活性化を誘導できる製剤を意味する。前記免疫チェックポイント抑制剤は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、又はＣＤ２００Ｒをターゲットとする薬物であり得るが、これに制限されるものではない。
前記併用投与対象である第１成分及び第２成分のそれぞれは、同時に投与され得る。また、前記併用投与対象である第１成分及び第２成分のそれぞれは、一定の時間間隔を置いて別途に投与することもできる。前記併用投与対象のうち第１成分の投与前後に、第２成分が別途に投与され得る。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１：ファージライブラリー（Ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ、ｓｃＦｖ）の準備
既存に製作されたヒト由来の合成ｓｃＦｖライブラリー遺伝子を有するファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターをファージ（ｐｈａｇｅ）形態で回収するために、６個の下位ライブラリー（（１）Ｂａｉ，Ｘｕｅｌｉａｎ ＆ Ｋｉｍ，Ｊｉｈｙｅ ＆ Ｋａｎｇ，Ｓｅｕｎｇｍｉｎ ＆ Ｋｉｍ，Ｗａｎｋｙｕ ＆ Ｓｈｉｍ，Ｈｙｕｎｂｏ．（２０１５）。Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｕｍａｎ ｓｃＦｖ Ｌｉｂｒａｒｙ ｗｉｔｈ Ｎｏｎ－Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣＤＲ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ．１０．ｅ０１４１０４５．１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４１０４５．，（２）Ｙａｎｇ，Ｈｙｅ ＆ Ｋａｎｇ，Ｋｙｕｎｇ ＆ ＴＣＷ，Ｊｕｌｉａ ＆ Ｓｈｉｍ，Ｈｙｕｎｂｏ．（２００９）。Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｓｃＦｖ ｌｉｂｒａｒｙ ｗｉｔｈ ｓｉｘ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ ＣＤＲｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ．２７．２２５－３５．１０．１００７／ｓ１００５９－００９－００２８－９。）サンプルを各４００ｍｌの培養培地（ＳＢ／アンピシリン／２％のグルコース）で２時間にわたって培養した。Ｏ．Ｄ６００での吸光度が０．５～０．７になると、５０００ｇで２０分間遠心分離し、上清液を除去した後、４００ｍｌの２次培養培地（ＳＢ／アンピシリン）内に１０１２ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）のヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）（ＶＣＳＭ１３）を添加し、１時間にわたって再培養した。その後、カナマイシン抗生剤（ヘルパーファージ内に導入された抗生剤遺伝子）を７０μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、３０℃及び２５０ｒｐｍで１６時間にわたって振盪培養し、ファージライブラリーが宿主細胞外に生産され得るようにした。その後、培養物を遠心分離させた上清液にＰＥＧ８０００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ８０００）とＮａＣｌを添加し、４℃で２時間にわたって撹拌しながら組換えファージを沈澱させた。１００００ｇ及び４℃で３０分間遠心分離し、沈澱されたペレットにＰＢＳを添加して懸濁した後、１５０００ｇ及び４℃で３０分間遠心分離し、沈澱されたファージペレットにＰＢＳを添加し、ファージライブラリーを回収した。増幅された下位ライブラリーの濃度は、回収されたファージを希釈した後でＴＧ１細胞に感染させ、ＬＢ／アンピシリン固体培養培地に培養することによって発生するコロニーの数として計算した。
実施例２：バイオパンニングを用いた抗ＲＯＲ１特異的抗体（ｓｃＦｖ）の選別
ＲＯＲ１に特異的に結合するヒト抗体を選別するためのパンニングを実施した。ＲＯＲ１－Ｆｃ、ＲＯＲ１－Ｈｉｓタンパク質及び患者由来の細胞を用いて、次のようにバイオパンニングを行った。組換え抗原としては、ヒトＲＯＲ１ Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、９４９０－ＲＯ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＦ）とヒトＲＯＲ１ Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１３９６８－Ｈ０８Ｈ、ＲＯＲ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｕｍａｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＥＣＤ、Ｈｉｓ Ｔａｇ））を使用しており、患者由来の細胞としては、ＡｉｍｅｄＢｉｏで保有しているＲＯＲ１が過剰発現されるＬＣ－０７４Ｔを使用した。
抗原固定バイオパンニング：５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの濃度のヒトＲＯＲ１ Ｆｃタンパク質とネガティブＦｃタンパク質を９６ウェルプレートに４℃で１６時間にわたってコーティングし、３％の脱脂粉乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を用いてブロッキングした。プレートを空にした後、ライブラリーを（約２．０×１０１３ｐｆｕ）ネガティブＦｃタンパク質がコーティングされているプレートに入れ、常温で３０分間反応させた。これは、抗体ファージライブラリーでｈｕｍａｎ ＲＯＲ１を除いた他のタンパク質に結合する各ファージを除去し、ＲＯＲ１以外の非特異的な結合を防止する段階である。ネガティブＦｃタンパク質に非結合された各ファージを回収し、ヒトＲＯＲ１ Ｆｃがコーティングされたプレートに１時間にわたって結合させた。ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）溶液を用いて５回～９回洗浄し、非特異的な結合を除去した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１０２８、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ２．０）を用いてヒトＲＯＲ１に特異的なファージ抗体を回収した。これを合計３回目まで行い、抗原固定バイオパンニング結果を表１に示した。
ビーズベースのバイオパンニング：ビオチン化された（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ヒトＲＯＲ１タンパク質にマグネチックビーズを付着し、ビーズパンニングを反復して実施した。ストレプトアビジンが結合されたマグネチックビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１２０６Ｄ、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を使用しており、ビオチニレーションキット（ａｂｃａｍ、ａｂ２０１７９５、Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｆａｓｔ、Ｔｙｐｅ Ａ）－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ（登録商標））を用いてヒトＲＯＲ１タンパク質をビオチン化させた。ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズ１００μｌをマグネチックビーズセパレーター（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ ｓｅｐａｒａｔｏｒ）を用いてＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）溶液とＰＢＳ溶液で洗浄した後、ビオチン化された５０ｎＭ～１００ｎＭのヒトＲＯＲ１タンパク質を常温で３０分間反応させた。その後、ライブラリーを約１．０×１０１３ｐｆｕのレベルになるように取り合わせた後、３％の脱脂粉乳を用いてブロッキングした。ブロッキングされたライブラリーと予め反応されたビオチン化ヒトＲＯＲ１－ビーズ接合体とを混合し、２時間にわたって常温で反応させた。その後、ヒトＲＯＲ１ビーズと結合されたライブラリーをマグネチックビーズセパレーターを用いて回収し、ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－０．１％のＴｗｅｅｎ ２０）溶液とＰＢＳ溶液で７回～１２回洗浄した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１０２８、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ２．０）を用いてビオチン化ヒトＲＯＲ１－ビーズに結合されたファージ抗体を溶出した。これを合計３回目まで行い、ビーズベースのバイオパンニング結果を表２に示した。
患者由来の細胞を用いたバイオパンニング：抗原固定バイオパンニングとビーズベースのバイオパンニングで得られたファージ抗体をＪｕｒｋａｔ細胞に処理し、４℃で１時間にわたって結合させ、ＲＯＲ１過剰発現患者由来の細胞には結合しない上清液を回収した。これは、ファージ抗体でＲＯＲ１を除いた他の細胞膜タンパク質に結合する各ファージを除去し、ＲＯＲ１以外の非特異的な結合を防止する段階である。回収した上清液をＲＯＲ１患者由来の細胞であるＬＣ－０７４Ｔ（１．５Ｘ１０＾６）に処理し、４℃で１時間にわたって結合させた。その後、患者由来の細胞に結合していない各ファージを除去するために１５ｍｌのチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に移した後、１，０００ｇで３分間遠心分離させることによって細胞を分離させた後、冷たいＰＢＳを３ｍｌ入れ、洗浄過程を３回～５回行った。その後、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１０２８、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ２．０）を用いて氷上に１０分間置き、細胞表面にある各ファージを細胞表面から分離させた。その後、１，０００ｇで３分間遠心分離させ、細胞に５０μｌの溶解緩衝液を入れた後、氷上に１０分間置くことによって細胞を溶解させた。１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離させ、細胞残屑を分離し、細胞内にある各ファージ粒子がある上清液と細胞表面から分離させた各ファージを、予め育てておいたＴＧ１が入っている培養培地（ＳＢ）に入れ、３７℃及び１２０ｒｐｍで１時間にわたって培養することによって各ファージ粒子をＴＧ１細胞に感染させた。その後、各細胞をＬＢ／アンピシリン固体培地に塗抹し、残った溶液は、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させ、沈んだＴＧ１を１５ｃｍのＬＢ／アンピシリン固体培地に塗抹して培養した後、５ｍｌのＳＢ培養培地（５０％のグリセロール）を添加することによって各コロニーを回収及び保管（－８０℃）した。続いて、パンニングを反復して行うために、保管された前回のファージ溶液のうち５０μｌを採取し、ファージ粒子の増幅作業を行った。培養後、ヘルパーファージを添加し、回収された各ファージ粒子は、ＰＥＧ沈澱を通じて分離し、これを次回のパンニング時にも同一に使用した。これを合計２回目まで行い、患者由来の細胞を用いたバイオパンニング結果を表３に示した。患者由来の細胞で得られたファージ抗体のパンニングを組換えタンパク質として用いて３回目行い、この結果を表４に示した。回を重ねるごとに、パンニング前に比べてパンニング後のファージ粒子の比率が増加することを確認した。
実施例３：抗ＲＯＲ１特異的抗体（ｓｃＦｖ）の親和度ＥＬＩＳＡスクリーニング及び配列分析
最終回のパンニングを通じて回収されたファージからＲＯＲ１に特異的に結合する単一クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を選別するために、ｓｃＦｖスクリーニングを行った。最終回のパンニングの各コロニーを採取し、２００μｌのＳＢ／アンピシリン培養培地が入った９６ウェルプレートに接種した後、３７℃で２時間～３時間にわたって培養した。その後、ｓｃＦｖ－ｐIIIタンパク質発現の誘導のために各ウェルに最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理し、３０℃で一晩培養した。培養したプレートは、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって上清液を除去した後、ファージ粒子を回収するために各ウェル当たり４０μｌのＴＥＳ（５０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のスクロース、ｐＨ８．０）溶液を入れ、常温で３０分間細胞を溶解させた。その後、６０μｌの０．２Ｘ ＴＥＳ溶液を処理し、４℃で２時間置いてから細胞を分解させた後、プレートを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離させることによって上清液を回収した。
ヒトＲＯＲ１、マウスＲＯＲ１、ネガティブＦｃタンパク質がコーティングされた９６ウェルプレートの各ウェルに上清液を添加した後、２時間にわたって常温で結合させ、ＰＢＳＴと蒸留水を用いて４回洗浄した。その後、ＨＡタグに結合できるＨＲＰが結合された抗ＨＡ抗体を用いて１時間にわたって常温で結合させた後、再びＰＢＳＴと蒸留水を用いて６回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２９、１－ＳｔｅｐＴＭ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて発色した後、停止液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＳ０４、ＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で発色反応を停止し、Ｏ．Ｄ ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡを通じてヒトＲＯＲ１又はマウスＲＯＲ１に結合する３０個の抗体クローンを選別し、前記各抗体のＣＤＲ配列を表５に示し、重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を表６に示した。
実施例４：抗ＲＯＲ１特異的抗体（ｓｃＦｖ）の結合ドメイン分析
上述した選別された３０個の抗体クローンのｓｃＦｖを用いてドメインを分析するために、ＥＬＩＳＡを行った。前記結合ドメイン分析のための抗原でドメインを発現できる発現ベクターを製作し、タンパク質を発現及び精製した。製造のために、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ０１９７３で表されるＲＯＲ１アミノ酸配列の１番～５４２番又は配列１６５番～３９５番のアミノ酸に相当する残基を用いた。ＲＯＲ１の細胞外ドメインをコードする遺伝子ブロックを製作した。遺伝子の３’末端はＨｉｓタグに接合させた。前記遺伝子をｐｃＤＮＡ３．３ベクターに導入し、ベクターを確保した。トランスフェクト（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてタンパク質を発現及び精製した。８％のＣＯ２、３７℃及び１３０ｒｐｍで５日間培養した後、細胞培養上清液からタンパク質を精製した。培養液をカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－５４３８－０１、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ ＳｕＲｅ）に通過させ、発現された抗体をカラムに結合させた。その後、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１０２８、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ２．０）溶液で溶出させた後、溶出された抗体分画は、アミコンウルトラ３０ｋＤａチューブ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０３０２４、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液を交換しながら濃縮を行った。精製されたドメインは、２８０ｎｍの波長での吸光度と吸光係数を用いて定量した。
ヒトＲＯＲ１の免疫グロブリン－ドメイン（Ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＯ１－Ｈ５２２１、Ｈｕｍａｎ／Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ／Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ＲＯＲ１（３９－１５１、Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ヒトＲＯＲ１のフリズルドドメイン（ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｄｏｍａｉｎ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＯ１－Ｈ５２２２、Ｈｕｍａｎ／Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ／Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ＲＯＲ１（１６５－３０５、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｄｏｍａｉｎ）Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ヒトＲＯＲ１のクリングルドメイン（ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｋｒｉｇｌｅ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＯ１－Ｈ５２２３、Ｈｕｍａｎ／Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ／Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ＲＯＲ１（３０８－３９５、Ｋｒｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ヒトＲＯＲ１の免疫グロブリン及びフリズルドドメイン（ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｄｏｍａｉｎ）、ヒトＲＯＲ１のフリズルド及びクリングルドメイン（ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－Ｋｒｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）をそれぞれ９６ウェルプレートに２μｇ／ｍＬの濃度及び４℃で１６時間にわたってコーティングし、３％の脱脂粉乳を用いてブロッキングした。その後、各ｓｃＦｖを処理し、２時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴと蒸留水を用いて４回洗浄した。その後、ＨＡタグに結合できるＨＲＰが結合された抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ、１２０１３８１９００１、Ａｎｔｉ－ＨＡ－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ）を用いて１時間にわたって常温で結合させた後、再びＰＢＳＴと蒸留水を用いて６回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２９、１－ＳｔｅｐＴＭ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて発色した後、停止液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＳ０４、ＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で発色反応を停止し、Ｏ．Ｄ ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡを通じて、各ドメインに結合するｓｃＦｖを分析した。各クローンにより、エピトープドメインとは異なる結合特性が図１のように分析された。
実施例５：抗ＲＯＲ１抗体の哺乳動物細胞発現及び精製
実施例で確保した各クローンを完全な免疫グロブリン（ＩｇＧ）形態の単一クローン抗体の形態で生産するために、クローニングと生産を行った。重鎖発現ベクターを構築するために、重鎖の可変領域及び定常領域を含む重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐＯｐｔｉｖｅｃベクターにクローニングした。また、軽鎖を発現するベクターを構築するために、軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域を含む軽鎖をコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．３ベクターにクローニングした。
一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を通じて、前記軽鎖及び重鎖発現ベクターを用いてタンパク質を発現及び精製した。Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１４３５１０１、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）で浮遊・成長するＥｘｐｉ２９３Ｆ懸濁細胞（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１４５２７、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ Ｃｅｌｌｓ）をプラスミド及びＯｐｔｉ－ＭＥＭI（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５０７０、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３（Ｇｉｂｃｏ、１０００１４９９５、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３）の混合物でトランスフェクションした。８％のＣＯ２、３７℃及び１３０ｒｐｍで５日間培養した後、細胞培養上清液からタンパク質を精製した。培養液をカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－５４３８－０１、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ ＳｕＲｅ）に通過させ、発現された抗体をカラムに結合させた。その後、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１０２８、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ ２．０）で溶出させた後、溶出された抗体分画は、アミコンウルトラ３０ｋＤａチューブ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０３０２４、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液を交換しながら濃縮を行った。精製された抗ＲＯＲ１抗体は、２８０ｎｍの波長での吸光度と吸光係数を用いて定量した。
実施例６：抗ＲＯＲ１抗体に対する生物物理的特性改善エンジニアリング
前記実施例で確保した抗体の所望でないＰＴＭ部位（ｓｉｔｅ）の除去のために、抗体最適化を行った。前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の結果、優れた効能を示したＰ０１５０４２ｖ１抗体配列をベースにして最適化を行った。抗体配列のうち所望でないＰＴＭにより、生産過程及び生産後の応力条件（ｓｔｒｅｓｓｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で脱アミド（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）及び異性化（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）が発生するおそれがある配列を探した：ＨＣ ５５Ｇ、ＬＣ Ｓ５１、及びＬＣ Ｇ９５Ａ。既存の論文によると、脱アミドと異性化の憂いがある配列のうちＮ或いはＤを置換することが、抗体の親和力を相当損傷させる（Ｐａｔｅｌ，Ｃ．Ｎ．，Ｂａｕｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．，Ｄｕｒｂｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｈｉｙａｎｏｖａ，Ｔ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，＆ａｍｐ；Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｘ．（２０１６）。Ｎ＋１ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｈｏｔｓｐｏｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０５（２），５１２－５１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｓ００２２－３５４９（１５）００１８５－９）。そのため、配列のうちＮ或いはＤ以降の配列を置換し、最適化を行った。
合理的設計（Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）を通じて上で言及された配列をそれぞれ置換し、抗体の親和力を測定した。まず、ＨＣ Ｇ５５をＶ（Ｐ０１５０４２ｖ１－１）とＫ（Ｐ０１５０４２ｖ１－２）に置換した。そして、ＬＣ Ｓ５１をＡ（Ｐ０１５０４２ｖ１－３）とＫ（Ｐ０１５０４２ｖ１－４）に置換し、ＬＣ Ｇ９５をＡ（Ｐ０１５０４２ｖ１－５）に置換した。新しい変異体（ｖａｒｉａｎｔ）（Ｐ０１５０４２ｖ１－１～Ｐ０１５０４２ｖ１－５）を生産し、親和力を測定した結果、ＨＣ Ｇ５５配列はＫに、ＬＣ Ｓ５１とＬＣ Ｇ９５はそれぞれＫとＡに置換することが最も良いと判断した。そのため、これらの三つの配列変形を全て有しているＰ０１５０４２ｖ１－６を製作した。
各変形抗体のＣＤＲと重鎖及び軽鎖の可変領域配列を表７及び表８に示した。
実施例７：抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１特異的結合能分析（ＥＬＩＳＡ）
前記実施例で選別された各クローンのＩｇＧ抗体を用いて抗原に対する特異的結合能を分析するために、ＥＬＩＳＡを行った。
ヒトＲＯＲ１、マウスＲＯＲ１タンパク質をそれぞれ９６ウェルプレートに２μｇ／ｍＬの濃度及び４℃で１６時間にわたってコーティングし、３％の脱脂粉乳を用いてブロッキングした。その後、各抗体を３００ｎＭ、６０ｎＭ、１２ｎＭ、２．４ｎＭ、０．４８ｎＭ、０．０９６ｎＭ、０．０１９２ｎＭの濃度で処理してから１時間にわたって反応させた。ＰＢＳＴと蒸留水を用いて洗浄した後、塩素由来のＨＲＰが接合された抗ヒト抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１４８２、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧＦ（ａｂ’）２ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ）を用いて１時間にわたって常温で結合させた後、ＰＢＳＴと蒸留水を用いて再度洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２９、１－ＳｔｅｐＴＭ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて発色した後、停止液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＳ０４、ＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で発色反応を停止し、Ｏ．Ｄ ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。本願の抗ＲＯＲ１抗体と、その生物及び物理的特性が改善された変形抗体は、ヒトＲＯＲ１とマウスＲＯＲ１に交差結合することを確認した（図２）。
実施例８：抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１特異的結合能分析（ＳＰＲ）
ＲＯＲ１に対する抗ＲＯＲ１抗体の結合力をさらに定量的に分析するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を行った。このとき、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
アミンカップリング方式を用いて、ヒトＲＯＲ１又はマウスＲＯＲ１を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ４．５に希釈し、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３００ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ（ＲＵ）で固定化した。センサーチップの表面に残っている活性化部分は、１Ｍのエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加して非活性化させた。ＣＭ５センサーチップに固定化された抗体タンパク質に、本願の抗ＲＯＲ１抗体を３００ｎＭ、１５０ｎＭ、７５ｎＭ、３７．５ｎＭ、１８．７５ｎＭ、９．３７５ｎＭ、及び４．６８７５ｎＭの濃度で１８０秒間注入し（Ｋａ）、その次に、同一の流速で１８０秒間分離する段階（Ｋｄ）を通じて、ＫＤ結合センサーグラムを調査した。その結果、図２に示したように、抗ＲＯＲ１抗体は、ヒトＲＯＲ１とマウスＲＯＲ１に特異的に結合するセンサーグラムを示しており、ＫａとＫｄ値を通じた最終的なＫＤ値を（１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）表９及び表１０に示した。
実施例９：抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１ドメインマッピング
前記選別されたクローンのＩｇＧ抗体を用いて結合ドメインを分析するために、ＥＬＩＳＡを行った。
ヒトＲＯＲ１の免疫グロブリン－ドメイン（Ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＯ１－Ｈ５２２１、Ｈｕｍａｎ／Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ／Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ＲＯＲ１（３９－１５１、Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ヒトＲＯＲ１のフリズルドドメイン（ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｄｏｍａｉｎ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＯ１－Ｈ５２２２、Ｈｕｍａｎ／Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ／Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ＲＯＲ１（１６５－３０５、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｄｏｍａｉｎ）Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ヒトＲＯＲ１のクリングルドメイン（ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｋｒｉｇｌｅ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＯ１－Ｈ５２２３、Ｈｕｍａｎ／Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ／Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ＲＯＲ１（３０８－３９５、Ｋｒｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ヒトＲＯＲ１の免疫グロブリン及びフリズルドドメイン（ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｄｏｍａｉｎ）、ヒトＲＯＲ１のフリズルド及びクリングルドメイン（ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－Ｋｒｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）をそれぞれ９６ウェルプレートに２μｇ／ｍＬの濃度及び４℃で１６時間にわたってコーティングし、３％の脱脂粉乳を用いてブロッキングした。その後、各抗体を３００ｎＭ、６０ｎＭ、１２ｎＭ、２．４ｎＭ、０．４８ｎＭ、０．０９６ｎＭ、及び０．０１９２ｎＭの濃度で処理してから１時間にわたって反応させた。ＰＢＳＴと蒸留水を用いて洗浄した後、塩素由来のＨＲＰが接合された抗ヒト抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１４８２、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧＦ（ａｂ’）２ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ）を用いて１時間にわたって常温で結合させた後、ＰＢＳＴと蒸留水を用いて再度洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２９、１－ＳｔｅｐＴＭ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて発色した後、停止液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＳ０４、ＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で発色反応を停止し、Ｏ．Ｄ ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡを通じて、各ドメインに結合する抗ＲＯＲ１抗体クローンを分析した（図３）。
実施例１０：細胞種類別ＲＯＲ１受容体発現度の定量分析
Ｔ－４７Ｄ、Ｊｅｋｏ－１（異常細胞株）、ＡＭＢ－ＢＴ－００２４Ｔ、ＡＭＢ－ＢＴ－００１６Ｔ、ＡＭＢ－ＢＴ－００１３Ｔ、ＡＭＢ－ＬＣ－０００２Ｔ、ＡＭＢ－ＬＣ－０００３Ｔ、ＫＵＣ－ＯＣ２１－０２５Ｔ（異常患者由来の細胞）をそれぞれ二重で２×１０５細胞ずつ９６ウェルプレートに分注した。マウスＩｇＧ１－ＰＥイソタイプ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２－４７１４－８２）とＲＯＲ１－２Ａ２－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５７８０４）をそれぞれウェル当たり１００ｎＭずつ分注した。３０分間４℃でインキュベーションし、途中でＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ ＰＥビーズ（ＢＤ、３４０４９５）を０．５ｍＬのＰＢＳに入れ、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）でフローサイトメトリーを行う。ビーズでＲＯＲ１発現度の基準点を設定し、マウスイソタイプとＲＯＲ１－２Ａ２－ＰＥ抗体処理をした各細胞から出たＲＯＲ１発現量をビーズと比較して分析しながら、細胞別に発現するＲＯＲ１受容体の数を定量化した。
ヒトリンパ腫細胞株であるＪｅｋｏ－１が高いＲＯＲ１発現度を示しており、患者由来の細胞（ＰＤＸＣ）では、肺癌由来の細胞であるＡＭＢ－ＬＣ－０００３Ｔで最も高いＲＯＲ１発現度を示した（図４）。
実施例１１：抗ＲＯＲ１抗体の細胞表面発現ＲＯＲ１に対する特異的結合能測定
抗ＲＯＲ１抗体が治療用として使用される前に、まず、細胞表面に発現する抗原と結合するかどうかを確認することは非常に重要である。ＲＯＲ１発現が高く確認されたＪｅｋｏ－１細胞株とＡＭＢ－ＬＣ－０００３Ｔ患者由来の細胞で、本発明者等が開発した抗ＲＯＲ１抗体の細胞結合能をＦＡＣＳを用いて測定した。各細胞を９６ウェルプレートに各ウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＦＡＣＳ緩衝溶液に合わせて分注した。
抗ＲＯＲ１候補抗体Ｐ０１５００４、Ｐ０１５０４２、Ｐ０１５０４３、Ｐ０１５０４４、生物及び物理学的特性を改善を通じて確保したＰ０１５０４２ｖ１、及びその変形物質の一つであるＰ０１５０４２ｖ１－６で細胞結合能分析を行い、各抗体を１００ｎＭから１０倍ずつ希釈し、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭまで各細胞に処理した。これは、４℃で３０分間反応させてから２回洗浄した。ＰＥ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；１２－４９９８－８２）は、二次抗体としてＦＡＣＳ用緩衝溶液に１：１００の比率で希釈し、各ウェルに１００μｌずつ分注した。これは、４℃で３０分間再度反応させてから２回洗浄した。最後に、各ウェル当たり１００μｌのＦＡＣＳ用緩衝溶液を分注し、ピペットでよく混ぜた後、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーター（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてフローサイトメトリーを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．３．１を用いて分析しており、ｌｏｇ（アゴニスト） ｖｓ．反応－可変傾斜（ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ）非線形グラフモデルを用いてＥＣ５０値を導出した。
細胞結合能結果を見ると、ＲＯＲ１発現度が最も高かったＡＭＢ－ＬＣ－０００３Ｔ患者由来の細胞において、Ｊｅｋｏ－１細胞株より高いＭＦＩ（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示した。二つの細胞種で全てナノモル以下のＥＣ５０を示した抗体としては、Ｐ０１５０４２とその配列を追加的に変形させたＰ０１５０４２ｖ１、Ｐ０１５０４２ｖ１－６があり、Ｐ０１５０４４もナノモルレベルのＥＣ５０値を示した。それ以外の抗ＲＯＲ１クローンであるＰ０１５００４、Ｐ０１５０４３も、＜１０ｎＭレベルのＥＣ５０を示しており、いずれも良い細胞結合能を示した（図５及び図６）。
実施例１２：抗ＲＯＲ１抗体の細胞内在化分析
抗体－薬物接合体に開発するためには、抗ＲＯＲ１抗体が細胞にあるＲＯＲ１抗原と結合するだけでなく、細胞内在化をしたとき、接合体の薬物が細胞内に浸透しながら反応を起こす。これを分析するために、多様な時点で細胞表面に残っているＲＯＲ１抗原を検出することによって内在化を確認した。Ｊｅｋｏ－１細胞を二重でウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌに分注し、各時点別にプレートを準備した：細胞内在化の開始０分、１０分、３０分、１時間、２時間、４時間後、抗体によって内在化されずに細胞表面に残ったＲＯＲ１受容体を確認した。各細胞を各抗体で１ｎＭずつ処理した後、３０分間４℃で反応させた。１１００ｇで２分間遠心分離してから２回洗浄し、０分目のプレートを除いた残りのプレートは、１００μｌのＦＡＣＳ用緩衝溶液に細胞を混ぜてから３７℃及び５％のＣＯ２で反応させた。０分目のプレートは、直ぐヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１２－４９９８－８２）を１：１００の比率で希釈し、ウェル当たり１００μｌずつ分注しながら約３０分間４℃で反応させた。２回洗浄した後、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてフローサイトメトリーを行い、他のプレートも、時間になると同一の方式でＪｅｋｏ－１細胞に残っているＲＯＲ１発現を確認した。０分目に確認されたＲＯＲ１発現度を基準にして各値を標準化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．３．１にある［インヒビター］ ｖｓ．正規化反応－可変傾斜（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ）非線形グラフモデルを用いて分析した。
各抗体クローン別に異なる細胞内在化を示しており、ほとんどの抗体では、４時間後にも持続的に抗体が内在化されることを確認できた。Ｐ０１５０４２抗体の生物及び物理的特性を改善させ、エンジニアリングしたＰ０１５０４２ｖ１－６は、細胞内在化が最も良く行われたマックのＵＣ－９６１抗体と類似するレベルを示した（図７）。
実施例１３：抗ＲＯＲ１抗体－薬物接合体の製造
本発明の抗体薬物接合体又はその生成中間体の一般的な生成方法に対して説明する。各反応式に含まれた化合物の名称と代替記号を記載して説明する（図８）。
チオエーテルを通じて抗体（Ｙ）と薬物－リンカー（ＬＰ）構造とが連結される、数式（１）で示す抗体－薬物接合体は、例えば、下記の方法によって生成され得る。
［数（１）］
Ｘ（１）＋ＬＰ（２）→Ｘ－ＬＰ（３）
例示に使用された薬物－リンカー（ＬＰ）は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル－モノメチルアウリスタチンＥ（ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ；ＣＣＣ（Ｃ）Ｃ（Ｃ（ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＣＣＣ１Ｃ（Ｃ（Ｃ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＣ（Ｃ）Ｃ（Ｃ２＝ＣＣ＝ＣＣ＝Ｃ２）Ｏ）ＯＣ）ＯＣ）Ｎ（Ｃ）Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（Ｃ（Ｃ）Ｃ）ＮＣ（＝Ｏ）Ｃ（Ｃ（Ｃ）Ｃ）Ｎ（Ｃ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＣ３＝ＣＣ＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ３）ＮＣ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＣＣＮＣ（＝Ｏ）Ｎ）ＮＣ（＝Ｏ）Ｃ（Ｃ（Ｃ）Ｃ）ＮＣ（＝Ｏ）ＣＣＣＣＣＮ４Ｃ（＝Ｏ）Ｃ＝ＣＣ４＝Ｏ）であり、Ｘは、スルフヒドリル基を有するＩｇＧ１形態の単一クローン抗体である。
ＬＰのマレイミジル基とＸのスルフヒドリル基との間の反応を通じて、抗体－薬物接合体を生成することができる。
スルフヒドリル基を有する抗体（Ｘ）は、後述した方法によって収得することができる。抗体をトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）などの還元剤と反応させ、抗体内のヒンジ部分のジスルフィド結合を還元させることによってスルフヒドリル基を形成させることができる。
具体的には、抗体内部のジスルフィド当たりの還元剤として２～２０モル当量の５ｍＭのＴＣＥＰを使用し、代表的なキレート剤である５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＥＤＴＡ）を含む緩衝液で抗体（Ｙ）と反応させ、抗体内部のジスルフィドが部分的に或いは完全に還元されたスルフヒドリル基を有する抗体（Ｘ）を生成することができる。上述した抗体内のジスルフィド還元反応は、３７℃で２時間にわたって行われた。当該例示で使用された緩衝液は、抗体の生成時に同一に使用された食塩水を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）である。上述した抗体内のジスルフィド還元反応は、３７℃で２時間にわたって行われた。
反応が終了した後、残っているＴＣＥＰ及びＥＤＴＡなどの不純物を除去するために、アミコンウルトラ（３０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）容器内にスルフヒドリル基を有する抗体（Ｘ）溶液を添加し、遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８１０ Ｒ）を用いて遠心分離（３９５０Ｇで１０分～２０分間遠心分離）し、食塩水を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に緩衝液の交換を行った。当該過程は合計３回繰り返された。
緩衝液の交換を通じて不純物を除去したスルフヒドリル基を有する抗体（Ｘ）をアミコンウルトラ（３０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）容器で回収し、５～１５モル当量の１０ｍＭの薬物－リンカー（ＬＰ）と常温で２時間にわたって反応させる。薬物－リンカー（ＬＰ）が光によって変形し得るので、本反応は暗幕状態で行われた。化合物の溶解度を高めるために、薬物－リンカー（ＬＰ）を代表的な有機溶媒であるジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解させた。スルフヒドリル基を有する抗体（Ｘ）を含む緩衝溶液に１０～２０％ ｖ／ｖ程度のＤＭＡを添加した。
抗体－薬物接合反応は、未反応の薬物－リンカー（ＬＰ）の反応性をチオール－含有試薬で不活性化させて終了させることができる。本例示に使用されたチオール－含有試薬は、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）である。具体的には、抗体－薬物接合反応液に５モル当量のＮＡＣを添加し、室温で３０分間保管することによって反応を終了した。
残存する薬物－リンカー及びＮＡＣを除去するためにアミコンウルトラ（３０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）容器内に抗体－薬物反応液を添加し、遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８１０ Ｒ）を用いて遠心分離（３９５０Ｇで１０分～２０分間）し、食塩水を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に緩衝液の交換を行った。当該過程は合計３回繰り返された。最終的に、抗体－薬物接合体をアミコンウルトラ（３０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）容器のろ過膜から回収した。
実施例１４：抗ＲＯＲ１抗体－薬物接合体の濃度分析
抗体－薬物接合体における抗体の濃度は、分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００）を用いて測定した。
実施例１５：抗ＲＯＲ１抗体－薬物接合体の純度分析
抗体－薬物接合体の純度は、下記に敍述した方法を採用するサイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）分析を通じて測定した。抗体－薬物接合体試料の前処理は、濃度は０．５ｍｇ／ｍｌに、総量は２５μＬに合わせて準備する。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析は、下記の条件によって実施する。
抗体－薬物接合体クロマトグラムに現れる各ピークの維持時間をサイズマーカー（Ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１５１１９０１）の各ピーク別維持時間と比較及び対照し、抗体－薬物接合体の純度を測定した。サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズが大きい分子が先に検出されることによって、抗体ピーク（１５０ｋＤａ）を基準にして先に出るピークは、薬物の疎水性によって生成され得る高分子凝集体で、以降に出るピークは、接合されてから分離された薬物であると分析した。抗体－薬物接合体自体の純度は、全体のクロマトグラムで１５０ｋＤａに相当するピークの面積を百分率で換算して計算した。
実施例１６：抗ＲＯＲ１抗体－薬物接合体の抗体分子当たりの薬物分子平均接合数の分析（ＤＡＲ分析）
抗体－薬物接合体の抗体分子当たりの薬物分子平均接合数（Ｄｒｕｇ－ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）は、下記に敍述した方法を採用する疎水性相互作用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）分析を通じて測定した。ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析のための前処理として分析に使用する抗体－薬物接合体試料の濃度は０．５ｍｇ／ｍｌに、総量は３０μＬに合わせて準備する。ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析は、下記の条件によって実施した。
同一の薬物未接合抗体に比べて、抗体－薬物接合体は、接合された薬物分子の数に比例してさらに高い疎水性を帯びるようになり、よって、さらに長い維持時間を有するようになる。抗体の内部には、合計４個のジスルフィド結合が存在し、各ジスルフィド結合当たりに２個の薬物が接合され得る。したがって、抗体－薬物接合体のＨＩＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムで最大５個のピーク（ＤＡＲ ０、ＤＡＲ ２、ＤＡＲ ４、ＤＡＲ ６、ＤＡＲ ８）を観察することができる。薬物未接合抗体（ＤＡＲ０）の維持時間後に順次現れるピークに対しては、上述したＤＡＲ ２、ＤＡＲ ４、ＤＡＲ ６、ＤＡＲ ８の順に指定した。これを通じて各ピークに対するＤＡＲ割当が完了すると、下記の数式によって抗体分子当たりの薬物分子の平均接合数を計算した。
実施例１７：抗ＲＯＲ１抗体－薬物接合体の抗原結合能分析
抗体－薬物接合体の親和度分析は、親抗体との同等性を評価すると同時に、スルフヒドリル基を有する抗体を生成させるためのジスルフィド結合還元及び薬物－リンカー接合などの製造過程からもたらされ得る潜在的親和度の毀損有無を判断するために行う。当該分析は、下記に敍述した酵素免疫分析法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を通じて行われた。
２μｇ／ｍｌのヒト及びマウス由来のＲＯＲ１抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）は、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に各ウェル当たりに５０μＬを分注してコーティングする。コーティングされたＲＯＲ１抗原を振り払った後、３％のスキームミルクでコーティングされた各ウェルに２００μＬずつ分注してブロッキングする。１時間後に３％のスキームミルクを振り払った後、親抗体と抗体－薬物接合体を最高濃度３００ｎＭから１／５倍ずつ７回連続的に希釈させ、指定されたウェルに５０μＬだけ分注する。１次抗原－抗体結合を１時間にわたって行った後、０．０５％ ｖ／ｖの界面活性剤（ＰＢＳＴ）と蒸留水でプレートを洗う（各３回ずつ）。その後、１：３０００の比率でＦａｂ－ＨＲＰを３％のスキームミルクに希釈させ、各ウェルに５０μＬだけ分注する。１時間にわたって２次結合反応を行った後、０．０５％のＰＢＳＴと３次蒸留水でプレートを洗う（各３回ずつ）。プレートに残った水気を除去した後、ＴＭＢ（３４０２９、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を各ウェルに５０μＬだけ分注してから３分～５分間反応させる。最終的に、反応を終了させるために、停止液（ＳＳ０４、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を各ウェルに５０μＬだけ分注する。
抗体－薬物接合体の抗原結合力が単一クローン抗体に比べて８０％以上であると、抗体－薬物接合体の抗原結合能が類似していると判断した。
上記のように生成された抗ＲＯＲ１抗体－薬物接合体の３種（Ｐ０１５００４－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ、Ｐ０１５０４２－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ、Ｐ０１５０４４－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）を前記明示した抗体－薬物接合体分析及びＱＣ方法によって評価し、その結果を下記の表１８のようにまとめる。
図９は、本発明の実施例で使用された抗体－薬物接合体の純度分析結果を示し、図１０は、本発明の実施例で使用された抗体－薬物接合体の抗体分子当たりの薬物分子の平均接合数分析結果を示し、図１１は、本発明の実施例で使用された抗体－薬物接合体のＲＯＲ１結合に対するＥＬＩＳＡ分析結果を示した。
実施例１８：抗ＲＯＲ１抗体－薬物接合体の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞毒性評価
ＲＯＲ１発現度が高い肺癌患者由来の細胞として知られているＡＭＢ－ＬＣ－０００３ＴとＲＯＲ１発現が非常に低いＡＭＢ－ＬＣ－０００２Ｔで、前記言及した抗ＲＯＲ１候補抗体－薬物接合体に対する抗癌薬物としての毒性評価を行った。
各ウルトラローアタッチメント（Ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、Ｕ底（ｂｏｔｔｏｍ）３８４ウェル透明プレート（Ｓ－ｂｉｏ、＃ＭＳ－９３８４ＵＺ）に、肺癌患者由来の細胞であるＡＭＢ－ＬＣ－０００３ＴとＡＭＢ－ＬＣ－０００２Ｔ細胞をウェル当たりに５００個ずつ４０μｌのＭ１００１８（Ａｉｍｅｄｂｉｏ）メディアに三重で分注する。２５０ｇに２分間遠心分離させた後、３７℃及び５％のＣＯ２条件下で２４時間にわたって反応させた。反応後、各抗体－薬物接合体を５００ｎＭから３倍ずつ希釈しながら０．３１４ｐＭまで処理した。プレートは、再度３７℃及び５％のＣＯ２条件下で６日間反応させた。
合計７日間の反応後、各細胞が３８４ウェルプレートでスペロイドを形成するので、高含量スクリーニング方式であるＯｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）装備を用いて各ウェルにあるスペロイドイメージをキャプチャした。各ウェルにある各細胞のスペロイド形態を維持するために、分析前には洗浄を行わない。キャプチャされたイメージは、追加分析を通じて体積に換算し、最も低い濃度の薬物が処理されたスペロイドを基準にして、濃度別スペロイド体積値を標準化させた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．３．１を用いてｌｏｇ（インヒビター） ｖｓ 正規化反応－可変傾斜（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ）でグラフを作り、ＩＣ５０値を導出した（図１２）。
前記叙述したＰ０１５０４２－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ抗体－薬物接合体は、ＲＯＲ１発現が高いＡＭＢ－ＬＣ－０００３Ｔで優れたＩＣ５０（２．３０ｎＭ）値を示し、ＲＯＲ１発現が低い患者由来の細胞であるＡＭＢ－ＬＣ－０００２Ｔでは、１００ｎＭ以上のＩＣ５０値を有しながら、ＲＯＲ１特異的な効果のみを示すことを確認した。米国特許ＵＳ １０，３３５，４９６ Ｂ２の抗体－薬物接合体であるＵＣ９６１－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥに比べたとき、約８倍の相対力価（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｃｙ）を示しながら、抗体－薬物接合体としてのＲＯＲ１特異的な抗癌効能を期待できるようにした（図１３）。
本発明に係る抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合断片は、既存の抗ＲＯＲ１抗体よりもＲＯＲ１に対する優れた結合力を示し、目的とする腫瘍又は癌の予防又は治療に有用に使用され得る。
以上では、本発明の内容における特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
電子ファイルを添付した。

Claims (24)

  1. 次を含むＲＯＲ１（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片：
    配列番号１～配列番号１６で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    配列番号１７～配列番号４１、配列番号１８４及び配列番号１８５で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
    配列番号４２～配列番号６５で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
    配列番号６６～配列番号８６で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    配列番号８７～配列番号１０２、配列番号１８６及び配列番号１８７で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号１０３～配列番号１２１で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
  2. 配列番号１２２～配列番号１５２、及び配列番号１８８～配列番号１９３で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. 配列番号１５３～配列番号１８３、及び配列番号１９４～配列番号１９９で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  4. 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、及びジスルフィド－結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記ｓｃＦｖは、配列番号１２２～配列番号１５２、及び配列番号１８８～配列番号１９３で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域と、配列番号１５３～配列番号１８３、及び配列番号１９４～配列番号１９９で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域と、がリンカーを介して連結されたことを特徴とする、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記リンカーは、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含む、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. 請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
  8. 請求項７に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  9. 請求項８に記載の組換え発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
  10. ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０である、請求項９に記載の宿主細胞。
  11. 請求項９の宿主細胞を培養し、抗体を生成する段階；及び生成された抗体を分離及び精製する段階；を含む、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法。
  12. 請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異的又は多重特異的抗体。
  13. 請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の抗体のｓｃＦｖ及び免疫細胞活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む第２結合ドメインで構成されたｓｃＦｖを含む、免疫細胞エンゲージング二重特異的又は多重特異的抗体。
  14. 請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）。
  15. 前記薬物は、メイタンシノイド、アウリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦを含む）、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トトレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロリド酢酸塩（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバルミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、サラミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ぺプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素及び細菌又は動植物由来の毒素で構成された群から選ばれた一つ以上であることを特徴とする、請求項１４に記載の抗体－薬物接合体。
  16. 前記抗体又はその抗原結合断片は、薬物と、リンカーを介して結合されることを特徴とする、請求項１４に記載の抗体－薬物接合体。
  17. 前記リンカーは、切断性リンカー又は非切断性リンカーであることを特徴とする、請求項１６に記載の抗体－薬物接合体。
  18. 前記切断性リンカーは、酸性不安定リンカー（ａｃｉｄ－ｌａｂｉｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）、二硫化リンカー、ペプチドリンカー、又はβ－グルクロナイド（ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）リンカーであり、前記非切断性リンカーは、チオエーテル基又はマレイミドカプロイル基を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の抗体－薬物接合体。
  19. 前記リンカーは、抗体の二硫化結合還元時に露出するシステイン残基、又は抗体に結合されたタグに存在するシステイン残基に結合されることを特徴とする、請求項１６に記載の抗体－薬物接合体。
  20. 抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメイン及び細胞内信号伝逹ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の抗体のｓｃＦｖであることを特徴とするキメラ抗原受容体。
  21. 請求項２０に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入されている免疫細胞。
  22. Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ）、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、マクロファージ、腫瘍組織内浸透Ｔ細胞（Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、及び樹状細胞で構成された群から選ばれた一つ以上である、請求項２１に記載の免疫細胞。
  23. 請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含む癌の予防又は治療用組成物。
  24. 請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重又は多重特異的抗体、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、又は前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を投与する段階を含む癌の予防又は治療方法。
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