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JP2024543369A - Ｅｍｒ２修飾のための化合物及び方法 - Google Patents

Ｅｍｒ２修飾のための化合物及び方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2024543369000001
本明細書中で提供されるのは、ＥＭＲ２を標的化する標的化ドメインを含むｇＲＮＡであって、それは、例えば、細胞中で修飾を行うために使用され得る。また、本明細書中で提供されるのは、ＥＭＲ２遺伝子における修飾（例、挿入又は欠失）を有する遺伝子操作された細胞の方法、及び、そのような遺伝子操作された細胞を、対象、例えば造血器悪性腫瘍を有する対象などに投与することを含む方法である。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年１１月９日に出願された米国仮出願第６３／２７７，５４２号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、参照によりその全体が組み込まれる。
対象が、疾患又は状態に関連する抗原を標的とする免疫療法、例えば、抗癌ＣＡＲ－Ｔ療法を投与されるとき、当該療法は、標的化されることを意図している病的細胞だけでなく、標的抗原を発現し得る非病的細胞も枯渇させ得る。この「標的上・疾患外」効果が、いくつかのＣＡＲ－Ｔ治療剤、例えば、ＣＤ１９又はＣＤ３３を標的とするものについて報告されている。標的抗原が、対象の生存のために要求される細胞の表面上に、又はその枯渇が対象の健康に対して著しい損害である細胞の表面上に発現される場合、対象は、免疫療法を受けることができないであろう、又は、一度そのような治療が投与された場合に重度の副作用に直面するであろう。他の事例では、免疫療法を構成する免疫エフェクター細胞上に、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上に発現される抗原を標的とする免疫療法を投与することが望ましい場合があり、これは、フラトリサイドをもたらし、それぞれの治療剤を無効にするか、又は生産することを事実上不可能にし得る。
本開示のいくつかの態様は、特定の免疫療法アプローチ、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞などの治療を必要とする対象における具体的な抗原を標的とするリンパ球エフェクター細胞を含む免疫治療剤の有害な標的上・疾患外効果に対処する組成物、方法、方略、及び治療法を記載する。
本開示の態様は、表１～８に記載される配列を含む標的化ドメインを含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。一部の態様では、ｇＲＮＡは、標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、配列番号５９～７６、１２５～１４８、１６１～１６６、１７９、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、１９５、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４９、２４３、２４６、２４９、２５２、２５４～２５７、２６８、２７１、２７４、２７７、２８０、２８３、２８６、２８９、２９１、２９４、２９７、３００、３０３、３０６、３０９、３１２、３１５、３１７、及び２１９のうちのいずれか一つの配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、第一の相補性ドメイン、結合ドメイン、第一の相補性ドメインに相補的である第二の相補性ドメイン、及び近位ドメインを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、化学的に修飾された一つ又は複数のヌクレオチド残基を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’Ｏ－メチル部分を含む一つ又は複数のヌクレオチド残基を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオエートを含む一つ又は複数のヌクレオチド残基を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ部分を含む一つ又は複数のヌクレオチド残基を含む。
本開示の態様は、細胞を提供することと、細胞を、（ｉ）本明細書に記載されるｇＲＮＡのうちのいずれか、又は本明細書に記載されるｇＲＮＡのうちのいずれかによって標的化される標的化ドメインを標的とするｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）ｇＲＮＡに結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、したがって、（ｉ）のｇＲＮＡが（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼとリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、及び／又はそれを維持するため、かつＲＮＰ複合体が細胞のゲノム内の標的ドメインに結合するために好適な条件下で、ＲＮＰ複合体を形成することを含む、遺伝子操作された細胞を産生する方法を提供する。一部の実施形態では、接触は、（ｉ）及び（ｉｉ）を、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態において、細胞中に導入することを含む。一部の実施形態では、接触は、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）を、（ｉ）のｇＲＮＡ及び／又は（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸の形態において、細胞中に導入することを含む。一部の実施形態では、（ｉ）のｇＲＮＡ及び／又は（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である。一部の実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、エレクトロポレーションを介して細胞中に導入される。
一部の実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ（ｓｐＣａｓ）ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ（ｓａＣａｓヌクレアーゼ）である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を低下又は消失させる変異を含み、例えば、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ニカーゼ又はヌクレアーゼデッドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼバリアントである。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、Ｆｏｋ－Ｉヌクレアーゼドメインに融合される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、脱アミノドメイン、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１又はＡＰＯＢＥＣ３脱アミノドメインに融合される。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、塩基エディターである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、シトシン塩基エディターである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、アデニン塩基エディターである。
一部の実施形態では、細胞は、造血細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血前駆細胞である。一部の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。一部の実施形態では、細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔリンパ球である。
本開示の態様は、本明細書中に記載される方法のいずれかにより得られた、遺伝子操作された細胞を提供する。本開示の態様は、本明細書中に記載される、遺伝子操作された細胞を含む細胞集団を提供する。
本開示の態様は、遺伝子操作された細胞を含む細胞集団を提供し、遺伝子操作された細胞は、表１～８に記載される標的化ドメインを含むｇＲＮＡに結合されたときに、ＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断された部位のすぐ近位の挿入又は欠失からなるゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、それにおいて、ゲノム修飾は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象により生成される挿入又は欠失である。一部の実施形態では、それにおいて、ゲノム修飾は、相同組換え修復（ＨＤＲ）事象により生成される挿入又は欠失である。一部の実施形態では、ゲノム修飾は、そのようなゲノム修飾を持つ遺伝子操作された細胞におけるＥＭＲ２の機能の喪失をもたらす。一部の実施形態では、ゲノム修飾は、ＥＭＲ２のゲノム修飾を持たない同じ細胞型の野生型細胞におけるＥＭＲ２の発現レベルと比較して、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、又は０．００１％未満までのＥＭＲ２の発現の低下をもたらす。一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、造血幹細胞又は造血前駆細胞である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、免疫エフェクター細胞である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＥＭＲ２を標的化する。
一部の実施形態では、細胞集団は、レシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着し、かつレシピエントにおける全ての血液系細胞型の分化した子孫を生成する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも５０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも６０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも７０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも８０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも９０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、未編集造血幹細胞の分化能と同等である分化能によって特徴付けられるＥＭＲ２編集造血幹細胞を含む。
本開示の態様は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞のうちのいずれか又は本明細書に記載される細胞集団のうちのいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するか、又は造血器悪性腫瘍と診断されている。一部の実施形態では、この方法は、ＥＭＲ２を標的化する薬剤の有効量を対象に投与することをさらに含み、それにおいて、薬剤は、ＥＭＲ２に結合する抗原結合断片を含む。
上記の概要は、本明細書中に開示される技術の実施形態、利点、特徴、及び使用の一部を非限定的な様式で説明することを意図している。本明細書中に開示される技術の他の実施形態、利点、特徴、及び使用は、詳細な説明、図面、実施例、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
図１Ａ～１Ｅは、急性骨髄性白血病患者由来の細胞上での細胞表面マーカーＣＤ３３、ＣＬＬ－１、ＣＤ１２３、及びＥＭＲ２の発現を示す。図１Ａは、芽細胞において示されたマーカーを発現している前駆陽性細胞を示す（ＣＤ４５ｄｉｍ）。図１Ｂは、細胞（芽細胞）当たりの結合した抗体によって測定される抗原密度を示す。 図１Ｃは、白血病幹細胞（ＬＳＣ；ＣＤ４５ｄｉｍ、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－）において示されるマーカーを発現している前駆陽性細胞を示す。図１Ｄは、ＡＭＬ患者のＬＳＣにおけるＣＤ３３、ＣＬＬ－１、ＣＤ１２３、及びＥＭＲ２の細胞（ＬＳＣ）当たりの、結合した抗体によって測定される抗原密度を示す。 図１Ｅは、骨髄試料及びＬｅｕｋｏ Ｐａｋ試料中の示されたマーカー：造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性前駆（ＭＰＰ）細胞、骨髄系共通前駆（ＣＭＰ）細胞、顆粒球マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞、巨核球赤血球前駆（ＭＥＰ）細胞、及びリンパ球系共通前駆（ＣＬＰ）細胞の発現率を示す。図１Ａ～１Ｄの各々について、各マーカーの平均（陽性又は抗原密度の割合）をグラフの下の表に示す。
図２Ａ～２Ｅは、未成熟終止コドンにつながる挿入／欠失（インデル）をもたらす例示的なＥＭＲ２ ｇＲＮＡを使用したＥＭＲ２編集のための例示的なＣＲＩＳＰＲ戦略の概要を示す。図２Ａは、ＨＬ－６０細胞又はＣＤ３４＋細胞で生成された、例示的なＥＭＲ２ ｇＲＮＡ、平均編集効率及び主要なインデルを示す。 図２Ｂは、生成された、例示的なＥＭＲ２ ｇＲＮＡ、平均編集効率、及び主要な挿入／欠失（インデル）を示す。 図２Ｃは、ＥＭＲ２の野生型ゲノム配列及びアミノ酸配列の領域を示す。ガイドＥＭＲ２－１１の位置が示され、ＥＭＲ２－１１の（－４）インデルで欠失された４個のヌクレオチドが、垂直線の間に示される。 図２Ｄは、ガイドＥＭＲ２－１１で編集されたＥＭＲ２のゲノム配列及びアミノ酸配列の領域を示し、これは、早期終止コドン（「＊」で示される）をもたらす－４の欠失を生じる。 図２Ｅは、ＥＭＲ２の野生型ゲノム配列及びアミノ酸配列の領域を示す。ガイドＥＭＲ２－１１の位置が示され、ＥＭＲ２－１１の（＋１）インデルの位置のヌクレオチドが、垂直線に示される。 図２Ｆは、ガイドＥＭＲ２－１１で編集されたＥＭＲ２のゲノム配列及びアミノ酸配列の領域を示し、これは、早期終止コドン（「＊」で示される）をもたらす＋１の挿入を生じる。
図３Ａ及び３Ｂは、ｇＲＮＡ ＥＭＲ２－１１又はＥＭＲ２－１８を標的とするＣａｓ９及びＥＭＲ２を含有するリボ核タンパク質複合体を用いたエレクトロポレーション後のＥＭＲ２の表面発現の喪失を示す。図３Ａは、エレクトロポレーションの４８時間後及び９６時間後のＨＬ－６０細胞におけるＥＭＲ２ ＲＮＡ転写物発現を示す。各時点について、バーは、左から右に、ＷＴ細胞、ガイドＥＭＲ２－１１を使用した細胞編集、及びガイドＥＭＲ２－１８を使用して編集された細胞を指す。図３Ｂは、フローサイトメトリーによって評価される、エレクトロポレーションの４８時間後及び９６時間時後（それぞれ、２日後及び４日後）の生細胞のＥＭＲ２陽性の割合としてのＥＭＲ２表面発現を示す。
図４Ａ及び４Ｂは、ＥＭＲ２を標的とする、示されたｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ編集の効果を示す。図４Ａは、示されたｇＲＮＡを含有するＲＮＰを用いたエレクトロポレーション又は偽エレクトロポレーション（「偽（Mock）」）の２４時間後、４８時間後、９日後、及び１６日後の細胞数及び生存率を示す。図４Ｂは、エレクトロポレーションの４８時間後、９日後、又は１６日後のＣＤ３３ ｇＲＮＡ、対照ｇＲＮＡ（ｇ対照）、又は偽エレクトロポレーションと比較した、ＥＭＲ２を標的とする示されたｇＲＮＡの編集効率、並びに観察された主要なインデルを示す。
図５Ａ～５Ｃは、Ｃａｓ９及び示されたｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質を用いたエレクトロポレーションの２日後（上のパネル）、９日後（中央パネル）、及び１６日後（下のパネル）の示されたＥＭＲ２ ｇＲＮＡを用いた細胞のゲノム編集についての挿入／欠失（インデル）スペクトル及び編集効率を示す。図５Ａは、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ（ＣＤ３３ｇＲＮＡ）を用いた編集を示す。 図５Ｂは、ｇＲＮＡ ＥＭＲ２－１１を用いた編集を示す。 図５Ｂは、ｇＲＮＡ ＥＭＲ２－１８を用いた編集を示す。
図６Ａ～６Ｇは、経時的な、ｇＲＮＡ ＥＭＲ２－１１若しくはＥＭＲ２－１８、ＣＤ３３ ｇＲＮＡ、対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）を標的とするＣａｓ９及びＥＭＲ２を含有するリボ核タンパク質複合体を用いたエレクトロポレーション、又は偽エレクトロポレーション（「偽」）後の細胞マーカーの表面発現を示す。図６Ａは、親のＥＭＲ２＋頻度として示されるＥＭＲ２表面発現を示す。図６Ｂは、対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）を用いてエレクトロポレーションされた細胞に対する倍加変化として表されるＥＭＲ２表面発現を示す。 図６Ｃは、親の頻度として示されるＣＤ９７表面発現を示す。図６Ｄは、親の頻度として示されるＣＤ３３表面発現を示す。 図６Ｅは、親の頻度として示されるＣＤ１１ｂ表面発現を示す。図６Ｆは、親の頻度として示されるＣＤ１４表面発現を示す。 図６Ｇは、親の頻度として示されるＣＤ１５表面発現を示す。
図７Ａ～７Ｆは、Ｃａｓ９及びＥＭＲ２を標的とするＥＭＲ２－１１若しくはＥＭＲ２－１８、対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）を含有するリボ核タンパク質複合体を用いたエレクトロポレーション、又は偽エレクトロポレーション（「偽ＥＰ」）及びリポ多糖類（ＬＰＳ）、抗ＥＭＲ２モノクローナル抗体２Ａ１（２Ａ１）、標準ＩｇＧ１を用いた刺激、若しくは非刺激（ｕｎｓｔｉｍ）後のインビトロで分化したＣＤ３４＋細胞からのサイトカインレベルを示す。図７Ａは、ＩＦＮγレベルを示す。 図７Ｂは、ＩＬ－１βレベルを示す。図７Ｃは、ＩＬ－６レベルを示す。 図７Ｄは、ＩＬ－８レベルを示す。図７Ｅは、ＭＩＰ－１αレベルを示す。 図７Ｆは、ＴＮＦαレベルを示す。
図８Ａ～８Ｄは、ｇＲＮＡ ＥＭＲ２－１１若しくはＥＭＲ２－１８、ＣＤ３３ ｇＲＮＡを標的化するガイド（ＣＤ３３ｇＲＮＡ）、対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）、又はナイーブ細胞（Ｎａｉｖｅ）を標的とするＣａｓ９及びＥＭＲ２を含むリボ核タンパク質複合体を用いたエレクトロポレーション後の細胞の拡大及び生存率を示す。図８Ａは、エレクトロポレーション後の示された時点での顆粒球培地（骨髄Ｉ培地）中で培養された生細胞の平均数を示す。 図８Ｂは、エレクトロポレーション後の示された時点での顆粒球培地（骨髄Ｉ培地）中で培養された細胞の生存率のパーセントを示す。図８Ｃは、エレクトロポレーション後の示された時点での単球培地（骨髄ＩＩ培地）中で培養された生細胞の平均数を示す。 図８Ｄは、エレクトロポレーション後の示された時点での顆粒球培地（骨髄ＩＩ培地）中で培養された細胞の生存率のパーセントを示す。
図９は、ｇＲＮＡ ＥＭＲ２－１１又はＥＭＲ２－１８を標的とするＣａｓ９及びＥＭＲ２を含有するリボ核タンパク質複合体を用いたエレクトロポレーション後の細胞分化全体を通して、ＥＭＲ２編集が持続することを示す。編集効率のパーセントは、分化培地（骨髄Ｉ培地（Ｍｙｅ Ｉ）又は骨髄ＩＩ培地（Ｍｙｅ ＩＩ））中でのエレクトロポレーション後の経時的に示される。
図１０Ａ及び１０Ｂは、ｇＲＮＡｓ ＥＭＲ２－１１若しくはＥＭＲ２－１８、ＣＤ３３を標的化するガイド（ＣＤ３３ｇＲＮＡ）、対照ｇＲＮＡ（Ｃｔｒｌ）、又はナイーブ細胞を標的とするＣａｓ９及びＥＭＲ２を含むリボ核タンパク質複合体を用いたエレクトロポレーション後の経時的なＥＭＲ２の表面発現を示す。図１０Ａは、エレクトロポレーション後の顆粒球培地（骨髄Ｉ培地）中で培養された細胞におけるＥＭＲ２表面発現を示す。図１０Ｂは、エレクトロポレーション後の単球培地（骨髄ＩＩ培地）中で培養された細胞におけるＥＭＲ２表面発現を示す。
図１１Ａ～１１Ｆは、ｇＲＮＡｓ ＥＭＲ２－１１若しくはＥＭＲ２－１８、ＣＤ３３を標的化するガイド（ＣＤ３３ｇＲＮＡ）、対照ｇＲＮＡ（Ｃｔｒｌ）、又はナイーブ細胞を標的とするＣａｓ９及びＥＭＲ２を含むリボ核タンパク質複合体を用いたエレクトロポレーション後の単球又は顆粒球系統マーカーの発現分析を示す。図１１Ａは、示される時点で骨髄Ｉ培地中で培養されたときの顆粒球系統細胞におけるＣＤ１１ｂの発現を示す。図１１Ｂは、示される時点で骨髄Ｉ培地中で培養されたときの顆粒球系統細胞におけるＣＤ１４の発現を示す。 図１１Ｃは、示される時点で骨髄Ｉ培地中で培養されたときの単球系統細胞におけるＣＤ１１ｂの発現を示す。図１１Ｄは、示される時点で骨髄Ｉ培地中で培養されたときの単球系統細胞におけるＣＤ１４の発現を示す。 図１１Ｅは、示される時点で骨髄Ｉ培地中で培養されたときの顆粒球系統細胞におけるＣＤ１５の発現を示す。図１１Ｆは、示される時点で骨髄Ｉ培地中で培養されたときの単球系統細胞におけるＣＤ１５の発現を示す。
図１２Ａ～１２Ｈは、ｇＲＮＡｓ ＥＭＲ２－１１若しくはＥＭＲ２－１８、又は対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）を標的とするＣａｓ９及びＥＭＲ２を含むリボ核タンパク質複合体を用いたエレクトロポレーション並びに分化の１４日目でのリポ多糖類（ＬＰＳ ｓｔｉｍ）、Ｒ８４８（レシキモド、Ｒ８４８ ｓｔｉｍ）を用いた刺激、又は非刺激後のサイトカイン産生のレベルを示す。図１２Ａは、骨髄Ｉ培地中で培養されたときの顆粒球系統細胞におけるＩＬ－６レベルを示す。図１２Ｂは、骨髄ＩＩ培地中で培養されたときの単球系統細胞におけるＩＬ－６レベルを示す。 図１２Ｃは、骨髄Ｉ培地中で培養されたときの顆粒球系統細胞におけるＩＬ－８レベルを示す。図１２Ｄは、骨髄ＩＩ培地中で培養されたときの単球系統細胞におけるＩＬ－８レベルを示す。 図１２Ｅは、骨髄Ｉ培地中で培養されたときの顆粒球系統細胞におけるＭＩＰ－１αレベルを示す。図１２Ｆは、骨髄ＩＩ培地中で培養されたときの単球系統細胞におけるＭＩＰ－１αレベルを示す。 図１２Ｇは、骨髄Ｉ培地中で培養されたときの顆粒球系統細胞におけるＴＮＦαレベルを示す。図１２Ｈは、骨髄ＩＩ培地中で培養されたときの単球系統細胞におけるＴＮＦαレベルを示す。
図１３は、ＥＭＲ２ガイドスクリーニング及びタンパク質ノックダウン評価の実験計画の概略図を示す。
図１４Ａ及び１４Ｂは、エレクトロポレーションの６日後の示されたＥＭＲ２ ｇＲＮＡを用いた編集後のＥＭＲ２の発現レベルを示す。図１４Ａは、アイソタイプ対照と比較した、示されたｇＲＮＡを使用した、ＥＭＲ２編集ＨＳＣにおけるＥＭＲ２タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を示す。 図１５Ｂは、図１４Ａに示されるフローサイトメトリーデータの定量を示す。
図１５Ａ～１５Ｃは、ｇＲＮＡを標的とする示されたＥＭＲ２を使用したＥＭＲ２のアデノシン塩基編集（ＡＢＥ）が、細胞生存率に影響を与えないことを示す。図１５Ａは、エレクトロポレーション後の０日目（Ｄ０）、２日目（Ｄ２）、及び５日目又は６日目（Ｄ５／Ｄ６）のいずれかで測定された細胞数を示す。図１５Ｂは、エレクトロポレーション後０日目（Ｄ０）、２日目（Ｄ２）、及び５日目又は６日目（Ｄ５／Ｄ６）のいずれかに実施された細胞生存率の分析を示す。図１５Ａ及び１５Ｂについては、各ｇＲＮＡ条件について、バーは、それぞれ、左から右に、Ｄ０、Ｄ２、及びＤ５／Ｄ６に対応する。 図１５Ｃは、それぞれ、図１５Ａ及び１５Ｂに提示される細胞数及び生存率の分析に対応する生物学的複製物の数を示している表である。
図１６Ａ～１６Ｃは、ＥＭＲ２編集細胞における編集結果の概要を示す。図１６Ａは、エレクトロポレーション後２日目（Ｄ２）及び５日目又は６日目（Ｄ５／Ｄ６）のいずれかで実施されたＥＭＲ２編集頻度のｒｈＡｍｐＳｅｑ分析を示す。 図１６Ｂは、エレクトロポレーション後２日目（Ｄ２）又は５日目若しくは６日目（Ｄ５／Ｄ６）のいずれかで、示されたＥＭＲ２編集ｇＲＮＡを用いた編集後の塩基編集結果のｒｈＡｍｐＳｅｑ分析を示す。グラフの各バー内で、それぞれ、底部は、スプライス部位の破壊に対応し、中央部分は、ミスセンスバリアントに対応し、上部は、ＥＭＲ２のインデルに対応する。図１６Ｃは、図１６Ａ及び１６Ｂに対応する生物学的複製物の数を示す表である。
図１７Ａ～１７Ｃは、ＥＭＲ２編集細胞上のＥＭＲ２表面タンパク質発現の概要を示す。図１７Ａは、ＥＭＲ２発現の割合として表されるエレクトロポレーション後０日目（Ｄ０）、２日目（Ｄ２）、及び５日目又は６日目（Ｄ５／Ｄ６）のいずれかで実施されたＥＭＲ２編集細胞におけるＥＭＲ２発現レベルのフローサイトメトリー分析を示す。図１７Ｂは、幾何平均（ｇＭＦＩ）として表される、エレクトロポレーション後０日目（Ｄ０）、２日目（Ｄ２）、及び５日目又は６日目（Ｄ５／Ｄ６）のいずれかに実施されたＥＭＲ２編集細胞におけるＥＭＲ２発現の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）フローサイトメトリー分析を示す。 図１７Ｃは、図１７Ａ及び１７Ｂに提示されるフローサイトメトリーデータに対応する生物学的複製物の数（ｎ）を示している表である。
図１８Ａ及び１８Ｂは、示されたＥＭＲ２標的化ｇＲＮＡ又は対照を用いた編集後のＥＭＲ２転写物発現の液滴デジタルＰＣＲ分析の概要を示す。エレクトロポレーションの日、示されたＥＭＲ２標的化ｇＲＮＡ、対照ｇＲＮＡ（ｇＣｒｔｌ）のエレクトロポレーション、又はエレクトロポレーションなしの対照（ｎｏ ＥＰ）後２日目（Ｄ２）又は５日目（Ｄ５）に実験物から細胞を回収し、単一ｄｄＰＣＴ反応を、全ての時間点の全ての状態由来のｃＤＮＡを用いて実施した。単一条件については、ＡＢＥ ｇＲＮＡ：ＥＭＲ２－４３、ＥＭＲ２－６２、ＥＭＲ２－６３、又はＥＭＲ２－６４であるｇＲＮＡを使用した。三重条件については、以下のｇＲＮＡを使用した：三重１－ＥＭＲ２－６２、ＡＢＥ ｇＲＮＡ標的化ＣＤ３３、及びＡＢＥ ｇＲＮＡ標的化ＣＤ１２３。三重２－ＡＢＥ ｇＲＮＡ ＥＭＲ２－６４、ＡＢＥ ｇＲＮＡ標的化ＣＤ３３、及びＡＢＥ ｇＲＮＡ標的化ＣＤ１２３。図１８Ａは、エクソン１９～２０のプライマーを使用した平均正規化ＥＭＲ２転写物発現を示す。 図１８Ｂは、エクソン１０～１２のプライマーを使用した平均正規化ＥＭＲ２転写物発現を示す。図１８Ｃは、図１８Ａ及び１８Ｂに提示されるＥＭＲ転写物データに対応する生物学的複製物の数（ｎ）を示している表である。ＥＭＲ２ ｇＲＮＡｓ ＥＭＲ２－６２、ＥＭＲ－６３、及びＥＭＲ２－６４は、わずかなＥＭＲ２転写物損失（ＥＰなしと比較して２０～５０％の損失）をもたらした。
本開示のいくつかの態様は、治療剤、例えば、免疫療法剤によって標的化される抗原の発現が欠損している、遺伝子修飾された細胞、例えば、造血細胞に関連する組成物、方法、方略、及び治療法を提供する。本明細書中で提供される遺伝子修飾された細胞は、例えば、特定の免疫療法剤に関連付けられる、特定の望ましくない効果、例えば、任意の標的上・疾患外の細胞傷害性を軽減又は回避するために有用である。
特定の免疫療法剤に関連付けられる、そのような望ましくない効果は、例えば、免疫療法の介入を必要とする対象内の健常な細胞が、免疫療法剤により標的化される抗原を発現する場合に生じ得る。例えば、対象は、典型的には健康な細胞では発現されないが、対象内の非悪性細胞のサブセットでは比較的低いレベルで発現され得る、具体的な抗原の発現の上昇したレベルに関連する悪性腫瘍と診断され得る。免疫療法剤、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤、又は抗原を標的とする治療用抗体若しくは抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の対象への投与は、悪性細胞の効率的な殺傷をもたらし得るが、対象において抗原を発現する非悪性細胞の除去ももたらし得る。この標的上・疾患外の細胞傷害性は、重大な副作用をもたらし、場合によっては、免疫療法剤の使用を完全に無効にし得る。
本明細書に提供される組成物、方法、方略、及び治療法は、特定の免疫療法剤の標的上・疾患外の細胞傷害性の問題に対処する。例えば、本開示のいくつかの態様は、免疫療法剤によって標的化される抗原、又はその抗原の具体的な形態の発現の欠如をもたらす、そのゲノムに修飾を有する遺伝子操作された細胞を提供する。そのような遺伝子操作された細胞、及びそれらの子孫は、免疫療法剤により標的化されず、このように、免疫療法剤によりもたらされる任意の細胞傷害性に供されない。例えば、細胞療法剤によって標的化かつ殺傷された可能性のある健常な細胞に取って代わるために、及び／又は細胞療法剤による標的化に耐性がある細胞の集団を提供するために、そのような細胞を、抗原を標的とする免疫療法剤を受けている対象に投与することができる。例えば、対象における健常な造血細胞が抗原を発現する場合、抗原を発現せず、したがって、細胞治療剤によって標的化されない、本明細書で提供される遺伝子操作された造血細胞、例えば、遺伝子操作された造血幹又は前駆細胞が、対象に投与され得る。そのような造血幹細胞又は前駆細胞は、対象において造血ニッチを再配置することができ、それらの子孫は、細胞療法剤により除去されたであろうものを含む、様々な造血系統を再構成することができる。
ＣＤ３１２とも呼ばれるＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）は、ＣＤ９７と高レベルの相同性を有する接着性Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のＥＧＦ７回膜貫通型（ＴＭ７）ファミリーの約９０ｋＤａのタンパク質（アイソフォーム依存性）である８２３個のアミノ酸である。ＥＭＲ２は、ヘテロ二量体を形成し、そのＥＧＦ様ドメイン４を介してコンドロイチン硫酸Ｂに結合し、マクロファージにおける細胞接着、顆粒球走化性、脱顆粒、及び炎症促進性サイトカインの放出を仲介する。例えば、Ｋｕａｎ－Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１７） ８：３７３を参照のこと。いかなる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、ＥＭＲ２は、顆粒球、マクロファージ、及びクッパー細胞において最も高い発現を有する骨髄細胞上で発現される。
ヒト染色体１９上に位置するＡＤＧＲＥ２遺伝子は、ヒトＥＭＲ２をコードし、１９個のエクソンを古典的には含むが、代替的なＲＮＡスプライシングにより、様々な数のＥＧＦドメインを有する多くのアイソフォームが存在する。全血中の優性アイソフォームは、１７個のエクソンを含有する。例えば、Ｓａｆａｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃ．Ｒｅｖ．（２０１４）．８（２４２）：２０－２４を参照されたい。
ＥＭＲ２発現はまた、再発／難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と関連している。ＡＭＬ患者細胞における標的分布の分析により、ＥＭＲ２は、再発／難治性ＡＭＬ患者試料の大部分を含むほとんどのＡＭＬ患者においてＣＤ３３、ＣＬＬ１及びＣＤ１２３と共に、ＡＭＬ細胞（白血病幹細胞を含む）の９０％超で発現されることが示された。図１Ａ～１Ｅを参照されたい。
さらに、異常なＥＭＲ２発現は、ヒトの乳癌及び患者の生存と関連している。例えば、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．（２０１１）２５（３）：６１９－６２７を参照のこと。ＥＭＲ２過剰発現は、膀胱癌、結腸直腸癌、胃癌及び食道癌、並びに神経膠芽腫を含む他の癌と関連している。例えば、Ｓａｆａｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｖ．（２０１４） ８（２４２）：２０－２４を参照されたい。
ＥＭＲ２は、活性化された健常な細胞と悪性細胞に発現する抗原の両方に共通して発現しているため、ＥＭＲ２の治療標的化は、健常な細胞の殺傷をもたらし得る。
本明細書中に記載されているのは、ＥＭＲ２をコードする遺伝子の遺伝子修飾を特異的に方向づけるために開発されているｇＲＮＡである。また、本明細書中で提供されるのは、修飾された細胞が、ＥＭＲ２特異的免疫療法により認識されないように、ＥＭＲ２において欠損している又はＥＭＲ２の低下した発現を有する、遺伝子修飾された細胞、例えば、造血細胞、免疫細胞、リンパ球、及びそのような細胞の集団を生成するためのそのようなｇＲＮＡの使用である。また、本明細書中で提供されるのは、特定の免疫療法剤の標的上・疾患外細胞傷害性の問題に対処するために、そのような細胞、又はその組成物を対象に投与することを含む方法である。一部の例では、本明細書に記載されるように、遺伝子修飾された細胞は、例えば、ＥＭＲ２が欠損しているか、若しくはＥＭＲ２の発現が低減しているか、又はＥＭＲ２の変異体若しくはバリアントを発現し、したがって、ＥＭＲ２特異的免疫療法による殺傷に耐性があるＴ細胞などの系統に専念した細胞に発生することが可能である、ＥＭＲ２が欠損しているか、又はＥＭＲ２の発現が低減している造血細胞である。あるいは又は加えて、一部の例では、本明細書中に記載されるように、遺伝子修飾された細胞は、免疫細胞であり、例えば、ＥＭＲ２において欠損している、又はＥＭＲ２の低下した発現を有する、又はＥＭＲ２の変異あるいはバリアントを発現し、従って、他のＥＭＲ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞によるフラトリサイド殺傷に耐性であるＥＭＲ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞などである。
遺伝子操作された細胞並びに関連する組成物及び方法
本開示のいくつかの態様は、ＥＭＲ２の発現の喪失をもたらすそれらのゲノム中の修飾、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤により認識されないＥＭＲ２のバリアント形態の発現を含む遺伝子操作された細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞のゲノムにおける修飾は、ＥＭＲ２をコードするゲノム配列における変異である。
本明細書で使用される場合の「変異」という用語は、参照配列、例えば、そのような変異を有していない細胞の対応する配列、又は対応する野生型核酸配列と比較して、核酸配列の変化（例えば、挿入、欠失、逆位、又は置換）を指す。本明細書中で提供される一部の実施形態では、ＥＭＲ２をコードする遺伝子中の変異は、変異を持つ細胞におけるＥＭＲ２の発現の喪失をもたらす。一部の実施形態では、ＥＭＲ２をコードする遺伝子中での変異は、ＥＭＲ２を標的化する免疫療法剤により結合されない、又は遺伝子によりコードされる非変異ＥＭＲ２形態よりも有意に低いレベルで結合される、ＥＭＲ２のバリアント形態の発現をもたらす。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＥＭＲ２遺伝子におけるゲノム変異を持つ細胞は、ＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤、例えば、抗ＥＭＲ２抗体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって結合されないか、又は著しく低いレベルで結合される。
本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞、例えば、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント形態の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、遺伝子操作された細胞を生成するための組成物及び方法を提供する。本明細書で提供されるそのような組成物及び方法は、限定されるものではないが、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドヌクレアーゼを使用することによる、遺伝子操作された細胞のための好適な方略及びアプローチ、並びにそのようなＲＮＡガイドヌクレアーゼに結合し、それらを細胞のゲノム内の好適な標的部位に標的化して、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント形態の発現をもたらす、ゲノム修飾を生じさせることが可能である好適なＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作された造血幹若しくは前駆細胞又は遺伝子操作された免疫エフェクター細胞などの遺伝子操作された造血細胞）が、「編集」とも称される標的化された変化を細胞のゲノムに導入することが可能な任意の技術を含む、ゲノム編集技術を介して生成される。
一つの例示的な好適なゲノム編集技術は、細胞のゲノムに標的一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ切断を導入するためのＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの使用を含む、「遺伝子編集」であり、これは、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（「代替ＮＨＥＪ」若しくは「ａｌｔ－ＮＨＥＪ」と称されることもあるＭＭＥＪ）、又は典型的には（例えば、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド配列挿入、欠失、逆位、又は置換を介して）ヌクレアーゼ切断の部位に、又はそのすぐ近位に改変された核酸配列をもたらす相同組換え修復（ＨＤＲ）などの細胞修復機構を誘起する。例えば、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１９）２１：１４６８－１４７８、例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１４）１５７：１２６２－１２７８、Ｊａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（２０１６）４４：６－１６、Ｓｆｅｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（２０１５）４０：７０１－７１４を参照のこと。
別の例示的な好適なゲノム編集技術は、「塩基編集」であり、これは、塩基エディター、例えば、具体的な核酸塩基、例えば、細胞ミスマッチ修復機構を介して、ＣヌクレオチドからＴヌクレオチドへの変化、又はＡヌクレオチドからＧヌクレオチドへの変化をもたらす、Ｃ又はＡヌクレオチドのシトシン又はアデノシン核酸塩基を標的とし、脱アミン化する、デアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ損傷又は部分的ヌクレアーゼ損傷ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の使用を含む。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３３：４２０－４２４、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１８）１９（１２）：７７０－７８８、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）３８：８２４－８４４を参照されたい。
更に別の例示的な好適なゲノム編集技術には、触媒的に損なわれた又は部分的に触媒的に損なわれたＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、操作された逆転写酵素（ＲＴ）ドメインに融合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを使用した、新しい遺伝情報、例えば、改変されたヌクレオチド配列の特異的に標的化されたゲノム部位への導入を含む、「プライム編集」が含まれる。Ｃａｓ／ＲＴ融合は、所望の編集をコードする核酸配列も含み、ＲＴのためのプライマーとして機能することができる、ガイドＲＮＡによってゲノム内の標的部位に標的化される。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１９）５７６（７７８５）：１４９－１５７を参照のこと。
ゲノム編集技術の使用は、典型的には、一部の実施形態では、例えば、塩基編集又はプライム編集のために、触媒的に損なわれるか、又は部分的に触媒的に損なわれ得る、好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼの使用を特徴とする。好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼの例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが挙げられる。例えば、一部の実施形態では、本明細書で提供される細胞を遺伝子操作する方法で使用するための好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９ヌクレアーゼである。別の例について、一部の実施形態では、本明細書で提供される細胞を遺伝子操作する方法で使用するための好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼである。例示的な、適切なＣａｓ１２ヌクレアーゼの例は、限定されないが、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ、他のＣａｓ１２ａオルソログ、及びＣａｓ１２ａ誘導体、例えばＭＡＤ７システム（ＭＡＤ７（商標）、Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ，Ｉｎｃ．）、又はＡｌｔ－Ｒ Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）Ｕｌｔｒａヌクレアーゼ（Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ１２ａ Ｕｌｔｒａ；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）などを含む。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．ＬＩＰＳＣＯＭＢ ２０１７．Ｉｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ：Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２０２０）１１７（６０）：１８０５－１８１６を参照のこと。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作された造血細胞、例えば、遺伝子操作された造血幹若しくは前駆細胞、又は遺伝子操作された免疫エフェクター細胞など）は、ＲＮＡガイドヌクレアーゼが標的部位に結合し、細胞のゲノムＤＮＡを切断するために好適な条件下で、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼなどを、細胞のゲノム内の好適な標的部位に標的化することによって生成される。適切なＲＮＡガイドヌクレアーゼを、適切なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）により、ゲノム内の特定の標的部位に標的化することができる。本開示の態様によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを標的化するための好適なｇＲＮＡが、本明細書で提供され、例示的に好適なｇＲＮＡが、本明細書の他の場所でより詳細に記載される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＥＭＲ２ ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体化される。様々なＣａｓ９ヌクレアーゼが、例えば、ＥＭＲ２遺伝子にゲノム修飾を生成するために、本開示の態様によるゲノム編集を生じさせるために本明細書で提供されるｇＲＮＡとともに使用するために好適である。典型的には、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、細胞のゲノム上の標的部位、例えば、ＥＭＲ２遺伝子内の標的部位を標的とする、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体の形成に好適な形態及び条件下で提供される。一部の実施形態では、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体を、ＥＭＲ２遺伝子中の所望の標的ドメインに標的化するための所望のＰＡＭ特異性を示すＣａｓヌクレアーゼが使用される。好適な標的ドメイン及び対応するｇＲＮＡ標的化ドメイン配列が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が、例えば、インビトロで形成され、標的細胞が、例えば、細胞内へのＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体のエレクトロポレーションを介して、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞は、別々にＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡと接触され、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内に形成される。一部の実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸、又は両方と接触される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、好適なゲノム編集技術を使用して生成され、ゲノム編集技術は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用によって特徴付けられる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、若しくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ｓｔＣａｓ９）のものであるか、又はそれらに由来する。追加の好適なＣａｓ９分子としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ属、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ属、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、若しくはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅのもの、又はそれらに由来するものが含まれる。一部の実施形態では、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼの触媒的に損なわれた又は部分的に損なわれたバリアントが、使用され得る。追加の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼ、及びヌクレアーゼバリアントが、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。本開示は、この点において限定されない。
一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓ分子である。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、少なくとも一つのアミノ酸残基だけ、参照配列、例えば、最も類似する天然に存在するＣａｓ９分子、又は参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／１５７０７０号の表５０の配列と異なる、操作、改変、又は修飾されたＣａｓ分子である。
一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼのクラス２タイプＶに属するＣａｓヌクレアーゼが使用される。クラス２タイプＶ Ｃａｓヌクレアーゼは、タイプＶ－Ａ、タイプＶ－Ｂ、タイプＶ－Ｃ、及びタイプＶ－Ｕとしてさらに分類することができる。例えば、Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１７）を参照のこと。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ１などのタイプＶ－Ｂ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（２０１５）６０：３８５－３９７を参照のこと。一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム編集の方法で使用されるＣａｓヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）ヌクレアーゼなどのタイプＶ－Ａ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。例えば、Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１８）７１：１－９を参照のこと。一部の実施形態では、本明細書中で提供されるゲノム編集の方法において使用されるＣａｓヌクレアーゼは、プレボテラ属又はフランシセラ属、アシダミノコッカス属（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ科細菌（ＬｐＣｐｆ１）、あるいはユウバクテリウム・レクターレから由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＭＡＤ７（商標）（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの天然に存在するバリアント及び修飾バリアントの両方が、本開示の態様による使用に好適である。例えば、ｄＣａｓ又はニッカーゼバリアント、改変されたＰＡＭ特異性を有するＣａｓバリアント、及び改善されたヌクレアーゼ活性を有するＣａｓバリアントが、本開示のいくつかの実施形態によって包含される。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、低減されたＰＡＭ配列特異性を有するバリアントである。一部の実施形態では、かかるｇＲＮＡは、「ＰＡＭｌｅｓｓ又は「ｎｅａｒ ＰＡＭｌｅｓｓ」と呼ばれる。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＳｐＲＹヌクレアーゼである。例えば、Ｗａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０ Ａｐｒ １７；３６８（６４８８）：２９０－２９６を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの例示的で非限定的な好適なＣａｓヌクレアーゼのいくつかの特徴が、いかなる特定の理論にも拘束されることを所望することなく、本明細書により詳細に記載される。
天然に存在するＣａｓ９ヌクレアーゼは、典型的には、二つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブ及びヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、その各々は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号、例えば、その中の図９Ａ～９Ｂ（その出願が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）に記載されるドメインを更に含む。
ＲＥＣローブは、アルギニン豊富ブリッジヘリックス（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、及びＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、Ｃａｓ９特異的機能ドメインであると考えられる。ＢＨドメインは、長いアルファヘリックス及びアルギニンリッチ領域であり、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の配列のアミノ酸６０～９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡの反復：抗反復二本鎖の認識に関与する。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の配列のアミノ酸９４～１７９及び３０８～７１７に二つのＲＥＣ１モチーフを含む。これら二つのＲＥＣ１ドメインは、線形一次構造ではＲＥＣ２ドメインによって分離されているが、三次構造に集合し、ＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメイン又はその一部はまた、反復：抗反復二本鎖の認識において役割を果たし得る。ＲＥＣ２ドメインは、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１８０～３０７を含む。
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン（本明細書ではＲｕｖＣ様ドメインとも称される）、ＨＮＨドメイン（本明細書ではＨＮＨ様ドメインとも称される）、及びＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の非相補鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の配列のそれぞれアミノ酸１～５９、７１８～７６９、及び９０９～１０９８で、三つの分割されたＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩ、それらは、しばしば、当技術分野においてＲｕｖＣＩドメイン、又はＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインとして一般に言及される）から構築される。ＲＥＣ１ドメインと同様に、三つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内の他のドメインによって直線的に分離されるが、三次構造では、三つのＲｕｖＣモチーフは、集合してＲｕｖＣドメインを形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の相補鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ ＩＩ－ＩＩＩモチーフの間に存在し、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の配列のアミノ酸７７５～９０８を含む。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の配列のアミノ酸１０９９～１３６８を含む。
結晶構造が、天然に存在する細菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１７６）：１２４７９９７，２０１４を参照）、及びガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合）を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４）１５６：９３５－９４９、及びＡｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３５７９を参照）について決定されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９分子は、標的部位に、又はその直接近位に二本鎖ＤＮＡ切断の導入をもたらす、ヌクレアーゼ活性を示す。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、エンドヌクレアーゼの触媒残基のうちの一つを不活化するように修飾されている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ニッカーゼであり、一本鎖切断を生じる。例えば、Ｄａｂｒｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）１２（７５）を参照のこと。酵素のＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメイン内の一つ以上の変異が、Ｃａｓ９効率を改善し得ることが示されている。例えば、Ｓａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１８（１３）を参照されたい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、第二のドメイン、例えば、ＤＮＡ又はクロマチンを修飾するドメイン、例えば、デアミナーゼ又はデメチラーゼドメインに融合される。いくつかのそのような実施形態では、Ｃａｓ９分子は、そのエンドヌクレアーゼ活性を排除するように修飾される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、相同誘導型修復（ＨＤＲ）のためのテンプレートとともに投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、ＨＤＲテンプレートを伴わずに投与される。
一部の実施形態では、酵素の特異性を増強する（例、オフターゲット効果を低下させ、強固なオンターゲット切断を維持する）ように改変されるＣａｓ９ヌクレアーゼが使用される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、増強された特異性Ｃａｓ９バリアント（例、ｅＳＰＣａｓ９）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）３５１（６２６８）：８４－８８を参照のこと。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、高忠実度Ｃａｓ９バリアント（例、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５２９：４９０－４９５を参照のこと。
様々なＣａｓヌクレアーゼが、当技術分野で公知であり、様々な供給源から入手され、酵素の一つ以上の活性又は特異性を調節するように操作／修飾され得る。好適なＣａｓヌクレアーゼ、例えば、ＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９などの好適なＣａｓ９ヌクレアーゼのＰＡＭ配列の選好及び特異性が、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、一つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／修飾されている。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼが操作／修飾を伴わずに認識するＰＡＭ配列とは異なる一つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／修飾されている。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、酵素の標的外活性を低減するように操作／修飾されている。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ活性の特異性を変化させる（例、オフターゲット切断を低下させ、細胞中のエンドヌクレアーゼ活性又は寿命を減少させ、相同性指向性組換えを増加させ、非相同末端結合を低下させる）ためにさらに改変されるＣａｓヌクレアーゼが使用される。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１７）１６８：２０－３６を参照のこと。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識又は優先度を変化させるように改変されるＣａｓヌクレアーゼが使用される。例えば、ＳｐＣａｓ９が、ＰＡＭ配列ＮＧＧを認識する一方で、一つ以上の修飾を含むＳｐＣａｓ９のいくつかのバリアント（例えば、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＥＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９）は、バリアントＰＡＭ配列、例えば、ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、及び／又はＮＧＣＧを認識し得る。別の例として、ＳａＣａｓ９はＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴを認識するのに対し、一つ又は複数の改変（例、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９）を含むＳａＣａｓ９の一部のバリアントは、ＰＡＭ配列ＮＮＲＴを認識し得る。別の実施例では、ＦｎＣａｓ９（フランシセラ・ノビシダ由来のＣａｓ９）が、ＰＡＭ配列ＮＮＧを認識する一方で、ＦｎＣａｓ９のバリアントは、一つ以上の修飾（例えば、ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９）を含み、ＰＡＭ配列ＹＧを認識し得る。別の実施例では、置換変異Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒを含むＣａｓ１２ａヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列ＴＹＣＶを認識する。別の実施例では、置換変異Ｓ５４２Ｒ、Ｋ６０７Ｒ、及びＮ５５２Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列ＴＡＴＶを認識する。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）３５（８）：７８９－７９２を参照のこと。
一部の実施形態では、一つより多く（例えば、２つ、３つ、又はそれ以上）のＣａｓ分子が使用される。一部の実施形態では、一つより多く（例えば、２つ、３つ、又はそれ以上）のＣａｓ９分子が使用される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも一つは、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子のうちの少なくとも一つは、Ｃｐｆ１酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも一つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも一つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、少なくとも一つのＣａｓ９分子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓではない生物に由来する。
一部の実施形態では、塩基エディターを使用して、ＥＭＲ２の発現の喪失、又は免疫療法により標的化されないＥＭＲ２バリアントの発現をもたらすゲノム修飾が作製される。塩基エディターは、典型的には、機能ドメイン、例えば、デアミナーゼドメインに融合された触媒的に不活性又は部分的に不活性なＣａｓヌクレアーゼを含む。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照のこと。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓヌクレアーゼは、「死Ｃａｓ」又は「ｄＣａｓ」と称される。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ分子は、低減した活性を有し、例えば、ニッカーゼ（ｎＣａｓ）である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓ又はｎＣａｓを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）、例えば、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣ デアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））から進化したＣＢＥに融合されたｄＣａｓ又はｎＣａｓを含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、一つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合されたｄＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９分子は、低減した活性を有し、Ｃａｓ９ニカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９分子（ｄＣａｓ９）は、一つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合された触媒的なＣａｓ９分子（ｄＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｎＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｎＣａｓ９を含む。
好適な塩基エディターの例としては、限定されるものではないが、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＣＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＢＥ３、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ＡＢＥ８、ＡＢＥ８ｅ、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＡＢＥ、ＣＢＥ、ＣＢＥ１、ＣＢＥ２、ＣＢＥ３、ＣＢＥ４、及びＣＲＩＳＰＲ－ＳＫＩＰが含まれる。塩基エディターの追加の例は、例えば、米国出願公開第２０１８／０３１２８２５Ａ１号、米国出願公開第２０１８／０３１２８２８Ａ１号、及びＰＣＴ公開第２０１８／１６５６２９Ａ１号で見出すことができ、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本開示のいくつかの態様は、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらす細胞のゲノムにおける修飾を生じさせるために、例えば、本明細書で提供されるＲＮＡガイドヌクレアーゼを細胞のゲノム内の好適な標的部位に標的化するために好適であるガイドＲＮＡを提供する。
「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、本明細書では同義的に使用され、核酸、典型的には、ＲＮＡガイドヌクレアーゼによって結合され、標的核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的部位へのＲＮＡガイドヌクレアーゼの特異的標的化又はホーミングを促進するＲＮＡを指す。ｇＲＮＡは、典型的には、少なくとも二つのドメイン：時折、ＲＮＡガイドヌクレアーゼへの結合を媒介する「ｇＲＮＡ足場」又は「ｇＲＮＡ骨格」としても言及される「結合ドメイン」、及び標的部位へのｇＲＮＡ結合ＲＮＡガイドヌクレアーゼの標的化を媒介する「標的化ドメイン」を含む。いくつかのｇＲＮＡは、追加のドメイン、例えば、相補性ドメイン、又はステムループドメインを含む。天然のｇＲＮＡ結合ドメイン及びその操作されたバリアントの構造及び配列は、当業者に周知である。いくつかの好適なｇＲＮＡが、単一の核酸配列を含む単分子である一方で、他の好適なｇＲＮＡは、二つの配列（例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含む。
一部の例示的な、適切なＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場配列が本明細書中に提供されており、追加の適切なｇＲＮＡ足場配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。そのような追加の好適な足場配列には、限定されるものではないが、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８、ＰＣＴ公開第２０１４／０９３６９４号、及びＰＣＴ公開第２０１３／１７６７７２に引用されているものが挙げられ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、天然に存在するＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡの結合ドメインは、典型的には、ｃｒＲＮＡ（部分的に）及びｔｒａｃｒＲＮＡという二つのＲＮＡ分子を含む。例えば、テトラループを介して、又はクリックケミストリー型共有結合を介して、互いに共有結合されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含む、単一のＲＮＡ分子のみを含むＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡのバリアントが、操作されており、一般的に「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」と称される。天然に存在するＣａｓ１２ａガイドＲＮＡが単一のＲＮＡ分子を含むため、他のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼとともに使用するための好適なｇＲＮＡは、典型的には、単一のＲＮＡ分子のみを含む。したがって、好適なｇＲＮＡは、本明細書ではｓｇＲＮＡと称されることもある、単分子（単一のＲＮＡ分子を有する）、又はモジュール式（一つより多く、典型的には、二つの別個のＲＮＡ分子を含む）であり得る。
ＥＭＲ２遺伝子中の標的部位を標的化するために適切なｇＲＮＡは、多数のドメインを含み得る。一部の実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが使用される一部の実施形態では、単分子ｓｇＲＮＡは、５’から３’まで、
ＥＭＲ２遺伝子中の標的部位配列に対応する標的化ドメイン、
第一の相補性ドメイン、
結合ドメイン、
第二の相補性ドメイン（第一の相補性ドメインと相補的である）、
近位ドメイン、及び
任意選択的に、テールドメインを含む。
これらのドメインの各々が、ここでより詳細に記載される。
本明細書で提供されるｇＲＮＡは、典型的には、細胞のゲノム内の標的部位に結合する標的化ドメインを含む。標的部位は、典型的には、ＰＡＭ配列と、ＰＡＭ配列と同一の鎖上に、かつそれに直接隣接して、標的ドメインとを含む、二本鎖ＤＮＡ配列である。ｇＲＮＡの標的化ドメインは、典型的には、時として一つ以上のミスマッチを伴う標的ドメインの配列に類似するが、典型的には、ＤＮＡ配列の代わりにＲＮＡを含むという点で標的ドメイン配列に対応する、ＲＮＡ配列を含む。したがって、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、（完全又は部分的相補性で）標的ドメインの配列に相補的である二本鎖標的部位の配列と、したがって、ＰＡＭ配列を含む鎖に相補的である鎖と塩基対合する。ｇＲＮＡの標的化ドメインは、典型的には、ＰＡＭ配列を含まないことが理解されるであろう。ＰＡＭの場所は、採用されるヌクレアーゼに応じて、標的ドメイン配列の５’又は３’であり得ることが更に理解されるであろう。例えば、ＰＡＭは、典型的には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼについては標的ドメイン配列の３’、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼについては標的ドメイン配列の５’である。ＰＡＭの場所及び標的部位に結合するｇＲＮＡの機構の例証については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖａｎｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１９）６：６の図１を参照されたい。ＲＮＡガイドヌクレアーゼを標的部位に標的化するｇＲＮＡの機構の追加の例証及び説明については、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕ Ｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１４）（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）、及びＳｔｅｒｎｂｅｒｇ ＳＨ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３０１１）を参照されたい。
標的化ドメインは、標的ドメインの配列に対応するヌクレオチド配列、すなわち、ＰＡＭ配列に直接隣接するＤＮＡ配列（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼについてはＰＡＭ配列の５’、又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼについてはＰＡＭ配列の３’）を含み得る。標的化ドメイン配列は、典型的には、１７～３０個のヌクレオチドを含み、標的ドメイン配列に完全に一致する（すなわち、いかなるミスマッチヌクレオチドも伴わない）か、又は一つ以上であるが典型的には４つ以下のミスマッチを含み得る。標的化ドメインが、ＲＮＡ分子の一部であるため、ｇＲＮＡが、典型的には、リボヌクレオチドを含む一方で、ＤＮＡ標的化ドメインは、デオキシリボヌクレオチドを含むであろう。
２２ヌクレオチド標的ドメイン及びＮＧＧ ＰＡＭ配列を含むＣａｓ９標的部位、並びに標的ドメインに完全に対応する（したがって、標的ドメイン及びＰＡＭを含む鎖に相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性で塩基対合する）標的化ドメインを含むｇＲＮＡの例示的な例証が、以下に提供される。
２２ヌクレオチド標的ドメイン及びＴＴＮ ＰＡＭ配列を含むＣａｓ１２ａ標的部位、並びに標的ドメインに完全に対応する（したがって、標的ドメイン及びＰＡＭを含む鎖に相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性で塩基対合する）標的化ドメインを含むｇＲＮＡの例示的な例証が、以下に提供される。
一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列は、５’－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｖ－３’である。
理論によって拘束されることを所望しないが、少なくとも一部の実施形態では、標的化ドメインの長さ及び標的配列との相補性は、標的核酸とのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡの標的化ドメインは、長さが５～５０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが１５～２５個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが１８～２２個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが１９～２１個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが１５個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが１６個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが１７個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが１８個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが１９個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが２０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが２１個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが２２個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが２３個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが２４個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、長さが２５個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化ドメインは、ミスマッチを伴わずに、本明細書で提供される標的ドメイン配列又はその一部に完全に対応する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡの標的化ドメインは、本明細書で提供される標的ドメイン配列に対して１つのミスマッチを含む。一部の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメイン配列に対して２つのミスマッチを含む。一部の実施形態では、標的ドメインは、標的ドメイン配列に対して３つのミスマッチを含む。
一部の実施形態では、標的化ドメインは、例えば、参照によりその全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号に記載されるように、コアドメインと、二次標的化ドメインとを含む。一部の実施形態では、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端から約８～約１３個のヌクレオチド（例えば、標的化ドメインの最も３’位の８～１３個のヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、二次ドメインは、コアドメインに対して５’に位置付けられる。一部の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン配列又はその一部に完全に対応する。他の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン配列の対応するヌクレオチドとミスマッチである、一つ以上のヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡが提供される一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、第一の相補性ドメインと、第二の相補性ドメインを含み、第一の相補性ドメインは、第二の相補性ドメインと相補的であり、少なくとも一部の実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために、第二の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。一部の実施形態では、第一の相補性ドメインは、長さが５～３０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、第一の相補性ドメインは、５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、及び３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。一部の実施形態では、５’サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８又は９個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、中央サブドメインは、長さが１個、２個、又は３個、例えば、１個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、３’サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、又は４～１０個、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。第一の相補性ドメインは、天然の第一の相補性ドメインと相同性を共有することができ、又はそれから由来することができる。一実施形態では、それは、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、又はＳ．サーモフィラス、第一の相補性ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。
上記のドメインの配列及び配置は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／１５７０７０においてより詳細に記載されており、その中のｐ．８８～１１２を含めて、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
結合ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第一の相補性ドメインを第二の相補性ドメインと結合する役割を果たし得る。結合ドメインは、第一の相補性ドメイン及び第二の相補性ドメインを共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。一部の実施形態では、結合は、共有結合である。一部の実施形態では、結合ドメインは、第一の相補性ドメインと第二の相補性ドメインとの間に介在する共有結合であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、一つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１２６１７６号に開示される、少なくとも一つの非ヌクレオチド結合を含む。
一部の実施形態では、第二の相補性ドメインは、少なくとも部分的に、第一の相補性ドメインと相補的であり、一実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために第二の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。一部の実施形態では、第二の相補性ドメインは、第一の相補性ドメインとの相補性を欠く配列、例えば、二本鎖領域からループを作る配列を含むことができる。一部の実施形態では、第二の相補性ドメインは、長さが５～２７個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、第二の相補性ドメインは、第一の相補性領域よりも長い。一実施形態では、相補ドメインは、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、第二の相補性ドメインは、５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、及び３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。一部の実施形態では、５’サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、又は４～１０個、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、中央サブドメインは、長さが１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ、例えば、３つのヌクレオチドである。一部の実施形態では、３’サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８又は９個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、第一の相補性ドメインの５’サブドメイン及び３’サブドメインは、それぞれ、第二の相補性ドメインの３’サブドメイン及び５’サブドメインと相補的、例えば、完全に相補的である。
一部の実施形態では、近位ドメインは、長さが５～２０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインと相同性を共有するか、又はそれに由来し得る。一実施形態では、それは、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、又はＳ．サーモフィルスからの近位ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。
広範囲のテールドメインが、ｇＲＮＡで使用するために好適である。一部の実施形態では、テールドメインは、長さが０（不在）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、天然に存在するテールドメインの５’末端からの配列に由来するか、又はそれと相同性を共有する。一部の実施形態では、テールドメインは、互いに相補的であり、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する配列を含む。一部の実施形態では、テールドメインは、存在しないか、又は長さが１～５０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、テールドメインは、天然に存在する近位テールドメインと相同性を共有するか、又はそれに由来し得る。一部の実施形態では、テールドメインは、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、又はＳ．サーモフィラスからのテールドメインと少なくとも５０％の相同性／同一性を有する。一部の実施形態では、テールドメインは、３’末端に、インビトロ又はインビボ転写の方法に関連するヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、
例えば、５’から３’の方向に、
標的化ドメイン（ＥＭＲ２遺伝子内の標的ドメインに対応する）、及び
第一の相補性ドメイン、を含む、第一の鎖と、
例えば、５’から３’の方向に、
任意選択的に、５’拡張ドメイン、
第二の相補性ドメイン、
近位ドメイン、及び
任意選択的に、テールドメインを含む、第二の鎖と、を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡのうちのいずれかは、化学的に修飾されている一つ以上のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡの化学修飾は、以前に記載されており、好適な化学修飾には、ｇＲＮＡ機能のために有益であり、所与のｇＲＮＡの任意の望ましくない特性、例えば、標的外効果を計測可能に増加させない、任意の修飾が含まれる。好適な化学修飾としては、例えば、ｇＲＮＡがエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ触媒活性の影響をあまり受けなくするものが挙げられ、限定されるものではないが、ホスホロチオエート骨格修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾（例えば、３’及び５’末端の一方又は両方における）、２’Ｆ修飾、二環式ヌクレオチド－ｃＥｔによるリボース糖の置き換え、３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）修飾、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。追加の好適なｇＲＮＡ修飾が、本開示に基づいて当業者に明らかとなり、そのような好適なｇＲＮＡ修飾には、限定されるものではないが、例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｒａｈｄａｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（５１）Ｅ７１１０－Ｅ７１１７及びＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）；３３（９）：９８５－９８９において記載されるものを含み、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
例えば、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、一つ以上の２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端の両方に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及び３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのリン酸塩結合を含む。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのチオＰＡＣＥ結合を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、一つ以上の２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、一つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられている、骨格を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、一つ以上の２’－Ｏ修飾及び３’－リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、一つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、一つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、化学的に修飾された骨格を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、一つ以上の非架橋酸素原子は、硫黄原子に置き換えられている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、一つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、一つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、一つ以上の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、又は６個の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、三つの末端位置のうちの一つ以上及び５’末端に、並びに／又は三つの末端位置のうちの一つ以上に及び３’末端に、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、参照によりそれらの全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／２１４４６０号、同ＷＯ２０１６／０８９４３３号、及び同ＷＯ２０１６／１６４３５６号に記載されるように、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で提供されるＥＭＲ２標的化ｇＲＮＡは、適切な任意の様式において細胞に送達され得る。例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼに結合されたｇＲＮＡを含むＲＮＰを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達のための様々な適切な方法が記載されており、例示的な、適切な方法は、限定されないが、細胞中へのＲＮＰのエレクトロポレーション、細胞中へのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのエレクトロポレーション、様々なタンパク質又は核酸トランスフェクション方法、及びウイルスベクター、例えば、例えば、レトロウイルス（例、レンチウイルス）ベクターなどを介したコードＲＮＡ又はＤＮＡの送達を含む。任意の適切な送達方法が、本開示により包含され、本開示は、この点において限定されない。
本開示は、ＲＮＡガイドヌクレアーゼをヒトＥＭＲ２に標的化するために有用である、多数のＥＭＲ２標的部位及び対応するｇＲＮＡを提供する。以下の表１は、本明細書中に記載されるｇＲＮＡにより結合され得る、ヒト内因性ＥＭＲ２遺伝子中の好ましい標的ドメインを例証する。表１中に示されるヒトＥＭＲ２の例示的な標的配列は、一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ＳｐＣａｓ９との使用のためである。
本開示は、ＲＮＡガイドヌクレアーゼをヒトＥＭＲ２に標的化するために有用である、例示的なＥＭＲ２標的化ｇＲＮＡを提供する。以下の表２は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをヒト内因性ＥＭＲ２遺伝子に標的化するｇＲＮＡにおける使用のための好ましい標的化ドメインを例証する。表２中に示されるヒトＥＭＲ２の例示的な標的配列は、一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ＳｐＣａｓ９との使用のためである。
ヒトＥＭＲ２の例示的な塩基編集標的部位配列が、そのような部位を標的化するのに有用な例示的なｇＲＮＡ標的化ドメイン配列と同様に提供される。各標的部位について、第一の配列は、ＤＮＡ標的ドメイン配列を表し、第二の配列は、その逆補体を表し、第三の配列は、それぞれの標的部位を標的とするために使用され得るｇＲＮＡの例示的な標的化ドメイン配列を表す。太字で下線を引いたヌクレオチド残基は、塩基エディターによって変異が予測されるヌクレオチドを示す。
表３に示されるヒトＥＭＲ２の例示的な標的配列は、一部の実施形態では、例えば、シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）で使用するためのものである。
表５に示されるヒトＥＭＲ２の例示的な標的配列は、一部の実施形態では、例えば、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）で使用するためのものである。各標的部位について、第一の配列は、ＤＮＡ標的ドメイン配列を表し、第二の配列は、その逆補体を表し、第三の配列は、それぞれの標的部位を標的とするために使用され得るｇＲＮＡの例示的な標的化ドメイン配列を表す。
一部の実施形態では、gRNAは、ほとんどのPAM配列を標的とし、低減されたPAM配列特異性を有する。一部の実施形態では、かかるgRNAは、「PAMless又は「near PAMless」と呼ばれる。
一部の実施形態では、表７に提供されるｇＲＮＡのいずれかは、ＡＢＥ又はＣＢＥと共に使用され得る。一部の実施形態では、表７に提供されるｇＲＮＡのいずれかは、ＮＲＮ ＰＡＭを有するＳｐＲＹ Ｃａｓ９と共に使用され得る。
全長ＥＭＲ２の代表的なアミノ酸配列が、以下に示されるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ９ＵＨＸ３－１により提供される。
MGGRVFLVFLAFCVWLTLPGAETQDSRGCARWCPQDSSCVNATACRCNPGFSSFSEIITTPMETCDDINECATLSKVSCGKFSDCWNTEGSYDCVCSPGYEPVSGAKTFKNESENTCQDVDECQQNPRLCKSYGTCVNTLGSYTCQCLPGFKLKPEDPKLCTDVNECTSGQNPCHSSTHCLNNVGSYQCRCRPGWQPIPGSPNGPNNTVCEDVDECSSGQHQCDSSTVCFNTVGSYSCRCRPGWKPRHGIPNNQKDTVCEDMTFSTWTPPPGVHSQTLSRFFDKVQDLGRDYKPGLANNTIQSILQALDELLEAPGDLETLPRLQQHCVASHLLDGLEDVLRGLSKNLSNGLLNFSYPAGTELSLEVQKQVDRSVTLRQNQAVMQLDWNQAQKSGDPGPSVVGLVSIPGMGKLLAEAPLVLEPEKQMLLHETHQGLLQDGSPILLSDVISAFLSNNDTQNLSSPVTFTFSHRSVIPRQKVLCVFWEHGQNGCGHWATTGCSTIGTRDTSTICRCTHLSSFAVLMAHYDVQEEDPVLTVITYMGLSVSLLCLLLAALTFLLCKAIQNTSTSLHLQLSLCLFLAHLLFLVAIDQTGHKVLCSIIAGTLHYLYLATLTWMLLEALYLFLTARNLTVVNYSSINRFMKKLMFPVGYGVPAVTVAISAASRPHLYGTPSRCWLQPEKGFIWGFLGPVCAIFSVNLVLFLVTLWILKNRLSSLNSEVSTLRNTRMLAFKATAQLFILGCTWCLGILQVGPAARVMAYLFTIINSLQGVFIFLVYCLLSQQVREQYGKWSKGIRKLKTESEMHTLSSSAKADTSKPSTVN（配列番号１６７）
ＥＭＲ２の代表的なＤＮＡ配列が、ＮＣＢＩ参照配列番号 ＮＧ＿０４７１４６．１により提供される。
本開示のいくつかの態様は、ＥＭＲ２の発現の喪失をもたらすそれらのゲノム中の修飾、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤により認識されないＥＭＲ２のバリアント形態の発現を含む遺伝子操作された細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞のゲノムにおける修飾は、ＥＭＲ２をコードするゲノム配列における変異である。一部の実施形態では、修飾は、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ及び本明細書で提供されるＥＭＲ２標的部位を標的とするｇＲＮＡを使用する、又は本明細書で提供される標的化ドメイン配列を含む、ゲノム編集を介して、影響を受ける。
本明細書中で提供される組成物、方法、戦略、及び治療モダリティは、任意の細胞又は細胞型に適用され得る一方で、本発明の態様に従ったＥＭＲ２遺伝子中のゲノム修飾のために特に適切である、一部の例示的な細胞及び細胞型が、本明細書中により詳細に記載されている。当業者は、しかし、そのような例の提供は、一部の特定の実施形態を例証する目的のためであり、追加の適切な細胞及び細胞型は、本開示に基づいて当業者に明らかであろうが、この点おいて限定されない。
本開示のいくつかの態様は、ＥＭＲ２の発現の喪失をもたらすそれらのゲノム中の修飾、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤により認識されないＥＭＲ２のバリアント形態の発現を含む遺伝子操作された造血細胞を提供する。一部の実施形態では、そのゲノムにおける修飾を含む遺伝子操作された細胞は、例えば、同じ細胞型であるがゲノム修飾を含まない造血細胞と比較して、ＥＭＲ２の細胞表面発現の低減、及び／又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤による結合の低減をもたらす。一部の実施形態では、造血細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。一部の実施形態では、造血細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。一部の実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞又は前駆細胞である。
一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋である。一部の実施形態では、細胞は、造血細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血前駆細胞である。一部の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。一部の実施形態では、細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、又は組織特異的幹細胞からなる群から選択される。
一部の実施形態では、細胞は、レシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着し、かつレシピエントにおける全ての血液系細胞型の分化した子孫を生成する能力によって特徴付けられる細胞の集団に含まれる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも５０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも６０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも７０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも８０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも９０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、未編集造血幹細胞の分化能と同等である分化能によって特徴付けられるＥＭＲ２編集造血幹細胞を含む。
一部の実施形態では、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む造血細胞（例えば、ＨＳＣ又はＨＰＣ）が、ヌクレアーゼ及び／又は本明細書に記載されるヒトＥＭＲ２を標的とするｇＲＮＡを使用して作成される。そのような細胞は、細胞をヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡと接触させることにより作製することができる、あるいは細胞は、ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡと接触した細胞の娘細胞であることができることが理解されよう。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、遺伝子操作されたＨＳＣ又はＨＰＣ）は、ＨＳＣ若しくはＨＰＣニッチに集合すること、及び／又は対象の造血系を再構成することが可能である。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣ又はＨＰＣ）は、ヒト対象に生着すること、骨髄系細胞を産生すること、及びリンパ系細胞を産生することのうちの一つ以上（例えば、全て）が可能である。一部の好ましい実施形態では、本明細書中で提供される、遺伝子操作された造血細胞、又はその子孫は、好ましくは、同じ細胞型の造血細胞と比較して、任意の分化バイアスを伴わずに、全ての血液細胞系列中に分化することができるが、しかし、ＥＭＲ２の発現の喪失をもたらすゲノム修飾、又はＥＭＲ２を標的化する免疫療法剤により認識されないＥＭＲ２のバリアント形態の発現を含まない。
ドナー細胞をレシピエント宿主生物内に生着させると、例えば、所与のニッチ（例えば、骨髄）内の生着したドナー細胞（及びその子孫）並びに宿主細胞の相対レベルは、宿主生物の生理学的及び／又は治療的転帰にとって重要であることが理解されるであろう。所与の組織又はニッチ内の宿主細胞に対する生着したドナー細胞又はその子孫のレベルは、本明細書ではキメラ現象と称される。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣ又はＨＰＣ）は、ヒト対象に生着することが可能であり、同じ細胞型であるが、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含まない造血細胞と比較して、キメラ現象にいかなる差異も示さない。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣ又はＨＰＣ）は、ヒト対象に生着することが可能であり、同じ細胞型であるが、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含まない造血細胞と比較して、キメラ現象に１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％以下の差異を示す。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、一つだけのゲノム修飾、例えば、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含む。本明細書中で提供される遺伝子編集方法は、標的遺伝子の一方又は両方のアレルにおいてゲノム修飾をもたらし得ることが理解されよう。一部の実施形態では、所与の遺伝子座の両方のアレル中にゲノム修飾を含む、遺伝子操作された細胞が好ましい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾に加えて、二つ以上のゲノム修飾、例えば、一つ以上のゲノム修飾を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含み、更に、例えば、細胞のゲノムに統合されたＣＡＲをコードする発現構築物の形態で、キメラ抗原受容体をコードする発現構築物を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＥＭＲ２に結合する、結合ドメイン、例えば、抗体断片を含む。
本開示のいくつかの態様は、ＥＭＲ２の発現の喪失をもたらすそれらのゲノム中の修飾、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤により認識されないＥＭＲ２のバリアント形態の発現を含む遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を提供する。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、Ｔリンパ球は、アルファ／ベータＴリンパ球である。一部の実施形態では、Ｔリンパ球は、ガンマ／デルタＴリンパ球である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ細胞）である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、内因性導入遺伝子、例えば、トランスジェニックタンパク質を発現しない。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＥＭＲ２を標的化するＣＡＲを発現する。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＥＭＲ２を標的化するＣＡＲを発現しない。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含み、外因性タンパク質をコードする発現構築物を含まず、例えば、ＣＡＲをコードする発現構築物を含まない。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、実質的にＥＭＲ２タンパク質を発現せず、例えば、免疫染色法などの好適な方法によって測定され得るＥＭＲ２タンパク質を発現しない。一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、実質的に野生型ＥＭＲ２タンパク質を発現しないが、変異ＥＭＲ２タンパク質バリアント、例えば、ＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤、又は抗ＥＭＲ２抗体、抗体断片、若しくは抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によって認識されないバリアントを発現する。
一部の実施形態では、本明細書中に提供される遺伝子操作された細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹細胞又は前駆細胞であり、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性、自己再生性、並びに／又はそれぞれ、骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）及びリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）をさらに生み出す骨髄系とリンパ系前駆細胞の両方を含む、造血系の全ての系統を生成及び／若しくは再構成する能力によって特徴付けられる細胞である。ＨＳＣは、ＨＳＣの同定及び／又は単離に使用され得る、一つ以上の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ３４（例えば、ＣＤ３４＋）の発現、並びに細胞系統への関与に関連する細胞表面マーカーの不在によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作されたＨＳＣ）は、典型的にはＨＳＣ同定若しくは単離に関連する一つ以上の細胞表面マーカーを発現しないか、低減した量の細胞表面マーカーを発現するか、又は細胞表面マーカーを標的とする免疫療法剤によって認識されないバリアント細胞表面マーカーを発現するが、それでもなお、自己再生が可能であり、造血系の全ての系統を生成及び／又は再構成することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血幹細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書中に記載される、遺伝子操作された細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血前駆細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書中に記載される、遺伝子操作された細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血幹細胞及び複数の遺伝子操作された造血前駆細胞を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作されたＨＳＣは、対象、例えばヒト対象などから得られる。ＨＳＣを得る方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＵＳ２０１６／０５７３３９号に記載されている。一部の実施形態では、ＨＳＣは末梢血ＨＳＣである。一部の実施形態では、哺乳類対象は、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウス若しくはラット）、ウシ、ブタ、ウマ、又は家畜である。一部の実施形態では、ＨＳＣは、ヒト対象、例えば造血器悪性腫瘍を有するヒト対象などから得られる。一部の実施形態では、ＨＳＣは、健常なドナーから得られる。一部の実施形態では、ＨＳＣは、キメラ受容体を発現する免疫細胞がその後に投与される対象から得られる。細胞が得られた同じ対象に投与されるＨＳＣは、自己細胞として言及されるのに対し、細胞が投与される対象ではない対象から得られたＨＳＣは、同種細胞として言及される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞の集団は、細胞の異種集団、例えば、異なるＥＭＲ２変異を含む遺伝子操作された細胞の異種集団である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞の集団内のＥＭＲ２をコードする遺伝子のコピーの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％は、本明細書に記載されるゲノム編集アプローチによって、例えば、本明細書で提供されるｇＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生じさせられる変異を含む。一例として、遺伝子操作された細胞の集団は、複数の異なるＥＭＲ２変異を含むことができ、複数の各変異は、変異を有する細胞の集団におけるＥＭＲ２のコピーのパーセントに寄与し得る。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞上のＥＭＲ２の発現は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上のＥＭＲ２の発現と比較される。一部の実施形態では、遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上のＥＭＲ２の発現と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のＥＭＲ２の発現レベルの低減をもたらす。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）と比較して、ＥＭＲ２の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満を発現する。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＥＭＲ２を標的とするｇＲＮＡを使用する、本明細書に記載される遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上の野生型ＥＭＲ２の発現のレベルと比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の野生型ＥＭＲ２の発現レベルの低減をもたらす。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）と比較して、ＥＭＲ２の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満を発現する。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＥＭＲ２を標的とするｇＲＮＡを使用する、本明細書に記載される遺伝子操作は、好適な対照（例えば、一つの細胞又は複数の細胞）と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の野生型系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＥＭＲ２）の発現レベルの低減をもたらす。一部の実施形態では、適切な対照は、同じ対象からの複数の非操作細胞において測定又は予測される野生型系統特異的な細胞表面抗原のレベルを含む。一部の実施形態では、適切な対照は、健常な対象からの複数の細胞において測定又は予測される野生型系統特異的な細胞表面抗原のレベルを含む。一部の実施形態では、好適な対照は、健康な個人（例えば、１０、２０、５０、又は１００人の個人）のプールからの細胞の集団において測定又は予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。一部の実施形態では、好適な対照は、本明細書に記載される治療、例えば、抗ＥＭＲ２療法を必要とする対象、例えば、対象が癌を有し、癌の細胞がＥＭＲ２を発現する、対象において測定又は予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞を遺伝子操作する方法は、野生型細胞、例えば、野生型造血幹又は前駆細胞を提供するステップを含む。一部の実施形態では、ワイル型細胞は、ＥＭＲ２をコードする遺伝子の二つの機能的コピーを含む（例、発現する）未編集細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＧ＿０４７１４６．１に提供されるＥＭＲ２遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＧ＿０４７１４６．１によって提供される配列にコードされるＥＭＲ２タンパク質をコードするＥＭＲ２遺伝子配列を含み、例えば、ＥＭＲ２遺伝子配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＧ＿０４７１４６．１に提供される配列に対して一つ以上のサイレント変異を含み得る。一部の実施形態では、本方法において使用される細胞は、天然細胞又は非操作細胞である。一部の実施形態では、野生型細胞はＥＭＲ２を発現する、あるいはＥＭＲ２を発現する細胞株と同程度の（又は９０％～１１０％、８０％～１２０％、７０％～１３０％、６０～１４０％、若しくは５０％～１５０％内の）レベルでＥＭＲ２を発現する、より分化した細胞を生じる。
一部の実施形態では、野生型細胞は、ＥＭＲ２に結合する抗体（例、抗ＥＭＲ２抗体）に結合する、あるいはＥＭＲ２を発現する細胞株、例えば、Ｌ１２３６、Ｌ４２８、ＫＭ－Ｈ２、及びＬ５９１への抗体の結合と同程度の（又は９０％～１１０％、８０％～１２０％、７０％～１３０％、６０～１４０％、若しくは５０％～１５０％内の）レベルで、そのような抗体に結合する、より分化した細胞を生じる。抗体結合は、例えば、フローサイトメトリー又は免疫組織化学によって測定され得る。
二重ｇＲＮＡ組成物及びその使用
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡ（例えば、表１～８のいずれかで提供されるｇＲＮＡ）は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをゲノム内の二つの部位に標的化するために、第二のｇＲＮＡと組み合わせて使用することができる。例えば、一部の実施形態では、細胞が、二つの薬剤：抗ＥＭＲ２薬剤及び第二の系統特異的細胞表面抗原を標的とする薬剤に耐性を示し得るように、ＥＭＲ２及び第二の系統特異的細胞表面抗原、例えば、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ３８が欠損している造血細胞を産生することが所望され得る。一部の実施形態では、例えば、二回の切断を行い、二つの切断部位の間に欠失又は挿入を作成するために、細胞を、ＥＭＲ２の異なる部位を標的とする二つの異なるｇＲＮＡと接触させることが望ましい。したがって、本開示は、ｇＲＮＡ及び関連するＣＲＩＳＰＲ系の様々な組み合わせ、並びにｇＲＮＡ及び関連するＣＲＩＳＰＲ系のそのような組み合わせを使用したゲノム編集方法により作られた細胞を提供する。一部の実施形態では、ＥＭＲ２ ｇＲＮＡは、第二のｇＲＮＡとは異なるヌクレアーゼに結合する。例えば、一部の実施形態では、ＥＭＲ２ ｇＲＮＡはＣａｓ９に結合してもよく、第二のｇＲＮＡはＣａｓ１２ａに結合してもよく、又はその逆であってもよい。例えば、一部の実施形態では、ＥＭＲ２ ｇＲＮＡは、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ、ＣＢＥ）に結合してもよく、第二のｇＲＮＡは、別のＲＮＡガイドヌクレアーゼに結合してもよく、又はその逆であってもよい。
一部の実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書で提供されるＥＭＲ２ ｇＲＮＡ（例えば、表１～８のいずれかで提供されるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、Ｃ型レクチン様分子１、ＣＳ１、ＩＬ－５、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ１３３、ＣＤ７０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、及びＣＤ２６。
一部の実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書で提供されるＥＭＲ２ ｇＲＮＡ（例えば、表１～８のいずれか一つで提供されるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、腫瘍性若しくは悪性疾患又は障害、例えば、具体的なタイプの癌に関連する系統特異的細胞表面抗原、例えば、限定されるものではないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞性ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（一般的な（Ｂ前）急性リンパ性白血病及び悪性黒色腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫及び白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫及び白血病）、ＣＤ２６（上皮及びリンパ性悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ（リンパ性悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科癌、胆管癌、及び膵管腺癌）、並びに前立腺特異的膜抗原を標的とする。
一部の実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書で提供されるＥＭＲ２ ｇＲＮＡ（例えば、表１～８のいずれか一つで提供されるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２又はＣＤ３６３。
一部の実施形態では、第二のｇＲＮＡは、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０６６７６０号、同ＷＯ２０１９／０４６２８５号、同ＷＯ／２０１８／１６０７６８号、又はＢｏｒｏｔ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１９）１１６（２４）：１１９７８－１１９８７において開示されるｇＲＮＡであるが、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
投与を必要とする対象への投与の方法
本開示の一部の態様は、ＥＭＲ２の発現の喪失をもたらすそれらのゲノム中での改変、又はＥＭＲ２を標的化する免疫療法剤により認識されないＥＭＲ２のバリアント形態の発現を含む、本明細書中に記載される遺伝子操作された細胞の有効数を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
それを必要とする対象は、一部の実施形態では、ＥＭＲ２を標的化する免疫療法を受けている、又は受けようとしている対象である。それを必要とする対象は、一部の実施形態では、悪性細胞上のＥＭＲ２の発現により特徴付けられる悪性腫瘍を有する、又はそれと診断された対象である。一部の実施形態では、そのような悪性腫瘍を有する対象は、ＥＭＲ２を標的とする免疫療法の候補であり得るが、有害な標的上・疾患外効果のリスクが、対象にとって予期又は観察される利益を上回り得る。一部のそのような実施形態では、本明細書中に記載される遺伝子操作された細胞の投与は、有害な標的上・疾患外効果の改善をもたらす。なぜなら、本明細書中で提供される、遺伝子操作された細胞は、ＥＭＲ２を標的化する免疫療法剤により効率的に標的化されないためである。
一部の実施形態では、悪性腫瘍は、血液悪性腫瘍、又は血液の癌である。一部の実施形態では、悪性腫瘍はリンパ性悪性腫瘍である。一般的に、リンパ系悪性腫瘍は、リンパ細胞、例えばＴ系列又はＢ系列のリンパ球などの不適当な産生、発生、及び／又は機能に関連付けられる。一部の実施形態では、悪性腫瘍は、細胞表面上でＥＭＲ２を発現する細胞と特徴付けられる、又は関連付けられる。
本明細書に記載されるように、ＥＭＲ２発現は、急性骨髄性白血病を有する患者由来の試料でも観察されている。
一部の実施形態では、悪性腫瘍は、Ｔ系統癌、例えば、Ｔ細胞白血病又はＴ細胞リンパ腫などの異常Ｔリンパ球に関連する。
Ｔ細胞白血病及びＴ細胞リンパ腫の例は、限定されないが、Ｔ系統急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病、Ｔ前リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、他に特定されていない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾ガンマデルタＴ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、又は有毛細胞白血病を含む。一部の実施形態では、悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病である。
本明細書に記載されるように、ＥＭＲ２発現は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌及び食道癌、並びに神経膠芽腫に関連する。例えば、Ｓａｆａｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃ．Ｒｅｖ．（２０１４）８（２４２）：２０－２４を参照のこと。
一部の実施形態では、悪性腫瘍は、異常な上皮、例えば、癌に関連する。
癌の例としては、副腎皮質癌、腺癌、皮膚の基底細胞癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌及び食道癌、浸潤性管癌、膵癌、腎細胞癌、並びに扁平上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、悪性腫瘍は、神経膠芽腫である。
また、本開示の範囲内には、再発又は難治性癌腫などの再発性及び／又は難治性とみなされる悪性腫瘍がある。投与を必要とする対象は、一部の実施形態では、ＥＭＲ２を標的とする免疫エフェクター細胞療法、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けているか、又は受けるであろう対象であり、免疫エフェクター細胞は、ＥＭＲ２を標的とするＣＡＲを発現し、免疫エフェクター細胞の少なくともサブセットもまた、その細胞表面上にＥＭＲ２を発現する。本明細書で使用される場合、「フラトリサイド」は、自己殺傷を指す。例えば、細胞の集団の細胞は、同じ集団の細胞を殺傷する、又はその殺傷を誘導する。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞治療の細胞は、免疫エフェクター細胞治療の他の細胞を殺傷する、又はその殺傷を誘導する。そのような実施形態では、フラトリサイドは、所望の臨床転帰、例えば、対象内でＥＭＲ２を発現する悪性細胞のアブレーションが達成できる前に、免疫エフェクター細胞の一部分又は全集団をアブレーションする。いくつかのそのような実施形態では、本明細書で提供される、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を使用して、例えば、ＥＭＲ２を発現しない、又はＣＡＲにより認識されるＥＭＲ２バリアントを発現しない免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞治療の基礎を形成する免疫エフェクター細胞として、そのようなフラトリサイド及び治療転帰に対する関連する負の影響を回避し得る。そのような実施形態では、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、本明細書中で提供されるように、例えば、ＥＭＲ２を発現しない、又はＣＡＲにより認識されるＥＭＲ２バリアントを発現しない免疫エフェクター細胞は、また、ＥＭＲ２標的化ＣＡＲを発現するようにさらに改変され得る。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、例えば、Ｔリンパ球、例えば、アルファ／ベータＴリンパ球、ガンマ／デルタＴリンパ球、又はナチュラルキラーＴ細胞などであってもよい。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であってもよい。
一部の実施形態では、ＥＭＲ２の発現の喪失、又はＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤によって認識されないＥＭＲ２のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、本明細書に記載される有効数の遺伝子操作された細胞が、それを必要とする対象、例えば、ＥＭＲ２を標的とする免疫療法を受けているか、又は受けるであろう対象に投与され、免疫療法は、例えば、ＥＭＲ２を発現する対象における健康な細胞に向けた細胞傷害性の形態で、有害な標的上・疾患外効果に関連するか、又は関連する危険性がある。一部の実施形態では、有効数のそのような遺伝子操作された細胞は、抗ＥＭＲ２免疫療法剤との組み合わせにおいて対象に投与され得る。
薬剤（例えば、ＥＭＲ２修飾細胞及び抗ＥＭＲ２免疫療法剤）が組み合わせて投与されると、細胞及び薬剤が、同時に、又は異なる時間に、例えば、時間的に近接して、投与され得ることが理解される。更に、細胞及び薬剤は、混合されてもよく、又は別々の容量若しくは剤形において混合されてもよい。例えば、一部の実施形態では、組み合わせでの投与は、同じ治療過程における、例えば、抗ＥＭＲ２免疫療法を用いて対象を治療する過程における投与を含み、対象は、有効数の遺伝子操作されたＥＭＲ２修飾細胞を、抗ＥＭＲ２免疫療法と同時に、又は連続的に、例えば、治療の前、間、若しくは後に投与され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＥＭＲ２を標的とする免疫療法剤は、ＥＭＲ２に結合することが可能な抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体）を含むキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞である。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞）又はＮＫ細胞であり得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、刺激分子に由来するものを含む、組換えポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、少なくとも一つの共刺激分子、例えば４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／又はＣＤ２８、又はそれらの分子の断片に由来する一つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ＥＭＲ２結合抗体断片を含み得る。抗体断片は、一つ以上のＣＤＲ、可変領域（又はその一部）、定常領域（又はその一部）、又は前述のうちのいずれかの組み合わせを含むことができる。
ヒトＥＭＲ２を認識する例示的な抗体は、例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．（２００３）５４７（１－３）：１４５－１５０、Ｙｏｎａ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ（２００８）．２２（３）：７４１－７５１、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０８７８００号に提供されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、典型的には、ヒンジ領域（例えば、ＣＤ８又はＣＤ２８由来）、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８又はＣＤ２８由来）、一つ以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ）、及びシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚｅｔａ）を含み得る、例えば、ＣＡＲフレームワークに融合された抗体断片を含む、抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲドメイン及び構成要素の例示的な配列は、例えば、ＰＣＴ公開第２０１９／１７８３８２号、及び以下の表９に提供される。
一部の実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞の数は、１０６～１０１１の範囲内である。しかし、この例示的な範囲を下回る又は上回る量も、本開示の範囲内である。例えば、一部の実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞の数は、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、又は約１０１１である。一部の実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞の数は、１０６～１０９の範囲内、１０６～１０８の範囲内、１０７～１０９の範囲内、１０７～１０１０の範囲内、１０８～１０１０の範囲内、又は１０９～１０１１の範囲内である。
一部の実施形態では、ＥＭＲ２を標的化する免疫療法剤は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。ＡＤＣは、毒素又は薬物分子にコンジュゲートされた抗体又はその抗原結合断片を含む分子であり得る。対応する抗原への抗体又はその断片の結合は、その細胞表面上に抗原を提示する細胞（例えば、標的細胞）への毒素又は薬物分子の送達を可能にし、それによって、標的細胞の死をもたらす。
ＥＭＲ２に結合する適切な抗体及び抗体断片は、当業者に明らかであり、例えば、ＰＣＴ公開第２０１７／０８７８００号に記載されるものを含み、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
抗体－薬物コンジュゲート中での使用のために適合性のある毒素又は薬物は、当技術分野において公知であり、当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）３５（４）：ｅ００２２５、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１７）１６：３１５－３３７、Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１８）１１：８、Ｅｌｇｕｎｄｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１７）１２２：２－１９を参照のこと。一部の実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、ベランタマブマホドチンである。
一部の実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、抗体及び薬物分子を付着させるリンカー（例、ペプチドリンカー、例えば切断可能なリンカーなど）を更に含み得る。
抗体－薬物コンジュゲートのための適切な毒素又は薬物の例は、限定されないが、ブレンツキシマブベドチン、グレンバツムマブベドチン／ＣＤＸ－０１１、デパツキズマブマフォドチン／ＡＢＴ－４１４、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ポラツズマブベドチン／ＲＧ７５９６／ＤＣＤＳ４５０１Ａ、デニンツズマブマホドチン／ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＧＳ－１６Ｃ３Ｆ、ＣＤＸ－０１４、ＲＧ７８４１／ＤＬＹＥ５９５３Ａ、ＲＧ７８８２／ＤＭＵＣ４０６Ａ、ＲＧ７９８６／ＤＣＤＳ０７８０Ａ、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ、エンフォルツマブベドチン／ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＧ－１５ＭＥ、ＡＧＳ６７Ｅ、テリソツズマブベドチン／ＡＢＢＶ－３９９、ＡＢＢＶ－２２１、ＡＢＢＶ－０８５、ＧＳＫ－２８５７９１６、ティソツマブベドチン／ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ、ＨｕＭａｘ－Ａｘｌ－ＡＤＣ、ピナツズマブベドチン／ＲＧ７５９３／ＤＣＤＴ２９８０Ｓ、リファツズマブベドチン／ＲＧ７５９９／ＤＮＩＢ０６００Ａ、インデュサツマブベドチン／ＭＬＮ－０２６４／ＴＡＫ－２６４、バンドルツズマブベドチン／ＲＧ７４５０／ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ソフィツズマブベドチン／ＲＧ７４５８／ＤＭＵＣ５７５４Ａ、ＲＧ７６００／ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ＲＧ７３３６／ＤＥＤＮ６５２６Ａ、ＭＥ１５４７、ＰＦ－０６２６３５０７／ＡＤＣ ５Ｔ４、トラスツズマブエムタンシン／Ｔ－ＤＭ１、ミルベツキシマブソラフタンシン／ＩＭＧＮ８５３、コルツキシマブラヴタンシン／ＳＡＲ３４１９、ナラツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ５２９、インダツキシマブラヴタンシン／ＢＴ－０６２、アネツマブラヴタンシン／ＢＡＹ ９４－９３４３、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ４２８９２６、ＡＭＧ ２２４、ＰＣＡ０６２、ＨＫＴ２８８、ＬＹ３０７６２２６、ＳＡＲ５６６６５８、ロルボツズマブメルタンシン／ＩＭＧＮ９０１、カンツズマブメルタンシン／ＳＢ－４０８０７５、カンツズマブラヴタンシン／ＩＭＧＮ２４２、ラプリツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ２８９、ＩＭＧＮ３８８、ビバツズマブメルタンシン、ＡＶＥ９６３３、ＢＩＩＢ０１５、ＭＬＮ２７０４、ＡＭＧ １７２、ＡＭＧ ５９５、ＬＯＰ ６２８、バダツキシマブタリリン／ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３５２Ａ、ロバルピツズマブテシリン／ＳＣ１６ＬＤ６．５、ＳＣ－００２、ＳＣ－００３、ＡＤＣＴ－３０１／ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ－ＰＢＤ、ＡＤＣＴ－４０２、ＭＥＤＩ３７２６／ＡＤＣ－４０１、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ６３２、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン／ＣＭＣ－５４４、ＰＦ－０６６４７２６３、ＣＭＤ－１９３、ＣＭＢ－４０１、トラスツズマブデュオカルマジン／ＳＹＤ９８５、ＢＭＳ－９３６５６１／ＭＤＸ－１２０３、サシツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３２、ラベツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ミラツズマブドキソルビシン／ＩＭＭＵ－１１０／ｈＬＬ１－ＤＯＸ、ＢＭＳ－９８６１４８、ＲＣ４８－ＡＤＣ／ヘルツズマブ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６６４７０２０、ＰＦ－０６６５０８０８、ＰＦ－０６６６４１７８／ＲＮ９２７Ｃ、ルパルツマブアマドチン／ＢＡＹ１１２９９８０、アプルツマブイクサドチン／ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＸ７８８、ＡＧＳ６２Ｐ１、ＸＭＴ－１５２２、ＡｂＧｎ－１０７、ＭＥＤＩ４２７６、及びＤＳＴＡ４６３７Ｓ／ＲＧ７８６１中に含まれる毒素及び薬物を含む。
一部の実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへの抗体－薬物コンジュゲートの結合によって、抗体－薬物コンジュゲートの内部移行が誘導されて、薬物（又は毒素）が細胞内に放出され得る。一部の実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへの抗体－薬物コンジュゲートの結合によって、毒素又は薬物の内部移行が誘導されて、それによって、毒素又は薬物は、系統特異的タンパク質（標的細胞）を発現する細胞を殺傷することが可能になる。一部の実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープとの抗体－薬物コンジュゲートの結合は、毒素又は薬物の内部化を誘発し、それによって、毒素又は薬物は、系統特異的タンパク質（標的細胞）を発現する細胞の活性が調節され得る。本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートで使用される毒素又は薬物のタイプは、いかなる具体的なタイプにも限定されない。
本明細書に開示される技術の実施形態、利点、特徴、及び使用のうちのいくつかが、以下の実施例からより完全に理解されるであろう。実施例は、本開示の利益のうちのいくつかを例証し、かつ特定の実施形態を説明することを意図しているが、本開示の全範囲を例示することを意図しておらず、したがって、本開示の範囲を限定しない。
実施例１：ヒト細胞におけるＥＭＲ２の遺伝子編集
ｓｇＲＮＡ構築物の設計
表１～２に示す標的ドメイン及びｇＲＮＡは、例えば、標的領域に近接近した、適用可能なヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１に対するＰＡＭ配列の手動検査によって設計し、オンライン検索アルゴリズム（例えば、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇアルゴリズム、Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ ２０１６、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ ２０１３）を用いてヒトゲノム内の潜在的な標的外部位を最小限化することによって、予測した特異性に従って優先順位を決定した。全ての設計した合成ｓｇＲＮＡを、５’と３’末端の両方の三つの末端位置で、化学的に修飾したヌクレオチドを伴って生成した。修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ｍｓ」と略した）を含み、ｍｓ－ｓｇＲＮＡをＨＰＬＣ精製した。
初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおける編集
ＨＬ６０細胞又はＣＤ３４＋細胞において表１及び２に示すｇＲＮＡを使用して、ＥＭＲ２ ｇＲＮＡのスクリーニングを行った。動員した末梢血（ｍＰＢ）に由来するＣＤ３４＋ＨＳＣを、製造業者の指示に従って解凍した。ＣＤ３４＋ ＨＳＣを編集するために、約１×１０６個のＨＳＣを解凍し、ＲＮＰを用いたエレクトロポレーションの前に、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＣＣ１１０カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地中で２４～４８時間培養した。ＨＳＣをエレクトロポレーションするために、１．５×１０５個の細胞をペレット化し、２０μＬのエレクトロポレーション溶液中に再懸濁し、１０μＬのＣａｓ９ ＲＮＰと混合した。
ゲノムＤＮＡ解析
全てのゲノム分析について、ＤＮＡを細胞から採取し、標的領域に隣接するプライマーで増幅し、精製して、対立遺伝子修飾頻度を、ＴＩＤＥ（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を使用して分析した。解析を、模擬トランスフェクト試料の参照配列を使用して実行した。パラメータを、１０個のヌクレオチドのデフォルト最大Ｉｎｄｅｌサイズに設定し、分解ウィンドウを、高品質のトレースを伴って可能な限り最大のウィンドウを網羅するように設定した。３．５％の検出感度を下回る全てのＴＩＤＥ分析を、０％に設定した。
ＨＬ６０細胞又はヒトＣＤ３４＋細胞をＣａｓ９タンパク質でエレクトロポレーションし、上に記載したように、ＥＭＲ２標的化ｇＲＮＡを示した。編集率を、ＴＩＤＥ分析により評価したように、％インデルにより決定した。編集効率を、フローサイトメトリー分析により決定した。図２Ａ～２Ｆ、４Ｂ、５Ａ～５Ｃを参照のこと。図２Ｃ～２Ｆに示すように、ガイドＥＭＲ２－１１を用いたＥＭＲ２の編集は、４個のヌクレオチドの欠失（－４）又は１個のヌクレオチドの付加（＋１）のいずれかを通じて、未成熟終止コドンをもたらすことを見出した。
発現及びフローサイトメトリー分析
ＥＭＲ２ ｇＲＮＡ編集細胞をまた、例えば、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）により、ＥＭＲ２ ＲＮＡ転写物の発現及びＥＭＲ２タンパク質の表面発現について評価した。表面発現を評価するために、生ＣＤ３４＋ＨＳＣを、抗ＥＭＲ２抗体を使用してＥＭＲ２について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＥＭＲ２遺伝子が遺伝子修飾した細胞は、ＦＡＣＳにより検出したＥＭＲ２発現における低減を示した。図３Ａ及び３Ｂを参照されたい。
ＥＭＲ２ ｇＲＮＡ編集細胞も、培養中の経時的なＥＭＲ２タンパク質の表面発現について評価し、これは、ＥＭＲ２発現の有意かつ持続的な低減を示した。図６Ａ及び６Ｂを参照されたい。
ＣＤ９７及びＣＤ３３並びにいくつかの骨髄マーカー（例えば、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５）の表面発現も経時的に評価した。これらのマーカーは、ＥＭＲ２の編集によって有意に影響を受けなかった。図６Ｃ～６Ｇを参照されたい。
サイトカインレベル
リポ多糖類（ＬＰＳ）、抗ＥＭＲ２抗体（２Ａ１）、又はＩｇＧ１を用いた刺激後のインビトロで分化したＣＤ３４＋細胞について、サイトカイン産生を評価した。図７Ａ～７Ｆを参照されたい。予想した通り、ＬＰＳシミュレーションは、刺激していない細胞と比較して炎症促進性サイトカインの上方制御をもたらした。編集に関係なく、サイトカイン産生（すなわち、ＩＦＮ－γ、ＩＬ１ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦα）の大きなシフトを観察せず、これは、ＥＭＲ２発現の喪失が、サイトカイン分泌に影響を与えないことを示唆している。さらに、もしあれば、サイトカインの最小限の上方制御を、２Ａ１を用いた刺激の際に観察した。
編集した細胞の生存率
エクスビボ編集後の様々な時点、例えば、２４時間、４８時間、９日、及び１６時間で、細胞の総数並びに生きた編集したＥＭＲ２ＫＯ細胞の割合及び対照細胞を定量した。本明細書に記載するＥＭＲ２ ｇＲＮＡを使用して編集されたＥＭＲ２ＫＯ細胞は、生存可能であり、エレクトロポレーション及び遺伝子編集後に経時的に生存可能なままであった。これは、対照の偽編集細胞で観察したものと類似した。図４Ａを参照されたい。
実施例２：ＥＭＲ２編集細胞の生成及び評価
遺伝子修飾した細胞を、単一ドナーから得た細胞を使用して、例示的なｇＲＮＡ、ＥＭＲ２－１１及びＥＭＲ２－１８を使用して生成し、インビトロでの分化について分析した。ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ（ＣＤ３３ｇＲＮＡ）及び対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）を使用したゲノム編集も使用した。ゲノム編集後、細胞を、顆粒球培地（骨髄Ｉ培地（Ｍｙｅ Ｉ））又は単球性培地（骨髄ＩＩ培地（Ｍｙｅ ＩＩ））のいずれかで培養した。細胞数及び細胞の生存率を、編集後（エレクトロポレーション後）の様々な時点で評価した。
図８Ａ～８Ｄに示すように、ＥＭＲ２の編集は、顆粒球細胞又は単球細胞の細胞拡大又は生存率に影響を与えず、ＥＭＲ２編集ＨＳＰＣの８０％超が生存率を保持した。試験したＥＭＲ２ ｇＲＮＡの分化全体を通して、高レベルのＥＭＲ２編集効率も維持した。図９を参照されたい。ガイドＥＭＲ２－１１を用いた編集は、エレクトロポレーションの６日後までにＥＭＲ２表面発現の消失をもたらし、エレクトロポレーションの少なくとも１２日後まで持続することを見出した。図１０Ａ及び１０Ｂを参照されたい。
実施例１で観察したように、ＥＭＲ２の編集は、単球のマーカーであるＣＤ１１ｂ又はＣＤ１４の発現にも、顆粒球系統マーカーであるＣＤ１５にも影響を与えなかった。図１１Ａ～１１Ｆを参照されたい。
サイトカインの産生も評価して、ＥＭＲ２編集が、細胞機能を調節するかどうかを決定した。細胞をＬＰＳ若しくはＲ８４８で刺激するか、又は刺激せず、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１α、及びＴＮＦαの産生について評価した。図１２Ａ～１２Ｈに示す通り、ＥＭＲ２編集は、測定したサイトカイン、すなわち、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１α、及びＴＮＦαのいずれにも影響を与えなかった。
ＥＭＲ２編集細胞の細胞機能、例えば、貪食能も評価し得る。
実施例３：ヒト細胞におけるＥＭＲ２の遺伝子編集
ｓｇＲＮＡ構築物の設計
表３～４に示した標的ドメイン及びｇＲＮＡを、例えば、標的領域に近接近した、適用可能なヌクレアーゼ、例えば、塩基エディターヌクレアーゼに対するＰＡＭ配列の手動検査によって設計し、オンライン検索アルゴリズム（例えば、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇアルゴリズム、Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ ２０１６、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ ２０１３）を用いてヒトゲノム内の潜在的な標的外部位を最小限化することによって、予測した特異性に従って優先順位を決定した。全ての設計した合成ｓｇＲＮＡを、５’と３’末端の両方における三つの末端位置で、化学的に修飾したヌクレオチドを用いて生成した。修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ｍｓ」と略した）を含有し、ｍｓ－ｓｇＲＮＡをＨＰＬＣ精製した。
初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおける編集
ＨＬ６０細胞又はＣＤ３４＋細胞において表３及び４に示すｇＲＮＡを使用して、ＥＭＲ２ ｇＲＮＡのスクリーニングを行った。動員した末梢血（ｍＰＢ）に由来するＣＤ３４＋ＨＳＣを、製造業者の指示に従って解凍した。ＣＤ３４＋ ＨＳＣを編集するために、約１×１０６個のＨＳＣを解凍し、ＲＮＰを用いたエレクトロポレーションの前に、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＣＣ１１０カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地中で２４～４８時間培養した。ＨＳＣをエレクトロポレーションするために、１．５×１０５個の細胞をペレット化し、エレクトロポレーション溶液中に再懸濁し、ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼを含有するリボ核タンパク質複合体と混合し、エレクトロポレーション溶液中に再懸濁し、ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼを含有するリボ核タンパク質複合体と混合する。
例示的な塩基塩基エディターヌクレアーゼを、以下に示す。
例示的なシチジンデアミナーゼのアミノ酸配列（配列番号１７３）
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例示的なシチジンデアミナーゼの核酸配列（配列番号１７４）
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例示的なアデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列（配列番号１７５）
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例示的なアデノシンデアミナーゼの核酸配列（配列番号１７６）
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全てのゲノム分析について、ＤＮＡを細胞から採取し、標的領域に隣接するプライマーを用いて増幅し、精製し、対立遺伝子修飾頻度を分析する。編集効率を、フローサイトメトリー分析により決定する。
発現及びフローサイトメトリー分析
ＥＭＲ２ ｇＲＮＡ編集細胞をまた、例えば、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）により、ＥＭＲ２ ＲＮＡ転写物の発現及びＥＭＲ２タンパク質の表面発現について評価してもよい。
ＣＤ９７及びＣＤ３３並びにいくつかの骨髄マーカー（例えば、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５）などの他の表面マーカーの発現も経時的に評価してもよい。
編集した細胞の生存率
エクスビボ編集後の様々な時点、例えば、２４時間、４８時間、９日、及び１６時間で、細胞の総数並びに生ＥＭＲ２細胞の割合及び対照細胞を定量する。
実施例４：ＣＡＲ－Ｔ細胞傷害性アッセイ
表１～８に示すｇＲＮＡを使用して生成した遺伝子修飾した細胞を、ＥＭＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞による殺傷について評価してもよい。
ＣＡＲ構築物及びレンチウイルス産生
第二世代のＣＡＲを、ＥＭＲ２を標的化するよう構築する。例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通領域、４－１ＢＢ共刺激性ドメイン、並びにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを使用した、細胞外ｓｃＦｖ抗原結合ドメインからなる。抗ＥＭＲ２ ｓｃＦｖ配列は、当該技術分野において公知の任意の抗ＥＭＲ２抗体から得られ得る。標的についてのＣＡＲ ｃＤＮＡ配列を、ｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ発現ベクターの複数のクローニング部位中にサブクローニングし、レンチウイルスを、製造業者のプロトコル（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って生成する。レンチウイルスを、リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した２９３ＴＮ細胞（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の一過性トランスフェクションにより生成することができる。例示的なＣＡＲ構築物は、抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖及び重鎖を、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに、レンチウイルスプラスミドｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ中にクローニングすることにより生成する。
ＣＡＲ形質導入及び増殖
ヒト初代Ｔ細胞を、製造業者のプロトコル（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８マイクロビーズを使用した磁気ビーズ分離により、Ｌｅｕｋｏ Ｐａｋ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から単離する。精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を１：１で混合し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、１：１のビーズ対細胞比率で活性化させる。使用するＴ細胞培養培地は、免疫細胞血清置換、Ｌ－グルタミン及びＧｌｕｔａＭＡＸ（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖培地である。Ｔ細胞形質導入を、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在においてスピノキュレーションによる活性化後２４時間に実施する。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、凍結保存前に９日間にわたり培養する。全ての実験の前に、Ｔ細胞を解凍し、３７℃で４～６時間にわたり休ませる。
フローサイトメトリーベースのＣＡＲ－Ｔ細胞傷害性アッセイ
標的細胞の細胞傷害性を、陰性対照細胞の生存に対して、標的細胞の生存を比較することにより測定する。ＥＭＲ２細胞傷害性アッセイについては、ＥＭＲ２発現ＡＭＬ細胞株の野生型及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集細胞を、標的細胞として使用する。野生型Ｒａｊｉ細胞株（ＡＴＣＣ）を、両方の実験のための陰性対照として使用する。代替的に、ＣＤ３４＋細胞を、標的細胞として使用し得、ＥＭＲ２が欠損しているか、若しくはＥＭＲ２の発現が低減したか、又はＥＭＲ２のバリアントを発現しているＣＤ３４＋細胞を、実施例１～３に記載したように生成し得る。
標的細胞及び陰性対照細胞を、それぞれ、製造業者の指示に従って、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）及びＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色する。染色後、標的細胞及び陰性対照細胞を１：１で混合する。
抗ＥＭＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、エフェクターＴ細胞として使用する。非形質導入Ｔ細胞（偽ＣＡＲ－Ｔ）を、対照として使用する。エフェクターＴ細胞を、標的細胞／陰性対照細胞混合物と、１：１のエフェクター対標的比率で、二通りに共培養する。エフェクターＴ細胞を伴わない標的細胞／陰性対照細胞混合物単独の群を、対照として含む。細胞を、フローサイトメトリー分析の前に、３７℃で２４時間にわたりインキュベートする。ヨウ化プロピジウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を生存染料として使用する。特異的な細胞溶解の算出のために、生陰性対照細胞に対する生標的細胞の分画（標的分画と呼ばれる）を使用する。特異的細胞溶解を、（エフェクター細胞を伴わない標的分画－エフェクター細胞を伴う標的分画）／（エフェクターを伴わない標的分画）×１００％として算出する。
実施例５：操作したＨＳＣに対する抗ＥＭＲ２抗体薬物複合体の効果
表１～８中に示すｇＲＮＡを使用して生成した遺伝子修飾した細胞は、抗体－薬物コンジュゲート、例えば、免疫毒素にコンジュゲートした抗ＥＭＲ２抗体などによる殺傷について評価してもよい。
動員した末梢血に由来する凍結ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを解凍し、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質でのエレクトロポレーション前の７２時間にわたり培養する。試料を、以下の条件でエレクトロポレーションする：
ｉ．偽（ヌクレアーゼのみ（例えば、Ｃａｓ９）、及び
ｉｉ．ＫＯ ｓｇＲＮＡ（表１～８に示すＥＭＲ２ ｇＲＮＡのうちのいずれか一つなど）。
細胞を７２時間にわたり回復させ、ゲノムＤＮＡを回収して分析する。ＥＭＲ２陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより評価し、ＥＭＲ２ ｇＲＮＡを用いた編集が、ＥＭＲ２のノックアウト又は低下させる際に有効であることを確認する。ＨＳＣにおける編集事象は、様々なＩｎｄｅｌ配列をもたらす。
抗体－薬物コンジュゲートに対する、ＥＭＲ２欠失を有する細胞の感受性
インビトロ毒性を決定するために、細胞を、培養培地中で抗体－薬物コンジュゲートとインキュベートし、生存細胞の数を経時的に定量化する。ＥＭＲ２において欠損している、又は本明細書中に記載されるＥＭＲ２ ｇＲＮＡで生成した、低下したＥＭＲ２発現を有する、操作された細胞は、全長ＥＭＲ２（偽）を発現する細胞よりも、抗体－薬物コンジュゲート処理に対してより耐性である。
（ｉｉ）ＥＭＲ２修飾細胞の濃縮
ＥＭＲ２修飾細胞が抗体薬物コンジュゲートを用いた治療後に濃縮されるかどうかをアッセイするために、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、５０％の標準ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）対ｇＲＮＡ比で編集する。細胞のバルク集団を、抗体－薬物コンジュゲートを用いた処理の前及び後に分析する。抗体薬物コンジュゲートを用いた治療後、ＥＭＲ２欠損細胞の割合が増加するように、ＥＭＲ２修飾細胞が濃縮される。
（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋ＨＳＰＣのインビトロ分化
細胞集団を、分化後の様々な日に、抗体薬物コンジュゲートを用いた治療の前及び後のリンパ球分化について評価する。本明細書中に記載するＥＭＲ２ ｇＲＮＡを用いて生成した、操作したＥＭＲ２ノックアウト細胞は、分化マーカーの増加発現を示し得るのに対し、全長ＥＭＲ２（偽）を発現する細胞は分化しないことがある。
実施例６：インビボでのＥＭＲ２ＫＯ ＣＤ３４＋細胞の持続性の評価
動員した末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＣ（ｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ）における編集
ｇＲＮＡを、実施例１及び３において記載したように設計した。ｍＰＢ ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを、製造業者の指示に従って解凍した。次いで、これらの細胞を、本明細書に記載するＥＭＲ２標的化ｇＲＮＡ、並びにヒト又はマウスゲノム内の任意の領域を標的としないように設計している非ＥＭＲ２標的化対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）を使用して、実施例１～３に記載するようにヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を介して編集する。
エクスビボ編集後４、２４、及び４８時間に、生存能力のある編集したＥＭＲ２ＫＯ細胞及び対照細胞の割合を、フローサイトメトリー及び７ＡＡＤ生存率染料を使用して定量化する。本明細書中に記載するＥＭＲ２ ｇＲＮＡを使用して編集した高レベルのＥＭＲ２ＫＯ細胞は、生存可能であり、エレクトロポレーション及び遺伝子編集後の時間にわたり生存可能なままであり得るが、非ＥＭＲ２ ｇＲＮＡ標的化対照ｇＲＮＡ、ｇＣｔｒｌで編集した対照細胞中で観察するものと同程度である。
加えて、エクスビボ編集後４８時間に、ゲノムＤＮＡを、実施例１に記載したように、ＩＮＤＥＬ（挿入／欠失）によって評価する編集の割合を決定するために、細胞から採取し、標的領域に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅し、精製し、ＴＩＤＥによって分析する。
ＴＩＤＥ分析後、本明細書中に記載するＥＭＲ２ ｇＲＮＡを用いた編集後の長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）のパーセンテージを、フローサイトメトリーにより定量化する。特定したＥＭＲ２ ｇＲＮＡを用いた編集後のＬＴ－ＨＳＣのパーセンテージを評価する。このアッセイを、例えば、インビボでのＥＭＲ２ＫＯ細胞の持続性の調査のためにマウスに注射する前に、編集した細胞の凍結保存時に実施し得る。編集した細胞を、１バイアル当たり１ｍＬ体積の培地において、５×１０６細胞／ｍＬでＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で凍結保存する。
インビボでのＥＭＲ２ＫＯ ｍＰＢ ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣの生着効率及び持続性の検討
６～８週齢である雌ＮＳＧマウス（ＪＡＸ）を、２～７日間にわたり順化させる。順化後、マウスに、Ｘ線照射器による１７５ｃＧｙ全身照射を使用して照射する。これを、検討の０日目とみなす。４～１０時間に、照射後、マウスに、本明細書中に記載するＥＭＲ２ ｇＲＮＡのいずれかの間に生成したＥＭＲ２ＫＯ細胞、又はｇＣｔｒｌで編集した対照細胞で生着させる。凍結保存細胞を解凍し、ＢｉｏＲａｄ ＴＣ－２０自動細胞カウンターを使用して計数する。生細胞の数を、解凍したバイアル中で定量化し、それを、マウスにおける生着のための細胞の総数を調製するために使用する。マウスに、１００μＬ容量中での１×１０６個の編集細胞の単回静脈内注射を与える。体重及び臨床観察所見を、四群中の各マウスについて週一回記録する。
生着後の８及び１２週目に、５０μＬの血液を、フローサイトメトリーによる分析のために、後眼窩出血により各マウスから回収する。１６週目に、生着後、マウスを屠殺し、血液、脾臓、及び骨髄を、フローサイトメトリーによる分析のために回収する。骨髄を、大腿骨及び脛骨から単離する。大腿骨からの骨髄も、オンターゲット編集分析のために使用する。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）１０カラー及びＢＤＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを使用して実施する。細胞を、一般的に、最初に７ＡＡＤ生存率染料を使用して生存率により選別し（生／死分析）、次に生細胞を、ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）の発現によりゲーティングするが、しかし、マウスＣＤ４５（ｍＣＤ４５）ではしない。ｈＣＤ４５＋である細胞を次に、ヒトＣＤ１９（ｈＣＤ１９）（リンパ球細胞、具体的にはＢ細胞）の発現についてさらにゲーティングする。ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）を発現する細胞もゲーティングし、骨髄系列の様々な細胞マーカーの存在について分析する。
いずれの編集細胞を生着したかに関わらず、全てのマウスにわたり同程度である、分析マーカーの各々を発現する細胞の数は、マウスの血液中のＥＭＲ２ ｇＲＮＡで編集したＥＭＲ２ＫＯ細胞の成功裏の生着を示す。
生着後８、１２、及び１６週目に、ｈＣＤ４５＋である有核血液細胞のパーセンテージを、対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）で編集した対照細胞、又はＥＭＲ２ＫＯ細胞を受けたマウス（ｎ＝１５マウス／群）の群において定量化する。これを、ｈＣＤ４５＋絶対細胞数をマウスＣＤ４５＋（ｍＣＤ４５）絶対細胞数により割ることにより定量化する。
血液中のｈＥＭＲ２＋細胞のパーセンテージも、対照群及びＥＭＲ２ＫＯマウス群における生着後の８週目に定量化する。ＥＭＲ２ＫＯ細胞（本明細書中に記載するＥＭＲ２ ｇＲＮＡのいずれかで編集した）を生着させたマウスは、８、１２、及び１６週目に対照細胞で生着されたマウスと比較して、有意に低いレベルのｈＥＭＲ２＋細胞を有すると予測する。
次に、血液中の分化細胞、例えばＣＤ１９＋リンパ系細胞、ｈＣＤ１４＋単球、及びｈＣＤ１１ｂ＋顆粒球／好中球などの特定の集団のパーセンテージを、ＥＭＲ２ＫＯ細胞又は対照細胞を生着させたマウスにおける生着後８、１２、及び１６週目に定量化する。血液中でのｈＣＤ１９＋細胞、ｈＣＤ１４＋細胞、及びｈＣＤ１１ｂ＋細胞のレベルは、対照とＥＭＲ２ＫＯ群の間で同等であり、これらの細胞のレベルは、生着後８～１６週まで同等なままであった。血液中でのｈＣＤ１９＋、ｈＣＤ１４＋、及びｈＣＤ１１ｂ＋細胞の同程度のレベルは、ヒト骨髄細胞及びリンパ細胞集団の類似のレベルが、ＥＭＲ２ＫＯ細胞を受けたマウス及び対照細胞を受けたマウスにおいて存在することを示す。
最後に、アンプリコン－ｓｅｑが、生着後１６週目に単離された骨髄試料上で実施され、編集ＥＭＲ２ＫＯ細胞で生着されたマウスにおけるオンターゲットＥＭＲ２編集を分析し得る。
生着動物の脾臓から得られた細胞試料を評価する
生着後１６週目に、ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ及びｈＥＭＲ２＋細胞のパーセンテージをまた、対照細胞又はＥＭＲ２ＫＯ細胞を生着させたマウスの脾臓において定量化する。マウス（対照細胞又はＥＭＲ２ＫＯ細胞を生着）の群間でのｈＣＤ４５＋細胞の同程度のレベル及びｈＥＭＲ２＋細胞の低下レベルは、ＮＳＧマウスの脾臓におけるＥＭＲ２ＫＯ ＨＳＣの長期持続性を示し得る。
加えて、生着後の１６週目に、脾臓中のｈＣＤ１４＋単球、ｈＣＤ１１ｂ＋顆粒球／好中球、ＣＤ１９＋リンパ系細胞、及びｈＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを定量化する。対照群とＥＭＲ２ＫＯ群の間での脾臓におけるｈＣＤ１４＋細胞、ｈＣＤ１１ｂ＋細胞、ｈＣＤ１９＋細胞、及びｈＣＤ３＋の同程度のレベルは、編集ＥＭＲ２ＫＯ細胞が、ＮＳＧマウスの脾臓においてヒト造血細胞再構成を多系統化することが可能であることを示し得る。
血液及び骨髄好中球を評価する
生着後１６週目に、ｈＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセンテージを、対照細胞又はＥＭＲ２ＫＯ細胞を生着させたマウスの血液及び骨髄において定量化する。ＮＳＧマウスの血液及び骨髄の両方において対照細胞及びＥＭＲ２ＫＯ細胞を生着させたマウスにおいて観察した、ＣＤ１１ｂ＋好中球集団の同程度のレベルは、成功裏の生着及び分化を示す。
血液及び骨髄骨髄性及びリンパ系前駆細胞を評価する
また、１６週目に、血液中のｈＣＤ１２３＋細胞のパーセンテージ及び骨髄中のｈＣＤ１２３＋細胞のパーセンテージ、並びに骨髄中のｈＣＤ１０＋細胞のパーセンテージを、対照細胞又はＥＭＲ２ＫＯ細胞で生着されたマウスにおいて定量化する。対照群とＥＭＲ２ＫＯ群の間での骨髄前駆細胞及びリンパ系前駆細胞の同程度のレベルは、成功裏の生着及び発生を示し得る。
実施例７：ＣＢＥ及びＡＢＥ塩基エディターを使用したＥＭＲ２の編集
スクリーニングプロセスを利用して、ＣＤ３４＋細胞におけるＣＢＥ及びＡＢＥを用いてＥＭＲ２を編集するための例示的なガイドＲＮＡを評価した。図１３を参照されたい。ＣＢＥ及びＡＢＥなどの塩基エディターと対形成ときのＥＭＲ２編集効率について設計し、スクリーニングしたｇＲＮＡの例は、表３及び４並びに表５～７に見られる。ＧＣＣＧＡＣＧＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＣＧ（配列番号３２０）の配列を有するＥＭＲ２（ｇＣｔｒｌ）を標的としない対照ｇＲＮＡを、分析に使用した。
編集した細胞の生存率
編集後の様々な時点で、細胞数及び細胞生存率分析を行い、これは、ＥＭＲ２のＣＢＥ及びＡＢＥを用いた編集が、細胞生存率の低減を引き起こさなかったことを示した。図１５Ａ～１５Ｃを参照のこと。
ＤＮＡ編集分析
ＨＳＣにおけるＣＢＥ及びＡＢＥを使用したＥＭＲ２編集結果の分析を、エレクトロポレーション後の様々な時点でｒｈＡｍｐＳｅｑを使用して行った。結果は、ＥＭＲ２における高レベルの編集及び効率的なスプライス部位の破壊を示した。図１６Ａ～１６Ｃを参照のこと。
ＥＭＲ２タンパク質発現のフローサイトメトリー分析
ｇＲＮＡ及び塩基エディターを用いてエレクトロポレーションしたＥＭＲ２編集細胞のフローサイトメトリー分析により、有意なレベルのＥＭＲ２ノックダウンをもたらしたｇＲＮＡが明らかになった。図１４Ａ～１４Ｂ及び１７Ａ～１７Ｃの参照のこと。
転写産物発現分析
ＥＭＲ２転写物の液滴デジタルＰＣＲ分析は、エレクトロポレーションを受けなかった対照細胞と比較して、ＥＭＲ２ ｍＲＮＡ転写物のレベルの２０～５０％の低減を示した。図１８Ａ～１８Ｃを参照のこと。
参考文献
例えば、発明の背景、概要、詳細な説明、実施例、及び／又は参考文献のセクションにおける、本明細書に記述される全ての刊行物、特許、特許出願、公表、及びデータ塩基エントリー（例えば、配列データベースエントリー）は、個々の刊行物、特許、特許出願、公表、及びデータベースエントリーが、参照により具体的に及び個別に本明細書に組み込まれるかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先されるであろう。
均等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載される実施形態の多くの均等物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、一つ、又は一つより多くを意味し得る。群の二つ以上のメンバーの間に「又は」を含む、請求項又は明細書は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうちの一つ、一つより多く、又は全てが存在する場合に満たされるとみなされる。二つ以上の群のメンバーの間に「又は」を含む群の開示は、群のちょうど一つのメンバーが存在する実施形態、群の二つ以上のメンバーが存在する実施形態、及び群のメンバーの全てが存在する実施形態を提供する。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張又は否定され得ることが理解されるであろう。
本発明は、請求項のうちの一つ以上、又は明細書の一つ以上の関連部分からの一つ以上の制限、要素、節、又は説明用語が、別の請求項に導入される、全ての変形例、組み合わせ、及び順列を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に依存する請求項は、同じ基本請求項に依存する任意の他の請求項において見出される限定のうちの一つ以上を含むように改変され得る。更に、請求項が組成物を列挙する場合、別段の指示がない限り、又は矛盾若しくは不一致が生じることが当業者に明白ではない限り、本明細書に開示される作製若しくは使用方法のうちのいずれかによる、又は存在する場合、当技術分野で公知の方法による、組成物を作製若しくは使用する方法が含まれることを理解されたい。
要素が、例えば、マーカッシュグループ形式においてリストとして提示される場合には、要素のすべての可能な部分集団も開示されており、任意の要素又は要素の部分集団をグループから除外することができることを理解すべきである。また、「含む」という用語は、開放的であることを意図し、追加の要素又はステップの包含を可能にすることにも留意されたい。一般的に、実施形態、製品、又は方法が、特定の要素、特徴、又はステップを含むと言及される場合、そのような要素、特徴、若しくはステップからなる、又はそれらから本質的になる実施形態、製品、又は方法も同様に提供されることが理解されるべきである。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張又は否定され得ることが理解されるであろう。
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。更に、別段の指示がない限り、又は文脈及び／若しくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に別段に指示しない限り、一部の実施形態では、範囲の下限の単位の１／１０まで、記載された範囲内の任意の特定の値を想定し得ることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は、本明細書には個別に詳述されていないが、これらの値の各々は、本明細書に提供され、具体的に主張され又は否認され得ることが理解されよう。また、別段で指示されない限り、又は文脈及び／若しくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができ、部分範囲の終点は範囲の下限の単位の１／１０と同程度の精度で表されることも理解されたい。
加えて、本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか一つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。範囲が与えられる場合、その範囲内の任意の値は、請求項のうちのいずれか一つ以上から明示的に除外され得る。本明細書中に記載される組成物及び／又は方法の任意の実施形態、要素、特徴、適用、又は態様を、任意の一つ以上の特許請求から除外することができる。簡潔にするために、一つ以上の要素、特徴、目的、又は態様が除外される実施形態の全ては、本明細書に明示的に記載されていない。

Claims (48)

  1. 標的化ドメインを含むｇＲＮＡであって、前記標的化ドメインが、表１～８に記載される配列を含む、ｇＲＮＡ。
  2. 標的化ドメインを含むｇＲＮＡであって、前記標的化ドメインが、配列番号５９～７６、１２５～１４８、１６１～１６６、１７９、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、１９５、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４９、２４３、２４６、２４９、２５２、２５４～２５７、２６８、２７１、２７４、２７７、２８０、２８３、２８６、２８９、２９１、２９４、２９７、３００、３０３、３０６、３０９、３１２、３１５、３１７、及び２１９のいずれか一つの配列を含む、ｇＲＮＡ。
  3. 前記ｇＲＮＡが、第一の相補性ドメインと、結合ドメインと、前記第一の相補性ドメインに相補的である第二の相補性ドメインと、近位ドメインとを含む、請求項１及び２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  4. 前記ｇＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  5. 前記ｇＲＮＡが、化学的に修飾されている一つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  6. 前記ｇＲＮＡが、２’Ｏ－メチル部分を含む一つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  7. 前記ｇＲＮＡが、ホスホロチオエートを含む一つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  8. 前記ｇＲＮＡが、チオＰＡＣＥ部分を含む一つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  9. 遺伝子操作された細胞を生成する方法であって、
    ａ．細胞を提供することと、
    ｂ．前記細胞を、（ｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、又は請求項１～８のいずれか一項のｇＲＮＡによって標的化される標的化ドメインを標的とするｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）前記ｇＲＮＡに結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、したがって、（ｉ）の前記ｇＲＮＡが（ｉｉ）の前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼとリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、及び／又はそれを維持するため、かつＲＮＰ複合体が前記細胞のゲノム内の標的ドメインに結合するために好適な条件下で、前記ＲＮＰ複合体を形成することと、を含む、方法。
  10. 前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、ｓｐＣａｓヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ｓａＣａｓヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、塩基エディターである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、シトシン塩基エディター又はアデニン塩基エディターである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記接触させることが、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で、（ｉ）及び（ｉｉ）を前記細胞に導入することを含む、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記接触させることが、（ｉ）の前記ｇＲＮＡ及び／又は（ｉｉ）の前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）を前記細胞に導入することを含む、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. （ｉ）の前記ｇＲＮＡ及び／又は（ｉｉ）の前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である、請求項９～１６又は１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記リボ核タンパク質複合体が、エレクトロポレーションを介して前記細胞に導入される、請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記細胞が、造血細胞である、請求項９～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記細胞が、造血幹細胞である、請求項９～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記細胞が、造血前駆細胞である、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項９～２０のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記細胞が、リンパ球である、請求項９～２０又は２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記細胞が、Ｔリンパ球である、請求項９～２０、２４、又は２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 請求項９～２６のいずれか一項に記載の方法によって取得される、遺伝子操作された細胞。
  28. 請求項２７に記載の遺伝子操作された細胞を含む、細胞集団。
  29. 遺伝子操作された細胞を含む細胞集団であって、前記遺伝子操作された細胞が、表１～８のいずれかに記載される標的化ドメインを含むｇＲＮＡに結合されたときに、ＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断された部位のすぐ近位の挿入又は欠失からなるゲノム修飾を含む、細胞集団。
  30. 前記ゲノム修飾が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象によって生成された挿入又は欠失である、請求項２９に記載の細胞集団。
  31. 前記ゲノム修飾が、相同組換え修復（ＨＤＲ）事象によって生成された挿入又は欠失である、請求項２９に記載の細胞集団。
  32. 前記ゲノム修飾が、そのようなゲノム修飾を持つ遺伝子操作された細胞におけるＥＭＲ２の機能喪失をもたらす、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の細胞集団。
  33. 前記ゲノム修飾が、ＥＭＲ２のゲノム修飾を持たない同じ細胞型の野生型細胞におけるＥＭＲ２の発現レベルと比較して、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、又は０．００１％未満までのＥＭＲ２の発現の低減をもたらす、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の細胞集団。
  34. 前記遺伝子操作された細胞が、造血幹又は前駆細胞である、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の細胞集団。
  35. 前記遺伝子操作された細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の細胞集団。
  36. 前記遺伝子操作された細胞が、Ｔリンパ球である、請求項２９～３３又は３５のいずれか一項に記載の細胞集団。
  37. 前記免疫エフェクター細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項３５及び３６のいずれか一項に記載の細胞集団。
  38. 前記ＣＡＲが、ＥＭＲ２を標的とする、請求項３７に記載の細胞集団。
  39. レシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着し、かつ前記レシピエントにおける全ての血液系細胞型の分化した子孫を生成する能力によって特徴付けられる、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の細胞集団。
  40. 少なくとも５０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２８～３４又は３９のいずれか一項に記載の細胞集団。
  41. 少なくとも６０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２８～３４、３９又は４０のいずれか一項に記載の細胞集団。
  42. 少なくとも７０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２８～３４又は３９～４１のいずれか一項に記載の細胞集団。
  43. 少なくとも８０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２８～３４又は３９～４２のいずれか一項に記載の細胞集団。
  44. 少なくとも９０％の効率でレシピエントの骨髄にＥＭＲ２編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２８～３４又は３９～４３のいずれか一項に記載の細胞集団。
  45. 前記細胞集団が、未編集造血幹細胞の分化能と同等である分化能によって特徴付けられるＥＭＲ２編集造血幹細胞を含む、請求項２８～３４又は３９～４４のいずれか一項に記載の細胞集団。
  46. 請求項２７に記載の遺伝子操作された細胞又は請求項２８～４５のいずれか一項に記載の細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  47. 前記対象が、造血器悪性腫瘍を有するか、又は造血器悪性腫瘍と診断されている、請求項４６に記載の方法。
  48. 有効量のＥＭＲ２を標的とする薬剤を前記対象に投与することを更に含み、前記薬剤が、ＥＭＲ２に結合する抗原結合断片を含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
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