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JP2023525720A - Ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入のためのベクター及び方法 - Google Patents

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ジェー ジョリー、ダグラス
ジー オスタータグ、デレク
カサハラ、ノリユキ
イバネス、カルロス
エイ ベントレー、コーネリア
ムシュタク フセイン、モフド
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アビタス バイオ インコーポレイティッド
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Abstract

Figure 2023525720000001
本開示は、in vivoで抗原受容体結合構築物の細胞発現を介して免疫を誘導するための組成物及び方法を提供する。
【選択図】図１１

Description

関連出願への相互参照
本願は、35 U.S.C. §119に基づき、2020年5月11日に出願された米国仮出願第63/023,191号及び2020年12月31日に出願された米国仮出願第63/133,224号の優先権を主張する。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、癌、感染症、アレルギー、変性及び免疫疾患の細胞療法のための組成物及び方法を提供する。
配列表の参照による組み込み
本願には、2021年5月11日に作成され、239,881バイトのデータを有し、IBMPC、MS-ウィンドウズオペレーティングシステム上で機械フォーマットされた"Sequence-Listing_ST25.txt"と題した配列表が添付されている。該配列表は、あらゆる目的のため、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
養子免疫療法は、癌治療アプローチの最前線まで浮上している。T細胞は、腫瘍関連抗原を認識するキメラ抗原受容体(CAR)の遺伝子を発現するように操作することができる。CARは、T細胞を再誘導して腫瘍細胞を選択的に死滅させるように操作された免疫受容体である。癌免疫療法におけるそれらの使用の一般的な前提は、腫瘍標的化T細胞を迅速に生成することである。
概要
理想的な遺伝子送達システムは、製造が容易であり、投与が容易であり、正常細胞に対して非毒性であり、遺伝子情報を効率的かつ特異的に血流を介して標的組織に送達し、導入遺伝子が安定して発現されるように遺伝物質を宿主細胞に統合するであろう。本明細書に記載の新規なシステムは、これらに適合する。
本開示は、(a)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするポリヌクレオチド、及び(b)少なくとも1つのmiRNA標的配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供し、ここで、(a)及び(b)が同一のポリヌクレオチド上で連結される。一実施形態では、前記ベクターは、(c)プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する細胞傷害性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、前記(a)が、1つ以上の抗原結合ドメインをコードする第1ポリヌクレオチドドメイン、リンカーをコードする任意のポリヌクレオチドドメイン、前記第1ポリヌクレオチドドメインに作動可能に連結された第2ポリヌクレオチドドメイン（ここで、該第2ポリヌクレオチドドメインが膜貫通をコードする）、及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードする。第3ポリヌクレオチドドメインを含む。さらなる実施形態では、前記第1ポリヌクレオチドドメインは、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖可変断片、単一ドメイン抗体、ラクダ科VHHドメイン、非免疫グロブリン抗原結合足場、受容体または受容体断片、または二重特異性抗体をコードする。別の実施形態では、前記リンカーをコードする任意のポリヌクレオチドは、Gly3配列をコードする。さらに別の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα、βまたはζ鎖、CD3γ、CD3ε、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CDl la, CD18) 、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244, 2B4)、 CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A, Lyl08)、SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、及び/またはNKG2Cからなる群から選択されるメンバーに由来する。さらに別の実施形態では、前記第3ポリヌクレオチドドメインは、CD3ζ、共通FeRγ(FCER1G)、Feγ RIIa、FeRβ(FeεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP1O、及びDAP12からなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインをコードする。一実施形態では、前記プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する細胞傷害性ポリペプチドは、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチド、チミジンキナーゼ活性を有するポリペプチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。上記の実施形態のいずれにおいて、前記ベクターは、組み込みベクターである。さらなる実施形態では、前記ベクターは、レトロウイルスベクターである。さらに別の実施形態では、前記レトロウイルスベクターは、非複製γレトロウイルスベクターである。別の実施形態では、前記少なくとも1つのmiRNA標的配列は、hsa-miR-223-3p、hsa-miR143-3p、hsa-mir182-5p、hsa-miR-l0bp、hsa-miR141-3p、hsa-miR486-5p、及び前述の任意の組み合わせからなる群から選択されるmiRNAによって結合される。
本開示はまた、gagポリペプチド、polポリペプチド、envポリペプチド、及びレトロウイルスベクターのキャプシド内に含まれるレトロウイルスポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルス粒子を提供し、ここで、該レトロウイルスポリヌクレオチドが、5'から3'へ、(R-U5ドメイン)-(任意のシグナルペプチドコード配列ドメイン)-(結合ドメインコード配列ドメイン)-(任意のヒンジ/リンカーコード配列ドメイン)-(膜貫通(TM)コード配列ドメイン)-(miRNA標的ドメイン)-(U3-R ドメイン)を含む。一実施形態では、前記R-U5ドメインは、ヌクレオチド1から約ヌクレオチド145まで、配列番号:25と少なくとも80%同一である配列を有する。別のまたはさらなる実施形態では、前記結合ドメインコード配列には、シグナル配列が先行する。さらに別のまたはさらなる実施形態では、前記結合ドメインコード配列に続いて、任意のリンカー/スペーサードメイン配列が続く。さらに別のまたはさらなる実施形態では、前記レトロウイルスポリヌクレオチドは、キルスイッチドメインコード配列をさらに含む。さらなる実施形態では、前記キルスイッチドメインは、プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換するポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されたIRESを含む。さらなる実施形態では、前記ポリペプチドは、チミジンキナーゼ(TKO)活性またはシトシンデアミナーゼ(CD)活性を有する。別の実施形態では、前記レトロウイルスポリヌクレオチドは、少なくとも1つのmiRNA標的配列を含む。さらなる実施形態では、前記少なくとも1つのmiRNA標的配列は、複数のmiRNA標的配列を含む。さらに別の実施形態では、前記複数のmiRNA標的配列は、同一である。さらに別の実施形態では、前記複数のmiRNA標的配列の少なくとも2つが異なる。別の実施形態では、前記U3-Rドメインは、ヌクレオチド約5537から約6051まで、配列番号:25と少なくとも80%同一である配列を含む。
本開示はさらに、本開示のベクターを用いたin vivo形質導入によって産生された遺伝子形質導入幹細胞を担持する非ヒト動物を提供する。
3'UTRマイクロRNA標的配列を変化させるか、または変化させずにCARまたはGFP導入遺伝子を送達するように設計されたRNVの図である。その例には、miR233(単球における転写物の分解を引き起こす)またはmiRaBCT及びmiRaNKT(それぞれB細胞及びNK細胞における転写物の分解を引き起こす)が含まれる。これらの標的配列は、1～4の倍数で種々の組み合わせで添加され、単球、B細胞、及びNK細胞における導入遺伝子の分解を誘導する。
3'UTRマイクロRNA標的配列を変化させるか、または変化させずにCARまたはGFP導入遺伝子を送達するように設計されたRNVの図である。図1に加えて、さらなる例には、肝細胞における導入遺伝子の転写物の分解を規定するmiR122a及びmiR199aが含まれる。これらの標的配列は、1～4の倍数で図X1に記載のmiRNA標的配列と種々の組み合わせで添加され、導入遺伝子を誘導する。
混合リンパ球(PBMC)形質導入からの末梢T細胞における予想されるCD19CAR発現プロフィールを示す。in vitroで感染したPBMC細胞をCD3、CD20、CD4、CD8、CD45、及びCD19CARに特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析する。CD3、CD4、及びCD8陽性細胞は、RNV-GFP感染PBMCと比べて、CD19CAR陽性染色(APC)を示す。
安全性について修飾された3つのMLVベースのレトロウイルス成分:広宿主性のenv (4070A由来)、gag/pol(MoMLV由来)、及びベクター (MoMLV由来)の概略を示す。(A)pKT-1レトロウイルスベクターにおいて、外来配列(黒色で示す)5'LTRの上流、3'LTRの下流、及び単一ClaI部位とTAG env停止コドンとの間を欠失させた。また、2つの停止コドンを拡張パッケージシグナルΨ+に導入してGag/polタンパク質の産生を防止した。第1 TAA停止コドンは、gag/polのATG開始コドンを置換し、第2 TGA停止コドンは、第1 TAA停止後12 ntに導入された。これらの全ての変化は、安全性について修飾されたベクターpBA-5bに組み込まれた。次に、本研究で使用されたプラスミドベクターに到達するために、ポリリンカーをpBA5bの中に挿入した。(B)元のgag/pol構築物pSCV10において、全ての5'及び3'非翻訳配列を除去し、該配列は、切断されたPol(pSCV10/5',3'tr.またはpCI-GPM)におけるインテグラーゼ遺伝子の最後の 28 アミノ酸をコードする。また、変性コードをgag/polの最初の420 ntに組み込み、ベクター(pCI-WGPM)の拡張パッケージシグナルとの重複を防止した。(C)元の広宿主性エンベロープ構築物pCMVenvamDraを改変し、3'非翻訳配列(pCMVenvamDraLBGH)または5'及び3'非翻訳配列(pCMV-β/envam)のいずれかが欠失されるように、配列重複を最小限に抑えた。
上記の複数のmiR配列を用いて、骨髄細胞、B細胞、及びNK細胞におけるGFP配列の発現を減少させるために使用されるマイクロRNA標的配列を含む構築物を示す。
パッケージング細胞株(PCL)及び高力価のベクター生産株(VPCL)を親細胞株から生成するためのプロセスを要約するフローチャートを示す。臨床的製造のために、選択されたクローンを最終的に増殖し、凍結保存し、GMPに準じて試験し、GMPに適合したマスター及びワーキング細胞バンクを作成する。
A20 B細胞リンパ腫動物モデルにおける実験の結果を示す。ここで、(B)(A)mCD19(1D3)-IRES YCD(V)のベクターを、A20移植後3日目に開始して、1日あたりIE7の用量で4日間連続してIV注射した担癌マウス。A20 B細胞リンパ腫移植後12、18、及び25日目に、溶媒対照及びRNV-1D3処置動物におけるイメージング(C)及び発光シグナル(D、放射輝度)によって腫瘍負荷を評価した。発光シグナルのイメージングは、腫瘍負荷の視覚的な減少を示す(C)。腹側及び背側の両方の透視(頂部及び底部の画像)からの各マウスについて、定量的な発光シグナルを評価される。(E)処置及び対照マウスのB細胞(CD19陽性)カウントの測定から、25日目までに処置マウスにおけるB細胞カウントの有意な低下が示された。
ウエスタンブロットが、yCD2導入遺伝子を有しない構築物14と比べて、高MOI(MOI 10)及び低MOI(0.1)で、構築物8で形質導入された細胞中のyCD2の発現を確認できることを示す。
CD及びチミジンキナーゼ(TK)をコードするベクターについての死滅曲線を示す：CDをコードするベクター+/-5-FC(フルシトシン、D. Ostertagら Neuro-Oncology 2012)及びTKベクター+/-ガンシクロビル(GCV)。試験細胞をプレートし、24～48時間後に薬物を示した種々の濃度で添加した。5～7日後に生存率を測定し、死滅曲線を作成し、MTSアッセイ(Abcam ab197010)を用いてIC50を測定した。結果は、キルスイッチ遺伝子を持たないベクターを担持する細胞のIC50が、それを担持しない細胞と比べて、1～3 log大きいことを示している。
RNVベクター中の、miRNA標的配列を含む効果を示す。miR223-3pの標的配列をGFPベクターに挿入して、配列pBA-9B-GFPmiR223-3pB-4TX(構築物7)を得て、感染性ベクターの作製に用いた。miR223-3pは、単球または骨髄細胞においてのみ有意な濃度で産生されるマイクロRNAである。(A)所望の結果の概念画像。(B)は、U937 単球細胞株における、元のGFP ベクター(左の列)、GFP miR 223-3pベクター(中央の列)、及びmiRaBCに無関係なmiRNA標的を含む GFPベクターの発現を示し、他の2つのベクターと比べて、GFPmiR223感染細胞株におけるGFP発現の190～100倍の減少を示している。全ての3つのベクターはHT-1080線維肉腫細胞または他の非単球細胞において同等の量のGFPを産生した。
抗BCMA-CAR RNV構造の表現を示す。
miRNA発現の同定に関する箱ひげ図の一例を示す。
miRNA発現の非標的化の一例を示す。この図は、U937 単球細胞株における、元のGFP ベクター(左の列)、GFP miR 223-3pベクター(中央の列)、及びmiRaBCに無関係なmiRNA標的を含む GFPベクターの発現を示し、他の2つのベクターと比べて、GFPmiR223感染細胞株におけるGFP発現の100倍の減少を示している。
env配列のプロリンリッチ領域に挿入された両方向に抗CD8 scFV配列を含むように改変された4070A広宿主性エンベロープを示す。MuLV及びレンチ偽型を使用したCD34+造血幹細胞への細胞特異的標的化のための代替キメラウイルスエンベロープの使用。リンパ球を標的とするレンチウイルスベクターの偽型決定は、文献(Frankら (2019) リンパ球のサブタイプへの選択的遺伝子導入のための表面処理されたレンチウイルスベクター, Mol. Ther. (Vol. 12))で議論されている。キメラ偽型の大部分は、麻疹及びNipahウイルス系の二重標的化及び融合機能を利用して生じた。ウイルス細胞受容体の付着について、麻疹ウイルスは、シアル酸受容体に付着するためのヘマグルチニン-ノイラミダーゼ(HN)をコードし、タンパク質性受容体に付着するための糖タンパク質(G)及びヘマグルチニン(H)をコードする。
(A)ヒンジ-TM及びシグナル伝達ドメインに結合した抗マウスCD19-1D3 scFVモノクローナル抗体に基づくマウスCD19CAR構築物を有するpBA-9Bベクター、または(B)ヒンジ-TM及びシグナル伝達ドメインに結合した抗ヒトCD19-FMC63 scFVモノクローナル抗体に基づくヒトCD19CAR構築物を有するpBA-9Bベクターのプロウイルスの統合型を示す。
骨髄細胞、B細胞、及びNK細胞におけるCAR配列の発現を減少させるために使用されるマイクロRNA標的配列を示す。
ヒト抗CD19CAR配列の発現を確実にするEFlaエンハンサーを有する構成CMVプロモーターを用いて発現を駆動するSINベクター設計の例を示す。該ベクターは、ヒトコドン最適化チミジンキナーゼ(TKO)遺伝子または酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子(yCD2)の発現のための挿入リボソーム進入部位(IRES)配列を、その対応するプロドラッグに曝露されたときにベクターキルスイッチとして含み、続いて、目的遺伝子の発現増強のためのウッドチャック肝炎翻訳後(WPRE)要素を含む。
(A)CCR5、(B)CCR2、(C)CCR5及びCCR2、ならびに(D)内部プロモーターによって駆動されるCRISPR/CAS9を有するCCR5及びCCR2に対するCRISPR/CAS9システムを含むレトロウイルス構築物を示す。
HIV共受容体CCR5及びCCR2の活性を阻害することによってHIV感染または多発性硬化症を治療するためのレトロウイルス構築物(A-D)を示す。
HIV共受容体CCR5及びCCR2のsiRNAを用いてHIV感染または多発性硬化症を治療するためのレトロウイルス構築物(A-D)を示す。
CCR5及びCCR2にCRISPR/CAS系を用いてHIV感染または多発性硬化症を治療するためのレトロウイルス構築物を示す。
造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)のin vivoでの動員及び形質導入のためのプロトコルに用いられる予定表を示す。
動員されたBalb/cマウスにおける2時間のin vivo形質導入におけるRNV-GFPを示す。脾細胞を採取し、培養3日後にFACS分析及びMethoCultアッセイによりHSPCのGFP形質導入について調べた。FACS分析後に撮影した顕微鏡写真(上のパネルはUV光下でGFP+細胞を示し、下のパネルは位相差を示す)。
詳細な説明
本明細書及び添付の請求項に用いられる単数形の"１つ"、及び"該"は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の対象物を含む。従って、例えば、"一被験者"を言及することは、複数のこのような被験者への言及を含み、"該ベクター"を言及することは、当業者に公知の1つ以上のベクター及びその等価物への言及を含む。他についても同様である。
また、"または"は、他に記載されていない限り、"及び/または"を意味する。同様に、"含む"、"含んでいる"、"包含する"、及び"包含している"は、交換可能であり、限定を意図したものではない。
さらに理解すべきこととして、様々な実施形態の説明が"含む"という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、代替的に"本質的に・・・からなる"または"・・・からなる"という用語を用いて実施形態を説明してもよいことを理解するであろう。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Allenら, Remington:薬学と実践(第22版), Pharmaceutical Press(2012年9月15日); Hornyakら,ナノサイエンスとナノテクノロジー入門, CRC Press(2008); SingletonとSainsbury, 微生物学及び分子生物学辞書(第3版改定), J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); Smith, Marchの上級有機化学反応、メカニズムと構造(第7版), J. Wiley & Sons(New York, NY 2013); Singleton, DNAとゲノム技術辞典(第3版), Wiley-Blackwell(2012年11月28日); 及びGreenとSambrook, 分子クローニング：実験マニュアル(第4版), Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, NY 2012)では、当業者向けの、本出願で使用される多くの用語への一般的なガイドが提供されている。抗体の調製方法については、Greenfield, 抗体：実験マニュアル(第2版), Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013); KohlerとMilstein, 細胞融合による特異的な抗体産生組織培養及び腫瘍株の誘導, Eur. J. Immunol. 1976年7月,6(7):511-9; QueenとSelick,ヒト化免疫グロブリン,米国特許番号5,585,089(1996年12月);及びRiechmannら,治療用ヒト抗体の再形成, Nature, 1988年3月24日,332(6162):323-7A11を参照されたい。本明細書中で提供される全ての見出し及び副見出しは、単に読みを容易にするためだけであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載した方法及び材料と類似または同等の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。また、材料、方法、及び特定の実施例は、単に例示的なものであり、限定することを意図するものではない。
本明細書に言及される全ての刊行物は、本明細書の記載と関連して使用され得る方法論を記載し、開示する目的のために、本明細書に完全に組み込まれる。さらに、本明細書において明確に定義された用語と類似している、または同一である1つ以上の刊行物に提示される任意の用語に関して、本明細書に明示的に提供される用語の定義は、全ての点で制御するであろう。
理解されたいこととして、本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されるものではなく、これらは変化し得る。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態または態様のみを説明するためのものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例において、または別途に示される場合以外に、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において"約"という用語で修飾されると理解されるべきである。本明細書で使用される"約"という用語は、当業者によって測定された特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味することができ、その値がどのように計測または測定されるか、例えば、測定システムの限界に部分的に依存することができる。あるいは、"約"は、所定値のプラスまたはマイナス20%、プラスまたはマイナス10%、プラスまたはマイナス5%、またはプラスまたはマイナス1%の範囲を意味することができる。あるいは、特に、生物学的システムまたはプロセスに関して、該用語は、値の5倍以内、または2倍以内の大きさのオーダー内であることを意味することができる。特定の値が本願及び請求項に記載されている場合、特に断らない限り、特定の値に対する許容誤差範囲内での用語"約"の意味を仮定することができる。また、値の範囲及び/またはサブ範囲が提供される場合、該範囲及び/またはサブ範囲は、その終点を含むことができる。場合によっては、変動は、特定の量の20%、10%、5%、1%、0.5%、または0.1%の量または濃度を含むことができる。
本明細書における数値範囲の引用のために、同じ程度の精度を有する各介在番号が明示的に意図されている。例えば、6～9の範囲の場合、6及び9の他に番号7及び8が明示的に意図され、また、6.0～7.0の範囲の場合、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、及び7.0が明示的に意図されている。
ウイルスのレトロウィルス科は、宿主ゲノムに組み込まれ、形質導入された細胞及びその子孫に長期間の遺伝子発現を提供するベクターを作製するために使用され得る。一般に、γレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及び泡状ウイルスベクターが、動員された幹細胞を含む細胞を形質導入するのに使用可能であり、有用である。本開示は、γレトロウイルスベクターに焦点を当てているが、当業者は、本発明が、ウイルス及び非ウイルスベクターを含む全てのタイプの組込みベクター、例えば、アデノウイルス-レトロウイルスハイブリッド、piggy-bac、及び眠れる森の美女トランスポゾン等を使用できることをすぐに理解するであろう。本開示は、遺伝的疾患、癌、感染症、及び自己免疫疾患を含む多種の疾患において治療効果を達成するためにベクターを直接に投与することにより、in vivoで細胞(造血幹細胞を含む)を形質導入するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、in vivo感染の前に動員され得る。
本開示のベクター構築物を下記のドメインを有するモジュール(時にはカセットと呼ばれる)と考えることができる。一般に、該ベクターは、長鎖末端反復、結合ドメイン、ヒンジまたはリンカードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、1つ以上のmiRNA標的ドメイン、任意のキルスイッチドメイン、及び任意の細胞活性調節ドメインを含む。前記結合ドメイン、ヒンジ/リンカー、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、一般に、第1世代、第2世代、第3世代、及び関連構築物を含むキメラ抗原受容体(CAR)を含む。
本明細書で使用される用語"抗体"は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、モノクローナル、またはポリクローナル、多鎖または単鎖、または無傷の免疫グロブリンであってもよく、天然の供給源または組換え供給源に由来してもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であってもよい。該抗体は、"ヒト化"、"キメラ"または非ヒトであってもよい。
用語"抗体断片"は、(例えば、結合、立体障害、安定化/不安定化、空間分布によって)抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも1つの部分を指す。抗体断片の例には、これらに限定されないが、Fab、Fab'、Fv断片、scFv抗体断片、ジスルフィド結合Fv、VH及びCH1ドメインからなるFd断片、線状抗体、vLまたはvHのいずれかのような単一ドメイン抗体(sdAb)、ラクダ類vHHドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片のような抗体断片から形成された多特異的抗体、及び抗体の単離されたCDRまたは他のエピトープ結合断片が含まれる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、v-NAR、及びbis-scFvに組み込むことができる(例えば、HollingerとHudson, Nature Biotechnology 23：1126-1136, 2005を参照)。抗原結合断片は、フィブロネクチンタイプIII(Fn3)のようなポリペプチドに基づいて足場に移植することもできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第6,703,199号を参照)。
用語"抗体重鎖"は、抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖の天然に存在する立体構造の中の比較的大きいものを指す。これは、通常には抗体が属するクラスを決定する。
用語"抗体軽鎖"は、抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖の天然に存在する立体構造の中の比較的小さいものを指す。カッパー(κ)及びラムダ(λ)軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
"抗癌剤"は、異常な細胞分裂及び増殖を阻害し、新生物細胞の遊走を阻害し、侵襲性を阻害し、または癌の増殖及び転移を防止する薬剤を指す。該用語には、化学療法製剤、生物学的製剤(例えば、siRNA、遺伝子操作されたMLV等のウイルスベクター、アデノウイルス、細胞傷害性遺伝子を送達するヘルペスウイルス)、及び抗体等が含まれる。
"抗癌作用"という用語は、様々な手段によって明らかになる生物学的効果を指す。該手段には、腫瘍体積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存率の低減、または癌の状態に関連する様々な生理学的症状の改善が含まれるが、これらに限定されない。"抗癌作用"は、原発場所における癌の発生を予防する際のCARの能力によっても明らかになる。
用語"抗原"または"Ag"は、免疫応答を誘発する分子を指す。該免疫応答は、抗体の産生、または特異的免疫応答性細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含むことができる。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として機能することができることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムDNAから由来することができる。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、本明細書で使用されるような"抗原"をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。限定するものではないが、本開示は、1つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含む。これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードする様々な組み合わせで配列される。さらに、当業者は、抗原が"遺伝子"によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。明白なこととして、抗原が生成され、合成され、または生体試料から由来してもよく、あるいは、ポリペプチドの他の巨大分子であってもよい。このような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、または他の生体成分を含む細胞または液体が含まれるが、これらに限定されない。
標的され得る抗原の非限定的な例は、以下を含む：CD5、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD72、CD97、CD123、CD171、CS1(CD2サブセット1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319、及び19A24とも呼ばれる)、C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1)、表皮成長因子受容体変異体III(EGFRviii)、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr))、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)、Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)、CD44v6、グリコシル化CD43エピトープ、発癌性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、キット(CD117)、インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2またはCD213A2)、メソテリン、インターロイキン11受容体α(IL-llRa)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、プロテアーゼセリン21(テスティシンまたはPRSS21)、血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)、ルイス(Y)抗原、血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)、ステージ特異的胚抗原-4(SSEA-4)、葉酸受容体α(FRaまたはFR1)、葉酸受容体β(FRb)、受容体チロシンタンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu)、ムチン1、細胞表面関連(MUC1)、表皮成長因子受容体(EGFR)、神経細胞接着分子(NCAM)、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、変異された伸長因子2(ELF2M)、エフリンB2、線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)、インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、カルボニックアンヒドラーゼIX(CA1X)、プロテアソーム(プロサム、マクロペイン)サブユニット、β型、9(LMP2)、糖タンパク質100(gpl00)、ブレークポイントクラスター領域(BCR)及びAbelsonマウス白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ 1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質、チロシナーゼ、エフリンA型受容体2(EphA2)、シアリルルイス接着分子(sLe)、ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)、トランスグルタミナーゼ5(TGS5)、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)、腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248)、腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R)、クローディン6(CLDN6)、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)、Gタンパク質共役型受容体クラスC群5、メンバーD(GPRC5D)、染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61)、CD179a、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)、ポリシアル酸、胎盤特異的1(PLAC1)、グロボHグリコセラミドの六糖部分(GloboH)、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、ウロプラキン2(UPK2)、A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)、アドレナリン受容体β3(ADRB3)、パネキシン3(PANX3)、Gタンパク質共役型受容体20(GPR20)、リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K 9(LY6K)、嗅覚受容体51E2(OR51E2)、TCRγ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)、癌/精巣抗原1(NY-ESO-1)、癌/精巣抗原2(LAGE-la)、メラノーマ関連抗原1(MAGE-A1)、染色体12pに位置するETSトランスロケーション変異遺伝子6（ETV6-AML）、精子タンパク質17(SPA17)、X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1)、アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2)、メラノーマ癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)、メラノーマ癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)、Fos関連抗原1、腫瘍タンパク質p53(p53)、p53変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-lまたはガレクチン8)、T細胞1によって認識されるメラノーマ抗原(MelanAまたはMARTI)、ラット肉腫(Ras)突然変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、肉腫トランスロケーションブレークポイント、アポトーシスのメラノーマ阻害剤(ML-IAP)、ERG(膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)、N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)、ペアボックスタンパク質Pax-3(PAX3)、アンドロゲン受容体、サイクリンBl、v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来のホモログ(MYCN)、RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)、チトクロームP450 1B 1(CYP1B 1)、CCCTC-結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORIS、またはインプリント部位の兄弟制御因子)、T細胞3によって認識された扁平上皮細胞癌抗原(SART3)、ペアボックスタンパク質Pax-5(PAX5)、プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)、キナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4)、滑膜肉腫、xブレークポイント2(SSX2)、最終糖化産物の受容体(RAGE-1)、腎ユビキタス1(RU1)、腎ユビキタス2(RU2)、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6)、ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7)、腸管カルボキシルエステラーゼ、変異された熱ショックタンパク質70-2(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1))、IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89)、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)、CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)、C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)、骨髄間質細胞抗原2(BST2)、EGF様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)、リンパ球抗原75(LY75)、グリピカン-3(GPC3)、Fc受容体様5(FCRL5)、免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9、シアリルルイス抗原)、フコシル-GMl、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、ILllRa、IL13Ra2、CD179b-IGL11、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Timl-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1鎖、TCR-β2鎖、TCR-γ鎖、TCR-δ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体 (LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLVl-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、インフルエンザAヘマグルチニン(HA)、GAD、PDL1、グアニル酸シクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体 (Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、クローディン18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低透過性塩化物チャンネル、及びTNT抗体によって認識される抗原。
"抗原結合ドメイン"は、は、その一次、二次または三次配列、翻訳後修飾及び／または電荷により、高度の特異性で抗原に結合するポリペプチドまたはペプチドを指す。抗原結合ドメインは、例えば、抗体(全長重鎖、Fab断片、単鎖Fv (scFv)断片、二価単鎖抗体または二重特異性抗体)、非免疫グロブリン結合タンパク質、リガンドまたは受容体等の異なる供給源に由来し得る。しかし、 (サイトカイン受容体を有する細胞の認識を導く) 結合されたサイトカイン、アフィボディ、天然に存在する受容体からのリガンド結合ドメイン、(例えば、腫瘍細胞上の)受容体に対する可溶性タンパク質/ペプチドリガンド、ペプチド、及び免疫応答を促進するためのワクチンのような多くの代替物が存在する。いくつかの実施形態では、所定の同族または抗原を高い親和性で結合するほとんどの分子を、当業者に理解されるように、抗原結合ドメインとして使用することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、T細胞受容体(TCR)またはその一部を含む。
用語"抗感染効果"は、感染性病原体の力価の低下、感染性病原体のコロニー数の減少、感染状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない様々な手段によって現れることができる生物学的効果を指す。
用語"抗腫瘍効果"または"抗癌効果"は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、転移の抑制、または腫瘍細胞生存率の低減を含むが、これらに限定されない様々な手段によって現れることができる生物学的効果を指す。
本明細書で使用され"有益な結果"は、病状の重症度を軽減または緩和すること、病状の悪化を防ぐこと、病状を治すこと、病状の進行を防ぐこと、患者における病状を発症する可能性を低減させること、及び患者の寿命または平均余命を延長することを含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、"有益な結果"は、1つまたは複数の症状の緩和、欠損の程度の減少、癌の進行状態の安定化(即ち、悪化しない)、転移または侵襲の遅延または緩徐、ならびに癌に関連する症状の改善または緩和であり得る。
本明細書で使用される"その生物学的等価物"という用語は、参照タンパク質、抗体またはその断片、ポリペプチドまたは核酸に言及する場合、"その等価物"と同義であることを意図し、所望の構造及び／または機能性を依然として維持しながら最小限の相同性を有するものを意図する。例えば、当等価物は、少なくとも約70%、または少なくとも80%、また、代わりに少なくとも約85%、または代わりに少なくとも約90%、または代わりに少なくとも約95%、または代わりに少なくとも98%の相同性または同一性を意図し、そして参照タンパク質、ポリペプチド、抗体またはその断片または核酸に対して実質的に同等の生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その等価物は、参照ポリヌクレオチドまたはその相補物に厳密な条件下でハイブリダイズし、同じ生物学的機能を有する(例えば、特定の、miRNAに結合するか、または比較されているポリヌクレオチドに対して同一または類似の生物学的効果を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする)ポリヌクレオチドである。あるいは、ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、その等価物は、参照ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドまたはタンパク質である。
"癌"及び"癌性"は、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例には、B細胞リンパ腫(ホジキンリンパ腫及び/または非ホジキンリンパ腫)、T細胞リンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患（真性多血症、骨髄線維症、本態性血小板血症等）、皮膚癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、食道癌、肛門癌、原発部位が未知の癌、内分泌癌、精巣癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、生殖器癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳腫瘍(例えば、神経膠芽細胞腫多型)、前立腺癌（アンドロゲン依存性前立腺癌及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を含むが、これらに限定されない）、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。他の癌及び細胞増殖性障害は、当該技術分野において容易に認識されるであろう。用語"腫瘍"及び"癌"は、本明細書では互換的に使用され、例えば、両方の用語は、固体及び液体(例えば、拡散または循環)の腫瘍を包含する。本明細書で使用される用語"癌"または"腫瘍"には、前悪性ならびに悪性の癌及び腫瘍が含まれる。用語"癌"は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の段階に関係なく、全てのタイプの癌性成長因子または腫瘍形成プロセス、転移組織または悪性に形質転換された細胞、組織または器官を含むことを意味する。
用語"細胞活性調節ドメイン"は、免疫細胞(例えば、T細胞、CAR-T細胞等)で発現され、免疫細胞の活性を減少、調節または改変する、PDL1、PDL2、CD80、CD86、crmA、p35、NEMO-K277A(またはその誘導体)、K13-opt、IKK2-SS/EE、IKK 1-SS/EE、41BBL、CD40L、vFLIP-K13、MC159等のいずれか1つまたは複数、及びそれらの組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、付属モジュールは、CARまたはCAR発現細胞の発現または活性を増加、減少、調節または改変するためにCARのような免疫受容体と共発現される。該付属モジュールは、単一のベクターを用いて、または2つ以上の異なるベクターを用いてCARと共発現させることができる。
"化学療法剤"は、癌の化学療法に用いることで知られている化合物である。化学療法剤の非限定的な例には、以下が含まれる：細胞増殖を抑えるチオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロスホスホアミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホン酸塩；カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む)；ブリオスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンのようなニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ1I及びカリケアマイシンωI1（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照）のような抗生物質；ダイナミシンAを含むダイナミシン；クロドロネートのようなビスホスホネート；エスペアマイシン；ならびにネオカルゾノスタチン発色団及び関連の色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリン-ドキソルビシン、2-ピロリン-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートや5-フルオロウラシル（5-FU）のような代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類似体；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストトラクトンようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような男性ホルモン剤；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎;フロリン酸のような葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラクスエート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシト；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシンとアンサミトシンのようなマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK(登録商標)多糖複合体(JHS天然物、Eugene, Oreg.)；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(特に、T-2毒素、ベラクリンA、ロリジンA、及びアンギジン)；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド("Ara-C")；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド(例えば、TAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE(登録商標)Cremophor-free、パクリタキセルのアルブミン-遺伝子操作されたナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, I11)、及びTAXOTERE (登録商標)ドセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド(VP-16)；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバントネート；イリノテカン(Camptosar, CPT-11)；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン(DMFO)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン；コブレタスタチン；ロイコボリン(LV)；オキサリプラチン、ラパチニブ（Tykerb）；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFRの阻害剤(例えば、エルロチニブ(Tarceva(登録商標))、VEGF-A、及び上記のいずれか薬剤的に許容される塩、酸または誘導体、またはこれらの組み合わせ。
"キメラ抗原受容体"(CAR)は、養子細胞転写と呼ばれる技術を用いて癌、自己免疫疾患及び感染症の治療として使用するために企図される人工の(非天然発生)免疫細胞(例えば、T細胞)受容体である。CARはまた、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体またはキメラ免疫受容体としても知られている。CARは、CARが結合する特定の抗原に応答して、T細胞の活性化及び増殖を刺激するように特異的に構築される。一般に、CARは、ポリペプチドのセット、典型的には最も単純な実施形態において2つのポリペプチドを指し、免疫エフェクター細胞において発現される場合、標的抗原または細胞、典型的には癌細胞に対する特異性を細胞に提供し、そして細胞内シグナル生成を提供する。いくつかの実施形態では、CARは、少なくとも、刺激分子及び/または共刺激分子から誘導される機能シグナル伝達ドメインを含む細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメイン(本明細書では"細胞内シグナルドメイン"とも呼ばれる)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットが、互いに隣接している。一実施形態では、CARは、CAR融合タンパク質のアミノ末端(N-ter)に任意のリーダー配列を含む。一実施形態では、CARは、細胞外抗原結合ドメインのN末端にリーダー配列をさらに含み、ここで、該リーダー配列は、CARの細胞膜への細胞処理中及び局在化中に抗原結合ドメイン(例えばscFV)から任意に切断される。種々の実施形態では、CARは、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域(HR)、膜貫通ドメイン(TMD)、任意の共刺激ドメイン(CSD)、及び細胞内シグナル伝達ドメイン(ISD)を含む組換えポリペプチドである。該任意の共刺激ドメインは、一般に、第1世代CAR構築物には存在しない。抗原結合ドメイン(例えば、vL及びvH断片、vHH、リガンド及び受容体等)を含む第2世代CARは、典型的には、共刺激ドメイン(例えば、41BB)を組み込む。別段の指定がない限り、本明細書で使用する用語"CAR"は、細胞に抗原特異性を付与するためのより新しいアプローチも包含する。例えば、抗体-TCRキメラ分子またはAb-TCR(WO2017/070608A1、参照により本明細書に組み込まれる)、TCR受容体融合タンパク質またはTFP(WO2016/187349A1、参照により本明細書に組み込まれる)、三機能性T細胞抗原カプラー(Tri-TACまたはTAC)(WO2015/117229A1、参照により本明細書に組み込まれる)。典型的には、"CAR-T細胞"という用語は、キメラ抗原受容体を発現するように操作されたT細胞を指すために使用される。従って、このようなCARを有するTリンパ球は、一般にCAR-Tリンパ球と呼ばれる。CARは、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（iPSC）、NK細胞、マクロファージ等、T細胞以外の細胞でも発現され得る。
"コドンの最適化"または"種コドンバイアスの制御"は、特定の宿主細胞の好ましいコドン使用を指す。当業者には理解されるように、コード配列を改変して特定の宿主におけるその発現を増強することが有利になりうる。遺伝子コードは、64個の可能なコドンで冗長であるが、ほとんどの生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。種において、最も頻繁に利用されるコドンは、最適なコドンと呼ばれ、頻繁に利用されないコドンは、希少コドンまたは使用率の低いコドンとして分類される。コドン最適化の一部として、本開示のベクターのコード配列は、ApoBec媒介変異を制限するように改変することができる。一実施形態では、本開示のベクターは、それらの安定性及び/または発現を改変するように操作することができる。例えば、発現の変化は、細胞中で複製するときにベクター中に不活性化または減衰する突然変異が蓄積する頻度に起因して起こり得る。調査によると、最も頻繁に発生する事象の1つは、最初の複製段階からの単鎖DNAのマイナス鎖におけるGからAへの突然変異(CからTへの突然変異に対応する)に特徴的なApoBec媒介突然変異であることが示されている。これは、ベクターでコードされたタンパク質のアミノ酸組成の変化、及びTGG(トリプトファン)から停止コドン(TAGまたはTGA)へのコード化変化を引き起こす可能性がある。一実施態様では、該不活化変化は、ApoBec修飾の位置にあるフェニルアラニンやチロシン等、類似の化学的または構造的特性を持つ他のアミノ酸の置換コドンによって回避される。
このような突然変異は、コードされたタンパク質の生物学的活性を維持する許容可能なコドンにトリプトファンコドンを変化させるベクタードメインのコード配列中の1つ以上のコドンの修飾を含むことができる。当該技術分野で知られているように、トリプトファンのコドンは、UGG(DNA中のTGG)である。さらに、当該技術分野で知られているように、"停止コドン"は、UAA、UAGまたはUGA(DNA中のTAA、TAGまたはTGA)である。トリプトファンコドンにおける単一の点突然変異は、不自然な停止コドン(例えば、UGG->UAGまたはUGG->UGA)を引き起こす可能性がある。また、ヒトAPOBEC3GF(hA3G/F)は、G->A超変異を介してレトロウイルス複製を阻害することも知られている(Neogiら、J. Int. AIDS Soc., 16((1)：18472, 2013年2月25日)。従って、本開示は、トリプトファンコドンを許容可能な非トリプトファンコドンに改変することによって、ApoBec超変異を減少させるための、本開示のベクターのコード配列に対する改変を意図している。
"保存的置換"または"保存的配列修飾"とは、コードされたタンパク質の結合特性または機能を有意に影響または変化させないアミノ酸修飾を指す。例えば、"保存的配列修飾"は、本開示のCAR構築物の結合特性または機能に有意に影響または改変しないアミノ酸修飾（例えば、定常鎖、抗体、抗体断片、または非免疫グロブリン結合ドメインにおける保存的変化）を指す。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加、及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発及びPCR媒介突然変異誘発等の当技術分野で知られている標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸の置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、無極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β-分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。従って、本開示のCAR内の1つまたは複数のアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換し、そして改変されたCARを本明細書に記載の結合及び/または機能性アッセイを用いて試験することができる。
本明細書で使用される"共刺激ドメイン"とは、T細胞の増殖、生存及び/または発現を増強する生物学的薬剤を指す。共刺激ドメインは、例えば、TNFRスーパーファミリーのメンバー、CD28、CD137(4-1BB)、CD134(0X40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CDlla/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、またはそれらの組み合わせのいずれか1つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含むことができる。他の共刺激ドメイン(例えば、他のタンパク質から)は、当業者には明らかであり、本開示の代替の実施形態と関連して使用され得る。
サイトカイン放出症候群(CRS)は、発熱、低血圧、息切れ、腎機能障害、肺機能障害及び／または毛細血管漏出症候群等の徴候及び症状で現れる細胞療法(例えば、CAR-T、二重特異性T細胞結合抗体等)の合併症である。通常、CRSは、IL6及びIL1のようなサイトカインの過剰産生が原因である。
本明細書で使用される"由来する"とは、第1分子と第2分子との間の関係を示す。これは、一般に、第1分子と第2分子との間の構造的類似性を指し、第2分子から由来する第1分子上にプロセスまたはソース制限を含まない。例えば、抗体分子から由来する抗原結合ドメインの場合、抗原結合ドメインは、必要な機能、即ち、抗原に結合する能力を有するような十分な抗体構造を保持する。これは、抗体を産生する特定のプロセスに対するいかなる限定も含まない。
"ドメイン"または"モジュール"は、構築物の他のドメインまたはモジュールの機能に影響を与えることなく、類似のドメインと置換することができる、より大きな構築物の別個のセクションまたは部分を指す。例えば、キメラ抗原受容体ポリペプチドまたはコード核酸配列中の配列は、結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有すると記載することができる。CARの各"ドメイン"は、CARの他のドメインに影響を与えることなく改変または変更することができる。例えば、結合ドメインは、本明細書に記載されるような多数の異なる結合ドメインのうちの1つであってもよい。結合ドメインは、CD19抗原に結合するポリペプチド配列であってもよい。このCD19結合ドメインは、膜貫通ドメインを変化させることに影響を与えることなく、CD20に結合する結合ドメインと置換することができる。同様に、ウイルスキャプシドに含まれる本開示のレトロウイルスベクターは、(5'から3'まで)5'反復(5'R)-U5-パッケージング配列-CAR配列-(例えばチミジンキナーゼコーディング配列に連結されたIRESドメインを含む任意のキルスイッチ)-miRNA標的配列-U3-3'反復(3'R)を含む多数のドメインを有するポリヌクレオチドセンスRNA鎖を含む。ウイルスポリヌクレオチドの各ドメイン／モジュールは、異なるCAR配列、異なるキルスイッチ(例えば、TKOまたはCD)、異なるmiRNA標的配列等を提供できるように変更することができる。本開示の構築物は、設計においてモジュール式である。構築物の各ドメイン/モジュール、ポリヌクレオチド構築物またはコードされたポリペプチド構築物が、変異がドメインの生物学的活性を破壊しない限り、配列の小さな変動を含むことができる。従って、例えば、膜貫通ドメインは、特定の膜貫通配列に対して80～100%の同一性を有することができる。
本明細書で使用される"遺伝的に修飾された細胞"、"再誘導された細胞"、"遺伝子操作された細胞"または"改変細胞"は、例えば、CARを発現する細胞を指す。いくつかの実施形態では、遺伝的に改変された細胞は、CARをコードするベクターを含む。
本明細書で使用される"ヒンジ領域"(HR)は、抗原結合ドメインとCARの膜貫通ドメインとの間の親水性領域を指す。ヒンジ領域は、抗体またはその断片または誘導体のFc断片、抗体またはその断片または誘導体のヒンジ領域、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ヒンジ領域の例には、CD8aヒンジ、及び例えばGly3またはIgG（ヒトIgG4等）のCH1及びCH3ドメインと同程度に小さくてもよいポリペプチドで作製された人工スペーサーが含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、(i)IgG4のヒンジ、CH2及びCH3領域、(ii)IgG4のヒンジ領域、(iii)IgG4のヒンジ領域及びCH2、(iv)CD8aのヒンジ領域、(v)IgG1のヒンジ、CH2及びCH3領域、(vi)IgG1のヒンジ領域、または(vi)IgG1のヒンジ及びCH2領域のいずれか1つ以上である。他のヒンジ領域は、当業者には明らかであり、本開示の代替の実施形態に関連して使用され得る。
本明細書で使用される"免疫細胞"は、抗原提示細胞、B細胞、好塩基球、細胞傷害性T細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーT細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、メモリ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、血漿細胞、及びT細胞を含むがこれらに限定されない哺乳動物免疫系の細胞を指す。"in vivo免疫細胞"は、被験者から分離または除去されていない被験者の体内に存在する免疫細胞を指す。
本明細書で使用される用語"免疫エフェクター細胞"は、免疫応答に関与する細胞、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、T細胞、例えば、α/βT細胞及びγ/δT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、マスト細胞、及び骨髄由来の食細胞が含まれる。
"細胞内シグナル伝達ドメイン"(ISD)または"細胞質ドメイン"は、分子の細胞内シグナル伝達部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生する。免疫エフェクター機能の例には、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性及びヘルパー活性が含まれる。エフェクター機能シグナルを変換するドメインの例には、T細胞受容体複合体のz鎖またはそのホモログのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。エフェクター機能シグナルを伝達するドメインの例には、T細胞受容体複合体のz鎖またはその相同体（例えば、h鎖、FceR1g及びb鎖、MB1（Iga）鎖、B29（Igb）鎖等）、ヒトCD3ζ鎖、CD3ポリペプチド（D、d、e)、sykファミリーチロシンキナーゼ(Syk、ZAP 70等)、srcファミリーチロシンキナーゼ(Lck、Fyn、Lyn等)、及びCD2、CD5及びCD28等のT細胞形質導入に関与する他の分子が含まれるが、これらに限定されない。他の細胞内シグナル伝達ドメインは、当業者には明らかであり、本開示の代替の実施形態と関連して使用され得る。
別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例には、一次刺激または抗原依存性刺激の原因となる分子から由来するものが含まれる。別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含むことができる。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナルまたは抗原に依存しない刺激の原因となる分子から由来するものが含まれる。例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3zまたはCD3zlxx(Feuhtら, Med 2019)の細胞質配列を含むことができ、また、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28または41BBのような共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。一次細胞質シグナル伝達配列を含むITAMの例には、CD3ζ、共通FeRγ(FCER1G)、FeγRIIa、FeRβ(FeεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD7a、CD79b、DAP10、及びDAP12から由来するものが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語"単離された"は、他の物質を実質的に含まない分子、生物製剤または細胞材料を指す。一実施形態では、用語"単離された"は、天然源に存在するDNAまたはRNAのような核酸；タンパク質またはポリペプチド；細胞または細胞器官；または他のDNAまたはRNAからそれぞれ分離された組織；またはタンパク質またはポリペプチド、または細胞または細胞小器官、または組織または器官を指す。用語"単離された"はまた、組換えDNA技術によって産生される場合、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地を実質的に含まない核酸またはペプチドを指し、または化学的に合成された場合、化学前駆体または他の化学物質を指す。さらに、"単離された核酸"とは、断片として天然には存在せず、天然の状態では見出されない核酸断片を含むことを意味する。用語"単離された"は、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すためにも使用され、精製ポリペプチド及び組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。用語"単離された"は、本明細書において、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すためにも使用され、培養され、操作された細胞または組織の両方を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、用語"リンカー"("リンカードメイン"または"リンカー領域")は、それぞれCARポリヌクレオチドまたはポリペプチドの2つ以上のドメインまたは領域を結合するオリゴまたはペプチドを指す。リンカーは、長さ1～500個のアミノ酸または長さ3～1500個のヌクレオチドのいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、"リンカー"は、切断可能であるか、または切断不可能である。特に断らない限り、本明細書で使用される用語"リンカー"は、非切断性のリンカーを意味する。前記非切断性のリンカーは、互いに隣接するタンパク質ドメインが自由に移動できるようにする可撓性アミノ酸残基から構成され得る。このような残基の非限定的な例には、グリシン及びセリンが含まれる。いくつかの実施形態では、リンカーは、非可撓性アミノ酸残基を含む。切断可能なリンカーの例には、2Aリンカー(例えば、T2A)、2A様リンカーまたはその機能的等価物、及びそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ピコルナウイルス2A様リンカー、ブタテトロコウイルス(P2A)のCHYSEL配列、Thosea asignaウイルス(T2A)またはそれらの組み合わせ、変異体及び機能的等価物(例えば、GSG修飾変異体)を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、2Aグリシンと2Bプロリンとの間の切断を生じるモチーフを含むことができる。本明細書で使用できる他の切断可能なリンカーは、当業者には容易に理解される。
本明細書で使用される用語"可撓性ポリペプチドリンカー"は、単独でまたは組み合わせて使用されるグリシン及び/またはセリン残基のようなアミノ酸からなり、ポリペプチド鎖(例えば、可変重鎖及び可変軽鎖領域)を一緒に連結するペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可撓性ポリペプチドリンカーは、Gly/Serリンカーであり、アミノ酸配列(Gly3-Ser)nを含む。ここで、nは1以上の正の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10等)である。
本明細書で使用される"哺乳動物"は、哺乳動物綱の任意のメンバーを指す。これは、チンパンジーや他の類人猿やサル種等のヒト及び非ヒト霊長類；ウシ、羊、豚、山羊、ウマ等の家畜；犬や猫等の家畜哺乳類；マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類を含む実験動物を含むが、これらに限定されない。該用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。従って、成人及び新生児の被験者、ならびに胎児、男性または女性に関わらず、該用語の範囲内に含まれることが意図されている。当業者は、CAR構築物及び関連する配列が特定の哺乳動物種において使用するために最適化される(例えば、コードされたタンパク質/ポリペプチドが処置される哺乳動物種から由来する)ことを認識するであろう。
本明細書で使用される場合、"非特異的に形質導入された細胞"とは、開示のウイルスベクターによって感染されるが、該ベクターの遺伝子の発現が望ましくないかまたは望ましくない細胞を指す。当該技術分野において認識されるように、ウイルスベクターは、ウイルスエンベロープ上に標的タンパク質を組み込むことによって"標的化"され得る。さらにまたは代替的に、ウイルス遺伝子の発現は、組織特異的プロモーターの使用によって制御することができる。さらに他のまたはさらなる実施形態では、ウイルス遺伝子/構築物の発現は、自然の遺伝子発現制御を制御するために存在する細胞機械の使用によって制御することができる。この場合、RNAi標的配列を使用することができ、それによって、標的配列への自然miRNAの結合を使用して、非特異的な細胞型における発現を制御することができる。
用語"作動可能に連結された"または"機能的に連結された"は、各成分が機能し得るように、第1成分と第2成分との間の機能的な結合または関連を指す。例えば、作動可能に連結されたものは、調節配列と、結果として後者の発現をもたらす異種核酸配列との間の関連を含む。例えば、第1核酸配列は第2核酸配列と機能的に関係して配置されるときに、該第1核酸配列が、該第2核酸配列と作動可能に連結される。機能的に連結された2つのポリペプチドの状況では、第1ポリペプチドは、いかなる連結にも依存しないように機能し、第2ポリペプチドは、2つの間の連結が存在しないように機能する。
2種以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における"同一性百分率"は、パーセント配列同一性によって関連する2つ以上の配列を指す。2つの配列は、次の配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて、または手動整列及び目視検査での測定によって、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大の対応を得るために比較及び整列された場合に、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率（例えば、指定された領域、または指定されていない場合は配列全体にわたって、60％の同一性、場合によって、70％、71％。72％。73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の同一性）を有すれば、該2つの配列が"実質的に同一"である。場合によって、該同一性は、長さが少なくとも約50個のヌクレオチド(または10個のアミノ酸)の領域、より好ましくは、長さが100～500個または1000個以上のヌクレオチド（または20個、50個、200個、またはそれ以上のアミノ酸)の領域にわたって存在する。
配列比較では、一般に、１つの配列が参照配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。初期状態のプログラムパラメータを使用することができ、または代替のパラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。比較のための配列の整列方法は、当該技術分野で周知であり、公的に入手可能である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、SmithとWaterman (1970), Adv. Appl. Math. 2:482cの局所ホモロジーアルゴリズム、NeedlemanとWunsch(1970), J. Mol. Biol. 48:443の相同性整列アルゴリズム、PearsonとLipman (1988), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（GAP, BESTFIT, FASTA, 及びウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージにおけるTFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または手動整列と目視検査（例えば、Brentら, (2003) 分子生物学の現在のプロトコルを参照）によって行うことができる。
配列同一性及び配列類似性の百分率の測定に使用できるアルゴリズムの2つの例は、Altschulら, (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及びAltschulら, (1990) J. Mol. Bioi. 215:403-410にそれぞれ記載されているBLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)を通じて公的に入手可能である。
2つのアミノ酸配列の間の同一性百分率は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれているE. MeyersとW. Miller (1988), Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを用いて、PAM120ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4で測定することもできる。また、2つのアミノ酸配列の間の同一性百分率は、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラム（www.gcg.comで入手可能）に組み込まれているNeedlemanとWunsch(1970), J. Mol. Bioi. 48:444-453のアルゴリズムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはP AM250マトリックス、ギャップウエイト16、14、12、10、8、6、または4、及び長さウエイト1、2、3、4、5、または6で測定することができる。
本明細書で使用される用語"RNAi標的配列"または"、miR標的配列"または"miR標的カセット"は、RNA干渉を誘導するdsRNA（干渉RNA）に特異的にハイブリダイズする核酸配列に関する。従って、RNAi標的配列は、少なくとも1つのRNAi誘導分子(干渉RNA)に対して本質的に相補的な配列である。RNAi標的配列は、miRNA標的配列またはsiRNA標的配列である。典型的には、RNAi標的配列は、miRNA標的配列である。以下に詳細に説明するように、本開示は、CARのコード配列、1つまたは複数のRNAi標的配列、及び任意のキルスイッチコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する。
用語"単鎖可変領域"または"scFv"は、軽鎖可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片及び重鎖可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片を含む融合タンパク質を指す。ここで、該軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、短い可撓性ポリペプチドリンカーのような合成リンカーを介して連続的に連結され、単鎖ポリペプチドとして発現させることができる。ここで、該scFVは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、scFvは、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に関して、いずれかの順序で、vL可変領域及びvH可変領域を有することができる。scFVは、vL-リンカー-vHを含んでもよく、またはvH-リンカー-vLを含んでもよい。あるいは、scFVは、(vL+vH)または(vH+vL)としても記載される。
用語"シグナル伝達ドメイン"は、細胞内で情報を伝達し、セカンドメッセンジャーを生成することによって、またはそのようなメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することによって、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するタンパク質の機能性領域を指す。
用語"被験者"は、免疫応答を誘発できる生物(例えば、任意の家畜化された哺乳動物またはヒト)を含むことを意図されている。用語"被験者"または"個体"、"動物"、または"患者"は、本明細書では、本開示の組成物または医薬組成物の投与が望まれる任意の被験者、特に哺乳動物を指すために互換的に使用される。哺乳動物の被験者には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ等が含まれるが、ヒトが好ましい。
用語"T細胞"及び"Tリンパ球"は、交換可能であり、本明細書で同義的に使用される。その例には、ナイーブT細胞("リンパ球前駆体")、中央メモリT細胞、エフェクターメモリT細胞、幹メモリT細胞(Tscm)、iPSC由来T細胞、合成T細胞、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
"治療効果"という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少、感染病原体の力価の減少、病原体のコロニー数の減少、病状に関連する様々な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない種々の手段によって現され得る生物学的効果を指す。"治療効果"はまた、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体の、最初の疾患発生予防または疾患の再発予防における能力によって現され得る。
本明細書で使用される用語"治療有効量"は、疾患または障害の少なくとも１つまたは複数の症状を軽減するための、ベクターまたはin vivoで遺伝子操作された細胞を含む医薬組成物の量を指し、そして所望の効果を提供するのに十分な量の薬理組成物に関する。本明細書で使用される語句"治療有効量"は、任意の医療処置に適用可能な合理的な利益/リスク比で、障害を治療するのに組成物の十分な量を意味する。
症状の治療的または予防的に有意な軽減は、本明細書に記載のベクターを投与する前の対照または非処置の被験者または被験者の状態と比較して、例えば、測定されたパラメータにおいて、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約125%、少なくとも約150%、またはそれ以上の減少である。測定されたパラメータまたは測定可能なパラメータには、臨床的に検出可能な疾患のマーカー、例えば、生物学的マーカーのレベルの上昇または低下、ならびに臨床的に許容される症状の尺度または癌のマーカーに関連するパラメータが含まれる。しかし、理解されるように、本明細書に開示される組成物及び製剤の1日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定される。必要とされる精確な量は、被験者の治療される疾患のタイプ、性別、年齢、及び体重等の要素によって変化するであろう。
本明細書で使用される"膜貫通ドメイン"(TMD)は、血漿膜を通過するCARの領域を指す。本開示のCARの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質(例えば、タイプI膜貫通タンパク質)の膜貫通領域、人工疎水性配列、またはそれらの組み合わせである。他の膜貫通ドメインは、当業者には明らかであり、本開示の代替の実施形態と関連して使用され得る。いくつかの実施形態では、前記TMDは、T細胞受容体のα、βまたはζ鎖、T細胞受容体、CD3γ、CD3ε、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la, CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244, 2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、 Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A, Lyl08)、SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、及び/またはNKG2Cの膜貫通ドメインから選択される。
本明細書で使用される"ベクター"、"クローニングベクター"及び"発現ベクター"は、ポリヌクレオチド配列(例えば、外来遺伝子)を宿主細胞に導入し、宿主を形質転換し、導入された配列の発現(例えば、転写及び翻訳)を促進できる媒介物を指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス等が含まれる。
用語"ウイルスベクター"は、ウイルスから得られたまたは由来したベクターを指す。典型的には、該ウイルスは、レンチウイルス及びγレトロウイルスを含むが、これらに限定されないレトロウイルスである。本開示のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、γ-レトロウイルスベクターであってもよい。該ウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに基づいてもよい。本開示のウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。該ベクターは、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)のような非霊長類レンチウイルスに基づいてもよい。本開示のウイルスベクターは、ウイルスエンベロープにおける分裂促進的なT細胞活性化膜貫通タンパク質及び／またはサイトカインベースのT細胞活性化膜貫通タンパク質を含む。該分裂促進的なT細胞活性化膜貫通タンパク質及び／またはサイトカインベースのT細胞活性化膜貫通タンパク質は、上述したように、宿主細胞膜に由来する。
本明細書で使用される"ウイルス様粒子"または"VLP"は、ウイルスゲノムを欠くウイルス粒子を指す。場合によっては、該VLPは、envタンパク質を欠く。完全なウイルス粒子の場合と同様に、それらは、宿主細胞脂質二重層(膜)から作られた外側ウイルスエンベロープを含み、従って、宿主細胞膜貫通タンパク質を含む。VLPは、本開示の方法及び組成物において使用することができる。
以下にさらに詳細に説明するように、本開示は、非特異的な形質導入細胞においてベクターに含まれるコード配列（例えば、CARコード配列）の発現を制御するために、該ベクターに挿入された１つまたは複数のmiRNA標的配列の複数のコピーを含む組換えウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、組換えウイルスベクターは、キャプシド化されたウイルスポリヌクレオチドに挿入されたmiRNA標的配列を含んでもよい。非特異的な細胞で発現したmiRNAは、そのようなmiRNA標的配列に結合し、該miRNA標的配列を含むウイルスポリヌクレオチドの発現を抑制することができ、それによって、非特異的な形質導入細胞におけるウイルス複製及び/またはベクター含有コード配列(例えば、CAR)の発現を制限する。このような組換えウイルスベクターは、miR を発現していない、または発現が低下している細胞と比較して、取り込まれたmiR標的配列に結合できる1つまたは複数のmiRNAを発現する細胞におけるベクター含有コード配列の複製及び/または発現の減少または減弱を示すため、本明細書では"弱毒化-miR "、"発現制限ベクター"、または"複製制限ベクター"と呼ぶことができる。
特定の実施形態では、1つまたは複数のmiRNA標的配列は、CARコード配列の3'非翻訳領域(UTR)及び/または3'UTR下流に組み込まれる。転写されると、CARコード配列のmRNA転写物は、1つまたは複数のmiRNA標的配列(例えば、miRNA標的配列カセット)を含む、miR標的配列(TS)を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のmiR-TSカセットは、少なくとも1つのmiRNA標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のmiR-TSカセットは、複数のmiRNA標的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のmiR-TSカセットは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上のmiRNA標的配列を含む。このような実施形態では、前記miR-TSカセットが2つ以上のmiRNA標的配列を含む場合、該2つ以上の標的配列は、同じでもよく、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、複数のmiRNA標的配列を含み、ここで、該複数のmiRNA標的配列の各々は、同じmiRNAの標的配列である。例えば、前記miR-TSカセットは、ヌクレオチドスペーサー（例えば、1～10個のヌクレオチド）によって直接隣接するか、または分離された同じmiR標的配列の2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の2～6個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の3個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の4個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の5個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の6個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の7個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の8個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の9個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、同じmiR標的配列の10個のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のmiR-TSカセットは、複数のmiRNA標的配列を含み、ここで、該複数のmiRNA標的配列は、少なくとも2つの異なるmiRNA標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のmiR-TSカセットは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の異なるmiRNA標的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miRNA標的配列の1つ以上のコピー及び第2 miRNA標的配列の1つ以上のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピー及び第2 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miR標的配列の3または4個のコピー及び第2 miR標的配列の3または4個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記複数のmiRNA標的配列は、少なくとも3つの異なるmiRNA標的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miR標的配列の1つ以上のコピー、第2 miR標的配列の1つ以上のコピー、及び第3 miR標的配列の1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピー、第2 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピー、及び第3 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miR標的配列の3または4個のコピー、第2 miR標的配列の3または4個のコピー、及び第3 miR標的配列の3または4個のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記複数のmiRNA標的配列は、少なくとも4つの異なるmiRNA標的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miR標的配列の1つ以上のコピー、第2 miR標的配列の1つ以上のコピー、第3 miR標的配列の1つ以上のコピー、及び第4 miR標的配列の1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピー、第2 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピー、第3 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピー、及び第4 miR標的配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットは、第1 miR標的配列の3または4個のコピー、第2 miR標的配列の3または4個のコピー、第3 miR標的配列の3または4個のコピー、及び第4 miR標的配列の3または4個のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、前記miR-TSカセットが複数のmiRNA標的配列を含む場合、該複数のmiRNA標的配列は、介在する核酸配列なしに、直列に配列され得る。いくつかの態様では、前記複数のmiRNA標的配列は、リンカー配列によって分離され得る。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、約4～約20個のヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、前記リンカー配列は、約4～約16個のヌクレオチドを含む。例示的な実施形態として、miR-TSカセットは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の次のサブユニットを含み得る：第1 miRNA標的配列-リンカー-第2 miRNA標的配列。ここで、隣接するサブユニットは、他のリンカー配列によって分離される。いくつかの実施形態では、前記第1及び第2 miRNA標的配列は、同じmiRNAの標的である。いくつかの実施形態では、前記第1及び第2 miRNA標的配列は、異なるmiRNAの標的である。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-1251-5p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-124-3p、miR-448、miR-138-2-3p、miR-490-5p、miR-129-1-3p、miR-1264、miR-3943、miR-490-3p、miR-383-5p、miR-133b、miR-129-2-3p、miR-128-2-5p、miR-133a-3p、miR-129-5p、miR-1-3p、miR-885-3p、miR-124-5p、miR-759、miR-7158-3p、miR-770-5p、miR-135a-5p、miR-885-5p、let-7g-5p、miR-100、miR-101、miR-106a、miR-124、miR-124a、miR-125a、miR-125a-5p、miR-125b、miR-127-3p、miR-128、miR-129、miR-136、miR-137、miR-139-5p、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-146b-5p、miR-149、miR-152、miR-153、miR-195、miR-21、miR-212-3p、miR-219-5p、miR-222、miR-29b、miR-31、miR-3189-3p、miR-320、miR-320a、miR-326、miR-330、miR-331-3p、miR-340、miR-342、miR-34a、miR-376a、miR-449a、miR-483-5p、miR-503、miR-577、miR-663、miR-7、miR-7-5p、miR-873、let-7a、let-7f、miR-107、miR-122、miR-124-5p、miR-139、miR-146a、miR-146b、miR-15b、miR-16、miR-181a、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-185、miR-199a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-203、miR-204、miR-205、miR-218、miR-23b、miR-26b、miR-27a、miR-29c、miR-328、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-375、miR-383、miR-451、miR-452、miR-495、miR-584、miR-622、miR-656、miR-98、miR-124-3p、miR-181b-5p、miR-200b、及び/またはmiR-3189-3pの標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、脳癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-10b-5p、miR-126-3p、miR-145-3p、miR-451a、miR-199b-5p、miR-5683、miR-3195、miR-3182、miR-1271-5p、miR-204-5p、miR-409-5p、miR-136-5p、miR-514a-5p、miR-559、miR-483-3p、miR-1-3p、miR-6080、miR-144-3p、miR-10b-3p、miR-6130、miR-6089、miR-203b-5p、miR-4266、miR-4327、miR-5694、miR-193b、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122、miR-124、miR-1258、miR-125a-5p、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-129、miR-130a、miR-132、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-149、miR-152、miR-153、miR-15a、miR-16、miR-17-5p、miR-181a、miR-1826、miR-183、miR-185、miR-191、miR-193a-3p、miR-195、miR-199b-5p、miR-19a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-205、miR-206、miR-211、miR-216b、miR-218、miR-22、miR-26a、miR-26b、miR-300、miR-30a、miR-31、miR-335、miR-339-5p、miR-33b、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374a、miR-379、miR-381、miR-383、miR-425、miR-429、miR-450b-3p、miR-494、miR-495、miR-497、miR-502-5p、miR-517a、miR-574-3p、miR-638、miR-7、miR-720、miR-873、miR-874、miR-92a、miR-98、miR-99a、mmu-miR-290-3p、及び/またはmmu-miR-290-5pの標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、乳癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-143、miR-145、miR-17-5p、miR-203、miR-214、miR-218、miR-335、miR-342-3p、miR-372、miR-424、miR-491-5p、miR-497、miR-7、miR-99a、miR-99b、miR-100、miR-101、miR-15a、miR-16、miR-34a、miR-886-5p、miR-106a、miR-124、miR-148a、miR-29a、及び/またはmiR-375の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、子宮頸癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-133a-5p、miR-490-5p、miR-124-3p、miR-137、miR-655-3p、miR-376c-3p、miR-369-5p、miR-490-3p、miR-432-5p、miR-487b-3p、miR-342-3p、miR-223-3p、miR-136-3p、miR-136-3p、miR-143-5p、miR-1-3p、miR-214-3p、miR-143-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-127-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-145-3p、miR-199a-5p、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-101、miR-126、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-192、miR-200c、miR-21、miR-214、miR-215、miR-22、miR-25、miR-302a、miR-320、miR-320a、miR-34a、miR-34c、miR-365、miR-373、miR-424、miR-429、miR-455、miR-484、miR-502、miR-503、miR-93、miR-98、miR-186、miR-30a-5p、miR-627、let-7a、miR-1、miR-124、miR-125a、miR-129、miR-1295b-3p、miR-1307、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150-5p、miR-154、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-18a、miR-191、miR-193a-5p、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-198、miR-199a-5p、miR-203、miR-204-5p、miR-206、miR-212、miR-218、miR-224、miR-24-3p、miR-26b、miR-27a、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-29b、miR-30a-3p、miR-30b、miR-328、miR-338-3p、miR-342、miR-345、miR-34a-5p、miR-361-5p、miR-375、miR-378、miR-378a-3p、miR-378a-5p、miR-409-3p、miR-422a、miR-4487、miR-483、miR-497、miR-498、miR-518a-3p、miR-551a、miR-574-5p、miR-625、miR-638、miR-7、miR-96-5p、miR-202-3p、miR-30a、及び/またはmiR-451の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、結腸または結腸直腸癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-101、miR-130a、miR-130b、miR-134、miR-143、miR-145、miR-152、miR-205、miR-223、miR-301a、miR-301b、miR-30c、miR-34a、miR-34c、miR-424、miR-449a、miR-543、及び/またはmiR-34bの標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、子宮内膜癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-125b、miR-138、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-16-1、miR-16-1-3p、miR-16-2、miR-181a、miR-181b、miR-195、miR-223、miR-29b、miR-34b、miR-34c、miR-424、miR-10a、miR-146a、miR-150、miR-151、miR-155、miR-2278、miR-26a、miR-30e、miR-31、miR-326、miR-564、miR-27a、let-7b、miR-124a、miR-142-3p、let-7c、miR-17、miR-20a、miR-29a、miR-30c、miR-720、miR-107、miR-342、miR-34a、miR-202、miR-142-5p、miR-29c、miR-145、miR-193b、miR-199a、miR-214、miR-22、miR-137、及び/またはmiR-197の標的配列である。さらなるの実施形態では、該ベクターは、血液癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-1、miR-145、miR-1826、miR-199a、miR-199a-3p、miR-203、miR-205、miR-497、miR-508-3p、miR-509-3p、let-7a、let-7d、miR-106a*、miR-126、miR-1285、miR-129-3p、miR-1291、miR-133a、miR-135a、miR-138、miR-141、miR-143、miR-182-5p、miR-200a、miR-218、miR-28-5p、miR-30a、miR-30c、miR-30d、miR-34a、miR-378、miR-429、miR-509-5p、miR-646、miR-133b、let-7b、let-7c、miR-200c、miR-204、miR-335、miR-377、及び/またはmiR-506の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、腎臓癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-105、miR-122、miR-122a、miR-1236、miR-124、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-1271、miR-128-3p、miR-129-5p、miR-130a、miR-130b、miR-133a、miR-134、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-141、miR-142-3p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150-5p、miR-15b、miR-16、miR-181a-5p、miR-185、miR-188-5p、miR-193b、miR-195、miR-195-5p、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a-5p、miR-199b、miR-199b-5p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-203、miR-204-3p、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-21、miR-21-3p、miR-211、miR-212、miR-214、miR-217、miR-218、miR-219-5p、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2、miR-29c、miR-302b、miR-302c、miR-30a、miR-30a-3p、miR-335、miR-338-3p、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-365、miR-370、miR-372、miR-375、miR-376a、miR-377、miR-422a、miR-424、miR-424-5p、miR-433、miR-4458、miR-448、miR-450a、miR-451、miR-485-5p、miR-486-5p、miR-497、miR-503、miR-506、miR-519d、miR-520a、miR-520b、miR-520c-3p、miR-582-5p、miR-590-5p、miR-610、miR-612、miR-625、miR-637、miR-675、miR-7、miR-877、miR-940、miR-941、miR-98、miR-99a、miR-132、及び/またはmiR-31の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、肝臓癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。さらなる実施形態では、前記肝臓癌は、肝細胞癌である。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-143-3p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1266-3p、miR-6130、miR-6080、miR-511-5p、miR-143-5p、miR-223-5p、miR-199b-5p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-142-5p、miR-144、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-199a-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-1297、miR-141、miR-145、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-29b、miR-381、miR-409-3p、miR-429、miR-451、miR-511、miR-99a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-101、miR-133b、miR-138、miR-142-5p、miR-144、miR-1469、miR-146a、miR-153、miR-15a、miR-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-182、miR-192、miR-193a-3p、miR-194、miR-195、miR-198、miR-203、miR-217、miR-218、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29c、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-365、miR-449a、miR-449b、miR-486-5p、miR-545、miR-610、miR-614、miR-630、miR-660、miR-7515、miR-9500、miR-98、miR-99b、miR-133a、let-7a、miR-100、miR-106a、miR-107、miR-124、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-126、miR-126*、miR-129、miR-137、miR-140、miR-143、miR-146b、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-152、miR-154、miR-155、miR-17-5p、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-186、miR-193b、miR-199a、miR-204、miR-212、miR-221、miR-224、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-32、miR-335、miR-338-3p、miR-340、miR-342-3p、miR-361-3p、miR-373、miR-375、miR-4500、miR-4782-3p、miR-497、miR-503、miR-512-3p、miR-520a-3p、miR-526b、miR-625*、及び/またはmiR-96の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、肺癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、let-7b、miR-101、miR-125b、miR-1280、miR-143、miR-146a、miR-146b、miR-155、miR-17、miR-184、miR-185、miR-18b、miR-193b、miR-200c、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-211、miR-218、miR-26a、miR-31、miR-33a、miR-34a、miR-34c、miR-376a、miR-376c、miR-573、miR-7-5p、miR-9、及び/またはmiR-98の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、黒色腫を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、let-7d、miR-218、miR-34a、miR-375、miR-494、miR-100、miR-124、miR-1250、miR-125b、miR-126、miR-1271、miR-136、miR-138、miR-145、miR-147、miR-148a、miR-181a、miR-206、miR-220a、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-32、miR-323-5p、miR-329、miR-338、miR-370、miR-410、miR-429、miR-433、miR-499a-5p、miR-503、miR-506、miR-632、miR-646、miR-668、miR-877、及び/またはmiR-9の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、口腔癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、let-7i、miR-100、miR-124、miR-125b、miR-129-5p、miR-130b、miR-133a、miR-137、miR-138、miR-141、miR-145、miR-148a、miR-152、miR-153、miR-155、miR-199a、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-212、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-409-3p、miR-411、miR-429、miR-432、miR-449a、miR-494、miR-497、miR-498、miR-519d、miR-655、miR-9、miR-98、miR-101、miR-532-5p、miR-124a、miR-192、miR-193a、及び/またはmiR-7の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、卵巣癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-216a-5p、miR-802、miR-217、miR-145-3p、miR-143-3p、miR-451a、miR-375、miR-214-3p、miR-216b-3p、miR-432-5p、miR-216a-3p、miR-199b-5p、miR-199a-5p、miR-136-3p、miR-216b-5p、miR-136-5p、miR-145-5p、miR-127-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-559、miR-129-2-3p、miR-4507、miR-1-3p、miR-148a-3p、miR-101、miR-1181、miR-124、miR-1247、miR-133a、miR-141、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150*、miR-150-5p、miR-152、miR-15a、miR-198、miR-203、miR-214、miR-216a、miR-29c、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-373、miR-375、miR-410、miR-497、miR-615-5p、miR-630、miR-96、miR-132、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-126、miR-135a、miR-143、miR-144、miR-150、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-217、miR-218、miR-337、miR-494、及び/またはウイルス複製に必要な1つまたは複数のウイルス遺伝子の 5'UTR または 3'UTR に挿入されたmiR-98の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、膵臓癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、let-7a-3p、let-7c、miR-100、miR-101、miR-105、miR-124、miR-128、miR-1296、miR-130b、miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b、miR-135a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-154、miR-15a、miR-187、miR-188-5p、miR-199b、miR-200b、miR-203、miR-205、miR-212、miR-218、miR-221、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-29b、miR-302a、miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d、miR-30e、miR-31、miR-330、miR-331-3p、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374b、miR-449a、miR-4723-5p、miR-497、miR-628-5p、miR-642a-5p、miR-765、及び/またはmiR-940の標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、前立腺癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-101、miR-183、miR-204、miR-34a、miR-365b-3p、miR-486-3p、及び/またはmiR-532-5pの標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、網膜芽細胞腫を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-143-3p、miR-133b、miR-1264、miR-448、miR-1298-5p、miR-490-5p、miR-138-2-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-150-5p、miR-129-1-3p、miR-559、miR-1-3-p、miR-143-5p、miR-223-3p、miR-3943、miR-338-3p、miR-124-3p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-451a、miR-142-5p、miR-133a-3p、miR-145-5p、及び/またはmiR-145-3pの標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、膠芽腫を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記miR標的配列は、miR-143-3p、miR-223-3p、miR-6080、miR-208b-3p、miR-206、miR-133a-5p、miR-133b、miR-199a-5p、miR-199b-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-338-3p、miR-214-3p、miR-559、miR-133a-3p、miR-1-3p、miR-126-3p、miR-142-5p、miR-451a、miR-199a-3p、及び/またはmiR-199b-3pの標的配列である。さらなる実施形態では、該ベクターは、頭頸部癌を治療するために使用されるCARコード配列を含む。
CAR及び該CARに操作された結合ドメインによって、前記方法及び組成物は、多数の疾患及び障害を治療するために使用され得る。例えば、表1の任意の数の"標的"を標的とする結合ドメインを用いて、該標的に関連する疾患を治療することができる。
表1：
Figure 2023525720000002
Figure 2023525720000003
Figure 2023525720000004
Figure 2023525720000005
Figure 2023525720000006
本開示は、それを必要とする被験者に養子細胞免疫を提供する方法を提供する。本法は、CARが所望の免疫細胞型または免疫細胞幹細胞(例えば、造血幹細胞)において選択的に発現されるように、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする本開示のベクターを被験者に投与することを含む。本法は、ウイルスゲノム由来のポリヌクレオチドを含むウイルスキャプシド及びエンベロープを含むウイルス構築物を投与することを含む。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、RNAを含む。別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、γレトロウイルスに由来する。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、5'及び3'末端で長い末端反復を含む。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、CARのコード配列を含む。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のmiRNA標的配列を含む。さらに別の実施形態では、前記miRNA標的配列は、非特異的な細胞に存在するmiRNAの標的である。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドをコードする配列を含む。
本開示は、ウイルスキャプシド中にカプセル化されたポリヌクレオチドを産生する配列を含むプラスミドを提供する。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、RNAを含む。別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、γレトロウイルスに由来する。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、5'及び3'末端で長い末端反復を含む。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、CARのコード配列を含む。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のmiRNA標的配列を含む。さらに別の実施形態では、前記miRNA標的配列は、非特異な細胞には存在するが、標的細胞に存在せず、感染性ベクターの作製に使用される細胞にも存在しないmiRNAの標的である。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドをコードする配列を含む。
本開示は、5'から3'へ、シグナル伝達ドメインコード配列に作動可能に連結された膜貫通ドメインコード配列に作動可能に連結されたヒンジ／リンカーコード配列に作動可能に連結された結合ドメインのコード配列に作動可能に連結されたγレトロウイルスからの"R-U5"ドメイン、続いて1つまたは複数の miRNA標的配列(miR-TS；miR標的カセット)、続いてγレトロウイルスからの"U3-R"ドメインを含むウイルスポリヌクレオチド構築物を提供する。いくつかの実施形態では、前記ウイルスRNAは、IRESに作動可能に連結されたキルスイッチのためのコード配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、前記IRES-キルスイッチは、前記miRNAカセットの上流または下流(5'または3')であり得る。前記ポリヌクレオチド配列は、R-U5-結合ドメイン-ヒンジ/リンカー-TMドメイン-シグナル伝達ドメイン-miRNA標的-U3-Rのように概略的に示すことができる(図1も参照)。
一実施形態では、前記R-U5ドメインは、配列：GCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCAUCCGACUUGUGGUCUCGCUGUUCCUUGGGAGGGUCUCCUCUGAGUGAUUGACUACCCGUCAGCGGGGGUCUUUCAUU (配列番号:25、ヌクレオチド1～145)
と少なくとも80～100%同一である配列を含むことができる。
一実施形態では、前記R-U5パッケージングドメインは、配列：
GCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCAUCCGACUUGUGGUCUCGCUGUUCCUUGGGAGGGUCUCCUCUGAGUGAUUGACUACCCGUCAGCGGGGGUCUUUCAUUUGGGGGCUCGUCCGGGAUCGGGAGACCCCUGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGUAAGCUGGCCAGCAACUUAUCUGUGUCUGUCCGAUUGUCUAGUGUCUAUGACUGAUUUUAUGCGCCUGCGUCGGUACUAGUUAGCUAACUAGCUCUGUAUCUGGCGGACCCGUGGUGGAACUGACGAGUUCGGAACACCCGGCCGCAACCCUGGGAGACGUCCCAGGGACUUCGGGGGCCGUUUUUGUGGCCCGACCUGAGUCCAAAAAUCCCGAUCGUUUUGGACUCUUUGGUGCACCCCCCUUAGAGGAGGGAUAUGUGGUUCUGGUAGGAGACGAGAACCUAAAACAGUUCCCGCCUCCGUCUGAAUUUUUGCUUUCGGUUUGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGUCUUGUCUGCUGCAGCAUCGUUCUGUGUUGUCUCUGUCUGACUGUGUUUCUGUAUUUGUCUGAGAAUUAAGGCCAGACUGUUACCACUCCCUGAAGUUUGACCUUAGGUCACUGGAAAGAUGUCGAGCGGAUCGCUCACAACCAGUCGGUAGAUGUCAAGAAGAGACGUUGGGUUACCUUCUGCUCUGCAGAAUGGCCAACCUUUAACGUCGGAUGGCCGCGAGACGGCACCUUUAACCGAGACCUCAUCACCCAGGUUAAGAUCAAGGUCUUUUCACCUGGCCCGCAUGGACACCCAGACCAGGUCCCCUACAUCGUGACCUGGGAAGCCUUGGCUUUUGACCCCCCUCCCUGGGUCAAGCCCUUUGUACACCCUAAGCCUCCGCCUCCUCUUCCUCCAUCCGCCCCGUCUCUCCCCCUUGAACCUCCUCGUUCGACCCCGCCUCGAUCCUCCCUUUAUCCAGCCCUCACUCCUUCUCUAGGCGCCGGAAUUAAUUCUCGA (配列番号：25、ヌクレオチド1～1055)
と少なくとも80～100%同一である配列を含むことができる。
一実施形態では、前記U3-Rドメインは、配列：
UGAAAGACCCCACCUGUAGGUUUGGCAAGCUAGCUUAAGUAACGCCAUUUUGCAAGGCAUGGAAAAAUACAUAACUGAGAAUAGAGAAGUUCAGAUCAAGGUCAGGAACAGAUGGAACAGCUGAAUAUGGGCCAAACAGGAUAUCUGUGGUAAGCAGUUCCUGCCCCGGCUCAGGGCCAAGAACAGAUGGAACAGCUGAAUAUGGGCCAAACAGGAUAUCUGUGGUAAGCAGUUCCUGCCCCGGCUCAGGGCCAAGAACAGAUGGUCCCCAGAUGCGGUCCAGCCCUCAGCAGUUUCUAGAGAACCAUCAGAUGUUUCCAGGGUGCCCCAAGGACCUGAAAUGACCCUGUGCCUUAUUUGAACUAACCAAUCAGUUCGCUUCUCGCUUCUGUUCGCGCGCUUCUGCUCCCCGAGCUCAAUAAAAGAGCCCACAACCCCUCACUCGGCGCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCA (配列番号：25、ヌクレオチド5537～6051)
と少なくとも80～100%同一である配列を含むことができる。
当業者に認識されるように、R-U5及びU3-R配列のDNAプラスミド配列が"T"で置換された"U"を有する。
"CAR"の結合ドメインは、所望の標的抗原に結合するポリペプチドをコードする任意の配列であり得る。例えば、該結合ドメインは、所望の標的抗原(例えば、表1を参照)に誘導されたscFvのような抗体断片であり得る。表1に示された標的への種々の結合ドメインをコードする配列は、当該技術分野で知られており、多くの出願で公開されている。本開示のCARは、本質的にモジュラーであるため、所望の標的に応じて異なる"結合ドメイン"を付着させることができる。
上述したように、"ヒンジ"またはリンカーコード配列は、CARの結合ドメインに作動可能に連結され得る。場合によっては、該"ヒンジ"は任意であり、該結合ドメインは、膜貫通ドメインコード配列に直接結合することができる。別の実施形態では、前記結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、最小のペプチドコード配列またはスペーサーによって分離される。種々のヒンジドメイン及びスペーサーは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
miR標的配列またはカセットは、典型的には、ウイルス構築物のポリヌクレオチドの発現を阻害するmiRNA分子の標的を含む。例えば、該miR標的配列は、典型的には、miRNA標的配列は、典型的には、例えば、CARの発現が望ましくない、または望まれない組織または細胞で発現されるmiRNAに結合する。しかし、該miRNA は、ウイルス構築物からの発現が望まれる標的細胞やベクター産生細胞では発現しない。このような配列またはmiRNAが未知な場合、それらは、以下の方法よって容易に同定され、特徴付けられる。即ち、発現が望まれない標的組織の試料（例えば、腫瘍）や、発現が望ましい、または必要な細胞の試料（例えば、T細胞）から、全RNAを作成し、そのような試料に対してディープバルク配列決定を行い、次いで、当業者に知られている生体情報技術を使用して、さらなる試験のための候補miRNA及び対応する標的が同定される。また、本開示を利用して、当業者は、特定の癌または疾患を治療するための結合ドメイン、望ましくない組織及び/または細胞におけるCARの発現を防止するmiRNA標的配列、ならびに適切な"ヒンジ"、"膜貫通ドメイン"及び細胞内ドメインを容易に同定することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のベクター構築物は、さらなる安全機構としてキルスイッチを含み、これにより、該ベクター構築物の発現は、例えば、自殺遺伝子(例えば、チミジンキナーゼ(TK)またはシトシンデアミナーゼ(CD)活性を有するポリペプチド)の発現をもたらすであろう。被験者、細胞または組織が望ましくないベクター発現を起こした場合には、該被験者、組織または細胞をプロドラッグ（例えば、5-フルオロシトシン）と接触させ、これにより、例えば、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドを発現する細胞は、5-FCと接触し、5-FCは、キルスイッチの発現部位で細胞傷害性5-FUに変換され、それによってベクター感染細胞を死滅させる。
一実施形態では、本開示は、gagポリペプチド、polポリペプチド及びenvポリペプチドを含むレトロウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターのキャプシド内に含まれるレトロウイルスポリヌクレオチドを提供する。前記レトロウイルスポリヌクレオチドは、5'から3'まで：R-U5-結合ドメイン-ヒンジ/リンカー-TMドメイン-シグナル伝達ドメイン-miRNA標的-U3-Rを含む。一実施形態では、前記レトロウイルスポリヌクレオチドは、ヌクレオチド1～約ヌクレオチド145の配列番号：25の少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、98%、99%、または100%の同一性を有するR-U5核酸配列 (例えば、ヌクレオチド140、141、142、143、144、145、126、147、148、149、または150)を含む。さらなる実施形態では、前記レトロウイルスポリヌクレオチドは、R-U5ドメインに対するキメラ抗原受容体コード配列3'を含む。一実施形態では、前記CARコード配列は、抗原結合ドメインのコード配列(例えば、CD19に対するscFv)を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインコード配列は、シグナル配列によって先行され得る。さらなる実施形態では、前記結合ドメインコード配列に続いて任意のリンカー/スペーサードメイン配列が続く。さらに別の実施形態では、前記結合ドメインコード配列は、任意のスペーサー/リンカーコード配列に続いて、膜貫通ドメインをコードする核酸配列が続く。さらなる実施形態では、前記膜貫通コード配列に続いて、細胞質シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列が続く。別の実施形態では、前記レトロウイルスポリヌクレオチドは、任意のキルスイッチドメインコード配列を含むことができる。前記任意のキルスイッチコードドメインは、プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換するポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されたIRESを含む。一実施形態では、前記ポリペプチドは、チミジンキナーゼ(TKO)またはシトシンデアミナーゼ(CD)である。さらなる実施形態では、前記レトロウイルスポリヌクレオチドは、少なくとも1つ、典型的には複数の同一または異なるmiRNA標的配列を含む。該miRNA標的配列は、CARドメインに対して3'である。前記レトロウイルスポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの3'末端にU3-Rドメインをさらに含む。一実施形態では、該U3-Rドメインは、ヌクレオチド約5537から約6051までの配列番号：25と少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、98%、99%、または100%同一である配列を含む。上記のいずれかの実施形態のいくつかでは、前記ドメインは、クローニングの意図的または人工的な産物であり得る約2～20個のヌクレオチドの小さなスペーサー配列によって分離され得る。
本開示はまた、適当な宿主細胞で発現される場合、本開示のレトロウイルスベクターを産生するプラスミド配列も提供する。
本開示は、R-U5ドメイン、パッケージングドメイン、CARドメイン、及びmiRNA非標的化ドメイン(例えばmiRNA標的ドメイン)を有する組換えウイルスゲノムを含むレトロウイルスベクターを提供する。前記組換えウイルスゲノムは、自殺遺伝子のコード配列(例えば、TKOまたはCD活性を有するポリペプチドを産生する遺伝子)を含むキルスイッチをさらに含むことができる。前記CARドメインは、(当該技術分野で知られているように)所望の免疫細胞で発現されると、標的抗原に結合できる第1、第2または第3世代のCAR構築物を含むことができる。本開示のレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞に感染し、組換えウイルスゲノムを該哺乳動物の細胞に送達することができるエンベロープを含むレトロウイルスキャプシドを含む。前記レトロウイルスベクターは、in vivoで細胞を形質転換するために使用することができ、従って、現在の養子細胞療法において行われるように、細胞のex vivo単離の必要性を排除する。前記miRNA非標的化ドメインは、ウイルスゲノムの発現が望ましくない細胞において産生されるmiRNAによって結合され得る標的配列を含む。これらの細胞におけるmiRNAの結合は、miRNA標的配列を結合し、細胞内のウイルスゲノムの発現を防止する。
本開示は、癌の被験者を治療する方法も提供する。該方法は、生体内での免疫細胞操作を伴わずに、in vivoでCARの発現を誘導することを含む。該方法は、治療すべき疾患または障害に特異的な標的抗原を同定すること、該疾患または障害に特異的な抗原を標的とする結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を構築すること、CARコード配列を本開示のベクターにクローニングすること、該CAR構築物をコードするポリヌクレオチドを含むウイルス構築物を産生すること、そして、該被験者の免疫細胞がin vivoで形質導入されてCARを発現するように、該ウイルス構築物を投与することを含むことができる。
本開示のベクターを本明細書に記載されるように産生し、精製し、被験者へ投与するための医薬製剤に調製することができる。
別の実施形態では、本開示は、本開示のベクターを用いた治療を計画している、受けている、または受けた被験者における幹細胞(例えば、造血幹細胞)を動員する方法を提供する。
本開示は、造血幹細胞を動員するための多くの方法を提供する。造血幹細胞及び前駆細胞(HSPC)は、骨芽細胞、網状/間葉細胞、内皮細胞、マクロファージ、及び巨核球のようないくつかの細胞型によって占められている骨髄環境内の異なる微小環境に存在する。これらの微小環境細胞は、調節機能を果たし、HSPCの細胞周期への侵入を制限し、HSPCプールを維持及び再生できる限られた数のHSPCによる造血系の生涯にわたる再増殖を保証する。HSPCは、これらの微小環境から血液中に動員することができ、この動員は、成長因子、薬物、抗体等によって誘導され得る。動員されると、HSPCは血流を通って移動し、造血部位に戻ることができる。本開示は、比較的接近不能な骨髄微小環境に戻る前に血液中の造血幹細胞(HSC)の形質導入を可能にするためにこれを効果的に行ういくつかの異なる方法を提供する。
本開示は、これらの細胞の表面に示されたエピトープに結合するように設計された部分を有するレトロウイルスキャプシド上のエンベロープを用いて、HSCにレトロウイルスベクターを標的化する方法も提供する。
骨芽細胞は、可溶性及び膜局在化因子の発現を介してHSPCの静止状態または増殖を調節する。例えば、骨芽細胞は、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)及び肝細胞増殖因子(HGF)のような造血成長因子を、CD34+HSPCとの接触、またはPTH/PTHrP受容体（PPR）を介した副甲状腺ホルモン（PTH）または局所的に産生されるPTH関連タンパク質（PTHrP）による刺激の際に産生する。さらに、PTHの存在下で培養された骨髄間質細胞は、長期の骨髄惹起細胞(LTC-IC)を維持する能力を得る。また、PTHの適用は、骨髄再増殖活性を有するHSPCを増加させる。従って、PTHは、骨芽細胞間質細胞上のHSPCに対する関連する成長シグナルに影響を及ぼすことによってHSPC増殖を調節することができる(Calviら、2003)。
HSPCを担持する骨芽細胞は、n-カドヘリン+CD45-の明確な表現型をさらに有し、骨形成タンパク質(BMP)によって調節される。これらの骨芽細胞は、C-X-Cモチーフケモカイン-12(CXCL12；間質由来因子-1(SDF1)としても知られている)、ならびに幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-6(IL-6)、及びノッチリガンド、Jagged 1(Jag1)のようなケモカインを発現する。HSPCにおけるノッチシグナル伝達の増加、例えば、骨芽細胞におけるJag1のPRRのPTH/PTHrP活性化により、成熟造血細胞に影響を与えることなくHSPCの数を増加させる。一方、ノッチ活性化のγ-セクレターゼ阻害によるノッチシグナル伝達の遮断は、長期的な再増殖HSPCの数を減少させる(Calviら、2003；Stierら、2002)。
骨芽細胞は、アンギオポイエチン-1をさらに発現する(Araiら、2004)。これは、HSPC上のTie 2受容体に結合し、HSPC静止状態、HSPCの骨領域への付着、及びHSPCの維持を担持する。骨芽細胞は、トロンボポイエチン(TPO)も発現する。これは、骨髄中の静止状態のHSPC上で発現するMPL受容体を活性化する。TPO/MPL相互作用は、HSPC中でbetal-インテグリン及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を増加させ、それによってHSPCの静止状態を誘導する。それにより、抗MPL中和抗体によるTPO/MPL経路の阻害は、静止状態のHSPCの数を減少させる(Yoshiharaら、2007；Qianら、2007)。
骨芽細胞質の微小環境における原始的なHSPC増殖の調節における別の因子は、オステオポンチンである。これは、骨髄微小環境における原始細胞の膨張を制限する。オステオポンチンは、骨芽細胞により産生される。原始的なHSPCは、betalインテグリンを介してin vitroでオステオポンチンと特異的な接着を示す(Nilssonら、2005)。オステオポンチンの欠損または阻害は、ヒトCD34+HSPCにおける間質Jag1及びノッチl受容体の発現の有意な増加をもたらし、その結果、長期的に再増殖する HSPC の数が増加する(Stierら、2005；Iwataら、2004)。
骨髄間質は、骨髄細胞の付着画分の一部であり、骨髄が長期培養条件に置かれたときに造血支持接着層を形成する線維芽細胞様細胞をさらに含む。これらの線維芽細胞間葉系細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞のような種々の系統に分化することができ、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞(MSC)、外膜網状細胞(ARC)、及びSTRO-1細胞として様々に呼ばれている。これらの細胞は、STRO-1、SH2、SH3、SH4、ネスティン、血小板由来増殖因子受容体-a (PDGFRa)、CD51、CD146のような細胞表面マーカーを認識する抗体を用いて同定及び単離することができ、CD45、CD31、及びTerll9に対して陰性である (Simonsら、1994；Sacchettiら、2007；Mendez-Ferrerら、2010；Pnhoら、2013)。間葉系細胞マーカーNG-2(Cspg4)を発現する動静脈管細胞も、HSPCの静止状態を維持する (Kunisakiら、2013)。
特に、ネスティンは、HSPC及びアドレナリン性神経線維に空間的に関連する非造血MSCの小集団のマーカーである(Mendez-Ferrerら、2010)。ほとんどのHSPCは、大量のケモカインCXCL12を発現する間質細胞と密接に接触している。ケモカインCXCL12は、"CXCL12-豊富な網状"細胞と呼ばれ、シヌソイド内皮細胞を取り囲むか、またはエンドステムの近くにある(Sugiyamaら、2006)。CXCL12発現は、ネスティン-間質細胞よりもネスティン+において50倍以上高く、そして一次骨芽細胞よりも10倍高い。ネスティン+MSCsの枯渇は、未熟HSPCの50%の減少及び骨髄由来のHSPCの90%の減少をもたらす。さらに、PTHの投与は、ネスティン+MSCの増殖、それらの骨芽細胞への分化、及びHSPCプールの増加を誘発した(Mendez-Ferrerら、2010；Adamsら、2007)。
さらに、ネスティン-MSCと比較して、ネスティン+MSCは、HSPC維持遺伝子SCF/c-キットリガンド、IL-7、及び血管細胞接着分子-1(VCAM-1)を、HSPC維持の逆調節因子、オステオポンチンとして、高度に発現する。また、CXCL12に富む網状細胞は、ネスティン+MSCにおけるコネキシン43及び45の高発現により確認されるように、交感神経系によって神経支配される。これは、?-アドレナリン作動性神経端子との電気機械的な結合を示す。?3アドレナリン受容体拮抗薬の投与は、HSPCの動員を増強する(Katayamaら、2006)。
内皮細胞は、HSPC 微小環境シグナルにも寄与する。骨髄血管構造のイメージングは、85%の長期再増殖HSPCが、類洞血管の10 μm以内であり、レプチン受容体+及びCXCL12-高間質微小環境細胞と接触していることを示した(Acarら、2015)。最近の研究は、HoxB5の発現によりマークされた骨髄中のHSPCの94%以上が血管の内腔位置に見出され、VE-カドヘリン(Cdh5)発現内皮細胞に直接付着していることも示した(Chenら、2016)。
HSPCとヒト類洞内皮細胞との直接な細胞接触は、微小環境リガンドJagged 1(Jag1)、Jag2、δ様リガンド4(D114)、D111、及びD111由来の内皮標的合成融合タンパク質を介して、HSPCの再増殖能及び自己再生を増加させる。また、他の微小環境リガンドは、HSPCの再生を促進することができる(Butlerら、2010；Tianら、2013)。Notchシグナル伝達は、成人HSPCの恒常性維持には必須ではないが、Notch-リガンド接着相互作用は、HSCの静止状態及び微小環境保持を維持する。また、最近報告されているように、Notch2遮断(Notchl遮断ではなく)は、HSPCを動員刺激に感作し、骨髄から末梢血への流出を増大させる(Wang ら、2017)。
一方、報告されているように、3日間のモノクローナル抗体による、内皮細胞の生存に重要なVEカドヘリン依存性及び血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)依存性の血管新生シグナル伝達経路の破壊も、造血細胞におけるNotchシグナル伝達を破壊した。その結果、HSPCの頻度が減少し、分化が誘導される(Butlerら、2010)。化学療法の間、細動脈及び類洞内皮細胞を含む類洞血管は、用量依存的に損傷を受け、VEGFR2は、それらの再生及びHSPC再構成に不可欠である(Hooperら、2009)。
HSPC増殖を調節する他の因子には、内皮細胞及び血管周囲細胞を発現するレプチン受容体中の幹細胞因子(SCF)が含まれる(Dingら、2012)。骨髄類洞内皮細胞によって発現され、分泌されるヘパリン結合成長因子プレニトロフィンは、造血幹細胞の自己再生及び保持を調節することも示されている(Himburgら、2012)。また、内皮細胞に特異的な接着分子の欠失及びE-セレクチンは、増加したHSPC静止状態の増加を誘導し、内皮細胞もHSPC増殖を調節できることを示唆している(Winklerら、2012)。
HSPCは、骨芽細胞の生存及びそれらの微小環境におけるHSPCの保持を支持する骨髄マクロファージと接触していることも見出されている(Chowら、2011；Christoherら、2011)。CD169+(Siglecl)マクロファージの枯渇は、骨髄中の間葉(ARC)微小環境におけるHSPCの保持を減少させ、その結果、HSPCは、血流中で動員される(Chowら、2011)。さらに、G-CSFは、骨芽細胞の機能及びHSPC動員の抑制につながる骨内膜性のマクロファージの枯渇を誘導する(Winklerら、2010)。
HSPCは、HSPC微小環境にも寄与する巨核球と直接に接触することも見出されている。巨核球は、通常、HSPCを細胞周期のG0相に維持するトロンボポイエチン(TPO)、形質転換成長因子?1(TGF-?1)、及びケモカインC-X-Cモチーフリガンド-4(CXCL4)のような細胞周期調節因子を分泌する(Nakamura-Ishizuら、 2014；Brunsら、2014；Zhaoら、2014)。実際、TGF-β1は、骨芽細胞、内皮細胞、ネスティン+周辺血管細胞、及びCXCL12豊富な網状細胞を含む、骨髄の他のどの間質細胞型よりも巨核球でより高度に発現されることが報告されている。しかし、5-フルオロウラシル((5-FU)のような化学療法剤の化学毒性ストレス下では、巨核球は、線維芽細胞増殖因子1(FGF-1)を分泌し、TGF-β1を減少させ、そしてHSPCの増殖を刺激する(Zhaoら、2014)。
HSPCの動員は、多因子プロセスであり、HSPCと骨髄間質との間の相互作用を調節することにより骨髄微小環境のレベルで調節される。接着分子、パラクリンサイトカイン、及びケモカインは、この相互作用に関与している。微小環境におけるHSPCを係留する、及び/またはそれらの静止状態を誘導する主要な因子は、血管細胞接着分子(VCAM)-1、CD44、造血成長因子（例えば、幹細胞因子(SCF)及びFLT3リガンド）、CXCL12、成長調節タンパク質β及びIL-8を含むケモカイン、プロテアーゼ、ペプチド、及びヌクレオチドのような他の化学的伝達物質である。動員は、間質接着からの離脱によって開始され、続いて骨髄洞に向けて直接に移動し、続いて基底膜及び内皮層を通って放出する。
HSPCは、骨髄間質細胞上に見出されるリガンドを有する広範囲の細胞接着分子(CAM)を示す。動員及びホーミングプロセスにおける多くのCAM-リガンド対の役割及び寄与は、ほとんど知られていない。しかし、インテグリンLFA-1 (リンパ球機能関連抗原1)及びVLA-4(非常に後期抗原-4またはインテグリンα4β1)を含むいくつかの白血球接着分子は、骨髄に存在する前駆細胞と比較すると、循環前駆細胞では発現が減少する。これらの接着分子のそれぞれのリガンド(細胞間接着分子-1またはICAM-1、及び血管細胞接着分子-1またはVCAM-1)は、骨髄内皮及び間質細胞上に見出される。主に、VCAM-1タンパク質は、VLA-4(α4β1)の内皮リガンドであり、LPAM (リンパ球パイエルパッチ接着分子またはインテグリンα4β7)に弱く結合する。精製された全ての末梢血 CD34+細胞の 90% 以上がVLA-4(α4β1)インテグリンを発現するが、VLA-5(インテグリン α5β1またはフィブロネクチン受容体)を発現するのは10～15%のみである。VLA-4(α4β1)インテグリンは、単独に接着に影響を与える。一方、VLA-4(α4β1)及びVLA-5(α5β1)は、共に組換えフィブロネクチン上のクローン原性CD34+前駆細胞の走化性を媒介する(Carstanjenら、2005)。
骨髄内の間質細胞からのHSPCの放出は、エラスターゼ及びカテプシンGによるVCAM-1のタンパク質分解、及び好中球プロテアーゼによるCXCL12のタンパク質分解によって行われる(Levesqueら、2002)。また、マトリックスメタロプロテイナーゼ9(MMP-9)による膜結合SCFの脱落は、HSPC動員に寄与することが見出された(Heissigら、2002)。これらの発見は、G-SCFによる刺激の後だけでなく、ケモカインや化学療法等の他の刺激の後の HSPC動員における共通の"末端経路"を示した。
初期の研究では、VLA-4及びVCAMに対する抗体は、前駆細胞を動員し、及び/または非ヒト霊長類における骨髄へのそれらのホーミングを阻害することが示された(パパイア(Papayannopoulouら、1995；PapayannopoulouとNakamoto、1993)。続いて、骨髄微小環境におけるHSPCの保持のためのHSPCと間質細胞の間の、VLA-4/VCAM-1相互作用の重要性だけでなく、VLA-5(?5?1；フィブロネクチン受容体)/フィブロネクチン及びCD44/ヒアルロナン/オステオポンチン相互作用の重要性も、機能遮断抗VLA-5及び抗CD44抗体を用いた研究によって示されており、全ての結果、HSPCの遊離及び血液中へのそれらの動員をもたらす(Vermeulenら、1998；van der Looら、1998)。重要なことに、VLA-4(α4β1)及びVLA-5(α5β1)に対する抗体は、ヒト末梢血CD34+細胞の移植後の骨髄の再増殖を独立に減少させる(Carstanjenら、2005)。
ナタリズマブは、多発性硬化症及びクローン病の患者を治療するためにFDAに承認されたヒト化モノクローナル抗VLA-4抗体である。多発性硬化症のナタリズマブ点滴療法を受ける患者の連続測定では、約3倍の循環CD34+細胞の有意な増加が示された(Zohrenら、2008)。造血幹細胞移植及び幹細胞疾患の文脈において、ナタリズマブ単独または細胞傷害性薬物または他の抗体のいずれかとの組み合わせの使用は、幹細胞動員のための新しい様式であり得る(Neumann、Zohren、及びHaas、2009)。
HSPC上の接着分子の低発現または減少された結合活性は、骨髄からのそれらの動員も促進し得る。例えば、インターロイキン(IL)-3、顆粒球-マクロファージCSF(GM-CSF)、及びキットリガンド(KL)のような特定のサイトカインは、CD34+細胞で発現されるVLA-4及びVLA-5の機能を改変し、それによってフィブロネクチンへの接着を調節できることが示されている(Levesqueら、1995)。逆に、幹細胞因子(SCF)刺激後、CD34+ HSPC上のVLA-4及びVLA-5の発現は、それぞれ約2倍及び4～10倍増加し、それにより、SCFによる刺激後にフィブロネクチンへの接着が増加することが報告されている(Hartら、2004)。
さらに、骨髄類洞におけるEPHB4受容体と造血細胞におけるエフリンB2 リガンドの相互に排他的な分布は、HSPC動員におけるこれらの分子の相互作用の役割を示す。マウスにおけるEPHB4/エフリンB2シグナル伝達経路の遮断は、HSPC及び他の骨髄細胞の循環への動員を減少させることが示された(Kwakら、2016)。
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されるように、1種以上の薬剤的または生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、ウイルスベクターを含んでもよい。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等のような緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール等のような炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；酸化防止剤；EDTAまたはグルタチオンのようなキレート化剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；及び保存剤を含んでもよい。本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化することができる。該組成物は、二次活性剤(例えば、抗癌剤、抗ウイルス剤、または抗生物質剤)をさらに含んでもよい。
本開示の医薬組成物は、治療(または予防)すべき疾患に適した方法で投与してもよい。投与の量及び頻度は、患者の状態、及び患者の疾患の種類及び重症度のような要素によって決定される。"免疫学的に有効な量"、"抗腫瘍有効量"、"腫瘍抑制有効量"、"治療量"または"抗感染性"が示される場合、投与される本開示の組成物の量は、医師によって、症例における患者(被験者)の年齢や体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、及び患者(被験者)の状態での個人差を考慮して決定することができる。一般に、医薬組成物は、疾患または障害を治療するのに十分な免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)の形質導入を引き起こすのに十分な量で投与される。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、103～1011形質転換単位／用量でベクター(例えば、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、または上記2つの値のいずれかの間の任意の値)を含む。該投与量は、1日に1回から数回投与してもよく、in vivoで免疫エフェクター細胞を誘導するのに必要な連続した日、週、または月にわたって投与してもよい。本開示のベクターを含む医薬組成物は、免疫療法において一般に知られている点滴技術を用いて投与することができる(例えば、Rosenbergら、New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照)。
本開示は、以下の実験例を参照してさらに説明される。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供され、特に断らない限り、限定することを意図するものではない。従って、本開示は、以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意の及び全ての変形を包含するものと解釈されるべきである。
実施例1
miRNA標的配列を含む組換えレトロウイルスベクターからの選択的導入遺伝子発現のin vitro試験
本実験は、導入遺伝子のための転写されたコードRNA内にマイクロRNA標的配列を含む導入遺伝子を含有するRNVを用いて行われる。感染性ベクターは、実施例2～6に記載の方法のいずれかによって調製される。従来のように、プラスミド名は、全名に先行する小文字の"p"を有し、対応する感染性ベクターは、この"p"を付けず、または前または後に"v"を付けた同じ名称を有する。従って、pBA9-9b-hCD19-miRT223T4Xは、抗ヒトCD19CAR及びmiR223の標的配列の4つのコピーのコード配列を含むpBA-9B(配列番号:l、ここで、"U"は"T"であり得る)由来のウイルス骨格を担持するプラスミド（例えば、構築物7）を意味する。BA-9b-hCD19-miRT223T4XまたはvBA-9b-hCD19-miRT223T4XまたはBA-9b-hCD19-miRT223T4X(V)は、対応する感染性ベクターを表す。同族のマイクロRNAを発現する細胞は、miRNA標的配列を含むRNAを分解し、それによって、その細胞型における導入遺伝子の発現を制限する。導入遺伝子は、各マイクロRNA標的配列の1つ以上のコピーを含んでもよい。本実施例では、前記導入遺伝子は、転写物の3'末端にある各miRNA標的配列の4つのコピーを含む及び含まないCD19キメラ抗原受容体をコードする。一実施形態では、前記マイクロRNA標的配列は、miR223標的("miR223T(4X)")の4つの反復をコードし、形質導入された単球における導入遺伝子発現を減少させる(図1；構築物7；配列番号：2)。一実施態様では、前記マイクロRNA標的配列は、B細胞(リンパ腫)に特異的なmiRaBCT(4X)をコードし、形質導入されたB細胞における導入遺伝子発現を減少させる(図1)。一実施形態では、前記マイクロRNA標的配列は、miRaNKT(4X)をコードし、形質導入されたNK細胞における導入遺伝子発現を減少させる(図1)。一実施形態では、前記マイクロRNA標的配列は、miRaBCT(4X)及びmiR223T(4X)をコードし、形質導入されたB細胞及び単球における導入遺伝子発現を減少させる(図1、構築物5) 。一実施態様では、前記マイクロRNA標的配列は、miRaNKT(4X)及びmiR223T(4X)をコードし、形質導入されたB細胞及び単球における導入遺伝子発現を減少させる(図1)。一実施形態では、前記マイクロRNA標的配列は、miRaNKT(4X)、miRaNKT(4X)、及びmiR223T(4X)をコードし、形質導入されたB細胞及び単球における導入遺伝子発現を減少させる(図1)。別の実施形態では、RNVは、肝細胞における転写物の分解をもたらす導入遺伝子UTRにおいて、miRNA標的配列も含んでもよい。miRNA122aT(4X)及びmiR199aT(4X)配列を単一の標的として添加するか、またはUTRに組み合わせて添加すると、肝臓における導入遺伝子発現が減少する(図2、構築物36、37、38)。これらの肝臓非標的化miRNAは、図1からの成分と組み合わせてもよく、5つのmiRNA標的配列全てがRNV導入遺伝子UTR でコードされる組み合わせが含まれる(図2)。
本開示のRNAウイルスポリヌクレオチド(vRNAゲノム)は、配列番号：lで提供される；太字/下線の部分は、複数のクローニング部位を示す：
GCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCAUCCGACUUGUGGUCUCGCUGUUCCUUGGGAGGGUCUCCUCUGAGUGAUUGACUACCCGUCAGCGGGGGUCUUUCAUUUGGGGGCUCGUCCGGGAUCGGGAGACCCCUGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGUAAGCUGGCCAGCAACUUAUCUGUGUCUGUCCGAUUGUCUAGUGUCUAUGACUGAUUUUAUGCGCCUGCGUCGGUACUAGUUAGCUAACUAGCUCUGUAUCUGGCGGACCCGUGGUGGAACUGACGAGUUCGGAACACCCGGCCGCAACCCUGGGAGACGUCCCAGGGACUUCGGGGGCCGUUUUUGUGGCCCGACCUGAGUCCAAAAAUCCCGAUCGUUUUGGACUCUUUGGUGCACCCCCCUUAGAGGAGGGAUAUGUGGUUCUGGUAGGAGACGAGAACCUAAAACAGUUCCCGCCUCCGUCUGAAUUUUUGCUUUCGGUUUGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGUCUUGUCUGCUGCAGCAUCGUUCUGUGUUGUCUCUGUCUGACUGUGUUUCUGUAUUUGUCUGAGAAUUAAGGCCAGACUGUUACCACUCCCUGAAGUUUGACCUUAGGUCACUGGAAAGAUGUCGAGCGGAUCGCUCACAACCAGUCGGUAGAUGUCAAGAAGAGACGUUGGGUUACCUUCUGCUCUGCAGAAUGGCCAACCUUUAACGUCGGAUGGCCGCGAGACGGCACCUUUAACCGAGACCUCAUCACCCAGGUUAAGAUCAAGGUCUUUUCACCUGGCCCGCAUGGACACCCAGACCAGGUCCCCUACAUCGUGACCUGGGAAGCCUUGGCUUUUGACCCCCCUCCCUGGGUCAAGCCCUUUGUACACCCUAAGCCUCCGCCUCCUCUUCCUCCAUCCGCCCCGUCUCUCCCCCUUGAACCUCCUCGUUCGACCCCGCCUCGAUCCUCCCUUUAUCCAGCCCUCACUCCUUCUCUAGGCGCCGGAAUUAAUUCUCGAGGGGCCCAGAUCUGCGGCCGCUCGCGAGUCGACAAGCUUGGAUCCAUCGAUAAAAUAAAAGAUUUUAUUUAGUCUCCAGAAAAAGGGGGGAAUGAAAGACCCCACCUGUAGGUUUGGCAAGCUAGCUUAAGUAACGCCAUUUUGCAAGGCAUGGAAAAAUACAUAACUGAGAAUAGAGAAGUUCAGAUCAAGGUCAGGAACAGAUGGAACAGCUGAAUAUGGGCCAAACAGGAUAUCUGUGGUAAGCAGUUCCUGCCCCGGCUCAGGGCCAAGAACAGAUGGAACAGCUGAAUAUGGGCCAAACAGGAUAUCUGUGGUAAGCAGUUCCUGCCCCGGCUCAGGGCCAAGAACAGAUGGUCCCCAGAUGCGGUCCAGCCCUCAGCAGUUUCUAGAGAACCAUCAGAUGUUUCCAGGGUGCCCCAAGGACCUGAAAUGACCCUGUGCCUUAUUUGAACUAACCAAUCAGUUCGCUUCUCGCUUCUGUUCGCGCGCUUCUGCUCCCCGAGCUCAAUAAAAGAGCCCACAACCCCUCACUCGGCGCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCA
CAR構築物は、(miRNA標的ドメインやキルスイッチドメイン等のような他のドメインの有無にかかわらず)前記複数のクローニング部位にクローン化することができる。
種々の細胞型におけるmiRNA標的配列の特異性及び機能を確認するために、エメラルドGFPを含有するRNVをCD19CARの代わりに使用して、PMBC細胞型及び種々の細胞株にわたって導入遺伝子発現を調べる。図1に記載のベクターBA9B-emdGFP含有miR変異体を用いて、細胞株：Jurkat(T細胞)；TALL-104(T細胞)；Raji(B)；NALM6(B)；THP-1(単球)；U937(単球)；及びNK-92(NK)を形質導入した。陽性対照として、HT1080細胞を、ピューロマイシンと共に前駆体miRNAの単一または種々の組み合わせを発現する第3世代のSIN-レンチウイルスベクターで形質導入する。形質導入後のHT1080は、UTR中のmiRNA標的配列を有する所望の導入遺伝子をコードするRNV形質導入の前に、2週間、ピューロマイシン(6 μg/mL)で選択される。このことは、形質導入された少なくとも1つの細胞株が、分解のためにRNV導入遺伝子UTRを標的にするために所望のmiRNAを発現することを保証する。例えば、構築物5で形質導入された細胞において、mRNA標的配列のための同族miRNAを発現しない細胞株のみが、表2に要約されたように、eGFP発現を示す。同じGFP発現ベクターを用いてPBMCを形質導入し、主に、かなりのレベルと頻度でGFP導入遺伝子を発現するのは T 細胞のみであることを示す同様の結果が得られた(図 3)。
表2：BA9B-CD19CAR-miRaBCT4X-miRaNKT4X-miR223T4Xで形質導入した後のGFP発現(予測)
Figure 2023525720000007
並行して、BA9B-CD19CAR-miRaBCT4X-miRaNKT4X-miR223T4Xベクターを10 MOIで使用して、ポリブレン(4～8 μg/ml)の存在下で混合リンパ球反応中にPBMCを形質導入する。百万個のPBMCを、24ウェル組織培養プレートの単一ウェル中に10%FBSを補充したRPMI1640培地中のle6/ml密度で播種する。形質導入後24～48時間後、細胞を採取し、サイトメーターで測定し、CD19CARの細胞型特異的発現を評価する(図3)。CD4またはCD8基準マーカーを発現するT細胞のみが、フローサイトメトリーによるCD19CAR発現を示し、一方、B細胞、NK細胞及び単球を含む他の細胞型は、CD19CAR発現を示さない。また、CD19+B細胞の発生頻度の減少は、T細胞からのCD19CAR活性によって、PBMCの培養物において見られる。さらに、T細胞を発現するCD19CARは、以下に記載するいくつかのin vitroアッセイの実行中に濃縮され得る。
初期化されたT細胞のCD19CAR特異的活性について、複数の短期間及び長期細胞アッセイを実施し、CAR媒介性増殖、細胞内と分泌の両方でのサイトカイン産生、及びNalm6-CD19WT及びNalm6-CD19KO 腫瘍細胞株に対する細胞毒性
を測定する。腫瘍系統Nalm6-CD19WTをATCCから購入し、初期化されたT細胞と共培養してCD19 CAR活性を試験するために、10%ウシ胎児血清を補充した培地RPMI-1640中に維持する。初期化されたT細胞のCD19 CAR非特異的活性を測定するために、元のNalm6-CD19WT親腫瘍系統から、CRISPR技術を用いてNalm6(Nalm6-CD19KO)のCD19抗原欠損変異体を産生する。異なるエフェクター対標的(E:T)比16:1、8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、及び1:8で、初期化されたCD19 CAR-T細胞とNalm6との共培養物から上清を収集し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及びBiolegendのLegendplexアッセイを使用したフローサイトメトリーを用いて、分泌されたサイトカインのレベルを測定する。初期化されたCAR-T細胞は、Nalm6-CD19KOとの培養ではなく、Nalm6-CD19WTとの培養の上清のみに、IL2、IFNγ、及びTNF等のサイトカインをCD19 CAR特異的に分泌する。フローサイトメトリーに基づく方法は、Nalm6-CD19WT及びNalm6-CD19KO細胞株と別々に4時間の短期間共培養の後に、初期化されたCAR発現T細胞上の脱顆粒(CD107動員)及び細胞内サイトカインを検出するためにも使用される。初期化されたCAR-T細胞は、Nalm6-CD19KOとではなく、Nalm6-CD19WTとの共培養において、IL2、IFNγ、及びTNF等のサイトカインをCD19 CAR特異的に脱顆粒し、細胞内に保持する。フローサイトメトリーを用いて初期化されたT細胞のCAR媒介性増殖を測定するために、細胞追跡青紫色(CTV)で標識されたPBMCの全プールをRNV-hCD19で処理し、次いで、Nalm6-CD19WT及びNalm6-CD19KO細胞株と別々に72時間共培養する。初期化されたT細胞のみが、Nalm6-CD19KOとの培養物ではなく、Nalm6-CD19WTとの培養物中で優先的にCAR特異的に増殖する。
初期化されたT細胞は、短期間及び長期共培養アッセイで測定したNalm6-CD19KOとの共培養と比較して、Nalm6-CD19WTと共培養したときに、CD19 CARに特異的な腫瘍細胞毒性も示す。ルシフェラーゼ発現Naml6-CD19WTに対する短期間で即時のCARに特異的な細胞毒性を測定するために、発光に基づく方法を使用する。Nalm6-CD19WTに対する短期及び長期のCARに特異的な腫瘍細胞毒性を測定するために、AgilentのxCELLigenceアッセイも使用する。xCELLigenceアッセイは、培養プレートに埋め込まれたバイオセンサーを用いてNalm6腫瘍系統数の任意の変化について、連続したリアルタイムな細胞分析(RTCA)を行う。異なるE：T比での初期化されたT細胞を添加すると、Nalm6-CD19KO細胞と比較して、Nalm6-CD19WTのCD19 CARに特異的な死滅が示される。さらに、72時間のxCELLigenceアッセイでは、Nalm6-CD19WT腫瘍細胞株がCARに特異的に死滅し、成長が阻害されることが示される。
実施例2
親HT-1080細胞においてMLV由来のGag/pol及びEnvの遺伝子操作されたバージョンを発現するプラスミド構築をコードするHAL2パッケージング細胞株
Sheridanら、MOLECULAR THERAPY Vol. 2, No. 3, 2000年9月に記載されたHA-LBパッケージング細胞と同様の方法で、HAL2パッケージング細胞株を開発した。本実施例では、Shridanら、Mol. Ther. 2000にも記載されたHAIIパッケージング細胞株を使用することができる。HAL2パッケージング細胞プラスミド構築物及びHIIパッケージング細胞株の構築物は、本明細書に記載されている。該プラスミド構築物を親HT-1080細胞株(ATCC-CCL-121)に安定に遺伝子導入した。あるいは、当業者であれば、gag/pol及びenv MLV由来の配列も、VSG-gで偽型化されたレンチウイルスベクターを用いて挿入し、発現させることができ、連続的な形質導入事象において該MLV配列を安定的に形質導入して、類似のHAL2パッケージング細胞株を得ることができる。前記gag/pol配列を安定に遺伝子導入または形質導入した後、gag/pol発現HT-1080中間体を希釈クローン化し、個々のクローンをウエスタンブロット分析により高gag/pol p30発現についてスクリーニングした。前記gag/polクローン中間体を、パッケージングシグナルに隣接する 5' LTR と 3' LTR の両方を含む MLV ベクター、選択可能なマーカー (ネオマイシン耐性等)、または機能的なMLV env配列も発現するマーカー遺伝子(エメラルドGFP等)で形質導入し、gag/pol パッケージング細胞株中間体が高力価MLVウイルス粒子を産生できることを確認することにより、前記クローンを機能力価の産生についてスクリーニングすることもできる。良好な力価のベクトルの生産能力を確認した後、MLV env配列を、該MLV env配列をコードするレンチウイルスベクターを用いて、安定な遺伝子導入または安定な形質導入により、選択されたgag/pol中間体に挿入する。該MLV配列が送達された後、gag/pol及びenvの両方を発現するパッケージング細胞株を希釈クローン化し、スクリーニングし、最も高いenv発現を同定し、また、ウイルス env 配列がない場合を除き、選択可能なマーカーまたはマーカー遺伝子を発現できる同様のMLVテストベクターを使用して、機能的な力価産生を確認するため、個々のクローンパッケージング細胞株の性能を評価する。HAL2パッケージング細胞株を産生するために使用される特定のMLV gag/pol及びenv構築物を以下にさらに説明する。
MoMLV由来のgag/pol構築物。前記HAL2パッケージング細胞株は、相同な組換え事象によって複製可能なウイルスを減少させるように設計されたHA-LB MLVパッケージング細胞株に使用されるように、元のMoMLV由来のgag/polプラスミドpSCV10を使用する(例えば、WIPO特許公開WO 91/06852及びWO 92/05266を参照。それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。HAIIパッケージング細胞株におけるgag/pol構築物もまた使用することができ、これは、レトロウイルスベクター及びenv発現構築物に対する配列相同性を低下させた。HAIIでは、gag/pol構築物発現カセットpCI-WGPMは、gagのコード領域の最初の約400 ntの縮重コードならびに全ての5'及び3'非翻訳配列の欠失を含む。また、pol遺伝子の最後の28個のアミノ酸をコードする配列が欠失され、切断されたインテグラーゼ遺伝子が得られる。プラスミドpCI-GPM及びpSCV10/5',3'trは、gagの5'領域が天然配列を含むことを除いて、pCI-WGPMと同じgag/pol cDNAを含む。
MoMLV由来のAmphoエンベロープ構築物。gag/pol及びレトロウイルスベクタープラスミドにおける配列重複を減少させるために、元の4070A由来の広宿主性発現プラスミドpCMVenvamDra (特許出願WO 91/06852)を用いて、2つのプラスミド、即ち、HA-LBパッケージング細胞株で使用されたように、env停止コドンの後に全ての3'非翻訳配列が欠失されたプラスミド(pCMVenvamDraLBGH)、または、HALLパッケージング細胞株で使用されたように、全ての3'及び5'非翻訳配列を欠失させたプラスミド(pCMV-β/envam)を産生した。
pBA-9B-emdGFPmir233-3p4TXv2 MLVプラスミドベクターを使用して、非特異的または意図しない特定の細胞型におけるベクター発現低下のためにエメラルドGFP及びmiRNA配列をコードするMLVウイルス粒子を産生するための、HAL2からのベクター産生細胞株(VPCL)の生成
プラスミド構築物pBA-9B-emdGFPmir233-3p4TXv2(構築物7)は、細胞に特異的な非標的化ために改変されている。塩基性pBA-9B-emdGFP配列は、ベクターの安全性プロファイルを向上させ、意図しない細胞型での発現を防止するために、ベクター発現を細胞型に特異的に低減させる効果的な方法として、マイクロRNA (miR)標的配列もコードするように改変することができる。図5は、骨髄細胞、B細胞、及びNK細胞型における発現を阻害するために使用されるmiR標的配列の例を示す。
選択されたHAL2クローンパッケージング細胞株から、VSV-G偽型MLVベクター粒子を用いた単一または複数の形質導入の連続ラウンドを使用したm.o.t.'sが>20での高多重度の形質導入("m.o.t.")"高m.o.t."アプローチを用いて、レトロウイルス非クローンベクター産生細胞株及びその後の産生クローンを確立する。形質導入の多重度は、PCL非クローン細胞株の産生のためにPCL細胞あたりに使用される感染性ウイルス粒子の数と定義される。典型的には、形質導入の1日前に、PCL培養物を1×105個の細胞/ウェルで6ウェルプレート中に播種する。次いで、(4、5、6、7、または 8 μg/ml ポリブレンの存在下、それぞれ 0.1、0.5、5、25、及び125のm.o.t.に相当)適切な体積のベクター上清をPCLに加える。20～24時間後、該ベクター上清を2 mlの新鮮な培地で置換する。M.o.t.'sを増加させるために、同じ体積のベクター上清を用いて、2日目に該形質導入手順を繰り返すことができる。生産者プールをコンフルエンスまで増殖させ、24、48、及び72時間後に上清を毎日収集して、PCR形質導入力価を測定し、遺伝子発現の伝達を示す。選択された非クローンプールは、96ウェルプレートへの限定された希釈播種を用いてクローン化する。その結果、各ウェルあたり単一の細胞が得られる。クローンの個々のグループが増殖するにつれて、これらについて、数回の力価測定及び発現アッセイの転送によって分析する。持続可能に高力価で産生されるVPCLクローンを凍結保存し、安全性(無菌性、マイコプラズマ、複製可能なレトロウイルスならびにFDAの考慮すべき点及びガイダンスの刊行物に記載されている他のウイルス性不定因子)について試験されたワーキングストックの凍結品を調製する。個々のクローンから誘導されるウイルス粒子のゲノムウイルス配列は、適格な細胞バンクストック特性評価の一部として、ゲノムMLV配列の正確性を保証するためにも実施される。一旦適格すれば、適格された細胞バンクストックのバイアルをさらに増殖し、GMPに準拠してさらに試験して、GMPマスター及びワーキング細胞バンクストックを生産できる。パッケージング細胞株またはベクター生産細胞株のいずれかを産生するための一連の事象を図6に要約している。
実施例3
接着培養のための、複数のCorning CellSTACKs(登録商標）または試験規模での灌流供給細胞培養システムを使用する実験室規模としてのR&D研究のためのウイルス産生
以下の実施例は、小規模なR&D研究用のマウス白血病ウイルス(MuLV)を産生するために接着性ベクター生産者細胞株(VPCL)細胞を増殖させるための細胞培養ウイルスの産生方法を概説する。pBA-9B-emdGFPmir233-3p4TXv2構築物に基づく産生MuLVウイルスが例として使用されるが、該プロセスは、本開示に記載される全てのMLVウイルスベクターにも使用することができる。
本実施例では、親HT-1080細胞(ATCC CCL-121)から産生されたVPCLが記載されているが、該方法は、5%CO2と37℃の条件下で、HEK 293T、D17、またはCF2由来の細胞(それぞれCRL-1573、CCL-183、またはCRL-1430)から産生されたVPCLにも使用することができる。長期保存のために、VPCLは、液体窒素条件下で凍結保存され、10%DMSOと50～90%ウシ胎児血清を含む細胞培養増殖培地溶液で凍結された最大1.0x107個の細胞を含む抗凍結のプラスチックバイアルに保存される。解凍すると、細胞を最初にT-75フラスコに播種し、その後2つのT-175'に増殖させ、続いて以下の増殖培地で複数のT-175フラスコの中に培養することによって、細胞を増殖させる。
Figure 2023525720000008
コンフルエンスに達した後、細胞をTrpZean(登録商標)(Sigma)で収集し、標準的な細胞培養法を用いて同じ増殖培地で中和する。前記細胞を、DMEM完全培地中で約3.1×104個の生存細胞/cm2の播種密度で3つの10層CellSTACKs(登録商標)(Corning)に播種し、ウイルスを産生する。各CellSTACKは、1.1 Lの増殖培地を含む。該CellSTACKs(登録商標)を37℃と5%CO2でインキュベートする。
播種の約2日後、前記CellSTACKs(登録商標)培養物は、コンフルエンスに近づくか達する。コンフルエンスに達した後、各培養液の培地を、新鮮な培地交換後に収集された、産生されたウイルスを含む使用済み細胞培養培地を含む新鮮な培地と毎日交換する。あるいは、新鮮な培地の供給及びベクターの収集は、同じ容量(1.1 L)の新鮮な増殖培地で10～12時間毎に行うことができる。所望の容量が収集された後、精製のために収集された収集物をプールする。3つの収集物及びプールのウイルス力価を以下の表に列挙する。
Figure 2023525720000009
Corning CellCube(登録商標)灌流システムを用いた接着性VPCLの大規模なベクター生産
大量のベクターが必要とされる場合には、接着細胞培養拡張列を用いた大規模なレトロウイルスベクター産生は、繊維状ディスク、マイクロキャリアビーズ、またはiCellis(登録商標)システム(Pall Corporation、NY)のような固定床のようなシステムのような複数の頓用システムを用いて実施することができる。CellCube(登録商標)システムを播種するために、10%のγ-照射された規定のウシ胎児血清を配合したDMEMを用いて225 cm2の組織培養フラスコ中でVPCLの増殖を行う。細胞を、サブコンフルエンスになるまでに約3～4日間増殖させる。次いで、CellCube(登録商標)システムに接種するために必要な数の細胞に到達するために、表面積を4×10-層のCell Factory(Nalge Nunc International、IL)まで増加させながら、該細胞を漸進的に継代する。新鮮な培地灌流供給は、1日あたり4システムの体積の最大培地交換までのグルコースの消費量に基づいて制御される。CellCubeモジュールの数に応じた生産量は、最大約13～16日間で200～1000リットルである。代謝プロファイル及びPCR形質導入力価分析のために、代表的なバイオリアクターの試料を採取する。
実施例4
HT-1080 MuLVウイルスベクター生産者細胞株の、血清及び付着依存性から無血清懸濁培養への適応
簡単に述べると、HT-1080ベクター産生細胞株の適切な希釈クローンのスクリーニング及び同定の後に、無血清適応プロセスを実施する。該適応プロセスは、10 mlの前処置された5%血清を含む培地及び10 mlの選択された無血清培地を含む125 mLのシェーカーフラスコに約2x107個の細胞を播種することによって開始される。これにより、血清濃度が 2.5% 低下する。本実施例では、無血清培地は、Invitrogen Corp、Carlsbad、CAから入手されたフリースタイル293発現培地であるが、当業者であれば、同等または通常の無血清培地を使用することもできる。前記培養物を、温度とCO2ガスの両方が制御された組織培養インキュベーター内に配置された振盪台上に放置する。該振盪台を約80 RPMに設定する。また、該インキュベーターを37℃及び好ましい5%CO2の条件に設定する。3～7日毎に、懸濁液中にある細胞を収集することによって前記培養物を再供給し、10 mL の同じ初期馴化培地と約2.5%の血清レベルを維持する10 mLの新鮮な無血清培地を含む新しいシェーカーフラスコに再播種する。毎回の再供給時に、細胞増殖の確認に実施が必要な生存細胞カウントを行い、前記培養物を検査する。前記細胞が細胞の倍増またはグルコース消費に基づく増殖の証拠を示す場合、次に条件培地及び新鮮な無血清培地の体積量を調節することにより、1.67%の血清濃度を目標とする。前記細胞を再度検査し、3～7日毎に再供給する。前記細胞が増殖の証拠を示す場合、条件培地及び新鮮な無血清培地の体積量を再度調節することにより、1.25%の血清濃度を目標とする。前記細胞が100%の無血清状態になるまで、後続の血清条件が1.0%、0.9%、0.83%の血清条件となることを目標に、該プロセスを継続する。該適応プロセスの間、約0.5～1.0x106個の細胞/mLの最小生存培養を目標として、1,000 mLの振盪フラスコ中に細胞培養物を約200 mlの容量に増殖させる。前記細胞が100%無血清状態に達すると、無血清条件下で該細胞を連続的に継代し、より重い凝集細胞を撹拌せずに短時間沈降させることにより、単一の浮遊細胞を分離する。前記培養物が一貫して単一の細胞懸濁液の約 95%の集団で構成されると、標準的な哺乳動物細胞凍結条件を用いて、10%DMSO及び90%無血清培地からなる凍結保存培地中に該培養物を凍結できる。
所要材料：
・フリースタイル293発現培地、Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA
・125-mL及び1000-mLの通気された振盪フラスコ
・DMSO、ISP (Cryoserv、Bionche Pharma USA、Lake Forest、IL)
実施例5
生産者細胞株の、懸濁培養及び試験的/前臨床規模での産生のための、ロッキングバッグバイオリアクターシステムにおけるウイルス産生への適応。細胞増殖は、VPCL接着性クローンを無血清懸濁液VPCLに適応させるための前記プロセスで、フラスコごとに所定量の細胞培養培地を含む一連のシェーカーフラスコ：125-mL(20 mL培養液)；250-mL(40 mL)；500-mL(100 mL)；及び1-L(200 mL)（全てCorningより）を用いて開始する。細胞増殖は、0.1%ヒト血清アルブミン(HAS、Octapharma社より入手、USA、NJ)を補充した完全に規定された無血清培地(フリースタイル293発現培地、Gilco カタログ番号12338)を用いて実施する。37℃と5%CO2で、振盪速度約80 rpmで前記培養物をインキュベートする。5つの1-L振盪フラスコ培養を用いて、10 Lのワーキング容積を有する20-LのCellbagを含むWAVEバイオリアクター(WAVE 20/50 EHT、Cytica Healthcare Life Sciences/GE Healthcare、MA)を接種する。該バイオリアクターにおける初期細胞密度は、37℃で約4×105個の生存細胞/mL (生存率91%)である。初期操作条件は、5%CO2、ロッカー速度15 rpm、角度6°、空気流量0.2 L/分である。pH制御は約7.2に、DO制御は約40%に設定する。pH及びDO制御の両方は、WAVE POD制御システムによって実施される。
細胞密度が約1×106個の生存細胞/mlに達した後、中空繊維(部品番号CFP-6D-6A)カートリッジ(Cytica Healthcare Life Sciences/GE Healthcare、MA)を用いて、細胞灌流プロセスを開始させる。供給(及び通過)速度は、最初に約0.25体積/日に設定し、細胞密度に応じて約3.8体積/日まで徐々に増加させる。15日内にウイルスを含有する通過物の合計180 Lを収集する。約300 Lの収集された材料は、25 Lのワーキング容積を用いた50 LのWAVEバッグで収集することができる。前記180 L～300 Lの収集物中のウイルス力価は、5～8×106 TU/mLであり得る。
単回使用のバイオリアクター（SUB）灌流システムを使用した、大規模な懸濁適応VPCLのベクター産生。SUBバイオリアクターのスケールアップの例として、最小52 Lのワーキング量を有する100 L SUB(Thermo Fisher Scientific)システムを使用して、約900～1000 Lの清澄化されたベクターを産生する。WAVEバイオリアクターロッキングシステムの接種のために、細胞を前述したように増殖する。SUB接種後、前記WAVEと同様に、2～8℃に冷却された単回使用のミキサー（SUM）において新鮮な培地を連続的に供給し、清澄化された通過液を回収する（14～21日間）灌流プロセスで、前記細胞をより高い細胞密度に増殖させる。
培養物の灌流供給は、バイオリアクターが播種された後約3日で開始する。該細胞培養培地は、消泡剤B(Sigma-Aaldrich)のようなポリジメチルシロキサンに基づく低濃度の消泡剤を添加して、0.1%ヒト血清アルブミン(HSA)と共に使用する前に補充したGibcoフリースタイル293発現培地(Thermo Fisher Scientific)である。
SUBバイオリアクターシステムにおける灌流プロセスの間、懸濁細胞は細胞培養循環中に保持される。一方、ベクター生成物を含む細胞培養上清は、収集され、続いて、公称孔径 0.45 μmの中空糸カートリッジによる接線流精密濾過を行う。"通過物"または清澄化されたベクターの収集物は、2～8℃に制御されたジャケット付き頓用ミキサー(SUM)内で一回使用の収集バッグに回収される。細胞密度が3～5×106個の生存細胞/mLに達すると、収集物の収集は、5～9日間で開始する。収集プロセスは、11～17日間継続する。約900～1000 Lの清澄化されたベクター収集物が得られたときに、生産運転は終了する。該生産運転は、バイオリアクターを播種する時から約14～21日間かかる。
生産者細胞株の増殖及びベクターの製造プロセスを通じて、バイオリアクターの温度は、37℃に制御される。pHは、炭酸水素ナトリウムのコントローラ自動添加によって、7.20±0.15に制御される。また、溶存酸素は、バイオリアクター内へO2をスパージングすることにより、40%飽和設定点に制御される。CO2ガスの流量は、空気流量の5%に設定される。グルコース濃度は、供給速度の指標としてオンライン監視される。バイオリアクター中の細胞密度が約2.5×106個の生存細胞/mLに達するか、バイオリアクター中のグルコースのレベルが(初期値5 g/Lから)0.5 g/Lまで減少すると、新鮮な培地の灌流が開始される。細胞密度が時間と共に増加するにつれて、供給速度は増加する。供給速度の増加は、BioXpert W7ソフトウェア(Applikon Biotechnology)に基づいて、ユーザ固有の及び開発された自動化コードを利用したアップリケ制御装置を介して自動化される。新鮮な培地は、バイオリアクターに供給され、細胞密度が増加するにつれてバイオリアクター内の栄養素の消費が増加するため、グルコース及び栄養素の枯渇を補う。接線流中空糸カートリッジから回収された清澄化されたベクター収集物の速度は、培地の供給速度が増加するにつれて増加する。供給及び通過速度の両方の増加は、バイオリアクターからのライングルコース測定に基づいて自動化される。バイオリアクターの重量(容積)も、同じユーザ固有の自動化コードによって、供給速度と同時的に増加した後に、通過速度(バイオリアクターから取り出された容積)を調節することによって、前記システムで制御される。
実施例6
ウイルスの精製及び濃縮。精製されたウイルス調製物は、臨床用の医薬調製物として使用されるだけでなく、次にも必要である：(1)抗ウイルス抗体を検出するための精製捕捉された抗原としのELISAプレートのコーティング、及び(2)ELISAアッセイまたは他の免疫原性ウイルス検出方法のための陽性対照抗ウイルス抗体を産生するための、動物における精製された免疫原性抗原の使用。本開示のウイルスは、293T、MLV gag-polを発現する293細胞株(例えば、Burnsら、PNAS 90:8033-8037 1993 を参照)または HT1080細胞のいずれかの一過性遺伝子導入、またはベクター産生非クローン細胞株プールから、またはクローン化されたベクター産生細胞株からのいずれかにより、様々な様式で製造される。細胞株適応によって、培地は、血清または血清を含まないものであり得、そして、細胞は、接着細胞としてまたは懸濁液中で増殖させることができ、細胞培養上清をバッチ収集で収集するか、または灌流モードで収集し、2～8℃の冷蔵条件下で保存し得る。培養上清を収集し、4℃で2週間まで貯蔵する。該バルク収集物を、デッドエンド0.45ミクロンのフィルターカートリッジを通して濾過し、または、中空糸カートリッジまたはプレートを使用した接線流精密濾過及び大きな細胞破片を除去するために使用されるフレーム濾過システムを使用する。濾過後、2 mM MgCl2の存在下で2～5単位/mLのBenzonase(登録商標)(EMD Millipore、Damstadt Germany)で前記ベクターを処理し、最低温度4℃で15～30時間の範囲で一晩インキュベートして、細胞DNAを消化し(Shastryら、Hum Gene Ther., 15：221、2004)、その後、濃縮工程に供する。
前記濃縮工程は、接線流限外濾過または陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて行うことができる。限外濾過のために、ウイルスベクター材料の濃度は、再循環ループ内に大きなウイルス粒子を保持するように設計された500 MWカットオフ膜を使用して達成される。システムの消毒及び中和の後、処理後のベクター材料は、濃縮容器内で開始し、蠕動ポンプを通って、500 MW中空糸カートリッジを通って、次いで該濃縮容器に戻される再循環ループに濃縮される。一旦全ての空気が再循環システムから除去されると、通過液の出口は、開放されて濃縮工程を開始する。通過液の流れは、再循環速度の流量の約1/10に設定される。前記再循環速度は、中空糸カートリッジのサイズに依存するが、典型的には、ポンプ速度及び剪断速度がウイルスに損傷を与えない最大速度の約75%に設定される。通過液の廃棄物が収集されると、材料が所望の濃縮範囲に達するまで、他のベクター材料を該ループに添加する。通常では、力価が10～50倍増加し、対応して、容量が減少する。標的濃度が達成されると、製剤化用の緩衝液をダイアフィルタに使用し、緩衝液は、ベクターを目的のpH中性、等張 Tris 緩衝ショ糖溶液に交換する。次いで、この材料をフィルターで滅菌し、そのまま使用してもよく、さらなるクロマトグラフィー精製に供してもよい。研磨クロマトグラフィーは、(1)小さな分子量の荷電タンパク質をさらに除去できるCapto Core 400(Cytiva/GE Healthcare)のような多様式の樹脂の使用、または(2)緩衝液交換体として作用するS-500樹脂(Cytiva/GE Healthcare)のような標準サイズ排除クロマトグラフィーの使用、ならびに小さな分子量タンパク質を除去することのいずれかによって使用することができる。クロマトグラフィーの後、安定性を提供するために必要な賦形剤を用いて、前記ベクターを製剤化し、0.2 μフィルターで滅菌し、バイアル化し、マイナス65℃以下で凍結することができる。
限外濾過の代わりに、ベクター濃度は、AEXクロマトグラフィー(例えば、米国特許第5,972,643号；Rodriguezら、J. Gene Med., 9：233,2007; Sheridanら、Mol. Ther., 2：262-275、2000を参照)を使用して達成することもできる。ベンズアミダーゼで処理されたウイルス調製物を陰イオン交換カラムに負荷し、そしてウイルスを段階的NaCl勾配で溶出させる。ウイルスを含む画分は、PCRアッセイにより、またはA215、A280並びにA400により同定することができる。陽性画分を集めてプールする。続いて、プールされた調製物をサイズ排除カラム(SEC)に負荷して、塩分及び他の残存する低分子汚染物を除去し、ウイルスを SEC製剤化用緩衝液(90 mM NaCl、1%スクロース、HClでpHを7.2に調整した1%マンニトールからなる20 mM Trisベースの等張液)に調整する。製剤化用緩衝液を用いて不規則条件の下で前記SECを実行し、SECカラムからのウイルス画分を空隙容量から収集する。陽性に同定された画分をプールし、最終の1 mg/mLのヒト血清アルブミンに補充し、製剤予備湿潤滅菌0.2 μmフィルターを通して濾過し、分取し、マイナス65℃以下で凍結する。該工程に使用される全ての成分は、製造工程を備えた、臨床使用のために GMP 要件の下で実行できるUSP公定級の材料である。ウイルス調製物は、無菌性、マイコプラズマ及び内毒素等の標準試験に基づいて出荷され、純度と一貫性は、SDS PAGEゲル分析によって評価される。力価は、標的細胞中の統合ウイルスDNAのPCR定量により形質導入単位(TU)として測定される。最終製品は、lxl08～lx109 TU/mlの力価範囲を目標としている。
実施例7
麻疹H-CD8scFv及び切断された麻疹Fタンパク質分子の構築及び特徴付け
別の実施形態では、MLV-麻疹ハイブリッドベクターは、CD8陽性T細胞を標的とするために提供され、麻疹ヘマグルチン"H"構築物は、CD8発現細胞に特異的な単鎖抗体のキメラ配列をコードするように改変される。該設計において、キメラタンパク質を受容体結合配列でウイルスに固定するために使用されるHタンパク質細胞質尾部は、H受容体結合を破壊するために変異または欠失している。発現構築物HstalkscFvlhにおいて実証されているように、受容体結合はむしろ、リンカー配列を介して融合CD8標的scFv配列を使用して達成される。発現構築物HstalkscFvlhにおいて実証されているように、この及び他の受容体特異的scFv結合配列の代替重配列及び軽配列の方向を特定することによって、改良または代替標的化が達成される。該設計において、Edmonston B株の麻疹配列が使用されるが、麻疹ウイルスの他の株は、同等の改変のためにF及びHタンパク質を供与するために使用され得る。CD8細胞結合時のウイルス融合を達成するために、Pit2結合認識配列を含まない別個のキメラMLV env構築物を、EdB融合P DNA-4070テールを構築するために記載したように、麻疹"F"融合タンパク質に融合させる。このキメラ構築物は、広宿主性エンベロープの細胞質尾部を使用してウイルス粒子に結合される。別の設計では、テールレスFタンパク質を使用してウイルス粒子融合を達成することもできる。
実施例8
麻疹"F"融合タンパク質及びCD8陽性T細胞標的化のために修飾された"H"結合タンパク質を有するMoMLVハイブリッドエンベロープを使用した標的CD8エンベロープを有するPCL/VPCLの構築及び試験
CD8陽性T細胞を標的化できるMoMLVウイルス粒子を産生できるパッケージング細胞株を作製するために、実施例7に記載の麻疹H-CD8scFv及び切断された麻疹Fタンパク質構築物を、実施例2に記載のpCMVenvamDraLBGHまたはpCMV-β/envamエンベロープ構築物の代わりに使用して、パッケージング細胞株を製作する。簡単に説明すると、H-CD8scFvをコードするプラスミド構築物(構築物52、pCMVenvMFhlCD8DraLBGH)及び切断された麻疹Fタンパク質発現ベクター(構築物53、pCMVenvMtFDraLBGH)を、安定なプラスミド遺伝子導入により、特徴的なgag/polパッケージング細胞株中間体に逐次遺伝子導入する。先に示したように、当業者はまた、操作されたレンチウイルスベクターを使用して、gag/pol中間細胞株を標的化H-CD8scFv及び切断された麻疹F(mF)配列と安定的に形質導入することができる。一実施形態では、前記麻疹Fタンパク質ベクターは、まず、麻疹Fタンパク質も発現するgag/pol中間細胞株を産生するために送達される。これは、別のウイルス標的化電位を有するパッケージング細胞株を作製するために、ウイルスハイブリッドエンベロープ標的配列の添加を必要とする、別のgag/pol-mF中間細胞株を可能にする。この新規なgag/pol-Fタンパク質中間体を、ウエスタンブロット分析によりgag/pol及びmFタンパク質配列の両方の最も高い共発現についてスクリーニングしたクローンで連続的に希釈して希釈クローンを産生する。一旦、いくつかのクローンが安定な発現のために同定されると、選択マーカーを発現できる同様のMLV試験ベクター、ならびにウイルスパッケージング細胞株の性能を評価するためのウイルス標的化H-CD8scFv配列を細胞株に導入することにより、該クローンを機能的に試験することができる。力価分析を実施する際に、発現の伝達を試験するためのナイーブ試験細胞は、
TALL-104(ATCC CRL-11386)のようなCD8陽性細胞、Molt4(ATCC CRL-1582) である必要があり、またはPC-3(ATCC CRL-1435)またはHT0180(ATCC CCL-121)のようなCD8受容体を安定的に発現するように改変された接着細胞の上にある必要がある。クローンgag/pol-mF細胞株中間体が一旦同定されると、該細胞は、標的化H-CD8scFV発現ベクターで安定的に遺伝子導入または形質導入され得る。続いて、該標的化H-CD8scFVパッケージング細胞株を個々のクローンを全ての関連ウイルスタンパク質配列(gag/pol、mF及びH-CD8scFV)についてスクリーニングされた個々のクローンで連続的に希釈する。最も高い発現を有するクローンを、蛍光マーカー及び/または薬物選択可能な耐性マーカーを発現するMLV試験ベクターを導入して、ウイルス粒子のナイーブCD8陽性ティッタリング細胞への発現の伝達により安定な力価産生を評価することによって、機能的性能について再度試験する。
CD8標的化MLVパッケージング細胞株を用いたベクター産生細胞株(VPCL)の製作。上記のCD8標的化MLVパッケージング細胞株を用いてVPCLを産生するために、実施例2に示されたように、同一のMLVベクターpBA-9B-emdGFPmir233-3p4TXv2または代替のMLVベクター構築物を用いて、CD8標的PCLを安定的に遺伝子導入する。あるいは、該MLVベクター構築物を用いて、一時的に産生されたVSV-gまたは広宿主性由来のベクター粒子を産生し、CD8標的化MLVパッケージング細胞株を安定的に形質導入する。前記したように、レトロウイルスの非クローン性ベクター産生細胞株ならびにその後の産生クローンは、図6に参照される概要に従って確立する。しかし、本実施例では、gag/pol中間細胞株から産生されたVSV-G偽型MLVを使用するか、またはMLVベクターでHAL2細胞に一過的に遺伝子導入することにより両方向性ベクター生成粒子を使用する、単一または複数の連続バックラウンドの形質導入において使用される、同一のm.o.t.'sが>20での高い多重度の形質導入"高m.o.t."アプローチを使用して、CD8標的PCLをHAL2クローンパッケージング細胞株の代わりに使用する。典型的には、一過性形質導入の1日前に、PCL培養物を6ウェルプレート中に1×105個の細胞/ウェルで播種する。次いで、適切な量のベクター上清を(4～8 μg/mlポリブレンの存在下)PCLに加える。これは、0.1、0.5、5、25、及び125のm.o.t.'sに相当する。20～24時間後、該ベクター上清を2 mlの新鮮な培地で置換する。M.o.t.'sを増加させるために、2日目に同じ体積のベクター上清を用いて形質導入の操作を繰り返すことができる。生産者プールをコンフルエントに増殖させ、コンフルエンス後24、48、及び72 時間における日常培地再供給スケジュールを使用して上清を毎日収集し、CD8陽性細胞株をティッタリング細胞株として使用し、上記のようにPCR形質導入力価を測定し、及び/または遺伝子発現の伝達を評価する。96ウェルプレートに播種する限界希釈を使用して、選択された非クローンプールをクローン化し、ウェルあたり単一の細胞が得られる。これを、数回の力価測定、及び、個々のクローンが増殖するにつれて、発現アッセイの移行を使用して分析する。持続可能な高力価の産生を有するVPCLクローンを凍結保存して、冷凍のワーキングストックを調製する。これの安全性(無菌性、マイコプラズマ、複製可能なレトロウイルス、ならびに考慮すべき点に関するFDAの刊行物に記載されている他のウイルス性不定因子)について試験する。ゲノム MLV配列の正確性を確保するため、個々のクローンに由来するウイルス粒子のゲノムウイルス配列決定も適格な細胞バンクストックの特性評価の一環として実行すべきである。一旦適格すれば、適格された細胞バンクストックのバイアルをさらに増殖し、GMPに準拠してさらに試験して、最終的な臨床的生産のためにGMPマスター及びワーキング細胞バンクストックを生産できる。
実施例9
麻疹"F"融合タンパク質及びCD4陽性T細胞標的化のための"H"結合タンパク質を有するMoMLVハイブリッドエンベロープを使用いた標的CD 4エンベロープを有するPCL/VPCLの構築及び試験
CD4陽性T細胞を標的化できるMoMLVウイルス粒子を産生できるパッケージング細胞株を作製するために、実施例7に記載の麻疹H-CD4scFv及び切断された麻疹Fタンパク質構築物を、実施例2に記載のpCMVenvamDraLBGHまたはpCMV-β/envam エンベロープ構築物の代わりに使用して、該パッケージング細胞株を作製する。簡単に説明すると、プラスミド構築物H-CD4scFv及び切断された麻疹Fタンパク質発現ベクターは、安定なプラスミドの遺伝子導入により特徴付けられたgag/polパッケージング細胞株中間体に逐次遺伝子導入される。先に示したように、当業者はまた、操作されたレンチウイルスベクターを使用して、該gag/pol中間細胞株を標的化H-CD4scFV及び切断された麻疹F(mF)配列と安定的に形質導入することができる。一実施形態では、前記麻疹Fタンパク質ベクターを最初に送達して、麻疹Fタンパク質も発現する代替gag/pol中間体を作製する。これは、ウイルス標的配列の付加を必要とするgag/pol-mF中間細胞株が、別のウイルス標的化可能性のあるパッケージング細胞株を産生することを可能にする。該gag/pol-Fタンパク質細胞株中間体を連続的に希釈して、希釈クローンを産生し、これらのクローンを、ウエスタンブロット分析によりgag/pol及びmFタンパク質配列の両方の最も高い共発現についてスクリーニングした。いくつかのクローンが安定な発現のために一旦同定されると、該クローンは、ウイルスパッケージング細胞株の性能を評価するために、選択マーカー及びウイルス標的化H-CD4scFV配列を発現できる同様のMLV試験ベクターを細胞株に導入することによって、機能的に試験することができる。力価分析を実施する際に、発現の伝達を試験するためのナイーブ試験細胞は、CCRF-CEM (ATCC CCL-119)等のCD4陽性細胞；A301またはPC-3(ATCC CRL-1435)または HT0180(ATCC CCL-121)等でCD4受容体を安定して発現するように修飾された接着細胞である必要がある。クローンgag/pol-mF中間体が一旦同定されると、該細胞は、標的化H-CD4scFV発現ベクターで遺伝子導入または形質導入され得る。続いて、前記標的化H-CD4scFVパッケージング細胞株を、全ての関連ウイルスタンパク質配列についてスクリーニングされた個々のクローン（gag/pol、mF及びH-CD4scFV）で連続的に希釈する。全てのタンパク質の最高発現を有するクローンを、蛍光マーカー及び/または薬物選択可能な配列を発現するMLV試験ベクターを導入して、ナイーブCD4陽性試験細胞上でのウイルス粒子の発現の伝達により安定な力価産生を評価することによって、機能的性能について再度試験する。
CD4標的化MLVパッケージング細胞株を用いたベクター産生細胞株(VPCL)の製作。上記のCD4標的化MLVパッケージング細胞株を用いてVPCLを産生するために、実施例2に示すように、同一のMLVベクターpBA-9B-emdGFPmir233-3p4TXv2または別のMLVベクター構築物を用いて、CD4標的PCLを直接安定的に遺伝子導入する。あるいは、別の実施形態では、該MLVベクター構築物を用いて、一時的に産生されたVSV-gまたは両性由来のベクター粒子を産生し、CD4標的化MLVパッケージング細胞株を安定的に形質導入する。前述したように、レトロウイルスの非クローン性ベクター産生細胞株ならびにその後の産生クローンを、図6に参照される概要に従って確立する。しかし、本実施例では、gag/pol中間細胞株から産生されたVSV-G偽型MLVを使用するか、またはMLVベクターでHAL2細胞に一過的に遺伝子導入することにより広宿主性ベクター生成粒子を使用する、単一または複数の連続バックラウンドの形質導入において使用される、同一のm.o.t.'sが>20での高い多重度の形質導入"高m.o.t."アプローチを使用して、CD8標的PCLをHAL2クローンパッケージング細胞株の代わりに使用する。典型的には、一過性形質導入の1日前に、PCL培養物を6ウェルプレート中に1×105個の細胞/ウェルで播種する。次いで、適切な量のベクター上清を(4～8 μg/mlポリブレンの存在下) PCLに加える。これは、0.1、0.5、5、25、及び125のm.o.t.'sに相当する。20～24時間後、該ベクター上清を2 mlの新鮮な培地で置換する。M.o.t.'sを増加させるために、2日目に同じ体積のベクター上清を用いて形質導入の操作を繰り返すことができる。生産者プールをコンフルエンスに増殖させ、コンフルエンス後24、48、及び72 時間における日常培地再供給スケジュールを使用して上清を毎日収集し、CD8陽性細胞株を使用し、上記のようにPCR形質導入力価を測定し、及び/または遺伝子発現の伝達を評価する。96ウェルプレートに播種する限界希釈を使用して、選択された非クローンプールをクローン化し、ウェルあたり単一の細胞が得られる。これを、数回の力価測定、及び、個々のクローンが増殖するにつれて、発現アッセイの移行を使用して分析する。持続可能な高力価の産生を有するVPCLクローンを凍結保存して、冷凍のワーキングストックを調製する。これの安全性(無菌性、マイコプラズマ、複製可能なレトロウイルス、ならびに考慮すべき点に関するFDAの刊行物に記載されている他のウイルス性不定因子)について試験する。ゲノム MLV配列の正確性を確保するため、個々のクローンに由来するウイルス粒子のゲノムウイルス配列決定も適格な細胞バンクストックの特性評価の一環として実施する。一旦適格すれば、適格された細胞バンクストックのバイアルをさらに増殖し、GMPに準拠してさらに試験して、最終的な臨床的生産のためにGMPマスター及びワーキング細胞バンクストックを生産できる。
実施例10
腫瘍細胞におけるベクター発現(GFP)を防止するためのmiRNAによるBリンパ腫細胞の非標的化のin vivo試験
分化した細胞型は、miRNA、標的mRNAを分解することによって遺伝子発現の転写後調節因子として作用する小さな非コードRNAの独特なセットを発現する。特異的miRNA配列を非複製レトロウイルスの転写カーゴへ付加すると、レトロウイルスの細胞型が特異的に分解する。それにより、該レトロウイルスは、レトロウイルス形質導入及び発現が望ましくない細胞において効果的に遮断され得る。該アプローチの有効性を実証するために、HT-1080ヒト線維肉腫細胞を操作し、レントウイルスベクターを用いて正常に発現しないmiRNA R223-3pを過剰発現させた。次いで、これらの細胞をプラスミドpBA-9B-GFP (c45)及びpBA-9B-GFPmiR 223-3p4TX (c7)から作製されたGFPベクターで負荷した。その結果、miR223-3pを発現するHT-1080細胞中のGFP-miRT223-3pベクターからGFP発現がほぼ完全に遮断されたが、miR223-3p発現の有無にかかわらず、細胞で未修飾 GFPを使用して同等の良好なレベルのGFP発現が見られた。あまり操作されていない状況で該効果を示すために、単球細胞株U937は、miR223-3pを含むベクターからではなく、未修飾のベクターまたは無関係なmiRNA標的 (663A-T)を含むベクターからGFPを発現することが示された(図10)。これらの実験は、一致したマイクロRNAを発現する特定の細胞型におけるmiRT修飾ベクターを用いて遺伝子発現を遮断する能力を示している。該能力は、IRES CDモジュールをコードするベクターについても実証されており、キル-スイッチ遺伝子(IRES-キル-スイッチ、この場合シトシンデアミナーゼ)の構成がこのタイプの発現制御に等しく適用可能であることを示す。まとめると、これらのデータは、形質導入された細胞によって発現されるmiRNA配列を活用して、RNVペイロードの発現を消滅させることができることを裏付けている。
実施例11
リンパ腫の同系マウスモデルにおける直接投与により抗マウスCD19 CARをコードするRNVのin vivo治療効果
プラスミドpBA-9B-mCD19(1D3)-IRESyCD (c40)は、WO2020/142780に記載の抗マウスCD19(ID3)CARベクターをIRES-CDカセットでコードし、実施例2～6に記載の感染性ベクターを作製するために使用される。
Balb/cマウスにおける（ルシファー化された）A20リンパ腫株(Kueberuwa ら、J. Vis. Exp., (140), e58492, 2018)を用いて、マウス抗CD19 CAR RNV構築物、(mCD19-RNVCAR, mCD19 (1D3)-IRES yCD(v))、マウス抗CD19scFV 1D3、続いてマウスCDS膜貫通ドメイン、続いてマウス4-1BB細胞内ドメイン、続いてCD3i (構築物4)細胞内ドメインのin vivo感染の効力を評価した。簡単に述べると、A20リンパ腫細胞の移植の1日前、6～8週齢のBalb/cマウスに150 mg/kgのシクロホスファミドを腹膜(IP)に投与した。シクロホスファミドの前処理は、A20の頑強な腫瘍移植を可能にする。0日目に、A20 B細胞リンパ腫細胞をIV注射する(200 μL中1E5細胞)。A20移植の3日目から、該ベクターmCD19((1D3)-IRES yCD(v)を1日あたり1E8 TUの用量で4日間注射する。
mCD19 (1D3)-IRES yCD(v)処理は、A20リンパ腫細胞からの発光シグナルにより評価されるように、25日目の溶媒処置対照と比較して、A20腫瘍負荷を低下させた(図7を参照)。放射輝度数値の有意な減少もまた、視覚的に明らかである(図7Cを参照、検出可能な腫瘍生存率が4/10に比べて、6/10の処置群については明らかな生存の利点があり、対照群には検出可能な腫瘍のない動物はいない)。A20腫瘍量の減少は、mCD19-RNVCARベクターのIV投与がA20腫瘍増殖を阻害することを示している。mCD19 (1D3)-IRES yCD(v)のIV投与後に発生する腫瘍成長阻害のために、ベクターは、循環T細胞に入らなければならず、mCD19-CARは、それらのT細胞の表面上に発現されなければならず、次に、それらのT細胞は、播種された腫瘍の部位に戻らなければならず、そして最終的に、T細胞の表面にあるmCD19-CARは、A20腫瘍細胞のCD19と結合し、A20腫瘍細胞の死滅を活性化させなければならない。
実施例12
プロドラッグ活性化遺伝子の使用によるCAR-T細胞の非活性化
A. CD遺伝子+5-FC及びTK遺伝子+ガンシクロビルを有する感染細胞のin vitro死滅-図9と説明文を参照
B. プロドラッグフルシトシンを5-FUに変換し、急性サイトカイン放出症候群(CRS)を軽減し、in vitroでの長期間のB細胞欠失を緩和する酵母シトシンデアミナーゼ(CD)キルスイッチを使用したCAR-T細胞のin vitroでの失活
シトシンデアミナーゼ活性及び細胞を死滅させる能力を測定するためのin vitro及びin vivoアッセイは、米国特許公開第US20140178340A1及びUS9732326B2号に記載されている。該実施形態では、前記CDは、RNV形質導入されたCD19CAR陽性細胞を切除し、それによってCD19 CAR活性の治療を終了させるためのキルスイッチとして使用される。前記急性、CRS、及び長期間のB細胞形成不全は、例えば、構築物8及び11等のCD19 CARベクターに組み込まれた酵母CDキルスイッチを展開することによって軽減され得る。CD19CAR RNVで発現されるように操作されたシトシンデアミナーゼを有するポリペプチドの発現及び活性は、米国特許第9,732,326B2に記載のin vitroアッセイ及び酵母CD+構築物8)及びCD-ベクター(構築物14)で形質導入した細胞と比較した5-FC殺傷曲線により確認することができる。これらのデータは、CD+細胞の5FCに対する感度が、CD-細胞と比較して、ほぼ100倍増加していることを示している。
別の実施形態では、シトシンデアミナーゼを有するポリペプチドは、キルスイッチとして最適化されたチミジンキナーゼ(TKO)で置換される。チミジンキナーゼ活性及び細胞殺傷能力を測定するためのin vitro及びin vivoアッセイにおけるTKOの配列は、米国特許公開第US20150273029A1号に記載されている。シトシンデアミナーゼと同様に、追加の治療用遺伝子を含有するRNVに加えた場合、TKO を使用すると、ガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル (Valtrex(商標))等の一般的な抗ヘルペス薬や、RNV 形質導入細胞及び隣接細胞の細胞死をもたらす in situ でのリン酸化による他の類似体の活性化が可能になる。従って、抗ヘルペス薬と組み合わせた場合、CD19 CARベクターに組み込まれたTKOキルスイッチを展開することにより、急性CRSと長期のB細胞形成不全の両方を軽減できる。
ヒトにおけるCD19CAR治療の急性副作用は、CAR-T機能、サイトカイン放出症候群(CRS)によって産生されるある種のサイトカインのより高いレベルに関連する。該副作用は、長期入院につながる可能性があり、生命を脅かす可能性がある。応答を完全に排除することなく、CAR-T 細胞の数を減らすことによって、CAR-T 細胞機能によって媒介されるサイトカイン応答を減少させる能力は、安全性を高め、従来の CAR-T に関連する副作用を減らすことができる。CRSを減少させるキルスイッチの能力を評価するために、CD34+移植マウスをCD19CAR(v)またはCDCAR-yCD(v)でIV処置し、2日後に50～500 mg/kgの間の様々な濃度の5-フルシトシンを投与する。フルシトシンなしでは、約30%のマウスがCRS様症状を発現し、IL-6、IFN-g、GM-CSF、及びTNFaの血中サイトカイン濃度が上昇することを示す。上昇したサイトカインレベルを示すこれらのマウスはまた、PCR及びフローサイトメトリーによって、脾臓及び骨髄において強力なCD19CAR持続性を示す。高用量のフルシトシン(500 mg/kg)では、CD19CAR-yCD(v)で処置されたマウスのいずれも、末梢血サイトカインの上昇や脾臓及び骨髄でのCD19CARの持続性を示さず、一方、CD19CAR(v)で処置されたマウスでは、CRS様の症状を経験しているマウスの割合は変化していない。これは、サイトカイン上昇及びCRS様症状がCD19CARの存在と関連していることを示している。しかし、低用量のフルシトシン(50～150 mg/kg)では、CD19CAR-yCD(v)で処置されたマウスのいずれも、サイトカインの上昇やCRS 様症状を示さず、一方、CD19CAR(v)でのCRSの影響は30%のままである。CDCAR-yCD(v)で処置された動物では、検出可能なCD19CAR及び持続的なB 細胞形成不全が依然としてあり、これは、低用量のプロドラッグが、CAR及びCAR機能を排除することなく、CAR機能に関連するサイトカインレベルを低下させることができることを示唆している。低用量プロドラッグでサイトカイン応答を調整または調節する能力は、CDCAR-yCD(v)形質導入されたT細胞の機能を無効にすることなく、安全性を改善する可能性を開く。
C. TKOキルスイッチを使用したCAR-T細胞のin vivoでの不活性化は、長期的なB細胞形成不全の影響と急性サイトカイン放出症候群(CRS)を軽減させる。
別の実施形態では、酵母シトシンデアミナーゼ(yCD)は、CD19CAR発現RNV中のTKOと置換される。長期間のB細胞形成不全の効果、及びCAR-T活性に関連する急性のCRS効果は、CD19CARベクターに組み込まれたTKOキルスイッチを展開することによって軽減され得る。上記のように同様のin vivo試験を実施し、同様の結果を得た：低濃度のプロドラッグ(例えば、5～20 mg/kg ガンシクロビルIP、1日2 回)によるTKOキルスイッチの活性化は、CD19CAR を導入した T 細胞が持続して腫瘍細胞を殺すことを可能にしながら、CRSに関連する末梢サイトカインを減少させる。また、高用量のプロドラッグ(例えば、50 mg/kgのガンシクロビルIP、2回/日)によるTKOキルスイッチの活性化は、CAR形質導入細胞及びCAR形質導入細胞の活性、即ちB細胞枯渇を効果的に排除する。
実施例13A
CD19を標的とするキメラ抗原受容体も発現する非複製レトロウイルスベクターで発現されるIL-12p70のin vitro試験
ヒトIL-12p70をヒトCAR発現構築物へ単鎖構築物（構築物16；配列番号:3）として添加することは、CARの持続的かつ強力なT細胞活性を支持し、非CARで形質導入された免疫細胞の抗癌免疫活性を促進する。一次周辺T細胞またはT細胞株(例えば、EALL-104;Jurkat)は、ヒトCD19標的CARをコードする、 またはIL-12p70 導入遺伝子 (pBA9b-CD19CAR、構築物6または8、及びpBAb-CD19CAR-IL-12p70、構築物16)を様々なMOI(例えば、0.1、1、及び10)で共発現するCD19標的CARをコードするRNVで形質導入される。形質導入された細胞の試料のウエスタンブロットを実行し、CD19 CARの用量依存的発現を確認した。これにより、構築物16では、使用したMOIの増加に対応して、IL-12p70タンパク質レベルが増加する。RNV形質導入細胞を増殖モニタリング色素(例えば、細胞トレースバイオレット)で標識する。次いで、in vitro培養実験において、該細胞をCD19-発現細胞(例えば、NALM6+/-CD19発現；一次B細胞、またはCD19を組換え発現する改変細胞)と混合する。培養2、6、12、24、及び48時間の時点で、細胞を混合した細胞反応から採取した。例えば、Nalm6-CD19WT及びNalm6-CD19KO腫瘍細胞株を使用して、共培養上清を収集して、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及びフローサイトメトリーに基づくBiolegend’s Legendple（登録商標）アッセイを用いて、分泌されたサイトカインのレベルを測定する。初期化されたCAR-T細胞は、IL2、IFNg、TNF等のサイトカインを、Nalm6-CD19KO ではなく、Nalm6-CD19WTを含む培養上清にのみCAR特異的に分泌する。ELISAにより、IL-12p70がCD19CAR RNVによって共発現されたときに、MOI全体でインターフェロンγの産生が増加したことが確認される。インターフェロンγ産生における最大の差異は、より低いMOIで見られた。
前記試料のフローサイトメトリーを行って、T細胞増殖ならびに細胞殺傷を測定した。3つの構築物の全てで、MOIの増加に伴う細胞増殖の増加が用量依存的に観察された。また、IL-12p70がCD19CAR RNV によって共発現された場合の形質導入細胞は、CD19CAR のみの発現と比較して、同じ時間枠で発生した細胞分裂の数の増加を示した。同様の効果が細胞殺傷について観察され、細胞殺傷の増加は、GFPmiRTと同様の方法を使用したT細胞分裂に対応していた。
実施例13B
別の実施形態では、RNVを発現するCD19CARにおいて、IL12p70は、IL-2(構築物14；配列番号：5)で置換される。同様のin vitro試験を上記のように行って、同様の結果を得た。ウエスタンブロット及びELISAにより、IL-2が形質導入された細胞においてCD19 CARと共に発現されることが確認される。IL-2がRNV形質導入されたT細胞中のCD19 CARと一緒に共発現される場合、これらのT細胞は、活性(増殖)の増加、CD19(インターフェロンγ) による活性化によるサイトカイン分泌、及びアッセイにおける形質導入されたT細胞による CD19 発現細胞の死滅の増加を示す。
実施例13C
別の実施形態では、RNVを発現するCD19CARにおいて、IL12p70は、IL-242A(IL-2supmut、構築物13；配列番号:6)で置換される。同様のin vitro試験を上記のように行って、同様の結果を得た。ウエスタンブロット及びELISAにより、IL-2supmutが形質導入された細胞においてCD19 CARと共に発現されることが確認される。IL-2sumutがRNV形質導入されたT細胞中のCD19 CARと一緒に共発現される場合、これらのT細胞は、活性(増殖)の増加、CD19(インターフェロンγ) による活性化によるサイトカイン分泌、及びアッセイにおける形質導入されたT細胞による CD19 発現細胞の死滅の増加を示す。また、構築物6、8、13、または 14 で形質導入された Treg細胞 (初代またはMT-2細胞株) と 1:1で混合された T 細胞株を比較するin vitro 試験を行った。構築物6、8、及び14で形質導入された細胞は、Tregの活性化とIL-10の発現を示したが、IL-2supmutで形質導入されたものは、ベースラインに匹敵するレベルを示した。IL-2supmutの使用により、同じ培養でのTreg集団の活性の増強が排除されながら、CD19CAR+TH1 CD4+及びCD8+T 細胞の活性が増加することが確認された。
実施例13D
別の実施形態では、RNVを発現するCD19CARにおいて、IL12p70は、IL-7R-CPT(構築物15；配列番号:4)で置換される。インターロイキン-7受容体サブユニットα(IL7Ra)は、CD抗原CD127としても知られており、これは、I型サイトカイン受容体ファミリー及び4型サブファミリーに属する。IL7Ra/CD127は、ナイーブ及びメモリT細胞及び多くの他のものを含む種々の細胞タイプで発現される。IL7Raは、インターロイキン-2受容体サブユニットγ(IL2RG)とヘテロ二量体を形成し、IL-7シグナルを伝達する。しかし、IL7Raは、システイン及び/または非システイン突然変異を獲得して、ホモ二量体を形成することができる。これにより、リガンド(IL7)に依存しないシグナリング事象を導く。このリガンドに依存しないIL7Raホモ二量体(IL7-Ra-CPT)は、T細胞の継続した増殖及び長期持続性を裏付ける。同様のin vitro試験を上記のように行って、同様の結果を得た。ウエスタンブロット及びELISAにより、IL-7Ra-CPTが形質導入された細胞においてCD19 CARと共に発現されることが確認される。IL-7R-CPTがRNV形質導入されたT細胞中のCD19 CARと一緒に共発現される場合、上記のアッセイと同様に、これらのT細胞は、活性(増殖)の増加、CD19(インターフェロンγ) による活性化によるサイトカイン分泌、及びアッセイにおける形質導入されたT細胞による CD19 発現細胞の死滅の増加を示す。
実施例13E
別の実施形態では、RNVを発現するCD19CARにおいて、IL12p70は、IL-12(構築物16)またはIL-12p70に関連しないIL-12誘導体で置換される。同様のin vitro試験を上記のように行って、同様の結果を得た。ウエスタンブロット及びELISAにより、RNVで形質導入されたT細胞において、IL-12がCD19CARと共に発現されることが確認される。IL-12がRNV形質導入されたT細胞中のCD19 CARと一緒に共発現される場合、上記のアッセイと同様に、これらのT細胞は、活性(増殖)の増加、CD19(インターフェロンγ) による活性化によるサイトカイン分泌、及びアッセイにおける形質導入されたT細胞による CD19 発現細胞の死滅の増加を示す。
実施例13F
別の実施形態では、RNVを発現するCD19CARにおいて、IL12p70は、cJun(構築物12；配列番号：7)で置換される。c-Junの発現は、細胞増殖を支持し、一方、過剰発現はそれを加速する。T細胞の機能不全または消耗は、c-Jun レベルの低下と関連しており、その過剰発現は、Tエフェクター機能を回復させる一方で、継続的な細胞周期の進行と長期持続性を裏付ける。ウエスタンブロットにより、cJunが形質導入された細胞中のCD 19CARと共に発現されることが確認される。cJunがRNVで形質導入されたT細胞中のCD 19CARと一緒に共発現される場合、これらのT細胞は、上記のアッセイと同様に、これらのT細胞は、活性(増殖)及び生存率の増加、CD19(インターフェロンγ)による活性化によるサイトカイン分泌、及び形質導入されたT細胞によるCD19発現細胞の死滅の増加を示す。生存率の増加は、CD19陽性細胞との共培養後10日間まで時間経過を延長し、構築物6を使用してcJun 発現なしの結果と比較することによって測定される。
実施例13G
別の実施形態では、RNVを発現するCD19CARにおいて、IL12p70は、IL-15(構築物9または10)で置換される。IL-15は、CD8 T細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞の活性化、増殖、及び細胞溶解活性を刺激するサイトカインである。抗原の非存在下でメモリT細胞を維持する生存信号は、IL-15によって提供され、耐久性のあるCAR T応答を産生するのに有用であり得る。同様のin vitro試験を上記のように行って、同様の結果を得た。IL-15がRNVで形質導入されたT細胞中のCD19 CARと共に共発現される場合、これらのT細胞は、活性(増殖)の増加、CD19(IL2、IFNg、及びTNF) による活性化によるサイトカイン分泌、及び形質導入されたT細胞によるCD19発現細胞の死滅の増加を示す。さらなるin vitro試験は、IL-15発現が培養中の長期持続性メモリT細胞プールに寄与することを示している。
実施例13H
CD19を標的とするキメラ抗原受容体も発現する非複製レトロウイルスベクターで発現される逆配向転写IL-15のin vitro試験。RNV骨格(構築物9、配列番号：15)においてCD19 CAR遺伝子に対して反対方向に転写されるように操作されたIL-15遺伝子の添加により、CD19 CARと同じ方向で転写されたIL-15導入遺伝子(構築物10、配列番号:8)に対して、IL-15の発現が増加する(コンストラクト 10; 配列番号:8)。CAR発現構築物は、CARの持続性及び強力なT細胞活性を支持し、非CAR形質導入免疫細胞の抗癌免疫活性を促進する。一次末梢T細胞またはT細胞株(例えば、TALL-104；Jurkat)は、CD19標的CAR(pBA9b-CD19CAR)をコードする、または様々なMOI(例えば、0.1、1、及び10)でいずれかの方向(pBAb-CD19CAR-IL-15、構築物9または10)で IL-15導入遺伝子を共発現するCD19標的CARをコードするRNVで形質導入される。形質導入された細胞の試料のウエスタンブロットを実施し、構築物9のCD19 CARの用量依存的な発現、使用されるMOIの増加に対応するIL-15タンパク質レベルの増加、並びにCD19CAR導入遺伝子に対して逆方向を使用する場合の発現の増加を確認した。RNV形質導入細胞を増殖モニタリング色素(例えば、細胞トレースバイオレット)で標識する。次いで、in vitro培養実験において、該細胞をCD19発現細胞(例えば、NALM6；一次B細胞、または組換え的にCD19を発現する改変細胞)と混合する。培養の2、6、12、24、48時間の時点で、細胞を混合した細胞反応から採取する。ELISAにより、IL-12p70が、上記アッセイと同様に、CD19CAR RNVによって共発現されたときに、MOI全体でインターフェロンγの産生が増加したことが確認される。
実施例13I
他の実施形態では、他の免疫調節因子は、導入遺伝子発現の増加のために逆方向に転写されるように操作することができる。IL2、IL2supmut、IL12p70サイトカイン、IL-7Ra-CPT、及びcJunは、実施例13a～fに記載されているように、IL-15の代わりに使用することができる。
実施例13J
他の実施形態では、pBA-9B RNV骨格は、自己不活性化(SIN)LTR (構築物27、配列番号:18)で置換され得る。RNV LTRプロモーター活性が破壊されると、置換プロモーターが使用される。イントロン無しのEFlaまたはCMVプロモーターを用いて、pSIN-RNVから導入遺伝子を発現させることができる。本実施例では、ヒトまたはマウスCD19CARは、IRESまたは2A配列を依然としてコードして、キルスイッチ(例えば、酵母シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたはその変異体)(構築物27)を発現しながら、RNV内にコードされたEFlaプロモーターから発現される。さらに、追加の導入遺伝子は、前記キルスイッチの下流のCMVプロモーターから発現され得る。構築物27及び29において、IL-15サイトカインは、CMVプロモーターから発現される。該CMVプロモーター及びIL-15遺伝子は、CD19CAR(構築物9及び10)の転写方向に対して2つの方向に配置され得る。上記と同様の試験を用いて、これらの構築物中の全ての導入遺伝子の発現及び活性を特徴付ける。
実施例13K
他の実施形態では、pBA-9B RNV骨格は、自己不活化(SIN)レンチウイルス骨格(構築物28、配列番号：19)で置換され得る。CAR、IRES-キルスイッチ、免疫修飾因子、miRNA標的配列、shRNA、及びプロモーターを含む全ての設計された導入遺伝子を、本明細書に記載のように使用することができる。RNV配列(RNV LTR及びパッケージング配列を除く)に加えて、マーモット転写後調節要素を用いて、導入遺伝子の発現を増強する(Zuffereyら、“マーモット転写後調節要素は、レトロウイルスベクターによって送達された導入遺伝子の発現を増強させる”、Journal of Virology, 73((4)：2886-2892、1999)。導入遺伝子の発現及び活性を特徴付けるために、本明細書に記載されている同じin vitro及びin vivoアッセイは、この非複製性SINレンチウイルスベクターに使用される。
実施例13L
siRNA構築物。本開示の非複製レトロウイルスベクターを用いて、免疫細胞を含む細胞の活性を支配する重要な遺伝子の発現を遮断または低下させる、操作されたsiRNA、shRNAまたはmiRNAの発現を伴う免疫細胞の活性を調節することができる。このような標的には、PD-1のような遺伝子、T細胞活性を調節するための中心的なチェックポイント、及び抗癌活性を予防または減少させるための重要なタンパク質が含まれる。shRNA-PD-1発現及び転写物ノックダウン能力を測定するためのin vitro及びin vivoアッセイは、米国特許US20150273029A1に記載されている。MOI 10で構築物19ベクターに感染した一次T細胞中のPD-1の効率的なノックダウンを実証するために、感染後3日目に採取したT細胞から全RNAを抽出する。PD-1の遺伝子発現は、RNA polIIIプロモーター転写物を正規化のための内部制御として用いてqRT-PCRにより測定する。PD-1のナイーブ一次T細胞に対する相対発現レベルは、ΔΔc(t)法を用いて計算する。このデータでは、感染後3日目にPD-1が70%以上減少することが示される。感染細胞をIL-2の存在下で最長10日間培養し、PD-1の持続的なノックダウンが観察される。並行して、同様に形質導入された初代 T 細胞は、上記の方法と実験を使用して CD19CAR 活性について特徴付けられる。PD-1 shRNAがCD19CARと組み合わせて発現される場合、72時間にわたるxCELLigenceアッセイでは、CARに特異的な死滅の倍増及びCD19CAR単独に対するNalm6-CD19WT腫瘍細胞株の増殖阻害が示される。
実施例14
CD19を標的とするキメラ抗原受容体も発現する非複製レトロウイルスベクターで発現されるIL-12p70のin vitro試験
IL-12は、2つのサブユニット、IL-12A(p35)及びIL-12B(p40)から構成され、ヘテロ二量体活性サイトカインIL-12p70を作製する。IL-12p70は、抗原刺激に応答して、樹状細胞及びマクロファージを含む抗原提示細胞によって自然に産生される。IL-12p70は、NK及びT細胞のIFNg産生及び細胞毒性エフェクター機能を増強し、CD4 T細胞及びADCC活性におけるThl表現型を促進し、樹状細胞及びマクロファージの化学誘引剤として作用する炎症性サイトカインである。これらのIL-12活性は、一緒になって宿主抗腫瘍活性を刺激することができる。IL-12p70をCAR発現構築物へ単鎖構築物(構築物16)として添加することは、CARの持続性及び強力なT細胞活性を支持し、非CAR形質導入免疫細胞の抗癌免疫活性を促進する。
ルシフェル化 Nalm6 急性リンパ芽球性白血病細胞とヒトPBMCを静脈内移植した8週齢のNSG マウスに、組換えレトロウイルスベクター(pBA9b-CD19CAR、構築物6または8、及びpBAb-CD19CAR-IL-12p70、構築物16(ヒトCAR、IL12)[構築物41はマウスCD19CAR&IL12である]を静脈内注射することにより、CD19標的CARを発現する同じウイルスベクターから発現されるIL-12p70の機能的効果をin vivoで試験した。有効性評価(腫瘍量及び生存率)のための群あたり10匹の動物及び免疫評価(フローサイトメトリー)のための群あたり5匹の動物からなる各処置群に静脈内注射によって、各ベクターストックまたは溶媒対照の1E6-5E8 TUの用量を投与する。腫瘍量は、ルシフェラーゼ信号を定期的なイメージングにより、試験期間にわたって測定する。対照動物及び処置動物の生存率を評価する。結果では、CD19CARを発現するウイルスベクター(構築物6)による処置は、ルシフェラーゼ信号によって測定される腫瘍量を軽減し、ゼシグナルによって測定される腫瘍負荷を軽減し、対照動物と比較して生存を延長することが示される。CD19CAR-IL-12p70(構築物16)は、ルシフェラーゼ信号によって測定される腫瘍量を軽減し、対照動物及びCD19CAR(構築物6)処理動物と比較して生存率を延長し、ある場合には、検出可能な腫瘍が完全に存在しなくなる。フローサイトメトリー分析は、処置の開始直後にNalm6影響リンパ節で実施する。結果では、CD19CAR(構築物6)と比較して、CD19CAR-IL-12p70(構築物16)で処置した動物において、T細胞活性化及び脱顆粒が増強したことが示される。
免疫適格の、ルシフェリンA20 B細胞リンパ腫細胞を静脈内に移植した8週齢Balb/cマウスに、組換えレトロウイルスベクター(pBA9b-mCDl9CAR、構築物40(配列番号：16)及びpBAb-mCD19CAR-IL-12p70、構築物41；配列番号：13)を静脈内注射することにより、CD19標的CARを発現する同じウイルスベクターから発現されたIL-12p 70の機能的効果をin vivoで試験する。有効性評価(腫瘍量及び生存率)のための群あたり10匹の動物及び免疫評価(フローサイトメトリー)のための群あたり5匹の動物からなる各処置群に静脈内注射によって、各ベクターストックまたは溶媒対照の1E6-5E8 TUの用量を投与する。腫瘍量は、ルシフェラーゼ信号を定期的なイメージングにより、試験期間にわたって測定する。対照動物及び処置動物の生存率を評価する。結果では、mCD19CARを発現するウイルスベクター(構築物6)による処置は、ルシフェラーゼ信号によって測定される腫瘍量を軽減し、ゼシグナルによって測定される腫瘍負荷を軽減し、対照動物と比較して生存を延長することが示される。CD19CAR-IL-12p70(構築物41；配列番号：13)は、ルシフェラーゼ信号によって測定される腫瘍量を軽減し、対照動物と比較して生存を延長し、ある場合には、検出可能な腫瘍が完全に存在しなくなる。フローサイトメトリー分析は、処置の開始直後にA20患部リンパ節で実施する。結果では、mCD19CAR(構築物40)と比較して、mCD19CAR-IL-12p70(構築物41)で処置した動物において、T細胞活性化及び脱顆粒が増強したことが示される。さらに、検出可能な腫瘍を有しないmCD19CAR-IL-12p70処置動物は、他の処置なしに、A20細胞による再負荷に抵抗することができる。再負荷に対する耐性に関連する免疫記憶は、mCD19CAR-IL-12p70で形質導入されたT細胞の持続性と部分的に関連しているが、IL-12p70 発現によって媒介される炎症の増強及び抗原提示の活性化に関連する免疫学習にも関連している。免疫学習の寄与は、再負荷の前に、pBA9b-mCD19CAR及びpBAb-CD19CAR-IL-12p70ウイルスベクターの両方に存在するCDキルスイッチの活性化により、CAR発現細胞を死滅させることによって確認される。フルシトシンのIP投与に続いて、CD19CAR-IL-12p70を発現する細胞が完全に存在しないことを確認したところ、生存しているA20硬化動物は、A20再負荷に対して抵抗性であった。
実施例15
CD19を標的とするキメラ抗原受容体も発現する非複製レトロウイルスベクターで発現されるIL-2F42Aのin vitro試験
別の実施形態では、IL12p70は、ヒト及びマウスCD19CAR発現RNV構築物14及び42中のIL-2(構築物42；配列番号:14)でそれぞれ置換される。IL-2は、高度に炎症性であり、周囲に作用して、ナイーブT細胞のエフェクター及びメモリT細胞への分化を促進する。IL-2は、活性化されたCD4+及びCD8+ T細胞によって自然に産生される。IL-2は、いくつかのセッティングにおいて抗腫瘍活性を有することが示されているが、IL-2の全身投与は、重篤な副作用と関連している。IL-2野生型は、Treg細胞にも作用し、免疫応答を抑制する。Treg細胞に作用しないIL-2F42AのCAR発現構築物への添加は、CARの持続性及び強力なT細胞活性を支持し、非CARで形質導入された免疫細胞の抗癌免疫活性を促進する。また、特定のCARに対する高抗原密度の腫瘍部位へのCAR発現T細胞の自然なホーミング能力は、IL-2発現を主に腫瘍内に制限する。
同様のin vivo試験を上記のように実施し、同様の結果を得た。結果では、CD19CARと比較して、CD19CAR-IL-2F42A(v)(構築物42)で処置したNalm6 担癌、PBMC移植NSGマウスにおいて、T細胞の活性化と脱顆粒の増強、及びT細胞数の増加が示される。A20腫瘍を有する免疫適格動物についての結果では、mCD19CARと比較して、mCD19CAR-IL-2F42Aで処置されたマウスにおいて、T細胞の活性化及び脱顆粒の増強、及びT細胞の増加が示される。mCD19CAR(v)のみまたは対照の処置動物ではなく、mCD19CAR-IL-2F42A(v)によるA20担癌免疫適格マウスの処置も、本明細書に記載の免疫学習と共に完全な治癒をもたらす。
実施例16
CD19を標的とするキメラ抗原受容体も発現する非複製レトロウイルスベクターで発現されるIL-15-IL-15Raのin vitro試験
別の実施形態では、ヒト及びマウスCD19CAR発現RNVにおいて、IL12p70は、IL-15-IL-15Ra(構築物49及び54)で置換される。IL-15は、主に樹状細胞、単球、及びマクロファージにより発現され、T細胞及びNK細胞の活性化、増殖及び生存を支持する。IL-15は、IL 15Ra受容体と複合体化した膜結合形態で存在する。この強力なシグナル伝達複合体は、IL-15Ra (IL-15-IL15Ra)の寿司ドメインに連結されたIL-15の単鎖発現により可溶性形態で再調節することができる。単鎖構築物としての分泌されたIL-15-IL-15RaのCAR発現構築物への添加は、CARの持続性及び強力なT細胞活性、CAR及び非CAR T細胞の長期間のメモリT細胞への分化、及び非CARで形質導入された免疫細胞の抗癌免疫活性を裏付ける。
同様のin vivo試験を上記のように実施し、同様の結果を得た。結果では、CD19CARと比較して、CD19CAR-IL-15-IL-15Ra(v)(構築物49)で処置したNalm6 担癌、PBMC移植NSGマウスにおいて、T細胞の活性化と脱顆粒の増強、及びT細胞数の増加が示される。A20腫瘍を有する免疫適格動物についての結果では、mCD19CARと比較して、mCD19CAR-IL-15-IL-15Ra(v)(構築物49)で処置されたマウスにおいて、T細胞の活性化及び脱顆粒の増強が示される。mCD19CAR(v)のみまたは対照の処置動物ではなく、mCD19CAR-IL-2F42A(v)によるA20担癌免疫適格マウスの処置も、本明細書に記載の免疫学習と共に完全な治癒をもたらす。
実施例17
CD19を標的とするキメラ抗原受容体も発現する非複製レトロウイルスベクターで発現されるインターロイキン-7受容体-a変異体のin vivo試験
別の実施形態では、CD19CAR発現RNVにおいて、IL12p70は、IL-7Ra-CPT(構築物15及び55-ヒト及びマウスCD19CAR)で置換される。インターロイキン-7受容体サブユニットα(IL7Ra)は、I型サイトカイン受容体ファミリー及び4型サブファミリーに属するCD抗原CD127としても知られている。IL7Ra/CD127は、ナイーブ及びメモリT細胞及びその他の多くを含む種々の細胞タイプで発現される。IL7Raは、IL7シグナルを伝達するために、インターロイキン-2受容体サブユニットγ(IL2RG)とヘテロ二量体を形成する。しかし、IL7Raは、システイン及び/または非システイン突然変異を獲得して、ホモ二量体を形成することができ、リガンド(IL7)に依存しないシグナリング事象を導く。このリガンドに依存しないIL7Raホモ二量体は、T細胞の継続した増殖及び長期持続性を裏付ける。CAR発現構築物への変異体IL7Ra構築物(構築物15)の添加は、in vivoで初期化されたT細胞の抗癌免疫活性を促進しながら、持続的な増殖、持続性及び効力を支持する。
同様のin vivo試験を上記のように実施し、同様の結果を得た。結果では、CD19CARと比較して、CD19CAR-IL-7Ra-CPT(構築物15)で処置したNalm6 担癌、PBMC移植NSGマウスにおいて、T細胞の活性化及び脱顆粒の増強、T細胞数の増加が示される。A20腫瘍を有する免疫適格動物についての結果では、mCD19CARと比較して、mCD19CAR-IL-7Ra-CPT(構築物55)で処置されたマウスにおいて、T細胞の活性化と脱顆粒の増強、及びT細胞の増加を示される。mCD19CAR(v)のみまたは対照の処置動物ではなく、mCD19CAR-IL-7Ra-CPT(v) によるA20担癌免疫適格マウスの処置も、本明細書に記載の免疫学習と共に完全な治癒をもたらす。
実施例18
CD19を標的とするキメラ抗原受容体も発現する非複製レトロウイルスベクターで発現されるc-Junのin vivo試験
別の実施形態では、ヒト及びマウスCD19CAR発現RNVにおいて、IL12p70は、c-Jun (構築物12、配列番号：7)で置換される。c-Junは、JUN遺伝子によってコードされるタンパク質である。c-Junは、c-Fosと組み合わせて、AP-1初期応答転写因子を形成するし。c-Jun転写は、それ自身の生成物によって自己調節されるので、細胞外刺激からのシグナルを延長する。c-Junの発現は、細胞増殖を裏付けるが、過剰発現はそれを加速させる。T細胞の機能不全または消耗は、継続した細胞周期の進行及び長期持続性を裏付けながら、c-Junレベルの低下及びTエフェクター機能回復の過剰発現に関連している。c-Jun構築物(構築物xx)をCAR発現構築物に添加すると、エフェクター機能、持続的な増殖、持続性及び効力が支持され、同時に、in vivoでの初期化されたT細胞の抗癌免疫活性、持続的な増殖、持続性、及び効力が促進され、in vivoで初期化されたT細胞の抗癌免疫活性が促進される。
同様のin vivo試験を上記のように実施し、同様の結果を得た。結果では、CD19CARと比較して、CD19CAR-c-Junで処置したNalm6担癌、PBMC移植NSGマウスにおいて、T細胞の活性化及び脱顆粒の増強、及びT細胞数の増加が示される。A20腫瘍を有する免疫適格動物についての結果では、mCD19CARと比較して、mCD19CAR-c-Junで処置されたマウスにおいて、T細胞の活性化及び脱顆粒の増強、及びT細胞の増加が示される。mCD19CAR(v)のみまたは対照の処置動物ではなく、mCD19CAR-c-Jun(v)によるA20担癌免疫適格マウスの処置も、本明細書に記載の免疫学習と共に完全な治癒をもたらす。
実施例19
CD19を標的とするキメラ抗原受容体も発現する非複製レトロウイルスベクターで発現されるチェックポイント阻害剤PD-1(shPD-1)に対する短いヘアピンRNAのin vivo試験
別の実施形態では、CD19CAR発現RNVにおいて、IL12p70は、チェックポイント阻害剤PD-1(構築物19；配列番号：9)に対して短いヘアピンRNAで置換される。PD-1は、活性化後のT細胞によって発現され、T細胞疲弊の指標である。PD-1は、T細胞の炎症活性を抑制し、T細胞のアポトーシスを促進する。T細胞の機能不全または疲弊は、PD-1活性を遮断することによって逆転することができる。治療用抗体を用いたPD-1チェックポイント遮断は、癌細胞のT細胞殺傷を裏付けることにより、ある種の癌指標において臨床的に有効であることが示されている。shPD-1(構築物19)をCAR発現構築物へ添加すると、生存、増殖及び癌細胞殺傷を含むCAR発現T細胞の持続活性が裏付けられる。
同様のin vivo試験を上記のように実施し、同様の結果を得た。結果では、CD19CARと比較して、CD19CAR-shPD-l(構築物19)で処置したNalm6担癌、PBMC移植NSGマウスにおいて、T細胞の活性化及び脱顆粒の増強、及びT細胞数の増加が示される。A20腫瘍を有する免疫適格動物についての結果では、mCD 19CAR(構築物40、配列番号:16)と比較して、mCD19CAR-shPD-l(構築物m-shPD-1)で処置されたマウスにおいて、T細胞の活性化及び脱顆粒の増強、及びT細胞の増加が示される。mCD19CAR(v)のみまたは対照の処置動物ではなく、mCD19CAR-shPD-l(v)によるA20担癌免疫適格マウスの処置も、上記と同様の免疫学習と共に完全な治癒をもたらす。
実施例20
BCMAは、他の場所では最小限しか発現されない成熟形質細胞マーカーであり、多発性骨髄腫の治療においてCAR認識標的として首尾よく使用されてきた(Kochenderfer JN.ら、N Engl J Med. 380(18)：1726-1732, 2019年5月2日)。抗BCMA CARは、CD19以外の抗原に対するin vivo CAR送達システの効力を示すために使用される。
自殺遺伝子と、B細胞及び単球のmiRNA標的の非標的化によるa-BCMA CARベクターの構築及びin vitro試験
前記ベクターの構造は、pBA-9b-BCMACAR1.FHVH33-CD8BBZ.miRT663A-223を製作するために、ヒト化VhのみのFHVH33-CD8BBZ(Lamら, Nature Communic., 2020)等の既知の抗BCMA CAR配列で置換された抗CD 19CARに関するものである。
対応するコドン最適化DNA核酸配列は、以下の通りである：
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCGGCAGCGGCGACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACATCAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGAGGGCACCGGCGCCAACAGCAGCCTGGCCGACTACAGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCTTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCGCCAAGCCCACCACCACCCCCGCCCCCAGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGGAACAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG;または(SID50) pBA-9b-BCMACAR2.SID50.miRT663A-223を製作するために、WO 2015/158671におけるCARペプチドに対応するコドン最適化DNA核酸配列
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCCCCGACTACTACATCAACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCTACTTCGCCAGCGGCAACAGCGAGTACAACCAGAAGTTCACCGGCAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCATCAACACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGCCTGTACGACTACGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCAGCATCAGCTGCTGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCAGCCAGAGCAGCATCTACCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGACCACCACCCCCGCCCCCAGACCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA;または(SID56) pBA-9b-BCMACAR3.SID 56.miRT663A-223 を作成するために、WO 2015/158671におけるCAR ペプチドに対応するコドン最適化DNA核酸配列
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCCCCGACTACTACATCAACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCTACTTCGCCAGCGGCAACAGCGAGTACAACCAGAAGTTCACCGGCAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCATCAACACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGCCTGTACGACTACGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCAGCATCAGCTGCTGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCAGCCAGAGCAGCATCTACCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGACCACCACCCCCGCCCCCAGACCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA.
得られたプラスミドを用いて、対応する感染性RNV調製物を産生する。以下に記載するように、感染性ベクターを用いて、CARのin vitro及びin vivoでの活性を試験する。
in vitro試験
まず、本明細書に記載の適切なT細胞刺激によるPBMCの形質導入によって、CAR T細胞をin vitroで産生する。形質導入された細胞を特徴付けして、20～80%のT細胞形質導入をもたらす。次いで、これらの細胞をin vitro試験に使用する。
脱顆粒アッセイ(CD107aの動員)
T細胞を96ウェルプレート(40,000個の形質導入された細胞/ウェル)中で、BCMAタンパク質を発現するまたは発現しない等量の細胞と共にインキュベートする。共培養物を、X-Vivo（登録商標）-15培地(Lonza)の最終容量 100 μlにおいて37℃と5%CO2で6時間維持する。共培養の開始時に蛍光抗CD107a抗体(Miltenyi BiotecからのAPC 抱合体)を、1 μg/mlの抗CD49d(BD Pharmingen)、1 μg/mlの抗CD28(Miltenyi Biotec)、及び1xモネンシン溶液(eBioscience)とともに添加して、細胞刺激中にCD107a染色を行う。インキュベーションの6時間後、固定可能な生存度色素(eFluor 780、eBiosciencesから)及び蛍光色素抱合抗CD 8(PE抱合、Miltenyi Biotec)で細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析する。脱顆粒活性を、CD8+細胞のうちCD107a染色の平均蛍光強度シグナル(MFI)を測定することによって、CD8+/CD107a+細胞の%として測定する。脱顆粒アッセイは、PBMC/T細胞形質導入の少なくとも24時間後に実施する。
[00253]抗BCMA CAR T細胞は、BCMA(RPMI8226及びNCI-H929)を発現する癌細胞を発現するBCMAに対して活性である。一方、CARが無関係な標的(例えば、マウスCD19)に対するものであるCAR T細胞において、またはGFPで形質導入されたT細胞において、活性は検出されない。標的がBCMA陰性(K562細胞)である場合には、いずれのタイプの形質導入されたT細胞でもバックグラウンド活性は見られない。
実施例21
BCMA CARのin vivo試験
s.c.異種移植片を確立するために、雌のNOD-Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG；Jackson Laboratories)マウスに、0.2 mLの、E7 BCMA+RPMI-8226 MM腫瘍細胞を含む5E7細胞/ml懸濁液を皮下(s.c.)注射する。腫瘍移植の約10～15日目に、異種移植片を有するマウスに、0.2 mLの、E5～E8ヒトT細胞を含む細胞懸濁液を一回静脈内(i.v.)注射する。約18日目に、マウスにおける平均腫瘍体積が96+/-16 mm3になる際、かつ、ヒトT細胞の生着を確認した後に、マウスを10匹のマウス群にランダム化する。E3、E4、E5、E6、E7、E8、またはE9 TUのベクター用量で、CARをコードするベクターまたは対照ベクターを群にi.v.投与する。任意に、追加の陽性対照群に、4週間、週に2回で、l mg/kgのボルテゾミブ(Velcade)をi.v.投与する。マウスを腫瘍増殖について約100日まで監視する。対照群と比較して、腫瘍増殖阻害は、使用される用量及びベクター調製物に応じて、マウスの一部の群において観察され、他の群では観察されず、最も有効な用量及びベクターが特定される。
実施例22
BCMAを標的とし、IL-12p70を発現するキメラ抗原受容体を発現する非複製レトロウイルスベクターを含むCD8標的/偽型粒子のin vivo試験
CD8+ T細胞のin vivo形質導入のために、aBCMA-CAR及び単鎖IL12p70をコードする非複製性レトロウイルス粒子を、抗CD8a scFvを麻疹エンベロープタンパク質(構築物52、配列番号:20)に組み込むこと及びウイルスが"H"タンパク質ハイブリッドを介して"結合"すると、融合を引き起こす切断型麻疹Fタンパク質により、偽型化する。これにより、主にCD8+ T細胞の精巧な形質導入が可能になる。これは、腫瘍細胞、非CD8+免疫細胞、及び増殖性肝臓及び内皮細胞を含む他の増殖細胞型の潜在的な形質導入を回避する。標的化されていない細胞がベクター堆積のためのシンクにもはや作用しないので、CD8+細胞の効率的な標的化は、形質導入されたCD8+細胞の相対数も増加させる。
BCMA陽性腫瘍細胞株を皮下に移植し、ヒトPBMCを静脈内に移植した8週齢のNSGマウスに、広宿主性生産株及びハイブリッドエンベロープを有する生産株から作製された組換えレトロウイルスベクターBCMA-CAR-IL-12p70を静脈内注射し、BCMAを標的とし、IL-12p70を発現するキメラ抗原受容体を発現する非複製性レトロウイルスベクターを含有するCD8標的/偽型粒子の機能的効果をin vivoで試験する。有効性 (腫瘍体積) 評価のため、各ベクターストックまたは溶媒対照の1E6～5E8 TUの投与量を、１群あたり10匹の動物からなる各処置群に静脈内注射により投与する。試験期間にわたって腫瘍体積を測定する。結果では、BCMA-CAR-IL-12p70を発現するウイルスベクターによる処置が、対照の処置動物と比較して、腫瘍体積を減少させることが示される。CD8-PSMA-CAR-IL-12p70は、対照及び非標的PSMA-CAR-IL-12p70で処置された動物と比較して、腫瘍体積を減少させ、場合によって、測定可能な腫瘍が完全になくなることがある。組換えレトロウイルスベクターの静脈内注射の2日後の末梢血のフローサイトメトリー分析により、-CAR-IL-12p70形質導入がCD8+細胞に限定され、一方、非標的化BCMA-CAR-IL-12p70形質導入は、CD8+、CD4+、B細胞、及び単球を含む広い範囲の免疫細胞集団で検出可能であることが確認される。また、形質導入されたCD8+細胞の割合は、非標的ベクターと比較して、標的ベクターの方が高くなっている。
実施例23
miRNA発現レベルは、健康なドナーからのCD4+及びCD8+末梢血単核細胞に加えて、非ホジキンリンパ腫(DLBCLで表される)及び多発性骨髄腫患者からの一次生検から定量した。試料を全RNAについて抽出し、次いで、イルミナ小型 RNA配列ライブラリー構築を用いて、miRNA単離のために処理した。ライブラリーは、Illumina NextSeq配列決定を介して、1試料あたり約10,000,000回の読み取り、1回の末端読み取り、最小読み取り長1x75 bpを用いて、配列決定した。配列決定結果を処理し、Rで分析して、試料にわたるmiRNA発現を測定した。2つの方法、即ち、配列決定から得られたmiRNA発現プロファイルの微分及びランク付け分析で、標的miRNA及びそれらの対応する標的配列を同定した。
非ホジキンリンパ腫(NHL)miRNA候補の分析
表2及び3は、T細胞において十分に発現されないDLBCLにおいて発現されるmiRNAを計算及び同定するための2つの異なる方法(微分またはランク付け)の結果を示す。上位候補は、両方の表に強調表示している。表5は、両方の方法で同定された共通の標的を示している。
表3:微分発現法(R isoMirsパッケージを用いて計数データについての微分発現分析を実施した)
Figure 2023525720000010
表4：ランク百分位比較法(RPKMマトリックス表に基づいて細胞型で群分けされた全てのmiRNA発現をランク付けした)；2つの群について、各miRNAのRPKM発現値の中央値を、これらの値のlog2FCと共に以下の表に示す。
Figure 2023525720000011
表5：微分発現法及びランク付け比較法からの共通miRNA標的
Figure 2023525720000012
多発性骨髄腫(MM)miRNA候補の分析
表6及び7は、T細胞において十分に発現されないMMにおいて発現される上位miRNAを計算及び同定するための2つの異なる方法(微分またはランク付け)の結果を示す。上位候補は、両方の表に強調表示している。表6は、両方の方法で同定された共通の標的を示している。
表6: 微分発現法(R isoMirsパッケージを用いて計数データについての微分発現分析を実施した)
Figure 2023525720000013
表7: ランク百分位比較法(RPKMマトリックス表に基づいて細胞型で群分けされた全てのmiRNA発現をランク付けした)；2つの群について、各miRNAのRPKM発現値の中央値を、これらの値のlog2FCと共に以下の表に示す。
Figure 2023525720000014
表8: 微分発現法及びランク付け比較法からの共通miRNA標的
Figure 2023525720000015
図12は、対応する標的配列を遺伝子治療構築物に用いて、導入遺伝子の非特異的発現を減少させることができる理想的なmiRNA特性の例示的な箱ひげ図を示す。NHLとMMにおける強力なmiRNA候補には、癌における非特異的発現を減少させることが確認されたmiRNA hsa-miR-223-3p及びhsa-miR-143-3p との重複がある。RNVでコードされる候補miRNA及びmiRNA標的配列は、in vitroで生物学的活性を有することが確認された。例えば、図13は、RNAvベクター中にmiRNA標的配列を含む効果を示す。miR223-3pの標的配列をGFPベクターに挿入して、配列pBA-9B-GFPmiR223-3pB-4TX(構築物7；配列番号:2)を与え、感染性ベクターを作製するために使用される。miR223-3pは、単球または骨髄細胞においてのみ有意な濃度で産生されるマイクロRNAである。図13では、U937単球細胞株において、他の2つのベクターと比較して、GFPmiR223感染細胞株におけるGFP発現が100倍減少したことが示される。全ての3つのベクターは、HT-1080線維肉腫細胞または他の非単球細胞において同等の量のGFPを産生した。
実施例24
ヒトアデノシンデアミナーゼ(ADA)またはベクターをコードするレトロウイルスベクターの大規模ベクター生産のための広宿主性パッケージング及び生産者細胞株の作製及び安全性向上と高力価を考慮した臨床応用
プラスミド構築。
レトロウイルスベクター構築物。元のN2由来のレトロウイルスベクターpKT-1(特許出願WO 91/06852及びWO 92/05266)、及びその全ての安全性の修飾を図4A～Cに要約している。レトロウイルスベクターpCBβ-galは、pKT-1に由来し、β-ガラクトシダーゼ及びneor遺伝子をコードする。低減された相同性ベクターpBA-5bは、pKT-1に組み込まれたいくつかの安全性修飾の結果である。ベクター pKT-1は、gagの通常のATG開始部位の代わりに、修正ATTを既に含んでおり、拡張パッケージングシグナル(Ψ+)に2つの停止コドンを含むように修正されている。該ATTで改変された開始部位を停止コドンTAAに改変し、他のTGA停止コドンを21 nt下流に挿入した。5'LTRの上流、3'LTRの下流、及びポリプリン経路とenvの停止コドンとの間の全ての外来MLV由来のレトロウイルス配列を除去し、ベクターpBA-9bが産生される。
MoMLV由来のgag/pol構築物。元のMoMLV由来のgag/polプラスミドpSCV10 (特許出願WO 91/06852、WO 92/05266)に対する安全性修飾を行って、レトロウイルスベクター及びenv発現構築物に対する配列相同性を減少させた(図4B)。発現カセットpCI-WGPMは、gagのコード領域の約最初の400 ntの縮重コードならびに5'及び3'非翻訳配列の全ての欠失を含む。また、pol遺伝子の最後の28個のアミノ酸をコードする配列が、欠失され、切断されたインテグラーゼ遺伝子が得られる。プラスミドpCI-GPM及びpSCV10/5',3'tr.は、gagの5'領域が天然配列を含むことを除いて、pCI-WGPMと同じgag/pol cDNAを含む。
エンベロープ構築物。gag/pol及びレトロウイルスベクタープラスミドにおける配列重複を減少させるために、元の4070A由来の広宿主性発現プラスミドpCMVenvamDra(特許出願WO 91/06852)を用いて、env 停止コドンの後の全ての3'非翻訳配列が欠失された(pCMVenvamDraLBGH)、または全ての3'及び 5'非翻訳配列が欠失された(pCMV-β/envam)を有する2つのプラスミドを産生した(図4C)。異種性のレトロウイルスエンベロープ発現カセットpCMVxenoは、NZB9-1に由来し、広宿主性エンベロープ発現カセットpMLPenvamは、4070Aに由来する。
親細胞。ヒト腎臓293細胞(ATCC CRL 1573)、ヒト線維肉腫HT-1080細胞(ATCC CCL 121)、イヌ肉腫D-17細胞(ATCC CRL 8468)、及びこれらの親細胞由来のレトロウイルスパッケージング及び生産者細胞株を、10%gγ照射され、規定された胎児ウシ血清(FBS、Hyclone laboratories Inc., UT)、20 mM Hepes (Irvine Scientific、CA)、1X非必須アミノ酸、及び1 mMピルビン酸ナトリウムで補充したDMEM(Irvine Scientific、CA)の中に維持する。細胞株を製作する臨床ベクターを産生するために使用される親細胞株を、由来（即ち、アイソザイム分析及び核型分析）、発現されたレトロウイルス配列の欠如、及びマイコプラズマ、細菌、真菌、及びウイルスを含む外来病原体に関するFDAガイドラインに従って、保管し、試験する。
VSV-G偽型上清の製造。濃縮VSV-G(小胞性口内炎ウイルス糖タンパク質)偽型ベクター上清(G-上清)の大規模産生を、Yeeらに概説されているように、いくつかのマイナーな変更を加えて実施する。簡単に説明すると、HA-LBパッケージング細胞(表9)をT225フラスコに1×107個の細胞/フラスコで蒔く。12～20時間後、ProFectionキット(Promega Corp., WI)を用いて、プラスミドpMLP-GをコードするVSV-G及びそれぞれのレトロウイルスベクターで該細胞をCaPO4-遺伝子導入する。DNA沈殿物と6～8時間インキュベートした後、DNA懸濁液を除去し、新鮮な培地を添加する。12～20時間後、該上清を採取し、新鮮な培地を充てんする。4～5回繰り返して採取し、G-上清をプールし、濾過し(0.45 μm)、9000 g及び8℃で8～18時間遠心分離することにより濃縮した。ペレットを少量の新鮮な培地に再懸濁し、分取し、液体窒素下で凍結し、-70℃で保存する。次いで、該濃縮されたウイルス上清を、発現の伝達(TOE、下記参照)及びPCR力価分析により、力価について評価した後、生産者プール及びクローンの高いm.o.t.産生を実施する。
実施例25
MLVベースのパッケージング及び生産者細胞株の産生及び分析
パッケージング細胞株。PCLs DA、2A、HX、及び2Xの産生は、詳細に記載されている(特許番号WO 91/06852及びWO 92/05266号)、また、該手順は、PCL 2A-LB、HA-LB、HAII、DAII、及び DAwobの生成のためにさらに洗練された。
一般に、レトロウイルスgag/pol及びenv発現プラスミドを、フレオマイシンまたはメトトレキセートマーカープラスミドを用いてCaPO4媒介共遺伝子導入により細胞に順次導入し、続いて、2週間の適切な選択を行う。選択されたgag/pol中間体のプールをp30発現について分析した後、標準プロトコルに従って96ウェルプレートに希釈クローン化する。gag/pol中間体クローンを、ウエスタンブロット（J. Elderに提供されたポリクローナルヤギ抗 p30抗体）におけるp30発現、ならびに潜在力価について、広宿主性envプラス選択可能なマーカーをコードするレトロウイルスベクターで形質導入し、そして生成されたベクターを力価測定することによって分析する。最高の潜在力価を有するクローンを、レトロウイルスenv発現プラスミド及びマーカーで同時遺伝子導入し、遺伝子導入された細胞を選択し、希釈クローン化し、そして、PCLクローンをウエスタンブロット(ポリクローナルヤギ抗gp70抗体；Quality Biotech、MD)中のgp70発現及び潜在力価について分析する。潜在力価は、パッケージング能力の限界を試験するために、PCLに対するベクターの比率が高いPCLへのいくつかのレトロウイルスベクター構築物を使用した数回の形質導入で試験する。
表9: MLV ベースのパッケージング細胞株の特徴の概要
Figure 2023525720000016
注：n.d.未測定
a 力価値は、本開示に記載の、または示されていないデータからのVPCLプール及びクローン力価を表す。
b 以前、参考資料26、28、及び36に記載れたPCL
c 5つの別個のDAをベースしたレトロウイルスベクターの合計
d HAIIにベースしたヒト因子VIII VPCLを、Chiron Corp.社が主催した血友病Aの臨床試験に使用した。
実施例26
細胞特異的な標的化のための操作された広宿主性のenv
広宿主性のenvは、4070A env配列のプロリンに富む領域の改変によって操作することができる。図14に示されるように、GFP (env発現に沿って追跡するための報告マーカーとして)、またはウイルス形質導入をCD8+細胞に優先的に標的化するために使用されるscFV抗CD8配列(両方の向きで提示される)は、4070Aエンベロープ配列のプロリンに富む領域のL(ロイシン)コドン配列にクローン化される。
実施例27
CD34標的化
A. CD34+細胞への標的化を達成するために、単一の変化断片可変(scFv)モノクローナル抗体を用いた標的化、設計されたアンキリン反復タンパク質 (DARPins)、及び2つの別々の受容体エピトープを認識する二重特異性抗体 を達成するために、麻疹Hタンパク質を種々の標的化タンパク質足場部分と共に使用することができる。麻疹ウイルスに対する個体の既存の免疫を最小にするために、標的部分を操作するためのHタンパク質の典型的な位置は、Edmonston麻疹菌株のH-Noose-エピトープである。Hタンパク質がその天然受容体を認識するのを阻止するために、認識配列を破壊するように、点突然変異を操作する。CD34+造血幹細胞(HSC)を標的とするために、抗HPCA-1モノクローナル抗体を標的とするCD34は、抗HPCA-1抗体による刺激後に受容体媒介エンドサイトーシスがCD34+造血細胞で引き起こされるため、使用して麻疹Hタンパク質配列に組み入れるのに好ましいscFV部分である。麻疹融合(F)タンパク質の使用と一緒に抗HPCA-1 scFVを用いたキメラ麻疹Hタンパク質の使用は、標的化及びCD34+細胞へのMuLV偽型ウイルスベクターの融合を可能にするであろう。
B. シンドビスウイルスエンベロープタンパク質は、細胞侵入レベルでCD34+特異性を付与することにより、レンチウイルス及びMuLVベクターをCD34+細胞に偽型化及び標的化するためも使用することができる。プロテインAのZZドメインをシンドビスエンベロープに組み込め、そして、ベクター形質導入は、標的細胞の表面上の特定の抗原に結合する抗体結合によって達成される。E3タンパク質中のアミノ酸61～64の欠失及びE2タンパク質中のアミノ酸、K159A、E160A、及びSLKQ68-71AAAAの変異を含むいくつかの突然変異をシンドビスエンベロープ糖タンパク質中で産生し、シンドビスの自然の指向性を低下させる。その結果、高いベクター力価を維持しながら、そのバックグラウンドの感染性を低減させる。Elタンパク質中のアミノ酸226及び227のS及びGへの突然変異は、Elが標的膜中のコレステロールの不在下で融合を媒介することを可能にし、それによって、エンベロープ2.2として指定されたシンドビス偽型ベクターの指向性及び感染性の両方を増加させる。該2.2ベクターは、ヒト白血球抗原(HLA)クラス I、CD4、CD19、CD20、CD45、CD146、メラノーマ細胞のP糖タンパク質、及びヒト造血前駆細胞を標的とするために使用される、CD34、CD133、及びC-キットを含む前立腺幹細胞抗原を標的とすることに成功している。CD34+細胞を標的とする好ましい抗体は、抗HPCAl、クローンMy10である。しかし、標的化を増加させるために、抗HPCAlと抗C-キット+部分の両方を共に使用することを可能にする二重特異的な抗体の使用は、標的化を増強するであろう。
C. ニパキメラエンベロープ膜結合Gタンパク質及びFタンパク質変異体は、以下のいくつかの利点を持つ細胞特異的標的化に使用されている。(1)集団において既存の免疫を有しないことを示す。(2)より高いウイルス偽型力価を有する。(3)高い表面密度を有する。
実施例28
マウスまたはヒトCD19 CARレトロウイルスベクターをコードする生産者細胞株
安全性が改変されたpBA-9bレトロウイルスベクターも、抗CD3zキメラ抗原受容体(CAR)遺伝子配列を持つ4-1BB共刺激シグナルドメインに連結されたscFV mAB-ヒンジ-TMドメイン領域からなるその基本的な構築形態で、マウスまたはヒトのいずれかの抗CD19CARベクター構築物をコードするように同様に操作される(図15A～B)。
単一または複数の形質導入の連続ラウンドを使用したm.o.t.'sが>20での高多重度の形質導入"高m.o.t."アプローチを用いて、レトロウイルスの非クローン生産者プールならびにクローンをクローンPCLから確立する（図６で参照されるように）。形質導入の多重度は、VPCL非クローン性プールの産生のためにPCL細胞あたりに使用される感染性ウイルス粒子の数と定義される。
典型的には、形質導入の1日前に、PCL培養物を1×105細胞/ウェルで6ウェルプレート中に播種する。次いで、(8 μg/mlポリブレンの存在下、0.1、0.5、5、25、及び125のm.o.t.'sに対応する) 適切な体積のベクター上清をPCLに加える。20～24時間後、該ベクター上清を2 mlの新鮮な培地で置換する。M.o.t.'sを増加させるために、同じ体積のベクター上清を用いて、2日目に該形質導入手順を繰り返すことができる。生産者プールをコンフルエンスまで増殖させ、コンフルエンス後、24、48、及び72時間後に上清を毎日収集して、PCR力価を測定し、発現の伝達を示す。選択された非クローンプールは、96ウェルプレートへの限定された希釈播種を用いてクローン化する。その結果、各ウェルあたり単一の細胞が得られる。クローンの個々のグループが増殖するにつれて、これらについて、数回の力価測定及び発現アッセイの転送によって分析する。
実施例29
細胞特異的な非標的化のための、pBA-9b-CD19CAR配列の改変
ベクターの安全性プロファイルを増加させ、意図しない細胞型での発現を防止するために、塩基性pBA-9B-CD19 CAR配列は、ベクター発現を細胞型特異的に減少させる効果的な方法としてマイクロRNA(miR)標的配列もコードするように改変することができる。図16は、骨髄細胞、B細胞、及びNK細胞型における発現を阻害するために使用される例示的なmiR標的配列を示す。
実施例30
自己不活性化(SIN)ベクターpSIN-BA9bを産生するための、pBA-9Bの改変
レトロウイルスベクターの安全性を増加させるために、pBA-9bのSINバージョンを、LTR挿入突然変異誘発による癌遺伝子の活性化を排除するように操作することができる。図17は、複数のクローニング部位にクローン化されたhCD19 CAR遺伝子を有するpSIN-BA-9Bの例示的な設計を示す。
実施例31
レトロウイルスベクター調製物の重要特性の測定
A. PCRでコピー数定量による力価測定。ベクター試料のPCR力価分析を実施する。MLV特異的プライマー(5'-GCG-CCT-GCG-TCGGTA-CTA-G-3'(配列番号:26)、5'-GAC-TCA-GGT-CGG-GCC-ACA-A-3'(配列番号:27)、及びプローブ(5'-AGT-TCG-GAA-CAC-CCG-GCC-GC-3'(配列番号:28)を用いて80-bp産物を増幅する。該増幅反応は、50 μlの量で、200～400 μM dNTP、900 nMプライマー、及び100 nMプローブオリゴヌクレオチドを用いて実施される。得られた蛍光を検出し、形質導入単位/ml (TU/ml)として表されるプロベクターコピー数に基づいて力価を測定する。形質導入単位は、既知のコピー数標準と同等のゲノムあたりのプロベクターコピー数として定義され、ベクター統合単位の真の反映を表す。
B. 発現アッセイの転写及び力価測定。この一般的な力価測定アッセイは、形質導入の1日前に、ウェルあたり3×105個の細胞で6ウェルプレート(Corning Costar、NY)に播種したHT-1080標的細胞を利用する。形質導入する2時間前に、ポリブレン(8 μg/ml)を、ベクター上清の連続希釈で加える。20～24時間後、該上清を1～2 mlの新鮮な培地で置換する。細胞をさらに24～48時間増殖させた後、上清またはゲノムDNAを、遺伝子産物の発現の伝達(TOE力価)または存在するプロベクターコピーの数(PCR力価)についてアッセイする。
C. 発現力価測定のβ-ガラクトシダーゼ転移。2つの独立した方法でβ-gal TOE力価を測定する。第1方法は、標準的なプロトコルに従って、X-gal染色を用いた生化学的染色法である。第2手順は、ガラクト-光プラスキット(Tropix、Inc., MA)を利用した化学発光検出法である。
D. 複製可能なレトロウイルス(RCR)の検出。VPCLまたはベクター生成物中のRCRの有無を決定するために、それぞれ2つの手順を使用する。i)第1手順は、製造後のVPCLを試験した。これらの細胞を同数の複製許容細胞株M. dunni を含む培養液に播種する。vPCRを小規模(1×107個の細胞)のフラスコまたは大規模(1×108個の細胞)ローラーボトルに播種する。細胞を数代共培養し、最終的に収集する。細胞を含まない培養上清を、マーカーレスキューまたはPG4S+L-アッセイを用いて試験する。M.dunni細胞にハイブリッド マウス白血病ウイルスを感染させて産生した RCR 産生細胞株を、共培養手順の陽性対照として使用した。ナイーブ M. dunni細胞は、陰性対照として機能した。 (ii)第2手順は、ベクター調製物を直接試験する。未処理の生産収集物または精製されたバルク生成物を、ローラーボトルあたり100 mlの接種容量でM.dunni細胞に付加する。短い接種期間の後、150 mlの追加培地を培養物に添加し、そして、細胞を4～5回継代した後、培養上清の一部を収集し、濾過し、マーカーレスキューまたはPG4S+L-試験によりRCRについてアッセイする。最近のFDAガイダンス文書([www.]FDA.gov)によると、臨床的生産ロットからの300 mlの粗ベクターをRCRについてアッセイする。製品出荷に使用されるM.dunni増幅(大規模)及びPG4S +L-検出方法は、単一ユニットRCR検出に検証されている。
実施例32
複数の細胞工場を用いたウイルス産生
以下の実施例は、ウイルス産生のためにマウス白血病ウイルス(MuLV)を産生する接着性VPCL細胞を増殖させるのに必要な細胞培養法を概説する。MuLVウイルスの産生は、一例として使用されるが、該手順は、本開示に記載の全てのウイルスにも使用することができる。
本実施例では、親HT1080細胞(ATCC CCL-121)から産生されたVPCLが記載されているが、該方法は、37℃と5%CO2の好ましい条件下で、HEK 293T細胞(CRL-1573)、D-17(ATCC CCL-183)、及びCf2TH(ATCC CRL-1430)から産生されるVPCLにも使用することができる。長期保存のために、VPCLは、液体窒素条件下で凍結保存され、10%DMSOと50～90%ウシ胎児血清を含む細胞培養増殖培地溶液で凍結された最大1.0x107個の細胞を含む抗凍結のプラスチックバイアルに保存される。解凍すると、細胞を最初にT-75フラスコに播種し、その後2つのT-175'に播種し、続いて以下の増殖培地で10個のT-175フラスコに培養することによって、細胞を増殖させる。
Figure 2023525720000017
コンフルエンスに到達した後、細胞をTrpZean(登録商標)(Sigma)で収集し、標準的な細胞培養法を用いて同じ増殖培地で中和する。前記細胞を、前述したのと同じ培地中で、3.1×10^4個の生存細胞/cm2の好ましい播種密度で3つの10層細胞スタック(Corning)に播種し、ウイルスを産生する。各Cell Stackは、1.1 Lの増殖培地を含んでいた。該Cell Stackを37℃と5%CO2でインキュベートする。
播種の2日後、前記Cell Stack培養物は、コンフルエンスに近づくか達する。各培養物中の培地を新鮮な培地で置換する。2日後、生産されたウイルスを含む培地を収集し(収集物#1)、該培養物に同じ容量(1.1 L)の新鮮な培地を再供給した。10時間後、2回目の収集を行い(収集物#2)、細胞培養物に同じ容量(1.1 L)の新鮮な増殖培地を再供給した。2回目の収集の16時間後、3回目の収集を行う(収集物#3)。次いで、精製のために3回の収集物をプールする。3つの収集物及びプールのウイルス力価を以下の表に列挙する。
Figure 2023525720000018
実施例33
同じ技術で別の細胞株によるウイルス産生。実施例32に記載された同じ培養技術を用いて、ヒト細胞株HEK 293細胞(ATTC# CRL-1573)及びイヌ細胞株Cf2TH(ATCC# CRL-1430)またはD-17(ATCC# CCL-183)において、開示されたウイルスのいずれかを製造することができる。実施例32に記載されているように、3つの収集物を収集し、プールすることができる。Cf2TH細胞を用いた収集物プールにおけるウイルス力価は、4.9×10^6 TU/mLとすることができる。
実施例34
動員に導く、HSPC-微小環境相互作用の薬理学的阻害
骨髄内皮にわたる遊走、即ち経皮遊走は、前駆細胞動員の調節における重要な段階である。血液から骨髄へのHSPC指向の遊走と骨髄微小環境での保持を調節する中央機構には、網状ネスチン+間葉系幹細胞及び前駆細胞(MSPC) (Mendez-Ferrerら 2010)を含む間質細胞の異なるサブセット上に発現されるケモカインCXCL12(ストロマ細胞由来因子-1(SDF1)としても知られている) (Nagasawaら 1996；Oberlinら 1996)によるHSPC上のCXCR4受容体の活性化、ヒト網状 CD146+ MSPC(Sacchettiら 2007)、及び血管周囲の網状レプチン受容体 + 細胞(Dingら 2012)が含まれる。
これらの細胞によって分泌され、細胞外マトリックスに吸着されるCXCL12は、CXCL12勾配及び骨髄微小環境へのHSPC接着を誘導する(Sugiyamaら 2006)。例えば、マウスにおけるCXCR4またはCXCL12の条件的な欠失による、CXCL12/CXCR4相互作用との干渉の結果、骨髄でのHSPCの保持が減少し、末梢血及び脾臓へのHSPCの遊走の数が劇的に増加した(Tzengら 2011)。CXCL12(SDF1)自体は、細胞表面インテグリンVLA-4、VLA-5、及びLFA-1を活性化する(Peledら 2000)。堅い接着及び経内皮遊走につながるCXCL12(SDF-1)を有するCD34(+)細胞の活性化は、LFA-l/ICAM-1及びVLA-4/VCAM-1相互作用に依存し、さらに、CXCL12(SDF-1)による分極及び内皮の下にある細胞外マトリックスを介したCD34(+)/CXCR4(+)HSPCの血管外遊出は、VLA-4 と VLA-5 の両方に依存した(Peledら 2000)。さらに報告されているように、CXCL12(SDF1)はまた、接着分子CD44を活性化し、それによって固定化ヒアルロン酸に対するHSPC接着及びHSPCの骨髄へのホーミングを迅速かつ強力に刺激する。これは、抗CD44モノクローナル抗体または可溶性ヒアルロン酸により遮断され、ヒアルロニダーゼの静脈内注射後に有意に損なわれること可能性がある(Avigdorら 2004)。従って、CXCL12 (SDF1)/CXCR4相互作用の阻害は、複数のHSPC間質接着相互作用に対する下流効果を有する。
AMD3100(Plerixafor)は、最初に抗HIV薬として開発されたbiyclamクラスの合成有機分子である(De Clercq 2019)。CXCR4受容体を拮抗することにより、幹細胞を骨髄間質に結合させるCXCR4/CXCL12(SDF-1)相互作用と干渉することにより、AMD3100は種々の動物モデルにおいてHSPCを急速に動員することが見出された(Broxmeyerら 2005)。2008年に、AMD3100/Plerixafor(商品名Mozobil)は、非ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫の患者の採取及びその後の自家移植のためにHSPCを末梢血に動員させるために、G-CSFと併用することが米国で承認された。また、これは、G-CSFを介したHSPCの動員が十分な数の HSPCを誘導できない場合の支援策として使用される(De Clercq 2019)。AMD3100による急速な動員は、CXCL12レベルを調節するだけでなく、マトリックスメタロプロテアーゼ-9(MMP-9)及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)のようなプロテアーゼの活性化も誘導する(Darら 2011)。活性骨髄間質及び内皮細胞はまた、AMD3100による刺激時にCXCL12(SDF-1)を循環に分泌する役割を果たす(Darら 2011)。
さらに、AMD3100は、同様に CXCR4受容体を標的とし、KRH-1636や CX0714 等の幹細胞動員剤として潜在的に有用であり得る他の薬物化合物の研究のモデルとして機能する(De Clercq 2019)。T-140(4F-ベンゾイル-TN14003)は、マウスモデルでHSPCと赤芽球を動員し、G-CSFとの相乗効果を示す別のCXCR4 阻害剤である(Abrahamら 2007)。
α4β1及びα4β7インテグリン阻害剤Firategrastは、生後の造血微小環境におけるHSPC保持を破壊し、CXCR4阻害剤AMD3100と相乗的に相互作用することが示されている(Kimら 2016)。
α4β7インテグリンに対するヒト化モノクローナル抗体ベドリズマブは、入手可能であり、クローン病及び潰瘍性大腸炎の臨床試験、そして最近、同種異系HSPC移植後の移植片対宿主の疾病の予防のために試験されている(Chenら 2019)。HSPC放出の減少を伴う血漿中CXCL12レベルの減少が、ベドリズマブで治療したマウスで観察されている。
BOP(N-(ベンゼンスルホニル)-l-プロリル-L-O-(1-ピロリジニルカルボニル)チロシン)は、インテグリンα9β1/α4β1との標的干渉を引き起こす化学化合物である。該小分子拮抗薬の1回の投与は、HSPCを再構成する長期の多血統を急速に動員し、AMD3100に誘導されたHSPC動員も強化することが報告されている(Caoら 2016)。
Rac阻害剤：造血前駆細胞及びHSPCで発現する Rac small GTPase は、HSPC動員に複雑に関与していることが見出され、また、Rac活性(ただし、Cdc42 または RhoA 活性ではない) の特異的阻害剤の適用は、迅速なHSPC動員に使用され得る(Cancelasら 2005)。最近、Rac1活性化は、CXCL12/CXCR4 シグナル伝達を増強するヒトCXCR4の可逆的な立体構造上の変化につながることが示され、これらのシグナル伝達経路間の相互の掛け合い応答を示唆している(Zoughlamiら 2012)。
造血成長因子による動員
造血成長因子、特に顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF、フィルグラスチム、レノグラスチム)及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF、モルグラモスチム、サルグラモスチム)は、造血成長因子のみによる動員を使用して、ベースライン上で60倍までのレベルまで、HSPCを末梢血中に動員するのに有効であることが示されている(Petersら 1993；Gazitt 2002)。
このアプローチは、動員を前向きに計画することができ、関連する化学療法の罹患率なしで実行できる場合に有利である。また、患者は、自宅で動員のための造血成長因子の投与を受け、その後、外来でさらに遺伝子導入の治療を受けることが可能である。
G-CSF：内皮細胞は、骨髄中のG-CSFの感染誘導発現の主要な構成源であることが示されている(Boettcherら 2014)。従って、これらの信号は、HSPCの動員に関連するか、またはその一部である可能性が高い。なお、通過型電子顕微鏡による研究で示されるように、好中球は、骨髄中の類洞内皮バリアを透過処理する(Leeら 2009)。しかし、骨髄内皮バリアの破壊は、繰り返しのG-CSF刺激中に顕著であり、内皮細胞が、HSPC動員中にG-CSFの標的として機能することを示している(Szumilasら 2005)。
骨芽細胞において、SCF/c-キットリガンド、IL-7、及びVCAM-1、ならびにHSPC維持の逆調節因子として、オステオポンチンは、全て、G-CSF処置による動員の間、またはβ3アドレナリン受容体活性化の後に選択的に減少される(Mendez-Ferrer、Battista、及びFrenette 2010)。G-SCFは、β-副腎交感神経活性を刺激するので、これは、HSPC動員を誘導するシグナル伝達鎖の証拠を提供する。
さらに、G-CSF処置は、骨髄内の好中球の強力な増殖を誘導することが示され、そして、それらは、G-CSF投与後の動員の間に骨髄から出る最初の細胞である(DayとLink 2012)。G-CSF 受容体が好中球顆粒球に存在しない場合、外部刺激による 3つの古典的なタイプの HSPC 動員、即ちG-CSF、化学療法、及びケモカインは、全て破壊されるが、正常な造血にもかかわらずHSPCに存在しない場合はそうではない(Liu、Poursine-Laurent、及びLink 2000)。特に、G-CSF受容体は、FLT3Lに誘導された動員ではなく、シクロホスファミドまたはIL-8に誘導された動員に必要であることが示されている(Liu、Poursine-Laurent、及びLink 2000)。好中球顆粒球によって放出されたセリンプロテアーゼ及びメタロプロテイナーゼは、ストロマ微小環境細胞またはHSPCからVCAM-1、c-キット、SCF、及びCXCL12(SDF-1)を開裂することが示されており、好中球エラスターゼ、カテプシンG及びMMP-9を含む(Levesqueら 2002；Heissigら 2002)。これらのプロテアーゼは、G-CSF後の動員ステップ中、及びケモカインまたは化学療法での動員の間、好中球によって、最終ステップとして放出される。これにより、HSPC及び前駆細胞が循環に急速に流出する。顆粒球コロニー刺激因子受容体(G-CSFR)は、骨芽細胞の支持的役割を抑制し、CXCL12/CXCR4軸を破壊することにより、HSPCを血流に動員するように単球でシグナル伝達することも報告されている(Christopherら 2011)。
留意すべきこととして、糖尿病マウスは、骨髄中のHSPC保持が増加し、G-CSF上でのHSPC動員が低下していることを示す(Ferraroら 2011)。G-SCFによるCXCL12(SDF-1)の低下調節は、これらの動物には存在しない。この欠陥は、AMD3100の適用により救済することができ、HSPCの動員が造血系外の疾患によって影響され得ることを示す。HSPCにおいてc-Metシグナル伝達がないことは、骨髄から血液へのHSPC放出の強力な障害をもたらし、それによって、CXCR4の遮断は、G-CSFに誘導されたc-Met活性化及びHSPC動員を防止した(Tesioら 2011、Petitら 2002)。表皮成長因子は、G-CSFに誘導されたHSPC動員を阻害することも示す(Ryanら 2010)。
ミエロポエチン：インターロイキン-3(IL-3)及びG-CSF受容体の多機能刺激剤であるミエロポイエチン(MPO)も、正常な非ヒト霊長類における制御サイトカインと比較して、造血コロニー形成細胞(CFC)及びCD34+HSPCの効果的かつ効率的な動員者であることが報告されている(MacVittieら 1999)。
VEGF：増殖因子刺激前駆細胞は、大量のサイトカイン(例えば、血管内皮増殖因子、VEGF)を産生し、これは、内皮細胞に作用して、それらの増殖、運動性、通過性、及び窓形成を改変し得る。rhVEGF164またはヒスタミンの静脈内投与の15分以内に、血管漏出が増加し、また、血液中のHSC数が2～3倍増加した(Smith-Berdanら 2015)。VEGFまたはVEGF受容体の非存在下で造血が発達しなかったマウスモデルによって示されるように、VEGFは、造血前駆細胞の動員及びホーミングにも特異的に関与している可能性がある(Shalabyら 1995)。しかし、特にVEGFの投与した後に、AMD3100によるマウスの処置は、内皮前駆細胞及び間質前駆細胞の両方の動員をもたらしたが、HSPC動員は、抑制された(Pitchfordら 2009)。
SCF：c-キット等のサイトカイン受容体、サイトカインキット-リガンドの受容体(幹細胞因子、SCF)も、循環HSPC上で減少される。キット-リガンド(SCF)のような膜結合サイトカインは、骨髄間質及び内皮細胞上で発現されるので、c-キットは、接着分子としても作用し、前駆細胞動員及びホーミングにおいて役割を果たし得る。骨髄中のCXCL12(SDF-1)の減少は、SCF及びFLT3-lの投与時にも観察された(Christopherら 2009)。外膜網状細胞と同様に、骨芽細胞性細胞は、β-刺激剤を分泌し、CXCL12、VCAM-1、及びSCFの発現を減少させる(Katayamaら 2006；Mendez-Ferrer、Battista、及びFrenette 2010)。
補体因子：単球細胞は、補体カスケードを介して関与し、これは、放射線療法及び化学療法によって活性化され、それによって、アナフィラキシリンとして作用する補体因子C3(C3a、desArgC3a)及びC5(C5a及びdesArgC5a)切断断片を遊離させる(Ratajczakら 2013)。補体因子3(C3)ノックアウトマウスは、定常状態の条件下で、血液学的に正常であるが、野生型HSPCの照射または移植後の造血回復において有意な遅延を示す。また、C3補体因子は、CXCR4/CXCL12 軸に対するHSPCの応答性を高める(Ratajczakら 2013)。これは、HSPC動員における古典的な補体活性化経路の関与も示唆している。しかし、補体因子5(C5)-欠損マウスは、HSPC動員の障害を示した(Ratajczakら 2013)。
スフィンゴ脂質及びヌクレオチド：CXCL12(SDF-1)及びその受容体CXCR4に加えて、HSPCの遊走を誘導する多数の他の化学的誘引剤が知られている。これらには、Gタンパク質結合スフィンゴシン1-リン酸受容体1(S1P1)に結合するスフィンゴ脂質スフィンゴシン-l-ホスフェート(SIP)(Golanら 2012； Ratajczakら 2014) 及びセラミド-l-リン酸(C1P)(Ratajczakら 2014)が含まれる。さらに、アデノシン三リン酸(ATP)またはウリジン三リン酸(UTP)(Rossiら 2007)及び二価陽イオンCa2+及びその受容体(CaR)(Adams, 2006)、及びH+(Krewsonら 2020)のような細胞外ヌクレオチドは、内皮細胞等の幹細胞微小環境の特定の細胞だけでなく、HSPCの表面の接着分子を調節する。これらの分子の起源の細胞は、多くの場合、明確ではないが、それらの作用には、生着(移植後)、接着(定常状態下)、及び動員(誘導後)の媒介が含まれる。
SlP：SlP及び受容体S1P1は、HSPC定常状態の脱出及び骨髄からの動員を調節することが示唆されている。SlPは、成熟赤血球及び活性化血小板によって産生され、血液中おいて、大部分がアルブミン及び高密度リポタンパク質(HDL)に結合するマイクロモルSlPの濃縮をもたらす(Pappuら 2007；Liuら 2011)。低濃度のSlPのみが固体組織において検出可能であるため、HSPCの定常状態放出に重要な骨髄と血液との間の一定のSlP濃度勾配が示唆されている。このアイデアは、S1P1受容体の特異的阻害剤FTY720による阻害が、HSPCの血流中への定常状態の動員を減少させるという知見によって裏付けている(Golanら 2012；liuら 2011)。これに関連して、HSPCにおけるS1P1受容体の過剰発現は、SlPを介した遊走を増加させ、in vitro CXCL12(SDF-1)に誘導された遊走の有意な阻害による CXCR4 表面発現の減少と骨髄への HSPC ホーミング電位の低下をもたらした(Ryserら 2008)。また、G-CSFまたはAMD3100による動員中に、一過性のS1P血漿濃度の増加が観察される(Golanら 2012)。これは、おそらく補体カスケード及び膜攻撃複合体の活性化による溶血の増加が原因であり（Ratajczakら 2013；Ratajczakら 2014)、S1Pが動員中のHSPCの放出に関与することを示唆している(Golanら 2012)。増加したSlPの骨髄濃度は、骨髄ネスティン+MSCからのCXCL12(SDF-1)分泌を誘導し、HSPCの血液中への放出も減少させた(Golanら 2012)。
HSPC上で発現される第2 SlP受容体、S1PR3は、骨髄微小環境におけるHSPCの保持に関与することが示唆されている。S1PR3の阻害またはノックアウトは、HSPCの血液循環への動員をもたらし、それにより、S1PR3拮抗作用は、骨髄及び血漿CXCL12(SDF-1)濃度を抑制する(Ogleら 2017)。一方、S1PR3拮抗作用は、AMD3100に誘導された動員を増加させ、S1PR3とCXCR4経路との間の相乗作用を示す。
C1P：致死照射後、SlP及びC1Pのレベルは、骨髄微小環境において増加することが見られた；さらに、末梢循環HSPCは、循環中に存在する比較的高いレベルのSlP及びC1Pに暴露される。これらの機構の両方は、これらの生物活性脂質の潜在的なホーミング勾配に対する応答を減感することができる(Ratajczakら 2014)。
ATP及びUTP：5-ヌクレオチド三リン酸、特にATP及びUTPは、HSPCを含む造血細胞上での増殖、分化、細胞死、及び走化のP2ヌクレオチド受容体媒介性調節と関与する(Lemoliら 2004)。UTPは、組織損傷及び細胞死に起因して細胞外環境に迅速に放出される内因性危険信号を表すと考えられる。UTP及び他のヌクレオチドは、損傷した組織への白血球の遊走を誘導し、細胞増殖の誘導により組織回復を刺激し、また、抗炎症性経路を活性化することによって免疫応答の分解能を促進する(Di Vigilio、BoeynaemsとRobson 2009)。UTPを用いたHSPCの予備インキュベーションは、in vitroでのHSPCの、CXCR4に誘導された遊走を有意に改善したが、UTP自体は、ただHSPCの限界走化性遊走を誘導する(Rossiら 2007)。また、UTP単独またはCXCL12/SDF-1と組み合わせての前処理は、フィブロネクチンに対する細胞接着性を有意に増加させ、UTP前処理は、骨髄に対するヒトHSPCのホーミングを改善する(Rossiら 2007)。PBSC動員におけるUTPシグナル伝達の関与は、まだ解明されていない。百日咳毒素によるCXCL12-及びUTP依存性走化性の阻害は、Rhoグアノシン5’-トリホスファターゼ (GTPase) Rac2とそのエフェクターRho GTPase 活性化キナーゼ1及び2(ROCK1/2)が、UTP 制御/CXCL12依存性HSPC遊走に関与することを示唆している(Rossiら 2007)。
ウリジン二リン酸-グルコース：ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-glc)は、ストレスに応答して細胞外液に放出される。UDP-glcは、長期的に再増殖するHSPCを動員することが示されており、UDP-glcとG-CSF の同時投与により、G-CSF単独よりも大きいなHSPC 動員をもたらす(Kookら 2013)。競合的再増殖の実験では、UDP-glcとG-CSFで動員されたHSPCは、G-CSFのみで動員されたHSPCよりも良好に再増殖した。G-CSFと比較して、UDP-glcに動員されたHSPCは、よりリンパ様に偏った分化能を示し、UDP-glcがHSPCの機能的に異なるサブセットを動員することを示唆している(Kook ら 2013)。対照的に、阻害実験は、反応性酸素種(ROS)がUDP-glcに媒介されたHSPC動員の媒介物であることを示した。ROS阻害剤N-アセチル-L-システイン(NAC)の適用は、UDP-glcに誘導されたHSPC動員を有意に制限することができた。Kookらは、ROSが核因子カッパ Bリガンド(RANKL)発現の受容体活性化因子及びRANKL誘導性破骨細胞分化の増強を誘導し、HSPC動員につながる(Kookら 2013)。
Ca2+及びCaR：HSPCは、幹細胞微小環境におけるまたはそこからのHSPCの保持及び遊離に強く関与する7膜貫通架橋されたCaRを発現する。CaRを欠損した新生マウスは、骨髄における細胞性の低下及び原始HSPCの欠如を明らかにしたが、HSPCの数の増加は、循環系及び脾臓において見出された。CaR-/-マウスの胎児肝臓は、正常な増殖、分化、及び遊走の能力を有する正常な数のHSPCを有した。しかし、これらのHSPCは、コラーゲンIへの接着欠陥を明らかにし、骨内膜性微小環境への欠損した寄託をもたらす(Adamsら2006)。一方、CaRの陽性アロステリックモジュレーターであるシナカルセトによるCaRの薬理学的活性化は、HSPCのコラーゲンI及びフィブロネクチンへの接着の増加、CXCL12（SDF-1）へのin vitro遊走の増加、及び骨内微小環境へのin vivoホーミング及び寄託の増加をもたらした(Lam、Cunningham、及びAdams 2011。Ca2+処理は、骨髄細胞のCXCR4の転写と発現、及びSDF-1を介したCXCR4内在化を増加させたが、一方、Ca2+流入阻害剤または抗体によるCaRの遮断は、Ca2+ 誘導性CXCR4 発現を阻害した。HSPC上のCa2+に誘導された変化は、CXCR4の発現増加によって部分的に調節されることを示す(Wuら 2009)。
CXCR4の膜脂質ラフトへの組み込みを促進する分子：カチオン性抗菌ペプチド(CAMP)、カテリシジンLL-37、β2-デフェンシン、及びC3aは、CXCL12 (SDF-1)のピコモルレベル(1～2 ng/ml)に対するHSPCの応答性を大幅に改善し、これは、組織中の生理学的CXCL12(SDF-1)濃度を反映し、HSPCにおけるこのクラスの分子の生物学的有意性を裏付けていることが見出された(Wuら 2012)。これらの分子は、CXCR4受容体の膜脂質ラフトへの取り込みを改善する(Ratajczakら 2013)。膜脂質ラフト内では、HSPCの微小環境への配置、または遮断された場合の動員に重要であることが知られている、小さなグアニンヌクレオチドトリホスファターゼ（GTPase）Rac-1及びRac-2等のいくつかの細胞シグナル伝達分子が組み立てられている(Cancelasら 2005)。脂質ラフトにおけるCXCR4及びRac-1の共局在化は、Rac-1のGTP結合及び活性化を改善し得る。
カテリシジンll-37は、骨髄間質細胞によって発現される抗菌ペプチドであり、骨髄照射後に増加される。LL-37は、HSPCの走化性遊走及び接着性を増強させ、移植前のll-37によるHSPCの短時間予備インキュベーションは、マウスにおける血小板及び好中球カウントの回復を促進することが示された(Wuら 2012)。動員対するその効果は、まだ測定されていない。
プロスタグランジンE2：マウス及びヒトHSPCは、プロスタグランジンE2(PGE2)受容体を発現する。マウス移植実験では、PGE2への短期間のex vivo暴露は、HSPCのホーミング及び増殖を増強し、原始的な長期間再増殖性細胞の数を増加させる。これは、PGE2がHSPCの自己再生を支持することを示している(Northら 2007；Hoggattら 2009)。対照的に、コロニー形成単位-顆粒球マクロファージマクロファージ(CFU-GM)及びマクロファージ(CFU-M)に至る未成熟骨髄前駆細胞の分化は、PGE2によって抑制される(Pelusら 1979)。これは、PGE2による造血の差動的な調節を示唆している。インドメタシン、アスピリン、イブプロフェン、メロキシカム等の非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)によるPGE2産生の遮断は、G-CSFに誘発されたHSPC動員を倍増させた。G-CSF+NSAIDに動員された移植片の移植は、移植後の造血のより速い再生に関連した(Hoggattら 2013)。骨髄微小環境におけるPEG2の有意性は、次の発見に裏付けられている：i)照射された骨髄間質細胞によるPGE2産生の増加、及びii)C1P及びS1Pによって誘導される、間質細胞におけるシクロオキシゲナーゼ2の発現の増加。これにより、C1P及びS1Pは、致死量の放射線を解放され、損傷を受けた骨髄細胞から放出される。これは、致死量の放射線によるHSPC移植のコンディショニングは、骨髄におけるPGE2産生を誘導することを示唆している(Ratajczakら 2014)。
PGE2処置は、細胞CXCR4 mRNAの濃度及びHSPC表面上のCXCR4の発現を増加させ、in vitroでSDF-1/CXCL12への遊走及びin vivoで骨髄にホーミングを促進させる。さらに、PGE2は、サバイビンの発現の増加と細胞内活性カスパーゼ-3の減少により、HSPCの生存を強化する(Hoggattら 2009)。HSPC保持及びHSPCの血液中への流出のPGE2媒介性の調節のために重要な別のメカニズムは、オステオポンチン発現の調節である。NSAIDによるPGE2合成の遮断は、幹細胞微小環境におけるHSPCの保持に関与するオステオポンチン発現の減少につながることが示唆されている(Hoggattら 2013)。また、オステオポンチンは、幹細胞プールのサイズの負の調節因子であり、オステオポンチンの減少または非存在は、原始HSPC数の増加と関連している(Stierら 2005)。従って、間質細胞によって発現されるオステオポンチンは、G-CSFのみに動員された移植片と比較して、G-CSFとNSAIDに動員された幹細胞移植片の優れた再増殖能及び長期移植に関連し得る(Hoggattら 2013)。
内因性ヒトCXCR4拮抗物質であるEPI-X4：EPI-X4は、ヒト血液濾液及び血漿から単離された16個のアミノ酸ペプチドであり、炎症過程の間に免疫細胞から放出されるアスパラギン酸プロテアーゼカテプシンD及びEにより酸性条件下でアルブミンから産生される(Zirafiら 2015)。好中球は、アルブミンからEPI-X4を産生することが示された(Zirafiら 2015)。骨髄中の好中球顆粒球は、高度にタンパク質分解性の環境をもたらすG-CSFとのHSPC動員の間に強力に活性化されるため、そして、アルブミンは、骨髄の細胞外空間全体に分配されるため、骨髄中のEPI-X4産生によるCXCR4/CXCL12(SDF-1)軸の調節は、マウスへのEPI-X4の腹腔内単回注射が、致死的に照射された宿主を移植したHSPCの顕著な動員を生じたという発想に関連する可能性である(Levequeら 2002)。
CXCR2作用物質の切断形態であるGROβ：CXCR4拮抗物質AMD3100と組み合わせて、ヒトCXCR2ケモカイン作用物質GROβのN末端4-アミノ酸切断型を利用した迅速な幹細胞動員レジメンが最近報告された(Hoggattら 2018)。両方の薬剤をマウスに単回注入した結果、G-CSFの標準的な多日レジメンと同等の大きさであった15分以内に幹細胞動員のピーキングが生じた。この急速な動員は、好中球における相乗的シグナル伝達から生じ、これによりMMP-9の放出が増強された。また、MMP-9の遺伝子多型がこのレジメンの活性を変えることができることが見出された(Hoggattら 2018)。以前に、ヒト以外の霊長類で、SB-251353 (Kingら 2001)または SK&F 107647(Kingら 2000)として様々に指定されるN末端切断型GROβ単独またはG-CSFとの組み合わせで、同様の結果は報告された(Kingら 2001)。
シルデナフィル：単球に依存する可能性のある、HSPC動員を調節する因子は、酸化窒素である。誘導性酸化窒素合成酵素(iNOS)-/-マウスにおける動員の試験では、iNOSが造血細胞遊走の負の調節因子であり、動員中、末梢血中へのHSPC流出を防止することが示された(Adamiakら 2017)。ホスホジエステラーゼ5型（PDE5）阻害剤であるシルデナフィルクエン酸塩（バイアグラ）は、血管の内側を覆う平滑筋細胞の環状GMPの分解を阻害する。これにより、血管拡張を引き起こす。この阻害は、即時的であり、薬物の経口投与後の2時間で活性がピークに到達する(Andersson 2018)。最近の研究では、CXCR4拮抗薬AMD3100 の単回注射と組み合わせたシルデナフィルクエン酸塩の単回経口投与の迅速な2 時間レジメンが、G-CSFの5日間標準ケアのレジメン(Filgrastim/Neupogen)に匹敵するレベルで効率的なHSC動員をもたらすことが見出された(Smith-Berdanら 2019)。
動員レジメンの選択は、HSPC表現型に影響を及ぼし得る。
抗原発現の分析では、動員されたCD34+細胞と定常状態のCD34+細胞との間に表現型の相違があり、化学療法を伴うまたは伴わない造血増殖因子を動員する選択は、CD34+細胞の収集亜集団に影響を及ぼし得ることが示された。従って、動員レジメンの選択は、動員されたHSPCからの特定の細胞系統の造血再構成に影響を与え得る。
シクロホスファミドで動員されたCD34+細胞は、低いCD19発現と低いCD71発現によって測定されるように、プレBリンパ球をほとんど有していない。これは、活性な増殖の欠如、及び異なる患者間の亜集団の発生率の変動を示唆する。
逆に、化学療法とG-CSFの両方を用いた動員は、異なる患者におけるCD 33及びCD71共発現の多様性、及び高いレベルのCD71発現を示す。
長期間の血小板回復は、その誘導される異質性CD34+細胞集団ではなく、移植された原始CD34+CD33-細胞の数によってより正確に予測されることを示唆する証拠が蓄積し始まっている。
初期のヒト前駆細胞の特徴であるCD38抗原(CD38-)の発現の欠如は、採用される動員レジメンによって影響され得る。G-CSFに動員されたPBPCは、化学療法+G-CSF(97%発現CD38)、化学療法+GM-CSF(96.4%発現CD38)、または高用量の化学療法のみ(99.1%発現CD38)により動員されたものよりも、著しく大きい割合の原始前駆細胞を含有する(CD38を発現する細胞の88%のみ)。
同様に、長期間の培養に惹起された細胞(LTCIC)の収集量の増加を予測し得る特定の動員レジメンが記載されている。
実施例35
動員のための化学療法剤レジメン
循環HSPCの数は、定常状態レベルと比較して、骨髄抑制の化学療法後の回復期間中に有意に増加することができる。
例えば、4 g/m2シクロホスファミドを単回投与すると、CFU-GM の数が最大 25 倍に増加することができる。
同様に、シクロホスファミドを用量4～7 g/m2で投与した後、3.62x106個の細胞/kg程度のCD34+細胞収量が得られる。
HSPCを動員するための安全かつ有効な方法として、高用量エトポシド(2 g/m2)も使用してもよい。
高用量シクロホスファミドとエトポシド(600 mg/m2)との組み合せは、個々の化学療法剤で達成されるものよりもCFU-GM及びCD34+細胞含有量において優れたHSPCの動員をもたらす。
動員されたコロニー形成細胞の数は、導入化学療法レジメンの第1サイクルに続いて最も高くなるようであり、その後のサイクル後に数が減少する。
しかし、これらの動員された細胞の分析では、第1サイクルよりも4回目の化学療法サイクル後のCD34+細胞の割合が高いことが示されている。
化学療法に誘発された動員は、有効な抗癌治療の投与における遅延を回避し、HSPC動員に加えてin vivoでのパージを可能にする場合がある。
実施例36
動員のための造血成長因子レジメン
G-CSF：G-CSF単独は、骨髄から末梢血中にHSPCを効果的に移動させることができる。
通常、フィルグラスチムは、用量10 μg/kg/日が十分であるが、一部の研究では、用量16 μg/kg/日が使用されている。
前駆細胞の循環数を増加させるためのG-CSFの容量は、Durhsenらによって最初に記載された。さらなる研究では、G-CSFが、種々の悪性疾患を有する患者において骨髄から末梢血に前駆細胞を動員することが示された。
Sheridanらは、17名の予後不良の非骨髄性悪性疾患を有する患者において、G-CSF(12 μg/kg/日、6日間)を単独で使用し、HSPCを動員することを調べた。平均合計33×104 CFU-GM/kgを収集した。同様に、G-CSF(10 μg/kg/日)は、34名のホジキン病またはNHLの患者のHSPCを適切に動員し、中央値で32.6×104個のCFU-GM細胞/kg及び2.8×106個のCD34+細胞/kgを採取できた。De Arribaらは、G-CSF単独(0.84±0.1 μg/kg/日)での動員後の10名の乳癌患者において、1 回目と 2 回目の白血球除去後に、それぞれ0.77×106個の CD34+細胞/kg及び1.42×106個のCD34+細胞/kgの平均収量を報告した。
G-CSF用量応答効果。動員用量応答効果は、健康な成人及び患者において明らかである。G-CSF用量を5 μg/kg/日から10 μg/kg/日に増加させると、末梢血のCD34+含有量がベースラインの17倍～28倍に増加した。
同様に、G-CSF用量を10 μg/kg/日から24 μg/kg/日まで増加させると、CD34+HSPC収量が有意に改善される(11.32×107/kg細胞対48.25×107/kg細胞)。
動員されたHSPCの特徴付けはまた、投与されたG-CSF用量サイズによって影響され得る。G-CSF用量を100から200 μg/m2に上げると、成熟度の低い前駆細胞(即ち、混合コロニー形成細胞、CD34+CD33-細胞、及びCD34+HLA-DR-細胞)の循環系への動員が増加し得る。
実例(G-CSF)：HSPC動員のための現在の推奨用量に基づいて、10 μg/kg/日のフィルグラスチムまたはレノグラスチムを新規動員として投与するか、化学療法(Amgen；Chugai Pharma UK Ltd/ Rhone-Poulenc Rorer)と組み合わせて投与する場合、5 g/kg/日のフィルグラスチムまたはレノグラスチムを少なくとも4日間投与する。ウイルスベクター点滴は、5日目に開始し、連続3日間継続することができる。
GM-CSF：GM-CSFか、HSPCの動員にも有効であり、癌患者に4～64 μg/kg/日の用量を最大 7 日間持続静脈内注入すると、末梢血中の HSPCが4～18 倍増加する。
HSPC動員は、GM-CSFのみを使用して達成することができるが、留意すべきこととして、前駆細胞動員のためにGM-CSFを使用することの実現可能性は確認されているが、G-CSF単独での動員よりも優れているという証拠はない。
Hohausらによる二重盲検では、ホジキン病が再発した 26 人の患者が化学療法を受け、無作為に割り付けられ、化学療法後1日目から、 G-CSF(5 μg/kg/日、N=12)または GM-CSF(5 μg/kg/日、N=14)のいずれかを受けた。CD34+細胞の収率の中央値に有意な差は、観察されなかった(G-CSF及びGM-CSFについて、それぞれ7.6×106対5.6×106 CD34+細胞/kg)。
Villevalらは、37名の患者を0.3～30 μg/kg/日の皮下注射または0.3～20 μg/kg/日の短い静脈内注射で治療した結果、血中GM-CFCのレベルが、4 ～5日間の治療後に有意に上昇し、さらに明らかな用量応答効果があったことが見出された。
GM-CSFによって動員されたHSPC集団のCFU-GM含量は、250 μg/m2の投与量で用量応答性であると思われ、125 μg/m2の投与量よりも優れた収量を生じる。
しかし、留意されたいこととして、G-CSF(5 μg/kg/日)またはGM-CSF(5 μg/kg/日)単独で4日間の投与は、ベースラインを越えるCFU-GMの収集量の劇的な増加(それぞれ35.6及び33.7倍)を生じたが、既に7日間のGM-CSF(5 μg/kg/日)を投与された患者にG-CSF(5 μg/kg/日)をさらに5日間投与すると、HSPCがベースラインの80 倍に増加した。
しかし、健常者では、G-CSF(5 μg/kg/日)とGM-CSF(5 μg/kg/日)との組み合わせによる動員は、G-CSF(10 μg/kg/日)単独(平均、101×106個のCD34+細胞/kg対119×106個のCD34+細胞/kg)による動員と比較した場合、収集量の有意な増加を生じなかった。
実施例37
化学療法プラス動員のための造血成長因子レジメン
化学療法ベースの動員レジメンに造血成長因子を導入する目的は、早期の抗癌治療を支持しながらHSPCの収率を高めることである。化学療法後の造血成長因子の添加は、化学療法のみと比較して、HSPC動員の数を有意に増加させる。
上記のように、動員レジメンに化学療法を含めることは、いくつかの腫瘍の治療を迅速に開始するために重要な場合がある。しかし、これが必要でない場合には、化学療法の副作用を注意深く考慮すべきであり、造血成長因子のみの動員レジメンは、より適切である場合がある。また、化学療法とG-CSFを繰り返し行うと、G-CSF単独で動員した場合よりも、長期培養開始細胞(LTC-IC)の誘導が少なくなり得る。
多種多様な組み合わせレジメンが使用されており、最適な投与またはスケジュールに関するコンセンサス推奨がないが、4～7 g/m2のシクロホスファミドと5 μg/kg/日のG-CSFとの組み合わせが一般的に使用される。
臨床におけるレジメン
G-CSFプラスシクロホスファミド：G-CSFと高用量シクロホスファミド(4～7 g/m2)との組み合わせは、血液中のCD34+HSPCレベルの収率を改善することが示されている。
高用量のシクロホスファミドを使用して、HSPCの収率を改善することができる。例えば、多発性骨髄腫の患者は、高用量シクロホスファミド7 g/m2プラスG-CSF(300 μg/日)で動員することができる、その結果、シクロホスファミド4 g/m2プラスG-CSFの場合で得られる収量よりも有意に高い収量が得られる（>2.5×106個のCD34+細胞/kg）。
G-CSFプラスエトポシド：エトポシドは、NHL、ホジキン病、及びより低い程度で乳癌の治療に有効であることが示されている。このような悪性腫瘍患者の動員レジメンに含めることは、動員段階で治療を提供するために論理的である。
例えば、乳癌、NHLまたはホジキン病の患者は、エトポシド点滴完了後の48時間から開始して、高用量エトポシド(2 g/m2)とG-CSF(5 μg/kg/日)を24 時間にわたって持続的に静脈内注入することにより、HSPCを動員した。
ホジキン病、NHL、及び乳癌の患者でそれぞれ動員された収量の中央値が、白血球数が1×109/Lに回復した最初の日から測定された場合(エトポシド投与の平均10日後、7～16日の範囲)、それぞれ24×106個のCD34+細胞/kg(範囲：9.5～27.7×106/kg)、28.0×106個のCD34+細胞/kg(範囲：1.7～81.8×106/kg)、及び22.7×106個のCD34+細胞/kg (範囲：2.7～79.3×106/kg)であった。これは、動員レジメンが効果的であることを証明した。
G-CSFプラスシクロホスファミドプラスエトポシド：HSPC動員は、乳癌、骨髄腫、及びその他の悪性腫瘍の患者において、G-CSFの有無にかかわらず、高用量のシクロホスファミド(4 g/m2)プラスエトポシド(600 mg/m2)の後に達成することもできる。動員レジメンにG-CSFを含めると、シクロホスファミドとエトポシドのみで動員した後の約5倍のCD34+細胞の収量が得られる。
G-CSFプラス併用化学療法：乳癌の患者に、1日目に5-フルオロウラシル(500 mg/m2)、エピルビシン(120 mg/m2)、及びシクロホスファミド(500 mg/m2)を静脈内投与し、その後2日目からG-CSF(10 μg/kg/日)を静脈内投与する併用化学療法により、中央値17.7×106(範囲：9.4～50.6×106)個のCD34+細胞/kgが得られた。
同様に、例えばパクリタキセルを含むがこれに限定されない他の化学療法薬を、シクロホスファミドプラスG-CSFの併用レジメンにさらに加えると、動員をさらに改善し得る。
実施例38
臨床HIV予防
以前に、HIV陽性であり、CCR5Δ32ホモ接合ドナーから同種骨髄移植を受けた2名の患者("ベルリン"及び"ロンドン"と呼ばれる)(R.K.Guptaら Nature 2015) は、寛解を示し、HSC移植後に検出可能なウイルス血症が完全になくなった。従って、HSPCからCCR2及び/またはCCR5をノックアウトすることは、HIV感染を防止したり、既にHIVに感染している患者を寛解させたりするための実行可能な方法である。非複製レトロウイルスベクター(pBA-9b)は、HSCからCCR5またはCCR2遺伝子発現を減少またはノックアウトするためのいくつかの機構のうちの1つを含むように操作される。一例では、該ベクターは、CRISPR/CAS9及びガイドRNAをコードし、CCR5をノックアウトする(図18A)。別の例では、該ベクターは、CRISPR/CAS9及びガイドRNAをコードし、CCR2をノックアウトする(図18B)。さらなる例では、該ベクターは、CRISPR/CAS9及びガイドRNAをコードし、CCR5とCCR2の両方をノックアウトする(図5 18C)。さらなる例では、該ベクターは、標的細胞内で産生され、CCR5タンパク質の活性を遮断する、ラクダ科及びサメ抗体、またはダーピン、アフィマー、ヒカマー等のような他のタンパク質結合分子を含む単本鎖抗体をコードする(U. H. Wiedleら Cancer Genomics & Proteomics 10:155-168, 2013；K. SkrlecらTrends in Biotechnology, 33:408-418, 2015)。
さらなる実施形態は、CCR5及びCCR2が所望のT細胞集団においてノックアウトされるように、系統特異的プロモーターの添加を含む。本実施例では、CRISPR/CAS9は、CD3プロモーターによって駆動されるので、CRISPR/CAS9の発現は、ベクターによるHSPC形質導入後及びその後のHSPC成熟からのT細胞系列において起こる(図18D)。CD4及びCD8プロモーターを含む他のT細胞プロモーターは、置換されてもよい。
さらなる実施形態では、該ベクターは、標的細胞内で産生され、CCR5及び/またはCCR2タンパク質の活性を遮断する、ラクダ科及びサメ抗体、またはダーピン、アフィマー、ヒカマー等のような他のタンパク質結合分子を含む単本鎖抗体をコードする(U. H. Wiedleら Cancer Genomics & Proteomics 10:155-168, 2013；K. SkrlecらTrends in Biotechnology, 33:408-418, 2015)(図19A-D)。
さらに別の実施形態では、CRISP/CAS 9は、CRISPR/CAS9システムと同じ配置を用いてCCR5及びCCR2の発現をノックダウンするshRNAまたはマイクロRNAまたはサイレンシングRNA(全てsiRNAと呼ばれる)で置換されている(図20A-D)。
HIV感染患者の予防及び寛解の誘導に加えて、図21に記載のベクターは、多発性硬化症と診断された患者を治療するために使用される。本実施形態では、CRISPR/CAS9またはsiRNAを用いて、HSPCリネージュに特異的なCD3プロモーターを用いて、T細胞からCCR5及びCCR2発現を除去または低減する。また、前記ベクターは、治療の終了を可能にする、または急性炎症性エピソードを停止することを可能にする細胞キルスイッチ、チミジンキナーゼ(TK)を含み、それによって、患者は、TK発現細胞を殺す毒性化学物質に変換されるTKプロドラッグを与えられる(図21)。
ヒトの例：
1.ウイルス血症の HIV 患者は、レトロウイルスベクターを阻害することが知られている、または疑われる抗ウイルス薬を2～10日間中止し、次いで、E6、E7、E8、E9、E10、E11、または E12の用量の、CCR5をノックアウトするためのCRISPR/CAS9及びガイドRNAの導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターの臨床的に許容される(GMP)調製物を投与する。ベクターの注入は、本明細書の実施例に記載されているように、比較的アクセスしにくい骨髄からアクセス可能な末梢へHSPCを動員する適切なアジュバントで補完される。移植後、患者のT細胞は、時間の経過とともにCCR5発現の喪失を示し、その後、血液中の陽性細胞におけるHIV DNA陽性T細胞のレベルが低下し、形質導入された HIVフリーT細胞のレベルが上昇する。患者HSCにノックアウトされたCCR5の生産的移植及びその後のT細胞更新の後、患者T細胞の大部分は、CCR5陰性に変換され、1～3ヶ月以内にHIV感染に対して対抗的である。時間が経過すると、HIVは、患者の体から排除され、患者は、長期寛解に入り、HIVに対する長期耐性を維持する。
2.疾患の初期の炎症段階にある多発性硬化症患者は、ベクター形質導入の後HSC及び子孫T細胞でCCR2/5をサイレンシングするように設計されたPC3細胞で、力価がE8 TU/ml以上のレトロウイルスベクターのGMP調製物を投与される。投与パラメータは、適当な動員剤による前処理を伴うHIV患者に使用されたものと同一または類似である。CCR2及びCCR5の損失は、T細胞がMSに関連する炎症に遊走するのを防止し、組織への損傷を防止する。また、MSの急性期のMS患者にガンシクロビルを投与した結果、患者のマークされたT細胞が枯渇し、MRIで測定された病変が減少する。次いで、該患者は、反復ベクター/動員剤療法を受け、HSPC集団を回復させる。MRI検出可能な病変の減少は、患者のT細胞におけるCCR2/5の損失と関連している。
3.小児アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症の重症複合免疫不全(SCID)患者に、形質導入された細胞におけるヒトADAの発現につながるPC3細胞でE8 TU/ml以上の力価を持つレトロウイルスベクターのGMP調製物を投与する。投与量は、E6～E12の合計TUであり、HSPC動員剤による適切な投与が先行する。小児ADA SCID患者へのex vivo形質導入自己幹細胞の従来の移植後、正常または疑似正常免疫機能への回復は、A. Aiutiら NEJM 2009に記載されている通りである。
実施例40
G-CSFなしまたはG-CSFありのプレリキサフォルを用いた効率的なHSC動員のための詳細なヒト投与プロトコル
プレリキサフォルは、単独でまたはG-CSFの補助剤として使用し、CD34+HSPCを特異的に動員させることができる。使用される用量は、プレリキサフォルの場合は5日目に160 μg/kg x 1であり、G-CSFの場合は0、1、2、3、4 日目に10 μg/kgであり、プレリキサフォルを単独で使用する場合は240 μg/kg である。240 μg/kgのプレリキサフォルの単回投与(皮下)は、従来のG-CSF ベースの動員に代わって、より迅速で毒性が低く、扱いにくい代替手段となり得る。しかし、G-CSF(毎日10 μg/kg皮下、最大8日間)とプレリキサフォルの組み合わせ（4日目の夕方から開始し、最大4日間毎日継続）の240 μg/kg用量での皮下投与は、FDA によって承認されており、非ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫の患者の自家幹細胞動員及び移植に推奨されている。
プレリキサフォルの従来の用量は、240 μg/kgであるが、(健常な個体において)該用量は、480 μg/kgまで安全に増加させることができる。プレリキサフォル240 μg/kgの皮下注射後、血液中のCD34+HSPCカウントは、8～10時間以内に、1～2個の細胞/μLから約25個の細胞/μLのピークまで上昇し、そして徐々に減少するが、注射後24時間で依然として約10個の細胞/μLである。480 μg/kgのプレリキサフォルの皮下注射を投与する場合、血液中のCD34+HSPCカウントは、8～10時間以内に、1～2個の細胞/μLから約30個の細胞/μLのピークまで上昇し、そして徐々に減少するが、注射後24時間で依然として約20個の細胞/μLである。
実施例41
シルデナフィル(バイアグラ)プラスプレリキサフォルを用いたHSC動員のための詳細なマウスプロトコル
AMD3100(2.5 mg/kg)の単回皮下(SQ)注射の1時間前に、バイアグラをマウスに1回経口投与(OG)(3 mg/kg)した。対照マウスに、5日間のG-CSF処置を、毎日1回(250 mg/kg)投与した。AMD3100の1時間後またはG-CSFの24時間後に灌流により血液を採取し、致死量の放射線を照射されたレシピエントのフローサイトメトリー及び多系統再構成によって分析した。
5日後、多用量G-CSF動員は、2-h バイアグラ+AMD3100動員プロトコルよりも有意に優れていなかった。高用量のバイアグラ(10及び30 mg/kg)は、AMD3100を介したHSC動員も改善したが、3 mg/kgよりも効果的ではなかった。さらに、AMD3100の単回注射と組み合わせた3日間の経口バイアグラレジメンは、AMD3100単独よりも、血流中のHSCを有意に増加させた。対照マウスと比較して、表現型HSCの数は、AMD3100のみ、AMD3100プラスバイアグラ単回投与、及びAMD3100プラス3日間のバイアグラの場合、それぞれ3倍、7.5倍、及び8.5倍増加した。迅速な2時間(2,500 HSC/マウス)及び3日間(2,800 HSC/マウス)バイアグラ/AMD3100の組み合わせにおける血流中のHSCの数は、G-CSF注射(3,400 HSC/マウス)の連続4日間の1日後に存在する数と同様であった。
実施例42
in vivoでのRNVによる造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)形質導入
マウスHSPCのプロフィールは、Lin-、Scal+、KitlHI(LSK)であった。
GFPをコードする高力価(>E8 TU/ml)精製RNVでin vivoで形質導入した後に、末梢血(PB)、脾臓(S)、及び骨髄(BM)からHSPCを採取し、2つの異なるアッセイ：コロニー形成及びFACS分析によって特徴づけた。
動員プロトコルは、標的動物(Balb/cマウス)において作用することが示された。HSPCを動員するために、Balb/cマウスを使用した。第1群(1群)を、シクロホスファミド+GCSF +AMD3100を用いて以下のように動員した。
・シクロホスファミド + G-CSF + AMD3100動員レジメン
・0日目：シクロホスファミド(CY)(ip)4 mg/100 μL/20 gマウス(200 mg/kg/日)
・1日目：G-CSF(sc) 5 μg/μL/20 gマウス/日(250 μg/kg/日)
・2日目：G-CSF(sc) 5 μg/μL/20 gマウス/日(250 μg/kg/日)
・3日目：G-CSF(sc) 5 μg/μL/20 gマウス/日(250 μg/kg/日)
・4日目：AMD3100(sc) 100 μg/μL/20 gマウス(5 mg/kg)、G-CSFの最終投与の12～14時間後以内に注入。
AMD3100投与の1時間後、末梢血(PB)、脾臓(S)、及び骨髄(BM)を採取し、そして、PB、S、及びBM中のHSPC(マウスlin-、c-kit+、Sca-1+)の存在について、FACSによって分析した。
第2群(2群)を動員しなかった。
FACS分析の結果を表10に要約する。
表10：PB、脾臓、及び骨髄におけるHSPC(lin-、Scal+、kitl+)の動員のFACS分析結果の要約。各数値は、個々のマウスからの値を表す。
Figure 2023525720000019
これらの実験は、HSPCの末梢への動員を示した。
in vivoでの造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)形質導入
次に、(A2実験)実験を上記のように行ったが、続いてin vivoで2時間レトロウイルス(RV)形質導入を行った。Balb/cマウスの3つの群を使用した：1群-動員され、RV無し(n=3、マウス#1、2、3)；2群-動員され、RVあり(n=6、マウス#4、5、6、7、8、9)；及び3群-動員されず、RV無し(対照)(n=1、マウス#10)。
RV形質導入の2時間後に、末梢血(PB)、脾臓(S)、及び骨髄(BM)を採取した。PB、S、及びBM細胞を3日間培養し、GFP+ HSPC(Sca+kit+であるLIN-細胞)についてFACSにより分析した。GFP+ HSPCの多系統再構築は、メチルセルロース中においてPB、S、及びBM細胞を5日間培養することにより実施し、HSPCコロニーがGFP+であるかどうかを確認した。
次に、(A3実験)実験を上記のように行ったが、続いてin vivoで2日間レトロウイルス(RV)形質導入を行った。Balb/cマウスの3つの群を使用した：1群-動員され、RV無し(n=3、マウス#1、2、3)；2群-動員され、RVあり(n=6、マウス#4、5、6、7、8、9)；及び3群-動員されず、RV無し(対照)(n=l、マウス#10)。
RV形質導入の2日後に、末梢血(PB)、脾臓(S)、及び骨髄(BM)を採取した。PB、S、及びBM細胞を3日間培養し、GFP+ HSPC(Sca+kit+であるLIN-細胞)についてFACSにより分析した。GFP+ HSPCの多系統再構築は、メチルセルロース中においてPB、S、及びBM細胞を10日間培養することにより実施し、HSPCコロニーがGFP+であるかどうかを確認した。
脾臓におけるGFP+細胞の画像については、図23を参照されたい。表11は、実験A2の結果を示す。
表11：PB、S、及びBMからのHSPCのRNV-GFPによる動員及び形質導入；0.1%未満の数値は、FACS装置の信頼性できる検出の限界であるため、ゼロとしてカウントした。
Figure 2023525720000020
表12：(実験A2) HPSC動員後in vivoで2時間のRNV形質導入：末梢血(PB)；CFU：コロニー形成ユニット、M：単球/マクロファージ、G：顆粒球、GM：顆粒球/マクロファージ、GEMM：顆粒球/赤血球/マクロファージ/巨核球。1+2+3：動員されたが、形質導入されていない陰性対照からのプールされた末梢血、4～9：個々の、動員され、RNV形質導入されたマウスからの末梢血、10：動員されていなく、形質導入されていない対照からの末梢血：
Figure 2023525720000021
表12は、MethoCult GFM3434(Stem Cell Technologies)中で、12ウェルプレートにおいてウェルあたり4xl04個の末梢血(PB)細胞を5日間培養した後に得られたGFP+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)由来コロニーの数を示す。
表13：(実験A2) HPSC動員後in vivoで2時間のRV形質導入：脾臓(S)；CFU：コロニー形成単位、M：単球/マクロファージ、G：顆粒球、GM：顆粒球/マクロファージ、GEMM：顆粒球/赤血球/マクロファージ/巨核球。1+2+3：動員されたが、形質導入されていない陰性対照からのプールされた脾臓細胞、4～9：個々の、動員され、RNV形質導入されたマウスからの脾臓細胞、10：動員されていなく、形質導入されていない対照からの脾臓細胞：
Figure 2023525720000022
表13は、MethoCult GFM3434(Stem Cell Technologies)中で、12ウェルプレートにおいてウェルあたり2xl05個の脾臓(S)細胞を5日間培養した後に得られたGFP+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)由来コロニーの数を示す。
表14：(実験A2) HPSC動員後in vivoで2時間のRV形質導入：骨髄(BM)；CFU：コロニー形成ユニット、M：単球/マクロファージ、G：顆粒球、GM：顆粒球/マクロファージ、GEMM：顆粒球/赤血球/マクロファージ/巨核球。1+2+3：動員されたが、形質導入されていない陰性対照からのプールされた骨髄、4～9：個々の、動員され、RV形質導入されたマウスからの骨髄、10：動員化されていなく、形質導入されていない対照からの骨髄：
Figure 2023525720000023
表14は、MethoCult GFM3434(Stem Cell Technologies)中で、12ウェルプレートにおいてウェルあたり3xl04個の骨髄(BM)細胞を5日間培養した後に得られたGFP+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)由来コロニーの数を示す。
表15: (実験A3) HPSC動員後in vivoで2日間のRNV形質導入；CFU：コロニー形成ユニット、M：単球/マクロファージ、G：顆粒球、GM：顆粒球/マクロファージ、GEMM：顆粒球/赤血球/マクロファージ/巨核球。1+2+3：動員されたが、形質導入されていない陰性対照からのプールされた末梢血、4～9：個々の、動員され、RV形質導入されたマウスからの末梢血(注：#5は、RV注射後に死亡し、分析から除外され；#8からコロニーが形成されなかった)、10：動員化されていなく、形質導入されていない対照からの末梢血：
Figure 2023525720000024
表15は、MethoCult GFM3434(Stem Cell Technologies)中で、12ウェルプレートにおいてウェルあたり4xl04個の末梢血(PB)細胞を7日間培養した後に得られたGFP+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)由来コロニーの数を示す。
表16：(実験A3) HPSC動員後in vivoで2日間のRV形質導入：脾臓(S)；CFU：コロニー形成ユニット、M：単球/マクロファージ、G：顆粒球、GM：顆粒球/マクロファージ、GEMM：顆粒球/赤血球/マクロファージ/巨核球。1+2+3：動員されたが、形質導入されていない陰性対照からのプールされた脾臓細胞、4～9：個々の、動員され、RV形質導入されたマウスからの脾臓細胞、(注：#5は、RV注射後に死亡し、分析から除外され；#8からコロニーが形成されなかった)、10：動員化されていなく、形質導入されていない対照からの脾臓細胞(コロニーも観察されず)：
Figure 2023525720000025
表16は、MethoCult GFM3434(Stem Cell Technologies)中で、12ウェルプレートにおいてウェルあたり2xl05個の脾臓(S)細胞を7日間培養した後に得られたGFP+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)由来コロニーの数を示す。
表17：(実験A3) HPSC動員後in vivoで2日間のRNV形質導入：骨髄(BM)；CFU：コロニー形成ユニット、M：単球/マクロファージ、G：顆粒球、GM：顆粒球/マクロファージ、GEMM：顆粒球/赤血球/マクロファージ/巨核球。1+2+3：動員されたが、形質導入されていない陰性対照からのプールされた骨髄、4～9：個々の、動員され、RV形質導入されたマウスから骨髄(注：#5は、RNAv注射後に死亡し、分析から除外された)、10：動員化されていなく、形質導入されていない対照からの骨髄：
Figure 2023525720000026
表17は、MethoCult GFM3434(Stem Cell Technologies)中で、12ウェルプレートにおいてウェルあたり3xl04個の骨髄(BM)細胞を7日間培養した後に得られたGFP+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)由来コロニーの数を示す。
これらの実験（A2及びA3）は、100～200 μLにおける約2E7 TUのRNVのin vivo(IV)送達が、形質導入されるHSPC由来のCFUの約7%までをもたらせることを示す。
CD34+細胞形質導入を分析するために、追加の実験(実験Bl)を実施した。CD34+細胞の2つの群を使用した：1群-CD34+、RV無し(234ウェル-プレート中に1つのウェル)；2群-CD34+プラスRV(24ウェル-プレート中に2つのウェル)。細胞を解凍し、培養し、無血清SFEMII+CC100サイトカインカクテル(StemCell)中で増殖させた。細胞を100 μLのCD34+細胞(3xl05)でプレートし(24ウェルプレート中に3つのウェル)、そして100 μlのRNV-GFPウイルスを総体積2 ml中の2群のウェルに添加した。
細胞を15 mlのチューブに集め、PBSで洗浄し、24ウェルプレート中の新しいウェルに再プレートした。前記細胞をBBMM_CC100サイトカイン増殖因子の中でさらに2日間培養し、GFP陽性CD34+細胞の存在についてFACSにより分析した。また、CD34+細胞をメチルセルロース中で15日間培養することにより、GFP+HSPCの多系統再構築を実施し、HSPCコロニーがGPF+であるかどうかを確認した。
表18：(実験Bl) ヒトCD34+ HSPC in vitro で2時間のRNV形質導入：形質導入対照試験；CFU：コロニー形成ユニット、M：単球/マクロファージ、G：顆粒球、GM：顆粒球/マクロファージ、GEMM：顆粒球/赤血球/マクロファージ/巨核球(形質導入されていない：形質導入されていない対照CD34+細胞；RV TD1、2：RV形質導入の反復)：
Figure 2023525720000027
表18は、MethoCult(GF H4434, Stem Cell Technologies)中で、35 mmのディッシュあたり5×102個のヒトCD34+細胞を15日間培養した後に得られたGFP+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)由来コロニーの数を示す。
本実験(Bl)は、マウス幹細胞のin vivo形質導入を与えるRNVの調製物もヒトCD34+ HSPCを導入できることを示す。
本開示を例示するために、多くの実施形態が上に示されている。以下の請求項には、さらに本出願人は発明と見なすものが示される。

Claims (55)

  1. 組換えベクターであって、
    (a)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするポリヌクレオチド、及び
    (b)少なくとも1つのmiRNA標的配列を含むポリヌクレオチド
    を含み、
    (a)及び(b)が同一のポリヌクレオチド上に連結されている、組換えベクター。
  2. (c)プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する細胞傷害性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の組換えベクター。
  3. 前記(a)が、
    1つ以上の抗原結合ドメインをコードする第1ポリヌクレオチドドメイン、
    リンカーをコードする任意のポリヌクレオチドドメイン、
    前記第1ポリヌクレオチドドメインに作動可能に連結された第2ポリヌクレオチドドメイン、該第2ポリヌクレオチドドメインが膜貫通をコードし、及び
    細胞内シグナル伝達ドメインをコードする第3ポリヌクレオチドドメイン
    を含む、請求項1に記載の組換えベクター。
  4. 前記第1ポリヌクレオチドドメインが、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖可変断片、単一ドメイン抗体、ラクダ科VHHドメイン、非免疫グロブリン抗原結合足場、受容体または受容体断片、または二重特異性抗体をコードする、請求項3に記載の組換えベクター。
  5. 前記リンカーをコードする任意のポリヌクレオチドが、Gly3配列をコードする、請求項3に記載の組換えベクター。
  6. 前記膜貫通ドメインが、T細胞受容体のα、βまたはζ鎖、CD3γ、CD3ε、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la, CD18) 、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4 (CD244, 2B4)、 CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A, Lyl08)、SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、及び/またはNKG2Cからなる群から選択されるメンバーに由来する、請求項3に記載の組換えベクター。
  7. 前記第3ポリヌクレオチドドメインが、CD3ζ、共通FeRγ(FCER1G)、Feγ RIIa、FeRβ(FeεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP1O、及びDAP12からなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインをコードする、請求項3に記載の組換えベクター。
  8. 前記プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する細胞傷害性ポリペプチドが、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチド、チミジンキナーゼ活性を有するポリペプチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項2に記載の組換えベクター。
  9. 前記ベクターが、組み込みベクターである、請求項1～8のいずれか1項に記載の組換えベクター。
  10. 前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項9に記載の組換えベクター。
  11. 前記レトロウイルスベクターが、非複製γレトロウイルスベクターである、請求項10に記載の組換えベクター。
  12. 前記少なくとも1つのmiRNA標的配列が、hsa-miR-223-3p、hsa-miR143-3p、hsa-mir182-5p、hsa-miR-l0bp、hsa-miR141-3p、hsa-miR486-5p、及び前述の任意の組み合わせからなる群から選択されるmiRNAにより結合される、請求項1に記載の組換えベクター。
  13. 組換えレトロウイルス粒子であって、
    gagポリペプチド、
    polポリペプチド、
    envポリペプチド、及び
    レトロウイルスベクターのキャプシド内に含まれるレトロウイルスポリヌクレオチド
    を含み、
    該レトロウイルスポリヌクレオチドが、5'から3'へ、(R-U5ドメイン)-(任意のシグナルペプチドコード配列ドメイン)-(結合ドメインコード配列ドメイン)-(任意のヒンジ/リンカーコード配列ドメイン)-(膜貫通(TM)コード配列ドメイン)-(miRNA標的ドメイン)-(U3-R ドメイン)を含む、
    組換えレトロウイルス粒子。
  14. 前記R-U5ドメインが、ヌクレオチド1から約ヌクレオチド145まで、配列番号:25と少なくとも80%同一である配列を有する、請求項13に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  15. 前記結合ドメインコード配列には、シグナル配列が先行する、請求項13に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  16. 前記結合ドメインコード配列に続いて、任意のリンカー/スペーサードメイン配列が続く、請求項13に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  17. 前記レトロウイルスポリヌクレオチドが、キルスイッチドメインコード配列をさらに含む、請求項13に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  18. 前記キルスイッチコードドメインが、プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換するポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されたIRESを含む、請求項17に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  19. 前記ポリペプチドが、チミジンキナーゼ(TKO)活性またはシトシンデアミナーゼ(CD)活性を有する、請求項18に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  20. 前記レトロウイルスポリヌクレオチドが、少なくとも1つのmiRNA標的配列を含む、請求項13に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  21. 前記少なくとも1つのmiRNA標的配列が、複数のmiRNA標的配列を含む、請求項20に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  22. 前記複数のmiRNA標的配列が同一である、請求項21に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  23. 前記複数のmiRNA標的配列の少なくとも2つが異なる、請求項21に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  24. 前記U3-Rドメインが、ヌクレオチド約5537から約6051まで、配列番号:25と少なくとも80%同一である配列を含む、請求項13に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  25. 各ドメインが、約1～20個のヌクレオチドの小さなスペーサー配列によって別のドメインから分離され得る、請求項13に記載の組換えレトロウイルス粒子。
  26. 薬剤的に許容される担体の中に請求項13～25のいずれか1項に記載の組換えレトロウイルス粒子を含む、医薬組成物。
  27. (i)抗原を標的とする抗原結合受容体構築物をコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター；
    (ii)miR標的配列またはmiR標的カセット；
    (iii)任意のキルスイッチコードドメイン；及び
    (iv)薬剤的に許容される担体
    を含む、組成物。
  28. 前記抗原結合受容体構築物が、結合ドメイン、任意のヒンジ/リンカードメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項27に記載の組成物。
  29. 前記結合ドメインが、抗体、Fv、Fab、(Fab')2、抗体の重鎖可変領域(vHドメイン)、抗体の軽鎖可変領域(vLドメイン)、単一ドメイン抗体、単鎖可変断片(scFv)、抗体の単量体可変領域、ラクダ科vHHドメイン、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン(例えば、DARPIN、アフィボディ、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、オーボディ、リペボディ、フィノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、センチリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、アルマジロリピートタンパク質)、疾患または障害に関連する抗原に対する特異性を有するリガンドまたはその断片を含む、請求項28に記載の組成物。
  30. 前記レトロウイルスベクターが、脂質エンベロープを含む、請求項27に記載の組成物。
  31. 前記エンベロープが、広宿主性である、請求項30に記載の組成物。
  32. 前記抗原結合受容体構築物が、キメラ抗原受容体を含む、請求項27に記載の組成物。
  33. 前記miR標的配列またはmiR標的カセットが、非特異的細胞において発現されるmiRNAのための1つ以上の標的配列を含む、請求項27に記載の組成物。
  34. 前記任意のキルスイッチが、自殺遺伝子からのコード配列を含む、請求項27に記載の組成物。
  35. 前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ活性またはチミジンキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項34に記載の組成物。
  36. 前記ポリヌクレオチドが、5'から3'へ、R-U5-(抗原結合受容体コード配列)-(miR標的配列またはカセット)-(任意の自殺遺伝子)-U3-Rを含む、請求項27に記載の組成物。
  37. 前記ポリヌクレオチドが、γレトロウイルス性のR、U3、及びU5配列を含む、請求項27または36に記載の組成物。
  38. 前記抗原が、CD5、CD19、CD123、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD72、CD97、CD171、CS1(CD2サブセット1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319、及び19A24とも呼ばれる)、C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1)、表皮成長因子受容体変異体III(EGFRviii)、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr))、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)、Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)、CD44v6、グリコシル化CD43エピトープ、発癌性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、キット(CD117)、インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2またはCD213A2)、メソテリン、インターロイキン11受容体α(IL-llRa)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、プロテアーゼセリン21(テスティシンまたはPRSS21)、血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)、ルイス(Y)抗原、血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)、ステージ特異的胚抗原-4(SSEA-4)、葉酸受容体α(FRaまたはFR1)、葉酸受容体β(FRb)、受容体チロシンタンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu)、ムチン1、細胞表面関連(MUC1)、表皮成長因子受容体(EGFR)、神経細胞接着分子(NCAM)、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、変異された伸長因子2(ELF2M)、エフリンB2、線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)、インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、カルボニックアンヒドラーゼIX(CA1X)、プロテアソーム(プロサム、マクロペイン)サブユニット、β型、9(LMP2)、糖タンパク質100(gpl00)、ブレークポイントクラスター領域(BCR)及びAbelsonマウス白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ 1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質、チロシナーゼ、エフリンA型受容体2(EphA2)、シアリルルイス接着分子(sLe)、ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)、トランスグルタミナーゼ5(TGS5)、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)、腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248)、腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R)、クローディン6(CLDN6)、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)、Gタンパク質共役型受容体クラスC群5、メンバーD(GPRC5D)、染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61)、CD179a、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)、ポリシアル酸、胎盤特異的1(PLAC1)、グロボHグリコセラミドの六糖部分(GloboH)、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、ウロプラキン2(UPK2)、A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)、アドレナリン受容体β3(ADRB3)、パネキシン3(PANX3)、Gタンパク質共役型受容体20(GPR20)、リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K 9(LY6K)、嗅覚受容体51E2(OR51E2)、TCRγ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)、癌/精巣抗原1(NY-ESO-1)、癌/精巣抗原2(LAGE-la)、メラノーマ関連抗原1(MAGE-A1)、染色体12pに位置するETSトランスロケーション変異遺伝子6（ETV6-AML）、精子タンパク質17(SPA17)、X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1)、アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2)、メラノーマ癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)、メラノーマ癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)、Fos関連抗原1、腫瘍タンパク質p53(p53)、p53変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-lまたはガレクチン8)、T細胞1によって認識されるメラノーマ抗原(MelanAまたはMARTI)、ラット肉腫(Ras)突然変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、肉腫トランスロケーションブレークポイント、アポトーシスのメラノーマ阻害剤(ML-IAP)、ERG(膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)、N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)、ペアボックスタンパク質Pax-3(PAX3)、アンドロゲン受容体、サイクリンBl、v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来のホモログ(MYCN)、RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)、チトクロームP450 1B 1(CYP1B 1)、CCCTC-結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORIS、またはインプリント部位の兄弟制御因子)、T細胞3によって認識された扁平上皮細胞癌抗原(SART3)、ペアボックスタンパク質Pax-5(PAX5)、プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)、キナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4)、滑膜肉腫、xブレークポイント2(SSX2)、最終糖化産物の受容体(RAGE-1)、腎ユビキタス1(RU1)、腎ユビキタス2(RU2)、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6)、ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7)、腸管カルボキシルエステラーゼ、変異された熱ショックタンパク質70-2(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1))、IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89)、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)、CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)、C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)、骨髄間質細胞抗原2(BST2)、EGF様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)、リンパ球抗原75(LY75)、グリピカン-3(GPC3)、Fc受容体様5(FCRL5)、免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9、シアリルルイス抗原)、フコシル-GMl、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、ILllRa、IL13Ra2、CD179b-IGL11、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Timl-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1鎖、TCR-β2鎖、TCR-γ鎖、TCR-δ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体 (LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLVl-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、インフルエンザAヘマグルチニン(HA)、GAD、PDL1、グアニル酸シクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体 (Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、クローディン18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低透過性塩化物チャンネル、及びTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される、請求項29に記載の組成物。
  39. 前記組成物が、被験者への投与のために製剤化される、請求項27～38のいずれか1項に記載の組成物。
  40. 被験者における抗疾患免疫を提供する方法であって、該方法が、請求項26に記載の組成物の有効量を該被験者に投与することを含み、前記組成物が、in vivoで細胞を形質導入して、抗原受容体結合構築物を発現する免疫エフェクター細胞を生じる、方法。
  41. 前記組成物が、用量あたり103～1011のベクター変換単位（TU）を含む、請求項40に記載の方法。
  42. 前記抗原受容体結合構築物が、前記ポリヌクレオチドのmiRNA標的配列に結合する、miRNAを発現する細胞において発現されない、請求項40または41に記載の方法。
  43. 前記抗疾患免疫が、増殖性疾患、前癌状態、癌、及び前記抗原受容体結合構築物が結合する疾患関連抗原の発現に関連する非癌関連適応症からなる群から選択される疾患を治療する、請求項40または41に記載の方法。
  44. 前記癌が、慢性リンパ性白血病 (CLL)、急性白血病、急性リンパ性白血病 (ALL)、B細胞急性リンパ性白血病 (B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病 (T-ALL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大型B細胞リンパ腫、原発性浸出液性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストロームマクログロブリン血症、または前白血病のうちの1つ以上から選択される血液癌である、請求項43に記載の方法。
  45. 前記癌が、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌または頸部癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎の癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（CNS）の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、メルケル細胞癌、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、環境誘発性癌、前記癌の組み合わせ、及び前記癌の転移性病変からなる群から選択される、請求項43に記載の方法。
  46. 前記ベクターが、Tリンパ球(T細胞)、ナイーブT細胞、メモリT細胞、制御性T細胞、NK細胞、造血幹細胞、及びそれらの任意の組み合わせから選択される細胞を形質導入する、請求項40に記載の方法。
  47. 前記レトロウイルスベクターが、配列番号:25の配列を含む、請求項26に記載の組成物。
  48. マウス白血病ウイルス(MLV)gag-pol遺伝子を発現する細胞株を請求項1に記載のベクターで形質転換することを含むレトロウイルスベクターの製造方法。
  49. 前記ベクターが、配列番号：1～23または24に示される配列を含む、請求項48に記載の方法。
  50. 請求項48または49に記載の方法により製造されたレトロウイルス。
  51. 非特異的miRNA発現プロファイルを同定する方法であって、
    細胞または組織から全RNAを単離すること、
    該単離物RNAから配列ライブラリーを生成すること、
    該配列ライブラリーを配列決定すること、
    配列読み取りを処理し、miRNA配列を同定すること、
    微分及びランク付け分析を用いて、前記miRNA配列を順位付けすること、及び
    微分及びランク付け分析の両方に存在する、上位1～5個のmiRNA配列を同定すること
    を含む、方法。
  52. in vivo遺伝子導入療法のための、幹細胞を動員する方法であって、
    骨髄から造血幹細胞を動員する薬剤を被験者に投与することを含む、方法。
  53. 前記薬剤が、造血幹細胞をin vivoで形質導入するための導入遺伝子を含むベクターを投与する前に投与される、請求項52に記載の方法。
  54. 前記薬剤が、プレリキサフォル、G-CSF、シルデナフィル、フィルグラスチム、レノグラスチム、GM-CSF、モルグラモスチム、サルグラモスチム、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項52に記載の方法。
  55. 前記ベクターを含む請求項27に記載の組成物を投与することをさらに含む、請求項53に記載の方法。


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