JP2003535587A

JP2003535587A - 低温感受性変異体ｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JP2003535587A
Application number: JP2002502105A
Authority: JP
Inventors: ウェイン・エム・バーンズ; ミルコ・ビー・ケルメクチエフ
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2000-06-06
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2003-12-02
Also published as: ATE302279T1; EP1287146A2; US6316202B1; WO2001094562A2; WO2001094562A3; AU2001266726B2; US6214557B1; AU6672601A; US20020004203A1; EP1287146B1; US6333159B1; DE60112746D1; DE60112746T2

Abstract

(57)【要約】少なくとも１つの変異を含まない同じＤＮＡポリメラーゼと比べて２５℃で実質的に減少したポリメラーゼ活性を示し、少なくとも１つの変異を含まない同じＤＮＡポリメラーゼと比べて最適温度で正常またはほぼ正常なポリメラーゼ活性を示す、少なくとも１つの変異を有する変異体ＤＮＡポリメラーゼが提供される。また、かかるＤＮＡポリメラーゼをコードしているアミノ酸配列および核酸配列、ならびにこれらの配列の発現に適当なベクタープラスミドおよび宿主細胞が提供される。また、本発明の変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅ならびに他の遺伝子操作および分析を行う改善された方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに向けられており、より詳細には、サ
ーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）ポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ）の新規な変異体に向けられている。特に、本発明は、ＰＣＲ（ポリ
メラーゼ連鎖反応）によるポリヌクレオチドの増幅を触媒することができ、少な
くとも１つの変異を含まない同じポリメラーゼと比べて、室温（２５℃）〜４２
℃で実質的に減少した活性を示すが、酵素の通常の最適温度、６５〜７２℃でほ
ぼ正常な酵素活性および機能性を保持することのできるＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼおよび他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの新規な低温感受性変異体に向けら
れている。本発明は、また、かかるＴａｑＤＮＡポリメラーゼの変異体をコー
ドしている核酸およびアミノ酸配列、ならびにこれらのＤＮＡ配列の発現に適当
なベクタープラスミドおよび宿主細胞に向けられている。また、本発明のＤＮＡ
ポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅ならびに他の遺伝子
分析および操作を行うために、自動ホットスタート（hot start）に提供する改
善された方法が本明細書に記載される。

【０００２】（背景技術）ＰＣＲは、指数関数的に標的ＤＮＡ配列を特異的に増幅するための迅速かつ単
純な方法である（Saikiら、Science 239: 487-4391 (1988)）。簡単に言うと、
現在一般的に実施されている方法は、標的配列に隣接するＤＮＡに相補的なヌク
レオチド配列を有する一対のプライマーを利用する。プライマーは、標的ＤＮＡ
（鋳型）、ＤＮＡポリメラーゼおよび全４つのデオキシヌクレオチド（アデノシ
ン（Ａ）、チロシン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ））のためのｄ
ＮＴＰＳを含有する溶液と混合する。該混合物を次いで、ＤＮＡの２つの相補鎖
を分離するのに十分な温度まで加熱する。次に、混合物を、プライマーを目的の
遺伝子または配列に隣接する配列に特異的にアニールさせるのに十分な温度まで
冷却する。次いで、反応混合物の温度を好熱性ＤＮＡポリメラーゼの最適温度に
設定して、ＤＮＡ合成（伸長）を進行させる。次いで、温度管理を繰り返して各
増幅サイクルを続行する。かくして、ＰＣＲは、ＤＮＡ融解、アニーリングおよ
び伸長の複数のサイクルからなる。２０回の反復サイクルにより、標的ＤＮＡ配
列を百万倍まで増幅できる。いくつかの応用において、単一のプライマー配列が
標的の両末端にプライムするように機能するが、これはプライマー長が長すぎな
い場合にだけ効率よく働く。いくつかの応用において、数対のプライマーがマル
チプレックスＰＣＲとして一般に知られている工程に用いられる。

【０００３】ＰＣＲによって標的ＤＮＡ分子を増幅できる能力は、種々の分野のテクノロジ
ー、例えば、環境および食物微生物学（Wernarsら、Appl. Env. Microbiol., 57
:1914-1919 (1991); HillおよびKeasler, Int. J. Food Microbiol, 12:67-75 (
1991)）、臨床微生物学（Wagesら、J. Med. Virol., 33:58-63 (1991); Sacrame
ntoら、Mol. Cell Probes, 5:229-240 (1991)）、腫瘍学（KumarおよびBarbacid
, Oncogene, 3:647-651 (1988); McCormick, Cancer Cells, 1: 56-61 (1989)）
、遺伝病予後（Handysideら、Nature, 344:768-770 (1990)）および血液銀行お
よび法医学（Jackson, Transfusion, 30:51-57 (1990)）において応用されてい
る。

【０００４】温泉菌サーマス・アクアティカスから得られたＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ配列決定、および関連するＤＮＡ
プライマー伸長技術において助けとなっている。Lawyerら、J. Biol. Chem., 26
4:6427 (1989), GenBank 受託番号Ｊ０４６３９によって記載されたＤＮＡおよ
びアミノ酸配列は、本明細書中で使用される用語、サーマス・アクアティカスＤ
ＮＡポリメラーゼをコードしている遺伝子および酵素サーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼを定義付けている。密接に関連する細菌サーマス・フラヴァ
ス（Thermus flavus）によって発現される高類似性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ
ＤＮＡポリメラーゼ）は、Akhmetzjanov, A. A., およびVakhitov, V.A., Nucl
eic Acids Research 20:5839 (1992), ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６６１０５に
よって記載されたＤＮＡおよびアミノ酸配列によって定義付られる。これらの酵
素は、ＤＮＡポリメラーゼのファミリーを代表し、また、熱安定性であるサーマ
ス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼを包含する。
これらの酵素は、イー・コリ（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびファージ
Ｔ７、Ｔ３およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼのような中温性ＤＮＡポリメラーゼ
においてエディティング目的に有効であるような３’−エキソヌクレアーゼ活性
を欠く。エディティング機能を示す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは一般に、ピロ
コッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）などの好熱性古細菌において見
出される。該クラスの関連するＤＮＡポリメラーゼは一般に、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、
Ｐｆｘ、ＶｅｎｔまたはＤｅｅｐＶｅｎｔとして知られている。

【０００５】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの有用性は
、ＰＣＲを単純化かつ改善した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは９５℃まで安定
であり、ＰＣＲにおけるその使用は、各温度サイクル後に温度感受性ポリメラー
ゼを繰り返し添加する必要性を排除した。さらに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
は、より高温でＤＮＡを伸長することができ、プライマーの非特異的アニーリン
グを防止する傾向があるので、ＰＣＲの特異性および感受性を改善した。

【０００６】ＰＣＲテクノロジーにおいて有意な進歩があったが、非標的バックグラウンド
ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはプライマー自体におけるミスプライミングなどの
副反応による非標的オリゴヌクレオチドの増幅は今だ、重大な問題を提供する。
このことは特に、ＰＣＲが複雑なバックグラウンドＤＮＡを含有する環境で行わ
れ、一方で、標的ＤＮＡが単一コピーで存在しうる場合の診断的応用において言
える（Chouら、Nucleic Acid Res., 20: 1717-1723 (1992)）。

【０００７】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが最も高い活性を示す温度は６７〜７２℃である
が、有意な活性は室温、約２５〜３７℃で示される。通常または「コールドスタ
ート（cold start）」において、プライマーの３’末端の２、３塩基対の形成だ
けしか安定なプライミング複合体をもたらすことができないので、プライマーは
非特異的配列にてＤＮＡ伸長をプライムしうる。その結果として、所望の生産物
を犠牲にして、拮抗または阻害生産物を生じる。阻害生産物の例として、プライ
マーのみからなる構造（時々、「プライマーダイマー」と呼ばれる）が真の標的
鋳型を無視して、互いに対になったプライマー上でＤＮＡポリメラーゼが作用す
ることによって形成される。望ましくないプライマー−プライマー相互作用の確
率は、マルチプレックスＰＣＲを用いる場合、反応におけるプライマー対の数と
共に増加する。ＰＣＲサイクルの間、これらの非特異的伸長産物は所望の標的Ｄ
ＮＡと拮抗することができる。

【０００８】さらに、温度サイクルを始める前に全反応物を周囲の温度で混合するとき、副
反応がしばしば起こることが確定された。これらの副反応を最小限にするための
１の方法は、「ホットスタート」ＰＣＲと呼ばれる。多くのＰＣＲ分析、特に最
も要求の厳しいものは、ホットスタートから利益を得る。ホットスタートを用い
た場合、全ＰＣＲ反応の約５０％が改善された収率および／または特異性を示し
、いくつかの場合、ホットスタートは絶対的に不可欠である。これらの要求の厳
しいＰＣＲ分析は、非常にコピー数の少ない標的（例えば、１００００細胞あた
り１ＨＩＶゲノム）、変性ＤＮＡ（反応をセットする間、鋳型が１本鎖である
ように、多くのＤＮＡ抽出法は沸騰工程を包含する）または汚染されたＤＮＡ、
例えば、土壌または糞便由来のＤＮＡおよび／または大量のＲＮＡを含有するＤ
ＮＡを有するものを包含する。しかしながら、ホットスタートを達成する現行の
方法は、冗長で費用がかかり、および／または他の欠点を有する。

【０００９】ホットスタートＰＣＲは、種々の物理的、化学的または生物化学的方法によっ
て達成されうる。物理的ホットスタートにおいて、反応に必要な全成分が高温に
なるまで、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ活性に必須の１以上の
反応成分を試料ＤＮＡと接触させない。温度は、プライマーの非特異的部分ハイ
ブリダイゼーションに利用できる細胞の全ゲノムがあるにもかかわらず、所望の
鋳型位置以外のどの位置でもプライマーの部分ハイブリダイゼーションすら起き
ることができないような十分な高温でなければならない。したがって、温度は、
プライマーの塩基対合が完全またはほぼ完全とはいえないホモロジーを有する鋳
型（または汚染している鋳型）位置にて起きることのできないような十分な高温
でなければならない。この安全な開始温度は、典型的に５０〜７５℃であり、典
型的に、ＰＣＲにおいて使用されるアニーリング温度より約１０℃高い。

【００１０】１の物理的方法において、ホットスタートは、米国特許第５，５９９，６６０
号に開示される方法のようなワックスバリヤーを用いることによって達成できる
。また、Hebertら、Mol. Cell Probes, 7: 249-252 (1993); Hortonら、Biotech
niques, 16: 42-43 (1994)を参照のこと。かかる方法を用いて、ＰＣＲ反応は、
約５６℃で融解するパラフィンワックスの１ｍｍ薄層によって分離された二層に
おいてセットされる。２つの溶液中に反応成分を分離するために用いられうるい
くつかの方法がある。例えば、１Ｘバッファーを用いるが、ｄＮＴＰおよびＤＮ
Ａポリメラーゼ酵素を用いずに、ＤＮＡの全てを２５ｍｌ容量で加える。融解し
たワックスの１滴を加え、チューブ全体を６０℃に１分間加熱して、融解したワ
ックスに密封層を形成させ、その後、ワックスが凝固するようにチューブを冷却
する。次いで、１Ｘバッファー、全ｄＮＴＰｓおよび酵素を含有する２５ｍｌの
混合物を各反応に加える。最後に、１滴の油を添加して、全部で４層を作成する
。サーマルサイクラープロトコールは最初の融解工程（約９５℃）までチューブ
を加熱するので、ワックスが融解し、浮遊して油層と混合し、温度サイクル時の
対流によって２つの水層が混合する。

【００１１】ワックスバリヤーの使用を含む１の一般的な変形は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素
が不活性であるようにマグネシウムイオンを用いずに反応成分を集合させるもの
である。次いで（または最初に）、ワックスビーズ中に入れられたマグネシウム
イオンが加えられる。しかしながら、これらのワックス法に伴う問題は、各ＰＣ
Ｒサイクル後にワックスが硬化することである。ワックスは試料の取り出しに使
用されるピペットチップを詰まらせる傾向があるので、このことは試料回収を非
常に冗長にする。試料を再加熱してワックスを融解しても、このことは変わらな
い。別の潜在的な問題は、ワックスビーズを加えるためにピンセットを用いる場
合の相互的な汚染である。なぜならば、ピンセットとチューブキャップとの間の
わずかな接触がＰＣＲ反応開始前にＤＮＡ鋳型を試料間に移動させる可能性があ
るからである。

【００１２】ホットスタートＰＣＲを実行するための別の方法は、化学的であるが可逆的に
不活性化されたＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＡＭＰＬＩＴＡＱＧＯＬＤ^ＴＭ
（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用することである。PE Applied Biosystem
sによって配布される該酵素調製物は、不活性形態でユーザーに配布されるが、
加熱によって復活可能である。しかしながら、要求される反応条件は、鋳型ＤＮ
Ａに対して非常に苛酷である：９５℃、名目上のｐＨ８．３以下で１０分により
、ＰＣＲの開始に足る酵素の約３０％の復活をもたらす。Morettiら、Bio Techn
iques 25: 716-722 (1998)を参照のこと。該処理は１０００塩基ほど毎にＤＮＡ
を脱プリン化するので、該酵素は、２、３キロベース以上の長さのＤＮＡを増幅
するために使用できない。したがって、該酵素の使用は、約２００塩基対の長さ
の標的ＤＮＡを増幅することに制限される場合、最も有効である。

【００１３】ホットスタートを実行するためのさらなる方法は、試薬に加える前にＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ酵素をＴａｑ抗体と結合させることである。該方法は、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼに対して生じたモノクローナル不活性化抗体を用いる。S
caliceら、J. Immun. Methods, 172:147-163 (1994); Sharkeyら、Bio/Technolo
gy, 12:506-509 (1994); Kelloggら、Biotechniques, 16: 1134-1137 (1994)を
参照のこと。抗体は、周囲の温度でポリメラーゼ活性を阻害するが、いったん反
応が温度サイクルに付されると、熱変性によって不活性化され、よって、ポリメ
ラーゼを活性にする。不運にも、現在、該方法における使用に利用可能な抗体は
あまり有効ではなく、ホットスタートＰＣＲの利益をもたらすには、５ないし１
０倍モルの過剰量を使用しなければならない。ロングＰＣＲ（long PCR）のため
により高い蛋白質レベル（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの１０倍量までの蛋白質
）で使用されなければならないＫｌｅｎｔａｑ−２７８、コドン２７９で開始す
るアミノ末端が欠失したサーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼの場合、
ホットスタートに必要な抗体レベルは非常に高くなり、変性抗体蛋白質は、より
長いＰＣＲ標的に対しある程度の阻害を保持する。抗−Ｔａｑ抗体の元々の開発
者（Kodak, 現在はJohnson & Johnson）は、より有効であるが市販されておらず
、ロングＰＣＲにおいて試験されていないトリプル−モノクローナル抗体を使用
している。

【００１４】ホットスタートに用いられるこれらの方法は、しばしば高価な成分（例えば、
抗−Ｔａｑ抗体）を反応混合物に含むことを必要とし、試薬調製後、比較的短時
間で試薬を使用しなければならばいこと、または増幅の効率が低いなどのいくつ
かの望ましくない制約をＰＣＲの作業に与えうる。したがって、通常、もし実行
可能ならば、ＰＣＲにおいて物理的ホットスタートを行うことが好ましい。ローテク（low tech）の廉価なオプションは、酵素、マグネシウムおよび／ま
たはｄＮＴＰｓを、それらの加熱後に反応に加えることである。該方法は、冗長
であり、間違いを起こしがちなことのほか、一般に、熱い反応チューブをサーマ
ルサイクラー中で開けなければならないので、ＰＣＲ試料の汚染および相互汚染
をもたらす。

【００１５】氷上のチューブ中でＰＣＲ反応をセットし、次いで、予め９５℃に温めたサー
マルサイクラーブロックにチューブを入れるとき、ホットスタートをしていると
信じている作業者もいる。該方法からある程度の利益は生まれるが、チューブが
０℃から２５℃に温まる１５秒かまたはそれ以上の間に、１秒毎にほんの２、３
個のヌクレオチドのプライマーへの付加が起こることができる。これは、ホット
スタートを必要とする反応に対して望ましくない競合的ＰＣＲを開始するのに十
分である。また、多くのチューブが実験に伴う場合、最初にブロック中に置かれ
たチューブは、後にヒーティングブロック中に置かれたチューブと比べてより長
時間９５℃で加熱され、よって、試料間の再現性の欠失を生じる。

【００１６】好熱性ＤＮＡポリメラーゼは、一般に、約７０℃で活性を最適にするために、
その進化の間にその中温度活性を最小にしてきたと考えられる。この確信により
、その高温活性または９５℃耐性のいずれにもひどく欠陥を生じさせることなく
その室温活性をさらに減少することはできないであろう。

【００１７】しかしながら、発明者らは、ＰＣＲの通常の最適伸長温度での活性を損うこと
も、各ＰＣＲサイクルの融解工程に必要な熱安定性を損うこともなく、室温での
ポリメラーゼ活性を減少させるために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを「低温感
受性」表現型に変異させることができる可能性を推測した。かかる変異体は、Ｐ
ＣＲ増幅を触媒でき、変異のないＤＮＡポリメラーゼと比べて、室温での実質的
に減少した活性を示し、また、最適な反応温度でほぼ正常な活性を示すことがで
きる。かかる変異体ＤＮＡポリメラーゼは、ホットスタート適応性の提供におい
て非常に有用であり、付加的な工程またはプロトコールの変更を用いずに調製、
配布および使用できた。したがって、低温感受性ＤＮＡポリメラーゼを採用する
ことによって、エンドユーザーは、最初に通常の室温スタートで問題のあること
が示された分析だけでなく、ＰＣＲ分析の全てについてホットスタートの利益を
有することができた。さらに、都合のよいことには、「長く正確な（long and a
ccurate）」ＰＣＲ（すなわち、より長鎖の標的を用い、より強化された正確性
を伴う）に、冗長な過剰の配慮または工程を伴うことなくホットスタートの利益
を提供することができ、ヒトＳＴＲタイピングおよびマルチプレックスＰＣＲは
、信頼性および有効性において利得を得るであろう。かかる長く正確なＰＣＲは
Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2216-2220 (1994)および米国特許第
５４３６１４９号に記載されている。

【００１８】（発明の開示）発明の概要したがって、本発明のいくつかの態様のなかでも、変異のないＤＮＡポリメラ
ーゼと比べて、約２５℃〜３７℃で実質的に減少した活性を示し、６２−７２℃
で実質的に同様のポリメラーゼ活性を示す低温感受性変異体ＤＮＡポリメラーゼ
の提供；ＤＮＡ鋳型由来およびイー・コリの単一コロニー由来のＰＣＲ増幅技術
、ＤＮＡの１本鎖（線状）増幅、サイクル−シークエンシング、高温での核酸シ
ークエンシング、ＤＮＡ制限消化物充填（DNA restriction digest filling）、
ＤＮＡ標識、イン・ビボフットプリンティングおよびプライマーに指示される（
primer-directed）突然変異誘発に有用なかかる変異体の提供が注目されうる。
本発明のさらなる態様は、かかる変異体ＤＮＡポリメラーゼの発現のために提供
する組換えアミノ酸および核酸配列、ベクターおよび宿主細胞の提供である。本
発明のまた別の態様は、新規なＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるポリメラ
ーゼ連鎖増幅の改善された実施方法の提供である。本発明のさらなる態様は、Ｄ
ＮＡ鋳型由来およびイー・コリの単一コロニー由来のＰＣＲ増幅、ＤＮＡの１本
鎖（線状）増幅、核酸シークエンシング、ＤＮＡ制限消化物充填、ＤＮＡ標識、
イン・ビボフットプリンティングおよびプライマーに指示される突然変異誘発の
ために低温感受性ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法を提供することである。他の態様および特徴は、一部、明白であり、一部、本明細書の下記に示されよ
う。

【００１９】本発明のこれらおよび他の特徴、態様および利益は、下記の記載、特許請求の
範囲および添付の図面に関してより理解されるようになる。

【００２０】詳細な記載本明細書に引用される全ての出版物、特許、特許出願または他の引用文献は、
あたかも個々の出版物、特許、特許出願または引用文献が出典明示により本明細
書の一部とされることが特別におよび個別に示されるかのごとく、その全体が出
典明示により本明細書の一部とされる。

【００２１】略語および定義本明細書で使用される場合、挙げられた略語および用語は下記のとおり定義付
られる。ｂｐは塩基対の略である。Ｃｓは低温感受性の略である。本明細書で使用される場合、「低温感受性」酵
素とは、同一温度の野生型酵素の活性と比べて、酵素がその最適温度より低温で
減少した活性を有し、通常の最適温度で正常またはほぼ正常な活性を有する表現
型を展示している酵素である。ｋｂはキロベース（１０００塩基対）の略である。ｎｔはヌクレオチドの略である。ＯＲＦはオープンリーディングフレームの略である。Ｔａｑはサーマス・アクアティカスの略である。Ｔｆｌはサーマス・フラヴァスの略である。アミノ酸残基は本明細書において１文字表示で略される：Ａはアラニンを示し
；Ｒはアルギニンを示し；Ｎはアスパラギンを示し；Ｄはアスパラギン酸を示し
；Ｃはシステインを示し；Ｑはグルタミンを示し；Ｅはグルタミン酸を示し；Ｇ
はグリシンを示し；Ｈはヒスチジンを示し；Ｉはイソロイシンを示し；Ｌはロイ
シンを示し；Ｋはリジンを示し；Ｍはメチオニンを示し；Ｆはフェニルアラニン
を示し；Ｐはプロリンを示し；Ｓはセリンを示し；Ｔはスレオニンを示し；Ｗは
トリプトファンを示し；Ｙはチロシンを示し；Ｖはバリンを示す。

【００２２】Ｋｌｅｎｔａｑ−ｎｎｎは、コドンｎｎｎ＋１で開始するアミノ末端欠失型サ
ーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼであるが、好都合な制限部位を作成
するためのＤＮＡ配列の改変のため、開始コドンおよび次のコドンは野生型配列
と一致しなくてもよい。Ｋｌｅｎｔａｑ−２３５は、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許
第５６１６４９４号に請求されるような、Ｎ末端の２３５アミノ酸±１残基を除
きサーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼと実質的に同じアミノ酸配列を
有するＤＮＡポリメラーゼである。

【００２３】Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、米国特許第５４３６１４９号で請求されるような
、Ｎ末端の２７８アミノ酸を除きサーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼ
と実質的に同じアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼである。該ＤＮＡポリ
メラーゼの一般名または商品名はＫｌｅｎｔａｑ１である。ＷＴは野生型（全長）または３アミノ酸のみを欠失し、他の既知の変化がない
ことを示す。ＬＡＰＣＲは、米国特許第５４３６１４９号に請求されるような、２つのＤ
ＮＡポリメラーゼの平衡していない混合物を用いる長く正確な（Long and Accur
ate）ＰＣＲである。

【００２４】ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection）の略である。「熱安定性」なる語は、本明細書において、不可逆的に変性することなく、少
なくとも９５℃まで何十分も耐えることのできる能力および５５℃〜７５℃の最
適温度にてＤＮＡを重合することのできる能力を有すると定義される。

【００２５】ＰＣＲまたは遺伝子クローニングのような同じポリヌクレオチドの複製コピー
を生産する過程は、本明細書において、集合的に「増幅」または「複製」と称さ
れる。例えば、１本鎖または２本鎖ＤＮＡは、同じ配列を有する別のＤＮＡを形
成するように複製してもよい。ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡに向けられたＲＮＡポ
リメラーゼによって、またはＲＮＡを逆転写し、次いでＰＣＲを行うことによっ
て複製してもよい。後者の場合、ＲＮＡの増幅コピーは、相関または相同性配列
を有するＤＮＡである。

【００２６】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、１以上のプライマー、およびＤＮＡポ
リメラーゼのような重合の触媒、特に、熱安定性ポリメラーゼ酵素を用いて、複
製コピーが標的ポリヌクレオチドにより作成される反応である。一般に、ＰＣＲ
は、３つの工程：ＤＮＡが１本鎖に解離するように温度を調整する「融解」；塩
基対認識を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをその相補塩基配列に対合させ
て、増幅されるべきポリヌクレオチドの範囲の一端に２本鎖を形成させるように
温度を調整する「アニーリング」；および２本鎖を形成したオリゴヌクレオチド
がＤＮＡポリメラーゼで伸長されるように、アニーリングと同じ温度で起こりう
るか、または、わずかに高温またはより最適な温度に温度が調整される「伸長」
または「合成」よりなる「サイクル」を繰り返し行うことを含む。次いで、所望
の量の増幅ポリヌクレオチドが得られるまで該サイクルを繰り返す。ＰＣＲ増幅
方法は米国特許第４６８３１９５号および第４６８３２０２号に教示される。

【００２７】「ホットスタートＰＣＲ」は、一般に、改善された信頼度、低コピー標的由来
の改善された生産物、および／またはより汚染していないＰＣＲ産物を生産する
ＰＣＲ法である。鋳型ＤＮＡおよびプライマーを一緒に混合し、鋳型に対するプ
ライマーの非特異的結合の境界より高い温度で維持する。差し控えられる１の重
要な試薬を除き、ＰＣＲ反応成分の全てを伸長反応に加える。差し控えられた試
薬は、通常、熱安定性ポリメラーゼまたはマグネシウムであるが、また、例えば
、３リン酸またはプライマーであってもよい。サイクリングの直前に、差し控え
られた試薬を加えて、反応をより高温で行うことを可能とする。プライマーの鋳
型または互いへの非特異的ハイブリダイゼーションを欠くために、非標的位置で
の競合的伸長の減少または排除の結果として、ＰＣＲ増幅はより有効に進行する
。

【００２８】「コールドスタート」および［室温スタート」なる語は、本明細書において交
換可能に使用され、ＰＣＲ増幅に関して使用される場合、増幅に必要な全ＰＣＲ
反応成分を鋳型核酸配列に２５℃で加えることを示す。ＰＣＲ増幅を行う温度を記載するために使用される場合、「ウォーム（warm）
スタート」は、増幅に必要な全ＰＣＲ反応成分を鋳型核酸配列に３０〜３７℃で
加えることを示す。ＤＮＡポリメラーゼのような特定の蛋白質に関する場合、「単離された」なる
用語は、実質的に汚染物質のない蛋白質の調製をいう。

【００２９】特定のＤＮＡポリメラーゼに関する場合、「ポリメラーゼ活性」なる用語は、
ＤＮＡポリメラーゼの鎖伸長反応においてｄＮＴＰｓまたはｄｄＮＴＰＳを組み
込むことのできる能力をいう。変異したＤＮＡポリメラーゼに関する場合、「実
質的に同様のＤＮＡポリメラーゼ活性」なる用語は、変異したポリメラーゼが同
じ変異していないポリメラーゼのポリメラーゼ活性の少なくとも８０％を示すこ
とを意味する。変異したＤＮＡポリメラーゼに関する場合、「実質的に減少した
ＤＮＡポリメラーゼ活性」なる用語は、変異したポリメラーゼが同じ変異してい
ないポリメラーゼのポリメラーゼ活性の約２０％またはそれ以下を示すことを意
味する。

【００３０】「逆転写」または「逆転写する」なる語は、逆転写酵素などの核酸ポリメラー
ゼの作用によってＲＮＡがｃＤＮＡに変換される過程をいう。逆転写の方法は当
該分野でよく知られており、例えば、Fredrick M. Ausubelら(1995), "Short Pr
otocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, およびMichael A. Inn
isら(1990), "PCR Protocols", Academic Pressに記載されている。

【００３１】「Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント」なる語は、サーマス・アクアティカスＤＮＡ
ポリメラーゼと実質的に同じアミノ酸配列を有するが、ポリメラーゼ分子のＮ末
端の２８９アミノ酸の欠失をもたらす遺伝子操作のために、５’ヌクレアーゼ活
性を欠くＤＮＡポリメラーゼをいう。出典明示により本明細書の一部とされるEr
lichら、Science 252:1643(1991)を参照のこと。「サーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼ」または「ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ」なる語は、細菌サーマス・アクアティカス由来の熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼを示すために変換可能に使用され、天然および合成の全てのＴａｑ変
異体を包含する。

【００３２】核酸の分子操作を含む本明細書で開示された方法は、当業者に既知である。一
般に、Fredrick M. Ausubelら(1995), "Short Protocols in Molecular Biology
", John Wiley and Sons, およびJoseph Sambrook(1989), "Molecular Cloning,
A Laboratory Manual", 第二版, Cold Springs Harbor Laboratory Pressを参
照のこと（どちらも出典明示により本明細書の一部とされる）。

【００３３】したがって、本発明は、同じ変異されていないＤＮＡポリメラーゼと比べて、
室温で実質的に減少したポリメラーゼ活性を示すが、最適温度で実質的に同様の
ポリメラーゼ活性を示す新規な変異体ＤＮＡポリメラーゼに向けられている。変
異したＤＮＡポリメラーゼは、同じ変異していないポリメラーゼと比べて、２５
℃で約２０％またはそれ以下の大きさのポリメラーゼ活性を示し、６８℃で少な
くとも約８０％またはそれ以上の大きさのポリメラーゼ活性を示す。好ましい具
体例において、変異したＤＮＡポリメラーゼは、同じ変異していないポリメラー
ゼと比べて、２５℃で約１０％またはそれ以下の大きさのポリメラーゼ活性を示
し、６８℃で少なくとも約８０％またはそれ以上のポリメラーゼ活性を示し；ま
たより好ましくは、同じ変異していないポリメラーゼと比べて、２５℃で約５％
またはそれ以下の大きさのポリメラーゼ活性を示し、６８℃で少なくとも８０％
またはそれ以上のポリメラーゼ活性を示す。最も好ましくは、同じ変異していな
いポリメラーゼと比べて、２５℃で約１．５％またはそれ以下の大きさのポリメ
ラーゼ活性を示し、６８℃で少なくとも約８０％またはそれ以上のポリメラーゼ
活性を示す。

【００３４】１の具体例において、変異体ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼである。熱安定性酵素は、種々の起源から得てもよく、天然または組換え蛋白
質であってもよい。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのいくつかの例は、限定するも
のではないが、サーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｔｏｆｆｅｌ
フラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａ
ｑ−２７８のようなＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ末端欠失体；サーマス・サ
ーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；バチルス・カルドナックス（Bacillus caldo
tenax）ＤＮＡポリメラーゼ；サーマス・フラヴァスＤＮＡポリメラーゼ；バチ
ルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）ＤＮＡポリメ
ラーゼ；およびサーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｖｅｎｔともいう）、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、ＰｗｏおよびＤｅｅｐ
Ｖｅｎｔのような古細菌ＤＮＡポリメラーゼを包含する。１の好ましい具体例に
おいて、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカスポリメラーゼ
、より好ましくは、全長または末端切断型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、さらに
より好ましくは、Ｋｌｅｎｔａｑ−２３５またはＫｌｅｎｔａｑ−２７８を包含
する。

【００３５】配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を実質的に保持し、本発明の範囲内
に包含されるようなポリメラーゼの熱安定性に有意に影響を及ぼさない少数の変
更が、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡまたはそのアミノ
酸配列に組み込まれることは明らかであろう。当業者は、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質のアミノ酸配列中の修飾が、
元々のアミノ酸配列と比べて、等価または優れた機能的特徴を示す等価のまたは
おそらく改善された第二世代のペプチド等を生じることができることを知ってい
る。したがって、本発明は、かかる修飾されたアミノ酸配列を包含する。改変は
、アミノ酸挿入、欠失、置換、末端切断、融合、サブユニット配列のシャッフリ
ングなどを包含することができ、但し、かかる修飾によって生じたペプチド配列
は、本明細書に開示される天然の相対配列と実質的に同じ機能的特性を有する。
したがって、例えば、修飾された細胞膜浸透性ペプチドは、天然の相対配列と実
質的に同じ膜透過型輸送およびインターナリゼーション特性を有するべきである
。

【００３６】かかる変化を起こすことにおいて考慮されることのできる１の因子は、アミノ
酸のハイドロパシー・インデックスである。相互作用的生物学的機能の蛋白質へ
の授与におけるハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、KyteおよびDo
olittleによって議論されている。J. Mol. Biol., 157: 105-132, (1982)を参照
のこと。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特徴が、得られる蛋白質の第二構造
に寄与することは認められている。次に、これは、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ
、抗体、抗原などの分子と蛋白質との相互作用に影響を及ぼす。

【００３７】その疎水性および電荷特徴に基づいて、各アミノ酸は、下記のとおりのハイド
ロパシー・インデックスを割り当てられた：イソロイシン（＋４．５）；バリン
（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システ
イン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）
；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリ
プトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒス
チジン（−３．２）；グルタミン酸塩／グルタミン／アスパラギン酸塩／アスパ
ラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。

【００３８】当該分野において知られているように、ペプチドまたは蛋白質中のある種のア
ミノ酸は、同様なハイドロパシー・インデックスまたはスコアを有する他のアミ
ノ酸と置換でき、その結果、同様な生物学的活性を有する、すなわち、生物学的
機能性を今だ保持するペプチドまたは蛋白質を生産することができる。かかる変
化を起こすことにおいて、±２以内のハイドロパシー・インデックスを有するア
ミノ酸を互いに置換することが好ましい。より好ましい置換は、アミノ酸が±１
以内のハイドロパシー・インデックスを有する場合である。最も好ましい置換は
、アミノ酸が±０．５以内のハイドロパシー・インデックスを有する場合である
。

【００３９】同様に、アミノ酸はまた、親水性に基づいて置換できる。米国特許第４５５４
１０１号は、蛋白質の最も大きい局所的平均親水性（その隣接するアミノ酸の親
水性によって決定される）が、蛋白質の生物学的特性と相関することを開示する
。下記の親水性値がアミノ酸に割り当てられた：アルギニン／リジン（＋３．０
）；アスパラギン酸塩／グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）
；アスパラギン／グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０
．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン／ヒスチジン（−０．５）；シス
テイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン
／イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２
．５）；およびトリプトファン（−３．４）。したがって、ペプチド、ポリペプ
チドまたは蛋白質中の１のアミノ酸は、同様の親水性スコアを有する別のアミノ
酸で置換でき、その結果、今だ同様の生物学的活性を有する、すなわち、正しい
生物学的機能を今だ保持している蛋白質を生産することができる。かかる変化を
起こすことにおいて、好ましくは±２以内のハイドロパシー・インデックスを有
するアミノ酸を互いに置換し、±１以内のものがより好ましく、±０．５以内の
ものが最も好ましい。

【００４０】上記に概説されるように、本発明のペプチド中のアミノ酸置換は、アミノ酸側
鎖置換の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに
基づくことができる。現存のペプチドなどにサイレント変化をもたらす保存的ア
ミノ酸変化を生じるために、種々の前記の特徴を考慮する例示的置換は、その天
然アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択できる。アミノ酸は、下記の
４群：（１）酸性アミノ酸；（２）塩基性アミノ酸；（３）中性極性アミノ酸；
および（４）中性非極性アミノ酸に分けることができる。これらの種々の群のな
かで代表的なアミノ酸は、限定するものではないが、（１）酸性（陰性に荷電し
た）アミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性（陽
性に荷電した）アミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、およびリジン；（
３）中性極性アミノ酸、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、
シスチン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン；および（４）中性非極
性アミノ酸、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、
フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを包含する。機能的配列
の生産をもたらすならば、有利ではないと思われる変化もまた有用である可能性
があることに注目すべきである。

【００４１】本発明はさらに、かかる変異体ＤＮＡポリメラーゼをコードしているアミノ酸
配列および核酸配列、ならびにこれらのＤＮＡ配列の発現に適当なベクタープラ
スミドおよび宿主細胞に向けられている。変異体ＤＮＡポリメラーゼをコードし
ているこれらのＤＮＡ配列の発現に好ましい宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、
酵母、植物細胞および脊椎動物細胞である。

【００４２】本発明のさらなる態様は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
ダペスト条約にしたがって、１９９９年８月２３日にアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、10801 University Blvd., Manassas, VA 2
0110-2209, USAに寄託されたプラスミドｐＷＢ３２９Ｃｓ＃１およびｐＷＢ３２
９Ｃｓ＃２中に含有されるポリヌクレオチド配列によってコードされるＤＮＡポ
リメラーゼを包含する。これらの株は、各々、名称ＰＴＡ−５９６およびＰＴＡ
−５９７を有する。本明細書に記載する場合、説明のために、ＡＴＣＣ受託番号
ＰＴＡ−５９６は、ＡＴＣＣ寄託において、人工プラスミドｐＷＢ３２９Ｃｓ＃
１を含有するイー・コリＫ−１２細菌株と同定されるが、ＰＴＡ−５９６はより
正確には、実施例１−４に記載するように、Ｃｓ＃１に連結された人工プラスミ
ドｐＷＢ３０２である。同様に、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９７は、人工プラ
スミドｐＷＢ３２９Ｃｓ＃２を含有するイー・コリＫ−１２細菌株と同定される
が、ＰＴＡ−５９７は、より正確には、実施例１−４に記載されるように、Ｃｓ
＃２に連結された人工プラスミドｐＷＢ３０２である。

【００４３】本発明のまださらなる態様は、プラスミドｐＷＢ３０２Ｃｓ＃３中に含有され
るポリヌクレオチド配列によってコードされるＤＮＡポリメラーゼである。該Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、本明細書の表３に示されるような３つのアミノ酸変化を含
有し、その少なくとも１つはその低温感受性表現型に重要である。

【００４４】変異体ＤＮＡポリメラーゼの使用本発明は、ＤＮＡ鋳型からのおよびイー・コリの単一コロニーからのＰＣＲ増
幅、ＤＮＡの１本鎖（線状）増幅、核酸シークエンシング、ＤＮＡ制限消化物充
填、ＤＮＡ標識、変異検出、およびプライマーに指示される突然変異誘発のよう
な種々のＰＣＲ増幅技術に有用な変異体ＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明はまた、特異的な核酸配列、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡを増幅する
方法であって：（ａ）核酸配列が２本鎖である場合、ヌクレオチド鎖を分離し、
および／または鋳型鎖における全ての構造を融解し；（ｂ）各プライマーの伸長
産物が合成されるような条件下で、本発明の変異したＤＮＡポリメラーゼを用い
て、１本鎖をオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーで処理し、ここに、伸
長産物は各ＤＮＡ鎖に相補的であり；次いで（ｃ）プライマー伸長産物を鋳型（
その上で伸長産物が合成されている）から分離して１本鎖分子を生産し；次いで
（ｄ）工程ｂおよびｃを少なくとも１回繰り返すことを特徴とする方法に向けら
れている。

【００４５】本発明の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、また、２本鎖および１本鎖ＰＣＲ鋳型
の核酸配列をシークエンスするために使用できる。かかるシークエンシング方法
は、各々、核酸配列；核酸配列にハイブリダイズするプライマー；１の標識した
ｄＮＴＰおよび３つの非標識ｄＮＴＰ；変異体ＤＮＡポリメラーゼ；および終止
ヌクレオチドよりなる４つの混合物を生産することを含む。４つの混合物の各々
は、異なる終止ｄｄＮＴＰ：ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴ
ＴＰを含有する。核酸配列の配列は、ゲル電気泳動によって各混合物の増幅産物
を分離し、オートラジオグラフィーによって標識したｄＮＴＰを視覚化すること
によって決定できる。１の一般的な別法において、標識はｄｄＮＴＰｓ上に含ま
れ、各々、別個の標識を有し、全てが１の反応に含まれ、４つの分離した試料の
代わりに１の電気泳動試料として分析される。本発明は、さらに、標識したＤＮ
Ａ配列を増幅するための新規な変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ標識法
に向けられている。ヌクレオチド配列は、レポーター部分を含む標識ヌクレオチ
ドを提供し、標識ヌクレオチドを核酸配列鋳型と混合し；標識核酸配列を本発明
の変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し；次
いで、標識核酸配列を検出することによって標識できる。標識ヌクレオチドはＤ
ＮＡプライマー中に含有させることができる。種々のレポーター部分の例は、放
射性ヌクレオチド、発蛍光団または蛍光色素、ペプチド、抗体、抗原、ビタミン
およびステロイドである。

【００４６】本発明は、また、ＤＮＡを増幅するための変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いる
イン・ビボフットプリンティング法に向けられている。一般に、イン・ビボフッ
トプリンティングによるＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの蛋白質の相互作用の
分析は、まず、核酸をフットプリンティング試薬によってその場で修飾すること
を含む。フットプリンティング試薬は、修飾剤に対する核酸の反応性が、目的の
結合蛋白質との相互作用においてどれほど広範囲に改変されるかに基づいて選択
される。次いで、該修飾を、通常、ＰＣＲによって視覚化する（すなわち、目的
の配列の各ヌクレオチドの反応性の分析）。Grangeら、Methods (1997) 11: 151
-63を参照のこと。したがって、ＬＭ−ＰＣＲがＤＮＡ分子における修飾を視覚
化するために使用され、ＲＬ−ＰＣＲがＲＮＡ分子における修飾を視覚化するた
めに使用される。ＬＭ−ＰＣＲとＲＬ−ＰＣＲのどちらも、リンカーをイン・ビ
ボフットプリンティング分析に由来する未知の５’−末端に連結し、目的の領域
を指数関数的に増幅することを含む。ＬＭ−ＰＣＲにおいて、遺伝子特異的プラ
イマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑２本鎖末端を作成する。次いで、
１の平滑末端を有する部分的に２本鎖のＤＮＡリンカーをＤＮＡリガーゼを用い
て該平滑末端に連結する。次いで、リンカーが連結した鎖はＰＣＲ増幅の鋳型と
して働くであろう。同様に、ＲＬ−ＰＣＲにおいて、１本鎖ＲＮＡリンカーを、
ＲＮＡリガーゼを用いて全ＲＮＡ分子の５’Ｐ末端に連結する。次いで、目的の
配列のｃＤＮＡコピーを、逆転写酵素を用いて合成し、その結果、ＰＣＲ増幅の
ための鋳型を作成する。最後に、ＬＭ−ＰＣＲおよびＲＬ−ＰＣＲ由来の増幅産
物を標識し、分析のためにシークエンスする。

【００４７】本発明は、また、標的ＤＮＡ配列内に置換変異を有する変異した核酸配列を増
幅するための変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマーに指示される突然変
異誘発方法に向けられている。プライマーに指示される突然変異誘発方法は、核
酸配列を２つの変異したプライマーと接触させ、ここに、各変異は鋳型配列と比
べてミスマッチであり；新規な変異したＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅し；次
いで、増幅産物をリアニールさせることを特徴とする。これらのミスマッチの変
異したプライマーを用いて増幅された結果得られる核酸分子は、ミスマッチの塩
基を有し、変異鎖を含有する２本鎖領域を有する。Innisら、"PCR Protocols",
Academic Press, 1990, pp 177-183を参照のこと。

【００４８】本発明は、さらに、ＤＮＡを増幅するために新規な変異体ＤＮＡポリメラーゼ
を用いるＤＮＡ制限消化物充填法に向けられている。変異体ＤＮＡポリメラーゼ
を制限消化物充填に用いて、５’−粘着末端を作成する目的で制限酵素で消化し
た結果得られる３’末端を伸長する。該方法は、消化したＤＮＡ鎖を分離し；分
離した核酸分子の各３’末端をオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと接
触させ；新規な変異したＤＮＡポリメラーゼを用いて３’末端を伸長して平滑末
端を作成し；次いで、新しく合成された３’末端を有するＤＮＡ鎖をその相補鎖
に対してリアニールさせることを特徴とする。

【００４９】変異体ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの構築本発明の低温感受性ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを組
織的に変異させることによって得られる。一般に、変異したＤＮＡポリメラーゼ
の生産は典型的に、ＤＮＡポリメラーゼをコードしているポリヌクレオチド配列
を得て、変異させ；組換え型ＤＮＡポリメラーゼをコードしている変異したポリ
ヌクレオチドを含むＤＮＡセグメントを提供し；組換え型ＤＮＡポリヌクレオチ
ドをコードしている該ＤＮＡセグメントを発現ベクター中に挿入し、それを用い
て宿主細胞を形質転換し；次いで、所望の特徴を有する変種を同定するためにス
クリーニングする工程を含む。

【００５０】ポリヌクレオチド配列の変異は、本発明に重大ではない当該分野でよく知られ
た種々の方法によって達成できる。変異方法は、限定するものではないが、化学
的変異、挿入変異、欠失変異、部位特異的変異、ランダム変異、間違いを起こし
やすい（error prone）ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドを用いた変異などを包含す
る。得られる変異した遺伝子は、組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコード
する。

【００５１】好ましい手法において、熱安定性サーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラー
ゼ、好ましくは、Ｋｌｅｎｔａｑ−２３５をコードしているポリヌクレオチド配
列を、ポリヌクレオチド配列をランダム突然変異誘発に付すことによって、好ま
しくは「間違いを起こしやすい」ＰＣＲ技術によって変異させる。間違いを起こ
しやすいＰＣＲは、低い正確性の重合条件を用いて低レベルの点突然変異をポリ
ヌクレオチド配列内にランダムに導入するものであり、未知の配列のフラグメン
トの混合物に変異を起こさせるために使用されうる。例えば、Leungら、(1989)
Technique, 1:11-15; Caldwellら(1992) PCR Methods Applic., 2: 28-33; Gram
ら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 89:3576-3580; Hawkinsら、(1992) J. Mo
l. Biol., 226: 889-896を参照のこと。変異したポリヌクレオチド配列を発現ベ
クター中に挿入し、それを用いてイー・コリを形質転換する。次いで、該変種を
スクリーンし、所望の低温感受性特徴を有する変種を選択する。

【００５２】一般に、発現ライブラリーの調製は、変異したＤＮＡポリメラーゼをコードし
ているヌクレオチド配列およびベクターを部位特異的制限酵素で消化し；次いで
、ベクターおよび変異フラグメントを連結して、所望の調節および発現配列に隣
接する変異配列の挿入をもたらすことよりなる。使用される特定のベクターは、
一部、遺伝子発現における使用のために選択された宿主細胞の型に依存するであ
ろう。典型的には、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性のようなマーカー
用遺伝子を含有し、また、適当なプロモーターおよびターミネーター配列を含有
している宿主適合性プラスミドが用いられよう。

【００５３】ベクター中の特異的ヌクレオチド配列は、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩなど
の部位特異的制限酵素によって切断される。次いで、ベクターの任意のアルカリ
ホスファターゼ処理後、ベクターおよび標的フラグメントを連結して、所望の調
節および発現配列に隣接する場所に標的コドンの挿入をもたらす。次いで、ＤＮＡベクターを典型的には、形質転換またはトランスフェクション
として一般に知られる手法によって宿主細胞中へ導入する。適当な宿主細胞の形
質転換は、当該分野でよく知られた方法を用いて行ってもよい。形質転換された
宿主細胞を好ましい条件下で培養して、適合性形質転換宿主における遺伝子の発
現およびその後の蛋白質生産によって、組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの
生産をもたらす。調節配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を発現さ
せるために使用される宿主細胞の型に依存する。

【００５４】特定の宿主細胞のために特別に設計されたプロトコールを用いて、宿主細胞を
形質転換する。イー・コリの場合、カルシウム処理（Cohen, S.N., Proc., Natl
. Acad. Sci. 69:2110 (1972)）が形質転換をもたらす。細菌、例えば、イー・コ
リの種々の株、および酵母、例えば、パン酵母は、しばしば、ＤＮＡポリメラー
ゼの発現のための宿主細胞として用いられるが、より複雑な細胞を用いるための
技術が知られている。例えば、Depicker, A.ら、J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1:
561に記載される植物細胞を用いるための手法を参照のこと。

【００５５】別法およびより有効には、塩不含イー・コリのエレクトロポレーションをDowe
rら(1988), Nucleic Acids Research 16: 6127-6145の方法の後に行う。形質転
換後、形質転換された宿主を、発現ベクターから獲得された特徴、例えば、アン
ピシリン耐性に基づいて、他の細菌から選択し、次いで、細菌の形質転換コロニ
ーをさらに、高レベルのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−誘導性熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を生じる能力についてスクリーンする。次いで、
形質転換イー・コリのコロニーを大量に増殖させ、ＤＮＡポリメラーゼの発現を
単離および精製のために誘導する。

【００５６】次いで、発現した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを当該分野で既知の種々の方法
を用いて単離し、所望の特徴についてスクリーンする。種々の精製技術が知られ
ているが、全て、イー・コリ細胞の崩壊、天然蛋白質の不活性化および除去なら
びに核酸の沈殿の工程を含む。ＤＮＡポリメラーゼは、その重量（遠心分離）、
大きさ（透析、ゲルろ過クロマトグラフィー）、または電荷（イオン交換クロマ
トグラフィー）のような特徴を利用して分離する。一般に、これらの技術の組み
合わせを精製工程において一緒に用いる。下記の実施例は、本発明を説明しようとするものであり、制限するものではな
い。

【００５７】実施例実施例１：ｐＷＢ３２９の構築ＮＰＴＩＩ遺伝子（トランスポゾンＴｎ５由来）を含有するｐＷＢ２５０をＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化した。ＨｉｎｄＩＩＩで９０分消化後、ウシ腸アルカリホス
ファターゼ（１００Ｌあたり２単位）を３７℃でさらに３０分間、混合物に加え
た。プラスミドｐＷＢ２５３（米国特許第５６１６４９４号）を、５０ｍＭの全
４つのＮＴＰの存在下、３７℃で３０分間、ＮｃｏＩおよび１単位のＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて消化した。次いで、ｐＷＢ２５０イ
ンサートをベクターｐＷＢ２５３中に連結して、ｐＷＢ２５３においてＫｌｅｎ
ｔａｑ−２３５遺伝子の上流にｋａｎＲ遺伝子（ＮＰＴＩＩＩ）を含有するｐＷ
Ｂ３２９を生産した。ｐＷＢ３２９は、実施例２において非変異誘発性ＰＣＲを
用いて突然変異誘発した配列を伸長するために、鋳型ＤＮＡとして用いた。

【００５８】実施例２：Ｋｌｅｎｔａｑ２３５の突然変異誘発プルーフリーダーの無い触媒性ＤＮＡポリメラーゼとしてＫｌｅｎｔａｑ−２
７８、および７．０ｍＭＭｇ^２＋イオンのほかに０．５ｍＭＭｎ^２＋を用いて
、２５０μｌの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．５５、１６ｍＭ硫酸ア
ンモニウムよりなるＰＣＲバッファーを含有する反応において、間違いを起こし
やすいＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡは、Ｋｌｅｎｔａｑ−２３５ＤＮＡポリメラ
ーゼ（プラスミドｐＷＢ２５３；米国特許第５６１６４９４号参照）またはサー
マス・アクアティカス由来のゲノムＤＮＡをコードしているポリヌクレオチド配
列より構成された。突然変異誘発反応において使用されたＰＣＲプライマーは、
ＫＴ８５ＧＣＡＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡ（配
列番号７）およびＫｌｅｎｔａｑ３２ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＣＴＣ
ＣＴＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＴＣＣ（配列番号８）であった。ＫＴ
８５およびＫｌｅｎｔａｑ３２のどちらも、Ｃ末端側半分のＫｌｅｎｔａｑ−２
３５（プラスミドｐＷＢ２５３；米国特許第５６１６４９４号）にまたがり、よ
って、該酵素のＤＮＡポリメラーゼについての触媒機能を含有することが知られ
ている部分に突然変異誘発を集中する。

【００５９】突然変異誘発反応は、３つの異なる量のポリメラーゼを用いて３連で行った。
突然変異誘発性ＰＣＲの１５サイクルの場合（ｍ１５と称する）、用いられた鋳
型は、１００μｌ容量中１０、２０および３０ｎｇのｐＷＢ２５３であった。突
然変異誘発性ＰＣＲの２０および２５サイクルの場合（各々、ｍ２０およびｍ２
５と称する）、用いられた鋳型は、１００μｌ容量中１、２および３ｎｇのサー
マス・アクアティカス由来のゲノムＤＮＡであった。突然変異誘発性ＰＣＲサイ
クリング条件は、９５℃で６０秒および６５℃で７分であった。

【００６０】次いで、突然変異誘発反応ｍ１５、ｍ２０およびｍ２５の生産物をプライマー
として用い、ｐＷＢ３２９を鋳型として用いて、非突然変異誘発性の高い正確性
のＰＣＲ反応を用いて伸長した。これらの反応において使用された他のプライマ
ーは、ＮＰＴＩＩ遺伝子においてＮｃｏＩ部位にまたがるオリゴヌクレオチド４
４６８ＧＧＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣ
ＴＧＣＴＴＧＣＣ（配列番号９）であった。

【００６１】３連のＰＣＲ突然変異誘発反応（ｍ１５、ｍ２０およびｍ２５）をプールし、
ＰＥＧで沈殿させた。プライマーオリゴヌクレオチド４４６８（配列番号９）お
よび１−２ｎｇプラスミドｐＷＢ３２９を、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ
ＴｒｉｓｐＨ９．２、１６ｍＭ硫酸アンモニウム、３．５ｍＭＭｇＣｌ_２、
１００μｇ／ｍｌＢＳＡを含有するＰＣＲバッファーの２００μｌ中における
各々の全ペレットに加えた。各反応を２つのチューブ（チューブＡおよびＢ）に
分け、２０サイクルのＰＣＲを下記のサイクルパラメーター下で適用した：９６
℃で７０秒、６４℃で３０秒、および６５℃で７分。該最終ＰＣＲのサイクル１
２にて、プールしたｍ１５、ｍ２０およびｍ２５のための各ＰＣＲ反応のチュー
ブＢに２４ピコモルのプライマーＫｌｅｎｔａｑ３２（配列番号８）を加えた。
該添加は、標的の２ｋｂの突然変異誘発したＰＣＲフラグメントの最終収率を増
加した。各ＰＣＲ反応をＰＥＧで２回沈殿させて、全ｄＮＴＰおよびプライマー
を除去した。

【００６２】これは、ＮＰＴＩＩ（カナマイシン耐性）のＣ末端の一部を伴うＤＮＡポリメ
ラーゼＫｌｅｎｔａｑ−２３５全体の生産をもたらした。ＮＰＴＩＩ部分は、イ
ー・コリにおける変異ポリメラーゼの発現ライブラリーの生産のための発現ベク
ターｐＷＢ３０２中へのクローニングの間、ＰＣＲ産物の選択を可能にした。ラ
イブラリーは、実施例３において記載されるように、突然変異誘発の各レベルか
ら調製され、実施例４に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼ活性についてス
クリーンされた。

【００６３】実施例３：突然変異誘発したライブラリーｐＷＢ３０２ｍｋの調製変異したＤＮＡ配列を含有するペレットを制限酵素バッファーＮａＴＭＳ（５
０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．９、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０
ｍＭメルカプトエタノール）中で再懸濁し、３７℃で１００分間、ＮｃｏＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。突然変異誘発したＰＣＲ産物をクローニングする
ための発現ベクターｐＷＢ３０２（図２）は、Barnes, WM, Gene 112:29-35 (19
92)に記載されるように構築された。ｐＷＢ３０２は、本質的に、ｐＷＢ３０５
（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ８６８４７；Barnes 1992）のＳｎａＢ１およびＮ
ｃｏＩ部位間の欠失体である。ｐＷＢ３０２をＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよび
アルカリホスファターゼで消化した。消化した標的ＤＮＡおよび消化したｐＷＢ
３０２を、通常のフェノール抽出およびエタノール沈殿によって脱プロトン化し
、約０．２μｇ／μｌ濃度で再懸濁した。リガーゼ反応は、３２．５μｌの水、
５μｌの粘着末端専用（sticky-only）Ｔ４リガーゼバッファー（４０μＭｒＡ
ＴＰ、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．９、５ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＤＴＴ）
、１０μｌの標的ＤＮＡ、２．５μｌのベクターおよび１μｌのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを含有した。１０μｌを「リガーゼ前」のゲル試料として取り出した。リガ
ーゼ反応は５℃で２４時間インキュベートした。１０μｌを「リガーゼ後」のゲ
ル試料として取り出した。残りの混合物をエタノールを用いて沈殿させた。「リ
ガーゼ前」および「リガーゼ後」試料をアガロースゲルに流してｐＷＢ３０２中
への突然変異誘発性生産物の特有の連結を確実にした。

【００６４】ｐＷＢ３０２ベクター中に挿入された変異したＤＮＡ配列のライブラリーを本
明細書においてｐＷＢ３０２ｍｋと称する。プライマーＫＴ８５（配列番号７）
とＫｌｅｎｔａｑ３２（配列番号８）との間の領域は、突然変異誘発した配列を
含有する。該系において、変異したポリメラーゼ遺伝子は、人工オペロン中の第
２遺伝子として適度なレベルで発現され、そのｋａｎＲ（ＮＰＴＩＩ）が第１遺
伝子であり、ｋａｎＲの小部分がクローン化されるべき増幅ＤＮＡ上に包含され
ている。これにより、ＫａｎＲ選択を提供し、その結果、得られるライブラリー
コロニーのいずれもが空のベクターではないようにする。

【００６５】実施例４：低温感受性変異体の同定所望の表現型を有する変異体が、単一コロニーアッセイによって暫定的に同定
された。発明者らによって使用された単一コロニーＤＮＡポリメラーゼアッセイ
は、Sangerら、Gene, 97: 119-123, 1991の方法の修飾である。マルチピン・レ
プリケーター（multipin replicator）装置を用いて、上記の方法によって変異
されたポリメラーゼ遺伝子を含有するイー・コリコロニーを標準的な条件下、ニ
トロセルロースフィルター上で８ｘ１２ｃｍフィルター（ミクロタイタープレー
トサイズ）あたり３８４までの密度で増殖させた。

【００６６】コロニーを含有するフィルターを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９、
１６ｍＭ硫酸アンモニウム、２．５ｍＭ塩化マグネシウムおよび０．５％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００を含有する最小容量の反応バッファー上にかぶせた。次いで
、フィルターを６８℃で１５分間加熱して内在性イー・コリＤＮＡポリメラーゼ
およびＫｌｅｎｔａｑ−２３５のいずれもの熱感受性変異体を不活性化した。

【００６７】次いで、フィルターを、２０−４０ｍＭの全４つのｄＮＴＰおよび１マイクロ
キューリのアルファ−^３２Ｐ−ｄＡＴＰを含有する最小容量（２ｍｌ）の反応バ
ッファーの下に敷き、低温（３７または４２℃）または高温（６８℃）条件のい
ずれかの下でインキュベートした。２つの温度間の比較のためのシグナルを均一
にするために、低温試料を高温試料よりも約４−５倍長くインキュベートした。
別法では、低温スクリーニングを２５℃で行った。当業者に明らかなように、ス
クリーニングを２５℃で行うとき、高温および低温条件間のシグナルを均一にす
るために必要な増加されるインキュベーション時間が増す。取り込み後、フィル
ターを５％ＴＣＡ、１％ＰＰｉで洗浄し、各試験温度について野生型シグナルが
容易に検出できるまで、Ｘ−線フィルムまたはホスホイメージャーに曝した。変
異していない対照コロニーに関する低温インキュベーションシグナル対通常の高
温インキュベーションシグナルのさらなる均一化は、最後のＸ線フィルムの曝露
時間を調整することによって得られた。

【００６８】コロニーは、低温および高温条件間に生じたシグナル強度における差異に基づ
いて選択された。より詳細には、コロニーは、野生型を用いて最大限のシグナル
を生じた低温条件下で検出可能なシグナルを生じなかったが、高温条件下で対照
の変異していないコロニーによって生じたものに匹敵するシグナルを生じたもの
が選択された。これらの基準に基づいて、最も大きい低温感受性を示す３つのコ
ロニーが選択され、Ｃｓ＃１、Ｃｓ＃２およびＣｓ＃３と称された。

【００６９】Ｃｓ＃１に連結されたプラスミドｐＷＢ３０２を含有するイー・コリ細菌株は
、ｐＷＢ３２９Ｃｓ＃１と称され、Ｃｓ＃２に連結されたｐＷＢ３０２はｐＷＢ
３２９Ｃｓ＃２と称され、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダ
ペスト条約にしたがって、１９９９年８月２３日にアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、10801 University Blvd., Manassas, VA 201
10-2209, USAに寄託された。これらの株は、各々、名称ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ
−５９６およびＰＴＡ−５９７を有する。分類のために、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴ
Ａ−５９６は人工プラスミドｐＷＢ３２９Ｃｓ＃１を有するイー・コリＫ−１２
としてＡＴＣＣ寄託において同定されるが、ＰＴＡ−５９６は、実施例１−４に
記載されるようにＣｓ＃１に連結された人工プラスミドｐＷＢ３０２としてより
正確に記載される。同様に、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９７は人工プラスミド
ｐＷＢ３２９Ｃｓ＃２を有するイー・コリＫ−１２としてＡＴＣＣ寄託において
同定されるが、ＰＴＡ−５９７はより正確には、実施例１−４に記載されるよう
にＣｓ＃２に連結された人工プラスミドｐＷＢ３０２として記載される。

【００７０】ＰＴＡ−５９６としてＡＴＣＣに寄託されたｐＷＢ３２９Ｃｓ＃１と称される
プラスミド（Ｃｓ＃１に連結されたプラスミドｐＷＢ３０２）は、表１に示すよ
うな変異を有するＤＮＡポリメラーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を
含有する。ＤＮＡ配列位置およびアミノ酸配列位置は、各々、配列番号１および
２に示されるのと同様な全長の野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列
およびアミノ酸配列にしたがって番号を付される。

【００７１】

【表１】

【００７２】ＰＴＡ−５９７としてＡＴＣＣに寄託されたｐＷＢ３２９Ｃｓ＃２と称される
プラスミド（Ｃｓ＃２に連結されたプラスミドｐＷＢ３０２）は、表２に示され
るような変異を有するＤＮＡポリメラーゼをコードしているポリヌクレオチド配
列を含有する。ＤＮＡ配列位置およびアミノ酸配列位置は、各々、配列番号１お
よび２に示されるのと同様な全長の野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ
配列およびアミノ酸配列にしたがって番号が付される。

【００７３】

【表２】

【００７４】ｐＷＢ３０２Ｃｓ＃３（Ｃｓ＃３に連結されたプラスミドｐＷＢ３０２ｍｋ）
は、表３に示されるような変異を有するＤＮＡポリメラーゼをコードしているポ
リヌクレオチド配列を含有する。ＤＮＡ配列位置及びアミノ酸配列位置は、各々
、配列番号１および２に示されるのと同様な全長の野生型ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列にしたがって番号が付される。

【００７５】

【表３】

【００７６】米国特許第５６１６４９４号および第５４３６１４９号（出典明示により本明
細書の一部とされる）に教示されるＫｌｅｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａ
ｑ−２７８のための精製法を用いて、コロニーを膨張させ、ＩＰＴＧで誘導し、
細胞を溶解し、変異したＤＮＡポリメラーゼＣｓ＃１、Ｃｓ＃２およびＣｓ＃３
を精製した。

【００７７】実施例５：Ｃｓ＃１およびＣｓ＃２を用いるＰＣＲ増幅本発明の低温感受性ＤＮＡポリメラーゼが室温スタート条件下で、通常の熱安
定性ポリメラーゼおよびホットスタート条件を用いて達成されるのと同様な結果
を提供するかどうかを決定するために、コールドスタート、ウォームスタートお
よび手動式ホットスタート条件を用いてＣｓ＃１およびＣｓ＃２をＫｌｅｎｔａ
ｑ−２７８と比較した。反応は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．２、１６
ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１ＸＴＡＴバッフ
ァー中５０ｍｌ容量においてマグネシウムを用いないでセットされた。鋳型は５
ｎｇのヒトゲノムＤＮＡより構成された。１ｍｌ（約０．７μｇ）のＣｓ＃１ポ
リメラーゼ、Ｃｓ＃２ポリメラーゼまたはＫｌｅｎｔａｑ−２７８のいずれかを
５０ｍｌの反応混合物につき使用した。各５０ｍｌの反応は、２５０ｍＭのＭｇ^２＋不含ｄＮＴＰｓを含有した。コールドスタートおよびウォームスタート条件
の場合、塩化マグネシウム（３．５ｍＭの最終レベルまで）を試験温度２５、３
０または３７℃での３０分のプレインキュベーションの前に加えた。手動式ホッ
トスタートを行うために、反応プレインキュベーションは３０℃にてマグネシウ
ムを用いず、塩化マグネシウムは、最初のＰＣＲサイクル前に全ての反応が６８
℃でインキュベートされている期間（約５−７分）に加えられた。次いで、サイ
クリング条件は９２℃で４０秒、６７℃で３０秒および６８℃で２分の４５サイ
クルより構成された。

【００７８】大きさの異なる２つの標的配列が増幅された。２５０ｂｐよりなるヒトチロシ
ンヒドロキシラーゼ遺伝子（ＴＨ０１）配列および５１３ｂｐよりなるヒトケモ
カインレセプター５（ＣＣＲ５）配列が増幅された。使用されたプライマーセッ
トは下記のとおりである。ＴＨＯ１−１：ＧＴＧＧＧＣＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴＡＴ（配列番号３）ＴＨＯ１−２：ＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＧ（配列番号４）ＣＣＲ５−Ｄ５：ＡＧＧＴＡＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＴＴＴ（配列番号５
）ＣＣＲ５−Ｄ３：ＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧＴＣＡＴ（配列番号６
）

【００７９】より詳細には、コールドスタートＰＣＲの場合、５ｍｌの３５ｍＭＭｇＣｌ
_２を４５ｍｌの反応混合物に加え、室温（約２５℃）で３０分間プレインキュベ
ートした。ウォームスタートＰＣＲの場合、手順は、３０分のプレインキュベー
ションが３０℃で行われたことを除き、室温スタートの場合と同一であった。ホ
ットスタートＰＣＲの場合、４５ｍｌの反応混合物をＭｇ^＋＋を用いずに３０℃
で３０分間プレインキュベートした。次いで、最初の５−７分のウォームアップ
（６８℃）中の２−４分に、５ｍｌの３５ｍＭＭｇＣｌ_２を各反応混合物に加
えた。サイクリング後、得られた増幅産物を当業者によく知られた標準的な手法
を用いて単離した。例えば、Innisら（1990）“PCR Protocols, A Guide to Met
hods and Applications", Academic Press, Inc.（出典明示により本明細書の一
部とされる）を参照のこと。

【００８０】増幅産物は、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって
視覚化された。図４に示されるように、１５〜１８ｍｌの増幅産物を１．４％ア
ガロースゲルの各ウェルに負荷した。アガロースゲルのウェルは、表４に示され
るような条件下で得られた増幅産物を含有する。１００ｂｐ分子量ラダーをウェ
ル１に負荷した。電気泳動は、トラッキング染料が５−７ｃｍ移動するまで行っ
た。

【００８１】

【表４】

【００８２】図４において分かるように、本発明の低温感受性ポリメラーゼの２つ、Ｃｓ＃
１およびＣｓ＃２は、コールドスタート（レーン２および５においてＣｓ＃１、
レーン３および６においてＣｓ＃２）、ウォームスタート（レーン８および１１
においてＣｓ＃１；レーン９および１２においてＣｓ＃２）またはホットスター
ト（レーン１４および１７においてＣｓ＃１；レーン１５および１８においてＣ
ｓ＃２）のどの条件下でも鮮明なバンドを生じた。対照的に、標準Ｋｌｅｎｔａ
ｑ−２７８の使用は、手動式ホットスタート条件を用いたときにだけ（レーン１
６および１９）、鮮明なバンドの形成をもたらした。未知の理由のため、室温お
よびウォームスタート条件下での低温感受性ポリメラーゼを用いるより大きいＣ
ＣＲ５標的配列の増幅の効率は、ＴＨＯ１に関して観察されたよりも低かった。
このより低い効率でさえも、本発明の低温感受性ポリメラーゼを用いて得られた
結果は、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８で得られたものより優れている。

【００８３】実施例６：Ｃｓ＃３を用いるＰＣＲ増幅本発明のＣｓ＃３変異体ポリメラーゼがコールドスタート条件下で、通常の熱
安定性ポリメラーゼおよびホットスタート条件を用いて達成されるのと同様な結
果を提供するかどうかを決定するために、Ｃｓ＃３ポリメラーゼをコールドスタ
ートおよびホットスタート条件を用いてＫｌｅｎｔａｑ−２７８と比較した。５
１３ｂｐよりなる標的ヒトケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）を増幅した。Ｐ
ＣＲは、ＣＣＲ５−Ｄ５（配列番号５）およびＣＣＲ５−Ｄ３（配列番号６）を
プライマーとして用いて３５サイクル、等量の（１００μｌあたり８０ｎｇ）の
Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８またはＣｓ＃３ポリメラーゼを用いて行った。全反応は
１．３ＭベタインおよびＭｇ^＋＋不含ｄＮＴＰｓを含有した。

【００８４】手動式ホットスタートを行うために、ＰＣＲ試料を３０℃で３０分間プレイン
キュベートし、増幅前に、反応を６８℃で１０分間温めた。反応３および４は、
マグネシウムを用いずに、１．１１ＸＴＡＴバッファー（１Ｘ＝５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．２、１６ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０）の４５ｍｌ容量中３０℃で３０分間プレインキュベートした。次いで、５ｍ
ｌの３５ｍＭＭｇＣｌ_２を、全反応が最初のＰＣＲサイクル前に６８℃でイン
キュベートされている期間に、通常、最初の５−７分のウォームアップ（６８℃
）中の２−４分に、各反応混合物に加えた。コールドスタートＰＣＲの場合、５
ｍｌの３５ｍＭを反応混合物に加え、室温（約２５℃）で３０分間プレインキュ
ベートした。増幅は、ホットスタートおよびコールドスタートのどちらも下記の
サイクリング条件を用いて行った：９２℃で４０秒、６７℃で３０秒および６８
℃で２分の４５サイクル。

【００８５】サイクリング後、当業者によく知られた標準的な手法を用いて、得られた増幅
産物を単離した。例えば、Innisら(1990) "PCR Protocols, A Guide to Methods
and Applications", Academic Press, Inc.を参照のこと。増幅されたＣＣＲ５産物は、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマ
イド染色によって視覚化された。図５に示されるように、１５〜１８ｍｌの増幅
されたＣＣＲ５産物を１．４％アガロースゲルのウェル１−４中に負荷した。ア
ガロースゲルのウェルは、表５に示されるような条件下で得られる増幅産物を含
有する。１００ｂｐ分子量ラダーをウェル１に負荷した。電気泳動は、トラッキ
ング染料が５−７ｃｍ移動するまで行った。

【００８６】

【表５】

【００８７】図５において分かるように、Ｃｓ＃３ポリメラーゼの使用は、コールドスター
ト（レーン４）またはホットスタート（レーン２）のどの条件下でも鮮明なバン
ドを生じた。対照的に、標準Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の使用は、手動式ホットス
タート（レーン３）条件を用いたときにだけ、鮮明なバンドの形成をもたらした
。

【００８８】これらの結果は、明らかに、本発明の低温感受性ポリメラーゼの使用が、通常
の熱安定性ポリメラーゼを用いて観察される副反応を排除し、よって、目下、ホ
ットスタートＰＣＲに付随する潜在的な間違いおよび汚染問題を伴うことなくホ
ットスタートＰＣＲを用いて観察される利益を提供することを示す。

【００８９】本発明の詳細な記載および上記の実施例に照らして、本発明のいくつかの態様
が達成されることは評価されることができる。本発明が、当業者に本発明、その原理およびその実際的応用を知らせるために
説明および実施例によって詳細に記載されたことは理解されよう。さらに、示さ
れるような本発明の特定の具体例は、本発明を網羅しているまたは限定している
のではなく、上記の実施例および詳細な記載に照らして、多くの別法、修飾およ
び変更が当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、上記の特許請求の範
囲の精神および範囲内に留まるような別法、修飾および変更の全てを包含するも
のである。上記の実施例および記載のいくつかは、本発明が機能しうる方法につ
いていくつかの結果を包含するが、発明者らは、そのような結果および機能によ
って束縛されることを意図しておらず、ただ、可能な解釈としてそれらを示した
のである。

【図面の簡単な説明】

【図１】２−遺伝子オペロンの第二遺伝子としてＫｌｅｎｔａｑ−２３５
の野生型配列；カナマイシン耐性であるＮＰＴＩＩの第一遺伝子コードを有する
プラスミドｐＷＢ３２９の図。ｐＷＢ３２９は、突然変異誘発性ＰＣＲの鋳型で
あった。

【図２】ＮＰＴＩＩのＮ末端部分のみを有し、ＤＮＡポリメラーゼ配列を
全く有さないベクタープラスミドｐＷＢ３０２の図。

【図３】ライブラリーとしてのＰＣＲ突然変異誘発産物を適当に消化した
ベクタープラスミドｐＷＢ３０２中にクローニングする結果である、ライブラリ
ープラスミドｐＷＢ３０２ｍｋの図。

【図４】通常のＤＮＡポリメラーゼおよび本発明の２つの低温感受性変異
体ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｓ＃１およびＣｓ＃２）を用いるＰＣＲ増幅反応から
得られた増幅産物を示すアガロースゲルの写真。該ＰＣＲ反応の場合、通常のポ
リメラーゼＫｌｅｎｔａｑ−２７８は、コールドスタートおよびウォームスター
ト条件下でよく機能しないが、手動式ホットスタート下では機能できる。ＰＣＲ
反応を実施する条件は本明細書中に示される。

【図５】通常のＤＮＡポリメラーゼ（レーン３および５）および本発明の
低温感受性変異体ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｓ＃３）（レーン２および４）を用い
るＰＣＲ増幅反応から得られた増幅産物を示すアガロースセルの写真。レーン１
は、分子量標準ラダーを含有する。レーン２および３のＰＣＲ反応は、手動式ホ
ットスタート法によって行われ、レーン４および５におけるＰＣＲ反応は室温（
２５℃）で行われ、本発明の変異体ＤＮＡポリメラーゼの機能的利益を明らかに
する。ＰＣＲ反応を実施する条件は本明細書に示される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ミルコ・ビー・ケルメクチエフアメリカ合衆国63139ミズーリ州セント・ルイス、ウエスト・パーク・アベニュー 6665番Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA10 CA01 CA11 DA06 EA04 GA11 HA03 HA11 HA19 4B050 CC01 CC03 DD02 LL03 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR62 QS25 QS31 QS36 QX02 4B065 AA01X AA01Y AA57X AA90X AB01 BA01 CA29 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも１つの変異を含む変異体ＤＮＡポリメラーゼであ
って、２５℃で少なくとも１つの変異を含まない同じポリメラーゼと比べて約２
０％以下のポリメラーゼ活性を示し、６８℃で少なくとも１つの変異を含まない
同じポリメラーゼと比べて約８０％以上のポリメラーゼ活性を示す変異体ＤＮＡ
ポリメラーゼ。
【請求項２】２５℃で少なくとも１つの変異を含まない同じポリメラーゼ
と比べて約１０％以下のポリメラーゼ活性を示し、６８℃で少なくとも１つの変
異を含まない同じポリメラーゼと比べて約８０％以上のポリメラーゼ活性を示す
請求項１記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】２５℃で少なくとも１つの変異を含まない同じポリメラーゼ
と比べて約５％以下のポリメラーゼ活性を示し、６８℃で少なくとも１つの変異
を含まない同じポリメラーゼと比べて約８０％以上のポリメラーゼ活性を示す請
求項２記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】２５℃で少なくとも１つの変異を含まない同じポリメラーゼ
と比べて約１．５％以下のポリメラーゼ活性を示し、６８℃で少なくとも１つの
変異を含まない同じポリメラーゼと比べて約８０％以上のポリメラーゼ活性を示
す請求項３記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】熱安定性ポリメラーゼを含む請求項１〜４のいずれか１項記
載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカスＤ
ＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎ
ｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼのＮ−末端欠失体；サーマス・サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；バチルス
・カルドテナックスＤＮＡポリメラーゼ；サーマス・フラヴァスＤＮＡポリメラ
ーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；ならびにサーモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、ＰｗｏおよびＤｅ
ｅｐＶｅｎｔを含む古細菌ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請求
項５記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが全長または末端切断型Ｔａｑ
ポリメラーゼを含む請求項５記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカスＤ
ＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎ
ｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼのＮ−末端欠失体よりなる群から選択される請求項７記載の変異体ＤＮＡポリ
メラーゼ。
【請求項９】少なくとも１つの変異が（１）配列番号２に示されるアミノ
酸配列の６３８位置でのＩからＦへの置換；（２）配列番号２に示されるアミノ
酸配列の６５８位置でのＭからＩへの置換および（３）配列番号２に示されるア
ミノ酸配列の７０６位置でのＷからＲへの置換よりなる群から選択される請求項
１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】少なくとも１つの変異が（１）配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列の８１０位置でのＶからＧへの置換；（２）配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列の８０７位置でのＭからＬへの置換；（３）配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列の６８１位置でのＥからＧへの置換；および配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列の７０８位置でのＥからＤへの置換よりなる群から選択される請求項１
〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】少なくとも１つの変異が（１）配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列の６２６位置でのＥからＫへの置換；（２）配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列の６９０位置でのＱからＲへの置換；および（３）配列番号２に示され
るアミノ酸配列の７０７位置でのＩからＬへの置換よりなる群から選択される請
求項１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９６およびＰＴＡ−５９７よ
りなる群から選択される細胞によって発現される請求項１〜４のいずれか１項記
載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９６およびＰＴＡ−５９７よ
りなる群から選択される宿主細胞中に存在するプラスミドｐＷＢ３０２ｍｋ中に
含有される請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼをコー
ドしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】少なくとも１つの変異が（１）配列番号１に示される核酸
配列の１９１２位置でのＡからＴへの置換；（２）配列番号１に示される核酸配
列の１９７４位置でのＧからＴへの置換；および（３）配列番号１に示される核
酸配列の２１１６位置でのＴからＡへの置換よりなる群から選択される請求項１
３記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】請求項１４記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクター
。
【請求項１６】請求項１５記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】少なくとも１つの変異が（１）配列番号１に示される核酸
配列の２４２９位置でのＴからＧへの置換；（２）配列番号１に示される核酸配
列の２４１９位置でのＡからＴへの置換；（３）配列番号１に示される核酸配列
の２０４２位置でのＡからＧへの置換；および（４）配列番号１に示される核酸
配列の２１２４位置でのＧからＴへの置換よりなる群から選択される請求項１３
記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】請求項１７記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクター
。
【請求項１９】請求項１８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】少なくとも１つの変異が（１）配列番号１に示される核酸
配列の１９１２位置でのＡからＴへの置換；（２）配列番号１に示される核酸配
列の１９７４位置でのＧからＴへの置換；および（３）配列番号１に示される核
酸配列の２１１６位置でのＴからＡへの置換よりなる群から選択される請求項１
〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼをコードしているヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２１】少なくとも１つの変異が（１）配列番号１に示される核酸
配列の２４２９位置でのＴからＧへの置換；（２）配列番号１に示される核酸配
列の２４１９位置でのＡからＴへの置換；（３）配列番号１に示される核酸配列
の２０４２位置でのＡからＧへの置換；および（４）配列番号１に示される核酸
配列の２１２４位置でのＧからＴへの置換よりなる群から選択される請求項１〜
４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼをコードしているヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２２】少なくとも１つの変異が（１）配列番号１に示される核酸
配列の１８４２位置でのＡからＴへの置換；（２）配列番号１に示される核酸配
列の１８７６位置でのＧからＡへの置換；（３）配列番号１に示される核酸配列
の２０６９位置でのＡからＧへの置換；および（４）配列番号１に示される核酸
配列の２１１９位置でのＡからＣへの置換よりなる群から選択される請求項１〜
４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼをコードしているヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２３】請求項２２記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクター
。
【請求項２４】請求項２３記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラ
ーゼを含有するプラスミドｐＷＢ３０２ｍｋを含む宿主細胞。
【請求項２６】（ａ）核酸配列が２本鎖である場合、鎖を分離し、鎖内構
造を変性させ；（ｂ）各プライマーの伸長産物が合成されるような条件下で、請求項１〜４の
いずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いて、該１本鎖をオリゴデオ
キシリボヌクレオチドプライマーで処理し、ここに、伸長産物は各ＤＮＡ鎖に相
補的であり；（ｃ）鋳型（この上で伸長産物が合成される）からプライマー伸長産物を分離
して、１本鎖分子を生産し；次いで（ｄ）工程ｂおよびｃを少なくとも１回繰り返すことを特徴とする特異的核酸配列を増幅する方法。
【請求項２７】変異体ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
を含む請求項２６記載の方法。
【請求項２８】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体；サーマス・サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；バチル
ス・カルドナックスＤＮＡポリメラーゼ；サーマス・フラヴァスＤＮＡポリメラ
ーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；ならびにサーモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、ＰｗｏおよびＤｅ
ｅｐＶｅｎｔを含む古細菌ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請求
項２７記載の方法。
【請求項２９】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが全長または末端切断型Ｔａ
ｑポリメラーゼを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３０】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体よりなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】核酸配列がＲＮＡ配列である場合、まず、ＲＮＡをｃＤＮ
Ａに逆転写する請求項２６記載の方法。
【請求項３２】（ａ）プライマーを第１の核酸配列にハイブリダイズし；（ｂ）工程（ａ）の核酸、少なくとも１つの標識したデオキシリボヌクレオシ
ド３リン酸および３つの標識していないデオキシリボヌクレオシド３リン酸、請
求項１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄｄＡＴＰ
、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびＤＤＴＴＰよりなる群から選択されるターミネ
ーターヌクレオチドを含む混合物を作成し；（ｃ）該第１の核酸配列に相補的な核酸配列を合成するのに十分な条件下で、
工程（ｂ）の混合物を増幅し；（ｄ）４つのターミネーターヌクレオチドの全てが使用されるまで、異なるタ
ーミネーターヌクレオチドを用いて工程（ｂ）および（ｃ）を３回以上繰り返し
；（ｅ）合成された核酸配列を分離することによって、該第１の核酸配列のヌク
レオチド配列を決定することを特徴とする核酸の配列決定法。
【請求項３３】変異体ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
を含む請求項３２記載の方法。
【請求項３４】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体；サーマス・サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；バチル
ス・カルドナックスＤＮＡポリメラーゼ；サーマス・フラヴァスＤＮＡポリメラ
ーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；ならびにサーモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、ＰｗｏおよびＤｅ
ｅｐＶｅｎｔを含む古細菌ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請求
項３３記載の方法。
【請求項３５】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが全長または末端切断型Ｔａ
ｑポリメラーゼを含む請求項３３記載の方法。
【請求項３６】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌ
ｅｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼのＮ−末端欠失体よりなる群から選択される請求項３５記載の方法。
【請求項３７】（ａ）レポーター部分を含む少なくとも１つの標識された
ヌクレオチドを提供し；（ｂ）少なくとも１つの標識されたヌクレオチドを核酸配列鋳型と結合させ；
次いで（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応により標識された核酸配列を増幅し、該増幅は、
（１）核酸鎖を分離し；各プライマーの伸長産物が合成されるような条件下で、
請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いて、１本鎖
をオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーで処理し；（２）プライマー伸長
産物を鋳型（この上で伸長産物が合成される）から分離して１本鎖分子を生産し
；次いで、工程（１）および（２）を少なくとも１回繰り返す工程を特徴とする核酸配列を標識する方法。
【請求項３８】変異体ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
を含む請求項３７記載の方法。
【請求項３９】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体；サーマス・サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；バチル
ス・カルドナックスＤＮＡポリメラーゼ；サーマス・フラヴァスＤＮＡポリメラ
ーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；ならびにサーモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、ＰｗｏおよびＤｅ
ｅｐＶｅｎｔを含む古細菌ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請求
項３８記載の方法。
【請求項４０】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが全長または末端切断型Ｔａ
ｑポリメラーゼを含む請求項３８記載の方法。
【請求項４１】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼサーマス・アクアティカスＤ
ＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎ
ｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼのＮ−末端欠失体よりなる群から選択される請求項４０記載の方法。
【請求項４２】標識されたヌクレオチドが少なくとも１個のプライマーに
含有される請求項３７記載の方法。
【請求項４３】レポーター部分が放射性ヌクレオチド、発蛍光団または蛍
光色素、ペプチド、抗体、抗原、ビタミンおよびステロイドよりなる群から選択
される請求項３７記載の方法。
【請求項４４】（ａ）核酸配列を２つの変異させたプライマーと接触させ
、ここに、第１のプライマー上の変異および第２のプライマー上の変異は、核酸
配列と比べた場合、ミスマッチであり；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応を用いて核酸配列の一部を増幅し、該増幅は、（
１）核酸鎖を分離し；各プライマーの伸長産物が合成されるような条件下で、請
求項１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いて、１本鎖を
オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーで処理し；（２）プライマー伸長産
物を鋳型（この上で伸長産物が合成される）から分離して、１本鎖分子を生産し
；次いで、工程（１）および（２）を少なくとも１回繰り返す工程を含み；次い
で（ｃ）工程（ｂ）の増幅産物を復元させることを特徴とする、核酸配列上でプライマーに指示される突然変異誘発を行う方
法。
【請求項４５】変異体ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む
請求項４４記載の方法。
【請求項４６】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体；サーマス・サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；バチル
ス・カルドナックスＤＮＡポリメラーゼ；サーマス・フラヴァスＤＮＡポリメラ
ーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；ならびにサーモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、ＰｗｏおよびＤｅ
ｅｐＶｅｎｔを含む古細菌ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請求
項４５記載の方法。
【請求項４７】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが全長または末端切断型のＴ
ａｑポリメラーゼを含む請求項４５記載の方法。
【請求項４８】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体よりなる群から選択される請求項４７記載の方法。
【請求項４９】（ａ）細胞中の核酸を修飾し；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によって修飾した核酸を増幅し、該増幅は、（１
）各オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーの伸長産物が合成されるような
条件下で、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼを用い
て、１本鎖をオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーで処理し；（２）プラ
イマー伸長産物を鋳型（この上で伸長産物が合成される）から分離して、１本鎖
分子を生産し；次いで、工程（１）および（２）を少なくとも１回繰り返す工程
を含み；次いで、（ｃ）工程（ｂ）の増幅産物を標識する工程を特徴とする、イン・ビボフットプリンティング法。
【請求項５０】変異体ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼを含む
請求項４９記載の方法。
【請求項５１】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体；サーマス・サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；バチル
ス・カルドナックスＤＮＡポリメラーゼ；サーマス・フラヴァスＤＮＡポリメラ
ーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；ならびにサーモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、ＰｗｏおよびＤｅ
ｅｐＶｅｎｔを含む古細菌ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請求
項５０記載の方法。
【請求項５２】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが全長または末端切断型のＴ
ａｑポリメラーゼを含む請求項５０記載の方法。
【請求項５３】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体よりなる群から選択される請求項５２記載の方法。
【請求項５４】核酸がＲＮＡ配列である場合、まず、ＲＮＡをｃＤＮＡ配
列に逆転写する請求項４９記載の方法。
【請求項５５】（ａ）ＤＮＡ鎖をヌクレアーゼで消化し；（ｂ）消化したＤＮＡ鎖を分離し；（ｃ）分離した核酸分子の各３’末端をオリゴデオキシリボヌクレオチドプラ
イマーと接触させ；（ｄ）請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いて
３’末端を伸長し；次いで（ｅ）増幅産物をその相補鎖に対してリアニールさせることを特徴とする、制限消化物充填法。
【請求項５６】変異体ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
を含む請求項５５記載の方法。
【請求項５７】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体；サーマス・サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；バチル
ス・カルドナックスＤＮＡポリメラーゼ；サーマス・フラヴァスＤＮＡポリメラ
ーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ；ならびにサーモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、ＰｗｏおよびＤｅ
ｅｐＶｅｎｔを含む古細菌ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請求
項５６記載の方法。
【請求項５８】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが全長または末端切断型のＴ
ａｑポリメラーゼを含む請求項５６記載の方法。
【請求項５９】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス
ＤＮＡポリメラーゼ；ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２３５およびＫｌｅｎｔａｑ−２７８を含むＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼのＮ−末端欠失体よりなる群から選択される請求項５８記載の方法。