JP2003533987A - 表皮成長因子収容体に対するヒト化抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＥＣＡＣＣに受託番号第９７０２１４２８号で寄託された細胞株から収得することが可能な抗体３４０のヒト化形態を提供する。このような抗体は、マウス抗体３４０に比べ、細胞を殺す能力が増加するものと明らかになった。また、本発明は、このような抗体を暗号化する核酸、及び特に癌治療における抗体の薬物としての用途を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒト化(humanized)抗体及びその断片、特に表皮成長因子収容体（
ＥＧＦＲ）に対して特異的なヒト化抗体に関する。

【０００１】 ＥＧＦＲは腫瘍関連細胞表面抗原であって、抗体に対する公知の標的物である
。文献［参照：Durrant et al., Prenatal Diagnosis, 14, 131-140, 1994］は
、ＥＧＦＲに高特異的に結合する、「３４０」として知られているマウスモノク
ローナル抗体を記述している。これらの抗体を発現する細胞株は、ＥＣＡＣＣに
受託番号第９７０２１４２８号で寄託した。モノクローナル抗体３４０は、骨肉
腫細胞株７９１Ｔに対して生成された。免疫沈殿研究によれば、３４０は骨肉腫
腫瘍及び胎盤組織からの分子量１７０ｋＤａの膜糖蛋白質を認知する。精製され
た抗原の末端アミノ酸序列分析結果、表皮成長因子収容体と序列同一性を示した
。３４０抗原がＥＧＦ収容体であることを確認するために、放射線標識されたＥ
ＧＦ及びＥＧＦ収容体抗体がＳ３４０抗体抗原に結合するものと明らかになった
。また、３４０はＥＧＦの収容体への結合に対してＥＧＦと競争することができ
、ＥＧＦは３４０の抗原に対する結合について３４０と競争することができた。
広範囲な調査によれば、３４０は結腸、胃、卵巣、骨肉腫腫瘍細胞株に結合する
。また、この抗体は胎児栄養芽層を認知し、母の血液からの胎盤細胞を分類する
ことに用いられてきた。

【０００２】 数個の他のマウスモノクローナル抗体がＥＧＦ収容体を認知するものと明らか
になった。これらは、広範囲には２つの範疇、すなわち収容体には結合するがＥ
ＧＦの結合を抑制しない抗体、及び収容体に結合しＥＧＦの結合を抑制する抗体
に該当する。３４０モノクローナル抗体は後者のグループに属する。

【０００３】 齧歯類、特にマウスモノクローナルの抗体をヒトにおける治療的適用及び生体
内診断適用に使用することは、齧歯類抗体に対して患者に誘導される免疫反応に
よって制限されるものと明らかになった。患者において、所謂「ＨＡＭＡ(human
anti-mouse antibody)」（ヒト抗−マウス抗体）反応の展開によって抗体がそ
れらの抗原性標的物に到達する能力が制限され、抗体の効率が減少するものと明
らかになった。ＨＡＭＡ反応を減少させるために、マウス可変（Ｖ）領域がヒト
の不変（Ｃ）領域に結合されるキメラ抗体を開発した。このような抗体は、マウ
スＶ領域成分が依然として患者から免疫原性を発生させる基礎を提供するが、臨
床的に有用であると立証された［参照：LoBuglio et al., Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA, 86, 4220-4224. 1989］。したがって、齧歯類抗体からの相補性決定領
域ＣＤＲがヒトＶ領域に移植され、ヒトＣ領域に連結されて唯一の「非ヒト」成
分が人間の骨格(framework)領域に隣接したＣＤＲである、ヒト化抗体に対する
技術が開発された。ところが、ＣＤＲを単純移植すると、しばしばヒト化抗体の
親和性を減少させ、その結果親和性を回復するためにヒトＶ領域骨格に特定の非
ヒトアミノ酸の導入を必要とすることが分かった。

【０００４】 ヒト化抗体を生成するためのこれらの方法の共通的な様相は、ヒトにおいて本
質的に非免疫原性である抗体を製造することである。ところが、これを達成する
ための手段は、できる限り多くのヒト序列を齧歯類抗体に導入することであった
。特定の短いペプチド序列または「エピトープ」がヒトにおいて免疫原性であり
うることが公知になっている。したがって、このようなエピトープをコンピュー
タ分析で確認し、非免疫原性のペプチドを生成するためにアミノ酸を代替する技
術が開発された（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７）。

【０００５】 本発明者は、臨床的に有用な治療的手段を提供するために、免疫原性が減少し
た３４０抗体のヒト化バージョン［「３４０Ｃｈ」（マウスヒトキメラの場合）
またはＳＣ１００「脱免疫化(deimmunised)抗体の場合」とも知られている］を
生成した。思い掛けず、本発明者は、このようなヒト化抗体が、本来のマウス抗
体がＥＧＦＲを発現する細胞に結合することと同様に、このような細胞に結合し
て成長を抑制する能力が増加したことを発見した。

【０００６】 したがって、本発明の第１様相によって、受託番号第９７０２１４２８号でＥ
ＣＡＣＣに寄託された細胞株から入手可能な抗体３４０のヒト化形態を提供する
。

【０００７】 本発明の抗体は、ヒト抗体骨格に提供された抗体３４０のＣＤＲＨ３を含む場
合が好ましい。この抗体は３４０の重鎖または軽鎖の他のＣＤＲのいずれか一つ
以上をさらに含めることができる。このようなＣＤＲを図２に示した。これは抗
体３４０の過可変領域を含めることができる。過可変領域以外の可変領域は、ヒ
ト抗体の可変領域から誘導されることができる。このような抗体を製造する方法
は、例えば米国特許第５,２２５,５３９号（Winter）に開示されている。

【０００８】 過可変領域以外の抗体の可変領域は、モノクローナル抗体３４０から誘導され
ることもできる。このような抗体を製造する方法は、例えばBossによる米国特許
第４,８１６,３９７号（Celltech）及びCabillyによる米国特許第４,８１６,５
６７号（Genentech）に記述されているものを含み、当分野によく知られている
。したがって、好ましい態様において、抗体はヒト抗体骨格及び抗体３４０の可
変領域の実質的な部分、好ましくは図２に示すような可変領域を含む。

【０００９】 他の態様において、抗体はヒト抗体骨格及び図６に示したＶＨｂ、ｃ、ｄまた
はｅの一つ及び図７に示したＶｋｂ、ｃまたはｄの一つを含む。好ましい抗体は
ＶＨｄ及びＶｋｄまたはＶＨｄ及びＶｋｄと共にヒト抗体骨格を含む。

【００１０】 ヒト抗体骨格は、好ましくはヒト抗体の不変領域の全部または一部である。例
えば、図２に示したＶＬ領域の全部または一部に基づいたヒト化抗体は、そのＣ
−末端でヒトＣＫまたはＣλ鎖を含んだ抗体軽鎖不変ドメインに結合されること
ができる。同様に、図２に示したＶＨ領域の全部または一部に基づいた抗体は、
そのＣ−末端で抗体イソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、そ
してイソタイプの亜類(subclass)、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ４から誘導された免
疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合されることができる。ＩｇＧ１が好ま
しい。

【００１１】 モノクローナル抗体は、リガンド収容体のリガンド結合部位の近くに結合して
リガンドへの接近を立体的に遮断することにより、リガンドを遮断することがで
きる。他にも、抗体は分子的にリガンドを模倣し、リガンド結合部位で相互作用
することができる。本願において、本発明者は、３４０抗体及びそのＳＣ１００
誘導体がリガンド結合部位に結合するうえ、２次構造によって共にするリガンド
の２つの相違する部分とアミノ酸相同性を示すために特異であることを明らかに
する。また、単一アミノ酸がこのような領域で変化したとき、ＳＣ１００のＥＧ
Ｆｒに対する結合が相当減少するため、細胞結合調査においてＣＤＲＨ３領域の
重要性が確認された。これは、ペプチドリガンドと相同性を示すＣＤＲ領域を有
する抗体が収容体に対する結合においてリガンドと効果的に競争することができ
ることを意味する。したがって、これらはリガンド／収容体相互作用と関連のあ
るシグナル化を遮断することができる。このような例において、ＥＧＦは成長因
子であると同時に生存因子であるため、その収容体との相互作用を遮断すると、
細胞成長及びアポトーシス(apoptosis)を抑制する。ＥＧＦ収容体は、悪性腫瘍
において広範囲に過多発現するため、薬物または抗体によってＥＧＦ収容体を遮
断すると、腫瘍の成長を抑制させる。これらの試薬は動物モデルにおいて腫瘍の
退化を引き起こすが、化学療法と併行すれば特に効果的であると明らかになった
。

【００１２】 抗体は様々に変形されるので、用語「抗体」は要求される特異性と共に結合ド
メインを有するいずれの結合要素または物質も含むものと解釈されるべきである
。したがって、このような用語は免疫グロブリン結合ドメインを含んだいずれの
ポリペプチドでも含む、抗体断片、誘導体、作用的等価物及び抗体の相同物を含
む。

【００１３】 全体抗体の断片が抗原を結合する機能を行えるものと明らかになった。結合断
片の例は（i）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ii
）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（iii）単一抗体のＶＬ及びＶＨ
ドメインからなるＦｖ断片、（iv）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片［参照：Wa
rd, E. S. et al., Nature 341:544-546(1988)］、（v）分離されたＣＤＲ領域
、（vi）２つの連結されたＦａｂ断片を含む２価断片としてのＦ（ａｂ’）２断
片、（vii）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが抗原結合部位を形成するように結
合させるペプチドリンカーによって結合された、単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）［
参照：Bird et al., Science 242:423-426(1988); Huston et al., PNAS USA 85
:5879-5883(1988)］、（viii）二特異的な単一鎖Ｆｖ異量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２
／０９９６５）及び（ix）遺伝子融合によって作製された多価または多特異的断
片としてのジアポディー(diabody)［参照：ＷＯ９４／１３８０４；P. Hollinge
r et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)］を含む。

【００１４】 ジアボディーはポリペプチドの多量体であり、それぞれのポリペプチドは免疫
グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１ドメイン及び免疫グロブリン重鎖の結合領
域を含む第２ドメインを含める。この２つのドメインは、連結（例えば、ペプチ
ドリンカーによって）はされるが、抗原結合部位を形成するために互いに結合さ
れることはできない（抗原結合部位は多量体中の一ポリペプチドの第１ドメイン
が多量体中の他のポリペプチドの第１ドメインと結合されて形成される）（ＷＯ
９４／１３８０４）。

【００１５】 二特異的抗体が使用される場合、これらは多様な方法［参照：Hollinger & Wi
nter, Current Opinion Biotechnol. 1993 4:446-449］、例えば化学的にまたは
ハイブリッド・ハイブリドーマ(hybride hybridomas)から製造できる通常の二特
異的抗体であり、或いは上述した二特異的抗体断片である。全体抗体を使用する
よりは、ｓｃＦｖ二量体またはジアボディーを使用することが好ましい。ジアボ
ディー及びｓｃＦｖは、Ｆｃ領域なしで単に可変領域のみを用いて製造すること
ができ、暫定的に抗−遺伝子型(idiotypic)反応の効果を減少させる。他の形態
の二特異的抗体は、単一鎖「Janusin」を含む「参照：Traunecker et al., EMBO
Journal 10:3655-3659(1991)」。

【００１６】 二特異的全体抗体とは反対に、二特異的ジアボディーは作製が容易であり、E.
Coli.から発現できるため、特に有用である。適した結合特異性を有するジアボ
ディー（及び抗体断片のような多くの他のポリペプチド）は、ライブラリーから
ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いて容易に選択することが
できる。ジアボディーの一つのアーム(arm)が例えば抗原Ｘに対して指示された
特異性をもって一定に維持される場合、他のアームは変化し、適した特異性を有
する抗体が選択されるライブラリーを製造することができる。

【００１７】 免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも３つのＣＤＲ領域
及びこれらを仲裁する骨格領域を含む。好ましくは、前記部分は第１及び第４骨
格領域の一つまたは全ての約５０％以上を含み、５０％は第１骨格領域のＣ−末
端５０％と第４骨格領域のＮ−末端５０％からなる。可変ドメインの実質的な部
分のＮ−末端またはＣ−末端にある追加の残基は、天然的に発生する可変ドメイ
ン領域と正常的に関連しないものである可能性がある。例えば、再組み合せＤＮ
Ａ技術によって製造された本発明の抗体の作製物は、免疫グロブリン重鎖、他の
可変ドメイン（例えば、ジアボディーの製造時）または下記においてより詳細に
説明される蛋白質標識物を含んだ追加の蛋白質序列に本発明の可変ドメインを連
結させるためのリンカーの導入を含めて、クローニングまたは他の操作段階を容
易にするために導入されたリンカーによって、暗号化されたＮ−またはＣ−末端
残基の導入を有することができる。

【００１８】 本発明の一態様として、実質的に図２に示すようにＶL、ＶH領域に対するアミ
ノ酸序列に基づいた一対の結合ドメインを含む抗体が好ましいが、これらの序列
の一つに基づいた単一結合ドメインが本発明の追加態様を形成する。実質的に図
２に示したＶＨ領域に対するアミノ酸序列に基づいた結合ドメインの場合、この
ような結合ドメインは免疫グロブリンＶＨドメインが特定の方式で標的抗原に結
合できるものと公知になっているので、標的剤として使用できる。

【００１９】 単一鎖特異的結合ドメインの一つの場合、これらドメインは本願に記述された
抗体の如く優れており或いは同一の生体内特性を有する２−ドメイン特異的結合
部分を形成することが可能な相補的ドメインのスクリーニングに使用することが
できる。これはＨ鎖またはＬ鎖クローンを含む個々のコロニーが他の鎖（Ｌまた
はＨ）を暗号化するクローンの完全なライブラリーを感染させるのに用いられ、
生成された２−鎖特異的結合部分がＷＯ９２／０１０４７に記述されているよう
に、ファージディスプレイ技術によって選択される、ＷＯ９２／０１０４７に記
述されているような、いわゆる階層的二重結合接近を用いるファージディスプレ
イスクリーニング方法で達成することができる。

【００２０】 ＣＤＲ、過可変及び可変領域の序列がＥＧＦＲに結合する能力を喪失すること
なく変更できることが当分野の専門家によって理解されよう。例えば、本発明の
ＣＤＲ領域は図１及び図２の特定の領域と同一、あるいは高い相同性を示す。「
高い相同性」とは、１〜５個、好ましくは１〜４個、例えば１〜３個または１ま
たは２個の置換がＣＤＲで行われることができることを意図する。また、過可変
及び可変領域はこれらが本願に特異的に記述された領域と実質的な相同性を示す
ように変形されることができる。好ましくは（それぞれのＣＤＲ、過可変領域ま
たは可変領域及びこれらの非変形相対物間の）相同程度は少なくとも６０％、よ
り好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、よりさらに好ましくは９０％、
最も好ましくは９５％である。このような変形された序列は、これらがＥＧＦＲ
に結合し、抗体３４０より高い比率で細胞の成長を抑制する能力を有する限り、
本発明の範囲に属する。用語「抗体」は適切に解釈できる。

【００２１】 ２つのアミノ酸序列または２つの核酸序列の同一性（％）は、最適比較のため
に序列を整列し（例えば、序列との最上の整列のために第１序列にギャップが導
入される）、相応する位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較して決定さ
れる。「最上の整列」とは、最高の同一性（％）を示す２つの序列の整列である
。同一性（％）は比較される序列において同一のアミノ酸またはヌクレオチドの
数によって決定される（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×
１００）。

【００２２】 ２つの序列間の同一性（％）の決定は、当分野の専門家に公知になっている数
学的演算を用いて行うことができる。２つの序列を比較するための数学的演算の
例は、Ｋａｒｌｉｎでの如く変形された演算［参照：Karlin and Altschul (199
0) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268］及び演算［参照：Altschul (19
93) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877］である。文献［参照：Altschu
l, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410］のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡ
ＳＴプログラムはこのような演算を含んでいる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド調査は
、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド序列を得るために、スコア＝１００、
ワード長＝１２のＮＢＬＡＳＴプログラムで行われることができる。ＢＬＡＳＴ
蛋白質調査は、本発明の蛋白質分子と相同のアミノ酸序列を得るために、スコア
＝５０、ワード長＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムで行われることができる。比較
用のギャップド(gapped)整列を得るために、ギャップドＢＬＡＳＴが文献［参照
：Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402］に記述されて
いるように利用できるが、他には、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔが、分子間の距離関係（
Ｉｄ.）を知るための反復的調査を行うのに利用できる。ＢＬＡＳＴ、ギャップ
ドＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプ
ログラム（例：ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォールト(default)変数
が利用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照する。

【００２３】 序列比較のために利用される数学的演算の別の例は、文献［参照：Myers and
Miller, CABIOS(1989)］の演算である。ＣＧＣ序列整列ソフトウェアパッケージ
の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０）がこのような演算を含
んでいる。当分野でよく知られている序列分析のための他の演算は、文献［参照
：Torellis and Robbotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5］に記述され
ているようなＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ、及び文献［参照：Pearson and Lipm
an (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8］に記述されたＦＡＳＴＡを含む
。ＦＡＳＴＡにおいて、ｋｔｕｐは調査の感度と速度を定める調節オプションで
ある。

【００２４】 本願に示されるように、ＳＣ１００のＣＤＲＨ３は成長因子ＥＧＦとアミノ酸
相同性を示す。このような結果は、ＳＣ１００及びその断片及び誘導体が、腫瘍
細胞株の成長抑制、腫瘍細胞株のアポトーシス、ヌードマウスにおける腫瘍異種
移植片の生体内抑制によって例示されるように、腫瘍細胞の成長を抑制し或いは
腫瘍細部のアポトーシスを誘導するための癌治療剤として使用できることを提示
する。したがって、本発明は、ＳＣ１００またはＥＧＦの結合を抑制することが
可能な「ＳＣ１００」部類の他のポリペプチドの「断片」または「誘導体」の使
用をさらに含む。断片の好ましいグループは、モノクローナル抗体ＳＣ１００の
ＣＤＲ領域の全部または一部を含めるものである。ＳＣ１００またはＳＣ１００
部類のポリペプチドの断片は少なくとも５〜７個の隣接するアミノ酸のアミノ酸
残基のストレッチを意味する。時々少なくとも７〜９個の隣接するアミノ酸、通
常は少なくとも約９〜１３個の隣接するアミノ酸、より好ましくは約２０〜３０
個以上の隣接したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約３０個〜４０個以上の
隣接したアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチを意味する。ＳＣ１００またはＳ
Ｃ１００部類のポリペプチドの「誘導体」またはＳＣ１００部類のポリペプチド
の断片の「誘導体」は、蛋白質のアミノ酸序列を多様化させて変形されたポリペ
プチド、例えば蛋白質を暗号化する核酸の操作または蛋白質自体の変形によって
変形されたポリペプチドを意味する。天然アミノ酸序列のかかる誘導体は、抗−
腫瘍Ｔ−細胞反応を誘導することが可能なペプチドを提供する限り、一つ以上の
アミノ酸の挿入、添加、欠失及び／または置換を伴うことができる。好ましくは
、このような誘導体は２５個以下のアミノ酸、より好ましくは１５個以下、より
さらに好ましくは１０個以下、より一層さらに好ましくは４個以下、最も好まし
くは１または２個のアミノ酸の挿入、添加、欠失及び／または置換を伴う。

【００２５】 また、本発明は、結合パトーナー、例えばエフェクター(effector)分子、標識
物、薬物、毒素及び／またはキャリアまたは伝達分子に連結された前記抗体を提
供する。本発明の抗体をペプチド及び非ペプチド結合パトーナーの両方ともにカ
ップリングさせるための技術は、当分野に広く知られている。その一態様におい
て、キャリア分子は、末端Ｃｙｓ残基を介してペプチドにカップリングできる、
アンティナペディア(Antennapedia)のホメオドメイン(homeodomain)から誘導さ
れる１６個のアミノ酸ペプチド（例えば、「Penetratin」の名で市販されるもの
）である。「Penetratin」分子及びその特性はＷＯ９１／１８９８１号に記述さ
れている。

【００２６】 従って、本発明の抗体は、抗体映像化分野で公知になっている通常の化学的性
質を用いて付着できる、検出可能な標識物、例えば１３１Iまたは９９Ｔｃのよ
うな放射性標識物で標識されることができる。また、標識物はホースラディシュ
ペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)のような酵素標識物を含む。また、
標識物は特定の同系(cognate)の検出可能な残基、例えば標識されたアビジンへ
の結合によって検出できる化学的残基、例えばビオチンを含む。したがって、本
発明の抗体は作用性標識物で標識されることができる。このような作用性標識物
は毒素、例えばリシン、及び癌部位におけるプロドラッグをアクティブドラッグ
に転換させることが可能な酵素、例えば細菌性カルボキシペプチダーゼまたはニ
トロレダクターゼ(nitroreductase)を含む。

【００２７】 本発明の抗体は、全部または部分的に化学的合成によって製造することができ
る。本発明の抗体は、完全に確立された、標準液体または、好ましくは固相ペプ
チド合成方法（この一般的な技術は広範囲に利用できる）によって容易に製造し
［参照：J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd
edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois(1984); M. Bodanzsky
and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, N
ew York (1984); and Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Fost
er City, California］、液相方法または固相、液相または溶液化学の組合せに
よって、例えばまずそれぞれのペプチド部分を完成した後、必要かつ適合な場合
、存在する保護グループを除去した後、それぞれの炭酸またはスルホン酸または
その反応性誘導体の反応によって残基Ｘを導入することにより、溶液中で製造す
ることができる。

【００２８】 本発明に係る抗体（ペプチドまたはポリペプチド）を製造する別の便利な方法
は、発現システムにおいて核酸を用いてこれを暗号化する核酸を発現させる方法
である。

【００２９】 したがって、本発明はまた、本発明の抗体を暗号化する核酸を提供する。

【００３０】 一般に、本発明に係る核酸は、分離及び／または精製形態として提供され、ま
たは天然的に結合された物質がないか或いは実質的にない、例えば発現のための
一つ以上の調節序列を除いてはヒトゲノム遺伝子をフラキング(flanking)する核
酸がないか或いは実質的にない分離物として提供される。核酸は全部または部分
的に合成することができ、ゲノム性ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含むことが
できる。本発明に係る核酸がＲＮＡを含む場合、表示された序列に対する参照は
ＴをＵに置換しながらＲＡＮ等価物に対する参照として見なされるべきである。

【００３１】 本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを暗号化する核酸序列は、利用可能
な核酸序列及びクローンが与えられる限り、本願に記載の情報及び参照物及び当
分野の公知技術を用いて専門家によって容易に製造することができる［参照：Sa
mbrook, Fritsch and Maniatis, “Molecular Cloning”, A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and Ausubel et al., Short P
rotocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992］。これらの技術
は（ｉ）例えばゲノム供給源からこのような核酸のサンプルを増幅するために、
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の利用、（ii）化学的合成、または（iii）ｃＤ
ＮＡ序列の製造を含む。ＳＣ１００断片を暗号化するＤＮＡは、暗号化ＤＮＡを
取り、発現するべき部分のいずれか一側にある適合な制限酵素認知部位を確認し
た後、ＤＮＡから前記部分を切断することを含み、当分野の専門家に公知になっ
ている適合な方法で製造、利用することができる。つぎに、前記部分は標準市販
発現システムの適合なプロモータに作動的に連結することができる。別の再組み
合わせ接近は適したＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅すること
である。序列に対する変形物は、変形されたペプチドの発現をリードし或いは核
酸を発現させるのに用いられる宿主細胞におけるコドン選好度を考慮するために
、例えば特定部位の突然変異誘発を用いて製造することができる。

【００３２】 核酸序列の発現物を得るために、序列は発現の調節のために核酸に作動的に連
結された一つ以上の調節序列を有するベクトルに挿入することができる。このベ
クトルは、他の序列、例えば挿入された核酸の発現をリードするプロモータまた
はエンハンサー、ポリペプチドまたはペプチドが融合物として生成されるように
するための核酸序列、及び／または宿主細胞で生成されたポリペプチドが細胞か
ら分泌されるようにするための分泌シグナルを暗号化する核酸を含むことができ
る。次に、ポリペプチドはベクトルが作用可能な宿主細胞に形質転換させ、ポリ
ペプチドが生成されるように宿主細胞を培養した後、宿主細胞または周囲培地か
らポリペプチドを回収して収得することができる。E.Coli、酵母及びＣＯＳまた
はＣＨＯ細胞のような真核細胞を含み、原核細胞または真核細胞が当分野で上記
目的のために使用される。

【００３３】 従って、本発明はまた、本発明の抗体を暗号化する核酸（一般的に本発明に係
る核酸）からの発現を含んだ本発明の抗体を製造する方法を含める。これは、便
利には、抗体発現を生み出し或いは可能にする適合な条件の下で、このようなベ
クトルを含む宿主細胞を培養物として成長させることにより達成することができ
る。

【００３４】 ポリペプチド及びペプチドはまた試験管内システム、例えば網状赤血球溶解質
から発現することができる。

【００３５】 クローニング及び多くの相違する宿主細胞におけるポリペプチド発現のための
システムは十分公知になっている。適した宿主細胞は細菌、真核細胞、例えば哺
乳動物及び酵母、及びバキュロウィルスシステムを含む。異種ポリペプチドの発
現のための、当分野で利用可能な哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵
巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベービーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞などを含む。
通常の好適な細菌宿主はE.Coliである。

【００３６】 プロモータ序列、タミネータ断片、ポリアデニル化序列、エンハンサー序列、
マーカー遺伝子及び適合したその他の序列を含んだ適合な調節序列を含む、適し
たベクトルが選択或いは作製されることができる。ベクトルは、プラスミド、ウ
ィルス、例えばファージ(phage)またはファージミド(phagemid)である。更なる
説明のために、例えば文献［参照：Molecular Cloning: a Laboratory Manual:2
nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press］
を参照する。例えば、核酸作製物の製造、突然変異誘発、序列分析、ＤＮＡの細
胞への導入及び遺伝子発現において、核酸の操作のための多くの技術及びプロト
コル、並びに蛋白質の分析が文献「参照：Current Protocols in Molecular Bio
logy, Ausubel et al., John Wiley and Sons, 1992」に詳細に記述されている
。

【００３７】 従って、本発明の他の態様は、本願に記載されているような異種核酸を含む宿
主細胞を提供する。

【００３８】 本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例：染色体）に統合されることができる
。統合は、標準技術によってゲノムとの再組み合せを改善させる序列を含めるこ
とにより改善されることができる。核酸は細胞内の染色体の外、ベクトル上に存
在し、或いは細胞に対して異種または外因性である可能性がある。

【００３９】 本発明のさらに他の態様は、拡散を宿主細胞に取り込むことを含む方法を提供
する。（特に、試験管内への導入に対して）一般的に制限なく「形質転換」と言
える導入は利用可能ないずれの技術も用いることができる。真核細胞に対して適
した技術は、リン酸カルシウム形質感染(transfection)、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒ
ａｎ、電気穿孔、リポソーム媒介形質感染、及びレトロウィルスまたは他のウィ
ルス、例えばワクシニアまたは昆虫細胞のためのバキュロウィルスを用いた形質
導入(transduction)を含むことができる。細菌細胞に対して適した技術は塩化カ
ルシウム形質転換、電気穿孔及びバクテリオファージを用いた形質感染を含む。
その他にも、核酸の直接注入を用いることができる。

【００４０】 マーカー遺伝子、例えば抗生剤耐性または敏感遺伝子は、当分野で十分に知ら
れているように、目的とする核酸を含むクローンの確認に利用することができる
。

【００４１】 導入後は、例えば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞（この細胞はむしろ
形質転換された細胞の子孫に近いが、実際に形質転換された細胞を含むことがで
きる。）を培養して、暗号化されたポリペプチド（またはペプチド）を生成する
ことにより、核酸から発現を生み出すか或いは可能にすることができる。適した
シグナルリーダペプチドにカップリングしたポリペプチドが発現する場合、これ
は細胞から培養培地に分泌されることができる。ポリペプチドまたはペプチドが
発現によって生成された後、これらは宿主細胞及び／または培養培地から分離／
非分離され、或いは精製されることができ、次に例えば一つ以上の追加成分を含
むことが可能な組成物の剤形、例えば一つ以上の薬剤学的に許容される賦形剤、
ビヒクルまたは担体（例：以下参照）を含む薬剤学的組成物として目的に応じて
使用されることができる。

【００４２】 前述したように、ポリペプチドはまたエフェクター分子に結合されることがで
きる。エフェクター分子は様々な機能、例えば腫瘍成長を抑制し、ポリペプチド
を腫瘍細胞のような細胞に取り込ませ、ポリペプチドを細胞内の適した部位に行
かせるなどいろいろ有用な機能を行う。

【００４３】 エフェクター分子は、例えば細胞毒性分子である。細胞毒性分子は蛋白質、ま
たは非蛋白質性有機化学療法剤である。適した化学療法剤の例は、例えばドキソ
ルビシン、タクソール及びシスプラチンを含む。

【００４４】 本発明のポリペプチドへの結合に適したエフェクター分子の一部追加の例は、
シグナル形質導入抑制剤、ｒａｓ抑制剤及び細胞サイクル抑制剤を含む。シグナ
ル形質導入抑制剤の一部例は、蛋白質チロシンキナーゼ抑制剤、例えばケルセチ
ン［参照：Grazieri et al., Biochim. Biophs. Acta 714, 415(1981)］、laven
dustin A［参照：Onoda et al., J. Nat. Produc. 52, 1251 (1989)］及びハー
ビマイシンＡ(herbimycin A)［参照：Ushara eta al., Biochem. Int., 41:831(
1988)］を含む。

【００４５】 蛋白質及び非蛋白質化学療法剤は、当分野の公知方法によって本発明の抗体に
結合されることができる。このような方法は、例えばドキソルビシン結合につい
て文献［参照：Greenfield et al., Cancer Research 50, 6600-6607(1990)］に
記述されたもの、及び白金化合物の結合について文献［参照：Kiseleva et al.,
Mol. Biol(USSR)25, 508-514(1991)］に記述されたものを含む。ドキソルビシ
ン、タクソール及びシスプラチンが好ましい。

【００４６】 本発明の抗体は、薬剤学的に許容される担体を用いて薬剤学的組成物に剤形化
することができる。これらの組成物は、前記物質のいずれか一つ以外に、薬剤学
的に許容される賦形剤、緩衝剤、安定化剤または当分野の専門家に十分公知にな
っているその他の物質を含むことができる。このような物質は無毒性でなければ
ならず、活性成分の効能を妨害すればならない。担体またはその他の物質の正確
な特性は、投与方式、例えば経口、静脈内、経皮または皮下、鼻腔、筋肉内、腹
腔内経路に依存することができる。剤形物は、好ましくは液体であり、通常ｐＨ
６.８〜７.６の非リン酸塩緩衝液を含む生理的食塩水または凍結乾燥した粉末で
ある。

【００４７】 本発明の抗体を含むか或いは輸送するための組成物は、好ましくは個々人に利
益(benefit)を与えるに十分な「治療学的に効果的な量」で個々人に投与される
。投与される実際量、投与速度及び時間経路は、治療される病気の特性及び重症
度によって異なる。治療処方、例えば容量に対する決定などは一般開業医師及び
他の医師の責任範囲に属し、通常治療される障害、個々の患者の状態、伝達部位
、投与方法及び医師に公知になっているその他の要因を考慮する。

【００４８】 本発明の抗体は、特に既存癌の治療及び初期治療または手術後の癌再発予防に
適切である。上述した技術及びプロトコルの例示を文献［参照：Remington’s P
harmaceutical Science, 16th edition, Oslo, A.(ed), 1980］から検索するこ
とができる。したがって、本発明はまた、（ａ）癌の治療または予防用薬剤を製
造するにおいて、本発明の抗体または核酸の用途、及び（ｂ）対象に本発明の抗
体または核酸の治療学的有効量を投与して癌を治療または予防する方法を提供す
る。

【００４９】 本発明の抗体は、有効量でヒトに投与される場合、腫瘍細胞の成長を相当抑制
することができる。最適容量は例えば、年齢、性別、体重、治療される状態の重
症度、投与される活性成分及び投与経路を含んだ多数の変数に基づいて医師によ
って決定される。一般に、ＥＧＦ収容体の飽和を可能にするポリペプチド及び抗
体の血清濃度が好ましい。約０.１ｎＭ超過の濃度が通常的に十分である。例え
ば、１００ｍｇ／ｍ２容量の抗体は約８日間約２０ｎＭの血清濃度を提供する。

【００５０】 大略的な指針として、抗体の容量は１０〜３００ｍｇ／ｍ２の量で週を単位と
して投与されることができる。抗体断片の相当容量は血清水準をＥＧＦ収容体の
飽和を可能にする濃度を超えるように維持させるため、より頻繁な間隔で使用さ
れなければならない。

【００５１】 投与のための一部適合な経路は、静脈内、皮下及び筋肉内投与を含む。静脈内
投与が好ましい。

【００５２】 本発明の抗体は追加の薬剤学的に許容される成分と共に投与されることができ
る。このような成分は、例えば免疫システム刺激剤及び化学療法剤、例えば上述
したものを含む。

【００５３】 組成物は、治療される状態に応じて、単独で投与されるか、或いは他の処理と
併行して別個または同時に投与されるか、或いは連続して投与されることができ
る。他の癌治療は、他のモノクローナル抗体、他の化学療法剤、他の放射性治療
技術または当分野公知の他の免疫治療を含む。本発明の組成物の一つの特定適用
は、手術に対する補助剤であって、すなわち癌を除去した後癌再発の危険を減少
させることを助けるためのものである。

【００５４】 注射（iv）が本発明の抗体の治療学的投与のための主要経路であるものと考察
され、静脈内輸送、またはカテーテル(catheter)または他の手術的チュービング
による輸送も用いられる。液体剤形は粉末剤形から再構成した後、使用すること
ができる。

【００５５】 また、抗体はミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子輸送システムまたは血
液を含んだ特定の組織に置かれる徐放性剤形によって投与することができる。徐
放性担体の適した例は、分割物品形態の半透過性重合体マトリックス、例えば坐
剤または微小カプセルを含む。移植可能または微小カプセル徐放性マトリックス
は、ポリアクチド［参照：US Patent No. 3,773,919, EP-A-0058481］、Ｌ−グ
ルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体［参照：Sidman et
al., Biopolymers 22(1):547-556, 1985］、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタ
クリレート）またはエチレンビニールアセテート［参照：Langer et al., J. Bi
omed. Mater. Res. 15:167-277, 1981, and Langer, Chem. Tech. 1:98-105, 19
82］を含む。ポリペプチドを含んだリポソームは十分公知になっている方法［参
照：DE 3,218,121A, : Epstein et al., PNAS USA, 82:3688-3692, 1985; Hwang
et al., PNAS USA, 77:4030-4034, 1980;EP-A-0052522, E-A-0036676; EP-A-0
088046; EP-A-0143949; EP-A-0142541; JP-A-83-11808; US Patent Nos. 4,485,
045 and 4,544,545］によって製造される。通常、リポソームは脂質含量約３０
モル％超過のコレステロール（選択比率はポリペプチド漏洩の最適速度によって
調節される）である小さい（約２００〜８００Å）単一薄膜型である。

【００５６】 本発明の抗体は、腫瘍部位または他の目的部位に局所的方法で投与されるか、
腫瘍または他の細胞を標的とする方式で輸送されることができる。

【００５７】 抗体の容量は、用いられる製剤の特性、例えばその結合活性及び生体内血漿半
減期、剤形中のポリペプチドの濃度、投与経路、投与部位及び速度、伴われる患
者の臨床的許容性、患者を苦しめる病理学的状態などによって決定され、医師の
技術範囲内に属する。例えば、容量は約１０μｇ〜１ｍｇ／容量の範囲であるが
、３００μｇのポリペプチド／患者／投与の容量が好ましい。一連の連続的接種
期間にそれぞれ異なる容量が使用される。医師は初期接種物を投与した後、相対
的により小容量の抗体でブーストすることができる。

【００５８】 本発明の抗体は、様々な方法でそれぞれ異なる部類の受領者に投与されること
ができる。抗体で処理することが可能な癌類型の例は、血漿癌、肺癌、乳房癌、
胃癌及び卵巣癌を含む。

【００５９】 本発明は、また癌に対して予防的免疫反応を増強させるための最適免疫化スケ
ージュルに関するものである。

【００６０】 本発明のそれぞれの態様に対する好ましい特徴は、必要な変更を加えて異なる
それぞれの態様に対するものと同一である。本願に言及された先行技術文献が法
律によって許容される完全な範囲内で参照として挿入される。

【００６１】 本発明は、さらに下記の非制限的実施例を参照して記述される。添付図が参照
される。

【００６２】 〔実施例〕 〔実施例１〕ａ３４０から誘導されたキメラ抗体の作製 Qiagen RNeasyキットを用いて製造者の指示に基づいて５×１０６ハイブリド
ーマａ３４０細胞［参照：Durrant et al., Prenatal Diagnostics, 14, 131, 1
994］から総ＲＮＡを分離させた。ＲＮＡをPromega(Southampton, UK)逆転写酵
素、緩衝液及びｄＮＴＰを用いてｃＤＮＡに転換させた。可変領域重鎖（ＶＨ）
及び軽鎖（ＶＬ）ｃＤＮＡを文献［参照：Jones and Bendig, Bio/Technology,
9, 188, 1991］の方法のプライマーセットを用いて増幅した。増幅されたＤＮＡ
をゲル−精製し、ベクトルｐＧｅｍ（登録商標）Ｔ Ｅａｓｙ(Promega)にクロー
ニングした。これらのＰＣＴ生成物をApplied Biosystems自動序列分析器モデル
３７３Ａ(Applied Biosystems, Warrington, UK)を用いて両方向に序列分析した
。生成されたＶＨ及びＶＬＤＮＡ序列が図１に示されており、蛋白質序列は図２
に示されている（ＶＬはＶＫと同一である）。

【００６３】 相補性決定領域（ＣＤＲ）の位置は他の抗体序列を参照して決定された［参照
：Kabat EA et al., US Department of Health and Human Services, 1991］。
ａ３４０ＶＨはマウス重鎖サブグループIII（Ｂ）に指定し［参照：Kabat et al
., 1991］、ａ３４０ＶＫはマウスカッパ鎖サブグループIIに指定することがで
きる［参照：Kabat et al., 1991］。

【００６４】 キメラ抗体は、ヒト不変領域に連結されたマウス可変領域からなる。キメラ抗
体は、また脱免疫化抗体を試験する場合、同一のヒト不変領域を有する有用な対
象物を提供する（下記参照）。ベクトルＶＨ−ＰＣＲ１及びＶＫ−ＰＣＲ１［参
照：Riechmann et al., Nature, 332, 323, 1988］が、マウスＶＨ及びＶｋ遺伝
子周囲に、リーダシグナルペプチド、リーダイントロン及びマウス免疫グロブリ
ンプロモータを含んだ５’フランキング序列、及びスプライス部位及びイントロ
ン序列を含んだ３’フランキング序列を導入するための鋳型として用いられた。
マウスＶＨ及びＶＫ序列をｐｆｕプルーフ・リーディング(proof reading)ポリ
メラーゼ(pfu turbo, Stratagene, La Jolla, California)を用いてＶＨ／ＶＫ
−ＰＣＲ１ベクトル序列（図３）とオーバーラップするプライマーによって増幅
した。これは全長のキメラ重鎖及び軽鎖の作製を可能にした。これらＰＣＴプラ
イマーはＶＨ／ＶＫ領域及びＶＨ／ＶＫＰＣＲ−１ベクトルからの５’及び３’
ヒト領域の増幅に用いられた。

【００６５】 ５’ＨｕＨ／Ｋ、ＶＨ／Ｋ及び３’ ＨｕＨ／Ｋ領域を連結させ、ＶＨ／Ｋ１
及びＶＨ／Ｋ１２ ＰＣＲプライマーの末端を認知するフラキングプライマー（
ＶＨ／Ｋ１３及びＶＨ／Ｋ１４）を用いて増幅し、完全なキメラ抗体発現カセッ
トを得た。この生成物をＢａｍＨI及びＨｉｎｄIII制限酵素で切断し、ＢａｍＨ
I／ＨｉｎｄIII切断ｐＵＣ１９に連結させた（酵素はPromega、ｐＵＣ１９はAme
rsham Pharmacia）。つぎに、発現カセットの序列を前述したように序列分析し
て確認した。

【００６６】 マウスＶＨ及びＶＫ発現カセットを、ｐＵＣ１９からマウス重鎖免疫グロブリ
ンプロモータ、リーダシグナルペプチド、リーダイントロン、ＶＨまたはＶＬ序
列及びスプライス部位を含むＨｉｎｄIIIないしＢａｍＨI断片として切断した。
これらを、それぞれヒトＩｇＧ１またはκ不変領域及び哺乳動物細胞から選別す
るためのマーカーを含む発現ベクトルｐＳＶｇｐｔ及びｐＳＶｈｙｇ（図４及び
図５）に転移させた。ＤＮａ序列は発現ベクトルにおいてＶＨ及びＶＫに対して
適するものと確認された。

【００６７】 〔実施例２〕ａ３４０脱免疫化序列のデザイン 下記実施例は、既存の治療抗体によって誘導されたヒト免疫反応が減少する方
法を記述する。これは２つの段階からなる。まず、マウス重鎖及び軽鎖序列をヒ
ト生殖細胞序列(human germ-line sequences)のデータベースと比較した。最も
類似している生殖細胞序列が脱免疫化序列のためのヒト鋳型として選ばれ、マウ
スをヒト生殖細胞序列へ転換させるのに必要な変化が導入された。抗体構造及び
結合に重要であると見なされた残基は、このような工程から除外し、変化させな
かった。この段階で保有していたマウス残基は、最終抗体においてＣＤＲに隣接
した、例えばＮ−末端にある残基を除いた、主に非表面の埋められた残基であっ
た。この工程は表面残基が主にヒトのものであり、埋められた残基が本来のマウ
ス序列でのものと同一なので、広くは「veneered」抗体と類似している。

【００６８】 本実施において、ａ３４０抗体に対する可変領域蛋白質序列は、個別的にヒト
生殖細胞ＶＨ／Ｋ序列と比較された。ａ３４０の場合、ａ３４０ＶＨ鎖は生殖細
胞序列ＶＨＤＰ４２及びＪＨ６と最も類似している。０３４０ＶＫ鎖はＶＨＤＰ
１５及びＪＨ２と最も類似性を示した。

【００６９】 第２段階は、免疫反応の原因になる抗体ＶＨ／Ｋエピトープの確認、及びこの
ような序列を除去するための抗体序列の変形を伴う。ａ３４０はペプチドスレッ
ディング(threading)の新しい工程によって分析された。分析は、ＭＰＴｖｅｒ
１.０ソフトウェア(Biovation, Aberdeen, UK)を用いてコンピュータによって行
った。ソフトウェアパッケージはＷＯ９８／５２９７６号に記載の方法によって
ペプチドスレッディングを行う。ソフトウェアはヒト群に残っているＨＬＡ Ｄ
Ｒアロタイプを９６％より多く含む１８個の相違するＭＨＣ部類IIＤＲ対立遺伝
子に結合する暫定的なペプチドのインデックス(index)を提供することができる
。

【００７０】 前述したヒト生殖細胞序列を模倣するように作られたａ３４０抗体鎖がこの方
法でスレッディングされ、暫定的なＭＨＣ部類IIエピトープが確認された。この
ようなエピトープは、ＭＨＣ部類II結合の原因となるアミノ酸を類似の残基で置
換させて突然変異された。このような置換は、一般的な抗体構造及び抗原結合能
は保有するがＭＨＣエピトープは除去されるように考案される。

【００７１】 それぞれの鎖の数個の変形物が、本来のマウスａ３４０からぞれぞれ異なる水
準のＭＨＣ結合鎖及び突然変異を有する一定範囲の抗体を提供するように作られ
た。３つのＤＩＶＫ及び４つのＤＩＶＨ変形物（ＶＫｂ、ＶＫｃ、ＶＫｄ、ＶＨ
ｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ及びＶＨｅ）が作られ、これらを除去するために導入された
ＭＨＣエピトープ及び突然変異を示すためのそれぞれの整列から見られる（図６
及び図７参照）。

【００７２】 ａ３４０抗体のＣＤＲに導入された突然変異は、２つの突然変異を含む。ＶＫ
ｂのI−Ｌ突然変異はＶＫ領域のＣＤＲ３に含まれる。同様に、ＶＨｅのＶ−Ａ
突然変異はＶＨ領域のＣＤＲ３に含まれる。このような置換はａ３４０抗体の抗
原結合能に対して相当な効果を有することができ、それぞれ異なる突然変異を有
する他の変形物を生成することに対する価値を説明する。

【００７３】 〔実施例３〕脱免疫化抗体序列の作製 脱免疫化された可変領域をオーバーラッピングＰＣＲ再組み合せ方法で作製し
た。クローニングされたマウスＶＨ及びＶＫ遺伝子が要求される脱免疫化序列に
対する骨格領域の突然変異誘発のための鋳型として用いられた。変形される領域
を含む数セットの突然変異誘発プライマー対が合成された。

【００７４】 突然変異誘発プライマー対の使用は４８〜５０℃のアニーリング温度の利用を
必要とした。ｐｆｕ ｔｕｒｂｏプルーフ・リーディングポリメラーゼ(Stratage
ne, La Jolla, California)を全ての増幅に用いた。ａ３４０キメラＶＨ及びＶ
Ｋ作製物は、変形される可変領域だけでなく、リーダシグナルペプチド、リーダ
イントロン及びマウス免疫グロブリンプロモータを含んだ５’フランキング序列
、及びスプライス部位及びイントロン序列を含んだ３’フランキング序列を導入
するための鋳型として用いられた。オーバーラッピングＰＣＲはキメラ発現カセ
ットを作るために同一のフラキングプライマー（ＶＨ／Ｋ１３及びＶＨ／Ｋ１４
）を用いて行われた。製造された脱免疫化Ｖ領域はｐＵＣ１９にクローニングさ
れ、全体ＤＡＮ序列がそれぞれの脱免疫化ＶＨ及びＶＬに適したものと確認され
た。

【００７５】 脱免疫化された重鎖及び軽鎖Ｖ−領域遺伝子をｐＵＣ１９からマウス重鎖免疫
グロブリンプロモータ、リーダシグナルペプチド、リーダイントロン、ＶＨまた
はＶＬ序列及びスプライス部位を含むＨｉｎｄIIIないしＢａｍＨI断片として切
断した。これらを、それぞれヒトＩｇＧ１またはκ不変領域及び哺乳動物細胞に
おける選別のためのマーカーを含む発現ベクトルｐＳＶｇｐｔ及びｐＳＶｈｙｇ
に転移させた。ＤＮａ序列は発現ベクトルにおいて脱免疫化ＶＨ及びＶＬに適し
たものと確認された。形質転換のための作製物を製造するために、（形質転換当
たり）約５０μｇのＶＫ及び２５μｇのＶＨプラスミドをｐｖｕI(Promega, Sou
thampton, UK)で完全に分解した。その後、このＤＮＡをエタノールに沈殿させ
、ＤＮＡペレットを乾燥させた。形質転換する前に、ペレットを（形質転換当た
り）１０μｌの分子生物学等級数に再懸濁した。

【００７６】 〔実施例４〕ａ３４０脱免疫化抗体の発現 抗体発現のための宿主細胞株は、ＥＣＡＣＣ(European Collection of Animal
Cell Cultures, Porton, UK)(ECACC No. 85110505)から入手した、非免疫グロ
ブリン生成マウス骨髄腫としてのＮＳＯであった。重鎖及び軽鎖発現ベクトルを
電気穿孔によってＮＳＯ細胞に様々な組み合わせで共同−形質感染させた。それ
ぞれのＤＩＶＨ鎖をそれぞれのＤＩＶＫ鎖と共に形質感染させて１２個の脱免疫
化変形抗体を収得した。また、キメラＶＨ及びＶＫ領域を形質感染させてキメラ
ａ３４０抗体（ａ３４０Ｃｈ）を発現する細胞株を生成した。ａ３４０Ｃｈ抗体
は非免疫化以前の抗体の結合を示すために対照物として使用された。

【００７７】 ＮＳＯ細胞は、７５ｃｍ３フラスコ(NalgeNunc Int., Rochester, NY, USA)で
、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）、５ｍｌの抗生剤／抗かび剤溶液(Gibco BRL, Pa
isley, UK. Cat no. 15240-062)、２.５ｍｌゲンタマイシン(Gibco BRL, Paisle
y, UK. Cat no. 15710-049)及び５ｍｌピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL, Paisl
ey, UK. Cat no. 11360-039)／培地５００ｍｌで補充されたＤＭＥＭ(Dulbecco
’s Modified Eagle’s Medium)２０ｍｌで成長させた。一応融合(confluent)す
ると、これらの細胞をペレットとなるように遠心分離し、同一の培地０.５ｍｌ
（形質転換当たり）に再懸濁した。つぎに、このような０.５ｍｌの細胞を予め
分解したＤＮＡに加え、沈殿させた後、再懸濁し、５分間氷上で恒温処理した。
その後、細胞を２ｍｍのキュベット(Biorad, Hercules, CA, USA)に分配し、Bio
rad GenepulserIIで１７０volt及び９７５μＦでパルスを加えた後、２０分間氷
上に置いてから回収した。次に、細胞を前記ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ２０ｍｌに
分配した後、３７℃、５％ＣＯ２で一晩中成長させた。

【００７８】 ２４時間後、細胞を遠心分離し、８５ｍｌの選別的ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（
上述と同一）（＋５ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌキサンチン及び１６０μｌの２.５ｍ
ｇ／ｍｌマイコフェノール酸／培地５００ｍｌ：これらはｐｓｖ重鎖ベクトルの
ｇｐｔ遺伝子に対する選別剤である）に再懸濁した。つぎに、ウェル当たり２０
０μｌ分取量で４×９６ウェルプレートに分配した。これらのプレートを耐性コ
ロニーが展開されるまで１０日間成長させた。

【００７９】 形質感染された細胞クローンによるヒト抗体の生成は、ヒトIｇＧに対してＥ
ＬＩＳＡで測定した。抗体を分泌する細胞株を選別し、初期には２４ウェルプレ
ートに増大させた。つぎに、これらを２５ｃｍ３及び７５ｃｍ３フラスコに増大
させた。抗体生成をヒト対照抗体の公知濃度と比較してＥＬＩＳＡで分析した。
その後、それぞれの形質感染から最適の抗体生成クローンを１７５ｃｍ３フラス
コに増大させ、他のクローンは液体窒素で凍結させた。

【００８０】 ＶＨバージョンＣで形質感染された細胞からは、いずれの抗体も生成されなか
った。相当数の形質感染体コロニーが３つの個々の場合に生成されたが、いずれ
の抗体生成コロニーも発見されない理由は不明である。ＶＨｈ、ＶＨｄ及びＶＨ
ｅを伴う変形物の生成は記述されているように続いたが、ＶＨＣは続かなかった
。

【００８１】 〔実施例５〕脱免疫化ａ３４０抗体の生成及び試験 抗体を０.５ｍｌのProSep Ａ（Bioprocessing Ltd）と共に一晩中撹拌させる
ことにより、５００ｍｌ〜１Ｌの静置培養物から精製した。つぎに、Prosep Ａ
を親和性クロマトグラフィによって分離した。抗体を０.１ＭグリシンｐＨ３.０
で溶出させ、中和させた後、ＰＢＳに対して一晩中に透析させた。精製された抗
体製剤を濾過によってフィルタ滅菌させ、４℃で貯蔵した。精製された抗体の濃
度はヒトＩｇＧに対してＥＬＩＳＡで測定された。

【００８２】 ａ３４０ＤＩ抗体変形物をＡ４３１細胞(ECCAC NO. 85090402)に対する結合に
ついてＥＬＩＳＡで試験した。これらの上皮単層細胞は、表皮成長因子収容体（
ＥＧＦＲ）を過発現するので、ＥＧＦＲ抗原に対するａ３４０の結合を検定する
のに適する。Ａ４３１細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地及び１％非必須アミノ
酸(NEAA, Gibco BRL, Cat no, 11140-035)を用いて９６ウェルプレートで融合さ
れるように成長させた。つぎに、培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
その後、これらを室温で１時間Immunoassay Stabiliser(Quadratech)によって恒
温処理した。つぎに、溶液を捨て、プレートを室温で乾燥させた後、プレートを
−４℃で貯蔵した。

【００８３】 ａ３４０Ｃｈ抗体と本来のマウスａ３４０抗体とを比較する検定によって、キ
メラ形態が同等な結合をするものと明らかになった（図９）。洗浄は０.０５％
Ｔｗｅｅｎ(Sigma)を有するＰＢＳで行った。検出はそれぞれキメラ及びマウス
抗体に対してホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合されたヤギ抗−ヒトＩｇ
Ｇ（The Binding Site, Cambridge, UK）及び羊抗−マウス(Tne Binding Site,
Cambridge, UK)で行った。色相はｏ−フェニレンジアミン物質(Sigma, Poole, D
orset, UK)を用いて展開させた。

【００８４】 その結果は暫定的にそれぞれ異なる結合能を有する相違した２次抗体の使用に
より直接的に比較されることができない。ところが、これはａ３４０ＣｈがＡ４
３１細胞のＥＧＦＲに結合し、ＤＩａ３４０変形物の結合親和性を比較するため
に、陽性対照物として使用できることを明確にした。

【００８５】 ＤＩａ３４０変形物を検定するために、陽性対照物としてＤＩ変形物の二重希
釈物（ウェル当たり１００ｎｇから）及びａ３４０キメラ抗体（ウェル当たり１
００ｎｇから）を免疫検定板を横切って適用させた。ＥＬＩＳＡはａ３４０Ｃｈ
抗体と比較される能力の結合を示す変形物を検索するために行った。

【００８６】 ３つの脱免疫化ａ３４０軽鎖と組み合わされた３つの脱免疫化ａ３４０重鎖に
対する結合検定結果が図１０〜図１２に示されている。脱免疫化軽鎖バージョン
ｂ、ｃ及びｄと組み合わされた脱免疫化重鎖バージョンｂ及びｄから構成された
抗体は、キメラ抗体に比べＡ４３１に対して同等の結合を示し、これはＶＫ領域
に導入された突然変異がａ３４０のＥＧＦＲ結合を損傷させないことを示す。と
ころが、ＶＨｅに特定突然変異の導入（ＶＨのＣＤＲ３でＶ−Ａ）でＥＧＦＲに
対する結合活性が約３〜４倍喪失された。

【００８７】 脱免疫化されたバージョンＶＨｄ.Ｖｋｂは只一つの暫定的なＭＨＣエピトー
プを含むため、リード脱免疫化されたａ３４０抗体として選ばれた。このような
最後のエピトープの除去により、抗体によるＥＧＦＲ結合が相当喪失された。

【００８８】 〔実施例６〕ＳＣ１００モノクローナル抗体とＥＧＦ間のアミノ酸相同性 BiosoftによるMacintosh用Gene Jockey IIソフトウエアパッケージを、類似／
相同部分を確認するために、蛋白質序列の対を成す序列比較に使用した。ＳＣ２
００のＣＤＲＨ３領域をＥＧＦの蛋白質序列と比較したら、アミノ酸相同性がＥ
ＧＦの２つの相違する領域から観測された。ところが、これらの領域がＥＧＦの
ＮＭＲ分析された構造で強調される場合、これらは２次構造によって共にし、Ｓ
Ｃ１００ ＣＤＲＨ３に似ているものと明らかになった。

【００８９】 〔実施例７〕試験管内腫瘍成長の抑制立証 Ａ４３１細胞を３７Åの１０％胎児子牛血清及び５％二酸化炭素が補充された
ＲＭＩ１６４０中で維持させた。生存細胞の融合培養物をトリプシン／ＥＤＴＡ
で収去し、洗浄した後、５×１０４細胞／ｍｌで再懸濁した。

【００９０】 その後、１００μｌ分取量の細胞懸濁液を増加量の３４０マウス抗体、脱免疫
化ＳＣ１００（ＶＨｄＶＫｄまたはＶＨｄＶＫｄ）抗体と共に平底９６ウェルプ
レートに分配した。これらの培養物を５日間放置した後、残り生存細胞の数をク
リスタルバイオレット染色で測定した。その結果は四重ウェルに対する平均＋Ｓ
Ｅである。エラーバー(error bar)が現れない場合、これはこれらがあまり小さ
くてデータポイントによって含まれるためである。

【００９１】 ＶＨｄＶＫｄ及びＶＨｄＶＫｄ ＳＣ１００クローンは両方ともマウスモノク
ローナル抗体３４０より効果的にＡ４３１の成長を抑制することができる。実際
、ＶＨｄＶＫｄクローンは細胞成長を７０％抑制した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はマウスモノクローナル抗体３４０Ｖｈ及びＶｋ序列のＤＮＡ序列を示す
。

【図２】 図２はマウスモノクローナル抗体３４０Ｖｈ及びＶｋ序列の解読された蛋白質
序列を示す。太字下線付きの序列は順次的なＣＤＲを示す。すなわち、ＣＤＲ１
はそれぞれの鎖に対して示した第１序列であり、ＣＤＲ３は最後の序列である。

【図３】 図３はマウスＶｈ及びＶｋ序列の増幅に用いられるプライマー序列を示す。

【図４】 図４は重鎖の発現のために用いられる発現ベクトルの図式的表示である。

【図５】 図５は軽鎖の発現のために用いられる発現ベクトルの図式表示である。

【図６】 図６は脱免疫化(deimmunised：ＤＩ)重鎖変形物におけるＭＨＣ結合エピトー
プの位置を含んだ、脱免疫化重鎖序列の整列を示す。

【図７】 図７は脱免疫化軽鎖におけるＭＨＣ結合エピトープの位置を含んだ脱免疫化軽
鎖序列の整列を示す。

【図８】 図８はａ３４０キメラ及びａ３４０マウスモノクローナル抗体を用いたＡ４３
１細胞結合検定の結果を示す。

【図９】 図９はＶｈｄ脱免疫化変形物のＡ４３１細胞結合検定の結果を示す。

【図１０】 図１０はＶｈｅ脱免疫化変形物のＡ４３１細胞結合検定の結果を示す。

【図１１】 図１１はＶｈｂ脱免疫化変形物のＡ４３１細胞結合検定の結果を示す。

【図１２】 図１２はＳＣ１００モノクローナル抗体とＥＧＦ間のアミノ酸相同性を説明す
る。ＳＣ１００抗体の免疫グロブリン重鎖の相補性決定領域３に対して類推され
たアミノ酸序列は表皮成長因子に対して公知の序列の特定部分と明確な相同性を
示す。

【図１３】 図１３はＥＧＦとＳＣ１００を比較する分子モデルである。これらの例示的図
はそれぞれＳＣ１００重鎖及びＥＧＦを示し、図６に示したアミノ酸相同性を有
する２つの領域間の構造的類似性を説明する。特に、これらのダイアグラムは類
似序列の２つの部分がＥＧＦ構造で密接に隣接する方式及びこれらがＳＣ１００
抗体のＣＤＲＨ３中の相同序列によって模倣される方式を示す。

【図１４】 図１４は、マウス３４０モノクローナル抗体と比較される、（ａ）脱免疫化Ｓ
Ｃ１００抗体（クロンＶｈｄＶｋｄ）及び（ｂ）脱免疫化ＳＣ１００抗体（クロ
ーンＶｈｄＶｋｂ）に対するＡ４３１細胞の成長抑制率（％）を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１２月９日（２００２．１２．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１４】

【手続補正書】

【提出日】平成１５年３月２５日（２００３．３．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００９１】 ＶＨｄＶＫｄ及びＶＨｄＶＫｄ ＳＣ１００クローンは両方ともマウスモノク
ローナル抗体３４０より効果的にＡ４３１の成長を抑制することができる。実際
、ＶＨｄＶＫｄクローンは細胞成長を７０％抑制した。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Isu Chemical Co., Ltd. <120> HUMANISED ANTIBODIES TO THE EPIDEMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR <130> 021107 <140> <141> <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Murine <220> <221> gene <222> (1)..(363) <223> a340VH <400> 1 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgaagg ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgctttcaat acctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attggtagtg gtggtgatag aacctactat 180 ccagacactg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca atggcaagaa caccctgtat 240 ttgcaattga acagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacattat 300 ggtcactacg tggactatgc tgtggactac tggggtcaag gaaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 2 <211> 336 <212> DNA <213> Murine <220> <221> gene <222> (1)..(336) <223> a340VK <400> 2 gatgtgttga tgacccaaac tccactctct ctgcctgtca gtcttgggga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaac 336 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Murine <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(121) <223> a340VH <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Gly His Tyr Val Asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Murine <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(112) <223> a340VK <400> 4 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 110 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VH1/VK1 <400> 5 gcatgttgac cctgacgcaa gcttatgaat atgcaaa 37 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VH2 <400> 6 gactcctgca gctggacctg ggagtgg 27 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VH3 <400> 7 ccaactccca ggtccagctg caggagtctg g 31 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VH4 <400> 8 ctcacctgag gagacggtga ccg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VH5 <400> 9 cggtcaccgt ctcctcaggt gag 23 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VH12 <400> 10 gcgatagctg gactgaatgg atcctataaa tctctg 36 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VK2 <400> 11 gggtcatcaa cacatcggag tggacacctg tgg 33 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VK3 <400> 12 caggtgtcca ctccgatgtg ttgatgaccc 30 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VK4 <400> 13 gtttaaattc tactcacgtt tgatttccag cttgg 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VK5 <400> 14 ccaagctgga aatcaaacgt gatgagaatt taaac 35 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VK12 <400> 15 gcgatagctg gactgaatgg atccaactga ggaagc 36 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VH13/VK13 <400> 16 gcatgttgac cctgacgc 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VH14/VK14 <400> 17 gcgatagctg gactgaat 18 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Murine <220> <223> DIVHb Variant (340VHb) <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Gly His Tyr Val Asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 121 <212> PRT <213> Murine <220> <223> DIVHc Variant (340VHc) <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Met Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Gly His Tyr Val Asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Murine <220> <223> DIVHd Variant (340VHd) <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Met Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Gly His Tyr Val Asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 121 <212> PRT <213> Murine <220> <223> DIVHe Variant (340VHe) <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Met Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Gly His Tyr Ala Asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> Murine <220> <223> DIVKb Variant (340VKb) <400> 22 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 110 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Murine <220> <223> DIVKc Variant (340VKc) <400> 23 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Murine <220> <223> DIVKd Variant (340VKd) <400> 24 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA61 CA04 CA07 CA20 DA02 EA04 FA02 FA18 GA14 GA18 GA27 HA17 4B064 AG26 CA10 CA19 CC01 CC24 CD30 DA05 DA14 4B065 AA01X AA58X AA72X AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 BA03 BA25 BB01 BC01 CA25 CA44 CA46 4C085 AA14 BB01 BB41 BB43 CC02 CC23 GG02 GG03 GG04 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA50 CA40 DA76 EA28 EA50 FA50 FA74

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＥＣＡＣＣに受託番号第９７０２１４２８号で寄託された細胞株から収得する
   ことが可能な抗体３４０のヒト化抗体。
2. 【請求項２】 請求項１において、ヒト抗体骨格に提供された抗体３４０のＣＤＲＨ３を含む
   抗体。
3. 【請求項３】 請求項２において、抗体３４０のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤ
   ＲＨ１及びＣＤＲＨ２の少なくとも一つをさらに含む抗体。
4. 【請求項４】 請求項３において、抗体３４０の過可変領域を含む抗体。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか１項において、抗体３４０の可変領域の実質的な
   部分を含む抗体。
6. 【請求項６】 請求項５において、図２に示した可変領域を含む抗体。
7. 【請求項７】 請求項１または２において、ＶＨｂ、ｃ、ｄまたはｅの一つ及びＶＫｂ、ｃま
   たはｄの一つを含む抗体。
8. 【請求項８】 請求項７において、ＶＨｄ及びＶＫｄまたはＶＨ及びＶＫｂを含む抗体。
9. 【請求項９】 請求項２ないし８のいずれか１項において、ヒト抗体骨格がヒト抗体の不変領
   域の全部または一部である抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１ないし９のいずれか１項において、結合パトーナーまたはエフェクタ
    ー分子に連結された抗体。
11. 【請求項１１】 請求項１ないし請求項１０のいずれか１項の抗体を暗号化する核酸。
12. 【請求項１２】 発現を調節するために請求項１１の核酸に作動的に連結された一つ以上の調節
    序列を有するベクトル。
13. 【請求項１３】 請求項１１の核酸または請求項１２のベクトルを含む細胞。
14. 【請求項１４】 請求項１１の核酸からの発現を含む、抗体の製造方法。
15. 【請求項１５】 請求項１４において、抗体の発現を生み出し或いは可能にする適合な条件の下
    で請求項３の宿主細胞を培養物として成長させる方法。
16. 【請求項１６】 請求項１ないし１０のいずれか１項の抗体及び薬剤学的に許容される担体を含
    む薬剤学的組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１ないし１０のいずれか１項の抗体または請求項１１の核酸の薬剤とし
    ての用途。
18. 【請求項１８】 請求項１ないし１０のいずれか１項の抗体または請求項１１の核酸の癌治療ま
    たは予防用薬剤製造の用途。
19. 【請求項１９】 治療学的有効量の請求項１ないし１０のいずれか１項の抗体または請求項１１
    の核酸を患者に投与する、癌治療または予防方法。