JP2001333796A - 微生物の拭き取り検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】検査対象に繊維層を接触させて微生物の拭き取
り検査を行う場合に、培地成分が検査対象に付着しない
で行える検査方法を提供すること。 【解決手段】検査対象物表面を拭き取った繊維層を、水
溶性高分子化合物層を上層に持つ培地に載せるか、また
は張り付けて培養を行い、微生物の存在を確認すること
を特徴とする微生物の拭き取り検査方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物を採取し、培
養するための方法に関する。更に詳しくは食品や環境中
の微生物を拭き取りによって採取し、検査するための方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、微生物の検査は、検査対象物の一
定面積をガーゼ・綿棒等で拭き取り、これを滅菌水また
は滅菌生理食塩水中で洗い、付着している菌体を滅菌水
または滅菌生理食塩水中に懸濁させ、得られた懸濁液を
用いて、予め作製しておいた寒天培地に塗布すること
により、微生物の培養を行う方法や、予め、粉末寒天
培地を溶解、滅菌した後、約４５℃程度に保っておき、
その寒天培地の一定量を、上記懸濁液の一定量を入れて
おいた滅菌ペトリ皿等に分注し、混釈後、寒天を固化
し、一定温度で培養後、生じた微生物のコロニー数を計
数する等の方法により行われてきた。微生物の拭き取り
検査を、より簡便で、迅速に行うためには、このよう
な、手間と時間のかかる培地の調製が省けることが好ま
しい。また、通常の方法では、多量のプラスチック製ペ
トリ皿を使用するため、培養後に多量の廃棄物が発生す
る等の問題が残されていた。

【０００３】再公表ＷＯ９７／２４４３２号公報には、
多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層からなる
微生物培地が開示されている。これを用いて微生物の環
境検査を行う場合は、多孔質マトリックス層上から水ま
たは微生物を培養するための栄養成分等を含む水を添加
した後に、多孔質マトリックス層を直接、検査対象に接
触し、拭き取りを行なうことで、微生物が採取でき、更
にこのまま培地が行える。しかし、検査対象に直接接触
して検査を行うため、培地成分や、溶解した水溶性高分
子化合物が検査対象に付着し、そこで微生物の増殖が起
こる恐れがあり、これらの付着が起こらない拭き取りに
よる微生物検査の手段の開発が要望されていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、検査
対象に繊維層を直接接触して、微生物の拭き取り検査を
行う場合に、培地成分が検査対象に付着しないで行える
検査方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するべく鋭意検討を重ねた結果、以下の構成をとる
ことにより、所期の目的が達成されることを知り得て、
本発明を解決するに至った。 （１）検査対象物表面を拭き取った繊維層を、水溶性高
分子化合物層を上層に持つ培地に載せるか、または張り
付けて培養を行い、微生物の存在を確認することを特徴
とする微生物の拭き取り検査方法。 （２）繊維層が目付４０〜１００ｇ／ｍ²のナイロンメ
ルトブロー不織布であることを特徴とする前記（１）項
記載の微生物の拭き取り検査方法。 （３）水溶性高分子化合物層が培地成分を含むポリビニ
ルアルコール層であることを特徴とする前記（１）項ま
たは前記（２）項記載の微生物の拭き取り検査方法。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物の拭き取り検査方法は、微生物の存在を
検査する方法であって、滅菌された繊維層により検査対
象物を拭き取った後、前もって用意しておいた、上層に
水溶性高分子化合物層を有する滅菌された培地に、拭き
取りを行った繊維層を載せて培養を行い、微生物の存在
を確認するか、または同様の培地に、拭き取りを行った
繊維層を張り付けて培養を行い、微生物の存在を確認す
る、検査対象物に付着している微生物の存在の有無を検
査する微生物の拭き取り検査方法である。

【０００７】本発明に用いられる水溶性高分子化合物層
を上層に持つ培地は、水または微生物を培養するための
栄養成分等を加えることによって微生物の生育しうる状
態となり、その構成には、培地の上層に水溶性高分子化
合物層を有していることが必要である。このとき、水溶
性高分子化合物層は、単層でも、複数の層から構成され
ていてもよい。

【０００８】本発明に用いられる水溶性高分子化合物層
を上層に持つ培地は、通常、滅菌状態で容器の中に密閉
されているものを使用し、特にシート状の容器に密閉さ
れているものが、軽量で携帯性に優れるために好ましく
用いることができる。例えば、透明フィルムと粘着シー
トとによって培地部分を密封したシート状培地や、微細
発泡シートと平滑表面を有するフィルムが一体化したシ
ート状培地等が挙げられる。

【０００９】本発明に用いられる培地成分としては、検
出目的の微生物に適したものであれば、特に制限なく用
いることができる。例えば、微生物を培養するための栄
養成分が使用できる。更に検出目的以外の微生物の生育
を抑える抗生物質、合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面
活性剤、無機塩等の選択剤を加えてもよい。また、生じ
たコロニーを見やすくするために、２，３，５−トリフ
ェニルテトラゾリウムクロライド等のテトラゾリム塩
や、ＰＨ指示薬等を加えてもよく、また特定の微生物を
検出するために発色または蛍光酵素基質を加えてもよ
い。

【００１０】微生物を培養するための栄養成分として
は、汎用の液体培地や寒天培地から寒天を除いた成分等
が利用でき、例えば、一般生菌検査用としては酵母エキ
ス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混
合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等やこ
れらにリン酸二カリウム及び／または塩化ナトリウムを
加えたもの等が、大腸菌・大腸菌群検査用としてはデゾ
キシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモ
ニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ニ
ュートラルレッド混合物、ペプトン・乳糖・リン酸二カ
リウム・エオジンＹ・メチレンブルー混合物等が、ブド
ウ球菌用としては肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム
・マンニット・フェノールレッド・卵黄混合物、ペプト
ン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グ
リシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が、
ビブリオ用としては酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ
硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリ
ウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁・ブロ
ムチモールブルー・チモールブルー混合物等が、腸球菌
用としては牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブド
ウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム・ブロムチモ
ールブルー・塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリ
ウム混合物等が、真菌用としてはペプトン・ブドウ糖混
合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブ
ドウ糖混合物等が用いられる。

【００１１】本発明の培地には、水溶性高分子化合物層
の下層に台紙として樹脂フィルムが積層されていてもよ
い。この樹脂フィルムは、水溶性高分子化合物層を製造
する際に、台紙として使用されるフィルムである。この
フィルムは必要に応じて、水溶性高分子化合物層から取
り除いてもよい。この樹脂フィルムの原料としては、ポ
リエステル、ポリオレフィン、及びナイロンから選ばれ
た少なくとも１種の樹脂が用いられる。これらの樹脂か
らなる樹脂フィルムを用いることで、粘着シートとの接
着性が良好となるために好ましい。また、樹脂フィルム
の表面が滑らかであれば、微細発泡シートとの接着性が
良好となるために好ましい。培地は、どのような形に切
断して利用してもよい。

【００１２】本発明に使用される繊維層を形成する繊維
としては、ナイロン繊維，ポリアクリロニトリル繊維，
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）繊維，エチレン酢酸ビ
ニル共重合体繊維，ポリエステル繊維（親水化処理した
ポリエステル繊維がより好ましい），ポリオレフィン繊
維合成繊維（親水化処理したポリオレフィン繊維がより
好ましい），ポリウレタン繊維等の合成繊維、レーヨン
繊維等の半合成繊維、羊毛(獣毛)，絹，コットン繊維，
セルロース繊維，パルプ繊維等の天然繊維、ガラス繊維
等の無機繊維等が例示できる。上記繊維のうち、更に好
ましくは、ナイロン繊維、コットン繊維、セルロース繊
維、及びレーヨン繊維である。これらの繊維を用いて作
られた、編織布，不織布等の布帛からなる繊維層が使用
できる。

【００１３】本発明に用いられる繊維層としては、メル
トブロー製法で作製したナイロンメルトブロー不織布
や、ニードルパンチにより作製したレーヨン不織布が、
親水性であり、更に拭き取りがし易いことから好まし
い。また、繊維層の目付は、４０〜１００ｇ／ｍ²が好
ましく、より好ましくは５０〜９０ｇ／ｍ²であり、更
に好ましくは５５〜８０ｇ／ｍ²である。目付が４０ｇ
／ｍ²を大幅に下回る場合には、拭き取りを行った場合
に、繊維層に添加した滅菌水を保持しにくく、拭き取り
時に繊維層が破れることもある。逆に目付が１００ｇ／
ｍ²を大幅に上回る場合には、繊維層が固くなり、拭き
取りがしにくくなり、水溶性高分子化合物層に乗せて培
養したとき、水溶性高分子化合物層中に含まれる培地成
分が繊維層の表層まで上昇しにくく微生物の生育が遅れ
る傾向がある。なお、これらの繊維層は、滅菌したもの
を使用する必要がある。

【００１４】本発明で用いられる水溶性高分子化合物層
を形成するための水溶性高分子化合物としては、水等に
より溶解して１×１０^-2Ｐａ・ｓ（４０℃で測定した粘
度）以上の粘度を示し、微生物の生育を阻害しないもの
が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコー
ル、セルロース誘導体、ポリアクリル酸誘導体、でんぷ
ん誘導体、蛋白質、蛋白質誘導体、多糖類等が使用でき
る。この中でもポリビニルアルコールがより好ましく、
鹸化度が７５〜９５％、分子量が２５０００〜２５００
００のポリビニルアルコールが特に好ましい。

【００１５】本発明で用いられる培地は、少なくとも１
層の水溶性高分子化合物層からなる。この水溶性高分子
化合物層は単層であってもよいが、２層以上の多層であ
ってもよい。水溶性高分子化合物層が多層の場合には数
層に分けて作製することもできる。なお、水溶性高分子
化合物層を多層構造にする場合には、各層が密着してい
ることが好ましい。また、あまりに多くの層を形成して
も製造工程の増加に伴うコストアップに見合う効果が得
られないので、５層を越えた多層とすることにはあまり
意味はない。繊維層に接する水溶性高分子化合物層中の
水溶性高分子化合物の目付（水溶性高分子化合物自体の
含有量）は２〜２０ｇ／ｍ²がより好ましく、更に好ま
しくは３〜１２ｇ／ｍ²である。

【００１６】また、本発明の微生物培養器を微生物培地
として利用する場合には、水溶性高分子化合物層に、微
生物培地の製造時に前もって微生物を培養するための栄
養成分を添加しておくか、微生物の培養時に、微生物を
培養するための栄養成分を含む水を加えることが必要で
ある。

【００１７】以下に本発明で利用されるシート状培地の
製造方法の一例として、微細発泡シートを容器として用
いた例を示す。

【００１８】（シート状培地作製）微細発泡体層／白色
ポリエステルシートからなる微細発泡シートを、ポリプ
ロピレンフィルムのカバーで覆い密着させることで、シ
ート状培地の容器とする。

【００１９】（培地作製）２０重量％ポリビニルアルコ
ール水溶液、培地成分（微生物を培養するための栄養成
分を含む）、及び蒸留水からなる溶液を作製し（以下の
溶液の調製に当たってはすべて、溶液が均一となるよう
に最後にポリビニルアルコール溶液を加える）、この溶
液を、ガラス板に固定したポリエチレンテレフタレート
台紙に適当な目付となるようにアプリケーターを用いて
コーティングし、１１０℃で３分間乾燥させる。

【００２０】（シート状培地作製）作製した培地を直径
５ｃｍの円形にカットし、その台紙側を、カバーを剥が
したシート状容器の微細発泡シート（微細発泡体層側）
の中央部分に接着し、再度カバーをかけ発泡シートと密
着させる。エチレンオキサイドガス、γ線等により滅菌
を行ない、シート状培地とする。

【００２１】（使用法１）繊維層として滅菌済みの不織
布を用い、これを滅菌水で湿らせた後、検査対象面を拭
き取り、シート状培地のフィルムの一部を剥がし、水溶
性高分子化合物上に前記不織布を乗せ、フィルムを再接
着して、適切な温度で培養を行う。

【００２２】（使用法２）繊維層として滅菌済みの不織
布を用い、これをそのまま検査対象面に接触させ、シー
ト状培地のフィルムの一部を剥がし、前記不織布を水溶
性高分子化合物上に乗せ、不織布上に滅菌水または滅菌
生理食塩水を滴下して、フィルムを再接着して、適切な
温度で培養を行う。

【００２３】

【実施例】次に実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
また、本発明で用いられる測定法については以下に記載
する。 （１）目付 ２０ｃｍ×２０ｃｍのサイズに切断した繊維層の重量を
測定後、１ｍ²当たりの重量に変換した値（単位：ｇ／
ｍ²）。 （２）水溶性高分子化合物層中の水溶性高分子化合物の
目付 １０ｃｍ×１０ｃｍのサイズに切断した水溶性高分子化
合物層を乾燥し、その重量を測定後、１ｍ²当たりの重
量に変換した値（単位：ｇ／ｍ²）。培地成分を含む水
溶性高分子化合物層では比例計算により培地成分を除し
た値。多層構造としたときは、各層を塗布乾燥後、重量
を測定し、各工程毎の差を求めた。 （３）厚み シート及びフィルムの厚みは、（株）東洋精機製作所テ
クネスメーターＢ１により測定を行った。

【００２４】実施例１ 微細発泡シートとして、厚さ２６０μｍ、サイズ８０ｍ
ｍ×９０ｍｍのテクノヒロセ（株）製ＨＩＳＴＡＲ-Ｓ
Ｋ（微細発泡体層／白色ポリエステルシート）を用い、
これに、厚さ６０μｍ、サイズ９０ｍｍ×９０ｍｍのポ
リプロピレンフィルムのカバーを１０ｍｍはみ出るよう
に被せ、密着させることで、シート状容器とした。次
に、２０重量％ポリビニルアルコール水溶液５００ｇ、
肉エキス０．８ｇ、ペプトン２．４ｇ、ＮａＣｌ０．８
ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄０．８ｇを加え、これを蒸留水で１ｄｍ
³とし、この溶液を、ガラス板に固定した４００ｍｍ×
３００ｍｍ×０．０５ｍｍのポリエチレンテレフタレー
ト台紙上に、１１５ｇ／ｍ²となるようアプリケーター
を用いてコーティングし、１１０℃で３分間乾燥させ、
培地を製造した。作製した培地を直径５０ｍｍの円形に
カットし、その台紙側を、シート状容器のカバーを剥が
した微細発泡シートの中央部分に接着し、再度カバーを
被せ、発泡シートに密着させた。これをエチレンオキサ
イドガス滅菌し、シート状培地とした。上記シート状培
地から、培地の上面がすべて露出するまで、フィルムを
開け、繊維層として滅菌済みポリエチレンフィルム−不
織布積層物を用い、これに滅菌水０．５ｍｌを添加し、
これの不織布側で、まな板を拭き取り、更にこの繊維層
の不織布側に０．５ｍｌの水を加えた後、繊維層の不織
布側と培地とを重ね、再度、フィルムを被せ、密閉後、
３５℃の恒温槽内で２４時間培養した。培養により赤色
のスポットが生じた。このスポットの数えることにより
生菌数を計測できた。

【００２５】実施例２ 実施例１と同様に作製したシート容器を用いた。また、
培地としては、２０重量％ポリビニルアルコール水溶液
５００ｇ、肉エキス２．４ｇ、ペプトン７．２ｇ、Ｎａ
Ｃｌ２．４ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄２．４ｇ、塩化２，３，５−
トリフェニルテトラゾリウム１０ｍｇを加え、これを蒸
留水で１ｄｍ³とし、この溶液を、ガラス板に固定した
４００ｍｍ×３００ｍｍ×０．０５ｍｍのポリエチレン
テレフタレート台紙上に、１１５ｇ／ｍ²となるようア
プリケーターを用いてコーティングし、１１０℃で３分
間乾燥させた。このようにして作製した培地を直径５０
ｍｍの円形にカットし、その台紙側を、シート状容器の
カバーを剥がした微細発泡シートの中央部分に接着し、
再度カバーをかけ、発泡シートに密着させた。これをエ
チレンオキサイドガス滅菌し、シート状培地とした。上
記シート状培地から、培地の上面がすべて露出するま
で、フィルムを開け、繊維層として滅菌済みポリプロピ
レン円盤に接着した不織布を用い、これに０．５ｍｌを
添加し、これの不織布側で、テーブルを拭き取り、更に
これから不織布を剥がし、この不織布の拭き取った面の
反対側が培地に接するように重ね、滅菌水０．５ｍｌを
追加後、再度、フィルムを被せ、密閉後、３５℃の恒温
槽内で２４時間培養した。培養により赤色のスポットが
生じた。このスポットの数えることにより生菌数を計測
できた。

【００２６】

【発明の効果】環境中の微生物の拭き取り検査が簡便に
行え、なおかつ、培地成分を含まない繊維層により拭き
取りが行えるので、検査対象物に培地成分が付着せず、
検査対象を汚染する心配がなく、良好に微生物検査が行
える。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検査対象物表面を拭き取った繊維層を、
   水溶性高分子化合物層を上層に持つ培地に載せるか、ま
   たは張り付けて培養を行い、微生物の存在を確認するこ
   とを特徴とする微生物の拭き取り検査方法。
2. 【請求項２】 繊維層が目付４０〜１００ｇ／ｍ²のナ
   イロンメルトブロー不織布であることを特徴とする請求
   項１記載の微生物の拭き取り検査方法。
3. 【請求項３】 水溶性高分子化合物層が培地成分を含む
   ポリビニルアルコール層であることを特徴とする請求項
   １または請求項２記載の微生物の拭き取り検査方法。