DE69223502T2

DE69223502T2 - Gen für die glykoprotease aus pasteurella haemolytica

Info

Publication number: DE69223502T2
Application number: DE69223502T
Authority: DE
Inventors: Khalid Abdullah; Reggie Lo; Alan Mellors
Original assignee: University of Guelph
Current assignee: University of Guelph
Priority date: 1991-01-15
Filing date: 1992-01-15
Publication date: 1998-07-16
Anticipated expiration: 2012-01-16
Also published as: US5543312A; WO1992013078A3; EP0567503B1; ATE161050T1; DE69223502D1; EP0567503A1; DK0567503T3; GB9100825D0; WO1992013078A2; CA2101781A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf das Klonieren, Sequenzieren und Exprimieren von DNA eines Gens für Pasteurella haemolytica Glycoprotease. Die genetische Information und Expressionsprodukte können in einer Vielzahl von Testarten benutzt werden. Das gereinigte Glycoproteaseenzym kann in einer Vielzahl von chemischen und biochemischen Modifikationen von Glycoproteinen benutzt werden.
P. haemolytica ist der Hauptmikroorganismus, der mit pneumonischer Rinder- Pasteurellose assoziiert ist, ein Hauptursache für Krankheit und Tod von zum Verzehr bestimmten Rindern in Nordamerika. Martin et al. 1980. "Factors associated with mortality in feedlot cattle: The Bruce County beef cattle project." Can. J. Comp. Med.; Yates, W. D. G. 1982. "A review of infectious bovine rhinotricheitis, shipping fever pneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle." Can. J. Comp. Med. P. haemolytica wurde auf der Basis von löslichen oder extrahierbaren Oberflachenantigenen in 16 Serotypen eingeteilt. Biberstein, E. L. 1978. "Biotyping and serotyping of Pasteurella haemolytica." Methods Microbiol. Unter den 16 Serotypen ist Serotyp A1 der Hauptmikroorganismus, der von pneumonischen Lungen isoliert wurde. Smith, P.C. 1983. "Prevalence of Pasteurella haemolytica in transported calves." Am. J. Vet. Res.; Yates, W. D. G. 1982. "A review of infectious bovine rhinotricheitis, shipping fever pneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle." Can. J. Comp. Med. P. haemolytica A1 stellt eine Anzahl von Antigenen her, welche wahrend seines Wachstums in den Kulturüberstand sezerniert werden. Diese Antigene schließen ein hitzelabiles Cytotoxin, welches spezifisch für Leukocyten von Wiederkauern ist ein, Shewen et al. 1988. "Vaccination of calves with leukotoxic culture supernatant form Pasteurella haemolytica." Can J. Vet. Med., ein serotyp-spezifisches Außenmembranprotein, Gonzalez et al. 1986. "Cloning of Serotype-Specific Antigen form Pasteurella haemolytica A1." Infect. Immun., eine für Sialoglycoproteine spezifische Glycoprotease, Otulakowski et al. 1983. "Proteolysis of Sialoglycoprotein by Pasteurella haemolytica Cytotoxic Culture Supernatant." Infect. Immun. und Neuroaminidase, Frank, G. H. 1981. "Neuraminidase Activity of Pasteurella haemolytica Isolates." Infect. Immun. Impfung von Kalbem mit bakterienfreiem Kulturüberstand von Kulturen in der logarithmischen Phase induziert Resistenz gegen experimentelle Herausforderung und es ist ein Vaccin, das auf dem Kulturüberstand basiert, entwickelt worden (Presponse ), Shewen et al. 1988. "Efficacy testing a Pasteurella haemolytica extract vaccine." Vet. Med.; Shewen et al. 1988. "Vaccination of calves with Ieucotoxic culture supernatant from Pasteurella haemolytica." Can. J. Vet. Med.
Die Glycoprotease von P. haemolytica A1 ist hochspezifisch für O-glycosylierte Glycoproteine, so daß Proteine, denen umfangreiche O-Sialoglycopeptidreste fehlen, nicht von der Glycoprotease gespalten werden. Das bestcharakterisierte Glycoproteinsubstrat für die Glycoprotease ist Glycophorin A aus menschlichen Erythrocyten. Wir haben festgestellt, daß Spaltung durch das Enzym entweder in situ auf der Oberfläche von Plasmamembranen von Erythrocyten oder wenn das Glycoproteinsubstrat in Lösung vorliegt, auftritt. Dieses Enzym ist eine neutrale Metalloprotease und ist nicht toxisch für kultivierte Säugerzellen, einschließlich pulmonaren Rinder-Macrophagen, Rinderendothelialzellen und Erythrocyten, Otulakowski et al. 1983. "Proteolysis of Sialoglycoprotein by Pasteurella haemolytica Cytotoxic Culture Supernatant." Infect. Immun. Die Rolle der Glycoprotease in der Pathogenese und in der Induktion einer Immunantwort ist unbekannt. Eine homogene Enzymzubereitung der Glycoprotease ist schwierig durch herkömmliche biochemische Verfahren zu isolieren.
Wir haben ein Gen für die P. haemolytica Glycoprotease entdeckt und kloniert. Wir haben das Gen kloniert, sequenziert und exprimiert. Das Expressionsprodukt des Gens kann isoliert werden, um die Glycoprotease in homogener Form zur Verfügung zu stellen. Das Enzym hat eingeschränkte Substratspezifität, welches eine Vielzahl von chemischen und biochemischen Verwendungen in der Modifikation von Glycoproteinen hat. Solche Verwendungen schließen ein, Charakterisieren von Glycoproteinen durch spezifische Schnittstellen der Glycoprotease; die Glycoprotease kann benutzt werden, um Komponenten der Immunantwort durch die ausgewählte Spaltung von Oberflächenmolekülen auf Immunzellen aufzugliedern. Die Glycoprotease kann ebenfalls benutzt werden, um Immunreinigung von verschiedenen Arten von Zellen durch Spaltung von Oberflächen-Glycoproteinen zu erleichtern.
Demgemäß sind Eigenschaften der Erfindung wie folgt:
1) Das Gen codiert für das P. haemolytica Enzym, welches eine einzigartige Substratspezifität hat. Wie vorher berichtet spaltet es das Zelloberflächen O- Sialoglycoprotein Glycophorin A entweder in situ auf der Oberfläche von menschlichem Erythrocyten oder wenn das Protein frei in Lösung vorliegt. Die Hauptschnittstelle ist die Amidbindung zwischen den Arginin-31 und den Aspartat-32 Resten. Nebenschnittstellen scheinen an Ala7-Met8, Try34-Ala35, Glu60-Arg61, Ala65-His66 und His67-Phe68 Amidbindungen vorzuliegen.
2) Das Enzym spaltet andere Glycoproteine. Das Enzym spaltet das menschliche Zelloberflächenglycoprotein CD34 (ursprüngliches Knochenmarkstammzellantigen), CD43 (Leukosialinlsialophorin), CD44 (Hyaluronatrezeptor) und CD45 (gewöhnliches Leukocytenantigen; engl. leukocyte common antigen). Andere Zelloberflächenglycoproteine von Menschen und anderen Organismen sind gute Substrate für die Enzymtätigkeit.
3) Das Gen kann benutzt werden, um rekombinantes Enzym frei von anderen Proteinen von P. haemolytica zu machen und dieses Enzym kann benutzt werden, um spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen. Die Antikörper sind nützlich für das Screenen anderer Organismen, welche ähnliche Enzyme machen könnten. Die Antikörper können benutzt werden, um die Enzymtätigkeit zu neutralisieren, die Rollen des Enzyms in Krankheitsabläufen zu bestimmen, von denen man weiß, daß das Bakterium P. haemolytica daran beteiligt ist und um nach Beteiligung dieses Bakteriums in der Diagnose der Infektion zu screenen.
4) Die Gensequenz kann benutzt werden, um Sonden herzustellen, DNA Polynudeotide, die mit nativer DNA anderer Bakterien hybridisieren und das Auftreten dieser oder ähnlicher (homologer) Gene in anderen Bakterien detektieren.
5) Die Gensequenz hat umfangreiche Homologie mit einem unbekannten Gen von Escherichia coli aufgedeckt, ein Gen, welches Orfx genannt wird. Das E. coli Genprodukt kann ein proteolytisches Enzym mit einiger Ähnlichkeit zu der P. haemolytica Glycoprotease sein.
6) Das Enzym kann benutzt werden, um neue biologische Produkte durch die Spaltung von O-Sialoglycoproteinen natürlicher Herkunft herzustellen. Die Spaltung des menschlichen Blutplättchen- und endothelialen Zelloberflächenglycoproteins Thrombomodulin durch die P. haemolytica Glycoprotease kann benutzt werden, um ein lösliches Antikoagulant mit möglichen Verwendungen in der Behandlung von Blutgerinnungsleiden, einschließlich DIC (disseminierte intravasculäre Koagulopathie) herzustellen.
Verschiedene Aspekte der Erfindung sind wie folgt:
1) Ein gereinigtes DNA-Molekül, bestehend aus der DNA-Sequenz in Fig. 4 von Basenpaarposition 1 bis 975.
2) Ein gereinigtes DNA-Molekül, bestehend aus mindestens 12 Nucleotiden, ausgewählt aus der Gruppe von Nucleotiden, die von den Basenpaarpositionen 1 bis 975 in Fig. 4 repräsentiert werden.
3) Ein gereinigtes DNA-Molekül, bestehend aus einer DNA-Sequenz, die eine Glycoprotease codiert, welche eine Aminosäuresequenz aus Fig. 4 enthält.
4) Ein gereinigtes DNA-Molekül, bestehend aus mindestens 18 Nucleotiden, welche ein Fragment einer Glycoproteaseaminosäuresequenz codieren, wobei das Fragment aus mindestens 6 korrespondierenden sequentiellen Aminosäureresten der Aminosäuresequenz aus Fig. 4 ausgewählt ist.
5) Eine gereinigte DNA-Probe, bestehend aus einer DNA-Sequenz aus Punkt 2.
6) Ein rekombinanter Klonierungsvektor, welcher ein DNA-Molekül aus Punkt 1, 2 oder 3 enthält.
7) Ein Wirt, transformiert mit einem rekombinanten Expressionsvektor, welcher ein DNA-Molekül aus Punkt 1, 2 oder 3 enthält.
8) Ein Verfahren zum Screenen einer biologischen Probe, um die Anwesenheit eines Gens zu bestimmen, welches eine Glycoprotease aus Fig. 4 codiert, umfassend:
i) Das zur Verfügungstellen einer biologischen Probe, die von einer Quelle stammt, von der vermutet wird, daß sie ein Serotyp von P. haemolytica ist, welcher die Glycoprotease herstellt,
ii) Durchführen eines biologischen Tests zum Bestimmen der Gegenwart in einer biologischen Probe von mindestens einem Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Glycoproteasegensequenz von Fig. 4 und
b) Glycoproteaseaminosäuresequenz von Fig. 4.
Ein Verfahren zum rekombinanten Herstellen von Glycoprotease oder einem Fragment der Glycoproteaseaminosäuresequenz, umfaßt das Kultivieren eines Wirtes aus Punkt 7. Die Glycoprotease kann von solch einem Kulturmedium getrennt und gereinigt werden. Abhängig von der Auswahl des DNA-Moleküls stellt die exprimierte DNA- Sequenz entweder die Glycoprotease oder Fragmente der Glycoproteaseaminosäuresequenz her. Der bevorzugte Wirt für die rekombinante Herstellung von Glycoprotease ist E. coli.
Gesichtspunkte der Erfindung werden mit Bezug auf die Zeichnungen dargestellt, wobei:
FIG. 1. Glycoproteaseaktivität in rekombinanten E. coli Klonen. Spuren: a, ¹²&sup5;I- Glycophorin A alleine; b, E. coli, welches pBR322 enthält; c, E. coli welches pPH1 enthält; d, E. coli welches pPH8 enthält; e bis k sind die anderen E. coli Klone der genomischen Genbank. (GPA)&sub2;, Glycophorin A Dimer; GPA, Glycophorin A Monomer.
FIG. 2. Restriktionskarten von Plasmiden, welche in dieser Untersuchung benutzt wurden. (A) Restriktionskarte von Insert-DNA in pPH1 und pPH8. Die Pfeile zeigen die Richtung und das Ausmaß der sequenzierten DNA an. (B) Subklonierung des 3,3-kbb BamHI-BgIII Fragmentes von pPH1 in pTTQ19 in beiden Orientierungen. p, Richtung der Expression vom tac- Promotor in pPH1.1 und pPH1.2; dunkle Balken mit ΔA und ΔE, innere Fragmente, welche jeweils in den Plasmiden pPH 1.1 A und pPH 1.1 E deletiert sind; offener Balken, offenes Leseraster, welches für gcp wie von der DNA-Sequenz abgeleitet, codiert. Abkürzungen: A, Aval; B,BamHI ;Bg, BgIII; B/S, BamHI-Sau3A-Überschneidung der Schnittstellen; E,EcoRI;H, HindIII; X, Xba1.
FIG. 3. Maxizellmarkierung der plasmidcodierten Proteine. Autoradiogramm einer 15 %igen SDS-PAGE, enthaltend [³&sup5;S]Methionin-markierte Proteine, welche in E. coli exprimiert wurden, welches pBR322 enthält (Spur a), pPH1 (Spur b), pPH1.1 (Spur c), pPH1.2 (Spur d), pPH1.1A (Spur e), pPH1.1E (Spur f) und pTTQ19 (Spur g). Die β-Lactamase von P8R322 und das Lac Repressorprotein von pTTQIg sind durch Bla und I jeweils gekennzeichnet. Molekulare Größenstandards, beginnend von oben, repräsentieren 92,5; 66; 43; 31 und 21 kDa. Die gefüllten Kreise im Gel zeigen die Position des 53-kDa-Proteins, welches der Glycoprotease entspricht.
FIG. 4. Nucleotidsequenz von Insert-DNA zwischen den BamHI- und EcoRI Schnittstellen in pPH 1.1. Die Zahlen über jeder Linie beziehen sich auf Nucleotidpositionen, welche willkürlich von -140 an der BamHI- Schnittstelle bis 1.170 an der EcoRI-Schnittstelle numeriert sind. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz für die Glycoprotease ist unter der DNA- Sequenz gezeigt. Die umgekehrten Wiederholungen stromabwärts von dem gcp-Translationsstopcodon sind mit Pfeilen unterstrichen. Abkürzungen: B, BamHI; E, EcoRI
FIG. 5. Hydropathisches Profil (engl. hydropathy profile) des Glycoproteaseproteins. Das benutzte Verfahren war das von Klein, P., M. Kanehisa und C. Delisi. 1985. The Detection and Classification of Membrane-Spanning Proteins. Biochem. Biophys. Acta. 815:468476. Die vertikale Achse gibt die Skala der hydrophoben (positiven) und hydrophilen (negativen) Werte an, welche für jedes Fenster von neun Resten festgestellt wurde. Die horizontale Achse gibt die Skala für die Aminosäuren im Protein an.
FIG. 6. Homologie zwischen der Glycoprotease und Orfx. Die segmentierten vertikalen Linien zeigen die Lokalisierung identischer Reste. Die segmentierten horizontalen Linien repräsentieren Repressorbrüche, welche eingefügt wurden, um die Homologie zu maximieren. Ein potentieller Zinkligand der Glycoprotease und von OrfX wird in der Region bei His-111 und His-115 gefunden.
FIG. 7. Hohe Expression und Sekretion der Glycoprotease. (A) Gesamtzellproteine, welche von Kulturen von E. coli HB101, die pTTQ18 enthalten (Spur 1) exprimiert wurden, nicht induziertes pGP1 (Spur 2), pTTQ18 (Spur 3) und pGP1, induziert mit IPTG (Spur 4) aufgetrennt durch eine 15 %igen SDS- PAGE und mit Coomassie blue gefärbt.
FIG. 8. Enzymaktivität der hochexprimierten Glycoprotease in E. coli HBI 01. Spur a, ¹²&sup5;I-Glycophorin A alleine; Spur b, negative Kontrolle, Proteinextrakt von E. coli, welches pTTQ18 enthält; Spur c, positive Kontrolle, konzentrierter Kulturüberstand von P. haemolytica Al; Spur d, Proteinextrakt von E. coli, welches pGPI enthält nach IPTG-Induktionen. (GPA)&sub2;, Glycophorin A Dimer; GPA, Glycophorin A Monomer. A1 Kulturüberstände (0,3 mg Protein, pH 4,5 Fraktion) in HEPES Puffer wie oben, über 80 Min. Die Inkubationen sind: Spur (a) keine Inkubation; Spur (b) 5 Min.; Spur (c) 10 Min.; Spur (d) 20 Min.; Spur (e) 40 Min.; Spur (f) 80 Min. A&sub2; ist Glycophorin A Dimer, A ist Glycophorin A Monomer.
Die Entdeckung der Gensequenz, welche für die P. haemolytica Glycoprotease codiert, stellt eine Anzahl an bedeutenden Vorteilen in der Detektion, molekularer Tests, Proteinmechanismen und medizinischer Pflege bezogen auf Krankheiten, die von P. haemolytica Infektionen ausgelöst werden und die Verwendungen des Enzyms in der Spaltung von Glycoproteinen und im besonderen O-Sialoglycoproteinen zur Verfügung. Verschiedene DNA-Sonden können aus der Sequenz, die zu Zwecken des Detektierens komplementärer DNA-Sequenzen in verschiedenen Arten von biologischen Materialien, einschließlich lebendiger Zeilen beschrieben wurde, entwickelt werden. Teile der oder die gesamte Sequenz können in einem geeigneten Expressionsvehikel exprimiert werden, welches bakterielle Zellen, Viren, Pflanzen&sub3; Tiere und im besonderen Säugerzellen sein können. Die Glycoprotease, wie durch die Expression der DNA hergestellt oder Fragmenten des Enzyms wie durch korrespondierende Fragmente der DNA hergestellt, können benutzt werden, um verschiedene Spaltungsoperationen an Molekülen oder anderem biologischem Material, einschließlich lebender Zellen, die Oberflächenproteine, welche O-Sialoglycoproteine einschließen, durchzuführen. Expression der ausgewählten DNA-Sequenz in einem transformierten Expressionssystem stellt gereinigtes Enzym zur Verfügung, obwohl man sich bewußt sein wird, daß das Enzym aus einer Kultur des ausgewählten P. haemolytica Serotyps gereinigt werden kann. Das hergestellte Protein kann zum Entwickeln verschiedener poly- und monoklonaler Antikörper benutzt werden, welche in der Diagnose und in verschiedenen Arten von Tests wirksam sind, sowie mögliche Verwendung als passive Vaccine. Das Protein kann ebenfalls direkt in verschiedenen Formen von Tiervaccinen in der Behandlung von P. haemolytica Infektionen und besonders in Kombination mit dem vom Anmelder mitanhängigen Anmeldungen S. N. 786,662, 720,332 und 462,929 veröffentlicht sind benutzt werden. Es gibt selbstverständlich andere Verwendungen des Enzyms, welche schon beschrieben worden sind oder in der folgenden Beschreibung dieser Erfindung beschrieben werden.
Das Klonieren des Glycoproteasegens kann in Übereinstimmung mit der folgenden Weise, die von den Erfindern zur Entdeckung des Gens eingesetzt wurde, erzielt werden.
Die Lysate von 27 rekombinanten Klonen in E. coli wurden auf Glycoproteaseaktivität getestet. Die Ergebnisse in Fig. 1 zeigten ein Autoradiogramm der Hydrolyse von radioaktiv iodiertem Glycophorin A, welches mit Lysat von Klon pPH1 inkubiert wurde. Eine negative Kontrolle des pBR322 transformierten E. colis zeigt keine Hydrolyse und eine positive Kontrolle von P. haemolytica Al Kulturüberstand steigt komplette Hydrolyse. Verlängerte Autoradiographie des Geis zeigte ebenfalls schwache Hydrolyse von ¹²&sup5;I- Giycophorin A durch das Lysat eines anderen Klons pPHB. Die Aktivität in pPH1 und pPH8 war jeweils 50 % und 10 % der Glycoproteaseaktivität der Probe des Kulturüberstands von P. haemoiytica AI. Restriktionsendonuclease-Analyse der rekombinanten Piasmide pPH1 und pPH8 zeigten, daß beide Plasmide ein identisches Insert (Fig. 2) enthielten, und pPH1 wurde für weitere Studien ausgewählt.
Das Plasmid pPH1 wurde in E. coli CSR603 transformiert und die plasmidcodierten Proteine durch in vivo ³&sup5;S-Markierung untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß ein zusätzliches Protein von ungefähr 35 kD von pPH1 exprimiert wurde (Fig. 3). Dies gibt eine Schätzung der Größe der Glycoprotease und stimmt mit der geschätzten Größe des Enzyms in SDS-PAGE Analyse von Extrakten von P. haemolytica A1 Kulturüberstand überein. Um die codierende Region des Glycoproteasegens auf pPH1 zu lokalisieren, wurde das 3,3 kbp BamHI-BgIII Fragment in den Expressionsvektor pTTQ19 subkloniert, um die Subklone pPH1.1 und pPH1.2 herzustellen, welche die Insert-DNA in entgegengesetzten Orientierungen enthalten (Fig. 2B). Die plasmidcodierten Proteine von pPH1.1 und pPH1.2 wurden in dem E. coli Maxizellsystem untersucht und die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Nur Plasmid pPH1.1 exprimierte ein plasmidcodiertes Protein, welches in der Größe mit dem klonierten Protein, das von pPH1 exprimiert wird, identisch ist, was andeutet, daß dieses Plasmid die richtige Orientierung zur Expression codiert. Zwei Subkione wurden von pPH1.1 durch Deletieren ausgesuchter innerer Fragmente konstruiert, um die Konstrukte pPH1.1A und pPH1.1E zu ergeben (Fig. 2C). Subklon pPH1.1A (durch partiellen Verdau von pPH1.1 mit Aval und Religation konstruiert) exprimierte das 35 kD Protein nicht, während pPH1.1E das Protein, ähnlich dem in pPHI und pPH1.1 beobachteten immer noch exprimiert (Fig. 3). Dies zeigte, daß die Aval Schnittstelle in dem Glycoproteasegen lokalisiert ist und die EcoRI Schnittstelle nahe am Ende des Gens sein könnte. Basierend auf der Größe des exprimierten Glycoproteins in der Maxizellanalyse wird ein DNA-Fragment von ungefähr 1 kbp benötigt, um für dieses 35 kD Protein zu codieren und dieses Gen muß in dem 2,3 kbp BamHI-HindIII Fragment in der Orientierung, dargestellt in pPH1.1, lokalisiert sein.
Die vollständige Nucleotidsequenz des 2,3 kbp BamHI-Hindlil Fragmentes wurde bestimmt und die 1,3 kBp Sequenz zwischen der BamHI und EcoRI Schnittstelle ist in Fig. 4 gezeigt. Mehr als 80 % beider Stränge der DNA wurden entweder direkt sequenziert oder wurden durch die Verwendung von überlappenden Deletionen der klonierten DNA in den Phagenvektoren M13, mp18 oder M13 mp19 sequenziert. Die meisten Regionen wurden mindestens dreimal unabhängig voneinander in Übereinstimmung mit dem Verfahren sequenziert. Analyse der sequenzierten DNA zeigte ein großes offenes Leseraster, das in der Richtung, die von den Maxizell-Markierungsexperimenten vorhergesehen war, exprimierte (Fig. 2). Das offene Leseraster deckt eine Länge von 975 Nucleotiden ab und codiert für 325 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 35,2 kD. Diese Schätzungen sind in Übereinstimmung mit der Größe des Proteins, welches in den Maxizell-Markierungsexperimenten exprimiert wurde. Zum Zwecke der weiteren Diskussionen wurde das Gen, welches die Glycoprotease codiert, als gcp bezeichnet.
Die klonierte Glycoprotease wurde aus Plasmid pGPI (siehe unten) wie im folgenden beschrieben durch SDS-PAGE hergestellt und auf PVDF-Membran unter Anlegen eines gerichteten Stromflusses übertragen (engl. electroblotted). Die Membranregion, die die Glycoprotease enthält, wurde ausgeschnitten und die N-terminale Aminosäuresequenz wurde bestimmt. Die Ergebnisse der ersten acht Zyklen sind identisch mit den ersten acht Aminosäuren, die von der Nucleotidsequenz von gcp vorhergesagt wurden, was die Zuordnung des offenen Leserasters für die Glycoprotease bestätigt.
Eine Untersuchung der Nucleotidsequenz stromaufwärts von gcp zeigte keine Eigenschaften, die ähnlich zu den gewöhnlicherweise gefundenen Eigenschaften von Promotoren in E. coli sind (Fig. 4). Weder die Konsensuspromotersequenzen TATAAT noch die Konsensus RNA-Polymerase Bindungsstelle TTGACA sind identifiziert worden. Weiterhin fehlt ebenfalls eine vermutete Ribosombindungsstelle, die sofort auf das ATG Initiationscodon von gpc folgt (Fig. 4). Es ist möglich, daß der gcp-Promotor nicht leicht in E. coli erkannt wird und dies könnte die geringe Expression von Glycoproteaseaktivität in den anfänglichen Klonen pPH1 und pPH8 erklären. Andererseits konnte stromabwärts von dem Terminationscodon von gcp eine MRNA-Struktur identifiziert werden, welche aus einer 14 Bp-Stamm- und Schlingenstruktur ähnlich dem rho unabhängigen Transkripsitonssignal von E. coli besteht, identifiziert werden (Fig. 4). In zwei anderen Loci können Sequenzen von P. haemolytica, Sequenzen, welche den E. coli Promotoren ähnlich sind, identifiziert werden, Lo et al. 1987. "Nucleotide Sequence of the Leucotoxin Genes of Pasteurella Haemolytica AI." Infect. Immun.; Strathdee et al. 1989. "Cloning, nudeotide sequence, and characterization of genes encod ing the secretion function of the Pasteurella haemolytica leukotoxin determinant." J. Bacteriol. Es wird darunter verstanden, daß es möglich ist, daß verschiedene Arten von Promotoren unter verschiedenen Regulationssystemen in P. haemolytica eingesetzt werden.
Die vorhergesagte Aminosauresequenz der Glycoprotease wurde im Hinblick auf ihre Hydrophobizitat und möglichen Membrandurchspannungsregionen analysiert. Fig. 5 zeigt einen Hydropathieplan (engl. hydrophathyplot) der Glycoprotease, die durch das SOAP-Programm analysiert wurde (Klein et al. supra). Die Analyse klassifizierte die Glycoprotease als ein mögliches peripheres Membranprotein aber nicht als ein integrales Membranprotein mit einer Transmembrandomäne. Dies stimmt "berein mit der Glycoprotease, die unter den sezernierten Produkten von P. haemolytica A1 gefunden wurde.
Eine Suche nach der Nucleotidsequenz von gcp mit Datenbanken wie Genbank zeigte weitreichende Homologie mit der DNA-Region stromaufwärts des E. coli rpsU-dnaGrpoD Macromolekular-Syntheseoperons. Im besonderen ist gcp fast identisch mit einem in dieser Region identifizierten Gen, welches als OrfX bezeichnet wurde, Nesin et al. 1987. "Possible new genes revealed by molecular analysis of 5-kb Escherichia coli chromosomal region 5 to the rpsU-dnaG-rpoD macromolecular-synthesis operon." Gene. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuren der Glycoprotease und OrfX ist in Fig. 6 gezeigt. Fast 76 % der Aminosäuren von Glycoprotease sind identisch mit denen von OrfX, was andeutet, daß die beiden Proteine eine ähnliche Funktion haben. Andererseits sind der Codongebrauch in den zwei Genen und die flankierenden Nucleotidsequenzen sehr unähnlich. Es ist wenig über die Funktion des Proteins, welches von orfX codiert wird bekannt, außer daß es in der Regulation der Expression des rpsU-dnaGrpoD Operons beteiligt sein könnte, Nesin et al. 1987 (supra). Basierend auf dieser Erfindung ist es jedoch höchstwahrscheinlich, daß eine proteolytische Aktivität mit dem OrfX-Protein assoziiert ist, welche Teil der Regulation von Macromolekül-Biosynthese sein könnte.
Das 2,3 kbp BamHI-HindIII Fragment wurde dann in die BamHI und HindIII Schnittstelle eines starken Expressionsvektors pTTQ18 subkloniert, um das Plasmid pGP1 herzustellen. Dies plaziert das Initiationscodon von gcp in einen geeigneten Abstand zu dem tac- Promotor, um eine hohe Expression der Glycoprotease zu erlauben. Fig. 7 zeigt Expression der P. haemolytica A1 Glycoprotease in E. coli, welches pGP1 enthält, nach Induktion mit IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid). Glycoprotease konnte weder in E. coli entdeckt werden, welches lediglich pTTQ18 enthält, noch in nicht induzierten Kulturen (Fig. 7). Die selben Proteinpräparationen wurden ebenfalls auf Glycoproteaseaktivität getestet und die Ergebnisse in Fig. 8 zeigten, daß E. coli, welches pGP1 enthält, Enzymaktivität exprimiert, welche identisch zu der in dem P. haemolytica A1 Kulturüberstand gefundenen ist.
Das überexprimierte 35 kDa Protein, welches durch SDS-PAGE aus E. coli Lysaten, die die Glycoproteaseaktivität enthielten, isoliert wurde, wurde benutzt, um polyklonale Antikörper in Kaninchen herzustellen. Dieses Antiserum wurde benutzt, um die Glycoproteaseaktivität in Kulturüberständen von P. haemolytica Al zu neutralisieren. Unter Bedingungen, in denen die P. haemolytica Glycoprotease 16,8 pg von Glycophorin A in 30 Min. abbaute, wenn Kaninchen-Anti-Glycoproteaseantiserum in Titern von 1/4,1/8, 1/16 und 1/32 zugesetzt wurde, sank der Abbau von Glycophorin A auf 4,0; 8,9; 8,4 und 11,5 ug an Glycophorin A pro 30 Min. Kontrollantiseren gegen 35 kDa Banden von Lysaten von plasmidtransformierten E. coli, welchen das pGP1 Gen fehlte, zeigten keine Inhibition der P. haemolytica Glycoprotease.
Die Glycoprotease von P. haemolytica A1 wird normalerweise in das Kulturmedium sezerniert, aber der Sekretionsmechanismus ist nicht bekannt. Nach IPTG-lnduktion von E. coli, welches pGP1 enthält, wurden die Zeilen einer osmotischen Schockbehandlung unterzogen&sub1; um die Lokalisierung der Glycoprotease zu bestimmen. Die Glycoprotease ist in der periplasmatischen Fraktion des E. coli Klons lokalisiert. Lediglich Spuren des Glycoproteaseproteins wurden in der zellulären Fraktion entdeckt. Eine Untersuchung der DNA-abgeleiteten N-terminalen Aminosäurensequenz der Glycoprotease zeigte die Abwesenheit einer herkömmlichen Signalpeptidsequenz. Weiterhin zeigte die Nterminale Aminosäuresequenzanalyse der Glycoprotease, welche in E. coli exprimiert wurde, daß es keine Spaltung der Aminosäuren von der N-terminalen Region während des Exportes der Glycoprotease in das Periplasma von E. coli gibt. Dies deutet an, daß ein anderer Mechanismus an der Sekretion der Glycoprotease beteiligt sein kann.
Die Klonierungs- und Sequenzierungsdaten zeigen, daß die P. haemolytica A1 Glycoprotease ein 35,2 kD Protein ist. Das Enzym hat einen vorhergesagten pl von 5,2, was mit unseren Erkenntnissen übereinstimmt, daß die Enzymaktivität aus Kulturüberständen durch Erniedrigung des pH auf 4,5 präzipitiert wird.
In den ursprünglichen Stadien der Entwicklung der Expression des Gens wurden nur geringe Mengen an Glycoproteaseaktivität in E. coli exprimiert, welche mit pPH1 (oder pPH8) transformiert waren. Dies war höchstwahrscheinlich durch die ineffiziente Aktivität des P. haemolytica A1 gcp Promotors in E. coli oder durch unvollständiges Prozessieren des Enzyms oder durch Instabilität des Enzyms in E. coli bedingt. Nach Subkionierung des geeigneten DNA-Fragmentes in pTTQ18 wurde die Menge an Glycoproteaseaktivität in E. coli erhöht, jedoch war die spezifische Aktivität der Enzympräparation geringer als die, welche in serumfreien Kulturüberständen von P. haemolytica A1 beobachtet wurden. Die geringere spezifische Aktivität des rekombinanten Produktes war wahrscheinlich auf einen Mangel an post4ranslationaler Prozessierung des klonierten Glycoproteasegens in E. coli zurückzuführen.
Das Leukotoxin ist ein anderes sezerniertes Protein von P. haemolytica A1 für welches die Nucleotidsequenz und die Regulation von Leukotoxinexpression beschrieben wurde, Lo et al. 1987. "Nudeotide Sequence of the Leucotoxin Genes of Pasteurella haemolytica A1." lnfect.; immun. Strathdee et al. 1989a, "doning, nudeotide sequence, and characterization of genes encoding the secretion function of the Pasteurelle haemolytica Ieucotoxin determinant." J. Bacteriol; Strathdee et al 1989b. Die Leukotoxindeterminante ist aus vier aufeinanderfolgenden Genen IktCABD auf demselben DNA-Strang codiert, wobei LktA das strukturelle Gen für das Leukotoxin (LktA) ist, während Proteine, welche durch lktc codiert sind, in der Aktivierung von Leukotoxin (LktA) fungieren, während Proteine, die von lktb und lktd codiert sind, an der Sekretion von Leukotoxin beteiligt sind. Es ist möglich, daß die Glycoprotease eine ähnliche Aktivierungsweise wie das Leukotoxin hat, welches die geringere spezifische Aktivität des in E. coli exprimierten Enzyms erklären könnte. Eine Untersuchung des Aminoterminus der Glycoprotease von pGPI zeigt kein Muster, das den herkömmlichen Signalsequenzen, die aus einer Anzahl von sezernierten Proteinen charakterisiert wurden, ähnlich ist, Michaelis et al. 1982. "Mechanism of incorporation of cell envelope proteins in Escherichia coli." Ann. Rev.; Silhavy et al. 1988. "Mechanism of protein localization." Microbiol. Rev.; Von Heijne, G. 1983. "Pattems of amino acids near signal sequence cleavage sites." Eur. J. Biochem. Da die Glycoprotease normalerweise aus P. haemolytica A1 sezerniert wird, könnte ein alternativer sekretorischer Mechanismus, an dem kein aminoterminales Signal beteiligt ist eingesetzt werden, wie berichtet vom Leukotoxin, Strathdee et al. 1989. "Cloning, nudeotide sequence, and characterization of genes encoding the secretion function of the Pasteurella haemolytica leukotoxin determinant." J. Bacteriol.
Es wird daher verstanden, daß mit der Vielzahl von Expressionsvehikeln und Expressionssystemen und mit der Information, die durch die Gensequenz und die Analyse der entsprechenden Proteinsequenz der Glycoprotease zur Verfügung gestellt wird, die Herstellung von gereinigter Glycoprotease von einem Fachmann durchgeführt werden kann.
Die Glycoprotease von P. haemolytica A1 scheint einige Ähnlichkeit in der Tätigkeit mit anderen neutralen Metalloproteasen von Bakterien zu haben, wie Thermolysin, Nakahama et al. 1986. "doning and sequencing of Serratia protease gene." Nucleic Acids Res., aber es gibt keine große Sequenzhomologie mit diesen Enzymen, außer die Anwesenheit einer möglichen Zinkbindungsstelle (Fig. 6). Die ungewöhnliche Substratspezifität der Glycoprotease, besonders ihre Spezifität für O-sialoglycosylierte Proteine und der Mangel an Homologie mit anderen Proteasen, deutet an, daß sie ein Mitglied einer neuen Enzymklasse ist.
Vor unserer Entdeckung war wenig über die Beziehung zwischen der Glycoprotease von P. haemolytica A1 und anderen bakteriellen Proteasen bekannt. Hohe Expressionswerte von pGPI in E. coli nach Induktion mit IPTG erlaubt Herstellung der Glycoprotease im großen Maßstab, welche frei von P. haemolytica Al Proteinen ist. Solch eine Präparation kann für detaillierte Untersuchungen der Aktivitäten und immunologischer Eigenschaften des Enzyms benutzt werden. Polyknale Antikörper werden leicht unter Verwendung des klonierten Enzyms in Kaninchen hergestellt. Dies ist ein wichtiges Reagenz für die weitere Charakterisierung der biochemischen und biologischen Eigenschaften der Glycoprotease. Es wird verstanden, daß mit der Proteinsequenzinformation für die Glycoprotease ausgewählte funktionelle Regionen des Proteins in der Herstellung von Antikörpem oder das gesamte Protein in der Herstellung von Antikörpem benutzt werden kann. Die o. g. polyklonalen Antikörper können in Übereinstimmung mit Standardverfahren entwickelt werden, obwohl darunter verstanden wird, daß für bestimmte Anwendungen monoklonale Antikörper für Diagnoseverwendungen u. ä. entwickelt werden können. Es wird ebenfalls verstanden, daß in dem Verfahren zum Entwicklen verschiedener Formen von Antikörpern Proteinsequenzen von normalerweise sechs Resten oder mehr ausgewählt würden.
Es wird ebenfalls verstanden, daß die DNA-Sequenz die notwendige Information zum Entwickeln einer Vielzahl von DNA-Sonden zur Verfügung stellt, welche in einer korrespondierenden Diagnose benutzt werden können. Die Sonden können von ausgewählten Teilen der DNA-Sequenz zu Zwecken des Bestimmens der Anwesenheit von bestimmten funktionellen Teilen der Sequenz entwickelt werden. Es wird allgemein darunter verstanden, daß für Zwecke der DNA-Hybridisierung vorzugsweise 14 bis 18 Basenpaare ausgewählt werden. Solche Sonden können zum Screenen von Serotypen von P. haemolytica für das Auftreten des Glycoproteasegens benutzt werden, wie diskutiert in Abdullah et al. Dezernber 1990. "Distribution of glycoprotease activity and the glycoprotease gene among serotypes of Pasteurella haemolytica." Biochemical Society Transactions.
Es wurde gefunden, daß die Glycoprotease instabil ist, wenn mit HPLC aus serumfreien Kulturüberständen isoliert. Jedoch werden im folgenden alternative Verfahren zum Isolieren und Reinigen aus Kulturen zur Verfügung gestellt. Dieses ist in deutlichem Kontrast zu der bemerkenswerten Stabilität der Enzymaktivität in gefriergetrockeneten pH 4,5 Prezipitaten von Kulturüberständen, in welchen Aktivität für viele Monate bei Raumtemperatur erhalten wird. Die erhöhten Proteinkonzentrationen des rekombinanten Genproduktes, welches in hochaktiven Expressionsvektoren exprimiert wurde, sollte die Anfälligkeit des Enzyms bei geringen Proteinkonzentrationen überwinden. Die Glycoprotease ist nur eine Nebenproteinkomponente des Kulturüberstandes von P. haemolytica, selbst wenn die Bakterien in serumfreien Medien herangewachsen werden. Folglich war es schwierig, homogene Präparationen der Glycoprotease zu isolieren, außer durch aufwendige chromatographische Verfahren. Die kürzliche Identifizierung der rekombinanten Glycoprotease als eine 35 kDa³&sup5;S-markierte Bande in SDS-PAGE, der hohe Wert an Expression dieses Produktes und die Erkenntnis, daß das rekombinante Produkt im periplasmatischen Raum von E. coli HB101 lokalisiert ist, versetzt einen in die Lage, große Mengen hochgereinigten Produktes zu erhalten.
Die folgenden Beispiele illustrieren das Klonieren des Genes, welches die Glycoprotease codiert und die Entwicklung von Antikörpern dagegen. Solche Beispiele sind nicht beabsichtigt den Bereich der Erfindung in irgendeiner Weise zu limitieren.

Material und Methoden

Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen:

E. coii Stämme HB101, TG-1, CSR603 und P. haemolytica A1 sind vorher beschrieben worden, Lo et al. 1986. "A simple immunological detection method for the direct screening of genes from done banks." Can. J. Biochem. & Celi Biol.; Lo et al. 1985. "Cloning and Expression of the Leukotoxin Gene of Pasteurelle haemolytica Al in Escherichia coli K-12." lnfect. Immun.; Sancar et al. 1979. "A simple method for identification of plasmid-coded proteins." J. Bacteriol. Die Herstellung einer Klonbank, welche die P. haemolytica A1 genomische DNA, die in dem Vektor P8R322 vorliegt, enthält, wurde ebenfalls beschrieben von Lo et al. 1985. "Cloning and Expression of the Leukotoxin Gene of Pasteurella haemolytica A1 in Escherichia coli K-12." lnfect. Immun. Die rekombinanten E. coli Klone und besonders pPH1 und pPH8, welche lösliche Antigene von P. haemolytica A1 codieren, wurden unter Verwendung eines Antiserums, welches gegen P. haemolytica lösliche Antigene gerichtet war in einem Kolonie-lmmunoblottest isoliert, Lo et al. 1986. "A simple immunological detection method for the direct screening ofgenes from done banks." Can. J. Biochem. Die M13 Phagenvektoren mp18 und mplg und die Expressionsvektoren PUQ18 und pTTQ19 waren von Pharmacia Chemicals Inc. (Dorval, Que.). Die E. coli HBIOI Klone wurden in LT-Medium kultiviert, welches mit Ampicillin bei 100 ug/ml (LT+A) supplementiert war, Lo et al. 1986. "A simple immunological detection method for the direct screening of genes from done banks." Can. J. Biochem & Cell Biol. P. haemolytica Kulturen wurden in Gehirn-Herzlnfusionsmedium (BHIB) herangezogen. E. coli TG-1 wurde auf Davis minimal medium, Miller, J. H. 1972. "Experiments in Molecular Genetics." Cold Spring Harbor Laboratory, herangezogen.

Enzyme und Chemikalien:

Alle Restriktionsendonucleasen und DNA-modifizierenden Enzyme waren von Bethesda Research Labs. (Burlington, ONT) oder Pharmacia Chemicals Inc. und wurden wie vom Hersteller empfohlen benutzt. Ziegen Anti-Kaninchenimmunglobulin G alkines Phosphatasekonjugat und Farbentwicklungsreagenzien wurden von Bio-Rad Labs. (Mississauga, ONT) oder Sigma Chemicals (St. Louis, MO.) gekauft, [α³²P]-dATP (3000 Ci/mmol) und Tran ³&sup5;5-Markierung (1130 Cilmmol) waren von ICN Biochemicals (St. Laurent, QUE) und Immobilon , Polyvinylfluorid (PVDF) Membranen waren von Milpore (Mississauga, ONT).

Beispiel 1:

Screenen nach Glycoproteaseaktivltät und Enzymtest:

Die rekombinanten E. coli Klone wurden in LT+A Medium über Nacht herangewachsen, subkultiviert (11100) und für 4 Std. bei 37ºC bis zu einer logarithmischen Phase herangewachsen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 x g) geerntet, mit 50 mM N-2- Hydroxyethylpiperazin-N¹-ethansulfonsäure (H EPES) Puffer (pH 7,4) gewaschen und durch dreimaliges Passieren durch eine French press bei einem Druck von 17.000 psi lysiert. Die Lysate wurden bei 1.085 x g für 5 Min. zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und der Überstand von 0,1 ml wurde mit 5 pg ¹²&sup5;I-Glycophorin A (20 uCi/mg), hergestellt wie beschrieben (10,11) in 0,1 ml 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) für 16 Std. bei 37ºC inkubiert. Das nicht hydrolysierte Substrat und Hydrolyseprodukte wurden durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Laemmli, U. K. 1970, getrennt. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature, und durch Autoradiographie unter Verwendung von Cronex 4 Röntgenfilm (Dupont, Wilmington DE) detektiert. Die Enzymaktivität der Glycoprotease wurde durch den Prozentsatz des Verschwindens von Glycophorin A Banden errechnet, wie durch das In-Scheiben-Schneiden des Geis und Zähens der Bande in einem Gammazähler bestimmt wurde.

Beispiel 2:

In vivo Markierung von klonierter Glycoprotease:

Die rekombinanten Plasmide, welche pPH1 einschließen, wurden in E. coli CSR603 transformiert und Maxizellen wurden hergestellt, Sancar et al. 1979. "A simple method for identification of plasmid-coded proteins." J. Bacteriol. E. coli CSR603, welches die rekombinanten Plasmide enthält, wurde zur mittellogarithmischen Phase bei 37ºC in Davis minimal medium, welches mit Ampicillin und 0,5 % Case-Aminosäuren (engl. Case amino acids) supplementiert war, herangewachsen. Dann wurden 10 ml der Kultur für 15 Sek. mit 400 uW/cm² unter Verwendung einer G-E keimtötenden Lampe (General Electric) bestrahlt. Nach dem Kultivieren für 2 Std. wurden 100 ul D-Cycloserin (2 mg/ml) zugesetzt und die Kultur über Nacht herangewachsen. Ungefähr 3 ml der Kultur wurden zentrifugiert und das gewaschene Sediment in 0,75 ml Davis minimal medium, welches mit Threonin (10 mglml), Arginin (15 mg/ml), Leucin (15 mg/ml) und Prolin (10 mg/ml) supplemenuert worden war, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für 1 Std. bei 37ºC inkubiert, nach der 25 uCi an Tran ³&sup5;S-Markierung zugesetzt wurden. Für Rekombinante in den Expressionsvektoren pTTQLB oder pTTQ19 wurde Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG, 0,5 mM) zur Induktion des tac-Promotors eingeschlossen. Nach Markierung für 1 Std. wurden die Zellen in einer Mikrofuge geerntet und durch Resuspendieren in 150 pl von SDS-Probenpuffer lysiert, Laemmli, U. K. 1970. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature. Die markierten Proteine wurden durch SDS-PAGE gemäß Laemmli, U. K. 1970. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature, aufgetrennt und durch direkte Autoradiographie auf dem getrockneten Gel identifiziert.

Beispiel 3:

Subklonierung und DNA-Sequenzierung:

Das 3,3 kbp BamHI-BgIII Fragment aus Fig. 2 von pPH1 wurde in die BamHI-Schnittstelle des Expressionsvektors pTTQ19 subkloniert. Selektive Fragmente wurden durch Verdau und Religation mit einer Endonuclease, welche eine Restriktionsstelle besitzt, die in der Insert-DNA lokalisiert ist und eine in der Multiklonierungsstelle in pTTQ19 besitzt, aus der Insert-DNA entfernt. Eine Folge von Subkonen wurde hergestellt, welche jeder lediglich ausgewählte Fragmente der ursprünglichen Insert-DNA für pPH1 enthielt. Jeder Subklon wurde dann auf die Expression der Glycoprotease in dem E. coli Maxizellsystem analysiert. Ein 2,3 kbp BamHI-HindIII Fragment aus Fig. 2 wurde bestimmt, das Glycoproteasegen zu enthalten. Dieses Fragment wurde in M13 Phagenvektoren mp18 und mp19 subkloniert, welche in E. coli TG-1 propagierten. Die Nucleotidsequenz der Insert-DNA wurde durch das Dideoxy-Ketten-Beendungsverfahren bestimmt, wie vorher beschrieben von Dale, et al. 1985. "A rapid single-stranded doning strategy for producing a sequential series of overlapping clones for use in DNA sequencing: application to sequencing the corn mitochondria 18s rDNA." Plasmid. Das Verfahren von Dale wurde benutzt, um überlappende Deletionen der Insert-DNA in entweder M13, mp18 oder mp19 Vektoren zum Sequenzieren der gesamten Insert-DNA zu erzeugen. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Pustell Sequence Analysis Programms (IBI, Toronto, ONT) analysiert. Die Nucleotiddatenbank Genbankr wurde mit der codierenden Sequenz gescreent, um nach Sequenzhomologie zu suchen.

Beispiel 4:

Expression des Glycoproteasegens:

Das 2,3 kbp BamHI-HindIII Fragment von pPH1 wurde in dem Expressionsvektor pTTQ18 subkloniert, um das Plasmid pGP1 zu bilden. Die Expression wurde durch Transformieren von E. coli HB101 mit pGP1 durchgeführt. Kulturen wurden über Nacht bei 37ºC in LT+A Medium herangewachsen. Die Kulturen wurden dann durch Zentrifugieren (5.000 x g) geerntet und das Sediment wurde in vorgewärmtem LT-Medium (ohne Glucose), supplementiert mit Ampiciilin und IPTG (0,5 mM) resuspendiert und für 90 Min. bei 37ºC herangewachsen. Die Kultur wurde zentrifugiert (5.000 x g) und das Sediment in 0,1 Vol eines 2x Natriumdodecylsulfat (SDS)-Probenpuffers resuspendiert. Laemmli, U. K. 1970. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature Nach Sminütigem Aufkochen wurden die Proben durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden durch Anfärben mit Coomassie brilliant blue R250 visualisiert. Für die Bestimmung von Glycoproteaseaktivität wurden die Zellen durch eine French press lysiert und die Lysate wie oben beschrieben auf Aktivität getestet.

Beispiel 5:

N-terminale Aminosäureanalyse:

Die von pGPI exprimierte Glycoprotease wurde nach SDS-PAGE wiedergewonnen und durch Anlegen eines gerichteten Stromflusses auf PVDF-Membran transferiert, Walsh et al. 1988. "Extended N-terminal sequencing of proteins of Archaebacterial Ribosome blotted from two-dimensional gels onto glass fibre and PVDF membrane." Biochemistry. Die PVDF-Membran wurde mit Coomassie blue R250 gefärbt, um das Genprodukt zu lokalisieren, entfärbt und die geeignete Region, die die Glycoprotease enthält, wurde ausgeschnitten. Die Glycoprotease wurde dann einer N-terminalen Aminosäureanalyse durch das automatisierte Edman-Verfahren in einem Gasphasen-Peptid-Mikrosequenzierer unterzogen.

Claims

1. Gereinigtes DNA-Molekül bestehend aus der DNA- Sequenz der Abbildung 4 für bp-Positionen 1 bis 975.

2. Gereinigtes DNA-Molekül bestehend aus zumindest 12 Nukleotiden, die aus der Gruppe von Nukleotiden ausgewählt sind, die durch bp-Positionen 1 bis 975 der Abbildung 4 dargestellt sind.

3. Gereinigtes DNA-Molekül bestehend aus einer DNA- Sequenz, die eine Glycoprotease mit einer Aminosäuresequenz der Abbildung 4 kodiert.

4. Gereinigtes DNA-Molekül bestehend aus zumindest 18 Nukleotiden, die ein Fragment einer Glycoprotease mit einer Aminosäuresequenz kodieren, wobei dieses Fragment aus zumindest 6 entsprechenden aufeinanderfolgenden Aminosäureresten der Aminosäuresequenz der Abbildung 4 ausgewählt ist.

5. Gereinigte DNA-Sonde bestehend aus einer DNA-Sequenz von Anspruch 2.

6. Gereinigte DNA-Sonde bestehend aus einer DNA-Sequenz von Anspruch 4.

7. Rekombinanter Klonierungsvektor, der ein DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 enthält.

8. Mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformierter Wirtsorganismus, der ein DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 enthält.

9. Wirtsorganismus von Anspruch 8, bei dem dieser Wirtsorganismus ein geeignetes aus geeigneten prokariotischen oder eukariotischen Zellen ausgewähltes Expressionssystem ist, wobei das DNA-Molekül in operativer Weise mit einer Expressionssteuerungssequenz so verbunden ist, daß das DNA-Molekül einer Expression unterliegt, um die Glycoprotease oder ein Glycoproteasefragment davon zu bilden, wobei die Expressionssteuerungssequenz aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen, die die Expression von Genen prokariotischer oder eukariotischer Zellen steuern, ausgewählt ist.

10. Methode zum Screenen einer biologischen Probe, um zu bestimmen, ob ein eine Glycoprotease kodierendes Gen der Abbildung 4 anwesend ist, wobei diese Methode umfaßt:

i) Bereitstellung einer biologischen Probe, die aus einer vermutlich eine Serotype von P. haemolytica enthaltenden Quelle stammt, die die Glycoprotease bildet;

ii) Durchführung eines Biotests, um zu bestimmen, ob in der biologischer Probe zumindest ein Mitglied anwesend ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Glycoprotease-Gensequenz der Abbildung 4 und

b) Glycoprotease-Aminosäuresequenz der Abbildung 4.

11. Methode von Anspruch 10, bei dem der Biotest einen DNA-Hybridisierungstest umfaßt, in dem eine markierte Probe von Anspruch 5 oder 6 verwendet wird.

12. Verfahren zur rekombinantischen Bildung von Glycoprotease oder von einem Fragment der Glycoprotease- Aminosäuresequenz, wobei dieses Verfahren die Kultivierung von einem Wirtsorganismus von Anspruch 9 in einem geeigneten Nährmedium umfaßt.

13. Verfahren von Anspruch 12, bei dem der Wirtsorganismus von Anspruch 9 mit dem rekombinanten Expressionsvektor umfassend ein DNA-Molekül von Anspruch 1 oder 3 transformiert wird, um die Glycoprotease zu bilden.

14. Verfahren von Anspruch 13, bei dem der Wirtsorganismus von Anspruch 9 mit dem rekombinanten Expressionsvektor umfassend ein DNA-Molekül von Anspruch 2 oder 4 transformiert wird, um das Fragment der Glycoprotease-Aminosäuresequenz zu bilden.

15. Verfahren von Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem man die Glycoprotease oder ein Glycoproteasefragment davon aus dem Nährmedium abtrennt und die Glycoprotease oder ein Glycoproteasefragment davon reinigt.

16. Verfahren von Anspruch 15, bei dem der Wirtsorganismus E. coli ist.

17. Verfahren nach Anspruch 13, 15 oder 16, das den weiteren Schritt der Formulierung des Proteins mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zur Impfstoffverabreichung einschließt.