DE69032484T4

DE69032484T4 - Zusammensetzungen und deren verwendung zur förderung der immunopotentiation

Info

Publication number: DE69032484T4
Application number: DE69032484T
Authority: DE
Inventors: Jeffery Bluestone
Original assignee: Arch Development Corp
Current assignee: Arch Development Corp
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-26
Publication date: 1999-09-16
Anticipated expiration: 2010-10-27
Also published as: DE69032484D1; AU6642390A; EP0497883A1; ATE168272T1; EP0497883B1; JPH05504554A; WO1991006319A1; DE69032484T2; EP0839536A1; US6143297A; JP2546544B2; US6113901A; CA2071478A1

Description

Diese Erfindung betrifft die Immunologie, und genauer gesagt die Herstellung und Verwendung von immunpotentierenden Agenzien, die in der Lage sind, Immunantworten hervorzurufen, zu steigern und/oder in anderer Weise zu modifizieren. Diese Mittel weisen durch ihre Fähigkeit, zelluläre oder humorale Immunantworten hervorzurufen, eine potentielle Nützlichkeit in einer Vielzahl von krankhaften Zuständen auf, bei denen man erwarten könnte, daß Immuntherapie einen Vorteil liefert.
Das Immunsystem des Körpers dient als eine Verteidigung gegen eine Vielzahl von Zuständen, einschließlich zum Beispiel Verletzung, Infektion und Neoplasie, und wird vermittelt durch zwei getrennte, aber verknüpfte Systeme, das zelluläre und das humorale Immunsystem. Allgemein gesagt wird das humorale System durch lösliche Produkte, genannt Antikörper oder Immunglobuline, vermittelt, die die Fähigkeit aufweisen, sich mit Produkten, die durch das System als dem Körper fremd erkannt werden, zu verbinden und diese zu neutralisieren. Im Gegensatz dazu umfaßt das zelluläre Immunsystem die Mobilisierung bestimmter Zellen, genannt T-Zellen, die eine Vielzahl von therapeutischen Rollen innehaben.
Das Immunsystem von sowohl Menschen als auch Tieren schließt zwei Hauptklassen von Lymphozyten ein: die vom Thymus abgeleiteten Zellen (T-Zellen), und die vom Knochenmark abgeleiteten Zellen (B-Zellen). Reife T-Zellen entstehen aus dem Thymus und zirkulieren zwischen den Geweben, Lymphgefäßen und dem Blutstrom. Die T-Zellen weisen immunologische Spezifität auf und sind direkt in den zellvermittelten Immunantworten (wie beispielsweise Gewebeabstoßung) involviert. T-Zellen wirken gegen oder in Antwort auf eine Vielzahl von fremden Strukturen (Antigenen). In vielen Fällen sind diese fremden Antigene auf Wirtszellen als ein Ergebnis einer Infektion exprimiert. Jedoch können fremde Antigene auch von dem Wirt kommen, der sich durch Neoplasie oder Infektion verändert hat. Obwohl T- Zellen selbst keine Antikörper sekretieren, sind sie gewöhnlicherweise erforderlich für Antikörpersekretion durch die zweite Klasse von Lymphozyten, den B-Zellen.
Es gibt verschiedene Untergruppen von T-Zellen, die allgemein durch antigene Determinanten, die auf ihren Zelloberflächen gefunden werden, ebenso wie funktionelle Aktivitäten und Erkennung von fremden Antigenen definiert sind. Einige Untergruppen von T-Zellen, wie beispielsweise CD8&spplus;-Zellen sind Killer/Suppressor-Zellen, die eine regulierende Funktion im Immunsystem spielen, wohingegen andere, wie beispielsweise CD4&spplus;-Zellen, dazu dienen, entzündliche und humorale Antworten zu fördern. (CD bezeichnet Zelldifferenzierungscluster; die begefügten Zahlen werden vorgesehen gemäß der Nomenklatur, die durch die International Workshops on Leukozyte Differentiation (5) vorgegeben werden. Eine allgemeine Literaturstelle für alle Aspekte des Immunsystems kann gefunden werden in (1)).
Menschliche periphere T-Lymphozyten können durch eine Vielzahl von Agenzien, einschließlich fremder Antigene, monoklonaler Antikörper und Lektine, wie beispielsweise Phytohämagglutinin und Concanavalin A, stimuliert werden, um die Mitose zu durch laufen. Obwohl die Aktivierung vermutlich dadurch erfolgt, daß die Mitogene an spezifischen Stellen auf Zellmembranen binden, ist die Natur dieser Rezeptoren und ihre Aktivierungsmechanismen nicht vollständig aufgeklärt. Die Induktion der Proliferation ist nur ein Anzeichen für T-Zellaktivierung. Andere Anzeichen für Aktivierung, definiert als Änderungen im Basal- oder Ruhezustand der Zellen, schließen erhöhte Lymphokin- Produktion und zytotoxische Zellaktivität ein.
T-Zellaktivierung ist ein unerwartet komplexes Phänomen, das von einer Beteiligung einer Vielzahl von Zelloberflächenmolekülen, die auf den antwortetenden T-Zellpopulationen exprimiert werden, abhängt (2, 3). Zum Beispiel ist der Antigenspezifische T-Zellrezeptor (TcR) zusammengesetzt aus einem Disulfid-verbundenen Heterodimer, das zwei klonal verteilte, integrale Membranglycoproteinketten, α und β, oder -γ und δ, enthält, die nicht kovalent assoziiert sind mit einem Komplex aus niedermolekularen invarianten Proteinen, die gewöhnlich als CD3 (die ältere Bezeichnung ist T3) bezeichnet werden (2, 4).
Die TcR-α und -β-Ketten bestimmen Antigenspezifitäten (6). Man nimmt an, daß die CD3-Strukturen zusätzliche Moleküle darstellen, die die transduzierenden Elemente von Aktivierungssignalen sind, die nach Bindung des TcR-αβ an seinen Liganden initiiert werden. Es gibt sowohl konstante Regionen der Glycoproteinketten von TcR als auch variable Regionen (Polymorphismus). Polymorphe variable Regionen von TcR definieren Untergruppen von T-Zellen mit bestimmten Spezifitäten. Im Unterschied zu Antikörpern, die lösliche ganze Fremdproteine als Antigene erkennen, tritt der TcR-Komplex mit kleinen peptidischen Antigenen in Wechselwirkung, die im Zusammenhang mit Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Proteinen vorhanden sind. Die MHC-Proteine stellen eine andere hochpolymorphe Untergruppe von Molekülen dar, die zufällig über die Spezies verteilt sind. Somit bedarf die Aktivierung gewöhnlicherweise der Wechselwirkung von drei Elementen aus dem TcR und fremdem peptidischem Antigen, das an die Haupt-MHC-Proteine gebunden ist.
Hinsichtlich der Erkennung von fremden Antigen durch T-Zellen ist die Anzahl von Peptiden klein, die in ausreichenden Mengen vorhanden sind, um sowohl an den polymorphen MHC zu binden als auch durch einen gegebenen T-Zell-Rezeptor erkannt zu werden und somit Immunantwort als einen praktischen Mechanismus zu induzieren. Eines der Hauptprobleme in der klinischen Immunologie ist, daß die polymorphen Antigene des MHC der Auslösung einer Immunantwort schwere Restriktionen auferlegen. Ein weiteres Problem ist, daß die Dosen eines eindringenden Antigens zu niedrig sein können, um eine Immunantwort auszulösen. Zu dem Zeitpunkt, da der Antigentiter steigt, kann es für das Immunsystem zu spät sein, den Organismus zu retten.
Die erstaunliche Heterogenität der MHC-Proteine zwischen Individuen bleibt der ernstzunehmenste beschränkende Faktor bei der klinischen Anwendung von Fremdgewebetransplantation. Es ist extrem selten möglich, zwei Individuen aufzufinden, deren MHC identisch ist. Somit erkennen T-Zellen von Transplantatempfängern unveränderlicherweise das Donororgan als fremdartig. Bemühungen, die Alloreaktivität durch pharmazeutische Wirkstoffe oder Bestrahlungen zu unterdrücken, haben zu schwerwiegenden Nebenwirkungen geführt, die ihre Brauchbarkeit beschränken. Deshalb haben die neuesten experimentellen und klinischen Studien die Verwendung von Antikörpertherapie um faßt, um die Immunfunktion in vivo zu ändern. Der erste erfolgreiche Versuch, eine selektivere immunsuppressive Therapie beim Menschen zu entwickeln, war die Verwendung von polyklonalen heterologen anti-Lymphozyten-Antisera (ATG) (7, 8, 9).
Klinische Versuche der ATG-Behandlung legten eine wesentliche Verringerung früher Abstoßungsepisoden, verbessertes Langzeitüberleben und, am wichtigsten, Umkehr von fortlaufenden Abstoßungsepisoden nahe. Jedoch waren die Ergebnisse oft aufgrund der Unfähigkeit, einzelne Antiserum-Präparate zu standardisieren, inkonsistent. Zusätzlich konnte die genaue Natur der Zielantigene, die durch die polyklonalen Reagenzien erkannt wurden, nicht definiert werden, was die wissenschaftlich Analyse schwierig macht. Das Erscheinen der monoklonalen Antikörper (mAb)-Technologie lieferte die Basis zum Entwickeln potentiell therapeutischer Reagenzien, die mit spezifischen Zelloberflächenantigenen reagieren, die bei der T-Zellaktivierung beteiligt sind.
Monoklonale Antikörper (mAb) wurden von Kohler und Milstein 1975 entwickelt. Die gewöhnlicherweise verwendeten Verfahren, um mAb herzustellen, bestehen darin, zwei Typen von somatischen Zellen zu fusionieren (hybridisieren): (1) eine neoplastische Myelomazellinie; und (2) einen normalen B-Lymphozyten, der von einem immunisierten Tier erhalten wurde. Das Ergebnis wird als Hybridom bezeichnet, der gekennzeichnet ist durch immortales Wachstum und die Fähigkeit, Antikörper, die für das Immunisierungsantigen spezifisch sind, zu sekretieren.
Eine der klinisch erfolgreichen Verwendungen von monoklonalen Antikörpern ist es, das Immunsystem zu unterdrücken und somit die Wirksamkeit von Organ- oder Gewebetransplantation zu erhöhen. US-Patent 4,658,019, beschreibt ein neues Hybridom (bezeichnet als OKT3), welches in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper gegen ein Antigen herzustellen, das auf im wesentlichen allen normalen menschlichen peripheren T-Zellen vorhanden ist. Man sagt, daß dieser Antikörper monospezifisch ist für eine einzelne Determinante auf diesen T-Zellen und nicht mit anderen normalen peripheren lymphoiden Zellen des peripheren Blutes reagiert. Der in diesem Patent beschriebene OKT3-mAb wird derzeit verwendet, um Nierentransplantatabstoßung zu verhindern (10).
Eine unerwartete Nebenwirkung der OKT3-Therapie war die weitreichende mitogene Wirkung des mAb in vivo (28). Obwohl man zeigte, daß anti-CD3-mAb T-Zellen in vitro aktivierten, um verschiedene Lymphokine, etc. (11) zu produzieren, ist OKT3 bis vor kurzem nicht verwendet worden, um das Immunsystem in vivo zu stimulieren.
Zusätzlich sind andere Zelloberflächenmoleküle identifiziert worden, die die T-Zellfunktion aktivieren können, die aber nicht notwendigerweise Teil des T-Zelloberflächenrezeptorkomplexes sind. Monoklonale Antikörper gegen Thy-1-, TAP-, Ly-6-, CD2- oder CD28-Moleküle können T-Zellen bei Abwesenheit von Fremdantigenen in vitro aktivieren (12, 13, 14, 15, 16). Darüberhinaus hat man gezeigt, daß bestimmte bakterielle Proteine, obwohl hinsichtlich ihrer Struktur von mAbs verschieden, auch an Untergruppen von T-Zellen binden und sie in vitro aktivieren (17). Obwohl für einige dieser Antigene in vitro Wirkungen kürzlich gezeigt worden sind, ist in vitro-Aktivität oftmals keine verläßliche Vorhersage für in vivo-Wirkungen.
Eine Ursache von malignem Tumorwachstum soll die Unfähigkeit des Immunsystems sein, in geeigneter Weise auf Tumorantigen zu antworten. Zum Beispiel sind maligne Progressortumoren nur schwach immunogen und können der Wirtserkennung und Abstoßung entgehen. Sowohl spezifische als auch nicht-spezifische Effektorwege sind an der Tumorimmunität beteiligt. Behandlung durch Immuntherapie stellt darauf ab, Defekte im Immunwaffenarsenal zu heilen. Das Ziel der Immuntherapie ist die Verstärkung von einem oder beider dieser Wege gewesen. Ein potentieller Ansatz für die Therapie ist es, zelluläre Antitumoreffektormechanismen des Wirtes zu aktivieren.
In der Vergangenheit sind nicht-spezifische Adjuvanzien wie BCG oder Pertussis verwendet worden, um Immunantworten zu steigern. In den normalen Individuen amplifizieren diese Adjuvanzien Immunantworten, indem nicht-spezifische Reize zur Verfügung gestellt werden, die die Gesamtimmunität erhöhen. Jedoch wirken diese Adjuvanzien nicht selektiv auf T-Zellen, oder Untergruppen von T-Zellen, und man hat nicht zeigen können, daß sie in der Lage sind, Immunmangelzustände zu überwinden. Unglücklicherweise sind derzeitige Formen von Immuntherapie, die nicht-spezifische Effektorzellen induzieren, nicht wirksam genug beim Potentieren von Antitumorantworten (18). Kürzlich ist vorgeschlagen worden, daß Immuntherapieschemata, die die Fähigkeit des Immunsystems, Tumorantigene in spezifischer Weise zu erkennen, zum Beispiel Verwendung spezifischer Tumorinfiltrierender Lymphozyten, zur Immuntherapie verwenden, zu einer überlegenen Antitumorimmunität führen (19). Somit haben sich gegenwärtige Bemühungen, die auf die Entwicklung wirksamerer Formen von Immuntherapie gerichtet sind, auf spezifische Antitumorantworten und dem Gedächnis folgender Antigenerkennung konzentriert. Ein Ansatz, der früher nicht verfolgt worden ist, ist die in vivo-Verabreichung von T-Zellen-aktivierenden mAbs gewesen, um Antitumoraktivität zu fördern.
Menschliches Immundefizienzvirus (HIV), das biologische Agens von AIDS, verursacht eine persistente Infektion, die mit tiefreichender Immunsuppression verbunden ist, die zu einer Empfänglichkeit für opportunistische Infektionen führt. Immunologische Antworten auf HIV-Infektion erfordert die Entwicklung von sowohl humoralen als auch zellvermittelten Effektormechansimen; jedoch scheiterten gegenwärtigen Bemühungen bei der Behandlung und Impfstoffentwicklung entweder infolge der mit der viralen Infektion verbundenen Immundefizienz oder der zu geringen Immunogenität des Impfstoffes (20). Die Entwicklung eines sicheren und wirksamen Impfstoffes gegen Infektion mit menschlichem Immundefizienzvirus (HIV) wird verkompliziert durch ein fehlendes Verständnis hinsichtlich protektiver Immunität gegen HIV und Entwicklung der Krankheit, und dem Fehlen eines adäquaten und günstigen Tiermodells zum Studium von HIV-Infektion.
Da HIV entweder als ein zellfreier oder zellassoziierter Virus übertragen werden kann, wird wahrscheinlicherweise eine protektive Immunantwort gegen HIV-Infektion sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunität erfordern, einschließlich neutralisierender Antikörper gegen HIV, Antikörper, die bei Antikörper abhängiger zellulärer Zytotoxizität beteiligt sind und zytotoxischer Lymphozyten. All diese Aktivitäten umfassen Virus-spezifische T-Zellen. T-Zellaktivierung erfordert potente in vivo Immunantworten gegen fremde Antigene, wie beispielsweise Viren.
In mit HIV infizierten Personen sind zwei Komponenten des Immunsystems suboptimal und die Fähigkeit, eine Immunantwort in diesen Individuen zu erzeugen, ist, deshalb, beeinträchtigt. Erstens ist die verringerte Häufigkeit von Antigen-reaktiven CD4&spplus;-T-Zellen augenscheinlich nicht ausreichend, um eine ausreichende Immunantwort gegen HIV aufzubauen, insbesondere wenn die Menge an HIV-Antigen gering ist. CD4 ist ein Membranprotein, das als eine Bindungsstelle und Eintrittspforte in CD4&spplus;- Lymphozyten für das menschliche Immundefizienzvirus vom Typ 1 (HIV-1) dient (21). Zweitens hängen alle Immunantworten von der Fähigkeit von T-Zellen ab, prozessiertes Antigen zu erkennen, das mit Haupthistokompatibilitätsantigenen (MHC) assoziiert ist. Jeglicher Impfstoffansatz, der HIV-Peptide oder inaktiviertes Virusantigen verwendet, muß von der Fähigkeit von Antigen-Peptiden abhängig sein, die geeigneten MHC-Antigene zu binden, die notwendig sind, um eine Immunantwort zu initiieren. Bei dem enormen Polymorphismus der MHC-Antigene, die in der Population exprimiert sind, und der Variation des HIV- Virus ist die Entwicklung eines erfolgreichen HIV-Impfstoffes zur allgemeinen Verwendung schwierig und ist noch nicht erfolgreich gewesen.
Die Nützlichkeit bestimmter Peptide, Proteine oder anderer potentieller oder erwünschter Immunogene in Impfstoffen kann beschränkt sein durch verschiedene kritische Faktoren. Zum Beispiel kann die geringe Immunogenität der Peptide oder anderer Strukturen, die man zu verwenden wünscht, ein schwieriges zu überwindendes Problem sein, insbesondere mit kleineren Peptiden und jenen Peptiden, die keine geeigneten starken B- und/oder T-Zellen-potentierenden Sequenzen enthalten. Solche Peptide sind typischerweise bestenfalls nur schwach immunogen. Darüberhinaus müssen die ausgewählten Peptide, um breit an wendbar zu sein, in der Lage sein, eine Immunantwort in einem Großteil der Bevölkerung zu induzieren.
Es ist aus verschiedenen Gründen schwierig gewesen, gegen einen Angriff durch Organismen wie das HIV-Virus zu schützen oder Tumorimmunität vorzusehen. Zum Beispiel existieren genetische Unterschiede zwischen den Individuen beim Haupthistokompatibilitätsort, der die Fähigkeit des Systems beschränkt, auf einzelne kleine Peptide zu antworten. Somit können die verschiedenen Komponenten der Immunantwort, einschließlich der T-Zellen und B-Zellen, nicht in geeigneter Weise beim Erzeugen einer Immunantwort gegen nicht- oder schwachimmunogene kleine Peptide zusammenwirken. Bemühungen, um Peptidylimmunogenität zu verbessern, haben sich wesentlich auf die Verwendung von Adjuvanzien, wie Alum oder vollständiges Freundsches Adjuvans, konzentriert. Jedoch haben sich frühere Adjunvanzien, wie diese, aus verschiedenen Gründen als ungeeignet erwiesen, einschließlich einer Unfähigkeit des Adjuvans, spezifische T- oder B-Zellaktivität zu erhöhen und die Unfähigkeit des Adjuvans, die schwerwiegenden Beschränkungen der MHC-Restriktion zu überwinden.
Obwohl flüchtige Einblicke in die Verteidigungsmechanismen des Immunsystems des Körpers durch in vitro Studien und durch Beobachtung einiger in vivo-Reaktionen geliefert worden sind, besteht ein ernster Mangel an erfolgreichen therapeutischen Verfahren, um Immunität in vivo zu erhöhen. Verbesserte Zusammensetzungen und/oder Verfahrensweisen zum Hervorrufen oder Verstärken zellulärer oder humoraler Antworten in Säugetieren werden sowohl dafür benötigt, Tiermodelle zur Untersuchung therapeutischer Schemata bereitzustellen, neue Mittel zum Herstellen verbesserter Immunsystem-orientierter Produkte wie verbesserte immuntherapeutische Antikörper vorzusehen, als auch um die Behandlung und mögliche Immunisierung voranzutreiben, zum Beispiel, für Zustände wie HIV, Krebs und Infektionen.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine immunpotenzierende Zusammensetzung und ihre Verwendung, wie in den Ansprüchen definiert.
Der Begriff "Aktivierung" wird allgemein definiert, um irgendeine Änderung zu bezeichnen, die im Basal- oder Ruhezustand von T- oder B-Zellen induziert ist. Dies schließt ein, ist aber nicht darauf beschränkt, erhöhte Zellproliferation und DNA-Synthese, Lymphokin- und zytotoxische Zellproduktion, ein schneller Anstieg des intrazellulären Calciums, Freisetzung von wasserlöslichen Inositolphosphaten, verstärkte IL-2-Rezeptorexpression, verstärkte proliferative Antwort auf IL-2 und verstärkte Antworten auf fremde Antigene oder MHC (23). Im Gegensatz dazu ist der Begriff "immunpotenzierend" klassischerweise definiert als die Fähigkeit, eine Wirkung auf das Immunsystem zu produzieren, die die Fähigkeit des Systems verstärkt, auf fremde Antigene zu antworten. Somit kann Immunpotenzierung die zelluläre Antwort, humorale Antwort oder beides betreffen. Beispielhafte Anzeichen von Immunpotenzierung schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, Zellproliferation, verstärkte DNA-Synthese, verstärkte Produktion von Lymphokinen, verstärkte Produktion von zytotoxischen Zellen, Calciumefflux oder andere Änderungen, die die Zelle über den Basal- oder Ruhezustand hinaus erheben.
EP-A-0 336 379 offenbart die Verwendung von Antikörper-Heterokonjugaten, die an verschiedene Zelloberflächenantigene bin den, um T-Zellen oder B-Zellen zu regulieren. WO89/12458 offenbart heterofunktionelle Reagenzien, in denen ein Bindungsligand, der an eine T-Zelle bindet, an ein krankheitsassoziiertes Antigen gebunden ist. WO90/03985 betrifft einen Antikörper gegen ein Differenzierungsantigen NDAS.
Während man Betrachtungen anstellen kann, daß eine Unterscheidung zwischen den Begriffen "Potenzierung" und "Aktivierung" besteht, soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Verwendung des Begriffs "Potenzierung" sowohl Potenzierung als auch Aktivierung umfassen. Somit kann die Immunpotentierung, die durch die Verfahren und Agenzien dieser Erfindung erreicht wird, alle T-Zellen, bestimmte Untergruppen von T- Zellen oder B-Zellen betreffen, abhängig von der Natur des/der Agens/Agenzien und ihren Dosierungsniveaus. Eines der Ziele dieser Erfindung besteht darin, Mittel zum Feineinstellen der Immunpotenzierung zur Verfügung zu stellen, was erlaubt, T- und/oder B-Zellantworten zu targetieren, abhängig von der Natur des zu behandelnden klinischen Zustandes.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Ausführungsformen, die in den Ansprüchen definiert sind.
In Form von Antikörpern werden nützliche Immunpotenzierungsmittel im allgemeinen Antikörper gegen ein Zelloberflächenepitop von T-Zellen umfassen, wobei Binden des Antikörpers an das Oberflächenepitop der T-Zelle zur Immunpotenzierung führen wird. Ein beispielhafter Antikörper ist anti-CD3 (z. B. OKT3), von dem man früher nur wußte, das er immunsuppressiv ist und von dem man nicht wußte, daß er immunpotenzierend ist. Die vorliegenden Erfinder haben überraschend entdeckt, daß, wenn anti-CD3 in relativ geringen Dosen verabreicht wird (z. B. im Größenordnungsbereich von 100 bis 200 ug/kg Körpergewicht), er tatsächlich eine sehr weitreichende immunpotenzierende Wirkung anstelle einer immunsuppressiven Wirkung aufweist. Der Grund dafür scheint die Induktion von Lymphokinen, die Proliferation von T-Zellen, oder sogar die Progression von T-Zellen, von einem naiven in einen Gedächtniszustand zu sein, braucht aber nicht darauf beschränkt zu sein.
Während anti-CD3 ein nützliches Immunpotenzierungsmittel ist, wird man viele andere immunpotenzierende Antikörper als im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachten. Solche Antikörper sind allgemein definiert als Antikörper, die ein T-Zellaktivierungsmolekül oder Epitop auf der Zelloberfläche von T-Zellen erkennen und aktivieren. Zum Beispiel werden monoklonale Antikörper, die besonders nützlich beim Ausführen der vorliegenden Erfindung sind, jene umfassen, die gegen die variablen oder konstanten Epitope von T-Zellen auf der Zelloberfläche von T-Zellen gerichtet sind. Die T-Zellaktivierungsmoleküle, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, können entweder jene sein, die mit dem T-Zellrezeptorkomplex assoziiert sind, oder jene mit den Antigenen, die getrennt sind von, d. h. nicht physisch assoziiert mit, TcR auf der Zelloberfläche. Spezifische Ausführungsformen von T- Zellaktivierungsmolekülen umfassen entweder die Epitope der variablen oder der kontanten Region, die auf den Antigen-spezifischen polymorphen Ketten, z. B. a-, β-, γ- und δ-Ketten, vom T-Zellrezeptor exprimiert sind.
Ausführungsformen der nicht-polymorphen TcR-assoziierten CD3- Ketten, gegen die monoklonale Antikörper zur Verwendung als immunpotenzierende Agenzien gerichtet sein können, sind die γ, δ, , -Ketten. Monoklonale Antikörper sind gegen einige die ser Ketten entwickelt worden, wie exemplarisch dargestellt durch OKT3, SP34, UCHTI oder 64.1 (68-70). Unter den T-Zelloberflächenantigenen, die getrennt sind von, und nicht physisch assoziiert sind mit TcR, sind CD2, CD28, Thy-1 und die Aktivierungsepitope, die auf Mitgliedern der Ly-6-Proteinfamilia exprimiert sind.
Für direkte Verwendung als immunpotenzierende Agenzien wird man im allgemeinen wünschen, das Mittel zuerst mit einem pharmakologisch geeigneten Vehikel zu kombinieren, so bspw. Kombinieren mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Puffer, in einer Menge und Konzentration, die geeignet ist, um Potenzierung des Immunsystems bei Verabreichung zu bewerkstelligen. Typischerweise wird man im Falle von, z. B. anti-CD3, wünschen, parenterale Zusammensetzungen bereitzustellen mit von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 1 mg/ml, um parenterale Verabreichung geeigneter Mengen des Antikörpers zu erlauben.
Wie erwähnt, betrachtet die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser immunpotenzierenden Agenzien in ein Immunogen enthaltenden Zusammensetzungen, wie bspw. Impfstoffen, wo das Agens als "Adjuvans" dient, um die Immunogenität anderer Komponenten der Zusammensetzung zu erhöhen. Somit wird ins Auge gefaßt, daß durch die Verwendung derartigen Agenzien als "Adjuvanzien" die Herstellung von nützlichen Impfstoffen, die nur schwach oder nicht-immunogene Moleküle verwenden, von denen man früher nicht wußte, daß sie als Immunogene wirken, ermöglicht wird. In solchen Ausführungsformen wird das immunpotenzierende Protein zusammengemischt mit oder anderweitig zusammen mit dem Molekül verabreicht, gegen das eine Immunantwort erwünscht ist, wobei das immunpotenzierende Mittel in Mengen vorhanden ist, die wirksam sind, die Potenzierung nach Verabreichung an das spezielle Individuum zu fördern.
Es wird vorgeschlagen, daß noch weitere Vorteile realisiert werden, wo das Immunpotenzierungsagens tatsächlich mit dem Molekül konjugiert ist, gegen das eine Immunantwort erwünscht ist. Diese Konjugate werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als "Heterokonjugate" bezeichnet. Wie hierin verwendet, ist ein immunpotenzierendes Heterokonjugat definiert als ein immunpotenzierendes Agens, das an ein zweites Protein oder anderes Molekül konjugiert ist, gegen das eine Immunantwort erwünscht ist, wobei die Konjugation in der Natur einer chemischen oder molekularen Quervernetzung vorliegt.
Beispielhafte Ausführungsformen des zweiten Moleküls schließen Proteine ein, die Aminosäuresequenzen oder andere potentielle Determinanten (z. B. eine Nicht-Aminosäuredeterminante wie eine Sialogruppe), gegen die eine zelluläre oder humorale Immunantwort erwünscht ist. Wie bei den Adjuvansausführungsformen, betrachtet die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nicht-Proteinmolekülen, wie beispielsweise Glycolipide, Kohlenhydrate oder sogar Lektine, als das zweite Molekül, gegen die eine Immunreaktion gesucht wird. Alles was benötigt wird zur Verwendung im Zusammenhang mit Heterokonjugaten ist, daß man in der Lage ist, das Molekül an das Immunpotenzierungsagens zu konjugieren.
Es wird vorgeschlagen, daß andere, besonders wichtige Anwendungen im Zusammenhang mit Virus-spezifischen oder Virusassoziierten Epitopen liegen, insbesondere jene, wo das Immunsystem beeinträchtigt ist, wie beispielsweise im Fall von HIV- Infektionen. Darüberhinaus können auch Aminosäuresequenzen, die homolog sind jenen, die von Genen in einem Bakterium, Pilz, protozischem oder metazoischem Parasiten abgeleitet sind, als konjugierende Agenzien verwendet werden.
Natürlich können, wo erwünscht, die als zweite Proteine verwendeten Epitope entweder von der Zelloberfläche abgeleitet sein oder aus Zellen extrahiert werden, die infiziert oder erkrankt sind. Alternativ können Aminosäuresequenzen synthetisch durch standardmäßige chemische Synthese oder molekularbiologische Verfahren hergestellt werden. So sind, beispielsweise im Falle der HIV-Immuntherapie, Aminosäuresequenzen für verschiedene Peptide bekannt, die aus der HIV-Virus gp120- Zellmembran isoliert wurden, die als Ausführungsformen der zweiten Verbindung verwendet werden können, die einfach in einem geeigneten pharmazeutischen Vehikel zusammengemischt sind. Bevorzugte Ausführungsformen der Peptide, die als zweites Protein in einem Heterokonjugat verwendet werden können, das verwendet wird, um Immunität gegen HIV zu erhöhen, umfaßt Peptide 18, T1, T2, oder Peptide, die von der CD4-Bindungsstelle abgeleitet sind.
In ähnlicher Weise können als das zweite Protein Epitope verwendet werden, die spezifisch für Aminosäuresequenzen sind, die homolog zu jenen sind, die auf der Oberfläche von menschlichem Hepatitis-Virus exprimiert sind, oder extrahiert sind aus Zellen, die mit dem Virus infiziert sind. Spezifische virale Epitope können auch Aminosäuresequenzen umfassen, die homolog sind zu jenen, die auf der Oberfläche von infizierten Zellen exprimiert werden.
Immunogene Zusammensetzugen können zur Verabreichung an Individuen hergestellt werden, indem ein unkonjugierter monoklonaler Antikörper, der gegen ein T-Zellaktivierungsmolekül oder Epitop auf der Zelloberfläche einer menschlichen T-Zelle gerichtet ist, eingeschlossen wird, wobei der Antikörper nicht gegen NDA5 oder CD28 gerichtet ist. Die Materialien, die formuliert werden, werden typischerweise pharmakologisch dadurch akzeptabel gemacht, daß sie gemäß den Regeln des guten Produzierens hergestellt werden, extensiv dialysiert werden, um unerwünschte Moleküle mit geringem Molekulargewicht zu entfernen und/oder lyophilisiert werden für einsatzbereitere Formulierungen in ein erwünschtes Vehikel.
Wo derartige Zusammensetzungen für die Verabreichung an den Menschen beabsichtigt sind, wird man typischerweise wünschen, eine Menge von immunpotenzierendem Agens einzuschließen, die zu T-Zellaktivierung führen wird, bei Fehlen von einhergehender Immunsuppression. Die Bestimmung genauer Mengen wird von den speziellen Umständen abhängen, beispielsweise den speziellen zu behandelnden Zuständen, dem physischen Zustand des Patienten, der Art der immunogenen Zusammensetzung, die verabreicht werden soll, und dergleichen. So kann man beispielsweise auf der Basis muriner Studien, die vom Erfinder durchgeführt wurden, im Falle von Ausführungsformen, die immunpotenzierende Antikörper wie anti-CD3 oder anti-CD2 einbauen, extrapolieren, daß geeignete Formulierungen typischerweise von etwa 10 ug bis etwa 1000 ug Bolus/Patient alle 14 Tage oder so umfaßen und bevorzugterweise 100 ug bis etwa 400 ug des Antikörpers pro Patient. In ähnlicher Weise kann man im Falle von Enterotoxinen extrapolieren, daß man typischerweise wünschen soll, von etwa 100 ug bis etwa 10 mg des Enterotoxins pro Dosierung zu verwenden und bevorzugterweise etwa 1 bis etwa 5 mg/Dosis.
Für die Herstellung von Zusammensetzungen, die für parenterale Verabreichung geeignet sind, können die Immunogene der Erfindung in Ölen wie bspw. Sesam- oder Erdnußöl, wässriges Propylenglycol, in Liposomen oder in sterilen wässrigen Lösungen formuliert werden. Solche Lösungen sind typischerweise geeignet gepuffert, sofern erforderlich, und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst mit ausreichender Saline und Glucose isotonisch gemacht. Zusätzlich können Stabilisatoren in der Form von, z. B., Sorbitol oder stabilisierter Gelatine umfaßt sein. Diese speziellen wässrigen Lösungen können besonders gut für intramuskuläre oder subkutane Injektionen geeignet sein, wie es bevorzugt sein kann für Impfung unter Verwendung von Antigenpräparaten.
Die Proteine können in die Zusammensetzung in neutralen Formen oder Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen saure Beimischungssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen der Peptide) und die mit anorganischen Säuren gebildeten ein, wie, z. B. Salzsäure oder Phosphorsäuren, oder solche organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen wie, z. B., Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, oder Eisen (III)-Hydroxiden, und solchen organischen Basen wie Isoprophylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen, abgeleitet werden.
Die Zusammensetzungen werden verabreicht in einer Art und Weise, die mit den Dosierungsformulierungen kompatibel ist und in einer solchen Menge, die therapeutisch wirksam und immunogen sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt vom zu behandelnden Individuum ab, einschließlich, z. B., der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren und dem Umfang des erwünschten Schutzes. Genaue Mengen von aktiven Ingredenzien, die verabreicht werden müssen, hängen vom Urteil des Praktikers ab. Geeignete Schemata für anfängliche Verabreichung und Auffrischungen sind ebenfalls variabel, sind aber durch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Inokulierungen oder anderen Verabreichungen typifiziert. Verschiedene Verfahren zum Erreichen einer zusätzlichen Adjuvanswirkung für den Wirkstoff schließt die Verwendung von Agenzien wie Aluminiumhydroxid oder -phosphat (Alum), gewöhnlicherweise verwendet als 0,05 bis 0,1% Lösung in phosphatgepufferter Saline, Zusammenmischung mit synthetischen Zuckerpolymeren (Carbopol), verwendet als 0,25% Lösung, bzw. Aggregation der Proteine im Impfstoff durch Hitzebehandlung ein bei Temperaturen, die von 70º bis 101ºC reichen für die Dauer von 30 Sekunden bis 2 Minuten. Aggregation durch Reaktivierung von mit Pepsin behandelten Antikörpern (Fab) gegen Albumin, Mischen mit Bakterienzellen wie C. parvum oder Endotoxinen oder Lipopolysaccharidkomponenten von Gram-negativen Bakterien, Emulsion in physiologisch akzeptablen Ölvehikeln, wie Mannide- Mono-Oleat (Aracel A) oder Emulsion mit einer 20% Lösung eines Perfluorkohlenstoffs (Fluosol-DA), verwendet als ein Blocksubstituent, kann auch verwendet werden.
Während die Verabreichung der vorgenannten immunpotenzierenden Zusammensetzungen wahrscheinlich ihre größte Nützlichkeit und Anwendung bei der Behandlung von Erkrankungen des Menschen finden wird, ist die Erfindung in keinster Weise auf die Anwendung beim Menschen beschränkt und es ist beabsichtigt, sie auf ein jegliches Säugetier anzuwenden, das ein Immunsystem aufweist, einschließlich, z. B., Nager, wie bspw. Mäuse, Hamster und Ratten, Primaten, Kaninchen, sogar Nutztiere, wie bspw. Kühe, Schweine etc. Somit faßt die Erfindung ins Auge, z. B., daß bestimmte der vorgenannten Ausführungsformen eine allgemeine Anwendbarkeit aufweisen werden, wo immer man wünscht, eine verstärkte Immunantwort gegen ein bestimmtes Molekül zu erhalten, wie bei der anfänglichen Immunisierung von Tieren für die Hybridomentwicklung oder sogar die Entwicklung polyklonaler Antikörper.
Während ins Auge gefaßt wird, daß die Natur des zweiten Moleküls für die erfolgreiche Ausführung der Erfindung nicht kritisch ist, wird anerkannt, daß die Erfindung ihre größte Nützlichkeit dort finden wird, wo das zweite Molekül ein Peptid ist, was darin begründet liegt, daß es oft bekanntermaßen schwer ist, eine Immunantwort gegen Peptide zu erhalten. Somit wird angenommen, daß besondere Vorteile realisiert werden durch die Verwendung von Peptiden mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 100 Aminosäuren und bevorzugterweise einer Länge von etwa 8 bis etwa 50 Aminosäuren.
Wie oben erwähnt, faßt die vorliegende Erfindung ins Auge, daß verschiedene nützliche biologische Produkte durch die Anwendung der vorerwähnten immunpotenzierenden Zusammensetzungen abgeleitet werden können. Darüber hinaus hat man gefunden, daß immunpotenzierende Antikörper, wie bspw. anti-CD3, dazu dienen können, die Rekrutierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu fördern, vermutlich durch Stimulierung der Freisetzung von Cytokinen und Lymphokinen aus aktivierten T-Zellen. Dies schafft die Möglichkeit, daß derartige Ausführungsformen für die Herstellung hochaktiven Knochenmarks für Transplantation oder sogar für die Verabreichung an Knochenmarktransplantatempfänger oder jene mit dezimierten Knochenmarkszellen verwendet werden, um dem Mark eine metabolische Auffrischung zu ver leihen. Darüber hinaus wird ins Auge gefaßt, daß die aktivierten T-Zellen selbst nützlich sein werden, so daß beispielsweise in der Antitumortherapie, die tumorinfiltrierende Lymphozyten verwendet.
Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung werden nach dem Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung und durch Bezugnahme auf die Zeichnungen augenfällig werden:
Fig. 1. Formen von Immunsteigerung. Diese Figur zeigt eine Ausführungsform, wobei das immunpotenzierende Protein einfach mit einer Verbindung gemischt wird, gegen die eine Immunantwort erwünscht ist.
Fig. 2. Aktivierung von T-Zellen von peripheren Lymphknoten von anti-CD3-behandelten C3H Mäusen, wie bewertet durch Flußzytometrie (FCM). Zweifarben-FCM von Kontrolltieren und jenen, die mit 4, 40 oder 400 ug anti-CD3 behandelt worden sind, sind als Konturdiagramm auf einer logarithmischen Skala dargestellt. Die Intensität von grüner FITC-Fluoreszenz ist aufgetragen entlang der X-Achse und rote (B-Phycoerythrin)-Fluoreszenz ist entlang der Y-Achse aufgetragen. (A) Anti-CD4-Färbung auf der X-Achse und anti-IL-2-Rezeptor (IL-2R)-Färbung auf der Y-Achse. (B) Anti-CD3-Färbung auf der X-Achse und anti-Thy-1- Färbung auf der Y-Achse. C3H/HeN MTV&supmin;-Mäuse wurden 18 Stunden nach intravenöser Injektion von gereinigtem anti-CD3 (MAb 145- 2C11) getötet, der wie beschrieben (24) angezogen und gereinigt war. Femorale, axilläre und mesenterische Lymphknoten wurden entfernt und in Einzelzellsuspension zerlegt und eine FCM-Analyse wurde durchgeführt (25). Zellen wurden mit FITC-anti-CD3 oder FITC-anti-CD4 (MAb GK1.5) (Becton Dickinson), und Biotin-konjugierter anti-IL-2R (MAb 3C7) oder Bio tin-konjugierte MAb gegen Thy-1.2 (Becton Dickinson) gefärbt, dann mit B-Phycoerythrin-konjugiertem Eiklaravidin (Jackson Immuno Research Laboratories) gegengefärbt. Diese Ergebnisse zeigen, daß gering dosierte (4 ug) anti-CD3-Behandlung T-Zellen aktiviert, wie belegt durch IL-2R-Expression, aber nicht T-Zellrezeptoren moduliert.
Fig. 3. In vitro Proliferation von Lymphknoten-T-Zellen von anti-CD3-behandelten C3H-Mäusen. 18 Stunden nach intravenöser anti-CD3-Verabreichung wurden Lymphknoten von Tieren entfernt und die Zellen (1 · 10&sup5; Zellen für gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) und gemischte Lymphozyten-Tumorkultur (MLTC)) in Medium inkubiert, das bestrahlte syngeneische Milzzellen (2 · 10&sup5;) plus rekombinantes IL-2 (rIL-2), oder bestrahlte allogene (C57BL/10)-Milzzellen, oder Mitomycin C-behandelte Pro-4L-Tumorzellen (5 · 10³) enthielt. Proliferation wurde gemessen durch [³H]-Tymidin-Aufnahme bei 48 Stunden (rIL-2) oder 72 Stunden (MLR und MLTC). Hintergrundaufnahme (gewöhnlicherweise weniger als 5 · 10³ cpm) wurde bestimmt von Lymphknotenzellen, die mit syngeneischen bestrahlten Nebenzellen stimuliert wurden, oder von Mitomycin C-behandelten Tumorzellen, die alleine kultiviert wurden, und wurde dann von den Werten für behandelte Zellen abgezogen. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt; Standardabweichungen waren weniger als 5%. Die Ergebnisse zeigen, daß (a) funktioneller IL-2R auf anti-CD3-behandelten Zellen exprimiert wird; und b) anti-CD3-behandelte Zellen auf allogene MHC- und Tumorantigene nachdrücklicher antworteten als unbehandelte Zellen unter ansonsten gleichen Bedingungen.
Fig. 4. Kolonie-stimulierender Faktor (CSF) in Serum von Mäusen nach Iniektion von anti-CD3. Vereinigte Seren von drei Tieren wurden bei einer Endverdünnung von 6% murinen Knochenmarkszellen zugesetzt und die Anzahl von Kolonien wurde nach 7 Tagen gezählt. Jede Probe wurde doppelt getestet und die Werte wurden gemittelt. In allen Fällen unterschieden sich die Doppelwerte durch nicht mehr als 5% A: Die Mäuse erhielten 400 ug anti-CD3-Ig ( ), oder 250 ug F(ab')&sub2;-Fragmente von anti-CD3 (o). (Die Anzahl von Kolonien bei 3 Stunden für anti-CD3-behandelte Mäuse war mehr als 300.) B: Anzahl von Kolonien nach verschiedenen Dosen von anti-CD3. Serum wurde dann 3 Stunden nach Injektion gesammelt. Diese Ergebnisse zeigen, daß anti- CD3 in vivo Lymphokine induziert, einschließlich Kolonie-stimulierende Faktoren.
Fig. 5. Klinische Antwort auf anti-CD3 (OKT3)-Behandlung. A: Erhöhte allogerie MHC-Antwort in Patienten, die mit OKT3 behandelt wurden. B: Proliferation von T-Zellen vor und nach OKT3- Behandlung in Gegenwart (kreuzschraffierte Balken) oder Abwesenheit (geschlossene Balken) von rIL-2, schlägt vor, daß in vivo-Behandlung mit OKT3 menschliche T-Zellen aktiviert.
Fig. 6. Anti-CD3 erhöht die Immunantwort. Anti-KLH (Keyhole limpet hemocyanin)-Antikörper in Mäusen, die mit KLH behandelt wurden unter Verwendung von PBS, CFA oder anti-CD3 als Immunadjuvanzien. Die Ergebnisse schlagen vor, daß anti-CD3 anti- KLH-Antikörper-Antworten potenziert.
Fig. 7. Alloantwort auf Lymphozyten von C3H-Mäusen, die mit Staphylococcüs Enterotoxin B (SEB) oder mAb 145-2C11 behandelt wurden. Die Antwort, wie durch Zellproliferation gemessen(³H- Aufnahme in CPM), wurde verglichen unter Kontrollzellen gegenüber jenen, die entweder mit mAb 145-2C11 (anti-CD3) oder einer von 3 Dosen von SEB behandelt wurden. Zellproliferation wurde über Kontrollniveaus hinaus durch eine jede Behandlung erhöht. Zusätzlich zeigte die Stimulierung durch SEB eine Dosisantwort.
Fig. 9. Proliferative Antworten auf SEB. Lymphknotenzellproliferation wurde getestet durch ³H-Aufnahme (CPM) in C3H-Mäusen 18 Stunden nach Verabreichung von SEB. rIL-2-Antwort auf SEB war verstärkt, verglichen mit Kontrollen oder mit 145- 2C11-behandelten Mäusen. Zusätzlich existierte eine Dosisantwort (5, 50, 250 ug SEB).
Fig. 11. Verteilung von Lymphozytenuntergruppen nach Behandlung mit geringen Dosen an OKT3. Nach Behandlung mit geringen Mengen an OKT3 (100 ug pro Patient) wurde eine anfängliche Abnahme bei Lymphozytenuntergruppen, gefolgt von einer dramatischen Erholung von CD2-, CD3- und CD4-positiven Zellen beobachtet, und im geringeren Umfang von CD8-positiven Lymphozyten. Zusätzlich beobachtete man, daß Zellen durch die anti- CD3-Behandlung auf der Grundlage einer verstärkten Expression von IL-2-Rezeptor (CD25) auf Post-Behandlungslymphozyten aktiviert wurden.
Fig. 12. Erhöhte Lymphokin-Produktion nach Behandlung von Menschen mit OKT3. In Antwort auf in vivo-Behandlung eines Patienten mit einer Dosis von 100 ug OKT3 sieht man relative Titer an hämatopoetischen Vorläuferzellen (z. B. Banden, Myelozyten) sich in Antwort auf OKT3-Verabreichung dramatisch erhöhen.
Fig. 13. Überleben von Transplantaten als eine Funktion von Behandlung mit anti-CD3. In der durch diese Figur wiedergegebenen Studie wurde die Fähigkeit von CD3 in einem murinen Mo dell getestet, Graft-Versus-Host-Erkrankung (GVHD) aufzuheben, wobei die mAb-Behandlung auch das Einwachsen des Knochenmarks erhöhte. Die Studie wurde wie folgt durchgeführt: (B10 · B10.BR)F&sub1;-Mäuse wurden subletal mit 500 RAD bestrahlt und man injizierte ihnen eine tödliche Dosis von GVH-reaktiven B10.BR Milzzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von immunsuppressivem anti-CD3. Die Ergebnisse, wie in der Figur dasgestellt, zeigen, daß wenn ein Kontrollantikörper verabreicht wurde (normales Hamster-Ig), es am Tag 13 kein Überleben gab. Zu demselben Zeitpunkt gab es jedoch eine Überlebensrate von etwa 25% bei Verabreichung einer geringeren Dosis von anti-CD3 (25 ug) und bemerkenswerte 75% bei höherer Dosierung (250 ug), was darauf hindeutet, daß anti-CD3 Graft-Versus-Host-Erkrankung verhindert hatte. Die mittlere Überlebensrate betrug 11 Tage bei Kontrollen und 12 Tage bei Tieren, die mit der niedrigen Dosis anti-CD3 (25 ug) behandelt wurden. Die Überlebensrate bei der hochdosierten anti-CD3-Gruppe erreichte bei 75% ein Plateau.
Fig. 14. Wirkungen von Behandlungen von Mäusen in vivo mit einer Kombination aus 1005/45-KLH und 145-2C11. Diese Figur spiegelt Studien wieder, die ausgeführt wurden, um die Adjuvans-Charakteristik von anti-CD3 (mAb 145-2C11, ein anti-muriner CD3-mAb, der spezifisch für ein 25 kd-Protein-CD3- ist) zu zeigen, wenn zusammen mit einem KLH-verbundenen Peptid (1005/45; Literaturstelle 29) verabreicht, bei intraperitonealer Verabreichung. Man verabreichte C57BL/10-Mäusen 100 ug des 1005/45-KLH-Konjugates, intraperitoneal (IP) oder subkutan (SC), entweder alleine oder zusammen mit 4 ug anti-CD3 (145- 2C11) IP. Titer von anti-1005/45 wurden von Tag 7-28 nach Injektion getestet. Die Ergebnisse zeigen, daß, wenn das Peptid alleine über eine jegliche der Routen verabreicht wurde, sich ein sehr geringer spezifischer Antikörpertiter entwickelte.
Wenn jedoch anti-CD3 mit verabreicht wurde, resultierte ein überraschender Anstieg des spezifischen Antikörpertiters.
Fig. 15. In vivo-Behandlung mit mAbs. Die Antwort von IL-2- Rezeptor-positiven Zellen nach Behandlung mit anti-CD3 alleine wurde verglichen mit Behandlung mit einem Heterokonjugat, das anti-CD3 und anti-CD4 umfaßte. Anti-CD3 alleine führte zu signifikanten Erhöhungen von sowohl CD4+- als auch CD8+- IL-2- Rezeptor+-Zellen. Das Heterokonjugat (gekoppelt durch das SPDP-Verfahren) produzierte eine verstärkte IL-2R-Expression auf CD4+-Zellen, was eine Untergruppen-spezifische Antwort andeutet.
Fig. 16. In vivo-Immunstimulation von Mäusen, denen man ein Heterokonluqat verabreicht hatte. Tafel A: IgG-anti-FITC-Antikörperproduktion in anti-CD3-behandelten Mäusen, die mit FITC- BSA in vollständigem Freundschen-Adjuvans (CFA) oder PBS immunisiert waren, verglichen mit ELISA-Messungen von Seren von Kontrollmäusen (offene Balken). Tafel B: IgG-anti-FITC-Antikörperproduktion gemessen von Seren von FITC-anti-CD3-behandelten Mäusen (linksgestreifte Balken), verglichen mit FITCnormalem Hamster-Ig (schraffierte Balken), gemessen durch ELISA, vorgenommen an Blutungen vom Tag 10.
Das Immunsystem des Körpers ist nicht unüberwindlich. Es zerbricht unter dem Angriff, wenn es nicht in der Lage ist, die Notwendigkeit zu erkennen, Eindringlinge zurückzuschlagen, z. B., wenn der fremde oder anormale Reiz zu schwach immunogen ist, um eine Antwort zu produzieren. Zustände genetischer Immundefizienz ebenso wie erworbene Immundefizienz (z. B. durch Drogen oder viral induziert) unterminieren ebenfalls die Fähigkeit des Immunsystems, auf Infektion oder anormales Wachs tum, wie bspw. Neoplasmen, zu reagieren. Darüberhinaus ist artifizielle Suppression des Immunsystems, oft verwendet bei dem Bestreben, das Risiko von Transplantationsfehlschlägen infolge Host-Versus-Graft-Erkrankung zu reduzieren, begleitet von dem Risiko ernsthafte Nebenwirkungen zu erzeugen, z. B. Infektion und sogar Tumorentwicklung. Ein anderer Problemkreis entsteht, wenn nicht-selektive Stimulation normale ebenso wie anormale Zellen angreift, was zur Selbstzerstörung führt.
Es ist unbestritten, daß das Immunsystem eine Rolle bei der Prävention oder Suppression von malignem Wachstum hat, aber die Natur und der Umfang dieser Rolle ist unklar. Es wurden Bestrebungen unternommen, die Immunantwort zu verstärken und/- oder Tumorantworten auf einen Angriff hin zu ändern. Solche Bestrebungen, geeignete immuntherapeutische Protokolle zu entwickeln, sind jedoch nicht allgemein erfolgreich gewesen. So wurde bspw. mit wenig Erfolg sowohl der Transfer von Immunlymphozyten wie Immunstimulation verwendet bei Bestrebungen, Tumoren in Krebspatienten zu behandeln. Darüberhinaus hat die Suche nach den "Wunderkugeln" bspw. durch die Injektion von Antikörpern oder von Antikörpern mit nicht-spezifischen tumorzidalen Agenzien, z. B. Toxinen, nicht zu der erhofften Regression von Tumoren geführt. In ähnlicher Weise hatte die nichtspezifische Stimulierung des Immunsystems von tumortragenden Individuen durch Injizieren von Adjuvanzien, z. B., BCG, nur begrenzten Erfolg (z. B. im Fall von Melanomen). Darüberhinaus ist Immunisierung mit unmodifizierten allogenen Tumorzellen unwirksam und kann sogar zu schnellerem Tumorwachstum führen.
Die vorliegende Erfindung offenbart eine Sammlung von verwandten Strategien zum Überwinden eines oder mehrerer Versäumnisse der früheren Immuntherapie-Technik. Der Erfolg und potentielle Erfolg dieser Strategie wird in den folgenden Beispielen gezeigt. Die Strategie umfaßt Herstellen neuer immunpotenzierender Agenzien und Zusammensetzungen, die, z. B., die Verwendung von 1) ausgewählten immunpotenzierenden Agenzien alleine, 2) als "Adjuvanzien" mit zweiten Agenzien, gegen die eine ausgewählte Antwort erwünscht ist, oder 3) als Heterokonjugate, worin das immunpotenzierende Agens an die zweite Verbindung konjugiert ist, anwenden.
In Fig. 1 ist eine grundsätzliche Ausführungsform gezeigt, wobei ein immunpotenzierendes Protein (im gezeigten Beispiel ist das immunpotenzierende Protein ein immunpotenzierender Antikörper, anti-CD3), in einer Beimischung mit einem Peptid, gegen das eine Immunantwort erwünscht ist, vorliegt.
Wie die folgenden Beispiele veranschaulichen, wurde der Erfolg der verschiedenen Strategien der Erfindung durch in vivo-Antworten von Tieren und Menschen auf diese immunpotenzierenden Agenzien gezeigt, wobei gezeigt wurde, daß in der Tat Immunpotenzierung, Tumorwachstumsbeschränkung, induzierte Tumorimmunität, Resistenz gegen Infektion und verstärktes Rekrutieren von Knochenmarksstammzellen erreicht worden ist, wie vorhergesagt aufgrund der neuen Theorien des Erfinders.
Es ist in vitro gezeigt worden, daß monoklonale Antikörper (mAb), die spezifische T-Zelloberflächenmoleküle erkennen, T- Zellen in Abwesenheit von nominalem Antigen aktivieren können. (26, 27). Der mAb ahmt offensichtlich das physiologische Antigen nach und umgeht den T-Zell-Rezeptor (TcR)-Antigen-spezifischen Erkennungsmechansismus. Während T-Zellaktivierung kritisch ist beim Erzeugen potenter in vivo-Immunantworten auf, z. B., Tumorantigene, sind in vielen Fällen die residenten T- Zellen eines Individiums nicht ausreichend, um eine geeignete Immunantwort aufzubauen. Um diese Beschränkung zu überwinden, hat der Erfinder in vivo-Behandlungen entwickelt, die in der Lage sind, das Immunpotential von T-Zellen zu verstärken und dadurch ein leistungsfähiges Werkzeug zur Verfügung zu stellen, um das Immunsystem zu verstärken.
Basierend auf den in den folgenden Beispielen veranschaulichten Ergebnissen ist nun klar, daß Antikörper, die gegen TcR/- CD3 und andere T-Zelloberflächenstrukturen gerichtet sind, T- Zellfunktion tiefgreifend in vivo potentieren können. Diese Wirkung von monoklonalen Antikörpern war in vivo unerwartet, da eine klinische Hauptverwendung von mAbs, die gegen T-Zelloberflächenproteine gerichtet sind, darin bestanden hatte, die Immunantwort gegen fremde Antigene zu unterdrücken und nicht zu stimulieren. Darüber hinaus sind monoklonale Antikörper (mAb) gegen T-Lymphozytenantigene verwendet worden, um Immunantworten in vivo und in vitro durch Blockieren von T- Zellrezeptor-vermittelter Antigenerkennung zu unterdrücken, eine Eigenschaft, die klinisch angewandt wird, um Organtransplantatabstoßung zu verhindern und umzukehren.
Bei der Ausführung der Erfindung ist ein wichtiger Aspekt die Fähigkeit, geeignete immunpotenzierende Agenzien zu identifizieren, die in immunpotenzierenden Zusammensetzungen hiervon verwendet werden können. Diese Identifizierung erfolgt routinemäßig durch die Verwendung von Tests, die Potenzierung und/- oder Aktivierung von Immunsystemzellen identifizieren. Zum Beispiel verwendet der Erfinder routinemäßig Tests zur Aktivierung von T-Zellen, wie sie als zytolytische Aktivität von einer antwortenden Zelle, wie einer aktivierten CD8+-Zelle, gegen eine Zielzelle, wie bspw. eine K562-Zelle, gezeigt wer den könnte. Alternativ kann T-Zellaktivierung abgelesen werden anhand der Produktion von Lymphokinen (z. B. GMCSF, IL-2, -γ- IFN), die durch die antwortenden Zellen freigesetzt werden. Solche Tests sind in der Technik gut bekannt, wie dargestellt durch Literaturstelle 64. Ein weiterer hilfreicher Test verwendet Thymidineinbau als ein Maß für T-Zellproliferation (65). Andere mögliche Tests schließen IL-2-Rezeptorexpression, Phosphoinositidumsatz, und sogar Ca&spplus;&spplus;-Flux ein (66, 67).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet der Erfinder routinemäßig die Induktion von zytolytischer Aktivität, Lymphokinproduktion und T-Zellproliferation als Tests für Immunpotenzierung. Beispielhafte Tests sind angeführt in Tabellen 1 und 2 unten, die verwendet wurden, um mAb 145-2C11 (29) zu identifizieren, der mAb, der spezifisch ist für das 25 kd-Protein CD3- . Die in diesen zwei Tabellen zusammen angegebenen Daten zeigen die Fähigkeit des mAb 145-2C11, T-Zellen zu aktivieren. In Tabelle 1 ist ein Test angeführt, worin die Fähigkeit des mAb bewertet wird, die Lyse von cytotoxischen T- Lymphozyten (CTLs) wieder auf irrelevante Zielzellen auszurichten. Details des Tests sind wie in Literaturstellen 28 und 45 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß keine der alloreaktiven murinen CTLs signifikant die menschliche Zielzelle K562 bei Fehlen von mAb lysierte (Tabelle 1). Jedoch führte der Zusatz von Kulturüberstand von dem Hybridom, der anti-CD3-γ- mAb sekretierte, zur Lyse von Zielzellen.
Die Lyse hing ab vom Vorhandensein von Effektor-CTLs, da Inkubation der K562-Zellen mit mAb alleine zu keiner Lyse von Zielzellen führte.
Keiner von verschiedenen anderen Antikörpern, einschließlich anti-Lyt-2.2- und anti-LFA-1-mAb, die antigenspezifische lytische Aktivität inhibierten, waren in der Lage, Lyse der K562-Ziele durch die CTL-Effektoren zu fördern. Diese Fähigkeit, Lyse des BM10-37-CTL-Klons wieder auf das K562-Target zu richten, war in der Tat als Screeningprozedur zum Identifizieren des 145-2C11-mAb verwendet worden. Tabelle 1: mAb 145-2C11 aktiviert murine T-Zellen; Belegt durch Induktion von nicht-Antigen-spezifischer Lyse
Die Induktion von CTL-Aktivität wurde bestimmt durch Inkubation von Effektor-CTL und das antigennegative menschliche Ziel K562 in Gegenwart von 5 ul Kulturüberstand für 8 Stunden bei 37ºC. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten durch Verwendung einer großen Breite von Antikörperkonzentrationen (von 50 ul bis 1 ul Kulturüberstand). E/T = Effektor/Ziel-Verhältnis.
In der in Tabelle 2 angeführten Studie wurden die mitogenen Eigenschaften der mAbs durch Proliferationstests bewertet. Insbesondere wurde die Fähigkeit von mAb 145-2C11, T-Zellproliferation zu induzieren, studiert. In dieser Studie wurden T- Zellen (10&sup5;) in RPMI-1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum und 50 uM 2-Mercaptoethanol enthielt, mit bestrahlten Milzzellen (2000 Rad; 1 Rad = 0,01 Gy) (2 · 10&sup5;) in Gegenwart oder Abwesenheit von mAb und/oder Faktoren in Mikronapfplatten mit flachem Boden kultiviert. Das rekombinante menschliche Interleukin 2 wurde geliefert von Cetus (Palo Alto, CA). Nach 2 Tagen wurden die Zellen mit 1 uCi (1 Ci = 37 GBq) [³H]-Thymidin pro Napf für 18 Stunden inkubiert, die Zellen wurden geerntet und der Einbau von radioaktivem Isotop mit einem Scintillationszähler gemessen.
Somit wurden gereinigte T-Zellen mit 145-2C11 oder KontrollmAbs in Gegenwart oder Abwesenheit von costimulierenden Faktoren inkubiert. Der mAb 145-2C11 induzierte signifikante Proliferation in Abwesenheit exogener Faktoren. Der Zusatz jedoch von entweder Phorbol-12-myristat-13-acetat oder rekombinantem Interleukin-2 erhöhte signifikant die proliferativen Antworten. Schließlich proliferierten sowohl Lyt-2&spplus; (CD8)-, L3T4&supmin; (CD4)- als auch Lyt2&supmin; (CD8)-, L3T4&spplus; (CD4)-Milz-T-Zellen in Gegenwart von löslichem anti-CD3- -mAb. Im Vergleich zeigte man, daß ein löslicher anti-Vβ8-spezifischer mAb stark CD8-T-Zellen stimulierte, aber nur minimal CD4-Lymphozyten beeinflußte. Somit könnten phänotypisch verschiedene Untergruppen von T- Zellen differentiell durch Antikörper aktiviert werden, die spezifisch sind für verschiedene Komponenten des murinen TCR- T3 Komplexes. Tabelle 2: mAb 145-2C11 aktiviert T-Zellen, wie belegt durch Induktion von T-Zellproliferation
* C57BL/10 T-Zellen (10&sup5;) wurden mit bestrahlten Milzzellen (2 · 10&sup5;) als Stimulatoren kultiviert.
t Milzzellen wurden mit Antikörpern gegen die CD8- oder CD4-Moleküle, gefolgt von Kaninchenkomplement (C') inkubiert. In beiden Fällen führte Antikörperbehandlung zur Eliminierung von > 95% der korrespondierenden Zellpopulation, wie durch Flußzytometrie beurteilt.
f Phorbol-12-myristat-13-acetat (10 ng/ml).
§ Rekombinantes Interleukin 2 (50 Einheiten/ml).
mAb 145-8D10.
Somit haben Antikörper gegen CD3- (z. B. 145-2C11) die Fähigkeit, Immunpotenzierung in den vorgenannten Tests, wie gemessen durch Proliferation, Sekretion von Lymphokinen und die Expression von Interleukin-2-Rezeptor (IL-2R), bereitzustellen. Ähnliche Phänomene treten nach Behandlung von Mäusen auf mit Dosen von, z. B., im Bereich von 4 ug bis 400 ug~anti-CD3- mAb in vivo (30; Fig. 2-4). Bei höheren Dosen verursachen jedoch anti-CD3-mAbs (z. B. im Bereich von 40 ug bis 400 ug) auch ein Belegen von TcR, Modulieren und Erschöpfung von T- Zellen aus peripherem Blut und Lymphorganen. Somit ist das Netto-Ergebnis der Behandlung mit hohen Dosen von anti-CD3- mAbs in vivo Immunsuppression. Aus diesem Grund betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Protokolle, die darauf abgestellt sind, die Verabreichung von vglw. geringen Dosen zu erlauben.
Es wird ins Auge gefaßt, daß Tests, wie jene oben für T-Zellaktivierung und Potentierung angeführten, verwendet werden können in einer Vielzahl von Art und Weisen, um das Erreichen der Ziele der vorliegenden Erfindung zu unterstützen. Zum Beispiel wird vorgeschlagen, daß Tests wie diese verwendet werden können zum Screenen von Hybridomkolonien, um jene zu identifizieren, die mAbs sekretieren, die die erwünschte immunpotenzierende Wirkung aufweisen. In ähnlicher Weise können Tests wie diese leicht verwendet werden, um andere geeignete Immun potenzierungsmittel, wie bspw. immunpotenzierende bakterielle oder mycoplasmale Proteine, zu screenen und zu identifizieren. Weiterhin können Tests wie diese verwendet werden als ein erster Schritt bei der Bestimmung von geeigneten Dosierungen in Versuchstieren (z. B. als mg/kg Körpergewicht), die Immunpotenzierungen im Gegensatz zu Immunsuppression vorsehen werden.
Die vorerwähnte Information kann wiederum verwendet werden von den Fachleuten auf dem Gebiet, um vernünftige Dosierungen zu bestimmen, die wahrscheinlich bei der Therapie am Menschen erfolgreich sein würden. Zum Beispiel hat man gefunden, daß anti-CD3 (OKT3), der Menschen während eines klinischen Versuches über die Verwendung von anti-CD3 bei Krebsbehandlung verabreicht wurde, in ähnlicher Weise wie in den obigen Testsystemen wirkt und T-Zellen aktiviert (Fig. 5 A und B).
Obwohl immunpotenzierende Antikörper, die auf Aktivierungsantigene gerichtet sind, die auf allen T-Zellen exprimiert sind, bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wird vorgeschlagen, daß Antikörper oder Reagenzien, die spezifisch auf T-Zelluntergruppen gerichtet sind, als Immunadjuvanzien, ohne assoziierte Immunsuppression zur Folge zu haben, sogar nützlicher sind, da diese Spezifität gewährleistet, daß der Hauptteil der T-Zellen unbeeinträchtigt bleiben wird.
Somit werden bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung die verwendeten Potenzierungsreagenzien in bestimmten Fällen alle T-Zellen aktivieren, und in anderen werden Untergruppen von T- Zellen selektiv aktiviert werden.
Die T-Zelluntergruppen werden definiert als einzelne Familien von T-Zellen, die gemeinsame Merkmale teilen, einschließlich Zelloberflächenproteine, wie beispielsweise CD4 und CD8, die auf 66% bzw. 33% der T-Zellen exprimiert werden, Ly-6 und CD28, die auf bestimmten Familien von T-Zellen exprimiert werden, oder die TcR-Proteine (11, 15, 16)
In Tabelle 3 unten ist eine Reihe von bevorzugten T-Zellepitopen aufgelistet, die vorgeschlagen werden, um bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, um immunpotenzierende mAbs zu erzeugen.

Tabelle 3: Bevorzugte T-Zellepitope

1. Proteine im T-Zell-Rezeptorkomplex (TcR)

a. Nicht-polymorphe (monomorphe) Epitope (z. B. CD-γ, δ, , oder Epitope von der konstanten Region von TcR- α-, β-, γ-, δ-Ketten)
b. Polymorphe untergruppenspezifische Epitope (z. B. Epitope, die auf dem variablen Teil von TcR-, Vα-, Vβ-, Vγ- oder Vδ-Ketten exprimiert sind)

2. Proteine, die nicht mit TcR assoziiert sind

a. Nicht-polymorphe (monomorphe) Epitope (z. B. Thy-1, CD2)
b. Polymorphe Untergruppen-spezifische Epitope (z. B. CD4, CD8, Ly-6, CD28)
Die Antwort des Immunsystems auf Staphylococcus Enterotoxin (SEB) als ein immunpotenzierendes Agens ist erstaunlicherweise stärker als diejenige, obwohl qualitativ ähnlich zu dieser, die in Antwort auf anti-CD3 beobachtet wird (Fig. 7 bis 10). Zum Beispiel liefert SEB als Antwort auf die Dosis eine Erhöhung der allogenen Zellproliferation in Mäusen (Fig. 7).
Darüberhinaus waren proliferative Wirkungen, die durch SEB- Verabreichung hervorgerufen wurden, wie gemessen in Gegenwart von RIL-2, auch von einer überraschenden Größenordnung (Fig. 9).
Es wird vorgeschlagen, daß mAb-Therapie gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindungen eine weitreichende Nützlichkeit im Zusammenhang mit Knochenmarktransplantationen haben wird. Eines des größten Probleme bei Knochenmarktransplantationen ist die Gegenwart von T-Zellen im Inoculum. Obwohl verschiedene Studien vorgeschlagen haben, daß eine Erschöpfung an T-Zellen beim Vermeiden von Draft-Versus-Host- Erkrankung kritisch ist (GvHD), können T-Zellen eine kritische Rolle beim Gewebeeinwachsen spielen. Zuerst können T-Zellen benötigt werden, um eine Cytomegalovirus- und Epstein-Barr- Virusinfektion in transplantierten Individuen zu begrenzen. Zweitens können, wenn Knochenmarktransplantation bei Leukämie- Patienten verwendet wird, spezifische T-Zellen potente Transplantat-vs.-Leukämie-Antworten vorsehen, die die restlichen Tumore eliminieren. Schließlich können T-Zellen eine kritische Rolle beim Gewebeeinwachsen vorsehen, indem sie eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren wie GM-CSF herstellen. Während eine vollständige T-Zellerschöpfung GvHD eliminieren kann, kann sie auch ein erfolgreiches Einwachsen von Knochenmark verhindern.
Es wird vorgeschlagen, daß Aspekte der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, wenn man sich diesem Problem zuwendet. Es gibt offensichtlich eine Wechselwirkung zwischen Immunsuppression und Immunpotenzierung. Die Verwendung von bestimmten Dosen aktivierender anti-CD3-Antikörper in vivo wird nicht nur GvHD verhindern, sondern wird auch endogene T-Zellen aktivieren, um hämatopoietische Wachstumsfaktoren zu produzieren, die ein Einwachsen des Gewebes erleichtern. Beispielhafte Dosen, um diese Wirkung zu erreichen, werden von 5 mg/kg bis 20 mg/kg reichen, wobei 10 mg/kg als optimal vorgeschlagen werden. Die Fähigkeit von immunpotenzierenden Agenzien, Hämatopoese zu erhöhen, wird gezeigt, z. B., durch Studien, in denen gezeigt wird, daß spezifisches Rekrutieren von Stammzellen, wie Myelocyten und Banden, nach Verabreichung solcher Agenzien an den Menschen, und erhöhte Koloniebildung in sowohl Mäusen als auch Menschen auftritt. Zusätzlich wird vorgeschlagen, daß mAbs, die gegen Aktivierungsantigene gerichtet sind, die auf Stammzellen oder hämatopoietischen Zellen vorhanden sind, Faktorproduktion oder Zelldifferenzierung induzieren können, die ein Einwachsen von Gewebe bei Abwesenheit von T-Zellen erleichtern werden.
Es ist wesentlich, daß hochdosierte anti-CD3-Behandlung Graftvs.-Host-Erkrankung blockiert. In einer exemplarischen Studie wurden zuerst (C57BL/10 · BALB/C)F1-Mäuse i. p. mit 250 ug anti-CD3-mAb (145-2C11) behandelt und dann einer Gamma-Bestrahlung von 500 Rad ausgesetzt. Innerhalb von ein bis zwei Stunden nach Bestrahlung wurden den Mäusen Milzzellen von einer C57BL/10-Maus injiziert. Kontrollmäuse, die nicht mit anti-CD3 behandelt waren, starben an GVH-Erkrankung innerhalb von 2 Wochen. Im Gegensatz dazu überlebten 75% der Mäuse, denen eine einzige Dosis an anti-CD3 verabreicht worden war. Beachtlich ist, daß der anti-CD3-Antikörper vorab verabreicht wurde, da vorgeschlagen wird, daß zirkulierender anti-CD3-Antikörper TcR von Wirts-T-Zellen modulieren würde und somit HvD-Reaktionen in Experimenten inhibieren würde, die auf Verstärkung allogenischer Knochenmarkseinwachsung gerichtet sind. Da zirkulierend, erschöpfte somit anti-CD3-mAb alloreaktive T-Zellen aus dem Donor-Inoculum, bevor GvH-Reaktionen eingeleitet werden konnten (Fig. 13). Zusätzlich wurden mAb-Wirkungen durch CSF- Tests, in vivo, und CFU-C-, BFU-E- und CSF-Tests in vitro untersucht.
Studien haben gezeigt, daß mAbs darauf gerichtet sein können, Aktivierungsmoleküle zu erkennen, die auf hämatopoietischen Zellen exprimiert sind. Verschiedene Antikörper sind kürzlich identifiziert worden, die mit Untergruppen von hämatopoietischen Stammzellen reagieren. Ly-6A, auch bekannt als Scal, wird auf den frühesten hämatopoietischen Stammzellen exprimiert und Studien haben gezeigt, daß mAbs, die auf das Ly-6A- Epitop gerichtet sind, T-Zellen aktivieren werden. Von einem zweiten mAb 143-4-2, der mit dem Ly-6C-Epitop reagiert, das auf 40% der Nicht-Stammzellen im Knochenmark exprimiert ist, wurde auch gezeigt, daß er T-Zellen aktiviert [27]. Diese Ergebnisse unterstützen die Vorstellung; daß mAbs das Knochenmark stimulieren können.
Die Daten in Fig. 12 zeigen, daß Verabreichung von 1-3 Dosen von 100 ug direkt in Antwort auf die Verabreichung zu weitreichenden Verstärkungen an zirkulierenden Stammzellen führt, wie beispielsweise Myelozyten und Banden. Eine einzelne Dosis von 250 ug anti-CD3 resultierte in einer > 100-fachen Erhöhung an CFU-C-, BFU-E- und Gesamtknochenmarkkolonien (Fig. 11) 4 bis 10 Tage nach Injektion. Diese Erhöhungen der Hämatopoese sind auch bei Menschen beobachtet worden, die mit OKT3 behandelt worden waren (Fig. 12). Diese Studien wurden durch histologische Untersuchungen und standardmäßigen in vitro-Knochenmarkkoloniebildungstests bei Abwesenheit oder Anwesenheit exogener Wachstumsfaktoren wie Erythropoetin oder GM-CSF durchgeführt.
In ähnlicher Weise zeigt Tabelle 4 unten Daten, die die in vivo-Wirkungen von anti-CD3 auf die Hämatopoese zeigen. Die in Tabelle 4 gezeigten Studien wurden durchgeführt durch Injizieren von 250 ug anti-CD3 am Tag 0. Knochenmarkzellen wurden am Tag 4 und 10 geerntet und in vitro auf Knochenmarkkolonie-Bildungen wie oben untersucht. Wie ersichtlich, führte die Verabreichung von anti-CD3 an Mäuse in allen Fällen zu tiefgreifenden Erhöhungen hämatopoietischer Vorläuferzellaktivität. Tabelle 4: In vivo-Wirkungen von anti-CD3 auf Hämatopoese
Wie oben festgehalten, ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung die Erkenntnis, daß immunpotenzierende Agenzien, die hierin beschrieben sind, als "Immunadjuvanzien" verwendet werden können, um eine verbesserte Immunantwort gegen Verbindungen her vorzurufen, gegen die eine solche Reaktion erwünscht ist. Somit wird erwogen, daß derartige immunpotenzierende Agenzien formuliert oder ansonsten co-verabreicht werden können zusammen mit derartigen Verbindungen, um eine Immunantwort gegen eine solche Verbindung zu verbessern oder zu entwickeln. Verschiedene Studien sind durchgeführt worden, die dazu dienen, das überraschende Potential für die immunpotenzierenden Agenzien hiervon, in dieser Weise als Immunadjuvanzien zu wirken, zu zeigen.
In einer solchen Studie wurde die Fähigkeit von verschiedenen Adjuvanssubstanzen auf der Basis ihre Fähigkeit verglichen, die Bildung von Antikörpern gegen ein Keyhole Limpet Hemocyanin (KHL)-Testantigen zu fördern. Die studierten Adjuvanzien waren PBS (phosphatgepufferte Saline-Kontrolle), CFA (vollständiges Freundsches Adjuvans) und anti-CD3. Die Studie wurde wie folgt durchgeführt: 100 ug KLH wurden am Tag 0 i. p. in Gegenwart oder Abwesenheit von Adjuvans injiziert. Man frischte die Mäuse am Tag 14 auf und die Mäuse wurden in wöchentlichen Intervallen zur Ader gelassen. Antikörperaktivität wurde in Seren durch Standard-ELISA getestet.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 6 gezeigt. Wie ersichtlich, lieferte die gleichzeitige Verabreichung von anti- CD3, bei allen Verdünnungen des resultierenden Antiserums, wesentlich bessere Ergebnisse als das PBS-Adjuvans hinsichtlich spezifischer anti-KLH-Titer, die sich entwickelten. In weiteren Studienserien wurden Mäuse auf ihre Fähigkeit getestet, spezifische Antikörper als Antwort auf Reizung über verschiedene Routen mit einem KLH-gekoppelten Peptid, bezeichnet als Peptid 1005/45-KLH, zu produzieren mit und ohne gleichzeitige Verabreichung von anti-CD3. Dieses Peptid ist abgeleitet aus dem CD4-bindenden Teil des HIV-GP120-Moleküls. Den Mäusen wurde das Testimmunogen, 1005/45-KLH, entweder 100 ug subcutan (sc) oder 100 ug intraperitoneal (i. p.) am Tag 0 und 14 verabreicht, gefolgt von Verabreichung von 4 ug anti- CD3 (145-2C11) i. p. in Versuchstiere. Zu verschiedenen Zeitpunkten (7, 14, 21, 28 Tage) wurden die entsprechenden Mausseren auf das Auftreten von Antikörpern gegen 1005-45 getestet(anti-1005/45-Titer). Wie in Fig. 14 gezeigt, demonstrierten die Ergebnisse eine starke Erhöhung im 1005/45-spezifischen Titer am Tag 21 in den 145-2C11-behandelten Tieren, verglichen mit den Kontrollen. Die stärkste Antwort betreffend Serumtiter an anti-1005/45-Antikörpern war in der Gruppe, die sowohl Antigen als auch 145-2C11 intraperitoneal erhielt. (Tabelle 5, Fig. 14). Es gab im wesentlichen keine Antwort bei den Kontrollgruppen oder bei den subcutan Behandelten. Die Ergebnisse zeigen die immunpotenzierende Wirkung von anti-CD3 als ein Adjuvans, wenn zusammen mit einem relativ nicht-immunogenen Protein verabreicht. Tabelle 5 Serumtiter von anti-1005/45-Antiköpern in C57BL/10, die intraperitoneal (IP) oder subcutan (SC) mit 1005/45-KLH und 145-2C11 behandelt wurden
Daten werden als höchste Verdünnung angegeben, bei der Antikörper in Serum durch ELISA nachgewiesen wurden.
ND = Nicht nachweisbar.
Man hat gefunden, daß kleine Peptide als Immunogene wirken, wenn Sie mit anderen Adjuvanzien als monoklonalen Antikörpern oder weiteren bakteriellen Enterotoxinen verwendet werden. Die Aktivierung von Immunsystemkomponenten war nicht zuverlässig genug, um einen klinischen Erfolg hervorzusagen. Spezifische Langzeitimmunität beruht in vielen Fällen auf den stringenten Erfordernissen für T-Zellerkennung von Antigenen im Umfeld der polymorphen MHC-Moleküle. Die Verwendung von immunpotenzierenden Proteinen, wie beispielsweise monoklonalen Antikörpern und bakteriellen Proteinen, um T-Zellen zu aktivieren bei Abwesenheit des Erfordernisses von Antigen-/MHC-Interaktion, gekoppelt mit der Wahrscheinlichkeit, daß die meisten kleinen Peptide immunogene Epitope exprimieren werden, obwohl sie nicht von T-Zellen oder MHC-Proteinen erkannt werden können, bilden eine wesentliche Grundlage der vorliegenden Erfindung. Ein Ziel dieser Erfindung bestand darin, ein Peptid direkt an ein immunpotenzierendes Protein, z. B. monoklonalen Antikörper oder bakterielles Enterotoxin, zu koppeln, um ein potenteres Immunogen als das Peptid alleine vorzusehen.
Was in dieser Erfindung erreicht worden ist, ist die Entwicklung eines "Passierscheins", der die Zelle dazu verleitet, zu glauben, daß sie ein präsentiertes fremdes Antigen sieht und sie veranlaßt, aktiviert zu werden. Indem ein Peptid, das entweder an ein immunpotenzierendes Protein gekoppelt ist, oder in Kombination mit ihm präsentiert wird, wird die T-Zellaktivität auf das einzige antigenspezifische B-Zellen-Ziel gerichtet. (Fig. 16 und 17).
Das zweite Protein wird isoliert und gereinigt durch Standardverfahren aus erkranktem oder anormalem Gewebe, aus einem infektiösem Agens, oder durch genetechnologisches Herstellen einer spezifischen Aminosäuresequenz unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken. Ausführungsformen des zweiten Proteins im allgemeinen sind in Tabelle 6 gezeigt. Eine spezifische Ausführungsform wäre die Aminosäuresequenz, T1, die innerhalb des GP120-Proteins von HIV-Virus kodiert wird: K Q I I N M W Q E V G K A M Y A. Tabelle 6: Ausführungsformen des zweiten Proteins*
* Schließt ein Epitop ein, gegen das eine humorale Immunantwort erwünscht wird.
Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Stimulieren einer Immunantwort in identifizierten Personen, die einer solchen Stimulierung bedürfen, da sie an einer Erkrankung oder an Infektionen leiden. Personen, die Kandidaten für diese Behandlung sind, schließen jene ein, die einen Tumor haben, immunbeeinträchtigt sind oder sich AIDS oder andere virale, bakterielle, fungale oder parasitische Infektionen zugezogen haben.
Die Immunantwort wird stimuliert durch Verabreichen nur des immunpotenzierenden Proteins, das nicht an das zweite Protein gekoppelt ist. Das immunpotenzierende Protein kann zuvor, danach oder zusammen mit dem zweiten Protein verabreicht werden. Alternativ kann ein einzelnes immunpotenzierendes Agens verwendet werden.
Für die klinische Anwendung werden die Personen, die einer Behandlung bedürfen, identifiziert und der monoklonale Antikörper, der spezifisch für ein nichtpolymorphes oder polymorphes T-Zelloberflächenprotein ist, wird den Personen über die intravenöse Route verabreicht. Der monoklonale Antikörper darf weder immunsuppressiv sein, noch die CD3/TcR-Expression bei der verwendeten Dosis negativ beeinträchtigen. Eine offenbarte Ausführungsform ist es, monoklonalen Antikörper gegen die CD3- Zelloberflächenantigene zu verwenden, die mit TcR assoziiert sind. Der mAb ahmt ein physiologisches Antigen nach und umgeht den TcR-Antigen-spezifischen Erkennungsmechanismus.
Wenn das Epitop ein Tumor ist, verhindert die Behandlung mit Dosen von monoklonalen Antikörper, die so ausgewählt sind, daß sie Titer sind, die nicht immunsuppressiv, sondern immunpotenzierend sind, das Auswachsen des Tumors und liefert auch anhaltende Tumorimmunität. In dieser Erfindung offenbarte Verfahren verstärken das Immunpotential von T-Zellen und anderen Komponenten des Immunsystems und liefern leistungsfähig Werkzeuge, um das Immunsystem zu verstärken. Ein Ziel der Erfindung ist es, die Wirkungen von schwach immunogenen oder kleinen Peptiden oder Proteinen auf das Immunsystem zu verstärken. Zum Beispiel liefert das Konjugieren von Proteinen an monoklonale Antikörper eine stärkere Antwort, indem die Erfordernisse von Immunogenität, die unter das Mandat der MHC-Beschränkung und Antigenerkennung durch T-Zellrezeptor gestellt wird, umgangen werden.
Die Strategie dieser Erfindung besteht darin, T-Zellimmunaktivität unter Verwendung von mAbs zu stimulieren. T-Zellaktivierung verstärkt die Fähigkeit eines Individuums, einen malignen Tumor in spezifischer Weise zurückzuweisen und liefert langanhaltende Tumorimmunität. Deshalb sind antigenähnliche Wirkungen von monoklonalen Antikörpern gegen TcR/CD3-Strukturen offenbart als ein Mittel, um spezifisch Immunfunktion in vivo in tumortragenden Individuen zu verstärken.
Diese Erfindung erlaubt die direkte Wechselwirkung von wesentlichen Komponenten des Immunsystems beim Entwickeln starker zellulärer und humoraler Immunität. Sie ist auch darauf gerichtet, jene zu schützen, die noch nicht von der Erkrankung oder einem Zustand betroffen sind, indem ein Impfstoff offenbart wird, der das hierin beschriebene immunogene Heterokonjugat umfaßt. Die Verwendung dieses Heterokonjugats erfordert nicht die Wechselwirkung des Peptids mit den Haupthistokompatibilitätskomplex-Antigenen, was einen sehr wesentlichen Vor teil darstellt, nämlich, die polymorphe Antwort zu umgehen, was herkömmlicherweise mit dem MHC-System ein Problem ist. Alle Immunantworten hängen von der Fähigkeit von T-Zellen ab, prozessiertes Antigen, das mit Haupthistokompatiblitäts-Antigenen (MHC) assoziiert ist, zu erkennen.
Ein jeglicher Impfstoffansatz, der HIV-Peptide verwendet oder inaktiviertes Virüsantigen, muß von der Fähigkeit des antigenen Peptids abhängen, die geeigneten MHC-Antigene zu binden, die notwendig sind, um eine Immunantwort zu initiieren. Genauer gesagt trifft die Entwicklung eines erfolgreichen HIV-Impfstoffes für die allgemeine Verwendung auf große Probleme infolge des enormen Polymorphismus der in der Population exprimierten MHC-Antigene und der Variation des Virus. Somit könnte eine ideale Form der Immuntherapie und Impfstoffe gegen, z. B., AIDS erreicht werden, indem die Antigenität der Peptid- MHC-Wechselwirkung verstärkt wird oder die Aktivität der Immunzellen aufgefrischt wird und somit die Schwelle der Antigenität verringert wird, die notwendig ist, um spezifische Immunantworten und Gedächtnis nach Antigen-Exposition auszulösen. Ein allgemeinerer Impfstoff wird durch Verwendung des Heterokonjugates erzeugt, was ein Aspekt der Erfindung ist, da die extensive genetische Diversität des MHC kein Faktor beim Binden an T-Zellen ist. Ausgehend von der hochpolymorphen Natur von sowohl den MHC-Proteinen als auch den TcR-Genprodukten ist die Anzahl von Peptiden, die in ausreichender Menge vorhanden sind, um sowohl den MHC als auch den TcR zu binden, um somit eine Immunantwort zu induzieren, gering, Faktoren, die den Erfolg von Impfstoffen beschränken.
Die Wirksamkeit von Impfstoffen, insbesondere jene, die schwach immunogen sein können, kann verbessert werden, indem das Fremdantigen so modifiziert wird, daß es immunogener ist, oder die Verwendung von Peptiden erlaubt, die unter normalen Bedingungen nicht immunogen sind, da sie nicht an MHC binden würden, die aber eine konservierte Stelle auf den hauptsächlichen HIV-Virusproteinen darstellen, die in einem großen Prozentsatz der Population gefunden wird. Monoklonale Antikörper, die als das immunpotenzierende Protein im Impfstoff verwendet werden, schließen T-Zelloberflächen-Antikörper ein, die gegen nicht-polymorphe oder polymorphe T-Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind.
Ein Ziel dieser Erfindung ist ein Therapieansatz, der die zellulären Antitumoreffektormechanismen des Wirtes aktiviert, obwohl das Epitop nur schwach immunogen ist und der Wirtserkennung und Abstoßung entgehen könnte, sofern nicht erhöht. Hauptformen von Immundefizienz können auf der Unfähigkeit von Antigenen beruhen, infolge suboptimaler Antigenpräsentation und T-Zellaktivierung eine primäre Immunantwort auszulösen.
Zusätzlich zur Verabreichung von Zusammensetzungen, um Immunität zu stimulieren, regt die vorliegende Erfindung auch an, daß bestimmte immunologische Produkte, die als das Ergebnis einer solchen Verabreichung hergestellt werden, manchen Individuen einen Vorteil liefern können, insbesondere immunbeeinträchtigten Individuen. Das bedeutet, daß erwägt wird, daß die immunpotenzierenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen verwendet werden können, um Antikörperzusammensetzungen zu produzieren, wie Gammaglobulinfraktionen, die Individuen zur Entwicklung passiver Immunität verabreicht werden können.
Für derartige Ausführungsformen werden immunpotenzierende Zusammensetzungen hiervon, die geeignete Verbindungen enthalten, gegen die eine Immunantwort erwünscht ist, sei es, daß solche Zusammensetzungen in der Form von "Adjuvans"-Zusammensetzungen oder Heterokonjugaten vorliegen, krankheitsfreien Individuen in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um eine spezifische Immunantwort gegen die zweite Verbindung hervorzurufen. Die resultierende Gammaglobulinfraktion wird dann erhalten und durch bekannte Techniken gereinigt, und Individuen, die einer solchen Behandlung bedürfen, in wirksamen Mengen verabreicht. Beachtlich ist, daß zusätzlich zur Verwendung von Immunglobulinfraktionen die vorliegende Erfindung erwägt, daß andere immunologische Produkte, wie bspw. aktivierte T- und B-Zellen, auch für derartige Zwecke, z. B. bei der Behandlung von Krebs und sogar HIV-Infektionen, hilfreich sein werden.
Die Entwicklung der Erfindung machte die Herstellung von immunpotenzierenden Agenzien, Testen ihrer Wirkungen in vitro und schließlich Entwickeln ihrer in vivo-Wirkungen an Mäusen als Modelle und am Menschen zu Zwecken der Behandlung erforderlich.
Die in dieser Erfindung offenbarten in vivo-Wirkungen sind von den in vitro-Wirkungen nicht absolut vorhersehbar, da eine Antwort eines intakten Organismus Wechselwirkungen eines komplexen Immunsystems widerspiegelt, wohingegen in vitro einzelne Komponenten kontrolliert werden können und Systemwechselwirkungen schwierig zu stimulieren sind. In vivo können verschieden Komponenten, die im Labor in bestimmter Weise getrennt reagieren, möglicherweise nicht in geeigneter Weise interagieren, wenn ihre Wirkungen kombiniert werden.
Die folgenden Beispiele stellen Verfahren dar zum Herstellen der hierin beschriebenen immunpotenzierenden Agenzien, Verfah ren zu deren Verabreichung an Nicht-Menschen oder Menschen und Verfahren zum Testen ihrer Wirkungen.

Beispiel 1: Herstellung der immunpotenzierenden Agenzien

Monoklonale Antikörper wurden gegen spezifische Klassen von T- Zellepitopen hergestellt. Diese Klassen sind in Tabelle 3 aufgelistet. In der folgenden Ausführungsform sind Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein nichtpolymorphes Epitop, CD3, und ein polymorphes Epitop Vßx beschrieben, wobei x = eine spezifische Kette im variablen Teil des TcR-Komplexes ist:
Monoklonale Antikörper wurden erzeugt, die mit den T-Zelloberflächenstrukturen reaktiv sind, die als alloreaktive zytotoxische T-Zellen (CTL)-Klone exprimiert und an der T-Zell-Aktivierung beteiligt sind. MAbs, die für diese Oberflächenmoleküle spezifisch waren, wurden identifiziert unter Verwendung eines Tests (entwickelt von Bluestone, der Umorientierungslysetest (33), siehe auch Beispiel 13), der auf der Fähigkeit von Antikörpern, die mit dem TcR-Komplex reagieren, beruht, antigenspezifische CTL zu induzieren, Zellen zu lysieren, die nicht ihre natürlichen Ziele sind. Diese Aktivität hängt sowohl von der Fähigkeit des Antikörpers ab, die CTL über den TcR zu aktivieren als auch den Effektor an die Zielzellen über den Fc·-Rezeptor (FcR) auf den Zielzellen multivalent querzuvernetzen. Mehrere mAbs sind auf diese Weise gewonnen worden. Dieser Test ist ein Weg, um auf mAbs zu selektieren, die T- Zellen aktivieren und Proliferation und Lymphokin-Freisetzung erhöhen.
Der mAb, 145-2C11, wurde gewonnen durch Fusionieren von Milzzellen von einem armenischen Hamster, der mit einem murinen CTL-Klon gegen SP2/0-Zellen immunisiert war, und Screenen der resultierenden Hybridomüberstände in dem Umorientierungslysetest. Dieser mAb immunpräzipierte den vollständigen TcR- Komplex unter Verwendung nicht-ionischen Detergenzien, reagierte aber spezifisch mit einer 25-kD-Proteinkomponente (CD3-E) des antigenspezifischen TcR-Komplexes. mAb 145-2C11 kann auch erhalten werden durch Anziehen von Hybridomzellen in einer Acusyst P-Maschine (Endotronics, Minn., MN) und dann Sammeln des Überstandes. Antikörper wurden dann durch 50% Ammoniumsulfatpräzipitation, gefolgt von Gelfiltration auf einer ACA 34-Ultragelsäule [BF Biotechnics, Savage, MR] gereinigt.
Ein weiterer mAb, 143-4-2, wurde gewonnen durch Fusionieren von Milzzellen aus einer BALB/c-Maus, die mit einem murinen CTL-Klon immunisiert war, und Screenen, wie in Beispiel 13. Dieser mAb definiert ein neues Zelloberflächenmolekül, das an der T-Zellaktivierung beteiligt ist. Die Expression des 143-4- 2-definierten Epitops wurde auf dem Ly-6C-Molekül exprimiert und war in seiner Lymphoid-Expression auf Knochenmarkszellen und auf eine Untergruppe von peripheren CD8+-Zellen (34) beschränkt. Der Anti-Ly-6.2C-Antikörper kann die Lyse von Zielzellen fördern, die kein Antigen tragen, durch alloreaktive CTL-Klone und induzierte, in Anwesenheit von Co-Faktoren (PMA oder IL-2), eine Untergruppe von CD8+-Zellen, zu proliferieren, vielleicht durch einen autokrinen Weg. Obwohl der beschriebene Antikörper antigenähnliche Wirkungen aufweist, wie beschrieben für anti-TcR-Komplex-Regenzien, wurde gezeigt, daß das Ly-6.2C-Molekül nicht auf der Zelloberfläche mit Komponenten des TcR-Komplexes assoziiert war. Dies schloß biochemische Analysen, phänotypische und funktionelle Studien ein, die zeigen, daß im Unterschied zur Aktivierung über den TcR/CD3- Komplex Ly-6.2C-vermittelte Aktivierung nicht durch anti-CD8- mAbs inhibiert wurde (35). Nichtsdestoweniger bedarf es der Zelloberflächenexpression des TcR-Komplexes zum optimalen Auslösen von T-Zellen vermittels des Ly-6.2C-Moleküls.
mAbs wurden durch Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration gereinigt. F(ab')2- und Fab-Fragmente wurden hergestellt durch Pepsin- bzw. Papainspaltung von gereinigtem Antikörper (36).
Zusätzliche mAbs wurden hergestellt, die als immunpotenzierende Proteine in vivo verwendet werden können, um T-Zelluntergruppen und hämatopoietische Stammzellen zu aktivieren. Diese schließen ein: UC3-10A6- und UC7-13D5-mAbs, die spezifisch sind für den TcR-γ-δ-Rezeptor; UC3-7B7, der spezifisch ist für Thy-1; 145-4B11 und D7 (erhalten von Tom Malek, Miami, FL), die spezifisch sind für Ly-6A (auch bekannt als das Scal-Antigen, das auf Knochenmarkstammzellen exprimiert wird); und H597.57, ein anti-TcRαβ-mAb (Ralph Kubo, Denver, CO).
In dieser Erfindung offenbarte immunpotenzierende Proteine umfassen monoklonale Antikörper, die wie folgt hergestellt wurden:
a. expandiere Zellkulturen von Lymphozyten durch Standardverfahren (37); verwende limitierende Verdünnung oder Hybridomatechnologie, um T-Zellen zu klonieren oder produziere T-Zellhybridome (38) und sei dadurch in der Lage, diskrete Aktivierung von T-Zellen von einer einzelnen Vorläuferzelle (Klon) zu selektieren;
b. verwende Molekularsonden oder mAb, um Verwendung von Vβx zu bestimmen; dies wird alle Klone identifizieren, die Vβx exprimieren (obwohl diese Klone auch andere T-Zell-Antigene exprimieren werden, einschließlich einer Vα-Kette, CD3-Ketten und nicht-TcR-assoziierte Proteine);
c. verwende Klone oder Extrakte der Klone die Vßx exprimieren, um Tiere (Maus, Ratte oder Hamster) durch Standardtechniken (39) zu immunisieren;
d. verwende Milzen von den immunisierten Tieren, stelle Hybridome nach Standardtechnik her (40)
e. screene die Hybridome auf jene, die den beiden folgenden Kriterien gerecht werden:
1) Akivieren von T-Zellen (bestimmt durch Tests, die in Beispiel 13 beschrieben sind) (Beachte: von 1000-2000 gescreenten mAb wird eine Minderheit T-Zellen aktivieren)
2) stelle einen monoklonalen Antikörper her, der gegen den T-Zell-Klon gerichtet ist;
f. wähle monoklonale Antikörper aus, die nur spezifisch für Vßx sind, durch Eliminieren von mAb, die Klone aktivieren, die mit anderen Vβ- Proteinen exprimieren, auf der Basis des Reaktionsmusters von verschiedenen Vβ-exprimierenden Klonen und biochemischer Analyse von TcR- Verwendung.
g. bestätige, daß der Antikörper spezifisch ist für Vβx durch biochemisch Techniken, einschließlich Immunpräzipitation und Western Blot des TcR-Antigens oder Vβx und anderen T-Zellklonen.
Eine jegliche mikrobielle Komponente, z. B. ein bakterielles Enterotoxin, kann auf die Zellaktivierung getestet werden. Enterotoxine können von Biochemiefirmen gekauft werden. Toxine, die den Kriterien von Aktivierungstests genügen, können Standardproteinreinigungstechniken, Gelfiltration und Austauschchromatographie, unterworfen werden. (1) Bei jedem Reinigungsschritt wird das resultierende Produkt getestet, um zu bestimmen, ob die Fähigkeit erhalten bleibt, T-Zellen zu aktivieren. Bevorzugte Epitope können von den in Tabelle 3 gezeigten ausgewählt werden.

Beispiel 2: Aktivieren von T-Zellen durch Verabreichung von anti-CD3

Um zu prüfen, ob niedrige Dosen von anti-CD3 beim Aktivieren von T-Zellen in Mäusen wirksam waren, verabreichte man Mäusen verschiedene Dosen und ihre Lymphknoten und Milzzellen wurden auf IL-2R-Expression durch Flußzytometrie untersucht. IL-2R- Expression war verstärkt bei den drei getesteten Dosen (4, 40 und 400 ug) und erreicht ein Plateau bei 400 ug. (Fig. 2). Wenn dieselben lymphoiden Zellen in Medium inkubiert wurden, das menschliches rIL2 enthielt, war ihre Proliferation proportional zu ihrer IL-2R-Expression erhöht. Die Immunsuppression, die von einer Dosis von 400 Mikrogramm anti-CD3 resultierte, war das Ergebnis von T-Zellverarmung, T-Zell-Rezeptorblockade und Modulation des TcR-Komplexes. Das Nettoergebnis bestand darin, daß die Menge an Zelloberflächen-CD3, das verfügbar war, um mit Antigenen zu reagieren, verringert war, was die T- Zellen unfähig machte, auf Antigen-Reize zu antworten, da eine wirksame antigenspezifische Aktivierung von der Anwesenheit von intaktem TcR abhängt. Deshalb wurde die Menge an verfügbarem CD3 auf Lymphknotenzellen von Kontroll- und von behandelten Mäusen 18 Stunden nach Behandlung getestet. Die Zellen wurden mit Fluorescein-Isothiocyonat (FITC)-konjugiertem anti- CD3 und Thy-1+-T-Zellen gefärbt und untersucht. (Fig. 2). Optimale Bedingungen für anti-CD3-vermittelte T-Zellaktivierung sind jene, bei denen die Konzentration 4 ug betrug, niedrig genug, um Aktivierung zu erlauben, ohne CD3/TcR-Expression nachteilig zu beeinträchtigen. Ein zusätzlicher Beleg, daß die niedrig dosierte anti-CD3-Behandlung nicht nur T-Zellen nichtspezifisch aktivierte, sondern die Immunreaktionsbereitschaft erhöhte, wurde von Studien von Reaktionen von allogenischen gemischten Lymphozyten (MLR) und Tumorkulturen von gemischten Lymphozyten (MLTC) erhalten.

Beispiel 3: Wirkung von anti-CD3-Behandlung auf Sendai- Virus-Infektion bei Mäusen

Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von mAb- Behandlung auf Infektion zu testen. Verabreichung von niedrigen Dosen von anti-CD3 verhinderte die letale Pneumonie, die durch das Sendai-Virus bei > 60% der Mäuse verursacht wird. Mit anit-CD3 behandelte, viral-infizierte Mäuse entwickelten auch andauernde Virus-spezifische Immunität, wie belegt durch ihre Fähigkeit, einer nachfolgenden Dosis vom Sendai-Virus vom 1000-fachen der LD&sub5;&sub0;-Dosis zu widerstehen. Behandelte Mäuse entwickelten auch eine Sendai-Virus-spezifische DTH und Antikörperantwort ähnlich den Mäusen, die mit einem nichtvirulenten Sendai-Virus-Impfstoff immunisiert waren. Interessanter Weise wurde der 129/J-Mäusestamm auch durch die anti-CD3-Behandlung geschützt. Da man gezeigt hatte, daß Virusempfindlichkeit bei diesen Mäusen durch eine inadäquate Erzeugung von NK-Zellantworten hervorgerufen wird, scheint es so, als ob NK- Aktivität, die durch die mAb-Behandlung induziert wurde, zum viralen Schutz beiträgt. (51)

Beispiel 4: Anti-CD3 verhindert malignes Progressortumor wachstum in Mäusen

Das Ziel dieses Beispiels war, die Machbarkeit von Immuntherapie zu zeigen, die konzipiert ist, um ein Auswachsen von Tumor zu verhindern und Tumorimmunität zu induzieren durch Verabreichen von anti-CD3 in vivo, um T-Zellen zu aktivieren. Diese Möglichkeit wurde an Mäusen mit dem letztendlichen Ziel getestet, ähnliche Strategien beim Menschen zu verfolgen.
Die Wirkungen einer derartigen CD3-Behandlung auf malignes Tumorwachstum in vivo wurden an Mäusen getestet. Das C3H-Fibrosarcom 1591-Pro-4L, ein schwach immunogener Ultraviolettlicht-induzierter muriner Tumor, dem Zelloberflächen-CD3 und FcR fehlt, reagiert nicht direkt mit dem für die Behandlung verwendeten anti-CD3. Dieser maligne Tumor wächst progressiv in 95% der normalen CD3H-Mäusen und tötet letztendlich die Mäuse durch infiltratives Wachstum ohne makroskopischen Beleg für Metastasen. Keine der Mäuse, die mit 4 ug anti-CD3 behandelt wurden, entwickelte in diesem Experiment Tumoren. (Tabelle 7). Tiere, die mit 4 ug anti-CD3 behandelt waren, entwickelten ebenso Tumorimmunität, da sie 60 Tage später keine Tu moren nach einer zweiten Inokulation mit Pro-4L entwickelten, trotz keiner zusätzlicher intervenierender Therapie mit monoklonalem Antikörper, wohingegen Kontrolltiere, die zu der Zeit mit Tumorfragmenten gereizt wurden, Tumoren entwickelte. Behandlung mit F(ab')&sub2; ist immunsuppressiv, aktiviert aber T- Zellen nicht und hatte keine Wirkung auf Tumorwachstum.
Immunpotenzierenden Wirkungen schließen ein erhöhte Tumorspezifische T-Zellen, erhöhte Lymphokin-aktivierte Killerzellenaktivität, Erhöhungen des Tumornekrose-Faktors (TNF), der im Serum von behandelten, aber nicht von Kontrollmäusen nachgewiesen wurde. In Tabelle 7 berichtete Befunde wurden bestätigt unter Verwendung eines metastatischen Tumorsystems MCA102. Lungenmetastasen in Mäusen mit etablierten MCA102-Tumoren werden wesentlich reduziert durch mAb-Behandlung. In einem Experiment entwickelten Mäuse, denen Tumor alleine injiziiert war, ein Mittel von 105 ± 26 Lungenmetastasen, während Mäuse, die mit anti-CD3-mAb behandelt waren oder 10 Tage nach Tumorinokulation 25 ± 6 bzw. 44 ± 14 Lungenmetastasen entwickelten.

Tabelle 7: Zusammenfassung von Tumorinzidenz am Tag 28 in anti-CD3-behandelten Mäusen

Es gab kein Wiederauftreten, spätes Auswachsen oder Tumorregression nach 28 Tagen. Der P-Wert (X²-Verfahren) für die Differenz zwischen den Kontrolltieren und den mit 4 ug anti-CD3 behandelten betrug P < 0,001.
Behandelte Gruppe (drei getrennte Experimente)
Tumorinzidenz (Tag 28) Anzahl mit Tumor/- Gesamtanzahl (%)
Kontrolle 42/44 (95)
anti-CD3 (4 ug) 11/31 (35)
F(ab')&sub2; anti-CD3 (2,6 ug) 9/10 (90)
*P < 0,001

Beispiel 5: Die Verwendung von staphylococcalen Enterotoxinen (SE) als immunpotenzierende Agenzien

Die Ergebnisse der Studien mit SEB sind in Tabellen 8a und 8b unten dargestellt. Wie gezeigt in Tabelle 8a, führt in vivo- Verabreichung von SEB zu einer selektiven Aktivierung von Vβ8&spplus;-T-Zellen. Darüberhinaus zeigen die in Tabelle 8b gezeigten Studien, daß während zwei von sechs mit 4 ug anti-CD3 behandelte Mäuse Tumoren nach Tumorinokulation entwickelten, die Verabreichung von 50 ug SEB zu keinem Auftreten von Tumorentwicklung führte. Tabelle 8a. IL-2-Rezeptor-Expression auf T-Zellen von SEBbehandelten Mäusen Tabelle 8b. Tumor-Regression in anti-CD3- und SEB- behandelten Mäusen

Beispiel 6: Allo-Antwort und Anti-Tumorantwort auf SEB

Um die vorgeschlagene Verwendung von SEB zur Immunpotenzierung zu testen, wurden C3H-Mäuse entweder mit anti-CD3 (145-2C11) oder mit einer von drei Dosen von Staphylococcus-Enterotoxin (5 ug, 50 ug, 500 ug) behandelt. Es gab unbehandelte Kontrollen. Sowohl syngeneische als auch allogeneische Antworten wurden bestimmt durch ³H-Aufnahme von Lymphozyten. Wie in Fig. 7 gezeigt, fördert die Behandlung mit diesem einzelnen Agens eine allogene Antwort. Eine klare Dosiswirkung wurde auch beobachtet.
Die erstaunliche proliferative Antwort von Maus-Lymphozyten auf SEB alleine, verglichen mit anti-CD3, ist in den Fig. 7 bis 10 gezeigt, die darauf hinweisen, daß diese Enterotoxine für die Immuntherapie hilfreich sind. Tatsächlich zeigten SEB- behandelte Mäuse eine signifikant geringere Tumorinzidenz (Tabelle 8b).
Es wurde ein Unterschied gefunden zwischen Antworten des Immunsystems auf ein einzelnes Agens in der Ausführungsform von anti-CD3 gegenüber SEB. Anti-CD3 schien eine allgemeinere Antwort zu induzieren, wohingegen SEB darauf gerichtet werden konnte, spezifische T-Zelluntergruppen zu aktivieren.

Beispiel 7: Antwort von menschlichen Lymphozyten auf OKT3 in vivo

Die anti-CD3-Antworten in Tiermodellen bestätigend, stellen die Fig. 5A und B, 11, 12 die Antwort von menschlichen Zellen auf niedrige Dosen von OKT3 dar. Verschiedene Lymphozyten- Untergruppen zeigen ein ähnliches Antwortmuster, aber verschiedene absolute Prozentzahlen an Gesamtlymphozyten. Diese Ergebnisse stammen aus laufenden klinischen Versuchen von OKT3 beim Behandeln von Patienten mit Krebs. Die Verfahren für diesen Versuch sind in Beispiel 12 beschrieben.

Beispiel 8: Anti-CD3-Behandlung hebt Graft-Versus-Host- Erkrankung (GVHD) auf

Die Verwendung von anti-CD3 wird vom klinischen Zustand ab hängigen. Abhängig davon, werden Dosierungen ausgewählt. Mäuse wurden mit Bestrahlungen von 500 R behandelt, um ihr Immunsystem zu unterdrücken und dadurch Transplantation zu erleichtern. Nach 13 Tagen wurde jedoch das Transplantat in den Kontrolltieren abgestoßen. Eine dramatisch erhöhte Überlebensrate von 75% wurde zum selben Zeitpunkt für Tiere beobachtet, die mit 250 gg anti-CD3 behandelt wurden und eine 30% Überlebensrate nach 25 ug anti-CD3. (Fig. 13). Man glaubt, daß diese Wirkung auf induzierter Hämatopoese beruht, die das Transplantat revitalisiert.

Beispiel 9: Verwendung eines Haptens oder Peptids als eine gleichzeitig verabreichte Kombination

Fluorescein-Isothiocyanat (Sigma) oder Dinitrophenol (DNP) in Boratpuffer, pH 8,5 für 4 Stunden bei 22ºC, sind Beispiele von zu diesem Zweck getesteten Haptenen.
Beispiele anderer sekundärer Proteine sind synthetisch Peptide von HIV, 13-23 Reste lang, hergestellt durch das Multi-Simultan-Peptidverfahren der Festphasensynthese in Polypropylennetz. vSC-8 (rekombinanter Vaccinia-Vektor, der bakterielles LACz-Gen enthält), und vSC-25 (rekombinanter Vaccinia-Vektor, der das HIV-env-Glycoprotein gp160 des HTLV IIIb-Isolats von HIV-Struktur- oder Regulationsproteinen exprimiert) werden verwendet. Mäuse wurden herkömmlich mit 100 ug HIV/pep-KLH oder HIV/pep in vollständigem Freundschen Adjuvans (Difco Laboratories) intraperitoneal 1-12 Monate vor Verwendung entweder gleichzeitig oder nach Injektion von 4 ug anti-CD3-mAb immunisiert.
Obwohl die gleichzeitige Behandlung von Mäusen mit anti-CD3- mAb die spezifische Antikörperproduktion für das FITC-Hapten erhöhte, trat der am stärksten ausgeprägte Effekt auf, wenn das anti-CD3 direkt an FITC gekoppelt war (Fig. 16). Diese Studien lieferten Einsichten in die Fähigkeit von anti-CD3, T- Zell- und B-Zell-Immunität zu erhöhen. Sie lieferten auch die Grundlage für eine Analyse der Fähigkeit von anti-CD3/Hapten- Heterokonjugaten, Immunität durch direkte T-Zell/B-Zell-Wechselwirkungen zu induzieren, die MHC-Restriktion und IR-Genkontrolle ändern kann. Diese Studien werden am besten ausgeführt unter Verwendung von in vitro-Plaque-bildenden Zell (PFC)-Antworten oder ELISA, um die Immunogenetiken der Antikörperproduktion zu untersuchen. Z. B. haben unter Verwendung klassischer MHC-Restriktionsanalysen, um die Rolle von MHC/Peptid- Wechselwirkungen in anti-CD3 erhöhter Immunität, Studien gezeigt, daß bestimmte Mäuse auf OVA schwach antworten, abhängig von ihrem MHC-Haplotyp. Die geringe Antwort beruhte auf der Unfähigkeit von Träger-spezifischen T-Zellen, OVA-Peptide im Kontext mit eigenem MHC zu erkennen.

Beispiel 10: Bispezifische Liganden

Studien sind auch durchgeführt worden, worin die immunpotenzierende Wirkung der Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern, die miteinander verbunden waren, um ein einzelnes Molekül zu bilden. Die in diesen Studien verwendeten Antikörper waren gegen zwei distinkte, aber verschiedene Epitope, CD3 und CD4, gerichtet. Diese Epitope wurden ausgewählt, da der anti- CD3 T-Zellen aktiviert, wohingegen der anti-CD4 die Aktivierung auf eine spezifische Untergruppe fokussiert. Dieses Konjugat wurde durch Quervernetzen der entsprechenden Antikörper unter Verwenden von SPD, wie in Beispiel 15B hierin unten beschrieben, konstruiert.
In den Studien, die die Basis für das vorliegende Beispiel bilden, wurden 4 /19 des resultierenden Konjugates, bezeichnet als F(ab')&sub2;-anti-CD3 · anti-CD4, Mäusen i. p. am Tag 0 verabreicht, und die resultierenden % von IL-2-Rezeptor&spplus;-Zellen durch Flußzytometrie an Milzzellen 18 Stunden nach Injektion bestimmt. Der Prozentsatz an IL-2-Rezeptor&spplus;-Zellen ist ein Indikator für die T-Zellaktivierung. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Fig. 15 gezeigt.
Wie ersichtlich, zeigen die in Fig. 15 angegebenen Ergebnisse, daß dieses bispezifische Antikörperkonstrukt selektiv CD4&spplus;-Zellen aktiviert. Somit ist das bispezifische Antikörperkonjugat hinsichtlich Immunpotenzierung sehr hoch aktiv.

Beispiel 11: Tumore

Die UV-induzierten Hauttumorlinien 1591-Pro-4-L, 6139-Pro-1, 1316-Pro-1 und 1591-Var4L wurden wie beschrieben hergestellt (50). Tumorzellen wurden durch serielle Kultur in vollständigem Medium passagiert. Für in vivo-Studien wurden Tumorzellen in C3H-Nacktmäuse injiziert. 3 Wochen später isolierte solide Tumoren wurden in 2 mm Fragmente geschnitten und 10 dieser Fragmente wurden in eine einzelne subkutane Lokation unter Verwendung einer 14 Gauge, 2 inch langen Trokarnadel injiziert. Tumoranwesenheit und -größe wurden nach einem Monat in Mäusen bestimmt. YAC-1-T-Lymphomzellen und P815-Mastocytomzellen wurden als Ziele in einigen Tests in vitro verwendet.
Spezifische Antigene können von Tumorzellen isoliert werden, die durch serologische Techniken oder Suspensionsverdünnungen isoliert wurden. Diese Antigene wurden gereinigt durch Standardverfahren, z. B., Dichtegradientenzentrifugation oder Ge schwindigkeitsimmunsedimentation. Die Identität des Antigens wurde mittels Serologie oder durch histologische Untersuchung bestätigt. Zellen wurden lysiert und in den in Beispiel 3 beschriebenen Tests verwendet, um einzigartige Tumorantigene zu identifizieren. Proteinextrakte werden durch Standardverfahren hergestellt, einschließlich Molekülgrößen- und Austauschionenchromatographie. Eine weitere molekulare und biochemische Analyse auf T-spezifische Antigene kann durch etablierte Klonierungstechniken vorgenommen werden.

Beispiel 12: Tiere

Männliche C57BL/10-Mäuse mit einem Alter von 8 bis 12 Wochen wurden erhalten von The Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME. Eine thymische BALB/c-Maus und NIH-Schweiz-Maus wurden erhalten von der Kleintierzuchtstation des National Institut of Health.

Beispiel 13: Verabreichung des immunpotenzierenden Antikörpers an Patienten

In vivo-Antwort auf OKT3 ist in Fig. 5 A und B, 11, 12 gezeigt. Für Behandlung ausgewählte Patienten waren jene, die histologisch dokumentierte Malignität aufwiesen, die entweder evaluierbar oder meßbar ist und für die eine Standardtherapie nicht verfügbar ist. Diese Patienten sollten keine vorherige Verabreichung von murinen Antikörpern oder Anamnese dokumentierter oder vermuteter lebensbedrohender immunvermittelter Erkrankungen, wie beispielsweise Asthma, aufweisen. Es sollte keine gleichzeitige Wirkstofftherapie oder Infektion geben. Patienten sollten nicht schwanger sein oder weder Klasse III noch Klasse IV Herzerkrankungen aufweisen. (Klassifikation der New York Heart Association) Der in einer bevorzugten Ausführungsform zu verabreichende monoklonale Antikörper war Muromonab-CD3 (OKT3), ein muriner monoklonaler Antikörper, der gegen das T3 (CD3)-Antigen von menschlichen T-Zellen gerichtet ist. Dieser Antikörper reagiert mit einem 20.000 Dalton-Molekül (CD3) in der Membran menschlicher T-Zellen, das in vitro mit der Antigen-Erkennungsstruktur von T-Zellen assoziiert ist und das für die Signaltransduktion essentiell ist. In den zytolytischen in vitro-Tests verstärkten geringe Dosen an OKT3 sowohl die Erzeugung als auch die Funktion von Effektorzellen. In vivo reagiert anti-CD3 mit den meisten peripheren Blut-T- Zellen und T-Zellen in Körpergeweben, aber man hat nicht gefunden, daß er mit anderen hämatopoietischen Elementen oder anderen Körpergeweben reagiert. Er ist in vivo ein potentes Mitogen.
Der Wirkstoff wurde durch eine Nadel in die contralaterale Vene durch intravenöse Infusion verabreicht. Monomurab-CD3 wurde über 30 bis 60 Sekunden unter Verwendung einer 20 cc- Spritze, die OKT3-Dosis in 5% menschlichem Serumalbumin enthielt, gedrückt. Die Lebenszeichen des Patienten wurden für die ersten 15 Minuten alle 5 Minuten aufgezeichnet, dann nach 2 Stunden und 4 Stunden bis 24 Stunden nach der Infusion. Patienten erhielten 3 Behandlungen in Zweiwochenintervallen, sofern nicht durch Toxizität ausgeschlossen. Toxische Antwort wird definiert durch publizierte Kriterien.
Sterile Orthoclone OKT3 (Muromonab-CD3)-Lösung ist ein muriner monoklonaler Antikörper gegen das T3 (CD3)-Antigen von menschlichen T-Zellen, der als ein immunsupprimierendes Mittel wirkt. Der Antikörper ist ein biochemisch gereinigtes IgG2- Immunglobulin mit einer schweren Kette von etwa 50.000 Dalton und einer leichten Kette von etwa 25.000 Dalton. Er ist gerichtet gegen ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 20.000 in der menschlichen T-Zelloberfläche, das für T-Zellfunktion essentiell ist. Da es ein Präparat eines monoklonalen Antikörpers ist, ist sterile Orthoclone-OKT3-Lösung ein homogenes reproduzierbares Antikörperprodukt mit konsistenter meßbarer Reaktivität gegen menschliche T-Zellen. Jede 5 ml-Ampulle sterile Orthoclone-OKT3-Lösung enthält 5 ml (1 mg/ml) Muromonab-CD3 in einer klaren, farblosen Lösung, die einige wenige feine durchsichtige Proteinpartikel enthalten kann. Jede Ampulle enthält eine Pufferlösung (pH 7,0 ± 0,5) aus monobasischem Natriumphosphat (2,5 ml), Natriumsulfat (9,0 mg), Natriumchlorid (43 mg) und Polysorbat 80 (1,0 mg) in Wasser zur Injektion. Der Eigenname Monomurab CD3 ist abgeleitet von dem beschreibenden "muriner monoclonaler Antikörper". Die CD3-Bezeichnung identifiziert die Spezifität des Antikörpers als der Zelldifferenzierungs(CD)-Cluster 3, der durch den International Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens definiert ist.
Orthoclone OKT3 wird als sterile Lösung zur Verfügung gestellt und abgepackt in 5 ml-Ampullen, die 5 ml Muromonab-CD3 enthalten. Diese Glasfläschchen werden gelagert, gekühlt bei 2-8ºC. Vor Verabreichung kann die Orthoclone OKT3-Lösung einige wenige durchscheinende Partikel entwickeln. Man hat von diesen gezeigt, daß sie ihre Wirksamkeit nicht beeinträchtigen. Das Produkt wird für die Injektion hergestellt durch Aufziehen der Lösung aus dem Glasfläschchen in eine Spritze durch einen 0,2 Mikrometer-Filter, der Protein nur gering bindet. Der Fiter wird verworfen und die beigefügte Nadel für IV-Bolus-Injektion verwendet. Orthoclone OKT3 wird als ein IV-Bolus abgegeben in weniger als einer Minute. Dieser Wirkstoff sollte nicht als eine intravenöse Infusion oder in Verbindung mit anderen pharmazeutischen Wirkstofflösungen verabreicht werden. Wenn erforderlich, kann Orthoclone OKT3 mit steriler Saline verdünnt werden.
Für die Herstellung von OKT3 zur Injektion wurde der Antikörper in eine Spritze, wie oben beschrieben, aufgezogen. Die geeignete Dosis an OKT3 wurde dann zu 15 bis 20 cc 5% menschliches Serumalbumin in normaler Saline gegeben und in eine 20cc Spritze gegeben. Toxizität wurde aufgezeichnet und kann Fieber und Schüttelfrost, Kurzatmigkeit, allergische Reaktion, Brustschmerzen, Übergeben, Keuchen, Übelkeit, Diarrhoe oder Tremor umfassen.
Messen der Wirkung von CD3 wurde vorgenommen, wie in Tabelle 9 gezeigt.

Tabelle 9: Messen der Wirkung von CD3-Behandlung auf das Immunsytem

I. Phänotyp peripherer Leukocyt

Gesamtlymphozytenzahl.
Gesamt-T-Zellzahl.
Gesamte Th- und Ts-Zahlen. Helfer/Suppressor Gesamte NK-Zell-Zahl.
CD3- und CD25-Expression.

II. Lymphokin-Produktion

Interleukin-2 (IL-2)-Titer
Löslicher IL-2-Rezeptor - eine Widerspiegelung von T-Zehlaktivierung.
G-CSF- und GM-CSF-Titer.
TNF-Titer.

III. Zelluläre Cytotoxizität.

NK-Zell-Cytotoxizität auf K562-Zellinie bei 0 und 24 Stunden.
LAK-Zell-Cytotoxizität auf Raji-Zellinie bei 0 und 24 Stunden.
Prä-LAK-Zelle (LAK-Zell-Cytotoxizität nach 3-tägiger Kultur in IL-2)

IV. Zelluläre proliferative Antworten.

Anti-CD3-induzierte Proliferation.
IL-2-induzierte Proliferation.
Unidirektionale MLC gegen vereinigte Mitomycin C-behandelte Lymphocyten.
PHA- und Con A-induzierte Proliferation.
LAK = Lymphokin-aktivierte Killerzellen

Tests

Beispiel 14: Test für T-Zell-Aktivierung

Effektorzellen und &sup5;¹Cr-markierte Zielzellen wurden dreifach zu Näpfen von 96-Napf-Gewebekultur-Seroclustern (Costar, Cambridge, MA) bei verschiedenen Verhältnissen von Effektor zu Ziel in einem Gesamtvolumen von 200 ul vollständiges Medium gegeben. Der monoklonale anti-TcR-Antikörper, 2.4G2 (47), wurde zu den Näpfen in einer Konzentration von 10% cs hinzugegeben, wo angegeben. Platten wurden dann für 4 oder 6 Stunden bei 37ºC inkubiert, danach 100 ul Überstand abgesaugt und in einem Gamma-Zähler analysiert (Micromedic Systems, Inc., Horsham, PA). Prozent spezifische Lyse wurde berechnet unter Verwendung der Formel [Ecpm-Scpm/Tcpm Scpm] · 100. Ecpm stellt das &sup5;¹Cr dar, das aus den Zielzellen, die mit Effektorzellen inkubiert wurden, freigesetzt wurde; TcPm stellt die Freisetzung von Radiomarkierung von Zielzellen in einer 0,05 N-Lösung von HCL dar; Scpm stellt die Hintergrundfreisetzung von Zielzellen dar, die in Medien in Abwesenheit von Effektorzellen kultiviert werden. Allgemein sollten die Daten zumindest 3 Experimente mit identischen Ergebnissen darstellen. Der Standardfehler für alle &sup5;¹Cr-Freisetzungswerte sollte weniger als 5% sein.
Virus-spezifische CTL-Populationen wurden in vitro erzeugt unter Verwendung von 5 · 10&sup6; antwortenden Milzzellen, die mit 2,5 · 10&sup6; bestrahlten (3300 Rad) Vaccinia-Virus-infizierten syngeneischen Milzzellen (1 Std., 37ºC, Vielfachheit der Injektion, 10 : 1) in 2 ml Kulturen in vollständigem Medium (RPMI 1640, supplementiert mit 10% ausgewähltem fötalem Kälberserum (FCS), Natriumpyruvat, nicht-essentiellen Aminosäuren, Glutamin und 2-Mercaptoethanol) gemischt wurden. Cytolytische Aktivität wird nach 6 Tagen an geeigneten Virus-infizierten Zielen oder Peptid-gepulsten syngeneischen oder allogeneischen &sup5;¹Cr-markierten Zielen getestet.
T-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium kultiviert, das 10% FCS und 2-Mercaptoethanol enthielt, in Gegenwart oder Abwesenheit von mAbs und/oder Faktoren in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen und flachem Boden. In einigen Experimenten wurden gereinigte anti-CD3-mAb auf Platten immobilisiert als ein Mittel zum Aktivieren von Zellen bei der Abwesenheit von Fc-Rezeptor&spplus;-Zellen. Nach drei Tagen wurden die Zellen mit 1 uCi [³H]-Thymidin für 16 Stunden gepulst, die Proben geerntet und der Einbau von radioaktivem Isotop unter Verwendung eines Scintillationszählers gemessen. Die Sekretion von löslichen Lymphokinen wurde überprüft durch die Fähigkeit von Kulturüberständen von aktivierten T-Zellen, Wachstum der Lymphokin-abhängigen HT-2-Zellinie zu unterstützen. 5 · 10³ HT-2-Zellen wurden für 24 bis 36 Stunden mit dem zu testenden Überstand kultiviert, dann für 16 Stunden mit 1 uCi [³H]-Thymidin gepulst.
Dieses Protokoll ist anpaßbar hinsichtlich Zeit und Zellzahlen, wenn statt in Tieren in Menschen getestet wird.
Antikörper-Antworten wurden in vitro durch zwei Verfahren getestet: (1) Antworten von Plaque-bildenden Zellen (PFC) wurden gemessen am Tag der Kultur durch Testen von TNP, HIV-Peptid von FITC-konjugierten Schaferythrocyten, wie beschrieben (48). Indirekte IgG-Antworten wurden bewertet durch Blockieren der IgM-Plaques mit Ziegen-anti-Maus-IgM und Entwickeln mit einem Kaninchen-anti-Maus IgG. (2) Direkt bindende Enzym-gekoppelte Immunoadsorbens-Tests (ELISA) von FITC, TNP oder Peptid-bindenden Antikörpern wurden wie folgt durchgeführt. Nung-ELISA- Platten wurden über Nacht mit 100 ul 50 ug/ml FITC-BSA, TNP- BSA oder HIV-Peptid-BSA in Voller's Puffer (4ºC) beschichtet. Die Platten wurden extensiv mit 0,05% Tween 20, verdünnt in PBS, gewaschen. Freie Stelle wurden blockiert durch Inkubieren der Platten mit 0,5% BSA für 1 Std. bei Raumtemperatur. 100 ul Kontroll- oder Immunseren, verdünnt in PBS-Tween, wurden zu jedem Napfin dreifacher serieller Verdünnung hinzugegeben und für 1 Std. inkubiert. Nach Waschen wurden 100 ul von 1 ug/Napf Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG zugegeben. Nach 1 Std. wurden die Platten gewaschen und 100 ul Peroxidase-Substratsystem hinzugesetzt. Diese Reaktion wurde bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten entwickelt, gestoppt mit 100 ul 1% SDS und bei 415 nm mit einem automatischen ELISA-Plattenlesegerät abgelesen. ELISA-Tests wurden durch Titrieren von Seren bestimmt und die berichteten Werte der optischen Dichte (O. D.) werden aus einem linearen Abschnitt der Titrationskurven erhalten werden, wo O. D. proportional der Serumkonzentration ist. Wo geeignet, wird Affinitäts-gereinigtes Maus-anti-FITC, anti-DNP oder HIV-Antikörper hergestellt werden und experimentelle Antworten wurden als ug/ml Antikörper auf der Grundlage dieses Standards bestimmt.
E. Spezifische Ausführung von Tests für mit OKT3 behandelte Menschen

I. Kontrollprotokoll

1. Stelle zumindest sechs Replikate für Kontrollzellen her.
2. Platiere 100.000 Zellen/Napfin einem Gesamtvolumen von 200 ul aus.
3. Inkubiere bei 37ºC und 5% Kohlendioxid für dieselbe Zeit, wie stimulierte Zellen.
4. Füge 20 ul MTT (5 mG/mL in PBS) zu.
5. Inkubiere für 5 Stunden bei 37ºC und 5% Kohlendioxid.
6. Zentrifigure für 5 Minuten bei 600 · g.
7. Sauge vorsichtig 160u1 Überstand ab.
8. Füge 160 ul DMSO zu jedem Napf hinzu.
9. Schüttle die Platte für 30 Minuten, bis sich alle Kristalle vollständig auflösen.
10. Lese unmittelbar im Multiskan bei 550 nm ab.

II Protokoll für Patientenproben

1. Mache wenigstens sechs Replikate pro Stimulans.
2. Plattiere 100.000 Zellen/Napfin einem Gesamtvolumen von 180 ul aus.
3. Füge ein Volumen von 20 ul dem Napf zu.
4. Inkubiere bei 37ºC und 5% Kohlendioxid.
5. Füge 20 ul MTT hinzu (5 mg/mL in PBS).
6. Inkubiere 5 Stunden bei 37ºC und 5% Kohlendioxid.
7. Zentrifugiere bei 600 · g für 5 Minuten.
8. Sauge vorsichtig 160 ul Überstand ab.
9. Füge 160 ul DMSO zu jedem Napfzu.
10. Schüttle die Platte für 30 Minuten oder bis sich alle Kristalle vollständig lösen.
11. Lese unmittelbar im Multiskan bei 550 nm ab.
Vorbehandlung und 24 Stunden-Zeitpunkte:
Gebe die Zellen pro Proliferationstest in Kultur und Dreifachplatten mit LPS (U-Platten).
Entferne 150 ul Zellsuspension nach 18-24 Stunden und friere die Suspension und die Pellets bei 70º ein.
Teste Pellets auf Gewebefaktor.
Teste Suspension auf TNF-α und IL-1β.

Beispiel 15: Biochemische Analyse

Zelloberflächenmarkierung mit 1251 (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) wurde vorgenommen durch das Lactoperoxidase-Ver fahren, wie kürzlich beschrieben (52). Markierte Zellen wurden in 1% Digitonin-Puffer lysiert und vorgeklärt mit hyperimmunem Kaninchenserum. Lysate wurden immunpräzipitiert mit anti-CD3 (145-2C11) und Protein A-Agarose-Kügelchen. Immunpräzipitate wurden von der Protein A-Agarose in nicht-reduzierenden Probenpuffer (enthaltend 2% SDS) eluiert und wurden entweder direkt einer Elektrophorese unterzogen oder erneut vor Elektrophorese immumpräzipitiert mit spezifischem anti-TcR-Serum. Die Erzeugung von anti-TcR-Serum ist kürzlich beschrieben worden (53). Analysen wurde vorgenommen auf zweidimensionalen/von der Diagonalen abgängigen (2-D)-Gelen (54). Lysate wurden zuerst einer Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen in 10% Polyacrylamid SDS-PAGE-Röhrchengelen unterworfen und dann unter reduzierenden Bedinungen (5% 2-ME) elektrophoretisiert auf 10% Polyacrylamid SDS-PAGE-Plattengelen. Proteine wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Bestimmung der Molekülmasse wurde vorgenommen durch Vergleich mit vorgefärbten hochmolekularen Massenstandardmarkern.

Beispiel 17: Zelltrennung und Gewebekulturtechniken

Allgemeine Techniken zum Reinigen von T-Zellen durch Zellsortierung oder Antikörper und Komplementbehandlung, wie sie routinemäßig durch veröffentlichte und den Fachleuten gut bekannte Labormethoden (49) durchgeführt werden.

Beispiel 19: Synthetische Peptide

Synthetische Peptide entsprechend den ausgewählten Stellen werden hergestellt unter Verwendung von Standardverfahren der Festphasenpeptidsynthese auf einem Vega 250-Peptid Syntheseapparat unter Verwendung doppelter Dicyclohexylcarbodimid-ver mittelter Kopplungen (57, 58) und Butyloxycarbonyi (Boc)-geschützten Aminosäurederivaten. Hydroxybenzotriazol-Präaktivierungskopplungen werden vorgenommen, wenn Glutamin oder Asparagin gekoppelt wird. Der Umfang des Koppelns wird überwacht unter Verwendung des qualitativen Ninhydrin-Tests und erneutes Koppeln wird vorgenommen, wenn eine Kopplung von < 99, 4% beobachtet wird. Peptide werden vom Harz abgespalten unter Verwendung des Niedrig/Hoch-Fluorwasserstoff (HF)-Verfahrens (59). Für Peptid env T2 wird standardmäßige HF-Spaltung verwendet, da man gefunden hat, daß die Entfernung der Tryptophan-Formyl-Schutzgruppe für Antigen-Aktivität nicht erforderlich scheint. Peptide werden zur Homogenität durch Gelfiltration und Umkehrphasen-HPLC gereinigt (60). Die Zusammensetzung wurde bestätigt und Konzentrationen bestimmt durch Aminosäureanalyse (61).

Beispiel 20: Gereinigte und rekombinante Proteine

Als ein Beispiel für ein für HTV-relevantes Protein wird natives gp120 aus Virus-infizierten Zellen gereinigt, wie beschrieben (62). Die rekombinanten Proteine R10 und PB1 werden durch Klonieren von Restriktionsfragmenten Kpn I (Nukleotid 5923) bis Bgl II (Nukleotid 7197) oder Pvu II (Nukleotid 6659) bis Bgl II (Nukleotid 7197) aus dem BH10-Klon von menschlichem T-Zell-lymphotrophen Virus (HTLV-IIIg) vom Typ III in den Repugen-Expressions-Vektor hergestellt, gefolgt von Expression in Escherichia coli und Reinigung, wie beschrieben (63). R10 ist anfangs solubilisiert in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 10 mM 2-Mercaptoethanol bei 0,22-0,66 mg/mi. B1 ist solubilisiert in 8 M Harnstoff bei 1,9 mg/ml. Protein R10 stellt Reste 49-474 des HTLV-IIIg-Hüllproteins dar mit 25 nicht vom HTLV-III-Vektor stammenden Resten am N-Terminus und 440 derartigen Reste am C-Terminus. Protein PB1 stellt Reste 294-474 von gp120 dar mit 30 bzw. 24 nicht-HTLV-III-Resten am N- bzw. C-Terminus.
Die N-terminalen Reste von PB1 werden teilweise geteilt mit jenen von R10, wohingegen die C-terminalen Resten ohne Beziehung sind.
Andere erwünschte Proteine können durch Verfahren hergestellt werden, die den Fachleuten wohlbekannt sind.

Beispiel 21: Modelle, um die Verwendung von anti-CD3 als ein immunpotenzierendes Agens bei anti-viraler oder anti-Tumor-Immunität zu testen.

Ein präklinisches huSCID-Modell für eine anti-human-CD3 erhöhte virale und Tumorimmunität kann entwickelt werden als ein Modell für das menschliche Gegenstück, OKT3, um Immunität in ähnlicher Weise zu aktivieren. Erste Studien legten nahe, daß mit OKT3 behandelte Patienten kurz nach Antikörper-Injektion aktivierte T-Zellen entwickelten. Zusätzlich wurde, in anderen Studien, gezeigt, daß Serum von anderen Patienten kurz nach OKT3-Injektion verschiedene Lymphokine und Cytokine enthielt, einschließlich TNF, γ-Interferon, IL-2 und GM-CSF. Somit, ähnlich anti-murinem CD3, aktiviert OKT3 T-Zellen in vivo. Um jedoch zu bestimmen, ob in vivo-Aktivierung von menschlichen T-Zellen zur Immunpotenzierung führen kann, kann ein Modell entwickelt werden, um den OKT3-Antikörper zu untersuchen. SCID-Mäuse, die mit menschlichen T- und B-Zellen bevölkert sind, können verwendet werden, um zu untersuchen, ob OKT3 anti-Tumor-Immunantworten potentieren wird. Ansätze:
a: Entwicklung des huSCID-Modells. Schwere kombinierte Immundefizienz (SCID)-Mäuse sind von Bosma, et al. [49] entwickelt worden. Diese Mäuse enthalten einen genetischen Defekt in einem Rekombinase-Gen, der die Expression reifer T-Zellen und B-Zellen verhindert. Die resultierende Immundefizienz erlaubt das Überleben menschlicher Zellen in diesen Mäusen. Ein Modell zum Studieren der Funktion menschlicher T- und B-Zellen in rekonstituierten SCID-Mäusen (huSCID) ist von Mosier et al. [50] entwickelt worden. In diesem Modell werden 10&sup7; menschliche periphere Blutzellen intraperitoneal in SCID-Mäuse injiziert. 4-6 Wochen nach Injektion werden die Lymphgewebe und die Peritonealhöhle auf Anwesenheit von menschlichen T-Zellen und B-Zellen untersucht. Man hat in diesem Modell gezeigt, daß mit menschlichen Zellen wieder bevölkerte Mäuse Antikörper gegen Diphterie-Toxin herstellen. Vorläufige Studien haben gezeigt, daß SCID-Mäuse rekonstituiert werden können mit menschlichen T- und B-Zellen des peripheren Blutes, wie überprüft in der Peritonealhöhle 3-6 Wochen nach Injektion. Zusätzlich können SCID-Mäuse, die mit HLA-präsensibilisierten PBL rekonstituiert wurden, Allotransplantate menschlicher Haut abstoßen.
b: Behandlung von huSCID-Mäusen mit OKT3 und Tumoren. Nachdem das huSCID-Modell entwickelt worden war, wurden abgestufte Dosen von OKT3 in transplantierte Tiere injiziert. Flußzytometrieanalyse wurde verwendet, um den Umfang von T-Zell-Rezeptormodulation, -verarmung und -aktivierung, wie bewertet durch IL-2-Rezeptor-Expression, zu bestimmen. Das Serum von behandelten Tieren wurde auch auf Anwesenheit von Lymphokinen und Cytokinen untersucht.

Literaturstellen

Die unten angeführten Literaturstellen ergänzen, erklären und liefern einen Hintergrund für oder lehren Methodiken, Techniken und/oder Zusammensetzungen, wie hierin verwendet.
Referenz 1. Klein, J. Immunology: The Science of Self- Nonself Discrimination, Wiley & Sons, N. Y. (1982).
Referenz 2. Leo, O, Foo, M, Sachs, DH, et al. PNAS(USA) 84: 1374 (1987).
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Claims

1. Eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Immunpotentiation eines Menschen umfassend einen unkonjugierten monoklonalen Antikörper, der gegen ein T-Zellaktivierungsmolekül oder Epitop auf der Zelloberfläche einer menschlichen T-Zelle gerichtet ist, wobei der Antikörper nicht gegen NDA5 oder CD28 gerichtet ist.

2. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der monoklonale Antikörper gegen ein T-Zellaktivierungsmolekül gerichtet ist, das mit dem T-Zellrezeptorkomplex assoziiert ist.

3. Die Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der monoklonale Antikörper gegen ein Epitop der variablen oder konstanten Region eines T-Zellaktivierungsmoleküls gerichtet ist, das auf einer polymorphen TcR α-, β-, γ- oder δ-Kette von antigenspezifischen T-Zellrezeptor exprimiert ist.

4. Die Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der monoklonale Antikörper auf CD3 gerichtet ist.

5. Die Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der monoklonale Antikörper OKT3 umfaßt (ATCC CRL-8001).

6. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der monoklonale Antikörper auf ein T-Zelloberflächenantigen gerichtet ist, das verschieden vom und nicht physisch auf der Zelloberfläche mit dem TcR assoziiert ist.

7. Die Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der monoklonale Antikörper gerichtet ist gegen Thy-1.

8. Die Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der monoklonale Antikörper auf ein Aktivierungsepitop gerichtet ist, das auf einem Mitglied der Ly-6-Proteinfamilie exprimiert ist.

9. Die Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der monoklonale Antikörper gegen menschliches CD2 gerichtet ist.

10. Die Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der monoklonale Antikörper ein bispezifischer Antikörper ist, wobei der eine Arm spezifisch ist für ein T- Zellaktivierungsepitop und der andere Arm spezifisch ist ein Epitop, das spezifische ist für eine Untergruppe von T-Zellen.

11. Die Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei der monoklonale Antikörper eine Vereinigung monoklonaler Antikörper umfaßt, die individuell gegen CD3 und CD4 gerichtet sind.

12. Eine immunpotenzierende Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung beim Hervorrufen oder Verstärken einer zellulären oder humoralen Immunantwort in einem menschlichen Wesen, wobei die Zusammensetzung dem menschlichen Wesen in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um eine zelluläre oder humorale Immunantwort hervorzurufen oder zu verstärken.

13. Eine immunpotenzierende Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die weiter eine zweite ausgewählte Verbindung umfaßt, zur Verwendung beim Hervorrufen oder Verstärken einer zellulären oder humoralen Immunantwort in einem menschlichen Wesen gegen ein Epitop, das in der ausgewählten Verbindung enthalten ist, wobei die Zusammensetzung dem menschlichen Wesen in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um eine zelluläre oder humorale Immunantwort gegen das Epitop hervorzurufen oder zu verstärken.

14. Die Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die ausgewählte Verbindung ein Protein oder Peptid umfaßt.

15. Die Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die ausgewählte Verbindung ein Protein oder Peptid umfaßt, das eine Aminosäuresequenz einschließt, gegen die die Immunantwort erwünscht ist.

16. Die Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Protein oder Peptid von etwa 8 bis etwa 100 Aminosäuren lang ist.

17. Die Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Protein oder Peptid von etwa 8 bis etwa 50 Aminosäuren lang ist.

18. Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die ausgewählte Verbindung ein Protein oder Peptid umfaßt, das von einem tumorspezifischen oder tumorassoziierten Epitop abgeleitet ist.

19. Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die ausgewählte Verbindung ein Protein oder Peptid umfaßt, das von einem virusspezifischen oder virusassoziierten Epitop abgeleitet ist.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das virenspezifische oder virenassoziierte Epitop eine Aminosäuresequenz umfaßt, die auf der Oberfläche eines HIV-Virus gefunden wird oder die für HIV-infizierte Zellen spezifisch ist.

21. Die Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das virusspezifische oder virusassoziierte Epitop ein Epitop von dem gp120-Hüllprotein von HIV-1 umfaßt.

22. Die Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das gp120 Hüllprotein Peptide 18, T1 oder T2 umfaßt.

23. Die Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das virusspezifische oder virusassoziierte Epitop eine Aminosäuresequenz umfaßt, die homolog ist zu den auf der Oberfläche von menschlichem Hepatitisvirus exprimierten.

24. Die Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das virusspezifische oder virusassoziierte Epitop eine Aminosäuresequenz umfaßt, die homolog ist zu den auf der Oberfläche von Viren, die Influenza verursachen, exprimierten.

25. Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die ausgewählte Verbindung ein Protein oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfaßt, die homolog zu derjenigen ist, die abgeleitet ist von einem Gen in einem Bakterium, Fungus, protozoischen oder metazoischen Parasiten.

26. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen, das einen Tumor hat.

27. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen, das immunkompromisiert ist.

28. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen, das eine Infektion hat.

29. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen, dem es an hämatopoietischen Knochenmarkstammzellen mangelt.

30. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichen an ein menschliches Wesen, das ein hämatopoietisches Gewebetransplantat oder Transplantat erhält.

31. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen in einer Menge zwischen etwa 10 ug und etwa 1000 ug.

32. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen in einer Menge zwischen etwa 100 ug und etwa 400 ug.

33. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen als ein Bolus.

34. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen als eine Serie von Bolen.

35. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verabreichung an ein menschliches Wesen als eine Serie von Bolen etwa alle 14 Tage.

36. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung beim Hervorrufen oder Verstärken einer zellulären oder humoralen Immunantwort in einem menschlichen Wesen und um nachfolgend einen Antikörper von dem Wesen zu erhalten.

37. Eine Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung beim Hervorrufen oder Verstärken einer zellurären oder humoralen Immunantwort in einem menschlichen Wesen und um nachfolgend eine T-Zelle von dem Wesen zu erhalten.

38. Verwendung einer immunpotenzierenden Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments zum Hervorrufen oder Verstärken einer zellulären oder humoralen Immunantwort in einem menschlichen Wesen bei Verabreichung an ein menschliches Wesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine zelluläre oder humorale Immunantwort hervorzurufen oder zu verstärken.